KR20050052542A

KR20050052542A - 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 측정 방법 및 시약

Info

Publication number: KR20050052542A
Application number: KR1020057006643A
Authority: KR
Inventors: 유키 가타야마; 마유미 후지나카
Original assignee: 교와 메덱스 가부시키가이샤
Priority date: 2002-10-16
Filing date: 2003-10-16
Publication date: 2005-06-02
Also published as: AU2003301323A1; US20060014229A1; CN1694965A; ATE449867T1; EP1555326A1; US7851174B2; EP1555326A4; ES2335658T3; JP4498143B2; DE60330264D1; JPWO2004035816A1; EP1555326B1; CN100577812C; KR101046898B1; CA2502559A1; WO2004035816A1; CA2502559C

Abstract

검체와, ⅰ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 ⅱ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, ⅰ) 비이온성 계면활성제, 폴리아니온 및 알부민 또는 ⅱ) 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민 및 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체를 함유하는 수성매체 중에서 반응시켜, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 측정 방법 및 시약.

Description

고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 측정 방법 및 시약 {METHOD AND REAGENT FOR MEASURING CHOLESTEROL IN HIGH DENSITY LIPOPROTEINS}

본 발명은 검체 중 고밀도 리포 단백질 (이하 HDL 이라 함) 중의 콜레스테롤의 측정 방법, 측정용 시약 및 측정용 키트에 관한 것이다.

생체 중 리포 단백질은, 그 비중에 따라 고밀도 리포 단백질, 저밀도 리포 단백질 (이하 LDL 이라 함), 초저밀도 리포 단백질 (이하 VLDL 이라 함), 카이로미크론 (CM) 으로 분류되어 있고, 각각 주로 아포 단백질의 종류 차이에 따라 생체 중에서의 활동이 크게 다르며, 지방질 조성도 여러 가지이다. 그 중에서 HDL 은 동맥벽을 포함한 각 조직으로부터 콜레스테롤을 받아들여서 세포 내에 축적된 콜레스테롤의 제거 작용에 관계되며, 관동맥 경화증을 비롯한 각종 동맥 경화증의 위험예방 인자이고, 그 혈중 레벨은 동맥 경화성 질환의 발증 예지의 유용한 지침이 된다는 것이 알려져 있다.

종래의 HDL 중 콜레스테롤 (이하 HDL 콜레스테롤이라 함) 의 측정법은, 초원심법, 면역화학적방법, 전기영동법, 침전법 등에 의한 분획 조작과 콜레스테롤 정량 조작의 2단계로 이루어진다. 그러나 분획 조작은 조작이 번잡하고, 장시간을 요하는 것이며, 또한 안전성의 점에서도 문제가 있었다. 따라서, 이들 분리 조작을 수반하는 측정법은 매우 효율이 나빠 실용화에 적합하지 않은 방법이었다.

최근, 상기 문제를 해결하기 위해 여러 가지 측정법이 보고되고 있다. 예를 들어 혈청 또는 혈장을 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 옥시다아제 및 담즙산염, 담즙산 유도체 또는 디옥틸술포숙시네이트를 함유하는 완충액 중에서 그 효소와 반응시키고, VLDL 및 LDL 중의 콜레스테롤을 HDL 콜레스테롤에 앞서 반응시켜, 생성된 과산화수소를 측정한 후, 비이온계 폴리옥시에틸렌 옥시드기 함유 계면활성제를 반응액에 첨가하고 HDL 콜레스테롤과 그 효소를 반응시켜 HDL 콜레스테롤을 특이적으로 분별 정량하는 방법 (일본 공개특허공보 소62-69999호), 혈청을 특정한 pH 및 특정 온도 하, 췌장 유래의 콜레스테롤 에스테라아제, 콜레스테롤 옥시다아제, 담즙산군의 계면활성제 및 비이온계 계면활성제를 함유하는 완충액 중에서 그 효소와 반응시킴으로써 HDL 콜레스테롤을 측정하는 방법 (일본 공개특허공보 소63-126498호) 이 알려져 있다. 특허문헌 2 에 기재된 측정법에서는, 먼저 LDL 콜레스테롤과 그 효소의 반응이 진행되고, 다음에 HDL 콜레스테롤과 그 효소의 반응이 진행되어, HDL 콜레스테롤의 측정이 가능해진다. 그러나 이들 측정법은 측정에 장시간을 필요로 하고, 또한 반드시 HDL 콜레스테롤에 특이적인 측정법인 것은 아니었다.

HDL 이외의 리포 단백질을 응집시켜서 HDL 콜레스테롤을 측정하는 방법으로는, 예를 들어 덱스트란황산 등의 HDL 이외의 리포 단백질을 응집시키는 시약, 2가의 금속염 및 화학적으로 수식된 효소를 사용하는 측정법 (일본 공개특허공보 평8-131197호), 폴리아니온 등의 HDL 이외의 리포 단백질과 복합체를 형성하는 시약과, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 축합물 등의 리포 단백질을 용해하지 않는 계면활성제를 사용하는 측정법 (일본 공개특허공보 평8-201393호), 덱스트란황산 등의 폴리아니온, 2가의 금속염, 특정한 비이온성 계면활성제 및 시료 유래의 알부민과는 다른 알부민을 사용하는 측정법 (일본 공개특허공보 평9-285298호), 혈청 또는 혈장을 리포 단백질 분획제 (덱스트란황산 등의 폴리아니온과 마그네슘 이온 등의 2가 양이온과의 조합) 를 포함하는 용액으로 처리하고, 얻어진 혼합액을 고체 및 액체로 분리 처리하지 않고 아니온성 계면활성제 (알킬 술폰산 또는 담즙산 혹은 그 유도체) 의 존재 하에 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 옥시다아제와 반응시켜, 생성된 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 혈청 또는 혈장 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하는 방법 (일본 공개특허공보 평8-116996호), 생체 시료에, 폴리아니온 등의 HDL 이외의 리포 단백질과 복합체를 형성하는 물질과, 리포 단백질을 용해하지 않는 특정한 계면활성제를 첨가한 후, 효소적으로 HDL 콜레스테롤을 측정하는 방법 (일본 공개특허공보 평8-201393호) 등이 알려져 있다.

그러나, 이들 HDL 이외의 리포 단백질을 응집시키는 HDL 콜레스테롤 측정법에서는, 종래의 기준법과 양호한 상관성이 있지만 반응에서 생성하는 응집물에 의한 탁함에 기인하는 부정확성, 반응셀을 알칼리 세정할 때 반응액 중의 금속염과의 반응에서 생성되는 금속 수산화물의 석출에 의해 자동분석장치에 과도한 부하가 걸리는 등의 문제가 있다.

HDL 이외의 리포 단백질을 응집시키지 않고 HDL 콜레스테롤을 측정하는 방법으로는, 예를 들어 생체 시료와, 췌장 유래의 콜레스테롤 에스테라아제 및 콜레스테롤 옥시다아제를 담즙산 혹은 그 염 및 알부민 존재 하에 반응시켜, 그 효소반응에 의해 소비 또는 생성하는 화합물을 측정하는 것에 의한 생체 시료 중의 HDL 콜레스테롤의 측정 방법 (국제공개 제97/40376호 팜플렛), HDL 획분에 대하여 반응 선택성을 갖는 HLB 값이 16 이상인 비이온성 계면활성제의 존재 하에, 검체와, HDL 획분에 우선적으로 작용하는 리포 프로테인 리파아제 및/또는 콜레스테롤 에스테라아제, 그리고 콜레스테롤 산화 효소를 반응시켜 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하는 방법 (국제공개 제00/52480호 팜플렛) 등이 알려져 있다. 또한 아실폴리옥시에틸렌솔비탄에스테르에 의해 HDL 이외의 리포 단백질 중의 콜레스테롤을 우선적으로 과산화수소로 변환하고, 생성된 과산화수소를 소거한 후 폴리옥시에틸렌알킬에테르의 첨가에 의해 HDL 콜레스테롤을 효소적으로 측정하는 방법 (일본 공개특허공보 평9-299호) 도 알려져 있다.

그러나 이들 HDL 이외의 리포 단백질을 응집시키지 않는 HDL 콜레스테롤의 측정법에서는, HDL 이외의 리포 단백질 중 콜레스테롤의 불완전한 소거나 HDL 이외의 리포 단백질 중의 콜레스테롤에 대한 비특이 반응에 기인하는 측정치의 부정확성이 문제가 될 경우가 있다.

또 광학적 수법에 의해 검체 중의 특정 물질을 측정할 경우, M 단백혈증이나 골수종 등의 환자 유래의 검체에서는 수불용성 단백질에 기인하는 탁함이 광학적인 영향을 주는 것이 큰 문제가 되어 있다. 이 광학적인 영향을 피하기 위하여, 반응액 중의 염류를 고농도로 하여 수불용성 단백질에 기인하는 탁함을 해소시키는 방법이 일반적으로 알려져 있다. 그러나, HDL 콜레스테롤의 측정에서는, 고농도의 염류를 존재시킴으로써, HDL 콜레스테롤에 대한 특이성 저하나 나아가서는 함유되어 있는 효소의 실활을 초래하는 경우가 있는 점에서, 고농도의 염류의 존재 하에서의 HDL 콜레스테롤의 측정은 매우 곤란한 경우가 많다.

발명의 개시

본 발명의 목적은, 간편하게, 또한 정확한 측정을 할 수 있는 HDL 콜레스테롤의 측정 방법, 측정용 시약 및 측정용 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명은, 하기 [1]∼[37] 에 관한 것이다.

[1] 검체와, ⅰ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 ⅱ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 비이온성 계면활성제, 폴리아니온 및 알부민을 함유하는 수성매체 중에서 반응시켜, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 측정 방법.

[2] 수성매체가 추가로 담즙산 유도체를 함유하는 [1] 에 기재된 측정 방법.

[3] 담즙산 유도체가 음이온성 담즙산 유도체인 [2] 에 기재된 측정 방법.

[4] 비이온성 계면활성제가, 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민인 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.

[5] 폴리아니온이 덱스트란황산 또는 그 염인 [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 측정 방법.

[6] 비이온성 계면활성제, 폴리아니온, 알부민, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 시약.

[7] 비이온성 계면활성제, 폴리아니온, 알부민, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 조효소를 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 시약.

[8] 추가로 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 [7] 에 기재된 시약.

[9] 추가로 담즙산 유도체를 함유하는 [6]∼[8] 중 어느 하나에 기재된 시약.

[10] 담즙산 유도체가 음이온성 담즙산 유도체인 [9] 에 기재된 시약.

[11] 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민인 [6]∼[10] 중 어느 하나에 기재된 시약.

[12] 폴리아니온이 덱스트란황산 또는 그 염인 [6]∼[11] 중 어느 하나에 기재된 시약.

[13] 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 키트이며, 폴리아니온, 비이온성 계면활성제, 알부민 및 과산화수소 측정 시약을 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하고, 콜레스테롤 산화 효소를 제 2 시약에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.

[14] 폴리아니온을 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 비이온성 계면활성제, 알부민 및 과산화수소 측정 시약을 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.

[15] 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 키트이며, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 폴리아니온, 비이온성 계면활성제, 알부민 및 산화형 조효소를 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하고, 콜레스테롤 탈수소 효소를 제 2 시약에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.

[16] 폴리아니온을 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 비이온성 계면활성제, 알부민 및 산화형 조효소를 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.

[17] 추가로 환원형 조효소 측정용 시약을, 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 [15] 또는 [16] 에 기재된 키트.

[18] 추가로 담즙산 유도체를 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 [13]∼[17] 중 어느 하나에 기재된 키트.

[19] 담즙산 유도체가 음이온성 담즙산 유도체인 [18] 에 기재된 키트.

[20] 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민인 [13]∼[19] 중 어느 하나에 기재된 키트.

[21] 폴리아니온이 덱스트란황산 또는 그 염인 [13]∼[20] 중 어느 하나에 기재된 키트.

[22] 검체와, ⅰ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 ⅱ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, ⅰ) 비이온성 계면활성제, 폴리아니온 및 알부민, 또는 ⅱ) 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민 및 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체를 함유하는 수성매체 중에서 반응시켜, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 측정 방법.

[23] 검체와, ⅰ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 ⅱ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민 및 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체를 함유하는 수성매체 중에서 반응시켜, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 측정 방법.

[24] 추가로 폴리아니온을 함유하는 [23] 에 기재된 방법.

[25] 폴리아니온이 덱스트란황산 또는 그 염인 [23] 또는 [24] 에 기재된 방법.

[26] 추가로 알부민을 함유하는 [23]∼[25] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[27] 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민 및 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 시약.

[28] 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민 및 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 조효소를 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 시약.

[29] 추가로 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 [28] 에 기재된 시약.

[30] 추가로 폴리아니온을 함유하는 [27]∼[29] 중 어느 하나에 기재된 시약.

[31] 폴리아니온이 덱스트란황산 또는 그 염인 [30] 에 기재된 시약.

[32] 추가로 알부민을 함유하는 [27]∼[31] 중 어느 하나에 기재된 시약.

[33] 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 키트이며, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정 시약의 각각을 임의로 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하고, 콜레스테롤 산화 효소를 제 2 시약에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.

[34] 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 키트이며, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체 및 산화형 조효소 각각을 임의로 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하고, 콜레스테롤 탈수소 효소를 제 2 시약에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.

[35] 추가로 제 1 시약과 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 [34] 에 기재된 키트.

[36] 추가로 제 1 시약과 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 폴리아니온을 함유하는 [33]∼[35] 중 어느 하나에 기재된 키트.

[37] 추가로 제 1 시약과 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 알부민을 함유하는 [33]∼[37] 중 어느 하나에 기재된 키트.

본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정 방법은, HDL 이외의 리포 단백질 중의 콜레스테롤을 소거하지 않고 HDL 콜레스테롤을 특이적으로 측정하는 방법이다.

본 발명의 측정 방법에서 사용할 수 있는 검체로는, 예를 들어 전혈, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 타액, 양수, 오줌, 땀, 췌액 등을 들 수 있지만, 혈장 및 혈청이 바람직하다.

본 발명에서의 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소로는, 콜레스테롤 에스테르를 가수분해할 능력을 갖는 효소라면 특별히 한정은 없고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤 에스테라아제, 리포 프로테인 리파아제 외에 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 콜레스테롤 에스테라아제, 리포 프로테인 리파아제 등도 사용할 수 있다.

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소로는, 무수식 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소도, 화학적으로 수식된 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소도 사용할 수 있다. 또한 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소로는 시판품을 사용할 수도 있다.

시판되고 있는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소로는, 예를 들어 콜레스테롤 에스테라아제 "Amano" 2 (CHE2 ; 아마노엔자임사 제조), 콜레스테롤 에스테라아제 "Amano" 3 (CHE3 ; 아마노엔자임사 제조), 리포 프로테인 리파아제 (LPL311 ; 도요보세키사 제조), 리포 프로테인 리파아제 "Amano" (LPL6 ; 아마노엔자임사 제조), 콜레스테롤 에스테라아제 [COE313 (화학적으로 수식된 콜레스테롤 에스테라아제) ; 도요보세키사 제조] 등을 들 수 있다. 또한 본 발명에서는, 2종류 이상의 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소를 조합해서 사용할 수도 있다.

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소의 화학수식에서 그 효소를 수식하는 기 (화학수식기) 로는, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌글리콜과 폴리에틸렌글리콜의 공중합체를 갖는 기, 수용성 다당류를 함유하는 기, 술포프로필기, 술포부틸기, 폴리우레탄기, 킬레이트 기능을 갖는 기 등을 들 수 있지만, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기가 바람직하다. 수용성 다당류로는, 예를 들어 덱스트란, 풀루란, 가용성 전분 등을 들 수 있다.

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소를 화학적으로 수식하기 위한 시약 (화학수식제) 으로는, 상기 화학수식기와, 효소의 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기 등과 반응할 수 있는 관능기 또는 구조를 함께 갖는 화합물 등을 들 수 있다. 효소 중의 아미노기와 반응할 수 있는 관능기 또는 구조로는, 예를 들어 카르복실기, 활성에스테르기(N-히드록시숙신이미드기 등), 산무수물, 산염화물, 알데히드, 에폭시드기, 1,3-프로판술톤, 1,4-부탄술톤 등을 들 수 있다. 효소 중의 카르복실기와 반응할 수 있는 관능기 또는 구조로는, 예를 들어 아미노기 등을 들 수 있다. 효소 중의 술프히드릴기와 반응성이 있는 기 또는 구조로는, 예를 들어 말레이미드기, 디술피드, α-할로에스테르(α-요오드에스테르 등) 등을 들 수 있다.

화학수식제로서 시판품을 사용할 수도 있다. 시판되고 있는 화학수식제로는, 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기와 N-히드록시숙신이미드기를 갖는 선브라이트 VFM-4101, 선브라이트 MEAC-50HS 및 선브라이트 MEC-50HS (모두 니혼유시사 제조), 폴리알킬렌글리콜을 주성분으로 하는 기와 산무수물 구조를 갖는 선브라이트 AKM 시리즈 (예를 들어 선브라이트 AKM-1510 등), 선브라이트 ADM 시리즈 및 선브라이트 ACM 시리즈 (모두 니혼유시사 제조), 폴리에틸렌글리콜을 주성분으로 하는 기와 에폭시드기를 갖는 EPOX-3400 및 M-EPOX-5000 (모두 Sheawater Polymers사 제조), 킬레이트 기능을 갖는 기와 산무수물 구조를 갖는 디에틸렌트리아민-N,N,N',N",N"－펜타무수아세트산 (DTPA anhydride ; 도진가가쿠사 제조) 등을 들 수 있다.

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소의 화학수식 방법은 특별히 제한은 없고, 예를 들어 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소를 pH 8.0 이상의 완충액 (예를 들어HEPES 완충액) 에 용해하고, 0∼55℃ 에서 0.01∼500배 몰량의 화학수식제를 첨가하여 5분간∼5시간 교반함으로써 실시할 수 있다. 본 발명에 사용하는 화학적으로 수식된 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소로는, 이 반응액 자체, 필요에 따라 한외 여과막 등에 의해 미반응 화학수식제 등을 제거한 것도 사용할 수도 있다.

본 반응의 방법에 사용할 수 있는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소의 농도로는, 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 농도라면 특별히 제한은 없지만, 반응액 중에서 0.01∼200U/㎖ 의 농도인 것이 바람직하고, 0.02∼100U/㎖ 인 것이 보다 바람직하다.

본 발명에서의 콜레스테롤 산화 효소로는, 콜레스테롤을 산화시켜 과산화수소를 생성하는 능력을 갖는 효소라면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤 옥시다아제 외에 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 콜레스테롤 옥시다아제 등도 사용할 수 있으며, 콜레스테롤 옥시다아제 "Amano" 1 (CHOD1 ; 아마노엔자임사 제조), 콜레스테롤 옥시다아제 (CO-PE ; 깃코망사 제조), 콜레스테롤 옥시다아제 (COO321 ; 도요보세키사 제조) 등의 시판품을 사용할 수도 있다. 또한 본 발명에서는, 2종류 이상의 콜레스테롤 산화 효소를 조합해서 사용할 수도 있다.

콜레스테롤 산화 효소는 무수식 효소이어도 되고 화학적으로 수식된 효소 이어도 된다. 화학적으로 수식된 콜레스테롤 산화 효소는, 예를 들어 상기 서술한 화학수식제를 이용하여 상기 서술한 화학수식 방법에 의해 제작할 수 있다.

본 반응의 방법에 사용되는 콜레스테롤 산화 효소의 농도로는, 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 농도라면 특별히 제한은 없지만, 반응액 중에서 0.01∼200U/㎖ 의 농도인 것이 바람직하고, 0.02∼100U/㎖ 의 농도인 것이 보다 바람직하다.

본 발명에서의 콜레스테롤 탈수소 효소로는, 산화형 조효소의 존재 하에 콜레스테롤을 산화해서 환원형 조효소를 생성할 능력을 갖는 효소라면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜레스테롤 디히드로게나아제 외에 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 콜레스테롤 디히드로게나아제 등도 사용할 수 있다. 콜레스테롤 디히드로게나아제 "Amano" 5 (CHDH5 ; 아마노엔자임사 제조) 등의 시판품을 사용할 수도 있다. 또한 본 발명에서는, 2종류 이상의 콜레스테롤 탈수소 효소를 조합해서 사용할 수도 있다. 콜레스테롤 탈수소 효소는 무수식 효소이어도 되고 화학적으로 수식된 효소이어도 된다. 화학적으로 수식된 콜레스테롤 탈수소 효소는, 예를 들어 상기 서술한 화학수식제를 이용하여 상기 서술한 화학수식 방법에 의해 제작할 수 있다.

본 반응의 방법에 사용할 수 있는 콜레스테롤 탈수소 효소의 농도로는, 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 농도라면 특별히 제한은 없지만, 반응액 중에서 0.01∼200U/㎖ 의 농도인 것이 바람직하고, 0.02∼100U/㎖ 의 농도인 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 콜레스테롤 탈수소 효소를 사용한 측정법에서는, 산화형 조효소가 사용된다. 산화형 조효소로는, 예를 들어 NAD, NADP, 티오-NAD, 티오-NADP 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 알부민으로는, 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 알부민이라면 특별히 한정은 없고, 예를 들어 소, 말, 양, 인간 유래의 알부민 등을 들 수 있지만, 소 혈청 알부민 (BSA) 이 바람직하다. 또한 유전자 공학적인 수법에 의해 제조된 알부민도 사용할 수 있다. 본 발명에서는 2종류 이상의 알부민을 조합해서 사용할 수도 있다. 본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정에서의 알부민의 농도로는, 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 농도라면 특별히 제한은 없지만, 반응액 중의 농도가 0.001∼10% 인 것이 바람직하고, 0.01∼1% 가 보다 바람직하다.

본 발명에서 사용할 수 있는 폴리아니온으로는, 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 폴리아니온이라면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 덱스트란황산 혹은 그 염, 헤파린 혹은 그 염, 인텅스텐산 또는 그 염, 황산화시클로덱스트린 또는 그 염, 황산화올리고당 또는 그 염, 카라기난 등을 들 수 있지만, 덱스트란황산 혹은 그 염이 바람직하다. 덱스트란황산으로는, 예를 들어 분자량이 4만, 8만, 20만, 50만, 100만, 200만 등인 덱스트란황산을 들 수 있다. 황산화올리고당으로는, 예를 들어 황산화 아갈로스, 황산화 트레할로스, 콘드로이틴황산 등을 들 수 있다. 염으로는, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 리튬염, 암모늄염, 마그네슘염 등을 들 수 있다. 또한 본 발명에서는 폴리아니온을 2종 이상 사용해도 된다.

본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정에서의 폴리아니온의 농도로는, 본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정을 가능하게 하는 농도라면 특별히 제한은 없지만, 반응액 중의 농도가 0.001∼10% 인 것이 바람직하고, 0.01∼1% 가 보다 바람직하다.

본 발명에서 사용할 수 있는 비이온성 계면활성제로는, 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 비이온성 계면활성제라면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 폴리옥시에틸렌알킬아민, 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알케닐에테르, 폴리옥시에틸렌아릴에테르 유도체, 에틸렌디아민테트라폴리옥시알킬렌 등을 들 수 있다.

비이온성 계면활성제로는, 폴리옥시에틸렌알킬아민 및 폴리옥시에틸렌알케닐아민이 바람직하다.

폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민으로는, 예를 들어 일반식 (Ⅰ)

[식 중 R 은 직쇄 또는 분기 모양의 알킬기 또는 알케닐기를 나타내고, X 는 수소원자 또는 (CH₂CH₂O)_nH 를 나타내고, m 및 n 은 동일하거나 다르며, 1∼100 의 정수를 나타내고, m+n 은 2∼200 의 정수이다] 로 나타내는 화합물 [이하, 화합물 (Ⅰ) 이라 함] 을 들 수 있다.

폴리옥시에틸렌알킬아민, 화합물 (Ⅰ) 및 폴리옥시에틸렌알킬에테르에서의 알킬로는, 직쇄 또는 분지형인 탄소수 6∼30 의, 예를 들어 헥실, 헵틸, 옥틸, 이소옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실(라우릴), 트리데실, 테트라데실(미리스틸), 펜타데실, 헥사데실(세틸), 헵타데실, 옥타데실(스테아릴), 노나데실, 이코실, 헤네이코실, 도코실(베헤닐) 등을 들 수 있다.

폴리옥시에틸렌알케닐아민, 화합물 (Ⅰ) 및 폴리옥시에틸렌알케닐에테르에서의 알케닐로는, 직쇄 또는 분지형인 탄소수 6∼30 의, 예를 들어 헥세닐, 헵테닐, 옥테닐, 노네닐, 데세닐, 시트로네릴, 운데세닐, 도데세닐, 트리데세닐, 테트라데세닐, 펜타데세닐, 헥사데세닐, 헵타데세닐, 올레일, 노나데세닐, 에이코세닐, 헨에이코세닐, 도코세닐, 트리코세닐, 테트라코세닐, 펜타코세닐, 헥사코세닐, 헵타코세닐, 옥타코세닐, 노나코세닐, 트리아콘테닐 등을 들 수 있다.

폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민의 구체예 (제품) 로는, 예를 들어 나이민 L201 (옥시에틸렌도데실아민 ; 니혼유시사 제조), 나이민 L207 (폴리옥시에틸렌도데실아민 ; 니혼유시사 제조), 나이민 S204, 나이민 S210 (폴리옥시에틸렌옥타데실아민 ; 니혼유시사 제조), 뉴콜 OD420 (폴리옥시에틸렌옥타데실아민 ; 니혼뉴카자이사 제조), 파이오닌 D3104 (폴리옥시에틸렌라우릴아민 ; 다케모토유시사 제조), 파이오닌 D3110 (폴리옥시에틸렌라우릴아민 ; 다케모토유시사 제조), 파이오닌 D3605 [폴리옥시에틸렌알킬(대두)아민 ; 다케모토유시사 제조], 파이오닌 D3615T [폴리옥시에틸렌알킬(우지)아민 ; 다케모토유시사 제조], BLAUNON O209 (폴리옥시에틸렌오레일아미노에테르 ; 아오키유시사 제조) 등을 들 수 있다.

폴리옥시에틸렌알킬에테르 또는 폴리옥시에틸렌알케닐에테르의 구체예 (제품) 로는, 예를 들어 에말민 L90S (폴리옥시에틸렌라우릴에테르 ; 산요가세이사 제조), 뉴콜 1310 (폴리옥시에틸렌트리데실에테르 ; 니혼뉴카자이사 제조), BLAUNON-EN1520 (폴리옥시에틸렌올레일에테르 ; 아오키유시사 제조) 등을 들 수 있다.

폴리옥시에틸렌아릴에테르 유도체로는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌스티렌화페닐에테르, 폴리옥시알킬렌스티렌화페닐에테르, 폴리옥시에틸렌스티렌화메틸페닐에테르, 폴리옥시에틸렌스티릴페닐에테르 축합물, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르포름알데히드 축합물 등을 들 수 있다.

폴리옥시에틸렌아릴에테르 유도체의 구체예 (제품) 로는, 예를 들어 뉴콜 2604, 뉴콜 710 (모두 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 ; 니혼뉴카자이사 제조), 뉴콜 2608F (폴리옥시알킬렌 다환 페닐에테르 ; 니혼뉴카자이사 제조), 파이오닌 D6310, 파이오닌 D6320 (모두 폴리옥시에틸렌스티릴페닐에테르 축합물 ; 다케모토유시사 제조), 닛콜 R1020 (폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르포름알데히드 축합물 ; 닛코케미칼즈사 제조) 등을 들 수 있다.

에틸렌디아민테트라폴리옥시알킬렌으로는, 예를 들어 에틸렌디아민폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 축합물, 에틸렌디아민테트라폴리옥시에틸렌, 에틸렌디아민테트라폴리옥시프로필렌 등을 들 수 있다.

에틸렌디아민테트라폴리옥시알킬렌의 구체예 (제품) 로는, 예를 들어 아데카플루로닉 TR704, 아데카플루로닉 TR701, 아데카플루로닉 TR913R (모두 에틸렌디아민폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 축합물 ; 아사히덴카사 제조), 유니루브 32TY-65BI (에틸렌디아민테트라폴리옥시알킬렌 ; 니혼유시사 제조) 등을 들 수 있다.

폴리옥시에틸렌알킬아민, 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알케닐에테르, 폴리옥시에틸렌아릴에테르 유도체 및 에틸렌디아민테트라폴리옥시알킬렌에서의 옥시알킬렌쇄 (옥시에틸렌쇄 또는 옥시프로필렌쇄) 의 중합수는 바람직하게는 1∼100, 보다 바람직하게는 1∼60 이다.

폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르로는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌스티렌화페닐에테르 황산에스테르, 폴리옥시에틸렌벤질페닐에테르 황산에스테르 등을 들 수 있다.

폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르의 구체예 (제품) 로는, 예를 들어 뉴콜 707SF, 707SN, 714SF, 723SF, 740SF (모두 니혼뉴카자이사 제조) 등을 들 수 있다. 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르에서의 옥시에틸렌쇄의 중합수로는 1∼100 이 바람직하고, 5∼40 이 보다 바람직하다.

본 발명에서는 비이온성 계면활성제를 2종류 이상 사용해도 된다. 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정 방법에서의 비이온성 계면활성제의 농도로는, 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 농도라면 특별히 제한은 없지만, 반응액 중의 농도가 0.0001∼10% 인 것이 바람직하고, 0.001∼1% 가 보다 바람직하다.

본 발명에서의 담즙산 유도체로는, 예를 들어 음이온성 담즙산 유도체, 양성 담즙산 유도체, 비이온성 담즙산 유도체 등을 들 수 있지만, 음이온성 담즙산 유도체가 바람직하다.

음이온성 담즙산 유도체로는, 예를 들어 콜산 혹은 그 염, 타우로콜산 혹은 그 염, 글리콜산 혹은 그 염, 리토콜산 혹은 그 염, 디옥시콜산 혹은 그 염, 케노디옥시콜산 혹은 그 염, 우루소디옥시콜산 혹은 그 염, 7-옥소리토콜산 혹은 그 염, 12-옥소리토콜산 혹은 그 염, 12-옥소케노디옥시콜산 혹은 그 염, 7-옥소디옥시콜산 혹은 그 염, 히오콜산 혹은 그 염, 히오디옥시콜산 혹은 그 염, 디히드로콜산 혹은 그 염 등을 들 수 있다. 염으로는, 예를 들어 암모늄염, 리튬염, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염 등을 들 수 있다.

양성 담즙산 유도체로는, 예를 들어 일반식 (Ⅱ)

[식 중 R¹ 은, 3-(3-코라미드프로필)디메틸암모니오기이고, R² 는 수소원자 또는 수산기임] 로 나타내는 화합물 [이하, 화합물 (Ⅱ) 라 함] 등을 들 수 있다. 이하 R² 가 수소원자인 화합물 (Ⅱ) 를 CHAPS, R² 가 수산기인 화합물 (Ⅰ) 을 CHAPSO 라 부른다.

비이온성 담즙산 유도체로는, 예를 들어 일반식 (Ⅲ)

(X 는 수소원자 또는 수산기를 나타내고, R³ 및 R⁴ 는 동일하거나 다르며, 치환 혹은 비치환의 알킬 또는 치환 혹은 비치환의 알카노일을 나타낸다) 로 나타내는 화합물 [이하, 화합물 (Ⅲ) 이라 함] 등을 들 수 있다. 알킬, 알카노일에서의 알킬로는, 직쇄 또는 분기형인 탄소수 1∼10 의, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프렌, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등을 들 수 있다. 치환 알킬 및 치환 알카노일에서의 치환기로는, 예를 들어 수산기, 할로겐 원자 등을 들 수 있다. 할로겐 원자는 불소, 염소, 브롬, 요오드의 각 원자를 의미한다. 화합물 (Ⅲ) 중 R³ 및 R⁴ 가 함께

(이하, 치환기 A 라 함) 인 화합물이 바람직하다. 이하, X, R³ 및 R⁴ 가 각각 수소원자, 치환기 A 및 치환기 A 인 화합물을 deoxy-BIGCHAP, 수산기, 치환기 A 및 치환기 A 인 화합물을 BIGCHAP 라 한다.

담즙산 유도체의 농도로는, 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정을 가능하게 하는 농도라면 특별히 제한은 없지만, 반응액 중의 농도가 0.001∼10% 인 것이 바람직하고, 0.01∼1% 가 보다 바람직하다.

본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정 방법에서 사용되는 수성매체로서는, 예를 들어 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있는데, 완충액이 바람직하다.

완충액에 사용하는 완충제로는, 예를 들어 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충제, 인산 완충제, 붕산 완충제, 굿의 완충제 등을 들 수 있다.

굿의 완충제로는, 예를 들어 2-모르폴리노에탄술폰산(MES), 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄(Bis-Tris), N-(2-아세트아미드)이미노 2아세트산(ADA), 피페리진-N,N'－비스(2-에탄술폰산)(PIPES), N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산(ACES), 3-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산(MOPSO), N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산(BES), 3-모르폴리노프로판술폰산(MOPS), N-〔트리스(히드록시메틸)메틸〕-2-아미노에탄술폰산(TES), 2-〔4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐〕에탄술폰산(HEPES), 3-〔N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노〕-2-히드록시프로판술폰산(DIPSO), N-〔트리스(히드록시메틸)메틸〕-2-히드록시-3-아미노프로판술폰산(TAPSO), 피페라진-N,N'－비스(2-히드록시프로판술폰산)(POPSO), 3-〔4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐〕-2-히드록시프로판술폰산(HEPPSO), 3-〔4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐〕프로판술폰산〔(H)EPPS〕, N-〔트리스(히드록시메틸)메틸〕글리신(Tricine), N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신(Bicine), N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산(TAPS), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산(CHES), N-시클로헥실-3-아미노-2-히드록시프로판술폰산(CAPSO), N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산(CAPS) 등을 들 수 있다.

완충액의 농도는 측정에 알맞은 농도라면 특별히 제한은 되지 않지만, 0.001∼2.0mol/ℓ이 바람직하고, 0.005∼1.0mol/ℓ이 보다 바람직하다.

이하에, 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정 방법, 측정용 시약 및 측정용 키트를 구체적으로 설명한다.

(HDL 콜레스테롤의 측정 방법)

본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정 방법으로는, 예를 들어 이하의 양태의 방법을 들 수 있다.

측정 방법 1

(1) 검체와, ⅰ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 ⅱ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 비이온성 계면활성제, 폴리아니온 및 알부민을 함유하고 필요에 따라 안정화제, 방부제, 영향물질 소거제, 반응 촉진제 등을 함유하는 수성매체 중에서 반응시켜,

(2) 필요에 따라 과산화수소 측정용 시약 또는 환원형 조효소 측정 시약의 존재 하에, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하고,

(3) (2) 에서 측정한 값과, 미리 작성한 검량선으로부터 검체 중 HDL 콜레스테롤 농도를 산출함으로써, 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정할 수 있다.

측정 방법 2

(1) 검체와, ⅰ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 ⅱ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 비이온성 계면활성제, 폴리아니온, 알부민 및 담즙산 유도체를 함유하고 필요에 따라 안정화제, 방부제, 영향물질 소거제, 반응 촉진제 등을 함유하는 수성매체 중에서 반응시켜,

측정 방법 3

(1) 검체와, ⅰ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 ⅱ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민 및 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체를 함유하고 필요에 따라 폴리아니온, 알부민, 안정화제, 방부제, 영향물질 소거제, 반응 촉진제 등을 함유하는 수성매체 중에서 반응시켜,

측정 방법 4

(1)검체와, ⅰ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 ⅱ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 및 음이온성 담즙산 유도체를 함유하고 필요에 따라 폴리아니온, 알부민, 안정화제, 방부제, 영향물질 소거제, 반응 촉진제 등을 함유하는 수성매체 중에서 반응시켜,

수성매체로는, 예를 들어 상기 서술한 수성매체 등을 들 수 있다. 안정화제로는, 예를 들어 에틸렌디아민 4아세트산(EDTA), 슈 클로스, 염화칼슘 등을 들 수 있다. 방부제로는, 예를 들어 아지화나트륨, 항생물질 등을 들 수 있다. 영향물질 소거제로는, 예를 들어 아스코르브산의 영향을 소거하기 위한 아스코르브산 옥시다아제 등을 들 수 있다. 반응 촉진제로는, 예를 들어 코리파아제, 포스포리파아제 등의 효소, 황산나트륨, 염화나트륨 등의 염류 등을 들 수 있다.

본 측정법에서는, (1) 및 (2) 의 반응은 동일하거나 다른 조건 하, 동시 또는 순서대로 각각 예를 들어 10∼50℃ 에서, 바람직하게는 20∼40℃ 에서, 1∼60분간, 바람직하게는 2∼30분간 실시한다.

생성된 과산화수소의 양은, 예를 들어 과산화수소 측정용 시약에 의해 측정할 수 있다. 과산화수소 측정용 시약은, 생성된 과산화수소를 검출 가능한 물질로 변환하기 위한 시약이다. 검출 가능한 물질로는 예를 들어 색소, 발광 등을 들 수 있는데, 색소가 바람직하다. 검출 가능한 물질이 색소인 경우에는, 과산화수소 측정용 시약은 산화 발색형 색원체 및 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질을 함유한다. 산화 발색형 색원체로는, 예를 들어 후술하는 산화 발색형 색원체를 들 수 있다. 검출 가능한 물질이 발광인 경우에는, 과산화수소 측정용 시약은 화학 발광 물질을 함유한다. 화학 발광 물질로는, 예를 들어 루미놀, 이소루미놀, 루시게닌, 아크리디늄에스테르 등을 들 수 있다.

과산화수소 측정용 시약으로서, 산화 발색형 색원체 및 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질을 함유하는 시약을 사용할 경우에는, 과산화수소는 과산화 활성 물질의 존재 하에 산화 발색형 색원체와 반응하여 색소를 생성하고, 생성된 색소를 정량함으로써 과산화수소를 정량할 수 있다. 또한 화학 발광 물질을 함유하는 과산화수소 측정용 시약을 사용할 경우에는, 과산화수소는 화학 발광 물질과 반응해서 광자(photon)를 생성하고, 생성된 포톤을 정량함으로써 과산화수소를 정량할 수 있다.

산화 발색형 색원체로는, 예를 들어 류코형 색원체, 산화 커플링 발색형 색원체 등을 들 수 있다. 류코형 색원체는, 과산화수소 및 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질의 존재 하, 단독으로 색소로 변환되는 물질이다.

류코형 색원체로는, 예를 들어 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진(CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진(MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4－비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염(DA-64), 4,4'－비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스〔3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐〕아민(BCMA) 등을 들 수 있다.

산화 커플링 발색형 색원체는, 과산화수소 및 퍼옥시다제 등의 과산화 활성 물질의 존재 하, 2개의 화합물이 산화적 커플링하여 색소를 생성하는 물질이다. 2개의 화합물의 조합으로는, 커플러와 아닐린류의 조합, 커플러와 페놀류의 조합 등을 들 수 있다.

커플러로는, 예를 들어 4-아미노안티피린(4-AA), 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라진 등을 들 수 있다. 아닐린류로는, N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린(TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린(MAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린(TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-디-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민(EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린(F-DAOS) 등을 들 수 있다.

페놀류로는, 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀, 3-히드록시-2,4,6-트리요오드벤조산(HTIB) 등을 들 수 있다.

과산화수소의 측정에서, 과산화 활성 물질의 농도는 측정에 알맞은 농도라면 특별히 제한은 없지만, 과산화 활성 물질로서 퍼옥시다제를 사용하는 경우는, 1∼100kU/ℓ가 바람직하다. 또한 산화 발색형 색원체의 농도는, 측정에 알맞은 농도라면 특별히 제한은 없지만, 0.01∼10g/ℓ가 바람직하다.

환원형 조효소의 측정 방법으로는, 예를 들어 생성된 환원형 조효소의 흡광도를 측정하는 방법, 환원형 조효소 측정용 시약을 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 환원형 조효소의 흡광도를 측정하는 방법에서의 흡광도로는, 300∼500㎚ 가 바람직하고, 330∼400㎚ 가 보다 바람직하고, 340㎚ 부근이 특히 바람직하다. 환원형 조효소 측정용 시약은, 생성된 환원형 조효소를 검출 가능한 물질로 변환하기 위한 시약이다. 검출 가능한 물질로는, 예를 들어 색소 등을 들 수 있다. 검출 가능한 물질이 색소인 경우의 환원형 조효소 측정용 시약으로는, 예를 들어 디아포라아제, 전자 캐리어 및 환원 발색형 색원체를 함유하는 시약을 들 수 있다. 전자 캐리어로는, 예를 들어 1-메톡시-5-메틸페나듐메틸술페이트 등을 들 수 있다. 환원형 조효소 측정용 시약으로서, 디아포라아제, 전자 캐리어 및 환원 발색형 색원체를 함유하는 시약을 사용할 경우에는, 환원 발색형 색원체가 변환되어 생성된 색소를 정량함으로써 환원형 조효소를 정량할 수 있다.

환원 발색형 색원체로는, 예를 들어 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨브로미드(MTT), 2-(4-요드페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨모노나트륨염(WST-1), 2-(4-요드페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨모노나트륨염(WST-3) 등을 들 수 있다.

(HDL 콜레스테롤 측정용 시약)

본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약으로는, 예를 들어 이하의 양태의 시약을 들 수 있다.

시약 1

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 비이온성 계면활성제, 폴리아니온, 알부민 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

시약 2

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 비이온성 계면활성제, 폴리아니온, 알부민, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

시약 3

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 비이온성 계면활성제, 폴리아니온, 알부민 및 산화형 조효소를 함유하는 시약.

시약 4

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 비이온성 계면활성제, 폴리아니온, 알부민, 담즙산 유도체 및 산화형 조효소를 함유하는 시약.

시약 5

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 비이온성 계면활성제, 폴리아니온, 알부민, 산화형 조효소 및 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 시약.

시약 6

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 비이온성 계면활성제, 폴리아니온, 알부민, 담즙산 유도체, 산화형 조효소 및 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 시약.

시약 7

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

시약 8

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 음이온성 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

시약 9

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르, 음이온성 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

시약 10

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 및 산화형 조효소를 함유하는 시약.

시약 11

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 음이온성 담즙산 유도체 및 산화형 조효소를 함유하는 시약.

시약 12

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르, 음이온성 담즙산 유도체 및 산화형 조효소를 함유하는 시약.

시약 13

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르, 산화형 조효소 및 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 시약.

시약 14

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 음이온성 담즙산 유도체, 산화형 조효소 및 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 시약.

시약 15

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르, 음이온성 담즙산 유도체, 산화형 조효소 및 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 시약.

본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약에서는, 상기 서술한 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정 방법에서 든 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 비이온성 계면활성제, 폴리아니온, 알부민, 담즙산 유도체, 과산화수소 측정용 시약, 산화형 조효소, 환원형 조효소 측정용 시약을 사용할 수 있다.

(HDL 콜레스테롤 측정용 키트)

본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약은, 키트의 형태로 보존, 유통 및 사용되어도 된다. 키트의 형태로는 특별히 제한은 없고, 2 시약계, 3 시약계 등 모두 되지만, 2 시약계가 바람직하다.

제 1 시약과 제 2 시약으로 이루어지는 2 시약계의 HDL 콜레스테롤 측정용 키트에서는, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소와, 콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소는, 제 1 시약과 제 2 시약에 따로 함유되어도 되고 제 2 시약에 함께 함유되어도 되지만, 제 1 시약과 제 2 시약에 각각 함유될 경우에는 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소가 제 1 시약에, 콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소가 제 2 시약에 함유되는 양태가 바람직하다. 폴리아니온은, 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유되어도 되지만, 제 1 시약에 함유되는 것이 바람직하다. 비이온성 계면활성제 및 알부민은, 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유되어도 된다. 콜레스테롤 탈수소 효소를 사용한 측정법에서 사용되는 산화형 조효소는, 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유되어도 된다.

과산화수소 측정용 시약은 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유되어도 되지만, 그 시약이 산화 커플링형 색원체를 함유할 경우에는, 산화 커플링형 색원체의 각각의 화합물은 각각의 시약에 함유되는 양태가 바람직하다. 환원형 조효소 측정용 시약은, 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유되어도 된다. 또한 담즙산 유도체는 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유되어도 된다.

본 발명의 키트는 예를 들어 하기의 양태인 것을 들 수 있다.

제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 키트이며, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 폴리아니온, 비이온성 계면활성제, 알부민 및 과산화수소 측정 시약, 필요에 따라 담즙산 유도체, 안정화제, 방부제, 영향물질 소거제 각각을 임의로 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하고, 콜레스테롤 산화 효소를 제 2 시약에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.

폴리아니온을 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 비이온성 계면활성제, 알부민 및 과산화수소 측정 시약, 필요에 따라 담즙산 유도체, 안정화제, 방부제, 영향물질 소거제 각각을 임의로 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.

제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 키트이며, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 폴리아니온, 비이온성 계면활성제, 알부민 및 산화형 조효소, 필요에 따라 환원형 조효소 측정용 시약, 담즙산 유도체, 안정화제, 방부제, 영향물질 소거제 각각을 임의로 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하고, 콜레스테롤 탈수소 효소를 제 2 시약에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.

폴리아니온을 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 비이온성 계면활성제, 알부민 및 산화형 조효소, 필요에 따라 환원형 조효소 측정용 시약, 담즙산 유도체, 안정화제, 방부제, 영향물질 소거제 각각을 임의로 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.

제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 키트이며, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정 시약, 필요에 따라 폴리아니온, 알부민, 안정화제, 방부제 및 영향물질 소거제 각각을 임의로 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하고, 콜레스테롤 산화 효소를 제 2 시약에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.

제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 키트이며, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체 및 산화형 조효소, 필요에 따라 환원형 조효소 측정용 시약, 폴리아니온, 알부민, 안정화제, 방부제 및 영향물질 소거제 각각을 임의로 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하고, 콜레스테롤 탈수소 효소를 제 2 시약에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.

보다 구체적으로는, 예를 들어 이하의 양태의 키트를 들 수 있지만, 이들은 본 발명의 범위를 조금도 한정하는 것은 아니다.

키트 1

제 1 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 폴리아니온, 알부민, 비이온성 계면활성제 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

제 2 시약

콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

키트 2

제 1 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 폴리아니온, 알부민, 비이온성 계면활성제, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

제 2 시약

키트 3

제 1 시약

제 2 시약

콜레스테롤 산화 효소, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

키트 4

제 1 시약

폴리아니온, 알부민, 비이온성 계면활성제 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

제 2 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

키트 5

제 1 시약

폴리아니온, 알부민, 비이온성 계면활성제, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

제 2 시약

키트 6

제 1 시약

제 2 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

키트 7

제 1 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 폴리아니온, 알부민 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 시약.

제 2 시약

콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 조효소를 함유하는 시약.

키트 8

제 1 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 폴리아니온, 알부민, 비이온성 계면활성제 및 담즙산 유도체를 함유하는 시약.

제 2 시약

키트 9

제 1 시약

제 2 시약

콜레스테롤 탈수소 효소, 담즙산 유도체 및 산화형 조효소를 함유하는 시약.

키트 10

제 1 시약

제 2 시약

콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 조효소 및 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 시약.

키트 11

제 1 시약

제 2 시약

키트 12

제 1 시약

제 2 시약

콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 조효소, 담즙산 유도체 및 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 시약.

키트 13

제 1 시약

폴리아니온, 알부민 및 비이온성 계면활성제를 함유하는 시약.

제 2 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 조효소를 함유하는 시약.

키트 14

제 1 시약

폴리아니온, 알부민, 비이온성 계면활성제를 함유하는 시약.

제 2 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 조효소 및 담즙산 유도체를 함유하는 시약.

키트 15

제 1 시약

폴리아니온, 알부민, 비이온성 계면활성제 및 담즙산 유도체를 함유하는 시약.

제 2 시약

키트 16

제 1 시약

제 2 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 조효소 및 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 시약.

키트 17

제 1 시약

제 2 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 조효소, 환원형 조효소 측정용 시약 및 담즙산 유도체를 함유하는 시약.

키트 18

제 1 시약

제 2 시약

키트 19

제 1 시약

폴리아니온, 알부민 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

제 2 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 비이온성 계면활성제 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

키트 20

제 1 시약

폴리아니온, 알부민, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

제 2 시약

키트 21

제 1 시약

제 2 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 비이온성 계면활성제, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

키트 22

제 1 시약

폴리아니온 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

제 2 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 알부민, 비이온성 계면활성제 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

키트 23

제 1 시약

폴리아니온, 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

제 2 시약

키트 24

제 1 시약

폴리아니온 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

제 2 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 알부민, 비이온성 계면활성제, 담즙산 유도체 및 과산화수소용 측정 시약을 함유하는 시약.

키트 25

제 1 시약

음이온성 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

제 2 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

키트 26

제 1 시약

과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

제 2 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 음이온성 담즙산 유도체, 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

키트 27

제 1 시약

폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

제 2 시약

키트 28

제 1 시약

과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

제 2 시약

콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르, 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.

본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 키트에서는, 상기 서술한 본 발명의 HDL 콜레스테롤의 측정 방법에서 든 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 비이온성 계면활성제, 폴리아니온, 알부민, 담즙산 유도체, 과산화수소 측정용 시약, 산화형 조효소, 환원형 조효소 측정용 시약을 사용할 수 있다.

본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약 및 측정용 키트에는, 필요에 따라 상기 서술한 수성매체, 안정화제, 방부제, 영향물질 소거제, 반응 촉진제 등이 함유되어도 된다.

본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약 및 측정용 키트는, 동결건조된 상태이어도 되고 수성매체에 용해된 상태이어도 된다. 동결건조된 상태의 시약을 이용하여 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정할 경우에는, 그 시약은 수성매체에 용해하여 사용된다.

본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약 및 측정용 키트에서의 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소의 함량으로는, 수성매체에서 용해된 상태에서의 농도가 0.01∼800U/㎖ 가 되는 함량이 바람직하고, 0.02∼400U/㎖ 가 되는 함량이 보다 바람직하다. 본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약 및 측정용 키트에서의 비이온성 계면활성제의 함량으로는, 수성매체에서 용해된 상태에서의 농도가 0.0001∼10% 가 되는 함량이 바람직하고, 0.001∼5% 가 되는 함량이 보다 바람직하다. 본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약 및 측정용 키트에서의 폴리아니온의 함량으로는, 수성매체에서 용해된 상태에서의 농도가 0.001∼10% 가 되는 함량이 바람직하고, 0.01∼5% 가 되는 함량이 보다 바람직하다.

본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약 및 측정용 키트에서의 알부민의 함량으로는, 수성매체에서 용해된 상태에서의 농도가 0.001∼10% 가 되는 함량이 바람직하고, 0.01∼5% 가 되는 함량이 보다 바람직하다. 본 발명의 HDL 콜레스테롤 측정용 시약 및 측정용 키트에서의 담즙산 유도체의 함량으로는, 수성매체에서 용해된 상태에서의 농도가 0.001∼10% 가 되는 함량이 바람직하고, 0.01∼5% 가 되는 함량이 보다 바람직하다.

이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하는데, 이들은 본 발명의 범위를 조금도 한정하는 것은 아니다. 또한 본 실시예에서는 하기 제조사의 시약 및 효소를 사용하였다.

HEPES (BDH Laboratory사 제조), EMSE (다이토케믹스사 제조), 덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) (파르마시아사 제조), 덱스트란황산나트륨 (분자량 8만) (ICN사 제조), ι-카라기난 (쥰세이가가쿠사 제조), 헤파린리튬 (와코쥰야쿠사 제조), 인텅스텐산나트륨 (간토가가쿠사 제조), 소 혈청 알부민 (BSA ; 오리엔탈사 제조), 4-아미노안티피린 (사이쿄가세이사 제조), 퍼옥시다아제 (도요보세키사 제조), LPL311 (콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 ; 도요보세키사 제조), COO321 (콜레스테롤 옥시다아제 ; 도요보세키사 제조), LPL6 (콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 ; 아마노엔자임사 제조), 나이민 L207 (폴리옥시에틸렌도데실아민 ; 니혼유시사 제조), 나이민 S204 (폴리옥시에틸렌옥타데실아민 ; 니혼유시사 제조), 나이민 S210 (폴리옥시에틸렌옥타데실아민 ; 니혼유시사 제조), 뉴콜 OD420 (폴리옥시에틸렌옥타데실아민 ; 니혼뉴카자이사 제조), 파이오닌 D3104 (폴리옥시에틸렌라우릴아민 ; 다케모토유시사 제조), 파이오닌 D3110 (폴리옥시에틸렌라우릴아민 ; 다케모토유시사 제조), 파이오닌 D3605 [폴리옥시에틸렌알킬(대두)아민 ; 다케모토유시사 제조], 뉴콜 2608F (폴리옥시알킬렌 다환 페닐에테르 ; 니혼뉴카자이사 제조), 닛콜 R1020 (폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르포름알데히드 축합물 ; 닛코케미칼즈사 제조), 아데카플루로닉 TR704 (에틸렌디아민 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 축합물 ; 아사히덴카사 제조), 에말민 L90S (폴리옥시에틸렌라우릴에테르 ; 산요가세이사 제조), 콜산나트륨 (ACROS사 제조), 타우로콜산나트륨 (도쿄가세이사 제조), 글리콜산나트륨 (도쿄가세이사 제조), 뉴콜 740-SF, 뉴콜 707-SF (모두 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 염 ; 니혼뉴카자이사 제조).

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

참고예 1 화학수식 LPL311 (화학적으로 수식된 LPL311) 의 조제

HEPES 완충액 (pH 8.5, 0.15mol/ℓ) 에 LPL311 을 33g/ℓ가 되도록 첨가해 5℃로 냉각한 후, 선브라이트 VFM-4101 (니혼유시사 제조) 을 330g/ℓ가 되도록 더하고 다시 3시간 반응시켰다. 얻어진 수식 효소 용액을 정제 분리하지 않고 그대로 화학수식 LPL311 로서 사용하였다.

실시예 1 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 HDL 콜레스테롤 측정용 키트를 조제하였다.

제 1 시약 (시약 A)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

나이민 L207 0.07g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 2 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 A)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

나이민 L207 0.07g/ℓ

제 2 시약 (시약 b)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 3 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 A)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

나이민 L207 0.07g/ℓ

제 2 시약 (시약 c)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

콜산나트륨 6.0g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 4 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 A)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

나이민 L207 0.07g/ℓ

제 2 시약 (시약 d)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

콜산나트륨 6.0g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 1 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 B)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 2 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 C)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 3 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 D)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

나이민 L207 0.07g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 4 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 E)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 5 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 F)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

나이민 L207 0.07g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 6 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 G)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

나이민 L207 0.07g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 5 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트를 이용하여 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40검체 중의 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

(1) 검량선의 작성

표준액으로서 생리식염수 (HDL 콜레스테롤 농도 : 0.0㎎/㎗) 및 혈청 (HDL 콜레스테롤 농도 : 60.0㎎/㎗) 을, 키트로서 실시예 1 의 키트를 이용하여, 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 HDL 콜레스테롤 농도와 「흡광도」사이의 관계를 나타내는 검량선을 작성하였다.

여기에서 「흡광도」란, 이하의 반응에서 측정된 2개의 흡광도 (E1 및 E2) 를 기준으로 E2 에서 E1 을 뺌으로써 얻어진 값을 나타낸다.

반응셀에 표준액 (3㎕) 과 제 1 시약 (0.24㎖) 을 첨가해 37℃ 로 5분간 가온하고, 반응액의 흡광도 (E1) 를 주파장 600㎚, 부파장 700㎚ 로 측정하고, 다음에 이 반응액에 제 2 시약 (0.08㎖) 을 첨가하여 다시 37℃ 로 5분간 가온하고, 반응액의 흡광도 (E2) 를 주파장 600㎚, 부파장 700㎚ 로 측정하였다.

(2) 인간 혈청 검체와 실시예 1 의 키트의 반응에 의한 그 검체에서의 「흡광도」 산출

(1) 의 검량선의 작성에서 사용한 표준액 대신에 인간 혈청 검체를 사용하는 것 이외에는, (1) 의 「흡광도」의 산출 방법과 동일한 방법에 의해 그 검체에서의 「흡광도」를 산출하였다.

(3) 인간 혈청 검체 중 HDL 콜레스테롤 농도의 측정

(2) 에서 산출한 「흡광도」와 (1) 에서 작성한 검량선으로부터 각 검체 중 HDL 콜레스테롤 농도를 측정하였다.

실시예 6 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 2 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 7 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 3 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 8 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 4 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 7 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 1 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 8 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 2 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 9 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 3 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 10 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 4 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 11 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 5 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 12 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 6 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

다음에 실시예 5∼8 및 비교예 7∼12 의 측정에서 사용한 인간 혈청 40 검체를 이용하여 클리니컬 케미스트리 제45권, 10호(1999년) 에 기재된 DCM 법 (Designated Comparison Method) 에 의해 그 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하여 각 실시예 및 비교예에서의 값과 비교하였다.

실시예 5∼8 및 비교예 7∼12 각각의 측정법과 DCM 법에 의한 측정법의 상관계수를 표 1 에 나타낸다.

측정법	측정 키트		상관계수
측정법	제 1 시약	제 2 시약	상관계수
실시예 5	시약 A	시약 a	0.960
실시예 6	시약 A	시약 b	0.958
실시예 7	시약 A	시약 c	0.983
실시예 8	시약 A	시약 d	0.996
비교예 7	시약 B	시약 a	0.590
비교예 8	시약 C	시약 a	0.385
비교예 9	시약 D	시약 a	0.388
비교예 10	시약 E	시약 a	0.800
비교예 11	시약 F	시약 a	0.405
비교예 12	시약 G	시약 a	0.118

실시예 5 와 비교예 7∼12 의 비교에 의해, 콜레스테롤 측정용 효소 이외에 BSA, 덱스트란황산나트륨 및 폴리옥시에틸렌알킬아민을 전부 함유하는 키트를 사용한 측정에서만 DCM 법에 의한 측정과 양호한 상관계수가 얻어지는 것이 판명되었다. 실시예 5 와 실시예 6 의 비교에 의해, 화학적으로 수식된 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소를 사용한 측정에서도 DCM 법에 의한 측정과 양호한 상관계수가 얻어지는 것이 판명되었다. 또한 실시예 5 와 실시예 7 의 비교, 실시예 6 과 실시예 8 의 비교에 의해, 콜레스테롤 측정용 효소, BSA, 덱스트란황산나트륨, 폴리옥시에틸렌알킬아민 이외에 담즙산 유도체의 하나인 콜산나트륨을 첨가한 키트를 사용한 측정에서도 DCM 법에 의한 측정과 양호한 상관이 인정되었다.

실시예 9 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 H)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 8만) 0.5g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

나이민 L207 0.07g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 10 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 I)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

ι-카라기난 0.5g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

나이민 L207 0.07g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 11 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 J)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

헤파린리튬 0.5g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

나이민 L207 0.07g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 12 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 K)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

인텅스텐산나트륨 0.5g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

나이민 L207 0.07g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 13 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 9 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 14 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 10 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 15 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 11 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 16 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 12 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 13∼16 각각의 측정법과 DCM 법에 의한 측정법의 상관계수를 표 2 에 나타낸다.

측정법	측정 키트		상관계수
측정법	제 1 시약	제 2 시약	상관계수
실시예 13	시약 H	시약 a	0.995
실시예 14	시약 I	시약 a	0.988
실시예 15	시약 J	시약 a	0.986
실시예 16	시약 K	시약 a	0.983

실시예 5 와 실시예 13∼16 의 비교에 의해, 덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 이외의 폴리아니온을 사용한 경우에서도 DCM 법의 측정에 대하여 양호한 상관계수가 얻어지는 것이 판명되었다.

실시예 17 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 L)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

뉴콜 OD420 0.05g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 18 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 M)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

파이오닌 D3605 0.01g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 19 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 N)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

에말민 L90S 0.05g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 20 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 O)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

뉴콜 2608F 0.2g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 21 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 P)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

닛콜 R1020 0.2g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 22 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 Q)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

아데카플루로닉 TR704 1.5g/ℓ

제 2 시약 (시약 a)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

LPL6 0.05kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 23 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 Q)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

아데카플루로닉 TR704 1.5g/ℓ

제 2 시약 (시약 b)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 24 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 17 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 25 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 18 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 26 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 19 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 27 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 20 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 28 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 21 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 29 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 22 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 30 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 23 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 24∼30 각각의 측정법과 DCM 법에 의한 측정법의 상관계수를 표 3 에 나타낸다.

측정법	측정 키트		상관계수
측정법	제 1 시약	제 2 시약	상관계수
실시예 24	시약 L	시약 a	0.984
실시예 25	시약 M	시약 a	0.909
실시예 26	시약 N	시약 a	0.934
실시예 27	시약 O	시약 a	0.952
실시예 28	시약 P	시약 a	0.949
실시예 29	시약 Q	시약 a	0.913
실시예 30	시약 Q	시약 b	0.993

실시예 5 와 동일하게 나이민 L207 (폴리옥시에틸렌도데실아민) 이외의 비이온성 계면활성제를 사용한 경우에도 DCM 법의 측정에 대하여 양호한 상관계수가 얻어지는 것이 판명되었다. 또한 실시예 29 와 실시예 30 의 비교에 의해, 화학적으로 수식된 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소를 사용한 측정에서도 DCM 법에 의한 측정과 양호한 상관계수가 얻어지는 것이 판명되었다

실시예 31 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 R)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

타우로콜산나트륨 2.7g/ℓ

제 2 시약 (시약 e)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

파이오닌 D3104 0.05g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 32 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 R)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

타우로콜산나트륨 2.7g/ℓ

제 2 시약 (시약 f)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

나이민 S204 0.05g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 33 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 R)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

타우로콜산나트륨 2.7g/ℓ

제 2 시약 (시약 g)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

나이민 S210 0.05g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 34 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 S)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

콜산나트륨 2.0g/ℓ

제 2 시약 (시약 g)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

나이민 S210 0.05g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 35 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 T)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

글리콜산나트륨 2.4g/ℓ

제 2 시약 (시약 g)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

나이민 S210 0.05g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 36 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 D)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

나이민 L207 0.07g/ℓ

제 2 시약 (시약 d)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

콜산나트륨 6.0g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 37 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 F)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

나이민 L207 0.07g/ℓ

제 2 시약 (시약 d)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

콜산나트륨 6.0g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 38 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 G)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

나이민 L207 0.07g/ℓ

제 2 시약 (시약 d)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

콜산나트륨 6.0g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 13 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 R)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

타우로콜산나트륨 2.7g/ℓ

제 2 시약 (시약 b)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 14 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 S)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

콜산나트륨 2.0g/ℓ

제 2 시약 (시약 b)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 15 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 T)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

글리콜산나트륨 2.4g/ℓ

제 2 시약 (시약 b)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 16 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 U)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

제 2 시약 (시약 e)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

파이오닌 D3104 0.05g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 17 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 U)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

제 2 시약 (시약 f)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

나이민 S204 0.05g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 18 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 U)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

제 2 시약 (시약 g)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

나이민 S210 0.05g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 39 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 31 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 40 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 32 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 41 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 33 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 42 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 34 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 43 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 35 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 44 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 36 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 45 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 37 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 46 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 38 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 19 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 13 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 20 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 14 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 21 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 15 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 22 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 16 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 23 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 17 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 24 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 18 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 39∼46 및 비교예 19∼24 각각의 측정법과 DCM 법에 의한 측정법의 상관계수를 표 4 에 나타낸다.

측정법	측정 키트		상관계수
측정법	제 1 시약	제 2 시약	상관계수
실시예 39	시약 R	시약 e	0.992
실시예 40	시약 R	시약 f	0.986
실시예 41	시약 R	시약 g	0.994
실시예 42	시약 S	시약 g	0.994
실시예 43	시약 T	시약 g	0.993
실시예 44	시약 D	시약 d	0.978
실시예 45	시약 F	시약 d	0.988
실시예 46	시약 G	시약 d	0.984
비교예 19	시약 R	시약 b	0.967
비교예 20	시약 S	시약 b	0.975
비교예 21	시약 T	시약 b	0.976
비교예 22	시약 U	시약 e	0.634
비교예 23	시약 U	시약 f	0.665
비교예 24	시약 U	시약 g	0.884

실시예 39∼43 과 비교예 19∼24 의 비교에 의해, 아니온성 담즙산 유도체 혹은 폴리옥시에틸렌알킬아민만 함유한 키트의 측정보다도 양쪽 화합물을 함유한 키트의 측정이 DCM 법에 의한 상관계수가 양호한 것이 판명되었다. 또한 실시예 44 와 실시예 45∼46 의 비교에 의해, 콜레스테롤 측정용 효소, 아니온성 담즙산 유도체, 폴리옥시에틸렌알킬아민 이외에 덱스트란황산 또는 알부민을 첨가한 키트를 사용한 측정에서도 DCM 법에 의한 측정과 양호한 상관이 인정되었다.

실시예 47 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 V)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

뉴콜 740SF 0.5g/ℓ

제 2 시약 (시약 h)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

파이오닌 D3110 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 48 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 W)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

뉴콜 707SF 0.5g/ℓ

제 2 시약 (시약 i)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

나이민 L207 0.1g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 49 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 W)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

뉴콜 707SF 0.5g/ℓ

제 2 시약 (시약 h)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

파이오닌 D3110 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 50 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 X)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

뉴콜 707SF 0.5g/ℓ

제 2 시약 (시약 h)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

파이오닌 D3110 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 51 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 Y)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

뉴콜 707SF 0.5g/ℓ

제 2 시약 (시약 h)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

파이오닌 D3110 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 52 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 Z)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

덱스트란황산나트륨 (분자량 50만) 1.0g/ℓ

BSA 2.0g/ℓ

뉴콜 707SF 0.5g/ℓ

제 2 시약 (시약 h)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

파이오닌 D3110 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 25 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 V)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

뉴콜 740SF 0.5g/ℓ

제 2 시약 (시약 b)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 26 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 W)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

뉴콜 707SF 0.5g/ℓ

제 2 시약 (시약 b)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

비교예 27 HDL 콜레스테롤 측정용 키트

제 1 시약 (시약 U)

HEPES (pH 7.5) 10mmol/ℓ

EMSE 0.3g/ℓ

제 2 시약 (시약 h)

HEPES (pH 7.0) 10mmol/ℓ

4-아미노안티피린 0.3g/ℓ

파이오닌 D3110 0.3g/ℓ

퍼옥시다아제 20kU/ℓ

화학수식 LPL311 0.2kU/ℓ

COO321 3.0kU/ℓ

실시예 53 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 47 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 54 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 48 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 55 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 49 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 56 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 50 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 57 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 51 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 58 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 실시예 52 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 28 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 25 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 29 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 26 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

비교예 30 HDL 콜레스테롤의 측정

실시예 1 의 키트 대신에 비교예 27 의 키트를 사용하는 것 이외에는, 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 인간 혈청 40 검체 중 HDL 콜레스테롤을 측정하였다.

실시예 53∼58 및 비교예 28∼30 각각의 측정법과 DCM 법에 의한 측정법의 상관계수를 표 5 에 나타낸다.

측정법	측정 키트		상관계수
측정법	제 1 시약	제 2 시약	상관계수
실시예 53	시약 V	시약 h	0.974
실시예 54	시약 W	시약 i	0.981
실시예 55	시약 W	시약 h	0.985
실시예 56	시약 X	시약 h	0.981
실시예 57	시약 Y	시약 h	0.990
실시예 58	시약 Z	시약 h	0.998
비교예 28	시약 V	시약 b	0.201
비교예 29	시약 W	시약 b	0.875
비교예 30	시약 U	시약 h	0.852

실시예 53∼55 와 비교예 28∼30 의 비교에 의해, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐 황산에스테르 혹은 폴리옥시에틸렌알킬아민만 함유한 키트의 측정보다도 양쪽 화합물을 함유한 키트의 측정쪽이 DCM 법에 의한 상관계수가 양호한 것이 판명되었다. 또한 실시예 55 와 실시예 56∼58 의 비교에 의해, 콜레스테롤 측정용 효소, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐 황산에스테르, 폴리옥시에틸렌알킬아민 이외에 덱스트란황산 및/또는 알부민을 가한 키트를 사용한 측정에서도 DCM 법에 의한 측정과 양호한 상관이 인정되었다.

실시예 59 M 단백혈증 환자 유래의 혈청 중 HDL 콜레스테롤의 측정

검체로서 M 단백혈증 환자에게서 얻은 혈청을 사용하고, 측정용 키트로서 실시예 1 의 키트를 이용하여 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 HDL 콜레스테롤을 측정하였다. 시료에 제 1 시약을 첨가해 5분간 반응시킨 후의 흡광도, 즉 제 2 시약 첨가전의 반응액의 흡광도 (E1) 값을 표 6 에, HDL 콜레스테롤의 측정치를 표 7 에 나타낸다. 또한 비교로서 그 M 단백혈증 환자 유래의 혈청을 DCM 법에 의해 측정하였을 때의 측정치도 표 7 에 나타낸다.

비교예 31 M 단백혈증 환자 유래의 혈청 중 HDL 콜레스테롤의 측정

검체로서 M 단백혈증 환자에서 얻은 혈청을 사용하고, 측정용 키트로서 비교예 5 의 키트를 이용하여 실시예 5 의 측정법과 동일한 방법으로 히타치 7170형 자동분석장치에 의해 HDL 콜레스테롤을 측정하였다. 시료에 제 1 시약을 첨가해 5분간 반응시킨 후의 흡광도, 즉 제 2 시약 첨가전의 반응액의 흡광도 (E1) 값을 표 6 에, HDL 콜레스테롤의 측정치를 표 7 에 나타낸다.

검체	제 2 시약 첨가전의 흡광도 (E1) (mAbs)
검체	실시예 59	비교예 31
M 단백혈증 검체 1	15.7	236.4
M 단백혈증 검체 2	12.2	189.5
M 단백혈증 검체 3	9.8	105.2
일반 검체	6.2	6.1

표 6 에 나타내는 바와 같이 비교예 5 의 측정 키트를 사용한 경우에는 제 2 시약이 첨가되기 전에서도 수불용성 단백질에 기인하는 탁함이 해소되지 않았지만, 덱스트란황산나트륨을 함유하는 실시예 1 의 측정 키트를 사용한 경우에는 제 2 시약이 첨가되기 전에는 수불용성 단백질에 기인하는 탁함이 해소되어 있는 것이 판명되었다.

검체	측정치 (㎎/㎗)
검체	실시예 59	비교예 31	DCM 법
M 단백혈증 검체 1	28.2	47.3	31.2
M 단백혈증 검체 2	15.5	9.5	16.0
M 단백혈증 검체 3	22.8	26.1	22.8
일반 검체	66.2	57.6	68.8

표 7 에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 의 키트를 사용한 측정 (실시예 59) 에서의 측정치는 DCM 법에서의 측정치와 거의 일치했지만, 비교예 5 의 키트를 사용한 측정 (비교예 31) 에서의 측정치는 실시예 59 의 방법이나 DCM 법에서의 측정치와는 크게 달라, 정확한 측정을 반영하는 것은 아니었다. 이렇게 본 발명의 키트를 사용함으로써 M 단백혈증 환자 검체 중 HDL 콜레스테롤도 정확하게 측정할 수 있다는 것이 분명해졌다.

본 발명에 의해, 간편하고 정확한 측정을 할 수 있는 HDL 콜레스테롤의 측정 방법, 측정용 시약 및 측정용 키트가 제공된다.

Claims

검체와, ⅰ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 ⅱ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 비이온성 계면활성제, 폴리아니온 및 알부민을 함유하는 수성매체 중에서 반응시켜, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 측정 방법.
제 1 항에 있어서, 수성매체가 담즙산 유도체를 함유하는 방법.
제 2 항에 있어서, 담즙산 유도체가 음이온성 담즙산 유도체인 측정 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 비이온성 계면활성제가, 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민인 측정 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아니온이 덱스트란황산 또는 그 염인 측정 방법.
비이온성 계면활성제, 폴리아니온, 알부민, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
비이온성 계면활성제, 폴리아니온, 알부민, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 조효소를 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
제 7 항에 있어서, 추가로 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 담즙산 유도체를 함유하는 시약.
제 9 항에 있어서, 담즙산 유도체가 음이온성 담즙산 유도체인 시약.
제 6 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민인 시약.
제 6 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아니온이 덱스트란황산 또는 그 염인 시약.
제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 키트이며, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 폴리아니온, 비이온성 계면활성제, 알부민 및 과산화수소 측정 시약을 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하고, 콜레스테롤 산화 효소를 제 2 시약에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
폴리아니온을 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 비이온성 계면활성제, 알부민 및 과산화수소 측정 시약을 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 2 시약과, 폴리아니온, 비이온성 계면활성제, 알부민 및 산화형 조효소를 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
폴리아니온을 함유하는 제 1 시약과, 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 비이온성 계면활성제, 알부민 및 산화형 조효소를 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 추가로 환원형 조효소 측정용 시약을, 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 키트.
제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 담즙산 유도체를 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하는 키트.
제 18 항에 있어서, 담즙산 유도체가 음이온성 담즙산 유도체인 키트.
제 13 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리옥시에틸렌알킬아민 또는 폴리옥시에틸렌알케닐아민인 키트.
제 13 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아니온이 덱스트란황산 또는 그 염인 키트.
검체와, ⅰ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 ⅱ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, ⅰ) 비이온성 계면활성제, 폴리아니온 및 알부민, 또는 ⅱ) 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민 및 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체를 함유하는 수성매체 중에서 반응시켜, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 측정 방법.
검체와, ⅰ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소, 또는 ⅱ) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를, 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민 및 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체를 함유하는 수성매체 중에서 반응시켜, 생성된 과산화수소 또는 환원형 조효소를 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 측정 방법.
제 23 항에 있어서, 추가로 폴리아니온을 함유하는 방법.
제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 폴리아니온이 덱스트란황산 또는 그 염인 방법.
제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 알부민을 함유하는 방법.
폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민 및 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민 및 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 산화형 조효소를 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 시약.
제 28 항에 있어서, 추가로 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
제 27 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 폴리아니온을 함유하는 시약.
제 30 항에 있어서, 폴리아니온이 덱스트란황산 또는 그 염인 시약.
제 27 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 알부민을 함유하는 시약.
제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 키트이며, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체 및 과산화수소 측정 시약의 각각을 임의로 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하고, 콜레스테롤 산화 효소를 제 2 시약에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 키트이며, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 폴리옥시에틸렌알킬아민 혹은 폴리옥시에틸렌알케닐아민, 폴리옥시에틸렌 에테르 다환 페닐 황산에스테르 혹은 음이온성 담즙산 유도체 및 산화형 조효소 각각을 임의로 제 1 시약, 제 2 시약 중 어느 하나 또는 양쪽에 함유하고, 콜레스테롤 탈수소 효소를 제 2 시약에 함유하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤 측정용 키트.
제 34 항에 있어서, 추가로 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 키트.
제 33 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 폴리아니온을 함유하는 키트.
제 33 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 알부민을 함유하는 기재된 키트.