UA125366C2 - Антитіло, яке специфічно зв’язується з людським cd127 - Google Patents

Abstract

Винахід стосується антитіла, або його антигензв’язувального фрагмента, що специфічно зв’язується з людським CD127, також винахід стосується молекули нуклеїнової кислоти, фармацевтичної композиції, застосування антитіла, молекули нуклеїнової кислоти та фармацевтичної композиції для виробництва лікарського засобу, та способу лікування пацієнта.

Description

Даний винахід відноситься до галузі антитіл, спрямованих на альфа-субодиницю рецептора для інтерлейкіну 7 (1-7), яка позначається СО127, або роб 1І-7К, або ІІ -7Кальфа, або 1І/-7кКа, інколи також називану ІЇ-7Ка, особливо на альфа-ланцюг рецептора для людського 1-7, який експресується на людських клітинах. Ці антитіла характеризуються антагоністичними властивостями по відношенню до взаємодії І -7-І/-7К, можуть проявляти цитотоксичну активність по відношенню до СО127-позитивних клітин, але не підвищують дозрівання дендритних клітин (ОС), індуковане Т5І Р, цитокіном, який також використовує СЮО127 у складі свого рецептора. В якості альтернативи або доповнення, ці антитіла не індукують інтерналізацію СО127 та/або інгібують індуковану 1-7 інтерналізацію СО127. Згідно з другим аспектом даного винаходу передбачаються антитіла, які розпізнають епітоп людського СО127, який містить послідовності з сайту 265 у СО127, зокрема, епітоп містить послідовності людського

СО127 з домену 01 та з сайту 265 у СО127, зокрема, епітоп містить щонайменше одну послідовність з О1, яка містить 5ЕО ІЮО Мо: 115 (зокрема, яка містить ЗЕО ІЮО Мо: 110), та послідовність з сайту 20, яка містить послідовність 5ЕО ІЮ Мо: 116 та необов'язково також містить 5ЕО ІЮ Мо: 117 (зокрема, містить хЕО ІЮО Мо: 111).

Відповідно, антитіла згідно з даним винаходом є придатними для застосування з метою вилікування стану, діагностованого у пацієнта-людини, який є результатом патогенезу, пов'язаного з лімфопоезом, коли шляхи передачі сигналу за участі І/-7 роблять внесок у зазначений патогенез, особливо, коли небажаним є підвищення дозрівання дендритних клітин, точніше, підвищення експресії костимулюючих молекул у них.

Біохімія

СО0127 є спільним для рецептора 1-7 (11/-7К) та для рецептора Т5ІР (ТБІРК). ІС-7А складений гетеродимером із СО127 та спільного гама-ланцюга (ус) інтерлейкінових рецепторів.

Спільний гама-ланцюг ус інколи називається у даному документі та в літературі СО132. І -78 зв'язується з інтерлейкіном 7. Рецептор Т5І Р являє собою гетеродимер із СЮО127 та фактора 2, подібного до цитокінового рецептора (СКІ Е2). Рецептор Т5І Р зв'язується з Т5І Р. В літературі

Т58І РК інколи використовується для позначення як СКІ Е2-ланцюга рецептора, так і комплексу

СОр127/САГ Е2. З метою уникнення плутанини надалі Т5І РЕК звичайно позначає комплекс.

С0127 (номер доступу в базі даних бЗм/із5 Ргої Р16871) може існувати в чотирьох ізоформах.

Зо Канонічна ізоформа, що також називається Н2г0 (Зулб5 Ргої Р16871.1), являє собою трансмембранний білок, що один раз проходить крізь мембрану, має 459 амінокислот та складається у напрямку від М-кінця до С-кінця з 20-амінокислотного сигнального пептиду, 219- амінокислотного позаклітинного домену, 25-амінокислотного трансмембранного домену та 195- амінокислотного внутрішньоклітинного домену. В інших ізоформ однаковою є послідовність усього (або більшої частини) позаклітинного домену Н2О та проявляються змінні С-кінцеві послідовності. ІЗоОформи 2 та 4 секретуються (Зм/із5 Ргої Р1І6871-4 та Р16871-3), у той час як ізоформа З (Зм/55 Ргої Р16871-2) також являє собою трансмембранний білок. Послідовність

СО0127 без сигнального пептиду наведено у даному документі у вигляді зХЕО ІЮ Мо: 57. Що стосується пронумерованих амінокислот у СО127 в даній заявці, зазначена послідовність буде слугувати в якості еталона для нумерації. Повідомлялося, що СО127 має послідовність зЕО 10

Мо:113, та його позаклітинний домен, коли сигнальний пептид видалений, має послідовність

ЗЕО ІЮО Мо:114. Якщо не зазначено інше, нумерація, що використовується у даному документі для амінокислот в СО127 являє собою нумерацію з ЗЕО ІЮО Мо:114.

СО0127 являє собою рецептор класу І цитокінових рецепторів (СКН І). Як широко відомо у рівні техніки, позаклітинний домен цих рецепторів складається з двох доменів фібронектину типу 3, які називають 01 та 02. Точна кристалографічна структура СО127 була опублікована та обговорювалась, наприклад, в МеЕїгоу еї аїЇ., 2009; МеЕїгоу еї аї., 2012, та У/аі5и, 2012, та, зокрема, була розкрита у вигляді даних про структуру білка в базі даних Кезеагсп СоПарогаїогу тог Бігисьтшга! Віоіпіоптаїййс5 Ргоївїп Сага Вапк (ЕС5В РОВ) під номером доступу ЗОРІ. В цілому, р1 вважається залученим у зв'язування з 1-7, у той час як 02 залучений у зв'язування з ус- ланцюгом (а також з 1-7). Важливо, що сайт 265 у домені 02, який складається, по суті, з амінокислот 109-127 у БЕО ІО Мо:114 (див. Умаїб!, 2012), є критично важливим для взаємодії

СОр127-ус, зокрема, забезпечуючи можливість зв'язування або підвищуючи зв'язування СО127 з ус у присутності 1-7. Зокрема, вважають, що мутації в Р112 та І 115, які було ідентифіковано у пацієнтів, що страждають на тяжкий комбінований імунодефіцит (ЗСІЮ), дестабілізують гідрофобну серцевину домену 02, що, ймовірно, призводить у результаті до їх патогенетичних проявів. Як зазначено вище, сайт 2р складається, по суті, з амінокислот 109-127; спеціаліст у даній галузі техніки зрозуміє, що крайні точки такого домену не обов'язково можуть бути визначені однозначно з точністю до однієї основи, та що сайт 20, як можна зрозуміти, містить 60 або на одному з кінців, або на обох кінцях згаданої послідовності на 1, 2 або З амінокислоти більше або менше. Отже, при згадуванні у даному документі сайту 25 у СО127, він, як варто розуміти, відноситься до послідовності в СЮО127, починаючи з положення 106, 107, 108, 109, 110, 111 або 112 та закінчуючи положенням 124, 125, 126 або 127; зокрема, до такої послідовності, яка, як вважається або як показано, складає необхідний сайт зв'язування з ус- ланцюгом в 1--7-К, зокрема, у присутності І1І--7.

Передача сигналу за участі І. -7А8

Зв'язування 1-7 з ІІ -7К запускає активацію декількох шляхів передачі сигналу, у тому числі

Янус-кіназ (АК) 1 та 3, передавача сигналу та активатора транскрипції 5 (ЗТАТ5) та фосфатидилінозитол-3-кінази (РІЗ-К). Повідомляється, що активуються шляхи за участі 5ТАТ1 та ЗТАТЗ, хоча вони не вважаються головними шляхами. Активація шляху ЗТАТ5 необхідна для індукції антиапоптотичного білка Всі-2 та запобігання попадання проапоптотичного білка Вах у мітохондрію та, отже, для виживання попередників Т-клітин, що розвиваються у тимусі.

Активація шляху РІЗ-К приводить у результаті до фосфорилювання та утримання в цитоплазмі проапоптотичного білка Вад.

Передача сигналу за участі Т5І РК

Тимічний стромальний лімфопоетин (Т5І Р) являє собою цитокін епітеліальних клітин, який є активним при лімфопоезі та, зокрема, залучений у регуляцію розвитку клітин імунної системи, причому зазначена регуляція впливає, зокрема, на дозрівання зазначених клітин. Людський

Т5ІР (номер доступу в сСепрапк АЕ338732) являє собою фактор, який викликає поляризацію дендритних клітин та стимулює проліферацію та диференціювання Т- та В-клітин. Т5І Р. також пригнічує утворення Тгед клітин (І єї еї аї., 2011).

Було показано, що індуковані Т5ІР шляхи передачі сигналу відрізняються на молекулярному рівні від шляхів, що індукуються 1-7. Зокрема, хоча зв'язування Т5ІР з його рецептором також активує Чак-ї, воно не активує ЧУак-3, а активує Чак-2. Ці відмінності узгоджуються зі спостереженням, що ЧЩак-1 з'єднується з СО127, який є спільним для обох рецепторів, у той час як дак-2 з'єднується з СК Е2, та дак-3 - з ус (Косптап еї а!., 2010). Про активацію шляху за участі ЗТАТ5 також повідомлялося для індукованої Т5І Р передачі сигналу (2/попо еї аїІ., 2014). Один головний ефект Т5І Р полягає в тому, що він приводить до активації дендритних клітин, у тому числі до надекспресії костимулюючих молекул, таких як СО80О, тим

Зо самим стимулюючи опосередковані ТН-2 запальні реакції (Кеспе еї аї., 2001).

Клітинна біологія

Термін "СО0О127-позитивні клітини" позначає клітини, які експресують СО127 на своїй клітинній поверхні. У більшості випадків СО127-позитивні клітини експресують СО127 у комплексі, що утворює 1-7ВА (І1/-7В-позитивні клітини), тал"або в комплексі, що утворює Т5І РЕ (Т5І РЕА-позитивні клітини). СО127 експресується різноманітними клітинами, у тому числі як Т- клітинами пам'яті, так і наївними Т-клітинами. СО127 експресується, зокрема, ефекторними Т- клітинами (Тей), у тому числі спочиваючими Т-клітинами та Т-клітинами пам'яті, та незрілими В- клітинами, але не експресується, зокрема, спочиваючими натуральними регуляторними Т- клітинами (натуральними Тгед). І/-7Ка є необхідним для стимуляції диференціювання тимоцитів та клонального розмноження лімфоцитів.

Важливість шляху за участі І/-7-С0127 для гомеостазу наївних Т-клітин підкреслюється декількома нещодавніми дослідженнями, які показують, що рівні експресії мембранозв'язаного

І/-7Ка на звичайних СО4- Т-клітинах корелюють із частотами виявлення СО4- Т-клітин- нещодавніх емігрантів з тимуса (КТЕ) у здорових індивідів та ВІЛ-інфікованих пацієнтів, а також у пацієнтів з М5 (АІбидиегдиє еї аї., 2007) (Вгоих еї аї., 2010). І. -/Ка також є компонентом рецептора Т5І Р. Було продемонстровано, що секреція Т5І Р тільцями Гассаля, структурами, які складаються з епітеліальних клітин у медулярній області тимуса, створює умови для індукції

СО11с: мієлоїдними дендритними клітинами (МОСС) диференціювання тимоцитів у Тгед (Умаїапабе сеї аї., 2005а). Відповідно, для розвитку Тгтед необхідні сигнали від рецептора ІІ -7, як показано в нокаутних за І/-7Ка мишей (Ма2исспеїї еї аї., 2008). У статті (Наа5 еї аї., 2011) автори показали знижену експресію ІЇ/-7Ка на звичайних Т-клітинах та підвищені рівні 1-7 в плазмі разом зі зниженням частот виявлення Тгед-нещодавніх емігрантів з тимуса та функцією

Тгед при М5 без явного генетичного впливу (Нааз еї аї., 2011).

Аналіз того, як І--7 регулює переміщення свого когнатного рецептора через мембрану, є ключовим для вичерпного розуміння ролі 1--7/-7К у функціонуванні лімфоцитів. В попередніх дослідженнях передбачалося, що стимуляція Т-клітин І/-7 веде до знижувальної модуляції експресії СО127 на поверхні протягом 30 хвилин, можливо, внаслідок інтерналізації рецептора.

В наступні моменти часу (2-6 годин) І/-7, як було показано, індукує знижувальну регуляцію транскрипції СО127. Проте фактичні динамічні характеристики інтерналізації СО127 та бо регуляцію ІЇ/-7 механізмів його переміщення через мембрану все ще необхідно з'ясувати

(Непгідцез еї аї., 2010). Також передбачалося, що індукована 1-7 передача сигналу залежить від інтерналізації СО127, та що подальше руйнування рецептора обумовлено активністю УАКЗ та опосередковується як протеасомами, так і лізосомами.

Патофізіологія

Дендритні клітини після дозрівання експресують високі рівні костимулюючих молекул, таких як СО80, який стимулює опосередковані Т-клітинами імунні реакції. Вони також продукують цитокін ТАКС (ССІ 17), який індукує хемотаксис у Т-клітин. Самі по собі зрілі дендритні клітини роблять внесок у патофізіологію декількох імуноопосередкованих захворювань, у яких відіграють роль Т-клітинні реакції, як наприклад, при астмі, ревматоїдному артриті, коліті, розсіяному склерозі та увеїті. Зрілі дендритні клітини також відіграють ключову роль у процесі відторгнення алотрансплантатів клітин, тканин або органів. Отже, метою багатьох терапевтичних стратегій є запобігання дозрівання дендритних клітин.

Наявність або відсутність костимулюючих молекул на антигенпрезентуючих клітинах (АРС), таких як дендритні клітини, має значний вплив на якісний і кількісний характер імунної реакції.

Надекспресія СО8О дендритними клітинами викликає дозрівання ОС та підвищує активацію Т- клітин пам'яті (Вошиг-огаап еї аї., 2011). З точки зору механізму взаємодія СО28 з СЮО80О впливає на центральний кластер імунологічного синапса та локалізується спільно з зайнятим ТСК, тим самим стабілізуючи імунний синапс (Оизіїп апа 5пам, 1999) (Сгакоці еї аї., 1999). Взаємодія між ср28 та СО80 фактично утворює належне просторове розташування для ефективної взаємодії

ТК з молекулами НГА (Зйпауг апа Бизіп, 1997).

Розсіяний склероз (М5) являє собою запальне демієлінізуюче захворювання центральної нервової системи (СМ5). Виникнення демієлінізуючих бляшок у СМ5 пацієнтів з М5 пов'язане з запальним інфільтратом, що складається в основному з макрофагів та Т-лімфоцитів. На рівні механізму М5 вважається аутоїмунним захворюванням. Як правило, М5 вважається захворюванням, опосередкованим переважно СО4- Т-клітинами. Конкретні субпопуляції СО4»,

ТА1 та, як стало відомо останнім часом, ТпП17, залучені в патофізіологію захворювання. В даний час усе ще важко визначити конкретні ролі кожної субпопуляції ТИ1ї та Тп17. Більш того, інгібування переміщення лейкоцитів за рахунок антагонізму альфа-4(а4)-інтегрину зараз затверджено в якості терапевтичного підходу для лікування запальних захворювань, таких як

Зо М5 та запальне захворювання кишечника (ІВО), а також для лікування атеросклерозу (2Пі еї аї., 2014). «487 експресується на більш обмеженому наборі лейкоцитів, що включає в себе активовані макрофаги, субпопуляції лімфоцитів, МК-клітини, гладкі клітини та еозинофіли.

Людський 1-7 індукує сильну експресію са4- та В7-інтегринів іп міго на людських Т- лімфоцитах і різко підвищує частоту виявлення людських Т-лімфоцитів, які експресують ад4-, Дд7- та а4/фВ7-інтегрини (фіг. 19), що необхідні для хоумінгу Т-лімфоцитів та їх утримання в тканинах, які не відносяться до лімфоїдних, таких як тканини кишечника, головного мозку та шкіри (Оєписсі єї аі., 2009; Ссопи еї а!., 2009).

Наївні Т-клітини є частково відповідальними за гостре відторгнення трансплантованих органів і тканин. Ці клітини можуть піддаватися контролю сучасними імунодепресивними лікарськими засобами (інгібітори кальциневрину) та моноклональними антитілами, які блокують костимуляцію (засоби, що протидіють адгезії, інгібітори СО80/86). Т-клітини пам'яті також є відповідальними за відторгнення трансплантата. Т-клітини пам'яті накопичуються у людини у результаті імунних реакцій, що проявлялися протягом життя, в основному, попередніх реакцій проти вірусів. Було показано, що Т-клітини пам'яті можуть повторно активуватися алоантигенами у результаті "гетерологічного імунітету", який являє собою перехресну реакцію противірусних захисних механізмів людини з алоантигенами (Адат5 еї аї., 2003).

Гетерологічний імунітет являє собою сильну перешкоду для індукції толерантності, оскільки Т- клітини пам'яті, на відміну від наївних Т-клітин, запрограмовані на швидку активацію зі зменшеними вимогами до костимулюючих сигналів. Т-клітини пам'яті також можуть бути залучені у хронічне відторгнення. Разом з їх роллю у трансплантації органів та тканин наївні Т- клітини та Т-клітини пам'яті також спільно відповідають за численні аутоїмунні захворювання.

Це відноситься до виразкового коліту (Зпіпопага еї аї., 2011), ревматоїдного артриту, псоріазу або реакції «трансплантат проти хазяїна».

Більш того, було показано, що у деяких злоякісних клітин проявляється 1-7. Це відноситься до шкірної лімфоми при синдромі Сезарі (6095 з них) або дитячого гострого лімфобластного лейкозу, при якому приблизно в 15 95 випадків проявляється мутація з набуттям функції в СО127, що робить ці пухлини частково ІІ -7-залежними (Зпоснпаї еї а!., 2011).

Скорочення кількості Т-лімфоцитів було очевидним підходом у імуносупресії для протидії відторгненню алотрансплантата або боротьби з аутоїмунними реакціями. Тим не менш, повне бо вичерпання Т-клітин може не бути сприятливим для індукції імунологічної толерантності.

Цілеспрямований вплив на субпопуляції Т-клітин або вибірково активовані Т-клітини без модифікації Тгед клітин може складати про-толерогенний підхід (Найдероиго еї аї., 2009). Отже,

СО0127 можна вважати потенційною привабливою терапевтичною мішенню для моноклональних антитіл (Маб), спрямованих на модуляцію імунних реакцій, оскільки такі моноклональні антитіла можуть мати потенціал у плані скорочення кількості ефекторних, а не регуляторних лімфоцитів.

Відповідно, передбачалося, що вони можуть проявляти ефективність при трансплантації, аутоїмунних реакціях (Міспеї еї аї!., 2008) та злоякісних пухлинах за рахунок протидії доступу 1-7 до 1І-7-Е та, отже, обмеження функціонування та росту Т- та В-клітин.

Терапія моноклональним антитілом, яке створює перешкоду на шляху за участі 1-7, по відношенню до СО127--клітин може досягти цієї мети за рахунок ліквідації/нейтралізації наївних

Т-клітин та Т-клітин пам'яті та/або зниження їх кількості при збереженні Тгед клітин або за рахунок ліквідації або зниження кількості СО127-позитивних злоякісних клітин. Тим не менш, терапія моноклональним антитілом проти СО127:-клітин може діяти як двогострий меч, якщо вона приводить до активації дендритних клітин. Дійсно, СО127 також експресується дендритними клітинами в поєднанні з СКІЕ2, утворюючи рецептор Т5І Р. У присутності Т5І Р дендритні клітини стають активованими та стимулюють опосередковані Т-клітинами імунні реакції. Деякі моноклональні антитіла до СО127, як передбачається, за рахунок модифікації характеру взаємодії Т5І Р з рецептором Т5ІР, характеризуються властивістю, яка полягає в підвищенні дозрівання дендритних клітин, що індукується ТЗІ Р (як показано на фіг. 7 при типових умовах). Як наслідок, терапія моноклональним антитілом до СО127, яке не буде підвищувати дозрівання дендритних клітин, індуковане Т5ІР, буде надавати терапевтичну перевагу. Вона буде надавати перевагу блокади ІЇ-7К без недоліку, що полягає в активації дендритних клітин у середовищі, що піддається запаленню та містить ТІ Р.

У публікації (Касаре еї аї!., 2009) автори аналізували значення альфа-рецептора ІІ -7 (ІІ - тка) в якості можливої терапевтичної мішені при трансплантації. Розглянувши експресію І -7кКа на різноманітних Т-клітинах та сприйнятливих до 1-7 клітинах, автори визначали, чи може цілеспрямований вплив на Т-клітини пам'яті, які експресують І/-7Ка, подовжити термін виживання алотрансплантата у мишей, і зробили висновки, що цілеспрямований вплив на І -7 або І/-7Ка переважно не буде торкатися Тгед клітин. З урахуванням перспектив автори

Зо звернули увагу на те, що цілеспрямований вплив або на ІІ -7, або на І -7Ка при терапевтичному лікуванні може мати різні наслідки для виживання клітин, які експресують СО127, та може викликати різні типи лімфопенії. Питання щодо ефектів антитіл, які будуть спрямовані на ІІ -7Ка, залежно від того, чи будуть вони являти собою антитіла, що блокують, або антитіла, що нейтралізують, або цитотоксичні антитіла, також ставилося з концептуальної точки зору. Тим не менш, автори не показали одержання та аналіз таких антитіл, а радше виявили потребу в подальшому вивченні для оцінки обгрунтованості даної гіпотези.

З урахуванням недоліків доступних терапевтичних підходів при пов'язаних з імунними реакціями захворюваннях, а також при інших захворюваннях, у яких задіяні ІІ -7/І -7Ка, таких як різні типи злоякісних пухлин, у тому числі деякі злоякісні пухлини молочної залози, все ще існує потреба в додаткових кандидатах на роль лікарського засобу, особливо в кандидатах, активних по відношенню до більш вибіркових мішеней, з метою контролю, наприклад модуляції, активації імунних реакцій у пацієнтів-людей.

У цьому контексті моноклональні антитіла до ІІ -7Ка, що характеризуються антагоністичними властивостями по відношенню до ІЇ-7Ка, було розкрито в міжнародній заявці УМО 2010/017468, а їх гуманізовані варіанти - в міжнародній заявці ММО 2011/094259 з метою лікування аутоїмунних захворювань, що подібні до розсіяного склерозу. Зазначено, що описані антитіла протидіють зв'язуванню 1-7 з його рецептором та є активними по відношенню до розмноження та виживання Тн1і7 та Тні клітин, для яких, як було зазначено, необхідна взаємодія 1-7 з рецептором СО127 на них. Ефект цих антитіл по відношенню до дозрівання імунних клітин та, особливо, дендритних клітин не розглядався. Окрім того, ці антитіла, як зазначено, не інгібують індуковане Т5І Р продукування ТАКС (с. 107 у міжнародній заявці УМО2011/094259). Аналогічно, антитіла до СО127, описані в міжнародній заявці УМО2011/104687 або УМО2013/056984, які передбачаються для застосування в лікуванні дібету, вовчака, ревматоїдного артриту та інших аутоїмунних захворювань, не обговорювались щодо їх можливого впливу на дозрівання дендритних клітин, та про їх взаємодію з індукованою Т5ІР передачею сигналу не повідомлялося. Окрім того, як опубліковано Кепгп та співавт. (Кегп еї аї., 2013; Кеп еї аї., 2015) та як показано у даному документі, антитіла до СО127 з рівня техніки індукують інтерналізацію рецептора. Оскільки антагоністичні антитіла до СО127, які також індукують інтерналізацію

СО127, не здатні контролювати шкірну гіперчутливість ІМ типу (фіг. 10), в той час як 60 антагоністичні антитіла до СО127, які не індукують інтерналізацію, здатні на це, видається можливим, що процес інтерналізації активує шлях передачі сигналу, який ослаблює антагоністичний ефект антитіл. Нарешті, антитіла з рівня техніки розпізнають епітоп, який не містить будь-якої послідовності з сайту 265 у СО127 (тобто, зокрема, з амінокислот 109-127 у

ЗЕО ІЮ Мо:114); та не було показано, що вони порушують зв'язування СО127 з ус-ланцюгом у

ІС-7-8.

Незважаючи на сучасний інтерес до розробки антитіл до СО127, зусилля, отже, концентрувалися на інгібуванні індукованої ІЇ-7 передачі сигналу за участі І--7К. При цьому

Т5ІР та Т5ІРЕК були задіяні у ряді патологій. Було показано, що Т5ІР відіграє роль у захворюваннях шкіри та легень (Не апа Сепа, 2010) та пов'язаний із різноманітними патологіями, у тому числі з запальним захворюванням дихальних шляхів та атопічним дерматитом у людини та мишей (хіпд еї аї., 2008) (дагімаїа еї аї., 2011). Окрім того, було показано, що Т5І Р пов'язаний із регуляцією імунних реакцій та запалення в кишечнику (Тауїог еї аї., 2009). Інші патології, у яких задіяні Т5І Р та Т5І РЕ, включають у себе дитячий В-клітинний лейкоз (мап Водедот еї аї., 2012), алергічні розлади, специфічні по відношенню до легень та шкіри, захворювання, пов'язані з аутоїмунними реакціями (Коап еї аї., 2012), та злоякісну пухлину, у тому числі злоякісну пухлину молочної залози (ОїКпапиоа еї аї., 2011).

Отже, хоча в рівні техніки у великій кількості джерел підтверджується, що антитіла до СО127 є перспективними кандидатами для лікування захворювань, пов'язаних з аутоіїмунними реакціями, шляхом протидії індукованим 1-7 та/або опосередкованим 1І--7-К механізмам, та що такі антитіла також будуть зв'язуватися з СО127 в контексті рецептора Т5І Р та перешкоджати індукованим Т5І Р та/або опосередкованим рецептором Т5І Р механізмам, їх можлива участь у дозріванні дендритних клітин не досліджувалась, та в рівні техніки не повідомлялося про покращення, що полягає в одержанні антитіл, які не проявляють ефект, що полягає в підвищенні дозрівання дендритних клітин, та/або які не індукують інтерналізацію СО127, та/або які інгібують індуковану 1І--7 інтерналізацію.

Після несподіваного відкриття індукованого існуючими антитілами до СО127 небажаного підвищення дозрівання дендритних клітин, яке індукується Т5ІР (хоча антитіла інгібують індуковане Т5І Р продукування ТАКС), авторами даного винаходу було розроблено антитіла, які не проявляють такого підвищення та, отже, є більш підходящими для лікування захворювань,

Зо зокрема, аутоїмунних захворювань. Більш того, авторами даного винаходу було виявлено, що антитіла, які не індукують інтерналізацію та/або інгібують індуковану 1-7 інтерналізацію СО127 характеризуються високою ефективністю, особливо іп мімо, у порівнянні з антитілами з рівня техніки, такими як МО707-13.

Даним винаходом передбачаються придатні у даних умовах засоби, що відносяться до моноклональних антитіл до І--7Ка, які мають негативний вплив тільки на шлях за участі Т5І Р.

Відповідно, моноклональні антитіла (Маб) згідно з даним винаходом не підвищують індуковане

Т5І Р. дозрівання дендритних клітин, на противагу тому, що спостерігалося авторами даного винаходу з традиційними антитілами до СО127. В якості доповнення або альтернативи, антитіла згідно з даним винаходом не індукують інтерналізацію СО127 та/або інгібують індуковану 1-7 інтерналізацію СО127. Згідно з конкретним варіантом здійснення в антитілах, що забезпечуються згідно з даним винаходом, поєднані ці властивості, які відносяться до дозрівання ОС та/або інтерналізації, з антагоністичною активністю по відношенню до передачі сигналу за участі ІС-7/ЛІ/-7-К. Згідно з конкретними варіантами здійснення антитіла згідно з даним винаходом інгібують індуковану 1-7 експресію а4-, В7- та с4/В7-інтегринів у Т-клітинах, зокрема, іп мімо. Ці Мар із новими механізмами дії, отже, є складовою нових продуктів для оцінки терапевтичних сприятливих ефектів цілеспрямованого впливу на СО127.

Більш того, авторами даного винаходу розкрито епітоп, який розпізнається переважним антитілом згідно з даним винаходом, тим самим забезпечуючи можливість безпосередньої розробки альтернативних антитіл та/або їх фрагментів, або антигензв'язувальних доменів, або структурно пов'язаних антигензв'язувальних доменів з інших типів поліпептидів, які зв'язуються з відповідним епітопом та зберігають бажані характеристики.

Епітопи у СО127, що розпізнаються М13В82, ідентифікували за допомогою сканування на матриці з пришитими олігопептидами (яке інколи називається скануванням пептидами, що перекриваються, або рерзсап-аналізом), та вони містять амінокислотні послідовності людського

СО0127, які складаються з послідовностей ері! (ЗЕО ІО Мо: 110), ер2 (ЗЕО ІО Мо: 111) та ерз (ЗЕО ІО Мо:86). У цій методиці використовується бібліотека олігопептидних послідовностей із сегментів білка-мішені, що перекриваються та не перекриваються, та її досліджують щодо здатності даних послідовностей до зв'язування з антитілом, що становить інтерес. Комбінуючи несуміжні пептидні послідовності з різних частин білка-мішені та забезпечуючи конформаційну бо жорсткість цього комбінованого пептиду (як наприклад, за рахунок використання кістяків СІ ІРБ)

(Тіттептап еї а!., 2007), епітопи, що перекриваються, можна наносити на карту з дуже високою ймовірністю та точністю (Стадод, 2011) (Сазейвіме еї аї., 2010). Додаткове визначення епітопа з використанням процедур захисту від протеолізу дозволяє визначити, що ідентичний епітоп містить амінокислотні послідовності людського СО127, які мають послідовності 5ЕО ІЮО Мо: 115,

ЗЕО ІЮО Мо: 116 та 5ЕО ІО Мо: 117. Отже, епітоп містить послідовності з сайту 265 у СЮО127. Більш того, епітоп містить послідовності в обох доменах 01 та 02 у СО127 та, більш конкретно, послідовності з домену 01 разом із послідовностями з сайту 20. Епітопи згідно з даним винаходом більш детально описані нижче. Зокрема, зазначені епітопи складаються з 5ЕО ІЮ

Мо:115 (або 5ЕО ІЮО Мо:110), БЕО ІЮ Мо:116 (або 5ЕО ІЮО Мо:86) та ЗЕО ІО Мо:117 (або 5ЕО ІЮ

Мо:111) в їх конформаційному розташуванні в нативному СО127.

Згідно з конкретним варіантом здійснення моноклональні антитіла також проявляють цитотоксичну дію по відношенню до СО127--клітин-мішеней, що також фізично зменшує їх кількість (скорочення субпопуляції).

Отже, даний винахід відноситься до макромолекули, такої як антитіло, антигензв'язувальний фрагмент антитіла або химерна молекула, що містить антитіло або його фрагмент, які (Її) специфічно зв'язуються з альфа-ланцюгом рецептора до 1-7 (який позначається СО127) за допомогою взаємодії антитіло-антиген, особливо з альфа-ланцюгом рецептора 1-7, що експресується людськими СО127-позитивними клітинами, та які (ії) не підвищують дозрівання дендритних клітин, індуковане Т5І Р (що характеризується, наприклад, підвищеною експресією антигенів СО8О та/(або СО40 на клітинній поверхні), та/або (ії) не індукують інтерналізацію

С0127, та/або інгібують індуковану 1-7 інтерналізацію СО127.

Згідно з конкретним варіантом здійснення даного винаходу зазначена макромолекула містить МН-ланцюг, який містить щонайменше одну з наступних амінокислотних послідовностей: - МНООВІ1 5ЕО І Мо:10; - МНОСОВ2 5ЕО І Мо:12; - МНеСОКЗ 5ЕО ІО Мо:14 або 5ЕО ІО Мо: 48; "- МН БЕО ІО Мо:22; та/або Мі-ланцюг, який містить щонайменше одну з наступних амінокислотних послідовностей:

Коо) - М СОКІ1 5ЕО ІО Мо:16 або 5ЕО ІО Мо: 50; - МСОК2 5ЕО ІО Мо:18 або 5ЕО ІО Мо: 52; - МуСОВЗ 5ЕО ІО Мо:20; "- МІ 5ЕО ІЮО Мо:24.

Згідно з конкретними варіантами здійснення макромолекула проявляє цитотоксичну активність по відношенню до людських Т-клітин, які експресують СО127 (СО127--клітини). Згідно з іншими варіантами здійснення макромолекула не проявляє цитотоксичну активність по відношенню до людських Т-клітин, які експресують СО127 (СО127--клітини).

Даний винахід також відноситься до композицій, які містять зазначену макромолекулу, способів одержання зазначених макромолекул та застосувань зазначених макромолекул та композицій.

Як використовується у даному документі, макромолекула позначає будь-яку молекулу, особливо молекулу біологічного походження, або молекулу, яка містить фрагменти біологічного походження, з молекулярною масою більш ніж 500 Да. Макромолекули включають у себе поліпептиди та модифіковані поліпептиди, такі як глікозильовані поліпептиди та їх кон'югати, але не обмежуються ними. Як використовується у даному документі, макромолекула, яка "специфічно зв'язується з СО127 за допомогою взаємодій антитіло-антиген", означає, що взаємодії між зазначеною макромолекулою та СО127 складаються, по суті, з тих же взаємодій, що і взаємодії між антитілом, специфічним до СО127, та СО127. Зокрема, зазначена макромолекула може містити залишки в антитілі, які задіяні у зазначеній взаємодії, у просторовій конфігурації, що забезпечує можливість утворення тих же хімічних зв'язків із білком

СОр127. Згідно з конкретним варіантом здійснення макромолекула містить щонайменше одну послідовність СОМ МН-ланцюга та/або Мі -ланцюга антитіла. Згідно з переважним варіантом здійснення макромолекула містить усі з послідовностей СОК МН-ланцюга та/або Мі -ланцюга антитіла. Згідно з переважним варіантом здійснення макромолекула містить повний МН-ланцюг та/або повний Мі -ланцюг антитіла.

Згідно з конкретними варіантами здійснення макромолекулу одержують, конструюють або піддають добору таким чином, щоб вона розпізнавала епітоп, що визначається наступними ознаками (що визначається щонайменше однією з наступних ознак): (а) епітоп містить послідовності, зокрема, щонайменше 3, 4, 5, б або 7 послідовних 60 амінокислот, узятих з сайту 26 у СО127, зокрема, з амінокислот 109-127 у БЕО ІЮ Мо:114, більш конкретно, з амінокислот 110-125, 110-120, 112-120 у 5ЕО ІО Мо:114, більш конкретно, з амінокислот 114-119 у БЕО ІЮ Мо:114 (що відповідають 5ЕО ІЮ Мо:116); зокрема, епітоп містить

ЗЕО ІЮ Мо:116, зокрема, містить ЗЕО ІО Мо:86; зокрема, епітоп містить Р112 або 1115 у СО127; (б) додатково до ознак із пункту (а) вище епітоп містить послідовності, зокрема, щонайменше 3, 4, 5, 6 або 7 послідовних амінокислот, узятих з домену 01 у СО127, зокрема, з амінокислот 1-98 у БЕО ІЮО Мо:114; зокрема, епітоп містить амінокислотні послідовності БЕО ІЮ

Мо:115 (зокрема, містить амінокислотну послідовність ер! (ЗЕО ІЮО Мо:110)); (с) додатково до ознак із пункту (а) та необов'язково з пункту (Б) вище епітоп містить послідовності, зокрема, 3, 4, 5, 6 або 7 послідовних амінокислот, узятих з амінокислот 180-220 у

ЗБО ІО Мо:114, зокрема, з амінокислот 190-200; зокрема, епітоп містить амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮО Мо:117; зокрема, містить амінокислотну послідовність ер2 (ЗЕО ІО

Мо:111); (а) епітоп містить послідовності ЗЕО ІЮ Мо:115 та послідовності ФЕО ІЮ Мо:116, або епітоп містить послідовність 5Е0О ІЮ Мо:117 та послідовності ЗЕО ІЮ Мо:116; зокрема, епітоп містить послідовності ФЕО ІЮ Мо:115, 5ЕО ІЮ Мо:116 та 5ЕО ІЮО Мо:117; (є) епітоп містить послідовності у СО127, які визначені в пунктах (а), (Б) (с) та/або (а) вище, та не містить амінокислотні послідовності (з більш ніж 3, 4 або 5 послідовних амінокислот) у

СО0127, що відрізняються від безпосередньо згаданих, тобто, зокрема, епітоп містить тільки наступні послідовності в СО127: - одну послідовність, узяту з сайту 20, зокрема, яка складається з амінокислот 109-127 у

ЗБО ІЮ Мо:114, або амінокислот 110-125, 110-120 або 112-120 у 5ЕО ІЮО Мо:114, або амінокислот 114-119 у 5ЕО ІЮ Мо:114 (що відповідають 5ЗЕО ІЮО Мо:116), або послідовність, яка відповідає ЗЕО ІЮ Мо:86 та/або складається з послідовності з З амінокислот або більш ніж 3, 4, 5, 6, 7 амінокислот та з 19 амінокислот або менш ніж 19, 18, 15, 11 амінокислот, узятих з сайту 20, зокрема, таку послідовність, яка містить Р112 або І 115 у СО127; - необов'язково, додатково до послідовності сайту 20, одну послідовність, узяту з домену 01 у 20127, зокрема, з 98 амінокислот у 5ЕО ІО Мо:114, зокрема, одну послідовність, яка складається з ЗЕО ІЮ Мо:110 або з 5ЕБЕО ІЮО Мо:115 та/або складається з послідовності з З амінокислот або більш ніж 3, 4, 5, 6, 7 амінокислот та з 20 амінокислот або менш ніж 20, 18, 16,

Ко) 11 амінокислот, що містять ЗЕО ІЮ Мо:115 або що містяться в послідовності БЕО ІЮ Мо:115; - необов'язково, додатково до послідовності сайту 20 та до необов'язкової послідовності з домену 01, якщо вони присутні, одну послідовність, узяту з амінокислот 180-220 у 5ЕО ІЮ

Мо:114; зокрема, одну послідовність, яка складається з 5ЕО ІЮО Мо:111 або з 5БЕО ІЮ Мо:117 та/або складається з послідовності з З амінокислот або більш ніж 3, 4, 5, 6, 7 амінокислот та з 20 амінокислот або менш ніж 20, 18, 16, 11 амінокислот, що містять ЗЕО ІЮ Мо:117 або що містяться в послідовності 5260 ІЮ Мо:117; причому зазначений епітоп, можливо, містить додаткові амінокислоти за умови, що ці додаткові амінокислоти не взяті з послідовності СО127 (тобто за умови, що епітоп не містить більш ніж 3, 4 або 5 послідовних амінокислот з послідовності СО127, за виключенням послідовності з сайту 20, та, можливо, необов'язкових послідовностей з домену О1, та з амінокислот 180-220 у БЕО ІО Мо:114, описаній вище); (Ї) епітоп, додатково до ознаки, описаної в пункті (а), (Б), (с) або (4) вище, не містить більш ніж 3, 4 або 5 послідовних амінокислот, узятих з ділянки 99-108 у 5ЕО ІЮ Мо:114, не містить більш ніж 3, 4 або 5 послідовних амінокислот, узятих з ділянки 128-179 у ЗЕО ІО Мо:114, та/або не містить більш ніж 3, 4 або 5 послідовних амінокислот із ділянки 220-239 у 5ЕО ІЮО Мо:114, зокрема, не містить більш ніж 3, 4 або 5 послідовних амінокислот із будь-якої з ділянок 99-108, 128-179 та 220-239 у БЕО ІЮ Мо:114; (9) епітоп містить комбінацію послідовностей з СО127, які визначені в пунктах (а), (Б), (с), (а), (є) та/або (Її) вище, причому деякі амінокислоти було піддано мутації, зокрема, делеції та/або заміні, зокрема, заміні на амінокислоти з подібними властивостями (консервативні заміни); зокрема, епітоп складається з послідовностей або містить послідовності, щонайменше на 80 95, 85 95, 90 95 або 95 95 ідентичні послідовностям у СО127, які визначені в пунктах (а), (Б), (с), (4), (є) та/або (Її) вище, в комбінації, як визначено в пунктах (Б), (с) або (а), у випадку, коли це є доречним; (п) епітоп являє собою ідентичний епітоп, який має ознаки, визначені в пунктах (а), (Б), (с), (9), (є), ()О та/або (9) вище, тобто містить послідовності або складається з послідовностей, які визначені в пунктах (а), (Б), (с), (94), (е), (Ж та/"або (9) вище, в конформації, що імітує конформацію зазначених послідовностей в нативному СО127 (або у вигляді мономера, або у вигляді димера з ус та/або зв'язаного з ЇЇ -7); бо () епітоп містить фрагмент СО127 (тобто відрізок з послідовних амінокислот) з ознаками з пунктів (а), (Б), (с), (а), (9) та/або (й) вище; () епітоп має ознаки, визначені в пункті (9) вище, та його одержують за допомогою технології, такої як технологія СІ ІР5, яка забезпечує можливість синтезу збірних пептидних ансамблів з передбачуваною структурою.

Згідно з конкретними варіантами здійснення епітопів з ознаками з пунктів (Б) та (с), епітоп включає в себе амінокислотну послідовність у СО127, яка лежить між двома послідовностями ер! та ер2 та необов'язково не продовжується з включенням у себе будь-якої амінокислоти або не продовжується з включенням у себе більш ніж однієї амінокислоти в послідовності людського

СО0127, що лежить вище (тобто в напрямку М-кінця відносно послідовності ер!) та/або нижче (тобто в напрямку С-кінця відносно послідовності ер2) цих послідовностей. Згідно з іншими конкретними варіантами здійснення епітоп є таким, щоб жодна з послідовностей ер! або ерг2 не продовжувалась із включенням у себе будь-якої з амінокислот, суміжних з ними в послідовності людського СО127, або з включенням у себе більш ніж 7, 5 або 1 послідовної амінокислоти з амінокислот, суміжних з ними в послідовності людського СО127, яка лежить між ері та ерг; продовження послідовностей ер! та ер2 в даному випадку також може обмежуватися вище (відносно ері) або нижче (відносно ерг), як зазначено вище. Згідно з конкретними варіантами здійснення послідовності СО127, які містять послідовності епітопів, зазначені вище, не продовжуються так, щоб вони містили суміжні з ними амінокислоти з послідовності людського

СО0127, які є суміжними з ері більш ніж на 1 амінокислоту з М-кінця або більш ніж на 7 амінокислот з С-кінця, або є суміжними з ер2 більш ніж на 30 амінокислот з М-кінця або на 30 амінокислот з С-кінця.

Згідно з варіантами здійснення, при яких макромолекулу одержують, конструюють або піддають добору таким чином, щоб вона розпізнавала епітоп, що містить декілька несуміжних амінокислотних послідовностей у СО127 (тобто послідовностей, які не є суміжними в первинній послідовності СЮО127), можливо одержати або добирати антитіла, які розпізнають епітоп, що містить одну з зазначених послідовностей у СО127, а потім добирати з-поміж цих антитіл ті, які розпізнають іншу послідовність(послідовності) в СО127 (зазначений подальший добір можна здійснювати за допомогою послідовних процедур добору, якщо розпізнаватися мають більш ніж дві несуміжні послідовності в СО127).

Даний винахід також включає в себе ідентичний епітоп, який розпізнається антагоністичними антитілами згідно з даним винаходом. Даний винахід також включає в себе антитіла, які зв'язуються з цим конформаційним епітопом. Варіанти здійснення включають у себе ідентичний епітоп у СО127, який містить (ї) домен із послідовністю, щонайменше на 80 95, 85 95, 90 95 або 95 95 ідентичною 5ЕО ІЮ МО. 115, та/або домен із послідовністю, щонайменше на 80 95, 85 905, 90 95 або 95 95 ідентичною 5ЕО ІЮ МО. 117, та (і) домен із послідовністю, щонайменше на 80 95, 85 95, 90 95 або 95 95 ідентичною ЗЕО ІЮ МО. 116. Більш конкретно, ідентичний епітоп у СО127 містить амінокислотні залишки 73-79 та/або 114-119 та амінокислотні залишки 193-196 у ЗЕО ІЮ

Мо:114. Даний винахід включає в себе антитіла, які зв'язуються з цим конформаційним епітопом. Згідно з конкретними варіантами здійснення макромолекулу одержують, конструюють або піддають добору таким чином, щоб вона розпізнавала ідентичний епітоп, що містить амінокислотні послідовності в людському СО127, які мають послідовності ЗЕО ІЮО Мо: 115, ЗЕО

ІО Мо: 116 та ЗЕО ІО Мо: 117.

Зокрема, згідно з описаними вище варіантами здійснення утворення антитіла індукується у відповідь на імуноген, який складається з описаного епітопа або містить описаний епітоп, тобто спочатку одержують за допомогою імунізації тварини, яка не є людиною, зокрема, ссавця, антигеном, що містить зазначений епітоп або складається з нього. Відповідно, даний винахід також відноситься до антигену, який містить епітоп, описаний вище, зокрема, до його застосування в якості імуногену при одержанні антитіл та/або до його застосування в способах добору та/або дослідження для одержання антитіла, або антигензв'язувального фрагмента, або іншої макромолекули. Даний винахід також відноситься до зазначених способів застосування зазначеного антигену. Оскільки антигени можуть містити непептидні складові додатково до пептидних складових та/або можуть містити пептидні складові, які не утворюють частину епітопа, у даному документі варто розуміти, що, якщо не зазначено інше, або це очевидно з контексту, у випадку, коли це відноситься до послідовності антигену та/або до ознак зазначеної послідовності, зазначені послідовність або ознаки, як варто розуміти, позначають послідовність (або її ознаки) частини антигену, що являє собою епітоп. Якщо антиген містить амінокислоти, які не утворюють частину епітопа, зазначені амінокислоти переважно не містять більш ніж 3, 4 або 5 послідовних амінокислот у СО127.

Якщо вони є відповідними, та якщо вони не є непридатними з технічної точки зору, бо визначення та ознаки, розкриті у даному документі по відношенню до антитіл або їх фрагментів,

аналогічно застосовуються до будь-якої макромолекули згідно з даним винаходом.

Зв'язування СО127

Згідно з даним винаходом «зв'язування» з білком ІЇ-7Ка відноситься до взаємодії типу антиген-антитіло та охоплює властивості «специфічного зв'язування» антитіл або їх антигензв'язувальних фрагментів, причому специфічне зв'язування означає, що антитіла або антигензв'язувальні фрагменти зв'язуються з білком ІЇ-7Ка, в той час як вони не зв'язуються або зв'язуються зі значно слабшою афінністю з іншими білками (наприклад, спільним у- ланцюгом цитокінового рецептора). Специфічне зв'язування переважно характеризують та/або визначають в фізіологічних умовах, особливо з урахуванням рН досліджуваного розчину та вмісту у ньому солі. Зв'язування та специфічність зв'язування можна досліджувати згідно з аналізами, розкритими у розділі Приклади, та їх, зокрема, можна досліджувати за допомогою аналізу методом Віасоге, ЕГІЗА або вестерн-блотинг.

Згідно з конкретним варіантом здійснення даного винаходу антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти цілеспрямовано впливають на альфа-ланцюг 1Ї-7-К та зв'язуються з альфа-ланцюгом 1І--7-К, коли він знаходиться в комплексі з рецептором Т5І/ Р (з

ССРКЕ2; номер доступу в зЗепрапк АЕ338733; Кеспе еї аї., 2001).

Згідно з конкретним варіантом здійснення антитіла або їх фрагменти або химерні молекули згідно з даним винаходом зв'язуються з СО127 у вигляді виділеного білка з константою дисоціації (Ка), яка є нижчою ніж 5Е-10 М. Згідно з переважним варіантом здійснення константа дисоціації (Ка) є нижчою ніж 1Е-10 М, або нижчою ніж 9Е-11 М, або нижчою ніж 5Е-11 М.

Згідно з конкретними варіантами здійснення антитіла або їх фрагменти, або химерна молекула, або інша макромолекула згідно з даним винаходом зв'язуються з антигеном людського СО127, який містить послідовності ер! (5ЕО ІО Мо: 110) та/або ер2 (ЗЕО ІО Мо: 111).

Згідно з конкретними варіантами здійснення антиген містить фрагмент людського СО127, який містить як ер, так і ер2 (тобто антиген містить послідовності ер! та ер2 та послідовності людського СО127, що лежать між ними). Згідно з іншими варіантами здійснення антиген містить тільки послідовності ері! та ер2 з людського СО127, можливо, додатково до інших послідовностей з іншого джерела, які відрізняються від послідовностей людського СО127.

Згідно з іншими варіантами здійснення послідовності ері! та/або ер2 продовжуються з включенням у себе декількох додаткових амінокислот з людського СО127, зокрема, до однієї амінокислоти з М-кінця відносно ері, до 7 амінокислот з С-кінця відносно ер, до 1, 10, 20 або 30 амінокислот з М-кінця відносно ерг, до 7, 10, 20 або 30 амінокислот з С-кінця відносно ерг.

Конкретні антигени включають у себе антиген, який описаний вище, що переважно містить як ер!ї, так і ер2, причому послідовність СО127, яка містить ері, не продовжується так, щоб вона містила амінокислоти, суміжні з зазначеною послідовністю в послідовності людського СО127, або не продовжується так, щоб вона містила більш ніж 1 амінокислоту з М-кінця або більш ніж 7 амінокислот з С-кінця відносно ері в послідовності людського СО127; та антиген, який описаний вище, причому послідовність СО127, яка містить ер2, не продовжується так, щоб вона містила амінокислоти, суміжні з зазначеною послідовністю в послідовності людського СО127, або не продовжується так, щоб вона містила більш ніж 30 амінокислот з М-кінця або більш ніж 30 амінокислот з С-кінця відносно ер2 в послідовності людського СЮО127; та антигени, які мають обидві ці ознаки. Згідно з конкретними варіантами здійснення антитіла або їх фрагменти, або химерна молекула, або інша макромолекула згідно з даним винаходом зв'язуються з антигеном людського СО127, який містить послідовності «ЕС ІЮ Мо: 115, 5ЕО ІО Мо: 116 та 5ЕО ІО Мо: 117.

Згідно з деякими варіантами здійснення антиген не перекривається з епітопом або не містить епітоп у І--7К, який розпізнається моноклональним антитілом, вибраним із групи, що складається з СІМ, С2М3, РЗАЗУ, Р4В3, Р2О2, Р2Е11, НА! 403а та НА 4035 (описані в міжнародній заявці УМО 2011104687 Ат). Згідно з деякими варіантами здійснення утворення антитіла індукується у відповідь на антиген, або антитіло зв'язується з епітопом, який не містить будь-який залишок або не містить деякі з залишків І82, К84, К100, Т105 та У192 альфа- рецептора інтерлейкіну 7, зокрема, не містить К100 та/або не містить Т105. Згідно з деякими варіантами здійснення антиген або епітоп не містить К194 або не містить будь-який із залишків або не містить усі з залишків, вибраних із групи, яка складається з залишків 0190, НІ191 та К194 в людському 1-7. Згідно з конкретними варіантами здійснення антиген або епітоп не містить ані І82, ні К84, або не містить ані К100, ні Т105, або не містить 192, або містить ані 0190, НІ191,

У192, ні К194.

Хоча СО127 є спільним як для 1 -7К, так і для Т5І РК, варто зазначити, що антитіло до

СО0127 не обов'язково буде розпізнавати (тобто зв'язуватися в підходящих умовах) СО127 в 60 обох контекстах. Більш того, навіть якщо антитіло зв'язується з СО127 як в контексті ІІ -7К, так і

Т5І РЕ, воно не обов'язково буде мати однаковий ефект по відношенню до взаємодії ІІ--7-ІІ -78 та взаємодії ТЗІ Р-Т5І РЕ. Воно, наприклад, може запобігати зв'язуванню 1-7 з ІІ-7К, але не зв'язуванню ТОР з Т5І РЕ. Більш того, зв'язування антитіла з будь-яким із рецепторів може мати різні ефекти окрім різних ефектів по відношенню до взаємодії ліганд-рецептор. Дійсно, зв'язування антитіла може модифікувати конформацію рецептора незалежно від ліганда або в поєднанні з лігандом та тим самим активувати або інактивувати рецептор. Ефект може відрізнятися для будь-якого з рецепторів, та фактично він може бути зворотним: антитіло, яке інактивує ІС-7К, може активувати Т5І РЕ та навпаки.

Як використовується у даному документі, активація рецептора означає запуск щонайменше деяких із біохімічних змін, які відбуваються після зв'язування ліганда з його рецептором. Ці зміни можуть включати в себе модифікацію структури рецептора (наприклад, димеризацію); фосфорилювання рецептора та притягнення та/або фосфорилювання білків, що зв'язуються з рецептором (таких як Янус-кінази, транскрипційні фактори 5ТАТ і т.д.) та/або зміни в клітинній локалізації рецептора (наприклад, інтерналізації рецептора). Як використовується у даному документі, деактивація рецептора означає запобігання або повернення щонайменше однієї з біохімічних модифікацій, пов'язаних зі зв'язуванням його ліганда з рецептором. Наприклад, рецептор може активуватися конститутивно (тобто активуватися навіть за відсутності ліганда) та деактивуватися у присутності засобу, такого як антитіло згідно з даним винаходом. В якості альтернативи або доповнення, індукована лігандом активація може повністю або частково інгібуватись при деактивації рецептора. Отже, деактивація може відбуватися, з-поміж інших механізмів, за допомогою запобігання зв'язуванню ліганда (та наступних подій «активації»), та/або запобігання структурних змін, пов'язаних зі зв'язуванням ліганда (наприклад, димеризації), та/"або модифікації положення рецептора в клітині (наприклад, деактивувальний засіб може запускати інтерналізацію та/або руйнування рецептора та, отже, запобігає активації лігандом).

Відсутність підвищеного дозрівання дендритних клітин, що індукується ТЗІ Р

Антитіла згідно з даним винаходом можуть зв'язуватися з СО127 у рецепторі Т5І Р (тобто можуть зв'язуватися з СО127, коли він знаходиться в комплексі з СК Е2, утворюючи рецептор

Т5І Р). Отже, антитіла згідно з даним винаходом можуть перешкоджати індукованій Т5І Р та/або

Зо опосередкованій рецептором Т5І Р передачі сигналу.

Автори даного винаходу несподівано виявили, що відповідні антитіла, які спрямовані на

СО0127 (або які розпізнають СО127) у рецепторі ТГЗР та проявляють певний антагонізм по відношенню до взаємодії ТО Р-Т5І РК, все-таки підвищують дозрівання дендритних клітин, індуковане Т5І Р: зазначене дозрівання вище у клітинах, оброблених Т5І Р та антитілами, ніж у клітинах, оброблених тільки ТЗІ Р. Ці традиційні антитіла підвищують залежне від Т5ІР дозрівання дендритних клітин. Згідно з переважними варіантами здійснення антитіла або фрагменти згідно з даним винаходом не проявляють синергізм із Т5ІЇР по відношенню до дозрівання імунних клітин, зокрема, дендритних клітин. Інакше кажучи, антитіла згідно з даним винаходом не підвищують дозрівання імунних клітин, індуковане Т5І Р. Даний ефект є особливо бажаним по відношенню до дозрівання дендритних клітин.

Варто зазначити, що здатність антитіл до СО127 до інгібування індукованого Т5ІР продукування ТАКС не можна вважати обгрунтованим прогностичним фактором для негативного (або щонайменше такого, що не відноситься до позитивного) ефекту антитіл по відношенню до індукованої Т5ІР передачі сигналу та її подальших наслідків (зокрема, дозрівання дендритних клітин). Дійсно, як виявили автори даного винаходу, навіть антитіла, що ефективно інгібують індуковане Т5І Р продукування ТАКС, можуть підвищувати залежне від

Т5І Р дозрівання дендритних клітин, яке вимірюють за експресією СО40 або СОВ80 з Т5І РЕ.

Індуковане Т5І Р дозрівання дендритних клітин можна вимірювати за експресією клітинного маркера СО40 та/або СОВ0О (Іпаба єї аї., 1995; У/агіапабе еї аї., 20055) в якості маркера, який є визначальним фактором дозрівання деяких імунних клітин, особливо, так званого диференціювання ТН-2, що спостерігається при деяких аутоїмунних захворюваннях, астмі та трансплантації. Згідно з конкретними варіантами здійснення підвищення дозрівання дендритних клітин, індуковане Т5ЇР, оцінюють за допомогою визначення підвищеної експресії маркера(маркерів) клітинної поверхні СО40 та/або СО8О у Т5ІРЕ-позитивних клітинах, оброблених Т5ІР та макромолекулою згідно з даним винаходом, у порівнянні з ТЗІ РЕ- позитивними клітинами, обробленими тільки Т5І Р.

Згідно з конкретним варіантом здійснення макромолекули, зокрема, антитіла або їх фрагмент, які не підвищують індуковане Т5І Р дозрівання дендритних клітин, не підвищують експресію СО80О більш ніж на 2595 у порівнянні зі стимуляцією тільки Т5І Р (без макромолекули). бо Переважно, експресія СО80О не підвищується більш ніж на 2095, переважно не більш ніж на 1095 та ще більш переважно не більш ніж на 595. Згідно з конкретним переважним варіантом здійснення експресія СО80О не підвищується або знижується у клітинах, що стимулюються Т5І Р та макромолекулою, у порівнянні з клітинами, які стимулюються тільки Т5І Р.

Згідно з конкретним варіантом здійснення макромолекули, які не підвищують індуковане

ТІ Р дозрівання дендритних клітин, не підвищують експресію СО40 більш ніж на 50 95 у порівнянні зі стимуляцією тільки ТЗІ Р (без макромолекули). Переважно, експресія СО40 не підвищується більш ніж на 25 95, переважно не більш ніж на 10 95 та ще більш переважно не більш ніж на 5 95. Згідно з конкретним переважним варіантом здійснення експресія СЮО40 не підвищується або знижується у клітинах, що стимулюються Т5ІР та макромолекулою, у порівнянні з клітинами, які стимулюються тільки Т5І Р.

Процедури з вимірювання дозрівання дендритних клітин також ілюструються у розділі

Приклади (див. зокрема, приклад 9), та їх можна проводити згідно з будь-яким стандартним способом, відомим будь-якому спеціалісту у даній галузі техніки, зокрема, будь-яким способом, придатним для визначення експресії СО8О та/або СО40 на дендритних клітинах в якості маркера дозрівання дендритних клітин.

Для аналізу властивостей антитіл до СО127 щодо відсутності небажаного посилення передачі сигналу за участі Т5І Р можна використовувати клітини, які експресують Т5І РЕ, такі як про-В-клітини ссавця (такі як ВА/ЕЗ клітини, проілюстровані у даному документі).

Інгібування індукованої ІІ--7 експресії а4-, В7- та а4/р7-інтегринів

Згідно з конкретними варіантами здійснення антитіла (або макромолекули) згідно з даним винаходом інгібують індуковану 1-7 експресію а4-, В7- та а4/рВ7-інтегринів іп міїго. Індукована ЇЇ - 7 експресія а4-, В7- та а4/рВ7-інтегринів, як використовується у даному документі, позначає будь- яке з або обидва з підвищення рівня експресії а4- та р7-інтегринів та підвищення кількості або частки Т-лімфоцитів, які експресують а4-, В7- та/або а4/р7-інтегрини. Інгібування може бути частковим, тобто рівень експресії а4-, Д7- та а4/87-інтегринів у присутності І--7 є підвищеним у порівнянні з фоновим рівнем (тобто рівнем і без антитіла, і без ІІ -7) у присутності антитіл, але підвищений менше, ніж за відсутності антитіл; або інгібування може бути повним, тобто рівень експресії а4-, В7- та а4/87-інтегринів у присутності ІЇ/-7 та антитіла не перевищує фонового рівня.

Згідно з конкретними варіантами здійснення антитіла згідно з даним винаходом інгібують експресію а4-, В7- та/або а4/рВ7-інтегринів іп міго, тобто рівень експресії а4-, В7- та/або а4/87- інтегринів нижче у клітинах, оброблених антитілами (і з ІІ--7, і/або без ІІ -7), ніж в необроблених клітинах (тобто без антитіла або 1І--7). Ступінь інгібування може бути дозозалежним. Інгібування експресії можна виміряти, як наведено у розділі Приклади, причому спеціаліст у даній галузі техніки може адаптувати вимірювання, наприклад, до специфічних антитіл, фрагментів антитіл, або антигензв'язувальних доменів, або інших макромолекул, розкритих у даному документі, та/або до конкретних моделей захворювань, якщо це необхідно.

Згідно з переважними варіантами здійснення антитіла (або макромолекули) згідно з даним винаходом інгібують експресію а4-, В7- та/або а4/рВ7-інтегринів іп мімо. Як використовується у даному документі, ця експресія означає, що (ї) експресія а4-, В7- та/або с4/р7-інтегринів, (ії) кількість та/або частка а4-, В7- та/або а4/В7-позитивних Т-лімфоцитів та/або (ії) приживляння а4-, В7- та/або а4/87-позитивних Т-лімфоцитів знижені у зразках, одержаних з тварин, які оброблені антитілами, порівняно з необробленими тваринами. Як використовується у даному документі, приживляння позначає включення пересадженої тканини або клітин в організм хазяїна, процес, який, як правило, відбувається протягом період часу, що становить від декількох годин до декількох діб. Згідно з конкретними варіантами здійснення тварина являє собою ссавця, зокрема, ссавця, що не є людиною, особливо мишу. Згідно з конкретними варіантами здійснення тварина являє собою людину. Згідно з конкретними варіантами здійснення ефект спостерігається на людських лімфоцитах, які вводять ін'єкцією тварині- реципієнту, переважно, імунодефіцитній миші. Згідно з конкретними варіантами здійснення через два тижні після ін'єкції людських РВМС імунодефіцитним мишам середній відсоток Д7- інтегрин-позитивних Т-клітин знижується щонайменше на 25 95, переважно щонайменше на 50

Фо у оброблених антитілом мишей порівняно з необробленими мишами. Згідно з конкретними варіантами здійснення через два тижні після ін'єкції лодських РВМС імунодефіцитним мишам середній відсоток ВД7-інтегрин-позитивних Т-клітин, що прижилися, знижується щонайменше на 25 96, переважно щонайменше на 50 95 та ще більш переважно щонайменше на 70 95 у оброблених антитілом мишей порівняно з необробленими мишами. Ефект антитіла або макромолекули згідно з даним винаходом можна визначити за допомогою методів, наведених у розділі Приклади, зокрема, у прикладі 16 для експресії а4/8В7-інтегринів та приживляння, бо причому спеціаліст у даній галузі техніки може адаптувати дані методи, якщо це необхідно,

наприклад, до конкретного антитіла, його фрагмента або антигензв'язувального домену або іншої макромолекули та/або до конкретної моделі захворювання.

Інгібітори інтерналізації СО127

Інтерналізація є процесом у клітині, за допомогою якого рецептор клітинної поверхні, такий як СО127, транспортується всередину цитоплазматичного простору клітини (можливо, на/біля поверхні внутрішньоклітинних компартментів або мембран) та, отже, більше не доступний з позаклітинного простору, тобто інтерналізований рецептор не може безпосередньо контактувати з лігандом у позаклітинному просторі. Ліганд, або природний ліганд рецептора, або будь-який штучний ліганд або інша молекула, зв'язана з рецептором, може інтерналізуватися разом із рецептором. Більшість рецепторів піддаються постійній інтерналізації, та їх експресія на клітинній поверхні зберігається постійною або внаслідок заміни інтерналізованих та зруйнованих рецепторів наново синтезованими/дозрілими рецепторами, або внаслідок прямого повернення, тобто транспорту інтерналізованого рецептора назад на клітинну поверхню.

Деякі стимули можуть приводити до підвищеної частоти інтерналізації та/або зниженої частоти заміни/лповернення, таким чином приводячи до сумарного зменшення експресії рецептора на клітинній поверхні. Як використовується у даному документі, індукована 1-7 інтерналізація СЮО127 позначає зниження експресії СО127 на клітинній поверхні, індуковане присутністю 1-7 (або що спостерігається у присутності І--7) у позаклітинному середовищі, яке спостерігається іп омйго опісля обмеженого періоду інкубування з метою виключення довготривалих ефектів, таких як знижувальна регуляція транскрипції. Зазначений обмежений період, як правило, становить порядку десятків хвилин, переважно менш ніж 2 години, більш переважно менш ніж 1 годину та ще більш переважно 45 хвилин або менше, 30 хвилин або менше або 15 хвилин або менше.

Згідно з переважним варіантом здійснення антитіло згідно з даним винаходом інгібує індуковану ІЇ/-7 інтерналізацію СО127. Отже, при інкубуванні з антитілом згідно з даним винаходом присутність ІЇ-7 не індукує зниження експресії СО127 на клітинній поверхні або індукує менш сильне зниження експресії СЮО127 на клітинній поверхні, ніж у клітин, які інкубують без антитіл. Згідно з конкретними варіантами здійснення при інкубуванні з антитілами згідно з

Зо даним винаходом рівень експресії СО127 на клітинній поверхні, коли клітини інкубують при 37 "С протягом 15 хвилин з 5 нг/мл І-7, становить щонайменше 8095, переважно щонайменше 90

Фо від рівня експресії на клітинній поверхні у клітинах, які інкубують без ІЇ/-7. Експресію на клітинній поверхні переважно вимірювали іп міго після обмеженого періоду, як зазначено вище.

Окрім того, більшість процесів інтерналізації в клітину інгібуються при низькій температурі, ефект зазвичай найкраще спостерігається при фізіологічній температурі, зокрема, 37"С. Тим не менш, також передбачається інкубування клітин при низькій температурі, зокрема, 4"с.

Відомо, що антитіла до рецептора можуть індукувати інтерналізацію рецептора, це означає, що експресія рецептора на клітинній поверхні знижується у присутності антитіла. Це, зокрема, може бути результатом індукції зміни конформації рецептора, яка імітує зміну, індуковану природним лігандом, який індукує інтерналізацію, та цей ефект може залежати від епітопа, що розпізнається антитілами. Як використовується у даному документі, «антитіло індукує інтерналізацію СО127» означає, що клітини, які інкубують у присутності антитіла, проявляють знижену експресію СО127 на клітинній поверхні у порівнянні з клітинами, які інкубують за відсутності антитіла. Експресію на клітинній поверхні переважно вимірюють іп міго після обмеженого періоду інкубування та в температурних умовах, як згадується вище. Згідно з переважним варіантом здійснення антитіло згідно з даним винаходом не індукує інтерналізацію

СО0127. Отже, експресія СО127 на клітинній поверхні у клітин, які інкубують у присутності антитіла, не знижується або не знижується значно порівняно з експресією на клітинній поверхні у клітин, які інкубують в ідентичних в інших відношеннях умовах, але за відсутності антитіла.

Згідно з конкретними варіантами здійснення при інкубуванні при 37 "С протягом 30-45 хвилин у присутності 50 нг/мл антитіла рівень експресії СО127 на клітинній поверхні становить щонайменше 80 95, переважно щонайменше 90 95 від рівня у клітин, які інкубують за відсутності антитіла. Цей ефект можна спостерігати за відсутності ІЇ-7 (як у оброблених антитілом, так і необроблених антитілом клітин), у присутності 1ІІ-7 та/або в обох випадках.

Будь-яка з двох вищеописаних ознак, що відносяться до інтерналізації СО127 (тобто інгібування індукованої 1ІІ--7 інтерналізації або відсутність індукції інтерналізації), може робити внесок у підвищену ефективність антитіл, в той час як комбінація обох ознак, можливо, буде ще більш ефективною. У даному документі розкрито антитіло, що являє собою переважний варіант здійснення, причому у присутності як ІЇ/-7, так ії зазначеного антитіла експресія СО127 на бо клітинній поверхні не знижується значно. Згідно з такими переважними варіантами здійснення після 45-хвилинного інкубування у присутності 50 нг/мл антитіла, що включає 15 хвилин у присутності 5 нг/мл ІЇ-7, при 37"С рівень експресії СЮО127 на клітинній поверхні становить щонайменше 8095, переважно щонайменше 9095 від цього рівня в контрольних клітинах, які інкубують у середовищі, що не містить антитіло або І! -7.

Порушення взаємодії СО127 - ус-ланцюг

Згідно з конкретним варіантом здійснення макромолекула, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, згідно з даним винаходом може порушувати зв'язування

СОр127 з ус-ланцюгом у 1--7-К. Це означає, що в умовах (зокрема, хімічних та фізичних умовах), коли СО127 та ус-ланцюг зв'язуються разом за відсутності антитіла та, зокрема, у присутності

І/-7, присутність антитіла значно знижує зазначене зв'язування. Згідно з конкретними варіантами здійснення у присутності антитіла та І/-7 СО127 не зв'язується з ус. Зокрема, у присутності антитіла та 1ІЇ/-7 кількість ус-ланцюга, який виявляється зв'язаним (або який зв'язався) з СО127 становить менш ніж 80 95, переважно менш ніж 5095, ще більш переважно менш ніж 25 95 або 1095 від кількості, яка зв'язалася за відсутності антитіла (або у присутності іншого антитіла до СО-127, такого як МО707-13) в ідентичних в інших відношеннях умовах, зокрема, у присутності ІЇ/-7. Таку ознаку антитіла можна оцінювати, зокрема, за допомогою методів спільного імуноосадження, добре відомих спеціалісту у даній галузі техніки для дослідження взаємодії білків та проїлюстрованих у даному документі в прикладі 21. Зокрема, клітини можна інкубувати у присутності або за відсутності досліджуваного антитіла, потім солюбілізувати в умовах, які забезпечують можливість збереження білкових комплексів, та одержаний у результаті лізат можна піддати імуноосадженню з використанням антитіла до

СОр127, а присутність ус у комплексі, що містить СО127 та піддається імуноосадженню можна оцінювати за допомогою вестерн-блотингу з використанням антитіл до ус (та навпаки, імуноосадження можна здійснювати з використанням антитіл до ус, а присутність СО127 можна оцінювати з використанням антитіл до СО12 7).

Один спосіб одержання таких антитіл полягає в індукції утворення зазначених антитіл до епітопа, що містить послідовності з сайту 25 у СО127, або в доборі антитіл, які розпізнають такий епітоп. Дійсно, зв'язування антитіла з цим сайтом, критично важливим для взаємодії з ус, імовірно, порушує взаємодію ус з СО127, наприклад, за рахунок конкуренції або стеричної невідповідності.

Також видається можливим, зокрема, добір антитіл, які мають цю бажану ознаку, з-поміж антитіл до СО127, наприклад, з бібліотеки антитіл (у тому числі, коли дана бібліотека не одержана з використанням імуногену, що містить послідовності сайту 25) за допомогою традиційних процедур скринінгу, які відомі спеціалісту у даній галузі техніки та легко адаптуються для такої мети. Зокрема, наприклад, СО127 (або тільки його позаклітинний домен) може бути зв'язаний з 9б6-лунковими планшетами або подібними підкладками, які зазвичай використовуються для такого скринінгу. Антитіла, що складають бібліотеку, можна додавати окремо, кожне в одну лунку, і ус-ланцюг можна додавати в кожну лунку. Після промивання планшетів можна досліджувати присутність ус в кожній лунці, наприклад, за допомогою методів, заснованих на флуоресценції. В лунках, що містять антитіло з бажаною ознакою, не виявлявся ус (або виявлялися його малі кількості). Очевидно, що можливо модифікувати дану процедуру, наприклад, навпаки, нанести антитіла на тверду підкладку у вигляді окремих плям; забезпечити можливість зв'язування СО127 з нанесеними у вигляді плям антитілами та забезпечити можливість зв'язування ус-ланцюга з іммобілізованими таким чином ланцюгами СО127.

Антагоніст по відношенню до взаємодії ІІ--7 - І -78А

Згідно з конкретним варіантом здійснення, макромолекула, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, згідно з даним винаходом додатково характеризується антагоністичними властивостями по відношенню до інтерлейкіну 7 (1-7), тим самим протидіючи доступу, тобто зв'язуванню 1-7 з СО127, на СЮО127-позитивних клітинах.

Вираз "антагоністичні властивості по відношенню до взаємодії ІІ -7-І/-7К" означає, що антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти згідно з даним винаходом, які цілеспрямовано впливають на ІІ -7Кальфа, мають ефект, що полягає в обмеженні доступності рецептора 1-7, який експресується на СО127-клітинах, особливо на людських ефекторних Т-клітинах, зокрема, на людських Т-клітинах пам'яті, для його партнера по утворенню зв'язку, ІЇ/-7, особливо людського 1-7. У результаті протидії зв'язуванню І! -7 антитіла згідно з даним винаходом або їх функціональні фрагменти приводять до лімфопенії, запобігаючи залежному від І--7 утворенню

Т-клітин в тимусі.

Антагоністичні властивості можуть являти собою, зокрема, антагонізм по відношенню до передачі сигналу за участі І -7К, індукованої 1-7. Антагоніст передачі сигналу за участі І -7В, бо індукованої 1/-7, можна ідентифікувати за допомогою вимірювання інгібування фосфорилювання 5ТАТ5, як описано у розділі Приклади. Індуковане 1І--7 фосфорилювання

ЗТАТЬ є маркером активації ІІ -7К, та антитіло, що протидіє взаємодії 1І--7-ІЇ -7К, як очікується, знижує індуковане 1-7 фосфорилювання 5ТАТ5.

Згідно з конкретними варіантами здійснення макромолекула згідно з даним винаходом являє собою антагоніст передачі сигналу за участі І-7К, індукованої 1-7. Згідно з конкретним варіантом здійснення макромолекула згідно з даним винаходом інгібує індуковане 1-7 фосфорилювання З5ТАТ5. Згідно з переважними варіантами здійснення інгібування фосфорилювання ЗТАТ5 становить більш ніж 50 95 при концентраціях антитіла до 50 нг/мл, та/або інгібування фосфорилювання ЗТАТ5 становить більш ніж 8095 при концентраціях антитіла до 100 нг/мл. Інгібування фосфорилювання ЗТАТ5 можна оцінити за допомогою методів, відомих спеціалісту у даній галузі техніки, та, зокрема, за допомогою методу, наведеного у розділі Приклади (зокрема, у прикладі 3).

Антагоніст по відношенню до зв'язування Т5І Р

Оскільки антитіла згідно з даним винаходом зв'язуються з СЮО127 в І--7К, вони також можуть зв'язуватися з СЮО127 в Т5І РЕ, та вони можуть інгібувати зв'язування Т5І Р з Т5І РЕ, зокрема, за рахунок стеричної невідповідності та/або за рахунок конкуренції у спільних сайтах зв'язування. Інакше кажучи, антитіла згідно з даним винаходом можуть проявляти антагоністичну активність по відношенню до зв'язування Т5І Р.

Інгібітор індукованого Т5І Р продукування ТАКС

Згідно з конкретним варіантом здійснення антитіла згідно з даним винаходом можуть інгібувати індуковане Т5І Р продукування ТАКС у СО127-позитивних клітин. Як згадується вище, стимульовані Т5ІР дендритні клітини продукують підвищені рівні ТАКС. Це може бути результатом їх зв'язування з Т5І РЕ та їх потенційної дії в якості антагоністів зв'язування Т5ЇІ Р.

Згідно з конкретним варіантом здійснення антитіла згідно з даним винаходом та їх антигензв'язувальні фрагменти піддають добору за їх здатністю не підвищувати дозрівання (причому дозрівання визначається, наприклад, підвищенням експресії маркера клітинної поверхні СО40 та/або СОВ80).

Рівень індукованого Т5І Р продукування ТАКС може бути нижчим у клітин, оброблених Т5І Р разом з антитілами до СО127 або їх фрагментами або химерними молекулами, які описані у

Зо даному документі, ніж у клітин, оброблених тільки Т5І Р. Інакше кажучи, макромолекули згідно з даним винаходом можуть являти собою інгібітори індукованого Т5ЗІР продукування ТАКС.

Згідно з варіантом здійснення даного винаходу антитіло або його фрагмент або химерна молекула, які описані у даному документі, знижують рівні продукування ТАКС. Згідно з конкретним варіантом здійснення даного винаходу рівень продукування ТАКС у клітинах, оброблених Т5І Р та антитілом, фрагментом або химерною молекулою знижується більш ніж на 1095, переважно більш ніж на 2095 у порівнянні з рівнем у клітинах, оброблених тільки Т5І Р, при концентраціях антитіла до 1 мкг/мл. Вимірювання продукування ТАКС ілюструється у розділі

Приклади (зокрема, в прикладі 9), та його можна виконувати на СО127-позитивних імунних клітинах, зокрема, дендритних клітинах, зі зразка крові з використанням стандартного методу, відомого спеціалісту у даній галузі техніки.

Цитотоксична активність

Згідно з конкретним варіантом здійснення даного винаходу антитіла згідно 3 даним винаходом або їх антигензв'язувальні фрагменти, спрямовані на молекулу СО127, яка присутня в рецепторі 1-7, характеризуються додатковою властивістю, що полягає у цитотоксичності по відношенню до людських клітин, особливо людських Т-клітин, які експресують зазначений рецептор. Людські клітини, що експресують СО127 у вигляді ланцюга рецептора ІІ -7, які є мішенями антитіл згідно з даним винаходом та їх фрагментів, являють собою в основному Т- лімфоцити, а точніше, вони являють собою субпопуляції ефекторних Т-лімфоцитів, що включають у себе наївні Т-клітини та Т-клітини пам'яті, але не являють собою регуляторні Т- клітини (Тгед), особливо, не являють собою спочиваючі натуральні Тгед. Т-клітини пам'яті утворюються у результаті праймування антигеном та визначаються, в основному, за своїми функціональними характеристиками, у тому числі за здатністю піддаватися проліферації при вторинній імунній відповіді після повторної активації та диференціювання у вторинні ефекторні клітини та клітини пам'яті. Аналогічно, рецептор Т5І Р, який являє собою мішень (у вигляді комплексу, що включає в себе альфа-ланцюг 1 -7-К), регулює диференціювання Т-хелперних лімфоцитів, В-клітин та дендритних клітин.

Згідно з варіантом здійснення даного винаходу антитіла та їх антигензв'язувальні фрагменти, що характеризуються «цитотоксичною активністю по відношенню до Т-клітин» або цитотоксичними властивостями (цитотоксичні антитіла), викликають скорочення популяції 60 ефекторних Т-клітин внаслідок цитолізу цих клітин, та, відповідно, кількість цих клітин знижується при їх введенні. Тим не менш, ці антитіла не змінюють субпопуляцію регуляторних

Т-клітин або не змінюють її в значній мірі, дозволяючи Тгед клітинам виконувати свою функцію.

В цьому контексті, згідно з конкретним варіантом здійснення спостерігалося, що частка регуляторних Т-клітин (Тгтед) порівняно з ефекторними Т-клітинами (Тей) зростає після введення антитіл згідно з даним винаходом. Згідно з конкретним варіантом здійснення антитіла згідно з даним винаходом забезпечують можливість зазначеного зростання приблизно на 10 95 або більше. Згідно з конкретним варіантом здійснення підвищення частки Тгед порівняно з Теї становить приблизно 20 95.

Згідно з конкретним варіантом здійснення даного винаходу цитотоксичні антитіла проявляють антитілозалежну клітинну цитотоксичність (АОСС). Згідно з іншим варіантом здійснення антитіла згідно з даним винаходом не характеризуються властивостями АОСС.

Потенціал антитіла до АОСС вважається позитивним, коли специфічна цитотоксичність перевищувала 10 95. Властивості АОСС можна оцінити в аналізі АОСС, такому як аналіз, описаний у розділі Приклади (зокрема, в прикладі 10). Якщо антитіло являє собою щуряче антитіло, ефекторні клітини, що використовуються в аналізі АОСС, являють собою ГАК (лімфокін-активовані кілери) клітини щура. Якщо антитіла є гуманізованими, аналіз АОСС можна виконувати на людських МК-клітинах.

Антитіла згідно з даним винаходом, які характеризуються властивостями як цитотоксичності, так і антагонізму по відношенню до СО127-позитивних клітин, забезпечують можливість кумулятивних ефектів від цих властивостей по відношенню до скорочення кількості ефекторних

Т-клітин, особливо Т-клітин пам'яті, тим самим забезпечуючи можливість більш сильного скорочення (вичерпання пулу СО127:-клітин) та відповідного зниження кількості Т-клітин- мішеней.

У абзацах вище, а також у розділі Приклади описується те, як досліджувати ці функціональні характеристики. В наступних розділах будуть детально описуватися різноманітні структурні характеристики та можливі модифікації антитіл, або фрагментів, або химерних молекул. З урахуванням цих вказівок спеціаліст у даній галузі техніки буде здатний одержати антитіла або фрагменти з нижченаведеними структурними характеристиками разом із бажаними функціональними характеристиками, зокрема, виходячи з антитіла, яке має бажані

Зо функціональні характеристики, такого як М1382, оскільки в деяких випадках можна спрогнозувати, що перейняття деяких зі структурних ознак не буде модифікувати функціональні ознаки, талабо за допомогою аналізу щодо втрати функціональних характеристик після введення нової структурної характеристики. Більш того, згідно з розкриттям у даному документі епітопа, що розпізнається антитілом, розробка інших антитіл, у яких присутні ті ж функціональні ознаки, є стандартною процедурою, оскільки антитіла, утворення яких індукують проти однакового або подібного епітопа, можна піддавати добору щодо їх здатності викликати подібні ефекти при зв'язуванні з СО127. Більш того, у даному документі розкрито нескладні процедури аналізу, спеціаліст у даній галузі техніки може використовувати ці аналізи для добору підходящих антитіл.

Згідно з переважним варіантом здійснення даного винаходу макромолекула являє собою

М1382 або антитіло, що має щонайменше один з СОК М13В2, або фрагменти являють собою фрагменти М13В82. Відповідно, даний винахід відноситься до антитіла або його фрагменту, МН яких містить щонайменше одну з наступних амінокислотних послідовностей або один з їх переважних гуманізованих варіантів, описаних нижче: ее МНОСОВІ 5ЕО ІЮ Мо:10; е МНОСОВ2 5ЕО І Мо:12; є МНОСОВЗ 5ЕО І Мо:14; та/або МІ. яких містить щонайменше одну з наступних амінокислотних послідовностей або один з їх переважних гуманізованих варіантів, описаних нижче: а М СОВІ 5ЕО ІО Мо:16; а М СОВ2 ЗЕ Ю Мо:18; ае М СОВЗ 5ЕО І Мо:20.

Згідно з конкретним варіантом здійснення макромолекула містить щонайменше 2, 3, 4 або 5 з послідовностей СОК М1382, тобто МНСОКІ 5ЕО ІЮ Мо:10, МНСОН2 5ЕО ІО Мо:12, УНСОВЗ

ЗЕО ІО Мо:14, МІСОКІ 5ЕО ІЮО Мо:16, МЕСОК2 5ЕО ІЮ Мо:18 та МІСОКЗ 5ЕО ІО Мо:20, будь- яку кількість з яких можна замінити одним з їх переважних гуманізованих варіантів, описаних нижче. Згідно з конкретним варіантом здійснення макромолекула містить усі шість послідовностей СОК М13В82, будь-яку кількість з яких можна замінити одним з їх переважних гуманізованих варіантів, описаних нижче. Згідно з конкретними варіантами здійснення 60 макромолекула містить МН-ланцюг, що має амінокислотну послідовність БЕО ІЮ Мо:22, та/або

МІ-ланцюг, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Мо:24. Згідно з конкретними варіантами здійснення макромолекула містить важкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність зЕО ІЮ

Мо:2 та/або 5ЕО ІО Мо:б, та/або легкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ

Мо:4. Інші конкретні варіанти здійснення, які відносяться до МН- та Мі -ланцюгів, являють собою гуманізовані варіанти, розкриті нижче. Згідно з конкретним варіантом здійснення константний ланцюг має послідовність Ес-ланцюга щурячого Ідс1і з фіг. 12 (Опіргої Р20759) та/або послідовність ЗЕО ІЮ Мо:34.

Фрагменти "Антигензв'язувальний фрагмент" антитіла згідно з даним винаходом являє собою частину антитіла, тобто молекулу, що відповідає частині структури антитіла згідно з даним винаходом, яка проявляє антигензв'язувальну здатність по відношенню до альфа-ланцюга рецептора 1-7 для людського 1-7, можливо, в його нативній формі; такий фрагмент, особливо, проявляє таку ж або практично таку ж специфічність зв'язування з антигеном щодо зазначеного антигену у порівнянні зі специфічністю зв'язування з антигеном у відповідного чотириланцюгового антитіла.

Переважно антигензв'язувальні фрагменти характеризуються аналогічною афінністю зв'язування, що й відповідні 4-ланцюгові антитіла. Тим не менш, антигензв'язувальний фрагмент, який характеризується зниженою афінністю зв'язування антигену порівняно з відповідними 4-ланцюговими антитілами, також охоплюється даним винаходом.

Антигензв'язувальну здатність можна визначити за допомогою вимірювання афінності антитіла та фрагмента, що розглядається. Ці антигензв'язувальні фрагменти можна також назвати функціональними фрагментами антитіл.

Антигензв'язувальні фрагменти антитіл являють собою фрагменти, які містять їх гіперваріабельні домени, що позначаються СОК (ділянки, що визначають комплементарність), або їх частина(частини), які охоплюють сайт розпізнавання для антигену, тобто ІЇ-7Ка для людського ІІ--7, тим самим визначаючи специфічність розпізнавання антигену. Кожний легкий та важкий ланцюг (відповідно, МІ та МН) у чотириланцюговому імуноглобуліні має три СОК, які позначаються МІ-СОВІ, МІ-СОВ2, МІ-СОКЗ та МН-СОВІ, МН-СОВ2, МН-СОКЗ, відповідно.

Отже, даний винахід відноситься, зокрема, до фрагментів антитіл згідно з даним винаходом, які містять або складаються з усіх СОК або набору СОК з числа МІ-СОВ1 (5ЕО ІО Мо:16), МІ -СОВ2

Коо) (ЗЕО ІО Мо:18), МІ-СОКЗ (ЗЕО ІЮ Мо:20) та МН-СОВІ1 (5ЕО ІЮ Мо:10), МН-СОВ2 (5ЕО ІЮ Мо 12) та МН-СОКЗ (ЗЕО ІО Мо:14), їх гуманізованих варіантів, розкритих нижче, або їх функціональних частин, тобто частин, які проявляють бажану специфічність зв'язування, переважно з високою афінністю по відношенню до ІЇ-7Ка для людського 1-7.

Конкретні антигензв'язувальні фрагменти згідно з даним винаходом являють собою фрагменти МН-ланцюга антитіла згідно з даним винаходом, у яких об'єднані його СОКІ, СОК2 та СОКЗ домени, зокрема, домени, які мають амінокислотну послідовність, розкриту у даному документі, у тому числі гуманізовані варіанти, розкриті нижче. Інші фрагменти згідно з даним винаходом являють собою фрагменти Мі -ланцюга антитіла згідно з даним винаходом, у яких об'єднані його СОКІ, СОМК2 та СОКЗ домени, зокрема, домени, які мають амінокислотну послідовність, розкриту у даному документі, у тому числі гуманізовані варіанти, розкриті нижче.

Фрагменти, які містять або складаються з МН-СОМКЗ та/або МІ -СОМКЗ, зокрема, таких, що мають амінокислотну послідовність, розкриту у даному документі, у тому числі гуманізовані варіанти, розкриті нижче, або їх функціональні частини, є особливо переважними, коли СОКЗ ділянки виявляються детермінантами специфічності розпізнавання антигену.

Спеціаліст у даній галузі техніки буде здатний визначити розташування різних ділянок/доменів антитіл, виходячи зі стандартних визначень, наведених у зв'язку з цим, включаючи еталонну систему нумерації (Мапіп, 2001), або виходячи з системи нумерації за

Кабаї (Кабаї єї аї., 1992), або за допомогою застосування ІМТ алгоритму «сойПег де регіє» (Перл. тд ога/МаТіпаех/Сої ет. пІті, І еїтапс сеї аї!., 1999). У зв'язку з цим, для визначення послідовностей згідно з даним винаходом варто зазначити, що розмежування ділянок/доменів може змінюватися від однієї еталонної системи до іншої. Відповідно, ділянки/домени, які визначені згідно з даним винаходом, охоплюють послідовності, в яких проявляються зміни у довжині або локалізації послідовностей, що розглядаються, у межах повнорозмірної послідовності варіабельних доменів антитіл, які становлять приблизно /-1095.

Окрім того, деімунізуючі залишки можуть бути присутні у СОК доменах варіабельної ділянки в антитіл або їх антигензв'язувальних фрагментів. Згідно з конкретним варіантом здійснення антитіло або його фрагмент є деімунізованим.

Виходячи зі структури чотириланцюгових імуноглобулінів, антигензв'язувальні фрагменти можна, таким чином, визначити за допомогою порівняння з послідовностями антитіл у 60 доступних базах даних та у джерелах із рівня техніки (Магійп, 2001) та, особливо, за допомогою порівняння розташування функціональних доменів у цих послідовностях, ураховуючи, що положення каркасних та константних доменів добре визначені для різних класів антитіл, особливо для |дсС, зокрема, для дос ссавців. Таке порівняння також включає дані, що відносяться до З-вимірних структур антитіл.

З метою ілюстрації конкретних варіантів здійснення даного винаходу антигензв'язувальні фрагменти антитіла, які містять варіабельні домени, що містять СОК зазначеного антитіла, охоплюють Ем, азЕм, зсЕм, Раб, Раб", К(аб)2, які добре визначені в джерелах (КарБбаї еї аї., 1992), (Мапйіп, 2001), а також (ОєїЇме5 еї аІ., 2011). Ем фрагменти складаються з МіІ- та МН-доменів антитіла, зв'язаних разом за рахунок гідрофобних взаємодій; у 45Ем фрагментах гетеродимер

МН.МГ. стабілізується дисульфідним зв'язком; у 5сЕм фрагментах МІ- та МН-домени з'єднані один з одним за допомогою гнучкого пептидного лінкера, утворюючи таким чином одноланцюговий білок. Бар фрагменти являють собою мономерні фрагменти, які можна одержати за допомогою розщеплення антитіла папаїном; вони містять повний І -ланцюг та МН-

СНІ фрагмент Н-ланцюга, зв'язані разом за допомогою дисульфідного зв'язку. Е(ар)2 фрагмент можна одержати за допомогою розщеплення антитіла пепсином нижче дисульфідного зв'язку в шарнірній ділянці; він містить два Бар' фрагменти та додатково частину шарнірної ділянки молекули імуноглобуліну. Гар' фрагменти можна одержати з Е(ар)2 фрагментів за допомогою розрізання дисульфідного зв'язку в шарнірній ділянці. Е(аб)2 фрагменти є бівалентними, тобто вони містять два антигензв'язувальні сайти, подібно до нативної молекули імуноглобуліну; з іншого боку, Ем (димер МН-МІ, що складає варіабельну частину Раб), а5Ем, 5сЕм, Раб та Рар' фрагменти є моновалентними, тобто вони містять один антигензв'язувальний сайт.

Химерні антитіла

Згідно з іншим варіантом здійснення даного винаходу антитіла є модифікованими та у результаті являють собою химерні антитіла, що містять домени або нитку(нитки) амінокислотних залишків із різних антитіл, зокрема, антитіл, одержаних із тварин різних видів, об'єднані разом у функціональному антитілі. Згідно з конкретним варіантом здійснення макромолекула згідно з даним винаходом являє собою химерне антитіло, що складається зі збірки фрагментів антитіла щонайменше з двох різних видів. Згідно з конкретним варіантом здійснення химерне антитіло містить константну ділянку людського антитіла. Такі константні ділянки ілюструються у прикладах Ес фрагментами С1 (ЗЕО ІЮ Мо:26), або Ес фрагментами 54 (ЗЕО ІЮ Мо:28), або Сі фрагментом капа-ланцюга (ЗЕО ІЮ Мо:30). В якості альтернативи, можна застосовувати людські Ес фрагменти, які наведені на фіг. 12 (піргої РО1857, Опіргої

РО1859, Опіргої РО1861) та/або мають послідовності ФЕО ІЮО Мо:31, 5ЕО ІЮО Мо:32, 5ЕО ІЮ Мо:33 або ЗЕО ІЮ Мо:112. Згідно з конкретним варіантом здійснення химерне антитіло містить варіабельну ділянку з антитіла гризуна та константну ділянку з людського антитіла. Згідно з конкретним варіантом здійснення химерне антитіло містить МН-ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ

Мо:г2 (М1382-41т-МН-Есб1т(ЕЗЗЗА)) або послідовністю 5БО І Моб (М1382-с4т-УН-

Есб4пт(5228Р)) та Мі -ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮО Мо:4 (М1382-С21 т-МІ -СІ Карра).

Афітини, антикаліни та інші міметики антитіл

Макромолекули згідно з даним винаходом також містять штучні білки зі здатністю зв'язуватися з антигенами, імітуючи таку здатність антитіл, які також називаються у даному документі антигензв'язувальним міметиком антитіла. Такі білки включають афітини та антикаліни. Афітини являють собою штучні білки зі здатністю до селективного зв'язування з антигенами. В плані структури вони походять від ДНК-зв'язувального білка Зас7а, який було виявлено у Би!ПМоЇори5 асідосаїдагіи5, мікроорганізму, що відноситься до домену архей.

Розташовуючи у довільному порядку амінокислоти на поверхні Зас7д, яка бере участь у зв'язуванні, наприклад, утворюючи варіанти, які відповідають випадковим замінам 11 залишків на поверхні Зас7й, що бере участь у зв'язуванні, можна створити бібліотеку афітинів та піддати одержану у результаті бібліотеку білків раундам рибосомного дисплею, афінність може бути спрямована на різноманітні мішені, такі як пептиди, білки, віруси та бактерії. Афітини являють собою міметики антитіл, та їх розробляють в якості інструментів у біотехнології. Їх також використовували в якості специфічних інгібіторів для різноманітних ферментів (Ктепепбгіпк еї аІ., 2008). Спеціаліст у даній галузі техніки легко зможе розробити афітини з необхідними властивостями зв'язування з використанням способів, відомих в рівні техніки, зокрема, розкритих у патентній заявці ММО2008068637 та у вищенаведеній публікації, зокрема, створення бібліотек для фагового дисплею та/або рибосомного дисплею та їх скринінг із використанням антигену, який розкрито у даному документі. Антикаліни являють собою штучні білки, які здатні до зв'язування з антигенами, або з білками, або з малими молекулами. Вони являють собою міметики антитіла, одержані з людських ліпокалінів, які являють собою родину природних бо зв'язувальних білків. Антикаліни є приблизно у вісім разів меншими, причому їх довжина становить приблизно 180 амінокислот, а маса приблизно 20 кДа (ЗКеїта, 2008). Було створено бібліотеки фагового дисплею антикалінів, які забезпечують можливість скринінгу та добору, зокрема, антикалінів із властивостями специфічного зв'язування. Спеціаліст у даній галузі техніки легко зможе розробити афітини з необхідними властивостями зв'язування з використанням способів, відомих в рівні техніки, зокрема, розкритих у європейському патенті

ЕР1270725 ВІ, патенті США 58536307 В2, (5спПІепибег апа 5Кеїта, 2002) та у вищенаведеній публікації, зокрема, створення бібліотек для фагового дисплею та/або рибосомного дисплею та їх скринінг із використанням антигену, який розкрито у даному документі. Як антикаліни, так і афітини можна одержувати у ряді експресійних систем, що включає бактеріальні експресійні системи. Отже, даним винаходом передбачаються афітини, антикаліни та інші подібні міметики антитіл з ознаками антитіл, описаних у даному документі, зокрема, у тому, що стосується зв'язування з СО127, відсутності індукції та/або інгібування інтерналізації СО127, дозрівання рес, причому всі вони передбачаються в якості макромолекул згідно з даним винаходом.

Гуманізація

Згідно з конкретним варіантом здійснення макромолекули в згідно з даним винаходом являють собою гуманізовані антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти. Відповідно, оскільки спочатку вони були одержані у тварин, особливо у гризунів та, зокрема, у щурів після імунізації тварин та одержання моноклональних антитіл з гібридоми, у антитіл згідно з даним винаходом модифікують послідовності їх МН та/або МІ за допомогою заміни амінокислотних залишків в каркасній області та, необов'язково, додатково в послідовностях СОК. Гуманізацію можна здійснювати за допомогою рекомбінації поверхневих залишків або за допомогою СОК- прищеплення згідно з відомими методиками. Рекомбінації поверхневих залишків, зокрема, досягають за допомогою заміни залишків з гризуна на людські амінокислотні залишки. Заміну виконують таким чином, щоб зберігалася структура каркасної області вихідного антитіла, а також презентування СОК, тим самим забезпечуючи можливість того, що взаємодії каркасних областей та СОК у антитілі, яке було піддане рекомбінації поверхневих залишків, зберігають нативну конформацію поверхні, що контактує з антигеном для того, щоб у антитіла зберігалася афінність зв'язування з антигеном.

Переважні варіанти здійснення антитіла згідно з даним винаходом представлені

Зо гуманізованими варіантами антитіла М1382 (щурячого), що містить наступні легкі та важкі ланцюги:

Важкий ланцюг М13В2-п1, що має послідовність ЗЕО ІО Мо: 36, в якому послідовності СОК щурячого М13В2 було збережено, як і декілька інших амінокислот за межами послідовностей

СОК, та в якому усі інші амінокислоти співпадають із послідовністю людського антитіла. Цей важкий ланцюг на 87,89о ідентичний важкому ланцюгу людського антитіла. Наступні залишки за межами послідовностей СОК було збережено: М у положенні Н24 за Кабаї (положення 24 на фіг. 23; А - у людській послідовності), М у положенні НЗ7 за Кабаї (положення 37 на фіг. 23; 1- у людській послідовності), А у положенні Н49 за Кабаї (положення 49 на фіг. 23; 5 - у людській послідовності) та Ю у положенні Н7З за Караї (положення 74 на фіг. 23; М - у людській послідовності);

Важкий ланцюг М1382-Нп2, що має послідовність 5ЕО ІО Мо: 38, в якому, порівняно з важким ланцюгом М1382-п1, амінокислоти в положеннях НЗ7, Н49 та Н7З за Караї за межами послідовностей СОК було модифіковано таким чином, щоб вони співпадали з послідовністю важкого ланцюга людського антитіла;

Важкий ланцюг М1382-Нп3, що має послідовність 5ЕО ІО Мо: 40, в якому, порівняно з важким ланцюгом М1382-п2, М у положенні НОб за Караї (положення 100 на фіг. 23) у межах послідовності СОКЗ було мутовано на Г. для того, щоб вона співпадала з послідовністю важкого ланцюга людського антитіла та/або для запобігання посттрансляційній модифікації. Інші можливі залишки для цього положення включають у себе, зокрема, А, Е та І та, більш переважно, Е або І. Відповідно, можливий гуманізований варіант для послідовності СОКЗ у МН

М1382 має послідовність 5ЕО ІЮО Мо: 48.

Легкий ланцюг М1382-п1, що має послідовність 5ЕО ІО Мо: 42, в якому послідовності СОК щурячого М13В2 було збережено, як і декілька інших амінокислот за межами послідовностей

СОК, та в якому усі інші амінокислоти співпадають із послідовністю людського антитіла. Цей легкий ланцюг на 8095 ідентичний легкому ланцюгу людського антитіла. Наступні залишки за межами послідовностей СОК було збережено: М у положенні І 48 за Кабаї (положення 48 на фіг. 24; І - у людській послідовності), ХУ у положенні І 71 за Кабраї (положення 71 на фіг. 24; Е - у людській послідовності) та Е у положенні І 87 за Кабаї (положення 87 на фіг. 24; У - у людській послідовності); 60 Легкий ланцюг М138В2-п2, що має послідовність БЕО ІЮО Мо: 44, в якому, порівняно з легким ланцюгом М1382-п1, амінокислоти в положеннях 148, 171 та 187 за Караї за межами послідовностей СОК було модифіковано таким чином, щоб вони співпадали з послідовністю легкого ланцюга людського антитіла;

Легкий ланцюг М138В2-п3, що має послідовність БЕО ІО Мо: 46, в якому, порівняно з легким ланцюгом М1382-п2, амінокислоти в положеннях 31 (положення 31 на фіг. 24) та/або 152 (положення 53 на фіг. 24) за Кабраї у межах послідовностей СОКІ та СОК2, відповідно, було мутовано з М на СО та з 5 на Т, відповідно, для того, щоб вона співпадала з послідовністю легкого ланцюга людського антитіла та/або для запобігання посттрансляційній модифікації. Інші можливі амінокислоти для положення І 31 включають у себе Н та ЕК. Інші можливі мутації для послідовності СОКЗ включають збереження 5 у положенні І 52 та мутування М у положенні 1 51 (положення 52 на фіг. 24) на О, Н, К або К. Відповідно, можливий гуманізований варіант для послідовності СОКІ у МІ М13В82 має послідовність зЕО ІО Мо: 50, та можливий гуманізований варіант для послідовності СОК2 у МІ М13В82 має послідовність 5ЕО ІЮ Мо: 52.

Мультифункціональні антитіла або фрагменти

Ці основні антигензв'язувальні фрагменти згідно з даним винаходом можна поєднати разом з одержанням мультивалентних антигензв'язувальних фрагментів, таких як діатіла, тріатіла або тетратіла. Ці мультивалентні антигензв'язувальні фрагменти також є частиною ю даного винаходу.

Вищезгадані модифікації можна комбінувати у тих випадках, коли це доречно. Згідно з конкретними варіантами здійснення макромолекула являє собою антитіло, яке являє собою химерне антитіло, або гуманізоване антитіло, та/або деімунізоване антитіло.

Способи одержання антитіл згідно з даним винаходом

Утворення антитіла або його антигензв'язувального фрагмента згідно з даним винаходом переважно індукують, зокрема, щодо молекули, яка являє собою СО127, що експресується людськими Т-клітинами, можливо, їх утворення також індукується імунізацією під дією форми нативного поліпептиду або рекомбінантної молекули.

Імунізацію можна виконувати згідно з протоколом, розкритим у розділі Приклади нижче: рекомбінантну химеру СО127-Ес (10975-НОЗН б5іпо ВіоІодіса!ї, Пекін, Китай) використовували для імунізації щурів, таких як щури лінії ГОШ/С ІдКта, доступної від Левенського університету,

Бельгія). В якості альтернативи, антиген, який містить амінокислотні послідовності ЗЕ ІЮ

Мо:115 (зокрема, який містить ЗЕО ІЮ Мо: 110), талабо ЗЕО ІЮО Мо:117 (зокрема, який містить

ЗЕО ІЮО Мо: 111), тал"або 5ЕО ІЮО Мо:116, причому зазначений антиген додатково містить інші послідовності, зокрема, інші послідовності з людського СЮО127, які розкрито вище, або не який містить їх, можна застосовувати в якості імуногену. Гібридому одержували за допомогою злиття мононуклеарних клітин селезінки з клітинами лінії ГОШ, лінії несекретуючих та стійких до азагуаніну Т-клітин щурячої імуноцитоми ІКУ8ЗЕ, згідно з раніше описаною процедурою (Спаззоих сеї аїЇ., 1988). Гібридому спочатку піддавали скринінгу за ознакою здатності моноклональних антитіл, що секретуються, зв'язуватися з рекомбінантною молекулою СО127 (химера СО127-Ес; 10975-НОЗН, 5іпо Віоіодіса!Ї, Пекін, Китай). Гібридоми потім піддавали скринінгу щодо здатності моноклональних антитіл з неї до зв'язування з СО127, що експресується людськими Т-клітинами та щодо здатності до інгібування індукції фосфорилювання 5ТАТ-5, яке індукується ІЇ-7 в людських лейкоцитах, що проілюстровано на фіг. 1, та щодо їх здатності не підвищувати дозрівання дендритних клітин, індуковане Т5І Р.

Згідно з конкретним варіантом здійснення даного винаходу гуманізоване антитіло згідно з даним винаходом одержують з антитіла, позначеного М13В2, за допомогою мутації однієї або декількох з СОР. ділянок у його варіабельному важкому ланцюзі (МН) та/або у варіабельному легкому ланцюзі (МІ), зокрема, антитіло зберігає щонайменше одну або дві вихідних СОК ділянки з числа СОКЗ, СОК2 та СОКІ ділянок у будь-якому з МН та/або МІ, причому зазначене модифіковане антитіло має менш ніж 1095 мутованих амінокислотних залишків, переважно, один мутований амінокислотний залишок або не має мутованих амінокислотних залишків у СОМ ділянках, які розглядаються окремо, порівняно з вихідною СОКІ, СОМК2 або СОМЗ ділянкою, причому зазначені вихідні СОК ділянки являють собою: й МНООКТ, який має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ Мо 10; іі. УНеоОКа, який має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ Мо 12; іїї. МНООКЗ, який має амінокислотну послідовність ХЕ ІЮ Мо 14; їм. МІ СОН, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Мо:16;

У. МІ СОН, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Мо:18; мі. МІ СОКЗ, який має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Мо:20.

Відповідно, МНСОКЗ може мати амінокислотну послідовність ХЕО ІО Мо: 48; МЕ СОКІ може 60 мати амінокислотну послідовність ЗЕ ІЮО Мо: 50; МІ СОК2 може мати амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 52.

Згідно з конкретним варіантом здійснення антигензв'язувальний фрагмент згідно з даним винаходом являє собою антигензв'язувальний фрагмент антитіла М1382, який є модифікованим, як описано в попередніх абзацах, причому зазначений модифікований антигензв'язувальний фрагмент має менш ніж 1095 мутованих амінокислотних залишків порівняно з вихідним антигензв'язувальним фрагментом.

З урахуванням ідей, забезпечених даним винаходом, для експресії антитіл згідно з даним винаходом спеціаліст у даній галузі техніки буде здатний одержати гібридому або застосувати альтернативні технології, такі як експресійні бібліотеки та експресійні системи, з наступним добором антитіл, що мають структуру таких антитіл, секретованих гібридомою, та які мають їх властивості, зокрема, їх властивості зв'язування та нейтралізації. Бібліотеки КкДНК можна відповідним чином одержати з РНК, що експресується в гібридомі згідно з даним винаходом, та відповідні послідовності можна піддати добору та здійснювати їх експресію. В якості альтернативи, кКДНК, що кодує антитіла згідно з даним винаходом або їх фрагменти, одержують за допомогою синтезу. "Клітини гібридоми" згідно з даним винаходом являють собою клітини, утворені у результаті злиття антитілопродукуючих клітин (В-лімфоцитів) з тварини, яку раніше імунізували вибраним імуногеном, та партнера для злиття, який являє собою клітини мієломи, що забезпечують можливість імморталізації одержаної у результаті злиття клітини. Клітини мієеломи та антитілопродукуючі клітини (В-клітини, такі як спленоцити) можуть мати однакове походження та являють собою еукаріотичні клітини, зокрема, клітини ссавця з однієї й тієї ж тварини. В якості альтернативи, вони можуть мати різне походження, таким чином приводячи до утворення гетерогібридоми. Клітини мієломи, такі як клітини лінії ГО, лінії несекретуючих та стійких до азагуаніну Т-клітин щурячої імуноцитоми ІКУО8З3Е, вибирають з-поміж клітин, які нездатні продукувати імуноглобуліни, для того, щоб забезпечити можливість секреції гібридомою тільки моноклональних антитіл з бажаною специфічністю. Замість щурячої імуноцитоми можна застосовувати інші клітини, придатні для стимуляції АЮСС, такі як описані на наступних сторінках для одержання антитіл за допомогою експресії в рекомбінантних клітинах. Такі клітини переважно являють собою клітини, які характеризуються низькою здатністю до фукозилювання, або клітини, у яких відсутня здатність до фукозилювання.

Одержання гібридоми, придатної для здійснення даного винаходу, виконують згідно з традиційними методиками. У розділі Приклади в даній заявці детально описані варіанти здійснення, конкретні розкриті ознаки яких можна адаптувати до інших клітин, що використовуються в якості партнерів для злиття.

Антигензв'язувальні фрагменти антитіла можна одержати, виходячи з антитіла, особливо, при використанні ферментативного розщеплення згідно з добре відомими методиками, у тому числі розщеплення папаїном або пепсином, або за допомогою будь-якої придатної методики розщеплення. В якості альтернативи, вони можуть експресуватись у клітинах-хазяїнах, модифікованих за допомогою рекомбінації з використанням послідовностей нуклеїнової кислоти, що кодують амінокислотну послідовність зазначених фрагментів, або їх можна синтезувати, особливо, хімічно синтезувати. Відповідно, антитіла згідно з даним винаходом, у тому числі модифіковані антитіла та антигензв'язувальні фрагменти антитіл, також можна одержати за допомогою класичних методик генної інженерії, таких як описані затюбгоок еї аї. (Оеєіпіпдег, 1990) та оновлені версії). Даний винахід, відповідно, відноситься до варіантів поліпептидів УН та МІ, які включають або не включають у себе сигнальний пептид. Сигнальний пептид може бути необхідним під час одержання поліпептидів у клітинах.

У розрахунку на застосування антитіл згідно з даним винаходом або їх функціональних фрагментів для введення пацієнту-людині, може бути вигідним одержання гуманізованих моноклональних антитіл, або химерних моноклональних антитіл, та/або деімунізованих антитіл з антитіл згідно з даним винаходом, які будуть являти собою антитіла тварини, що не відноситься до приматів, такі як проілюстровані у розділі Приклади, особливо, для зниження імунної реакції на зазначені антитіла у хазяїна або пацієнта, що одержує їх. Функціональні фрагменти цих варіантів антитіл можна одержати також, як і гуманізовані, химерні або деїімунізовані варіанти.

Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, які являють собою гуманізоване антитіло, також можна одержати за допомогою заміни амінокислотного залишку(залишків), що присутній(присутні) у константній ділянці(ділянках) варіабельних ланцюгів (МН та/або М) антитіла згідно з даним винаходом, яке не є людським антитілом, на людський амінокислотний залишок(залишки) з відповідним розташуванням у людських антитілах згідно зі стандартним бо визначенням та нумерацією, причому рівень заміни становить від 195 до 2095, зокрема, від 190 до 18 95 залишків у зазначених каркасних ділянках. Зазначені константні ділянки включають у себе такі з каркасних ділянок (Бм/К), визначених у чотириланцюгових антитілах, ідентифікованих, зокрема, згідно з нумерацією за Кабаї.

Конкретні приклади модифікованих антитіл згідно з даним винаходом охоплюють химерні антитіла, гуманізовані антитіла та/або деїімунізовані антитіла.

Конкретне модифіковане антитіло має модифіковані амінокислотні залишки в СОК ділянках, причому зазначена модифікація приводить у результаті до деїмунізації за рахунок втрати Т- клітинних епітопів у варіабельному домені антитіла, що не є людським. Деїімунізацію можна провести після визначення Т-клітинних епітопів у варіабельному домені антитіла, особливо за допомогою іп в5іїсо прогнозування, з наступним введенням точкової мутації в послідовність варіабельних ланцюгів антитіла, яка ліквідує функціональні Т-клітинні епітопи. Згідно з переважним варіантом здійснення даного винаходу модифікація СОК ділянки(ділянок), особливо СОКЗ ділянки, обмежується ступенем, необхідним для деїімунізації з розрахунком на введення в людський організм, наприклад, для зниження аффінності зв'язування Т-клітинних рецепторів з комплексами НІ А-класу П/пептид. Згідно з конкретним варіантом здійснення СОКЗ ділянка(ділянки) МН та/або Мі не є модифікованою(модифікованими). Згідно з ще одним варіантом здійснення ЕК ділянки та/"або СН ділянки також є модифікованими, особливо гуманізованими.

Антитіла в рамках даного винаходу охоплюють, відповідно, антитіло, що характеризується визначеними вище ознаками, яке являє собою гуманізоване антитіло, особливо антитіло, одержане за допомогою заміни амінокислотного залишку(залишків), що присутній(присутні) в каркасній ділянці(ділянках) антитіла згідно з даним винаходом, на людський амінокислотний залишок(залишки) з відповідним розташуванням у людських антитілах згідно зі стандартним визначенням та нумерацією. Рівень заміни амінокислотних залишків у каркасних ділянках та/або у СОК для гуманізації, включаючи деїімунізацію, становить від 1 95 до 20 95, зокрема, від 1 95 до 18 95, залишків в зазначених каркасних ділянках та/або СОК ділянках. Як згадується вище, мішенню гуманізації переважно є каркасні ділянки вихідних антитіл. В деяких випадках гуманізація, в якості альтернативи або доповнення, може торкатися СОК ділянки(ділянок), особливо СОКІ1 та/або СОК2 ділянки(ділянок), та більш конкретно називається деїімунізацією.

Зо Згідно з конкретними варіантами здійснення в кожній СОК ділянці модифікують не більш ніж одну амінокислоту. Приклади гуманізованих та/або деімунізованих антитіл, що походять зі щурячого антитіла М13В82, розкриті у даному документі.

Гуманізацію, отже, можна здійснювати, розглядаючи людські каркасні області легкого ланцюга або важкого ланцюга зародкової лінії, які проявляють найбільш високу ідентичність послідовності з послідовністю антитіла або фрагмента, що не є людськими, та вибираючи амінокислотні залишки, особливо залишки, які проявляються на поверхні в антитіла та підлягають заміні в зазначених антитілі або його фрагменті, що не є людськими, для того, щоб забезпечити відповідність до людського залишку(залишків), що відповідають їм. Згідно з конкретним варіантом здійснення деякі або усі ЕКІ. та/або деякі або усі ЕКН ділянки є повністю людськими, тобто є характерними для людських каркасних послідовностей. Згідно з іншим варіантом здійснення замінними є вибрані залишки в деяких або усіх ЕЕ. ділянках.

Способи гуманізації антитіл також добре відомі в рівні техніки та описані, наприклад,

Кошіедеде еї аЇ. (Едмжага сб. Кошієдде, 1993). Ці способи також можна застосовувати до антигензв'язувальних фрагментів, таких як 5сСЕм. В якості прикладу, спосіб, відомий як «рекомбінація поверхневих залишків», полягає в заміні ряду поверхневих залишків у каркасних ділянках варіабельної ділянки антитіла, що не є людським, на ряд людських поверхневих залишків, в той час як спосіб, відомий як СОК-прищеплення, полягає в переносі СОК з антитіла, що не є людським, у каркасні ділянки людського антитіла. СОК-прищеплення звичайно доповнюють оптимізацією каркасних ділянок, яка полягає в заміні деяких залишків в людських каркасних ділянках з метою оптимізації афінності зв'язування. Стадію оптимізації каркасних ділянок нещодавно спростили завдяки застосуванню комбінаторних бібліотек (Ко5ок еї аї., 1996) (Васа єї а!., 1997).

Даний винахід відноситься, зокрема, до гуманізованих антитіл, одержаних за допомогою

СОВ-прищеплення з щурячого антитіла М1382. З бази даних вибирали людські послідовності

МН та Мі, які мають послідовності з сильною гомологією з послідовностями МН та МІ, відповідно, з щурячого М1382. Послідовності СОК з М1382 прищеплювали на ці людські послідовності. Деякі залишки за межами послідовностей СОК можуть мати значний вплив на розпізнавання антигену або афінність до нього, зокрема, залишки, що знаходяться у безпосередній близькості до СОК, та залишки, відомі як залишки зони Мегпіег. Як детально 60 описано нижче, а також у розділі Приклади, зокрема, у прикладі 12, досліджували декілька варіантів гуманізованих антитіл: найбільш консервативні, в яких зберігались усі щурячі послідовності для СОК та вищезгаданих важливих у плані структури залишків, варіанти, в яких людські послідовності піддавали добору щодо важливих у плані структури залишків, та варіант, найбільш близький до людських послідовностей, в якому, додатково до важливих у плані структури залишків за межами СОК, модифікували декілька залишків усередині СОК з вихідної щурячої послідовності, зокрема, з метою запобігання посттрансляційних модифікацій, таких як окиснення або дезамідування.

В іншій сучасній стратегії, доступній для гуманізації антитіла, зберігають тільки вихідні, які не є людськими, послідовності СОКЗ легкого та важкого ланцюгів, у той час як решту послідовності вибирають з бібліотек людських М-генів, що раніше не піддавалися впливу (Кадег еї а!., 1998).

Химерні, гуманізовані та/або деїімунізовані антитіла згідно з даним винаходом можуть відноситься до будь-якого класу імуноглобулінів, як і немодифіковані антитіла. Переважно, вони відносяться до підкласу класу до, як наприклад, Іде, Ідса2, доз або Ідсаі.

Способи одержання рекомбінантних антигензв'язувальних фрагментів або химерних антитіл за допомогою поєднання варіабельних ділянок антитіла з використанням підходящих лінкерів або з використанням константних ділянок з іншого антитіла відомі в рівні техніки.

Як зазначено, антитіла згідно з даним винаходом являють собою моноклональні антитіла, це означає, що будова цих антитіл є однорідною, особливо ідентичною, за специфічністю зв'язування з антигеном та, відповідно, за будовою варіабельної ділянки. Отже, антитіла можна класифікувати як моноклональні, навіть якщо їх одержують за допомогою методик, альтернативних методикам із використанням гібридоми.

Згідно з іншим варіантом здійснення даний винахід також відноситься до химерної молекули, яка містить антитіло згідно з визначенням, наданим у даному документі, або його антигензв'язувальний фрагмент, причому зазначене антитіло або його функціональний фрагмент є зв'язаними з функціонально відмінною молекулою. Химерна молекула згідно з даним винаходом може являти собою або злитий химерний білок, або кон'югат, одержаний у результаті будь-якого придатного виду прикріплення, у тому числі ковалентного прикріплення, прищеплення, хімічного зв'язування з хімічною або біологічною групою або з молекулою, такою як полімер РЕС або інша захисна група або молекула, придатна для захисту від розщеплення протеазами іп мімо, для поліпшення стабільності та/або періоду напіввиведення антитіла або функціонального фрагмента. Використовуючи аналогічні методики, особливо за допомогою хімічного приєднання або прищеплення, можна одержати химерну молекулу з біологічно активною молекулою, причому зазначена активна молекула вибрана, наприклад, з-поміж токсинів, зокрема, екзотоксину А Рзепдотопах (Кізбегу еї аї., 2011), А-ланцюга рослинного токсину рицину (мап Оо:5іетоці еї аї., 2001) або токсину сапорину (Ріамеї! еї аї., 2006), особливо, терапевтичного активного інгредієнта, вектора (у тому числі, особливо, вектора для білка), придатних для цілеспрямованого впливу антитіла або функціонального фрагмента на конкретні клітини або тканини людського організму, або вона може бути зв'язана з міткою або з лінкером, особливо у випадку, коли використовуються фрагменти антитіла.

Пегілювання антитіл або їх функціональних фрагментів є варіантом здійснення, що становить особливий інтерес, оскільки воно поліпшує умови доставки активної речовини до хазяїна, особливо для терапевтичного застосування. Пегілювання може бути сайт-специфічним для запобігання створення перешкод для сайтів розпізнавання в антитілах або функціональних фрагментах, та його можна здійснювати з використанням РЕС з високою молекулярною вагою.

Пегілювання можна здійснювати за вільними цистеїновими залишками, що присутні в послідовності антитіла або функціонального фрагмента, або за доданими вільними цистеїновими залишками у амінокислотній послідовності антитіла або функціонального фрагмента.

Даний винахід також відноситься до композиції, що містить антитіла або їх функціональні фрагменти, як визначено у даному документі, причому антитіла або їх функціональні фрагменти являють собою однорідну популяцію антитіл або їх функціональних фрагментів або являють собою моноклональні антитіла або їх функціональні фрагменти.

В деяких випадках можливо застосування композиції з продуктів для одержання бажаного ефекту у випадку, коли кожний із продуктів у композиції створює щонайменше один бажаний ефект. У даному випадку, наприклад, видається можливим поєднання молекул, що характеризуються інгібіторним ефектом по відношенню до взаємодії ІІ--7 - ІІ -7Р, та молекул, які характеризуються цитотоксичним ефектом по відношенню до СО127-позитивних клітин. Такі комбінації включені в даний винахід. Важливо, що згідно 3 даним винаходом композиція з продуктів не повинна проявляти синергізм із Т5І Р по відношенню до дозрівання дендритних 60 клітин. Зазвичай передбачається поєднання в комбінацію продуктів, жоден з яких окремо не проявляє синергізм з Т5І Р по відношенню до дозрівання дендритних клітин.

Згідно з конкретним варіантом здійснення даний винахід відноситься до композиції або сукупності сполук, що містять антитіла, фрагменти або химерні молекули, які описані у даному документі, причому зазначена композиція містить (ї) популяцію антитіл або їх антигензв'язувальних фрагментів або химерних молекул, що характеризуються цитотоксичною активністю по відношенню до СО127-позитивних клітин, особливо СО127--Т-клітин, та (ії) популяцію антитіл або їх функціональних фрагментів або химерних молекул, які характеризуються антагоністичними властивостями по відношенню до людського 1-7, ці популяції антитіл або поєднують у суміші, або розділяють та, в даному останньому варіанті, складають для комбінованого або послідовного введення. Антитіла, та/або функціональні фрагменти, та/"або химерні молекули не проявляють синергізм з Т5ІР по відношенню до дозрівання дендритних клітин.

Визначення, наведені у даному документі, особливо, щодо антитіл згідно з даним винаходом, аналогічно, є застосовними до їх антигензв'язувальних фрагментів, за виключенням тих випадків, коли очевидно, що з технічної точки зору це недоречно. Ці визначення також застосовні до макромолекул (зокрема, химерних антитіл або химерних молекул) або композицій, які містять ці антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти або одержані з цих антитіл, які розкрито в даній заявці. Додатково визначається, що з точки зору ідеї або створення антигензв'язувальні фрагменти антитіл згідно з даним винаходом одержані з антитіл, але їх можна одержувати за допомогою різноманітних методик, до яких вдаються для одержання продуктів, що не обов'язково являють собою антитіла.

Даний винахід також відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, що кодує макромолекулу згідно з будь-яким із визначень, наведених у даному документі. Згідно з конкретними варіантами здійснення нуклеїнова кислота згідно з даним винаходом кодує амінокислоту, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮО Мо:2; 5ЕО ІЮ Мо:4; 5ЕО ІЮ Мо:6; 5ЕО ІО Мо:8; 5ЕО

ІЮ Мо:10; 5ЕО ІО Мо:12; 5ЕО ІО Мо:14; 5ЕО ІО Мо:16; 5ЕО 10 Мо:18;55ЄО ІЮО Мо:20; 5ЕО І

Мо:22, ЗЕО ІЮО Мо:24, 5ЕО ІЮ Мо:36, 5ЕО ІО Мо:38, 5ЕО ІО Мо:40, 5ЕО ІО Мо:42, 5ЕО ІО Мо:44,

ЗЕО ІО Мо:46, 5ЕО ІО Мо:48, 5ЕО І Мо:50, 5ЕО ІЮ Мо:52, 5ЕО ІО Мо:54, 5ЕО ІО Мо:56, 5ЕО 10

Мо:110, 5ЕО ІО Мо:111, 5ЕО ІО Мо:86, ЗЕО ІЮ Мо:115, 5ЕО ІО Мо:116 та 5ЕО ІЮО Мо:117. Згідно з конкретними варіантами здійснення нуклеїнова кислота згідно з даним винаходом містить або складається з послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 або 55.

Така нуклеїнова кислота, придатна для одержання макромолекул згідно з даним винаходом, є вибраною, зокрема, з групи наступних: і. полінуклеотид, що кодує МН-ділянку та має послідовність 5ХЕО ІЮ Мо 1, або 5ЗЕО

ІО Мо: 5, або 5ЕО ІЮО Мо:54 або кодує варіабельну ділянку МН-ділянки та має послідовність ЗЕО

ІО Мо:21, або 5ЕО ІО Мо: 35, або 5ЕО ІЮ Мо:37, або 5ЕО ІЮ Мо:39; ії. полінуклеотид, що кодує Мі -ділянку, який має послідовність 5ЕО ІЮ Мо 3, або 5ЕО ІО

Мо: 7, або 5ЕО ІЮ Мо:56, або кодує варіабельну ділянку Мі -ділянки та має послідовність ЗЕО ІЮ

Мо:23, або 5ЕО ІО Мо: 41, або 5ЕО ІЮ Мо:43, або 5ЕО ІЮ Мо:45; й. полінуклеотид, що кодує МНСОКТІ ділянку, який має послідовність 5Е0 ІЮ Мо:9, їм. полінуклеотид, що кодує МНСОКІ ділянку, який має послідовність БЕО ІЮО Мо:11, м. полінуклеотид, що кодує МНСОКЗ ділянку, який має послідовність 5ЕО ІЮ Мо:13 або

ЗЕО ІЮ Мо:47, мі. полінуклеотид, що кодує М СОКІ1 ділянку, який має послідовність 5ЕО ІЮ Мо 15 або

ЗЕО ІЮ Мо:49, мії. полінуклеотид, що кодує М СОК2 ділянку, який має послідовність 560 ІЮО Мо 17 або

ЗЕО ІЮ Мо:51, мії. полінуклеотид, що кодує МІ СОКЗ ділянку, який має послідовність ЗЕО ІО Мо 19.

Даний винахід також відноситься до полінуклеотиду, що має модифіковані нуклеотиди відносно послідовності ХЕО ІЮ Мо 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 або 55, та який: (а) кодує поліпептид, що має амінокислотну послідовність, відповідно, ХЕО ІО Мо 2,4,6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 36, 38, 40, 42, 44, Аб, 48, 50, 52, 54 або 56, та/або (б) характеризується щонайменше 85 95, переважно щонайменше 90 95, більш переважно щонайменше 95 95 та найбільш переважно щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 ідентичністю за всією своєю довжиною з одним з полінуклеотидів, що мають послідовність, відповідно, 5ЕО ІЮО Мо 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53 або 55, та/або бо (с) являє собою фрагмент полінуклеотиду, що має послідовність з послідовності БЕО ІЮ

Мо: 1, 3, 5, 7, 21, 23, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 53 або 55, та кодує поліпептид, який містить антигензв'язувальний фрагмент або який складається з нього.

Полінуклеотиди згідно з даним винаходом також можуть являти собою оптимізовані послідовності, особливо для експресії у клітинах-хазяїнах. Методики оптимізації в даній галузі являють собою традиційні методики.

Фрагменти полінуклеотиду згідно з даним винаходом переважно мають послідовність щонайменше з 9 нуклеотидів, зокрема, щонайменше з 18 нуклеотидів, та є коротшими за послідовність, з якої вони походять, особливо, коротшими за проілюстровані повнорозмірні послідовності МН або МІ, відповідно.

Згідно з конкретним варіантом здійснення полінуклеотиди згідно з даним винаходом переважно можуть містити, крім послідовності, що кодує макромолекулу згідно з даним винаходом, вище послідовності, яка кодує ланцюги антитіла, послідовність, що кодує сигнальний пептид, який забезпечує можливість секреції зазначеного білка при експресії в клітині, що його продукує. Вони також можуть містити одну або декілька послідовностей, що кодують один або декілька маркерних пептидів для виявлення та/або полегшення очищення зазначеного білка.

Даний винахід також відноситься до вектора для клонування та/або для експресії полінуклеотиду, розкритого у даному документі. Згідно з конкретним варіантом здійснення вектор згідно з даним винаходом являє собою плазміду, придатну для клонування та/або експресії у клітинах ссавця, яка містить регуляторні послідовності для транскрипції та експресії.

Даний винахід додатково відноситься до клітин або клітинних ліній, у які було вбудовано за допомогою рекомбінації полінуклеотид згідно з даним винаходом, особливо до клітин або клітинних ліній ссавців або птахів. Наприклад, клітини яєчника китайського хом'ячка, генетично модифіковані для зниження загального фукозилювання. Дійсно, антитіла, у яких відсутнє фукозилювання корової частини, проявляють значно посилену антитілозалежну клітинно- опосредковану цитотоксичність (АОСС) (моп Ногеїгеп еї аї., 2010). Іншим прикладом є клітинна лінія ЕВбб, яка за своєю природою характеризується властивостями слабкого фукозилювання (Оїїмівг еї аї., 2010).

Отже, даний винахід також відноситься до способу одержання антитіла або його

Зо антигензв'язувального фрагмента, який передбачає: (а) одержання гібридоми після імунізації тварини, особливо ссавця, людським альфа- ланцюгом людського рецептора ІЇ/-7, переважно його антигеном, який містить послідовності людського СО127 з послідовностями 5ЕО ІЮ Мо:115 (та/"або 5ЕО ІЮ Мо: 110), талабо 5ЕО ІЮ

Мо:117 (талабо 5ЕО ІЮ Мо: 111), талабо ЗЕО ІЮ Мо:116 (талабо 5ЕО ІЮ Мо:86), причому зазначений антиген містить інші послідовності людського СЮО127 або не містить їх, як розкрито вище, та у випадку, коли це необхідно, бустер-імунізації зазначеної тварини тим же імуногеном, виділення клітин селезінки або лімфатичних вузлів з тварини, що відповідає на імунізацію, та злиття зазначених клітин з клітинами мієломи з виділенням моноклональних антитіл, та/або (б) експресію полінуклеотидів, що кодують такі антитіла, як наприклад, полінуклеотидів, розкритих у даному документі, причому їх нуклеотидна послідовність присутня в рекомбінантній формі у клітинах в умовах, які забезпечують можливість виділення антитіл, та (с) виділення антитіл, що розпізнають епітоп, який визначений у даному документі, зокрема, який містить послідовності з сайту 26 у СО127, та, зокрема, який містить такі послідовності, а також додатково послідовності з домену 01 у СО127, зокрема, антитіл, що характеризуються бажаною афінністю зв'язування по відношенню до альфа-ланцюга людського рецептора І -7.

Згідно з конкретним варіантом здійснення даного винаходу антитіла або їх фрагмент одержують у клітинах, у яких проявляються властивості слабкого фукозилювання, такі як ЕВбб клітини птахів.

Даний винахід також відноситься до способу добору антитіл, що передбачає стадії одержання, можливо, за допомогою одного з способів, описаних у даному документі, антитіл або їх фрагментів, які специфічно зв'язуються з СО127, зокрема, з його антигеном, який розкрито вище, та здійснення добору з-поміж цих антитіл таких, які не підвищують індуковане

Т5І Р дозрівання імунних клітин, зокрема, дендритних клітин, які не індукують інтерналізацію

С0127, та/або які інгібують індуковану 1-7 інтерналізацію СО127, та/або які інгібують іп мійго та/лабо іп мімо експресію с4-, В7- та/або а4/8В7-інтегринів. Добір можна здійснювати з використанням будь-якої з процедур, описаних у розділі Приклади, для аналізу по відношенню до підвищення або зниження індукованої ТОР експресії маркерів клітинної поверхні СО40 та/або СО80, або для аналізу ефектів по відношенню до інтерналізації СО127, або для аналізу ефектів по відношенню до експресії а4-, В7- та а«4/р7-інтегринів. Такі аналізи можна підходящим 60 чином здійснювати, наприклад, у 9б-лункових планшетах для забезпечення можливості швидкого та ефективного скринінгу великої кількості антитіл-кандидатів, та зчитування результатів можна здійснювати за допомогою класичного імуноофарблювання та проточно- цитометричного аналізу. Отже, даний винахід відноситься до способу добору антитіл, їх антигензв'язувальних фрагментів або інших макромолекул, який передбачає або складається з щонайменше однієї з наступних стадій: а. дослідження (наприклад, як описано в прикладі 1, прикладі 2, прикладі 6 та/або прикладі 7) макромолекули зі зв'язувальною здатністю макромолекули по відношенню до СО127, зокрема, по відношенню до його антигену, який розкритий у даному документі; р. дослідження (наприклад, як описано на фіг. 16 та/або в прикладі 5) інтерналізації СО127, індукованої присутністю макромолекули, в клітинах, які експресують СО127; с. дослідження (наприклад, як описано на фіг. 16 та/або в прикладі 5) інгібування макромолекулою індукованої 1ІІ--7 інтерналізації СО127 в клітинах, які експресують СО127; й. дослідження (наприклад, як на фіг. 5, фіг. 6 та/або в прикладі 9) підвищення дозрівання

ОС, індукованого Т5І Р у присутності макромолекули; та необов'язково який передбачає щонайменше одну з наступних стадій: е. дослідження (наприклад, як на фіг. 1, фіг. 2 та/або в прикладі 3) інгібування макромолекулою індукованої ІІ-7 передачі сигналу, зокрема, фосфорилювання 5ТАТ5;

Ї. дослідження (наприклад, як в прикладі 9, на фіг. 5 та/або на фіг. б) інгібування макромолекулою індукованого Т5І Р продукування ТАКС; 9. дослідження (наприклад, як в прикладі 16, на фіг. 19 та/або на фіг. 20) інгібування макромолекулою експресії са4-, В7- та/або а4/В7-інтегринів, зокрема, експресії на клітинній поверхні на Т-лімфоцитах;

А. дослідження (наприклад, як в прикладі 21, на фіг. 28) порушення антитілом зв'язування

СОр127 з ус-ланцюгом, зокрема, в присутності 1Ї--7.

Кожна з цих стадій дослідження супроводжується добором однієї або декількох макромолекул із бажаними функціональними ознаками, які розкрито у даному документі.

Як згадувалося вище, у випадку, якщо бажано, щоб антитіло розпізнавало епітоп, який містить послідовності, які не є суміжними в послідовності СО127, можливо послідовно аналізувати розпізнавання фрагментів епітопа (або зв'язування з ними), що складається (або, по суті, складається) з однієї суміжної послідовності СО127. Наприклад, якщо бажаним є одержання антитіла, що розпізнає епітоп, який містить послідовності ЗЕО ІЮ Мо:115, 5ЕО ІЮ

Мо:116 та 5ЕО ІЮ Мо:117, можливо, по-перше, провести добір антитіл, що розпізнають епітоп, який складається, по суті, з ЗЕО ІЮ Мо:116, а потім, по-друге, вибрати з-поміж антитіл, вибраних у першому доборі, антитіла, що розпізнають епітоп, який складається, по суті, з «ЕО ІЮО Мо:115, а потім вибирати з-поміж антитіл, вибраних у другому доборі, антитіла, що розпізнають епітоп, який складається, по суті, з ЗЕО ІЮО Мо:117. Очевидно, що порядок проведення добору можна модифікувати відносно даного порядку, наведеного виключно в якості прикладу.

Іншою метою даного винаходу є фармацевтична композиція, яка містить макромолекулу згідно з даним винаходом із фармацевтичним носієм, причому зазначена фармацевтична композиція необов'язково додатково містить відмінний активний інгредієнт.

Даний винахід також відноситься до композиції, що містить в якості активного інгредієнта макромолекулу згідно з даним винаходом або фармацевтичну композицію, яка визначена вище, у складі, підходящому для контролю виживання або розмноження позитивних за людським

С0127 клітин, зокрема, позитивних за людським СО127 ефекторних клітин, особливо виживання або розмноження СО127: Т-клітин пам'яті, особливо Т-клітин пам'яті, які являють собою і

Ср127--, і СО8ч-, або які являють собою і СО127:-, і СО4--клітини, при введенні пацієнту-людині.

Згідно з конкретним варіантом здійснення композиція, яка містить макромолекулу згідно з даним винаходом в якості активного інгредієнта, присутня у складі, підходящому для контролю диференціювання та/або дозрівання дендритних клітин при введенні пацієнту.

Композиція згідно з даним винаходом може додатково містити додаткову сполуку, що характеризується терапевтичним імуномодулювальним ефектом, зокрема, по відношенню до клітин, залучених в алергію або аутоїмунну реакцію. З метою ілюстрації, ілюстративні імуномодулятори, які становлять інтерес, являють собою інші моноклональні антитіла, що цілеспрямовано впливають на Т-клітини, такі як антитіла до СОЗ, антитіла до ІСО5 або антитіла до СО28, або рекомбінантні білки або антитіла, які цілеспрямовано впливають на акцесорні клітини, такі як антитіла до СТІ А4Ід або антитіла до СЮО40.

Даний винахід також відноситься до антитіла або його антигензв'язувального фрагмента або химерної молекули, які визначені або проілюстровані у даному документі, для застосування в якості активного інгредієнта в комбінації або у складі схеми додаткової терапії у пацієнта, який бо потребує цього. Також передбачається застосування макромолекули, нуклеїнової кислоти,

клітини або клітинної лінії згідно з даним винаходом у якості терапевтично активного інгредієнта в комбінації або у складі схеми додаткової терапії у пацієнта, який потребує цього.

Макромолекула згідно з даним винаходом, нуклеїнова кислота, вектор, клітина, клітинна лінія, фармацевтична композиція або композиція, які визначені у даному документі, передбачаються, зокрема, для застосування у пацієнта-людини для лікування патологічних станів, на які впливають імунні реакції, особливо реакції за участі Т-клітин пам'яті. Відповідно, автори даного винаходу передбачають, що антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, химерну молекулу згідно з даним винаходом, фармацевтичну композицію або композицію, які визначені у даному документі, можна застосовувати для лікування аутоімунних або алергічних захворювань, зокрема, шкірних алергічних розладів, кишечних розладів, або при відторгненні трансплантата, або для лікування лейкозу, такого як гострий лімфобластний лейкоз (наприклад,

Т-АГ, або лімфоми, такої як лімфома Ходжкіна, або лікування злоякісного захворювання, такого як злоякісна пухлина молочної залози, асоційована з СО127--клітинами, злоякісна пухлина нирки, злоякісна пухлина сечового міхура, злоякісна пухлина легені, злоякісна пухлина підшлункової залози, або для лікування шкірної Т-клітинної лімфоми, такої як лімфома при синдромі Сезарі, або для лікування гострого лімфобластоїдного лейкозу з мутацією з набуттям функції в рамках шляху за участі ІІ -7-В/Т5І Р.

Згідно з різноманітними варіантами здійснення даний винахід відноситься до застосування макромолекул, які визначені у даному документі, з метою скорочення кількості СО127- позитивних клітин при збереженні СО127-негативних клітин.

Згідно з варіантами здійснення даний винахід відноситься до застосування макромолекул, які визначені у даному документі, з метою запобігання диференціюванню, та/або розмноженню, та/або дозріванню СО127-позитивних клітин, зокрема, диференціюванню, розмноженню або дозріванню, що індукуються ІІ--7 та/або Т5І Р, при цьому маючи незначний ефект або не маючи ефект по відношенню до СО127-негативних клітин.

Згідно з конкретним варіантом здійснення даний винахід відноситься до застосування макромолекул, визначених у даному документі, з метою ліквідації/нейтралізації наївних Т-клітин та Т-клітин пам'яті шляхом перешкоджання індукованій ІЇ-7 передачі сигналу при збереженні

Тгед клітин.

Згідно з конкретним варіантом здійснення даний винахід також відноситься до застосування макромолекул, визначених у даному документі, з метою скорочення субпопуляцій лімфоцитів або інших клітинних популяцій, які експресують СО127 (у тому числі нормальних або патологічних Т- та В-лімфоцитів, МК-клітин, дендритних клітин та інших типів клітин, у тому числі епітеліальних клітин), у результаті цитотоксичної дії антитіл, можливо, але не виключно, за допомогою АОСС (антитілозалежної клітинної цитотоксичності) та, необов'язково, за допомогою СОС (комплементзалежної цитотоксичності).

Згідно з вищенаведеними варіантами здійснення передбачувані застосування також застосовні до нуклеїнових кислот, векторів, клітин, клітинних ліній та композицій згідно з даним винаходом.

Під терміном «лікування» або «терапевтичне лікування» мається на увазі, що здійснювані стадії введення приводять у результаті до поліпшення клінічного стану тварини або пацієнта- людини, який потребує цього, та який страждає від порушення(порушень), пов'язаних зі шляхом за участю 1-7, тобто таких, що включають активацію або проліферацію СО127-позитивних клітин. Таке лікування має на меті поліпшення клінічного статусу тварини або пацієнта-людини за допомогою усунення або ослаблення симптомів, асоційованих з порушенням(порушеннями), пов'язаними зі шляхом за участі І/-7, тобто порушеннями, що включають активацію або проліферацію СО127-позитивних клітин. Згідно з переважним варіантом здійснення лікування згідно з даним винаходом забезпечує можливість відновлення здоров'я. Згідно з переважним варіантом здійснення зазначене лікування не має небажаних негативних ефектів, обумовлених підвищеним дозріванням імунних клітин, зокрема, дендритних клітин.

Даний винахід включає в себе застосування макромолекул в лікуванні патологічних станів, що включають зміну імунної реакції у пацієнта-людини, яка приводить до домінантного толерогенного стану або, навпаки, до недостатності толерантності, у випадку, коли буде необхідним контроль рівня імунної реакції а також для руйнування злоякісних СО127- позитивних клітин.

Даним винаходом передбачаються засоби, підходящі для застосування при патологіях, таких як патології, що викликані відторгненням трансплантата, аутоїмунними захворюваннями, алергічними захворюваннями, респіраторними захворюваннями, хронічними вірусними інфекціями, лімфомою, лейкозом або іншими злоякісними захворюваннями, у тому числі 60 захворюванням, що є результатом солідних пухлин (наприклад, злоякісна пухлина молочної залози), у випадку, коли ці патології асоційовані з СО127-позитивними клітинами, а також зі шляхом передачі сигналу за участі ІЇ/-7, та коли необхідно уникати підвищення дозрівання дендритних клітин.

Згідно з конкретним варіантом здійснення даний винахід відноситься до застосування макромолекули, нуклеїнової кислоти, клітини, клітинної лінії або композиції згідно з даним винаходом у пацієнта-людини для лікування аутоїмунного захворювання або алергічного захворювання, або для лікування лейкозу, такого як гострий лімфобластний лейкоз, або для лікування лімфоми, або для лікування злоякісного захворювання, або для лікування хронічної вірусної інфекції, або для лікування запальних захворювань, або для лікування респіраторних захворювань, або для лікування симптомів, пов'язаних із трансплантацією.

Згідно з конкретним варіантом здійснення даний винахід відноситься до способу лікування, що передбачає введення макромолекули, нуклеїнової кислоти, клітини, клітинної лінії або композиції згідно з даним винаходом у пацієнта-людини для лікування аутоімунного захворювання або алергічного захворювання, або для лікування лейкозу, такого як гострий лімфобластний лейкоз, або для лікування лімфоми, або для лікування злоякісного захворювання, або для лікування хронічної вірусної інфекції, або для лікування запальних захворювань, або для лікування респіраторних захворювань, або для лікування симптомів, пов'язаних із трансплантацією.

Додаткові ознаки та властивості згідно з даним винаходом будуть зрозумілі з наступних прикладів та описання фігур.

Короткий опис креслень

Фіг. 1. Інгібування передачі сигналу за участі ІІ -7К. Інгібування індукованих ІІ -7 реТАТО» Т- лімфоцитів залежно від дози моноклональних антитіл до людського ІІ-7Ка. М1382 (квадрат),

МІ1ТЗЕ5 (коло) та М1З3К12 (трикутник). рРеТАТ5 (96): частка (95) клітин, позитивних за фосфо-

ЗТАТ5, яка виміряна за допомогою методу ГАС5. Дозозалежне інгібування фосфорилювання

ЗТАТ»5 є подібним для трьох клонів, причому усі три інгібують фосфорилювання ефективно в концентрації 50 нг/мл (приблизно 5095 інгібування) та повністю в концентрації 100-500 нг/мл (» 9595 інгібування).

Фіг. 2. Інгібування передачі сигналу за участі І -7К тАБ М1382. Вісі відповідають фіг. 1. (А)

Зо Інгібування індукованих 1-7 реТАТО" Т-лімфоцитів залежно від дози тАб М13В82 (квадрати) у порівнянні з таб МО707-3 (кола), причому обидва з них мають формат антитіла гризуна. (В) Той же експеримент, що і в (А), з химерними формами М1382 в формі людського Ідс1 (квадрат) та людського ІдОС4 (коло) у присутності 0,1 (незафарбовані символи) або 5 нг/мл (зафарбовані символи) рекомбінантного людського 1-7. М13В2 є більш ефективним в інгібуванні 5ТАТ5, ніж

МО707-13 (5095 інгібування в концентрації 100 нг/мл для М13В2 у порівнянні з 1000 нг/мл для

МО707-13), у той час як у різних ізотипів (4 М1382 проявляється порівнянна ефективність інгібування.

Фіг. 3. (А) Дослідження зв'язування щурячого антитіла М13В2 до СО127. Антитіло М1382 або

МО707-1 впорскували на іммобілізований антиген СО127 у різній концентрації. Відмін. відп.: відмінність відповіді. Час: час у секундах (загальна тривалість: 20 хв.). Холост.: холоста проба (без антитіла). Криві асоціації та дисоціації аналізували з використанням моделі «Бівалентний аналіт» у програмному забезпеченні ВіАемаї 4. Результати наведено в таблиці 1 нижче.

Таблиця 1

Результати досліджень зв'язування 111111. | Кай/мео | кас) | КАМ) | ком

Таблиця 2

Ка для М1382 та його химер, описаних в (А) в окремому експерименті

Атах

Антитіло Ка1 (1/М с) ка1 (1/с) (Відн. КА (1/М) КО (М)

Од.

Фіг. 4. Активність по відношенню до СО127 у нового антитіла М1382 вимірювали за допомогою аналізу методом ЕЇІЗА з використанням рекомбінантного антигену пСО127.

ОО 450 нм: оптична щільність при 450 нм. А. Активність зв'язування М1382 (зафарбоване коло) з СО0127 порівнювали з попереднім поколінням антитіл (МО707-1 (незафарбований ромб), З (незафарбований трикутник) та 6 (зафарбований квадрат)). Виявляється, що М1382 найбільш ефективно зв'язується в аналізі. В. Порівнювали активність СО127 у різних форматів М1382 (щур, 951 (коло) або Ід54 (квадрат). Не спостерігали значущої відмінності в активності зв'язування.

Таблиця З

ЕО50О у добраних антитіл 11111110 ЕоОБО(нимлу | | 77717171 1 во БО (нг/мл) 1 Мм13В2г | 6564 0177 | 5смО707-3-601 | в 01 мМО70741 | 12293717 | смізвао! | 7777127 01 мМО707-3,. | 293,92 177. | смізвао4 | 126 2 кцК о мо707-6 | 278941 | Кб

Фіг. 5. Індуковане Т5І Р продукування ТАКС (хемокін тимусу, що регулює активацію, ССІ 17) та експресія маркера клітинної поверхні СО8О мієлоїдними дендритними клітинами. Відсутня: без стимуляції. ГРО: стимуляція ліпополісахаридом. Т5І Р: стимуляція Т5І Р. А) Кількісне визначення продукування ТАКС в супернатанті за допомогою методу ЕГІЗА; та В) експресії

СО80 на клітинній поверхні за допомогою проточної цитометрії людських СО1С-дендритних клітин крові, які культивували протягом 24 годин тільки з середовищем, з 1 мкг/мл І Р5 або 15 нг/мл Т5І Р. Дані являють собою середнє х стандартна похибка або середньоквадратична похибка (5ЕМ) для концентрації з З незалежних експериментів.

Фіг. 6. Інгібування індукованого Т5І Р. продукування ТАКС антитілами до людського СО127.

Кількісне визначення методом ЕГІЗА продукування ТАКС у супернатанті людських СО1С-- дендритних клітин крові, які культивували протягом 24 годин з 15 нг/мл Т5ІР та різними концентраціями антитіл до людського СО127: антитіло М1І3В2 (коло), МО707-6 (трикутник) та антитіло до ТЗІ Р в якості контролю (Х). Дані є репрезентативними для трьох незалежних донорів крові. МІ3ЗВ2 лише дуже помірно інгібує індукцію секреції ТАКС (2095 інгібування в концентрації б мкг/мл), у той час як МО707-13 та антитіло до ТІ РК є більш ефективними

Зо інгібіторами (відповідн., 5095 та «7095 інгібування).

Фіг. 7. Ефект антитіл до СЮО127 по відношенню до індукованої Т5І Р експресії маркерів дозрівання дендритних клітин СО8О та СО40. Клітини активували ТОЇ Р в концентрації 15 нг/мл протягом 24 годин. Антитіла до СО127 М1382, МО707-3 та МО707-6 додавали до супернатанту в концентрації 6 мкг/мл. Експресію СО80О (А) та СО40 (В) на клітинній поверхні аналізували за допомогою методу БГАС5. Дані є репрезентативними для З незалежних експериментів та виражені в 95 від рівня експресії в контрольних клітинах (середовище - без антитіла, з Т5І Р). З антитіл, які аналізували, тільки М138В2 не підвищує експресію СО40 та СО80 на клітинній поверхні у оброблених Т51І Р клітин.

Фіг. 8. Антитілозалежна клітинна цитотоксичність (АЮСС) химерного (401 або Ідс4) М1382 антитіла до людського СО127. Людські МК-клітини, що використовували в якості ефекторних (Е),

інкубували протягом 4 годин з лінією клітин ВАЕ/3, трансфікованих людським СО127, в якості клітин-мішеней (співвідношення клітин: 10 ефекторних на 1 мішень) та з різними концентраціями химерного М13В2 ІдсС1 (зафарбований квадрат), М138-Іде4 (незафарбований квадрат) або химерного МО707-3 (Х). Процентне значення специфічної цитотоксичності визначали за вивільненням 51сСГг.

Фіг. 9. Ефективність щурячих тАбр М1382 до СО127 щодо ослаблення хімічно індукованого коліту у гуманізованих імунодефіцитних мишей. Виживання (А) та зміну ваги (В) відслідковували щоденно від Дня 0, початку хімічної обробки 2,4,6-тринитробензолсульфоновою кислотою (ТМВ5), яка індукує тяжке запалення товстого кишечника при інтраректальному введенні, після ін'єкції РВ5 (суцільна лінія/зафарбований трикутник) або антитіло М13В2 до 1І-7Ка (пунктирна лінія, незафарбований трикутник). На секції (В) кожна точка представляє дані середньої ваги (ї4/- ЗЕМ); п - 6 для групи Ни-ТМВ5 ї- РВ5 та п - б для групи ТМВ5 «т антитіло до І -7Ка. В обробленій групі виживання є підвищеним, а втрата ваги - зниженою.

Фіг. 10. Нуклеотидна та амінокислотна послідовність МН- та Мі -ланцюгів химери

М1382 С1М. Ес-ланцюги надруковані малими літерами, три СОК в кожній послідовності підкреслені. Зірочкою (") позначений стоп-кодон у амінокислотній послідовності.

Фіг. 11. Нуклеотидна та амінокислотна послідовність химери М1382 (34М. Ес-ланцюги надруковані малими літерами, три СОК в кожній послідовності підкреслені. Зірочкою (7) позначене розташування стоп-кодону в амінокислотній послідовності.

Фіг. 12. Амінокислотна послідовність трьох альтернативних людських Ес-ланцюгів (ІД4с1,

ІЧОе2 та Ідс4) та Ес-ланцюга щурячого антитіла (4дс1) М1382.

Фіг. 13. Аналіз зв'язування з СО127 за допомогою методу ЕГІ5БА: нанесення у вигляді покриття людського СО127-Ес та виявлення антитіла до людського капа-ланцюга. Активність по відношенню до СО127 у нового антитіла М1382 вимірювали за допомогою аналізу методом

ЕБІІЗА з використанням рекомбінантного антигену йСО127. Порівнювали активність по відношенню до СО127 у різних форматів антитіла М13В82 (антитіло ул (Х), п1 (зафарбований квадрат), п2 (незафарбоване коло) або ПЗ (зафарбований трикутник) гуманізоване антитіло

ІЧе4). Ор: оптична щільність.

Коо)

Таблиця 4

ЕО 50 у добраних антитіл 11111111 ЕОБО(нимлу// 00 МІ3Вана | 777777 06 С 0 Ммі3ваня | 77777706 С

Фіг. 14. Інгібування Р-5ТАТ5 антитілами до СО127. А. Інгібування індукованого 1-7 Р-ЗТАТЬ гуманізованими тА М1382 на Т-лімфоцитах (М1382 П1 (чорний квадрат), п2 (незафарбоване коло) та З (чорний трикутник) залежно від дози та порівняно з щурячим антитілом М1382 Ул (Х) у присутності 0,1 нг/мл рекомбінантного людського ІІ -7. В. Різні антитіла до СО127 з попередніх поколінь антитіл порівнювали за їх здатністю до інгібування ІІ-7-залежного Р-5ТАТЬ: МО707 З (коло), МО7О7 4 (трикутник) та МО7О07 13 (квадрат).

Таблиця 5

ІС 50 у добраних антитіл 11111111 с5О(нимлу//

Фіг. 15. Аналіз стабільності гуманізованих антитіл до СО127 порівняно з щурячим антитілом до СО127. Концентрації антитіл вимірювали за допомогою методу ЕГІ5ЗА після 7 діб при 377

(щуряче М1З3В2мМі (ж) або гуманізоване М13В2 З (квадрат)) та при -80"С (щуряче М1З3В2м (Х) або гуманізоване Мм1382 пз (трикутник)) та після чотирьох разів заморожування/розморожування (ромби).

Таблиця 6. Активність зв'язування у антитіла після 7 діб при 37"С або при -80"С та після заморожування/розморожування, які виконували 4 рази н"Ш'ННІЕІСТТЬТЬТИЛТВОВВЛВВВВВВВВВВВВВВВВИ УТ СТТТОЙ

Таблиця 7. Аналіз стабільності гуманізованих антитіл до СО127 порівняно з щурячим антитілом до СО127. Аналіз утворення агрегатів за допомогою гель-фільтрації після інкубування протягом 7 діб при 37"С або при -8076. 11111111 міз3ваам/ | 77777111 Ммізват111СсСсС 11111110 О7при-80с | О7при37с | О7при-80С | О7приз37сббмономерів./ | (897 2ЮБ4ь. | -(Р9б | 972 | 968 ф(Ни(

Фіг. 16. Аналізи конкуренції та інтерналізації за допомогою цитометрії. Людські мононуклеарні клітини периферичної крові інкубували з декількома тАб до СО127 протягом

ЗО хв. або при 4"С (заштрихований стовпець) або 37"С (чорний стовпець) або при 37" протягом 30 хв. без ЇЇ -7, а потім протягом 15 хв. з 5 нг/мл рекомбінантного людського 1І--7 (сірий стовпець): (А) 10 мкг клонів МО707-5, МО707-12 або МО707-13 або химерного М1382-Сс4; (В) 50 нг М1І382, НАЇ клона НЗІ 4 або 1А11 або середовище в якості контролю. Клітини потім офарблювали при 4"С з використанням комерційно доступних тАб до людського СЮО127 для оцінки рівня експресії альфа-ланцюга рецептора 1-7 на клітинній мембрані.

Антитіла МО707-5, МО707-12 та МО707-13 індукували інтерналізацію рецептора при 37"С з або без 1-7, у той час як химерне М1382-04 не індукувало. Антитіло НАГ. індукувало зниження експресії СО127 на клітинній поверхні в будь-яких умовах. Результати при 4"С показують, що антитіло 1А11 незначною мірою конкурує з антитілом, що використовується для мічення, у той час як НАЇ проявляє сильну конкуренцію, а М1382 не проявляє конкуренції. При 37"С не спостерігали офарблення клітинної поверхні у присутності НАГ, у той час як 1А11 само по себе індукувало сильне зниження експресії СО127 на клітинній поверхні, а в поєднанні з 1-7 експресія на клітинній поверхні знижувалась на 9095. На відміну від цього, М13В2 не знижувало

Зо експресію СО127 на клітинній поверхні при 4"С, а також не індукувало зниження експресії

СО0127 на клітинній поверхні при використанні окремо, та воно інгібувало зниження, що спостерігається у присутності 1І--7.

Фіг. 17. (А) Вивчення фармакокінетичних та фармакодинамічних характеристик введення тАб М1382 та МО707-13 приматам, відмінним від людини. Павіанів (Раріо апирі5) обробляли внутрішньовенно 10 мг/кг М1382-ІдС21 (п-3, зафарбований квадрат), М1382-ІдД24 (п-З3, зафарбоване коло) або МО707-13-д054 (п-3, незафарбоване коло). Концентрацію тАб до

СОр127 у сироватці відслідковували за допомогою методу ЕГІЗА. (В) Паралельно експресію

СОр127 на поверхні Т-лімфоцитів в крові відслідковували за допомогою проточної цитометрії та нормалізували до рівня, який вимірювали перед ін'єкцією тАб (показаний пунктирною лінією). "7 р-е0,05. Загальні рівні в плазмі є порівнянними з часом для усіх трьох антитіл. Експресія СО127 на клітинній поверхні знижується після «8 діб обробки МО707-13, в той час як таке зниження не спостерігається з будь-яким із досліджуваних клонів М13В2.

Фіг. 18. Павіанів (Раріо апиріх) обробляли внутрішньовенно 10 мг/кг М1382-ІдС1 (п-3, зафарбований квадрат), М1382-ІД2а4 (п-3, зафарбоване коло) або МО707-13-І4024 (п-3, незафарбоване коло). Частоту виявлення регуляторних Т-лімфоцитів (С0О3: СО4я5 Сабо

Еохр3") у крові та лімфатичних вузлах (виражену в 96 СО4-позитивних Т-клітин), а також розраховану абсолютну кількість регуляторних Т-лімфоцитів (виражену у кількості клітин/мл) відслідковували в День 0 та через 2 тижні після введення тАб. "и р«е0,01, и р«0,001. Усі три антитіла підвищують загальну кількість регуляторних Т-клітин в крові та частку регуляторних Т- клітин як в крові, так і в лімфатичних вузлах.

Зо

Фіг. 19. Іп міїго інгібування експресії а4-, В7- та а4/В7-інтегринів. А. Процент а4-позитивних та а4/87-позитивних людських Т-лімфоцитів після 9 діб культивування з 5 нг/мл людського ІІ--7 або без нього аналізували за допомогою методу ГАС5. В. Те ж, що й вище, причому зазначені концентрації тАб М1382 додавали до культури в День 0. Пунктирними лініями позначений фоновий рівень у контрольних умовах (без ІЇ-7 та тАр М1382). Індукованому 1-7 підвищенню експресії а4-, В7- та а4/В7-інтегринів запобігає гуманізоване тАр М1382 іп міїго (воно повністю інгібує дане підвищення при концентрації антитіла ч2 мкг/мл).

Фіг. 20. Іп мімо інгібування експресії са4-, В7- та а4/8В7-інтегринів. 40 х 106 людських мононуклеарних клітин периферичної крові вводили ін'єкцією внутрішньобрюшинно опроміненим імунодефіцитним мишам (МОБ/5СІОБ/ нокаутним за гама-ланцюгом рецептора 1-2 мишам). Відсоток В7-позитивних Т-лімфоцитів в крові (ліворуч) та приживляння р7-позитивних людських Т-лімфоцитів (праворуч) після двох тижнів обробки контрольним буфером (п-5) або тАр М1ЗВ2 (5 мг/кг, п-5) оцінювали за допомогою методу БАС5. 7" р«0,01. М1382 значно знижує частку В7-позитивних Т-клітин та приживляння В7-позитивних Т-клітин.

Фіг. 21. Ефект антитіла М13В2 в моделі ОТН, іп мімо моделі псоріазу. Вакцинованих ВСО (бацила Кальмета-Герена) павіанів (Раріо апиріє) сенсибілізували за допомогою інтрадермальної ін'єкції 2000 (А) або 1000 (В) одиниць очищеного туберкуліну для індукції реакції гіперчутливості сповільненого типу та діаметри області еритеми записували кожного дня (зірочка; пунктирна лінія). Місяць потому тварин обробляли внутрішньовенно 10 мг/кг М1382- 991 (п-3, зафарбований квадрат), М1382-І954 (п-3, зафарбоване коло) або МО707-13-ІС4 (п-3, незафарбоване коло). Через чотири тижні після введення тАр тварин знов сенсибілізували за допомогою інтрадермальної ін'єкції 2000 (А) або 1000 (В) одиниць очищеного туберкуліну для індукції реакції гіперчутливості сповільненого типу та діаметри області еритеми записували кожного дня (суцільні лінії). Антитіло МІ3В2, але не МО707-13 інгібує реакцію лімфоцитів пам'яті, що вимірювали за діаметром області еритеми після другої сенсибілізації.

Фіг. 22. Павіанів (Раріо апиріх) обробляли внутрішньовенно 10 мг/кг М1382-ІдС1 (п-3, зафарбований квадрат), М1382-І954 (п-3, зафарбоване коло), або МО707-13-І9024 (п-3, незафарбоване коло), або контрольним буфером (п-3, пунктирна лінія). Після чотирьох годин

Зо тварини отримували внутрішньовенну ін'єкцію 1,5 мл баранячих еритроцитів (ЗКВС) у концентрації 1095. Титри специфічних антитіл Їдо до 5КВС відслідковували через 1 тиждень та 2 тижні після введення 5КВС та нормалізували до їх титрів у День 0. 7 р«е0,05. М13В82, але не

МО707-13 інгібує гуморальну імунну відповідь, що вимірювали за титром специфічного Ідо.

Фіг. 23. Послідовність білка гуманізованого М13В2 МН Ідс4 5228Р. Пп: у послідовності сірим кольором виділені СОК, виділені підкресленням та жирним шрифтом амінокислоти є мутованими (М42І, Аб545, 082М, М1081), підкреслена послідовність являє собою мутовану послідовність Ід(4 (5228Р).

Фіг. 24. Послідовність білка гуманізованого М13В82 МІ СКарра 3: в послідовності сірим кольором виділені СОЖК, виділені підкресленням та жирним шрифтом амінокислоти є мутованими (М541Ї, у77Е, Е93У- М310, 5597), підкреслена послідовність являє собою мутовану послідовність Ід(4 (5228Р).

Фіг. 25. М13В2 захищає від загибелі в моделі запалення у мишей: у гуманізованих мишей індукували реакцію «трансплантат проти хазяїна» (див. приклад 13). Відсоток МБО мишей, що вижили, яким вводили ін'єкцією 50 мільйонів людських РВМС в День 0, та яких не піддавали обробці (білий квадрат, п-14) або обробляли три рази на тиждень за допомогою внутрішньобрюшинної ін'єкції 5 мг/кг химерного М13В82 (чорне коло, п--19).

Фіг. 26. М13В2 специфічно попереджує запалення товстого кишечника в моделі запалення у мишей (див. приклад 13). На момент умертвлення (тобто при 2595 втраті ваги або через 100 діб після ін'єкції) інфільтрацію запальних клітин в кожну тканину М5О мишей, яким уводили ін'єкцією 50 мільйонів людських РВМС в День 0 та обробляли (показано чорним) три рази на тиждень 5 мг/кг М1382 або не обробляли (показано білим), аналізували за допомогою гістологічного аналізу 10 мкм зрізів, офарблених гематоксиліном та еозином. Результати представлені наступним чином: А. Товстий кишечник, В. тонкий кишечник, С. печінка та 0. легеня. Дані являють собою середнє /- ЗЕМ від щонайменше п-8 на групу.

Фіг. 27. Епітопні домени на білюу СО127 (Опіргої Р16871), які розпізнаються антитілом

М1382. Амінокислоти, виділені жирним шрифтом, відповідають послідовностям, що утворюють ідентичний епітоп, який розпізнається М13В2; амінокислоти на сірому фоні є важливими для взаємодії з ІІ -7; амінокислоти, які закреєлені, складають сигнальний пептид СО127.

Фіг. 28. Дослідження спільного імуноосадження комплексу СО127/ЛІ -7/20132 з антитілами 60 до пСО127 (приклад 21). Смуги: 1- тільки РВІ, 2- РВІ ІІ -7, 3- РВІ 4 -7-М1382, 4- РВІ ні -

7-М0707-13, 5- СО132-Ес (72 кДа) або СО-127-Ес (80 кДа). Спільне імуноосадження зразків на колонці з антитілом АСО127 (МО707-9). Елюати аналізували за допомогою вестерн-блотингу (А) з використанням кролячого антитіла до людського СО132, яке виявляли з використанням міченого пероксидазою козячого антитіла до кролячого антитіла, або (В) з використанням щурячого антитіла до людського СО127, яке виявляли з використанням міченого пероксидазою віслючого антитіла до щурячого антитіла.

Приклади

Приклад 1

Одержання та добір нових Маб до людського СО127

Клітини імунізували рекомбінантним пНСО127-Ід (пСО127, злитим з константним фрагментом імуноглобуліну, - бЗіпо Віоіодісаіє, Пекін, Китай; код 10975-НОЗН) та моноклональні антитіла одержували згідно з традиційними методиками. Протокол імунізації, який використовували, був наступним: рекомбінантну химеру СО127-Рс (10975-НОЗН б5Біпо Віоіодіса!, Пекін, Китай) використовували для імунізації щурів лінії ГОМ дКкТа. П'ятдесят мікрограм білків суспендували у повному ад'юванті Фрейнда та вводили підшкірно. Після 20 діб здійснювали вторинну ін'єкцію білка, суспендованого в неповному ад'юванті Фрейнда. Іншу подібну вторинну ін'єкцію здійснювали в День 60 та бустер-ін'єкцію здійснювали в День 90 з використанням 100 мікрограм білків за 4 доби до збирання клітин селезінки.

Гібридому одержували за допомогою злиття мононуклеарних клітин селезінки з клітинами лінії ГО, лінії несекретуючих та стійких до азагуаніну Т-клітин щурячої імуноцитоми ІК9У8ЗЕ, згідно з раніше описаною процедурою (Спавзоих еї аї, 1988). Гібридому спочатку піддавали скринінгу за ознакою здатності моноклональних антитіл, секретуються, до зв'язування з рекомбінантною молекулою СО127 (химера СО127-Ес; 10975-НОЗН, 5іпо Віоіодіса!ї, Пекін,

Китай).

Після добору гібридому культивували в повному середовищі ОМЕМ. Супернатант концентрували за допомогою ультрафільтрації (Сепігатаїг(е, РаїЇ) та очищали за допомогою афінної хроматографії на білку Сб (НіТгар, СеНеаййсаге). Елюювання здійснювали з використанням 0,1 М гліцинового буферу для елюювання з рН 2,8. Одержані у результаті очищені імуноглобуліни оцінювали в аналізі ЕГІЗА щодо активності по відношенню до людського СО127.

З-поміж перших добраних клонів, вибраних, виходячи з розпізнавання антитілами, що секретуються, рекомбінантного СО127, 2 піддавали додатковому добору за допомогою проточної цитометрії по відношенню до розпізнавання СО127, який експресується людськими Т- клітинами, та по відношенню до їх антагоністичних властивостей до Т5І Р.

Антитіла одержували та їх ізотип, а також значення їх афінності, характеризували за допомогою вимірювання поверхневого плазмонного резонансу з використанням технології

ВІАсоге.

Приклад 2

Розпізнавання гСО127 Маб до п-СО127, що оцінювали за допомогою ЕГІЗА

Рекомбінантний пСО127 (5іпо Віоіодіса!І5, Пекін, Китай; код 10975-НОВН) іммобілізували на пластику та зростаючі дози Мар додавали для вимірювання зв'язування. Після інкубування та промивання додавали мічене пероксидазою мишаче антитіло до щурячого капа-ланцюга (Аразегоїес) та виявляли його за допомогою традиційних методів. Зв'язування підтверджували для кожного антитіла.

Приклад З

Інгібування передачі сигналу за участі ІІ -7 (реоТАТ5)

Людські моноцитарні клітини периферичної крові (РВМС), зібрані у градієнті щільності фіколу, від здорових добровольців, інкубували у безсироватковому середовищі з різними концентраціями антитіл, що становлять інтерес, протягом 15 хвилин при кімнатній температурі

БО перед інкубуванням з 0,1 або 5 нг/мл рекомбінантного людського 1-7 (ІІ -7; АБО Зегоїес, код

РНРО46) протягом 15 хвилин при 37"С. РВМС, не оброблені гпІІ/-7, аналізували в якості фонового сигналу, в той час як оброблені 1-7 клітини без антитіла використовували в якості негативного контролю. РВМСОС потім швидко охолоджували та промивали ГЕАСЗ5 буфером для зупинки реакції. Клітини потім інкубували протягом 15 хвилин з холодним розчином

Суюйх/Суїюрегт (ВО Віобзсіепсе, код 554722), промивали двічі буфером Репп///ахп (Ва

Віозсіепсе) та офарблювали міченим РІТС антитілом до людського СОЗ (Ва Віозсіепсе, код 557694) протягом 30 хвилин на льоду. РВМС потім двічі промивали буфером Регт//Л/а5п та пермеабілізували в буфері ВО Регт Вийег ПІ (Ва Віозсіепсе, код 558050) протягом 30 хвилин.

Клітини потім двічі промивали в ГАС5 буфері (і/або РВЗ з 195 В5А та 0,195 азиду) та інкубували бо протягом 30 хвилин при кімнатній температурі з міченим АІеха 647 антитілом до людського роТАТ5 (ВО Віозсіепсе, код 612599). Зразки аналізували на ЕАС5З-інструменті ВО САМТО ЇЇ. Як показано на фіг. 1 та фіг. 2, М13В2 та химерні антитіла, одержані з нього (М1382-51 та М1382- б4), були сильними інгібіторами фосфорилювання ЗТАТ»5; з більш ніж 5095 інгібуванням при концентраціях до 50 нг/мл та більш ніж 8095 (для 0,1 нг/мл 1-7) або більш ніж 9095 (для 5 нг/мл

І--7) інгібуванням при концентраціях антитіла до 100 нг/мл.

Приклад 4

Значення напівмаксимальної інгібувальної концентрації (ІС50) для різних моноклональних антитіл до людського ІІ-7Ка наведено в таблиці 1.

Таблиця 8. ІС50 для різних антитіл до СЮО127 по відношенню до Р-5ТАТ»5, що індукується 100 пг/мл гп1--7

Приклад 5

Аналіз інтерналізації І-7К з використанням цитофлуориметрії

Аналіз інтерналізації можна здійснювати з використанням конфокального мікроскопа, як детально описано в розділі «Матеріали та методи» в Непгіднез еї а! (2010); та Ї о еї аї. (2011).

Для спостереження інтерналізації СО127 за відсутності І/-7 антитіла пПМ13В2, клон НЗІ 4 НА. (патент США Мо 863727) або 1А11 (міжнародна патентна заявка М/О2011094259) в кінцевій концентрації 50 нг/мл (або антитіла МО707-5, МО707-12, МО707-13 або М1382-64 в кінцевій концентрації 10 мкг/мл) інкубували з людськими РВМС (100000 клітин/лунка) в безсироватковому середовищі (ТехмАС5, Мінепуї Віоїес) протягом 30 хв. при 4"С або 37"С. Для спостереження інтерналізації СО127 за відсутності І/-7 використовувались ті ж умови попереднього інкубування при 37"С з антитілами, та клітини потім стимулювали рекомбінантним

І--7 (АБО Бегоїес, код РНРО46) у концентрації 0,1 нг/мл протягом 15 хв. при 37"С. Реакцію зупиняли при 4"С та клітини промивали З рази РВ5З-195В5А-0,195 азиду перед офарбленням міченим РЕ антитілом до СО127 (клон ПІС-78-М21, ВО Віозсіепсе, код 557938), розведеним у співвідношенні 1/10 у РВ5З-195854А-0,195 азиду, та інкубували 15 хв. при 4"С. Після промивання клітини аналізували з використанням цитофлуориметрії на цитометрі Сапіої! (ВО Віозсіепсев5).

Зо Результати, наведені на фіг. 16, є репрезентативними для трьох незалежних експериментів.

Даний спосіб можна легко адаптувати до 9б-лункових планшетів з метою здійснення скринінгу та проведення добору антитіл, які блокують залежну або незалежну від 1-7 інтерналізацію СО127.

Приклад 6

Вивчення афінности антитіла до СО127

Афінність антитіла до йСО127 вимірювали за допомогою поверхневого плазмонного резонансу на Віасоге 3000 (СЕ Неайпсаге)

Чип СМ5 (СЕ Ппеаййсаге) активували впорскуванням суміші МНБЗ/ЕОС протягом 7 хв. СО- 127Ес (500 мкг/мл) розводили в 5 мМ малеатному буфері з рН 6,2 та залишки сукцинімідного естеру впорскували до уловлювання сигналу у 300 КИ (відносні одиниці). Вільні реакційноздатні залишки інактивували за допомогою впорскування 1 М етаноламіну з рН 8,5. Антитіла впорскували на іммобілізований СО127 в діапазоні концентрацій, визначеному в розділі

Результати. Швидкість впорскування встановлювали на 40 мкл/хв., асоціацію вимірювали протягом З хв., а дисоціацію - протягом 10 хв. Між кожним циклом аналізу чип регенерували впорскуванням розчину 5 М Масі» протягом 60 з.

Одержані сенсограми аналізували з використанням моделі «Бівалентний аналіт» у програмному забезпеченні ВіАемаї 4.

Як показано на фіг. З та у таблиці 2 у даному документі, М13В2 з щура та химеризоване антитіло проявляли високу афінність по відношенню до СО127, причому КО знаходилась у діапазоні 4,9Е-11 М - 8,Е-11 М (М1382 від щура), 3,77.Е-10 (М1382-О1) та 1,70.Е-10 (М1382-.4).

Антитіло МО707-1 з щура проявляло нижчу афінність по відношенню до СО127, ніж М1382 з щура.

Приклад 7

Активність зв'язування антитіла до СО127

Для здійснення сендвіч-ЕЇ ІА, віслюче антитіло до людського до (Ес-специфічне) наносили у вигляді покриття в концентрації 1,2 мкг/мл на Роб-планшет та очищені антитіла додавали для вимірювання концентрації залежно від стандартного діапазону. Після інкубування та промивання додавали мишаче специфічне по відношенню до капа-ланцюга антитіло до людського легкого ланцюга (Арсат, код ар79115, або Ейітипе, клон Мам'76-5Е3) та мічене пероксидазою віслюче антитіло до мишиному антитілу (аскбоп Іттипогезеагс!, код 715-036- 151) та виявляли їх за допомогою традиційних методів.

Активність зв'язування антитіла до НСО127 оцінювали за допомогою ЕГІЗА (твердофазний імуноферментний аналіз). У випадку ЕГІЗА аналізу рекомбінантний пНСО127 (Зіпо Віоіодіса!5,

Пекін, Китай; код 10975-НОВН) іммобілізували на пластику в концентрації 1 мкг/мл та очищене антитіло додавали для вимірювання зв'язування. Після інкубування та промивання додавали мічене пероксидазою мишаче антитіло до щурячого капа-ланцюга (Аразегоїес) та виявляли його за допомогою традиційних методів.

Як показано на фіг. 4 та в таблиці 3, виміряна за допомогою ЕЇ ІЗА активність зв'язування антитіла М13В2 є високою, причому ЕО5БО - 65,6 нг/мл (ЕО5бБО« 75 нг/мл та ЕО5О «100 нг/мл) для щурячого М1382 антитіла до пСО127, та ЕО5О становила 12,0 нг/мл та 12,6 нг/мл (ЕЮБбБО -15 нг/мл) для двох химерних антитіл, одержаних з М1382 (сСМ1382-01 та сМ1382-(4).

Приклад 8

Аналіз стабільності

Гуманізовані та химерні очищені М1382-01 інкубували при 37"С або при -80"С протягом 7 діб. Два аналізу використовували для вимірювання стабільності антитіла: аналіз зв'язування антитіла з СО127 за допомогою ЕГІЗА та утворення агрегатів за допомогою гель-фільтрації. У випадку ЕГІ5А аналізу активності рекомбінантний пНСО127 (5іпо Віоіодіса!є5, Пекін, Китай; код 10975-НОВН) іммобілізували на пластику в концентрації 1 мкг/мл та розведені зразки супернатанту додавали для вимірювання зв'язування. Після інкубування та промивання додавали мишаче антитіло до людського легкого ланцюга (специфічне по відношенню до капа- ланцюга) та мічене пероксидазою віслюче антитіло до мишиному антитілу та виявляли їх за допомогою традиційних методів. У випадку аналізу утворення агрегатів зразок аналізували на колонці для гель-фільтраційної хроматографії (Зирегдех 200, 10/3000|, СеНеайсаге) для розділення та оцінки агрегату та мономеру зі зразків.

Приклад 9

Індуковане Т5І Р продукування ТАКС та експресія маркерів зрілих дендритних клітин СО8О та С040.

Мієлоїдні дендритні клітини (ОС) виділяли з використанням набора для виділення СО1с (ВОСА-1):-дендритних клітин (Мікепуії Віоїес, Бергіш-Гладбах, Німеччина) з крові здорових добровольців (ЕФ2аріїззетепі Егапсаії5 ди Запд, Нант, Франція). Мієлоїдні дендритні клітини культивували в середовищі КРМІ, що містить 1095 фетальної телячої сироватки, 195 пірувату, 196 Нерев, 195 І -глутаміну та 195 пеніциліну-стрептоміцину. Клітини висівали в кількості 5.104 клітин/лунку в плоскодонні 96-лункові планшети у присутності Т5І Р (15 нг/мл), ГРЗ (1 мкг/мл) або тільки середовища культивування та при додаванні щурячих антитіл до людського СЮО127 в різних концентраціях. Через 24 години культивування клітини аналізували за допомогою проточної цитометрії по відношенню до маркера дозрівання СО8О на клітинній поверхні (антитіло до СЮО80-М450 (802Ж560442), та супернатанти збирали та аналізували по відношенню до продукування ТАКС за допомогою ЕГІЗА аналізу (КО 5уїетв5, Мінеаполіс, США).

Інгібування індукованого Т5І Р продукування ТАКС оцінювали за допомогою вимірювання зазначеного продукування, як описано вище, за відсутності антитіла або у присутності М13В82, або МО707-6, або комерційного антитіла до Т5І РК (КУО5увзіет5, код АЕ981) у концентрації 1 мкг/мл або 6 мкг/мл. Як показано на фіг. 6, М13В82 інгібувало індуковане Т5І Р продукування

ТАКС більш ніж на 2595 у концентраціях до 1 мкг/мл, тобто так само ефективно, як і МО707-6 у цій концентрації.

Інгібування індукованої Т5І Р експресії маркерів клітинній поверхні СО40 та СО80 оцінювали за допомогою вимірювання зазначеної експресії як описано вище (у випадку С040 використовували антитіло (антитіло до СО40-РІТС від ВесКіоп ріскіпбзоп, код 555588) в умовах, подібних до описаних вище для СОВ80), за відсутності антитіла (в даному випадку експресію нормалізують до 100 95) або у присутності антитіл М1382, МО707-3 або МО707-6 в концентрації б мкг/мл. Як показано на фіг. 7, як МО707-3, так і МО707-6 індукували підвищення експресії

СсОр40 та СО80, у той час як МО707-3 було хорошим інгібітором активації 5ТАТ5 та добре зв'язувалося з СО127 (фіг. 2 та фіг. 4), та МО707-6 було сильним інгібітором індукованого Т5І Р продукування ТАКС (фіг. 6). Підвищення становило щонайменше 20 95 для СО8О та 5095 для

СОр40. На відміну від цього, антитіло згідно з даним винаходом, М13В2, не підвищувало індуковану Т5І Р експресію СО40 або СОВ80. Разом з тим, зазначені рівні експресії були нижчими у присутності Т5І Р та антитіла, ніж у присутності тільки Т5І Р.

Приклад 10 бо Антитілозалежна клітинна цитотоксичність (АЮОСС) Мар до людського СЮО127

АрСС називається зв'язування антитіла з епітопом, що експресується на клітинах-мішенях, та наступне Ес-залежне приваблення ефекторних імунних клітин, які експресують Ес-рецептори (в основному МК-клітин та активованих лімфоцитів), що приводить у результаті до цитолізу клітин-мішеней переважно за допомогою механізмів на основі гранзиму/перфорину.

Ефекторні клітини являли собою свіжі первинні людські МкК-клітини, виділені з мононуклеарних клітин периферичної крові за допомогою негативного добору з використанням магнітних гранул (набір для виділення МК-клітин, Мікепуї Віоїес, Бергіш-Гладбах, Німеччина) та інструмента для клітинного сортингу АШОМАСЗ5. МК-клітини інкубували протягом ночі при 37" з 596 202 в середовищі ЕРМІ 1640 (І їе Тесппоіодіє5, Карлобад, Каліфорнія), доповненому 1095

ЕВ (те Тесппоіодієз), 100 МО/мл пеніциліну (І їе Тесппоїодіев5), 0,1 мг/мл стрептоміцину (Те

Тесппоіодієб), 2 ММ І-глутаміном (Се ТесппоЇодіе5) та 150 МО/мл людського 1-2 (НосНе,

Базель, Швейцарія). Клітини-мішені (клітинна лінія ВАЕ/З3, трансфікована людським СО127 (Рагк еї аїІ,, 2000)) мітили 100 мкКі (3,7 МБк) 51Сг (РегкіпЕІтег) протягом 1 години при 37"7С та промивали п'ять разів середовищем культивування. Клітини-мішені інкубували з розведеними антитілами або з допоміжним засобом (середовищем культивування) протягом 15 хв. при кімнатній температурі та 10000 клітин поміщали в 9б-лунковий планшет з О-подібним дном.

Ефекторні Т-клітини додавали при співвідношенні клітин 10:1 (кінцевий об'єм: 200 мкл) протягом 4 годинного періоду інкубування при 37"С. Потім збирали в сумарно 25 мкл супернатанту та виконували підрахунок на лічильнику гама-частинок (РаскКага Іпзігитепо).

Як Мар МО707-3 щурячого походження, так і химерне Мар М1382-О1 (що, таким чином, має

Ес-домен типу ЇД01) проявляли АОСС. Химерне М1382-54 (що має Ес-домен типу Ідс4) не проявляло жодної активності АЮСС та використовувалось в якості негативного контролю.

Цікаво, що не існувало прямої кореляції між афінністю, властивостями зв'язування та АОСС, вказувало на те, що властивості АЮСС вне можна спрогнозувати, виходячи з аналізів зв'язування.

Приклад 11

Нуклеотидні та амінокислотні послідовності Мар до людського СО127

МУН- та МІ-ділянки клона М13В2 секвенували з використанням технології ПЛР зі швидкою ампліфікацією кінців КкДНК (КАСЕ РСК). Коротко, загальну РНК екстрагували, піддавали

Зо зворотній транскрипції та одержану у результаті кДНК піддавали поліаденілуванню по 3'-кінцю молекул з використанням ЗАТР та ферменту термінальної трансферази. Перші 35 циклів реакції

ПЛР проводили з використанням якірного праймера оліго(4Тт) та ферменту геркулази (Зігаїадепе). Другі 35 циклів ПЛР проводили з використанням якірних праймерів для гніздової

ПЛР. Одержаний у результаті ПЛР-продукт потім піддавали ТА-клонуванню в Е. Соїї та після добору на ампіциліні одержані у результаті колонії піддавали скринінгу за допомогою аналізу профілю фрагментів із використанням рестрикційних ферментів та секвенували кДНК, яка вбудувалася.

Приклад 12

Гуманізація

Гуманізацію щурячого моноклонального антитіла М1382 виконували з використанням стандартної технології СОК-прищеплення. Принцип даного методу полягає в структурній перебудові людського антитіла таким чином, щоб воно містило тільки ділянки, що визначають комплементарність (СОК), із щурячого моноклонального антитіла для того, щоб не тільки знизити імуногенність антитіла у людей, але також поліпшити біофізичні властивості молекули з прищепленими СОК.

Гуманізація за допомогою СОК-прищеплення вимагає того, щоб антигензв'язувальні залишки з вихідного щурячого антитіла зберігались у гуманізованого варіанта. Було виявлено, що залишки, суміжні з СОЖК, які називають залишками «з зони Мегпіеєг», впливають на конформації СОК та на точне регулювання розпізнавання антигену. Споїпіа апа ГІ езкК, (1987), виділяли конформації СОК згідно з «канонічними» залишками, деякі з яких самі розташовані у межах СОК, а інші - в каркасних ділянках. Отже, ідентифікація цих залишків «з зони Мегпіег» та "канонічних" залишків є критично важливою стадією. Використовуваний протокол засновується на підході, вперше запропонованому Грегом Вінтером та колегами (Райз апа Уміпіег, 2006) в

Раді з досліджень у галузі медицини, Кембридж, Великобританія, та в якому використовуються залишки СОК, визначені за Кабаї.

Добір акцепторних людських каркасних ділянок, на які прищеплюють СОК ділянки щурячого

М1382, виконували за допомогою ІМОТ пошуку в базах даних М-генів для щура та людини з використанням ІЗ9ВГАБТ - інструмента, розробленого в МСВІ для полегшення аналізу послідовностей варіабельних ділянок імуноглобулінів (пЕр:/Лимли. порі. піт. пін.дом/дбіаві ; Ме єї 60 аі.,, 2013), причому в якості даних, які вводять, використовували послідовності МН та МІ.

щурячого М1382. Окрім цього, у стратегії що застосовується в даному випадку, використовуються людські послідовності зародкової лінії, які являють собою природні людські послідовності, що не містять соматичних гіпермутацій, які виявляються в білку та одержаних з

КДНК послідовностях. Звичайно добирали гени зародкової лінії що найбільш подібні до щурячих послідовностей МІ. та МН. Акцепторні людські каркасні МН- та Мі -ділянки зародкової лінії ідентифікували за допомогою вирівнювання послідовностей МН та Мі. вихідного антитіла

М1382 та на основі наступних критеріїв: 1. ідентичність послідовності у каркасній області та

СОК, як визначено Караї, 2. ідентичні та сумісні залишки на поверхні взаємодії між ланцюгами, 3. підтримувальні петлі з вихідними канонічними конформаціями СОК та залишками з зони

Метівг.

Декілька різних послідовностей, одержаних у результаті гуманізації, досліджували відносно

М1382 для вибору кращої, яка зберігає зв'язування та біологічну активність. Для гуманізованих варіантів М1І3В2 варіабельну послідовність гуманізованого важкого ланцюга (МН) антитіла

М1382 клонували за допомогою Есоб/М в експресійну плазміду рбизесСНід-псте4 (Іпмімодеп,

Тулуза), що містить СНІ-СН2-СНЗ домени підсС!, в які було введено мутацію ЕЗЗЗА для підвищення АЮСС. Варіабельну послідовність гуманізованого легкого ланцюга (Мі) антитіла

М1382 клонували за допомогою В5ім/І в експресійну плазміду рбизе2СГ Ід-пК (Іпмімодеп, Тулуза), яка містить людський СІ Карра.

В СоО5-клітинах, які автори даного винаходу піддали спільній трасфекції за допомогою методу з використанням ліпофектаміну, була присутня плазміда, яка містить МН-пПЕсСС1, з плазмідою, що містить МІ-СІК. Після 48-72-годиного інкубування супернатант виділяли та очищали за допомогою афінної хроматографії на білку З (НіТгар, СеНеаййсаге) з 01 М гліциновим буфером для елюювання з рН 2,8. Очищене антитіло піддавали діалізу в РВ5 та концентрували. Їх кількісне визначення здійснювали за допомогою сендвіч-ЕГІЗА та досліджували в аналізе активності щодо антигену СО127.

Приклад 13

Дослідження впливу антитіл до ІЇ/-7Ка по відношенню до І/-7 в різних іп мімо моделях запального захворювання

З метою оцінки ефекту антагоністичного антитіла в індукції коліту в гуманізованих МО

Зо мишей автори даного винаходу провели ряд експериментів у моделі з ТМВ5, які показали вимірний ефект. Застосування гаптенів, таких як ТМВ5 (2,4,6-тринітробензолсульфонова кислота), дозволяє забезпечити імітацію імунологічної моделі (Мапсеу еї аї., 2008). Коліт індукують у мишей шляхом інтраректального введення ТМВ5 (Зідта Спетісаї, І 5Іе а'Абеаи

Спезпе, Франція), розведеного в етанолі, в День 0 чотирьом гуманізованим мишам. Спочатку мишей піддавали анестезії за допомогою інгаляції газовою сумішшю. В День 7 тварин умертвляли під анестезією шляхом інтоксикації СО2 для декількох досліджений (дані не показані). Деяких тварин умертвляли до Дня 7 внаслідок їх поганої клінічної оцінки.

Отже, дві нових групи мишей обробляли або РВ5, або ін'єкціями 210 мкл антитіла до ІІ -7Ка

М1382 у концентрації 0,7 мг/мл кожні 2 доби, починаючи з дня перед обробкою ТМВ5.

Здійснювали аналізи, подібні до тих, що виконували при розробці моделі.

Потім автори даного винаходу досліджували ефективність антитіла М13В2 в моделі реакції «трансплантат проти хазяїна» (ЗМУНО) з використанням гуманізованих мишей. Дана модель імітує загальне запальне захворювання. Деяких МОБ/зсіалі -2Ку-/- (МБО) мишей (СПагіев Кімег,

ЛАрбрель, Франція) віком 7-12 тижнів опромінювали (3 Гр) та вводили інфузією внутрішньобрюшинно (ір.) 50 мільйонів людських РВМС від здорових донорів, як раніше описано Роїгіег еї аіІ., 2012. Тварин потім розміщували в асептичних умовах та піддавали моніторингу три рази на тиждень щодо зміни ваги та клінічної оцінки. Контрольну групу залишали необробленою після інфузії клітин, а група обробки одержувала, починаючи з Дня 0 та три рази на тиждень, і.р. ін'єкції 5 мг/кг химерного тАБ М1382. Діагноз ЗМНО ставили миші після 2095 втрати ваги. Тварин, у яких було виявлено більш ніж 2595 втрату ваги, та тварин, що вижили після 100 діб з Дня 0, умертвляли. Після умертвлення тканини товстого кишечника, тонкого кишечника, печінки та легень заморожували в рідкому азоті та реактиві Тіз5и-ек для гістологічного аналізу. Заморожені зрізи (10 мкм) з цих тканин сушили в повітрі при кімнатній температурі протягом 1 години до фіксації в ацетоні протягом 10 хв. при кімнатній температурі, а потім офарблювали розчином гематоксиліну та еозину. Результати наведені на фіг. 25 та фіг. 26.

Приклад 14

Аналіз різних клінічних параметрів

Виживання (фіг. 9А): автори даного винаходу оцінювали виживання у зв'язку з хімічною бо обробкою та застосуванням антитіл до ІЇ-7Ка. Проявлялася тенденція, що відсоток тварин, що вижили, виявився більш значним для групи Ни-ТМВ5 -- ІІ -7Ка, ніж для групи Ни-ТМВ5 - РВ5 (фіг. 9А). Дійсно, автори даного винаходу спостерігали, що 100 95 з мишей групи Ни-ТМВ5 -- ІІ - та виживали до 5 діб, у той час як у групі Ни-ТМВ5 « РВ5 три тварин довелося умертвити до 5.

Вага (фіг. 98): в оброблених ТМВ5 групах, починаючи з інтраректальної ін'єкції 5 95 ТМВ5/50 до етанолу з Дня 0, автори даного винаходу спостерігали зниження ваги до 20 95 для обох груп.

Тим не менш, в групі Ни-ТМВ5 -- І -7Ка тварини набирали вагу з 93, у той час як в групі Ни-

ТМВ5 ї- РВЗ втрат ваги продовжувалась (фіг. 98). Важливо зазначити, що миші мали бути умертвлені для збору біологічних даних, та більш довготерміновий протокол підтвердив би повторний набір ваги.

Виживання (фіг. 25): автори даного винаходу оцінювали виживання у зв'язку з ін'єкцією людських РВМСОС (розвиток зУНО) та застосуванням антитіла до ІЇ-7/Ка М1382. Виживання тварин було на 3095 кращим, коли тварин обробляли антитілом, ніж у контрольних тварин (100

Фо смертність контрольних тварин після 60 діб). Ці результати показують, що антитіло М1382 захищає від СУНО та загибелі.

Інфільтрат у тканинах (фіг. 26): товстий кишечник, тонкий кишечник, печінку та легені з загиблих тварин та тварин, що вижили (але були умертвлені), оброблених або не оброблених, піддавали гістологічному аналізу щодо показника інфільтрації запальних клітин у них (визначали гістологічну оцінку). Автори даного винаходу спостерігали, що товстий кишечник тварини, обробленої М13В82, містив меншу кількість клітинного інфільтрату, ніж контроль. Не спостерігали відмінностей між обома станами в тонкому кишечнику, печінці та легені.

У тварин, оброблених М13В2, проявлялося 3095 виживання у порівнянні з контролем.

Клітинний інфільтрат, що характеризує запалення, не модифікувався при обробці в тканинах тонкого кишечника, печінки та легені, це показувало, що в даній моделі запалення М1382 не захищає від запалення в цих тканинах. Тим не менш, М13В82 індукувало 50 95 зниження кількості клітинного інфільтрату в товстому кишечнику. Можна побачити кореляцію цього ефекту з активністю антитіла М1382 по відношенню до експресії а4р7-інтегрину, що наведено на фіг. 19 та фіг. 20. Дійсно, а«4р7-інтегрин, як відомо, відіграє важливу роль в хоумінгу активованих лімфоцитів у кишечник. Отже, зниження експресії інтегрину, індуковане антитілом М1382, може

Зо відповідати за зниження кількості клітинного інфільтрату, що спостерігається в товстому кишечнику (фіг. 26). Варто підкреслити, що явна відсутність захисту в інших тканинах може бути специфічною для моделі, яка використовується в даному випадку, та це не має приводити до висновку, що захисний ефект антитіла обмежується товстим кишечником. Зокрема, набагато вище виживання оброблених тварин показує, що захисний ефект антитіла має сильний позитивний вплив на загальний стан тварин.

Приклад 15

Іп мімо ефективність антитіла по відношенню до неінтерналізованого СО127

Тварини

Павіани (Раріо апибі5, з Центра приматології СМЕ5, Руссе, Франція) були негативними за всіма карантинними аналізами, у тому числі за туберкуліновою шкірною пробою. Тварин розміщували у великому віварії при лабораторії, додержуючись етичних нормативів Іпзійшіопаї!

Ештпісаї! сцідеїїпе5 інституту Іпбзійцї Маїйопаї ає Іа Запіє Ех де Іа Кеспегоспе МеадісаІе, Франція. Усі експерименти виконували під загальною анестезією з використанням золетилу (міграс, Карро,

Франція). Фармакокінетичні та фармакодинамічні дослідження здійснювали під час експериментів з ОТН на п'яти павіанах, що отримували ім. болюсну ін'єкцію 10 мг/кг будь-якого з М1382-І901, або М1382-Ідс4, або МО707-13-Ідс4.

ВС вакцинація та ОТН аналіз

Згідно з Роїгіег та співавт. (Роїгієг еї аї., 2011) павіанів імунізували інтрадермально (і.а.) двічі вакциною на основі бацили Кальмета-Герена (ВС) (0-1 мл; 2-8 Ух 105 ОБ5; Запоїї Рахівиг М5О,

Ліон, Франція) в верхню область нижньої кінцівки за 4 та 2 тижні до аналізу шкірної ОТН. Для вивчення антигенспецифічного Т-клітинного імунітету перед аналізом шкірної ОТН успішну імунізацію підтверджували за допомогою імуноферментного спот-аналізу (ЕГІБРОТ) інтерферону (ІЄМ)-д9 (набір для ЕГІЗРОТ-аналізу ІРМ-д примата, відмінного від людини; КУО

Бузіветв5, Мінеаполіс, Мінесота, США) на свіжовиділених РВМС згідно з інструкціями виробника.

Інтрадермальні реакції (ІК) проводили з використанням дублюючих інтрадермальних ін'єкцій двох доз (1000 МО або 2000 МО) очищеного білкового продукту туберкуліну (РРО; Зутрбіоїіс5

Согрогайоп, Сан-Дієго, Каліфорнія, США) в об'ємі 0,1 мл у шкіру на правій частині спини тварин.

Сольовий розчин (0,1 мл) використовували в якості негативного контролю. Шкірні реакції в місцях ін'єкції вимірювали з використанням штангенциркуля. Діаметр кожної затверділої області бо еритеми вимірювався двома спостерігачами, починаючи з Днів 3-8, та результат вважався позитивним, коли діаметр області становив 24 мм. Записували середнє значення показів.

Зразки біопсії шкіри з місця ОТН або місця введення контролю (сольового розчину) забирали в

День 4 на місці однієї дублюючої ін'єкції та поміщали в реактив Тіз5це ТеК для забезпечення оптимальної температури одержання зрізів (ОСТ) (ЗакКига Ріпеїек, Вільнев-д'Аск, Франція) для імуногістохімічного аналізу. Другу ІК проводили після З-тижневого "відмивного періоду", та тварини одержували одну і.м. ін'єкцію 10 мг/кг будь-якого з химерних антитіл до СО127 (М1382-

І9С1, або М1382-І954, або МО707-13-Ід04) за 1 добу до цієї другої сенсибілізації РРО. Третю

ІОК проводили після додаткового 3-6б-тижневого "відмивного періоду" та тварин залишали необробленими. В деяких випадках проводили четверту ЮК після ще одного З-місячного «відмивного періоду» та тварин також залишали необробленими.

Приклад 16

Експресія «4ф87 на поверхні Т-клітин іп мігго та іп мімо у мишачій моделі

Для вимірювання індукованої ІІ -7 експресії «487 на поверхні Т-клітин людські Т-лімфоцити стимулювали протягом 9 діб при 37"С з використанням І/-7 (АБО бегоїес, код РНРО46) у концентрації 5 нг/мл. Реакцію зупиняли при 4"С та промивали перед офарбленням міченим

РегСрР/Су5 антитілом до а4 (ВО Віозсіепсе, 563644, клон 9Е10) та міченим РЕ антитілом до В7 (ВО Віозсієпсе, клон РІВ504). Позитивні щодо а4-інтегрину клітини, а потім В7-позитивні клітини піддавали вимірюванню за допомогою проточної цитометрії. Гуманізоване антитіло М1382 додавали в День 0 у культуру клітин у різних концентраціях, що становили від 0,01 до 20 мкг/мл. іп мімо, 40 х 106 людських мононуклеарних клітин периферичної крові вводили ін'єкцією внутрішньобрюшинно опроміненим імунодефіцитним мишам (МОБ/5СІЮ/ нокаутним за гама- ланцюгом рецептора 1-2 мишам). Через два тижні після обробки контрольним буфером (п-5) або тАр М1382 (5 мг/кг, п-5) відсоток В7-позитивних Т-лімфоцитів в крові вимірювали за допомогою проточної цитометрії та приживляння В7-позитивних людських Т-лімфоцитів вимірювали за допомогою проточної цитометрії. Дане приживляння вимірювали за допомогою проточної цитометрії шляхом відокремлення людських СО45-позитивних клітин від мишачих

СОра45-позитивних клітин з використанням специфічних антитіл (РЕСу7 антитіло до людського сС045 від ВО, код 57748, та РегсРСуб5.5 антитіло до мишиного СО45 від ВО, код 550994), потім аналізували людські В7-позитивні клітини (ВО Віозсіепсе, клон РІВ504).

Приклад 17

Визначення антигенного профілю антитіл з використанням мікроматриць з пептидами

Мікроматриці з пептидами РерзіагТМ від Реріїде ТесппоЇодіе5 містять очищені синтетичні пептиди, одержані з антигенів або інших джерел, які є хемоселективно та ковалентно іммобілізованими на скляній поверхні. Оптимізований гідрофільний лінкерний фрагмент вводили між скляною поверхнею та одержаною з антигену пептидною послідовністю для уникнення одержання хибних негативних результатів, викликаних стеричною невідповідністю. З технічних причин усі пептиди містили С-кінцевий гліцин. Експерименти з визначення антигенного профілю зразків виконували на пептидній бібліотеці, яка складається з 52 пептидів.

Повний перелік пептидів наведено нижче.

Таблиця 9

Перелік пептидів, що використовуються в аналізі з використанням мікроматриць з пептидами 60 | ОІЕОАЕГОРУБЗЕВСУ | 78 | ПОКБМІСУКУСЕК5 | 96 | КОЕМКУУТНУМІ55ТК 62 | ОУЗЕ5СУБОЇЕММОЗ | 80 | УКМСЕКБІТСККІР | 98 | УМІ55ТКІТНОНКІ. 63 | ЗСУБОГЕУМаБОНВІ | 81 | ЕКБІТСККІРІТТІМ | 99 | 5ТК-ТШОВКІОРАА 66 | НБІТСАРЕОРОММТТ | 84 | ТІМКРЕАРЕРІЗМІМ )|102| РААМУБІКУВБІРОН 68 | ОРОММТТМІЕРЕІСЯ | 86 | РОРІЗМІУВЕСАМОРМ | 104 | УВБІРОНУРКОРМУЗЕ (69 | МТТМІЕРЕІССАЄУЕ | 87 | МІУВЕСАМОРУМУТЕМ | 105 | РОНУРКОРМ/ЗЕМУ5РЗ

Продовження таблиці 9 71 | ІСОАІМЕУКСІМЕНК | 89 | ОРМУТЕМТЗНІОККМУ | 107 | МЗЕМ5РБУУЕВТРЕ! 72 | ІМЕМКСІМЕВНКСОІ | 90 | ТЕМТ5НІОККУУКМІ |108| ЗРБУУЕВТРЕЇММ55 74 | ЕВКСОЕІМНЕТККЕ | 92 | ККУУКМІМНОМАУВО (75 | ОБІМНЕТККЕШІЯ )| 93 | КМІМНОУМАУВОЕКОЕ

У сумі 9 зразків інкубували на скельцях з мікроматрицями з використанням багатолункового формату. Для антитіла М13В2 та інших зразків застосовували 4 різні концентрації (10,1, 0,1 та 0,01 мкг/мл). Інкубування одного негативного контролю (тільки вторинне антитіло) здійснювали паралельно. Білки людського та мишачого Ідс піддавали спільній іммобілізації разом із кожним набором пептидів, щоб вони слугували в якості контролів при аналізі. Усі процедури інкубування здійснювали паралельно з використанням двох скелець. Дві пептидні міні-матриці на кожному скельці використовували в якості контролю інкубування, наносячи на них тільки антитіло для виявлення, що містить флуоресцентну мітку, для оцінки хибного позитивного зв'язування з пептидами. Після промивання та висушування скелець їх сканували з використанням лазерного сканера з високою роздільною здатністю при довжині хвилі 635 нм з одержанням зображень даних інтенсивностей флуоресценції. Зображення піддавали кількісній оцінці для одержання середнього значення інтенсивності пікселя для кожного пептиду. Вторинне антитіло до щурячого Ідс (ЛК 212-175-082), мічене Суб в концентрації 1 мкг/мл. Буфери та розчини.

Використовуваний буфер являв собою ТВ5-буфер, що включав у себе 0,0595 Тмееп20 (РТ), та

Т20 буфер для аналізу (Ріегсе, ЗирегВіоск ТВ5 20, Ж37536). Збір та аналіз здійснювали з використанням мікроматриць з пептидами (РТ Рерііїде Тесппоїодіе5х СТрБН, Берлін, Німеччина; партія Мо 2668), багатолункової інкубаційної камери, сканера Ахоп Сеперіх бсаппег 4200АЇ, програмного забезпечення для розпізнавання плям СеперРіх та Місго5ой Ехсеї, К.

Приклад 18

Нанесення на карту епітопів за допомогою мас-спектрометричного аналізу

Мас-спектрометрію використовували для ідентифікації конформаційного епітопа.

Визначення послідовності епітопа виконували з використанням мас-спектрометра з МАЇ 01.

Даний інструмент забезпечує можливість аналізу пептидної послідовності вагою від 800 до 4000 Да. Розщеплення білка, що становить інтерес, дозволяючи розрізати білок на невеликі фрагменти (потенційні епітопи). В ідеалі, розщеплювальний фермент має здійснювати розрізання якомога ближче до границь епітопа. Вибір розщеплювального ферменту варто виконувати з урахуванням частоти розрізання ферментом в послідовності рекомбінантного

Зо білка. Друге розщеплення передбачається для зменшення розміру епітопів, одержаних у кінці першого розщеплення. Залежно від вибраного ферменту профілі значно відрізняються.

Ферментом, що характеризується найкращим розподілом розщеплених фрагментів у послідовності, є хімотрипсин. Другим ферментом із підходящою частотою розрізання та хорошим розподілом розщеплених фрагментів у послідовності, що становить інтерес, є Сім С.

Оскільки епітоп є конформаційним, перевагу віддають розщепленню комплексу під час афінної хроматографії. Ідентифікація послідовності, що становить інтерес, засновується на захисті епітопа від ферментативного розщеплення за допомогою утворення комплексу антиген- антитіло. Після проходження афінної хроматографії та розщеплення фрагменти епітопа елюють та визначають послідовність за допомогою мас-спектрометрії (МАСОІ-ТОЕ-ТОЕ ВгикКег). 30- структура білка, що становить інтерес, є доступною, та її порівнюють з одержаними результатами.

Послідовність у базі даних Опіргої під номером доступу Р16871 (21-239| (Зед ІЮ Мо:114): відповідає топологічному домену альфа-субодиниці рецептора інтерлейкіну 7 Ното Заріепв:

ЕБамМАОМИарІ ЕСАЕГООМБЕЗСУВОЇ ЕУМавзОНБІ ТСАРЕОРОММТТМГЕБЕІССАЇГМЕМКСІ МЕ

ВАКГОЕІМЕЕТККЕ ПаКОМІСУКМОЕКБІ ТОККІВІ ТТІУКРЕАРЕОІ БМІМВЕСАМОЕЄМУМТЕМТЗНІ ОК

КУУКМІ МНОМАМАОЕКОЕМКУУ ТНУМІ 55ТКІ ТІ ОВКГОРААМУЄІКУВАЗІРОНУЕКИагєМмЗЕМУ5РБУ

МЕВТРЕІММЗБЗИаЕМО

Визначені іп 5йісо можливі варіанти вибору ферменту, що розщеплює СО127, (див. підкреслені амінокислоти вище в послідовності, яка відповідає Зед ІЮ Мо:114). Хімотрипсин вибрали в якості розщеплювального ферменту. Сайти розрізання (товсті лінії), кількість пептидів, частота розрізання є підходящими. Фермент (СІ0-С вибирали в якості другого розщеплювального ферменту. Кількість одержаних пептидів з вагою, що становить від 800 до

4000 Да, є підходящою. Частота розрізання Сіи-С та розташування сайтів розрізання (тонка лінія) є підходящими. Використовувана процедура є традиційною та добре відома спеціалісту у даній галузі техніки, також вона описана в ЗискКаи еї аї, 1990, та Рарас еї аї, 1994.

Матеріали та реактиви: мас-спектрометр МАГОІ-ТОР/ТОЕ ІІ де ВгикКег; Ні-гар МН5 колонки (код: 17-0716-01 - СЕ ППеанйпсаге); хімотрипсин (код: 11418467001 - Воспє); Сі С (код:11420399001 - Коспе); 2ір/ТІР С18 (код: 771С185096 - МіШіроге); бікарбонат амонію (код: 09830 - 5ідта); гліцин (код: 57126 - ЗБідта); Масі (код: 27800.360 - ММ/В).

Фаза 1. Розщеплення незв'язаного білка та антитіла в розчині. Розщеплення у розчині незв'язаного антигену та антитіла хімотрипсином або Сім С протягом 1 години, 2 годин, З годин, 4 годин, 5 годин та протягом ночі при кімнатній температурі або при 37"С. Аналіз розщеплених пептидів здійснювали за допомогою мас-спектрометрії (М5) розщеплених пептидів. Ці експерименти дозволяють встановити підходящі умови для ферментативного розщеплення (час та температуру). Мета полягає в тому, щоб мати достатнє розщеплення антигену при мінімальному впливі на структуру антитіла, наскільки це можливо. Визначеними оптимальними умовами були наступні: Розщеплення хімотрипсином: 1 година при кімнатній температурі; розщеплення (Ій-С: протягом ночі при 37"С. Кожний розщеплений фрагмент антигену та антитіла аналізують за допомогою мас-спектрометрії МАС ОІ-ТОР/ГТОБЕ.

Фаза 2. Повне розщеплення комплексу з цілого зв'язаного Ас « цілого антигену. Зв'язування моноклонального антитіла М1382-с1 до СО127 (партія 210415) здійснювали на колонці Ні-Ттар

МН5, слідуючи стандартній процедурі. Захоплення антигену антитілом на колонці здійснювали протягом 1 години, що забезпечувало можливість утворення комплексу антиген-антитіло.

Ефективність зв'язування антитіла М1382-51 на чотирьох колонках Ні-Ттар, МН була наступною: 8495, 8495, 8390 та 8395. Одержували відповідні та ідентичні продукти зв'язування.

Розщеплення комплексу здійснювали при співвідношенні 1/50, або 1 мг ферменту на 50 мг антитіла, при температурі та протягом періоду, визначених за допомогою вищезгаданих контрольних експериментів. Колонку потім промивали буфером для промивання (25 мМ бікарбонат амонію) для видалення та виділення незв'язаних пептидів антигену. Стадію промивання в буферному сольовому розчині (РВ5-2М МасіЇ) також здійснювали для видалення неспецифічних пептидів. Після промивання здійснювали елюювання з використанням

Зо розчинника для елюювання (50 мМ гліцин з рН 2), щоб специфічно екстрагувати та виділити пептиди, що специфічно зв'язалися (які за прогнозом відповідають епітопу).

МАГ аналіз: фракції, одержані у результаті промивання та елюювання, концентрували за допомогою гідрофобної хроматографії на С18 матриці. Потім їх аналізували за допомогою мас- спектрометрії МАСОІ-ТОЕ/ТОРК. У М5-аналізі можна точно виміряти масу пептидів, та порівняння одержаних в експерименті мас із теоретичними масами у пептидів, одержаних у результаті розщеплення іп 5йїсо незв'язаного антигену, забезпечує можливість ідентифікації пептидів;

М5/М5 аналіз можна здійснювати для підтвердження послідовності пептиду, якщо це необхідно.

Спектр елюату після розщеплення хімотрипсином виявив присутність пептидів із масою, що становить: 912,49; 1086,47; 1843,03; 2104,16; 1944,97; 1564,73; 1835,97; 2022,05; 242422 та 2858,42 Да, які можуть відповідати пептидам антигену в таблиці 10 нижче.

Таблиця 10

Пептиди, одержані після розщеплення хімотрипсином (послідовності, захищені від протеолізу)

Спектр елюату після розщеплення Сіи-С виявляв присутність розщеплених пептидів з білка, що становить інтерес, з масою, яка становить 1200,43; 1309,68; 2108,97; 2191,04; 2699,43;

3170,68 та 3264,70 Да, які можуть відповідати пептидам антигену в таблиці 11 нижче.

Таблиця 11

Пептиди, одержані після розщеплення Сіи-С (послідовності, захищені від протеолізу)

Два розщеплення дозволили авторам даного винаходу ідентифікувати три сайти (таблиця 12 нижче), залучені у взаємодію між пЯМ1382 та антигеном СО127. Пептиди, одержані на стадії промивання сольовим буферним розчином, виключали для обмеження послідовностей, що становлять інтерес.

Таблиця 12

Послідовності пептидів людського СО127, захищені М1382 від протеолізу

Нанесення на карту епітопів для антитіла М1382 на антигені СЮО127 показало 3 різні послідовності, важливі для активності антитіла по відношенню до шляху за участі І1-7/20127 (фіг. 27). За результатами ЗО-кристалографічного аналізу взаємодії 1 -7/50127 (МеЕЇоу еї аї,

Бігисішге 2009, РОВ:З0ОІ2) дві з послідовностей (бед ІЮ М"115 та ІЮ М" 117) є близькими за структурою та розташовані в ділянці, залученій у зв'язування //-7 з СО127. Третя ідентифікована послідовність (зед ІЮ М"116) розташована в сайті 26 у домені 02 рецептора, домені, який згідно із прогнозом взаємодіє з СО132, гама-ланцюгом рецептора (Умаївй еї аї, 2012). М13В2 розпізнає ідентичний епітоп на СО127, розташований у 2 частинах білка, який інгібує взаємодію 1 -7-СО0127 та утворення гетеродимеру СЮО127-СО132. Зв'язування М13В2 має дестабілізувати утворення «потрійного комплексу 1І-7ВалЛі-7/д-ланцюг», як передбачалося умаїі5п 5Т, що блокує інтерналізацію комплексу.

Приклад 19

Результати

Як описано раніше (Непігіднез сеї аї., 2010), 1-7 сам по собі індукує швидку інтерналізацію (30-4095) альфа-ланцюга (СО127) рецептора 1-7 на поверхні Т-лімфоцитів, яка необхідна для опосередкованої 1І--7 передачі сигналу. У даному документі автори даного винаходу описували, що тА М13В82 запобігає індукованій 1-7 інтерналізації СО127 та саме по собі не індукує цю інтерналізацію (фіг. 16). На відміну від цього, автори даного винаходу описували, що клон 1А11 антитіла до людського СО127 від О5К (патентна заявка УЛО2011094259) різко знижує експресію

Зо С0127 на поверхні Т-лімфоцитів при застосуванні його окремо або в комбінації з І -7 при 377С (фіг. 16). Цей ефект спостерігали з використанням диференційного офарблення декількома комерційними антитілами до І/-7К (еВіоКОК5 та МВ15-1809, дані не показано). Після внутрішньовенного введення химерного тар М13В82 (у форматі з Ес-доменом людського Ідс1 або Ідс4) у концентрації 10 мг/кг приматам, відмінним від людини, автори даного винаходу під час вимірювання не спостерігали зниження експресії СО127 на поверхні Т-лімфоцитів протягом 2--тижневого періоду подальшого спостереження (фіг. 178). На відміну від цього, у інших приматів, відмінних від людини, паралельно оброблених внутрішньовенно 10 мг/кг клона

МО707-13 антитіла до людського СО127 (у форматі з Ес-доменом людського Ідс4;

ММО2013/056984), автори даного винаходу спостерігали значне зниження (6095) СО127 на поверхні Т-лімфоцитів (фіг. 178). Інформація про дану інтерналізацію СО127 після зв'язування

ТАБ до людського СО127 на Т-лімфоцитах, також раніше публікувалася групою Рії?ег, де було описано, що їх тАбБ до людського СО127 (клон НАГ-НЗІ 4, патент США Мо 8637273) значною мірою індукує інтерналізацію СО127 ех мімо на людських клітинах крові та клітинах крові примата, відмінного від людини, а також іп мімо після внутрішньовенного введення приматам, відмінним від людини, (Кепгп еї аї., 2013).

У нещодавній публікації за авторством Кегп та співавт. (Кегп еї аї., 2015) досліджували зайнятість СО127 та проводили конкурентні аналізи. Клон НІГ-78-М21 антитіла до СО127 від ВО ріозсіепсе5, як було показано, конкурував з антитілом НАМ/АБІ (від групи Ріїег) за зв'язування з

СОр127. Як показано на фіг. 16 згідно з даним винаходом, антитіло НАГ. (клон НЗІ 4, патент США

Мо 8637273) порівнювали з М13В82 та 1А11 з точки зору експресії та інтерналізації СО127. Ці результати показали конкуренцію між антитілом НАГ. та НІС-7 А-М21, підтверджуючи дані Кегпп еї аі, 2015. Тим не менш, М1382 не конкурує з НІС-78-М21. Кепт та співавт. також показали, що

НАЇ/АрРІ сам по собі індукує іп мімо знижувальну регуляцію експресії СО127 на клітинній поверхні через 4-8 годин після ін'єкції. Ці результати є порівнянними з результатами, наведеними на фіг. 17В згідно з даним винаходом із кллоном МО707-13. На фіг. 178 показана знижувальна регуляція експресії на клітинній поверхні через 4-10 діб після ін'єкції антитіла.

Також спостерігали, що цей іп мімо ефект може корелювати з МО707-13-залежною інтерналізацією СО127 в клітину іп міїго.

В дослідженні епітопів за допомогою мікроматриць з пептидами та мас-спектрометрії ідентифікували ідентичний епітоп, який розпізнається М1382 на СО127. Даний епітоп розташований у доменах 01 та 02, на відміну від антитіл з рівня техніки, які розпізнають епітоп, що розташований тільки в О1 (приклад 17). Більш того, на фіг. 16 показано, що антитіла з рівня техніки індукують інтерналізацію СО127, у той час як М13В2 не індукує. Отже, автори даного винаходу зробили висновок, що властивість М13В2, яка полягає в тому, що воно не індукує інтерналізацію СО127, корелює з його властивістю, яка полягає в розпізнаванні епітопа, розташованого в обох доменах 01 та 02.

В цілому, ці, а також раніше описані результати показали, що тАБб до людського СО127 (клон 1А11, клони НА/АБІ та НЗІ 4 та клон МО707-13), які, як описано, блокують зв'язування ЇЇ - 7 на рецепторі ІЇ/-7, також індукують інтерналізацію альфа-ланцюга рецептора 1-7, що знаходиться в асоціації з рецептором 1-7 та потрібний для передачі сигналу з його участю.

Несподівано та на відміну від цього, тАб М13В82 має унікальну властивість, яка полягає в тому,

Зо що воно не індукує інтерналізацію СО127 та запобігає такій інтерналізації, індукованій ІІ -7. Ці результати мають корелювати зі спостереженням, що тАБбБ-індуктори інтерналізації СО127 (наприклад, клон МО707-13), які є ефективним іп міго для запобігання передачі сигналу за участі рецептора І/-7 (наприклад, фосфорилювання 5ТАТ5, фіг. 14В), не здатні запобігати імунним реакціям клітин пам'яті (фіг. 21) або гуморальним імунним реакціям (фіг. 22) іп мімо. На відміну від цього, автори даного винаходу описали, що тАбБ М1382, яке ефективно блокує передачу сигналу за участі рецептора ІС-7 (фосфорилювання ЗТАТ5), але не індукує інтерналізацію СО127 ех мімо на людських Т-лімфоцитах та іп мімо у приматів, відмінних від людини, запобігає реакціям гіперчутливості сповільненого типу за участі клітин пам'яті (фіг. 21), а також імунізації у відповідь на ксеногенні баранячі еритроцити (фіг. 22). Хоча не спостерігалось відмінності між ізотипами М1І382 по відношенню до контролю гуморальної реакції клітин пам'яті, автори даного винаходу помітили, що М13В2 у форматі Ідс4 було більш ефективним у запобіганні реакцій за участі клітин пам'яті у порівнянні з ЇдДе1. Не спостерігали відмінностей у плані впливу тАБ та їх концентрацій в сироватці поміж тваринами, обробленими

МО707-13 та обробленими М1382. Аналогічно, автори даного винаходу також спостерігали значне підвищення кількості регуляторних Т-лімфоцитів у тварин, оброблених будь-яким із тАб

М1382 або МО707-13 (фіг. 22).

Людський 1-7 індукував сильну експресію а4- та р7-інтегринів іп мійго на людських Т- лімфоцитах та різко підвищував частоту виявлення людських Т-лімфоцитів, які експресують аг-,

В7- та а4/В7-інтегрини (фіг. 19А), що необхідні для хоумінгу Т-лімфоцитів та їх утримання в тканинах, які не відносяться до лімфоїдних, таких як тканини кишечника, головного мозку та шкіри (СсСопи еї а!., 2009, Оемиссі еї аї., 2009). Відповідно, автори даного винаходу спостерігали, що тАБ М138В2 дозозалежно інгібує іп міго експресію та а4, та В7, а також знижує частоту виявлення а4-позитивних та «4/87-позитивних людських Т-лімфоцитів (фіг. 198). Аналогічно, після переносу людських мононуклеарних клітин периферичної крові в імунодефіцитних мишей автори даного винаходу спостерігали, що антитіло М1382 значно та швидко знижує відсоток Д7- позитивних Т-лімфоцитів, а також кількість (і4. приживляння) цих клітин після однієї (дані не показано) та двох тижнів обробки (фіг. 20). Результати, одержані в двох різних моделях запалення, показують, що антитіло М1І3В82 до І/-7Ка може бути ефективним лікувальним засобом проти запальних захворювань та, зокрема, при коліті. 60 Приклад 20

Створення конформаційного епітопа

Пептиди СІІРЗ5 можна використовувати для відповідної імітації нативної вторинної та третинної структури антигену з метою перетворення цих пептидів СІІР5 на активні та сильнодіючі імуногени, які індукують бажані антитіла (Воз5пці2еп еї аїЇ, 2014). Технологія СГІР5 включає циклізацію (багатократну) лінійних пептидів за допомогою реакції з невеликою жорсткою молекулою (хімічний кістяк), яка несе 2, З або 4 якірні точки. Якірні групи реагують виключно з одним типом функціональних груп пептиду (тобто тіолами) та прикріплюються до пептиду за допомогою багатьох ковалентних зв'язків. Пептид згортається навколо кістяка та втрачає гнучкість, при цьому повільно приймаючи чітко визначену тримірну структуру з молекулою кістяка в центрі, подібну до структури типу «павук у павутині».

В технології використовуються повністю синтетичні спеціально розроблені кістяки. Кістяки

СІІРБ5 варіюють переважно за розміром, полярністю, жорсткістю, розчинністю, функціональними групами та відстанню, що «розділяє 55-зв'язки». Ці кістяки використовуються для прикріплення вільних кінців пептиду. При належному розташуванні всередині пептидної послідовності, одержаний у результаті пептид СІ ІР5, ймовірно, має набагато більшу схожість із

ЗО-структурою відповідної ділянки на інтактному білку у порівнянні з лінійною послідовністю.

СПІРО-циклізації можна здійснювати на нативних залишках І-цистеїну, але також на штучно введених О- та І -(гомо)цистеїнах практично в будь-якому бажаному положенні в послідовності.

Отже, структуру та розміри скріплених за допомогою СІ ІР5 пептидів можна змінювати, як завгодно. Реакція циклізації триває не більш ніж 30 хв., проходить при кімнатній температурі та не потребує будь-якого виду каталізатора. Більш того, її можна здійснювати повністю у водних умовах і при нейтральному рН (7,5-8,0), та, отже, вона є сумісною з високочутливими біологічними системами, подібними до бактеріофагів. Нарешті, реакції можна проводити в умовах сильного розведення (10-100 мкМ), що сприяє високим виходам циклічних продуктів та уникає полімеризації. Дана технологія є дуже універсальною, та вона є унікальною за простотою її застосування.

Прагнучи реконструювати як лінійні, так і переривчасті епітопи для антитіла до рецептора, лінійні пептиди, які перекриваються, з багатьох мономерних ланок синтезують безпосередньо на поліпропіленових планшетах розміром з кредитну карту, причому їх С-кінець є ковалентно

Зо приєднаним до дна кожної лунки об'ємом З мкл (455 лунок на планшет), та кожна лунка містить різний пептид. В кожному з однодоменних пептидів циклізований дицистеїновий місток утворювали для вбудовування обмежувальної петлі в прикріплений до планшета пептид. В

Тееїїпод еї аї, 2006, пояснюється, як створювати циклізовані пептиди з пептидами, що становлять інтерес, з метою відтворення переривчастого епітопа, що розпізнається антитілом, що становить інтерес. Коротко, спочатку синтезували зв'язані з планшетом дицистеїн-вмісні пептиди, у яких цистеїни були розділені 4-13 амінокислотами в пептиді, наприклад, СХХХХС- планшет, ХХХСХХХХСХХХХХХ планшет або СХХХХС-планшет і т.д. Пептиди потім циклізували за допомогою обробки а,.а-дибромксилолом у водному розчині з одержанням цистеїтнових петель, що містять різні кількості амінокислот. Ця хімічна модифікація забезпечує більш стабільні петлі, ніж дисульфідні містки. (МіведегеїПпег еї аї, 2011)

Приклад 21

Спільне імуноосадження СО127 та ус

Для дослідження ефекту антитіла М1І3В2 та антитіл з рівня техніки по відношенню до зв'язування СО127 з ус-ланцюгом експеримент зі спільного імуноосадженню здійснювали у клітинах, що стимулюються ІГ -7, та які інкубують за відсутності антитіл або у присутності антитіл

МО707-13 або М1382. За відсутності антитіл було показано, що СО127 та ус піддаються спільному імуноосадженню. Інкубування клітин з МО707-13 не запобігало такому спільному імуноосадженню, у той час як інкубування з М13В2 приводило до відсутності такого спільного імуноосадження. Розроблене авторами даного винаходу антитіло, отже, здатне порушувати зв'язування СО127 з ус-ланцюгом, у той час як антитіла з рівня техніки не характеризуються такою ознакою.

Для спільного імуноосадження комплексу СО127-С0132-ІИ./-7 у присутності антитіла до

С0127, людські РВГІ. інкубували з щурячим антитілом до НСО127 (щуряче М1382 або МО707-13 в концентрації 10 мкг/мл) протягом 30 хв. при 37"С перед стимуляцією 1-7 (АБО Зегоїес, код

РНРО46) у концентрації 5 нг/мл протягом 15 хв. при 37"С. Реакцію зупиняли при 4"7С та промивали два рази холодним РВ5 перед додаванням буферу для лізису з набору для спільного імуноосадження (набор Ріегсе Оігесі ІР Кії, код 26148).

Колонку для очищення з використанням антитіла до людського СО127 готували з використанням набору для спільного імуноосадження (набор Ріегсе Оігесі ІР Кії, код 26148). З бо колонкою зв'язували 75 мкг неконкуруючого щурячого антитіла до людського СО127 (Ептипе,

МО707-9), слідуючи процедурі, рекомендованій виробником. Лізат піддавали попередньому очищенню на незв'язаній колонці з метою видалення молекул, що призводять до неспецифічного зв'язування. Потім лізат додавали в колонку з антитілом до СО127 та інкубували 2 години при 4"С при перемішуванні на роликовій мішалці. Колонку промивали двічі буфером для промивання, а потім елюювали буфером для елюювання. Виділені зразки аналізували за допомогою методу вестерн-блотингу.

У випадку вестерн-блотингу готували 505-Раде гель (1095 для розділювального, 495 для концентрувального гелю завтовшки 1,5 мм) та 50 мкл денатурованого елюату (для денатурації:

РТ 01 М та 10 хв. при 95"С) додавали в кожну лунку. Рекомбінантний білок СО127Ес (Зіпо

Віоіодіса!5, Пекін, Китай; код 10975-НОВН) та СО132Ес (5іпо Віоіодіса!5, Пекін, Китай; код 10555-

НО2Н) додавали (5 мкг/лунку) в якості контролю для виявлення за допомогою методу вестерн- блотингу. Після міграції протягом 1 години 30 хвилин при 200 В, та переносу на нітроцелюлозну мембрану протягом 35 хв. при 20 В виконували насичення протягом 2 годин при кімнатній температурі в 595 молоці.

Для початку виявлення кроляче антитіло до людського СО132 (апіісогр5-еп-Іднпе, Франція, код АВІМ741840) додають у співвідношенні 1/50 протягом ночі при 4"С, а потім виявляють з використанням міченого пероксидазою козячого антитіла до кролячого антитіла (даск5оп

Іпптипогезеагсй, код 111-035-144) у співвідношенні 1/2000 протягом 1 години при кімнатній температурі. Після дегібридизації мембрану інкубували з щурячим антитілом до людського

СбОр127 (ЕЄбітипе, МО707-9) у співвідношенні 1/200 протягом ночі при 4"С та виявляли з використанням міченого пероксидазою віслючого антитіла до щурячого антитіла (даскзоп

Іпптипогезеагсй, код 712-035-153) у співвідношенні 1/1000 протягом 1 години при кімнатній температурі. У випадку кожного виявлення ЕСІ. (Тпепгто зсіепіййс, код 34080) використовували для виявлення пероксидази за допомогою хемолюмінісценції та результати зчитували з використанням камери Еції 4000.

На фіг. 28 показано результати спільного імуноосадження комплексу СО127ЛІ -7/60132.

Автори спостерігали, що ланцюг СО132 (60 кДа) піддається спільному імуноосадженню з СО127 у будь-яких умовах, за виключенням таких, коли клітини інкубували з антитілом М1382 (285А).

Тим не менш, в кожному наборі умов СО127 (70 кДа) добре піддається імуноосадженню

Зо антитілом МО707-9, що показано на фіг. 288, це вказує на те, що М1І38В2 та МО707-13 не конкурує з МО707-9 за розпізнавання СО127. Антитіло М1382 інгібує утворення комплексу ср127/с20132 у присутності 1-7. Ці результати узгоджуються з нанесенням на карту епітопів для антитіла М1382 на СО127, яке показує, що М1382 зв'язується з амінокислотною послідовністю в межах сайту 265 у домені 02 альфа-ланцюга 1-78 (У/аївй єї аї, Іттипої гєм. 2012).

Разом ці результати показали, що антитіло М13В2 є антагоністом взаємодії 1І/-7/20127, а також є антагоністом взаємодії СО127/С0132 в сайті 260 у присутності І--7, що може пояснювати інгібіторну активність антитіла по відношенню до інтерналізації СО127, яка спостерігається з ІЇ-- 7 та/або антитілами до СО127 з рівня техніки.

Наступні пронумеровані варіанти здійснення складають переважні варіанти здійснення даного винаходу. 1. Антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент антитіла, або антигензв'язувальний міметик антитіла, які специфічно зв'язуються з СО127 та не індукують інтерналізацію СО127. 2. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, зокрема, згідно з варіантом здійснення 1, які інгібують індуковану 1ІІ--7 інтерналізацію СО127.

З. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик згідно з варіантом здійснення 1 або 0, причому експресія СО127 на клітинній поверхні у оброблених 1-7 клітин у присутності антитіла або фрагмента становить щонайменше 8095, переважно щонайменше 9095 від її рівня у клітин, які інкубують за відсутності антитіла. 4. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, які специфічно зв'язуються з СО127 та тим самим порушують зв'язування СО127 зі спільним ус-ланцюгом цитокінових рецепторів. 5. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким із варіантів здійснення 1-0, які порушують зв'язування СО127 зі спільним ус-ланцюгом цитокінових рецепторів при зв'язуванні з СО127. 6. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент згідно з будь-яким із варіантів здійснення 0 або 0, у присутності якого кількість ус, що зв'язався з СО127, становить менш ніж 8095, переважно менш ніж 5095, ще більш переважно менш ніж 2595 або 1095 від зазначеної кількості, виміряної за відсутності антитіл в ідентичних в інших відношеннях умовах, зокрема, коли зазначене вимірювання здійснюють на клітинних лізатах, що містять молекулярні бо комплекси, які містять СО127, з інтактних клітин, що експресують рецептор 1-7 на клітинній поверхні, які інкубують у присутності або за відсутності зазначених антитіл. 7. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик згідно з будь-яким із вищезазначених варіантів здійснення, які є антагоністами передачі сигналу за участі 1-78, індукованої ІІ--7. 8. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, зокрема, згідно з будь- яким із вищезазначених варіантів здійснення, які специфічно зв'язуються з антигеном згідно з будь-яким із варіантів здійснення 53-67 або епітопом в зазначеному антигені. 9. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, які специфічно зв'язуються з СО127, зокрема, згідно з будь-яким із вищезазначених варіантів здійснення, що не підвищує дозрівання дендритних клітин, індуковане Т5І Р. 10. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик згідно з будь-яким із вищезазначених варіантів здійснення, які інгібують експресію а4-, В7- та/або а4/р7-інтегринів. 11. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик згідно з варіантом здійснення 10, які інгібують експресію а4-, В7- та/або ай/рВ7-інтегринів іп мімо, зокрема, в людських Т-клітинах, які вводять ін'єкцією імунодефіцитній миші. 12. Антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, які специфічно зв'язуються з СО127, зокрема, згідно з будь-яким із вищезазначених варіантів здійснення, що містять МН-ланцюг, який містить щонайменше одну з наступних амінокислотних послідовностей: ее МНООВІ 5ЕО ІО Мо:10; ее МНОСОВ2 5ЕО ІО Мо:12; е МНСОКЗ 5ЕО ІО Мо:14 або 5ЕО ІЮ Мо:48; або є МН 5ЕО І Мо:22; та/або Мі-ланцюг, який містить щонайменше одну з наступних амінокислотних послідовностей: ее М СОКІ1 5ЕО ІО Мо:16 або 5ЕО ІО Мо:50; а М СОК2 5ЕО ІЮО Мо:18 або 5ЕО ІО Мо:52; ее МСОКЗ 5ЕО ІЮ Мо:20; або е МІ ЗЕО І Мо:24. 13. Антитіло або його фрагмент або міметик згідно з варіантом здійснення 12, які містять щонайменше дві, три, чотири або п'ять послідовностей СОК, вибраних із групи, яка складається з МНСОКІ 5ЕО ІЮ Мо:10, МНСОК2 5ЕО ІЮО Мо:12, МНСОКЗ 5ЕО ІЮ Мо:14 або 5ЕО ІЮ Мо:48,

МІСОМК1 5ЕО ІЮО Мо:16 або 5ЕО ІО Мо:50, МСОМК2 5ЕО ІЮО Мо:18 або 5ЕО ІО Мо:52 та МІ СОКЗ

ЗЕО ІО Мо:20. 14. Антитіло або його фрагмент або міметик згідно з варіантом здійснення 13, які містять усе шість послідовностей СОК МНСОКІ 5ЕО ІО Мо:10, МНСОК2 5ЕО ІО Мо:12, МНСОКЗ 5ЕО І

Мо:14 або 5ЕО ІЮ Мо:48, МІСОМК1 5ЕО ІЮ Мо:16 або 5ЕО ІО Мо:50, МІСОК2 5ЕО І Мо:18 або

ЗЕО ІЮ Мо:52 та МЕСОКЗ 5ЕО ІЮО Мо:20. 15. Антитіло згідно з варіантом здійснення 14, в якому - МН-ланцюг складається з МН-ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ Мо:2, або ЗЕО ІО Мо:6, або 5ЕО ІО Мо:54 або містить послідовність 5ХЕО ІЮ Мо:22 або 5ЕО ІЮ Мо:36 або 5ЕО ІЮ Мо:38 або

ЗЕО ІЮ Мо:40; та - МІ -ланцюг складається з Мі -ланцюга з послідовністю ЗЕО ІЮ Мо:4 або 5ЕО ІЮО Мо:56 або містить послідовність 5ХЕО ІЮ Мо:24, або 5ЕО ІЮ Мо:42, або 5ЕО ІО Мо:44, або 5ЕО ІО Мо:46. 16. Антитіло згідно з будь-яким із вищезазначених варіантів здійснення, яке являє собою химерне антитіло, або гуманізоване антитіло, або деімунізоване антитіло. 17. Антитіло згідно з варіантом здійснення 13, яке являє собою гуманізоване та деіїмунізоване антитіло, в якому важкий ланцюг має послідовність БЕО ІО Мо:52, та легкий ланцюг має послідовність ЗЕО ІЮО Мо:54. 18. Макромолекула, яка являє собою химерну молекулу, що містить антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик згідно з будь-яким із вищезазначених варіантів здійснення, причому зазначене антитіло є зв'язаним із функціонально відмінною молекулою, при цьому зазначена химерна молекула є або злитим химерним білком, або кон'югатом, одержаним у результаті ковалентного прикріплення хімічної групи або молекули, такої як полімер РЕС або мічене антитіло. 19. Макромолекула згідно з будь-яким із вищезазначених варіантів здійснення, яка являє собою афітин або антикалін. 20. Макромолекула, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, згідно з будь-яким із вищезазначених варіантів здійснення, яка зв'язується з СО127 з

Ка, яка є нижчою ніж 5Е-10 М, особливо, нижчою ніж 1Е-10 М, особливо, нижчою ніж 5Е-11 М. бо 21. Макромолекула, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, згідно з будь-яким із вищезазначених варіантів здійснення, яка проявляє цитотоксичну активність по відношенню до СО127-позитивних клітин. 22. Макромолекула, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, згідно з будь-яким із вищезазначених варіантів здійснення, яка не підвищує дозрівання дендритних клітин, індуковане ТОР, причому підвищення дозрівання дендритних клітин, індуковане Т5І Р, оцінюють за допомогою визначення підвищеної експресії маркера клітинної поверхні СО40 та/або СО80 в позитивних за рецептором Т5ІР клітинах, оброблених Т5ІР та зазначеною макромолекулою, у порівнянні з клітинами, обробленими тільки Т5І Р. 23. Макромолекула, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, згідно з варіантом здійснення 22, причому експресія СО80О підвищується не більш ніж на 2595, переважно не більш ніж на 1095 в позитивних за рецептором Т5ІР клітинах, оброблених Т5ІР та зазначеною макромолекулою, у порівнянні з клітинами, обробленими тільки Т5І Р. 24. Макромолекула, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, згідно з варіантом здійснення 23, причому експресія СО80О не підвищується або знижується в позитивних за рецептором Т5ІР клітинах, оброблених Т5ІР та зазначеною макромолекулою, у порівнянні з клітинами, обробленими тільки Т5І Р. 25. Макромолекула, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик згідно з варіантом здійснення 22, причому експресія СО40 підвищується не більш ніж на 5095, переважно не більш ніж на 2595 в позитивних за рецептором Т5І Р клітинах, оброблених Т5І Р та зазначеною макромолекулою, у порівнянні з клітинами, обробленими тільки Т5І Р. 26. Макромолекула, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, згідно з варіантом здійснення 25, причому експресія СО40 не підвищується або знижується в позитивних за рецептором Т5ІР клітинах, оброблених Т5ІР та зазначеною макромолекулою, у порівнянні з клітинами, обробленими тільки ТЗІ Р. 27. Молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або макромолекулу згідно з будь-яким із вищезазначених варіантів здійснення. 28. Молекула нуклеїнової кислоти згідно з варіантом здійснення 27, яка кодує амінокислоту, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ Мо:2; ЗЕО ІЮ Мо:4; 5ЕО ІЮ Мо:6б; БЕО ІЮ Мо:8; 5ЕО ІЮ

Ко) Мо:10; 5ЕО ІЮ Мо:12; 5ЕО І Мо:14; 5ЕО ІО Мо:16; 5ЕО ІО Мо:18; 5ЕО ІО Мо:20; 5ЕО ІО Мо:22;

ЗЕО ІО Мо:24; 5ЕО ІО Мо:36; 5ЕО І Мо:38; 5ЕО ІО Мо:40; 5ЕО ІО Мо:42; 5ЕО ІЮ Мо:44; 5ЕО І

Мо:46; 5ЕО ІО Мо:48; 5ЕО ІО Мо:50; 5ЕО ІЮ Мо:52; 5ЕО ІЮ Мо:54 та 5ЕО ІО Мо:56. 29. Молекула нуклеїнової кислоти згідно з варіантом здійснення 28, яка вибрана з групи, що складається з БЕО ІЮО Мо:1; 5ЕО ІЮО Мо:3; 5ЕО ІЮ Мо:5; 5ЕО ІЮ Мо:7; 5ЕО ІЮ Мо:9; 5ЕО ІЮ Мо:11;

ЗЕО ІО Мо:13; 5ЕО ІО Мо:15; 5ЕО 10 Мо:17; 5ЕО ІЮ Мо:19; 5ЕО ІЮ Мо:21; 5ЕО ІО Мо:23; 5ЕО І

Мо:35; 5ЕО ІЮ Мо:37; 5ЕО ІЮ Мо:39; 5ЕО ІО Мо:41; 5ЕО ІО Мо:43; 5ЕО ІО Мо:45; 5ЕО ІЮО Мо:47;

ЗЕО ІЮО Мо:49; 5БЕО ІЮО Мо:51; 5ЕО ІО Мо:53 та 5ЕО ІО Мо:55. 30. Вектор для клонування та/або для експресії полінуклеотиду згідно з будь-яким із варіантів здійснення 27-29, особливо плазміда, підходяща для клонування та/або експресії у клітинах ссавця. 31. Клітина або клітинна лінії, в яку було вбудовано за допомогою рекомбінації полінуклеотид згідно з будь-яким із варіантів здійснення 27-30, особливо клітина або клітинна лінія ссавця. 32. Фармацевтична композиція, яка містить макромолекулу, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, згідно з будь-яким із варіантів здійснення 1-26 з фармацевтичним носієм, причому зазначена фармацевтична композиція необов'язково містить додатковий відмінний активний інгредієнт. 33. Фармацевтична композиція, яка містить в якості терапевтично активного інгредієнта макромолекулу, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, згідно з будь-яким із варіантів здійснення 1-26, або фармацевтичну композицію згідно з варіантом здійснення 32 у складі, підходящому для контролю диференціювання/дозрівання дендритних клітин при введенні пацієнту-людині. 34. Фармацевтична композиція згідно з варіантами здійснення 32 або 33, яка додатково містить додаткову сполуку, що характеризується терапевтичним імуномодулювальним ефектом, зокрема, по відношенню до клітин, залучених у аутоїмунне захворювання або алергічне захворювання, лейкоз, такий як гострий лімфобластний лейкоз, лімфому, злоякісне захворювання, хронічну вірусну інфекцію, запальні захворювання, трансплантацію, респіраторні захворювання або аутоїмунну реакцію. 35. Макромолекула, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або 60 міметик, згідно з будь-яким із варіантів здійснення 1-26, або нуклеїнова кислота згідно з будь-

яким із варіантів здійснення 27-30, або клітина або клітинна лінія згідно з варіантом здійснення 31 для застосування в якості терапевтично активного інгредієнта в комбінації або у складі схеми додаткової терапії у пацієнта, який потребує цього. 36. Макромолекула, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, згідно з будь-яким із варіантів здійснення 1-26, або нуклеїнова кислота згідно з будь- яким із варіантів здійснення 27-30, або клітина або клітинна лінія згідно з варіантом здійснення 31, або фармацевтична композиція згідно з будь-яким із варіантів здійснення 32-34 для застосування в лікуванні пацієнта, зокрема, пацієнта-людини, з захворюванням. 37. Макромолекула, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, згідно з будь-яким із варіантів здійснення 1-26, або нуклеїнова кислота згідно з будь- яким із варіантів здійснення 27-30, або клітина або клітинна лінія згідно з варіантом здійснення 31, або фармацевтична композиція згідно з будь-яким із варіантів здійснення 32-34 для застосування в лікуванні пацієнта, зокрема, пацієнта-людини, з ризиком захворювання. 38. Макромолекула, нуклеїнова кислота, клітина, клітинні лінії або фармацевтична композиція для застосування згідно з варіантом здійснення 36 та/або варіантом здійснення 37, причому захворювання являє собою аутоїмунне захворювання, зокрема, ревматоїдний артрит, розсіяний склероз, діабет І типу, аутоімунний тиреоїдит та вовчак. 39. Макромолекула, нуклеїнова кислота, клітина, клітинні лінії або фармацевтична композиція для застосування згідно з варіантом здійснення 36 та/або варіантом здійснення 37, причому захворювання являє собою запальне захворювання, зокрема, ІВО та енцефаломієліт. 40. Макромолекула, нуклеїнова кислота, клітина, клітинні лінії або фармацевтична композиція для застосування згідно з варіантом здійснення 36 та/або варіантом здійснення 37, причому захворювання являє собою алергічне захворювання. 41. Макромолекула, нуклеїнова кислота, клітина, клітинні лінії або фармацевтична композиція для застосування згідно з варіантом здійснення 36 та/або варіантом здійснення 37, причому захворювання являє собою злоякісне захворювання. 42. Макромолекула, нуклеїнова кислота, клітина, клітинні лінії або фармацевтична композиція для застосування згідно з варіантом здійснення 36 та/або варіантом здійснення 37, причому захворювання являє собою респіраторні захворювання.

Зо 43. Макромолекула, нуклеїнова кислота, клітина, клітинні лінії або фармацевтична композиція для застосування згідно з варіантом здійснення 36 та/або варіантом здійснення 37, причому захворювання є пов'язаним із трансплантацією, зокрема, є її наслідком. 44. Спосіб лікування, який передбачає введення макромолекули, зокрема, антитіла або його антигензв'язувального фрагмента або міметика згідно з будь-яким із варіантів здійснення 1-26, або нуклеїнової кислоти згідно з будь-яким із варіантів здійснення 27-30, або клітини або клітинної лінії згідно з варіантом здійснення 31, або фармацевтичної композиції згідно з варіантами здійснення 32-34 пацієнту з захворюванням або з ризиком захворювання. 45. Спосіб лікування згідно з варіантом здійснення 44, причому захворювання являє собою аутоїмунне захворювання, зокрема, ревматоїдний артрит, розсіяний склероз, діабет І типу, аутоїмунний тиреоїдит та вовчак. 46. Спосіб лікування згідно з варіантом здійснення 44, причому захворювання являє собою запальне захворювання, зокрема, ІВО та енцефаломієліт. 47. Спосіб лікування згідно з варіантом здійснення 44, причому захворювання являє собою алергічне захворювання. 48. Спосіб лікування згідно з варіантом здійснення 44, причому захворювання являє собою злоякісне захворювання. 49. Спосіб лікування згідно з варіантом здійснення 44, причому захворювання являє собою респіраторні захворювання. 50. Спосіб лікування згідно з варіантом здійснення 44, причому захворювання є пов'язаним із трансплантацією, зокрема, є її наслідком. 51. Макромолекула, зокрема, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент або міметик, згідно з будь-яким із варіантів здійснення 1-26, або нуклеїнова кислота згідно з будь- яким із варіантів здійснення 27-30, або клітина або клітинна лінія згідно з варіантом здійснення 31, або фармацевтична композиція згідно з будь-яким із варіантів здійснення 32-34 для застосування в лікуванні пацієнта, зокрема, пацієнта-людини, який потребує трансплантації, та/або на якого незабаром чекає трансплантація, та/або пацієнта, який переніс трансплантацію. 52. Спосіб лікування, який передбачає введення макромолекули, зокрема, антитіла або його антигензв'язувального фрагмента або міметика згідно з будь-яким із варіантів здійснення 1-26, або нуклеїнової кислоти згідно з будь-яким із варіантів здійснення 27-30, або клітини або бо клітинної лінії згідно з варіантом здійснення 31, або фармацевтичної композиції згідно з варіантами здійснення 32-34 пацієнту, який потребує трансплантації, та/або на якого незабаром чекає трансплантація, та/або пацієнту, який переніс трансплантацію. 53. Антиген, в якому епітоп містить або складається з послідовностей з сайту 265 у СО127, зокрема, що містять щонайменше 3, 4, 5, 6 або 7 послідовних амінокислот з сайту 26 у СО127. 54. Антиген згідно з варіантом здійснення 53, в якому епітоп містить або складається з послідовностей з сайту, що складається з амінокислот 109-127 у 5ЕО ІЮ Мо:114, зокрема, з сайту, який складається з амінокислот 110-125, 112-125, 112-120, зокрема, що містять щонайменше 3, 4, 5, 6 або 7 послідовних амінокислот з зазначеного сайту. 55. Антиген згідно з будь-яким із варіантів здійснення 53 або 54, в якому епітоп містить щонайменше 3, 4, 5, 6 або 7 послідовних амінокислот з СО127, при цьому зазначені послідовні амінокислоти містять Р112 та/або 1115. 56. Антиген згідно з будь-яким із варіантів здійснення 53-55, в якому епітоп складається з або містить послідовність зЗЕО ІЮ Мо:116, зокрема, містить послідовність ЗЕО ІЮ Мо:86. 57. Антиген згідно з будь-яким із варіантів здійснення 53-56, в якому епітоп також містить послідовності, зокрема, щонайменше 3, 4, 5, 6 або 7 послідовних амінокислот, з домену 01 в

С0127, зокрема, з амінокислот 1-98 у БЕО ІЮ Мо:114. 58. Антиген згідно з варіантом здійснення 57, в якому епітоп містить послідовність людського

СО0127, що містить або складається з послідовності ЗЕО ІЮ Мо:115, зокрема, що містить або складається з БЕО ІЮ Мо:110. 59. Антиген згідно з будь-яким із варіантів здійснення 53-58, в якому епітоп також містить послідовності, зокрема, щонайменше 3, 4, 5, 6 або 7 послідовних амінокислот, з амінокислот 180-220 у БЕО ІЮ Мо:114, зокрема, при цьому зазначені послідовності з амінокислот 180-220 у

ЗЕО ІЮ Мо:114 складаються з або містять послідовність ЗЕО ІЮ Мо:117, зокрема, містять або складаються з 5ЕО ІЮО Мо:111. 60. Антиген згідно з будь-яким із варіантів здійснення 53-59, в якому епітоп складається з або містить послідовності людського СО127, що складаються 3: послідовності 5ЕО ІЮ Мо:110 або послідовності ЗЕО ІЮО Мо:115; послідовності 5ЕО ІЮ Мо:111 або послідовності ЗЕО ІЮО Мо:117; та послідовності 5ЕО ІЮ Мо:86 або послідовності ФЕО ІЮО Мо:116. 61. Антиген згідно з будь-яким із варіантів здійснення 53-60, в якому епітоп не містить більш ніж 3, 4 або 5 послідовних амінокислот з послідовності амінокислот 99-108 у 5ЕО ІЮ Мо:114, та/або не містить більш ніж 3, 4 або 5 послідовних амінокислот з послідовності амінокислот 128- 179 у 5ЕО ІЮ Мо:114, та/"або не містить більш ніж 3, 4 або 5 послідовних амінокислот з послідовності амінокислот 220-239 у 5БЕО ІЮО Мо:114, зокрема, не містить більш ніж 3, 4 або 5 послідовних амінокислот з будь-якої з зазначених амінокислотних послідовностей у 5ЕО ІЮ

Мо:114. 62. Антиген згідно з будь-яким із варіантів здійснення 53 або 60, в якому послідовність епітопа людського СЮО127, що містить ЗЕО ІЮ Мо:111, не продовжується так, щоб вона містила амінокислоти, суміжні з зазначеною послідовністю в послідовності людського СО127 більш ніж на 1 амінокислоту з М-кінця або більш ніж на 7 амінокислот з С-кінця. 63. Антиген згідно з варіантом здійснення 61, в якому послідовність епітопа людського

С0127, що містить 5ЕО ІЮ Мо:110, не продовжується так, щоб вона містила будь-яку з М- кінцевих та/або С-кінцевих амінокислот, суміжних із зазначеною послідовністю в послідовності людського СО127. 64. Антиген згідно з будь-яким із варіантів здійснення 53-63, в якому послідовність епітопа людського СО127, яка містить 5ЕБЕО ІЮ Мо:111, не продовжується так, щоб вона містила амінокислоти, суміжні з зазначеною послідовністю в послідовності людського СО127 більш ніж на 30 амінокислот з М-кінця або більш ніж на 30 амінокислот з С-кінця. 65. Антиген згідно з варіантом здійснення 64, в якому послідовність епітопа людського

БО СО0127, яка містить ЗЕО ІЮО Мо:111, не продовжується так, щоб вона містила будь-яку з М- кінцевих та/або С-кінцевих амінокислот, суміжних із зазначеною послідовністю в послідовності людського СО127. 66. Антиген згідно з будь-яким із варіантів здійснення 53-65, в якому епітоп являє собою ідентичний епітоп, зокрема, в якому пептиди з СО127, що містяться в зазначеному епітопі, присутні в конформації, яка імітує конформацію відповідних пептидів у нативному СО127 або його позаклітинному домені, зокрема, в СЮО127 у його мономерній формі без ліганду, у його формі, зв'язаній з ус, та/або у його формі, зв'язаній з ЇЇ -7. 67. Антиген згідно з варіантом здійснення 66, в якому епітоп являє собою ідентичний епітоп, у якому пептиди з СО127 зв'язані з жорстким молекулярним кістяком, що підтримує їх у бажаній бо конформації, зокрема, такий антиген, одержаний із використанням технології СГІР5.

68. Епітоп, який визначений у будь-якому з варіантів здійснення 53-67. 69. Нуклеїнова кислота, яка кодує антиген, який визначений будь-яким із варіантів здійснення 53-67. 70. Спосіб одержання антитіла, який передбачає імунізацію тварини, відмінної від людини, антигеном, який визначений в будь-якому з варіантів здійснення 53-67. 71. Спосіб добору антитіла, фрагмента антитіла або міметика антитіла, зокрема, антитіла, одержаного, як описано в варіанті здійснення 70, його фрагмента або міметика, який передбачає стадію аналізу зв'язувальної здатності зазначеного антитіла по відношенню до щонайменше одного антигену, який визначений в будь-якому з варіантів здійснення 53-67, зокрема, при цьому зазначений спосіб передбачає декілька таких послідовних стадій, причому на кожній стадії аналізують зв'язувальну здатність по відношенню до окремого пептиду, що складається з однієї суміжної послідовності в СО127. 72. Спосіб добору макромолекули, зокрема, антитіла, зокрема, антитіла, одержаного, як описано в варіанті здійснення 70, або антигензв'язувального фрагмента або міметика такого антитіла, який передбачає або який складається зі стадії дослідження зв'язувальної здатності макромолекули по відношенню до СО127, зокрема, по відношенню до його антигену, який визначений у будь-якому з варіантів здійснення 53-67, та необов'язково проведення добору макромолекул згідно з варіантом здійснення 20. 73. Спосіб добору макромолекули згідно з будь-яким із варіантів здійснення 71 або 72, причому антиген містить декілька несуміжних пептидів в СО127, та при цьому спосіб передбачає декілька стадій, причому кожна з зазначених стадій складається з дослідження зв'язувальної здатності макромолекули по відношенню до одного з зазначених пептидів СО127. 74. Спосіб, зокрема, згідно з будь-яким із варіантів здійснення 71-73, добору макромолекули, зокрема, антитіла, зокрема, антитіла, одержаного, як описано в варіанті здійснення 70, або антигензв'язувального фрагмента або міметика такого антитіла, що передбачає або який складається зі стадії дослідження інтерналізації СО127 в клітини, які експресують СО127, індукованої присутністю макромолекули. 75. Спосіб, зокрема, згідно з будь-яким із варіантів здійснення 71-74, добору макромолекули, зокрема, антитіла, зокрема, антитіла, одержаного, як описано в варіанті здійснення 70, або

Зо антигензв'язувального фрагмента або міметика такого антитіла, що передбачає або який складається зі стадії дослідження інгібування макромолекулою індукованої 1І-7 інтерналізації

С0127 в клітини, які експресують СО127, та, необов'язково, проведення добору макромолекул згідно з варіантом здійснення 3. 76. Спосіб, зокрема, згідно з будь-яким із варіантів здійснення 71-75, добору макромолекули, зокрема, антитіла, зокрема, антитіла, одержаного, як описано в варіанті здійснення 70, або антигензв'язувального фрагмента або міметика такого антитіла, що передбачає або який складається зі стадії аналізу здатності зазначеної макромолекули до порушення, шляхом свого зв'язування з СО127, зв'язування СО127 з ус-ланцюгом. 71. Спосіб, зокрема, згідно з будь-яким із варіантів здійснення 71-76, добору макромолекули, зокрема, антитіла, зокрема, антитіла, одержаного, як описано в варіанті здійснення 70, або антигензв'язувального фрагмента або міметика такого антитіла, що передбачає або який складається зі стадії дослідження підвищення дозрівання ОС, що індукується Т5ІР. у присутності макромолекули, та, необов'язково, проведення добору макромолекул згідно з будь- яким із варіантів здійснення 22-26. 78. Спосіб згідно з будь-яким із варіантів здійснення 71-77, який додатково передбачає одну або декілька з наступних стадій: а. дослідження інгібування макромолекулою індукованої ІЇ-7 передачі сигналу, зокрема, фосфорилювання 5ТАТ5; р. дослідження інгібування макромолекулою індукованого Т5І Р продукування ТАКС; с. дослідження інгібування макромолекулою експресії «а4-, 8В7- та/або а4/р7-інтегринів, зокрема, експресії на клітинній поверхні на Т-лімфоцитах.

Список літератури

Адатв, А.В., Реагзоп, Т.С., апа І агзєеп, С.Р. (2003). Неїегоїосдоив5 іттипйцу: ап омепоокКеа

Брате" ю юІегапсе. Іттипої. Нєм. 196, 147-160.

АІридциегдне, А.5., Сопезао, С.5., Рохаї!, Е.В., Зоагев5, К.5., Місіогіпо, К.М.М., апа Бошза, А.Е. (2007). Ваїє ої іпсгеавзе іп сігсшайіпод І--7 апа 055 ОЇ ІІ -7НаїІрна ехргезвіоп дінег іп НІМ-1 апа НІМ-2 іптесіопе: їмо Іутрпорепіс дізеабзе5 мйй 5ітіїаг пурепйттипе асіїмайоп Биї аївіпсі ошсотев. у.

Іттипої. Вайіт. Ма 1950 178, 3252-3259.

Васа, М., Ргевіа, І.6., О'Соппог, 5.)., апа Умеїі5, 9У.А. (1997). Апібоду Ппитапі?гайоп ив5іпд 60 топомаїепі рнаде аїізріау. У. Віо!. Снет. 272, 10678-10684.

Мап Водедот, 0., 7Нопа, у., Корр, М., Оина, С., Кіт, М.-5., Віга, І., МУеїдепй, О., Тупег, х.,

Рапавєу, А., Мода, А., єї а. (2012). ОйШегепсез іп зідпаїїпа (пгоцди їШте В-сеї! ІєиКетіа опсоргоївїп

САГЕ2 іп тезропзе о Т5І Р апа Шгоцди тшапі УАК2. Віоса 120, 2853-2863.

Во5Ппцігеп, Н.5., Магзаєп, С., Тикквіга, У., Ноззапі, С.)., біооївіга, у)., Сорієу, С., апа Зепмжатрот, К. (2014). А сотрбіпаїййоп ої іп міо Іесппідцев ог ейісієепі аівсомегу ої Типсііопаї топосіопаї апіїбодієз адаіпвї питап СХСО спетокіпе гесеріог-2 (СХОСН2г). тАбБз 6, 1415-1424.

Воц-Чогдап, Н., Езепвієп, У.Н., Мапіпе2-Погаєїа, М., Репагапда, С., біштрі, М., апа

ВіІнезюпе, 9.А. (2011). Іпійпвіс апа ехійпвіс сопіго!ї ої регірпега! Т-сеї!Ї юІегапсе ру совіїтшаюгу тоїесціе5 ої Ше СО28/87 Таптійу. Іттипої. Кем. 241, 180-205.

Вгоих, В., Неїпо5, М., МепКеп, К., Ниттепв, 9.-Г., Непзеп, К., Мап М/і|)теегїзси, В., апа

Зііпіввеп, Р. (2010). Наріоїуре 4 ої Ше тийріє зсіегозіз-аззосіаїей іпіепецйКіп-7 гесеріог аІрна депе іпїнепсев Пе Гедиепсу ої гесепі Іпутіс етідгапів. Сепе5 Іттип. 11, 326-333.

Снавзоих, О.М., ІіІпаге5-Сти7, І.С2., Вагіп, Н., апа еїапівіамеКі, М. (1988). К-сеїІ-теаіаївай суюїохісйу іпдисед мій гаї топосіопа! апійбодієв. І. Апііродіє5 ої мапйоив ізоїуре5 айег іп ІНеїг арішу ю іпдисе суїоїохісйу тедіагеа Бу гаї апа питап еїПесіог5. Іттипоіоду 65, 623-628.

Споїніа, С., апа ГевзкК, А.М. (1987). Сапопіса! 5іШисійге5 Тог Ше ПНурегмагіарбіє гедіопе ої іттиподіоБиїїпв5. у. Мої. Вісі. 196, 901-917.

Овїпіпдег, Р. (1990). МоїІесшіаг сіопіпа: А Іарогаїюгу тапиа!: 2па єд. Еаіїеа Бу У. Затргоок, Е.

Е. Етпйвсп, апа Т. Мапіаїї5. Соїа бргіпа Натотг І арогаюгу Ргезз, Соїд Зргіпу Нагброг, МУ, 1989 (іп З моЇштев). Апаї. Віоспет. 186, 182-183.

Оеїмев, Р.)., Мапліп, 5.)., Випоп, О.К., апа Коїй, І.М. (2011). Койг5 Еззепіда! ІттипоЇоду (опп

М/їеу б 5Опв).

Оеписсі, С.б., МіїснеїІї, 9У.5., апа Зпітіги, М. (2009). Іпієедгіп їмпсіп іп Т-сеіЇ потіпд їо

Іутрпоїа апа попіутрноїа віїтев: деціпу ІПеге апа в5іауїпу ІПеге. Стії. Вем. Іттипої. 29, 87-109.

Бивійп, М.І.., апа Нам, А.5. (1999). Совіїтиціайоп: Биїаіпа ап іттипоіодіса! зупарзе. Зсієпсе 283, 649-650.

Еджага с. Вошеадде, 5.0.С2х. (1993). ВезНаріпу апіїродієв юг ІНегару. 13-44.

Намеї, 0.9У., Магпез, 5.І., Вгузоп, С.9., РієЇїд, 5.А., Мов5, А.., РасКкнат, С, апа Ріамеї!, 5.0. (2006). Тне апіі-СО20 апіїроду пихітар адтепів їйе іттипозресіїс Іпегарешііс еПесіїмепевв5 ої ап апі-СО19 іттипоїохіп адігесієй адаінві питап В-сеї! Іутрпота. Вг. у). Наетайо!. 134, 157-170.

Сазеїйвіме, 5., Маїепіїпі, О., Манаамігаг, 5., НешШу, М., ЕНтп5і, А., апа Мавигег, М. (2010).

Рерііде тістоатау-базей ідепіййсайоп ої Мусобасіелйит Шбегсціовзіє ерпйоре бБіпаіпуд юю НІіА- рав170101, ОАВІ171501, апа ОАВ170401. Сіїп. Массіпе Іттипої. СМІ 17, 168-175.

Сопи, с, Вімега-Міемев, у., апа І еу, К. (2009). Воїє ої Беїа?7 іпіедгіпзв іп іпіезііпа! ІЇмтрпосуїе / потіпд апа гегепійоп. Ст. Мої. Меа. 9, 836-850.

Стакоці, А., Вготієу, 5.К., Зйитеп, С., Юамі5, М.М., Зам, А.5., АМПеп, Р.М., апа Ривійп, М... (1999). Тне іттипоіодіса! зупарзе: а тоЇесшаг тасніпе сопігоїййпу Т сеї! асіїмайоп. Зсієпсе 285, 221-227.

Наав, 9., Когрогаї, М., Зспмаг2, А., Ваїїпі, В., апа У/Пдетапп, В. (2011). ТнНе іпепеикКіп-7 гесеріог а спаіп сопігіршез (о апегед поптеозіавів ої гедшаюгу Т сеїв іп тиПіріє 5сіего5і5. Еик. у.

Іттипої. 41, 845-853.

Нацпйдероиго, Т., Роїгпег, М., апа Мапроме, В. (2009). Оерієїїпа Т-сеї! зирроршіайоп5 іп огдап тмапзріапіацйоп. Тгапзрі. Іпі. ОМ. У. Єшг. ос. Огдап Тгапзріапі. 22, 509-518.

Не, В., апа Сепа, В8.5. (2010). Тнутіс вігота! ІутрНороіеєїнп. Апп. М. У. Асай. з5сі. 1183, 13-24.

Непгіднез, С.М., Віпо, у., Міррв, В.)., Сстанат, Са.)., апа Вагаїа, 9.Т. (2010). 11 -7 іпдисез гарій сіаїйгіп-теаіагтеад іпіетаїї2гайоп апа ЧАКЗ-дерепаепі дедгадаїйоп ої І -7Ваїрна іп Т сеїїв. Віоса 115, 3269-3277.

Моп Ноггіеп, Н.Н., Одогек, С., Віапснага, М., Оеттієг, С., Сієбзе, б., М/іпКІег, К., Кацшр, М.,

Вегаєг, М., УЧогаап, І., апа Запаїд, М. (2010). Ргодисіп ої поп-тисозуїаївй апіїродієз Бу со- ехргезвіоп ої Неіегоїсдоив С0ЮР-6-деоху-О-Іухо-4-пехціозе гедисіазе. Сіусоріоіоду 20, 1607-1618.

Іпаба, К., Іпаба, М., Ууйтег-РаскК, М., НаїснсоскК, К., Нодевз, В., апа бівіптап, В.М. (1995).

Ехргеввіоп ої В7 совіїтшціанцг тоїесшцев оп тоив5е депанйіс сеїІ5. Дам. Ехр. Меа. Віої. 378, 65-70.

Уапмаїа, 5.Р., Абгатв;в, Е., Вепзоп, А., Годетап, 9., апа непо, Т. (2011). Тне гоїе ої Іутіс зіготаї Іутрпороїевійп іп Те іттипораїподепезів ої аїоріс дептаїйів. Сіїп. Ехр. АПегду 9. Вг. бос.

Аїегау Сіїп. Іттипої. 41, 1515-1520.

Кабаї, Е.А., Ми, Т.Т., Веїд-МіїПет, М., Регту, Н.М. апа Сонезтап, К.5. (1992) бБедиєпсев ої

Ргоївїп5 ої Іттипоіодісаї! Іптегевзі (ОІАМЕ рибіїєпіпо, 1992).

Кет, В., Ктаупом, Е., І ее, І..-Р., Вау, В. (2013). Ресеріог оссирапсу апа іпіегпаіі2айоп ої ап апіі-ІЇ -7 гесеріог апіїроду. Суїокіпе 63, 276-277. (510) Кепт, В., Ії, М., Вопо, С., І ее, І..-Р., апа Кгаупом, Е. (2015). Весеріог оссирапсу апа ріоскіпд ої ЗТАТЬ відпаїйпу Бу ап апії-ІІ/-7 гесеріог « апіїбоду іп супотоЇди5 топКеуз. Суїотеїгу В Сіїп.

Суют.

КтепепргіпК, М., Снаті, М., Сиймоці, І., АІгагі, Р.М.,Ресогагі Р., Ридзієу А.Р. (2008). Апіісіа

Біпаїпа ргоївїп5 (Айійіп5) аз ргобез їог сопіогтаїййопаї! спапдез іп зестгеїіп РОЮ. / Мої! Віої. 2008 Мом 28.

І епапс, М.-Р., Сіцдісеїййї, М., Сіпезіосих, С., Водтег, у., МіоПег, МУ/., Вопігор, К., І етайге, М.,

Маїїйк, А., Вагбіє, М., апа Спаште, 0. (1999). ІМСТ, Ше іпіегпайопа! ІтМипосепетісв дагаразе.

Мисівїс Асіаз5 Не. 27, 209-212.

І ві, С., 7Ннапа, У., Мао, МУ., Каріап, М.Н., апа 27Нои, В. (2011). Тнутіс Зіотаї І утрпороїіеїїп

Іпїепегез м/йп Аіїплау ТоіІегапсе Бу Зирргезвзіпуд Ше Сіепегаййоп ої Апіїдеп-5ресіїс Ведшаюгу Т

СеїІв. У. Іттипої!. 186, 2254-2261.

Ї о, Н., Ми, 2., ОЇ, 5., Уп, МУ., Нап, В., УМи, 9. (2011). Ернгіпр1 апа Ерпгіпрег аге аззосіаїтейд м/йн іптепПеикКіп-7 гесеріог с« апа геїага й5 іпіегпа|й2ацоп їот Ше сеїЇ зиптасе. ) Віої Спет. 2011 Оес 30:286(52):44976-87.

Мапіп, А.С.В. (2001). Ргоївїп Зедиєепсе апа бігисіиге Апаїувів ої Апіїроду Магіабіє ботаїпв. Іп

Апііроду Епдіпеегіпо, О.К. Копіегтапп, апа 0.5. Юабеї, еадв. (Зргіпдег Ветгіїп НеїдеїБрего), рр. 422- 439.

Маг2исснНеїйї, ВА., Ніхоп, 9У.А., 5рої5Кі, А., Спеп, Х., Її, М/.О., Наїї, М.С., УУШене-ВгоУл, ».,

Нигміа, А.А., І еопага, М/.у., апа Оигит, 5.К. (2008). ОєемеІортепі ої гедшаюгу Т сеїІ5 гедцігез ЇЇ - 7Ваїрна зійтшіацоп Бу 1-7 ог Т5І Р. Віоса 112, 3283-3292.

МеЕїгоу, С.А., бопт, ..А., апа Уаївн, 5.Т.8. (2009). Бігисішга! апа Біорпузіса! зішаїєв ої Ше питап 1--7/--7 Варна сотріех. 5ігисі. І опа. Епаї. 1993 17, 54-65.

МеЕїгоу, С.А., НоїЇПапа, Р.)., 2Нао, Р., іт, У.-М., М/еїІв, Г., Еібепвівїп, Е., апа УаївнН, 5.7.8. (2012). зігистшга! геогдапігайоп ої Шїе іпіепПешкКіп-7 відпаїїту сотріех. Ргос. Май). Асад. 5сі. 0. 5. А. 109, 2503-2508

Міснеї, Г., ВепНеїої, Ї., Рейге, 5., УМіепемув5Кі, 5., І еїеге, Е., Вгацдеаи, С., Вгоцага), 5., зоШШои, 4.-Р., апа І аріаца, 0.-А. (2008). Раїепів м/йп геІарзіпд-тетіціпд тийіріє 5сіеговів Наме поттаї Тгед їпсіоп мпеп сеї ехргеввіпа ІІ -7 тесеріог аірпа-снаїп аге ехсіцадейа їот (Не апаїувів.

У. Сііп. Іпмеві. 118, 3411-3419.

Коо) Мапсеу, 5., Натгаоці, М., Моиззаїа, 0., старбетг, І., Віепмепи, у., апа Ріошгє, В. (2008). Зегит іптепеикКіп-6, зоїШбіє іпіепПеицКіп-б гесеріог апа Стгопп'5 аіїзеазе асіїміу. ід. Оі5. 5сі. 53, 242-247.

МієденеїІпег, а., аттепв, А., Мипаїді, О., сеогдев, С.)., Зспавїег, МУ., зспуаідег, М., ЕгапКе,

А., Міеснтапп, К., Уепемеїіп, 5., Зіооївіга, ..МУ., єї аї. (2011). Ерпоре сНагасієгігайоп апа сгувіа! віписіиге ої САТО1 ргоміде іпвіднів іпіо Ше тоїіесшціаг равів Тог їуре ІЛІ аівііпсіоп ої СО20 апііродіев.

Віоса 118, 358-367.

Оїїмієг, 5., Уасору, М., Вийоп, С., Воцієїгтеац, 5., МоїІвєї, Т., Метієге, О., Апдеї, А., Бапеї, 5.,

ЗошШои, В., Ссцуепеппеих, Е., еї аіІ. (2010). ЕВбб сеї! ІПпе, а диск етргуопіс 5ієт сеїІ-депмеа зирвгігаїе ог Ше іпаивіа! ргодисіп ої Шегарешіс топосіопа! апіїродієз міт епнапсейа АрСС асіїмпу. тАбБз 2, 405-415.

ОіКнапий, Р.В., Восптап, У., Вододаї, М., МаїЇснпіпкпци, Е., МУеіке2а, К., Хи, М., Стев5, В.Е.,

Незадопег, С., І еопага, М/.У., апа Вігадуп, А. (2011). Тнутіс зіота! ІутрНороіеїнп і5 а Кеу тедіаг ої ргєаві сапсег ргодгезвіоп. у). Іттипої. Вайіт. Ма 1950 186, 5656-5662.

Мап Оовіетоці, У.М., мап Етві, У.Ї., ВаККег, Н.Н., Ргєїег5, Е.МУ., Зспацепрего, А.У., Виїйег, 0.9., Емегв, 5., Коортап, у.Р., апа де Міцне, Т. (2001). Ргодисійоп ої апіі-СОЗ апа апіі-СО7 гісіп А- іттипоюхіпв ог а сіїпіса! рії вішау. пі. У. Рпапт. 221, 175-186.

Рарас, 0.І., Ноуев, у., апа Тотег, К.В. (1994). Еріюре тарріпуд ої Ше давійп-геІєавзіпд рерііде/апіі-ротревіп топосіопа! апіроду сотрієх Бу ргоїеоїувзів тоПомеа Бу таїгіх -а55івієй Іазег дезогрійп іопігайоп тазт5 зресіготеїгу. Ргоївєїп сі. 3, 1485-1492.

Рак, І.5., Мапіп, О., СаКа, К., СіІіпіак, В., Сі Бапіо, У.Р., МиПШег, МУ., І агааеєзрада, 0.А.,

Сореїапа, М.(с., УепКіп5, М.А., Ра, А.(., еї аі. (2000). Сіопіпд ої Ше тигіпе Шутіс віготаї

Іутрпороієїіп (Т5І Р) гесеріог: Гоптаїйоп ої а гипсійопа! Не(еготегіс сотрієх гедціге5 іпіепеицкКіп 7 гесеріог. 9). Ехр. Мед. 192, 659-670.

Райз, 0., апа МУіпієг, сх. (2006). Марріпа ерйоре5 апа апіідепісйпу Бу зіе-дігесієд таФвкКіпа.

Ргос. Маї!. Асад. Зсі. 0. 5. А. 103, 9172-9177.

Роїгіег, М., Напйдероиго, Т., Вгідпопе, С., ОйПек, М., Негуошеї, у)., Міпашії, О., Сошіоп, Е., де ЗШУ,

В.У., Тпебеї, Р., Віапсно, а., єї аї. (2011). Апііроду-теаіаїєд аерівеїйоп ої ІутрНосуїе-асіїмайоп депе-3 (ГАС-3(-) )-асіїмаїей Т Іутрпосуїез ргемепіз деіауєа-їуре Нурегзепейймйу іп поп-питап ргіта!ев. Сіїп. Ехр. Іттипої. 164, 265-274.

Касаре, М., Маппоме, В., ЗоцШои, 9.-Р., апа Вгоцага, 5. (2009). Іпіепеишкіп 7 гесеріог аІрна а 60 а роїепіда! егарешіїйс їагдеї іп ігапзріапіайоп. Агоп. Іттипої. Тег. Ехр. (УМагв2.) 57, 253-261.

Вадетг, С., СНегези, 0.А., апа Вагбавз, С.Р. (1998). А рпаде адігріау арргоасні ог гаріа апіїбоду

Ппитапігаїйоп: дезідпед сотбріпаюгіа! М депе Іргагієв. Ргос. Маї!. Асай. сі. ). 5. А. 95, 8910-8915.

Веспеє, Р.А., боцтвії5, М., Сбоптап, О.М., Сійога, Т., іш Му, пиїЇ, Тгамі5, М., 2!цгамекі, 5.М.,

УЧоппвоп, 9., ім, М.уУ., Зріїв, Н., еї а. (2001). Нитап Шутіс 5ітотаї! Іутрпороїіеїїп ргеїегепііану в5ітша(ез туєїоїйа сеїІв. у). Іттипої. Вайт. Ма 1950 167, 336-343.

Кізрегу, К., Роазіадй, 9., апа Апаеге5оп, У. (2011). Зупегодівійс апіїсапсег еПесів ої Те 9.2.27РЕ іттипоїохіп апа АВТ-737 іп теіапота. Ріоб5 Опе 6, е24012.

Воап, Р., ВеїІ, В.О., 5юКіазек, Т.А., Кіїазіта, М., Нап, Н., апа 7ієдіег, 5.Е. (2012). Тне типПіріє

Тасеїв ої Шутіс віготаї! ІутрПороїеїйп (Т5І Р) ашгіпд аПегдіс іпїаттаїйіоп апа реуопа. У. І еикос.

Віо!. 91, 877-886.

Восптап, У., Казпуар, М., Вобіпзоп, Сі.МУу., Закатоїо, К., ботег-Ноагіднег, у., Мадпег, К.-О., апа Геопага, МУ.)У. (2010). Тнрутіс 5іготаї! Іутрпороієїіп-тедіаєд ЗТАТ5 рпозрпогуїайоп міа

Кіпазез ЧАК апа УАК2 геуєаї5 а Кеу аінйегепсе їот ІІ -7-іпдиседа відпаїїпд. Ргос. Маї!. Асай. 5сі. 0.

З. А. 107, 19455-19460.

КозокК, М.9У., Меноп, О.Е., Нагтів5, І.9У., Ва|огакй, 9., Неїїбігбт, К.Е., НеїївігОт, І., Стги7, О.А.,

Кіївїепо5оп, К., Піп, Н., Низе, МУ.О., еї а. (1996). А сотрбріпайютіа! Іргагу вігаїеду Тог Ше гаріа

Питапігайоп ої апіісагсіпота ВНАЗ6 Раб. .). Віої. Спет. 271, 22611-22618. зЗепіепибег, 5., ЗКеїта, А. (2002). Типіпод Ідапа айіпіу, 5ресіїсйу, апа гоїдіпу табіїйу ої ап епдіпеегед Іросаїїп мапапі -- а 5о-саІеа "апіїіса|іп'-- ивіпд а тоіесшаг гтапдот арргоасі. Віорпув

СПпет. 2002 Мау 2:96(2-3):213-28

Зпам, А.5., апа Ривійп, М.І. (1997). МакКіпу їйе Т сеї! гесеріог до Ше дівіапсе: а юроіодіса! міему ої Т сеї! асіїмайоп. Іттипку 6, 361-369.

Зпіпонага, Т., Метоїо, У., Капаї, Т., Катеуата, К., ОКатоїйо, В., Т5испіуа, К., МаКкатига, Т.,

Тоївика, Т., ІКша, К., апа У/аїтапабе, М. (2011). Оргедшаїеа 1Ї/-7 гесеріог « ехргезв5іоп оп соїйодепіс тетогу СО4- Т сеї тау рапісіраїє іп Те демеіортепі апа регвівієпсе ої спгопіс соїйів. у). Іттипої. Вайт. Ма 1950 186, 2623-2632.

Зпоснаї, С., Таї, М., Вапаараїййї, О.ВА., Раїті, С., Саптоге, І., ї6 Ктоппіє, С., Сагіо, С.,

Саггапіда, Сх., Киїогік, А.Е., єїапиа, М., єї аї. (2011). Саіп-оїпсіоп тиїайопв5 іп іпіепеикіп-7 гесеріог-а (І-7К) іп спідпоса асше Іутрпобіавійс ІеиКетіав. У. Ехр. Меа. 208, 901-908.

Зо ЗКеїта, А. (2008). АПегпаїїме Біпаїіпу ргоїєїп5: апііса|йпе - Нагпеззіпа Ше зігосішчга! ріавіїсйу ої

ІНе Іросаїїп Ідапа росКеї тю епаіпеег помеї! ріпаїпуд асіїмціез. РЕВ5 у). 2008 дип/275(11):2677-83. дої: 10.1111/.1742-4658.2008.06439.х. Ериб 2008 Арг 24. зЗисКач, 0., КОП, 9., Кагмаш, с., Зсппеїдег, К., Сазагено, М., Війег-Зцептапп, 0., апа

РіггубуїзКі, М. (1990). МоІесшаг еріюре ідепійісайоп Бу Іїтіїєа ргоїеоїувів ої ап іттобійї2еа апіїдеп- апіїроду сотрієх апа тав5 зресіготеїгіс реріїде тарріпод. Ргос. Маї!. Асад. 5сі. О. 5. А. 87, 9848-- 9852

Тауїог, В.С., 7арн, С., Ттоу, А.Е., Би, М., сзца, К.У., Сотеаицй, М.НВ., апа Апів, О. (2009). ТІ Р гедшіатез іпіевіїпа! іттипйу апа іпїтаттаїйоп іп тоибе тоае!5 ої НеІтіпій іп'есіп апа соїйів. 5.

Ехр. Меа. 206, 655-667.

Тевіїпа, 9У.Г., МасКив, М/.У.М., ММіедтап, 1І.9.).М., мап деп Вгакеї, У.Н.М., Веєгз, 5.А., Егепси,

В.В., мап Меепеп, Т., Ебеїїпо, 5., Мік, Т., Біооївіга, ..МУ., еї аІ. (2006). ТНне Біоіодіса! асіїмпу ої питап СО20 топосіопаї! апііродієв і5 ПпКей о ипідое ерйорез оп СО20. 9. Іттипої. Ваціт. Ма 1950 177, 362-371.

Тіттептап, Р., Риїк, УМ.С., апа Меїоєп, В.Н. (2007). ЕРипсійопа! гесопвігисіоп апа зупінеїййс тітісгу ої а сопіоптаїййопаї! ерйоре изіпд СГІРЗ ТесПпоіоду. 9. Мої. Весодпії. УМА 20, 283-299.

ММаівп, 5.Г.К. (2012). Бігисішга! іпзідніє іпіо (Ше соттоп у-спайп їТатіїу ої суїоКіпе5 апа гесеріог5 їтот Ше іпіепешиКіп-7 раштулау. Іттипої!. Нем. 250, 303-316.

МУаїапаре, М., Мапа, М.-Н., Геє, Н.К., Мо, Т., Мапа, М.-Н., Сао, МУ., апа іш, М.-У. (2005а).

Наззаї5 согризсієв іпзігисі депагйіс сей юЮ іпдисе С0О4-0025- гедшіайюгу Т сеїї5 іп питап

Шутив. Маїшйге 436, 1181-1185.

М/аїапабре, М., Напарисні, 5., Мапоїіе-Ргомові, М.-А., АпіопепкКо, 5., Гм, М.-у., апа Боштеїів, М. (20055). Нитап Т5І Р рготоїе5 СО40 Іїдапа-іпдисеа 1-12 ргодисіоп Бу туєїоід депанііс сеїЇв Биї таїпіаїп5 ІНеїк ТН2 ргітіпа роїепіа!. Віоса 105, 4749-4751.

Уе, у., Ма, М., Мадаєп, Т.Г., апа ОзієїІ, У.М. (2013). ЗВГ А5Т: ап іттиподіобиїййп магпабіе дотаїйп зедиепсе апаїувзів 1001. Мисівїс Асід5 Нев. 41, М/34-М/40.

Уіпод, 5., О'Соппог, В., Кай, 9., Мепо, О., Рапо, С., Соивіп5, О., 2папд, о., си, 5., зао, 7.,

Зпатії, В., єї а). (2008). Ехргеззіоп апа сеїІшіаг ргомепапсе ої ІШутіс вігота! Іутрпороієїіп апа спетокіпез іп райепів м/ййп земеге азійта апа спгопіс обзіписіїме риїтопагу адізеазе. у). Іттипо).

Вайціт. ма 1950 181, 2790-2798. 60 пі, К., Її, М., 2папо, Х., Сао, 7., Ваї, 9., МУчу, М., 2поиц, 5., Її, М., апа би, Г. (2014). а«4ф87

Іпїедгіп (ГРАМ-1) іє иргедшіаївєа аї ашШегозсієгоїїс Іебзіоп5 апа і5 іпмоїмейд іп ашйегозсіегов5іб ргодгезвіоп. СеїЇ. Рпузіо!. Віоспет. Іпі. у). Ехр. СеїІ. Рпувіої. Віоспет. Рпагтасої. 33, 1876-1887. 7попо, у., ЗНаптта, -., Ва), В., Раіарейна, 5.М., Ргазад, Т.5.К., Ниапо, Т.-С., Мода, А., Тупег,

УМ., мап Водедот, 0., М/еіпвіоск, О.М., еї аї. (2014). Т5І Р відпаїпу раїймжау тар: а ріаногт ог апаїувів ої ТОЇ Р-теадіаїеа зідпаїїпо. ОСаїабазе . Віо!. Оаїаразез Сигайоп 2014, райо07.

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«110» Еффім'юн «120» Антитіла, спрямовані проти СО127 -1305 8107448 -1505. 05 62/010117 «1515 2014-06-10 «1505 ЕР 15305078.6 -1515 2015-01-23 «1605 132 «170» РаїепіНп версія 3.5 -2105 1 «2115 1359 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 1 дсддідсадс юдвіддадіс юддодааддс сіаддсадс сідчадддіс ссідааасіс (10)

Зо Іїссіддсая ісісаддай сасісісаді дасіацаса іддссіддді ссдссадасі 120 ссааадаада дісддаац ддісдсаасс апйадіосса діддосісад ааснцасіаї 180 ссадасіссуд дааддодссо сісасіаїс Іссададайд аїдсааааад дадссісйс 240 7 сідсаааїда ссадісідаа дістаддас асддссасії апасідідсаадассдаю 300

Іїсідсасасі аїддішШаа сіасшоаї їасіддддсс ааддацдісаї даїсасадіє 360

Іссісадсіа дсассааддо сссаїсддіс Носсссіду сасссіссіс саададсасс 420

Іістдддоадса садсддсссі дддсідссід дісааддасі асіссссда ассдадасу 480 дідісдюдда асісаддсдс ссідассадс досдідсаса ссіїсссоддс ідіссіасад 540 7 Іссісаддас іІсіасісссі садсадсоід дідассдідс ссіссадсадсіпдоддсасс 600 садассіаса іІсідсаасодї дааісасаад сссадсааса ссааддідда саадааади 660 дадсссаааї спдідасаа аасісасаса Ідсссассді дсссадсасс даасіссід 720 ддчадассодїі садіснсосії споссссса ааасссаадду асасссісаї даїсісссдда 780 ассссюадао ісасадсаї чаїдаіддас ддадссасод аадасссіда даїсаадис 840 7 аасддіасуд юдасдодсої ддаддаіюсаї ааїдссаада сааадссудсу ддаддадсад 900

Тасаасадса сдіассдіді даїсадсодіс сісассдісс їдсассадда сіддсідааї 960 60 ддсааддаді асаадідсаа ддісіссаас ааадсссісс садсссссаї сдсдааааєс 1020 аїсіссааад ссаааддаоаса дссссдадаа ссасаддіді асасссідсс сссаїсссду 1080 даддадаюа ссаадаасса ддісадссід ассідссіда Ісаааддси сіаїсссадс 1140 дасаїсоассо ддадщада дадсааюда садссддада асаасіасаа дассасдссі 1200 сссодідсіда асіссдасдао сіссцсіс сісіасадса адсісассді ддасаададс 1260 аддіддсадс аддддаасої сисісаїдс іссаїдаїдс ададодсісі дсасаассас 1320

Тасасдсада ададссісіс ссідісіссу даїааатда 1359 -2105 2 «2115 452 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005 2

Аа Маї Сіп І еи Маї Спи Зег Сіу Спу Спу Гей Маї Сип Рго Спу Спу 1 5 10 15 зег і єи Гуз І єи 5ег Суз Аїа Маї 5ег СПу Ре ТНг ГГ еи Зег Азр Туг

Ко) 20 25 Зо

Туг Меї Ага Тр Маї Аго сСіп Аїа Рго Гуз Гу Спу Геи Сім Тер Маї 35

Аа Тниг Пе 5ег Аа бег Су І єи Агу Тнг Туг Туг Рго Авр 5ег Маї бо 40

Гуз Спу Ага Ре Тнг Пе 5ег Ага Авр Азр Аїа Гуз Агу 5ег І єи Рпе 65 70 75 80 45 Ї еи Сп Меї Тнг 5ег І єи І ув бег СІи Авр ТНг Аа Тнг Тут Туг Суз 85 90 95

Аа Агд Рго Меї 5ег Аа Ні Туг Сіу Ріє Авп Туг Рне Авр Тут Тр 50 100 105 110

Сіу Сп Сіу Ма! Меї маї Тнг Маї Зег Зег Аіа 5ег ТНг Гуз Спу Рго 115 120 125 55 зЗег Маї РНе Рго І ви Аа Рго 5ег Зег І уз Зег Тиг Зег Сіу пу ТНг 130 135 140 (516)

Аа Аїа І єи Стпу Суз І ви Ма! Гуз Ар Туг Ріє Рго Сіи Рго Ма! ТНг 145 150 155 160

Маї Зег Ттр Авп 5ег Сту Аа І еи Тнг ег Стіу Маї Ні Тнг Рпе Рго 165 170 175

Аа Ма! І єи Сіп бег Зег Спу Геи Туг Зег І єи 5ег Зег Маї Маї ТНг 180 185 190 маї Рго 5ег Зег 5егІ ви Спу ТНиг Сп Тне Тук Пе Сув Азп Маї Азп 195 200 205

Нів Гуз Рго 5ег Азп ТНг Гуз Маї Авр Гуз І уз Ма! Спи Рго Гуз 5ег 210 215 220

Суз Авр Гуз ТНг Ні Тиг Сув Ро Рго Суз Рго Аа Рго Си І єи І єи 225 230 235 240

Стпу Су Рго 5ег Маї РНе І єи Рне Рго Рго І уз Рго І уз Авр ТНг І єи 245 250 255

Ме! Пе Зег Аг9 Тиг Рго Сім Ма! Тиг Суз Маї Ма! Маї Авр Маї Зег

Ко) 260 265 270

Ніз Сіи Авр Рго Си Маї Гуз Рне Авп Тр Туг Ма! Азр Сіу Маї Спи 275 280 285 маї Ні Авп Аа Гуз Тнг Гуз Рго Агу СІм Спи Сп Тук Авп Зег ТНг 290 295 00

Туг Агу Маї Маї 5ег Ма! І еи Тнг Ма! І еи Нів Сіп Авр Ттр І еи Авп 305 310 315 з20 асіу Гуз Сім Туг Гуз Суз І уз Ма! бЗег Авп І уз Аа І єи Рго Аа Рго 325 330 335

Пе Аа Гуз ТАг Пе Зег Гуз Аа Гуз Спіу Сип Рго Агу Спи Рго Сп 340 345 350 маї Туг Тит Г ем Рго Рго 5ег Агу Спи Сім Меї ТАг Гуз Авп Сп Маї 355 360 365 зЗег І ей Тиг Суз І єи Маї Гуз Спіу РНе Туг Рго 5ег Авр Іе Аа Маї 370 375 380 (516)

Сім Тр Сім Зег Авп Спу Сіп Рго Спи Авп Авп Туг Гуз ТНг Тнг Рго 385 390 395 400

Рго Маї І єи Авр 5ег Азр Су 5ег РНе Рнеє І єи Туг зе" І уз І єи ТНАг 405 410 415 маї Авр Гуз 5ег Аг9 Тр СіІп Сп Сіу Авп Маї Рне Зег Суз 5ег Маї 420 425 430

Меї Ніз Си Аа І єи Нів Авп Ні Туг ТНг Сіп І ув 5ег І ей 5ег і еи 435 440 445 зЗег Рго Су І уз 450 -2105» З «2115» 645 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005 З

Зо дасаїссада Юасасацдіс іІссадсіїсс сюісюдсаї сісюддада аасідісасс (610) аїсдаащіс даасаадіда ддасашас ааддшад саддіаїса дсадаадсса 120 дадаааїсіс сісадсіссі дадїсіаїаді дсааавадсі їасаїацод додісссаїса 180 сдоансавдід дсадюддаїс (ддіасасад їайсісіса адаіааасад ссідсааш 240 даадайщцісд сааонаїй сідісаасад їайасдай аїссдсісдс днсоаЯйсі 00 дддассаадс ддадаїсаа асддасоудід дсідсассаї сідіснсаї сИпсссдсса 360 їстдаюдадс аднодаааїс (ддаасідсс Ісіднаоїі дссідсідаааасісіаї /-420 сссадададд ссааадіаса чіддааддід даїаасодссс іссааіїс99дд їаасісссад 480 дададідіса сададсадда садсааддас адсассіаса дссісадсад сасссідасу 540 сідадсааад садасіасда дааасасааа дісіасдссі дсдаадісас ссаїсадддс 600 сюадсісдс ссдісасааа дадснсаас аддддададі днад 645 «-210» 4 «2115 214 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність бо

«400» 4

Азр Пе Сип Меї ТАг Сіп Зег Рго Аа 5ег І єи Зег Аа 5ег І ви Спу 1 5 10 15

Сім Тнг Маї Тнг Пе Спи Суз Агу ТАг Зег Спи Авр Іе Туг Авп Спу 20 25 0)

Ї еи Авіа Тір Туг Сіп Сп Г ув Рго Сіу Гуз Зег Рго Сіп І єи Гей Маї 35 40 45

ТугЗег Аіа Авп 5ег І єи Нів Пе Спу Маї Рго 5ег Ага РНе Зег Спу 50 55 60 зЗег Сіу Зег Сіу ТНг Сіп Туг Зег Геи Гуз Пе Авп Зег І еи Сп Рпе 65 70 75 80

Сім Авр Маї Аа 5ег Туг Рне Суз Сіп Сп Туг Туг Азр Туг Рго Гей 85 90 95

Аа Ре Сіу Зег Спу ТАг Гуз І еи Спи Пе Гуз Ага ТНг Маї Аїа Аа 100 105 110

Зо

Рго Зег Маї Ре Пе Рне Рго Рго 5ег Авр Спи Сп Геи Гуз Зег Спу 115 120 125

ТА г Авіа бег Маї Ма! Суз І еи Гей Авзп Азп Ре Туг Рго Ага Сім Аа 130 135 140

І уз Маї Сп Тр Гуз Маї Азр Авп Аа І єи СіІп бег Сіу Авп 5ег Сп (145 150 155 160

Сіи Зег Ма! Тиг Спи Стпп Авр Зег Гуз Авр Зег ТНиг Туг Зег І еи Зег 165 170 175 зЗег ТигІ єи ТигГеи Зег Гуз Аіа Авр Туг Си Гуз Нів Гуз Маї Туг 180 185 190

Аа Суз Спи Маї Тнг Ніз Сп Су І єи Зег 5ег Рго Маї ТНг І уз 5Бег 195 200 205

Ре Азп Аг9 Сіу Сіи Суз 210 «2105» 5 60 0о«2115 1350

«212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005» 5 дсддідсадс юдвіддадіс юддодааддс сіаддсадс сідчадддіс ссідааасіс (10)

Іїссіддсая ісісаддай сасісісаді дасіацаса іддссіддді ссдссадасі 120 ссааадаада дісддаац ддісдсаасс апйадіосса діддосісад ааснцасіаї 180 ссадасіссуд дааддодссо сісасіаїс Іссададайд аїдсааааад дадссісйс 240 й сідсаааїда ссадісідаа дістаддас асддссасії апасідідсаадассдаю 300

Іїсідсасасі аїддішШаа сіасшоаї їасіддддсс ааддацдісаї даїсасадіє 360

Іссісадсіа дсассааддо сссаїсддіс Псссссідд судсссідсіс саддадсасс 420

Іїссдададса садссдсссі ддосідссід дісааддасі асіссссда ассдаїдасд 480 дідісдюдда асісаддсдс ссідассадс досдідсаса ссіїсссоддс ідіссіасад 540 7 Іссісаддас іІсіасісссі садсадсоїд дідассдідс ссіссадсад спддодсася 600 аадассіаса ссідсаасодї адаїсасаад сссадсааса ссааддідда саадададн 660

Зо дацдіссаааї аддіссссс адсссасса дсссадсас сідадіссі дддаддасса 720 їсадіснсс ЮНессссс аааасссаад дасасісіса ідаїсісссу дассссідад 780 дісасдаідсо ддіддоада соїдадссад даадасссся аддіссадії саасіддіас 840 7 даюдатдосо ддаддіодса гїааїдссаад асааадссдс ддааддадса дісаасадс 900 асодіассодїд іддісадсої ссісассдіс сідсассадо асіюддсідаа сддсааддад 960

Тасаадідса аддісіссаа саааддссіс ссдіссісса Ісдадаааас саїсіссааа 1020 дссааадддс адссссдада дссасадаїд їасасссідс ссссаїссса ддаддадаю 1080 ассаадаасс аддісадссі дассідссід дісаааддсі Ісіїіассссад сдасаїсдсс 1140 7 даюдавдвіддо ададсааідд дсадссоддад аасаасіаса адассасдсс ісссдідсід 1200 дасіссдася дсіссісії ссісіасадс адасіаасся юдасаадад саддіддсад 1260 дададодаа! існсісаю сіссдадацд сададосіс їдсасаасса сіасасасад 1320 аададссісі сссідісісс дддіааада 1350 «2105 6 «2115» 449 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність бо «220»

223» Синтетична послідовність «4005» 6

Аа Маї Сип І єи Маї Спи Зег Спу Сіу СПУ Гей Маї Сп Рго СПу Спу 1 5 10 15 зег і єи Гуз І еи Зег Суз Аїа Маї 5ег Спу РНе ТНг І єи Зег Азр Туг 20 25 0)

Туг Меї Ага Тр Маї Аго сСіп Аїа Рго Гуз Гу Спу Геи Сім Тер Маї 35 40 45

Аа Тнг Пе 5ег Аа бег Су І єи Агу Тнг Туг Туг Рго Авр 5ег Маї 50 55 60

Гуз Спу Ага Ре Тнг Пе 5ег Ага Авр Азр Аїа Гуз Агу 5ег І єи Рпе 65 70 75 80

Ї еи Сп Меї Тнг 5ег І єи І ув бег СІи Авр ТНг Аа Тнг Тут Туг Суз 85 90 95

Аа Агд Рго Меї 5ег Аа Ні Туг Сіу Ріє Авп Туг Рне Авр Тут Тр 100 105 110

Сіу Сп Сіу Ма! Меї маї Тнг Маї Зег Зег Аіа 5ег ТНг Гуз Спу Рго 115 120 125

З5 зЗег Маї Рпеє Рго І єи Аа Рго Су бЗег Агу Зег ТНг Зег Спи Зег ТНг 130 135 140

Аа Аїа І єи Стпу Суз І еи Ма! Гуз Ар Туг Ріє Рго Сіи Рго Маї ТНг 145 150 155 160

Маї Зег Ттр Авп 5ег Сіу Аа Геи Тниг Зег Сіу Маї Ні Ти Рпе Рго 165 170 175

Аа Ма! І єи Сіп бег Зег Спу Геи Туг Зег І єи 5ег Зег Маї Ма! ТНг 180 185 190 маї Рго 5ег Зег 5егІ ви Спу ТАг Гуз Тнг Тук Тиг Сувз Азп Маї Азр 195 200 205

Ні Гуз Рго 5ег Авп ТАг Гуз Маї Ар Гуз Ага Маї Спи Зег Гуз Туг 210 215 220 60

Спу Рго Ріо Суз Рго Рго Суз Рго Аа Рго Сіи РНе І еи Спіу Спу Рго 225 230 235 240 зЗег Ма! Рпє ГІ єи РнНе Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр Тиг Геи Ме! Ше 5ег 245 250 255

Агу Тнг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Ма! Зег Сіп СПи Ар 260 265 270

Рго Ст Маї Сип Рне Авзп Тр Туг Маї Авр Су Маї Си Маї Ні5 Авп 275 280 285

Аа Гуз ТНиг Гуз Рго Ага Си Спи Сп Рпє Авп 5ег Тнг Туг Агу Маї 290 295 00 ма! Зег Ма! Геи Тнг Маї І єи Ніз Сип Авр Тр І єи Азп Су І уз Спи 305 з10 315 з20

ТугГувз Суз І уз Маї Зег Авп Гуз Спу Геи Рго Зег Зег Пе Спи Г ув 325 330 335

Ти Пе Зег Гуз Аа Гуз Спу Спп Рго Агу Сім Рго Сп Маї Туг ТНг 340 345 350

Ї еи Ріо Рго Зег Сп Сім СТи Меї Тнг Гуз Авп ап Маї з5ег І еи ТНг 355 360 365

З5

Сувз І єи Ма! Гуз Спу Рне Туг Рго 5ег Азр Пе Аа Ма! Спи Ттр Сім 370 375 380 зег Авп Сіу Сп Рго Сіи Авп Авп Туг Гуз Тиг ТНг Рго Рго Маї Гей 385 390 395 400

Авр бег Авр Сіу бег Рпе РНе ГГ еи Туг 5ег Ага ГІ еи ТАг Маї Ар Гув 405 до 415 зег Аг Ттр Сп Сіи Спу Авп Маї РНе 5ег Суз Зег Ма! Меї Ні5 Си 420 425 430

Аа І еи Ні Авп Нів Тут ТНг Сп Гуз 5ег І еи 5ег І єи Зег Рго Спу 435 440 445

Гуз 60

-2105 7 «2115» 645 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005 7 дасаїссада Юасасацдіс іІссадснсс сідісдсаї сісідддада аасщісасс бо аїсдаащісє даасаадда ддасацас ааддщад саюддніаїйса дсадаадсса 120 дадаааїсіс сісадсіссі ддісіагаді дсаааїадсі іасаїан9дд ддісссаїса 180 сдоансавдід дсадіддаїс Юдіасасад їансісіса адаїааасад ссідсааш 240 даадайдісд сааонаїй сідісаасад їапасодаї! аіссдсісдс дНсоднсї 300 дддассаадс ддадаїсаа асодасдоїд осідсассаї сідісісаї сісссдсса 360

Іїстдаюдадс адндаааїс (ддаасідсс істнаці дссідсідааааснсіаї /-420 сссадададд ссааадіаса сддаадоїю даїаасодссс іссааїс9додіаасісссад 480 дададідіса сададсадда садсааддас адсассіаса дссісадсад сасссідасд 540 сідадсааад садасіасда дааасасааа дісіасодссі дсдаадісас ссаїсадддс 600

Зо сюадсісдс ссдісасааа дадсіїсаас аддадададі днад 645 -2105» 8 «2115 214 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 8

Азр Пе Сип Меї ТАг Сіп Зег Рго Аа 5ег І єи 5ег Аа 5ег І ви Спу 1 5 10 15

Сім Тнг Маї Тнг Пе Спи Суз Агу ТАг Зег Спи Авр Іе Туг Авп Спу 20 25 зо

Ї еи Авіа Тір Туг Сіп Сп ГГ ув Рго Сіпу Гуз бег Рго Сіп І ей Гей Маї 35 40 45

ТугЗег Аіа Авп 5ег І єи Нів Пе Спу Маї Рго 5ег Ага РНе Зег Спу 50 55 бо

Зег Сіу Зег Спу ТНиг Сп Туг Зег І єи Гуз Пе Авп 5ег І ви Сп Рпе бо 65 70 75 80 в2

Сім Авр Маї Аа 5ег Туг Рне Суз Сіп Сп Туг Туг Азр Туг Рго Гей 85 90 95

Аа Ре Спу Зег Спу ТАг Гуз І еи Спи Пе Гуз Агу ТНг Маї Аа Аа 100 105 110

Рго Зег Маї Ре Пе Рне Рго Рго 5ег Авр Спи Сп Геи Гуз Зег Спу 115 120 125

ТАг Авіа 5ег Маї Ма! Суз І еи Гей Авзп Азп РПе Туг Рго Ага Сім Аа 130 135 140

І уз Маї Сп Тр Гуз Маї Азр Авп Аа І єи СіІп бег Сіу Авп 5ег Сп (145 150 155 160

Сіи Зег Ма! Тиг Спи Стпп Авр Зег Гуз Авр Зег ТНиг Туг Зег І еи Зег 165 170 175 зЗег ТигІ єи ТигГеи Зег Гуз Аіа Авр Туг Си Гуз Нів Гуз Маї Туг 180 185 190

Зо

Аа Суз Сім Ма! Тнг Ні Сіп С1пу І еи бег Зег Рго Маї Тиг Гув Зег 195 200 205

Ре Азп Аг9 Сіу Сіи Суз 210 «210» 9 «2115 27 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005» 9

Нсасісіса дідасіаца саїддсс 27 «2105 10 «2115» 9 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 10 (516)

Рпе Тнг Геи Зег Авр Туг Туг Меї Аа 1 5 «-2105 11 «2115 51 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005 11 ассанадід ссадідддсі садааснНас іаїссадасі ссдідаа9д949 с 51 «-2105 12 «-2115 17 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 12

ТА Пе 5ег Аа бег СІу І еи Агу ТАг Туг Туг Рго Авр 5ег Маї І уз 1 5 10 15

Зо спіу «2105 13 «211» 39 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 13 ссдаїщісід сасасіаїдд ІШаасіас Шдацас 39 «-2105» 14 «-2115 13 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 14

Рго Меї 5ег Аїа Ніз Туг Сіу Ре Авп Туг Ріе Авр Туг 1 5 10 бо

«-2105 15 «-2115 33 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 15 сдаасаадід аддасаша сааїддша оса З3 «-2105» 16 «2115 11 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 16

Аг Тнг Зег Спи Авр Пе Туг Азп Сту Геи Аа 1 5 10 «-2105» 17 «2115 21 -212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 17 адюдсаааїа дсНасаїаї ї 21 «-2105» 18 «-2115 7 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 18 5ег Аа Авп 5ег І ви Ніз Іе 1 5 «-2105» 19 «-2115 27 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність

Гс10)

«4005» 19 саасадіайї асданаїсс дсісдсд 27 «2105» 20 «2115» 9 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 20 ап Сп Туг Туг Авр Туг Рго І ви Аа 1 5 «2105» 21 «2115» 366 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 21 дсддідсадс юдвіддадіс юддодааддс сіаддсадс сідчадддіс ссідааасіс (10)

Зо Іїссіддсая ісісаддай сасісісаді дасіацаса іддссіддді ссдссадасі 120 ссааадаада дісддаац ддісдсаасс апйадіосса діддосісад ааснцасіаї 180 ссадасіссуд дааддодссо сісасіаїс Іссададайд аїдсааааад дадссісйс 240 сідсаааїда ссадісідаа дістаддас асддссасії апасідідсаадассдаю 300 ісідсасасі аїддішШаа сіасшоаї їасіддддсс ааддацдісаї даїсасадіє 360 їссіса 366 «2105» 22 «2115 122 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005 22

Аа Маї Сіп І еи Маї Спи Зег Сіу Спу Спу Гей Маї Сип Рго Спу Спу 1 5 10 15 зег і єи Гуз І єи 5ег Суз Аїа Маї 5ег СПу Ре ТНг ГГ еи Зег Азр Туг 20 25 зо бо

Туг Меї Ага Тр Маї Аго сСіп Аїа Рго Гуз Гу Спу Геи Сім Тер Маї 35 40 45

Аа ТТН Пе 5ег Аа 5ег Су І еи Агу Тнг Туг Туг Рго Авр Зег Маї 50 55 бо

Гуз Спу Ага Ре Тнг Пе 5ег Ага Авр Азр Аїа Гуз Агу 5ег І єи Рпе 65 70 75 80

Ї еи Сп Меї Тнг 5ег І єи І ув бег СІи Авр ТНг Аа Тнг Тут Туг Суз 85 90 95

Аа Агд Рго Меї 5ег Аа Ні Туг Сіу Ріє Авп Туг Рне Авр Тут Тр 100 105 110 сСіу Сп Сіу Ма! Меї маї Тнг Маї Зег Зег 115 120 «-2105» 23 «2115 324 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність

Зо «220» 223» Синтетична послідовність «4005 23 дасаїссада Юасасацдіс іІссадснсс сідісдсаї сісідддада аасщісасс (610) аїсдаащісє даасаадда ддасацас ааддщад саюддніаїйса дсадаадсса 120 дадаааїсіс сісадсіссі ддісіагаді дсаааїадсі іасаїан9дд ддісссаїса 180 сдоансавдід дсадіддаїс Юдіасасад їансісіса адаїааасад ссідсааш 240 даадайдісд сааонаїй сідісаасад їапасодаї! аіссдсісдс дНсоднсї 300 дддассаадс іІддадаїсаа асда 324 «2105» 24 -2115 108 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 24

Азр Пе Сип Меї ТАг Сіп Зег Рго Аа 5ег І єи 5ег Аа 5ег І ви Спу 1 5 10 15 бо

Сім Тнг Маї Тнг Пе Спи Суз Агу ТАг Зег Спи Авр Іе Туг Авп Спу 20 25 зо

Ї еи Авіа Тір Туг Сіп Сп ГГ ув Рго Сіпу Гуз бег Рго Сіп І ей Гей Маї 35 40 45

Туг Зег Аа Авп зе І єи Нів Пе Стпу Маї Рго 5ег Ага РНе 5ег Спіу 50 55 бо

Зег Сіу Зег Спу ТНиг Сп Туг Зег І єи Гуз Пе Авп 5ег І ви Сп Рпе 65 70 75 80

Сім Авр Маї Аа 5ег Туг Рне Суз Сіп Сп Туг Туг Азр Туг Рго Гей 85 90 95

Аа Ре Спу Зег СЧу ТАг Гуз І еи Сім Пе Гуз Агд 100 105 «2105» 25 -2115» 993 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність

Зо «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 25 дсіадсасса адддсссаїс ддісцсссс сіддсасссі ссіссаадад сассісідад (610) дасасадсда сссідддсід ссіддісаад дасіаснсс ссдаассододї дасадідісєд 120 дааасісад дсдсссідас садсддсдід сасасснсос сдусідіссіасадіссіса 180 ддасісіасі сссісадсад саїддіщдасс дідсссісса дсадснода сасссадасс 240

Тасаїсідса асдідааїіса саадсссадс аасассаадоу ддасаадааадндадссс 300 аааїсноїд асаааасіса сасаїдссса ссдідсссад сассідаасі ссіддадада 360 ссдісадісі Іссісносс сссаааассс ааддасассс ісаїдаїсіс ссодасссосі 420 дадаїсасаї дсодчоіоої ддасдідадс сасдаадасс сідаддісаа днсаасюда 480 тасдюдасод дсдаддадої дсаїаадсс аадасааадс сдасдддадда дсадіасаас 540 адсасдіасс дідщаїсаяд садїссісасс діссідсасс аддасіддсі дааїддсаад 600 дадіасааді дсааоддісіс саасааадсс сісссадссс ссаїсдсдаа аассаїсісс 660 ааадссааад ддсадссссд адаассасад дідіасассс іІдсссссаїс ссдддадчад 720 ащдассаада ассаддісад ссідассідс сіддісааад осисіаїсс садсдасаїс 780 60 дссдюдадасді дддададсаа дддсадссод дадаасаасі асаадассас дссісссдід 840 сюдасіссо асодсіссії снссісіас адсаадсіса ссдіддасаа дадсадуща 900 садсадддда асадіснсіс адсіссодід аїдсададао сісідсасаа ссасіасасд 960 садаададсс ісісссідіс Іссдадіааа ща 993 «2105» 26 «-2115 330 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005» 26

Аа 5ег Тиг Гуз СПУ Рго 5ег Ма! Рне Рго Г еи Аа Рго 5ег Зег Гуз 201 5 10 15 зЗег Тиг Зег Сіу СІу Тнг Аа Аа І єи Слу Суз І єи Маї Гуз Авр Туг

Зо 25

Рпє Рго Си Рго Маї Тнг Маї Зег Тгтр Авзп Зег Спу Аа Геи Тнг Зег

Зо

Стпу Маї Ні5 Тнг РНе Рго Аїа Маї І єи Сп бег бег СПУ І єи Туг Зег 60 35 Гей Зег Зег Ма! Ма! Тниг Маї Рго бег Зег Зег І ви Спу Тиг Сп ТНг 65 70 75 80

Туг Пе Суз Авп Маї Авп Нів Гуз Рго 5ег Авп ТНг Гуз Маї Авр ГГ ув 40 85 90 95

Гуз МаїЇ Спи Рго Гуз бег Суз Авр І уз ТНг Ні Тнг Сув Рго Рго Сув 100 105 110 45

Рго Аїа Рго Сі І еи Геи СПу Спу Рго Зег Маї Рпеє ГГ еи Рне Рго Рго 115 120 125 50

Гуз Рго Гу Ар ТНиг Геи Ме! Ше 5ег Ага Тиг Рго Сім Ма! ТАиг Сув 130 135 140 55 Маї Маї Ма! Авр Маї Зег Ні Сім Авр Рго Сім Маї Гуз РНе Авп Тгтр 145 150 155 160

Туг Маї Азр Сту Маї Сім Маї Ні Авп Аїа Гуз Тнг Гуз Рго Агу Спи бо 165 170 175 сій Сп Туг Азп 5ег Тниг Туг Агу Маї Маї 5ег Ма! І єи Тнг Ма! І еи 180 185 190

Ні5 Сіп Авр Тгр Г еи Авп сту Гуз Спи Туг Гуз Суз Гуз Ма! Зег Авп 195 200 205

І уз Аа І єм Рго Аїа Рго Пе Аїа І уз ТНг Пе 5ег І уз Айва І уз СПУ 210 215 220 ап Рго Агу Си Рго Сіп Маї Туг ТНиг І єи Рго Рго Зег Агу СПИ Спи 225 230 235 240

Меї Тиг Гуз Авп ап Маї 5ег І еи ТНг Суз Геи Ма! Гуз Спу Рпе Туг 245 250 255

Рго бег Авр Пе Аа Маї Спи Тгр Спи бег Азп Спу Сп Рго Сіи Авп 260 265 270

Авп Туг Гуз Тиг Тнг Рго Рго Маї І єи Авр 5ег Азр Сіу бег Рне Ріє 275 280 285

Зо

Ї ви Туг Зег Гуз І еи ТАиг Маї Азр Гуз 5ег Агу Тгр Сип Сп Спу Авп 290 295 оо

Маї Рпе 5ег Суз Зег Ма! Меї Ні5 Сім Аа Геи Нів Авп Ні Туг ТНг 305 З10 315 з20

Сіп Гуз б5егіІ ви Бег І єи бег Рго Сіу Гув з2г5 330 «2105» 27 «2115» 984 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005 27 дсіадсасса адддсссаїс ддісцсссс сіддсдсссі дсіссаддад сассіссдад (610) адсасадссд сссіддасід ссіддісаад дасіасісс ссдаассдді дзасадщісд 120 дааасісад дсдсссідас садсддсдід сасасснсос сдусідіссіасадіссіса 180 ддасісіасі сссісадсад саїддщдасс дідсссісса дсадснода сасдаадасс 240 бо їТасассюса асадїадаїса саадсссадс аасассаадо ддасаадададндадієс 300 ааагадцдіс ссссаїдссс ассаїдссса дсассідаді іссідда9999 ассаїсадіє 360 пссіднНеос сссосаааасс сааддасасі сісаїдаїсі сссддасссс аддісасу 420 тдсащаїщ9о ддасадад ссаддаадас сссдадаісс адіїсаасід діасуюдаї 480 ддсдддадао юсаїаадс саадасааад ссдсдоададоу адсадісаа садсасдіас 540 сущідаїса дсдіссісас сдіссідсас саддасіддс ЮШаасддсаа ддадіасаад (100) тюдсааддісї ссаасааада ссісссдісс Іссаїсдада ааассаїсіс сааадссааа 660 дадсадсссс дададссаса ддщіасасс сідсссссаї сссаддадда чадассаад 720 аассаддіса дссідассід ссіддісааа досіїсіасс ссадсдасаї сдссдаддад 780 щадададса адддсадсс ддадаасаас іасаадасса сдссісссоаї дсіддасісс 840 дасддсіссі Існосісіа садсаддсіа ассдіддаса ададсадаю дсаддад99а 900 аащісйнсі садсіссді даюсащдад дсісідсаса ассасіасас асадаададс 960 сісісссіді сіссдддіаа ада 984 «2105» 28 «2115 327 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «-4005 28

Аа 5ег Тпг Гуз СПУ Рго 5ег Ма! Рне Рго Г єи Аа Рго Суз 5ег Ага 1 5 10 15 зег Тиг Зег Си Зег ТАг Аа Аа І єи Стпу Суз І еи Маї Гуз Авр Туг 20 25 зо

Рпє Рго Си Рго Маї Тнг Маї Зег Тгтр Авзп Зег Спу Аа Геи Тнг Зег 35 40 45

Стпу Маї Ні5 Тнг РНе Рго Аїа Маї І єи Сп бег бег СПУ І єи Туг Зег 50 55 бо

Ї еи Зег Зег Маї Ма! Тниг Маї Рго Зег Зег Зег І еи Спу ТНг Гуз ТНг 65 70 75 80

Туг Тиг Суз Авп Маї Авр Ніз Гуз Рго 5ег Азп ТНг Гуз Маї Авр ГГ ув 85 90 95 бо

Ага Маї Спи Зег Гуз Туг Спу Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго Аа Рго 100 105 110 ам Рпе Геи Сіу Спу Рго 5ег Маї РНе Геи Рне Рго Рго Гуз Рго ГГ ув 115 120 125

Азр Тпиг ГГ еи Меї Пе 5ег Аг ТНиг Рго Сім Ма! Тнг Суз Маї Маї Маї 130 135 140

Азр Маї 5ег Сип СіПи Авр Рго Спи Маї Сіп РНе Авзп Тгр Туг Ма! А5р 145 150 155 160

Сіу Ма! Спи Маї Ні Авп Аїа Гуз ТНг Гуз Рго Агу Спи Сім Спп Рпе 165 170 175

Азп Зег ТНиг Туг Агу Маї Ма! 5ег Ма! І єи Тнг Маї І еи Ні Сип Авр 180 185 190

Тірі єи Азп Су Гуз Сім Туг Гуз Суз І уз Ма! бег Авп І уз Спу І ей 195 200 205

Рго Зег Зег Пе Спи Гуз ТАг Пе Зег Гуз Аа Гуз Спу Сп Рго Агд 210 215 220

Сім Рго Сіп Маї Тут Тиг Геи Рго Рго Зег Сип Спи Спи Меї Тниг Гуз 225 230 235 240

З5

Авп Сп Маї 5ег І єи Тнг Суз І еи Маї! Гуз Сіу Рне Туг Рго 5ег Ар 245 250 255

Пе Аа Маї Спи Тгтр Спи Зег Азп Стпу Сп Рго Спи Авп Авп Туг ГГ ув 260 265 270

ТАТА Ріо Рго Маї І єи Авр 5ег Авр Су Зег Рпе Рне І єи Туг Зег 275 280 285

Аго ГІ еи Тнг Маї Азр Гуз 5ег Аго Ттр Сп Спи СПу Авп Маї Рпє 5ег 290 295 00

Сув Зег Ма! Меї Ніз Сі Аїа ГГ еи Нів Авп Ні Туг Тиг Сіп Гув 5ег 305 з10 315 з20

Ї еи Зег І єи Зег Рго Спу Гув 325 60

«2105» 29 «2115 321 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 29 асддуддсід сассаїсідії сіїсаїсне ссдссаїсід ададсадії даааїсюда бо асідссісід Ндщіодссії дсідааїаас йсіаїссса дададдссаа адіасадідд 120 ааддюдаїйа асосссісса аїсоддадіаас Ісссаддада дідісасада дсаддасадс 180 ааддасадса ссіасадссі садсадсасс сідасасщда дсааадсада сіасдадааа /--240 сасааацдісї асоассідсда адісасссаї саддоассіда дсісдсссдісасааададс 300

Нсаасадоад зададчіона а 321 «2105» 30 «2115» 106 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність

Зо «-4005 30

ТНг Маї Ага Аа Рго 5ег Маї Рне Пе Рне Рго Рго 5ег Авзр Си С1п 1 5 10 15

Ї еи Гуз Зег Спу Тнг Аа 5ег Маї Маї Суз ГІ еи І єи Авп Авп Ре Туг 20 25 зо

Рго Ага Сім Аїа Гуз Маї Сіп Ттр Гуз Маї Авр Авп Аа І єи Сп 5ег 35 40 45 ау Авп 5ег Сп Спи 5ег Ма! Тиг Спи Сп Авр Зег Гуз Авр 5ег ТНиг бо

Туг Зег І єи бег Зег ТНгІ єи ТНг І єи Зег І уз АІа Азр Туг Си ГГ ув 50 65 70 75 80

Ні Гуз Маї Туг Аіа Суз Спи Маї Тиг Ні Сип Спу Геи Зег 5ег Рго 85 90 95 55 маї Тниг Гуз Зег Рне Азп Ага Сіу Сіи Суз 100 105 бо

«2105 31 «2115 330 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005 31

Аа 5ег Тиг Гуз СПУ Рго 5ег Ма! Рне Рго Г еи Аа Рго 5ег Зег Гуз 1 5 10 15

Бег Тиг Зег СпПу Спіу ТАг Аа Аа І єи Спу Суз ГІ еи Маї Гуз Авр Туг 0)

Рпє Рго Си Рго Маї Тнг Маї Зег Тгтр Авзп Зег Спу Аа Геи Тнг Зег 20 35 40 45

Стпу Маї Ні5 Тнг РНе Рго Аїа Маї І єи Сп бег бег СПУ І єи Туг Зег 50 55 60 25

Ї еи Зег Зег Маї Ма! Тниг Маї Рго Зег Зег Зег І еи Спу Тиг Сіп ТНг 65 70 75 80

Зо

Туг Пе Суз Авп Маї Авп Нів Гуз Рго 5ег Авп ТНг Гуз Маї Авр ГГ ув 85 90 95

Гуз МаїЇ Спи Рго Гуз бег Суз Авр І уз ТНг Ні Тнг Сув Рго Рго Суб 100 105 110

Рго Аїа Рго Сі І еи Геи СПу Спу Рго Зег Маї Рпеє ГГ еи Рне Рго Рго 115 120 125

Гуз Рго Гу Авр ТНиг Геи Ме! Пе 5ег Ага Тнг Рго Сім Ма! Тиг Суб 130 135 140 маї Маї Маї Ар Маї Зег Ніз Спи Авр Рго Сім Маї Гуз РНе Авп Тр 145 150 155 160

Туг Маї Азр Сту Маї Сім Маї Ні Авп Аїа Гуз Тнг Гуз Рго Ага Спи 165 170 175 сім Сп Туг Авп 5ег ТНАг Туг Агу Маї Маї Зег Ма! Геи Тнг Ма! Г еи 180 185 190

Ніз Сіп Авр Тгр Г еи Авп сту Гуз Спи Туг Гуз Суз Гуз Ма! Зег Авп бо 195 200 205

Гуз Аа ГІ еи Рго Аїа Рго Пе Спи Гув ТНиг Пе Зег Гуз Айа Гуз Спу 210 215 220

Сіп Рго Ага Сім Рго Сіп Маї Тук ТНг Геи Рго Рго Зег Агу Авр Спи 225 230 235 240

Ї еи Тит Гуз Авп ап Маї 5ег І еи ТНг Суз Геи Ма! Гуз Спу Рпе Туг 245 250 255

Рго Бег Азр Іе Аїа Маї Спи Ттр Спи 5ег Авп Сіу Сіп Рго Спи Авп 260 265 270

Авп Туг Гуз Тиг Тнг Рго Рго Маї І єи Авр 5ег Азр Сіу 5ег Рне Ріє 275 280 285

Ї ви Туг Зег Гуз І еи ТАиг Маї Азр Гуз 5ег Аго Ттр Сп Сп СПу Авп 290 295 00 маї Рне 5ег Суз 5ег Ма! Меї Ні Спи Аа І єм Ні Авп Нів Туг ТНг 305 з10 315 з20

Зо

Сіп Гуз 5егІ ви 5ег І ви бег Рго Сіу Гув 325 330 0о«2105» 32 «2115 326 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005 32

Аа бег ТИ Гуз Спу Рго 5ег Ма! РНе Рго І єм Аа Рго Суз Зег Аг9 1 5 10 15 зег Тиг Зег Си Зег ТАг Аа Аа І єи Стпу Суз І еи Маї Гуз Авр Туг 20 25 0)

Рпє Рго Си Рго Маї Тнг Маї Зег Тгтр Авзп Зег Спу Аа Геи ТНиг 5ег 35 40 45

Стпу Маї Ні5 Тнг РНе Рго Аїа Маї І єи Сп бег бег СПУ І єи Туг Зег 50 55 60 60

Ї еи Зег Зег Маї Ма! Тниг Маї Рго 5ег Зег Азп Рпе Сіу ТНг Сп ТНг 65 70 75 80

Ту ТНг Сув Авп Маї Авр Ніз Гуз Рго 5ег Авп ТНг Гуз Маї Авр Гуз 85 90 95

Тниг Маї Си Ага Гуз Суз Суз Маї Спи Сув Рго Рго Суз Рго Аа Рго 100 105 110

Рго Маї Аа Сіу Рго 5ег Маї Рне Гей Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр 115 120 125

ТАгГ єи Ме! Пе 5ег Агу Тнг Рго Сіи Маї Тнг Суз Маї Ма! Ма! Азр 130 135 140 маї Зег Ніз Сіи Авр Рго Сім Маї Сіп Рне Авп Тр Туг Ма! Азр Спу 145 150 155 160

Маї Сіи Маї Ні Авп Аа Гуз ТНг Гуз Рго Агу Сі Спи Сп Рпе Авп 165 170 175 зЗег Тиг РНє Агу Маї Маї 5ег Ма! І еи Тнг Маї Маї Ніз Сип Авр Ттр

Ко) 180 185 190

Ї еи Авп ату Гуз См Туг Гуз Суз Гуз Ма! Зег Авп ГГ уз Спу Геи Рго 195 200 205

З5

Аа Рго Пе Спи Гуз ТНк Пе 5ег Гуз Тиг Гуз Спу Сп Рго Агу Сім 210 215 220

Рго Сіп Маї Туг ТНг І єи Рго Рго бег Агу Сіи Си Меї Тнг Гуз Авп 225 230 235 240 ап МаїЇ 5ег І еи Тиг Суз Геи Ма! Гуз Спу Ре Туг Рго Зег Авр Пе 245 250 255 зЗег Ма! Сім Тгтр Спи Зег Авзп Спу Сп Рго Спи Авп Авп Тут Гуз ТАг 260 265 270

ТАг Рго Рго Меї І єи Азвр 5ег Азр Сіу 5ег РНе Рнє І єи Туг Зег І уз 275 280 285

Ї еи Тиг Маї Авр Гуз 5ег Аг Ттр Сп Суп Сіу Авп Маї Рне Зег Сув 290 295 100) 60 зЗег Ма! Меї Ніз Сім Айа Г єи Ні Авп Ні Туг ТНг Сіп Гуз Зег І еи 305 з10 315 з20 зегеи Зег Рго Сіу Гуз 325 «2105» ЗЗ3 «2115 327 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005» ЗЗ3

Аа 5ег Тпг Гуз СПУ Рго 5ег Ма! Рне Рго Г єи Аа Рго Суз 5ег Ага 201 5 10 15 зег Тиг Зег Си Зег ТАг Аа Аа І єи Стпу Суз І еи Маї Гуз Авр Туг 0) 25

Рпє Рго Си Рго Маї Тнг Маї Зег Тгтр Авзп Зег Спу Аа Геи Тнг Зег

Зо

Стпу Маї Ні5 Тнг РНе Рго Аїа Маї І єи Сп бег бег СПУ І єи Туг Зег 60 35 Гей бег Зег Маї Ма! Тниг Маї Рго бег Зег Зег І ви Спу Тиг Гув ТНг 65 70 75 80

Туг Тиг Суз Авп Маї Авр Ніз Гуз Рго 5ег Азп ТНг Гуз Маї Авр ГГ ув 40 85 90 95

Ага Маї Спи Зег Гуз Туг Спу Рго Рго Суз Рго 5ег Сув Рго Аа Рго 100 105 110 45

Сім РНе Г єи Стпу СПУ Рго 5ег Маї РНе ГІ єи Ре Рго Рго Гуз Рго Гуз 115 120 125 50

Азр Тпиг ГГ еи Меї Пе 5ег Аг ТНиг Рго Сім Ма! Тнг Суз Маї Ма! Маї 130 135 140 55 А5р Маї Зег Сп Си Авр Рго Сіи Маї Сип РНе Авзп Тгр Туг Ма! А5р 145 150 155 160

Сіу Ма! Спи Маї Ні Авп Аїа Гуз ТНг Гуз Рго Агу Сіи Спи Сп Рпе бо 165 170 175

Авп 5ег ТНиг Туг Агу Маї Маї 5ег Маї І єи Тнг Ма! І еи Ні Сіп Ар 180 185 190

Тр Геи Авп Сіу Гуз Сім Туг Гуз Суз ГІ уз Ма! Зег Авп Гуз Су І еи 195 200 205

Рго Зег Зег Пе Спи Гуз ТАг Пе Зег Гуз Аа Гуз Спу Сп Рго Агд 210 215 220

Си Рго Сп Маї Туг Тиг Геи Рго Рго 5ег Сип СП Спи Меї ТАг Гуз 225 230 235 240

Авп Сп Маї 5ег І єи Тнг Суз І еи Маї! Гуз Сіу Рне Туг Рго 5ег Ар 245 250 255

Пе Аа Маї Спи Тгтр Спи Зег Азп Спу Сп Рго Сім Авп Авп Туг Гуз 260 265 270

Тиг Тниг Ріо Рго Маї І єи Авр Зег Авр Су Зег Рпе Рне І єи Туг Зег 275 280 285

Зо

Ага ГІ еи Тнг Маї Азр Гуз 5ег Аго Ттр Сп Спи СПу Авп Маї Ріє Зег 290 295 00

Сувз 5ег Ма! Меї Ніз Сім Аїа І єи Ні Авп Ні Туг Тиг Сп Гу Бег 305 з10 315 з20

Ї еи ЗегІ єи Зег І єи Спу Гуз 325 «2105» 34 «2115 326 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 34

Аа Спи Тиг ТНиг Айа Рго 5ег Маї Туг Рго І єи Аа Рго Сіу ТАг Аа 1 5 10 15

Ї еи Гуз Зег Авп бег Меї Маї ТАг І еи Спу Суз І ви Ма! Гув Спу Туг 20 25 0) 60

Рпє Рго Си Рго Маї Тнг Ма! ТАг Ттр Авп зЗег Су Аа І єи Бег Зег 35 40 45 ау Маї Нів Тнг Рне Рго Аїа Маї І еи Сіп Зег СПУ Г еи Туг ТАг І еи 50 55 60

Тниг Зег Зег Маї Тиг Маї Рго Зег Зег Тниг Тр Рго 5ег Сп Тнг Маї 1065 70 75 80

ТАг Сув Авп Маї Аїа Ні Рго Аа 5ег 5ег ТНг І уз Маї Авр Гуз ГІ ув 85 90 95

Пе Маї Рго Агу Авп Суз Сіу Спу Авр Суз І уз Рго Суз Пе Сув ТНг 100 105 110

Спу бег Си Маї 5Зег Зег Ма! Рне Пе Рне Рго Рго Гуз Рго Гуз Азр 115 120 125 ма! Геи Тит Пе Тнг І єи Тнг Рго Гуз Маї Тиг Суз Маї Ма! Ма! Азр 130 135 140

Пе бег Сп Авр Ар Рго Сіи Маї Ніз РНе 5ег Тгтр Рне Маї Азр Азр 145 150 155 160 маї Сі Маї Ні Тниг Аа Сп Тйг Аго Рго Рго Сім Спи Сіп Рпе Авп 165 170 175

Зег ТНиг Рне Агу 5ег Маї бег Спи І еи Рго Пе І еи Ніз Сип Авр Тр 180 185 190

Ї еи Авзп ау Агу ТНг Ре Ага Суз Гуз Ма! Тниг 5ег Аа АЇа Рпє Рго 195 200 205

Зег Рго Пе Спи Гу5 Тит Пе 5ег Гув Рго СПм Спу Ага Тнг Сп Маї 210 215 220

Рго Ніз Маї Туг Тиг Меї Зег Рго Тниг Гуз Спи Сіи Меї Тнг Сп Авп 0225 230 235 240

Спи Маї Зег Пе Тнг Сувз Меї Маї Гуз Спіу Рне Туг Рго Рго Азвр Пе 245 250 255

Туг Маї Сіи Тгтр Сп Меї Авп Ссіпу Сп Рго Сп Спи Авп Туг Гу Авп 260 265 270 (516)

Тиг Ріо Рго Тнг Меї Авр ТНг Азр Сту 5ег Туг РНе І єи Туг Зег Гув 275 280 285

Гей Авп Маї Гуз Гуз Сім Гуз Ттр Сп Сп Спіу Азп ТАг РНе ТАиг Сув 290 295 оо зег Ма! І єм Ніз Спи Су І еи Ні Авп Нів Ніз ТНг Спи Гуз Зег І ви 305 З10 315 з20 зЗег Ні 5ег Рго Су Гуз з2г5 «2105 35 «2115» 366 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «-4005 35 саддідсадс ддісдааїс (ддадаодо9ої сіддісаадс ссддадддіс асдсаїсід (610) їсаюдсодсса ісісаддуй сасасідісї дасіасіаїа (ддсіддаї дсдасаддса 120

Зо ссаддсаадад дасіддадю одісоссасі аїсісідсіа дідассідад дассіасіаї 180 ссідаїадцід даададаад дінсасаай ісасдоадасу адсаааааа сісссідіас 240 сідсадаїда аїадссдад адсадаадас ассдссдісі асіайдсдс ссодссосаай 300 адсаосісасі аїддснсаа сіасшодаї їанддаддс адоддіасссі ддідасадіє 360 їссадс 366 «2105 36 «2115 122 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «-4005 36

Сп Маї Сій І єи Маї Спи Зег Сіу Спу Спу Гей Маї Гуз Рго Спіу СПу 1 5 10 15 зегеи Ага Геи Зег Суз Аа Ма! Зег Сіу Рпе ТНг І єи 5ег Авр Туг 20 25 зо

Туг Меї Ага Тр Маї Аго Сіп Аїа Рго Стпу Гув Спу Гей Спи Тгр Маї бо 35 40 45

Аа Тниг Пе 5ег Аа бег Су І єи Агу Тнг Туг Туг Рго Авр 5ег Маї 50 55 бо

Гуз Спіу Ага Ре Тнг Іе 5ег Ага Авр Авр Аа Гуз Авп 5ег І еи Туг 65 70 75 80

Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95

Аа Агу Рго Меї 5ег Аїа Ні Туг Спу Рпе Авп Туг Ріє Азр Туг Тр 100 105 110

Спу Сп Спу ТАг Гей Маї Тнг Ма! бег 5ег 115 120 «-2105 37 «2115» 366 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність

Зо «4005 37 саддідсадс ддісдааїс (ддддоадода сіддісааас ссддадоусіс асідсдісю (610) їсаюдідссо ісісаддсії іїіасасідадс дасіасіаїа ддсаюдаї ссдасаддса 120 ссададсаадо дасіддадчю адідістасі ашсідсса аідодссідад дассіасіаї 180 ссідасадід ісаадддааяд айсасааїс Ісасдддаїа асосіааааа Псссідіас 240 сідсадаїда асадссідад адссдаадас ассдсідіді астайдсосісоссосааюд /-з00

Іссдсасасі аїдасіїсаа Пасшода! їайддддас аддаїасссі ддідасадіє 360 їссадс 366 «2105» 38 «2115 122 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність -4005» 38

Сп Маї Сій І єи Маї Спи Зег Сіу Спу Спу Гей Маї Гуз Рго Спіу СПу 1 5 10 15 бо зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аїа Маї 5ег Спу Ре ТНг ГГ еи Зег Азр Туг 20 25 зо

ТугМеї Аа Ттр Іе Аго Сп Аїа Рго Спу Гуз Спу Гей Сім Тер Маї 35 40 45 зег ТП Пе Зег Аіа 5ег Стпу Геи Агу Тиг Туг Туг Рго Авр 5ег Маї 50 55 бо

Гуз Спіу Ага Ре Тнг Іе 5ег Ага Авр Авп Аа Гуз Авп 5ег І еи Туг 65 70 75 80

Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95

Аа Агд Рго Меї 5ег Аа Ні Туг Сіу Ріє Авп Туг Рне Авр Тут Тр 100 105 110

Сіу Сп Спу ТНг ГГ еи Маї Тниг Маї Зег Зег 115 120 «2105 39

Зо «2115 366 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «-4005 39 саддідсадс ддісдааїс адддаадддда сіддісааас ссдддоадсіс асідсдісід (610) їсащідсса ісісаддсії сасасідадс дасіасіаїа ддсаддаї ссдасадаса 120 ссададсаадо дасіддадчю адідістасі ашсідсса аідодссідад дассіасіаї 180 ссідасадід ісаадддааяд айсасааїс Ісасдддаїа асосіааааа Псссідіас 240 сідсадаїда асадссідад адссдаадас ассдсідіді астайдсосісодссосасія /-зо00

Іссдсасасі аїдасіїсаа Пасшода! їайддддас аддаїасссі ддідасадіє 360 їссадс 366 «2105» 40 «2115 122 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність бо в2

«4005» 40

Сп Маї Стій І єи Маї Спи Зег Сіу Спу Спу І єи Ма! Гуз Рго Спіу СПу 1 5 10 15 зег І ви Аго І єи 5ег Суз Аїа Маї 5ег Спу Ре ТНг ГГ еи Зег Азр Туг 20 25 зо

Туг Меї Аа Тр Іе Аг Сіп Аа Рго Спу Гуз Спу І еи Спи Тур Маї 35 40 45

Зег Ти Пе 5ег Аа 5ег Сіу І еи Аг ТНг Туг Туг Рго Авр 5ег Маї 50 55 бо

Гуз Спіу Ага Ре Тнг Іе 5ег Ага Авр Авп Аа Гуз Авп 5ег І еи Туг 65 70 75 80

Ї еи Сп Меї Авп 5ег І ви Агу Аа Сіи Авр ТНг Аа Маї Туг Туг Суз 85 90 95

Аа Ага Рго Геи 5ег Аїа Ні Туг Сіу Ріє Авп Туг Рне Авр Тут Тр 100 105 110

Зо

Спу Сп Спу ТАг Гей Маї Тнг Ма! бег 5ег 115 120 «2105 А «2115 321 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005 41 дааандіда ідасісадіс Ісссдсіасс сідісадісі сісссддсда асуддсіасс (610) сідіссідсс даассісада адаїаїсіас аасадосідо сподіаїса дсадаадссс 120 даасаддссс сіаддсідсі ддіаїасісс дсіаансіс І(дсасаїсдо сайссадса 180 соонсісію діадіддсіс аддаасщад їагасссіда сааїсіссад ссідсададс 240 даадасійсд садщїтасії Ндссадсад іасіадац аїссссіддас сшддсода 300 дддассаадад ісдадаїсаа 9 321 «2105» 42 «2115 107 «212» Білок 60 -213» Штвтучна послідовність

223» Синтетична послідовність «4005» 42

Сі Пе Маї Меї Тиг Сіп 5ег Рго Ага ТНг Геи Зег Ма! Зег Рго Спу 1 5 10 15

Сім Ага Айїа Тпг ГГ еи Зег Суз Агу ТАг Зег Си Авр Іе Туг Азп Спу 20 25 зо

Ї еи Аа Тр Туг Сп Сп Гуз Рго Спу Сіп Аїйа Рго Агу І! єи Г еи Маї 35 40 45

Туг Зег Аа Авп 5ег І єм Ні Пе Сіу Пе Рго Аа Ага РНе 5ег Спу 50 55 бо

Зег Сіу Зег Сіу Тиг Спи Туг Тиг І єи Тне Пе бЗег 5ег І єи Сп 5ег 65 70 75 80

Сім Ар Ре Аїа Маї Туг Рне Суз Сіп Сіп Туг Туг А5р Туг Ро І еи 85 90 95

Зо

Аа Ре Спіу Спу Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «210» 43 «2115 321 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «-4005 43 даааісдюа ідасісацдіс іссідсіасі сідіссущі ссссіддода асддсіасі (10) сідіссідіє діассіссда адаташас аасдадсідуд спдаїаїса дсадаадссс 120 даасаддссс сіаддсідсі даїсіасісс дсіаайнсіс ідсасаїсду санссадса 180 соднсісІю діадіддсіс аддаасідад Шасссіда саашіссад ссідсададс 240 даадасійсод садщіасіа Носсадсад іасіадац аїссссіддс сшддсода /-З00 дддассаадд ісдадаїсаа а 321 «2105» 4А «2115 107 «212» Білок 60 -213» Штвтучна послідовність

223» Синтетична послідовність «4005» 44

Сі Пе Маї Меї Тиг Сіп 5ег Рго Ага ТНг Геи Зег Ма! Зег Рго Спу 1 5 10 15

Сім Ага Айїа Тпг ГГ еи Зег Суз Агу ТАг Зег Си Авр Іе Туг Азп Спу 20 25 зо

Ї еи Ага Тр Туг СіІп Сп Гув Рго Стпу Сп Айа Рго Аго І єи Геи Іе 35 40 45

Туг Зег Аа Авп 5ег І єм Ні Пе Сіу Пе Рго Аа Ага РНе 5ег Спу 50 55 бо

Зег Сіу Зег Сіу Тиг Спи Рне ТНг І єи Тит Пе бег 5ег І єи Сіп Бег 65 70 75 80 сій Авр РНе Аїа Маї Туг Туг Суз Сп Сп Туг Туг Авр Туг Рго І єи 85 90 95

Зо

Аа Ре Спіу Спу Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105» 45 «2115 321 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 45 дааандіда іІдасісадад сссідсіаса сідіссдіса дсссіддада асдідсіаса (10) сідіссідіє дсассісада адаїашас сададосідо спддіаїса дсадаадссс 120 ддаасаддссс сіаддсідсі даїсіасісс дсіаасасіс Ідсасаїс9ду сайссадса 180 соонсісю діадіддсіс аддаассдад Шасссіда саашссад ссідсадієї 240 даадасійсод садщіасіа Носсадсад іасіадац аїссссіддс сшддсода /-З00 дддасааадяо ісдадаїсаа а 321 «2105» 46 «2115 107 «212» Білок 60 -213» Штвтучна послідовність

223» Синтетична послідовність «400» 46

Сі Пе Маї Меї Тиг Сіп 5ег Рго Ага ТНг Геи Зег Ма! Зег Рго Спу 1 5 10 15

Сім Ага Айа Тнг Геи Зег Су Агу ТНг Зег Сім Авр Пе Туг Сп Спу 20 25 0)

Ї еи Ага Тр Туг Сіп Сп Гув Рго Стпу Сп Айа Рго Аго І єи І єи Пе 35 40 45

Туг Зег Аа Авзп ТНг Геи Нів Пе Спу Пе Рго Аа Агу РНе 5ег Спу 50 55 бо

Зег Сіу Зег Сіу Тиг Спи Ре ТНг І єи Тнг Пе бег 5ег І єи Сп Бег 65 70 75 80 сій Авр РНе Аїа Маї Туг Туг Суз Сп Сп Туг Туг Авр Туг Рго І єи 85 90 95

Зо

Аа Ре Спіу Спу Спу ТНг Гуз Маї Спи Пе Гув 100 105 «2105» 47 «2115» 39 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 47 ссасідіссу сасасіаща сіїсаацас Шдайнаї 39 «2105» 468 «2115 13 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «400» 48

Рго І єи 5ег Аа Ні Туг Сіу Рне Азп Туг Рпе Азвр Туг 1 5 10 (516)

«-210» 49 «-2115 36 212» ДНК -213» Штгтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 49 ідісдсассії садаадаїа!ї Нассаддда сідасі 36 «2105 50 «-2115 12 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «-4005 50

Сув Агу Тит Зег Спи Авр Пе Туг СІп Спу І еи Аа 1 5 10 «-2105 51 «2115 21 212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 51 іссодсіааса сісюсасаї с 21 «-2105 52 «-2115 7 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «4005 52 5ег Аа Азп ТНг І єи Нів Пе 1 5 «2105 53 «-2115 1350 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність 60

«4005 53 саддідсадс ддісдааїс адддаадддда сіддісааас ссдддоадсіс асідсдісід (610) їсащідсса ісісаддсії сасасідадс дасіасіаїа ддсаддаї ссдасадаса 120 і ссададсаадо дасіддадчю адідістасі ашсідсса аідодссідад дассіасіаї 180 ссідасадід ісаадддааяд айсасааїс Ісасдддаїа асосіааааа Псссідіас 240 сідсадаїда асадссідад адссдаадас ассдсідіді астайдсосісодссосасія /-зо00

Іссдсасасі аїдасіїсаа Пасшода! їайддддас аддаїасссі ддідасадіє 360

Іїссадсдсіа дсассаадду сссаїсддіс Псссссіду сдсссідсіс саддадсасс 420 й Іїссдададса садссдсссі ддосідссід дісааддасі асіссссда ассоддідасу 480 дідісдюдда асісаддсдс ссідассадс ддсоідсаса ссісссддс щіссіасад 540 іссісаддас ісіасісссї садсадсдд додассадідс ссіссадсад спдадсасд (100) аадассіаса ссідсаасодї адаїсасаад сссадсааса ссааддідда саадададчії 660 дацдіссаааї адіссссс аїдсссасса іІдсссадсас сідаайссі ддододасса 720 7 їсадіснос дісссссс аааасссаад дасасісіса Юаїсісссд дассссдад 780 дісасдіюсо дюддвіддюада сдідадссад даадассссо аддіссади саасіддіас 840

Зо даюдащдосо ддаддіодса іааїдссаад асааадссдс дддаддадса дисаасадс 900 асоіассодід іддісадсої ссісассдіє сюсассадд асюдсідаа сддасааддад 960

Тасаадідса аддісіссаа саааддссіс ссдіссісса Ісдадаааас саїсіссааа 1020 7 дссааадддс адссссдада дссасаддід їасасссідс ссссаїссса ддаддадаю 1080 ассаадаасс аддісадссі дассідссід дісаааддсі Істассссад сдасаїсдсес 1140 дюдавдвіддо ададсааідд дсадссддад аасаасіаса адассасдсс ісссдїдсід 1200 дасіссдаса асіссісії ссісїіасадс аддсіаассу юдасаадад саддіддсад 1260 дададодаа!о існсісаїд сіссдідад сададасіс ідсасаасса сіасасасад 1320 7 аададссісі сссідісісс ддоїаааюда 1350 «2105 54 «2115» 449 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» «223» Синтетична послідовність «4005 54

Сп Маї Сій І єи Маї Спи Зег Сіу Спу Спу Гей Маї Гуз Рго Спіу СПу 601 5 10 15 зег І ви Ага І еи 5ег Суз Аїа Маї 5ег Спу Рне ТНг ГГ еи Зег Азр Туг 20 25 0)

Туг Меї Аа Ттр Іе Аг Сіп Аа Рго Спу Гуз Спу І еи Спи Тр Маї 35 40 45 зег ТП Пе Зег Аіа 5ег Стпу Геи Аго Тиг Туг Туг Рго Авр 5ег Маї 50 55 60

Гуз Спіу Ага Ре Тнг Іе 5ег Ага Авр Авп Аа Гуз Авп 5ег І еи Туг 65 70 75 80

Ї еи Сп Меї Авп з5ег ГГ еи Аг Аїа Сім Ар ТНг Аа Маї Туг Туг Суб 85 90 95

Аа Ага Рго Геи 5ег Аїа Ні Туг Сіу Ріє Авп Туг Рне Авр Тут Тр 100 105 110

Сіу Сп Сіу ТНг Ге Маї Тнг Маї бег Зег Аіа Зег Тпг Гуз Спу Рго 115 120 125

Зо зЗег Маї Рпеє Рго І єи Аа Рго Су бЗег Агу Зег ТНг Зег Спи Зег ТНг 130 135 140

Аа Аа єи Сіу Суз І єи Маї! Гуз Авр Туг Ре Рго Сім Рго Маї ТНг 145 150 155 160 маї Зег Тр Авп 5ег Су Аїа Геи ТНг Зег Спіу Маї Ніз Тиг Рне Рго 165 170 175

Аа Ма! І єи Сіп бег Зег Спу Геи Туг Зег І єи 5ег Зег Маї Ма! ТНг 180 185 190 маї Рго 5ег Зег 5ег І еи Спу ТАг Гуз Тиг Туг ТАг Суз Азп Маї Азр 195 200 205

Ні Гуз Рго 5ег Авп ТАг Гуз Маї Ар Гуз Ага Маї Спи Зег Гуз Туг 210 215 220 ау Ро Рго Сув Рго Ріо Суз Рго Аа Рго Спи РНеє І ви Спу Спіу Рго 225 230 235 240 зЗег Ма! Рпє ГІ єи РнНе Рго Рго Гуз Рго Гуз Авр Тиг Геи Ме! Ше 5ег бо 245 250 255

Агу Тнг Рго Сім Маї Тиг Суз Маї Маї Маї Авр Ма! Зег Сіп СПи Ар 260 265 270

Рго Ст Маї Сип Рне Авзп Тр Туг Маї Авр Су Маї Си Маї Ні5 Авп 275 280 285

Аа Гуз ТНиг Гуз Рго Ага Си Спи Сп Рпє Авп 5ег Тнг Туг Агу Маї 290 295 00

Ма! Зег Ма! І єи ТНиг Ма! І єи Ні Сіп Авр Тгр Геи Авп Спу Гув Спи 305 з10 315 з20

Туг Гуз Суз Гуз Ма! Зег Авп Гуз С1пу І еи Рго Бег 5ег Пе Спи Гув 325 330 335

Ти Пе Зег Гуз Аа Гуз Спу Спп Рго Агу Сім Рго Сп Маї Туг ТНг 340 345 350

Ї еи Ріо Рго Зег Сп Сім СТи Меї Тнг Гуз Авп ап Маї Зег І еи ТНг 355 360 365

Зо

Сувз І єи Ма! Гуз Спу Рне Туг Рго 5ег Азр Пе Аа Ма! Спи Ттр Сім 370 375 380 /Бег Авп Стпу Сп Рго См Авп Авп Туг Гуз Тг ТНг Рго Рго Маї І єи 385 390 395 400

Авр 5ег Авр Су бег Рпеє РнНе ГГ еи Туг 5ег Агу І єи Тнг Маї Авр І уз 405 до 415 зег Аг Ттр Сп Сіи Спу Авп Маї РНе 5ег Суз Зег Ма! Меї Ні5 Си 420 425 430

Аа І еи Ні Авп Нів Тут ТНг Сп Гуз 5ег І еи 5ег І єи Зег Рго Спу 435 440 445

Гуз «2105 55 «2115» 642 «212» ДНК -213» Штвтучна послідовність бо «220»

223» Синтетична послідовність -4005 55 дааандіда іІдасісадад сссідсіаса сідіссдіса дсссіддада асдідсіаса (10) сідіссідіє дсассісада адаїашас сададосідо спддіаїса дсадаадссс 120 ддаасаддссс сіаддсідсі даїсіасісс дсіаасасіс Ідсасаїс9ду сайссадса 180 соонсісю діадіддсіс аддаассдад Шасссіда саашссад ссідсадієї 240 даадасійсод садщіасіа Носсадсад іасіадац аїссссіддс сшддсода /-З00 дддасааадд іІсдадаїсаа аасодіддсі дсассаїсід існсаїсії сссдссаїсі 360 дададсаді даааїсідд аасідссісї дчнащідсс ідсідааіаа сисіаіїссс 420 адададдсса аадіасадід даадаїддаї аасосссісс ааісддаїаа сісссаддад 480 адідісасад адсаддасад сааддасадс ассіасадсс ісадсадсас ссідасоасід 540 адсааадсад асіасдадаа асасааацдіс їіасдссідсд аадісассса ісадддссід (610)0) адсісдсссу Ісасааадад сисаасадо ддаздацчіцї ад б42 «2105 56 «2115 213 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «-4005 56

Сі Пе Маї Меї Тиг Сіп 5ег Рго Ага ТНг Геи Зег Ма! Зег Рго Спу 1 5 10 15

Сім Ага Айа Тнг Геи Зег Су Агу ТНг Зег Сім Авр Пе Туг Сп Спу 20 25 зо

Ї еи Ага Тр Туг СіІп Сп Гув Рго Стпу Сп Айа Рго Аго І єи Геи Іе 35 40 45

Туг Зег Аа Авзп ТНг Геи Нів Пе Спу Пе Рго Аа Агу РНе 5ег Спу 50 55 бо

Зег Сіу Зег Сіу Тиг Спи Рне ТНг І єи Тит Пе бег 5ег І єи Сіп Бег 65 70 75 80 сій Авр РНе Аїа Маї Туг Туг Суз Сп Сп Туг Туг Авр Туг Рго І єи 85 90 95 бо

Аа Ре Стпу Спу Спу ТАг Гуз Маї Спи Пе Гуз Тнг Маї Аїа Аа Рго 100 105 110 зег Маї Ре Пе Рне Рго Рго 5ег Авр Сіи Сп ей Г ув Зег Спіу ТНг 115 120 125

Аа 5ег Маї Ма! Суз І єи І еи Азп Азп Рне Туг Рго Аг9 Сім Аїа І ув 130 135 140 маї Сіп Тер Гуз Маї Авр Авзп Аа І єи Сіп Зег Спіу Авп 5ег Сп Спи 145 150 155 160

Зег Ма! Тиг Спи Сіп Авр 5ег І уз Авр 5ег ТНиг Туг 5ег І єи бег Бег 165 170 175

ТигГеи Тит ем 5ег Гуз Аа Авр Туг Сім Гуз Ніз Гуз Маї Туг Аа 180 185 190 Суз Сім Маї ТАг Ні Сп Спу Гей Зег Зег Рго Маї Тиг Гуз Зег Рпе 195 200 205

Азп Агу спу Спи Сув 210 «2105 57 «2115» 439 «212» Білок «213» Ното бЗарієпе «4005 57 спи Бег Спу Туг Аіа Сіп Авп Су Авр Гей Спи Авр Аа Сі Гей Авзр 1 5 10 15

Ар Туг Зег Рне 5ег Суз Туг Зег Сп Ї єи Спи Ма! Азп Спу бег Сп 20 25 Зо

Ні Зег І єи Тниг Суз Аа РНе Си Авр Рго Авр Маї Авзп ТНг Тиг Авп 35 40 45

Ї еи Си Рне Сі Пе Суз Сіу Аа І єи Маї Спи Ма! І уз Суз І ей Ап 50 55 60

Рпє Аг Гуз Г еи Сп См Пе Туг Рпе Пе Сти Тк Гуз Гуз Рне І єи 65 70 75 80 60 Ї еи Пе Стпу Гуз бег Авп Ге Суз Маї І уз Ма! Спу Спи Гуз Зег І еи

85 90 95

Тпиг Суз Гуз Гуз Пе Ар І еи Тнг ТНг Пе Маї Гуз Рго Спи Аа Рго 100 105 110

Рпе Авр Геи 5ег Ма! Пе Туг Агу Спи С1пу Аа Азп Авр РНе Маї Маї 115 120 125

Тиг Рне Авп Тнг 5ег Нів І єи Сп Гуз Гуз Туг Ма! Гуз Ма! Геи Меї 130 135 140

Ні5 Азр Маї Аа Туг Агу Сп Спи Гуз Авр Сім Авп Гуз Тр ТАг Нів 145 150 155 160 маї Авп І єи бег 5ег ТНг Гуз І єи ТНг І єи І ви Сп Агу Гуз І еи Сп 165 170 175

Рго Аїа Аа Меї Туг Сім Пе Гуз Маї Агу 5ег Пе Рго Авр Ні Туг 180 185 190

Рпе Гуз Спу Ріє Ттр 5ег Сім Тр Зег Рго Зег Туг Туг РНе Аг Тиг 195 200 205

Зо

Рго Сіш Пе Авп Авп бег бег Сіу Си Меї Ар Рго Іе І єи І єи ТНг 210 215 220

Пе Бег Пе Геи 5ег Рпе РНе 5ег Маї Аїа Г еи І еи Ма! Пе І єи Аа 225 230 235 240

Суз Маї Г еи Ттр Гуз Гуз Ага Іе Гуз Рго Пе Маї Тер Рго 5ег Гей 245 250 255

Рго Авр Ніз І уз Гуз ТНг І єи Спи Нів Гей Суз І уз І уз Рго Ага ГІ уз 260 265 270

Авп І єи Авп Маї бег Рне Авзп Рго Спи 5ег РНе Гей Авр Суз СіІп Пе 275 280 285

Ні Агу Маї Ар Ар Іе Сіп Аа Агу Азр Спи Маї Спи СПу Рпе Гей 290 295 00

Сп Азр Тнг РНе Рго СіІп Сп Ї ви Спи СП бег Спи Гуз Сп Аго І еи 305 310 315 з20 60 Спу Сіу Авр Маї Сіп 5ег Рго Азп Суз Рго бег Сіи Авр Маї Ма! Пе

325 330 335

Тиг Рго Сім Зег Ре Сіу Агу Авр Зег 5ег І еи ТАг Суз І еи Аа Су 340 345 350

Азп Маї 5ег Аіа Суз Азр Аїа Рго Іе І єи Зег 5ег Зег Агу зег І єи 355 360 365

Азр Суз Агу См Зег СПу Гуз Авп ау Рго Ні Маї Туг Сп Авр І єи 370 375 380

Ї еи Гєи Бег Гей Спу ТАг Тнг Авп зег ТАг ГГ еи Рго Рго Рго Рпеє 5ег 385 390 395 400

Ї еи Сп Зег Спу Пе Г еи ТНг І єи Авп Рго Маї Аа Сіп Спу Сп Рго 405 до 415

Пе Геи Тиг Зег Геи СПу Зег Авп Сп Спи С1им Аїйа Туг Ма! Тиг Меї 420 425 430 зЗег Зег Рпе Туг Сп Авп Сп 435

Зо «2105 58 «2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 58 сій Зег Спу Туг Аа Сіп Авп Спу Авр І еи Сім Авр Аа Сі І еи 1 5 10 15 «2105» 59 «2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 59

Аа Сп Авп Су Авр І єи Спи Авр Аа Спи І ей Ар Авр Туг 5ег 1 5 10 15 60 «2105» 60

«-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність -4005» 60

Аврі єи Спи Ар Аа Сі І єи Авр Авр Туг Зег Рпе бЗег Суз Туг 1 5 10 15 «-2105 61 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «4005» 61

Аа Спи Геи Авр Авр Туг Зег Рпе 5ег Суз Туг Зег Сп І еи Си 1 5 10 15 «-2105» 62 «-2115 15

Зо «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 62

Азр Туг Зег Рпе Зег Суз Туг Зег Сп І єи СП Маї Авп Спу Зег 1 5 10 15 «-2105» 63 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність

БО «400» 63

Зег Суз Туг Зег Сп Ї еи Спи Ма! Азп Стпу 5ег Сіп Ні 5егі єи 1 5 10 15 «-2105» 64 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність

Гс10)

«020» 223» Синтетична послідовність «400» 64

Сіп Геи Спи Маї Абп сту Зег Сіп Нів Зег І еи ТАг Суз Аа Рпе 1 5 10 15 «2105» 65 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «-4005» 65

Авп Сіпу бег Сп Ні 5ег І єи Тнг Суз Аіа Рне Спи Авр Рго Ар 1 5 10 15 «2105» 66 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «-4005» 66

Ні Зег І єи Тиг Суз Аа Ре Сіи Авр Рго Азвр Маї Авп ТНг ТНг 1 5 10 15 «-2105» 67 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 67

Суз Аа Рпє Сіи Авр Рго Азвр Маї Авп Тниг Тнг Авп І еи Си Ре 1 5 10 15 «-2105» 68 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність 60 «400» 68

Азр Рго Азвр Маї Авп ТНг Тиг Авп ГГ еи Спи Рпе Сіи Пе Сув Спу 1 5 10 15 «210» 69 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 69

Авп ТНиг ТНг Авп Гей Спи Рне Спи Пе Сувз Спу Аа І ей Маї СПи 1 5 10 15 «-2105 70 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 70

Гей Сім Рне Сі Пе Суз Спіу Аа Геи Маї Спи Ма! Гуз Сув І еи 1 5 10 15 «-2105 71 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «4005 71

Пе Суз Спу Аїа І єм Маї Спи Маї Гуз Сувз Геи Авзп РНе Аг Гуз 1 5 10 15 «-2105 72 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005 72

Ї еи Ма! Спи Маї Гуз Суз І вєи Азп РНе Ага Гуз ГГ еи Сп Спи Пе 1 5 10 15

Гс10)

«-2105 73 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 73

Гуз Суз І еи Авп Ріє Ага Гуз І єи Сп Спи Пе Туг Рне Пе Спи 1 5 10 15 «-2105» 74 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 74

Рпє Аг Гуз І еи Сп Сім Пе Туг Рпе Пе Сіи ТАг Гуз Гуз Рпе 1 5 10 15 «2105» 75 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005 75 ап Спи Пе Туг РНе Пе Спи ТА Гуз Гуз РНе ГГ еи І еи Пе Спу 1 5 10 15 «-2105 76 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «4005» 76

Рпеє Пе Спи Тнг Гуз Гуз Ре Г еи ГГ еи Пе Спу Гув Зег Авп Пе 1 5 10 15 «-2105 77 «-2115 15 60 «212» Білок

-213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 77

Гуз Гуз Рнє І єи І єи Пе Сту І уз бег Азп Пе Суз Маї Гуз Ма! 1 5 10 15 «-2105 78 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 78

Ї еи Пе Стпу Гуз бег Авп Ге Суз Маї І уз Ма! Спу Спи І ув Бег 1 5 10 15 «-2105» 79 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «4005» 79 зЗег Авп Пе Суз Маї Гуз Ма! Спу Сім Гуз Зег І еи ТНиг Суз Гув 1 5 10 15 «-2105» 80 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність -4005» 80

Маї Гуз Ма! Спу Спи Гуз Бег І еи Тиг Сув Гуз І уз Пе Авр І єи 1 5 10 15 «-2105» 81 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 60 «223» Синтетична послідовність

«400» 81

Сім Гуз 5егІ еи Тнг Сувз І уз І уз Пе Авр І єи Тнг Тнг Те Маї 1 5 10 15 «-2105» 82 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 82

Тпиг Суз Гуз Гуз Пе Авр І єи Тиг ТАг Пе Маї Гуз Рго Сім Аа 1 5 10 15 «210» 83 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність

Ко) «400» 83

Пе А5р Гей Тиг Тнг Те Маї Гуз Рго Си Аа Рго РНеє Авр І єи 1 5 10 15 «-2105» 84 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 84

Тит Пе Маї Гуз Рго Сім Аїа Рго Рне Азр Геи 5ег Ма! Пе Туг 1 5 10 15

БО «210» 85 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 85 (510) Рго Сіи Аїа Рго РНе Авр ГІ єи 5ег Ма! Пе Туг Агу Сім Сіу Аіа

1 5 10 15 «210» 86 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 86

Рпе Авр Геи 5ег Ма! Пе Туг Агу Спи Спіу Аіа Азп Ар Ре Маї 1 5 10 15 «-210» 87 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 87 ма! Ме Туг Агу Спи Спіу Аа Авп Авр РнНе Маї Маї Тиг Ре Авп 1 5 10 15 «210» 88 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 88

Сім Спу Аа Азп Авр Рнє Маї Ма! Тнг Рне Авзп ТнНг 5ег Нів І ви 1 5 10 15 «210» 89 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 89

Азр Ре Маї Маї Тнг Рне Авп Тнг 5ег Ніз І єи Сіп Гуз Гуз Туг 1 5 10 15 60 «210» 90

«-2115 15 «212» Білок 213» Штучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність -4005» 90

ТАг Рне Авп Тнг 5ег Ніз І єи Сіп Гуз Гуз Туг Ма! Гуз Маї Гей 1 5 10 15 «2105» 91 «-2115 15 «212» Білок -213» Штгтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 91 зЗег Ні І еи Сп Гуз І уз Туг Ма! Гуз Маї І єи Меї Ніз Азр Маї 1 5 10 15 «-2105» 92 «-2115 15

Зо «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 92

Гуз Гуз Туг Ма! Гуз Маї І єи Меї Ні Авр Маї Аа Туг Агу Сп 1 5 10 15 «2105 93 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність

БО «400» 93

Гуз Ма! І єи Меї Ніз Азр Маї Аа Туг Ага Сіп Спи Гуз А5р Си 1 5 10 15 «-2105» 94 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність 60

«020» 223» Синтетична послідовність «400» 94

Ні5 Азр Маї Аа Туг Агд Сп Спи Гуз Авр Сім Авп Гуз Тр ТАг 1 5 10 15 «210» 95 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 95

Туг Ага Сп Сім Гуз Авр Си Авп ГГ уз Тр ТНг Ніз Маї Авп І еи 1 5 10 15 «210» 96 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 96

Гуз Ар Сім Авп І уз Тр ТАг Ні Маї Авп І єи Зег Зег ТНг Гуз 1 5 10 15 «-210» 97 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 97

Гуз Тр ТАг Ні Маї Авп І єи Зег 5ег Тпиг Гуз Геи ТНг І єи Гей 1 5 10 15 «210» 98 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність 60 «400» 98 маї Авп І єи бег 5ег ТНг Гуз І єи ТНг І єи І ви Сп Агу Гуз ей 1 5 10 15 «210» 99 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 99 зЗег Ти Гуз І еи Тиг Гени І еи Сп Аго Гуз ГГ еи Сп Рго Аа Аа 1 5 10 15 «2105» 100 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «400» 100

Зо Тип еи І си Сп Ага Гуз І еи Сп Рго Аа АІа Меї Туг Спи Пе 1 5 10 15 «210» 101 «2115» 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 101

Ага Гуз І ви Сп Рго Аа Аа Меї Туг Сіи Пе Гуз Маї Ага Зег 1 5 10 15 «2105» 102 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 102

Рго Аїа Аа Меї Туг Сім Пе Гуз Маї Агу Зег Пе Рго Авр Ніб 1 5 10 15 60

«2105» 103 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 103

Туг см Пе Гуз Маї Агу Зег Пе Рго Авр Ніз Туг РНе Гуз Спу 1 5 10 15 «210» 104 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 104

Ммаї Ага зе" Пе Рго Ар Ні Туг Рпе Гуз Сіу Ре Тр 5ег Сі 1 5 10 15 «210» 105 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 105

Рго Авр Ні Туг Рпє Гуз Спу Рпеє Тгр Зег Сім Тгр Зег Рго Зег 1 5 10 15 «210» 106 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 106

Рне Гуз Сіу РНе Тр 5ег Си Тр 5ег Рго 5ег Туг Туг Рне Ага 1 5 10 15 «-2105» 107 «-2115 15 60 «212» Білок

-213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 107

Тр Зег Сім Тгр 5ег Рго 5ег Туг Туг Рпє Агу ТНг Рго Спи Пе 1 5 10 15 «2105» 108 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 108 зЗег Рго 5бег Туг Туг Рне Агу Тнг Рго Сім Пе Авп Авп 5ег 5ег 1 5 10 15 «210» 109 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 109

Туг Рне Ага Тнг Рго Сім Пе Авп Авп Зег Бег Спу СПи Меї Авр 1 5 10 15 «2105» 110 «2115 31 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 110

Гуз Суз І єи Авп РнНє Ага ГГ уз І єи Сп СПш Пе Тук Рне Пе Спи ТНг 1 5 10 15

Гуз Гуз Рнє І єи І єи Пе Сту І уз бег Азп Пе Суз Маї Гуз Ма! 20 25 0) -2105 111 «2115 31 60 «212» Білок

-213» Штгтучна послідовність 223» Синтетична послідовність «4005 111

Туг см Пе Гуз Маї Агу Зег Пе Рго Авр Ні Туг РНе Гуз Спу Рпе 1 5 10 15

Тр Зег Сім Тгр 5ег Рго 5ег Туг Туг Рпє Агу ТНг Рго Спи Пе 20 25 Зо «2105 112 «2115 327 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 112

Аа 5ег Тпг Гуз СПУ Рго 5ег Ма! Рне Рго Г єи Аа Рго Суз 5ег Ага 1 5 10 15

Бег Тиг Бег Спи Бег ТНг Аа Аа І еи Спу Суз І еи Ма! Гуз Авр Туг 20 25 Зо

Рпє Рго Си Рго Маї Тнг Маї Зег Тгтр Авзп Зег Спу Аа Геи Тнг Зег 35 40 45

Стпу Маї Ні5 Тнг РНе Рго Аїа Маї І єи Сп бег бег СПУ І єи Туг Зег 50 55 60

Ї еи Зег Зег Маї Ма! Тниг Маї Рго 5ег Зег Зег І ви Спу ТНиг Гуз ТНг 65 70 75 80

Туг Тиг Суз Авп Маї Авр Ніз Гуз Рго 5ег Азп ТНг Гуз Маї Авр ГГ ув 85 90 95

Ага Маї Спи Зег Гуз Туг Спу Рго Рго Суз Рго Рго Суз Рго Аа Рго 100 105 110

Сім Рне І єи Спу Сіу Рго 5ег Маї РНе І єи Рне Рго Рго Гуз Рго ГІ уз 115 120 125

Азр ТНг І єи Меї Пе 5Зег Агу Тнг Рго Сіши Маї Тнг Суз Маї Маї Маї 130 135 140 (516)

Азр Маї 5ег Сип СіПи Авр Рго Спи Маї Сіп РНе Авзп Тгр Туг Ма! А5р 145 150 155 160

Сіу Ма! Спи Маї Ні Авп Аа Гуз ТНг Гуз Рго Агу Сіи Спи Сп Рпе 165 170 175

Авп 5ег ТНг Туг Агу Маї Маї Зег Ма! Геи Тниг Ма! Геи Ні Сип Авр 180 185 190

Тр Геи Авп Сіу Гуз Сім Туг Гуз Суз І уз Ма! Зег Авп Гуз Су І еи 195 200 205

Рго Зег Зег Пе Спи Гуз ТАг Пе Зег Гуз Аа Гуз Спу Сп Рго Агд 210 215 220

Сім Рго Сіп Маї Тут Тиг ГГ еи Рго Рго Зег Сп Спи Сім Меї Ти Гуз 225 230 235 240

Авп Сп Маї 5ег І єи Тнг Суз І еи Маї! Гуз Сіу Рне Туг Рго 5ег Ар 245 250 255

Коо) Пе Аа Маї Спи Тгтр Спи Зег Азп Спу Сп Рго Сім Авп Авп Туг Гуз 260 265 270

Тиг Тниг Ріо Рго Маї І єи Авр Зег Авр Су Зег Рпе Рне І єи Туг Зег 275 280 285

Ага ГІ еи Тнг Маї Азр Гуз 5ег Аго Ттр Сп Спи СПу Авп Маї Ріє Зег 290 295 00

Сув Зег Ма! Меї Ніз Сі Аїа ГГ еи Нів Авп Ні Туг Тиг Сіп Гув 5ег 305 з10 315 з20

Ї еи Зег І єи Зег Рго Стпу Гув 325 «2105» 113 «2115» 459 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 113 (510) Меї Тит Пе Геи Спу ТНг Тнг Ріе Стпу Меї Маї Ре 5ег І єи Гей Сп

1 5 10 15 маї Маї Зег Сіу Сім Зег Сіу Туг Аіа Сп Азп Сіу А5р Гей Си Авр 20 25 0)

Аа Спи Геи Авр Авр Туг Зег Рпе Зег Суз Туг Зег Сп І еи СПи Маї 35 40 45

Авп Сіпу бег Сп Ні 5ег І єи Тнг Суз Аіа Рне Спи Ар Рго Авр Маї 50 55 60

Авп ТНиг ТНг Авп ГГ еи Спи Рне Спи Пе Сувз Сіпу Аа І ей Маї Спи Маї 65 70 75 80

Гуз Суз І єи Авп Рнє Ага ГГ уз І єи Сп СП Пе Туг Ре Пе Спи ТАг 85 90 95

Гуз Гуз Ре Геи І єи Пе Спу Гуз 5ег Авп Пе Суз Ма! Гуз Ма! СПу 100 105 110 сій Гуз зег Гей ТНг Суз Гуз Гуз Пе Авр Геи Тит Тнг Пе Маї Гуз 115 120 125

Зо

Рго Сіи Аїа Рго РНе Авр ГІ єи Зег Ма! Пе Туг Агу Спи Спу Аа Авп 130 135 140

З5

Ар Ре Маї Маї Тнг Рне Авзп Тнг 5ег Ніз І еи Сп ГГ уз І ув Туг Маї 145 150 155 160

Гуз Ма! Геи Меї Ні Авр Маї Ага Туг Агу Сіп Спи Гув А5р Сім Авп 165 170 175

Гуз Тр ТАг Ні Маї Авп І єи Зег Зег Тпг Гуз Геи ТНг І ви Геи Сп 180 185 190

Ага Гуз І єи Сп Рго Аа Аїа Меї Туг Сім Пе Гуз Маї Ага 5ег Пе 195 200 205

Рго Авр Ні Туг РНе Гуз Спу Рпеє Ттр 5ег Спи Тгр Зег Рго Зег Туг 210 215 220

Туг Рне Аго Тнг Рго Сім Пе Авп Авп 5Зег Зег Сіу Спи Меї Авр Рго 225 230 235 240 60 Пе еи Гей Тнг Пе 5ег Пе Геи Зег РНе Рне 5ег Маї Аа І еи І єи

245 250 255 ма! Іе І еи Аа Суз Ма! І еи Тгр Гуз Гуз Ага Іе Гуз Рго Іе Маї 260 265 270

Тер Рго 5ег І єи Рго Авр Ніз І уз Гуз ТНг І еи Си Нів І єи Суз І уз 275 280 285

Гуз Рго Аго Гуз Авп ГГ еи Авзп Маї Зег Рне Авп Рго Спи 5ег Ре І єи 290 295 00

Азр Суз ап Пе Ні Агу Маї Ар Ар Іе Сіп Аїа Агу Ар Си Маї 305 з10 315 з20 сім Спу Рпе Геи Сп Авр ТНг Ріє Рго Сіп Сп І ви Спи СП Бег Си 325 330 335

Гуз Сп Аго Геи Спу Спу Авр Маї Сп 5ег Рго Авп Суз Рго 5ег Сі 340 345 350

Азр Маї Ма! Пе Тнк Рго Сім Зег РНе Сіпу Агу Авр Зег 5ег Геи ТНг 355 360 365

Зо

Суз І єи Аа Су Авп Маї Зег Аіа Су Авр Аїа Рго Іе І єи Бег Зег 370 375 380

З5

Зег Агу 5ег І еи Азр Суз Агу Сім бег СПУ Гуз Азп Сіу Рго Ні Маї 385 390 395 400

Тугаїп Аврі ей Гей Ї еи 5ег І єи Спу ТНиг ТНг Авзп 5ег ТНг І єи Рго 405 а410 415

Рго Рго РНе 5ег І єи Сп бег Спу Пе І ей ТНг І єи Азп Рго Маї Аа 420 425 430

Сіп Спу Сп Рго Пе І еи Тиг 5ег Геи Спіу Зег Авп Сп Спи Спи Аа 435 440 445

Туг Ма! Тиг Меї 5ег Зег Рне Туг Сп Авп Сп 450 455 «2105 114 «2115 219 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність 60

223» Синтетична послідовність «400» 114 сій Зег СЧПу Туг АІа Сп Авп Стпу Авр Геи Си Авр Аа Сім І еи Авр 1 5 10 15

Ар Туг Зег Рне 5ег Суз Туг Зег Сп Ї єи Спи Ма! Азп Спу бег Сп 20 25 0)

Нів Зег І єи Тнг Суз Аа РНе Си Авр Рго Авр Маї Авзп ТНг Тиг Авп 35 40 45

Ї ви Спи РНе Сііи Пе Суз Спу Аа ГІ єи Маї Сім Ма! Гуз Сув І еи Авп 50 55 60

Рпє Аг Гуз Г еи Сп См Пе Туг Рпе Пе Сти Тк Гуз Гуз Рне І єи 65 70 75 80

Ї еи Пе Слу Гу5 Зег Азп Іе Суз Маї Гуз Маї Спу Спи Гуз Бег І еи 85 90 95

Зо ТАг Сувз І уз І уз Пе Авр І и Тнг Ти Те Маї Гуз Рго Сі Аа Рго 100 105 110

Рпе Авр Геи 5ег Ма! Пе Туг Агу Спи С1пу Аа Азп Ар РНе Маї Маї 115 120 125

ТАг Рне Авп Тнг 5ег Нів І еи Сп Гуз І уз Туг Ма! Гуз Маї І єи Меї 130 135 140

Ні5 Азр Маї Аа Туг Агу Сп Спи Гуз Авр Сім Авп Гуз Тр ТНг Нів 145 150 155 160 маї Авп І єи бег 5ег ТНг Гуз І єи ТНг І єи І ви Сп Агу Гуз І еи Сп 165 170 175

Рго Аїа Аа Меї Туг Сім Пе Гуз Маї Агу Зег Пе Рго Авр Ні Туг 180 185 190

Рпе Гуз Спу Ріє Ттр 5ег Сім Тр Зег Рго Зег Туг Туг РНе Аг Тиг 195 200 205

Рго Сіш Пе Авп Авп бег 5ег Спу Сіи Меї Азр 210 215 60

«-2105 115 «-2115 7 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 115

РНе Пе Сім ТНг І ув Гуз Рне 1 5 «2105» 116 «-2115 6 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 116

Азр Гей Зег Ма! Пе Туг 1 5 «-2105 117 «2115» 4 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 117

Рпе Гуз Спу Рпе 1 «210» 118 «2115» 14 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 118

Ага Гуз І еи Сп Спи Пе Туг Ре Пе Спи Тиг Гуз Гув Рпе 1 5 10 «210» 119 «-2115 16 60 «212» Білок

-213» Штгтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 119

Азп Ре Ага Гуз І еи Сп Сім Пе Туг Рне Пе Сім ТАг Гуз Гуз Рпе 1 5 10 15 «2105» 120 «-2115 17 «212» Білок -213» Штгтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 120

Азр Геи Зег Ма! Пе Туг Агу Сім СПу Аа Азп Азр Ре Маї Маї ТнНг 1 5 10 15

Рпе

Зо -2105» 121 «-2115 13 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 121

Маї Маї Тиг Рне Авп ТАг З5ег Нів І єи Сп Гуз Гуз Туг 1 5 10 «-2105» 122 «-2115 15 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «4005» 122

Спи Пе Гуз Маї Агу 5ег Пе Рго Азвр Ніз Туг РНе Гуз Спу Рпе 1 5 10 15 «210» 123 «-2115 16 60 «212» Білок

-213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 123

Сп Пе Гуз Маї Ага 5ег Пе Рго Авр Ні Туг РНеє І уз Сіу Рне Тр 1 5 10 15 «2105» 124 «-2115» 19 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 124

Сп Пе Гуз Маї Ага 5ег Пе Рго Авр Ні Туг РНеє І уз Сіу Рне Пр 1 5 10 15 зЗег Сім Тр «-2105 125 «2115 23 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 125

Сп Пе Гуз Маї Ага 5ег Пе Рго Авр Ні Туг РНеє І уз Сіу Рне Тр 1 5 10 15 зег Сім Ттр Зег Рго 5ег Туг 20 «210» 126 «-2115» 8 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 126

Рпе Гуз Спу Рпє Тгр 5ег Си Тр 1 5

Гс10)

«-2105» 127 «2115 23 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «4005» 127

Пе Туг Рне Пе Сім ТАг Гуз Гуз РнНе І єи І еи Пе Спу Гуз Зег Авп 1 5 10 15

Пе Суз Маї Гуз Маї СпПу Спи 20 «210» 128 «2115» 28 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» «223» Синтетична послідовність «400» 128

Гуз Бегі єи ТАг Сув Гуз І уз Пе Авр І єи ТАг ТАг Пе Маї Гув Рго 1 5 10 15

Сім АЇа Рго РНе Азр Геи 5ег Ма! Пе Туг Ага Сі 20 25 «210» 129 «-2115» 19 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «020» 223» Синтетична послідовність «400» 129

Ї еи Тит Тнг Пе Маї Гуз Рго Сім Аа Рго РНе Азр ГІ єи 5ег Маї Пе 1 5 10 15

Туг Агу Сі «-2105» 130 «2115 11 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність

Гс10)

223» Синтетична послідовність «400» 130

Аа Рго Рнеє Азр І єи 5ег Ма! Ме Туг Агу Спи 1 5 10 «210» 131 «2115 27 «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «400» 131

Авп Гуз Тр ТАг Ніз Маї Авп І єи Зег 5ег Тиг Гуз Геи ТНг Геи Гей 1 5 10 15

Сіп Ага Гуз ГІ еи Сп Рго Аа Аа Меї Туг Сіи 20 25 «2105» 132 «-2115 17

Зо «212» Білок -213» Штвтучна послідовність «220» 223» Синтетична послідовність «4005» 132

Пе Гуз Маї Ага зег Пе Рго Авр Ні Туг РНе Гуз Спу РНе Тр 5ег 1 5 10 15

Сім

Claims (20)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, що специфічно зв'язується з людським С0127, причому зазначене антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, містить: () МН-ланцюг, що містить наступні амінокислотні послідовності: МНООКІ1 5ЕО ІЮ МО:10; МНеОСОКа2 5ЕО ІЮО МО:12; МНеОСОМКЗ 5ЕО ІЮ МО:14; та Мі -ланцюг, який містить наступні амінокислотні послідовності: МІСОК1 5ЕО І МО:16; МІ СОК2 5ЕО І МО:18; МІСОВАЗ 5ЕО ІО МО:20; або (її) МН-ланцюг, який містить наступні амінокислотні послідовності: МНООКІ1 5ЕО ІЮ МО:10; МНеОСОКа2 5ЕО ІЮО МО:12; МНеОСОКЗ 5ЕО ІЮ МО:48; та Мі -ланцюг, який містить наступні амінокислотні послідовності: МІСОК1 5ЕО ІО МО:50; МІ СОК2 5ЕО ІО МО:52; МІСОВАЗ 5ЕО ІЮ МО:20; і причому зазначене антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, є антагоністом передачі сигналу за участі ІІ -7К, індукованої 1І--7.

2. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 1, що специфічно зв'язується з послідовностями епітопа, узятими з домену 01 та з сайту 265 людського СО127, причому епітоп містить або складається з: (а) послідовності 5ЕО ІЮ МО: 86 або 5ЕО ІЮ МО:116 і (Б) послідовності ЗЕО ІЮ МО:110 або ЗЕО ІЮ МО 115 та (с) послідовності ЗЕО ІЮ МО:111, ї) причому послідовність епітопа в людському СО127, яка містить 5ХЕО ІЮ МО:110, не продовжується так, щоб вона містила амінокислоти, суміжні з зазначеною послідовністю в послідовності людського СО0127 більш ніж на 1 амінокислоту з М-кінця або більш ніж на 7 амінокислот з С-кінця; та/або її) причому послідовність епітопа в людському СО127, яка містить 5ЕО ІЮ МО:111, не продовжується так, щоб вона містила амінокислоти, суміжні з зазначеною послідовністю в послідовності людського СО127 більш ніж на 30 амінокислот з М-кінця або більш ніж на 30 амінокислот з С-кінця.

3. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за п. 2, що специфічно зв'язується з послідовностями епітопа з домену 01 та з сайту 265 людського СО127, причому послідовності епітопа містять або складаються з послідовності ЗЕО ІЮО МО:116 та послідовності ЗЕО ІЮ МО:115, та послідовності БЕО ІЮ МО:117.

4. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким одним із пп. 1-3, що не підвищує дозрівання дендритних клітин, індуковане Т5І Р.

5. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким одним із пп. 1-4, що містить: - важкий ланцюг з послідовністю ЗЕО І МО:2 або 5ЕО ІО МО:б6, або 5ЕО ІЮО МО:54 або який містить послідовність ЖЕО ІЮ МО:22 або 5ЕО ІЮ МО:З36, або 5ЕО ІО МО:38, або 5ЕО ІЮО МО:40; та - легкий ланцюг з послідовністю ЗЕО ІЮ МО:4 або 5ЕО ІО МО:56 або який містить послідовність 5ЕО ІЮ МО:24 або 5ЕО ІЮО МО:42, або 5ЕО ІЮО МО:44, або 5ЕО ІЮ МО:46.

6. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким одним із пп. 1-5, що являє собою химерне антитіло або гуманізоване антитіло, або деімунізоване антитіло.

7. Молекула нуклеїнової кислоти, яка кодує антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким одним із пп. 1-6, зокрема, амінокислоту, вибрану з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ МО:2; ЗЕО ІЮ МО:4; 5ЕО ІЮ МО:6; 5ЕО ІО МО:8; 5ЕО ІЮ МО:10; 5ЕО ІЮ МО:12; 5ЕО ІЮ МО:14; ЗЕО ІЮ МО:16; 5ЕО ІЮ МО:18; 5ЕО ІЮ МО:20; 5ЕО ІО МО:22; 5ЕО ІЮ МО:24; 5ЕО ІЮ МО:36; 5ЕО ІО МО:38; 5ЕО ІЮ МО:40; 5ЕО І МО:42; 5ЕО ІЮ МО:44; 5ЕО І МО:46; 5ЕО ІЮ МО:48; 5ЕО І МО:50; 5ЕО ІЮ МО:52; 5ЕО ІО МО:54 та 5ЕО ІЮ МО:56, зокрема, молекула нуклеїнової кислоти, що містить або складається з послідовності нуклеотиду, яка вибрана з групи, що складається з ЗЕО ІЮО МО:1; 5ЕО ІЮО МО:3; 5ЕО ІЮ МО:5; 5ЕО ІЮ МО:7; 5ЕО ІЮ МО:9; 5ЕО ІЮ МО:11; 5ЕО І МО:13; 5ЕО ІО МО:15; 5ЕО ІЮО МО:17; 5ЕБЕО ІЮ МО:19; 5ЕО ІЮ МО:21; 5ЕО ІЮ МО:23; 5ЕО І МО:35; 5ЕО ІЮО МО:37; 5ЕО ІС МО:39; 5ЕБЕО ІЮ МО:41; 5ЕО ІЮ МО:43; 5ЕБЕО ІЮ МО:45; 5ЕО І бо МО:47; ЗЕО ІО МО:49; 5ЕО ІО МО:51; 5ЕО ІО МО:53 та 5ЕО ІЮО МО:55.

8. Фармацевтична композиція, яка містить антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким одним із пп. 1-6 або молекулу нуклеїнової кислоти за п. 7 з фармацевтичним носієм.

9. Фармацевтична композиція за п. 8, яка містить додатковий відмінний активний інгредієнт, зокрема, додаткову сполуку, що характеризується терапевтичним імуномодулювальним ефектом, зокрема, відносно клітин, залучених у аутоїмунне захворювання або алергічне захворювання, лейкоз, такий як гострий лімфобластний лейкоз, лімфому, злоякісне захворювання, хронічну вірусну інфекцію, запальні захворювання, трансплантацію, респіраторні захворювання або аутоїмунну реакцію.

10. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким одним із пп. 1-6 для застосування як терапевтично активного інгредієнта у комбінованій схемі терапії у пацієнта, який потребує цього.

11. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 7 для застосування як терапевтично активного інгредієнта у комбінованій схемі терапії у пацієнта, який потребує цього.

12. Фармацевтична композиція за п. 8 або 9 для застосування як терапевтично активного інгредієнта у комбінованій схемі терапії у пацієнта, який потребує цього.

13. Застосування антитіла або антигензв'язувального фрагмента за будь-яким із пп. 1-6 як терапевтично активного інгредієнта для виробництва лікарського засобу, що використовується у комбінованій схемі терапії у пацієнта, який потребує цього.

14. Застосування молекули нуклеїнової кислоти за п. 7 як терапевтично активного інгредієнта для виробництва лікарського засобу, що використовується у комбінованій схемі терапії у пацієнта, який потребує цього.

15. Застосування фармацевтичної композиції за п. 8 або 9 як терапевтично активного інгредієнта для виробництва лікарського засобу, що використовується у комбінованій схемі терапії у пацієнта, який потребує цього.

16. Спосіб лікування пацієнта, що включає введення макромолекули, яка являє собою антитіло, або антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким із пп. 1-6, або молекули нуклеїнової кислоти за п. 7, або фармацевтичної композиції за п. 8 або 9, у комбінованій схемі терапії.

17. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким одним із пп. 1-6, для Зо застосування в лікуванні пацієнта, зокрема пацієнта-людини, який потребує трансплантації та/або на якого незабаром чекає трансплантація, та/або пацієнта, який переніс трансплантацію, та/або пацієнта з захворюванням або з ризиком захворювання, на яке впливають реакції Т- клітин пам'яті, зокрема, аутоїмунного захворювання, такого як ревматоїдний артрит, розсіяний склероз, діабет І типу, аутоїмунний тиреоїдит або вовчак, або запального захворювання, такого як запальне захворювання кишечнику (ІВО) та енцефаломієліт, або алергічного захворювання, або злоякісного захворювання, або респіраторного захворювання, або захворювання, пов'язаного з трансплантацією.

18. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 7 для застосування в лікуванні пацієнта, зокрема пацієнта-людини, який потребує трансплантації та/або на якого незабаром чекає трансплантація, та/або пацієнта, який переніс трансплантацію, та/або пацієнта з захворюванням або з ризиком захворювання, на яке впливають реакції Т-клітин пам'яті, зокрема, аутоїмунного захворювання, такого як ревматоїдний артрит, розсіяний склероз, діабет Ї типу, аутоїмунний тиреоїдит або вовчак, або запального захворювання, такого як запальне захворювання кишечнику (ІВ) та енцефаломієліт, або алергічного захворювання, або злоякісного захворювання, або респіраторного захворювання, або захворювання, пов'язаного з трансплантацією.

19. Фармацевтична композиція за п. 8 або 9 для застосування в лікуванні пацієнта, зокрема пацієнта-людини, який потребує трансплантації та/або на якого незабаром чекає трансплантація, та/або пацієнта, який переніс трансплантацію, та/або пацієнта з захворюванням або з ризиком захворювання, на яке впливають реакції Т-клітин пам'яті, зокрема, аутоїмунного захворювання, такого як ревматоїдний артрит, розсіяний склероз, діабет Ї типу, аутоїмунний тиреоїдит або вовчак, або запального захворювання, такого як запальне захворювання кишечнику (ІВ) та енцефаломієліт, або алергічного захворювання, або злоякісного захворювання, або респіраторного захворювання, або захворювання, пов'язаного з трансплантацією.

20. Застосування антитіла, або його антигензв'язувального фрагмента, за будь-яким одним із пп. 1-6 для виробництва лікарського засобу для лікування пацієнта, зокрема пацієнта-людини, який потребує трансплантації та/або на якого незабаром чекає трансплантація, та/або пацієнта, який переніс трансплантацію, та/або для лікування пацієнта з захворюванням або з ризиком бо захворювання, на яке впливають реакції Т-клітин пам'яті, зокрема, аутоїмунного захворювання,

такого як ревматоїдний артрит, розсіяний склероз, діабет | типу, аутоїмунний тиреоїдит або вовчак, або запального захворювання, такого як запальне захворювання кишечнику (ІВО) та енцефаломієліт, або алергічного захворювання, або злоякісного захворювання, або респіраторного захворювання, або захворювання, пов'язаного з трансплантацією.

21. Застосування молекули нуклеїнової кислоти за п. 7 для виробництва лікарського засобу для лікування пацієнта, зокрема пацієнта-людини, який потребує трансплантації та/або на якого незабаром чекає трансплантація, та/або пацієнта, який переніс трансплантацію, та/або для лікування пацієнта з захворюванням або з ризиком захворювання, на яке впливають реакції Т- клітин пам'яті, зокрема, аутоїмунного захворювання, такого як ревматоїдний артрит, розсіяний склероз, діабет І типу, аутоїмунний тиреоїдит або вовчак, або запального захворювання, такого як запальне захворювання кишечнику (ІВО) та енцефаломієліт, або алергічного захворювання, або злоякісного захворювання, або респіраторного захворювання, або захворювання, пов'язаного з трансплантацією.

22. Застосування фармацевтичної композиції за п. 8 або 9 для виробництва лікарського засобу для лікування пацієнта, зокрема пацієнта-людини, який потребує трансплантації та/або на якого незабаром чекає трансплантація, та/або пацієнта, який переніс трансплантацію, та/або для лікування пацієнта з захворюванням або з ризиком захворювання, на яке впливають реакції Т- клітин пам'яті, зокрема, аутоїмунного захворювання, такого як ревматоїдний артрит, розсіяний склероз, діабет І типу, аутоїмунний тиреоїдит або вовчак, або запального захворювання, такого як запальне захворювання кишечнику (ІВО) та енцефаломієліт, або алергічного захворювання, або злоякісного захворювання, або респіраторного захворювання, або захворювання, пов'язаного з трансплантацією.

23. Спосіб лікування пацієнта, зокрема пацієнта-людини, який потребує трансплантації та/або на якого незабаром чекає трансплантація, та/або пацієнта, який переніс трансплантацію, та/або пацієнта з захворюванням або з ризиком захворювання, на яке впливають реакції Т-клітин пам'яті, зокрема, аутоїмунного захворювання, такого як ревматоїдний артрит, розсіяний склероз, діабет І типу, аутоїмунний тиреоїдит або вовчак, або запального захворювання, такого як запальне захворювання кишечнику (ІВО) та енцефаломієліт, або алергічного захворювання, або злоякісного захворювання, або респіраторного захворювання, або захворювання, Зо пов'язаного з трансплантацією, причому зазначений спосіб включає введення макромолекули, яка являє собою антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за будь-яким одним із пп. 1-6, або молекули нуклеїнової кислоти за п. 7, або фармацевтичної композиції за п. 8 або 9.

503 Кох ТВ ї Б. во ЗЕ, Бо м «о М

1. с и 205 м 1о 105 чо 10006 Антнзе де Н.В (нг/мл) «фур. 1 г ї2а що чо со зона Б в іш я- БВ. зе у КС ах У бе Е ! ; я ; і с ! Х Ж З Її 5 МЕТ ! х інн редут -ій с ми Же КА З ча чтаа КЕНННУ на аитизізо до ЛАК (г/м)

В. 380 ОХ ве ко ду че і їв Б Я м їх У хх ФА хх са "І її ї 5 «З ооокквонотя сх І ние нини ВИШ за 395 1800 нива Анхтизіза да НАУК (вла

Фіг. З зх вес ще я ях , хо г в ве ВВ У 5 В ж ше Не я 18 " Й З -е в В її х х : 2 х Е у ще і : : Е їх В 5 г х У х Я Б : з 4 х ї 3 х ОЗ ї х І З хх 5 5 іч х г: х Я Ж З : 3 З З - Е ШЕ і х Х 8 їх СЯ : я ї х ЗУ Х р Е Е х З ї х Я Я Е х Е: ЕЗ Ж З ї х 5 ще ! : . . ГУ Ж Е Я х Х Ко 3 Ж З і ; З ї : х ; КЗ Е Ї Е Х Є : ЖЕ ЯК З З З З Її є : Е ся У х Ге Х Е ; ї ї з ЕЕ ї є: ї ЕЕ ШЕ Е ї ї ЕЕ: З | : Ї х : ЖЕ З З У КУ

ЩЕ . | | | і г ; З З їх х КЗ ї Ох : З 5 З

ШЕ . шщ- КУ ї : І: : Е ШЕ ШЕ: | : | В х І, Б Х : Х х шко х х х х З. х су їх ІЗ їх х Б Я Х х СК ж ше ЩЕ ШЕ Е: їх ї се г ж ШЕ ЩЕ МЕ 3 Ж ЗБЕ ЩЕ ВИНЕН З ї ї Я х х Х х ше | . У ЗНИК | З і: ГУ : З З З х г ж ше ши ше їх х х Зх Х Е х х х х Я БУ х х х їх ж ЕЗ х Е Ж х її х КУ Х їх Е х хх гЗ Х Х їх х Х 2 х х нені зак оо КК Х ї «- 3 5 5 3 5 Б ї З 5 3 їх СЯ -Я х. х 5 М Б С х З сх хх ІЗ ж З З с ь і х в ще в ше: ча о я ГУ 5 М вк ши мо Е с и Кн кн Ж ск У х га еВ ОКО, хх г хо Кх х ї о х х ; З З ЧК що з . г з й Ж с -о 000 ж ся Фа С Фа удо (й та те ЕМ я я Кік хі з Відмів. відн, лу В

Фр. З й. - Та їй ї й | ГИ Р Бо ; а МК дек ; Х Х г-Я од. Я | 5 Х / ДЕД і ЧЕ джерсі, о 1 10 не 1000 0 7Оо000 ковневтранія Г/л Й, 1 2 Є З

10 . ов, з хо Ї шо Й 0 То 100 ОО Нюй 00000 концентрація (мл) сг, З й до0оч НІ 15005 тех в Водні 0. ОК о се о. ши 0 гу ТО г їх о Віжутня РЕ ТІВ ж

5 . зах а З б щаапо о в я ЖК с г5 а ШЕ ох о | і и Є 0. вс З М 0 ВО Що хо Я0О0 Ко ш Ж - | ЩЕ Др не ее Нідсутня КЕ те

Фіг. х

В щ ге . у - 20- Ше о ше е Автизіло (мкг/мл фіг. 6

В. що | ПНТУ з | с Б 450. о й | о. З і й і ' .: І їй .її и ще: 55 НО І і КА не пиши пиши пише ши я с як як є ши Ше й. с. ц

ЖЕН. оо ш-

: и. - ши. щі ЕКЗ В ОН вишня е ня | «5 « 5 Ки ми ЕЕ а ві. 7

-к КН ії ще З ЩЕ.

го . ши ж и т во 20 / ни в. ; | ІЙ Й Е є Р. і 1 10 100 тАВівнгмлі г. Я

КН нн! р дити же жиле т Я х Ех х С Й а ; Е: ря ше: ше ЯН ! х х : ве й Зкечихкихккккю КЕ ке . ї : ! : вання -е З : й й ши і З ча ме х їх. У КЕ мух - й Я уоонннжюккттоовоюютеткккно З і 4 де зоеоектєтке дк дккосор кодове ЕВ ї й й 4 5 56 7 Чае (об КВ ще : : чав- : : : нич : : : пани ШИНИ - ще 1: : Е Т ще ; Ше зе : : Я Бо со З : я - х ж я ш шшшше як ШЕ : З : : г ще ше ШЕ В :

вв. ши ин ни а «Б и В В Я и Б ВВ Часова) чріг. З

УНІ М ЕЗІЗА) я ДНК ВСОва САС ТІВТОСАСТСТОВОВОАООМОСТАВТОСАВОСТОВАСОВТО СЕСТОАААСТОТОСТО СССАС ТО ТСАСОКИ ТСАСТСТСАВТОЗАСТАТТАСАТОЄ ТВОГО ССАВОСТКСАААОААВСОИСТОСТОВААТОСОТСОСААСОСАТТАС ОССАБТОВОСТСАВААСТТАСТАТССАВАСТОСОТОААСОВОСОСТТСАСТАТ СТОСАСАСАТОАТОСАААААВОМОССИ ТТ ТОСТОаСАААТВАССАВТСТОДАЄТ СТВА ВАСАВОСООСАСТТАТТАСТОТЗСВАЗАСОВАТОТСТОЗСАСАСТАТОСТ ТЕТААСТАСТТ ОА ТАТО ССААСВОАО САНУ ТСАСАО СТО САОМа довсосвацюдзововюдаювоовоавзпасотосюовадвостоюадаосвсвЗсдоосщооо юс зав аойосоанюсовізасзвюювтцваовасюваюцесосвавсвосоюсцівсяє зеснсоссоацєююаватаювоцавіввасюєіюавцевдювіва вові сосісєвоовуєноЯу саросацвоцаосвн сао ва ювсавасоєвосввсвосвацвіднесвацаааціацовсова зн щасзвавнловнасвдствохносоввосвосютвиовиввовасоціаноосенчео ососвавасосавовасвосоювіаювсздасосоцвоповсвіесв ооо оосає давзвосєтацававвова да вена ов асвіваюсазвовся вас цо дадассовнасвасадовоо да ювоваюєсювосвюоєвввассзоазасодовавицюваз севоватносваувиюсвасвавюєссієєсвосососаюцесвзавссововааесванода свасеводвацвеосасвоввасасовідссоєвси косо ововідасовадавосвоацієвасою десієсювісававоєченоссваєдавтодесо она ,цсвоюєюютцавсв зсізгавовосводесюссві с овасюєавсдвсюсвсносюіавсацоввусісвосовтовсвад в сао юцдсадевозоатвааовівоювіввссвівовізазосісевсозвосасвовоЗсвуваца зессесіослцоюоющеавав чеосікАвнА.чиК ОАСАТОСАВАТЗАСАСАСТСТССАОСТ ТОССТО ТСТОСАТСТОТОСЮАСАААЄ ТОТСАССАТОВААТО ТЕОЛАСВАОТОВОСАСАТ АсАТ ОО ТТ ТАОСАТОСТА ТАССАВААЛОССАВСОАААТС ТО Т САВСТОСТ ОО ГТАТАСТІЗСАДАТАЄСТ ТАТА ТОЮ СОСКА ТО ОСА ТО ОА СТО ОТАСАСАСТАТІ СПТСААБАТАААСАСВССТОСАЛАТТТОААВАТОТСОСААСИ ТАТ ТІСТО Те АОТАТТАСВАТТАТССОСТОБСОТ ТОМИ СТО ОВАССААОСТОВАСАТОВАВ, собасвавнасарсовівц нив ювоссдосвоідаввосвопоаватсівавастювє4ти цдюосасіаввізасноввиюссвзацазассввавієза два содвівасоаовєсваювацчої понад васацаосванннюваозвослуриосманоовавсвонасюсі воює звацсадасівоцадвавасвасвомооваанесвововн ав емнисасова о звадецеваановоново Ва ВМО ЕВАНС А УСЕ ТІ ДК МУ У КО АРККО СЕЧУ УАПЕДАЦЬНТУХРОЗУКОНЕ ПОКООАКВ ЕЛ ТЯ КВОТ У САНИ МАН ОКУМООСУ У Уха НВО ВК кевізани кОм ревнива арх ана аріувіх ву ув вв віце усвепнкреткУккуєркиоо кпневосраройвавУ роко Ва праеоллатзней рак та уч вт а ун уп» ЗК ва покеукскуєвк варі ів казки оосУу розетку У Ко уро вує я ревнуюнвик ві кепка кн це ев ве ут кірки ЧЛОСЬКАВА «Бізех ОМА ЛАН СЕТУ ПЕКІН ХВО АМУР УА НІ УРУКР ОБШИТИ УМІВ ОККО У А СОЦ У ТОВАРА ТК ЕК АК уавр проза ці ке и пі УЮгеаимОМ Куй ов ку из уе Кв кувсн повіка кто Фі ми ЕК ЗНИНЕННЯ І ВО ПОКОАЄ ТО ТО АВТ С ТОВ ВА СВО ССТА ОТ ОСАСССТ СОВА СОСТОАААСТОТОСТОТОСАСТСТОСАООАТТСАСТСТСАСТОАСТАТТАСАТ васСетООаТ ОО ССАООСТОСАААСААВООТСТОСААТОВОТСОСААСЄ АМАВТОССАВТООВБСТСАСААСТТАЄ ТАТ ОСАВАСТОСОТОАЛОВОССОС ПСАТЛАТСТОСВОДОАРЗАТОСААЛААОВАОСТОТ ТОСТОСАААТОДОСА ЗІСТОЛАСТСТЗАВОАСАСОООСАСТТАТТАСТОТОСААСАССОАТОТОТО САСАСТАТООІТТГТААСТАСТТТ ЗАТ ТАС СО ОСЛАСВАСТОАТОСТСАЄ АБТСТОСТОвОасіВОєВосвацоцосовіювиснОовостівоссосіоюєьцеВосюси аовпеововаєсдесєвоЗевссваювававеасвссссовасспоцвосввєавовассво Зодоссоюасововвосощевосв нерва тасавіюєвіьсвацеєнасюєсісвосвоосц дойдассововесюсворвцєвавосасовадаєсюсвосісвасевовієвсавасосяосаве восавдовювсвадцавнновоссваа вів юсессаююєсвосви остов іавносю чзаводассвнювосінсооєсьювавасосяводисвоі сіювізантоводасоссваоВюєв сакеювіавецювасовюадосвоазазавооттововюєаоновасза неп аоденоцдаай пшевазеєеваца вав овосвЗнсавочево во юки сю пасиви дасюавовиозвоадаціноваціасяаеюєввоваацдосювоВ ссаюдвовавассвююсвавоссвадвасвоссоєда асо ове не свое ссвддвоЧацаювосавовассвневоссющасссєісваосневеосссвосввовюв жошщанооовзадсавювоєсзосовювавасвасівозаваєєасрвреєєстьсицЗаєеоя зсдосісснепосіюввсвосвацавсотодасазовосадоювсвозвоаоодваюцеюві зозхооєваЗасювювевасовсвововововиас вові юсвтєюєвавоваиах мс кКавРА зи ПАСАТОСАСАТЗАСАСАСТОТОСАВСТТОССТОТСТОСАТТСТОООСАВАА АСТОТСАССАТОСВАТОТ СОЛАСААСТИЕАОСАСАТ ТАСЛАТ ОО ТА САТ ВСАА САОСАОАДАСЮСАОСВОАААТ С ТС ТОАВС ОС ТОС АТ АТОСАД АІАССТТАВААТ ТОЮ ТОК САКОО ТО КОС ВОТСМЗАТОТОМО ТА АСАСТАТ ТС СТ САДОВО АТАЛАСАОССТОСААТТТОЛАСАТОЕ САТ ТАТІ ТОТОТЕААСАОСТАМАСОАГАТССОСТОВСОТТСВОТТСТООВАССААЮЮТ ООАЗАТСАААСОСВЗасовідвассасовщоневевісбоссоссвюваввиюаивавакі цаззсевсою на кивоссіюсювава ти сосвововооссввацівовцюзавон ца одессюдрав давав свовзаЗовопасвосавдаевоєсзесевєввно васздовосо сао ацсвавосадасівоцицивасвсавацюавсоосюєоваціювоссв дадоссювасіссссоюасаваавннисвасвоовнво нова УНН СОСаМ МАЯК я прю АУП УКЗОСОТ УЦР САМО ПІСУУМАУУУНО АРК ЕМ УА УДО УЖ УКИ ВЕТОВОПВАКВУ КОМ ТЗ КОВО ТАТУУСАНР МАНТИ МУ У УВО ОУМУТУ Замки рамі рів вемеівеау аа ко у рерчїухуп на ев ракету юка ут кре пек увНОСпОСоВ а В рококо ук йреу ців ваувунН ВК КО са діперигучУ мів домі пикеукску вка Зіка орг ор уУ Опов те кад ЛУКИ ВдУє тізув еп ппу пух ке у Вико цип еУ тові усі рик ДА КАРВА «Вкяж ГОМ ТОРА ВАВ ОТ У ПЕС ОЕСНУ МОЇ ЛУУ УДОКРОКВРОВЕУ УЧ МІУ НОВО ОУ В КІМ ЗЕ СУАВУР ОС УР АКОТ тавра ов вцікеаціаваппіюгевкуцет вні оа пад еко мувіванівка Ятекрезувсеч падівврУ кв днг,

Посцзавності с фюдськай Зб вимо РОТХУ; АБТКОРЗУЕРІАРЗЗКУТЗОСТААЦОСІУКОТУКРЕРУТУЮАУ МОВА ТООУНТЕР АУМОККН УВУ У ТУРБО ТО ГОСМУМНЕРЕОМТКУЮВККУЄРКУСОКТНІС РРОРАРЕНООРУУМ ЕРРКРКОПЛАУНОВТРЕУТСУУУПВУЗНЕСРЕУКЕМУУТУ ОСУЄУНМАКТКРКЕЕОУМУТ УВУ УВУ УГНОС УЛ МОКЕУКСКУЄМКА РАВ ЕКТЗКАКСОВКЕРЦУЄТ РЕАЛ КМОУМ ТО УКОЕУРУСТНАУК УВУ МОВ РЕММУКТТВРМА ВООЗ УИ ТУ ОКА ОСМУКСЗУМНЕАІНМНУТ КІРОК людський ВО Опір РОТК5ОК АЗТКОРУКРТ АРСУВУТЗЕМТААОСТУКОУКРЕВУТУВУУМОВАСТОСМНТЕРА УСБУ О5УУ ГУРБУМЕСТОТУТСМУВНКРУМТКУЮКТУЄВКССУКСРРС РАРРУДОРУУК ЕВЕРКРКУТ НАТРУ ТУ У УВТУВНЕВВЕ УСЕ ВА УЮ УЄ УНМАКТКРВЕКЦЕМУТЕКУУУУУНИаСУАЬМОКЕУКСКУЄУКОКРАРЕКТІ КТКСОСРКЕВОУУП РР МТ ККОУ В ТССТУКОЕУВО НУЄ АЄВМОСРЕКМ УКТТРРМЕОБВО5ЕН У УК УКВ УУОВОМУК СУМНА УНУТОКВ У СУвОок оодеький Ге Спр РОКУ АЗІКБРЗУКЕР АРКУ ЗЕЗТААЛ ОСТМКОТУЄРЕРУ ГУБУ МІС АСТЗОУМНТЕРА ОБУ УМ ТУРБОТ КУТУ ЮК КУТКУ ЕКО РВС АРЕРОЗСРУУК ЕВЕРЕСТ УВА ВЕУ ТОДАНУУВОЕВРЕУСЕВАЮВУЄ УНВАКТКРАЕКО ЕМО ТУВУУ УСТ У НОСУЛОКЕКСКУМКВЕРУНЕКТІВ КАКОСРЕЄЕРОДУУ ПРРЕЗОСЕЕМТКМОУОТСЬУКСЕУР У МАУЄ ЧТ ЕЗМООРЕМ МУКТТРЕМ ООН УК УСНУ ОМУКОСЗУМНЕА МНЕНУТОКОЇ Я МОХ Шурячні ОЇ (піч КО УК, ше використовується в ЛІВО АЕТТАРОУУРІ АВОТАСКОМОМ УТ ССІУКОУКРЕВУТУТУУМОСА ОЗ УНТЕ РАМ ОББИТІ ТО5УТУРЗУПЕРЗОТУТСУУАНРАУ КУЮККІУВАМСОСВОСК РОСТОБЕУУУНЕВРКРЮТВА ТТ ЕТРЕУ ТОД НОВОВЕУМРУ УМОВУ Є УНТАВТВРРЕЕЕСЕМУТЕАЗУВЕСРИ НОВУ МОЗВТЕАСКУТ5ААЕРЗРЕКТК РЕБАТОУРНУУТ МОРІ МТО МУ ТОМУ УРЕ УУ ЕМО гО ЕМУКМТРеТ МОТО НУК МУККЕ КА ООМТЕ ТС МНКСНМННТЕКЬ І5НаРОоК чне

18 З 06 / Е.

Ва ! Ка / пе : я . ших С нн 0 0 То 10,0 1Ко 1оо0Бо Ковпснтранія саг/лма) Як

А. ЇВ» Е ща од

Є в. їх - з хх

ОО. Кк кв: І в 5. и пи НИК ши шик МИ З о 100 нюо Концентрація (гля

Б. ТВ шу у Ше й хв й Я щ у Не ці «я і Б Н в з

Ж з. З че 180 чо8а 0 звов6 Антвтло до ОК (пглилі

Фо.

ще ГУ я " ЗЕ З у що па / ща по НЕД 1 152 БЕК 1005 Концентрація (нг/мл рі 15

А. .

й . ЗВ вк » 1 о хан о я її БО я с Іі 0. о що ще |. о . о о ен: . її ЕЕ З г. і є КЕ. Е її 1 є Ж її її и. п и й й й ОО

В. 40804 « дере г ї С зе х- НОЯ ії ше: яке З Б ен Її мо Б и Ек ше. - дО ії щЩщ Ц. Х уж її шої ї шен сеї Фіг, їб

А. І Ж ши ша С щи ЧИ жк 1005 Я че нах ноті в ї- ж я "і і 810 - о й й В 8 78 Чає (доба)

М. я зав | т о . ш 1504000 ий - шли ЕК. о БО»

ї. Я к Дня пи лик ДО п 2 4 6 а 0 з в «Час ідобаі «нг 17

Периферична кров ж й

! 9. а Вк ,

В. Що й.

Її. Вх 1. х Ж, Я що Я а п с й ж ий б ше ВЕ Ж ДЯ й ва є ет й ли те а Об уефносв Йо; ан вк ах ак слн Е на й й і ях З і м ах Кай 2 З ши ш День 0 з тнжні День З З тижні Лімфатичні вузі жжж й / я 18 х п : дай -о ото Ж рд те "Ж «ВВ ще Он шини ши я в. День В аж сф, ІВ

А. а4 спади о ко: Ж ! оком жк х ; В - ; що о. миши жен о. З с нн її; "М с с ш я. 1 ї я ко п. ше 0 Ес Б о нн ев о по ЩЕ ше що

ЖК. і і. а нн, ження кни нано пл ПУ ПИТИ плавки ДК ЕН В в 5 ЦОТ (вом Що ф(нрмл) І ще во. ЕВ й ї як м во Бе? жк х З і х гово) КОХ Е | 5 за. з | 5 За чи Кк мо фитяютя хи ут хх ним джин -АВ кі Би зу Ше Е 20. Шов Но Е. В учниннуюнтртт енакутнчечнен Дін ня повна ока пана нас вин вььассх ча з Я зво чо вм в 3 за за ЗІЗ огехуле Мазда сеча сік. Та

7 тижні жк ЖЖ Ж ї в ОЛЯ кВ я щ : в ВО, с понннннннння ши ши - Е | ш ж я В це Я ш шо В м ж З Ж ! Бе В х : я в й щ Е шк: Є ово ХЕ в З їх й й о -- о ШЕ о ше оо Ж о ха З шк о контроль МІЗНО ковтроль / М'ІЗБО

Фен. 2

А. КІВ З ї ! о | і ї в х . ! 5 ей як с» с и Ше І ал що В. ій ще ЧІ і Я і Що хг / з ЩО їх 5 а 565 788 Час (зоба)

В. 205 ї К вче : й ЩІ | ри кх Х 5 ; - у г у су 5 ї і ї а 7 ж а 4567 ото Чаве лобі

Чнг. Хі

ОА роя Е 16 г й На и 0 5 10 15 Часілойа) Янг

ОУСІУЕЗСОВІУКРОСЯІВІЗСАУ5ОЕТІВ у МИВОдРО КВІЕМУХ 01111111 11 еті5воМАКМБІ ОМ ІВАЕОТАУУУСАН 1 СО стіУТУ55А5ТКОР 5МЕРЕАРСЗНУТ5ЕХТААНОСЬУКОУЕРЕРУТУЄ УМСА ВУ НТЕРАУ ОБО З5УУТУрЗі ОТ КТ УТСМУВНКРОМТКУ РКВУЕЗКУСРРСРРСРАРЕБЦССРЗУБЬЕРРКРКОТІ МІ5АТРЕ УТСУМУРУЗОЕОРЕМОЕМУХУОБУЕУНМАКТКРВЕЕО МЕТ УВУУЗУМІТУНОрУЛМОКЕХУКСКУЗМКСЕРЗБІЕКТІЗКАКСО РВЕРОУУТЬРР5ОБЕМІТКМОУЗТСТУКСЕУРБОТАМЕМ ЕМО ОРЕММУКТТРРУБО5ОО5ЕВУ5ВІТУКОАМОВОМУЕЗСВУ МНЕАЛЬНМНУТОКЗЬВІЯРОКУ

«Віг. 23

ЕІУМТО5РАТІ5МУРОЕВАТІ5С 0 10 МТООКРСОА РВНЦІМ 0/1 бІРАВЕ5О5056ТЕЕТІТІ55О5ЕОБАУУКС МИ ДесссткуУвІКТУААРЗУНЕРРЗОЕОЬКУОТАБУУС СОУ КЕУРКЕАКУВАУКУВМАОЗОМЗОЕЗУТЕООЗКОВТ УЗ СТІЕТІЕЗКАВХЕКНКУУАСЕУТНОСІ55РМТК5ЕМАСЕСЯ

Фін. а

540. 8 8 т - НЕ 7 зо. т М с о о ко Бо во ню Час (лоба)

Фіг.

З 3я ШІ ши В щу ше В. хе | ве Ба - М заго х ШЕ ше я Ка ; "е : я ее 15 0 хе й о 5 1 б ВМО х : я і і ї ВІ М ! ОВ зе Я З ЕНН т ПЕН З ЕзМ | ї ВМ Б ОН Я і ДН Х Зно й сх у ці пииииииниииини ЕВ. и М ІОВ» кр контроль, М'ЯЗА конпнюль МіО Кк З і й вин: М дж ооо х шщ ЩО ння ій У - і Пи

1 щ. ШЕ що КЕ 3 Ся І о: в 1 с 15 г як і НО т іі оо о ! в. Ж ! С. Не: Б. ра і о. се 0. ех | 0. й о с мет Ко В фоовннннку Х ОО лях контроль АР контроль МІН чЧнг. о вд оК глив сх й ж т М ВЕ Су кА МА КЕХ КУТ ру ТИ ЮК фрукууи Ка ЕХ Ва ОК вен ОО ОАЕ зх сах и ж тим пит куту уюттичту ти пу ло ж Кок мем а и ЧК СЕН мо Ми АКБОРОУКЕТМ ВЕС АСУВУКС това тут ЖУКА си : же Ко дов Ето сут З ІТИ х ур Ж три живи ях ОМ оОоБІхивиА ВІЗКОМ КУТІВ рот Ки ТУ ОД КУ КТ, ТЕ тату Ї туту тут че Зм сЕат гуру тт хя ТТГ АРБАВГОЬе КЕОАМОГУЄТЕМЗН ОКУ УКУС ФІХТЕ ТАКИ ВІТЕР І МЕТ СИХ е урСоК К ичикюи чЕх АД МАКИ СУ их У нОУдукОоБКпЕМеКТУМ ВТК ОККО ААМуУКТІ КУ тс т ТЗІ ТІ МУ З КК тує Ат КУПИ СТ ТАТО ДИТИ ЕК т гр ах ВВІРОНТЕКОЯ 0000 еоУУБВтТервІММОБОоЕМОТ ТІ тт шт ОохУВт тт Т Вих уУтТ ПУТ ТУ ТУТ ТУЄТ ГУРТІ МИТ ех ТІ; МЕЖ к У А АСУСИКККІКи ТУ М е ЗОРОМ СЬВТЄ тут» куту ктт КЛІ ЖЕ КУТ ТУЮ І ТТ Роз Рут та Кут и В ту тр лих тт ут я КкКеКАМОМУВЕиМеВаК осо иУу Тел УвОоВК ТЕ тлу Ол ую кл ух ки Сх кукі ух тА тросу и сх Ер шт с дру ан ие но Кен В Ше все НИЙ Ж ду ТИВ ТТ тт чт КУТУ Ж от речти ПАБМУВАСЛАВІ ОВО НУ ще АН еф ки а ок а м в і ра п в в о о МБТІ ЗБОозаТоМеУдеи гос АХУ МАСА АД МБО ще дк ,

Фіг. 7 УК ЯЖ є би і хі х - Ма Я х А -/кДа г шк як. сш ж ще КО дну С ХК ОКХ ОО си се ЗМК п Я у с о. Ж в АК о З МОМ М ЗМ хе й о ХВ с дон з СХ о ЗО х ; Кв й : Е З ММ М ; ї с о. | : : КО З З :

с о.

ЕЕ. З с ОККО КК КК З У Ех ОК ОХ ХК ХО ОО ОО ще ВОМ ОО І з с шо ЗО ховввох 4 У Хо х МКК З В : с. о. о. у і зх З п КБ з ОО о. т-о с о З . ще о 1 | і Ми 7 : ОК . ОМ гля о 1 й СХ о. ОО ОО К сх ПК ХМ У . о. с ХО ї ох ВЗ сг. СЯ