MX2007006521A - Nuevas composiciones farmaceuticas utiles para vacunas. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere al campo de las composiciones farmaceuticas, particularmente en el campo de las vacunas. Mas precisamente la invencion tiene por objetivo una nueva composicion farmaceutica util como vacuna (o composicion de vacuna). La invencion tambien tiene por objeto un procedimiento para la preparacion de la composicion de vacuna segun la invencion.

Description

NUEVAS COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS ÚTILES PARA VACUNAS Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo de las composiciones farmacéuticas, en particular el campo de las vacunas. Más precisamente, la invención se refiere a una composición farmacéutica útil como vacuna (o composición de vacuna). La invención también se refiere a un método para preparar la composición de vacunas de la invención. Antecedentes de la Invención En el campo de la invención, se sabe que la eficacia de la composición de vacuna es esencial debido a la mezcla del antígeno usado con un adyuvante. Los adyuvantes para vacunas han sido usados durante muchos años y se definen como composiciones que cuando se combinan con un antígeno, producen una respuesta inmune mayor que la del antígeno únicamente. La potencia inmunogénica de una vacuna sin adyuvante es por regla general débil, particularmente cuando un virus inactivado está involucrado o cuando el antígeno es simplemente un péptido o una proteína y no hace posible inducir una respuesta inmunogénica. Se han realizado extensas investigaciones con el fin de obtener adyuvantes satisfactorios que idealmente deben tener las siguientes propiedades: * inducen una reapuesta inmune principal, particularmente con una dosis de antígeno mínima; * inducen una respuesta inmune mixta (humoral y celular) con el fin de promover y establecer una respuesta de memoria; * son perfectamente tolerados y libres de toxicidad; * si es posible están constituidos de excipientes comúnmente usados en el campo farmacéutico, más específicamente aquellos para los medicamentos inyectables; * son fáciles de administrar con la ayuda de una jeringa por ejemplo y si es posible, llenarse directamente en jeringas listas para usar; * son fáciles de combinar con varios antígenos diferentes, con el fin de permitir la estandarización de la producción de diferentes vacunas; * son fáciles de producir a escala industrial usando procesos de manufactura fácil de controlar. Una multitud de adyuvantes de varios tipos diferentes y orígenes son conocidos en la técnica. Alumbre (fosfato e hidróxido de aluminio) es un adyuvante cuyo uso está muy extendido en las vacunas humanas y veterinarias. Se conocen y usan otros adyuvantes para la investigación tales como el adyuvante de Freund constituido de una mezcla de aceite mineral y las micobacterias muertas. Este adyuvante es extremadamente efectivo y produce respuestas inmunes marcadas.

Sin embargo su limitada tolerancia limita su uso a la investigación en los animales de laboratorio. Varias patentes describen composiciones adyuvantes para vacunas. La patente de los Estados Unidos no. 4,788,056 describe una vacuna combinada contra herpes y E. coli para vacunar ganado vivo. Esta patente menciona varios adyuvantes posibles diferentes, incluyendo emulsiones aceite/agua o agua/aceite en base a ciertos aceites tales como Mygliol® (triglicéridos de cadena media) o tensoactivos tales como polisorbato, sin embargo sin indicar una formulación precisa del adyuvante. Sin embargo están involucradas las emulsiones convencionales en las cuales la fase dispersa existe en forma de gotitas. Además no se dan indicaciones con respecto al efecto del adyuvante en la potencia inmunogénica de la vacuna. La patente de los Estados unidos no. 5,688,761 describe una formulación de agua en aceite que se convierte en un sistema de aceite en agua por medio de la adición de un fluido acuoso, que da como resultado la liberación de un fluido acuoso, que da como resultado en la liberación de la proteína contenida en la fase acuosa. La ventaja de las microemulsiones es su formación espontánea y su estabilidad física. Los aceites usados por esos autores son aceites bien tolerados por medio e la ruta inyectable tales como mono- y triglicéridos de cadena media. Se emulsifican la fase acuosa por medio del uso de tensoactivos convencionales conocidos para los expertos en la técnica tales como esteres de sorbitano o polisorbatos. Su dilución por medio de fluidos biológicos durante su inyección da como resultado la inversión de fases y por lo tanto la liberación del agente biológico incorporado en la fase acuosa.

Ciertos ejemplos de la formulación muestran un aumento en la actividad de los agentes biológicos incorporados en la formulación descrita. Sin embargo los ejemplos proporcionados no se refieren al campo de las vacunas. La patente de los Estados Unidos no. 5,744,137 describe el uso de aceites no minerales en vacunas, en adición a las vacunas en la forma de emulsiones de agua en aceite que contienen una mezcla de cuando menos dos surfactantes seleccionados de entre aceite de ricino etoxilado, laurato de propilenglicol, caprilato de propilenglicol y succinato de isoesteril diglicerilo. Los aceites seleccionados son de origen animal o vegetal con el fin de limitar lo más posible la reacción de los tejidos relacionados para la administración de aceites minerales poco tolerados. La patente norteamericana no. 5,961,960 describe un adyuvante de vacuna presentado en la forma de una submicroemulsión de aceite en agua que contiene un emulsificador (se involucra a un fosfolípido), un surfactante no iónico y un aceite. Sin embargo el alto costo de los fosfolípidos restringe las aplicaciones de esta invención. La solicitud de patente norteamericana no. 2003011977 describe una composición que consiste de vesículas de lípidos bifásicas permitiendo la mejora de la respuesta inmune inducida por un antígeno. La solicitud de patente norteamericana no. 20030175309 describe un adyuvante que contiene lecitina, un aceite y un sufactante anfifílico capaz de formar una vacuna en la forma de un aceite estable en emulsión acuosa que hace posible minimizar las reacciones locales en el animal inyectado. La solicitud internacional WO 99/61003 describe un sistema para suministrar sustancia activas que contienen una reserva de medicamento en una forma sólida estrechamente compactada con una estructura isotrópica en el estado sólido. Este sistema es adecuado para suministrar sustancias activas por medio de inhalación, la sustancia activa se presenta en forma de liposomas, las liposomas se compactan subsecuentemente con e fin de formar el sistema de suministro sólido descrito. La solicitud de patente europea no. 0 398 287 describe una composición farmacéutica en la forma de una solución isotrópica que consiste de una o varias sustancias activas y un medio que se solidifica entre 20° C y 80° C (particularmente a la temperatura ambiente) y es soluble en agua. Sin embargo existe aun la necesidad recurrente en la industria de las vacunas de nuevos adyuvantes que presenten las propiedades enlistadas antes. En particular, existe la necesidad de proporcionar adyuvantes que permitan un mayor aumento en la potencia inmunogénica se basa en el hecho de que permiten la administración de bajas dosis de antígenos mientras que mantienen una respuesta inmune satisfactoria. Es particularmente deseable tener disponibles esas composiciones cuando el antígeno es costoso o difícil de producir en cantidades suficientes o cuando se usa un simple péptido o los antígenos obtenidos por síntesis o recombinación Sumario de la Invención En una manera sorprende e inesperada, los inventores han ahora descubierto que una composición farmacéutica en la forma de un isótropo aceitoso, cuando menos compuesto de una mezcla ternaria de aceite/surfactante(s)/fase acuosa, la fase acuosa contiene a la sustancia antigénica, capaz de tener una potencia inmunogénica marcadamente mayor que una composición ternaria de la técnica anterior en la forma de una emulsión, en una forma no isotrópica. Además una composición en forma isotrópica puede poseer una viscosidad capaz con administración por medio de inyección. El término "isótropo" se usará de aquí en adelante para designar un isótropo aceitoso de acuerdo con la invención, esto es la mezcla ternaria isotrópica de aceite/surfactante(s)/fase acuosa de acuerdo con la invención. De igual manera "isótropo que contiene una sustancia antigénica" denotara una composición de acuerdo con la invención en la cual la sustancia antigénica se incluye en la fase acuosa del isótropo aceitoso de acuerdo con la invención. El isótropo aceitoso significa una mezcla de aceite, agua y surfactantes, las proporciones de las cuales se ajustan de una forma que la preparación obtenida es límpida, clara y presenta un bajo nivel de viscosidad. De esta manera, tal composición puede administrarse por medio de inyección. Este tipo de composición corresponde a una disolución de agua en aceite, o más específicamente agua en un miscelio, en aceite (isótropo aceitoso).

De hecho durante la constitución del isótropo, se forman agregados moleculares del surfactante conocidos como miscelios, en los cuales el activo es más o menos insertado profundamente. Los isótropos son bien conocidos y encontraran toda la información necesaria entre otros en Galénica 1983 vol. 5, capítulo 4, páginas 195-219. En particular, este trabajo presenta diagramas ternarios de agua/aceite/surfactante, por ejemplo un diagrama de agua/aceite de parafina/Brij 96 en la página 203, permitiendo la determinación de las concentraciones respectivas de esos compuestos para los cuales se obtiene un sistema ¡sotrópico. Más específicamente, una composición en forma isotrópica presenta una estructura tridimensional continua, también conocida como estructura monofásica. Las emulsiones para su parte se forman de un sistema de dos líquidos inmiscibles uno de los cuales por otro lado está finamente dividido en gotitas o vesículas. La fase dispersa se conoce como fase interna o discontinua y la fase dispersante se conoce como la fase externa o continua. Una emulsión por lo tanto es una dispersión líquido-líquido que posee una estructura bifásica. Una composición en forma isotrópica difiere de una emulsión por la ausencia de organización del tipo de vesícula y por la presencia de miscelios. "Organización del tipo de vesícula", significa en el sentido de la presente invención, una estructura que presenta una pared que contiene o está constituida por componentes del tipo de surfactante, la pared incluye un volumen que contiene o está constituido por una fase interna hidrofílica cuando la fase externa es hidrofóbica y viceversa. Los resultados presentados a continuación y obtenidos en animales de laboratorio durante las pruebas con un isótropo que contienen una sustancia antigénica de acuerdo con la invención mostró que es posible obtener con ese isótropo un aumento altamente significante en la actividad inmunogénica del antígeno en comparación con a actividad inmunogénica obtenida con el antígeno en combinación con un adyuvante clásico. Además esas pruebas mostraron que el isótropo supera a las preparaciones consistentes de las convencionales emulsiones agua en aceite. La invención por lo tanto es el resultado de ese descubrimiento. Descripción Detallada de la Invención El objeto principal de la invención es por lo tanto una composición farmacéutica que contiene cuando menos una mezcla de cuando menos un aceite, cuando menos un tensoactivo y una fase acuosa, que contiene cuando menos una sustancia activa, la composición farmacéutica se encuentra en la forma de un isótropo aceitoso. Esta composición se encuentra en forma isotrópica y por lo tanto no en forma de una emulsión.

En particular, la composición presenta viscosidad compatible con la administración por inyección. De acuerdo con la invención, la sustancia activa puede ser cualquier tipo de sustancia biológicamente activa, tal como un antígeno vivo, atenuado o inactivado. Un antígeno vivo significa: una bacteria o un virus atenuado empírica o genéticamente, un antígeno proteico (o glico-lipoprotéico) expresado in vivo por medio de un vector (bacterial o viral recombinante). Un antígeno inactivado significa una bacteria o virus inactivado por cualquier método físico o por medio de métodos químicos o un extracto bacteriano o viral, o una proteína, un polipéptido o un péptido obtenido por medio de la recombinación genética o por medio de síntesis química, o cuando menos un generador in vivo de un compuesto que consiste de una secuencia de aminoácidos. Muy específicamente, la sustancia biológicamente activa puede ser inerte. De acuerdo con una modalidad específica de la invención la composición farmacéutica es una vacuna. En esta forma, la sustancia activa es un antígeno en este caso. El antígeno puede tener cualquier origen y cualquier forma comúnmente usada en el campo de las vacunas. El antígeno puede por ejemplo ser de origen viral, bacterial, parasitario o hasta tumoral. El antígeno puede ser natural o recombinante. Puede estar compuesto de un microorganismo (virus, bacterias o parásitos), atenuados o inactivados si es apropiado, o fracciones, particularmente fracciones acelulares, del microorganismos (antígenos purificados, proteínas naturales o glicoproteínas o péptidos, polinucleótidos, ya sea sintéticos o producidos por ingeniería genética en particular), o bien en base a antígenos solubles o dispersibles en agua. Preferentemente, una fase antigénica compuesta de moléculas excretadas por los microorganismos se usara de acuerdo con la invención, ya sea componentes de la pared bacteriana o componentes del citoplasma. La cantidad de sustancia activa y/o antígeno en la composición de acuerdo con la invención es una función del efecto deseado y de la naturaleza de la sustancia activa o antígeno usado. Alguien experto en la técnica es capaz de realizar ensayos con este último como función de la sustancia activas o antígenos usados. Las proporciones de cada uno de los constituyentes del isótropo se ajustan de tal forma que el conjunto forma un isótropo aceitoso. Más específicamente, la concentración de surfactante puede ser mayor que la concentración de miscelio crítica (CMC) Para una concentración menor al CMC, la porción esencial del surfactante en forma monomérica; por otro lado, para una concentración por encima de CMC, hay una apreciable presencia de miscelios. El valor CMC puede determinarse por medio de varios métodos diferentes, por ejemplo conductimetría o espectrofotometría, particularmente como se describe en el artículo de Dominguez et al.

"Journal of Chemical Education"; 1997, 1227-1231. En general, el CMC corresponde a una carga repentina en la ley de variación del parámetro medido, por ejemplo la conductancia o la absorbencia. Por lo tanto, las composiciones de acuerdo con la invención pueden contener un contenido de surfactante mayor o igual a la concentración crítica de miscelios. Esta concentración de micelios crítica depende de varios parámetros, incluyendo la naturaleza de los componentes presente sen la composición y su contenido. Por lo tanto, la composición de acuerdo con la invención contendrá cuando menos una concentración de surfactante alta y una baja cantidad de agua. De acuerdo con la invención, la composición contendrá entre 10% y 90% de aceite, preferentemente 40% a 75% en peso, en relación al peso de la composición total. Otra vez de acuerdo con la invención la cantidad de agua en la composición se encontrara entre 0.5% y 20% preferentemente entre 3% y 9% en peso, en relación al peso total de la composición. Finalmente, de acuerdo con la invención, la cantidad de surfactante en la composición puede encontrarse entre 1% y 60%, preferentemente entre 16% y 45% en peso, en relación al peso total de la composición. De acuerdo con la invención, la proporción de la cantidad de agua a la cantidad de aceite no debe ser menor a 1 (cantidad de aceite igual a la cantidad de agua) y preferentemente no debe ser menor a 5 (cantidad de aceite cuando menos 5 veces mayor que la cantidad de agua). Muchos aceites pueden usarse en la composición de acuerdo con la invención. Sin embargo ese aceite debe ser compatible con el uso farmacéutico, particularmente la administración inyectable por medio de la vía parenteral. El aceite puede seleccionarse de entre: - aceites minerales tales como sin limitación, aceite de parafina, aceite de vaselina, - aceites no minerales, tales como aceite de hígado de bacalao, lípidos sintéticos, aceites vegetales (tales como sin limite, aceite de soya, aceite de oliva, aceite de maíz, aceite de cacahuate, aceite de semillas de algodón, aceite de girasol, aceite de ajonjolí, aceite de ricino y aceite de almendra), triglicéridos de cadena media y larga (tal como los triglicéridos de ácido caprílico/cáprico tal como aquellos vendidos por la compañía Stearineries Dubois o aquellos vendidos bajo los nombres Miglyol 810®, 812® y 818®por la compañía Duynamit Nobel), aceites terpénicos tales como escualano y escualeno, y - sus mezclas. De acuerdo con la invención se prefiere usar un aceite tal como escualeno o preferentemente un aceite de la familia de los triglicéridos y más preferentemente triglicéridos de cadena media del tipo de Mygliol 810. De acuerdo con la invención es posible usar una mezcla de aceites.

Los surfactantes dados de acuerdo con la invención pueden ser aniónicos, catiónicos, no iónicos o anfotéricos. La clase preferida gracias a su buena seguridad, particularmente durante la inyección, es la de los surfactantes no iónicos. Preferentemente entre los últimos, todos aquellos utilizables de por medio de inyección pueden usarse solos o en mezcla. Se mencionará como ejemplo y sin que sea posible que esta lista sea limitativa, los polisorbatos, esteres de sorbitano, particularmente los esteres de sorbitano y los ácidos grasos, derivados polioxietilenados de aceite de ricino, derivados polioxíetilenados de ácido esterárico, copolímeros de óxido de etileno y óxido de propileno o poloxameros, esteres de sacarosa y ácidos grasos, esteres de glicol y ácidos grasos, mono-, di-, triéster de ácidos grasos y glicerol, esteres de polietilenglicol y ácidos grasos y esteres de sacarosa y ácidos grasos. Preferentemente de acuerdo con la invención, los polisorbatos y los esteres de sorbitano, particularmente se usan los esteres de sorbitano y ácidos grasos. De acuerdo con la invención es posible usa runa mezcla de dos o varios surfactantes. Esos surfactantes pueden tener HLB idénticos o diferentes (HLB es el balance hidrofílico-lipofílico, que es una característica de los surfactantes, relacionados a la estructura de su molécula). Preferentemente los surfctantes tendrán HLB diferentes con el fin de acercarse al HLB crítico de la fase aceitosa usada. El HLB crítico es una función de la concentración de los emulsificantes y la naturaleza química de los surfactantes. El experto en la técnica no tendrá dificultad en encontrar en "Handbook of excipients"; (Raymond C. Rowe, Paul J. Sheskey, Paul J. Weller - 4a edición, 2003), por ejemplo el HLB de los surfactantes y por lo tanto podrá seleccionar los surfactantes adecuados de acuerdo con la composición de la mezcla que desea producir. De acuerdo con la invención la fase acuosa puede contener además del antígeno soluble o dispersable en agua y agua, otras sustancias tales como sales diseñadas para acomplejar el antígeno con el fin de retrasar su liberación y por lo tanto prolongar su acción. Se puede mencionar silicato de alumina y fosfato de calcio como ejemplos de este tipo de sales. La fase acuosa puede también contener opcionalmente sustancias inmunogénicas no específicas conocidas para el experto tales como los lipopolisacáridos, o quitosano De igual manera puede contener polímeros, polímeros no iónicos (tales como poloxámeros) arcillas sintéticas (tales como Laponite®, Chimilab Essor, por ejemplo), citocinas o antioxidantes tales como vitamina E, reconocida por su potencia inmunoestimulante. De acuerdo con la invención, la composición posee una viscosidad de entre 5 y 150 mPas y preferentemente entre 5 y 100 mPa.s. La viscosidad de la composición se mide a la temperatura ambiente, preferentemente a 25° C, usando un viscosímetro del tipo rotor-estator, tal como el viscosímetro marca Rheo designado HAAK-VT500, de acuerdo con las indicaciones del fabricante. La composición de acuerdo con la invención puede prepararse por medio de cualquier método operativo conocido para los expertos en la técnica. Por ejemplo una composición de acuerdo con la invención puede prepararse por medio del siguiente método operativo: - durante una etapa inicial, el antígeno se disuelve o dispersa en la fase acuosa en la cual las sustancias adicionales antes descritas se incorporan opcionalmente y la mezcla se calienta, en un baño de agua por ejemplo a una temperatura de entre 30 y 60° C, preferentemente entre 35 y 45° C. - durante una segunda etapa, que puede ser concomitante, el o los surfactantes se mezclan con el aceite y la mezcla se calienta, en un baño de agua por ejemplo a una temperatura de entre 30 y 60° C, preferentemente entre 35 y 45° C; - durante una tercera etapa, la fase acuosa se incorpora en la fase aceitosa usando un homogenizador (tal como un homogeneizador Rayneri® 33300). Estos dispositivos se usan extensamente, particularmente en la preparación de emulsión y el experto en la técnica por lo tanto no tendrá problemas en la preparación de la mezcla de acuerdo con la invención; y - durante la etapa final el isótropo aceitoso obtenido se enfría a la temperatura ambiente y se esteriliza. Varios procesos diferentes descritos en la literatura pueden usarse para esta operación, tal como esterilización por medio de calor; radiación ionizante o por medio de filtrado por ejemplo. El procedimiento preferido es el de la filtración esterilizante. De acuerdo con otro método de realización, también es posible usar materiales de partida que son propiamente estériles y conducir toda la manufactura en un cuarto limpio, con el fin de evitar el estar obligado a realizar una operación de esterilización final. Los siguientes ejemplos se dan como ilustración de la invención y no la restringen en manera alguna. Otras modalidades son posibles usando un método de realización idéntico. Ejemplo 1: Composición de la fase antigénica En los tres siguientes ejemplos, se usa la misma fase acuosa que contiene el antígeno. Incluye una fase antigénica acelular compuesta de antígenos excretados durante el cultivo de una cepa bacteriana de Streptococcus suis. Esta bacteria es responsable de una enfermedad severa y muy extendida en los lechones. La infección se caracteriza por medio de enfermedades nerviosas (falta de coordinación motora, tremor y convulsiones) y enfermedades de las articulaciones. Casos de septicemia también han sido reportados, además de lesiones pulmonares. La transmisión a los humanos es posible (trabajadores en lo rastros, personal veterinario). Solo se usa la nata acelular del cultivo. Se usa una mezcla de proteínas una de las cuales se usa como marcador de actividad: MRP (proteína liberada por muramdiasa), cuya concentración puede determinarse por medio de la prueba ELISA (ensayo inmunosorbente ligado con enzimas). Un anticuerpo monoclonal anti-MRP se fija en los pozos de una placa de mícrotitulación. Después de la fase de saturación que hace posible evitar la adsorción específica, la vacuna (que contiene el antígeno que va a estudiarse) se diluye y transfiere a cada pozo. Después de lavar, se agrega un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína MRP y acoplada a una enzima. La reacción con el sustrato/cromógeno de la enzima hace posible obtener una reacción de color medida usando un lector de placas. La intensidad del colorante es directamente proporcional a la cantidad de antígeno de la vacuna. Una vez que se obtiene la concentración de esta solución, el experto en la técnica podrá ajustar sin dificultad por medio de dilución (excepcionalmente por concentración) la concentración de la solución que se va a utilizar en la vacuna. De acuerdo con la invención, la alícuota de la solución primaria que contiene la cantidad deseada de antígenos se diluye a la cantidad necesaria y suficiente de un amortiguador comúnmente usado en el campo de las vacunas, tales como por ejemplo amortiguador de fosfato. Ejemplo 2: composición 1 La siguiente tabla presenta la composición de acuerdo con la invención que se realiza. Las cantidades se dan en gramos. 1UU ll?UI--_ílll-i-- El Miglyol 810®, Tween 80® y Span 80 se mezclan en un vaso de precipitados. La fase aceitosa obtenida se caliente en un baño de agua a 40° C. En paralelo y por separado, la fase acuosa también se calienta en un baño de agua a 40° C. La fase acuosa se agrega a la fase aceitosa por goteo, homogenizando con un mezclador de turbina (Rayneri 33300) rotando a 500 rpm. Durante el mezclado los dos vasos de precipitados e mantienen a 40° C. Una vez que se ha realizado la mezcla, se retira del baño de agua y se deja enfriar a la temperatura ambiente. La concentración de proteína MRP objetivo del producto terminado es 1.6. la concentración es objetivo en una concentración relativa aun antígeno de referencia que tiene una concentración teórica y arbitraria de 1. (1.6 significa que la vacuna tiene una concentración 1.6 veces mayor que la referencia usada). Ejemplo 3: composición 2 Se prepara la siguiente composición. Las cantidades se dan en gramos: El proceso para preparar la mezcla es idéntico al descrito en el ejemplo 2. La concentración de proteína MRP objetivo del producto terminado es 1.6. Ejemplo 4: composición 3 Se prepara la siguiente composición. Las cantidades se dan en gramos: El miglyol 810®, Tween 8°® y Span 80® se mezclan en un vaso de precipitados. Esta mezcla se esteriliza al calentar a 120° C durante 30 minutos y subsecuentemente se deja enfriar a la temperatura ambiente. La fase acuosa que contiene el antígeno se esteriliza por medio de filtración a través de una membrana sintética con una porosidad de 0.22 µm. La fase aceitosa obtenida antes se calienta en paralelo y por separado y la fase acuosa se prepara de acuerdo con el ejemplo 1 en un baño de agua a 40° C. Una vez que las 2 fases están a la misma temperatura, la fase acuosa se agrega por goteo a la fase aceitosa homogenizando con un mezclador de turbina (Ryneri 33300) rotando a 500 rpm. Durante el mezclado los dos vasos se mantienen a esa temperatura. Una vez que la mezcla ha sido preparada se retira del baño de agua y se deja enfriar a la temperatura ambiente. La concentración de proteína MRP objetivo del producto terminado es 1.6. Ejemplo 5: comparación de la actividad inmunogénica de una composición de acuerdo con la invención con la actividad inmunogénica de la formulación de acuerdo con la técnica anterior: La actividad de la composición 1 del ejemplo 2 se compara con la de otras composiciones del tipo anterior que contiene el o los adyuvantes descritos en la literatura y conocidos para los expertos en la técnica. Por lo tanto, 4 otras formulaciones (controles) se preparan de acuerdo con las siguientes composiciones y los métodos operativos: Formulación de control 1: emulsión convencional del tipo aceite en agua: Para esta emulsión, los mismos excipientes descritos para el isótropo aceitoso en ejemplo 2 se usaron en diferentes proporciones con el fin de obtener una emulsión muy fina, para un HLB critico de 11. La cantidad se da en gramos.

El método usado es el siguiente: La fase antigénica obtenida en el ejemplo 1 se esteriliza por medio de filtrado a través de una membrana sintética con una porosidad de 0.22 µm. La Miglyol®, Tween 80® y el Span 80® se mezclan en un vaso de precipitados y la mezcla se esteriliza al calentar a 120° C durante 30 minutos y se deja enfriar a la temperatura ambiente. La fase acuosa (fase antigénica) y la fase aceitosa se calientan por separado en un baño de agua. Una vez que las 2 fases están a la misma temperatura la fase acuosa se agrega a la fase aceitosa agitando a 3000 rpm. Después de la adición de la fase acuosa, se continua con la agitación durante 30 minutos. Formulación de control 2: adyuvante comercial de aceite en agua (Montanide IMS, SEPPIC) Un adyuvante Montanide IMS, vendido por la compañía SEPPIC (PARÍS, Francia) listo para usarse se uso en esta segunda preparación de referencia. Las cantidades se dan en gramos.

Fase acuosa que contiene el antígeno (Ejemplo 1) 50.00 Montanide IMS 50.00 La fase acuosa obtenida en el ejemplo 1 y el adyuvante se mezclan mientras que se agita durante 20 segundos usando el homogeneizador Rayneri® 33300 rotando a 150 rpm. Todo se esteriliza por medio de filtrado a través de una membrana sintética con una porosidad de 0.22 µm. Formulación de control 3: adyuvante comercial de aceite en agua (Montanide ISA 763 VG, SEPPIC) Un adyuvante Montanide ISA 763 VG, vendido por la compañía SEPPIC (PARÍS, Francia) listo para usarse, se uso en esta tercera preparación de referencia. Las cantidades se dan en gramos. Fase acuosa que contiene el antígeno (Ejemplo 1) 30.00 Montanide ISA 763 VG 70.00 La fase acuosa obtenida en el ejemplo 1 se filtra a través de un filtro de nylon de 0.22 µm y el adyuvante a través de un filtro con una porosidad de 0.22 µm, todo ensamblado de forma aséptica. El adyuvante se transfiere a un vaso de precipitados a 800 rpm usando un homogenizadorr Rayneri® 33300. La fase acuosa antigénica se incorpora en una única operación, agitando a 1200 rpm, manteniendo durante 30 minutos. Formulación de control 4: adyuvante comercial de aceite en agua (Montanide ISA 763 VG, SEPPIC) Un adyuvante Montanide ISA 763 VG, vendido por la compañía SEPPIC (PARÍS, Francia) listo para usarse, se uso en esta tercera preparación de referencia. Las cantidades se dan en gramos. Fase acuosa que contiene el antígeno (Ejemplo 1) 50.00 Montanide ISA 763 VG 50.00 La fase acuosa obtenida en el ejemplo 1 se filtra a íravés de un filíro de nylon de 0.22 µm y el adyuvante a través de un filtro con una porosidad de 0.22 µm, todo ensamblado de forma aséptica. El adyuvante se transfiere aun vaso de precipitados a 800 rpm usando un homogenizador Rayneri® 33300. La fase acuosa antigénica se incorpora en una única operación, agitando a 120 rpm, manteniendo durante 15 minutos. Formulación de control 5: Adyuvante de LH de acuerdo con la solicitud de patente WO 01/40240 Otro adyuvante LH, un adyuvante experimental de la compañía COVACCINE (Lelystadt, PAÍSES BAJOS), listo para usarse, se uso como esta última de referencia. Las cantidades se dan en mililitros.

El adyuvante acuoso LH se esteriliza por medio el proveedor y se recibió tal cual. La fase antigénica acuosa y el amortiguador salino se mezclan asépticamente por medio de un agitador magnético durante 5 a 10 minutos y el adyuvante se agrega subsecuentemente muy lentamente ("en un chorrito") a la mezcla de fase antigénica-amortiguador salino. Manteniendo la agitación durante 10 minutos. Comparación de las concentraciones de MRP: Las concentraciones de proteína MRP, medidas tal como se describe antes de las formulaciones de referencia son de aproximadamente 4 en unidades RP (Potencia relativa: unidad de medición del Software Relative Potency Calculation, versión 3.0, Departamento norteamericana de Agricultura). La de la composición de acuerdo con la invención es de 1.01. De hecho dada la pequeña cantidad de agua presente en la composición de acuerdo con la invención, no es posible incorporan tanto antígeno como en las formulaciones de referencia excepto al aumentar su concentración en la fase acuosa, que podría potencializar la medición de la respuesta inmune. Y a pesar de estas concentraciones marcadamente menores y sorprendentemente los resultados descritos adelante demuestran una actividad inmunogénica marcadamente mayor del adyuvante de acuerdo con la invención. Protocolo de los estudios comparativos de la actividad inmunogénica y la tolerancia de las composiciones de control y la composición de acuerdo con la invención: Comparación de la tolerancia y la actividad inmunogénica realizada en ratones.

La actividad inmunogénica de la comparación 1 de acuerdo con la invención en el ejemplo 2 se comparó con aquellas de las composiciones de control siguiendo el siguiente protocolo experimental: Ratones BALB/C (proveedor: Charles River) de 18-22 gramos recibieron cada 2 semanas 2 inyecciones de 250 µl por medio de via intraperitoneal. La muestra de sangre se tomo una semana después del cese en la autopsia de los ratones. Desde el punto de vista serológico, el nivel de anticuerpo de ant'\-Streptococcus suis se determino por medio del método ELISA. Los pozos de una microplaca se forran con el antígeno (nata acelular del cultivo) y subsecuentemente se satura. Los sueros de los ratones que recibieron la vacuna se diluyen y depositan en la placa. Un anticuerpo anti-ratón marcado (conjugado con una enzima) se agrega. El sustrato/cromógeno de la enzima se deposita y se mide la reacción de color. La actividad inmunogénica de cada composición se define subsecuentemente por medio de una concentración media (en RP) correspondiente al medio de las concentraciones de los ratones que constituyen el grupo. La tolerancia se determina de acuerdo con tres criterios: la tasa de mortalidad, la actividad del animal y la apariencia de su pelaje. La presencia de un residuo en el punto de inyección también se verifica. Resultados * Potencia inmunogénica Los valores indicados son relativos: el valor indicado representa la potencia inmunogénica de una composición de acuerdo con la invención con referencia a la potencia inmunogénica de referencia no. 5 que sirve como referencia para determinar la potencia inmunogénica de cada referencia probada.

A: Composición 1 de acuerdo con la invención B: Control 1 C: Control 2 D: Control 3 E: Control 4 F: Control 5 Estos resultados muestran que la composición 1 (fórmula A) que contienen 4 y 6 veces menos antígeno que las referencias 1 y 4, inducen una respuesta inmunológica entre 2 y 80 veces mayor que la inducida por esos mismos controles. * tolerancia en animales + + : excelente (sin señales) + : buena (sin inflamación, sin residuo de producto, posiblemente pelaje maltratado) + : mala (inflamación, presencia de residuos de producto, pelaje maltratado) Esos resultados muestran que la fórmula A (composición 1), exactamente como la fórmula de referencia F (composición 5), es perfectamente tolerado tanto a nivel local como sistémico y mucho mejor tolerados que las 4 fórmulas de control.

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES 1. Composición farmacéutica que contiene cuando menos a mezcla de cuando menos un aceite, cuando menos un surfactante y una fase acuosa, que contiene cuando menos una sustancia activa, la composición farmacéutica no tiene la forma de una emulsión sino la forma de un isótropo aceitoso.
2. 2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque posee una viscosidad compatible con la administración por medio de inyección.
3. 3. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque la sustancia activa es una sustancial biológicamente activa, particularmente un antígeno vivo atenuado o inactivado.
4. 4. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque es una vacuna.
5. 5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada porque la sustancia activa es un antígeno.
6. 6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque el antígeno es de origen viral, bacterial, parasitario o hasta tumoral.
7. 7. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, caracterizada porque el antígeno puede ser natural o recombinante.
8. 8. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizada porque el antígeno está compuesto por un microorganismo, opcionalmente inactivado si es apropiado, o de fracciones de ese microorganismo.
9. 9. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque el antígeno contiene cuando menos una concentración de surfactante y una menor concentración de agua.
10. 10. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque contiene de 10% a 90% de aceite, preferentemente 40% a 75% en peso, en relación al peso de la composición total.
11. 11. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque contiene 0.5% y 20% en peso, preferentemente 3% a 9% en peso de agua, en relación al peso de la composición total.
12. 12. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque contiene 1% y 60% en peso, preferentemente 16% a 45% en peso de surfactante, en relación al peso de la composición total.
13. 13. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque la proporción de la cantidad de aceite a la de agua no debe ser menor a 1, preferentemente no menor a 5.
14. 14. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque el aceite se - - iUi- selecciona de entre los aceites minerales, aceites no minerales, tales como aceite de hígado de bacalao, lípidos sintéticos, aceites vegetales, triglicéridos de cadena media y larga, o aceites terpénicos y sus mezclas.
15. 15. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizada porque el aceite mineral se selecciona de entre aceite de parafina y aceite de vaselina.
16. 16. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada porque el aceite mineral es un aceite vegetal seleccionado de entre aceite de soya, aceite de oliva, aceite de aceites vegetales (tales como sin limite, aceite de soya, aceite de oliva, aceite de maíz, aceite de cacahuate, aceite de semillas de algodón, aceite de girasol, aceite de ajonjolí, aceite de ricino y aceite de almendra.
17. 17. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada porque los triglicéridos de cadena media y larga se seleccionan de entre los triglicéridos de ácido caprílico/cáprico.
18. 18. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada porque los aceites terpénicos se seleccionan de escualano y escualeno.
19. 19. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque se usa una mezcla de aceites.
20. 20. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de ?ift-?m?-?iáUi---i--u las reivindicaciones 1 a 19, caracterizada porque los surfactantes se seleccionan entre los surfactantes aniónicos, catiónicos, no iónicos o anfotéricos.
21. 21. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20, caracterizada porque el surfactante es un surfactante no iónico.
22. 22. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 21, caracterizada porque el surfactante se selecciona de entre los polisorbatos, esteres de sorbitano, particularmente los esteres de sorbitano y los ácidos grasos, derivados polioxietilenados de aceite de ricino, derivados polioxietilenados de ácido esterárico, copolímeros de óxido de etileno y óxido de propileno o poloxameros, esteres de sacarosa y ácidos grasos, esteres de glicol y ácidos grasos, mono-, di-, triéster de ácidos grasos y glicerol, esteres de polietilenglicol y ácidos grasos y esteres de sacarosa y ácidos grasos.
23. 23. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizada porque se usa una mezcla de surfactantes.
24. 24. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizada porque su viscosidad a la temperatura ambiente se encuentra entre 5 y 150 mPa.s, preferentemente entre 5 100 mPa.s.
25. 25. Un procedimiento para preparar una composición de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque: - durante una etapa inicial, el antígeno se disuelve o dispersa en la fase acuosa en la cual las sustancias adicionales antes descritas se incorporan si es apropiado y la mezcla se calienta, en un baño de agua por ejemplo a una temperatura de entre 30 y 6° C, preferentemente entre 35 y 45° C. - durante una segunda etapa, que puede ser concomitante, el o los surfactanles se mezclan con el aceite y la mezcla se calienta, en un baño de agua por ejemplo a una temperatura de entre 30 y 60° C, preferentemente entre 35 y 45° C; - durante una tercera etapa, la fase acuosa se incorpora en la fase aceitosa usando un homogenizador; y - durante la etapa final el isótropo aceitoso obtenido se enfría a la temperatura ambiente y se esteriliza.