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KR102612930B1 - Cd127에 대한 항체 - Google Patents

Cd127에 대한 항체 Download PDF

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KR102612930B1
KR102612930B1 KR1020177000724A KR20177000724A KR102612930B1 KR 102612930 B1 KR102612930 B1 KR 102612930B1 KR 1020177000724 A KR1020177000724 A KR 1020177000724A KR 20177000724 A KR20177000724 A KR 20177000724A KR 102612930 B1 KR102612930 B1 KR 102612930B1
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KR
South Korea
Prior art keywords
seq
antibody
disease
sequence
antigen
Prior art date
Application number
KR1020177000724A
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English (en)
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KR20170019417A (ko
Inventor
니꼴라 뿌와리에
꺄롤린느 마리
베르나르 바노브
Original Assignee
오제 이뮈노테라프틱스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52434718&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR102612930(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 오제 이뮈노테라프틱스 filed Critical 오제 이뮈노테라프틱스
Publication of KR20170019417A publication Critical patent/KR20170019417A/ko
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Abstract

본 발명은 인터루킨 7(IL-7) 수용체(IL-7R)의 알파 사슬인 CD127에 대한 항체에 관한 것으로서, 상기 항체는 IL-7-IL-7R 상호작용에 대하여 길항 특성을 갖고, CD127 양성 세포에 대하여 세포독성 활성을 나타낼 수 있지만, 그의 수용체의 일부로서 CD127을 또한 이용하는 사이토카인인 TSLP에 의해 유발된 수지상 세포(DCs)의 성숙을 증가시키지 않는다. 선택적으로 또는 부가적으로, 이들 항체는 CD127의 내재화(internalization)를 유발하지 않고 및/또는 CD127의 IL7-유도 내재화를 억제한다. 본 발명의 또 다른 측면에 따라, CD127의 2b 부위 유래의 서열을 포함하는 인간 CD127 에피토프를 인식하는 항체가 제공되는데, 특히 상기 에피토프는 CD127의 2b 부위 및 도메인 D1의 인간 CD127 서열을 포함하고, 특히 상기 에피토프는 서열번호 115(특히 서열번호 110) 및/또는 서열번호 111을 포함하는 D1 유래의 적어도 하나의 서열 및/또는 서열번호 116의 서열을 포함하는 2b 부위 유래 서열을 포함하고, 또한, 임의로 서열번호 117(특히 서열번호 111)을 포함한다. 본 발명의 항체는, IL-7 신호 전달 경로가 임파구생성 관련 발병(pathogenesis)에 기여하는 경우, 특히 성숙의 증가, 더욱 구체적으로는 수지상 세포의 공동자극 분자(costimulatory molecule)들의 상향 조절이 바람직하지 않은 경우, 상기 발병에 기인하여 인간 환자에서 진단되는 상태를 치료하기 위한 용도로 적당하다.

Description

CD127에 대한 항체{ANTIBODIES DIRECTED AGAINST CD127}
본 발명은 CD127 또는 p90 IL-7R 또는 IL-7R-알파 또는 IL-7Rα(때때로 IL-7Ra이라고도 명명됨)이라고 명명된 인터루킨7(IL-7)에 대한 수용체의 알파 서브유닛, 특히 인간 세포 상에서 발현된 인간 IL-7에 대한 수용체의 알파 사슬의 알파 서브유닛에 대한 항체의 분야에 관한 것이다. 이들 항체는 IL-7-IL-7R 상호작용에 대하여 길항 특성을 갖고, CD127 양성 세포에 대하여 세포독성 활성을 나타낼 수 있지만, 그의 수용체의 일부로서 CD127을 또한 이용하는 사이토카인인 TSLP에 의해 유도된 수지상 세포(DCs)의 성숙을 증가시키지 않는다. 선택적으로 또는 부가적으로, 이들 항체는 CD127의 내재화(internalization)를 유발하지 않고 및/또는 CD127의 IL7-유도(induced) 내재화를 억제한다. 본 발명의 또 다른 측면에 따라, CD127의 2b 부위 유래의 서열을 포함하는 인간 CD127 에피토프를 인식하는 항체가 제공되는데, 특히 상기 에피토프는 CD127의 2b 부위 및 도메인 D1의 인간 CD127 서열을 포함하고, 특히 상기 에피토프는 서열번호 115(특히 서열번호 110)를 포함하는 D1 유래의 적어도 하나의 서열 및 서열번호 116의 서열을 포함하는 2b 부위 유래 서열을 포함하고, 임의로 서열번호 117(특히 서열번호 111)을 또한 포함한다.
따라서, 본 발명의 항체는, IL-7 신호 전달 경로가 임파구생성 관련 발병(pathogenesis)에 기여하는 경우, 특히 성숙의 증가, 더욱 구체적으로는 수지상 세포의 공동자극 분자(costimulatory molecule)들의 상향 조절이 바람직하지 않은 경우, 상기 발병에 기인하여 인간 환자에서 진단되는 상태를 치료하기 위한 용도로 적당하다.
생화학 (Biochemistry)
CD127은 IL-7 수용체(IL-7R) 및 TSLP 수용체(TSLPR)에 공통된다. IL-7R은 인터루킨 수용체의 공통 감마 사슬(γc) 및 CD127의 이종이합체(heterodimer)로 구성된다. 상기 공통 감마 사슬 γc은 본원 및 문헌에서 CD132로 때때로 나타내어 진다. IL-7R은 인터루킨 7에 의해 결합 된다. TSLP 수용체는 CD127 및 사이토카인 수용체 유사 인자 2 (CRLF2)의 이종이합체이다. TSLP 수용체는 TSLP에 의해 결합된다. 문헌에서는, TSLPR은 그 수용체의 CRLF2 사슬 및 CD127/CRLF2 복합체 모두를 나타내기 위해 때때로 사용된다. 혼동을 피하기 위하여, 하기에서 TSLPR은 일반적으로 상기 복합체를 나타낸다.
CD127(Swiss Prot 기탁번호 P16871)은 4개의 동종형태(isoform)로 존재할 수 있다. H20(Swiss Prot P16871.1)라고도 명명되는 규범적인 동종형태는 단일 막관통 단백질(single-pass transmembrane protein), N-말단에서 C-말단의 방향으로 20개 아미노산 신호 펩티드, 219개 아미노산 세포외 도메인, 25개 아미노산 막관통 도메인 및 195개 아미노산 세포내 도메인으로 구성되는 459개 아미노산을 갖는다. 다른 동종형태는 H20의 세포외 도메인의 전부(또는 대부분)의 서열을 공유하고, 변화된 C-말단 서열을 나타낸다. 동종형태 2 및 4는 분비되는 반면(Swiss Prot P16871-4 and P16871-3), 동종형태 3(Swiss Prot P16871-2)은 막관통 단백질이기도 하다. 신호 펩티드가 없는 CD127의 서열은 본원에서 서열번호 57로 제공된다. 본 출원에서 CD127의 넘버링된 아미노산들이 언급되는 경우, 상기 서열은 그 넘버링을 위한 기준으로 이용된다. CD127은 서열번호 113의 서열을 갖는 것으로 보고되고, 그의 세포외 도메인은 신호 펩티드가 제거되는 경우 서열번호 114의 서열을 갖는다. 달리 나타내지 않는 경우, CD127의 아미노산에 대하여 본원에서 사용된 넘버링은 서열번호 114로부터의 넘버링이다.
CD127은 사이토카인 수용체 동족 클래스 I(CRH I) 수용체이다. 당업계에서 잘 알려져 있는 바와 같이, 이들 수용체의 세포외 도메인은 2개의 피브로넥틴 3 도메인 (D1 및 D2로 명명됨)으로 구성된다. CD127의 정확한 결정학적 구조가 예를 들어 다음 문헌 [McElroy 등, 2009; McElroy 등, 2012 및 Walsh, 2012]에 발표 및 논의되어 왔고, 특히 [Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB)] 데이터베이스에서 단백질 구조 데이터로서 개시되어 있고, 기탁번호가 3UP1 이다. D1은 IL-7과의 결합에 관여하는 것으로 일반적으로 판단되는 반면, D2는 γc 사슬 (및 IL-7)과의 결합에 관여한다. 중요한 것으로, 서열번호 114의 아미노산 109 내지 127로 본질적으로 구성되는 도메인 D2의 부위 2b( Walsh, 2012 참조)는, 특히 IL-7의 존재하에서 CD127과 γc의 결합을 가능하게 하거나 증가시키기 위해 CD127-γc 상호작용에 중요하다. 특히, 중증 복합 면역결핍증(SCID)으로 고생하는 환자에서 확인되어온 P112 및 L115의 돌연변이는, 그들의 발병 특징을 초래할 수 있는 D2 도메인의 소수성 코어를 불안정화하는 것으로 판단된다. 전술된 바와 같이, 상기 2b 부위는 아미노산 109 내지 127로 본질적으로 구성되고, 당업자는 이러한 도메인의 말단은 단일 염기 정밀성(single-base precision)을 가지고서 반드시 명백하게 정의될 필요가 없고 그 2b 부위가 그 언급된 서열의 일단 또는 양단에서 1개, 2개 또는 3개 초과 또는 미만의 아미노산을 포함한다는 것을 이해할 수 있다. 따라서, 본원에서 CD127의 2b 부위가 언급되는 경우, 이는 위치 106, 107, 108, 109, 110, 111 또는 112에서 시작되고 위치 124, 125, 126 또는 127에서 끝나는 CD127 서열, 특히 IL-7의 존재하에서 IL7-R의 γc 사슬을 갖는 본질적인 결합 부위를 구성하는 것으로 생각되거나 확인되는 서열을 언급하는 것이다.
IL-7R 신호전달(Signalling). IL-7R에 대한 IL-7의 결합은 야누스(Janus) 키나아제(JAK) -1 및 -3, 전사 5의 신호전달자 및 활성화자 (STAT5) 및 포스페이티딜이노시톨 3-키나아제(PI3-k)를 비롯한 여러 신호전달 경로의 활성화를 유발한다. STAT1 및 STAT3 경로는 주요 경로인 것으로 보이지는 않지만 활성화되는 것으로 보고된다. 그 STAT5의 활성화는 항세포사멸 단백질인 Bcl-2의 유도 및 미토콘드리아에서 세포사멸유도 단백질인 Bax의 유입의 방지를 위해 요구되고 따라서 흉선 발생 T 세포 전구체의 생존을 위해 요구된다. PI3-k 경로의 활성화는 세포사멸 유도 단백질인 Bad의 인산화 및 세포질 내 잔류를 초래한다.
TSLPR 신호전달. 흉선 간질 림포포이에틴 (TSLP)은 임파구 생성에서 활성이 있고 특히 면역계의 세포의 발생의 조절에 관여하는 상피 세포 사이토카인인데, 상기 조절은 특히 상기 세포의 성숙에 영향을 미친다. 인간 TSLP(Genbank 기탁번호 AF338732)은 수지상 세포의 분극화에 영향을 미치고 T 세포 및 B 세포 증식 및 분화를 촉진하는 인자이다. 또한, TSLP은 Treg 세포의 발생을 억제한다(Lei 등, 2011 ).
TSLP-유발 신호전달 경로들은 분자 수준에서 IL-7-유발 경로와 상이한 것으로 확인되어 왔다. 특히, 그의 수용체에의 TSLP의 결합은 Jak-1을 활성화하지만, Jak-3은 활성화하지 않고 Jak-2은 활성화한다. 이러한 차이는, Jak-1가 두 수용체에 의해 공유된 CD127과 결합하지만 Jak-2가 γc를 갖는 Jak-3 및 CRLF2과 결합한다는 관찰 결과와 일치한다 (Rochman 등, 2010). 또한, TSLP-유발 신호전달에 대하여 STAT5 경로의 활성화가 보고된다 (Zhong 등, 2014). TSLP의 한 가지 주요한 영향은 수지상 세포의 활성화를 유도하여, CD80과 같은 공동자극 분자들의 과발현을 유도함으로써 TH-2 매개 염증 반응을 촉진한다(Reche 등, 2001 ).
세포 생물학(Cellular biology)
"CD127-양성 세포"는 그의 세포 표면에서 CD127을 발현하는 세포를 의미한다. 대부분의 경우, CD127-양성 세포는 IL-7R을 구성하는 복합체((IL-7R-양성 세포) 및/또는 TSLPR를 구성하는 복합체(TSLPR-양성 세포)에서 CD127을 발현한다. CD127은 메모리 및 미접촉(naive) T 세포 모두를 포함한 여러 가지 세포들에 의해 발현된다. 특히, CD127은 휴지기 및 메모리 T 세포를 비롯한 효과 T 세포(Teff) 및 미성숙 B 세포에 의해 발현되지만, 휴지기의 천연 조절 T 세포(천연 Treg)에 의해서는 발현되지 않는다. IL-7Ra는 흉선 세포 분화 및 림프구의 클론 발현을 촉진하는데 필수적이다.
미접촉 T-세포 항상성을 위한 IL7-CD127 경로의 중요성은, 통상적인 CD4+ T 세포상의 막-결합 IL-7Ra의 발현 수준이 건강한 개체 및 HIV-감염 환자뿐 아니라 MS 환자에서 최근의 흉선 이주 (RTE)-CD4+ T 세포의 빈도와 상관관계가 있다는 것을 나타내는 몇몇의 최근 연구에 의해 강조되고 있다(Albuquerque 등, 2007) (Broux 등, 2010). 또한, IL-7Ra는 TSLP 수용체의 한 성분이다. 흉선 수질에서 상피 세포로 구성되는 구조인 하살 소체(Hassall's corpuscles) 에 의한 TSLP의 분비는 CD11c+ 골수성 수지상 세포(MDCs)를 조절하여 흉선 세포의 Treg로의 분화를 유도하는 것으로 확인되어 왔다(Watanabe 등, 2005a). 따라서, IL-7 유래의 신호는 IL-7Ra 녹아웃 마우스에서 나타난 바와 같은 Treg 발생을 위해 요구된다 (Mazzucchelli 등, 2008). Haas 등의 2011 문헌에서, 그 저자들은 명백한 유전적 영향이 없이, 통상적인 T 세포 상의 IL-7Ra 발현의 감소, IL-7 혈장 수준의 상향조절 및 MS에서 흉선 이주(thymic emigrant) Treg 빈도 및 Treg 기능의 감소를 보고했다(Haas 등, 2011).
IL-7이 그의 동족 수용체 막 이동(trafficking)을 어떻게 조절하는 지를 규명하는 것은 림프구 기능에서 IL-7/IL-7R의 역할의 심도있는 이해를 위해 중요하다. 예전의 연구는 T 세포의 IL-7 자극은 아마도 수용체 내재화 때문에 30분 이내에 CD127의 표면 하향 조절을 유도한다는 것을 시사했다. 나중의 시점(2 내지 6 시간)에서, IL-7은 CD127의 전사 하향 조절을 유도하는 것으로 확인되었다. 그러나, CD127 내재화의 실제 동적 특성 및 IL-7에 의한 이동 기작의 조절은 규명될 필요가 있다(Henriques 등, 2010). 또한, IL-7-유발 신호전달은 CD127 내재화에 의존한다는 것이 시사되었고 이후의 수용체 분해는 JAK3 활성에 의존하고 프로테오좀 및 리소좀 모두에 의해 매개된다는 것이 암시되었다.
생리병리학(Physiopathology)
수지상 세포는 T 세포 매개 면역 반응을 촉진하는 CD80와 같은 공동자극 분자들을 성숙 후에 높은 수준으로 발현한다. 또한, 이들 세포는 T 세포에서 화학주성을 유발하는 사이토카인인 TARC (CCL17)를 생성한다. 이와 같이, 성숙 수지상 세포는, T 세포 반응이 역할을 하는 몇몇의 면역 매개 질환, 예를 들어 천식, 류머티스 관절염, 대장염, 다발성 경화증 및 포도막염의 생리병리에 기여한다. 또한, 성숙 수지상 세포는 세포, 조직 또는 장기 타가이식의 거부 과정에서 핵심 역할을 한다. 따라서, 많은 치료 전략은 수지상 세포의 성숙의 예방에 목표를 두고 있다.
수지상 세포와 같은 항원 제시 세포(APCs) 상의 공동자극 분자의 존재 또는 부재는 면역 반응의 정성적 및 정량적 특성에 유의한 영향을 미친다. 수지상 세포에 의한 CD80의 과발현은 DC 성숙을 유발하고 메모리 T 세포 활성화를 증가시킨다(Bour-Jordan 등, 201 1 ). 기계작용적으로, CD28과 CD80의 상호작용은 면역 시냅스의 중심 클러스터를 구성하고, 계합된(engaged) TCR과 동시에 위치함으로써, 면역 시냅스를 안정화한다(Dustin 및 Shaw, 1999) (Grakoui 등, 1999). CD28 및 CD80 사이의 상호작용은 TCR이 HLA 분자와 효율적으로 상호작용하기 위한 적절한 간격을 실제적으로 발생한다(Shaw 및 Dustin, 1997).
다발성 경화증(MS)은 중추 신경계(CNS)의 염증성 탈수초성 질환(inflammatory demyelinating disease)이다. MS 환자의 CNS에서 탈수초성 패치의 출현은 대식세포 및 T 림프구로 주로 구성되는 염증성 침윤물과 관련이 있다. 기계작용적인 수준에서, MS는 자가면역 질환으로 간주된다. 일반적으로, MS는 주로 CD4 + T에 의해 매개되는 질환이다. CD4 +: Th1, 더욱 최근에는 Th17의 서브세트는 그 질병의 병리생리에 관여했다. 오늘날, Th1 및 Th17의 각각의 아집단에 특정의 역할을 할당하는 것은 여전히 어렵다. 또한, 알파4 (α4)-인테그린의 길항작용에 의한 백혈구 소통(trafficking)의 억제는 MS 및 염증성 장 질환(IBD)과 같은 염증성 질환의 치료뿐 아니라 죽상동맥경화증의 치료를 위한 치료적 접근법으로서 확인되어 왔다(Zhi 등, 2014). α4β7은 활성화된 대식세포를 포함한 백혈구의 더욱 제한된 세트, 림프구의 서브세트. NK 세포, 비만 세포 및 호산구 상에서 발현된다.
인간 IL-7은, 장, 뇌 및 피부와 같은 비림프 조직에의 T 림프구 귀환 및 잔류를 위해 요구되는 a4, β7 및 α4/β7 인테그린을 발현하는 인간 T 림프구의 빈도를 획기적으로 증가시키고 인간 T 림프구상에서 시험관내에서 a4 및 β7 인테그린의 강한 발현을 유도한다(도 19)(Denucci 등, 2009; Gorfu 등, 2009).
미접촉(Naive) T 세포는 이식된 장기 및 조직의 급성 거부의 부분적인 원인이 된다. 이들 세포는 공동자극을 차단하는 단일 클론 항체(항부착, CD80/86 억제제) 및 현재의 면역억제 약물(칼시뉴린 억제제)에 의해 조절된다. 또한, 메모리 T 세포도 이식 거부의 원인이 된다. 메모리 T 세포는 획득 면역 히스토리, 특히 바이러스에 대한 이전의 반응으로 인해 인간에서 누적된다. 메모리 T 세포는 우리의 항바이러스 방어물과 동종항원의 교차반응인 이종면역의 결과로서 동종항원에 의해 재활성화된다(Adams 등, 2003). 이종 면역은 내성 유도에 대한 가능한 장벽을 나타내는데, 이는 미접촉 T 세포와 대조적으로 메모리 T 세포는 공동자극 신호에 대한 요건이 감소되면서 신속히 활성화되도록 계획되어 있기 때문이다. 또한, 메모리 T 세포는 만성 거부에 관여할 수도 있다. 장기 및 조직 이식에서의 그들의 역할을 차치하고라도, 미접촉 및 메모리 T 세포도 많은 자가면역 질환의 원인이 된다. 이는 궤양성 대장염(Shinohara 등, 201 1 ), 류머티스 관절염, 건선 또는 이식편대 숙주 질환의 경우에 해당한다.
또한, 몇 종의 악성 세포들이 IL-7R을 발현하는 것으로 확인되어 왔다. 이는 세자리(Sezary) 피부 림프종(그들의 60%), 또는 그 경우들의 약 15%가 CD127에서 기능획득 돌연변이를 발생하는 유년기 급성 림프모구성 백혈병의 경우에 해당하여, 이들 종양들이 IL-7에 부분적으로 의존한다(Shochat 등, 2011).
T 림프구의 고갈은 동종이식 거부를 억제하거나 자가면역을 억제하기 위한 명백한 면역억제 접근법이다. 그러나, 전체 T 세포 고갈은 면역 관용의 유도에는 바람직하지 않을 수 있다. Treg 세포를 변형시키지 않고, T 세포 아집단 또는 선택적으로 활성화된 T 세포를 표적하는 것은 관용유도(pro-tolerogenic) 접근법을 구성할 수 있었다(Haudebourg 등, 2009). 따라서, CD127은 면역 반응을 조절하는데 목표를 둔 단일 클론 항체(Mabs)에 대한 가능한 매력적인 치료적 표적으로 간주될 수 있는데, 이는 이러한 단일 클론 항체는 조절 림프구가 아닌 효과 림프구를 고갈시키는 가능성을 가질 수 있었다. 따라서, 이들은 IL-7-R에의 IL-7의 접근을 억제하여 T 및 B 세포 기능 및 성장을 제한함으로써 이식, 자가면역(Michel 등, 2008) 및 악성 상태에서 효능을 나타낼 수 있는 것으로 판단되어 왔다.
IL-7 경로를 방해하는 CD127+ 세포에 대한 단일 클론 항체를 이용한 치료법은 미접촉 및 메모리 T 세포를 제거/중화하고/하거나 Treg 세포를 보존하면서 그 수를 감소시키거나 CD127-양성 악성 세포의 수를 감소시킴으로써 그 목적을 달성할 수 있었다. 그러나, CD127+ 세포에 대한 단일 클론 항체를 이용한 치료법은 수지상 세포 활성화를 유도하는 경우 양날의 검으로 작용할 수 있다. 실제로, CD127은 CRLF2와 함께 수지상 세포에 의해서도 발현되어 TSLP 수용체를 형성한다. TSLP의 존재하에서, 수지상 세포는 활성화되고, T 세포-매개 면역 반응을 촉진한다. CD127에 대한 몇몇 단일 클론 항체들은, 아마도 TSLP가 TSLP 수용체와 상호작용하는 방식을 변경함으로써, TSLP에 의해 유발된 수지상 세포 성숙을 증가시키는 특성을 갖는다(배지 조건을 갖는 도 7에서 도시된 바와 같이). 따라서, TSLP에 의해 유발된 수지상 세포 성숙을 증가시키는 CD127에 대한 단일 클론 항체를 이용한 치료법은 치료적 이점을 나타낼 수 있다. 이는 TSLP를 함유하는 염증 환경에서 수지상 세포를 활성화하는 단점이 없이 IL7R를 차단하는 이점을 나타낼 수 있다.
간행물(Racape 등, 2009)에서, 그 저자들은 이식에서 가능한 치료 표적으로서 IL-7 수용체 알파(IL7Rα)의 중요성을 분석했다. 여러 가지 T 세포 및 IL-7 반응성 세포 상에서의 IL-7Rα의 발현을 검토함으로써, 그 저자들은 IL-7Rα를 발현하는 메모리 T 세포를 표적하는 것이 마우스에서 동종이식 생존을 연장할 수 있는 지의 여부를 확인했고, IL-7 또는 IL-7Rα를 표적하는 것이 Treg 세포를 살리는 이점이 있다는 결론을 얻었다. 그 예상들 중에서, 그 저자들은 치료에서 IL-7 또는 IL-7Rα를 표적하는 것이 CD127 발현 세포들의 생존에 상이한 영향들을 미칠 수 있고 상이한 유형의 림프구 감소증을 유발할 수 있다는 것을 나타냈다. 또한, 그들이 차단 또는 중화 또는 세포독성 항체인 지의 여부에 따라 IL-7Rα에 대하여 지시되는 항체들의 효과의 의문이 개념적인 관점에서 제기되었다. 그럼에도 그 저자들은 이러한 항체들을 얻고 분석한 것을 나타내지 않았고, 오히려 그 가설의 타당성을 평가하기 위한 추가의 연구에 대한 필요성을 표현했다.
몇몇 유방암을 비롯한 여러 종류의 암과 같은 IL-7/IL-7Rα 을 동반하는 면역 관련 질환 및 기타 질환에서 이용가능한 치료적 접근법의 단점을 고려하여, 추가의 약물 후보, 특히 인간 환자에서 면역 활성화를 조절(예, 조정)하는 목적을 위한 더욱 선택적인 표적에 대한 후보의 필요성이 여전히 존재한다.
이러한 정황에 있어서, IL-7Rα에 대한 길항 특성을 갖는 IL-7Rα에 대한 단일 클론 항체들이 WO2010/017468호에 개시되었고, 그의 인간화 형태들이 다발성 경화증과 같은 면역질환을 치료하기 위한 견지에서 WO2011/094259호에 개시되었다. 그 기재된 항체들은 그의 수용체에 대한 IL-7 결합에 대하여 길항작용하고, 그들의 CD127 수용체와의 IL-7 상호작용을 필요로 한다고 언급한 TH17 및 TH1 세포에 대하여 활성이 있는 언급되어 있다. 면역 세포, 특히 수지상 세포의 성숙에 대한 이들 항체의 영향은 고려되지 않았었다. 게다가, 이들 항체는 TARC의 TSLP-유도 생성을 억제하지 않는 것으로 언급되어 있다(WO2011/094259호의 107 페이지). 마찬가지로, 당뇨병, 루프스, 류머티스 관절염 및 다른 자가면역 질환의 치료를 위해 사용되는 것으로 고려되는 WO2011/104687호 또는 WO2013/056984호에 보고된 항-CD127 항체들은 수지상 세포의 성숙에 관한 그들의 영향에 대하여는 검토되지 않았고, TSLP-유도 신호전달과의 그들의 상호작용이 보고되지 않았다. 또한, Kern 등에 의해 보고되고(Kern 등, 2013; Kern 등, 2015) 본원에 나타낸 바와 같이, 종래 기술의 항-CD127 항체는 그 수용체의 내재화를 유도한다. CD127의 내재화를 또한 유도하는 길항제인 항-CD127 항체는 피부의 IV형 과민증을 조절하지 못하는 반면(도 10), 내재화를 유도하지 않는 길항제인 항-CD127 항체는 내재화를 유도하므로, 그 내재화 과정이 신호전달 경로를 활성화하여 그 항체들의 길항 효과를 완화할 수 있는 것으로 보인다. 끝으로, 종래 기술의 항체는, CD127의 2b 부위(특히 서열번호 114의 아미노산 109 내지 127) 유래의 서열을 전혀 포함하지 않는 에피토프를 인식하고, IL7-R의 γc 사슬과 CD127의 결합을 차단하는 것으로 확인되지 않았다.
따라서, CD127 항체의 개발에 대한 최근의 관심에도 불구하고, IL7-유도 IL-7R 신호전달의 억제에 노력이 집중되어 왔다. 그럼에도, TSLP 및 TSLPR은 다수의 병리상태에 관여하여 왔다. TSLP은 피부 및 폐 질환에 역할을 하는 것으로 확인되어 왔고(He 및 Geha, 2010) 인간 및 마우스에서 기도 염증 질환 및 아토피 피부염을 비롯한 여러 병리상태에 관여하는 것으로 확인되어 왔다(Ying 등 , 2008) (Jariwala 등 , 2011). 또한, TSLP는 장내 면역 및 염증의 조절에 관여하는 것으로 확인되어 왔다(Taylor 등, 2009). TSLP 및 TSLPR를 동반하는 다른 병리상태로는 소아 B-세포 백혈병(van Bodegom 등, 2012), 폐- 및 피부- 특이적 알레르기성 질환, 자가면역 관련 질환(Roan 등, 2012), 및 유방암을 비롯한 암(Olkhanud 등, 2011)이 있다.
따라서, 항-CD127 항체는 IL-7-유도 및/또는 IL-7-R 매개 기작의 길항 작용을 통한 면역관련 질환의 치료를 위한 유망한 후보이고 이러한 항체는 TSLP 수용체의 환경에서 CD127을 결합하고 TSLP-유발 및/또는 TSLP 수용체-매개 기작을 방해한다는 것이 당업계에 풍부하게 알려져 있지만, 수지상 세포의 성숙에서 이러한 항체들의 가능한 관여가 고려되지 않았고, 수지상 세포 성숙을 증가시키는 효과를 나타내지 않고/않거나 CD127의 내재화를 유도하지 않고/않거나 IL7-유도된 내재화를 억제하는 항체들을 얻는 것으로 구성되는 개선이 종래 기술에서는 전혀 제안되지 않았다.
기존의 항-CD127 항체에 의해 유도된 TSLP-유도 수지상 세포 성숙의 바람직하지 않은 증가의 놀라운 확인에 따라(그 항체가 TARC의 TSLP-유도 생성을 억제하지만), 본 발명자들은, 이러한 증가를 나타내지 않으므로 질병, 특히 자가면역 질환의 치료에 더욱 적당하게 되는 항체를 개발했다. 또한, 본 발명자들은 CD127의내재화를 유도하지 않고/않거나 CD127의 IL7-유도 내재화를 억제하는 항체가 MD707-13과 같은 종래의 항체와 비교하여 특히 생체 내(in vivo)에서 높은 효율(efficacy)을 갖는다는 것을 확인했다.
본 발명은, TSLP 경로만을 소극적으로(negatively) 방해하는 IL-7Rα에 대한 단일 클론 항체에 관한 것으로, 이러한 정황에서 적당한 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명의 단일 클론 항체(Mabs)는 통상의 항-CD127 항체에 대하여 본 발명자들이 관찰한 것과는 대조적으로 TSLP-유도 수지상 세포 성숙을 증가시키지 않는다. 부가적으로 또는 선택적으로, 본 발명의 항체는 CD127의 내재화를 유도하지 않고/않거나 CD127의 IL7-유도 내재화를 억제한다. 특정의 구현예에서, 본 발명에서 제공된 항체는 IL-7/IL-7-R 신호전달에 대한 길항 특성과 DC 성숙- 및/또는 내재화-관련 특성을 겸비한다. 특정의 구현예들에서, 본 발명의 항체는 특히 생체 내에서 T 세포에서 α4, β7 및 α4/β7의 IL7-유도 발현을 억제한다. 따라서, 새로운 작용 기작을 갖는 이러한 Mab 들은 CD127 표적화의 치료적 이점을 평가하기 위한 새로운 생성물들을 구성한다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 바람직한 항체에 의해 인식되는 에피토프를 개시함으로써, 관련 에피토프에 결합하고 원하는 특징을 보존하는 선택적인 항체 및/또는 이의 항원-결합 도메인 또는 다른 형태의 폴리펩티드 유래의 구조적으로 관련된 항원-결합 도메인의 용이한 개발을 가능하게 한다.
N13B2에 의해 인식되는 CD127 유래의 에피토프는 배열(array) 기반 올리고펩티드 스캐닝(‹š때로 중첩 팹티드 스캔 또는 팹스캔(pepscan) 분석이라고도 부름)에 의해 확인되었고, ep1 (서열번호 110), ep2 (서열번호 111) 및 ep3 (서열번호 86)의 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 기법은 표적 단백질의 중첩 및 비중첩 단편들 유래의 올리고펩티드 서열의 라이브러리를 이용하고, 관련 항체를 결합하기 위한 그 단편들의 능력을 검사한다. 표적 단백질의 상이한 부분들 유래의 인접하지 않은 펩티드 서열들을 결합하고 이러한 결합 된 펩티드에 구조적인 강성을 부여함으로써(예를 들어 CLIPS 지지체를 사용함으로써)(Timmerman 등, 2007), 매우 높은 신뢰성 및 정밀도를 가지고서 불연속적인 에피도프가 지도작성될 수 있다(Cragg, 2011) (Gaseitsiwe 등, 2010). 단백질분해 보호 과정을 이용한 상기 에피토프의 추가의 확인은, 그 구조적 에피토프가 서열번호 115, 서열번호 116 및 서열번호 117의 서열을 갖는 인간 CD127의 아미노산 서열을 포함한다는 확인을 가능하게 했다. 따라서, 상기 에피토프는 CD127의 2b 부위 유래의 서열을 포함한다. 또한, 상기 에피토프는 CD127의 도메인 D1 및 D2 모두의 서열을 포함하고, 더욱 구체적으로는 2b 부위 유래의 서열과 함께 D1 도메인 유래의 서열들을 포함한다. 본 발명에 따른 에피토프는 아래에 더욱 상세히 기재되어 있다. 특히, 상기 에피토프는 천연 CD127에서 그의 구조적 배열에서 서열번호 115 (또는 서열번호 110), 서열번호(또는 서열번호 86) 및 서열번호 117(또는 서열번호 111)로 구성된다.
특정의 구현예에서, 상기 단일 클론 항체는 표적 CD127+ 세포에 대하여 세포독성 작용을 나타내어 그 세포들의 수를 물리적으로 감소시키기도 한다 (아집단의 축소).
따라서, 본 발명은 항체, 항체의 항원-결합 단편, 또는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 키메라 분자와 같은 거대분자에 관한 것으로, 상기 거대분자는 (i) 항체-항원 상호작용을 통해 IL-7에 대한 수용체(CD127로 나타냄)의 알파 사슬, 특히 인간 CD127 양성 세포에 의해 발현된 IL-7 수용체의 알파 사슬을 특이적으로 결합하고, (ii) TSLP에 의해 유도된 수지상 세포 성숙(예를 들어, 세포 표면 항원인 CD80 및/또는 CD40)의 발현 증가에 특징이 있는)을 증가시키지 않고, 및/또는 (iii) CD127의 내재화를 유도하지 않고/않거나 CD127의 L7-유도 내재화를 억제한다.
본 발명의 특정 구현예에서, 상기 거대분자는
다음 아미노산 서열:
- VHCDR1 서열번호 10;
- VHCDR2 서열번호 12;
- VHCDR3 서열번호 14 또는 서열번호 48;
- VH 서열번호 22
중 적어도 하나를 포함하는 VH 사슬, 및/또는
다음 아미노산 서열
- VLCDR1 서열 번호 16 또는 서열 번호 50;
- VLCDR2 서열 번호 18 또는 서열 번호 52;
- VLCDR3 서열 번호 20;
- VL 서열 번호 24
중 적어도 하나를 포함하는 VL 사슬을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 거대분자는 CD127을 발현하는 인간 T 세포(CD127+ 세포)에 대하여 세포독성 활성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 거대분자는 CD127을 발현하는 인간 T 세포(CD127+ 세포)에 대하여 세포독성 활성을 나타내지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 거대분자를 포함하는 조성물, 상기 거대분자를 얻는 방법 및 상기 거대분자 및 조성물의 용도에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 것으로, 거대분자는 500 Da 초과의 분자량을 갖는 임의의 분자, 특히 생물 기원의 분자 또는 생물 기원의 단편을 포함하는 분자를 가리킨다. 거대분자로는 폴리펩티드 및 글리코실화 폴리펩티드 또는 이의 접합체(conjugate)들과 같은 변형된 폴리펩티드가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 것으로, "항체-항원 상호작용을 통해 CD127을 특이적으로 결합하는" 거대분자는 상기 거대분자와 CD127 사이의 상호작용이 CD127에 특이적인 항체와 CD127 사이의 것들과 동일한 상호작용으로 본질적으로 구성된다는 것을 의미한다. 특히, 상기 거대분자는 CD127 단백질과의 동일한 화학적 결합의 형성을 가능하게 하는 공간 구조에서 상기 상호작용에 관여하는 항체 잔기들을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 거대분자는 항체의 VH 사슬 및/또는 VL 사슬의 적어도 하나의 CDR 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 거대분자는 항체의 VH 사슬 및/또는 VL 사슬의 모든 CDR 서열들을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 거대분자는 항체의 전체 VH 사슬 및/또는 전체 VL 사슬을 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 거대분자는 하기와 같이 정의된(하기의 특징들 중 적어도 하나에 의해 정의된) 에피토프를 인식하도록 생성, 디자인 및 선택된다:
(a) 상기 에피토프는 서열, 특히 CD127의 2b 부위, 특히 서열번호 114의 아미노산 109 내지 127, 더욱 특히 서열번호 114의 아미노산 110 내지 125, 110 내지 120, 112 내지 120, 더욱 특히 서열번호 114의 아미노산 114 내지 119 (서열번호 116에 해당)로부터 선택된 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7개의 연속적인 아미노산들을 포함하고, 특히 상기 에피토프는 서열번호 116을 포함하고, 특히 서열번호 86을 포함하며; 특히 상기 에피토프는 CD127의 P112 또는 L115를 포함하고;
(b) 상기 (a)의 특징 외에도, 상기 에피토프는 서열, 특히 CD127의 D1 도메인, 특히 서열번호 114의 아미노산 1 내지 98로부터 선택된 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7개의 연속적인 아미노산들을 포함하고, 특히 상기 에피토프는 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함(특히 ep1의 아미노산 서열(서열번호 110)의 아미노산 서열을 포함)하고;
(c) 상기 (a) 및 선택적으로 상기 (b)의 특징 외에도, 상기 에피토프는 서열, 특히 서열번호 114의 아미노산 180 내지 220, 특히 190 내지 200으로부터 선택된 3, 4, 5, 6 또는 7개의 연속적인 아미노산을 포함하고, 특히 상기 에피토프는 서열번호 117의 아미노산 서열을 포함하고, 특히 ep2의 아미노산 서열(서열번호 111)을 포함하고;
(d) 상기 에피토프는 서열번호 115의 서열 및 서열번호 116의 서열을 포함하거나, 상기 에피토프는 서열번호 117의 서열 및 서열번호 116의 서열을 포함하고, 특히 상기 에피토프는 서열번호 115, 서열번호 116 및 서열번호 117의 서열을 포함하고;
(e) 상기 에피토프는 상기 (a), (b) (c) 및/또는 (d)에서 정의된 바와 같은 CD127의 서열을 포함하고, 명백히 언급된 것들 이외의 CD127의 다른 아미노산 서열(3, 4 또는 5개의 연속적인 아미노산 서열)을 포함하지 않고, 즉, 특히 상기 에피토프는 CD127 유래의 하기의 서열들만을 포함하며:
- 부위 2b로부터 선택된 하나의 서열로서, 특히 서열번호 114의 아미노산 109 내지 127, 또는 서열번호 114의 110 내지 125, 110 내지 120 또는 112 내지 120, 또는 서열번호 114의 아미노산 114 내지 119(서열번호 116에 해당), 또는 서열번호 86에 해당되는 서열로 이루어지고, 및/또는 부위 2b로부터 선택된 3개의 아미노산 또는 3, 4, 5, 6, 7개 초과의 아미노산 또는 19개 아미노산 또는 19, 18, 15, 11개 미만의 아미노산 서열, 특히 CD127의 P112 또는 L115를 포함하는 서열로 이루어지는, 서열;
- 임의로, 부위 2b의 서열에 부가적으로, CD127의 도메인 D1로부터 선택되는 하나의 서열, 특히 서열번호 114의 아미노산 98로부터 선택된 하나의 서열, 특히 서열번호 110 또는 서열번호 115로 구성되고, 및/또는 서열번호 115를 포함하거나 서열번호 115의 서열에 포함되는 3개 아미노산 또는 3, 4, 5, 6, 7개 초과의 아미노산 및 20개 아미노산 또는 20, 18, 16, 11개 미만의 아미노산들의 서열로 구성되는 서열;
- 임의로, 부위 2b의 서열 및 존재하는 경우 도메인 D1 유래의 선택적인 서열 외에도, 서열번호 114의 아미노산 서열 180 내지 220으로부터 선택된 하나의 서열, 특히 서열번호 111 또는 서열번호 117로 구성되고/되거나, 서열번호 117을 포함하거나 서열번호 117에 포함되는 3개 아미노산 또는 3, 4, 5, 6, 7개 초과의 아미노산 및 20개 아미노산 또는 20, 18, 16, 11개 미만의 아미노산의 서열로 구성되는 하나의 서열;
상기 에피토프는 어쩌면 추가의 아미노산을 포함하며, 단 이들 아미노산은 CD127의 서열로부터 선택되지 않고(즉, 상기 에피토프는 부위 2b 유래의 서열과는 별개인 CD127의 서열 유래의 3, 4 또는 5개 초과의 연속적인 아미노산을 포함하지 않고 어쩌면 도메인 D1 및 전술한 서열번호 114의 아미노산 180 내지 220 유래의 선택적인 서열을 포함하지 않음);
(f) 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)에서 기재된 특징 외에도, 상기 에피토프는 서열번호 114의 영역 99 내지 108로부터 선택된 3, 4 또는 5개 초과의 연속적인 아미노산을 포함하지 않고, 서열번호 114의 영역 128 내지 179로부터 선택된 3, 4 또는 5개 초과의 연속적인 아미노산을 포함하지 않고/않거나 서열번호 114의 영역 220 내지 239로부터 선택된 3, 4 또는 5개 초과의 연속적인 아미노산을 포함하지 않고, 특히 서열번호 114의 영역 99 내지 108, 128 내지 179 및 220 내지 239로부터 선택된 3, 4 또는 5개 초과의 연속적인 아미노산을 포함하지 않고;
(g) 상기 에피토프는 상기 (a), (b), (c), (d), (e) 및/또는 (f)에서 정의된 바와 같은 CD127의 서열들의 조합을 포함하는데, 여기서의 몇몇 아미노산들은 돌연변이, 특히 결실 및/또는 치환되어 있고, 특히 유사한 특성을 갖는 아미노산에 의해 치환되어 있고(보존적 치환); 특히 상기 에피토프는 적절한 경우 상기 (b), (c) 또는 (d)에서 정의된 바와 같은 조합으로 상기 (a), (b), (c), (d), (e) 및/또는 (f)에서 정의된 바와 같은 CD127의 서열과 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열들로 구성되거나 그 서열들을 포함하고;
(h) 상기 에피토프는 상기 (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및/또는 (g)에서 정의된 특징을 갖는 구조적인 에피토프이고, 즉 천연 CD127(단량체로서 또는 γc와의 이합체로서 및/또는 IL-7과 결합된)내의 상기 서열들의 구조를 모방하는 구조 내에서 (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및/또는 (g)에 정의된 바와 같은 서열들을 포함하거나 그 서열들로 구성되고;
(i) 상기 에피토프는 상기 (a), (b), (c), (d), (g) 및/또는 (h)의 특징을 갖는 CD127의 단편(즉, 연속적인 아미노산들의 스트레치)을 포함하고;
(j) 상기 에피토프는 상기 (g)에서 정의된 특징을 갖고, 예측가능한 구조를 갖는 펩티드 어셈블리의 합성을 가능하게 하는 CLIPS 기술과 같은 기술에 의해 얻어진다.
(b) 및 (c)의 특징을 갖는 에피토프의 특정 구현예에서, 상기 에피토프는 두 개의 서열인 ep1 및 ep2의 사이에 삽입되는 CD127의 아미노산 서열을 포함하고, 임의의 것을 포함하도록 선택적으로 연장되지 않거나, 이들 서열의 상류(즉, ep1의 서열의 N-말단) 및/또는 하류 (즉, ep2의 서열의 C-말단)측의 인간 CD127 서열의 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하도록 연장되지 않는다. 다른 특정의 구현예에서, 상기 에피토프는 상기 ep1 또는 ep2 서열 중 어느 것도 인간 CD127 서열내의 그들의 인접 아미노산들 중 임의의 것을 포함하거나, ep1 및 ep2의 사이에 삽입되는 인간 CD127의 서열 내의 그들의 아미노산 서열들에서 선택된 7, 5 또는 1개 초과의 아미노산들을 포함하도록 연장되지 않으며, 이 경우 상기 ep1 및 ep2 서열들의 연장부는 위와 같은 (ep1)의 상류측 또는 (ep2)의 하류측으로 제한될 수 있다. 특정의 구현예에서, 상기의 에피토프 서열을 포함하는 CD127의 서열은 ep1에 인접한 1개 초과의 N-말단 아미노산 또는 7개 초과의 C-말단 아미노산만큼, 또는 ep2에 인접한 30개 초과의 N-말단 아미노산 또는 30개 초과의 C-말단 아미노산만큼 인간 CD127 서열 유래의 그들의 인접 아미노산을 포함하도록 연장되지 않는다.
CD127의 서로 접촉하지 않는 아미노산 서열들(즉, CD127의 1차 서열 내의 서로 접촉하지 않는 서열)을 포함하는 에피토프를 인식하도록 거대분자가 생성, 디자인 또는 선택되는 구현예에서, 상기 CD127 서열들 중 하나를 포함하는 에피토프를 인식하는 항체를 생성 또는 선택한 다음, 이들 항체들 중에서, 다른 CD127 서열(들)을 인식하는 것들을 선택하는 것이 가능하다(두 개 초과의 인접하지 않는 CD127 서열들이 인식되어야 하는 경우 상기 후자의 선택은 연속적인 선택들을 통해 수행될 수도 있다).
또한, 본 발명은 본 발명의 길항 항체(antagonist antibodies)에 의해 인식되는 구조적 에피토프를 포함한다. 또한, 본 발명은 상기 구조적 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 그 구현예들은 (i) 서열번호 115와 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 갖는 도메인 및/또는 서열번호 117과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 갖는 도메인, 및 (ii) 서열번호 116과 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 갖는 도메인을 포함하는 CD127 구조적 에피토프를 포함한다. 더욱 구체적으로, 상기 CD127 구조적 에피토프는 서열번호 114 내지 119의 아미노산 잔기 73 내지 79 및/또는 서열번호 114의 아미노산 잔기 193 내지 196을 포함한다. 본 발명은 이러한 구조적 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 특정의 구현예에서, 상기 거대분자는 서열번호 115, 서열번호 116 및 서열번호 117의 서열들을 갖는 인간 CD127의 아미노산 서열을 포함하는 구조적 에피토프를 인식하도록 생성, 디자인 및 선택된다.
특히, 상기 구현예들에 있어서, 상기 항체는 기재된 에피토프로 구성되거나 그 에피토프를 포함하는 면역원에 대하여 생성된다. 즉, 상기 에피토프는 에피토프로 구성되거나 그 에피토프를 포함하는 면역원을 이용하여 인간이 아닌 동물, 특히 포유동물을 면역화함으로써 초기에 생성된다. 따라서, 본 발명은 그의 에피토프가 전술한 바와 같은 것인 항원, 특히 항체의 제조에서 면역원으로서의 이의 용도 및/또는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 다른 거대분자를 제조하기 위한 선별 및/또는 검사 방법에서 이의 용도에 관한 것이기도 하다. 또한, 본 발명은 상기 항원을 이용한 상기 방법에 관한 것이다. 항원은 펩티드성 성분 외에도 비펩티드성(non-peptidic) 성분을 포함할 수 있고, 및/또는 에피토프의 일부를 형성하지 않는 펩티드성 성분을 포함할 수 있으므로, 본원에서는, 달리 언급하지 않거나 문맥으로부터 명백하지 않은 경우, 항원의 서열 및/또는 상기 서열의 특징이 언급되는 경우, 상기 서열 또는 특징은 그 항원의 에피토프 부분의 서열(또는 이의 특징)을 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 항원이 상기 에피토프의 일부를 형성하지 않는 아미노산들을 포함하는 경우, 상기 아미노산들은 CD127의 3, 4 또는 5개 초과의 연속적인 아미노산들을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
따라서, 기술적으로 관련이 없는 것으로 보이지 않는 한에 있어서는, 항체 또는 이들의 단편에 대하여 본원에 개시된 정의 및 특징은 본 발명의 임의의 거대분자에 마찬가지로 적용된다.
CD127의 결합(Binding of CD127)
본 발명에 따라, IL-7Rα 단백질에의 "결합"은 항원-항체 타입 상호작용을 의미하는 것으로, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 "특이적 결합" 특성을 포함하고, 상기 특이적 결합은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 IL-7Rα 단백질에 결합하지만 다른 단백질(예를 들어, 공통적인 사이토카인 수용체 γ-사슬)과 결합하지 않거나 유의하게 약한 친화력으로 결합한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 특히 시험 용액의 pH 및/또는 염 함량의 측면에서 생리학적 조건에서 정의 및/또는 결정되는 것이 바람직하다. 결합 및 결합 특이성은 구현예들에서 개시된 시험법에 따라 분석될 수 있고, 특히 Biacore, ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석될 수 있다.
본 발명의 특정의 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TSLP-수용체에서 복합체화되는 경우 IL-7-R 알파 사슬을 표적하여 그에 결합 된다(CCRF2의 경우; Genbank 기탁 번호 AF338733; Reche 등, 2001 ).
특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편 또는 키메라 분자는 5E-10 M 미만의 해리 상수(Kd)를 갖는 분리된 단백질로서 CD127에 결합한다. 바람직한 구현예에서, 상기 해리 상수(Kd)는 1E-10 M 미만 또는 9E-11M 미만 또는 5E-11M 미만이다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편 또는 키메라 분자 또는 다른 거대분자는 ep1의 서열(서열번호 110) 및/또는 ep2의 서열(서열번호 111)을 포함하는 인간 CD127의 항원에 결합한다. 특정의 구현예에서, 상기 항원은 ep1 및 ep2 모두를 포함하는 인간 CD127의 단편을 포함한다(즉, 상기 항원은 ep1 및 ep2의 서열 및 인간 CD127의 삽입(intercalated) 서열을 포함한다). 다른 구현예에서, 상기 항원은, 아마도 인간 CD127 서열과 구별되는 다른 기원의 다른 서열 외에도, 인간 CD127 유래의 ep1 및 ep2 서열만을 포함한다. 여전히 다른 구현예에서, ep1 및/또는 ep2 서열은 인간 CD127 유래의 몇 개의 추가의 아미노산, 특히 ep1의 N-말단인 1개 이하의 아미노산, ep1의 C-말단인 7개 이하의 아미노산, ep2의 N-말단인 1, 10, 20 또는 30개 이하의 아미노산, ep2의 C-말단인 7, 10, 20 또는 30개 이하의 아미노산을 포함한다. 특별한 항원으로는 하기의 것들이 있다: 특히 ep1 및 ep2 모두를 포함하는 위와 같은 항원으로서, ep1을 포함하는 CD127의 서열이 인간 CD127의 서열 내의 상기 서열에 인접한 아미노산들을 포함하도록 연장되지 않거나, 인간 CD127의 서열 내의 ep1의 1개 초과의 N-말단 아미노산 또는 7개 초과의 C-말단 아미노산을 포함하도록 연장되지 않는, 항원; 및 위와 같은 항원으로서, ep2를 포함하는 CD127의 서열이 인간 CD127의 서열 내의 상기 서열에 인접한 아미노산들을 포함하도록 연장되지 않거나, 인간 CD127의 서열 내의 ep2의 30개 초과의 N-말단 아미노산 또는 30개 초과의 C-말단 아미노산을 포함하도록 연장되지 않는, 항원; 및 이러한 특징들을 모두 갖는 항원. 특정의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 단편 또는 키메라 분자 또는 다른 거대분자는 서열번호 115, 서열번호 116 및 서열번호 117의 서열을 포함하는 인간 CD127의 항원에 결합한다.
몇몇 구현예에서, 상기 항원은 C1GM, C2M3, P3A9, P4B3, P2D2, P2E11, HAL403a 및 HAL403b (WO 2011104687 A1호에 기재됨)으로 이루어진 군에서 선택된 단일 클론 항체에 의해 인식되는 IL-7R의 에피토프와 겹치지 않거나 그 에피토프를 포함하지 않는다. 몇몇 구현예에서, 상기 항체는 항원에 대하여 생성되거나, 인터루킨-7 수용체 알파의 잔기 I82, K84, K100, T105 및 Y192 중 임의의 것을 포함하지 않거나 몇몇을 포함하지 않는 에피토프에 결합하는데, 특히 상기 에피토프는 K100를 포함하지 않고/않거나 T105를 포함하지 않는다. 몇몇 구현예에서, 상기 항원 또는 에피토프는 K194를 포함하지 않거나, 인간 IL-7R의 잔기 D190, H191 및 K194로 이루어진 군에서 선택된 잔기들 중 임의의 것을 포함하지 않거나 전부를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 항원 또는 에피토프는 I82 또는 K84를 포함하지 않거나, K100 또는 T105를 포함하지 않거나, Y192를 포함하지 않거나, D190, H191, Y192 또는 K194를 포함하지 않는다.
CD127은 IL-7R 및 TSLPR 모두에 공통이지만, 항-CD127 항체가 두 문맥에서 CD127을 반드시 인식(즉, 적당한 조건에서 결합)하지는 않는다는 것을 유념하여야 한다. 또한, 항체가 IL-7R 및 TSLPR의 문맥 모두에서 CD127에 결합하는 경우에도, 이는 IL-7-IL-7R 상호작용 및 TSLP-TSLPR 상호작용에 반드시 동일한 영향을 미치는 것은 아니다. 예를 들어, 이는 TSLPR에 대한 TSLP의 결합이 아니라 IL-7R에 대한 IL-7의 결합을 방지할 수 있었다. 또한, 어느 수용체에의 그 항체의 결합은 리간드-수용체 상호작용에 대한 여러 영향을 넘어서는 여러 영향을 미칠 수 있다. 실제로, 그 항체의 결합은 리간드와 독립적으로 또는 리간드와 조합으로 수용체의 구조를 변형함으로써, 그 수용체를 활성화 또는 불활성화할 수 있다. 그 영향은 수용체 마다 다를 수 있고, 실제적으로 반대로 될 수 있는 있는데, IL-7R를 불활성화하는 항체는 TSLPR 활성화할 수 있고, 그 반대일 수 있다.
본원에서 사용되는 것으로, 수용체를 활성화하는 것은 그의 수용체에의 리간드의 결합시 발생하는 생화학적 변화들 중 적어도 몇몇을 유발하는 것을 의미한다. 이러한 변화로는 수용체 구조의 변형(예, 이합체화(dimerization)); 수용체의 인산화 및 수용체-결합 단백질(야누스 키나아제, STAT 전사 인자 등)의 동원(recruitment) 및/또는 인산화 및/또는 수용체의 세포 내 위치(cellular localization; 예, 수용체 내재화)로의 변화를 들 수 있다. 본원에서 사용되는 것으로, 수용체를 불활성화하는 것은 수용체에의 그의 리간드의 결합과 관련이 있는 화학적 변형들 중 적어도 몇몇을 방지 또는 복귀하는 것을 의미한다. 예를 들어, 수용체는 본 발명의 항체와 같은 작용제의 존재하에서 항시 활성화(즉, 리간드의 분재하에서도 활성화) 및 불활성화될 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 수용체를 불활성화함으로써 리간드-유도 활성화가 완전히 또는 부분적으로 억제될 수 있다. 따라서, 불활성화는 다른 기작(mechanism)들 중에서, 리간드의 결합 (및 이후의 "활성화" 상태)를 방지, 및/또는 리간드의 결합 (및 이후의 "활성화" 상태)를 방지, 및/또는 리간드의 결합과 관련된 구조적 변화(이합체화)를 방지, 및/또는 수용체의 세포 내 위치의 변경을 방지함으로써 발생할 수 있다(예를 들어, 불활성화제는 수용체 내재화 및/또는 분해를 유발하여 리간드에 의한 활성화를 방지할 수 있다).
증가된 TSLP-유도 수지상 세포 성숙의 부재
본 발명의 항체는 TSLP 수용체 내의 CD127에 결합할 수 있다(즉, CD127이 CRLF2와 복합체 상태로 존재하여 TSLP 수용체를 형성하는 경우 상기 항체가 CD127에 결합할 수 있다). 따라서, 본 발명의 항체는 TSLP-유도 및/또는 TSLP 수용체-매개 신호전달을 방해할 수 있다.
놀랍게도, 본 발명자들은 TLSP 수용체 내의 CD127에 대항하는 (CD127을 인식하는) 것이고 TSLP-TSLPR 상호작용에 일부의 길항작용을 나타내는 기존의 항체들은 그럼에도, TSLP에 의해 유도된 수지상 세포 성숙을 증가시키고, 상기 성숙은 TSLP 및 항체를 이용하여 처리한 세포의 경우에 TSLP 단독을 이용하여 처리한 세포의 경우보다 높다는 것을 확인했다. 이러한 통상적인 항체들은 TSLP-의존적 수지상 세포 성숙을 증가시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 단편은 면역 세포, 특히 수지상 세포의 성숙을 위해 TSLP 와 상승작용하지 않는다. 즉, 본 발명의 항체는 TSLP에 의해 유도된 면역 세포 성숙을 증가시키지 않는다. 이러한 영향은 수지상 세포 성숙에 대하여 특히 바람직한 것이다.
TARC의 TSLP-유도 생성을 억제하기 위한 항-CD127의 능력은 TSLP-유발 신호전달 및 이의 하류측 결과(특히 수지상 세포 성숙)에 대한 항체의 소극적인 (또는 적어도 적극적이지 않은) 영향의 유효한 예측인자(predictor)로 고려될 수 없다는 것이 강조되어야 한다. 실제로, 본 발명자들이 확인한 바와 같이, TARC의 TSLP-유도 생성을 효율적으로 억제하는 항체 조차도 TSLPR을 이용한 CD40 또는 CD80의 발현에 측정된 바와 같이 수지상 세포의 TSLP-의존적 성숙을 증가시킬 수 있다.
TSLP-유도 수지상 세포 성숙은 몇몇 면역 세포의 성숙, 특히 몇몇 자가면역 질환, 천식 및 이식에서 관찰되는 이른바 TH-2 분화의 결정자(determinant)인 마커로서 세포 마커 CD40 및/또는 CD80의 발현을 통해 측정된다(Inaba 등, 1995; Watanabe 등, 2005b). 특별한 구현예에서, TSLP에 의해 유도된 수지상 세포 성숙의 증가는 TSLP 단독으로 처리된 TSLPR-양성 세포와 비교하여, TSLP로 처리하고 본 발명의 거대분자로 처리한 TSLPR-양성 세포에서 세포 표면 마커인 CD40 및/또는 CD80의 증가된 발현을 확인함으로써 평가된다.
특정의 구현예에서, TSLP-유도 수지상 세포 성숙을 증가시키지 않는 거대분자, 특히 항체 또는 이의 단편은 CD80의 발현을 TSLP 단독(거대분자 없음)을 이용한 자극과 비교하여 25% 초과만큼 증가시키지 않는다. 바람직하게, 상기 CD80의 발현은 20% 초과, 바람직하게는 10% 초과, 더욱 바람직하게는 5% 초과만큼 증가되지 않는다. 특정의 바람직한 구현예에서, 상기 CD80의 발현은 TSLP 단독으로 자극한 세포와 비교하여 TSLP 및 거대분자로 자극한 세포에서 증가되지 않거나 감소된다.
특정의 구현예에서, TSLP-유도 수지상 세포 성숙을 증가시키지 않는 거대분자는 CD40의 발현을 TSLP 단독(거대분자 없음)을 이용한 자극과 비교하여 50% 초과만큼 증가시키지 않는다. 바람직하게, 상기 CD40의 발현은 약 25% 초과, 바람직하게는 약 10% 초과, 더욱 바람직하게는 5% 초과만큼 증가되지 않는다. 특정의 바람직한 구현예에서, 상기 CD40의 발현은 TSLP 단독으로 자극한 세포와 비교하여 TSLP 및 거대분자로 자극한 세포에서 증가되지 않거나 감소된다.
또한, 수지상 세포 성숙의 측정이 실시예(특히 실시예 9 참조)들에서 예시되어 있고, 당업자에게 알려진 임의의 표준 방법, 특히 수지상 세포 성숙의 마커로서 수지상 세포 상의 CD80 및/또는 CD40 발현을 측정하는데 적합한 임의의 방법에 따라 수행될 수 있다.
TSLP 신호전달의 바람직하지 못한 강화의 부재에 대한 항-CD127의 특성을 분석하기 위하여, 포유동물의 pro B 세포(본원에서 예시한 BA/F3 세포와 같은)와 같은 TSLPR 발현 세포가 사용될 수 있다.
α4, β7 및 α4/β7의 IL7-유도 발현의 억제
특정 구현예에서, 본 발명의 항체(또는 거대분자)는 시험관 내(in vitro)에서 α4, β7 및 α4/β7 인테그린의 IL7-유도 발현을 억제한다. 본원에서 사용되는 것으로, α4, β7 및 α4/β7 인테그린의 IL7-유도 발현은 α4 및 β7 인테그린의 발현 수준의 증가 및 α4, β7 및/또는 α4/β7을 발현하는 T 림프구의 수 또는 비율의 증가 중 어느 하나 또는 둘 모두를 지칭한다. 그 억제는 부분적일 수 있다. 즉, IL7의 존재하에서 α4, β7 및 α4/β7 인테그린의 발현 수준은 항체의 존재하에서는 기선 수준(즉, 항체 또는 IL7이 없는 경우의 수준)과 비교하여 증가되지만, 항체의 부재하에서는 감소된다. 그렇지 않으면, 상기 억제는 완전할 수 있다. 즉, IL7 및 항체의 존재하에서 α4, β7 및 α4/β7 인테그린의 발현 수준은 기선 수준보다 높지 않다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 항체는 시험관 내에서 α4, β7 및/또는 α4/β7 인테그린의 발현을 억제한다. 즉, α4, β7 및/또는 α4/β7 인테그린의 발현 수준은 무처리 세포(즉, 항체 또는 IL7이 없음)에서 보다는 항체로 처리한 세포(IL7이 있거나 없음)에서 더욱 낮다. 그 억제의 정도는 용량 의존적일 수 있다. 그 발현의 억제는 당업자가 예를 들어 본원에 개시된 특정 항체, 항체 단편 또는 항원 결합 도메인 또는 다른 거대분자에 적용시킬 수 있고/있거나 필요한 경우 특정 질환 모델에 적용시킬 수 있는 실시예 부분에서 기재한 바와 같이 측정될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체(또는 거대분자)는 생체 내에서 α4, β7 및/또는 α4/β7 인테그린의 발현을 억제한다. 본원에서 사용되는 것으로, 이러한 발현은 (i) α4, β7 및/또는 α4/β7 인테그린의 발현, (ii) α4, β7 및/또는 α4/β7-양성 T 림프구의 수 및/또는 비율, 및/또는 (iii) α4, β7 및/또는 α4/β7-양성 T 림프구의 생착(engraftment)이 무처리 시료와 비교하여 항체 처리한 동물 유래 시료에서 감소 된다는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 것으로, 생착은 일반적으로 수 시간 내지 수 일의 시간에 걸쳐 일어나는 과정으로서, 숙주의 신체내로 이식된 조직 또는 세포가 혼입되는 것을 의미한다. 특정의 구현예에서, 상기 동물은 포유동물, 특히 비인간 포유동물, 특히 마우스이다. 특정의 구현예에서, 상기 동물은 인간이다. 특정의 구현예에서, 효과는 수용체 동물, 바람직하게는 면역결핍 마우스에 주입된 인간 림프구에서 관찰된다. 특정의 구현예에서, 면역결핍 마우스에의 인간 PBMC의 주입 후 2주째에, 인테그린 β7-양성 T 세포의 평균 백분율은 무처리 마우스와 비교하여 항체 처리된 마우스에서 적어도 25 %, 바람직하게는 적어도 50% 만큼 감소 된다. 특정의 구현예에서, 면역결핍 마우스에의 인간 PBMC의 주입 후 2주째에, 인테그린 β7-양성 생착 T 세포의 평균 백분율은 무처리 마우스와 비교하여 항체 처리된 마우스에서 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 70% 만큼 감소 된다. 본 발명의 항체 또는 거대분자의 효과는 당업자가 예를 들어 본원에 개시된 특정 항체, 항체 단편 또는 항원 결합 도메인 또는 다른 거대분자에 적용시킬 수 있고/있거나 특정 질환 모델에 필요에 따라 적용시킬 수 있는, α4/β7 인테그린의 발현 및 생착에 대한 실시예 부분, 특히 실시예 16에 기재된 방법을 이용하여 확인될 수 있다.
CD127 내재화의 억제제
내재화(Internalization)는 CD127과 같은 세포 표면 수용체가 세포질 공간 내(어쩌면 세포 내 구획 또는 막의 내부/표면)에 운반되어 세포 외 공간에 더이상 접근할 수 없게 되는 세포 과정이다. 즉, 내재화된 세포는 세포 외 공간에서 리간드와 직접 접촉할 수 없다. 리간드는 수용체의 천연 리간드이건 또는 임의의 인위적인 리간드이건 또는 수용체에 결합 된 다른 분자이건 상관없이, 수용체와 함께 내재화될 수 있다. 대부분의 수용체들은 일정한 내재화를 받고, 이들의 세포 표면 발현은 새로이 합성/성숙 된 수용체에 의한 내재화 및 분해된 수용체의 교체를 통해서 또는 직접 재순환, 즉, 내재화된 수용체의 세포 표면으로의 귀환 운반을 통해 일정하게 유지된다.
몇몇의 자극은 내재화 속도의 증가 및/또는 교체/재순환 속도의 감소를 유도하여, 수용체의 세포 표면 발현의 순수한 증가를 유도할 수 있다. 본원에서 사용되는 것으로, CD127의 IL7-유도 내재화는, 전사의 하향 조절과 같은 더욱 긴 기간의 영향을 배제하기 위하여 제한된 배양(incubation) 시간 후 시험관 내에서 관찰되는 것으로 세포외 배지에서 IL7의 존재에 의해 유도된(또는 IL-7의 존재하에서 관찰된) CD127의 세포 표면 발현의 감소를 지칭한다. 상기 제한된 시간은 일반적으로는 10분 정도, 바람직하게는 2시간 미만, 더욱 바람직하게는 1시간 미만, 아주 더 바람직하게는 45분 이하, 30분 이하 또는 15분 이하이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 CD127의 IL7-유도 내재화를 억제한다. 따라서, 본 발명의 항체와 함께 배양시, IL7의 존재는 항체가 없이 배양된 세포와 비교하여, CD127의 세포 표면 발현의 감소를 유도하지 않거나, CD127의 세포 표면 발현의 덜 강력한 감소를 유도한다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 항체와 함께 배양시, 세포가 37℃에서 15분간 5 ng/mL IL7과 함께 배양되는 때의 CD127 세포 표면 발현 수준은 IL7이 없이 배양된 세포의 경우의 세포 표면 발현 수준의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90% 이다. 시험관 내에서, 상기 세포 표면 발현은 위에서 나타낸 바와 같이 제한된 시간 후에 측정되는 것이 바람직하다. 게다가, 대부분의 세포 내재화 과정이 저온에서 억제되므로, 그 효과는 생리학적 온도, 특히 37℃에서 일반적으로 가잘 잘 관찰된다. 그러나, 저온, 특히 4℃에서 세포를 배양하는 것도 고려된다.
수용체에 대한 항체는 그 수용체의 내재화를 유도할 수 있다는 것이 알려져 있으므로, 그 수용체의 세포 표면 발현은 그 항체의 존재하에서 감소 된다는 것을 알 수 있다. 특히 이는 천연의 내재화 유도 리간드에 의해 유도된 것을 모방하는 수용체 구조 변화를 유도함으로써 발생할 수 있고, 이러한 영향은 항체에 의해 인식되는 에피토프에 의존할 수 있다. 본원에서 사용되는 것으로, "항체가 CD127의 내재화를 유도한다"는 항체의 존재하에서 배양된 세포가 항체의 부재하에서 배양된 세포와 비교하여 CD127의 세포 표면 발현의 감소를 나타낸다는 것을 의미한다. 세포 표면 발현은 위에서 언급한 바와 같은 온도 조건에서 제한된 배양 시간 후에 시험관 내에서 측정되는 것이 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 CD127의 내재화를 유도하지 않는다. 따라서, 그 항체의 존재하에서 배양된 세포에서 CD127의 세포 표면 발현 수준은, 동일한 조건하에서 배양되었지만 항체의 부재하에서 배양된 세포의 경우의 세포 표면 발현과 비교하여 감소 되지 않거나 유의하게 감소 되지 않는다. 특정의 구현예에서, 50 ng/mL의 항체의 존재하에 37℃에서 30 내지 45분간 배양시, CD127의 세포 표면 배양 수준은 그 항체의 부재하에서 배양된 세포 내의 그 수준의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%이다. 이러한 영향은 IL7의 부재(항체 처리 및 항체 무처리 세포에서)의 경우, IL7의 존재의 경우, 및/또는 둘 모두의 경우에 관찰될 수 있다.
전술한 두 CD127 내재화-관련 특징 중 어느 것(IL7-유도 내재화의 억제 또는 내재화의 비유도(non-induction))도 항체의 효율의 증가에 기여할 수 있지만, 그 두 특징들의 조합이 어쩌면 아주 더 효율적이다. 본원에서는 바람직한 구현예를 나타내는 항체로서, IL7 및 상기 항체의 존재하에서 CD127의 세포 표면 발현이 유의하게 감소 되지 않는, 항체를 개시한다. 이러한 바람직한 구현예에서, 37℃에서 5 ng/mL IL7의 존재하에서 15분을 비롯한, 50 ng/mL의 항체의 존재하에서 45분 배양 후, CD127의 세포 표면 발현 수준은 항체 또는 IL7을 함유하지 않는 배지에서 배양된 대조 세포내의 그 수준의 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 90% 이다.
CD127 -γc 사슬 상호작용의 차단
특정 구현예에 따라, 본 발명의 거대분자, 특히 항체 또는 이의 단편은 IL7-R의 γc 사슬에의 CD127 결합을 차단할 수 있다. 이는 CD127 및 γc 사슬이 항체의 부재하에서 특히 IL-7의 존재하에서 서로 결합되는 조건(특히 화학적 및 물리적 조건)하에서, 상기 항체의 존재가 상기 결합을 유의하게 감소시킨다는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 항체 및 IL-7의 존재하에서, CD127는 γc에 결합하지 않는다. 특히, 항체 및 IL-7의 존재하에서, CD127과 결합 된 것으로 확인된 γc 사슬의 양은 동일 조건하에서 특히 IL-7의 존재하에서 항체의 부재하에(또는 MD707-13과 같은 또 다른 항-CD-127 항체의 존재하에) 결합된 양의 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만, 더욱 바람직하게는 25% 미만 또는 10% 미만이다. 특히, 항체의 이러한 특징은 단백질들의 상호작용을 검사하기 위한 것으로 당업자에게 잘 알려져 있고 본원의 실시예 21에서 설명한 동시 면역침전 방법을 통해 평가될 수 있다. 특히, 세포는 검사 항체의 존재 또는 부재하에서 배양된 다음, 단백질 복합체의 보존을 가능하게 하는 조건에서 가용화되고, 얻어지는 용해물은 항-CD127 면역침전을 받고, CD127-함유 면역침전된 복합체 내의 γc의 존재 여부가 항-γc 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅을 통해 평가될 수 있다(반대로, 면역침전이 항-γc 항체를 이용하여 수행되고, CD127의 존재가 항-CD127 항체를 이용하여 평가될 수 있다).
이러한 항체를 얻기 위한 한 가지 방법은 CD127의 2b 부위 유래의 서열을 포함하는 에피토프에 대한 항체를 생성하거나, 이러한 에피토프를 인식하는 항체를 선택하는 것이다. 실제로, γc와의 상호작용을 위해 중요한, 이러한 부위에의 항체의 결합은 예를 들어 경쟁 또는 입체 장애를 통해 γc와 CD127의 상호작용을 차단하기에 적당하다.
특히, 당업자에게 알려져 있고 본 발명의 목적에 쉽게 적용되는 통상적인 스크리닝 과정을 통해, 항-CD127 항체들, 예를 들어 항체 라이브러리(이러한 라이브러리가 2b 부위의 서열을 포함하는 면역원을 이용하여 얻어지지 않는 경우를 포함)로부터 이러한 바람직한 특징을 갖는 항체를 선택하는 것도 가능하다. 특히, 예를 들어, CD127 (또는 이의 세포외 도메인 단독)은 이러한 스크리닝을 위해 일반적으로 사용되는 96-웰 플레이트 또는 유사한 기판에 결합 될 수 있다. 상기 라이브러리를 구성하는 항체는 개별적으로 하나의 웰에 첨가될 수 있고, γc 사슬이 각각의 웰에 첨가될 수 있다. 플레이트를 세척한 후, 예를 들어 형광에 기반한 방법을 통해 각각의 웰에서 γc의 존재가 검사될 수 있다. 바람직한 특징을 갖는 항체를 함유하는 웰에서는, γc가 검출되지 않거나 소량으로 검출된다. 이러한 과정을 변형하여, 예를 들어, 고체 기재상에 항체들을 개개의 스팟으로 스팟팅하고, 그 스팟팅된 항체들에 CD127이 결합하도록 하고, 얻어지는 고정화된 CD127 사슬에 γc 사슬이 결합하도록 하는 것이 명백히 가능하다.
IL-7-IL-7R 상호작용에 대한 길항제
특정의 구현예에 따라, 본 발명의 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원결합 단편은 인터루킨 7(IL-7)에 대한 길항 특성을 추가로 가짐으로써 CD127 양성 세포 상의 CD127에의 IL-7의 접근, 즉 결합을 길항한다.
"IL-7-IL-7R 상호작용에 대한 길항 특성"은 IL-7R 알파를 표적하는 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 CD127 세포, 특히 인간 효과 T 세포, 특히 인간 메모리 T 세포 상에 발현된 IL-7 수용체의 그의 결합 파트너 IL-7, 특히 인간 IL-7에 대한 접근성을 방지하는 효과를 갖는다는 것을 의미한다. IL-7의 결합을 길항한 결과로서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편은 IL-7-의존적 T 세포 발생을 방지함으로써 림프구 감소를 유도한다.
특히, 상기 길항 특성은 IL-7에 의해 유도된 IL-7R 신호전달에 대한 길항작용일 수 있다. IL-7에 의해 유도된 IL-7R 신호전달의 길항제는 구현예들에서 기재된 바와 같이 STAT5 인산화의 억제를 측정함으로써 확인될 수 있다. STAT5의 IL7-유도 인산화는 IL7R 활성화의 마커이고, IL7-IL7R 상호작용을 길항하는 항체는 STAT5의 IL7-유도 인산화를 감소시키는 것으로 예상된다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 거대분자는 IL-7에 의해 유도된 IL-7R 신호전달의 길항제이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 거대분자는 STAT5의 IL7-유도 인산화를 억제한다. 바람직한 구현예에서, STAT5 인산화의 억제는 50ng/ml와 같이 낮은 항체 농도에서 50% 초과이고/이거나 STAT5 인산화의 억제는 100ng/ml와 같이 낮은 항체 농도에서 80% 초과이다. STAT5 인산화의 억제는 당업자에게 알려진 방법, 특히 실시예 부분(특히 실시예 3)에서 기재된 방법을 통해 평가될 수 있다.
"TSLP의 결합에 대한 길항제"
본 발명의 항체는 IL-7R 내의 CD127에 결합하기 때문에, 이들 항체는 TSLPR 내의 CD127에 결합할 수도 있고, 특히 입체 장애 및/또는 공통 결합 부위 상에서의 경쟁을 통해, 이들 항체는 TSLPR에의 TSLP의 결합을 억제할 수 있다. 즉, 본 발명의 항체는 TSLP의 결합에 대하여 길항 활성을 나타낼 수 있다.
"TSLP-유도 TARC 생성의 억제제"
특정의 구현예에서, 본 발명의 항체는 CD127-양성 세포의 TSLP-유도 TARC 생성을 억제할 수 있다. 전술된 바와 같이, TSLP-자극 수지상 세포는 증가 된 수준의 TARC를 생성한다. 이는 TSLPR에의 그들의 결합 및 TSLP 결합의 길항제로서의 그들의 작용의 결과일 수 있다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 항체 및 이의 항원 결합 단편은 그들의 성숙을 증가시키지 않는 그들의 능력에 따라 선별되었다(예를 들어, 성숙이 확인되면, CD40 및/또는 CD80 세포 표면 마커의 발현의 증가가 확인된다).
TSLP-유도 TARC 생성의 수준은 TSLP 단독으로 처리한 세포에서보다 본원에 기재한 바와 같은 항-CD127 항체 또는 이의 단편 또는 키메라 분자와 함께 TSLP로 처리한 세포에서 더욱 낮다. 즉, 본 발명의 거대분자는 TSLP-유도 TARC 생성의 억제제일 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 본원에서 기재한 바와 같은 항체 또는 이의 단편 또는 키메라 항체는 TARC 생성의 수준을 감소시킨다. 본 발명의 특정의 구현예에서, TSLP 및 항체, 단편 또는 키메라 항체로 처리한 세포에서 TARC 생성은 1 μg/ml와 같이 낮은 항체 농도에서, TSLP 단독으로 처리한 세포 내의 수준과 비교하여, 10% 초과, 바람직하게는 20% 초과만큼 감소된다. TARC 생성의 측정은 실시예들(특히, 실시예 9)에서 설명되어 있고, 당업자에게 알려진 임의의 표준 방법을 이용하여 혈액 시료 유래의 CD127-양성 면역 세포, 특히 수지상 세포에 대하여 수행될 수 있다.
"세포독성 활성(Cytotoxic activity)"
본 발명의 특정의 구현예에서, IL-7 수용체에 존재하는 CD127 분자에 대한 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 세포, 특히 상기 수용체를 발현하는 인간 T 세포에 대하여 세포독성인 특성을 더욱더 갖는다. 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 표적인, IL-7 수용체의 사슬로서 CD127을 발현하는 인간 세포는 주로 T 림프구이고, 더욱 구체적으로는 미접촉 및 메모리 T 세포를 비롯한 효과 T 세포의 아집단이지만, 조절 T 세포(Treg), 특히 휴지기의 천연 Treg는 아니다. 메모리 T 세포는 항원 초회자극(antigen priming)의 결과로서 발생 되고, 재활성화 및 2차 효과 및 메모리 세포로의 분화시 면역회상 증식(recall proliferation)을 받는 능력을 포함한, 그들의 기능적 특성에 의해 주로 정의된다. 마찬가지로, 표적 된 TSLP 수용체(IL-7-R 알파 사슬을 포함한 복합체 형태)는 T 헬퍼 림프구, B 세포 및 수지상 세포 분화를 조절한다.
본 발명의 구현예에 따라, "T 세포에 대한 세포독성 활성" 또는 세포독성 특성을 갖는 항체 및 이의 항원 결합 단편(세포독성 항체)은 효과 T 세포들을 살해함으로써 효과 T 세포 집단을 고갈시켜서 투여시 이들 세포의 수를 감소시킨다. 그와 반대로, 이들 항체는 조절 T 세포의 아집단을 변화시키지 않거나 이런 세포 아집단을 유의한 정도까지 변화시키지 않아서, Treg 세포가 그의 기능을 수행할 수 있도록 한다. 이와 관련하여, 특정 구현예에서는, 효과 T (Teff) 세포에 대한 조절 T 세포의 비율은 본 발명의 항체의 투여 후 상승하는 것으로 관찰되었다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 상기 비율을 약 10% 이상으로 상승시키는 것을 가능하게 한다. 특정의 구현예에서, Teff에 대한 Treg의 비율의 증가는 약 20% 이다.
본 발명의 특정 구현예에 따라, 상기 세포독성 항체는 항체-의존적 세포독성(ADCC)을 나타낸다. 또 다른 실시예에 따라, 본 발명의 항체는 ADCC 특성이 업없다. 항체의 ADCC 특성은 특정 세포독성이 10% 이상인 경우 양성인 것으로 판단되었다. ADCC 특성은 실시예들 (특히 실시예 10)에서 기재된 시험법과 같은 ADCC 분석법으로 평가될 수 있다. 상기 항체가 쥐 항체인 경우, ADCC 분석에서 사용되는 효과 세포는 쥐의 LAK (Lymphokine-activated killer) 세포이다. 상기 항체가 인간화되는 경우, ADCC 분석은 인간 NK 세포에 대하여 수행될 수 있다.
CD127 양성 세포에 대하여 세포독성 및 길항 특성 모두를 갖는 본 발명의 항체는 효과 T 세포, 특히 메모리 T 세포의 고갈에 대한 이들 특성들의 누적 효과를 가능하게 함으로써, 더욱 강한 고갈(CD127+ 세포들의 풀(pool)의 고갈) 및 표적 T 세포들의 수의 해당하는 감소를 가능하게 한다.
상기 단락들뿐 아니라 하기의 실시예들은 이들 기능적 특성들을 검사하는 방법을 설명한다. 하기의 단락들은 상기 항체 또는 단편 또는 키메라 분자들의 여러 가지 구조적인 특성 및 가능한 변형을 상술한다. 이러한 안내(guidance)를 고려하여, 당업자는 N13B2와 같은, 특히 원하는 기능적 특성을 갖는 항체로부터 출발하여, 원하는 기능적 특성과 함께, 하기의 구조적 특성을 갖는 항체 또는 단편을 얻을 수 있는데, 이는 몇몇의 경우에 있어서, 상기 구조적 특징들 중 몇몇을 채택하는 것은 그 구조적 특징들을 변경할 수 없고/없거나 새로운 구조적 특징의 도입 후 기능적 특징의 손실을 검사할 수 없는 것으로 예상될 수 있기 때문이다. 또한, 상기 항체에 의해 인식되는 에피토프의 본원의 개시의 경우, 동일한 기능적 특징들을 공유하는 다른 항체들의 개발은 통상적인 과정인데, 이는 동일 또는 유사한 에피토프에 대하여 생성된 항체는 CD127에의 결합시 유사한 효과를 유발하는 그의 능력에 따라 선별될 수 있었기 때문이다. 또한, 용이한 시험 방법들이 본원에 개시되어 있으므로, 당업자는 이러한 시험법을 이용하여 적당한 항체를 선택할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 거대분자는 N13B2, 또는 N13B2의 CDR들 중 적어도 하나를 갖는 항체, 또는 N13B2의 단편이다. 따라서, 본 발명은 VH가 하기의 아미노산 서열들 중 적어도 하나 또는 아래에 기재된 바람직한 인간화 변이체들 중 하나를 포함하고:
- VHCDR1 (서열번호 10);
- VHCDR2 (서열번호 12);
- VHCDR3 (서열번호 :14),
및/또는 VL이 하기의 아미노산 서열들 중 적어도 하나 또는 아래에 기재된 바람직한 인간화 변이체들 중 하나를 포함하는 항체 또는 이의 변이체에 관한 것이다:
- VLCDR1 (서열번호 16);
- VLCDR2 (서열번호 18);
- VLCDR3 (서열번호 20).
특정의 구현예에서, 상기 거대분자는 N13B2의 CDR 서열들, 즉, VHCDR1 서열번호 10, 서열번호 12, VHCDR3 서열번호 14, VLCDR1 서열번호 16, VLCDR2 서열번호 18 및 VLCDR3 서열번호 20 중 적어도 2, 3, 4 또는 5개를 포함하고, 이들 서열 중 임의의 수는 아래에 기재된 그들의 바람직한 인간화 변이체(humanized variant)에 의해 교체될 수 있다. 특정의 구현예에서, 상기 거대분자는 N13B2의 6개 CDR 서열을 전부 포함하고, 이들 서열 중 임의의 수는 아래에 기재된 그들의 바람직한 인간화 변이체에 의해 교체될 수 있다. 특정의 구현예에서, 상기 거대 분자는 서열번호 22의 아미노산을 갖는 VH 사슬 및/또는 서열번호 24의 아미노산을 갖는 VL 사슬을 포함한다. 특정의 구현예에서, 상기 거대분자는 서열번호 2의 아미노산을 갖는 중쇄 및/또는 서열번호 4의 아미노산을 갖는 경쇄를 포함한다. VH 및 VL 사슬에 관한 다른 특정의 구현예는 아래에 기재된 인간화 변이체이다. 특정의 구현예에서, 불변 사슬은 도 12의 쥐 IgG1 Fc 사슬의 서열(Uniprot P20759) 및/또는 서열번호 34의 서열을 갖는다.
단편
본 발명의 항체의 "항원 결합 단편"은 항체의 일부, 즉 그의 천연 형태에서 인간 IL-7에 대한 IL-7 수용체의 알파 사슬에 대하여 항원 결합 능력을 나타낼 수 있는 본 발명의 항체 구조의 일부에 해당하는 분자이다. 특히, 이러한 단편은 해당하는 4개 사슬 항체의 항원 결합 특이성과 비교하여 상기 항원에 대하여 동일하거나 실질적으로 동일한 항원 결합 특이성을 나타낸다. 유리하게는, 상기 항원 결합 단편은 해당하는 4개 사슬 항체와 유사한 결합 친화성을 나타낸다. 그러나, 해당하는 4개 사슬 항체와 비교하여 감소 된 항원 결합 친화성을 갖는 항원 결합 단편도 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 항원 결합 능력은 항체 및 고려된 단편의 친화성을 측정함으로써 확인될 수 있다. 또한, 이러한 항원 결합 단편은 항체들의 기능적 단편으로 지칭될 수 있다.
항체들의 항원-결합 단편들은 항원, 즉 인간 IL-7의 IL-7Ra에 대한 인식 부위를 포함하는 CDR로 지칭된 초가변 도메인 또는 이의 일부분(들)을 포함함으로써 항원 인식 특이성을 정의하는 단편이다. 4개 사슬 면역글로불린의 각각의 경쇄 및 중쇄(각각 VL 및 VH)는 각각 VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3 및 VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3로 지칭된 세 개의 CDR들을 갖는다. 따라서, 본 발명은 특히, VL-CDR1 (서열번호 16), VL-CDR2 (서열번호 18), VL-CDR3 (서열번호 20) 및 VH-CDR1 (서열번호 10), VH-CDR2 (서열번호 12) 및 VH-CDR3 (서열번호 14), 아래에 기재된 이들의 이간화 변이체, 또는 이들의 기능적 부분, 즉, 인간 IL-7의 IL-7Ra에 대하여 바람직하게는 높은 친화성과 함께 원하는 특이성을 나타내는 부분 중에서 전부 또는 선택된 것을 포함하거나 그것으로 구성되는, 본 발명의 항체의 단편에 관한 것이다.
본 발명의 특정의 항원 결합 단편은 그의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 본 발명의 항체의 VH 사슬의 단편, 특히, 아래에서 개시한 인간화 변이체들을 포함한, 본원에서 개시한 아미노산 서열을 갖는 것들이다. 본 발명의 다른 단편은 그의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함하는 본 발명의 항체의 VL 사슬의 단편, 특히, 아래에서 개시한 인간화 변이체들을 포함한, 본원에서 개시한 아미노산 서열을 갖는 것들이다. CDR3 영역이 항원 인식 특이성을 결정하는 것으로 보이는 경우, VH-CDR3 및/또는 VL-CDR3를 포함하거나 이로 구성되는 단편, 특히 아래에서 개시한 인간화 변이체, 또는 이의 기능적 부분을 포함한, 본원에서 개시한 아미노산 서열을 갖는 것들이 특히 바람직하다.
당업자는 기준 넘버링 시스템(Martin, 2001)을 포함한 기재된 표준 정의를 참조, 또는 Kabat의 넘버링 시스템(Kabat 등, 1992)을 참조, 또는 IMGT "collier de perle" 알고리즘(http://www.imgt.org/IMGTindex/Colliers.html, Lefranc 등, 1999)을 참조하여 여러 가지 영역/도메인들의 위치를 결정할 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명의 서열의 정의를 위하여, 상기 영역/도메인들의 한계 결정(delimitation)은 하나의 기준 시스템으로부터 또 다른 시스템까지 다양할 수 있다는 것을 유념한다. 따라서, 본 발명에서 정의된 영역/도메인들은 항체들의 가변 영역들의 전체(full-length) 서열 내의 관련 서열들의 길이 또는 위치의 편차가 약 +/- 10%인 것을 나타내는 서열들을 포함한다.
또한, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 가변 CDR 도메인에 탈면역화(de-immunization) 잔기가 존재할 수 있다. 특정의 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 탈면역화된다.
따라서, 4개 사슬 글로불린의 구조에 기초하여, 항원 결합 단편은 이용가능한 데이터베이스 및 종래 기술(Martin, 2001) 내의 항체 서열들의 비교, 특히 이러한 서열들 내의 기능적 도메인들의 위치의 비교를 통해 정의될 수 있으므로, 프레임워크 및 불변 도메인의 위치는 여러 부류의 항체, 특히 IgG, 특히 포유동물의 IgG에 대하여 잘 정의된다는 것을 알 수 있다. 또한, 이러한 비교는 항체의 3차원 구조에 관한 데이터를 필요로 한다.
본 발명의 특정 구현예들의 예시 목적을 위하여, 항체의 CDR들을 포함하는 가변 도메인을 포함하는 상기 항체의 항원 결합 단편은 (Kabat 등, 1992), (Martin, 2001) 및 (Delves 등, 2011)을 참조하여 잘 정의되는 Fv, dsFv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2를 포함한다. Fv 단편들은 소수성 상호작용을 통해 서로 결합된 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된다. dsFv 단편의 경우, VH:VL 이종이합체는 이황화 결합을 통해 안정화되고, scFv 단편의 경우, VL 및 VH 도메인은 유연한 펩티드 링커를 통해 서로 연결되어 당일 사슬 단백질을 형성한다. Fab 단편은 항체의 파파인 절단(papain digestion)을 통해 얻어질 수 있는 단량체 단편으로서, 이들 단편은 이황화 결합을 통해 서로 결합된 전체 L 사슬 및 H 사슬의 VH-CH1 단편을 포함한다. F(ab')2 단편은 힌지 이황화물 아래에서 항체의 펩신 절단을 통해 제조될 수 있는데, 이는 두 개의 Fab' 단편, 및 부가적으로 면역글로불린 분자의 힌지 영역의 일부를 포함한다. Fab' 단편은 힌지 영역 내의 이황화 결합을 절단함으로써 F(ab')2 단편으로부터 얻어질 수 있다. F(ab')2 단편은 2가(divalent)이다. 즉, 이들 단편은 천연 면역글로불린과 마찬가지로, 두 개의 항원 결합 부위를 포함하는 반면, Fv(Fab의 가변성 부분을 구성하는 VH-VL 이합체), dsFv, scFv, Fab, 및 Fab' 단편은 일가(monovalent)이다. 즉, 이들 단편은 하나의 항원 결합 부위를 포함한다.
키메라 항체
본 발명의 또 다른 구현예에 따라, 상기 항체는 변형된 결과로서, 서로 다른 항체, 특히 서로 다른 동물 종으로부터 얻어지고 기능적 항체로 서로 결합된 항체들의 아미노산 잔기들의 도메인 또는 가닥(들)을 포함하는 키메라 항체이다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 거대분자는 적어도 2개의 종에서 유래한 항체 단편들의 어셈블리로 구성되는 키메라 항체이다. 특정의 구현예에서, 키메라 분자는 인간 항체의 불변 영역을 포함한다. 이러한 불변 영역은 실시예들에서 Fc 단편 G1 (서열번호 26) 또는 Fc 단편 G4 (서열번호 28) 또는 CL kappa 단편(서열번호 30)으로 예시되어 있다. 선택적으로, 도 12 (Uniprot P01857, Uniprot P01859, Uniprot P01861)되고/되거나 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 또는 서열번호 112를 갖는 인간 Fc 단편이 사용될 수도 있다. 특정의 구현예에서, 키메라 항체는 설치동물 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 불변 영역을 포함한다. 특정의 구현예에서, 키메라 항체는 서열번호 2의 서열(N13B2-G1m-VH-FcG1m(E333A)) 또는 서열번호 6의 서열(N13B2-G4m-VH-FcG4m(S228P))을 갖는 VH 사슬 및 서열번호 4의 서열(N13B2-G1m-VL-CLkappa)을 갖는 VL 서열을 포함한다.
애피틴(Affitin), 안티칼린 및 다른 항체 모방체(mimetic)
또한, 본 발명의 거대분자는 항체의 것을 모방하는 항원 결합 능력을 갖는 인공 단백질(본원에서는 항원 결합 항체 모방체라고도 명명함)을 포함한다. 애피틴은 항원에 선택적으로 결합하는 능력을 갖는 인공 단백질이다. 이들 단백질은 고세균 도메인에 속하는 미생물인 술포로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus acidocaldarius)에서 확인된 DNA 결합 단백질 Sac7d에서 구조적으로 유도된다. Sac7d의 결합 표면상의 아미노산들을 무작위화(randomizing)함으로써, 예를 들어, Sac7d의 결합 표면의 11개 잔기들의 무작위 치환에 해당하는 변이체(variant)들을 발생함으로써, 애피틴(affitin) 라이브러리가 발생될 수 있고, 얻어지는 단백질 라이브러리를 리보솜 디스플레이의 라운드(round)들에 처하게 함으로써, 펩티드, 단백질, 바이러스 및 박테리아와 같은 여러 가지 표적들에 대한 친화성이 얻어질 수 있다. 애피틴은 항체 모방체로서, 생명공학 기술에서 도구(tool)로서 개발되고 있다. 또한, 이들 애피틴은 여러 가지 효소에 대한 특이적 억제제로서 사용되어 왔다(Krehenbrink 등, 2008). 당업자는 당업계에 알려진 방법, 특히 특허 출원 WO2008068637호 및 상기 인용된 간행물에 개시된 방법, 특히 파지 디스플레이의 발생 및/또는 리보솜 디스플레이 라이브러리의 발생 및 본원에 기재한 항원을 이용한 이들의 스크리닝을 이용하여, 필요한 결합 특성을 갖는 애피틴을 용이하게 개발할 수 있다. 안티칼린(Anticalin)은 항원, 단백질 또는 소분자에 결합할 수 있는 인공 단백질이다. 이들은 천연 발생 결합 단백질의 부류인 인간 리포칼린(lipocalin) 유래의 항체 모방체이다. 안티칼린은 약 180개 아미노산 및 약 20 kDa의 질량을 가지면서 약 8배 더 작다(Skerra, 2008). 특히 특이적 결합 특성을 갖는 안티칼린의 스크리닝 및 선별을 가능하게 하는 안티칼린 파지 디스플레이 라이브러리가 발생되었다. 당업자는 당업계에 알려진 방법, 특히 EP 특허 EP1270725 B1, US 특허 US8536307 B2, (Schlehuber 및 Skerra, 2002) 및 위에서 인용한 간행물, 특히 파지 디스플레이의 발생 및/또는 리보솜 디스플레이 라이브러리의 발생 및 본원에 기재한 항원을 이용한 이들의 스크리닝을 이용하여, 필요한 결합 특성을 갖는 애피틴을 용이하게 개발할 수 있다.
안티칼린 및 애피틴 모두는 박테리아 발현 시스템을 포함하는 발현 시스템을 이용하여 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명은 특히 CD127에의 결합, CD127 내재화의 비유도 및/또는 억제, DCs의 성숙에 관하여 본원에 기재된 항체들의 특징을 갖는 애피틴, 안티칼린 및 다른 유사한 항체 모방체를 제공하고, 이들 모방체들은 모두 본 발명의 거대분자로서 고려된다.
인간화(Humanization)
특정 구현예에서, 본 발명의 거대분자는 인간화 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 따라서, 동물, 특히 설치동물 및 쥐에서 최초로 얻어졌으므로, 동물의 면역화 및 하이브리도마로부터 단일 클론 항체의 생성 후, 본 발명의 항체는 아미노산 잔기의 치환을 통해 그의 VH 및/또는 VL 서열, 프레임워크 및 선택적으로 CDR 서열이 변형된다. 본 인간화는 재표면화(resurfacing) 또는 알려진 기법에 따른 CDR 이식을 통해 수행될 수 있다. 특히, 재표면화는 인간 아미노산 잔기에 대한 설치 동물 잔기의 치환을 통해 달성된다. 상기 치환은 본래 항체의 프레임워크 구조 및 CDR 제시를 유지함으로써, 재표면화된 항체의 프레임워크 및 CDR 상호작용이 항원 접촉 표면의 천연 구조를 보존하여 항원 결합 능력을 유지할 수 있도록 수행된다.
본 발명의 항체의 바람직한 구현예는 하기의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 (쥐) N13B2 항체의 인간화 변형 형태(humanized version)에 의해 대표된다:
서열번호 36의 서열을 갖는 N13B2-h1의 중쇄로서, 쥐 N13B2의 CDR 서열뿐 아니라, 그 CDR 서열 외부의 몇몇의 다른 아미노산 잔기들이 보존되어 있고, 모든 다른 아미노산들이 인간 항체의 서열과 매치(match)되는, 중쇄. 이러한 중쇄는 인간 항체 중쇄와 87.8% 동일성을 갖는다. 상기 CDR 서열들의 외측의 하기의 잔기들이 보존되었다: 카밧(Kabat) 위치 H24(도 23의 위치 24; 인간 서열의 A)의 V, 카밧 위치 H37 (도 23의 위치 37; 인간 서열의 I)의 V, 카밧 위치 H49(도 23의 위치 49; 인간 서열의 S)의 A 및 카밧 위치 H73 (도 23의 위치 74; 인간 서열의 N )의 D;
서열번호 38의 서열을 갖는 N13B2-h2의 중쇄로서, N13B2-h1의 중쇄와 비교하여, CDR 서열 외측의 카밧 위치 H37, H49 및 H73의 아미노산들이 인간 항체 중쇄의 서열과 매치되도록 변형된, 중쇄;
서열번호 40의 서열을 갖는 N13B2-h3의 중쇄로서, N 13B2-h2의 중쇄와 비교하여, CDR3 내의 카밧 위치 H96 (도 23의 위치 100)의 M이 인간 항체 중쇄의 서열에 매치되고/되거나 전사후 변형을 회피하도록 돌연변이된, 중쇄. 이러한 위치에 대한 다른 가능한 잔기로는 특히 A, F 및 I, 더욱 바람직하게는 F 또는 I가 있다. 따라서, N13B2 VH의 CDR3 서열에 대한 가능한 인간화 변이체는 서열번호 48의 서열을 갖는다.
서열번호 42의 서열을 갖는 N13B2-h1의 경쇄로서, 쥐 N13B2의 CDR 서열뿐 아니라, 그 CDR 서열 외측의 몇몇의 다른 아미노산들이 보존되어 있고 모든 다른 아미노산 잔기들이 인간 항체의 서열에 매치되는, 경쇄. 이러한 경쇄는 인간 항체 경쇄와 80% 동일성을 갖는다. 그 CDR 서열 외측의 하기의 잔기들이 보존되어 있다: 카밧 위치 L48(도 24의 위치 48; 인간 서열의 I)의 V, 카밧 위치 L71(도 24의 위치 71; 인간 서열의 F)의 Y 및 카밧 위치 L87(도 24의 위치 87; 인간 서열의 Y)의 F;
서열번호 44의 서열을 갖는 N13B2-h2의 경쇄로서, N13B2-h1의 경쇄와 비교하여, 그 CDR 서열 외측의 카밧 위치 L48, L71 및 L87의 세 개의 아미노산들이 인간 항체 경쇄의 서열에 매치되도록 변형되어 있는, 경쇄.
서열번호 46의 서열을 갖는 N13B2-h3의 경쇄로서, N13B2-h2의 경쇄와 비교하여, 각각 CDR1 및 CDR2 서열 내측의 아미노산 카밧 위치 L31 (도 24의 위치 31) 및/또는 L52 (도 24의 위치 53)가 인간 항체 경쇄의 서열에 매치되고/되거나 전사후 변형을 회피하도록 N 내지 Q에서 각각 S 내지 T로 돌연변이되어 있는, 경쇄. L31 위치에 대한 다른 가능한 아미노산으로는 H 및 R이 있다. CDR3 서열에 대한 다른 가능한 돌연변이는 위치 L52의 S를 보존하고 위치 L51(도 24의 위치 52)의 N을 Q, H, K 또는 R으로 돌연변이시키는 것을 포함한다. 따라서, N13B2 VL의 CDR1 서열에 대한 가능한 인간화 변이체는 서열번호 50의 서열을 갖고, N13B2 VL의 CDR2 서열에 대한 가능한 인간화 변이체는 서열번호 52의 서열을 갖는다.
다기능성 항체 또는 단편
본 발명의 기본 항원 결합 단편들은 서로 결합되어 디아바디, 트리바디 또는 테트라바디와 같은 다가(multivalent) 항원 결합 단편이 얻어질 수 있다. 이러한 다가 항원 결합 단편도 본 발명의 일부이다.
상기 언급한 변형들은 적절한 경우 결합 될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 거대분자는 키메라 항체 또는 인간화 항체 및/또는 탈면역화 항체인 항체이다.
본 발명의 항체를 얻는 방법
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 T 세포에 의해 발현된 CD127인 분자에 대하여 특히 유리하게 생성되고, 어쩌면 천연 폴리펩티드 또는 재조합 분자의 형태하에서 면역화로부터 생성된다.
면역화는 아래의 구현예들에 개시된 프로토콜에 따라 수행될 수 있다: 재조합 CD127 Fc 키메라(10975-H03H Sino Biological사, 베이징, 중국)를 이용하여. Louvain 대학(벨기에)에서 이용가능 한 LOU/C Igkl의 쥐와 같은 쥐를 면역화했다. 선택적으로, 서열번호 115 (특히 서열번호 110을 포함) 및/또는 서열번호 117 (특히 서열번호 111을 포함) 및/또는 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 항원으로서, 다른 서열, 특히 위에서 개시한 바와 같은 인간 CD127의 다른 서열을 추가로 포함하거나 포함하지 않는 항원이 면역원으로 사용될 수 있다. 예전에 기재된 과정(Chassoux 등, 1988)에 따라 비장 단핵 세포를 비분비성(non-secreting)이고 아자구아닌(azaguanine)-저항성인 세포주인 LOU 쥐 면역종인 IR983F와 융합하여 하이브리도마를 얻었다. 우선, 재조합 CD127 분자 (CD127 Fc 키메라; 10975-H03H, Sino Biological사, 베이징, 중국)에 결합하는 분비된 단일 클론 항체의 능력에 따라 하이브리도마를 스크리닝했다. 다음에, 도 1에서 예시된 바와 같이, 인간 T 세포에 의해 발현된 CD127에 결합하는 단일 클론 항체의 능력 및 인간 백혈구 상에서 IL-7에 의해 유도된 STAT-5 인산화의 유도를 억제하는 능력, TSLP에 의해 유도된 수지상 세포 성숙을 증가시키지 않는 능력에 따라 하이브리도마를 스크리닝했다.
본 발명의 특정 구현예에 따라, 본 발명의 인간화 항체는, 그의 가변 중쇄(VH) 및/또는 그의 가변 중쇄(VL)의 CDR 영역(들)의 돌연변이에 의해 N13B2로 지칭된 항체, 특히 VH 및/또는 VL의 CDR3, CDR2 및 CDR1 중 적어도 하나 또는 두 개의 본래의 CDR 영역을 유지하는 항체로부터 유도되고, 상기 변형된 항체는 본래의 CDR1 , CDR2 또는 CDR3 영역을 기준으로 개별적으로 고려된 CDR 영역 내의 돌연변리된 아미노산 잔기들의 10% 미만, 바람직하게는 하나 이하의 돌연변이된 아미노산 잔기를 갖고, 상기 본래의 CDR 영역들은 다음과 같다:
i. 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 VHCDR1;
ii. 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 VHCDR2;
iii. 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는VHCDR3;
iv. 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는VLCDR1;
v. 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는VLCDR2;
vi. 서열번호 20의 아미노산 서열을 갖는VLCDR3.
따라서, 상기 VHCDR3은 서열번호 48의 아미노산 서열을 갖고, VLCDR1은 서열번호 50의 아미노산 서열을 갖고, VLCDR2은 서열번호 52의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단편은 이전의 단락들에서 기재된 바와 같이 변형되는 N13B2의 항원 결합 단편이고, 상기 변형된 항원 결합 단편은 본래의 항원 결합 단편을 기준으로 10% 미만의 돌연변이 아미노산 잔기들을 갖는다.
본 발명에 의해 제공된 가르침을 고려하여, 본 발명의 항체를 발현하기 위하여, 당업자는 하이브리도마를 제조하고 발현 라이브러리 및 발현 시스템과 같은 선택적인 기술을 이용할 수 있고, 그 다음 상기 하이브리도마에 의해 분비된 것들의 구조를 갖고 그의 특성, 특히 결합 및 중화 특성을 갖는 항체를 분비한다. cDNA 라이브러리는 본 발명의 하이브리도마에서 발현된 RNA로부터 적당히 제조될 수 있고, 적절한 서열이 선택 및 발현될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 항체를 암호화하는 cDNA가 합성을 통해 제조된다.
본 발명에 따른 "하이브리도마 세포"는 분비된 면역원을 이용하여 미리 면역화시킨 동물 유래의 항체 생성 세포(B 림프구)와, 얻어지는 융합세포에 불멸성(immortality)을 제공할 수 있는 골수종 세포인 융합 파트너의 융합을 통해 발생된 세포이다. 흑색종 세포 및 항체 생성 세포(비장세포와 같은 B 세포)는 동일 기원일 수 있고, 동일 동물의 진핵 세포, 특히 포유동물 세포이다. 그렇지 않으면, 이들 세포는 상이한 기원이고, 따라서 헤테로하이브리도마를 발생한다. 비분비성 아자구아닌 저항성 세포주인 LOU 쥐 면역종 IR983F와 같은 흑색종 세포는 제조된 하이브리도마가 원하는 특이성의 단일 클론 항체만을 분비할 수 있도록 하기 위하여 면역글로불린을 생성하지 못하는 세포들 중에서 선택된다. 재조합 세포에서의 발현을 통한 항체의 제조를 위한 하기의 페이지들에서 기재한 것들과 같은 ADCC를 촉진하기에 적당한 다른 세포들이 쥐 면역종 대신에 사용될 수 있다. 이러한 세포는 푸코실화 능력이 낮거나 없는 세포인 것이 유리하다.
본 발명을 수행하기에 적당한 하이브리도마의 제조는 통상의 기법에 따라 수행된다. 실시양태들이 본 발명의 실시예들에서 상세히 기재되어 있으며, 그의 특별한 개시된 특징들은 융합 파트너로서 사용된 다른 세포에 적용될 수 있다.
항체의 항원 결합 단편은 특히 파파인 또는 펩신 절단을 포함한 잘 알려진 기법을 이용하거나 임의의 적절한 절단 기법을 이용하여 항체로부터 출발하여 얻어질 수 있다. 그렇지 않으면, 이들 단편은 이의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열과의 재조합을 통해 변형된 숙주 세포에서 발현될 수 있거나, 합성될 수 있고, 특히 화학적으로 합성될 수 있다. 따라서, 변형된 항체 및 그 항체의 항원 결합 단편을 비롯한 본 발명의 항체는 Sambrook 등(Deininger, 1990)에 의해 기재된 것들 및 업데이트 된 버전과 같은 통상적인 유전자 공학 기법을 통해 제조될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 신호 펩티드를 포함하거나 포함하지 않는 VH 및 VL 폴리펩티드의 변형형태(version)에 관한 것이다. 상기 신호 펩티드는 세포 내에서 폴리펩티드의 제조 동안에 필수적일 수 있다.
인간 환자에게 투여하기 위한 본 발명의 항체 또는 이들의 기능적 단편을 사용하는 것을 고려하여, 구현예들에서 기재된 것들과 같은 비영장류 항체일 수 있는 본 발명의 항체로부터 인간화 단일 클론 항체 또는 키메라 단일 클론 항체 및/또는 탈면역화 항체를 유도하는 것이 이로울 수 있고, 특히 상기 항체에 대한 수용 숙주 또는 환자의 면역 반응을 저하시키는 것이 이로울 수 있다. 이러한 변이 항체의 기능적 단편은 인간화, 키메라 또는 탈면역화 변이체(variant) 형태로 얻어질 수도 있다.
또한, 인간화 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표준 정의 및 넘버링에 따라 인간 항체에서 해당하는 위치를 갖는 인간 아미노산 잔기(들)에 대한, 본 발명의 비인간 항체의 가변 사슬(VH 및/또는 VL)의 불변 영역(들)에 존재하는 아미노산 잔기(들)의 치환을 통해 얻어질 수 있다. 상기 치환 수준은 상기 프레임워크 영역내의 잔기들의 1% 내지 20%, 특히 1% 내지 18% 이다. 상기 불변 영역은 특히 카밧 넘버링을 참조하여 확인한 4개 사슬 항체에서 정의된 프레임워크 영역들((FwRs)의 것들을 포함한다.
본 발명에 따른 변형 항체의 특별한 예는 키메라 항체, 인간화 항체 및/또는 탈면역화 항체를 포함한다.
특정의 변형 항체는 CDR 영역 내의 변형된 아미노산 잔기들을 갖고, 상기 변형은 비인간 항체의 가변 도메인 내의 T 세포 에피토프의 손실을 통해 탈면역화를 결과한다. 탈면역화는 특히 인 실리코 예측(in silico prediction)을 통해 항체 가변 도메인 내의 T 세포 에피토프를 확인한 후에 수행될 수 있고, 다음에, 그 항체의 가변 영역의 서열을 점 돌연변이하여 기능적 T 세포 에피토프를 제거할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 인체에 투여하기 위하여, 예를 들어, HLA-클래스 II/펩티드에 대한 T 세포 수용체의 결합 친화성을 감소시키기 위하여, CDR(들) 영역, 특히 CDR3 영역의 변형은 탈면역화에 필요한 정도까지 제한된다. 특정의 구현예에서, 상기 VH 및/또는 VL의 CDR3 영역(들)은 변형되지 않는다. 또 다른 실시에에서, FR 영역 및/또는 CH 영역도 변형, 특히 인간화된다.
따라서, 본 발명의 프레임 내의 항체는 위에서 정의한 특징들을 포함하는데, 이러한 항체는 인간화 항체이고, 특히 표준 정의 및 넘버링에 따라 인간 항체 내의 해당하는 위치를 갖는 인간 아미노산 잔기(들)에 대한, 본 발명의 프레임워크 영역(들)에 존재하는 아미노산(들)의 치환을 통해 얻어진 인간화 항체이다. 탈면역화를 비롯한 인간화를 위하여 프레임워크 영역 및/또는 CDR내의 아미노산들의 치환 수준은 상기 프레임워크 영역 및/또는 CDR내의 잔기들 중 1% 내지 20%, 특히 1% 내지 18% 이다. 전술된 바와 같이, 인간화는 본래 항체의 프레임워크 영역을 주로 표적한다. 그렇지 않으면, 몇몇의 경우, 인간화는 특히 CDR1 및/또는 CDR2 영역(들)에 관한 것일 수도 있고, 더욱 특히 탈면역화로 지칭한다. 특정의 구현예에서, 1개 이하의 아미노산이 각각의 CDR 영역에서 변형된다. 쥐 항체인 N13B2로부터 유도한 인간화 및/또는 탈이온화 항체의 예들은 본원에 개시되어 있다.
따라서, 인간화는 해당하는 인간 잔기(들)에 합치하도록 하기 위하여, 비인간 항체 또는 단편의 서열과 최대 서열 동일성을 나타내는 인간 생식계열(germline) 경쇄 또는 중쇄 프레임워크를 고려하고, 상기 비인간 항체 또는 이의 단편 내의 치환하고자 하는 아미노산 잔기, 특히 항체의 표면에 노출된 잔기를 선택함으로써 달성될 수 있다. 특정의 구현예에서, FRL의 일부 또는 전부 및/또는 FRH 영역의 일부 또는 전부는 충분히 인간적이다. 즉, 인간 프레임워크 서열의 특징을 갖는다. 또 다른 구현예에서, FR 영역의 일부 또는 전부내의 선택된 잔기들이 치환된다.
또한, 항체를 인간화하기 위한 방법들이 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어 Routledege 등(Edward G. Routledge, 1993)에 의해 설명되어 있다. 또한, 이러한 방법들은 scFvs와 같은 항원 결합 단편에 적용될 수도 있다. 예를 들어, "재표면화(resurfacing)"로 알려진 방법은 비인간 항체의 가변 영역의 프레임워크 내의 표면 잔기들의 세트를 표면 잔기들의 인간 세트로 치환하는 것으로 구성되는 반면에, CDR 이식(grafting)으로 알려진 방법은 비인간 항체 유래의 CDR들을 인간 항체의 프레임워크 영역 내로 전달하는 것으로 구성된다. 일반적으로, CDR 이식은 결합 친화성을 최적화하기 위하여 인간 프레임워크의 몇몇 잔기들을 치환하는 것으로 구성되는 프레임워크 최적화를 통해 완료된다. 최근에, 프레임워크 최적화의 단계는 결합(combinatorial) 라이브러리의 사용을 통해 단순화되었다 (Rosok 등, 1996) (Baca 등, 1997).
특히, 본 발명은 쥐 N13B2 항체로부터 CDR 이식을 통해 얻은 인간화 항체에 관한 것이다. 각각 쥐 N 13B2의 VH 및 VL 서열에 대하여 강한 상동성의 서열을 갖는 인간 VH 및 VL 서열들을 데이터베이스에서 선택했다. N13B2의 CDR 서열을 이들 인간 서열에 이식했다. 상기 CDR 서열 외측의 몇몇 잔기, 특히 CDR에 아주 근접한 잔기 및 Vernier 잔기로 알려진 잔기들은 항원 인식 및 친화도에 유의한 영향을 미칠 수 있었다. 상기 및 실시예 부분(특히 실시예 12)에서 상술한 바와 같이, 인간화 항체들의 하기의 몇몇의 변형 형태(version)들이 검사되었다: 모든 쥐 서열들의 CDR 및 위에서 언급한 구조적으로 중요한 잔기들이 보존되어 있는 가장 보존적인 변형 형태; 인간 서열들의 구조적으로 중요한 잔기들이 선택된 변형 형태; 및 특히 산화 또는 탈아미드화와 같은 전사후 변형을 방지하기 위하여, CDR 외측의 구조적으로 중요한 잔기 외에도, CDR 내측의 몇몇 잔기들이 초기의 쥐 서열로부터 변형된, 인간 서열에 가장 근접한 변형 형태.
항체 인간화를 위하여 이용가능한 또 다른 최근의 전략은 경쇄 및 중쇄의 본래의 비인간 CDR3 서열을 보존하면서 나머지 서열은 천연 인간 V 유전자 라이브러리로부터 선택되는 것이다(Rader 등, 1998).
본 발명의 키메라, 인간화 및/또는 탈면역화 항체는 비변형 항체와 마찬가지로, 면역글로불린의 임의의 부류에 속할 수 있다. 바람직하게, 이들 항체는 IgG1 , IgG2, IgG3 또는 IgG4와 같은 IgG 류의 아류에 속한다.
항체의 가변 영역을 적절한 링커 또는 또 다른 항체의 불변 영역과 결합함으로써 재조합 항원 결합 단편 또는 키메라 항체를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 항체는 단일 클론 항체이므로, 이러한 항체들의 조성물은 항원 결합 특이성 및 가변 영역 조성의 측면에서 균일, 특히 동일하다. 따라서, 그 항체들은 하이브리도마의 기법에 대한 대안의 기법에 의해 얻어지는 경우에도 단일 클론 항체로 간주될 수 있다.
또 다른 구현예에 따라, 본 발명은 본원에서 제공된 임의의 정의에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 분자로서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편이 기능적으로 상이한 분자와 결합되어 있는, 키메라 분자에 관한 것이기도 하다. 본 발명의 키메라 분자는 항체 또는 기능적 단편의 안정성 및/또는 반감기의 개선을 위하여, 생체 내에서 프로테아제 절단에 대한 보호를 위해 적당한 PEG 중합체 또는 또 다른 보호기 또는 분자와 같은 분자 또는 화학적 또는 생물학적 기와의 공유 결합, 이식 또는 화학적 결합을 비롯한 임의의 적당한 결합 형태로부터 얻어지는 접합체(conjugate ) 또는 융합 키메라 단백질일 수 있다. 유사한 기법, 특히 화학적 결합 또는 이식을 이용하여, 키메라 분자가 생물학적 활성 분자를 이용하여 제조될 수 있는데, 상기 활성 분자는 예를 들어 독소류, 특히 슈도모나스 내독소 A (Risberg 등, 2011), 식물 독소 리신의 A-사슬(van Oosterhout 등, 2001) 또는 사프린톡신(Flavell 등, 2006), 특히 치료적 유효 성분, 인체의 특정 세포 또는 조직에 항체 또는 기능적 단편을 표적하기에 적당한 벡터(특히 단백질 벡터를 포함)로부터 선택된다. 그렇지 않으면, 상기 키메라 분자는, 특히 항체의 단편이 사용되는 경우, 라벨 또는 링커와 결합 될 수 있다.
상기 항체 또는 이의 기능적 단편의 페길화(PEGylation)는 특히 치료적 용도를 위해 활성 물질의 전달 조건을 개선하므로 특히 중요한 실시양태이다. 페길화는 항체 또는 기능적 단편의 인식부위를 방해하는 것을 방지하기 위해 부위 특이적일 수 있고, 고분자량 PEG를 이용하여 수행될 수 있다. 페길화는 항체 또는 기능적 단편에 존재하는 유리 시스테인 잔기를 통해 또는 항체 또는 기능적 단편 내의 추가된 유리 시스테인 잔기를 통해 달성될 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 조성물로서, 상기 항체 또는 이의 기능적 단편이 항체 또는 이의 기능적 단편의 동질적 집단(homogeneous population)이거나 단일 클론 항체 또는 이의 기능적 단편인, 조성물에 관한 것이다.
몇몇의 경우에 있어서, 생성물들의 조성물을 이용하여 원하는 효과를 얻는 것이 가능한데, 상기 조성물 내의 각각의 생성물은 적어도 하나의 원하는 효과를 나타낸다. 본 발명의 경우, 예를 들어, IL-7-IL-7R 상호작용에 대하여 억제 효과를 갖는 분자와 CD127 양성 세포에 대하여 독성 효과를 갖는 분자를 결합하는 것이 가능하다. 이러한 조성물은 본 발명에 포함된다. 중요한 것으로, 본 발명에 있어서, 상기 생성물들의 조성물은 수지상 세포의 성숙을 위해 TSLP와 상승작용하지 않아야 한다. 일반적으로, 이는 수지상 세포의 성숙을 위해 TSLP와 개별적으로 상승작용하지 않는 생성물들을 결합하는 것을 포함한다.
특정의 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항체, 단편 또는 키메라 항체를 포함하는 화합물들의 조성물 또는 어셈블리로서, 상기 조성물이 (i) CD127 양성 세포, 특히 CD127+ T 세포에 대하여 세포독성 활성을 갖는 항체 또는 이의 단편 또는 키메라 분자들의 집단, 및 (ii) 인간 IL-7에 대하여 길항 특성을 갖는 항체 또는 이의 단편 또는 키메라 분자들의 집단을 포함하고, 이러한 항체들의 집단들이 혼합물 형태로 결합되거나 서로 분리되어 있고, 후자의 경우 동시(combined) 또는 순차적인 투여를 위해 제형화되는, 조성물에 관한 것이다. 상기 항체 및/또는 기능적 단편 및/또는 키메라 분자들은 수지상 세포 성숙을 위해 TSLP와 상승작용하지 않는다.
특히 본 발명의 항체에 대하여 본원에서 제공된 정의들은, 기술적으로 명백히 관련이 없는 경우를 제외하고 이들의 항원 결합 단편에도 마찬가지로 적용된다. 또한, 이러한 정의들은 본원에 개시된 바와 같은, 거대분자(특히 키메라 항체 또는 키메라 분자) 또는 이러한 항체 또는 항체 결합 단편을 포함하거나 이러한 항체로부터 유도된 조성물에도 적용된다. 또한, 본 발명의 항체의 항원 결합 단편은 개념관점 또는 디자인 관점에서 항체로부터 유도되지만, 생성물로서 항체에 의존할 필요가 없는 여러 가지 기법을 통해 제조될 수 있다는 것을 유념한다.
또한, 본 발명은 본원에 제공된 정의들 중 임의의 것에 따른 거대분자를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 핵산은 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 6; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호 12; 서열번호 14; 서열번호 16; 서열번호 18; 서열번호 20; 서열번호 22, 서열번호 24, 서열번호 36, 서열번호 38, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 56, 서열번호 110, 서열번호 111, 서열번호 86, 서열번호 115, 서열번호 116 및 서열번호 117로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 암호화한다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 핵산은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 또는 55의 서열을 포함하거나 그 서열로 이루어진다.
이러한 핵산은 본 발명의 거대분자의 제조를 위해 적당하고, 특히 하기의 것들로 이루어진 군에서 선택된다:
i. 서열번호 1 또는 서열번호 5 또는 서열번호 54 또는 VH 영역의 가변영역의 서열을 가지고, 서열번호 21 또는 서열번호 35 또는 서열번호 37 또는 서열번호 39의 서열을 갖는 VH 영역을 암호하는 폴리뉴클레오티드;
ii. 서열번호 3 또는 서열번호 7 또는 서열번호 56, 또는 VL 영역의 가변 영역의 서열을 가지고 서열번호 23 또는 서열번호 41 또는 서열번호 43 또는 서열번호 45의 서열을 갖는 VL 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
iii. 서열번호 9의 서열을 갖는 VHCDR1 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
iv. 서열번호 11의 서열을 갖는 VHCDR2 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
v. 서열번호 13 또는 서열번호 47의 서열을 갖는 VHCDR3 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
vi. 서열번호 15 또는 서열번호 49의 서열을 갖는 VLCDR1 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
vii. 서열번호 17 또는 서열번호 51의 서열을 갖는 VLCDR2 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
viii. 서열번호 19의 서열을 갖는 VLCDR3 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
또한, 본 발명은, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 또는 55의 서열을 기준으로 변형된 폴리뉴클레오티드들을 갖는 폴리뉴클레오티드로서,
(a) 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54 또는 56의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하고, 및/또는
(b) 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 또는 55의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들 중 하나와 그의 전체 길이에 걸쳐서 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖고, 및/또는,
(c) 서열번호 1, 3, 5, 7, 21, 23, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 53 또는 55의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 단편이고 항원 결합 단편을 포함하거나 이로 구성되는 폴리펩티드를 암호화하는, 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 특히 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된 서열일 수 있다. 이 분야에서의 최적화 기법은 통상적인 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 단편은 적어도 9개 뉴클레오티드, 특히 적어도 18개 뉴클레오티드의 서열을 갖는 것이 유리하고, 이의 기원 서열보다 짧고, 특히 전체(full-length) 예시된 VH 또는 VL 서열보다 짧다.
특정 구현예에 따라, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따른 거대분자를 암호화하는 서열 외에도, 항체 사슬을 암호화하는 서열의 상류측에서, 생산 세포에서의 발현시 상기 단백질의 분비를 가능하게 하는 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 것이 유리하다. 또한, 이러한 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질을 검출하고/하거나 그의 정제를 촉진하기 위한 하나 이상의 마커 펩티드(들)를 암호화하는 하나 이상의 서열(들)을 포함한다.
또한, 본 발명은 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터에 관한 것이다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 벡터는, 포유동물 세포에서 클로닝 및/또는 발현을 위해 적당하고 전사 및 발현을 위한 조절 서열을 포함하는 플라스미드이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 재조합된 세포 또는 세포주, 특히 포유동물 또는 조류 세포 또는 세포주에 관한 것이다. 예를 들어, 전체적인 푸코실화(global fucosylation)를 감소시키도록 유전적으로 변형된 차이니즈 햄스터 난소 세포에 관한 것이다. 실제로, 코어 푸코실화기 결실된 항체는 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)의 유의한 감소를 나타낸다(von Horsten 등, 2010). 또 다른 예는 낮은 푸코실화 특성을 본래 갖는 EB66 세포주이다(Olivier 등, 2010).
따라서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법으로서,
(a) 인간 IL-7 수용체의 인간 알파 사슬, 바람직하게는 위에서 개시한 바와 같은 서열번호 115 (및/또는 서열번호 110) 및/또는 서열번호 117 (및/또는 서열번호 111) 및/또는 서열번호 116 (및/또는 서열번호 86)의 서열을 갖는 인간 CD127의 서열을 포함하고 인간 CD127의 다른 서열들을 포함하거나 포함하지 않는 항원을 이용하여 동물을 면역화하고, 필요한 경우, 상기 동물에 동일 면역원을 추가 접종(boosting)하고, 면역화에 반응하는 상기 동물로부터 비장 또는 림프절 세포를 회수하고 상기 세포를 골수종 세포와 융합하여 단일 클론 항체를 분리함으로써 하이브리도마를 얻고/얻거나,
(b) 항체의 회수를 가능하게 하는 조건하에서 세포 내에서, 뉴클레오티드 서열을 갖는 본원에서 개시한 폴리뉴클레오티드와 같은, 상기 항체를 암호화하는 뉴클레오티드를 재조합 형태로 발현하고,
(c) 특히 CD127의 2b 부위 유래의 서열, 특히 이러한 서열 및 CD127의 D1 유래의 서열을 포함하는 본원에서 개시한 바와 같은 에피토프를 인식하는 항체, 특히 인간 IL-7 수용체의 알파 사슬에 대하여 원하는 결합 친화성을 갖는 항체를 회수하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 특정의 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 단편은 EB66 조류 세포와 같은, 낮은 푸코실화 특성을 나타내는 세포에서 제조된다.
또한, 본 발명은 항체의 선별 방법으로서, CD127, 특히 위에서 개시한 바와 같은 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을, 아마도 본원에 기재한 방법들 중 하나를 통해 얻는 단계와, 이러한 항체들 중에서, 면역 세포, 특히 수지상 세포의 TSLP-유도 성숙을 증가시키지 않고, CD127의 내재화를 유도하지 않고/않거나, α4, β7 및/또는 α4/β7 인테그린의 시험관 내 및/또는 생체 내 발현을 억제하는 것들을 선별하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 상기 선별은 세포 표면 마커인 CD40 및/또는 CD80의 TSLP-유도 발현의 증가 또는 감소를 검사하거나 CD127의 내재화에 대한 영향을 검사하거나 α4, β7 및 α4/β7 인테그린의 발현에 대한 영향을 검사하기 위해 실시예 부분에서 기재된 과정들 중 임의의 것을 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 검사는 다수의 후보 항체들의 신속하고 효율적인 선별이 가능하도록 예를 들어 96-웰 플레이트에서 통상적으로 수행될 수 있고, 판독은 통상적인 면역염색 및 유세포 분석(flow cytometry analysis)을 통해 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명은 항체, 이의 항원 결합 단편 또는 다른 거대분자를 선별하는 방법으로서, 하기의 단계들 중 적어도 하나를 포함하거나 그 단계로 구성되는 방법에 관한 것이다:
a. CD127, 특히 본원에 개시된 바와 같은 항원,에 결합하는 거대분자의 능력으로, 거대 분자를 검사(예를 들어, 실시예 1, 실시예 2, 실시예 6 및/또는 실시예 7에 기재된 바와 같이)하는 단계;
b. 상기 거대분자의 존재에 의해 유도된 CD127-발현 세포에서 CD127의 내재화를 검사(예를 들어, 도 16 및/또는 실시예 5에서 기재된 바와 같이)하는 단계;
c. CD127-발현 세포에서 상기 거대 분자에 의한 CD127의 IL7-유도 내재화의 억제를 검사(예를 들어, 도 16 및/또는 실시예 5에서 기재된 바와 같이)하는 단계;
d. 상기 거대분자의 존재하에서 TSLP-유도 DC 성숙의 증가를 검사(예를 들어, 도 5, 도 6 및/또는 실시예 6에서 기재된 바와 같이)하는 단계.
상기 방법은 하기의 단계들 중 적어도 하나를 선택적으로 포함한다:
e. IL-7 유도 신호전달, 특히 STAT5 인산화의 상기 거대분자에 의한 억제를 검사(예를 들어, 도 1, 도 2 및/또는 실시예 3에서 기재된 바와 같이)하는 단계;
f. 상기 거대분자에 의한 TARC의 TSLP-유도 생성 억제를 검사(예를 들어, 실시예 9, 도 및/또는 도 6에서 기재된 바와 같이)하는 단계;
g. α4, β7 및/또는 α4/β7 인테그린 발현, 특히 T-림프구 상의 세포 표면 발현의 상기 거대분자에 의한 억제를 검사(예를 들어, 실시예 16, 도 19 및/또는 도 20에서 기재된 바와 같이)하는 단계;
h. 특히 IL-7의 존재하에서 γc 사슬에의 CD127의 결합의 상기 항체에 의한 차단을 검사(예를 들어, 실시예 21, 도 28에서 기재된 바와 같이)하는 단계.
이러한 검사 단계들은 각각 수행된 후, 본원에 개시된 바와 같은 원하는 특징을 갖는 하나 이상의 거대분자들의 선별이 수행된다.
전술된 바와 같이, 항체가 CD127의 서열 내의 서로 인접하지 않은 서열들을 포함하는 에피토프를 인식하는 것이 바람직한 경우, CD127의 단일 인접 서열로 구성(또는 본질적으로 구성)되는 에피토프의 단편의 인식(또는 그에 결합)을 연속적으로 검사하는 것이 가능하다. 예를 들어, 서열번호 115, 서열번호 116 및 서열번호 117의 서열을 포함하는 에피토프를 인식하는 항체를 얻는 것이 요구되는 경우, 서열번호 116으로 본질적으로 구성되는 에피토프를 인식하는 항체들을 일차적으로 선별한 다음, 이들 일차적으로 선별된 항체들 중에서, 서열번호 115로 본질적으로 구성되는 에피토프를 인식하는 항체들을 이차적으로 선별한 다음, 이들 이차적으로 선별된 항체들 중에서, 서열번호 117로 본질적으로 구성되는 에피토프를 인식하는 항체들을 선별하는 것이 가능하다. 명백히, 상기 선별의 순서는 예로서만 제공된 상기 순서를 기준으로 변경될 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 약학적 부형제(vehicle)와 함께 본 발명에 따른 거대분자를 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물로서, 다른 유효 성분을 선택적으로 추가로 포함하는 약학적 조성물이다.
또한, 본 발명은 인간 환자에게 투여시, 인간 CD127 양성 세포의 생존 또는 증식, 특히 CD127 양성 효과 세포의 생존 또는 증식(expansion), 특히 CD127+ 메모리 세포의 생존 또는 증식, 특히 CD127+ 및 CD8+를 나타내거나 CD127+ 및 CD4+ 세포인 메모리 T 세포의 생존 또는 증식을 제어하기에 적당한 제형으로서, 위에서 정의한 바와 같은 약학적 조성물 또는 본 발명의 거대분자를 유효 성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 거대분자를 유효 성분으로 포함하는 조성물은 환자에게 투여시 수지상 세포의 분화 및/또는 성숙을 제어하기에 적당한 제형이다.
본 발명의 조성물은 특히 알레르기 또는 자가면역에 관여하는 세포에 대하여 치료적 면역조절 효과를 갖는 추가의 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 예시 목적을 위하여, 관련 있는 모범적인 면역조절제는 항-CD3, 항-ICOS 또는 항-CD28 항체와 같은, T 세포를 표적 하는 다른 단일 클론 항체, 또는 CTLA4lg 또는 항-CD40 항체와 같은, 보조 세포를 표적 하는 재조합 단백질 또는 항체이다.
또한, 본 발명은 그를 필요로 하는 환자에서 병용(combination) 또는 추가 치료법(add-on therapeutic regimen)에서 유효 성분으로 사용하기 위한 것으로, 본원에 정의 또는 예시한 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 키메라 분자에 관한 것이다. 또한, 그를 필요로 하는 환자에서 병용(combination) 또는 부가 치료법(add-on therapeutic regimen)에서 치료적 유효 성분으로서 본 발명의 거대분자, 핵산, 세포 또는 세포주의 용도도 고려된다.
본 발명에 따른 거대분자, 핵산, 벡터, 세포, 세포주, 약학적 조성물, 또는 본원에서 정의한 바와 같은 조성물은 특히, 면역 반응, 특히 메모리 T 세포 반응에 영향을 받는 병리 상태를 치료하기 위해 인간 환자에서 사용되는 것으로 제안된다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 키메라 분자, 약학적 조성물 또는 본원에 정의된 바와 같은 조성물이 자가면역 또는 알레르기성 질환, 특히 알레르기 피부 질환, 장 질환 또는 이식 거부의 치료, 또는 급성 림프모구성 백혈병(예, T-ALL)과 같은 백혈병 또는 호지킨 림프종과 같은 림프종의 치료, 또는 CD127+ 세포와 관련된 유방암, 신장암, 방광암, 폐암, 췌장암과 같은 암 질환의 치료, 또는 세자리 림프종(Sezary lymphoma)과 같은 T 세포 피부 림프종의 치료, 또는 IL-7-R/TSLP 경로의 기능획득 돌연변이를 갖는 급성 림프모구성 백혈병(acute lymphoblastoid leukemia)의 치료를 위해 사용되는 것을 제안했다.
여러 가지 실시예에서, 본 발명은 CD127-음성 세포를 보존하면서 CD127-양성 세포를 고갈시키기 위한 본 원에 정의한 바와 같은 거대분자의 용도에 관한 것이다.
여러 가지 실시예에서, 본 발명은 CD127-음성 세포에는 직접적인 영향을 거의 미치지 않으면서 CD127-양성 세포의 분화 및/또는 증식 및/또는 성숙, 특히 IL-7 및/또는 TLLP에 의해 유도된 분화, 증식 또는 성숙을 방지하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 거대분자의 용도에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 Treg 세포를 보존하면서, IL-7-유도 신호전달을 저해함으로써 미접촉 및 메모리 T 세포를 제거/중화하기 위한 본원에 정의된 거대분자의 용도에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 아마도 오직 ADCC (항체-의존족 세포독성)를 통해서뿐만 아니라 선택적으로 CDC (보체-의존적 세포독성)을 통한 항체의 세포독성 작용의 결과로서 임파구의 아집단 또는 CD127을 발현하는 다른 세포 집단(정상 또는 병원성 T 및 B 임파구, NK 세포, 수지상 세포 및 다른 세포 타입(상피 세포 포함)을 포함)를 고갈하기 위한 거대분자의 용도에 관한 것이기도 하다.
상기의 실시예들에 있어서, 고려된 용도는 본 발명의 핵산, 벡터, 세포, 세포주 및 조성물에 적용될 수도 있다.
"치료 또는 "치료적 치료"는 수행된 투여 단계들이, IL-7 경로와 관련이 있는 질환(들), 즉, CD127 양성 세포의 활성화 및 증식을 동반하는 질환으로 고생하는, 그를 필요로 하는 동물 또는 인간 환자의 임상 상태를 개선하는 결과를 나타낸다는 것을 의미한다. 이러한 치료는 IL-7 경로와 관련이 있는 질환(들), 즉, CD127 양성 세포의 활성화 및 증식을 동반하는 질환과 관련된 증상들을 제거 또는 완화함으로써 동물 또는 인간 환자의 임상 상태를 개선하는데 목적이 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 치료는 건강을 회복하는 것을 가능하게 한다. 바람직한 구현예에서, 상기 치료는 면역 세포, 특히 수지상 세포의 성숙의 증가로 인한 바람직하지 않은 부작용이 없다.
본 발명은 우성 관용 상태를 유도하거나 또는 그와 반대로, 면역 반응 수준의 제어뿐만 아니라 악성 CD127-양성 세포의 파괴가 요구되는 관용의 결실을 유도하는, 인간 환자에 있어서 면역 반응의 변화를 동반하는 병리상태의 치료에서 거대분자의 용도를 포함한다.
본 발명은 이식 거부, 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 호흡기 질환, 만성 바이러스 감염, 림프종, 백혈병, 또는 병리상태가 CD127 양성 세포뿐만 아니라 IL-7 신호전달 경로와 관련이 있는 경우 고형 종양으로부터 야기되고 수지상 세포 성숙의 증가가 회피되어야 하는 것들(예, 유방암)을 포함한 다른 암 질환에 의해 유발된 것들과 같은 병리상태에 사용하기에 적당한 수단을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 자가면역 질환 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 급성 림프구성 백혈병과 같은 백혈병의 치료 또는 림프종의 치료, 또는 암질환의 치료, 또는 만성 바이러스 감염의 치료, 또는 염증성 질환의 치료, 또는 호흡기 질환의 치료, 또는 이식과 관련된 증상의 치료를 위한, 인간 환자에서 본 발명의 거대분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 조성물의 용도에 관한 것이다.
특정의 구현예에서, 본 발명은 자가면역 질환 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 급성 림프모구성 백혈병과 같은 백혈병의 치료 또는 림프종의 치료, 또는 암질환의 치료, 또는 만성 바이러스 감염의 치료, 또는 염증성 질환의 치료, 또는 호흡기 질환의 치료, 또는 이식과 관련된 증상의 치료를 위해 인간 환자에게 본 발명의 거대분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 특징 및 특성들은 하기의 실시예 및 도면으로부터 명백해진다.
도면의 간단한 설명
도 1. IL-7R 신호전달의 억제. 항-인간 IL-7Rα 단일 클론 항체에 대한 용량 의존 반응에 따른 IL-7 유도 pSTAT5+ T 림프구의 억제. N13B2 (사각형), N13E5 (원형) 및 N13K12 (삼각형). pSTAT5 (%): FACS에 의해 측정된, 포스포-STAT5에 대하여 양성인 세포들의 비율(%). STAT5 인산화의 용량 의존적인 억제는 세 경우 서로 유사한데, 세 경우 모두 50 ng/ml (대략 50% 억제) 및 약 100 내지 500 ng/ml (> 95% 억제)에서 인산화를 효율적으로 억제한다.
도 2. N 13B2 mAb에 의한 IL-7R 신호전달의 억제. 도 1에서와 같이 축(Axe). (A) 설치동물 포맷(format)에서, MD707-3 mAb (원형)과 비교하여 N13B2 mAb (사각형)에 대한 용량 반응에 따른 IL-7 유도 pSTAT5+ T 림프구의 억제. (B) 0.1 (속빈 기호) 또는 5 ng/ml (속찬 기호)의 재조합 인간 IL-7의 존재하에서 N13B2의 인간 IgG1 (사각형) 및 인간 IgG4 (원형) 키메라 형태를 이용한 (A)에서와 동일한 실험. N13B2은 MD707-13보다 STAT 5를 억제하는데 있어서 더욱 효율적이지만(MD707-13의 경우 1000 ng/mL에 대한 N13B2의 경우 100 ng/ml에서 약 50% 억제), N13B2의 서로 다른 IgG 동종형(isotype)들은 유사한 억제 효율을 나타낸다.
도 3. (A) 쥐의 N13B2 항-CD127 항체의 결합 연구. N13B2 항체 또는 MD707-1은 상이한 농도에서 CD127 고정 항원에 주입되었다. Resp. diff: 반응 차이. 시간: 시간(초)(전체 시간: 20분). Blk: 블랭크 (항체 없음). 결합 및 해리 곡선들은 BIAeval 4 소프트웨어 상에서 모델 "이가 검체(Bivalent analyte)"를 이용하여 분석되었다. 결과는 하기 표 1에서 나타낸다.
Ka (1/Ms) Kd (1/s) KA (1/M) KD (M)
MD707-1 2.66 E+05 1.21E-04 2.19E+09 4.56E-10
N13B2 2.01E+05 1.60E-05 1.26E+10 7.96E-11
[표 1] 결합 연구의 결과
항체 Ka1 (1/Ms) Kd1 (1/s) Rmax (RU) KA (1/M) KD (M)
N13B2 쥐 9.63E+04 4.75E-06 115 2.03E+10 4.93E-11
N13B2-G1 1.49E+05 5.62E-05 109 2.65E+09 3.77E-10
N13B2-G4 2.01E+04 3.41E-06 94.9 5.89E+09 1.70E-10
[표 2] 별개의 실험에서 (A)에서 기재된 N13B2 및 이의 키메라의 Kd
도 4. 새로운 항체인 N13B2의 항 CD127 활성은 재조합 hCD127 항원을 이영하여 ELISA 분석에 의해 측정하였다. OD 450 nm: 450 nm에서의 광학 밀도. A. N13B2의 CD127 결합 활성(속찬 원)은 예전의 항체 발생(MD707-1 (속빈 다이아몬드), 3 (속빈 삼각형) 및 6 (속찬 사각형)과 비교하였다. N13B2는 분석에서 가장 효율적인 결합제로 보인다. B. 서로 다른 N 13B2 포맷들(쥐, lgG1 (원형) 또는 lgG4 (사각형)) 사이의 CD127 활성을 비교했다. 결합 활성의 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
ED 50 (ng/ml)
N13B2 65,64
MD707-1 122,93
MD707-3 293,32
MD707-6 2789,41
St cMD707-3-G1 16,1
cN13B2-G1 12
cN13B2-G4 12,6
[표 3] 선택된 항체들의 ED50
도 5. 골수성 수지상 세포에 의한 CD80 세포 표면 마커의 발현 및 TSLP-유도 TARC (흉선 및 활성화-조절 케모카인, CCL17) 생성. None: 자극 없음. LPS: 리포폴리사카라이드를 이용한 자극. TSLP: TSLP를 이용한 자극. A) ELISA에 의한 상등액에서 TARC 생성의 정량, 및 B) 배지 단독, 1 μg/ml LPS 또는 15 ng/ml TSLP를 이용하여 24 시간 동안 배양된 인간 혈액 CD1C+ 수지상 세포의 유세포 분석을 통한 CD80 세포 표면 발현. 데이터는 평균 ± 표준 편차 또는 3개의 독립적인 실험의 평균 (SEM) 농도이다.
도 6. 항-인간 CD127 항체에 의한 TSLP-유도 TARC 생성의 억제. 15 ng/ml의 TSLP 및 상이한 농도의 항-인간 CD127 항체와 함께 24 시간 동안 배양한 인간 혈액 CD1C+ 수지상 세포의 상등액에서 TARC 생성의 ELISA에 의한 정량: N13B2 항체 (원형), MD707-6 (삼각형) 및 대조군(X)으로서 항-TSLP. 데이터는 세 개의 상이한 혈액 공여체로부터의 3회의 독립적인 실험들을 나타낸다. N13B2는 TARC 분비의 유도를 매우 온건하게만 억제하는 반면(6 g/mL에서 약 20% 억제), MD707-13 및 항-TSLPR은 더욱 효율적인 억제제이다(각각 약 50 % 및 약 70 % 억제).
도 7. 수지상 세포 성숙의 TSLP-유도 CD80 및 CD40 발현 마커에 대한 항-CD127 항체의 영향. 세포는 24 시간 동안 15 ng/ml에서 TSLP에 의해 활성화했다. N13B2, MD707-3 및 MD707-6 항-CD127 항체는 6 ㎍으로 상등액에 첨가했다. 세포 표면에서 CD80 (A) 및 CD40 (B) 발현을 FACS에 의해 분석했다. 데이터는 3번의 독립적인 실험들을 나타내는 것으로서, 대조 세포에서의 발현%로 나타낸다(배지 = 항체 없음, TSLP 있음). 검사된 항체들 중 N13B2 만이 TSLP-처리 세포에서 CD40 및 CD80의 세포 표면 발현을 증가시키지 않는다.
도 8. 키메라 N13B2 (IgG1 또는 IgG4) 항-인간 D127 항체의 항체-의존적 세포독성(ADCC). 이펙터(E)로서 사용된 인간 NK 세포는 표적 세포인 인간 CD127-형질감염 BAF/3 세포주(10 이펙터 대 1 표적세포 비) 및 상기한 농도의 키메라 N13B2 IgG1 (속찬 사각형), N13B-igG4 (속빈 사각형) 또는 키메라 MD707-3 (X)와 함께 4 시간 동안 배양했다. 특이적 세포독성의 백분율은 51 Cr 방출에 의해 결정했다.
도 9. 인간화 면역결핍 마우스에서 화학적으로 유발된 대장염을 개선하기 위한 쥐의 N13B2 항-CD127 mAbs의 효율. PBS (실선/속찬 삼각형) 또는 N13B2 항- IL7Rα 항체(점선, 속빈 삼각형)의 주사 후, 직장내 투여시 심한 만성 염증을 유발하는 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산(TNBS)를 이용한 화학적 처리의 출발(0일)로부터 생존율(A) 및 체중 변화(B)를 매일 모니터했다. (B)에서, 각각의 점은 평균 체중 데이터(+/- SEM)를 나타낸다. Hu-TNBS + PBS 그룹의 경우 n = 6, TNBS 그룹 + 항-IL-7Rα의 경우 n = 6. 처리된 그룹에서 생존률이 중가되고 체중 손실이 감소된다.
도 10. N13B2_G1 M 키메라 VH 및 VL 사슬의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열. Fc 사슬은 하부에 인쇄되고, 각각의 서열에서의 세 개의 CDR들이 밑줄로 표시되어 있다. 별표(*)는 아미노산 서열 내의 정지 코돈을 나타낸다.
도 11. N13B2_G4M 키메라의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열. Fc 사슬은 하부에 인쇄되어 있고, 각각의 서열에서의 세 개의 CDR들이 밑줄로 표시되어 있다. 별표(*)는 아미노산 서열 내의 정지 코돈의 위치를 나타낸다.
도 12. 세 개의 선택적인 인간 Fc 사슬(IgG1, IgG2 및 IgG4) 및 쥐의 N13B2 항체의 Fc 사슬(IgG1)의 아미노산 서열.
도 13. 항-CD127 ELISA 결합 분석: 인간 CD127Fc의 코팅 및 항-인간 kappa 항체를 이용한 확인. 새로운 항체인 N13B2의 항 CD127 활성은 재조합 hCD127 항원을 이용하여 ELISA 분석을 통해 평가했다. 서로 다른 N13B2 항체 포맷들(wt (X), IgG4 인간화 h1 (속찬 사각형), h2 (속빈 원형) 또는 h3 (속찬 삼각형) 항체) 사이의 CD127 활성을 비교했다. OD: 광학 밀도.
ED 50 (ng/ml)
N13B2 wt 3
N13B2-h1 2,4
N13B2-h2 0,6
N13B2-h3 0,6
[표 4] 선택된 항체들의 ED 50
도 14. 항-CD127에 의한 P-STAT5 억제: A. 0.1 ng/ml의 재조합 인간 IL-7의 존재하에서 Rat N13B2 wt (X) 항체와 비교하여 용량 의존적인 방식으로 T 임파구(N13B2 h1 (흑색 사각형), h2 (속빈 원형) 및 h3 (흑색 삼각형)에 대한 인간화 N13B2 mAbs에 의한 IL7-유도 P-STAT5의 억제. B. 예전의 항체 발생 유래의 상이한 항-CD127 항체들은 IL7 의존적 P-STAT5: MD707 3 (원형), MD707 4 (삼각형) 및 MD707 13 (사각형)을 억제하기 위한 그들의 능력에 대하여 비교하였다.
IC 50 (ng/ml)
N13B2 wt 50,2
N13B2-h1 63,8
N13B2-h2 18,7
N13B2-h3 21,2
[표 5] 선택된 항체들의 ED 50
도 15. 쥐의 항-CD127 항체에 대한 인간화 항체의 안정성 분석. 37℃(쥐 N13B2wt (+) 또는 인간화 N13B2 h3 (사각형)) 또는 -80℃(Rat N13B2wt (X) 또는 인간화 N13B2 h3 (삼각형))에서 7일 후 및 4번의 동결/해동(다이아몬드) 후 항체 농도를 ELISA에 의해 측정했다.
ED 50 (ng/ml)
N13B2 wt_-80℃에서 보관 3,6
N13B2 wt_37℃에서 7일간 보관 3,5
N13B2-h3_-80℃에서 보관 1,3
N13B2-h3_37℃에서 7일간 보관 1,1
N13B2-h3_4회의 동결 및 해동 1,7
[표 6] 37℃ 또는 -80℃애서 7일 후 및 4회의 동결/해동 후 항체들의 결합 분석
N13B2-wt N13B2-h?
-80℃에서 7일 37℃에서 7일 -80℃에서 7일 37℃에서 7일
응집체% 3 4 2,8 3,2
단량체% 97 96 97,2 96,8
[표 7] 쥐의 항-인간 CD127 항체에 대한 인간화 항체의 안정성 분석: 37℃ 또는 -80℃에서 7일간 정치(incubation) 후 겔 여과에 의한 응집체 형성의 분석
도 16. 세포분석에 의한 경쟁 및 내재화 분석. 인간 말초 혈액 단핵 세포를, 4℃(해치된(hatched) 막대), 37℃(흑색 막대)에서 30분간 또는 37℃에서 30분간 IL-7이 없이 몇몇의 항-CD127 mAb들과 함께 배양한 다음, 5 ng/ml의 재조합 IL-7(회색 막대)와 함께 15분간 배양했다. (A) 10 μg의 클론 MD707-5, MD707-12 또는 MD707-13 또는 키메라 N13B2-G4; (B) 50 ng의 N13B2, HAL 클론 H3L4 또는 1A11 또는 대조군인 배지. 다음에, 세포를 상업적으로 이용가능한 항-인간 CD127 mAb들을 이용하여 4℃에서 염색하여 세포막 수준에서 IL-7 수용체 알파 사슬 발현을 편가했다.
MD707-5, MD707-12 및 MD707-13 항체들은 IL-7의 존재 또는 부재하에서 37℃에서 수용체의 내재화를 유도했지만, 키메라 N13B2-G4은 그렇지 않았다. HAL 항체는 임의의 조건에서 CD127의 세포 표면 발현의 감소를 유도했다. 4℃에서의 결과들은 1A11 항체가 표지를 위해 사용한 항체와 약하게 경쟁하지만, HAL은 강한 경쟁을 나타내고, N13B2는 경쟁하지 않는다는 것을 나타낸다. 37℃에서, HAL의 존재하에서는 세포 표면 염색이 관찰되지 않았지만, 1A11 단독은 CD127의 세포 표면 발현의 강한 감소를 유발했고, IL-7과 결합시, 그 세포 표면 발현은 약 90% 만큼 억제되었다. N13B2은 4℃에서 CD127의 세포 표면 발현을 감소시키지 않았고, 단독으로 사용된 CD127의 세포 표면 발현의 감소를 유발하지도 않았고, IL-7의 존재하에서 관찰된 감소를 억제했다.
도 17. (A) 비인간 영장류에서 N13B2 and MD707-13 mAb 투여의 약동학 및 약력학 연구. 개코원숭이(papio anubis)들을 10 mg/kg의 N13B2-IgG1 (n=3, 속찬 사각형), N13B2-IgG4 (n=3, 속찬 원형) 또는 MD707-13-IgG4 (n=3, 속빈 삼각형)으로정맥내 처리했다. 항-CD127 mAb의 혈청 농도를 ELISA로 모니터했다. (B) 병행하여, 혈액 T 임파구의 표면에서 CD127의 발현을 유세포 분석을 통해 모니터하고, mAb의 주사 전에 측정한 수준(점선으로 나타냄)에 대하여 표준화했다. * p<0.05. 시간에 따른 세 개의 항체 모두에 대한 전체 혈장 수준은 유사하다. CD127의 세포 표면 발현은 MD707-13 처리의 약 8일 후에 감소되지만, 이러한 감소는 검사된 N13B2 클론들 중 어느 것에서도 관찰되지 않는다.
도 18. 개코원숭이(papio anubis)들을 10 mg/kg의 N13B2-IgG1 (n=3, 속찬 사각형), N13B2-IgG4 (n=3, 속찬 원형) 또는 MD707-13-IgG4 (n=3, 속빈 원형)으로 정맥내 처리했다. 혈액 및 림프절에서 조절 T 림프구(CD3+ CD4+ CD25high Foxp3+)의 빈도(CD4 양성 T 세포의 %로 나타냄)뿐만 아니라 조절 T 림프구의 무수 집계수(세포수/mL로 나타냄)를, mAb들의 투여 후 0일 및 2주째에 모니터했다. ** p<0.01, *** p<0.001. 세 종의 항체들은 모두 혈액내의 총세포수 및 혈액 및 림프절내의 조절 T 세포의 비율을 증가시킨다.
도 19. α4, β7 및 α4/β7 인테그린 발현의 시험관내 억제. A. 5 ng/ml의 인간 IL-7의 존재 또는 부재하에서 9일의 배양 후, FACS에 의해 분석된 설명적인(expositive) 세포 및 α4/37-양성 인간 T-림프구의 비율. B. 위와 동일함. 0일째에 배양액에 첨가된 N13B2 mAb의 농도를 나타냄. 점선은 대조 조건(IL-7 및 N13B2 mAb이 없음)에서의 기선 수준을 나타낸다. α4, β7 및 α4/β7 인테그린의 발현의 IL-7-유도 증가는 시험관 내에서 인간화 N13B2 mAb에 의해 방지된다(이는 약 2 μg/mL 항체 농도에서 완전히 억제된다).
도 20. α4, β7 및 α4/β7 인테그린 발현의 시험관내 억제. 40 x 106 개의 인간 말초 혈액 단핵 세포를 조사된 면역결핍 마우스(NOD/SCID/ IL-2 수용체 감마-사슬 녹아웃 마우스)에게 복막내 주사했다. 대조 완충액(n=5) 또는 N13B2 mAb를 이용한 처리 후 (5 mg/kg, n=5) 2주째에, FACS에 의해 분석된 혈액 β7-양성 T 림프구의 비율(좌측) 및 β7-양성 인간 T 림프구의 생착(우측). ** p< 0.01. N13B2는 β7 양성 T 세포의 비율 및 β7 양성 T 세포의 생착을 유의하게 감소시킨다.
도 21. 생체 내 건선 모델인 DTH 모델에 대한 N13B2 항체의 영향. BCG-(Bacillus Calmette-Guerin) 접종된 개코원숭이(papio anubis)에게 2000 유니트 (A) 또는 1000 유니트 (B)의 정제된 투베르쿨린(tuberculin)을 피내 주사에 의해 공격접종하여 지연형 과민 반응을 유발하고, 홍반의 직경을 매일 기록했다(별표; 점선). 1개월 후, 동물들을 10 mg/kg의 N13B2-IgG1 (n=3, 속찬 사각형), N13B2-IgG4 (n=3,속찬 원형) 또는 MD707-13-IgG4 (n=3, 속빈 원형)으로 정맥내 처리했다. mAb의 투여 후 4시간째에, 동물들에게 2000 유니트 (A) 또는 1000 유니트 (B)의 정제된 투베르쿨린(tuberculin)을 다시 피내 주사에 의해 공격접종하여 지연형 과민 반응을 유발하고, 홍반의 직경을 매일 기록했다(실선). MD707-13 항체가 아닌 N13B2는 두 번째 공격접종 후 홍반의 직경에 의해 측정된 바와 같이 메모리 림프구 반응을 억제한다.
도 22: 개코원숭이(papio anubis)들을 10 mg/kg의 N13B2-IgG1 (n=3, 속찬 사각형), N13B2-IgG4 (n=3, 속찬 원형) 또는 MD707-13-IgG4 (n=3, 속빈 원형) 또는 대조 완충액 (n=3, 점선)으로 정맥내 처리했다. 4 시간 후, 동물들은 10% 농도의1.5ml의 양 적혈구(SRBC)를 정맥내 주사 받았다. 특이적 항-SRBC IgG 역가를 SRBC의 투여 후 1주 및 2주째에 모니터하고 0일째의 그의 역가에 대하여 표준화했다. * p<0.05. MD707-13가 아닌 N13B2는 특이적 IgG 역가에 의해 측정된 바와 같이 체액성 면역 반응을 억제한다.
도 23. 인간화 N13B2 VH lgG4 S228P_h3의 단백질 서열: 회색으로 나타낸 서열은 CDR들이고, 밑줄친 볼드체(bolded)의 아미노산들은 돌연변이된 것이고(V42I, A54S, D82N, M108L), 밑줄친 서열은 돌연변이된 IgG4 서열(S228P)이다.
도 24. 인간화 N13B2 VL Ckappa_h3의 단백질 서열: 회색으로 나타낸 서열은 CDR들이고, 밑줄친 볼드체(bolded)의 아미노산들은 돌연변이된 것들이고(V54I, Y77F, F93Y+ N31Q, S59T), 밑줄친 서열은 돌연변이된 IgG4 서열(S228P)이다.
도 25. N13B2는 염증성 마우스 모델에서 사망으로부터 보호한다: 인간화 마우스에서 이식편대 숙주질환(graft-versus-host-disease)을 유발했다(실시예 13 참조). 처리를 받지 않는 0일째에 5천만 개의 인간 PBMC로 주사한 살아있는 NSG 마우스(백색 사각형, n=14) 또는 5mg/kg의 키메라 N13B2를 복막내 주사하여 일주일에 3회 처리한 살아있는 NSG 마우스(흑색 원형, n=19)의 비율.
도 26. N13B2은 염증성 마우스 모델에서 결장 염증을 특이적으로 예방한다(실시예 13 참조). 안락사시(즉, 25% 체중 감소 또는 주사후 100일), 0일째에 5천만 개의 인간 PBMC를 주사하고 5mg/kg의 N13B2를 일주일에 3회 처리하거나(흑색) 처리하지 않은(백색) NSG 마우스의 각 조직내의 염증 세포 침윤물을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 10μm 슬라이드 상에서 조직학적으로 분석했다. 결과는 다음과 같이 나타낸다: A. 결장, B. 창자, C. 간 및 D. 폐. 데이터는 그룹당 적어도 n=8의 평균 +/- SEM 이다.
도 27. N13B2 항체에 의해 인식되는 CD127 단백질(Uniprot P16871) 상의 에피토프 도메인. 볼드체의 아미노산들은 N13B2에 의해 인식되는 구조적인 에피토프를 형성하는 서열에 해당하고, 회색 바탕으로 나타낸 아미노산들은 IL-7와의 상호작용을 위해 중요한 것들이고, 줄을 그은 아미노산들은 CD127의 단일 펩티드를 구성한다.
도 28. CD127/IL7/CD132 복합체와 항-hCD127 항체의 동시면역침전(Co-immunoprecipitation) 연구(실시예 21). 레인: 1 - PBL 단독, 2- PBL+IL7, 3- PBL+IL7+N13B2, 4-PBL+IL7+MD707-13, 5-CD132-Fc (72 Kda) 또는 CD-127-Fc (80KDa). 항-hCD127 칼럼 (MD707-9)상의 시료의 동시면역침전. 용출액을 (A) 토끼 항-인간 CD132 항체로 웨스턴 블롯 분석하고 옥시다제-표지 염소 항-토끼 항체로 확인하거나 (B) 쥐 항-인간 CD127 항체로 웨스턴 블롯 분석하고 퍼옥사다제-표지 당나귀 항-쥐 항체로 확인했다.
실시예
실시예 1. 신규한 항-인간 CD127 Mab들의 제조 및 선별
재조합 hCD127-Ig (면역글로불린의 불변 영역이 융합된 hCD127 - Sino Biologicals사, 베이징, 중국; reference 10975-H03H)를 이용하여 쥐들을 면역시키고, 통상적인 기법에 따라 단일 클론 항체들을 유도했다. 사용된 면역 프로토콜은 다음과 같았다: 재조합 CD127 Fc 키메라 (10975-H03H Sino Biological사, 베이징, 중국)를 이용하여 LOU/C Igkla 주(strain)의 쥐들을 면역시켰다. 50 마이크로그램의 단백질을 완전 프로인트 아쥬반트(Complete Freund Adjuvant)에 현탁하고 피하 주사했다. 20 일후, 불완전 프로인트 아쥬반트에 현탁된 단백질의 리콜 주사(recall injection)를 수행했다. 60일째에 또 다른 리콜 주사를 수행하고, 90일째에 100 마이크로그램의 단백질을 이용하여 추가 주사(boost injection)를 수행하고, 4 일후 비장 세포를 수집했다.
예전에 설명된 과정(Chassoux 등, 1988)에 따라, 비분비성 아자구아닌 저항성 세포인 LOU 쥐 면역종 IR983F을 비장 단핵세포에 융합하여 하이브리도마를 얻었다. 우선, 하이브리도마를, 분비된 단일 클론 항체가 재조합 CD127 분자(CD127 Fc 키메라; 10975-H03H, Sino Biological사, 베이징, 중국)에 결합하는 능력에 따라 선별했다.
선별 후, 하이브리도마를 DMEM 완전 배지에서 배양했다. 상등액을 한외여과(Centramate, Pall)를 통해 농축하고 Protein G 크로마토그래피(HiTrap, GeHealthcare)상에서 친화성 정제했다. 글리신 0.1 M pH 2.8 용리 완충액을 이용하여 용리를 수행했다. 얻어지는 정제된 면역글로불린을 인간 CD127에 대한 활성 ELISA 분석을 통해 평가했다.
재조합 CD127의 분비된 항체에 의한 인식에 기반하여 선별된 1차 선별된 클론들 중에서, 인간 T 세포에 의해 발현된 CD127의 인식 및 TSLP에 대한 이들의 길항 특성에 대한 유세포 분석을 통해 2종의 클론을 더욱더 선별했다.
항체들을 생성하고, 이들의 동종형을 특성규명하고, BIAcore 기술을 이용한 표면 플라즈몬 공명 측정을 통해 그들의 친화성을 측정했다.
실시예 2. ELISA에 의해 평가된 항-h-CD127 Mab들의 rCD127 인식
재조합 hCD127(Sino Biologicals사, 베이징, 중국; reference 10975-H08H)를 플라스틱 상에 고정하고, 증가하는 용량의 Mab들을 첨가하여 결합을 측정했다. 배양 및 세척 후, 퍼옥시다제-표지 마우스 항-쥐 카파(kappa) 사슬(AbdSerotec)을 첨가하고, 통상적인 방법을 통해 확인했다. 각각의 항체마다 결합을 확인했다.
실시예 3. IL7 신호전달(pSTAT5)의 억제
건강한 자원자들로부터 피콜 구배(ficoll gradient)를 통해 수확한 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 실온에서 15분간 여러 항체 농도를 갖는 무혈청 배지에서 배양한 다음, 37℃에서 15분간 0.1 또는 5 ng/ml의 재조합 인간 IL-7 (rhlL-7; AbD Serotec ref PHP046)과 함께 배양했다. rhlL-7를 처리하지 않은 PBMC는 배경 신호로서 분석한 반면, 항체 없이 IL-7를 처리한 세포는 음성 대조군을 사용되었다. 다음에, PBMC를 신속히 냉각하고, FACS 완충액으로 로 세척하여 반응을 중지했다. 다음에 세포를 차가운 Cytofix/Cytoperm 용액(BD Bioscience사, ref 554722)와 함께 15분간 배양한 다음, Perm/Wash 완충액(Bd Bioscience)으로 2회 세척하고, 얼음상에서 30분간 항-인간 CD3 FITC 항체(Bd Bioscience ref 557694)로 염색했다. 다음에, PBMC를 Perm/Wash 완충액으로 2회 세척하고, BD Perm 완충액 III (Bd Bioscience, ref 558050)에서 30분간 투과화(permeabilization)했다. 다음에, 세포를 FACS 완충액 (및/또는 1% BSA 및 0.1% 아지드를 갖는 PBS)에서 2회 세척하고 항-인간 pSTAT5 Alexa 647 항체(BD Bioscience, ref 612599)와 함께 실온에서 30분간 배양했다. 시료를 BD CANTO II FACS 기기상에서 분석했다. 도 1 및 도 2에서 도시된 바와 같이, N13B2 및 이로부터 유도한 키메라 항체(N13B2-G1 및 N13B2-G4)는 STAT5 인산화의 강한 억제제인데, 50 ng/ml와 같이 낮은 농도에서는 50% 초과의 억제를 나타내고, 100 ng/ml와 같이 낮은 항체 농도에서 80% 초과(0.1 ng/ml의 IL-7의 경우) 또는 90% 초과(5 ng/ml의 IL-7의 경우)의 억제를 나타낸다.
실시예 4: 여러 가지 항-인간 IL- 7Rα 단일 클론 항체들의 반수 억제 농 고(IC50)을 표 1에서 나타낸다.
IC50 N13B2 N13E5 N13K12 MD707-3 N13B2-G1 N13B2-G4
pg/ml 43 50 62 1090 28 37
[표 8] 100 pg/ml의 rhlL7에 의해 유발된 P-STAT5에 대한 여러 가지 항-CD127 항체의 IC50
실시예 5: 유세포분석(cytofluorometry)에 의한 IL7R 내재화 분석
내재화 분석은 Henriques 등 (2010) 및 Luo 등 (2011)의 물질 및 방법에서 기재된 바와 같이 공초점 현미경을 이용하여 수행될 수 있었다. IL-7의 부재하에서 CD127의 내재화를 관찰하기 위하여, 50 ng/ml의 최종 농도의 항체 hN13B2, HAL 클론 H3L4 (미국 특허 8,637,27호) 또는 1A11 (국제특허출원 WO2011094259호) 또는 10 μg/ml의 최종 농도의 항체 MD707-5, MD707-12, MD707-13 또는 N13B2-G4를 4℃ 또는 37℃에서 30분간 무혈청 배지(TexMACS, Miltenyi Biotec)에서 인간 PBMC (100000 cells/well)와 함께 배양했다. IL-7의 부재하에서 CD127의 내재화를 관찰하기 위하여, 동일한 전배양 조건을 항체와 함께 37℃에서 사용한 다음, 세포를 37℃에서 15분간 0.1 ng/ml의 재조합 IL7 (AbD Serotec, ref PHP046)을 이용하여 자극했다. 그 반응을 4℃에서 중지하고, 그 세포를 PBS-1% BSA-0.1% 아지드로 3회 세척한 다음, PBS-1% BSA-0.1% 아지드에 1/10으로 희석되고 4℃에서 15분간 정치한 PE-표지 항-CD127 (클론 hlL7R-M21, BD Bioscience, ref 557938)로 염색했다. 세척 후, 세포들을 Cantoll 유세포분석기(BD Biosciences)를 이용한 유세포분석을 통해 분석했다. 도 16에서 나타낸 결과들은 3회의 독립적인 실험들을 나타낸다.
이러한 방법은 스크리닝을 수행하고 IL7-의존적 또는 -독립적 CD127 내재화를 차단하는 항체를 선별하기 위하여 96 웰 플레이트에서 쉽게 적용될 수 있다.
실시예 6: 항-CD127 항체 친화성 연구
항 hCD127의 친화성을 Biacore 3000 (GE Healthcare)상에서 표면 플라즈몬 공명을 통해 측정했다.
CM5 칩(GE healthcare)을 7분간 NHS/EDC 믹스의 주입을 통해 활성화했다. CD-127Fc (500μg/mL)를 5 mM 말레산 완충액 pH6.2에 첨가하고 주입하고, 후킹(hooking) 300RU 신호가 발생될 때까지 숙신이미드 에스테르 잔기를 첨가했다. 그 유리 반응성 잔기들을 1M 에탄올아민 pH8.5의 주입을 통해 불활성화했다. 고정된 CD 127상에 상기 결과 부분에서 나타낸 농도 범위로 항체들을 주입했다. 주입 속도는 40μL/분으로 설정되었고, 결합을 3분간 측정하고 해리를 10분간 측정했다. 각각의 분석 주기 사이에, 5M MgCl2의 용액을 60초간 주입하여 칩을 재생했다.
얻어진 소노그램(sensorgram)을 BIAeval 4 소프트웨어 상에서 모델 "Bivalent analyte"를 이용하여 분석했다.
도 3 및 표 2에서 나타낸 바와 같이, 쥐 유래의 N13B2 및 이의 키메라 항체는 CD127에 대하여 높은 친화도를 나타내었는데, 4.9E-11M 내지 8.E-11 M (쥐 유래의 N13B2), 3.77.E-10 (N13B2-G1 ) 및 1.70.E-10 (N13B2-G4)의 KD를 나타냈다. 쥐 유래의 MD707-1 항체는 쥐 유래의 N13B2보다 CD127에 대하여 더욱 낮은 친화도를 나타냈다.
실시예 7: 항-CD127 항체 결합 활성
샌드위치 ELISA를 위하여, 당나귀 항-인간 IgG (Fc 특이적) 항체를 P96-플레이트상에 1.2 g/ml으로 코팅하고, 정제수를 첨가하여 표준 범위에 다른 농도를 측정했다. 정치 및 세척 후, 카파 특이적인 마우스 항-인간 경쇄 (Abeam, reference ab791 15 또는 Effimune, 클론 NaM76-5F3) 및 퍼옥시다제-표지 당나귀 항-마우스(Jackson Immunoresearch사, reference 715-036-151) 항체를 첨가하고 통상적인 방법을 통해 확인했다.
항 hCD127 항체의 결합 활성을 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해 평가했다. ELISA 분석을 위하여, 재조합 hCD127 (Sino Biologicals사, 베이징, 중국; reference 10975-H08H)를 플라스틱 상에 1 ㎍/ml의 농도로 고정하고, 정제수를 첨가하여 결합을 측정했다. 정치(incubation)및 세척 후, 퍼옥시다제-표지 마우스 항-쥐 카파(kappa) 사슬(AbdSerotec)을 첨가하고 통상적인 방법을 통해 확인했다.
도 4 및 표 3에서 나타낸 바와 같이, ELISA에 의해 측정된 N13B2 항체의 결합 활성은 높았는데, 쥐 N13B2 항-hCD127 항체의 경우 ED50 = 65.6 ng/mL (ED50< 75 ng/ml 및 ED50 < 100 ng/ml)이고, N13B2 유래의 두 개의 키메라 항체(cN13B2-G1 및 cN13B2-G4)의 경우 ED50이 각각 12.0 ng/ml 및 12.6 ng/ml (ED50 < 15ng/ml)이었다.
실시예 8. 안정성 분석
인간화 및 키메라 정제 N13B2-G1를 37℃ 또는 -80℃에서 7일간 정치했다. 하기의 두 분석법을 이용하여 항체의 안정성을 측정했다: ELISA 분석에 의한 결합 항-CD127, 및 겔 여과에 의한 응집체 형성. 활성 ELISA 분석을 위하여, 재조합 hCD127 (Sino Biologicals사, 베이징, 중국; reference 10975-H08H)를 1 ㎍/ml의 농도로 플라스틱 상에 고정하고, 상등액의 희석액을 첨가하여 결합을 측정했다. 정치 및 세척 후, 마우스 항-인간 경쇄(카파 특이적) 및 퍼옥시다제-표지 항-마우스 항체를 첨가하고 통상적인 방법을 통해 확인했다. 응집체 형성의 분석을 위하여, 시료를 겔 여과 크로마토그래피 칼럼(Superdex 200, 10/300GL, GeHealthcare)상에서 분석하여 시료로부터 응집체 및 단량체를 분리 및 평가했다.
실시예 9. TARC의 TSLP -유도 생성 및 성숙한 수지상 세포 마커 CD80 및 CD40의 발현
건강한 자원자(Etablissement Frangais du Sang, Nantes, 프랑스)로부터 CD1c (BDCA-1)+ 수지상 세포 분리 키트(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일)를 이용하여 골수성 수지상 세포(DC)를 분리했다. 골수성 수지상 세포를 10% 송아지 혈청, 1% 피루베이트, 1% Hepes, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 RPMI에서 배양했다. 세포를 TSLP (15ng/ml), LPS (1 ㎍/ml) 또는 배지 단독이 존재하고 여러 농도의 쥐 항-인간 CD127 항체가 첨가된 평평한 96-웰 플레이트에 5.104 cells/well의 밀도로 파종했다. 24 시간의 배양 후, 세포를 유세포 분석을 통해 분석하여 성숙의 CD80 세포 표면 마커(항-CD80-V450 (BD#560442))를 분석하고, 상등액을 수집하고 TARC 생성을 ELISA 분석(R&D sytems사, Minneapolis, 미국)을 통해 분석했다.
TARC의 TSLP-유도 생성의 억제를, 1 μg/ml 또는 6 μg/ml의 농도의 N13B2 또는 MD707-6 또는 상업적인 항-TSLPR 항체(R&D systems사, ref. AF981)의 존재하에 또는 항체의 부재하에 위에서 기재한 바와 같이 그 생성을 측정함으로써 평가했다. 도 6에서 도시된 바와 같이, N13B2는 1 μg/mL와 같이 낮은 농도에서 TSLP-유도 TARC 생성을 25% 초과 만큼 억제했다. 즉, 이러한 농도에서 MD707-6 만큼이나 효율적으로 억제했다.
CD40 및 CD80 세포 표면 마커의 TSLP-유도 발현의 억제를, 6 μg/ml의 농도의 N13B2, MD707-3 또는 MD707-6의 존재하에서 또는 항체의 부재(이러한 조건의 경우 발현은 100%로 표준화됨)하에서 위에서 기재한 바와 같이 그 발현을 측정함으로써 평가했다. CD40의 경우, 항체(항-CD40-FITC, Beckton Dickinson사, ref. 555588)는 CD80에 대하여 위에서 기재한 바와 유사한 조건에서 사용했다. 도 7에서 도시한 바와 같이, MD707-3 및 MD707-6 모두는 CD40 및 CD80 발현의 증가를 유발한 반면, MD707-3은 STAT5 활성화의 양호한 억제제 및 CD127의 양호한 결합제이고(도 2 및 도 4), MD707-6은 TARC의 TSLP-유도 생성의 강한 억제제이다(도 6). 그 증가는 CD80의 경우 적어도 20%, CD40의 경우 50% 였다. 이와 대조로, 본 발명의 항체인 N13B2는 CD40 또는 CD80의 TSLP-유도 발현을 증가시키지 않았다. 대신에, 상기 발현은 TSLP 단독의 존재하에서 보다는 TSLP 및 항체의 존재하에서 더욱 낮았다.
실시예 10. 항-인간 CD127 Mab들의 항체-의존적 세포독성(ADCC)
ADCC는 표적 세포 상에서 발현된 에피토프에 항체가 결합된 다음, Fc 수용체 발현 효과 면역 세포(본질적으로 NK 세포 및 활성화된 림프구)를 Fc-의존적으로 동원(recruitment)하여, 주로 그란자임/퍼포린(granzyme/perforin)계 기작에 의한 표적 세포의 사멸을 결과하는 것을 의미한다.
효과(Effector) 세포는 마그네틱 비드(NK 분리 키트, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일) 및 AutoMACS 세포 선별 기기를 이용하여 네거티브 선별을 통해 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리한 신선한 일차 인간 NK 세포이다. NK 세포를, 10% FBS (Life Technologies사), 100 lU/ml 페니실린(Life Technologies사), 0,1 mg/ml 스트렙토마이신(Life Technologies사), 2mM L-글루타민(Life Technologies사) 및 150 lU/ml의 인간 IL-2 (Roche사, Basel, 스위스)이 보충된 RPMI 1640 배지(Life Technologies사, Carlsbad, California)에서 37℃, 5% C02에서 밤새 배양했다. 표적 세포(인간 CD127-형질감염 BAF/3 세포주(Park 등, 2000))에 37℃에서 1 시간 동안 100 μCi(3.7 MBq)의 51 Cr (PerkinElmer사)를 표지하고, 배지로 5회 세척했다. 표적 세포를 실온에서 15분간 희석된 항체 또는 부형제(배지)와 함께 배양하고, 10,000개의 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트에 위치시켰다. 효과 T 세포를 37℃에서 4 시간의 배양 시간 동안 10:1 세포비(최종 체적: 200 ㎕)로 첨가했다. 다음에, 전제 25 μl의 상등액을 수확하고 감마 카운터(Packard Instrument사)에서 계수했다.
쥐 유래의 MD707-3 및 키메라 N13B2-G1 (IgG1 타입 Fc 도메인을 갖는) Mab 모두는 ADCC를 유도하지 않았다. 키메라 N13B2-G4 (IgG1 타입 Fc 도메인을 갖는)는 ADCC 활성을 전혀 나타내지 않았고, 음성 대조구로서 사용되었다. 흥미롭게도, 친화도, 결합 및 ADCC 사이에는 직접적인 상관관계가 없어서, ADCC 특성은 결합 분석으로부터 예측될 수 없었다는 것을 알 수 있다.
실시예 11. 항-인간 CD127 Mab들의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열
N13B2의 VH 및 VL 영역을 RACE PCR 기술을 이용하여 서열분석했다. 간략히 말해서, 전체 RNA를 추출하고, 역전사하고, 얻어지는 cDNA를, dATP 및 말단 전이효소를 이용하여 그 분자의 3' 말단에 폴리아데닐화했다. 1차 35-사이클 PCR 반응은 oligodT 앵커 프라이머 및 Herculease 효소 (Stratagene사)를 이용하여 수행했다. 2차 35-사이클 PCR은 네스티드(nested) PCR 앵커 프라이머를 이용하여 수행했다. 다음에, 얻어지는 PCR 생성물을 대장균에 TA-클로닝하고, 암피실린을 이용하여 선별한 후, 얻어지는 콜로니들을 제한 효소 프로파일링을 통해 선별하고, 삽입된 cDNA를 서열분석했다.
실시예 12. 인간화
쥐 N13B2 단일 클론 항체의 인간화는 표준 CDR-이식 기술을 이용하여 달성했다. 이러한 방법의 원리는 인간 내의 항체 면역원성을 감소시키는 것뿐만 아니라 CDR 이식 분자의 생물리학적 특성을 개선하는 목적으로 쥐 단일 클론 항체 유래의 상보성 결정 영역(CDRs)만을 함유하도록 인간 항체를 변형하는 것이다.
CDR 이식에 의한 인간화를 위하여, 모체 쥐 항체 유래의 항원 결합 잔기들은 인간화 변형 형태에 유지되어야 한다. CDRs에 인접한 잔기("Vernier" 잔기로 명명)는 CDR 구조(conformation)에 영향을 미치고 항원 인식을 미세하게 조정하는 것으로 확인되었다. Chothia 및 Lesk (1987)은, 그의 일부가 CDRs에 위치하여 있고 다른 것들은 프레임워크 영역에 위치하여 있는 "고전적인(canonical)" 잔기들에 따라 CDR 구조를 분리했다. 따라서, 이러한 "Vernier" 및 "고전적인" 잔기들의 동정은 중요한 단계이다. 사용된 프로토콜은 영국 캠브리지에 위치한 Medical Research Council의 Greg Winter 및 그의 동료들에 의해 개척된 접근법(Paus 및 Winter, 2006)에 기초하고, 카밧에 따라 정의된 CDR 잔기들을 이용한다.
그에 쥐 N13B2 CDR 영역에 이식되는 인간 프레임워크 수용체 영역의 선별은 면역글로불린 가변 영역 서열의 분석을 촉진하기 위하여 NCBI에서 개발된 도구인 IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast; Ye 등, 2013)을 이용하여 쥐 N13B2 VH 및 VL 서열을 입력하여 IMGT 쥐 및 인간 V 유전자 데이터베이스를 검색함으로써 달성되었다. 게다가, 여기서 적용된 전략은 단백질 및 cDNA-유래 서열에서 확인되는 체세포 초돌연변이(somatic hypermutation)를 함유하지 않는 천연 인간 서열인 인간 생식세포 서열을 이용한다. 쥐 VL 및 VH 서열과 아주 유사한 생식세포 유전자들이 일반적으로 선택되었다. 인간 생식세포 수용체 VH 및 VL 영역들은 하기의 기준에 따라 모체의 N13B2 VH 및 VL 항체 서열의 정렬을 통해 동정했다: 1. 카밧에 의해 정의된 바와 같이 프레임워크 및 CDR들에 걸친 서열 동일성; 2. 동일 및 유사한 사슬내 계면 잔기; 3. 모체의 CDR 고전 구조 및 Vernier 잔기를 갖는 지지 루프(support loop).
인간화의 몇몇의 상이한 서열들을 N13B2에 대하여 검사하여, 결합 및 생물학적 활성을 유지하는 최상의 것을 선택했다. N13B2의 인간화 변형 형태의 경우, N13B2 항체의 인간화 중쇄(VH)의 가변 서열을, ADCC의 증가를 위해 E333A가 돌연변이된 hlgG1의 CH1-CH2-CH3 도메인을 함유하는 pFuseCHIg-hG1 e4 발현 플라스미드(Invivogen, Toulouse)에 EcoRV를 이용하여 클로닝했다. N13B2 항체의 인간화 경쇄(VL)의 가변 서열은 인간 CLkappa를 함유하는 pFuse2CLIg-hk 발현 플라스미드에 BsiWI를 이용하여 클로닝했다.
COS 세포의 경우, 본 발명자들은 VH-hFcG1 함유 플라스미드 및 VL-CLk 함유 플라스미드를 리포펙타민(lipofectamine) 방법을 통해 동시 형질감염했다. 48 내지 72 시간 배양후, 상등액을 회수하고, 글리신 0.1 M pH 2.8 용리 완충액을 이용하여 Protein G 크로마토그래피(HiTrap, GeHealthcare) 상에서 친화성 정제했다. 정제된 항체를 PBS에서 투석하고 농축했다. 이를 샌드위치 ELISA를 통해 정량하고 CD127 항원에 대한 활성 분석을 통해 검사했다.
실시예 13. 여러 가지 생체 내 염증성 질환 모델에서 IL-7에 대한 항- IL7Rα 항체의 연구
인간화 NSG 마우스에서 대장염의 유도에 대한 길항 항체의 영향을 조사하기 위한 목적으로, 본 발명자들은 측정가능한 효과를 나타내는 것으로 확인된, TNBS 모델에서 일련의 실험을 수행했다. TNBS (2, 4, 6, 트리니트로벤젠 설폰산)와 같은 합텐(hapten)을 사용하면, 면역학적 모델 모방을 유도하는 것이 가능하다(Nancey 등, 2008). 4마리의 인간화 마우스에게 0일째에 에탄올에 용해된 TNBS (Sigma Chemical사, L'lsle d'Abeau Chesne, 프랑스)의 직장 내 투여를 통해 쥐에서 대장염을 유도한다. 우선, 그 마우스를 기체 혼합물의 흡입을 통해 마취한다. 7일째에, 몇몇의 연구를 위해 C02 중독에 의한 마취하에 동물들을 희생시켰다(데이터 미도시). 몇몇의 동물들은 그의 나쁜 임상 점수 때문에 7일 이전에 희생시켰다.
따라서, 2개의 새로운 마우스 그룹들을 PBS로 처리하거나, TNBS 처리 전날로부터 출발하여 2일 마다 0.7 mg/mL 농도의 210 μL의 N13B2 항-IL7Rα를 주사했다. 상기 모델의 발생에서 사용된 것들과 유사한 분석을 수행하였다.
다음에, 본 발명자들은 인간화 이식편대 숙주질환(GVHD) 마우스 모델에서 N13B2 항체 효능을 검사했다. 이러한 모델은 전체적인 염증 질환을 모방한다. 몇몇의 7 내지 12 주령 NOD/scid/IL-2Rγ-/- (NSG) 마우스(Charles River사, L'arbresle, 프랑스)를 방사선조사(3Gy)하고, Poirier 등(2012)에 의해 예전에 설명한 바와 같이 건강한 공여체 유래의 5천 만개의 인간 PBMC를 복막내 주입했다. 다음에, 그 동물들을 무균 상태에서 유지하고, 체중 변화를 일주일에 3회 모니터하고 임상 평가했다. 대조군은 세포 주입 후 무처리 상태로 유지했고, 처리군은 0일째로부터 일주일에 3회 5 mg/Kg의 키메라 N13B2 mAb를 복막내 주사했다. 20% 체중 감소시 마우스를 GVHD 진단했다. 25% 초과의 체중 감소를 갖는 것으로 확인된 동물 및 0일째부터 100일 후에도 살아있는 동물들은 안락사했다. 안락사 후, 결장, 창자, 간 및 폐조직을 조직학적 분석을 위해 액체 질소 및 Tissu-tek에 동결했다. 이러한 조직 유래의 동결 절편을 실온에서 1 시간 동안 공기 건조한 다음, 실온에서 1 시간 동안 아세톤에 고정한 다음, 헤마톡실린 및 에오신 용액으로 염색했다. 결과는 도 25 및 도 26에서 나타낸다.
실시예 14. 여러 가지 임상 파라미터의 분석
생존율 (도 9A): 본 발명자들은 항-IL7Ra 항체의 사용 및 화학적 처리에 따른 생존율을 평가했다. 생존율(%)은 Hu-TNBS + PBS 그룹보다는 Hu-TNBS + IL7Rα 그룹의 경우에 더욱 중요하다 (도 9A). 실제로, 본 발명자들은 Hu-TNBS 그룹 + IL7Rα의 마우스의 100%가 5일까지 생존한반면, Hu-TNBS + PBS 그룹의 경우에는 세마리의 동물이 J5 이전에 안락사 되어야 했다.
체중 (도 9B): 5% TNBS/에탄올 50%의 직장 내 주사의 0일로부터 TNBS 처리 그룹의 경우, 본 발명자들은 두 그룹의 경우 20% 이하의 체중 감소를 관찰했다. 그러나, Hu-TNBS + IL7Rα 그룹의 경우, 동물들은 J3으로부터 체중이 증가한 반면, Hu-TNBS + PBS 그룹의 경우, 체중이 계속 감소하였다(도 9B). 생물학적 데이터를 수집하기 위해 동물들이 희생되어야 하고 더욱 장기간의 프로토콜이 체중 재증가를 확인시킬 수 있었다는 것을 유념하는 것이 중요하다.
생존율 (도 25): 본 발명자들은 항-IL7Rα 항체 N13B2의 사용 및 인간 PBMC (GvHD 발생)의 주입에 따른 생존율을 평가했다. 동물의 생존율을 대조 동물(60일후 대조 동물의 100% 사망율)에서 보다는 동물이 항체로 처리된 경우에 30% 더 좋았다. 이러한 결과는 N13B2 항체가 GvHD 및 사망으로부터 보호한다는 것을 나타낸다.
조직 침윤물 (도 26): 처리하거나 처리하지 않은 죽은 동물 및 살아있는 동물(안락사되지 않은) 유래의 결장, 창자, 간 및 폐를 그의 염증성 세포 침윤 속도에 대하여 조직학적으로 분석했다(조직학적 점수를 측정했다). 본 발명자들은 N13B2를 처리한 동물의 결장이 대조군보다 더욱 적은 세포 침윤물을 함유한다는 것을 관찰했다. 두 조건들 사이에서 창자, 간 및 폐의 차이는 관찰되지 않았다.
N13B2를 처리한 동물은 대조군과 비교하여 30% 생존율을 나타냈다. 염증의 특징인 세포 침윤물은 창자, 간 및 폐 조직에서 처리에 의해 변화되지 않았으므로, 이러한 염증 모델에서는 N13B2는 이러한 조직에서 염증에 대하여 보호하지 않는다는 것을 알 수 있다. 그러나, N13B2는 결장에서 세포 침윤물의 50% 감소를 유발했다. 이러한 영향은 도 19 및 도 20에서 나타낸 바와 같이 α4β7 인테그린 발현에 대한 N13B2 항체의 발현과 관련이 있을 수 있었다. 실제로, α4β7 인테그린은 활성화된 림프구를 소화관으로 귀환시키는데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, N13B2 항체에 의한 그 인체그린 발현의 감소는 결장에서 관찰된 세포침윤물의 감소의 원인이 될 수 있다(도 26). 다른 조직에서 보호의 명백한 부재는 여기서 사용된 모델에 특이적일 수 있고, 그 항체의 보호 효과가 결장으로 제한된다는 결론으로 이어지지 않는다는 것이 강조되어야 한다. 특히, 처리된 동물의 아주 더 높은 생존율은 그 항체의 보호 효과가 동물의 전체 상태에 강한 긍정적인 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
실시예 15. 내재화되지 않은 CD127 항체의 생체 내 효율
동물
개코원숭이들(Papio anubis, CNRS Primatology Center, Rousset, 프랑스)은 투베르쿨린 피부 검사를 포함한 모든 격리(quarantine) 검사에 음성이었다. 동물들을 프랑스의 Institut National de la Sante Et de la Recherche Medicale의 제도 윤리 가이드라인의 추천에 따라 본 발명자들의 실험실의 큰 동물 시설에 수용하였다. 모든 실험은 Zoletil(Virbac사, Carron, 프랑스)을 이용한 전신 마취하에서 수행되었다. 10 mg/kg의 N13B2-lgG1 또는 N13B2-lgG4 또는 MD707-13-lgG4의 정맥 내 볼러스(bolus)를 주사 받는 5마리 개코원숭이에 대한 DTH 실험 동안 약력학적 및 약동학적 연구를 수행했다.
BCG 백신접종 및 DTH 분석
Poirier 등(Poirier 등, 2011)에 따라, 개코원숭이들을 DTH 피부 검사 전 4주 및 2주 전에, 다리의 상부 부위에 바실러스 Calmette-Guerin (BCG) 백신(0·1 ml; 2-8 ￥ 105 UFS; Sanofi Pasteur MSD사, Lyon, 프랑스)을 2회 피내 주사(i.d.)하여 면역시켰다. DTH 피부 검사 전 항원 특이적 T 세포 면역을 조사하기 위하여, 면역이 성공적이었는 지의 여부를, 새로이 분리한 PBMC에 대하여 인터페론 (IFN)-g 효소 결합 면역스팟(ELISPOT) 분석법(비인간 영장류 IFN-g ELISPOT 키트; R&D Systems사, Minneapolis, MN, 미국)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 확인했다. 그 동물의 우측 등 부위 피부에 두 용량(1000 UI 또는 2000 UI)의 투베르쿨린 정제 단백질 유도체(PPD; Symbiotics Corporation사, San Diego, CA, 미국) 0.1 ml를 이중으로 피내 주사하여 피내 반응(IDR)을 수행했다. 염수(0.1 ml)를 음성 대조군으로 사용했다. 주사 부위에서의 피부 반응을 켈리퍼 스퀘어(caliper square)를 이용하여 측정했다. 각각의 단단한 홍반의 직경을 3 내지 8일째로부터 2명의 관찰자에 의해 측정하고, 직경이 > 4 mm인 경우 양성인 것으로 판단했다. 측정치의 평균을 기록했다. DTH 또는 대조군(염수)으로부터의 피부 생검을 4일째에 이중으로 수행하고, 면역조직화학 분석을 위해 조직 Tek 최적 절단 온도 (OCT) 화합물(Sakura Finetek사, Villeneuve d'Ascq, 프랑스)에 위치시켰다. 3주의 유실(washout) 기간 후 2차 IDR 수행하고, 이러한 PPD를 이용한 2차 공격 접종 전 1일 전에 동물들에게 10mg/kg의 키메라 CD127 항체(N13B2-lgG1 또는 N13B2-lgG4 또는 MD707-13-lgG4)를 정맥내 주사했다. 추가의 3 내지 6주의 유실 기간 후 3차 IDR을 수행하고, 동물들은 무처리 상태로 유지했다. 몇몇의 경우, 또 다른 3개월의 유실 기간 후 4차 IDR을 수행하고, 동물들은 무처리 상태로 유지했다.
실시예 16. 동물 모델에서 시험관 내 및 생체 내에서 α4β7의 T 세포 표면 발현
T 세포 표면에서 IL7-유도 α4β7 발현을 측정하기 위하여, 인간 T-림프구를 5ng/ml의 IL7 (AbD Serotec사, ref PHP046)를 이용하여 37℃에서 9일간 자극했다. 반응을 4℃에서 중지하고, 세척한 다음, PerCP/Cy5-표지 항-α4 (BD Bioscience사, 563644 클론 9F10) 및 PE-표지 항-37 (BD Bioscience사, 클론 FIB504)로 염색했다. α4 인테그린 양성 세포 및 이후의 β7 양성 세포를 유세포분석을 통해 측정했다. 0일째에, N13B2 인간화 항체를 세포 배양액에 0.01 내지 20 ug/ml의 다양한 농도로 첨가했다.
생체 내에서, 40 x 106 인간 말초 혈액 단핵 세포를 방사선조사된 면역결핍 마우스(NOD/SCID/IL-2 수용체 감마-사슬 녹아웃 마우스)에 복막 내 주입했다. 대조 완충액(n=5) 또는 N13B2 mAb (5 mg/kg, n=5) 처리 후 2주째에, 혈액 내의 β7-양성 T 림프구의 비율을 유세포 분석을 통해 측정하고, β7-양성 T 림프구의 생착을 유세포 분석을 통해 측정했다. 이러한 생착은 특이적 항체(PECy7 항-인간 CD45 (BD reference 57748) 및 PerCPCy5.5 항-마우스 CD45 (BD reference 550994))를 이용하여 마우스 CD45 양성 세포로부터 인간 CD45 양성 세포를 구별함으로써 유세포 분석을 통해 측정했다. 다음에, 인간 β7 양성 세포를 분석했다(BD Bioscience, 클론 FIB504).
실시예 17. 펩티드 마이크로어레이를 이용한 항체 프로파일링
펩티드인 Technologies' PepStarTM 펩티드 마이크로어레이는, 유리 표면에 화학선택적이고 공유결합적으로 고정되는 항원 또는 다른 소스로부터 유래한 정제된 합성 펩티드를 포함한다. 입체 장애에 의해 유발된 가성 음성(false negatives)을 회피하기 위하여 유리 표면과 항원 유래 서열의 사이에 최적화된 친수성 링커 부분을 삽입한다. 기술적인 이유 때문에, 모든 펩티드는 C-말단 글리신을 함유한다. 52종의 펩티드들로 구성되는 펩티드 라이브러리에 대하여 시료들의 프로파일링 실험을 수행했다. 펩티드들의 전체 목록은 아래에 나타낸다.
서열번호 서열 서열번호 서열 서열번호 서열
58 ESGYAQNGDLEDAEL 76 FIETKKFLLIGKSNI 94 HDVAYRQEKDENKWT
59 AQNGDLEDAELDDYS 77 KKFLLIGKSNICVKV 95 YRQEKDENKWTHVNL
60 DLEDAELDDYSFSCY 78 LIGKSNICVKVGEKS 96 KDENKWTHVNLSSTK
61 AELDDYSFSCYSQLE 79 SNICVKVGEKSLTCK 97 KWTHVNLSSTKLTLL
62 DYSFSCYSQLEVNGS 80 VKVGEKSLTCKKIDL 98 VNLSSTKLTLLQRKL
63 SCYSQLEVNGSQHSL 81 EKSLTCKKIDLTTIV 99 STKLTLLQRKLQPAA
64 QLEVNGSQHSLTCAF 82 TCKKIDLTTIVKPEA 100 TLLQRKLQPAAMYEI
65 NGSQHSLTCAFEDPD 83 IDLTTIVKPEAPFDL 101 RKLQPAAMYEIKVRS
66 HSLTCAFEDPDVNTT 84 TIVKPEAPFDLSVIY 102 PAAMYEIKVRSIPDH
67 CAFEDPDVNTTNLEF 85 PEAPFDLSVIYREGA 103 YEIKVRSIPDHYFKG
68 DPDVNTTNLEFEICG 86 FDLSVIYREGANDFV 104 VRSIPDHYFKGFWSE
69 NTTNLEFEICGALVE 87 VIYREGANDFVVTFN 105 PDHYFKGFWSEWSPS
70 LEFEICGALVEVKCL 88 EGANDFVVTFNTSHL 106 FKGFWSEWSPSYYFR
71 ICGALVEVKCLNFRK 89 DFVVTFNTSHLQKKY 107 WSEWSPSYYFRTPEI
72 LVEVKCLNFRKLQEI 90 TFNTSHLQKKYVKVL 108 SPSYYFRTPEINNSS
73 KCLNFRKLQEIYFIE 91 SHLQKKYVKVLMHDV 109 YFRTPEINNSSGEMD
74 FRKLQEIYFIETKKF 92 KKYVKVLMHDVAYRQ
75 QEIYFIETKKFLLIG 93 KVLMHDVAYRQEKDE
[표 9] 펩티드 마이크로어레이에서 사용된 펩티드들의 목록
전체 9개의 시료를 Multiwell-포맷을 이용하여 마이크로어레이 슬라이드 상에서 반응(incubation)시켰다. N13B2 항체 및 다른 시료의 경우, 4개의 상이한 농도들이 적용되었다(10, 1, 0.1 및 0.01 g/ml). 병행하여, 하나의 음성 대조 반응(2차 항체 단독)을 수행했다. 인간 및 마우스 IgG 단백질들을 각 세트의 펩티드들 측에 동시 고정하여 분석 대조군으로 이용되도록 하였다. 모든 반응들은 두 개의 슬라이드를 이용하여 병행하였다. 각 슬라이드 상의 두 개의 펩티드-미니-어레이들은 펩티드에의 가양성(false-positive) 결합을 평가하기 위하여 형광 표지 검출 항체 단독을 적용함으로써 대조 반응으로 이용되었다. 슬라이드의 세척 및 건조 후, 635 nm에서 고해상도 레이저 스캐너를 이용하여 스캐닝하여 형광 세기의 이미지를 얻었다. 그 이미지들을 정량하여 각각의 펩티드에 대한 평균 화소값(mean pixel value)을 얻었다. 이차 항체 항-쥐 IgG (JIR 212-175-082)는 1 ㎍/ml의 Cy5로 표지했다. 완충액 및 용액: 사용된 완충액은 0.05% Tween20을 포함하는 TBS-완충액(JPT) 및 분석 완충액 T20 (Pierce사, SuperBlock TBS T20, #37536)이었다. 획득 및 분석은 펩티드 마이크로어레이(JPT Peptide Technologies GmbH사, 베를린, 독일; batch #2668, Multi-Well 반응 챔버, Axon Genepix Scanner 4200AL, 스팟-인식 소프트웨어 GenePix 및 Microsoft Excel, R)를 이용하여 수행했다.
실시예 18. 질량 분광분석에 의한 에피토프 지도작성
질량 분광분석을 이용하여 구조적인 에피토프를 동정했다. 그 에피토프의 서열분석은 MALDI 질량 분광분석기를 이용하여 수행했다. 이러한 기기는 800 내지 4000 Da 사이의 펩티드 서열 분석을 가능하게 한다. 관련 단백질의 절단(digestion)은 그 단백질이 더욱 작은 단편들(가능한 에피토프)로 절단되도록 한다. 이상적으로, 절단 효소는 가능하면 에피토프의 경계에 근접하도록 절단하여야 한다. 절단 효소를 선택하는 것은 재조합 단백질의 서열 내의 효소 컷오프 빈도에 따라 이루어져야 한다. 2차 절단은 1차 절단의 종료 시에 얻은 에피토프의 크기를 감소시키는 것으로 판단된다. 선택된 효소에 따라, 그 프로필은 유의하게 다르다. 그 서열에서 절단물의 최상 분포를 갖는 효소는 키모트립신이다. 적당한 컷오프 빈도를 갖고 관련 서열상에 잘 분포되는 제2 효소는 Glu C 이다.
에피토프는 입체적(conformational)이므로, 친화성 크로마토그래피 동안에 복합체를 절단하는 것이 바람직하다. 관련 서열의 동정은 항원-항체 복합체의 형성에 의한 효소적 절단에 대한 에피토프의 보호에 기반한다. 친화성 크로마토그래피 및 절단 후, 에피토프의 단편을 용리하고 질량 분광분석(MALDI-TOF-TOF Bruker)을 통해 서열분석한다. 관련 단백질의 3차원 구조가 이용가능하고, 얻어진 결과와 비교된다.
Uniprot P16871 [21-239] (서열번호 114)는 호모 사피엔스 인터루킨-7 수용체 아단위 알파의 위상적 도메인(Topological domain)에 해당한다:
ESGYAQNGDLEDAELDDYSFSCYSQLEVNGSQHSLTCAFEDPDVNTTNLEFEICGALVEVKCL
NFRKLQEIYFIETKKFLLIGKSNICVKVGEKSLTCKKIDLTTIVKPEAPFDLSVIYREGANDFWTFN
TSHLQKKYVKVLMHDVAYRQEKDENKWTHVNLSSTKLTLLQRKLQPAAMYEIKVRSIPDHYFK
GFWSEWSPSYYFRTPEINNSSGEMD.
인 실리코(In silico) CD127 절단 효소 선택(서열번호 114에 해당하는 서열내의 위의 밑줄친 아미노산들 참조): 키모트립신을 절단 효소로 선택했다. 그 절단 부위(굵은 선), 펩티드 수, 절단부의 빈도가 적당하다. Glu-C 효소를 제2 절단 효소로 선택했다. 800 내지 4000 Da의 중량을 가지고서 얻어진 펩티드들의 수가 적당하다. Glu-C 절단부의 빈도 및 절단 부위(얇은 선)의 위치가 적당하다. 사용된 과정은 통상적이고, 당업자에게 잘 알려져 있고, 다음 문헌[Suckau 등, 1990 및 Papac 등, 1994]에 기재되어 있다.
물질 및 시약: 질량 분광분석 MALDI-TOF/TOF II de Bruker; Hi-trap NHS 칼럼 (Ref: 17-0716-01 -GE healthcare사); 키모트립신(Ref:1 1418467001 -Roche사); Glu C (Ref: 1 1420399001 -Roche사); Zip/TIP C18 (Ref: ZTC18S096-Millipore사); 중탄산암모늄 (Ref: 09830 -Sigma사); 글리신 (Ref:G7126 -Sigma사); NaCl (Ref : 27800.360 -VWR사).
단계 1: 용액에서 유리 단백질 및 항체의 절단. 실온 또는 37℃에서 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간 및 밤새 키모트립신에 의한 유리 항원 및 항체의 용액 내 절단. 절단된 폴리펩티드의 분석을 절단된 펩티드의 질량 분광분석((MS)을 통해 수행했다. 이러한 실험은 효소적 절단의 적당한 조건(시간 및 온도)를 확립하는 것을 가능하게 한다. 그 목적은 항체의 구조에 가능하면 영향을 미치지 않으면서 항원을 충분히 절단함에 있다. 최적은 조건은 다음과 같은 것으로 결정되었다: 키모트립신 절단: 실온에서 1 시간; Glu-C 절단: 37℃에서 밤새. 항원 및 항체의 각각의 절단물(digest)을 질량 분광분석 MALDI-TOF/TOF을 통해 분석한다.
단계 2: 복합체인 전체 결합된(tied) Ac + 전체 항원의 전체 절단. 항-CD127 단일 클론 항체 N13B2-G1 (배치(batch) 210415)의 결합을 표준 과정에 따라 Hi-Trap NHS 칼럼 상에서 수행했다. 그 칼럼 상에서의 항원 면역포착(immunocapture)을 1 시간 동안 수행하여, 항원-항체 복합체의 형성을 가능하게 했다. 4개의 칼럼 Hi-Trap NHS 상의 N13B2-G1 항체 결합 효율은 다음과 같았다: 84%, 84%, 83% 및 83%. 일치하고 동일한 결합 수율이 얻어졌다.
복합체를 절단하는 것은 위에서 언급한 조절을 통해 결정한 기간 동안 및 온도에서 1/50의 비율 또는 50 mg의 항체에 대한 1 mg의 효소의 비율로 수행했다. 다음에, 칼럼을 세척 완충액(중탄산 암모늄 25 mM)으로 세척하여 비결합 항원 펩티드를 제거 및 회수했다. 또한, 완충 염수(PBS-2M NaCl)에서의 세척 단계를 수행하여 비특이적 펩티드를 제거한다. 세척 후, 용리 용매(50 mM 글리신 pH 2)를 이용하여 용리를 수행하여, 특이적으로 결합된 펩티드(에피토프에 해당하는 것으로 판단된)를 특이적으로 추출 및 회수한다.
MALDI 분석: 세척 및 용리 분획을 C18 매트릭스 상에서 소수성 크로마토그래피를 통해 농축한다. 다음에, 그 분획을 질량 분광분석 MALDI-TOF/TOF을 통해 분석한다. MS 분석은 펩티드의 질량을 정밀하게 측정할 수 있고, 실험적 질량을 유리 항원의 인 실리코 절단으로부터 얻은 펩티드의 이론적 질량과 비교하는 것은 그 펩티드의 동정을 가능하게 한다; 필요한 경우, MS/MS 분석을 수행하여 펩티드의 서열을 확인할 수 있다.
키모트립신 절단 후 용출액의 스펙트럼은 하기의 표 10에서 나타낸 항원 펩티드에 해당할 수 있는 하기의 질량을 갖는 펩티드의 존재를 나타낸다: 912.49; 1086.47; 1843.03; 2104.16; 1944.97; 1564.73; 1835.97; 2022.05; 2424,22 또는2858,42 Da.
질량 (Da) 서열 서열번호
912,49 FIETKKF 115
1843,03 RKLQEIYFIETKKF 118
2104,16 NFRKLQEIYFIETKKF 119
1944,97 DLSVIYREGANDFVVTF 120
1564,73 VVTFNTSHLQKKY 121
1835,97 EIKVRSIPDHYFKGF 122
2022,05 EIKVRSIPDHYFKGFW 123
2424,22 EIKVRSIPDHYFKGFWSEW 124
2858,42 EIKVRSIPDHYFKGFWSEWSPSY 125
1086,47 FKGFWSEW 126
[표 10] 키모트립신 절단 후에 얻은 펩티드(단백질 분해로부터 보호된 서열)
Glu-C 절단 후 용출액의 스펙트럼은 하기의 표 11에서 나타낸 항원 펩티드에 해당할 수 있는 하기의 질량을 갖는 본 발명의 단백질의 절단 펩티드의 존재를 나타낸다: 1200.43; 1309.68; 2108.97; 2191.04; 2699.43; 3170,68 또는 3264,70 Da.
질량 (Da) 서열 서열번호
2699,43 IYFIETKKFLLIGKSNICVKVGE 127
3264,70 KSLTCKKIDLTTIVKPEAPFDLSVIYRE 128
2191,04 LTTIVKPEAPFDLSVIYRE 129
1309,68 APFDLSVIYRE 130
3170,68 NKWTHVNLSSTKLTLLQRKLQPAAMYE 131
2108,97 IKVRSIPDHYFKGFWSE 132
[표 11] Glu-C 절단 후에 얻은 펩티드(단백질 분해로부터 보호된 서열)
상기 두 가지의 절단은 hN13B2과 CD127 항원 사이의 상호작용에 관여한 3개의 부위(하기 표 12 참조)를 확인하는 것을 가능하게 했다. 염 완충 세척액으로부터 얻은 펩티드는 관련 서열을 제한하기 위하여 배제했다.
A (서열번호: 115) FIETKKF
B (서열번호: 116) DLSVIY
C (서열번호: 117) FKGF
[표 12] N13B2에 의해 단백질분해로부터 보호된 인간 CD127 펩티드의 서열
항원 CD127에 대한 N13B2 항체의 에피토프 지도작성은 IL7/CD127 경로에 대한 항체 활성에 대하여 중요한 3개의 상이한 서열들을 나타냈다 (도 27). IL7/CD127 상호작용의 3D 결정학적 분석의 경우(McElroy 등, Structure 2009, PDB:3DI2), 그 서열들 중 두 개(서열번호 115 및 서열번호 117)가 구조적으로 밀접하고, IL7과 CD127의 결합에 관여한 영역에 위치하여 있다. 세 번째 확인된 서열(서열번호 116)은 수용체의 감마 사슬인 CD132와 상호작용하는 것으로 예측된 도메인인, 수용체의 D2 도메인의 2b 부위에 위치하여 있다(Walsh 등 2012). N13B2은, IL7-CD127 상호작용 및 CD127-CD132 이종이합체 형성을 억제하는 단백질의 2개 부분에 위치한 CD127 상의 입체적 에피토프를 인식한다. N13B2의 결합은 Walsh ST에 의해 예측된 바와 같이 "삼원 IL7Ra/IL7/g-사슬 복합체"의 형성을 불안정화하여 그 복합체의 내재화를 차단한다.
실시예 19. 결과
예전에 설명된 바와 같이 (Henriques 등, 2010), IL-7 단독은 IL-7 매개 신호전달을 위해 요구되는, T 림프구의 표면에서의 IL-7 수용체 알파 사슬 (CD127)의 급속한 내재화(30-40%)를 유도한다. 여기서, 본 발명자들은 N13B2 mAb가 CD127의 IL-7-유도 내재화를 방지하고, 그 자체에 의해서는 내재화를 유도하지 않는다는 것을 설명했다(도 16). 이와 대조로, 본 발명자들은 GSK 유래의 항-인간 CD127 1A11 클론(특허 출원 WO2011094259호)이 37℃에서 단독으로 또는 IL-7과 조합으로 적용시 T 림프구의 표면에서의 CD127의 발현을 획기적으로 감소시킨다는 것을 설명했다(도 16). 이러한 효과는 몇몇 상업적인 항-IL7R 항체(eBioRDR5 및 MB15-18C9, 데이터 미도시)를 이용한 상이한 염색을 통해 관찰되었다. 비인간 영장류에 키메라 N13B2 mAb(인간 IgG1 또는 IgG4 Fc-도메인을 이용하여 포맷됨)를 10 mg/Kg으로 정맥내 투여 후, 본 발명자들은 2주의 추적 조사 기간에 걸쳐서 T 림프구의 표면에서 CD127 발현의 감소를 확인했다 (도 17B). 이와 대조로, 10 mg/kg의 항-인간 CD127 MD707-13 클론 (인간 IgG4 Fc-도메인을 이용하여 포맷됨; WO2013/056984호)을 정맥 내로 병행 처리한 다른 비인간 영장류의 경우, 본 발명자들은 T 림프구의 표면에서 CD127의 유의한 감소(60%)를 관찰했다(도 17B). 또한, T 림프구상에의 항-인간 CD127 mAb의 결합 후 CD127의 이러한 내재화는 예전에 Pfizer 그룹에 의해 보고되었는데, 그들은 항-인간 CD127 mAb (클론 HAL-H3L4, 미국 특허 8,637,273호)는 인간 및 비인간 영장류 혈액 세포 상에서 시험관 내에서뿐만 아니라 비인간 영장류에의 정맥 내 투여 후 생체 내에서 CD127 내재화를 유의하게 유도한다는 것을 설명했다(Kern 등, 2013).
Kern 등(Kern 등, 2015)에 의한 최근의 간행물에서, CD127 빈도(occupancy)가 연구되었고, 경쟁 분석이 수행되었다. BD biosciences사로부터 얻은 항-CD127 HIL-7R-M21 클론은 CD127에의 결합을 위해 HAL/Ab1 항체(Pfizer 그룹으로부터 얻음)와 경쟁하는 것으로 확인되었다. 본 발명의 도 16에서 도시한 바와 같이, HAL 항체(클론 H3L4, 미국 특허 8637273호)가 CD127 발현 및 내재화의 측면에서 N13B2 및 1A11와 비교되었다. 그 결과들은 HAL 항체와 HIL-7R-M21 특허 사이의 경쟁을 나타내서, Kern 등, 2015의 데이터가 확인되었다. 그러나, N13B2은 HIL-7R-M21와 경쟁하지 않는다. 또한, Kern 등은 HAL/Ab1 그 자체는 주입 후 4 내지 8일째에 세포 표면에서 CD127 발현의 시험관 내 하향 조절을 유도한다는 것을 나타냈다. 이러한 결과는 MD707-13 단독을 이용한 본 발명의 도 17B에서 나타낸 결과와 유사하다. 도 17B는 항체의 주사 후 4 내지 10일째에 세포 표면에서 CD127 발현의 하향 조절을 도시한다. 이러한 생체 내 효과는 관찰된 CD127의 시험관 내 MD707-13-의존적 세포 내재화와 관련이 있을 수 있다.
펩티드 마이크로어레이 및 질량 분광분석을 이용한 에피토프 연구는 CD127 상에서 N13B2에 의해 인식된 구조적 에피토프를 나타냈다. 이러한 에피토프는 D1에서만 위치한 에피토프를 인식하는 종래의 항체와 대조적으로 도메인 D1 및 D2에 위치한다(실시예 17). 또한, 도 16은 종래의 항체는 CD127의 내재화를 유도하는 반면, N13B2는 그렇지 않다는 것을 도시한다. 따라서, 본 발명자들은 CD127 내재화를 유도하지 않는 N13B2의 특성이 도메인 D1 및 D2 모두에 위치하는 에피토프를 인식하는 그의 특성과 관련이 있는 것으로 판단한다.
요컨대, 이러한 결과 및 예전에 보고된 결과는 IL-7 수용체에의 IL-7의 결합을 차단하는 것으로 설명된 항-인간 CD127 mAb들 (1A11 클론, HAL/Ab1 및 H3L4 클론 및 MD707-13 클론)도 IL-7 수용체 신호전달에 필요한 IL-7 수용체 알파 사슬 내재화를 유도한다는 것을 나타냈다. 이와 대조적이고도 놀랍게도, N13B2 mAb는 CD127 내재화를 유도하지 않는 독특한 특성을 가지며, IL-7에 의한 이러한 내재화를 방지한다. 이러한 결과는 시험관 내에서 IL-7 수용체 신호전달(예를 들어, STAT5 인산화, 도 14B)을 방지하는데 효과적인 CD127-내재화 유도제인 mAb (예를 들어, MD707-13 클론)가 생체 내에서 메모리 세포성(도 21) 또는 체액성(도 22) 면역 반응을 방지할 수 없다는 관찰 결과와 관련이 있다. 이와 대조로, 본 발명자들은 IL-7 수용체 신호전달(STAT5 인산화)을 효과적으로 차단하지만 인간 T 림프구상에서 생체 외에서 및 비인간 영장류에서 생체 내에서 CD127 내재화를 유도하지 않는 N13B2 mAb가 지연형 과민성 메모리 세포 반응(도 21)뿐 아니라 이종이식 양 적혈구에 대한 면역화(도 22)를 방지한다는 것을 설명했다. 메모리 체액성 반응의 조절에 관한 N13B2의 동종형들 사이의 차이가 관찰되지 않았지만, 본 발명자들은 IgG4-포맷 N13B2가 IgG1과 비교하여 메모리 세포성 반응을 방지하는데 더욱 효과적이라는 것을 확인했다. MD707-13-처리된 동물과 N13B2-처리된 동물 사이의 mAb 노출 및 혈청 농도의 차이가 관찰되지 않았다. 마찬가지로, 본 발명자들은 N13B2 또는 MD707-13 mAb를 처리한 동물에서 조절 T 림프구의 유의한 증가도 관찰했다.
인간 IL-7은 인간 T 림프구 상에서 시험관 내에서 α4 및 β7의 강한 발현을 유도했고, 창자, 뇌 및 피부와 같은 비림프구성 조직으로의 T 림프구 귀환 및 잔류를 위해 요구되는(Gorfu 등, 2009, DeNucci 등, 2009), α4, β7 및 α4/β7 인테그린을 발현하는 인간 T 림프구의 빈도를 획기적으로 증가시켰다(도 19A). 따라서, 본 발명자들은 N13B2 mAb가 α4 및 β7의 발현을 시험관 내에서 투여량 의존적으로 억제하는 외에도, α4-양성 및 α4/β7-양성 인간 T 림프구의 빈도를 감소시킨다는 것을 관찰했다(도 19B). 마찬가지로, 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 면역결핍 마우스로의 전달 후, 본 발명자들은 N13B2 항체가 β7-양성 T-림프구의 빈도뿐 아니라 처리의 1주(데이터 미도시) 및 2주(도 20) 후의 이들 세포의 수(즉, 생착)를 유의하고 급격하게 감소시킨다는 것을 확인했다. 두 개의 상이한 염증 질환 모델에서 얻은 결과는 N13B2 항-IL7Ra 항체는 염증성 질환, 특히 대장염에 대한 효율적인 치료제일 수 있다는 것을 나타냈다.
실시예 20. 구조적 에피토프의 발생
CLIPS 펩티드는, CLIPS 펩티드를 원하는 항체를 유도하는 활성 및 유력한 면역원으로 번역하는 목적으로 항원의 천연 2차 및 3차 구조를 적절하게 모방하기 위해 사용될 수 있다(Boshuizen 등, 2014). CLIPS 기술은 2,3 또는 4개의 앵커 포인트를 갖는 작고 단단한 실체(화학적 지지체)와의 반응을 통해 선형 펩티드를 (다중) 고리화하는 것을 포함한다. 그 앵커들은 그 펩티드(즉, 티올)의 작용기들 중 하나의 형태와만 반응하고 다중 공유 결합을 통해 그 펩티드에 결합한다. 그 펩티드는 상기 지지체(scaffold)의 둘레에서 접혀지고, 잘 정의된 3차원적 구조를 서서히 채택하면서 유연성을 나타내는데, 그 중심부의 지지체는 "거미집 내의 거미"와 같다.
상기 기술은, 완전히 합성된 것이고 맞게 제작된 지지체를 이용한다. CLIPS 지지체는 주로 크기, 극성, 강도, 용해도, 기능성, 및 'SS-간격(spanning)' 거리가 다양하다. 이러한 지지체는 펩티드의 느슨한 말단들을 부착하기 위해 사용된다. 펩티드 서열 내에 적절히 위치하는 경우, 얻어지는 CLIPS 펩티드는 선형 서열과 비교하여 완전(intact) 단백질 상의 해당하는 영역의 3차원 구조에 아주 잘 일치할 수 있다. CLIPS-고리화는 천연 L-시스테인 잔기 뿐 아니라, 그 서열 내의 임의의 원하는 위치에 인공적으로 도입된 D- 및 L-(호모)시스테인에 대하여 수행될 수 있다. 따라서, CLIPS된 펩티드의 구조 및 치수는 원하는 대로 변화될 수 있다. 그 고리화 반응은 30분 이하의 시간 동안 계속되고, 실온에서 진행되고, 촉매작용을 전혀 필요로 하지 않는다. 또한, 이는 완전히 수성인 조건 및 중성 pH (7.5-8.0)하에서 적용될 수 있고, 따라서 박테리아 파지와 같이, 아주 민감한 생물학적 계와 양립할 수 있다. 끝으로, 그 반응은, 고리형 생성물의 높은 수율을 촉진하고 중합을 회피하는 높은 희석 조건(10 내지 100 μM)하에서 진행될 수 있다. 이러한 기술은 융통성이 높고, 그의 적용의 용이성 때문에 독특한 것이다.
항-수용체 항체를 위한 선형이고 불연속적인 에피토프들을 재구성하기 위한 시도에 있어서, 선형 multi-mer 중첩 펩티드들을 그 C-말단이 각각의 3 ul 웰(플레이트당 455개 웰)에 공유 결합 되도록 신용 카트 크기의 폴리프로필렌 플레이트상에 직접 합성하는데, 각각의 웰은 상이한 펩티드를 함유한다. 단일-도메인 펩티드들의 각각의 내부에는, 고리화된 디시스테인(dicystein) 브릿지를 형성하여 속박 루프가 플레이트에 결합된 펩티드에 삽입되도록 한다. Teeling 등(2006)은 관련 항체에 의해 인식되는 불연속 에피토프를 재구성하는 목적으로 관련 펩티드들을 이용하여 고리화된 펩티드들을 발생하는 방법을 설명하고 있다. 간략히 말해서, 우선, 펩티드를 따라 4 내지 13개 아미노산의 거리만큼 간격을 둔 시스테인들, 예를 들어, CXXXXC-플레이트, XXXCXXXXCXXXXXX-플레이트 또는 CXXXXC-플레이트 등을 이용하여 플레이트-결합 디시스테인 함유 펩티드들을 합성한다. 다음에, 그 펩티드들을 수용액에서 a,a-디브로모메틸렌으로 처리하여 고리화하여 상이한 수들의 아미노산들을 함유하는 시스테인들을 얻는다. 이러한 화학적 변형은 이황화물 브릿지보다 더욱 안정한 루프를 제공한다(Niederfellner 등 2011).
실시예 21. CD127 및 γc의 동시침전
γc 사슬에의 CD127의 결합에 대한 N13B2 및 종래 항체의 영향을 검사하기 위하여, IL-7에 의해 자극되고 MD707-13 항체 또는 N13B2 항체의 존재하에서 배양된 세포에서 동시침전 실험을 수행했다. 항체의 부재하에서, CD127 및 γc는 동시 면역침전하는 것으로 확인되었다. MD707-13와 함께 세포의 배양은 이러한 동시면역침전을 방지하지 않은 반면에, N13B2와의 배양은 이러한 동시면역침전의 부재를 유도했다. 따라서, 본 발명의 항체는 γc 사슬에의 CD127의 결합을 차단하는 반면에, 종래의 항체는 이러한 특징이 없다.
항-CD127의 존재하에서 복합체 CD127-CD132-IL7을 동시면역침전하기 위하여, 인간 PBL을 37℃에서 30분간 쥐 항-hCD127 항체(10 μg/ml의 쥐 N13B2 또는 MD707-13)과 함께 배양한 다음, 37℃에서 15분간 5ng/ml의 IL7 (AbD Serotec사, ref PHP046)를 이용하여 자극했다. 4℃에서 반응을 중지하고, 차가운 PBS로 2회 세척한 다음, 동시면역침전 키트(Pierce Direct IP 키트, ref 26148)로부터 용해 완충액을 첨가했다.
동시면역침전 키트(Pierce Direct IP 키트, ref 26148)를 이용하여 정제 칼럼 항-인간 CD127을 제조했다. 그 칼럼을 제조사에 의해 추천된 과정에 따라 75μg의 비경쟁적 쥐 항-인간 CD127 (Effimune사, MD707-9)와 결합시켰다. 그 용해물(lysate)을 비결합 칼럼 상에서 예비 정제하여 비특이적 결합을 제거했다. 다음에, 용해물을 항-CD127 칼럼 상에 첨가하고 회전 교반 하면서 4℃에서 2 시간 동안 정치했다. 그 칼럼을 세척 완충액으로 2회 세척한 다음, 용리 완충액을 이용하여 용리했다. 회수된 시료를 웨스턴 블롯 분석했다.
웨스턴 블롯을 위하여, SDS-PAGE 겔을 제조하고(용해를 위하여 10%, 겔 점착을 위하여 4%, 1.5mm 두께), 50μl의 변성된 용출액(변성: DTT 0.1 M 및 95℃에서 10분)을 각각의 웰에 첨가했다. CD127Fc(Sino Biologicals사, 베이징, 중국; reference 10975-H08H) 및 CD132Fc(Sino Biologicals사, 베이징, 중국; reference 10555-H02H) 재조합 단백질을 웨스턴 블롯 검출을 위한 대조군으로 첨가했다(5 μg/웰). 200V에서 1 시간 30분간 이동 및 20V에서 35분간 니트로셀룰로오스 막으로의 이동후, 5% 밀크에서 실온에서 2 시간 동안 포화를 수행했다.
검출을 시작하기 위하여, 토끼 항-인간 CD132 항체(anticorps-en-ligne사, 프랑스, reference ABI N741840)를 1/50으로 4℃에서 밤새 첨가한 다음, 실온에서 1 시간 동안 1/2000으로 퍼옥시다제-표지 염소 알-토끼(Jackson Immunoresearch사, reference 111-035-144)를 이용하여 확인했다. 탈혼성화(dehybridization) 후, 그 막을 4℃에서 밤새 1/200의 쥐 항-인간 CD127 항체(Effimune사, MD707-9)와 함께 정치한 하고, 실온에서 1 시간 동안 1/1000의 퍼옥시다제-표지 당나귀 항-쥐 항체(Jackson Immunoresearch사, reference 712-035-153)를 이용하여 확인했다. 각각의 확인을 위하여, ECL (Thermo Scientific사, reference 34080)를 이용하여 화학발광에 의해 퍼옥시다제를 검출하고, 그 결과를 Fuji 4000 카메라를 이용하여 판독했다.
도 28은 CD127/IL7/CD132 복합체의 동시면역침전의 결과를 도시한다. 본 발명자들은 세포가 N13B2 항체와 함께 배양되는때를 제외하고 임의의 조건에서 CD132 사슬(60 KDa)이 CD127와 동시침전하는 것을 관찰했다(28A). 그러나, 각각의 조건에서, CD127 (70KDa)은 도 28B에서 나타낸 바와 같이 MD707-9 항체와 잘 동시침전하므로, N13B2 및 MD707-13는 CD127의 인식을 위해 MD707-9와 경쟁하지 않는다는 것을 알 수 있다. N13B2 항체는 IL-7의 존재하에서 CD127/CD132의 복합체 형성을 억제한다. 이러한 결과는 CD127 상의 N13B2 항체의 에피토프 지도작성과 일치하여, N13B2가 IL7R 알파 사슬의 도메인 D2의 부위 2b 내의 아미노산 서열과 결합한다는 것을 알 수 있다(Walsh 등, Immunol rev. 2012).
요컨대, 이러한 결과는 N13B2 항체가 IL7/CD127 상호작용의 길항제일 뿐 아니라 IL-7의 존재하에서의 2b에서의 CD127/CD132 상호작용의 길항제라는 것을 나타냈다. 이는 IL7 및/또는 종래 기술의 항-CD127 항체의 경우에 관찰된 CD127의 내재화에 대한 본 발명의 항체의 억제 활성을 설명할 수 있었다.
하기의 번호를 매긴 구현예들은 본 발명의 바람직한 구현예들을 구성한다.
1. CD127에 특이적으로 결합하고 CD127의 내재화를 유도하지 않는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 항체 모방체(mimetic).
2. CD127의 IL7-유도 내재화를 억제하는, 특히 구현예 1에 따른, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 모방체.
3. 항체 또는 단편의 존재하에서 IL-7 처리 세포(treated cell)에서 CD127의 세포 표면 발현이 항체의 부재하에서 배양된 세포 내의 그의 발현 수준의 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%인, 구현예 1 또는 2에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 모방체.
4. CD127에 특이적으로 결합함으로써 사이토카인 수용체들의 γc 공통 사슬에의 CD127의 결합을 차단하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
5. CD127에 결합시 사이토카인 수용체들의 γc 공통 사슬에의 CD127의 결합을 차단하는, 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
6. CD127에 결합 된 γc의 양이, 항체의 부재 외 동일 조건하에서 측정된, 특히 상기 항체의 존재 또는 부재하에서 배양된 세포 표면에서 IL7 수용체를 발현하는 천연 세포 유래의 CD127 함유 분자 복합체를 포함하는 세포 용해물에 대하여 측정되는, 상기 양의 80% 미만, 바람직하게는 50% 미만, 더욱 바람직하게는 25% 또는 10% 미만인 것 하에서의 구현예 4 또는 5 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
7. IL-7에 의해 유도되는 IL-7R 신호전달의 길항제인, 상기 구현예들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체.
8. 구현예 53 또는 67 중 어느 하나에 따른 항원 또는 상기 항원의 에피토프에 특이적으로 결합하고/하거나 그에 대하여 생성된, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체.
9. TSLP에 의해 유도된 수지상 세포 성숙을 증가시키지 않는, 특히 상기 구현예들 중 어느 하나에 따르는, CD127에 특이적으로 결합하는, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체.
10. α4, β7 및/또는 α4/β7 인테그린의 발현을 억제하는, 상기 구현예들 중 어느 하나에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체.
11. 생체 내, 특히 면역 결핍 마우스에 주입된 인간 T 세포에서, α4, β7 및/또는 α4/β7 인테그린의 발현을 억제하는, 구현예 10에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체.
12. CD127에 특이적으로 결합하고,
- VHCDR1 서열번호 10;
- VHCDR2 서열번호 12;
- VHCDR3 서열번호 14 또는 서열번호 48; 또는
- VH 서열번호 22
의 아미노산 서열들 중 적어도 하나를 포함하는 VH 사슬, 및/또는
- VLCDR1 서열 번호 16 또는 서열 번호 50;
- VLCDR2 서열 번호 18 또는 서열 번호 52;
- VLCDR3 서열 번호 20; 또는
- VL 서열 번호 24
의 아미노산 서열들 중 적어도 하나를 포함하는 VL 사슬
을 포함하는, 특히 상기 구현예들 중 어느 하나에 따른, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체.
13. VHCDR1 서열번호 10, VHCDR2 서열번호 12, VHCDR3 서열번호 14 또는 서열번호 48, VLCDR1 서열번호 16 또는 서열번호 50, VLCDR2 서열번호 18 또는 서열번호 52 및 VLCDR3 서열 번호 20으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 CDR 서열을 포함하는, 구현예 12에 따른, 항체, 또는 이의 단편 또는 모방체.
14. 6개의 CDR 서열인 VHCDR1 서열번호 10, VHCDR2 서열번호 12, VHCDR3 서열번호 14 또는 서열번호 48, VLCDR1 서열번호 16 또는 서열번호 50, VLCDR2 서열번호 18 또는 서열번호 52, 및 VLCDR3 서열번호 20 모두를 포함하는, 구현예 13에 따른, 항체, 또는 이의 단편 또는 모방체.
15. 구현예 14에 따른 항체로서,
- 상기 VH 서열이 서열번호 2 또는 서열번호 6 또는 서열번호 54의 서열을 갖는 VH 서열로 이루어지거나 서열번호 22 또는 서열번호 36 또는 서열번호 38 또는 서열번호 40의 서열을 포함하고,
상기 VL 사슬이 서열번호 4 또는 서열번호 56의 서열을 갖는 VL 사슬로 이루어지거나 서열번호 24 또는 서열번호 42 또는 서열번호 44 또는 서열번호 46의 서열을 포함하는, 항체.
16. 키메라 항체 또는 인간화 항체 또는 탈면역화 항체인, 상기 구현예들 중 아느 하나에 따른 항체.
17. 인간화 및 탈면역화 항체인 구현예 13에 따른 항체로서, 상기 중쇄가 서열번호 52의 서열을 갖고 경쇄가 서열번호 54의 서열을 갖는, 항체.
18. 상기 구현예들 중 어느 하나에 따른, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체를 포함하는 키메라 분자인 거대분자로서, 상기 항체가 기능적으로 상이한 분자와 결합되고, 상기 키메라 분자가 융합 키메라 분자이거나, 또는 PEG 중합체 또는 표지된 항체와 같은 화학적 기 또는 분자의 공유 결합으로부터 얻어지는 접합체인, 거대분자.
19. 애피틴 또는 안티칼린인, 상기 구현예들 중 어느 하나에 따른 거대분자.
20. 5E-10 M 미만, 특히 1E-10 M 미만, 특히 5E-11 M 미만의 Kd로서 CD127에 결합하는, 상기 구현예들 중 어느 하나에 따른, 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체.
21. CD127-양성 세포에 대하여 세포독성 활성을 나타내는, 상기 구현예들 중 어느 하나에 따른 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체.
22. TSLP에 의해 유도된 수지상 세포 성숙을 증가시키지 않는 상기 구현예들 중 어느 하나에 따른 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체로서, 상기 TSLP에 의해 유도된 수지상 세포 성숙의 증가가, TSLP 단독으로 처리한 세포와 비교하여, TSLP 및 거대분자로 처리한 TSLP 수용체-양성 세포에서 세포 표면 마커 CD40 및/또는 CD80의 발현의 증가를 확인함으로써 평가되는, 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체.
23. 구현예 22에 따른 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체로서, 이때 CD80의 발현이 TSLP 단독으로 처리한 세포와 비교하여, TSLP 및 거대분자로 처리한 TSLP 수용체-양성 세포에서 25% 이하만큼, 바람직하게는 10% 이하만큼 증가되는, 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체.
24. 구현예 23에 따른 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체로서, 이때 CD80의 발현이 TSLP 단독으로 처리한 세포와 비교하여, TSLP 및 거대분자로 처리한 TSLP 수용체-양성 세포에서 증가되지 않거나 감소되는, 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체.
25. 구현예 22에 따른 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체로서, 이때 CD40의 발현이 TSLP 단독으로 처리한 세포와 비교하여, TSLP 및 거대분자로 처리한 TSLP 수용체-양성 세포에서 50% 이하만큼, 바람직하게는 25% 이하만큼 증가되는, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체.
26. 구현예 25에 따른 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체로서, 이때 CD40의 발현이 TSLP 단독으로 처리한 세포와 비교하여, TSLP 및 거대분자로 처리한 TSLP 수용체-양성 세포에서 증가되지 않거나 감소되는, 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체.
27. 상기 구현예들 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 거대분자를 암호화하는 핵산 분자.
28. 서열번호 2; 서열번호 4; 서열번호 6; 서열번호 8; 서열번호 10; 서열번호12; 서열번호 14; 서열번호:16; 서열번호 18; 서열번호 20; 서열번호 22; 서열번호 24; 서열번호 36; 서열번호 38; 서열번호 40; 서열번호 42; 서열번호 44; 서열번호 46; 서열번호 48; 서열번호 50; 서열번호 52; 서열번호 54 및 서열번호 56으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산을 암호화하는, 구현예 27에 따른 핵산 분자.
29. 서열번호 1; 서열번호 3; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 9; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 15; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 21; 서열번호 23; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 39; 서열번호 41; 서열번호 43; 서열번호 45; 서열번호 47; 서열번호 49; 서열번호 51; 서열번호 53 및 서열번호 55로 이루어진 군에서 선택되는, 구현예 28에 따른 핵산 분자..
30. 포유동물 세포에서 클로닝 및/또는 발현을 위해 적당한, 구현예 27 내지 29 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 특히 플라스미드.
31. 구현예 27 내지 30 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오티드를 이용하여 재조합된 세포 또는 세포주, 특히 포유동물 세포 또는 세포주.
32. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 따른, 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 모방체 및 약학적 부형제를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 약학적 조성물이 임의로 추가의 상이한 유효 성분을 포함하는, 약학적 조성물.
33. 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 따른, 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 모방체를 치료적 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물, 또는 인간 환자에게 투여시 수지상 세포 분화/성숙을 제어하기에 적당한 제형 내의 구현예 32의 약학적 조성물.
34. 구현예 32 또는 33의 약학적 조성물로서, 특히 자가면역 질환 또는 알레르기성 질환, 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia)과 같은 백혈병, 림프종, 암질환, 만성 바이러스 감염, 염증성 질환, 이식, 호흡기 질환 또는 자가면역에 관여하는 세포에 대한, 치료적 면역조절 효과를 갖는 추가의 화합물을 더 포함하는 약학적 조성물.
35. 치료적 유효 성분으로서 그를 필요로 하는 환자에게의 복합 또는 부가 치료법에서 사용하기 위한, 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 따른 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체, 또는 구현예 27 내지 30 중 어느 하나에 따른 핵산, 또는 구현예 31의 세포 또는 세포주.
36. 질환을 갖는 환자, 특히 인간 환자의 치료를 위해 사용하기 위한, 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 따른 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체, 또는 구현예 27 내지 30 중 어느 하나에 따른 핵산, 또는 구현예 31의 세포 또는 세포주, 또는 구현예 32 내지 34 중 어느 하나의 약학적 조성물.
37. 질환의 위험을 갖는 환자, 특히 인간 환자의 치료를 위해 사용하기 위한, 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 따른 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체, 또는 구현예 27 내지 30 중 어느 하나에 따른 핵산, 또는 구현예 31의 세포 또는 세포주, 또는 구현예 32 내지 34 중 어느 하나의 약학적 조성물.
38. 구현예 36 및/또는 구현예 37에 따라 사용하기 위한, 거대분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 약학적 조성물로서, 이때 질환이 자가면역 질환, 특히 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 자가면역 갑상선염 및 루프스인 거대분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 약학적 조성물, .
39. 구현예 36 및/또는 구현예 37에 따라 사용하기 위한, 거대분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 약학적 조성물로서, 이때 질환이 염증성 질환, 특히 IBD 및 뇌척수염인, 거대분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 약학적 조성물.
40. 구현예 36 및/또는 구현예 37에 따라 사용하기 위한, 거대분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 약학적 조성물로서, 이때 질환이 알레르기성 질환인, 거대분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 약학적 조성물.
41. 구현예 36 및/또는 구현예 37에 따라 사용하기 위한, 거대분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 약학적 조성물로서, 이때 질환이 암 질환인, 거대분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 약학적 조성물.
42. 구현예 36 및/또는 구현예 37에 따라 사용하기 위한, 거대분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 약학적 조성물로서, 이때 질환이 호흡기 질환인, 거대분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 약학적 조성물.
43. 구현예 36 및/또는 구현예 37에 따라 사용하기 위한, 거대분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 약학적 조성물로서, 이때 질환이 이식과 관련되는, 특히 이식의 결과인, 거대분자, 핵산, 세포, 세포주 또는 약학적 조성물.
44. 질환을 갖거나 질환의 위험이 있는 환자에서, 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 따른 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체, 또는 구현예 27 내지 30 중 어느 하나에 따른 핵산, 또는 구현예 31의 세포 또는 세포주, 또는 구현예 32 내지 34 중 어느 하나의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
45. 구현예 44에 따른 치료 방법으로서, 상기 질환이 자가면역 질환, 특히 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 자가면역 갑상선염 및 루프스인, 치료 방법.
46. 구현예 44에 따른 치료 방법으로서, 상기 질환이 염증성 질환, 특히 IBD 및 뇌척수염인, 치료 방법.
47. 구현예 44에 따른 치료 방법으로서, 상기 질환이 알레르기성 질환인, 치료 방법.
48. 구현예 44에 따른 치료 방법으로서, 상기 질환이 암 질환인, 치료 방법.
49. 구현예 44에 따른 치료 방법으로서, 상기 질환이 호흡기 질환인, 치료 방법.
50. 구현예 44에 따른 치료 방법으로서, 상기 질환이 이식과 관련이 있고, 특히 이식의 결과인, 치료 방법.
51. 이식을 필요로 하는 환자 및/또는 이식될 환자 및/또는 이식된 환자, 특히 인간 환자의 치료를 위해 사용하기 위한, 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 따른 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체, 또는 구현예 27 내지 30 중 어느 하나에 따른 핵산, 또는 구현예 31의 세포 또는 세포주, 또는 구현예 32 내지 34 중 어느 하나의 약학적 조성물.
52. 이식을 필요로 하는 환자 및/또는 이식될 환자 및/또는 이식된 환자에게, 구현예 1 내지 26 중 어느 하나에 따른 거대분자, 특히 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 모방체, 또는 구현예 27 내지 30 중 어느 하나에 따른 핵산, 또는 구현예 31의 세포 또는 세포주, 또는 구현예 32 내지 34 중 어느 하나의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
53. 에피토프가 CD127의 부위 2b 유래의 서열을 포함하거나 그 서열로 구성되고, 특히 CD127의 부위 2b 유래의 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7개의 연속적인 아미노산들을 포함하는, 항원.
54. 구현예 53에 따른 항원으로서, 상기 에피토프가 서열번호 114의 아미노산 109 내지 127로 구성되는 부위 유래, 특히 아미노산 110 내지 125, 112 내지 125, 112 내지 120으로 구성되는 부위 유래의 서열을 포함하거나 그 서열로 구성되고, 특히 상기 부위 유래의 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7개의 연속적인(consecutive) 아미노산들을 포함하는, 항원.
55. 구현예 53 또는 54 중 어느 하나에 따른 항원으로서, 상기 에피토프가 CD127의 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7개의 연속적인 아미노산들을 포함하고, 상기 연속적인 아미노산들이 P112 및/또는 L115를 포함하는, 항원.
56. 구현예 53 내지 55 중 어느 하나에 따른 항원으로서, 상기 에피토프가 서열번호 116을 포함하거나 그로 구성되고, 특히 서열번호 86을 포함하는, 항원.
57. 구현예 53 내지 56 중 어느 하나에 따른 항원으로서, 상기 에피토프가 CD127의 D1 도메인 유래, 특히 서열번호 114의 아미노산 1 내지 98 유래의 서열, 특히 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7개의 연속적인 아미노산들을 또한 포함하는, 항원.
58. 구현예 57에 따른 항원으로서, 상기 에피토프가 서열번호 115의 서열, 특히 서열번호 110의 서열을 포함하거나 그 서열로 구성되는 인간 CD127의 서열을 포함하는, 항원.
59. 구현예 53 내지 58 중 어느 하나에 따른 항원으로서, 상기 에피토프가 서열번호 114의 아미노산 180 내지 220 유래의 서열, 특히 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 연속적인 아미노산들을 포함하고, 특히 상기 서열번호 114의 아미노산 180 내지 220 유래의 서열이 서열번호 117의 서열, 특히 서열번호 111의 서열로 구성되거나 그 서열을 포함하는, 항원.
60. 구현예 53 내지 59 중 어느 하나에 따른 항원으로서, 상기 에피토프가:
서열번호 110의 서열 또는 서열번호 115의 서열;
서열번호 111의 서열 또는 서열번호 117의 서열; 및
서열번호 86의 서열 또는 서열번호 116의 서열
로 이루어진 인간 CD127의 서열로 구성되거나 그 서열을 포함하는, 항원.
61. 구현예 53 내지 60 중 어느 하나에 따른 항원으로서, 상기 에피토프가 서열번호 114의 아미노산 99 내지 108의 서열 유래의 3, 4 또는 5개 초과의 연속적인 아미노산들을 포함하지 않고, 및/또는 서열번호 114의 아미노산 128 내지 179의 서열 유래의 3, 4 또는 5개 초과의 연속적인 아미노산들을 포함하지 않고, 및/또는, 서열번호 114의 아미노산 220 내지 239의 서열 유래의 3, 4 또는 5개 초과의 연속적인 아미노산들을 포함하지 않고, 특히 서열번호 114의 상기 아미노산 서열들 중 어느 것 유래의 3, 4 또는 5개 초과의 연속적인 아미노산들을 포함하지 않는, 항원.
62. 구현예 53 내지 60 중 어느 하나에 따른 항원으로서, 서열번호 110을 포함하는 인간 CD127의 에피토프 서열이 1개 초과의 N-말단 아미노산만큼 또는 7개 초과의 C-말단 아미노산만큼, 인간 CD127의 서열 내의 상기 서열에 인접한 아미노산들을 포함하도록 연장되지 않는, 항원.
63. 구현예 61에 따른 항원으로서, 서열번호 110을 포함하는 인간 CD127의 에피토프 서열이 인간 CD127의 서열 내의 상기 서열에 인접한 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산들 중 임의의 것을 포함하도록 연장되지 않는, 항원.
64. 구현예 53 내지 63 중 어느 하나에 따른 항원으로서, 서열번호 111을 포함하는 인간 CD127의 에피토프 서열이 30개 초과의 N-말단 아미노산만큼 또는 30개 초과의 C-말단 아미노산만큼, 인간 CD127의 서열 내의 상기 서열에 인접한 아미노산들을 포함하도록 연장되지 않는, 항원.
65. 구현예 64에 따른 항원으로서, 서열번호 111을 포함하는 인간 CD127의 에피토프 서열이 인간 CD127의 서열 내의 상기 서열에 인접한 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산들 중 임의의 것을 포함하도록 연장되지 않는, 항원.
66. 구현예 53 내지 65 중 어느 하나에 따른 항원으로서, 상기 에피토프가 구조적 에피토프(conformational epitope)이고, 특히 상기 에피토프로 이루어진 CD127 유래의 펩티드가 천연 CD127 또는 이의 세포외 도메인, 특히 리간드가 없는 단량체 형태, γc에 결합된 형태 및/또는 IL7에 결합된 형태의 CD127 내의 해당하는 펩티드의 구조를 모방하는 구조를 갖는, 항원.
67. 구현예 66에 따른 항원으로서, 상기 에피토프가 구조적 에피토프이고, 상기 CD127 유래의 펩티드들이 이들을 원하는 구조로 유지하는 단단한 분자 백본, 특히 CLIPS 기술을 이용하여 얻은 항원에 결합되는, 항원.
68. 구현예 53 내지 67 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 에피토프.
69. 구현예 53 내지 67 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 항원을 암호화하는 핵산.
70. 구현예 53 내지 67 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 항원에 대하여 비인간 동물을 면역시키는 것을 포함하는 항체 제조 방법.
71. 항체, 항체의 단편 또는 항체 모방체, 특히 구현예 70에서와 같이 얻은 항체 또는 이의 단편 또는 모방체를 선별하는 방법으로서, 구현예 53 내지 67 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 항원에의 상기 항체의 결합 능력을 분석하는 단계를 포함하고, 특히 상기 방법은 몇몇의 연속적인 그러한 단계들을 포함하고, 각각의 단계는 CD127의 단일 연속 서열로 구성되는 별개의 펩티드에의 결합 능력을 분석하는 것인, 방법.
72. 거대분자, 특히 항체, 특히 구현예 70에서와 같이 얻어지는 항체, 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 모방체를 선별하는 방법으로서, CD127, 특히 구현예 53 내지 67 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 항원에의 상기 거대분자의 결합 능력을 검사하고, 선택적으로 구현예 20에 따른 거대분자를 선별하는 단계를 포함하거나 그 단계로 구성되는, 방법.
73. 구현예 71 또는 72 중 어느 하나에 따른 거대분자 선별 방법으로서, 상기 항원이 CD127의 몇몇의 인접하지 않은 펩티드들을 포함하고, 상기 방법이 몇몇의 단계를 포함하고, 상기 단계들의 각각은 상기 CD127의 펩티드들 중 하나에의 상기 거대분자의 결합 능력을 검사하는 것으로 구성되는 것인, 방법.
74. 거대분자, 특히 항체, 특히 구현예 70에서와 같이 얻은 항체, 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 모방체를 선별하는,특히 구현예 71 내지 73 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 거대분자의 존재에 의해 유도된 CD127-발현 세포내의 CD127의 내재화를 검사하는 단계를 포함하거나 그 단계로 구성되는, 방법.
75. 거대분자, 특히 항체, 특히 구현예 70에서와 같이 얻은 항체, 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 모방체를 선별하는, 특히 구현예 71 내지 74 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 거대분자에 의한 CD127-발현 세포 내의 CD127의 IL7-유도 내재화의 억제를 검사하는 단계, 및 선택적으로 구현예 3에 따른 거대분자를 선별하는 단계를 포함하거나 그 단계로 구성되는 방법.
76. 거대분자, 특히 항체, 특히 구현예 70에서와 같이 얻은 항체, 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 모방체를 선별하는, 특히 구현예 71 내지 75 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 거대 분자의 CD127에의 결합에 의해, CD127의 γc 사슬에의 결합을 차단하는 상기 거대분자의 능력을 분석하는 단계를 포함하거나 그 단계로 구성되는 방법.
77. 거대분자, 특히 항체, 특히 구현예 70에서와 같이 얻은 항체, 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편 또는 모방체를 선별하는,특히 구현예 71 내지 76 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 거대분자의 존재하에서, TSLP에 의해 유도된 DCs의 성숙의 증가를 검사하는 단계, 및 선택적으로 구현예 22 내지 26 중 어느 하나에 따른 거대분자를 선별하는 단계를 포함하거나 그 단계로 구성되는 방법.
78. 구현예 71 내지 77 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 하기의 단계들 중 하나 이상을 추가로 포함하는 방법:
a. IL-7-유도 신호전달, 특히 STAT5 인산화의 상기 거대분자에 의한 억제를 검사하는 단계;
b. TARC의 TSLP-유도 생성의 상기 거대분자에 의한 억제를 검사하는 단계;
c. α4, β7 및/또는 α4/β7 인테그린, 특히 T-림프구 상에서의 세포 표면 발현의 상기 거대분자에 의한 억제를 검사하는 단계.
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Ile Pro Asp His Tyr Phe Lys Gly Phe Trp Ser 1 5 10 15 Glu

Claims (50)

  1. 인간 CD127에 특이적으로 결합하는 분리된(isolated) 항체 또는 항체의 항원-결합 단편으로, 상기 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이, (i) HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 (ii) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하며,
    a) - HCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    - HCDR2는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    - HCDR3은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    - LCDR1은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    - LCDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    - LCDR3은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나; 또는
    b) - HCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    - HCDR2는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    - HCDR3은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    - LCDR1은 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    - LCDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    - LCDR3은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나; 또는
    c) - HCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - HCDR2는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - HCDR3은 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - LCDR1은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - LCDR2는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - LCDR3은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나; 또는
    d) - HCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - HCDR2는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - HCDR3은 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - LCDR1은 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - LCDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - LCDR3은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는,
    분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    키메라 항체 또는 인간화 항체 또는 탈면역화 항체인, 분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    - HCDR1은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - HCDR2는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - HCDR3은 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - LCDR1은 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - LCDR2는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며,
    - LCDR3은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이 IL-7에 의해 유도된 IL-7R 신호전달의 길항제인, 분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  5. 제1항에 있어서,
    흉선 간질 림포포이에틴(Thymic Stromal Lymphopoietin: TSLP)에 의해 유도된 수지상 세포의 성숙을 증가시키지 않는, 분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  6. 제1항에 있어서,
    항체 또는 항체의 항원-결합 단편과 함께 배양된 세포에서, 상기 항체 또는 항체의 항원-결합 단편 없이 배양된 세포에서와 비교하여, CD127의 내재화를 유도하지 않는, 분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체의 항원-결합 단편 없이 인터루킨 7 (IL-7) 과 함께 배양된 세포와 비교하여, IL-7 및 상기 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 존재하에서 CD127의 세포 표면 발현이 유의적으로 감소되지 않거나 CD127의 내재화를 억제하는, 분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  8. 제1항에 있어서,
    (i) 서열번호 22의 서열을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 24의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하거나; 또는
    (i) 서열번호 36의 서열을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 42의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하거나; 또는
    (i) 서열번호 38의 서열을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 44의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하거나; 또는
    (i) 서열번호 40의 서열을 포함하는 중쇄; 및 (ii) 서열번호 46의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는,
    분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  9. 제1항에 있어서,
    (i) 서열번호 2, 또는 서열번호 6의 서열을 갖는 중쇄 (heavy chain); 및 (ii) 서열번호 4의 서열을 갖는 경쇄(light chain)를 포함하거나; 또는
    (i) 서열번호 54의 서열을 갖는 중쇄 및 (ii) 서열번호 56의 서열을 갖는 경쇄를 포함하는, 분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  10. 제1항에 따르는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 VH 사슬 및 VL 사슬을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, 분리된 재조합 핵산 분자.
  11. 제1항에 따르는 분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는, 이식을 필요로 하거나 이식될 또는 이식된 인간 환자의 치료를 위한, 또는 자가면역 질환, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 암 질환, 호흡기 질환, 또는 이식편대 숙주질환에서 선택되는 질환을 갖거나 그 질환의 위험이 있는 환자의 치료를 위한 약학적 조성물로, 질환이 인터루킨-(IL-7) 신호전달 경로와 관련된 질환인, 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    자가면역 질환이 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 자가면역 갑상선염 또는 루프스로 구성된 군에서 선택되는, 약학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    염증성 질환이 염증성 장 질환(IBD) 및 뇌척수염로 구성된 군에서 선택되는, 약학적 조성물.
  14. 제11항에 있어서,
    약학적 부형제를 더 포함하는 약학적 조성물.
  15. 제11항에 있어서,
    다른 활성 성분을 더 포함하는 약학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    다른 활성 성분이, T 세포를 표적 하는 단일 클론 항체, 항-CD3 항체, 항-ICOS 항체, 항-CD28 항체, 항-CD40 항체, 또는 재조합 단백질 CTLA4Ig에서 선택되는 치료적 면역조절 효과를 갖는 화합물인 약학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    치료적 면역조절 효과를 갖는 화합물이 자가면역 질환, 알레르기성 질환, 백혈병, 림프종, 암질환, 만성 바이러스 감염, 염증성 질환, 이식, 또는 호흡기 질환에 관여하는 세포에 대하여 작용하는, 약학적 조성물.
  18. 이식을 필요로 하거나 이식될 또는 이식된 인간 환자의 치료를 위한, 또는 자가면역 질환, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 암 질환, 호흡기 질환, 또는 이식편대 숙주질환에서 선택되는 질환을 갖거나 그 질환의 위험이 있는 환자의 치료를 위한, 제10항에 따른 분리된 재조합 핵산 분자를 포함하는 약학적 조성물로, 질환이 인터루킨-(IL-7) 신호전달 경로와 관련된 질환인, 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    자가면역 질환이 류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 자가면역 갑상선염 또는 루프스로 구성된 군에서 선택되는, 약학적 조성물.
  20. 제18항에 있어서,
    염증성 질환이 염증성 장 질환(IBD) 및 뇌척수염로 구성된 군에서 선택되는, 약학적 조성물.
  21. 제1항에 있어서,
    이식을 필요로 하거나 이식될 또는 이식된 인간 환자의 치료를 위한, 또는 자가면역 질환, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 암 질환, 호흡기 질환, 또는 이식편대 숙주질환에서 선택되는 질환을 갖거나 그 질환의 위험이 있는 환자의 치료를 위한 의약에 사용되고, 질환이 인터루킨-(IL-7) 신호전달 경로와 관련된 질환인, 분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  22. 제1항에 있어서,
    의약에의 사용을 위한, 분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  23. 제1항에 있어서,
    류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 자가면역 갑상선염 또는 루프스로 구성된 군에서 선택되는 자가면역 질환을 가지는 인간 환자의 치료용 의약에의 사용을 위한, 분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  24. 제1항에 있어서,
    염증성 장 질환(IBD) 및 뇌척수염로 구성된 군에서 선택되는 염증성 질환을 가지는 인간 환자의 치료용 의약에의 사용을 위한, 분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  25. 제10항에 있어서,
    이식을 필요로 하거나 이식될 또는 이식된 인간 환자의 치료를 위한, 또는 자가면역 질환, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 암 질환, 호흡기 질환, 또는 이식편대 숙주질환에서 선택되는 질환을 갖거나 그 질환의 위험이 있는 환자의 치료를 위한 의약에 사용되고, 상기 질환이 인터루킨-(IL-7) 신호전달 경로와 관련된 질환인, 분리된 재조합 핵산 분자.
  26. 제10항에 있어서,
    의약에의 사용을 위한, 분리된 재조합 핵산 분자.
  27. 제10항에 있어서,
    류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 자가면역 갑상선염 또는 루프스로 구성된 군에서 선택되는 자가면역 질환을 가지는 인간 환자의 치료용 의약에의 사용을 위한, 분리된 재조합 핵산 분자.
  28. 제10항에 있어서,
    염증성 장 질환(IBD) 및 뇌척수염로 구성된 군에서 선택되는 염증성 질환을 가지는 인간 환자의 치료용 의약에의 사용을 위한, 분리된 재조합 핵산 분자.
  29. 이식을 필요로 하거나 이식될 또는 이식된 인간 환자의 치료를 위한, 또는 자가면역 질환, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 암 질환, 호흡기 질환, 또는 이식편대 숙주질환에서 선택되는 질환을 갖거나 그 질환의 위험이 있는 환자의 치료를 위한 의약을 제조하는데 사용하기 위한, 제1항에 따른 분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물로, 질환이 인터루킨-(IL-7) 신호전달 경로와 관련된 질환인 약학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서,
    류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 자가면역 갑상선염 또는 루프스로 구성된 군에서 선택되는 자가면역 질환을 가지는 인간 환자의 치료용 의약을 제조하는데 사용하기 위한, 약학적 조성물.
  31. 제29항에 있어서,
    염증성 장 질환(IBD) 및 뇌척수염로 구성된 군에서 선택되는 염증성 질환을 가지는 인간 환자의 치료용 의약을 제조하는데 사용하기 위한, 약학적 조성물.
  32. 이식을 필요로 하거나 이식될 또는 이식된 인간 환자의 치료를 위한, 또는 자가면역 질환, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 암 질환, 호흡기 질환, 또는 이식편대 숙주질환에서 선택되는 질환을 갖거나 그 질환의 위험이 있는 환자의 치료를 위한 의약을 제조하는데 사용하기 위한, 제10항에 따른 분리된 재조합 핵산 분자을 포함하는 약학적 조성물로, 질환이 인터루킨-(IL-7) 신호전달 경로와 관련된 질환인 약학적 조성물.
  33. 제32항에 있어서,
    류머티스성 관절염, 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 자가면역 갑상선염 또는 루프스로 구성된 군에서 선택되는 자가면역 질환을 가지는 인간 환자의 치료용 의약을 제조하는데 사용하기 위한, 약학적 조성물.
  34. 제32항에 있어서,
    염증성 장 질환(IBD) 및 뇌척수염로 구성된 군에서 선택되는 염증성 질환을 가지는 인간 환자의 치료용 의약을 제조하는데 사용하기 위한, 약학적 조성물.
  35. 제1항에 따른 분리된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 치료적 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물로, 이를 필요로 하는 환자에게의 복합 또는 부가 치료법에서 사용되고, 자가면역 질환, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 암 질환, 호흡기 질환, 또는 이식편대 숙주질환에서 선택되는, 인터루킨-(IL-7) 신호전달 경로와 관련된 질환의 치료용인 의약을 제조하는데 사용하기 위한, 약학적 조성물.
  36. 제10항에 따른 분리된 재조합 핵산 분자를 치료적 유효 성분으로 포함하는 약학적 조성물로, 이를 필요로 하는 환자에게의 복합 또는 부가 치료법에서 사용되고, 자가면역 질환, 염증성 질환, 알레르기성 질환, 암 질환, 호흡기 질환, 또는 이식편대 숙주질환에서 선택되는, 인터루킨-(IL-7) 신호전달 경로와 관련된 질환의 치료용인 의약을 제조하는데 사용하기 위한, 약학적 조성물.
  37. 제1항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 키메라 분자인 거대분자(macromolecule)로서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편이 기능적으로 상이한 분자와 결합되고, 상기 키메라 분자는 융합 키메라 단백질이거나, 화학 기 또는 분자(chemical group or molecule)의 공유 결합으로부터 얻어지는 접합체(conjugate)인, 거대분자.
  38. 제37항에 있어서,
    화학 기 또는 분자가 PEG 중합체이거나 또는 표지된 항체인, 거대 분자.
  39. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  40. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산 분자들의 조합.
  41. 제37항에 따른 거대 분자를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  42. 제37항에 따른 거대 분자를 암호화하는 분리된 핵산 분자들의 조합.
  43. 인간 CD127의 에피토프 서열로 구성된 항원에 대해 비인간 동물을 면역시키는 것을 포함하는 제1항에 따른 항체의 제조 방법으로서,
    상기 에피토프 서열은 ,
    (a) 서열번호 116 또는 서열번호 86,
    (b) 서열번호 110 또는 서열번호 115,
    (c) 서열번호 111 또는 서열번호 117, 또는
    (d) 이들의 조합
    으로부터 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어지고,
    (i) 서열번호 110을 포함하는 인간 CD127의 에피토프 서열은 인간 CD127의 성 내의 상기 서열에서 인접한 아미노산 서열을 1개 초과의 N-말단 아미노산 또는 7개 초과의 C-말단 아미노산 만큼 포함하도록 연장되지 않거나; 또는
    (ii) 서열번호 111을 포함하는 인간 CD127의 에피토프 서열은 인간 CD127의 서열내 상기 서열에 인접한 아미노산을 30개 초과의 N-말단 아미노산 또는 30개 초과의 C-말단 아미노산만큼 포함하도록 연장되지 않거나, 또는
    (iii)서열번호 110을 포함하는 인간 CD127의 에피토프 서열이 인간 CD127의 성 내의 상기 서열에서 인접한 아미노산 서열을 1개 초과의 N-말단 아미노산 또는 7개 초과의 C-말단 아미노산 만큼 포함하도록 연장되지 않고 서열번호 111을 포함하는 인간 CD127의 에피토프 서열이 인간 CD127의 서열내 상기 서열에 인접한 아미노산을 30개 초과의 N-말단 아미노산 또는 30개 초과의 C-말단 아미노산만큼 포함하도록 연장되지 않는, 방법.
  44. 제1항에 따른 항체의 제조 방법으로,
    - 서열번호 1; 서열번호 3; 서열번호 5; 서열번호 7; 서열번호 9; 서열번호 11; 서열번호 13; 서열번호 15; 서열번호 17; 서열번호 19; 서열번호 21; 서열번호 23; 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 39; 서열번호 41; 서열번호 43; 서열번호 45; 서열번호 47; 서열번호 49; 서열번호 51; 서열번호 53 및 서열번호 55로 구성된 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 단계;
    - IL-7에 의해 유도된 IL-7R 신호전달의 길항제인 항체를 회수하는 단계,를 포함하는, 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    폴리뉴클레오티드가 낮은 푸코실화 특성을 나타내는 세포에서 발현되는, 방법.
  46. 제45항에 있어서,
    세포가 EB66 조류 세포(EB66 avian cell)인, 방법.
  47. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제43항 또는 제44항에 따른 방법에서 획득된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 상기 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하거나 상기 제43항 또는 제44항에 따른 방법에 의해 획득된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 포함하는 거대분자로 구성된 군에서 선택되는 화합물을 선별하는 방법으로서,
    상기 방법이 하기의 단계들:
    a. CD127에의 화합물의 결합 능력(binding capacity)을 검사하는 단계;
    b. 상기 화합물의 존재에 의해 유도된 CD127-발현 세포 내의 CD127의 내재화를 검사하는 단계;
    c. 상기 화합물에 의한 CD127-발현 세포 내의 CD127의 IL7-유도 내재화의 억제를 검사하는 단계; 및
    d. 상기 화합물의 존재하에서, TSLP에 의해 유도된 DCs의 성숙의 증가를 검사하는 단계,
    중 적어도 하나를 포함하거나 이로 구성되는, 화합물을 선별하는 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    하기의 단계들:
    e. 상기 화합물에 의한 IL-7 유도 신호전달(signalling)의 억제를 검사하는 단계;
    f. 상기 화합물에 의한 TARC의 TSLP-유도 생성의 억제를 검사하는 단계;
    g. 상기 화합물에 의한, α4, β7의 발현, α4/β7 인테그린 발현, 및 이들의 조합에서 선택되는 어느 하나의 억제를 검사하는 단계; 중 하나 이상을 더 포함하는, 화합물을 선별하는 방법.
  49. 삭제
  50. 삭제
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