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KR20040045400A - 패혈증의 치료 또는 예방을 위한 ｉｌ-18 저해물질의 용도 - Google Patents

패혈증의 치료 또는 예방을 위한 ｉｌ-18 저해물질의 용도 Download PDF

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KR20040045400A
KR20040045400A KR10-2003-7014798A KR20037014798A KR20040045400A KR 20040045400 A KR20040045400 A KR 20040045400A KR 20037014798 A KR20037014798 A KR 20037014798A KR 20040045400 A KR20040045400 A KR 20040045400A
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Abstract

본원 발명은 패혈증 및 중증 패혈증과 패혈성 쇼크에서 선택되는 전신성 염증 반응 증후군에 특징적인 다른 질환의 치료 및/또는 예방; 패혈증 관련된 심근 기능장애의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.

Description

패혈증의 치료 또는 예방을 위한 ＩＬ-18 저해물질의 용도{USE OF IL-18 INHIBITORS FOR THE TREATMENT OF PREVENTION OF SEPSIS}
1989년에, 미코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)로 감염되고 LPS로 공격받은 생쥐의 혈청에서 유도된 인자가 탐지되었다. 이 인자는 인터루킨-2(IL-2)의 존재하에 정상 생쥐의 비장 세포 배양액에서 인터페론-γ(IFN-γ)을 유도할 수 있었다(Nakamura et al. 1989). 상기 인자는 IFN-γ의 직접 유도물질로서 뿐만 아니라 IL-2, 항-CD3 또는 유사분열물질과 함께 보조-자극물질로서 기능하였다. 엔도톡신 처리된 생쥐 혈청으로부터 이런 활성을 좀더 분명하게 확인하려는 시도에서 상기 활성과 연관된 상동성 50-55 kDa 단백질이 발견되었다(Nakamura et al. 1993). 다른 사이토킨이 IFN-γ 생산에 대한 보조-자극물질로 작용할 수 있기 때문에, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 또는 TNF에 대한 중화 항체가 혈청 활성을 차단하지 못한다는 것은 이것이 별개의 인자라는 것을 의미한다. 이들 연자들은 여드름균(P.acnes)으로 사전처리된 생쥐의 간 추출물에 IFN-γ 생산을 위한 엔도톡신-유도된 보조-자극물질이 존재함을 입증하였다(Okamura et al., 1995). 이런 실험 모델에서는 간 대식세포 개체군(쿠퍼 세포)이 확대되고, 따라서 낮은 용량의 박테리아 리포폴리사카라이드(LPS)도 치명적이다. 사전-처리되지 않은 쥐에서는 유사한 처리가 치명적이지 않다. 처음에 IFN-γ-유도 인자(IGIF)라고 불렸고, 이후 인터루킨-18(IL-18)로 명명된 이 인자는 여드름균(P. acnes)-처리된 생쥐 간으로부터 균일하게 정제되었고, 부분적인 아미노산 서열이 수득되었다. 정제된 IL-18의 아미노산 서열로부터 유래된 축중 올리고뉴클레오티드는 뮤린 IL-18 cDNA를 클론하는데 이용되었다(Okamura et al. 1995). IL-18에 대한 사람 cDNA 서열은 1996년에 보고되었다(Ushio et al. 1996.)
인터루킨 IL-18(Tsutsui et al. 1996, Nakamura et al. 1993, Okamura et al. 1995, Ushio et al. 1996)은 IL-1 계통의 단백질과 구조적 특징을 공유하는데(Bazan et al. 1996), 이들은 4개의 나선 번들 구조를 보이는 대부분의 다른 사이토킨과 달리 β-쉬트 구조를 보유한다. IL-1β와 유사하게, IL-18은 생물학적 불활성 전구물질(프로IL-18)로 합성되고 신호 펩티드가 부재한다(Ushio et al. 1996). IL-1β와 IL-18 전구물질은 P1 위치의 아스파르트산 잔기 뒤에서 카스파제 I(IL-1β-전환 효소 또는 ICE)에 의해 절단된다. 생성된 성숙 사이토킨은 신호 펩티드의 결핍에도 불구하고 세포로부터 방출된다(Guayur et al. 1997; Gu et al. 1997).
IL-18은 I형 보조 T(Th1)세포에 의한 사이토킨(IFN-γ, IL-2, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자) 생산의 보조-자극물질(Kohno et al. 1997) 및 뮤린 자연 킬러 세포 클론에 의한 FAS 리간드-매개된 세포독성의 보조-자극물질(Tsutsui etal., 1989)로 작용하는 것으로 알려져 있다.
인터루킨-12(IL-12)는 단핵구/대식세포 및 다른 항원 제시 세포에 의해 생산되는 면역조절 사이토킨이다. 이는 선천 면역반응과 획득된 세포-매개된 면역반응의 조직에서 중심이다(Trinchieri 1998). 이는 서로 다른 2가지 유전자의 공유결합된 산물: 중쇄(p40)와 경쇄(p35)로 구성되는 이형이량체이다. IL-12의 생산은 특정 박테리아, 박테리아 산물, 세포내 기생충, 바이러스에 대한 반응으로 촉진된다. 다음의 기능은 IL-12에 기인한다: 1) 이는 T 세포와 자연 킬러(NK) 세포의 강력한 유도물질이다; 2) 이는 이들 세포에 대하여 보조-유사분열성이다; 3) 이는 대부분의 체계에서 Th1 반응의 발생에 중요하다(따라서, 이차적으로 IFN-γ와 TNF 생산의 증가, 대식세포 활성화 등을 유도한다); 4) 이는 세포독성 T 림프구와 NK 세포의 세포독성을 강화시킨다; 5) 이는 지연형 과민성 반응에 필요하다. 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) Cowan I 균주로 처리된 분리된 뮤린 비장 백혈구에서 IL-12 생산은 IFN-α 또는 IFN-β에 의해 억제되는 것으로 밝혀졌다(Karp et al. 2000).
최근에, IL-12는 장기-특이적 자가면역 염증 질환, 예를 들면 다발성 경화증(MS) 및 염증성 장 질환(IBD)(Blumberg and Strober 2001; Fiocchi 1999)의 병인에 관여하는 것으로 보고되었고(Karp et al. 2000), 따라서 이는 이들 질환의 치료를 위한 잠재적 약물 표적으로 간주되고 있다. .
IL-18과 IL-12는 T 세포에서 IFN-γ의 유도에 현저한 상승효과를 보인다(Okamura et al. 1998). 이런 상승작용에 대한 조사에서, IL-12는 IFN-γ생산 세포에서 IL-18 수용체의 양 사슬의 발현을 상향-조절하는 것으로 밝혀졌다(kim et al. 2001). IL-12와 IL-18이 선천 면역과 획득 면역 모두를 활성화시키긴 하지만, 활성화된 대식세포에 의한 이들의 과도한 생산은 면역계의 기능 부전을 비롯한 다양한 장기 질환을 유도할 수 있다(Seki et al. 2000).
일반적으로, 사이토킨 결합 단백질(가용성 사이토킨 수용체)은 개별 세포 표면 사이토킨 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인이다. 이들은 세포 표면 수용체의 양자택일적 절단접합 또는 단백분해 절단에 의해 만들어진다. 이들 가용성 수용체는 과거에 보고되었다: 예를 들면, IL-6과 IFN-γ에 대한 가용성 수용체(Novick et al. 1989), TNF(Engelmann et al. 1989; Engelmann et al. 1990), IL-1과 IL-4(Maliszewski et al. 1990), IFN-α/β(Novick et al. 1994, Novick et al. 1992). TNFR/Fas 계통의 구성원인 오스테오프로테게린(OPG 또는 골아세포 저해 인자-OCIF)라고 하는 사이토킨-결합 단백질은 분비된 단백질로만 존재하는 첫 번째 가용성 수용체로 생각된다(Andeson et al. 1997, Simonet et al. 1997, Yasuda et al. 1998).
인터루킨-18 결합 단백질(IL-18BP)은 IL-18 칼럼에서 소변으로부터 친화성 정제되었다(Novick et al. 1999). IL-18BP는 시험관내에서 IFN-γ의 IL-18 유도 및 NF-kB의 IL-18 활성화를 완전히 파괴한다. 이에 더하여, IL-18BP는 LPS를 주사한 생쥐에서 IFN-γ의 유도를 저해한다. IL-18BP 유전자는 크로모좀 11에 위치하고, 막통 도메인을 코딩하는 엑손은 IL-18BP를 포함하는 8.3kb 게놈 서열에서 발견되지 않았다. 양자택일적 mRNA 절단접합으로 만들어진 IL-18BP의 4가지 동등형이사람에서 발견되었다. 이들은 각각 IL-18BP a, b, c, d로 명명되었고, 동일한 N-말단을 공유하지만 C-말단에서는 상이하다(Novick et al., 1999). 이들 동등형은 IL-18에 결합하는 능력에서 서로 상이하다(kim et al. 2000). 이들 중에서, 사람 IL-18BP(hIL-18BP) 동등형 a와 C는 IL-18에 대하여 중화 능력을 갖는 것으로 알려져 있다.
가장 풍부한 IL-18BP 동등형, 즉 절단접합된 변이 동등형 a는 빠른 온-레이트(on-rate)와 느린 오프-레이트(off-rate) 및 0.4 nM의 해리 상수(Kd)로 IL-18에 대하여 높은 친화성을 보인다(Kim et al. 2000). IL-18BP는 비장에서 구성적으로 발현되고 면역글로불린 대과에 속한다. IL-18과 IL-18BP간 상호작용에 관여하는 잔기는 유사한 단백질 IL-1β와 IL-IR type I(Vigers et al. 1997) 사이의 상호작용에 기초하여, 컴퓨터 모델링(Kim et al. 2000)을 이용하여 제안되었다. IL-18BP에 대한 IL-18 결합 모델에 따르면, IL-18의 42번 위치에서 Glu 잔기와 89번 위치에서 Lys 잔기가 IL-18BP에서 각각 Lys-130과 Glu-114에 결합하는 것으로 제안되었다(Kim et al. 2000).
IL-18BP는 많은 세포에서 구성적으로 존재하고(Puren et al. 1999) 건강한 사람에서 순환하며(Urushihara et al. 2000) 사이토킨 생태에서 독특한 현상을 대표한다. IL-18에 대한 IL-18BP의 높은 친화성(Kd=0.4 nM) 및 순환기에서 발견되는 높은 IL-18BP 농도(IL-18보다 20배 몰 과다)로 인하여, 순환기에서 대부분의 IL-18 분자가 IL-18BP에 결합하는 것으로 추정되었다. 따라서, IL-18에 대하여 세포 표면 수용체와 경쟁하는 순환 IL-18BP는 천연 항-염증성 면역억제 분자로 기능할 수있다.
전술한 바와 같이, IL-18은 IFN-γ를 유도하는데, 이는 시험관내에서 IL-18BPa mRNA 발생을 유도하는 것으로 최근에 보고되었다(Muhl et al. 2000). 따라서, IL-18BPa는 신호를 "차단"하여 염증 반응을 종결시키는 역할을 할 수 있다.
IL-18BP는 여러 폭스 바이러스에 의해 인코드되는 일군의 단백질과 매우 유사하다(Novick et al. 1999; Xiang and Moss 1999). 이런 추정적인 바이러스 IL-18BP에 의한 IL-18의 저해는 염증성 항바이러스 Th1 반응을 약화시킬 것으로 생각된다.
전신성 염증 반응 증후군(SIRS)은 원인에 상관없이, 가족성의 만성적인 패혈증 증상을 의미한다. SIRS는 외상, 췌장염, 약물 반응, 자가면역질환 및 다른 질환에 의해 발생할 수 있다: 감염에 반응하여 발생하면, 패혈증이 된다(Nathens and Marshall 196).
패혈성 쇼크는 치료와 수술 중환자실에서 가장 빈번한 사망 원인이다(Astiz and Rackow 1998). 패혈증, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크는 감염에 대한 임상적 반응의 연속체(continuum)를 판정하는데 이용된다. 패혈증 환자는 감염의 증거 및 임상적 염증 증상을 나타낸다. 중증 패혈증 환자는 장기 기능장애와 함께 저관류(hypoperfusion)가 발생한다. 패혈성 쇼크는 저관류와 지속적인 저혈압으로 나타난다. 치사율은 16%(패혈증 환자에서) 내지 40-60%(패혈성 쇼크 환자에서)이다. 박테리아 감염이 패혈성 쇼크의 가장 일반적인 원인이다. 가장 빈번한 감염 부위는 폐, 복부, 요도관이다. 코르티코스테로이드의 사용과 같은 일반적인 항-염증요법은 패혈증과 패혈성 쇼크로부터 생존을 향상시키지 못하였다. 엔도톡신에 특이적인 단클론항체를 임상 시험하였지만, 이는 생존율을 향상시키지 못하였다. 종양 괴사 인자에 대한 길항물질, 인터루킨-1, 브래디키닌, 이부프로펜, 혈소판 활성화-인자를 이용한 요법 역시 패혈성 쇼크로부터 생존을 향상시키지 못하였다(Astiz and Rackow 1998).
패혈증은 그람-파지티브 박테리아, 예를 들면 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis)에 의해 특히 유발된다. 포도상구균(Staphylococcus) 종의 세포벽 주요 구성요소인 지질타이코산과 펩티도글리칸은 이런 조건하에 사이토킨 방출의 유도물질인 것으로 생각된다(Grupta et al. 1996; Cleveland et al. 1996). 하지만, 다른 그람-파지티브 구성요소 역시 사이토킨 합성의 촉진물질로 간주된다(Henderson et al.1996). IL-1, TNF-α, IFN-γ의 생산은 패혈성 쇼크 병인의 주원인으로 생각된다(Dinarello 1996; Okusawa et al. 1988). 이에 더하여, 케모킨 IL-8은 표피포도상구균(S. epidermidis)에 대한 반응으로 호중구에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌다(Hachicha et al. 1998). 표피포도상구균(S. epidermidis)에 의한 IL-1, TNF-α, IFN-γ 유도의 조절에서 중요한 인자는 IL-18, IL-12, IL-1β, TNF-α이다. IL-1β와 TNF-α는 IL-18과 유사한 방식으로, T 림프구에 의한 TNF-γ 생산의 보조-자극물질로 간주될 수 있다. 이들 두 사이토킨은 IL-12 또는 박테리아 자극의 상황에서 IFN-γ 생산에 보조-촉진 활성을 갖는다(Skeen et al. 1995; Tripp et al. 1993).
최근에, Nakamura 등(2000)은 IL-18과 IL-12의 동시 투여가 엔도톡신-유도된패혈성 쇼크에서와 유사한 높은 독성을 유발한다고 보고하였다.
IL-18의 수준이 패혈증 환자의 혈청에서 증가하고(Endo et al. 2000) 이런 증가가 크레아티닌 수준과 상관하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 IL-18의 상승된 수준이 신장 부전에 기인할 수 있음을 암시한다. 다른 연구(Grobmyer et al. 2000)에서는 9명의 패혈증 환자에서 IL-18의 수준이 입원후 첫 96시간동안 높게 나타나고 크레아티닌 수준과 상관하지 않는다고 보고하였다.
앞서 밝힌 바와 같이, IL-18은 염증성 강화와 약화 기능을 모두 갖는 다향성 인터루킨이다. 이는 TNF-α와 같은 친염증성 사이토킨의 생산을 강화시켜 염증을 촉진한다. 다른 한편, 이는 카스파제-1의 저해물질인 산화질소(NO)의 생산을 유도하여 IL-1β의 성숙을 차단하고 염증을 약화시킨다. 이와 같은 IL-18의 이중 역할은 염증 질환의 치료에서 IL-18 저해물질의 효능에 심각한 의문을 제기한다.
게다가, 염증의 조절에 매우 다양한 서로 다른 사이토킨과 케모킨이 참여하기 때문에, 이런 복잡한 상호작용 네트워크에서 하나의 경로만을 차단함으로써 항상 유익한 효과를 얻을 수는 없다.
Netea 등(2000)은 항-IL-18 다클론항체의 투여가 대장균(E. coli)이나 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로부터 유래된 LPS의 유해 효과로부터 생쥐를 보호한다고 보고하였는데, 이는 IL-18이 치명적 내독혈증(endotoxemia)에서 중요한 병원성 역할을 한다는 착상을 뒷받침한다. 하지만, IL-18 적중(knock out) 생쥐가 야생형 동물만큼 패혈증에 민감하고(Sakao et al. 1999) 최근의 보고서에서 IL-18의 친염증 활성이 중증도 감염에 대한 숙주 방어에 필수적이라는사실(Nakanishi et al. 2001; Foss et al. 2001)을 제안하고 있다는 점에서, IL-18 저해물질의 투여에 기초한 잠재적 치료 제제의 효능과 관련된 불확실성은 명백하다.
따라서, IL-18 저해물질의 사용과 관련된 전술한 고려 사항을 극복하면서 패혈증을 치료 및/또는 예방할 수 있는 수단이 절실히 요구된다.
본원 발명의 요약
본원 발명은 패혈증 및 중증 패혈증과 패혈성 쇼크에서 선택되는 전신성 염증 반응 증후군에 특징적인 다른 질환의 치료 및/또는 예방; 패혈증 관련된 심장 기능장애의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
좀더 구체적으로, 본원 발명은 카스파제-1(ICE) 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 하나에 대한 항체, IL-18 신호전달 경로의 저해물질, IL-18과 경쟁하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질, IL-18 생산의 저해물질 및 IL-18 결합 단백질, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 IL-18 결합 단백질과 적어도 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 이들의 원형 순열된 유도체에서 선택되는 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
본원 발명에 사용되는 IL-18 결합 단백질은 동등형, 뮤테인, 융합단백질(예, Ig 융합), 기능적 유도체(예, PEG-공액), 활성 분취물 또는 이들의 원형 순열된 유도체이다.
본원 발명에 사용되는 항체는 키메라, 인화, 사람 항체에서 선택되는 항-IL-18 특이적 항체이다.
이에 더하여, 본원 발명은 동시, 순차적 또는 개별 투여를 위한 IL-12 저해물질, 특히 IL-12 중화 항체; 인터페론, 특히 인터페론 α 혹은 β; 종양 괴사 인자 저해물질, 특히 가용성 TNFRI 혹은 TNFRⅡ; 또는 IL-1 저해물질, 특히 IL-1 수용체 길항물질을 추가로 함유하는 약물의 제조에서 저해물질의 용도에 관한다.
한 측면에서, 본원 발명은 예로써 유전자요법으로 패혈증을 치료 및/또는 예방하는 약물의 제조에서, 카스파제-1(ICE) 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 하나에 대한 항체, IL-18 신호전달 경로의 저해물질, IL-18과 경쟁하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질, IL-18 생산의 저해물질 및 IL-18 결합 단백질, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 IL-18 결합 단백질과 적어도 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 이들의 원형 순열된 유도체에서 선택되는 IL-18 저해물질의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 용도를 제시한다.
다른 측면에서, 본원 발명은 패혈증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서, 세포에서 IL-18 저해물질의 내생적 생산을 유도하거나 강화시키는 벡터의 용도를 제시한다.
이에 더하여, 본원 발명은 패혈증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서, IL-18 저해물질을 생산하도록 유전자 조작된 세포의 용도를 제시한다.
다른 구체예에서, 본원 발명은 패혈증 및 패혈증 관련된 심장 기능장애를 비롯한 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)에 특징적인 다른 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 카스파제-1(ICE) 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 하나에 대한 항체, IL-18 신호전달 경로의 저해물질, IL-18과 경쟁하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질, IL-18 생산의 저해물질 및 IL-18 결합 단백질, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 IL-18 결합 단백질과 적어도 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 이들의 원형 순열된 유도체에서 선택되는 IL-18 저해물질의 제약학적 효과량을 병든 개체에 투여하는 단계로 구성된다. 상기 방법은 L-12 저해물질, 특히 IL-12 중화 항체; 종양 괴사 인자 저해물질, 특히 가용성 TNFRI 혹은 TNFRⅡ; IL-1 저해물질, 특히 IL-1 수용체 길항물질; 또는 인터페론, 특히 인터페론 α 혹은 β에서 선택되는 사이토킨 저해물질의 치료요법적 효과량의 공동-투여로 구성될 수 있다.
이에 더하여, 본원 발명은 패혈증 및 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)에 특징적인 다른 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 카스파제-1(ICE) 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 하나에 대한 항체, IL-18 신호전달 경로의 저해물질, IL-18과 경쟁하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질, IL-18 생산의 저해물질 및 IL-18 결합 단백질, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 IL-18 결합 단백질과 적어도 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 이들의 원형 순열된 유도체에서 선택되는 IL-18 저해물질의 서열을 코딩하는 벡터의 제약학적 효과량을 병든 개체에 투여하는 단계로 구성된다.
다른 구체예에서, 본원 발명은 패혈증 및 SIRS에 특징적인 다른 질환을 치료및/또는 예방하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 세포에서 IL-18 저해물질의 내생적 생산을 유도하거나 강화시키는 벡터의 제약학적 효과량을 병든 개체에 투여하는 단계로 구성된다.
이에 더하여, 본원 발명은 본원 발명은 패혈증 및 SIRS에 특징적인 다른 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 IL-18 저해물질을 생산하도록 유전자 조작된 세포를 병든 개체에 투여하는 단계로 구성된다.
본원은 2001년 5월 16일에 출원된 미국 분할 출원 60/291,463에 우선권을 주장한다.
도 1에서는 특이적인 ELISA 검사(n=107)에 의한 IL-18BPa의 존재 분석에서 20-60세의 건강한 남성과 여성 피험자의 건강한 개별 혈청에서 혈청 IL-18BPa의 분포를 도시한다.
도 2A에서는 건강한 피험자와 패혈증 환자에서 IL-18과 IL-18BPa의 평균 수준을 도시한다. 혈청 IL-18과 IL-18BPa는 입원 직후와 입원동안 건강한 피험자(도 1)에서 및 42명의 패혈증 환자로부터 얻은 198개 시료에서 측정하였다.
도 2B에서는 도 2A에서 밝힌 건강한 피험자와 패혈증 환자의 IL-18과 IL-18BPa의 개별 수준의 분포를 도시한다. 건강한 피험자에서 혈청 IL-18과 IL-18BPa의 평균 혈청 수준은 각각 수직점선과 수평점선으로 표시한다.
도 3에서는 입원직후에 개별 패혈증 환자에서 전체 IL-18과 유리 IL-18간 비교를 도시한다. 혈청에서 유리 IL-18(닫힌 원)의 수준은 복합체에서 IL-18: IL-18BPa의 1:1 화학량을 고려한 전체 IL-18(열린 원)과 IL-18BPa의 농도 및 400pM의 Kd에 기초하여 계산하였다. 각 수직선은 개별 혈청 시료에서 전체 IL-18과 유리IL-18을 연결한다.
도 4에서는 전혈에서 표피포도상구균(S. epidermidis)-유도된 IFN-γ 생산에 대한 IL-18BP의 효과를 도시한다. 전혈은 표피포도상구균(S. epidermidis) 또는 표피포도상구균(S. epidermidis)과 재조합 IL-18BP를 지정된 농도로 자극하였다. 48시간 배양후, 혈액 배양액은 용해시키고 IFN-γ을 측정하였다. 결과는 표피포도상구균(S. epidermidis) IFN-γ 유도. P<0.01 vs. 표피포도상구균(S. epidermidis) 단독의 백분율로 표시한다. 이런 데이터는 6회 실험의 평균±표준오차(SEM)이다. SEM은 시료에서 평균 폭을 나타낸다. SEM은 평균에 정확성의 개념을 제공한다. SEM=SD/(시료 크기의 제곱근). 이들 데이터는 짝 스튜던트 검증으로 분석하였다.
도 5에서는 표피포도상구균(S. epidermidis)으로 처리된 전혈에 의한 IFN-γ 생산에 대한 IL-18BPa와 항-IL-12 단클론항체의 이중 활성으로 발휘된 저해 효과를 도시한다. 전혈은 IL-18BPa(125 ng/㎖), IL-12 Mab(2.5 ㎍/㎖) 또는 둘 모두의 존재하에 표피포도상구균(S. epidermidis)으로 자극하였다. 48시간 배양후, 혈액 배양액은 용해시키고 IFN-γ을 측정하였다. 결과는 IFN-γ 유도. P<0.01 vs. 표피포도상구균(S. epidermidis) 단독의 백분율로 표시한다. 이런 데이터는 6회 실험의 평균±표준오차(SEM)이다. SEM은 시료에서 평균 폭을 나타낸다. SEM은 평균에 정확성의 개념을 제공한다. SEM=SD/(시료 크기의 제곱근). 이들 데이터는 짝 스튜던트 검증으로 분석하였다.
도 6에서는 ELISA 표준 곡선으로 IL-18BPa의 정량을 도시한다. 재조합 사람 IL-18BPa는 연속 희석하고 실시예 3에서 밝힌 바와 같이 ELISA를 실시하였다. 데이터는 10회 실험의 평균 흡수도±SE(표준오차)이다.
도 7에서는 ELISA 분석에 의한 IL-18BPa의 정량에서 IL-18의 저해 효과를 도시한다. 신호의 저해 %를 제시한다.
도 8에서는 사람 IL-18BPa 동등형의 면역학적 교차 반응성을 도시한다. IL-18BP ELISA는 IL-18BP의 모든 동등형(a-d)으로 실시하였다. IL-18BP 동등형의 원액(3.2 ㎍/㎖)은 연속 희석하고 IL-18BPa ELISA에서 검사하였다.
도 9에서는 LPS 투여후 IL-18의 심근 조직 함량을 도시한다. 생쥐는 대장균(E. coli) LPS(0.5 ㎎/㎏, 복강내)를 주사하였다. 심장은 x 축에 지정된 시점에서 균일화시켰다. ELISA를 실시하여 심근 IL-18 함량을 측정하였다(n=4-5/군).
도 10에서는 LPS-유도된 심근 기능장애에 대한 항-IL-18 항체의 효과를 도시한다. 생쥐는 운반제(복강내 주사된 염수, n=8) 또는 대장균(E. coli) LPS(0.5 ㎎/㎏, 복강내 주사, n=8)을 주사하고, 6시간후 분리된 심장 관류로 좌심실 발생 압력(LVDP)을 측정하였다. 별도의 실험에서, 생쥐는 LPS보다 30분 앞서 정상 토끼 혈청(NRS, n=5) 또는 항-IL-18 항체(항-IL-18, n=8)로 사전처리하였다.
본원 발명은 패혈증을 치료 또는 예방하는 IL-18 저해물질의 투여에 관하고 실시예에서 밝힌 조사결과에 기초한다. 본원 발명에서, 순환하는 효과적인(유리) IL-18의 수준은 건강한 피험자에 비하여 패혈증 환자에서 현저하게 상승하고, IL-18의 저해는 그람-파지티브 박테리아 표피포도상구균(S. epidermidis)에 의한 IFN-γ 유도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
이에 더하여, 본원 발명에 따른 패혈증 치료는 IL-18 저해물질 및 이의 효과를 증가시킬 수 있는 다른 사이토킨 저해물질의 병용 투여로 접근할 수 있다.
본원 발명에 따른 패혈증은 SIRS, 중증 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독성 쇼크 등이며, 그람-파지티브 또는 그람-네거티브 박테리아에 의해 유발된다.
본원 발명에서 "IL-18 저해물질"은 IL-18 생산 및/또는 작용을 약화시키거나, 감소시키거나, 또는 부분적으로, 실질적으로 혹은 완전히 예방이나 차단하는 방식으로 IL-18 생산 및/또는 작용을 조절하는 임의의 분자를 의미한다.
생산 저해물질은 IL-18의 합성, 가공 또는 성숙에 부정적인 영향을 주는 임의의 분자, 예를 들면 ICE 저해물질일 수 있다. 본원 발명에 따른 저해물질은 예로써 인터루킨 IL-18 유전자의 발현 저해물질; IL-18 mRNA의 전사를 감소시키거나 예방하는 안티센스 mRNA 또는 상기 mRNA의 분해를 유도하는 리보자임; 정확한 접힘을 손상시키는 단백질; IL-18의 분비를 부분적으로 혹은 실질적으로 예방하는 단백질; IL-18을 분해시키는 프로테아제 등일 수 있다.
IL-18 작용의 저해물질은 IL-18 길항물질, 예를 들면 IL-18BP일 수 있다. 길항물질은 리간드(예, 수용체)에 대한 IL-18 결합을 주도하는 IL-18 또는 IL-18 결합부위를 부분적으로 혹은 실질적으로 중화시킬 수 있을 정도로 충분한 친화성과 특이성으로 IL-18 분자와 결합하거나 이를 격리시킬 수 있다. 길항물질은 IL-18/수용체 결합 직후에 세포내에서 활성화되는 IL-18 신호전달 경로를 저해할 수도 있다.
IL-18 작용의 저해물질은 가용성 IL-18 수용체나 이를 모방하는 분자; IL-18 수용체를 차단하는 작용제; 다클론이나 단클론 항체와 같은 IL-18 항체; 또는 표적에 대한 IL-18의 결합을 예방하는 임의의 작용제나 분자일 수도 있는데, 이들은 IL-18에 의해 매개되는 세포내 혹은 세포외 반응을 감소시키거나 또는 이의 유인을 예방한다.
본원에서 "IL-18 결합단백질"은 IL-18BP와 동의어로 사용된다. 여기에는 Kim et al., 2000에 정의된 IL-18 결합단백질의 절단접합 변이체 및/또는 동등형을 비롯하여 WO 99/09063 또는 Novick et al., 1999에 정의된 IL-18 결합단백질이 포함된다. 특히, 본원 발명에서 IL-18BP의 사람 동등형 a와 c가 유용하다. 본원 발명에 효과적인 단백질은 당화되거나 또는 당화되지 않을 수 있고, 천연 공급원(예, 소변)으로부터 유래되거나 또는 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 재조합 발현은 원핵 발현계(예, 대장균(E. coli)) 또는 진핵, 특히 포유동물 발현계에서 실시할 수 있다.
본원에서 "뮤테인"은 IL-18BP의 유사체 혹은 바이러스성 IL-18BP의 유사체를 말하는데, 여기서 고유 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 아미노산 잔기중 적어도 하나가 상이한 아미노산 잔기로 치환되거나 결실되고, 대안으로 하나이상의 아미노산 잔기가 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 고유 서열에 부가되는데, 이때 야생형 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP과 비교하여 생성된 산물의 능력에는 큰 변화가 없어야 한다. 이들 뮤테인은 공지된 합성 방법이나 특정부위-돌연변이유발 기술, 또는 임의의 적합한 다른 공지된 기술을 활용하여 만들 수 있다.
임의의 이런 뮤테인은 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 가지기 때문에, IL-18BP와 실제로 유사한 활성을 가진다. IL-18BP의 한가지 활성은 IL-18에 결합하는 능력이다. 뮤테인이 IL-18에 대하여 실제적인 결합 활성을 보유하는 경우에 이는 친화성 크로마토그래피와 같은 수단으로 IL-18의 정제에 사용될 수 있고, IL-18BP와 실제 동일한 활성을 가지는 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 통상적인 실험 방법으로 임의의 뮤테인이 IL-18BP와 실질적으로 동일한 활성을 가지는 지를 결정할 수 있는데, 상기 실험 방법은 적절히 라벨된 IL-18과 뮤테인이 결합하는 지를 측정하는 간단한 샌드위치 경합 분석 단계, 예를 들면 방사성면역분석 또는 ELISA 분석에 이런 뮤테인을 적용하는 단계로 구성된다.
본원 발명에 사용될 수 있는 IL-18BP 폴리펩티드 혹은 바이러스성 IL-18BP의 뮤테인, 또는 이들을 인코드하는 핵산에는 본원에 제시된 교시에 따라 과도한 실험없이 당업자가 용이하게 수득할 수 있는 치환된 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 일단의 실질적으로 상응하는 서열이 포함된다.
본원 발명에 따른 뮤테인에 대한 적절한 변화는 "보존성" 치환이다. IL-18BP 폴리펩티드나 단백질 또는 바이러스성 IL-18BP의 보존성 아미노산 치환에는 분자의 생물학적 기능을 보존하면서 유사한 물리화학적 성질을 가지는 일군의 동질성 아미노산간 치환이 포함된다(Grantham, 1974).
기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 상기 정의된 서열에서 실시될 수 있는데, 특히 30개 이하, 바람하게는 10개 이하의 아미노산이 부가 또는 결실되고 기능적 구조에 중요한 아미노산(예, 시스테인 잔기)이 결실 또는 치환되지 않는 경우에, 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 가능하다. 이런 결실/부가에 의해 만들어지는 단백질 및 뮤테인은 본원 발명의 목적에 포함된다.
바람직한 동질성 아미노산 군은 표 1에 제시한다. 좀더 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 2에 제시한다; 가장 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 3에 제시한다.
표 1
바람직한 동질성 아미노산 군
아미노산동질성 군
SerSer, Thr, Gly, Asn
ArgArg, Gln, Lys, Glu, His
LeuIle, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
ProGly, Ala, Thr, Pro
ThrPro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
AlaGly, Thr, Pro, Ala
ValMet, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
GlyAla, Thr, Pro, Ser, Gly
IleMet, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
PheTrp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
TyrTrp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
CysSer, Thr, Cys
HisGlu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn Gln, Asp, Ser, Asn
LysGlu, Gln, His, Arg, Lys
AspGlu, Asn, Asp
GluAsp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
MetPhe, Ile, Val, Leu, Met
Trp Trp
표 2
좀더 바람직한 동질성 아미노산 군
아미노산동질성 군
SerSer
ArgHis, Lys, Arg
LeuLeu, Ile, Phe, Met
ProAla, Pro
ThrThr
AlaPro, Ala
ValVal, Met, Ile
GlyGly
IleIle, Met, Phe, Val, Leu
PheMet, Tyr, Ile, Leu, Phe
TyrPhe, Tyr
CysCys, Ser
HisHis, Gln, Arg
GlnGlu, Gln, His
AsnAsp, Asn
LysLys, Arg
AspAsp, Asn
GluGlu, Gln
MetMet, Phe, Ile, Val, Leu
TrpTrp
표 3
가장 바람직한 동질성 아미노산 군
아미노산동질성 군
SerSer
ArgArg
LeuLeu, Ile, Met
ProPro
ThrThr
AlaAla
ValVal
GlyGly
IleIle, Met, Leu
PhePhe
TyrTyr
CysCys, Ser
HisHis
GlnGln
AsnAsn
LysLys
AspAsp
GluGlu
MetMet, Ile, Leu
TrpMet
본원 발명에 사용될 수 있는 IL-18BP 폴리펩티드나 단백질의 뮤테인, 또는 바이러스성 IL-18BP의 뮤테인을 수득하는데 활용할 수 있는 단백질에서 아미노산치환체의 생산 방법의 예에는 임의의 공지된 방법이 포함되는데, 이들 방법은 예로써 미국 특허 RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,) 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,); 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)(리신 치환된 단백질의 경우)에서 제시한다.
"융합단백질"은 예로써 체액에서 연장된 체류 시간을 갖는 다른 단백질과 융합되는 IL-18BP, 바이러스성 IL-18BP 또는 이들의 뮤테인으로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, IL-18BP 또는 바이러스성 IL-18BP는 다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예를 들면, 면역글로불린이나 이의 단편과 융합될 수 있다.
본원에서 "기능성 유도체"에는 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 유도체, 이들의 뮤테인, 융합된 단백질이 포함되고, 이들은 당분야에 공지된 수단으로 잔기 또는 N- 혹은 C-말단기에 측쇄로 생성되는 작용기로부터 만들 수 있는데, 이들이 제약학적으로 수용가능하면, 다시 말하면 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 활성과 실질적으로 유사한 단백질의 활성을 파괴하지 않고 이를 함유하는 조성물에 독성을 공여하지 않는다면 본원 발명에 포함된다.
가령, 이들 유도체에는 폴리에틸렌 글리콜 측쇄(PEG-공액됨)가 포함되는데, 이는 항원성 부위를 감추고 체액에서 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 체류를 연장시킬 수 있다. 다른 유도체에는 카르복실기의 지방족 에스테르; 암모니아 또는 일ㆍ이차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아마이드; 아실 성분(가령, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 작용기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체; 또는 아실 성분으로 형성된 유리 하이드록실기(가령, 세릴 또는 테레오닐 잔기)의 O-아실 유도체등이 포함된다.
본원 발명에서 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP, 뮤테인, 융합단백질의 "활성 분취물"에는 단독으로 또는 관련된 분자나 이에 결합된 잔기(예, 당이나 인산염 잔기, 또는 단백질 분자나 당 잔기의 자체적인 응집체)와 결합된 단백질 분자의 폴리펩티드 사슬의 임의 단편이나 전구물질이 포함되는데, 이런 단편은 IL-18BP와 실질적으로 유사한 활성을 보유해야 한다.
IL-18BP의 기능성 유도체는 중합체에 공액시켜 단백질의 특성, 예를 들면 안정성, 반감기, 생체이용효율, 사람 신체에 의한 내약성 또는 면역원성을 향상시킬 수 있다. 이를 달성하기 위하여, IL-18BP는 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 결합시킬 수 있다. PEG화(PEGlaytion)는 WO 92/13095에서 밝힌 공지된 방법으로 실시할 수 있다.
따라서, 본원 발명의 적절한 구체예에서 IL-18 저해물질, 특히 IL-18BP는 PEG-공액된다.
본원 발명의 다른 적절한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18 결합단백질의 전체 또는 일부분으로 구성되는 융합단백질이고, 이는 면역글로불린의 전체 또는 일부분과 융합된다. 생성된 융합단백질은 IL-18BP의 생물학적 활성, 특히 IL-18에 대한 결합을 계속 유지한다. 융합은 직접적으로, 또는 짧게는 1 내지 3개 아미노산 잔기 혹은 이보다 좀더 긴, 예를 들면 13개 아미노산 잔기의 링커 펩티드를 통하여 달성할 수 있다. 상기 링커는 트리펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met), 예를 들면 IL-18BP 서열과 면역글로불린 서열 사이에 도입된 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly- Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met을 포함하는 13개 아미노산 링커 서열이다. 생성된 융합단백질은 체액에서 체류 시간(반감기) 연장, 특이적 활성 증가, 발현 수준 증가 또는 융합단백질의 용이한 정제와 같은 향상된 특성을 보유한다.
IL-18BP는 Ig 분자의 불변 영역에 융합된다. 적절하게는, 이는 예로써 사람 IgG1의 CH2와 CH3 도메인과 같은 중쇄 영역에 융합된다. IL-18BP 및 면역글로불린의 일부분으로 구성되는 특이적 융합단백질의 생산은 WP 99/09063에서 기술한다. Ig 분자의 다른 동등형은 본원 발명에 따른 융합단백질, 예를 들면 동등형 IgG2혹은 IgG4, 또는 다른 Ig(IgM이나 IgA)의 생산에도 적합하다. 가령, 융합 단백질은 단량체 또는 다량체(헤테로- 또는 동종-)일 수 있다.
IL-18의 저해물질은 길항물질, 예를 들면 IL-18에 결합하지만 사이토킨이 수용체에 결합한 직후에 활성화되는 신호전달 경로를 유인하지 못하는 분자일 수 있다(예, IL1-Ra Dinarello 1996). 모든 길항물질 군은 패혈증 치료에서 단독으로 사용되거나 또는 IL-18 저해물질과 병용된다.
IL-18의 저해물질은 항-IL-18 특이적 항체일 수 있다. 항-IL-18 항체는 다클론이나 단클론, 키메라, 인화 또는 사람 항체이다. 재조합 항체와 이의 단편은 생체내에서 IL-18에 대한 높은 친화성 결합 및 낮은 독성으로 특성화된다. 본원 발명에 사용될 수 있는 항체는 낮은 독성으로 병원성 질환이나 이와 관련된 여러 증상을 효과적으로 저하 또는 완화시킬 만큼 충분한 기간동안 환자를 치료할 수 있는 능력으로 특성화된다.
IL-18은 패혈증에 의해 유발된 심장 기능장애동안 증가하는 것으로 밝혀졌다. IL-18 저해물질, 예를 들면 중화 항-IL-18 다클론항체와 함께 LPS의 공동-투여는 LPS-유도된 심근 기능장애를 방지한다.
중화 항체는 IL-18 면역주사로 토끼, 염소 또는 생쥐와 같은 동물에서 생성시킨다. 면역화 생쥐는 하이브리도마 제조를 위한 B 세포의 공급원을 제공하는데 특히 유용한데, 상기 하이브리도마는 배양하여 다량의 항-IL-18 단클론항체를 생산한다.
키메라 항체는 상이한 동물 종으로부터 유래된 2개이상의 분절 또는 일부분으로 특성화되는 면역글로불린 분자이다. 일반적으로, 키메라 항체의 가변 영역은 비-사람 포유동물 항체, 예를 들면 뮤린 단클론항체로부터 유래되고, 면역글로불린 불변 영역은 사람 면역글로불린 분자로부터 유래된다. 가급적, 양 영역 및 이들의 조합은 낮은 면역원성을 갖는다(Elliott et al., 1994). 인화 항체는 유전공학 기술로 만들어진 면역글로불린 항체인데, 여기서 뮤린 불변 영역은 사람 불변 영역으로 대체되고 뮤린 항원 결합 영역은 계속 유지된다. 생성된 생쥐-사람 키메라 항체는 사람에서 낮은 면역원성 및 향상된 약동학을 보유한다(Knight et al., 1993).
따라서, 다른 적절한 구체예에서 IL-18 항체는 인화 IL-18 항체이다. 바람직한 항-IL-18 인화 항체의 예는 유럽 특허 출원 EP 0 974 600에서 기술한다.
다른 적절한 구체예에서, IL-18 항체는 완전한 사람 항체다. 사람 항체를 생산하는 기술은 WO 00/76310, WO 99/53049, US 6,162,963 또는 AU5336100에서 자세히 기술한다. 바람직한 완전 사람 항체는 기능성 사람 Ig 좌위의 전체 또는 일부분을 포함하는 외래유전자도입 동물, 예를 들면 외래유전자도입 생쥐에서 만들어진 재조합 항체이다.
폴리펩티드 저해물질은 원핵이나 진핵 재조합 체계에서 생산되거나 또는 유전자 표적화(targeting)용으로 설계된 벡터에 인코드될 수 있다.
다른 사이토킨 저해물질은 패혈증의 치료에서 IL-18 저해물질과 병용될 수 있다. IL-18 저해물질은 IL-12 저해물질과 병용될 수 있다.
본원에서 "IL-12 저해물질"은 IL-12 생산 및/또는 작용을 약화시키거나, 감소시키거나, 또는 부분적으로, 실질적으로 혹은 완전히 예방이나 차단하는 방식으로 IL-12 생산 및/또는 작용을 조절하는 임의의 분자를 의미한다.
IL-12 생산의 저해물질은 IL-12의 합성에 부정적인 영향을 주는 임의의 분자, 예를 들면 인터페론 α/β(Karp et al. 2000), 또는 IL-12의 가공 또는 성숙에 부정적인 영향을 주는 임의의 분자일 수 있다. 본원 발명에 따른 저해물질은 예로써 인터루킨 IL-12 유전자의 발현 저해물질; IL-12 mRNA의 전사를 감소시키거나 예방하는 안티센스 mRNA 또는 상기 mRNA의 분해를 유도하는 리보자임; 정확한 접힘을 손상시키는 단백질; IL-12의 분비를 부분적으로 혹은 실질적으로 예방하는 단백질; IL-18을 분해시키는 프로테아제 등일 수 있다.
IL-12 길항물질은 여러 방식으로 활성을 발휘한다. 길항물질은 IL-12 수용체 결합을 담당하는 IL-12 에피토프를 부분적으로 또는 실질적으로 중화시키는데 충분한 친화성과 특이성으로 IL-12 분자와 결합하거나 또는 이를 격리시킬 수있다(이후, "격리 길항물질"). 격리 길항물질은 예로써 IL-12에 대한 항체, 수용체의 세포외 도메인이나 이의 기능적 일부분을 포함하는 IL-12 수용체의 절두된 형태 등이다. 길항물질은 IL-12/수용체 결합직후에 세포에서 활성화되는 IL-12 신호전달 경로를 저해할 수도 있다(이후, "신호 길항물질"). 이들 길항물질은 패혈증 치료에서 단독으로 사용되거나 또는 IL-18 저해물질과 병용된다. IL-12 길항물질은 시험관내에서 감수성 세포주, 예를 들면 포르볼(phorbol) 에스테르와 IL-12가 증식을 유발하는 생쥐 비세포(splenocyte)에서 고유 IL-12의 활성에 대한 효과를 일반적인 후보 스크리닝으로 확인하고 평가한다. 상기 분석에는 다양한 희석도, 예를 들면 분석에 이용된 IL-12 몰농도의 0.1 내지 100배 몰 함량의 후보 길항물질의 IL-12 제형 및 IL-12가 없고 길항물질만 존재하거나 포르볼 에스테르와 IL-12가 존재하는 대조가 포함된다(Tucci et al., 1992).
격리 길항물질은 본원 발명에 사용하는데 적합한 IL-12 길항물질이다. 격리 길항물질 중에서 IL-12 활성을 중화시키는 항체가 바람직하다. 본원 발명에서 IL-12 길항물질과 IL-18 저해물질의 동시, 순차적 또는 개별적 사용이 바람직하다. IL-18 저해물질과 병용되는데 바람직한 IL-12 길항물질은 항-IL-12 항체, 항체 유도체, 이의 단편, 영역, 생물학적 활성 부분이다. IL-18 저해물질은 IL-12 저해물질과 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용될 수 있다.
이에 더하여, IL-18 저해물질은 패혈성 쇼크에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 다른 사이토킨, 예를 들면 IL-1, TNF, IL-8 등의 저해물질과 병용될 수 있다(Dinarello 1996; Okusawa et al. 1998). IL-1 저해물질의 예는 IL-1 수용체 길항물질이고, TNF 저해물질의 예는 수용체 TNFRI과 TNFRⅡ의 가용성 부분이다.
본원 발명에서 "사이토킨 저해물질"은 사이토킨 생산 및/또는 작용을 약화시키거나, 감소시키거나, 또는 부분적으로, 실질적으로 혹은 완전히 예방이나 차단하는 방식으로 사이토킨 생산 및/또는 작용을 조절하는 임의의 분자(예, IL-1의 경우에 ICE 저해물질)를 의미한다.
생산 저해물질은 상기 사이토킨의 합성, 가공 또는 성숙에 부정적인 영향을 주는 임의의 분자일 수 있다. 본원 발명에 따른 저해물질은 예로써 사이토킨 유전자의 발현 저해물질; 사이토킨 mRNA의 전사를 감소시키거나 예방하는 안티센스 mRNA 또는 상기 mRNA의 분해를 유도하는 리보자임; 정확한 접힘을 손상시키는 단백질; 사이토킨의 분비를 부분적으로 혹은 실질적으로 예방하는 단백질; 사이토킨을 분해시키는 프로테아제 등일 수 있다.
사이토킨 길항물질은 여러 방식으로 활성을 발휘한다. 길항물질은 사이토킨 수용체 결합을 담당하는 사이토킨 에피토프를 부분적으로 또는 실질적으로 중화시키는데 충분한 친화성과 특이성으로 사이토킨 분자와 결합하거나 또는 이를 격리시킬 수 있다(이후, "격리 길항물질"). 격리 길항물질은 예로써 사이토킨에 대한 항체, 수용체의 세포외 도메인이나 이의 기능적 일부분을 포함하는 사이토킨 수용체의 절두된 형태(예, TNF의 경우에 가용성 수용체 TNFRI과 TNFRⅡ) 등이다. 대안으로, 사이토킨 길항물질은 사이토킨 결합이후에 세포 표면 수용체에 의해 활성화되는 사이토킨 신호전달 경로를 저해할 수 있다(이후, "신호 길항물질"). 길항물질은 수용체에 결합하지만 사이토킨이 수용체에 결합한 직후에 활성화되는 신호전달경로를 유인하지 못하는 분자일 수도 있다(예, IL1-Ra Dinarello 1996). 이들 길항물질은 패혈증 치료에서 단독으로 사용되거나 또는 IL-18 저해물질과 병용된다.
IL-18 저해물질은 전술한 사이토킨 저해물질과 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용될 수 있다.
더 나아가, 본원 발명은 패혈증의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 용도에 관한다. 따라서, 이런 질환을 치료 및/또는 예방하는데 유전자 치료 방식이 사용된다. 적절하게는, IL-18 저해물질의 발현은in situ로 진행되고, 따라서 이런 질환의 피해를 입은 조직에서 IL-18을 효과적으로 직접 차단한다.
정상 상태에서는 IL-18 저해물질의 발현이 중단되는 또는 충분한 함량의 저해물질을 발현하지 못하는 세포에서 IL-18 저해물질의 내생적 생산을 유도 및/또는 강화하기 위한 벡터의 용도 역시 본원 발명에 포함된다. 상기 벡터는 IL-18 저해물질을 발현하도록 소요의 세포에서 작동하는 조절 서열을 포함한다. 이런 조절 서열은 프로모터 또는 인헨서일 수 있다. 이후, 조절 서열은 동종 재조합으로 게놈의 정확한 좌위에 도입할 수 있는데, 여기서 이런 조절 서열은 발현을 유도 혹은 강화시켜야 하는 유전자에 동작가능하도록 연결된다. 이런 기술은 "내생적 유전자 활성화(EGA)"라 한다(WO 91/09955).
또한, 본원 발명은 패혈증의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18의 저해물질을 생산하도록 유전자 조작된 세포의 투여에 관한다.
당업자가 인지하는 바와 같이 동일 기술을 활용하여, 다시 말하면 네거티브조절 요소(예, 억제 인자)를 IL-18의 유전자 좌위에 도입하여 IL-18 발현을 차단하고, 따라서 IL-18 발현을 하향-조절 또는 예방하는 것이 가능하다. 당업자가 인지하는 바와 같이, IL-18 발현의 이런 하향-조절 또는 억제는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 IL-18 저해물질의 사용과 동일한 효과를 갖는다.
"제약학적으로 수용가능한"은 활성 성분의 생물학적 효능을 방해하지 않고 투여된 숙주에 독성을 보이지 않는 임의의 담체를 의미한다. 가령, 장관외 투여에서 활성 단백질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 운반제에 녹인 주사용 단위 약형으로 만들 수 있다.
본원 발명에 따른 제약학적 조성물의 활성 성분은 다양한 방법으로 개체에 투여할 수 있다. 투여 경로에는 피내, 경피(예, 서방 제형), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구, 경막외, 표면, 비강내 경로가 포함된다. 치료요법적으로 유효한 임의의 투여 경로, 예를 들면 상피나 내피 조직을 통한 흡수, 또는 활성 성분을 인코드하는 DNA 분자를 환자에 투여하고(예, 벡터를 통하여) 상기 DNA 분자가 생체내에서 활성 성분을 발현 및 분비하는 유전자 요법을 활용할 수 있다. 이에 더하여, 본원 발명에 따른 단백질은 제약학적으로 수용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제, 운반제와 같은 다른 생물학적 활성 성분과 함께 투여할 수 있다.
장관외(예, 정맥내, 피하, 근육내) 투여에서, 활성 단백질은 제약학적으로 수용가능한 장관외 운반제(예, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성(예, 만니톨) 또는 화학적 안정성(예, 방부제와 완충제)을 유지시키는 첨가제와 혼합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말 형태로 만들 수 있다. 상기 제형은 통상의 기술로 멸균한다.
본원 발명에 따른 활성 단백질의 생체이용효율은 사람 체내에서 분자의 반감기를 증가시키는 공액 과정으로, 예를 들면 상기 분자에 폴리에틸렌글리콜을 부착시켜 개선할 수 있다(PCT 특허 출원 WO 92/13095).
치료요법적 효과량의 활성 단백질은 길항물질의 유형, IL-18에 대한 길항물질의 친화성, 길항물질에 의한 임의 잔기의 세포독성, 투여 경로, 환자의 임상적 상태(내생적 IL-18 활성의 비-독성 수준 유지 필요성 포함)를 비롯한 다양한 변수의 함수다.
"치료요법적 효과량"은 IL-18의 생물학적 활성을 저해하는 IL-18 저해물질 복용량이다. 개체에 투여된 단일 또는 다중 복용량은 IL-18 저해물질 약동학, 투여 경로, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 병행 치료법, 치료 빈도, 소요 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라진다. 개체에서 IL-18의 저해를 측정하는 시험관내와 생체내 방법을 비롯하여, 기존 용량 범위의 조정은 당업자에게 공지된 것이다.
본원 발명에 따라, IL-18 저해물질은 예방이나 치료 목적으로 치료요법적 효과량의 다른 섭생이나 약물(예, 다중 약물 요법), 특히 IL-12 저해물질 및/또는 IL-1 저해물질, 인터페론, TNF 길항물질에 앞서, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 다른 치료요법적 약물과 동시에 투여되는 활성 약물은 동일한 또는 상이한 조성물로 투여될 수 있다.
또한, 본원 발명은 제약학적 조성물을 제조하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 IL-18 저해물질 및/또는 IL-12 저해물질 및/또는 IL-1 저해물질 및/또는 인터페론 및/또는 TNF 길항물질의 효과량 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 혼합하는 단계로 구성된다.
다음의 실시예를 참고하면 본원 발명을 좀더 쉽게 이해할 수 있지만, 이들 실시예는 본원 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1:
건강한 피험자와 패혈증 환자에서 혈청 IL-18BP와 IL-18의 수준
건강한 피험자와 패혈증 환자에서 순환하는 특정 사이토킨과 이들의 자연 저해물질의 측정은 질병의 진행과 심각도 측면에서 이들에 대한 정보를 제공한다. 본원 발명의 배경 섹션에서 언급한 바와 같이, 패혈증의 핵심 매개물질중 하나는 IFN-γ이다. IL-18은 IFN-γ의 보조유도물질(coinducer)이기 때문에, IL-18 및 이의 자연 저해물질, IL-18BP 절단접합 변이체 a의 수준을 패혈증 환자에서 모니터하고, 특이적인 ELISA를 이용하여 이를 건강한 피험자에서 발견된 수준과 비교하였다(실시예 3).
건강한 피험자에서 IL-18과 IL-18BPa의 수준
107명의 건강한 공여자에서 IL-18의 평균 수준은 ECL 분석(Pomerantz et al. 2001)에서 64±17 pg/㎖로 측정되었다. ECL 분석으로 관련된 단백질에 의한 간섭을 조사하였다. 이는 성숙 IL-1β 또는 프로IL-1β의 존재에 의해 영향을 받지 않지만 프로-IL-18과는 교차-반응하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 연구동안 사람혈청 시료에서 탐지된 성숙 IL-18의 약 20%는 프로-IL-18일 수 있다. IL-18의 ECL 분석은 ≤160 ng/㎖ 농도에서 IL-18BPa의 영향을 받지 않았다.
IL-18BPa의 수준은 107명의 건강한 피험자로부터 얻은 혈청에서 ELISA로 검사하였다(실시예 3). IL-18BPa의 수준은 0.5 ng/㎖ 내지 7 ng/㎖의 범위에서 평균적으로 2.15±0.15 ng/㎖이었다(도 1).
IL-18과 IL-18BPa는 혈청에 공존하기 때문에, 일부 IL-18은 IL-18BPa와 복합체 형태로 존재할 수 있다. 유리(free) IL-18의 수준은 전체 IL-18의 평균 수준(2.15 ng/㎖)에 기초하여 계산하였다. 유리 IL-18은 질량 작용의 법칙에 따라 측정하였다. 계산은 다음의 파라미터에 기초하였다: ECL 분석으로 측정된 전체 IL-18의 농도; ELISA로 측정된 전체 IL-1BPa의 농도; IL-18BPa와 IL-18의 복합체에서 1:1 화학량; 0.4 nM의 해리 상수(Kd)(Novick et al., 1999; Kim et al. 2000). 평형계(equilibrium system) L+R ↔ LR(여기서, L은 IL-18을 나타내고, R은 IL-18BP를 나타낸다)에서, 다음의 방정식이 적용가능하다:
Kd=[LR]/[Lfree][Rfree]
Lfree=L전체-LR
Rfree=R전체-LR
L전체= 64±17 pg/㎖(평균 수준), R전체= 2.15±0.15 ng/㎖(평균), Kd = 0.4 nM로 치환하면, 건강한 피험자에서 대략 51.2 pg/㎖ IL-18(전체의 대략 80%)이 유리 형태로 존재하는 것으로 밝혀졌다.
패혈증 환자에서 IL-18과 IL-18BPa의 수준
IL-18과 IL-18BPa의 수준은 입원직후 및 입원동안 42명의 패혈증 환자에서 얻은 192개의 혈청 시료에서 조사하였다. IL-18과 IL-18BPa의 수준은 건강한 피험자와 비교하여 패혈증 환자에서 현저하게 상승하였고, 수치의 광범위한 분포가 관찰되어다(도 2). 게다가, 패혈증 환자에서 이들 수준은 입원 당일에 특히 높았는데, 건강한 피험자와 비교하여 22배 높은 수준의 IL-18(1.5±0.4 ng/㎖ vs. 0.064±0.17 ng/㎖) 및 13배 높은 수준의 IL-18BPa(28.6±4.5 vs 2.15±0.15 ng/㎖, 도 2A)를 보였다. 크레아티닌 수준 및 이들 혈청에서 IL-18이나 IL-18BPa 사이의 통계학적으로 유의한 상관관계는 관찰되지 않았는데(APACHEⅡ 스코어로 평가, Knaus et al. 1993), 이는 이들 환자에서 상승된 IL-18과 IL-18BPa 수준이 신장 부전에 기인하지 않는다는 것을 암시한다.
패혈증 환자에서 혈청 IL-18과 IL-18BPa 수준은 상당히 가변적이기 때문에(도 2B), 개별 시료에서 유리 혈청 IL-18의 수준을 계산하였다. 계산은 동일한 3가지 방정식 및 실험적으로 확인된 Kd, L전체, R전체의 치환을 활용하여 전술한 바와 같이 실시하였다. 이런 계산에서 IL-18BPa는 대부분의 환자에서 유리 IL-18의 수준을 감소시키는 것으로 확인되었다(도 3). 주목할 점은 이런 효과가 전체 IL-18이 매우 높을 때 특히 강하다는 점이다. 가령, 2명의 환자에서 혈청 IL-18은 건강한 피험자에서보다 150배나 높은 0.5 nM(10 ng/㎖)에 육박하였다. 하지만, 순환하는 IL-18BPa(27 ng/㎖와 41.2 ng/㎖)에 대한 결합을 고려하면, 이들 2명의 환자에서유리 IL-18의 수준은 각각 78%와 84% 하락하였다(도 3). 따라서, 혈청 IL-18의 대부분은 순환하는 IL-18BPa에 의해 차단된다. 하지만, 이런 계산에 따르면 남아있는 유리 IL-18이 건강한 피험자에서 발견되는 것보다 여전히 높다. 이런 이유로, 패혈증 환자에 외인성 IL-18BPa의 투여는 순환하는 유리 IL-18 수준을 강하시켜 이런 질병으로 인한 결과를 완화시킬 것으로 기대된다.
실시예 2. 건강한 피험자의 전혈 시료에 존재하는 세포에서 표피포도상구균( S. epidermidis )-유도된 IFN-γ 생산에 대한 IL-18BPa의 효과
본원 발명의 배경 섹션에 언급된 바와 같이, 그람-파지티브 박테리아 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis)은 패혈증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 사이토킨, 예를 들면 IL-1, IFN-γ, TNF-α의 유도는 이런 병리의 핵심 매개물질이다. IL-18은 IFN-γ의 보조-유도물질이기 때문에, 표피포도상구균(Staphylococcus epidermidis) IFN-γ 유도에서 이의 저해를 조사하였다. IL-18 저해물질로 사용되는 IL-18BPa는 CHO 세포에서 만들어지는 재조합 히스티딘 태그된 이형이다.
0.5 ㎖ 혈액은 5 ㎖ 12X75 mm 둥근-바닥 폴리프로필렌 튜브(Falcon, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NL)에서, IL-18BP와 함께 또는 IL-18BP 없이 표피포도상구균(S. epidermidis)(ATCC로부터 구함)을 함유하는 0.5 ㎖ RPMI 성장 배지(Cellgro Mediatech, Hendon, 10 mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 10% FBS로 보충된 VA[Gibco BRL, Grand Island, NY])와 혼합하였다. 시료는 37℃(5% CO2)에서 48시간동안 배양하고, 이후 0.5% 최종 농도의Triton X-100(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA)으로 처리하여 전혈 시료에 존재하는 세포를 용해시켰다. 시료를 함유하는 튜브는 혈액 시료가 투명해질 때까지 수회 뒤집었다. 용해된 혈액 시료에서 세포내 사이토킨과 분비된 사이토킨을 대표하는 IFN-γ 농도는 Pomerantz 등(2001)이 밝힌 전기화학발광(ECL)으로 측정하였다.
이 연구를 위하여, 건강한 비-흡연 지원자로부터 얻은 전혈을 사용하였다. 혈액은 정맥천자(venipuncture)로 채취하고 헤파린처리된 튜브에 유지시켰다. 표피포도상구균(S. epidermidis)은 Aiura 등(1993)이 밝힌 바와 같이, 뇌실침출액체배지(brain-heart infusion broth)에서 24시간동안 증식시키고 발열인자없는 염수에서 세척하고 끓였다. 열-사멸된 박테리아의 농도는 백혈구 세포(WBC)당 10개의 박테리아 세포로 조정하였다.
도 4의 결과는 IL-18BPa가 IFN-γ의 표피포도상구균(S. epidermidis) 유도를 저해할 수 있다는 것을 보여준다.
IFN-γ이 IL-18과 IL-12에 의해 보조-자극되는 것으로 알려져 있기 때문에, 표피포도상구균(S. epidermidis)에 의해 주도된 IFN-γ 유도에 대한 IL-18BPa와 항-IL-12 특이적 항체(항-사람 IL-12 Mab 11.5.14, Preprotech, Rocky Hill, NJ) 혼합물의 효과를 조사하였다. 이런 유도는 125 ng/㎖ IL-18BPa(Novick et al. 1999에서 밝힌 바와 같이, COS 세포에서 만들어지고 탈롱(talon) 칼럼에서 정제된 히스티딘 태그된 IL-18BPa) 및 2.5 ㎍/㎖ 항-사람 IL-12 특이적 항체의 존재하에 검사하였다. 도 5에 도시된 결과는 항-IL-12 특이적 항체가 표피포도상구균(S.epidermidis)에 의한 IFN-γ 유도에 대한 IL-18BPa의 저해 효과를 강화시킨다는 것을 암시한다.
실시예 3: IL-18BP 특이적 ELISA 검사의 개발
ELISA는 2가지 항-IL-18BPa 항체: 포착 항체로서 실시예 4에서 밝힌 Mab 582의 서브클론인 뮤린 Mab 582.10 및 탐지용 토끼 다클론항체(실시예 4)로 구성되었다. 마이크로역가 96-웰 ELISA 플레이트(Maxisorb; Nunc A/S, Roskilde, Denmark)는 4℃에서 하룻밤동안 항-IL-18BPa Mab No. 582.10(Mab 582의 서브클론, PBS에서 4 ㎍/㎖)으로 코팅하였다. 플레이트는 0.05% Tween 20(세척용액)을 함유하는 PBS로 세척하고, 물에서 1:10 희석된 BSA 원액(KPL, Geithersburg, MD)으로 차단하였다(2h, 37℃). BSA 원액은 모든 검사 시료 및 탐지 항체의 희석을 위하여 물에서 1:15 희석하였다. 혈청 시료는 희석제에서 적어도 1:5로 희석하고, 100 ㎕ 분량을 웰에 첨가하였다. 고도로 순수한 rIL-18BPa(CHO세포에서 만들어지고 실시예 4의 표 1에 도시된 IL-18BP에 특이적인 단백질 G-정제된 Mab N 430을 이용한 면역친화성으로 정제됨)는 7회 연속 2배-희석(4에서 0.062 ng/㎖으로)하고 표준 곡선의 작성을 위하여 각 ELISA 플레이트에 첨가하였다. 플레이트는 37℃에서 2시간동안 배양하고 세척용액으로 3회 세척하였다. 토끼 항-IL-18BPa 혈청(희석제에서 1:5000 희석, 100 ㎕/웰)을 첨가하고, 플레이트는 37℃에서 2시간동안 추가로 배양하였다. 플레이트는 3회 세척하고 염소-항-토끼 양고추냉이 과산화효소(HRP, Jackson ImmunoResearch Labs, PBS에서 1:10,000, 100 pℓ/웰)의 공액체를 첨가하고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 플레이트는 3회 세척하고 실온에서 30분동안 OPD 과산화효소 기질(o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 정제(tablet), Sigma)의 첨가로 반응을 개시시켰다. 반응은 3N HCl(100 ㎕)로 중단시키고, 492 nm에서 흡수도는 ELISA 판독기로 측정하였다. OD는 IL-18BPa 농도의 함수로 플랏하는데, 선형성(linearity)은 0.12-2.00 ng/㎖ IL-18BPa 범위에서 관찰되었다(도 6).
혈청의 부재하에 또는 최대 20% 사람 혈청의 존재하에 IL-18BPa 표준 곡선은 동일하였다. IL-18BPa가 매우 높은 친화성으로 IL-18에 결합하기 때문에, ELISA가 유리 IL-18BPa와 결합된 IL-18BPa를 구별할 수 있는지를 확인하는 것이 필요하였다. IL-18은 IL-18 ELISA를 간섭하는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 이런 간섭은 혈청 시료에서 유의하지 않다. 90%의 패혈증 환자에서, 혈청 IL-18 수준은 4 ng/㎖ 미만이었다. 이런 혈청 시료는 측정하기에 앞서 5 내지 20배 희석을 요구하는 상승된 수준의 IL-18BPa를 보유한다. 이런 희석에서, IL-18은 10% 미만으로 IL-18BPa ELISA를 간섭한다(도 7). IL-18BPa보다 10배 과몰로 사용되는 프로IL-18 및 200배 과몰의 성숙 IL-1β를 비롯한 다른 관련된 사이토킨은 이런 분석을 간섭하지 않는다.
사람 IL-18BP의 가장 풍부한 동등형은 IL-18BPa이고, 동등형 b, c, d는 소수 절단접합 변이체이다(Novick et al. 1999; Kim et al. 2000). IL-18Ba는 IL-18에 대하여 최대 친화성을 보인다(Kim et al. 2000). IL-18에 대한 IL-18Bc의 친화성은 10배 낮고, 동등형 b와 d는 IL-18에 결합하거나 이를 중화시키지 않는다. 이런 이유로, ELISA에서 IL-18BPa와 IL-18BP의 다른 동등형의 교차-반응성을 확인하는 것이 중요하다. 도 8에 도시된 바와 같이, 사람 IL-18BPc는 huIL-18BPa와 비교하여 중량 기준에서 10배 적은 신호를 발생시키고, 사람 동등형 b와 d는 ELISA에서 유의한 신호를 발생시키지 않았다.
실시예 4: 항-IL-18BP 특이적 항체의 생산
토끼는 다클론항체 생산을 위하여 rIL-18BPa-His6을 주사하였다.
단클론항체의 생산을 위하여, 암컷 Balb/C 생쥐는 10 ㎍ 재조합 히스티딘 태그된 IL-18BPa(rIL-18BPa-His6)을 5회 주사하였다. 반전 방사선면역분석(IRIA, 실시예 5) 또는 고형상 RIA(sRIA, 실시예 5)에 의한 측정에서 최대 역가를 보이는 생쥐는 융합 3일과 4일전 최종 면역촉진주사를 복강내 주사하였다. 림프구는 비장으로부터 얻고 NSO/1 골수종 세포와 융합을 실시하였다. IL-18BPa에 항체를 생산하는 것으로 밝혀진 하이브리도마는 제한 희석으로 서브클론하였다. 발생된 클론은 IRIA(실시예 5)로 분석하였다. 대표적으로 하이브리도마는 표 1에 도시한다.
표 1: 항-IL-18BPa를 생산하는 대표적인 하이브리도마
Mab No. IRIA1(cpm) sRIA2(cpm)
148 23912 7941
297 1652 6483
369 316 12762
430 6887 3254
433 1009 15300
460 3199 4326
485 400 13010
582 15000 17897
601 1046 1928
1. 염소 항-생쥐 항체로 코팅된 플레이트 및 125I IL-18BPa로 탐지된 하이브리도마.
2. 소변 IL-18BP로 코팅된 플레이트 및 125I 염소 항-생쥐 항체로 탐지된 하이브리도마.
히스티딘 태그를 지향하는 항체를 분비하는 하이브리도마는 제거하엿다. 항체는 자연 발생 IL-18BP(소변으로부터 정제됨)를 인식하는 능력에 대하여 sRIA로 추가로 특성화시켰다. 여러 파지티브 하이브리도마의 결합 특성은 표 1에 도시한다. 하이브리도마 No.148, 430, 460, 582는 재조합 IL-18BP와 소변 IL-18BP 모두에서 파지티브하였다. 웨스턴 블랏팅, 면역침전, 면역친화성 정제 및 특정 ELISA의 개발에 적합한 항체를 수득하였다. 항-IL-BP 특이적 항체를 생산하는 파지티브 클론은 복수(ascite) 생산을 위하여, 프리스탄(pristane)으로 사전-기폭된 Balb/C 생쥐에 주사하였다. 항체의 아이소타입은 항-생쥐 IgG ELISA(Amersharn Pharmacia Biotech)를 이용하여 정의하였다. 재조합 IL-18BP 및 고유 IL-18BP와 높게 반응하는 Mab 582(표 1)는 IL-18BP 특이적 ELISA의 조합에 사용되었다(실시예 3).
항체는 IL-18의 존재하에, IL-18BPa와 IL-18의 복합체를 인식하는 능력을 sRIA로 검사하였다(실시예 5). 대부분의 항체는 IL-18과 복합된 IL-18BP를 인식하지 못하였다. 따라서, 이들 항체는 IL-18BPa의 리간드-결합 도메인을 지향하는 것으로 보인다.
실시예 5: 항-IL-18BP 항체를 생산하는 세포 클론의 탐지를 위한 방사선면역분석.
반전 방사선면역분석(IRIA)
PVC 마이크로역가 플레이트(Dynatech Laboratories, Alexandria, VA)는 4℃에서 하룻밤동안 친화성-정제된 염소 항-생쥐 F(ab)2항체(10 ㎍/㎖, 100 ㎕/웰; Jackson ImmunoResearch Labs)로 코팅하였다. 이후, 플레이트는 0.05% Tween 20(세척용액)을 함유하는 PBS로 2회 세척하고, 37℃에서 2시간동안 BSA(세척용액에서 0.5%)으로 차단하였다. 하이브리도마 배양 상층액(100 ㎕/웰)을 첨가하고, 플레이트는 실온에서 2시간동안 배양하였다. 플레이트는 3회 세척하고 각 웰에125I-rIL-18BPa-His6(100 ㎕에서 105cpm)을 첨가하며 22℃에서 5시간동안 배양하였다. 이후, 플레이트는 3회 세척하고, 개별 웰은 감마 계산기에서 계수하였다. 네거티브 대조보다 5배 높은 수준으로 결합 방사성을 보이는 하이브리도마 발생 상층액은 파지티브로 간주하였다.
고형상 RIA(sRIA)
rIL-18BPa(5 ㎍/㎖)은 포착 항원으로 사용되었고,125I-염소 항-생쥐 항체(100 ㎕, 105cpm)는 탐지에 사용되었다. 차단과 세척은 전술한 바와 같이 실시하였다. 파지티브 클론은 농축된 사람 소변으로부터 분리된 IL-18BP를 인식하는 능력을 sRIA로 추가로 조사하였다(Novick et al. 1999). 마이크로역가 플레이트는 리간드-친화성 정제된 소변 IL-18BP(1 ㎍/㎖)로 코팅하고, 전술한 바와 같이 차단하고 세척하였다. 하이브리도마 상층액(100 ㎕)을 첨가하고, 탐지는125I-염소 항-생쥐 항체(100 ㎕에서 105cpm)로 실시하였다.
IL-18BP의 리간드-결합 부위에 특이적인 항체에 대한 sRIA
마이크로역가 플레이트는 소변 IL-18BP(0.5 ㎍/㎖) 또는 rIL-18BPa(5 ㎍/㎖)로 코팅하고, sRIA에서처럼 차단하고 세척하였다. 재조합 사람 IL-18(50 ㎕)은 1.5 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하고(실온에서 15분), 이후 하이브리도마 상층액(50 ㎕)을 첨가하였다. 탐지는125I-염소 항-생쥐 항체(100 ㎕에서 105cpm)로 실온에서 2시간동안 실시하였다.
실시예 6: LPS이후 심근 IL-18 함량
TNFα와 IL-1β는 패혈증동안 심근 기능장애에 관여한다. IL-18은 TNFα와 IL-1β의 생산을 매개하는 것으로 알려진 친-염증성 사이토킨이기 때문에, LPS-유도된 심근 기능장애에서 IL-18의 농도를 조사하였다.
생쥐는 운반제(염수) 또는 LPS로 처리하였다. 심장은 LPS 투여후 2시, 4시, 6시에 수거하고 균일화시켜 ELISA(R&D Systems, Minneapolis MN)로 심근 IL-18 함량을 측정하였다. 도 9에서 결과는 LPS 투여후 4시에 심근 IL-18 함량에서 2배 증가를 보이는데, 이는 IL-18이 패혈증동안 심근 기능장애에 관여한다는 것을 암시한다.
실시예 7: LPS-유도된 심근 기능장애에 대한 IL-18의 중화 효과
앞선 실시예에서, IL-18 함량의 증가가 LPS에 유도된 심근 기능장애에서 확인되었다. 따라서, LPS-유도된 심근 기능장애에 대한 IL-18의 중화 효과를 평가하였다.
심근 기능은 기존 문헌(Meng et al. 1998)에서 밝힌 바와 같이 등용성 비-재순환 랑겐도르프(Langendorff) 기술로 측정하였다. 분리된 심장은 11.0 mmol/ℓ 글루코오스, 1.2 mmol/ℓ CaCl2, 4.7 mmol/ℓ KCl, 25 mmol/ℓ NaHCO3, 119 mmol/ℓ NaCl, 1.17 mmol/ℓ MgSO4, 1.18 mmol/ℓ KH2PO4를 함유하는 정열(normothermic) Krebs-Henseleit 용액으로 관류시켰다. 라텍스 풍선은 좌심방을 통하여 좌심실에 삽입하고 물로 팽창시켜 10 mmHg의 좌심실 확장압(LVEDP)을 달성하였다. 조율 와이어(pacing wire)를 좌심방에 부착하여 심장 박동을 분당 300회로 조율하였다. 관상 혈류량(coronary flow)은 폐동맥으로부터 배출물을 수거하여 정량하였다. 심근 온도는 37℃에 유지시켰다. 이의 일차 도함수(+dP/dt, -dP/dt)인 좌심실 발생 압력(LVDP) 및 LVEDP는 컴퓨터 압력 증폭기-디지타이저(Maclab 8, AD Instrument, Cupertino, CA)로 연속 기록하였다. 20분간 안정 기간이후, LVDP와 +/-dP/dt는 여러 LVEDP 수준(10, 15, 20 mmHg)에서 측정하였다.
LPS 투여후, 좌심실 발생 압력(LVDP)은 염소 대조와 비교하여 38% 정도 감소하였다(36.3+/-1.9 mmHg vs. 59.1+/- mmHg, P<0.001, 도 10). LPS 투여 30분전에 정상 토끼 혈청(NRS)으로 생쥐의 사전 처리는 LPS-유도된 심근 기능장애에 대한 영향이 미미하였다; 하지만, IL-18 중화 항체로 사전 처리하면 이런 기능장애가 소멸되었다(도 10). 관상 혈류량은 군간에 차이가 없었다.
이런 결과는 IL-18의 중화가 LPS-유도된 심근 기능장애를 방지한다는 것을암시한다.
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본원에서 밝힌 참고문헌은 여기에 순전히 참고로 한다.

Claims (32)

  1. 패혈증 및 중증 패혈증과 패혈성 쇼크에서 선택되는 전신성 염증 반응 증후군에 특징적인 다른 질환의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도.
  2. 제 1 항에 있어서, 패혈증 관련된 심장 기능장애의 치료 또는 예방에 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, IL-18 저해물질은 카스파제-1(ICE) 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 하나에 대한 항체, IL-18 신호전달 경로의 저해물질, IL-18과 경쟁하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질, IL-18 생산의 저해물질 및 IL-18 결합 단백질, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 IL-18 결합 단백질과 적어도 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 이들의 원형 순열된 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 제 3 항에 있어서, IL-18의 저해물질은 IL-18 결합 단백질이나 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 이들의 원형 순열된 유도체인 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 제 4 항에 있어서, IL-18 결합단백질은 PEG-공액되는 것을 특징으로 하는 용도.
  6. 제 3 항 내지 5 항중 어느 한 항에 있어서, 융합단백질은 Ig 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  7. 제 3 항에 있어서, IL-18 저해물질은 키메라, 인화, 사람 항체에서 선택되는 항-IL-18 특이적 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
  8. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 약물은 동시, 순차 또는 개별 투여를 위한 IL-12 저해물질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
  9. 제 8 항에 있어서, IL-12 저해물질은 중화 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
  10. 제 1 항 내지 9 항중 어느 한 항에 있어서, 약물은 동시, 순차 또는 개별 투여를 위한 인터페론을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
  11. 제 10 항에 있어서, 인터페론은 인터페론-β인 것을 특징으로 하는 용도.
  12. 제 10 항에 있어서, 인터페론은 인터페론-α인 것을 특징으로 하는 용도.
  13. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 약물은 종양 괴사 인자(TNF), IL-1, IL-8에서 선택되는 동시, 순차 또는 개별 투여를 위한 사이토킨 저해물질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
  14. 제 13 항에 있어서, TNF 저해물질은 TNFRI 또는 TNFRⅡ의 가용성 부분인 것을 특징으로 하는 용도.
  15. 제 13 항에 있어서, IL-1 저해물질은 IL-1 수용체 길항물질인 것을 특징으로 하는 용도.
  16. 패혈증의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 카스파제-1(ICE) 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 하나에 대한 항체, IL-18 신호전달 경로의 저해물질, IL-18과 경쟁하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질, IL-18 생산의 저해물질 및 IL-18 결합 단백질, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 IL-18 결합 단백질과 적어도 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 이들의 원형 순열된 유도체에서 선택되는 IL-18 저해물질의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 용도.
  17. 제 16 항에 있어서, 유전자요법에 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  18. 패혈증의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 세포에서 IL-18 저해물질의 내생적 생산을 유도하거나 강화시키는 벡터의 용도.
  19. 패혈증의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질을 생산하도록 유전자 조작된 세포의 용도.
  20. 패혈증 및 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)에 특징적인 다른 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, IL-18 저해물질의 제약학적 효과량을 병든 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, IL-18 저해물질은 카스파제-1(ICE) 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 하나에 대한 항체, IL-18 신호전달 경로의 저해물질, IL-18과 경쟁하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질, IL-18 생산의 저해물질 및 IL-18 결합 단백질, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 IL-18 결합 단백질과 적어도 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 이들의 원형 순열된 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, IL-12 저해물질의 치료요법적 효과량을 투여하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21 항 또는 22 항에 있어서, 종양 괴사 인자(TNF) 저해물질, IL-1 저해물질, IL-8 저해물질에서 선택되는 사이토킨 저해물질을 투여하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, TNF 저해물질은 TNFRI 또는 TNFRⅡ의 가용성 부분인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, IL-1 저해물질은 IL-1 수용체 길항물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 20 항 내지 25 항중 어느 한 항에 있어서, 인터페론을 투여하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 인터페론은 인터페론-A인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 인터페론은 인터페론-a인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 패혈증 및 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)에 특징적인 다른 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 카스파제-1(ICE) 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18수용체 아단위중 하나에 대한 항체, IL-18 신호전달 경로의 저해물질, IL-18과 경쟁하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질, IL-18 생산의 저해물질 및 IL-18 결합 단백질, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능적 유도체, 활성 분취물 또는 IL-18 결합 단백질과 적어도 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 이들의 원형 순열된 유도체에서 선택되는 IL-18 저해물질의 서열을 코딩하는 벡터의 치료요법적 효과량 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 병든 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 패혈증 및 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)에 특징적인 다른 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, 세포에서 IL-18 저해물질의 내생적 생산을 유도하거나 강화하는 벡터의 치료요법적 효과량 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 병든 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 패혈증 및 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)에 특징적인 다른 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, IL-18 저해물질을 생산하도록 유전자 조작된 세포 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 병든 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 20 항 내지 31 항중 어느 한 항에 있어서, 패혈증 관련된 심장 기능장애의 치료 및/또는 예방에 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
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