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KR102593668B1 - 유도 기질 부재 하의 사상 진균 세포에서의 단백질 생산 - Google Patents

유도 기질 부재 하의 사상 진균 세포에서의 단백질 생산 Download PDF

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KR102593668B1
KR102593668B1 KR1020197010929A KR20197010929A KR102593668B1 KR 102593668 B1 KR102593668 B1 KR 102593668B1 KR 1020197010929 A KR1020197010929 A KR 1020197010929A KR 20197010929 A KR20197010929 A KR 20197010929A KR 102593668 B1 KR102593668 B1 KR 102593668B1
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KR
South Korea
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promoter
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ala
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KR1020197010929A
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마이클 워드
윈 루오
펠리페 오세아스 벤데주
마리 발꼬넨
마르꾸 살로헤이모
니나 아로
띠나 빠꿀라
Original Assignee
다니스코 유에스 인크.
브이티티 테크니컬 리서치 센터 오브 핀란드 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다니스코 유에스 인크., 브이티티 테크니컬 리서치 센터 오브 핀란드 리미티드 filed Critical 다니스코 유에스 인크.
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Abstract

본 발명의 일부 구현예는 변이체 사상 진균 세포, 이의 조성물 및 이의 1종 이상의 관심 단백질의 증가된 생산을 위한 방법을 대상으로 한다. 더욱 구체적으로는, 일부 구현예에서, 본 발명은 모 사상 진균 세포로부터 유래된 변이체 사상 진균 (숙주) 세포를 대상으로 하며, 이때, 변이체 숙주 세포는 유도 기질의 부재 하에 관심 단백질(POI)의 발현/생산을 가능하게 하는 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변이체 진균 숙주 세포는 본 설명에서 Ace3-L로 지칭된 Ace3 단백질을 암호화하는 변이체 셀룰라아제 발현 활성화 인자 3(activator of cellulase expression 3, ace3) 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함한다.

Description

유도 기질 부재 하의 사상 진균 세포에서의 단백질 생산
[관련 출원에 대한 상호 참조]
본 출원은 2016년 10월 04일자로 출원된 미국 가출원 제62/403,787호의 이익을 청구하며, 본 설명에 그 전체가 참조로 포함된다.
[서열 목록]
EFS를 통하여 함께 제출된 서열 목록 텍스트 파일은 2017년 10월 02일에 생성되고, 크기가 157 킬로바이트인 파일 "NB41159WOPCT_SEQLISTING.txt"를 포함한다. 본 서열 목록은 37 C.F.R. §1.52(e)를 준수하며, 본 설명에 그 전체가 참조로 포함된다.
[기술분야]
본 발명은 일반적으로 분자생물학, 생화학, 단백질 생산 및 사상 진균 분야에 관한 것이다. 본 발명의 일부 구현예는 변이체 사상 진균 세포, 이의 조성물 및 이의 1종 이상의 관심 단백질의 증가된 생산을 위한 방법을 대상으로 한다. 더욱 구체적으로는, 일부 구현예에서, 본 발명은 모 사상 진균 세포로부터 유래된 변이체 사상 진균 (숙주) 세포를 대상으로 하며, 이때, 변이체 숙주 세포는 유도 기질의 부재 하에 1종 이상의 관심 단백질(POI)의 발현/생산을 가능하게 하는 유전자 변형을 포함한다.
리그노셀룰로오스 식물성 물질의 구성요소인 셀룰로오스는 자연계에서 발견되는 가장 풍부한 다당류이다. 마찬가지로, 사상 진균은 식물성 바이오매스의 효율적인 분해자임이 당해 분야에 공지되어 있으며, 실제 산업상 관련 있는 리그노셀룰로오스 분해 효소(이하, 집합적으로 "셀룰라아제" 효소라 지칭됨)의 주된 공급원이다. 예를 들어, 사상 진균은 셀룰로오스의 β-(1,4)-연결된 글리코시드 결합을 가수분해하여 글루코오스를 생산하는(즉, 그에 의해 성장을 위해 셀룰로오스를 활용하는 이러한 사상 진균의 능력을 부여하는) 세포 외 셀룰라아제 효소(예컨대, 셀로비오하이드롤라아제, 엔도글루카나아제, β-글루코시다아제)를 생산한다고 알려져 있다.
특히, 사상 진균 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei, T. reesei; 진균 하이포크레아 제코리나(Hypocrea jecorina)의 무성생식형)는 셀룰라아제 효소의 효율적인 생산자라고 알려져 있다(예컨대, PCT 국제 출원 제WO1998/15619호, 제WO2005/028636호, 제WO2006/074005호, 제WO1992/06221호, 제WO1992/06209호, 제WO1992/06183호, 제WO2002/12465호 등 참조). 따라서, T. 레에세이와 같은 사상 진균은 셀룰로오스 유래 에탄올, 섬유 및 의류, 세제, 섬유질, 식품 및 사료 첨가제와 같은 이러한 상품의 생산 및 기타 산업적 용도에 있어서 가치 있는 효소를 생산하는 그것들의 능력을 위하여 활용되어 왔다.
트리코더마에서 이러한 산업적으로 관련 있는 효소의 발현(및 생산)은 성장에 이용할 수 있는 탄소 공급원에 의존한다고 알려져 있다. 더욱 상세하게는, 사상 진균에 의한 셀룰라아제 효소의 생산은 에너지를 소비하는 과정이며, 따라서, 이들 효소의 효율적인 생산을 확실히 하기 위하여 유도 및 억제 메커니즘이 사상 진균에서 진화하였다. 예를 들어, 식물 세포벽 물질의 분해에 필요한 효소(즉, 셀룰라아제/헤미셀룰라아제)를 암호화하는 다양한 유전자는 "유도" 기질의 존재 하에 "활성화되고", "탄소 이화대사산물 억제"(이하, "CCR")라고 알려져 있는 메커니즘을 통해 식물성 바이오매스에 비해 선호되는 용이하게 대사된 탄소 공급원(예컨대, D-글루코오스)의 존재 하에 "억제된다". 따라서, 셀룰라아제 유전자는 글루코오스에 의해 엄중하게 억제되고, 셀룰로오스 및 일부 이당류(예컨대, 소포로오스, 락토오스, 겐티오비오스)에 의해 수천 배 유도된다. 예를 들어, 주요 셀로비오하이드롤라아제 1(cbh1)의 발현 수준은 글루코오스 함유 배지와 비교하여 셀룰로오스 또는 소포로오스와 같은 유도성 탄소 공급원을 함유하는 배지 상에서 수천 배 "상향 조절된다"(Ilmen et al., 1997). 나아가, "유도된" T. 레에세이 배양물에 대한 "억제성" 탄소 공급원의 첨가는 (셀룰로오스 또는 소포로오스) 유도를 무력화하여, 셀룰라아제 유전자 발현의 하향 조절을 초래하는 것으로 나타났다(el-Gogary et al., 1989; Ilmen et al., 1997). 따라서, 셀룰라아제 시스템(효소)을 포함하는 유전자의 발현은 전사 수준에서 적어도 조직화되고 조절되는데, 이때, 이 시스템의 유전자 구성원은 상승적으로 작용하고, 위에서 언급된 바와 같이, 셀룰로오스의 가용성 올리고당으로의 효율적인 가수분해에 필수적이다.
더욱 구체적으로, 전 유전체 분석은 T. 레에세이에는 적어도 10종의 셀룰로오스 분해성 및 16종의 자일란 분해성 효소 암호화 유전자가 있음을 보여주었다(Martinez et al., 2008). 특히, 가장 많이 분비된 효소는 두 가지 주요 셀로비오하이드롤라아제(EC. 3.2.1.91)인 cbh1(셀로비오하이드롤라아제 1) 및 cbh2(셀로비오하이드롤라아제 2), 그리고 두 가지 주요 특이적 엔도-β-1,4-자일라나아제(EC 3.3.1.8)인 xyn1(엔도-1,4-베타-자일라나아제 1) 및 xyn2(엔도-1,4-베타-자일라나아제 2)이며, 본 설명에서 "주요 산업적으로 관련 있는 헤미셀룰라아제 및 셀룰라아제(major industrially relevant hemicellulases and cellulases)" 또는 "MIHC"라 지칭된다. 이들 MIHC는 추가적인 효소와 함께 작용하여 셀룰로오스와 자일란을 분해하며, 이는 가용성 올리고당 및 단당류, 예컨대, 셀로비오스, D-글루코오스, 자일로비오스 및 D-자일로오스의 생성을 초래한다. 또한, 소포로오스는 이들 효소 중 일부의 글리코실전이반응 활성의 생성물이다(Vaheri et al., 1979). 더욱 상세하게는, 이들 가용성 올리고당 및 단당류(즉, 셀로비오스, D-글루코오스, 자일로비오스, D-자일로오스 및 소포로오스)는 문헌에서 T. 레에세이에서 MICH의 발현에 영향을 미친다고 보고된 바 있다. 예를 들어, D-글루코오스의 존재는 CCR을 유발하며, 이는 소량의 MIHC의 분비를 초래한다. 소포로오스는 cbh1 및 cbh2의 발현을 위한 가장 강력한 유도인자인 것으로 여겨진다. D-자일로오스는 농도 의존적인 방식으로 xyn1 및 xyn2 발현을 조절한다.
일반적으로, 트리코더마와 같은 사상 진균에 의한 효소/폴리펩티드의 상업적 규모의 생산은 전형적으로, 배치식, 유가식 및 연속 순환식 공정을 포함한 고체 또는 액침 배양에 의해 이루어진다. 예를 들어, 트리코더마에서의 산업적 셀룰라아제 생산의 가장 문제가 많고 값비싼 측면 중 하나는 트리코더마 숙주 세포에 적절한 유도인자(즉, 유도 기질)를 제공하는 것이다. 예를 들어, 실험실 규모의 실험의 경우와 같이, 상업적 규모의 셀룰라아제(효소) 생산은 고체 셀룰로오스(즉, 유도 기질) 상에 진균 세포를 성장시키거나 "락토오스"(즉, 유도 기질)와 같은 이당류 유도인자의 존재 하에서 세포를 배양함으로써 "유도된다".
불행히도, 산업적 규모에서는 "유도"의 두 가지 방법은 셀룰라아제 생산과 관련된 높은 비용을 초래하는 결점이 있다. 예를 들어, 전술한 바와 같이, 셀룰라아제 합성은 셀룰로오스 유도 및 글루코오스 억제 둘 다를 거치게 된다. 따라서, 유도성 프로모터의 제어 하에 셀룰라아제 효소의 수율에 영향을 미치는 중요한 인자는 셀룰로오스 기질과 글루코오스 농도 사이의 적절한 균형을 유지하는 것이다(즉, 그것은 조절된 유전자 생성물의 합리적인 상업적 수율을 얻는 데 중요하다). 셀룰로오스는 효과적이고 저렴한 유도인자이지만, 사상 진균 세포를 고체 셀룰로오스 상에서 성장시킬 때 글루코오스 농도를 조절하는 것은 문제가 될 수 있다. 낮은 농도의 셀룰로오스에서, 글루코오스 생산은 활성 세포 성장 및 기능의 대사적 요구를 충족시키기에는 너무 느릴 수 있다. 반면, 셀룰라아제 합성은 글루코오스 생성이 그것의 소비보다 빠를 때 글루코오스 억제에 의해 중단될 수 있다. 따라서, 느린 기질 첨가 및 글루코오스 농도 모니터링을 제공하기 위해서는 값비싼 공정 제어 계획이 필요하다(Ju and Afolabi, 1999). 또한, 기질의 느린 연속적 전달은 셀룰로오스 물질의 고체 성질의 결과로서 달성하기가 어려울 수 있다.
"유도 기질"로서의 셀룰로오스의 사용과 관련된 문제 중 일부는 "락토오스", "소포로오스" 또는 "겐티오비오스"와 같은 가용성 "유도 기질"의 사용을 통해 극복될 수 있다. 예를 들어, "유도 기질"로서 락토오스를 사용할 때, 락토오스는 유도인자 및 탄소 공급원으로서 기능하기 위하여 고농도로 제공되어야 한다(예컨대, Seiboth, et. al., 2002 참조). 소포로오스는 셀룰로오스보다 더 강력한 유도인자이지만, 소포로오스는 값이 비싸고, 제조가 어렵다. 예를 들어, 글루코오스, 소포로오스 및 (즉, 글루코오스의 효소적 전환을 통해 생성된) 다른 이당류의 혼합물은 셀룰라아제의 효율적인 생산에 이용될 수 있는데, 이는 글루코오스를 단독으로 사용하는 것보다 더 많은 (생산) 비용을 초래한다. 따라서, 고체 셀룰로오스보다 다루기 쉽고 제어하기 쉽지만, 그럼에도 유도 기질로서 소포로오스를 사용하는 것은 셀룰라아제 생산 비용을 엄두도 못 낼 정도로 비싸게 만들 수 있다.
전술한 바에 기초하여, 그러한 생산을 위하여 값비싼 유도 기질(예컨대, 소포로오스, 락토오스 등)을 제공할 필요성 또는 요구 없이, 사상 진균에 의한 효소/폴리펩티드의 비용 효과적인 상업적 규모의 생산을 위한 계속 진행 중인, 그리고 충족되지 않은 필요성이 당업계에 남아 있음은 명백하다. 더욱 상세하게는, 사상 진균 숙주 세포에 의한 1종 이상의 내인성 리그노셀룰로오스 분해 효소의 상업적 규모의 생산에 대한 필요성이 당업계에 남아 있으며, 이때, 그러한 사상 진균 세포는 유도 기질의 부존재 하에서 이들 유전자 중 1종 이상을 발현할 수 있다. 또한, 그러한 사상 진균 숙주 세포에서 발현되고 생산된 1종 이상의 이종성 단백질 생성물의 비용 효과적인 생산을 위한 당업계의 충족되지 않은 요구가 있으며, 이때, 이러한 단백질을 암호화하는 이종 유전자는 진균 숙주 세포 내로 도입되며, 이 진균 숙주 세포는 유도 기질의 부존재 하에 그러한 이종 유전자를 발현할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예는 그러한 생산을 위하여 값비싼 유도 기질(예컨대, 소포로오스, 락토오스 등)을 제공할 필요성 또는 요구가 없는, 사상 진균에 의한 효소/폴리펩티드의 상업적 규모의 생산에 관한 것이다. 따라서, 일부 다른 구현예는 변이체 사상 진균 세포, 이의 조성물 및 이의 1종 이상의 관심 단백질의 증가된 생산을 위한 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 일부 구현예는 모 사상 진균 세포로부터 유래된 변이체 사상 진균 세포에 관한 것으로, 변이체 세포는 서열 번호 6의 Ace3 단백질에 대해 약 90%의 서열 동일성을 포함하는 Ace3 단백질을 암호화하는 도입된 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하고, 이때, 변이체 세포는 모 세포에 비해 유도 기질의 부존재 하에 증가된 양의 관심 단백질(POI)을 생산하며, 이때, 변이체 세포와 모 세포는 유사한 조건 하에서 배양된다. 일부 다른 구현예에서, 변이체 세포는 모 세포에 비해 유도 기질의 존재 하에서 증가된 양의 POI를 생산하는데, 이때, 변이체 세포와 모 세포는 유사한 조건 하에서 배양된다.
변이체 세포의 또 다른 구현예에서, 서열 번호 6에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 암호화된 Ace3 단백질은 마지막 4개의 C 말단 아미노산으로 "Lys-Ala-Ser-Asp"를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 서열 번호 6에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 암호화된 Ace3 단백질은 서열 번호 6에 작동 가능하게 연결되며 이에 앞서는 서열 번호 98의 N 말단 아미노산 단편을 포함한다. 변이체 세포의 일부 다른 구현예에서, Ace-3 단백질은 서열 번호 12에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함한다. 또 다른 구현예에서, Ace3 단백질을 암호화하는 도입된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5에 대하여 약 90% 동일성을 포함하는 오픈 리딩 프레임(ORF) 서열을 포함한다.
변이체 세포의 또 다른 구현예에서, POI는 내인성 POI 또는 이종성 POI이다. 따라서, 일부 구현예에서, 변이체 세포는 이종성 POI를 암호화하는 도입된 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이종성 POI를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체는 셀룰로오스 유도성 유전자 프로모터의 제어 하에 발현된다. 일부 다른 구현예에서, 내인성 POI는 리그노셀룰로오스 분해 효소이다. 따라서, 다른 구현예에서, 리그노셀룰로오스 분해 효소는 셀룰라아제 효소, 헤미셀룰라아제 효소, 또는 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 다른 구현예에서, 리그노셀룰로오스 분해 효소는 cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl4, egl5, egl6, bgl1, bgl2, xyn1, xyn2, xyn3, bxl1, abf1, abf2, abf3, axe1, axe2, axe3, man1, agl1, agl2, agl3, glr1, swo1, cip1 및 cip2로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 이종성 POI는 α-아밀라아제, 알칼리성 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 셀룰라아제, 덱스트라나아제, α-글루코시다아제, α-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 헤미셀룰라아제, 펜토사나아제, 자일라나아제, 인버타아제, 락타아제, 나린지나아제, 펙티나아제, 풀루라나아제, 산성 프로테아제, 알칼리성 프로테아제, 브로멜라인, 중성 프로테아제, 파파인, 펩신, 펩티다아제, 레닛, 레닌, 키모신, 서브틸리신, 서몰리신, 아스파르트산 프로테이나제, 트립신, 리파아제, 에스테라아제, 포스포리파아제, 포스파타아제, 피타아제, 아미다아제, 이미노아실라아제, 글루타미나아제, 리소자임, 페니실린 아실라아제; 이소메라제, 옥시도리덕타아제, 카탈라아제, 클로로페록시다아제, 글루코오스 옥시다아제, 하이드록시스테로이드 데하이드로게나아제, 페록시다아제, 리아제, 아스파르트산 β-데카르복실라아제, 푸마라아제, 히스타다아제, 트랜스페라아제, 리가아제, 아미노펩티다아제, 카르복시펩티다아제, 키티나아제, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 락카아제, 만노시다아제, 뮤타나아제, 폴리페놀 옥시다아제, 리보뉴클레아제 및 트랜스글루타미나아제로 구성된 군으로부터 선택된다.
변이체 세포의 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 프로모터 서열 5'을 포함하고, 서열 번호 6에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 Ace3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 천연 ace3 종결자 서열 3'을 더 포함하고, 서열 번호 6에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 Ace3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일부 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈 내로 통합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈의 텔로미어 부위 내로 통합된다. 일부 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈의 글루코아밀라아제(gla1) 유전자좌 내로 통합된다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 서열 번호 4, 서열 번호 11 또는 서열 번호 13에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 암호화된 Ace3 단백질은 서열 번호 6, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 대해 95% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 다른 구현예에서, 암호화된 Ace3 단백질은 서열 번호 6, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 변이체 세포는 서열 번호 48의 야생형 자일라나아제 조절인자 1(Xyr1) 단백질 또는 서열 번호 46의 변이체 자일라나아제 조절인자 1(Xyr1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 유전자 변형을 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 변이체 세포는 내인성 탄소 이화대사산물 억제인자 1(Cre1) 단백질 또는 Ace1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 감소시키거나 방지하는 유전자 변형을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 변이체 세포는 Ace2 단백질 발현을 포함하는 유전자 변형을 포함한다. 다른 구현예에서, 사상 진균 세포는 자낭균(Ascomycota) 아문의 페지조마이코티나(Pezizomycotina) 세포이다. 일부 다른 구현예에서, 사상 진균 세포는 트리코더마 종 세포이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 6, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 Ace3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 ORF에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 변이체 세포에 의해 생산된 리그노셀룰로오스 분해 효소에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 세포의 변이체 세포에 의해 생산된 이종성 POI에 관한 것이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 유도 기질의 부존재 하의 트리코더마 종 진균 세포 내에서 내인성 관심 단백질의 생산 방법에 관한 것으로, 방법은 (i) 5'에서 3' 방향으로 (a) 프로모터를 포함하는 제1 핵산 서열 및 (b) 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 진균 세포 내로 도입하는 단계로서, 이때, 제2 핵산 서열은 서열 번호 6에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 Ace3 단백질을 암호화하고, 마지막 네 개의 C 말단 아미노산으로서 "Lys-Ala-Ser-Asp"를 포함하는 것인, 단계, 및 (ii) 진균 세포 성장 및 단백질 생산에 적합한 조건 하에서 단계 (i)의 세포를 발효시키는 단계로서, 이때, 그러한 적합한 성장 조건은 유도 기질을 포함하지 않는 것인, 단계를 포함한다. 방법의 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 제3 핵산 서열 3'을 포함하고, 제2 핵산에 작동 가능하게 연결되는데, 이때, 제3 핵산 서열은 천연 ace3 종결자 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈 내로 통합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈의 텔로미어 부위 내로 통합된다. 일부 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈의 글루코아밀라아제(gla1) 유전자좌 내로 통합된다. 방법의 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 서열 번호 4, 서열 번호 11 또는 서열 번호 13에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 암호화된 Ace3 단백질은 서열 번호 6, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 대해 95% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 암호화된 Ace3 단백질은 서열 번호 6, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함한다.
방법의 일부 구현예에서, 단계 (i) 프로모터는 rev3 프로모터(서열 번호 15), bxl 프로모터(서열 번호 16), tkl1 프로모터(서열 번호 17), PID104295 프로모터(서열 번호 18), dld1 프로모터(서열 번호 19), xyn4 프로모터(서열 번호 20), PID72526 프로모터(서열 번호 21), axe1 프로모터(서열 번호 22), hxk1 프로모터(서열 번호 23), dic1 프로모터(서열 번호 24), opt 프로모터(서열 번호 25), gut1 프로모터(서열 번호 26) 및 pki1 프로모터(서열 번호 27)로 구성된 군으로부터 선택된다.
방법의 관련된 구현예에서, 내인성 POI는 리그노셀룰로오스 분해 효소이다. 일부 구현예에서, 리그노셀룰로오스 분해 효소는 셀룰라아제 효소, 헤미셀룰라아제 효소, 또는 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 셀룰라아제 효소는 cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl4, egl5, egl6, bgl1, bgl2, swo1, cip1 및 cip2로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 헤미셀룰라아제 효소는 xyn1, xyn2, xyn3, xyn4, bxl1, abf1, abf2, abf3, axe1, axe2, axe3, man1, agl1, agl2, agl3 및 glr1로 구성된 군으로부터 선택된다.
방법의 다른 구현예에서, 단계 (i)은 이종성 POI를 암호화하는 도입된 폴리뉴클레오티드 구성체를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 POI를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체는 셀룰로오스 유도성 유전자 프로모터의 제어 하에 발현된다. 일부 구현예에서, 셀룰로오스 유도성 유전자 프로모터는 cbh1, cbh2, egl1, egl2, xyn2 또는 stp1로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 방법은 서열 번호 48의 야생형 자일라나아제 조절인자 1(Xyr1) 단백질 또는 서열 번호 46의 변이체 자일라나아제 조절인자 1(Xyr1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 유전자 변형을 더 포함한다. 다른 구현예에서, 방법은 내인성 탄소 이화대사산물 억제인자 1(Cre1) 단백질 또는 Ace1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 감소시키거나 방지하는 유전자 변형을 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 Ace2 단백질 발현을 포함하는 유전자 변형을 더 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 유도 기질의 부존재 하의 트리코더마 종 진균 세포 내에서 내인성 관심 단백질의 생산 방법에 관한 것으로, 방법은 (i) 5'에서 3' 방향으로 (a) 프로모터를 포함하는 제1 핵산 서열 및 (b) 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 진균 세포 내로 도입하는 단계로서, 이때, 제2 핵산 서열은 서열 번호 12에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 Ace3 단백질을 암호화하는 것인, 단계, 및 (ii) 진균 세포 성장 및 단백질 생산에 적합한 조건 하에서 단계 (i)의 세포를 발효시키는 단계로서, 이때, 그러한 적합한 성장 조건은 유도 기질을 포함하지 않는 것인, 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 제3 핵산 서열 3'을 포함하고, 제2 핵산에 작동 가능하게 연결되는데, 이때, 제3 핵산 서열은 천연 ace3 종결자 서열을 포함한다. 방법의 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈 내로 통합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈의 텔로미어 부위 내로 통합된다. 일부 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈의 글루코아밀라아제(gla1) 유전자좌 내로 통합된다. 방법의 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 서열 번호 4, 서열 번호 11 또는 서열 번호 13에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 Ace3 단백질은 서열 번호 6, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 대해 95% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 암호화된 Ace3 단백질은 서열 번호 6, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 방법 8의 다른 구현예에서, 내인성 POI는 리그노셀룰로오스 분해 효소이다. 특정 구현예에서, 리그노셀룰로오스 분해 효소는 셀룰라아제 효소, 헤미셀룰라아제 효소, 또는 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 셀룰라아제 효소는 cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl4, egl5, egl6, bgl1, bgl2, swo1, cip1 및 cip2로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 헤미셀룰라아제 효소는 xyn1, xyn2, xyn3, xyn4, bxl1, abf1, abf2, abf3, axe1, axe2, axe3, man1, agl1, agl2, agl3 및 glr1로 구성된 군으로부터 선택된다.
방법의 또 다른 구현예에서, 단계 (i)은 내인성 POI를 암호화하는 도입된 폴리뉴클레오티드 구성체를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 POI를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체는 셀룰로오스 유도성 유전자 프로모터의 제어 하에 발현된다. 방법의 일부 다른 구현예에서, 단계 (i) 프로모터는 rev3 프로모터(서열 번호 15), bxl 프로모터(서열 번호 16), tkl1 프로모터(서열 번호 17), PID104295 프로모터(서열 번호 18), dld1 프로모터(서열 번호 19), xyn4 프로모터(서열 번호 20), PID72526 프로모터(서열 번호 21), axe1 프로모터(서열 번호 22), hxk1 프로모터(서열 번호 23), dic1 프로모터(서열 번호 24), opt 프로모터(서열 번호 25), gut1 프로모터(서열 번호 26) 및 pki1 프로모터(서열 번호 27)로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 방법은 서열 번호 48의 야생형 자일라나아제 조절인자 1(Xyr1) 단백질 또는 서열 번호 46의 변이체 자일라나아제 조절인자 1(Xyr1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 유전자 변형을 더 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 방법은 내인성 탄소 이화대사산물 억제인자 1(Cre1) 단백질 또는 Ace1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 감소시키거나 방지하는 유전자 변형을 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 Ace2 단백질 발현을 포함하는 유전자 변형을 더 포함한다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명은 유도 기질의 부존재 하의 트리코더마 종 진균 세포 내에서 이종성 관심 단백질의 생산 방법을 대상으로 하는데, 방법은 (i) 5'에서 3' 방향으로 (a) 구성성 프로모터를 포함하는 제1 핵산 서열 및 (b) 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 진균 세포 내로 도입하는 단계로서, 이때, 제2 핵산 서열은 서열 번호 6에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 Ace3 단백질을 암호화하고, 마지막 네 개의 C 말단 아미노산으로서 "Lys-Ala-Ser-Asp"를 포함하는 것인, 단계, 및 (ii) 진균 세포 성장 및 단백질 생산에 적합한 조건 하에서 단계 (i)의 세포를 발효시키는 단계로서, 이때, 그러한 적합한 성장 조건은 유도 기질을 포함하지 않는 것인, 단계를 포함한다. 따라서, 방법의 일부 구현예에서, 진균 세포는 이종성 POI를 암호화하는 도입된 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는데, 이때, 구성체는 단계 (i) 이전에, 단계 (i) 중에, 또는 단계 (i) 이후에 진균 세포 내로 도입된다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 제3 핵산 서열 3'을 포함하고, 제2 핵산에 작동 가능하게 연결되는데, 이때, 제3 핵산 서열은 천연 ace3 종결자 서열을 포함한다. 방법의 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈 내로 통합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈의 텔로미어 부위 내로 통합된다. 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈의 글루코아밀라아제(gla1) 유전자좌 내로 통합된다.
방법의 일부 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 서열 번호 4, 서열 번호 11 또는 서열 번호 13에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 암호화된 Ace3 단백질은 서열 번호 6, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 대해 95% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 암호화된 Ace3 단백질은 서열 번호 6, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 이종성 POI를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체는 셀룰로오스 유도성 유전자 프로모터의 제어 하에 발현된다. 일부 다른 구현예에서, 이종성 POI는 α-아밀라아제, 알칼리성 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 셀룰라아제, 덱스트라나아제, α-글루코시다아제, α-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 헤미셀룰라아제, 펜토사나아제, 자일라나아제, 인버타아제, 락타아제, 나린지나아제, 펙티나아제, 풀루라나아제, 산성 프로테아제, 알칼리성 프로테아제, 브로멜라인, 중성 프로테아제, 파파인, 펩신, 펩티다아제, 레닛, 레닌, 키모신, 서브틸리신, 서몰리신, 아스파르트산 프로테이나제, 트립신, 리파아제, 에스테라아제, 포스포리파아제, 포스파타아제, 피타아제, 아미다아제, 이미노아실라아제, 글루타미나아제, 리소자임, 페니실린 아실라아제; 이소메라제, 옥시도리덕타아제, 카탈라아제, 클로로페록시다아제, 글루코오스 옥시다아제, 하이드록시스테로이드 데하이드로게나아제, 페록시다아제, 리아제, 아스파르트산 β-데카르복실라아제, 푸마라아제, 히스타다아제, 트랜스페라아제, 리가아제, 아미노펩티다아제, 카르복시펩티다아제, 키티나아제, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 락카아제, 만노시다아제, 뮤타나아제, 폴리페놀 옥시다아제, 리보뉴클레아제 및 트랜스글루타미나아제로 구성된 군으로부터 선택된다.
방법의 다른 구현예에서, 단계 (i) 프로모터는 rev3 프로모터(서열 번호 15), bxl 프로모터(서열 번호 16), tkl1 프로모터(서열 번호 17), PID104295 프로모터(서열 번호 18), dld1 프로모터(서열 번호 19), xyn4 프로모터(서열 번호 20), PID72526 프로모터(서열 번호 21), axe1 프로모터(서열 번호 22), hxk1 프로모터(서열 번호 23), dic1 프로모터(서열 번호 24), opt 프로모터(서열 번호 25), gut1 프로모터(서열 번호 26) 및 pki1 프로모터(서열 번호 27)로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 방법은 서열 번호 48의 야생형 자일라나아제 조절인자 1(Xyr1) 단백질 또는 서열 번호 46의 변이체 자일라나아제 조절인자 1(Xyr1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 유전자 변형을 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 내인성 탄소 이화대사산물 억제인자 1(Cre1) 단백질 또는 Ace1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 감소시키거나 방지하는 유전자 변형을 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 Ace2 단백질 발현을 포함하는 유전자 변형을 더 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 유도 기질의 부존재 하의 트리코더마 종 진균 세포 내에서 이종성 관심 단백질의 생산 방법에 관한 것으로, 방법은 (i) 5'에서 3' 방향으로 (a) 구성성 프로모터를 포함하는 제1 핵산 서열 및 (b) 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 진균 세포 내로 도입하는 단계로서, 이때, 제2 핵산 서열은 서열 번호 12에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 Ace3 단백질을 암호화하는 것인, 단계, 및 (ii) 진균 세포 성장 및 단백질 생산에 적합한 조건 하에서 단계 (i)의 세포를 발효시키는 단계로서, 이때, 그러한 적합한 성장 조건은 유도 기질을 포함하지 않는 것인, 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 진균 세포는 이종성 POI를 암호화하는 도입된 폴리뉴클레오티드 구성체를 포함하는데, 이때, 구성체는 단계 (i) 이전에, 단계 (i) 중에, 또는 단계 (i) 이후에 진균 세포 내로 도입된다. 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 제3 핵산 서열 3'을 포함하고, 제2 핵산에 작동 가능하게 연결되는데, 이때, 제3 핵산 서열은 천연 ace3 종결자 서열을 포함한다. 방법의 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈 내로 통합된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈의 텔로미어 부위 내로 통합된다. 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 진균 세포 게놈의 글루코아밀라아제(gla1) 유전자좌 내로 통합된다. 또 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 구성체는 서열 번호 4, 서열 번호 11 또는 서열 번호 13에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 암호화된 Ace3 단백질은 서열 번호 6, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14에 대해 95% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 암호화된 Ace3 단백질은 서열 번호 6, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 방법의 또 다른 구현예에서, 이종성 POI를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체는 셀룰로오스 유도성 유전자 프로모터의 제어 하에 발현된다. 일부 구현예에서, 이종성 POI는 α-아밀라아제, 알칼리성 α-아밀라아제, β-아밀라아제, 셀룰라아제, 덱스트라나아제, α-글루코시다아제, α-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 헤미셀룰라아제, 펜토사나아제, 자일라나아제, 인버타아제, 락타아제, 나린지나아제, 펙티나아제, 풀루라나아제, 산성 프로테아제, 알칼리성 프로테아제, 브로멜라인, 중성 프로테아제, 파파인, 펩신, 펩티다아제, 레닛, 레닌, 키모신, 서브틸리신, 서몰리신, 아스파르트산 프로테이나제, 트립신, 리파아제, 에스테라아제, 포스포리파아제, 포스파타아제, 피타아제, 아미다아제, 이미노아실라아제, 글루타미나아제, 리소자임, 페니실린 아실라아제; 이소메라제, 옥시도리덕타아제, 카탈라아제, 클로로페록시다아제, 글루코오스 옥시다아제, 하이드록시스테로이드 데하이드로게나아제, 페록시다아제, 리아제, 아스파르트산 β-데카르복실라아제, 푸마라아제, 히스타다아제, 트랜스페라아제, 리가아제, 아미노펩티다아제, 카르복시펩티다아제, 키티나아제, 큐티나아제, 데옥시리보뉴클레아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 락카아제, 만노시다아제, 뮤타나아제, 폴리페놀 옥시다아제, 리보뉴클레아제 및 트랜스글루타미나아제로 구성된 군으로부터 선택된다.
방법의 다른 구현예에서, 단계 (i) 프로모터는 rev3 프로모터(서열 번호 15), bxl 프로모터(서열 번호 16), tkl1 프로모터(서열 번호 17), PID104295 프로모터(서열 번호 18), dld1 프로모터(서열 번호 19), xyn4 프로모터(서열 번호 20), PID72526 프로모터(서열 번호 21), axe1 프로모터(서열 번호 22), hxk1 프로모터(서열 번호 23), dic1 프로모터(서열 번호 24), opt 프로모터(서열 번호 25), gut1 프로모터(서열 번호 26) 및 pki1 프로모터(서열 번호 27)로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 방법은 서열 번호 48의 야생형 자일라나아제 조절인자 1(Xyr1) 단백질 또는 서열 번호 46의 변이체 자일라나아제 조절인자 1(Xyr1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 유전자 변형을 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 내인성 탄소 이화대사산물 억제인자 1(Cre1) 단백질 또는 Ace1 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 감소시키거나 방지하는 유전자 변형을 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 Ace2 단백질 발현을 포함하는 유전자 변형을 더 포함한다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명은 유도 기질의 부존재 하에서의 내인성 단백질의 증가된 생산을 위하여 트리코더마 레에세이 주를 유전자 변형하는 방법에 관한 것으로, 방법은 (i) 서열 번호 3의 Ace3-S 단백질, 서열 번호 8의 Ace3-SC 단백질 또는 서열 번호 10의 Ace3-LC 단백질을 암호화하는 ace3 유전자의 게놈 카피를 포함하는 T. 레에세이 주를 스크리닝하고 확인하는 단계로서, 이때, 확인된 T. 레에세이 주는 서열 번호 6의 Ace3-L 단백질, 서열 번호 14의 Ace3-LN 단백질 또는 서열 번호 12의 Ace3-EL 단백질을 암호화하는 ace3 유전자의 게놈 카피를 포함하지 않는 것인, 단계, (ii) 5'에서 3' 방향으로 (a) 프로모터를 포함하는 제1 핵산 서열 및 (b) 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구성체를 단계 (i)에서 확인된 T. 레에세이 주 내로 도입하는 단계로서, 이때, 제2 핵산 서열은 서열 번호 6에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 Ace3 단백질을 암호화하고, 마지막 네 개의 C 말단 아미노산으로서 "Lys-Ala-Ser-Asp"를 포함하거나 제2 핵산 서열은 서열 번호 12에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 Ace-3 단백질을 암호화하는 것인, 단계, 및 (iii) 진균 세포 성장 및 단백질 생산에 적합한 조건 하에서 단계 (ii)의 세포를 발효시키는 단계로서, 이때, 그러한 적합한 성장 조건은 유도 기질을 포함하지 않는 것인, 단계를 포함한다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명은 모 사상 진균 세포로부터 유래된 변이체 사상 진균 세포에 관한 것으로, 변이체 세포는 대안적인 프로모터에 의해 교체된 천연 ace3 유전자 프로모터를 포함하고, 이때, 변이체 세포는 모 세포에 비해 유도 기질의 부존재 하에 증가된 양의 관심 단백질(POI)을 생산하며, 이때, 변이체 세포와 모 세포는 유사한 조건 하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 대안적인 프로모터는 트리코더마 레에세이 프로모터이다. 또 다른 구현예에서, 대안적인 프로모터는 rev3 프로모터(서열 번호 15), bxl 프로모터(서열 번호 16), tkl1 프로모터(서열 번호 17), PID104295 프로모터(서열 번호 18), dld1 프로모터(서열 번호 19), xyn4 프로모터(서열 번호 20), PID72526 프로모터(서열 번호 21), axe1 프로모터(서열 번호 22), hxk1 프로모터(서열 번호 23), dic1 프로모터(서열 번호 24), opt 프로모터(서열 번호 25), gut1 프로모터(서열 번호 26) 및 pki1 프로모터(서열 번호 27)로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터이다.
도 1은 Ace3 단백질 암호화 영역에 대한 개략도를 보여 준다. 더욱 상세하게는, 도 1a는 게놈의 동일한 DNA 서열에 대해 정렬시킨 T. 레에세이 주 QM6a 및 RUT-C30(도 1a)의 주석을 기반으로 한 Ace3 단백질 암호화 영역에 대한 개략도를 보여 준다. 예상되는 엑손과 인트론을 각각 화살표와 점선으로 나타내었다. 점선으로 표시된 수직선은 RUT-C30 게놈의 넌센스 돌연변이를 나타낸다. 서열 번호 2의 클로닝된 ace3-S (짧은) 오픈 리딩 프레임 및 서열 번호 5의 클로닝된 ace3-L (긴) 오픈 리딩 프레임을 본 출원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고 시험하였다. 도 1b에는 T. 레에세이 주 RUT-C30으로부터의 Ace3-L 단백질(서열 번호 6), T. 레에세이 주 QM6a로부터의 Ace3-S 단백질(서열 번호 3), Ace3-SC 단백질(서열 번호 8), Ace3-LN 단백질(서열 번호 14), Ace3-LC 단백질(서열 번호 10) 및 Ace3-EL 단백질(서열 번호 12)의 아미노산 정렬을 기재하였다.
도 2는 Ace3-발현 벡터 pYL1(도 2a), pYL2(도 2b), pYL3(도 2c) 및 pYL4(도 2d)의 개략도를 보여 준다.
도 3은 T. 레에세이 모 세포 및 변이체 세포 상청액의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 보여 주며, 이때, 모 세포와 변이체 세포는 20% 락토오스(lac) 또는 20% 글루코오스(glu)를 함유하는 srMTP 중의 합성 배지에서 성장시켰다. 동일한 부피의 배양 상청액을 각 레인에 로딩하였다. M은 분자량 마커이고, 모 T. 레에세이 균주는 대조군 균주로 기능하였다.
도 4는 T. 레에세이 모 세포 및 변이체 세포 상청액의 SDS-PAGE를 보여 주며, 이때, 모 세포와 변이체 세포는 진탕 플라스크에서 1.5% 글루코오스/소포로오스(sop) 또는 1.5% 글루코오스(glu)가 첨가된 합성 배지 중에서 성장시켰다. 동일한 부피의 배양 상청액을 각 레인에 로딩하였다. 배양 상청액의 총 단백질 농도는 각각의 해당하는 레인 하단에 열거하였다. M은 분자량 마커이고, KD는 킬로달톤이다.
도 5는 2L 발효기에서 탄소 공급원으로 글루코오스/소포로오스(sop) 또는 글루코오스(glu)가 첨가된 합성 배지 중에서 성장시킨 T. 레에세이 모 세포 및 변이체 세포의 SDS-PAGE를 보여 준다. M은 분자량 마커이고, 영(0)은 종배양(seed culture) 상청액이다.
도 6은 ace3 유전자좌에 천연 프로모터의 5' 영역 상류를 포함하는 DNA 단편, loxP가 측면에 있는 하이그로마이신 B-저항성(선택 가능한 마커) 카세트 및 ace3 ORF의 5' 말단에 작동 가능하게 융합된(연결된) 관심 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 융합시켜 제조된 프로모터 교체 구성체의 개략도를 보여 준다.
도 7은 dic1 프로모터를 포함하는 Ace3-발현 벡터 pYL8의 개략도를 보여 준다.
도 8은 T. 레에세이 모 세포 및 그것의 변형된 (딸) 세포 상청액의 SDS-PAGE를 보여 주며, 이때, 모 균주와 변형된 균주는 진탕 플라스크에서 2.5% 글루코오스/소포로오스("Sop", 유도 조건) 또는 2.5% 글루코오스("Glu", 비유도 조건)가 첨가된 합성 배지에서 성장시켰다. 동일한 부피의 배양 상청액을 각 레인에 로딩하였다. M은 분자량 마커이고, KD는 킬로달톤이다.
도 9는 소규모(2 L) 발효의 단백질 생산을 보여 준다. T. 레에세이 모 균주 및 딸 균주 "LT83"은 탄소 공급원으로 글루코오스/소포로오스(Sop, 유도 조건) 또는 글루코오스(Glu, 비유도 조건)가 첨가된 합성 배지에서 성장시켰다. 발효 종료 시 글루코오스/소포로오스 상의 모 균주에 의해 생산된 총 단백질을 임의로 100으로 설정하였고, 각 시점에서 각각의 균주에 의해 생산된 상대적인 단백질량을 그래프로 나타내었다.
도 10은 T. 레에세이 모 세포 및 그것의 변형된 (딸) 세포 상청액의 SDS-PAGE를 보여 주며, 이때, 모 균주와 변형된 균주는 진탕 플라스크에서 2.5% 글루코오스/소포로오스("Sop", 유도 조건) 또는 2.5% 글루코오스("Glu", 비유도 조건)가 첨가된 합성 배지에서 성장시켰다. 동일한 부피의 배양 상청액을 각 레인에 로딩하였다. M은 분자량 마커이고, KD는 킬로달톤이다.
도 11은 ace3 유전자좌에 대한 개략적인 이미지를 보여 준다. ace3 유전자좌의 5' 말단(N 말단)의 화살표는 cDNA 서열(화살표 1), RutC-30 주석형(화살표 2) 및 QM6a 주석형(화살표 3)이 제시한 형태에서의 상이한 전사 개시 부위를 나타낸다. ace3 유전자좌의 3' 말단(C 말단)의 화살표는 RutC-30 주석형(화살표 4) 및 QM6a 주석형(화살표 5)에서의 상이한 정지 코돈을 나타낸다.
도 12는 클로닝된 상이한 ace3 형태에 대한 개략적인 이미지를 보여 준다. 따라서, 도 12에 제시되고 실시예 6에 기술된 바와 같이, 다음의 ace3 형태가 클로닝되고 시험되었다: 1,713bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 177 bp 엑손 4를 포함하는 서열 번호 1의 " ace3 -S", 1,713bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 144 bp 엑손 4를 포함하는 서열 번호 7의 " ace3 -SC", 258 bp 엑손 2, 423 bp 인트론 2, 1,635 bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 144 bp 엑손 4를 포함하는 서열 번호 4의 " ace3 -L", 258 bp 엑손 2, 423 bp 인트론 2, 1,635 bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 177 bp 엑손 4를 포함하는 서열 번호 9의 " ace3 -LC", 61 bp 엑손 1, 142 bp 인트론 1, 332 bp 엑손 2, 423 bp 인트론 2, 1,635 bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 144 bp 엑손 4를 포함하는 서열 번호 11의 " ace3 -EL", 및 258 bp 엑손 2, 1,635 bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 144 bp 엑손 4를 포함하는 서열 번호 13의 " ace3 -LN".
도 13은 ace3 -SC 유전자 형태(서열 번호 7; 1,713bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 144 bp 엑손 4 포함)의 핵산 서열 및 암호화된 Ace3-SC 단백질 서열(서열 번호 8)을 보여 준다. ace3-SC 유전자 형태에 대해 도 13에 제시된 바와 같이, 굵은 검은색 글자체로 표시된 뉴클레오티드는 인트론 서열을 나타낸다.
도 14는 ace3 -S 유전자 형태(서열 번호 1; 1,713bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 177 bp 엑손 4 포함)의 핵산 서열 및 암호화된 Ace3-S 단백질 서열(서열 번호 3)을 보여 준다. ace3-S 유전자 형태에 대해 도 14에 제시된 바와 같이, 굵은 검은색 글자체로 표시된 뉴클레오티드는 인트론 서열을 나타낸다.
도 15는 ace3 -L 유전자 형태(서열 번호 4; 258 bp 엑손 2, 423 bp 인트론 2, 1,635 bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 144 bp 엑손 4 포함)의 핵산 서열 및 암호화된 Ace3-L 단백질 서열(서열 번호 6)을 보여 준다. ace3-L 유전자 형태에 대해 도 15에 제시된 바와 같이, 굵은 검은색 글자체로 표시된 뉴클레오티드는 인트론 서열을 나타낸다.
도 16은 ace3 -LC 유전자 형태(서열 번호 9; 258 bp 엑손 2, 423 bp 인트론 2, 1,635 bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 177 bp 엑손 4 포함)의 핵산 서열 및 암호화된 Ace3-LC 단백질 서열(서열 번호 10)을 보여 준다. ace3-LC 유전자 형태에 대해 도 16에 제시된 바와 같이, 굵은 검은색 글자체로 표시된 뉴클레오티드는 인트론 서열을 나타낸다.
도 17은 ace3 -EL 유전자 형태(서열 번호 11; 61 bp 엑손 1, 142 bp 인트론 1, 332 bp 엑손 2, 423 bp 인트론 2, 1,635 bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 144 bp 엑손 4 포함)의 핵산 서열 및 암호화된 Ace3-EL 단백질 서열(서열 번호 12)을 보여 준다. ace3-EL 유전자 형태에 대해 도 17에 제시된 바와 같이, 굵은 검은색 글자체로 표시된 뉴클레오티드는 인트론 서열을 나타낸다.
도 18은 ace3 -LN 유전자 형태(서열 번호 13; 258 bp 엑손 2, 1,635 bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 144 bp 엑손 4 포함)의 핵산 서열 및 암호화된 Ace3-LN 단백질 서열(서열 번호 14)을 보여 준다. ace3-LN 유전자 형태에 대해 도 18에 제시된 바와 같이, 굵은 검은색 글자체로 표시된 뉴클레오티드는 인트론 서열을 나타낸다.
도 19는 gla1 유전자좌에서 ace3 형태들의 통합을 위해 설계된 DNA 단편의 배열에 대한 개략도를 보여 준다.
도 20은 벡터 pMCM3282의 개략도를 보여 준다.
도 21은 벡터 pCHL760의 개략도를 보여 준다.
도 22는 벡터 pCHL761의 개략도를 보여 준다.
도 23은 유도("Glu/Sop") 및 비유도("Glu") 배양 조건 하에서의 T. 레에세이 모 세포(도 23, 세포 ID 1275.8.1) 및 변이체 T. 레에세이(딸) 세포(도 23, 세포 ID 번호: 2218, 2219, 2220, 2222 및 2223)의 액침 배양(즉, 진탕 플라스크)에 의해 생산된 분비 단백질의 SDS-PAGE를 보여 준다.
[생물학적 서열의 간단한 설명]
다음의 서열은 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825("뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열의 기재를 포함하는 특허 출원의 요건--서열 규정[Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequence and/or Amino Acid Sequence Disclosures--the Sequence Rules")를 준수하며, WIP 표준 ST.25 (2009) 및 유럽 특허 조약(European Patent Convention, EPC) 및 특허 협력 조약(Patent Cooperation Treaty, PCT) 시행규칙 5.2 및 49.5(a-bis), 및 시행 세칙의 제208조 및 부칙 C의 서열 목록 요건과 일관된다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용되는 부호 및 포맷은 37 C.F.R. § 1.822에 개시된 규정을 따른다.
서열 번호 1은 서열 번호 3의 Ace3-S 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 트리코더마 레에세이 야생형 균주 QM6a 핵산 서열이다.
서열 번호 2는 서열 번호 3의 Ace3-S 단백질을 암호화하는 핵산 서열 오픈 리딩 프레임(ORF)이다.
서열 번호 3은 이하에서 "Ace3-S"로 표기된, 트리코더마 레에세이(균주 QM6a) Ace3 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 4는 서열 번호 6의 Ace3-L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 트리코더마 레에세이 균주 Rut-C30 핵산 서열이다.
서열 번호 5는 서열 번호 6의 Ace3-L 단백질을 암호화하는 핵산 서열 ORF이다.
서열 번호 6은 이하에서 "Ace3-L"로 표기된, 트리코더마 레에세이(균주 Rut-C30) Ace3 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 7은 서열 번호 8의 Ace3-SC 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 트리코더마 레에세이 핵산 서열이다.
서열 번호 8은 이하에서 "Ace3-SC"로 표기된, 트리코더마 레에세이 Ace3 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 9는 서열 번호 10의 Ace3-LC 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 트리코더마 레에세이 핵산 서열이다.
서열 번호 10은 이하에서 "Ace3-LC"로 표기된, 트리코더마 레에세이 Ace3 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 11은 서열 번호 12의 Ace3-EL 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 트리코더마 레에세이 핵산 서열이다.
서열 번호 12는 이하에서 "Ace3-EL"로 표기된, 트리코더마 레에세이 Ace3 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 13은 서열 번호 14의 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 트리코더마 레에세이 핵산 서열이다.
서열 번호 14는 이하에서 "Ace3-LN"으로 표기된, 트리코더마 레에세이 Ace3 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 15는 rev3 프로모터 서열을 포함하는 핵산 서열이다.
서열 번호 16은 β-xyl 프로모터 서열을 포함하는 핵산 서열이다.
서열 번호 17은 tki1 프로모터 서열을 포함하는 핵산 서열이다.
서열 번호 18은 PID104295 프로모터 서열을 포함하는 핵산 서열이다.
서열 번호 19는 dld1 프로모터 서열을 포함하는 핵산 서열이다.
서열 번호 20은 xyn4 프로모터 서열을 포함하는 핵산 서열이다.
서열 번호 21은 PID72526 프로모터 서열을 포함하는 핵산 서열이다.
서열 번호 22는 axe3 프로모터 서열을 포함하는 핵산 서열이다.
서열 번호 23은 hxk1 프로모터 서열을 포함하는 핵산 서열이다.
서열 번호 24는 dic1 프로모터 서열을 포함하는 핵산 서열이다.
서열 번호 25는 opt 프로모터 서열을 포함하는 핵산 서열이다.
서열 번호 26은 gut1 프로모터 서열을 포함하는 핵산 서열이다.
서열 번호 27은 pki1 프로모터 서열을 포함하는 핵산 서열이다.
서열 번호 28은 프라이머 TP13의 핵산 서열이다.
서열 번호 29는 프라이머 TP14의 핵산 서열이다.
서열 번호 30은 프라이머 TP15의 핵산 서열이다.
서열 번호 31은 프라이머 TP16의 핵산 서열이다.
서열 번호 32는 프라이머 TP17의 핵산 서열이다.
서열 번호 33은 프라이머 TP18의 핵산 서열이다.
서열 번호 34는 프라이머 TP19의 핵산 서열이다.
서열 번호 35는 프라이머 TP20의 핵산 서열이다.
서열 번호 36은 프라이머 TP21의 핵산 서열이다.
서열 번호 37은 프라이머 TP22의 핵산 서열이다.
서열 번호 38은 프라이머 TP23의 핵산 서열이다.
서열 번호 39는 프라이머 TP24의 핵산 서열이다.
서열 번호 40은 프라이머 TP25의 핵산 서열이다.
서열 번호 41은 프라이머 TP26의 핵산 서열이다.
서열 번호 42는 플라스미드 pYL1의 핵산 서열이다.
서열 번호 43은 플라스미드 pYL2의 핵산 서열이다.
서열 번호 44는 플라스미드 pYL3의 핵산 서열이다.
서열 번호 45는 플라스미드 pYL4의 핵산 서열이다.
서열 번호 46은 T. 레에세이 xyr1(A824V) 변이체 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 47은 T. 레에세이 Ace2 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 48은 T. 레에세이 야생형 xyr1 단백질의 아미노산 서열이다.
서열 번호 49는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 50은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 51은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 52는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 53은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 54는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 55는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 56은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 57은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 58은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 59는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 60은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 61은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 62는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 63은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 64는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 65는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 66은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 67은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 68은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 69는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 70은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 71은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 72는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 73은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 74는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 75는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 76은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 77은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 78은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 79는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 80은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 81은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 82는 인공 핵산 서열이다.
서열 번호 83은 인공 핵산 서열이다.
서열 번호 84는 인공 핵산 서열이다.
서열 번호 85는 인공 핵산 서열이다.
서열 번호 86은 인공 핵산 서열이다.
서열 번호 87은 인공 핵산 서열이다.
서열 번호 88은 인공 핵산 서열이다.
서열 번호 89는 인공 핵산 서열이다.
서열 번호 90은 인공 핵산 서열이다.
서열 번호 91은 인공 핵산 서열이다.
서열 번호 92는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 93은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 94는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 95는 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 96은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 97은 프라이머 핵산 서열이다.
서열 번호 98은 서열 번호 12의 Ace3-EL 단백질의 N 말단 서열의 45개 아미노산의 단편을 포함하는 아미노산 서열이다.
서열 번호 99는 Ace3-SC 단백질을 암호화하는 핵산 서열 ORF이다.
서열 번호 100은 Ace3-LC 단백질을 암호화하는 핵산 서열 ORF이다.
서열 번호 101은 Ace3-EL 단백질을 암호화하는 핵산 서열 ORF이다.
서열 번호 102는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 핵산 서열 ORF이다.
I. 개요
본 발명의 일부 구현예는 변이체 사상 진균 세포, 이의 조성물 및 이의 1종 이상의 관심 단백질의 증가된 생산을 위한 방법을 대상으로 한다. 더욱 상세하게는, 본 발명의 일부 구현예는 유도성 먹이(즉, 락토오스, 소포로오스, 겐티오비오스, 셀룰로오스 등과 같은 유도 기질)의 부존재 하에 1종 이상의 관심 단백질을 생산할 수 있는 변이체 사상 진균 세포를 대상으로 한다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예는 모 사상 진균 세포로부터 유래된 변이체 사상 진균 (숙주) 세포를 대상으로 하며, 이때, 변이체 숙주 세포는 유도 기질의 부존재 하에 (관심 단백질을 암호화하는) 관심 유전자의 발현을 가능하게 하는 유전자 변형을 포함한다. (관심 단백질을 암호화하는) 관심 유전자는 내인성 사상 진균 세포 유전자(예컨대, cbh1, chb2, xyn1, xyn2, xyn3, egl1, egl2, egl3, bgl1, bgl2 등) 또는 이 사상 진균 세포에 대해 이종성인 유전자일 수 있다.
따라서, 일부 다른 구현예에서, 본 발명의 변이체 진균 숙주 세포는 Ace3-L 단백질(서열 번호 6), Ace3-EL 단백질(서열 번호 12) 및 Ace3-LN 단백질(서열 번호 14)로 구성된 군으로부터 선택된 Ace3 단백질을 암호화하는 "셀룰라아제 발현 활성화 인자(activator of cellulase expression) 3"(ace3) 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 변이체 진균 숙주 세포는 Ace3-L 단백질(서열 번호 6), Ace3-EL 단백질(서열 번호 12) 및 Ace3-LN 단백질(서열 번호 14)로 구성된 군으로부터 선택된 Ace3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임(ORF)의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 변이체 진균 숙주 세포는 Ace3-L 단백질(서열 번호 6), Ace3-EL 단백질(서열 번호 12) 및 Ace3-LN 단백질(서열 번호 14)로 구성된 군으로부터 선택된 Ace3 단백질에 대해 약 90% 내지 약 99% 서열 동일성을 포함하는 Ace3 단백질을 암호화하는 Ace 유전자 또는 이의 ORF의 발현/생산을 증가시키는 유전자 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, Ace3 단백질(즉, Ace3-L, Ace3-EL 또는 Ace3-LN 단백질)의 발현을 증가시키는 유전자 변형은 사상 진균 숙주 세포의 게놈(염색체) 내로 통합된 ace3 발현 카세트이다. 다른 구현예에서, 사상 진균 세포에서 Ace3 단백질의 발현을 증가시키는 유전자 변형은 ace3 발현 카세트(즉, Ace3-L, Ace3-EL 또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는)를 포함하는 에피솜 유지된 플라스미드 구성체이다. 다른 구현예에서, 사상 진균 세포에서 Ace3-L, Ace3-EL 또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 ace3 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형은 텔로미어 부위에 통합된 텔로머 벡터/플라스미드이다. 일부 구현예에서, 이러한 발현 카세트 또는 플라스미드는 두 카피 이상 존재한다. 일부 다른 구현예에서, ace3 유전자, 또는 ace3 ORF는 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 다른 구현예에서, 사상 진균 세포에서 Ace3-L, Ace3-EL 또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 ace3 유전자(또는 이의 ORF)의 발현을 증가시키는 유전자 변형은 천연 ace3 프로모터(즉, ace3 유전자와 천연적으로 관련이 있는 ace3 프로모터 영역)의 변형이며, 이 변형은 Ace3-L, Ace3-EL 또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 ace3 유전자의 발현을 바꾼다.
II. 정의
본 발명의 조성물 및 방법을 더욱 상세하게 기술하기 전에, 다음의 용어 및 어구가 정의된다. 정의되지 않은 용어는 당해 분야에서 사용되고 당업자에게 공지된 통상적인 의미를 따라야 한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물 및 특허는 본 설명에 참조로 포함된다.
일정 범위의 값이 제공되는 경우, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한 및 하한, 그리고 그 언급된 범위 내의 임의의 기타 언급된 값 또는 개재 값의 사이에 있는 각각의 값은 하한 단위의 소수점 첫째 자리까지, 본 발명의 조성물 및 방법에 포함된다. 또한, 이러한 더 작은 범위의 상한들 및 하한들은, 이러한 더 작은 범위 내에 독립적으로 포함될 수 있으며, 언급된 범위 내의 임의의 구체적으로 제외된 한계치를 조건으로, 본 발명의 조성물 및 방법에 포함된다. 언급된 범위가 한계치 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 그렇게 포함되는 한계치 중 하나 또는 둘 다를 제외하는 범위들 또한, 본 발명의 조성물 및 방법에 포함된다.
일부 범위는 용어 "약"이 선행되는 수치 값으로 본 설명에 제시된다. 용어 "약"은 뒤에 오는 정확한 수뿐만 아니라, 이 용어 뒤에 오는 수에 근사한 수 또는 대략 이 용어 뒤에 오는 수를 문자 그대로 뒷받침하기 위하여 본 설명에서 사용된다. 소정의 수가 구체적으로 인용된 수에 근사한 수 또는 대략 구체적으로 인용된 수인지를 결정하는 데 있어서, 근사한 수 또는 근사값의 인용되지 않은 수는, 그것이 제시된 문맥에서, 구체적으로 인용된 수의 실질적인 등가를 제공하는 수일 수 있다. 예를 들어, 수치와 관련하여, 용어 "약"은, 이 용어가 문맥에서 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 이 수치의 -10% 내지 +10%의 범위를 지칭한다. 다른 예에서, 어구 "약 6의 pH 값"은, 이 pH 값이 구체적으로 달리 정의되지 않는 한, 5.4 내지 6.6의 pH 값을 지칭한다.
본 설명에 제공된 표제는 본 명세서를 전체로서 참조하여 가질 수 있는 본 발명의 조성물 및 방법의 다양한 양태 또는 구현예의 제한이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 본 명세서를 전체로서 참조하여 더욱 완전하게 정의된다.
이러한 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 따라, 다음의 약어 및 정의가 적용된다. 단수형("a", "an" 및 "the")은, 문맥에서 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의한다. 따라서, 예를 들어, "효소"에 대한 언급은 복수형의 그러한 효소를 포함하며, "투여량"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 투여량 및 이의 등가물에 대한 언급을 포함하며, 다른 것도 마찬가지이다.
청구범위는 임의의 선택적 요소를 제외하도록 작성될 수 있다는 것 또한, 유의한다. 따라서, 이러한 서술은 청구항 요소의 설명과 관련하여 "오로지", "단지", "제외하는", "포함하지 않는" 등과 같은 배타적인 용어의 사용, 또는 "부정적" 제한의 사용에 대한 선행적 근거로서의 역할을 하기 위한 것이다.
본 설명에서 사용되는 바와 같은 "포함하는"이라는 용어는 "포함하는"이라는 용어 앞의 성분(들)을 "포함하지만 이에 한정되는 것은 아님"을 의미함에 또한, 유의한다. "포함하는"이라는 용어 앞의 성분(들)은 요구되거나 의무적이지만, 이 성분(들)을 포함하는 조성물은 다른 비-의무적 또는 선택적 성분(들)을 추가로 포함할 수 있다.
본 설명에서 사용되는 바와 같은 "~로 이루어진"이라는 용어는 "~로 이루어진"이라는 용어 앞의 성분(들)을 "포함하고 이에 한정됨"을 의미함에 또한, 유의한다. 따라서 "~으로 이루어진"이라는 용어 앞의 성분(들)은 요구되거나 의무적인 것이며, 다른 성분(들)은 조성물에 전혀 존재하지 않는다.
본 개시 내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본 설명에 기술되고 예시된 각각의 개별적인 구현예는 본 설명에 기술된 본 발명의 조성물 및 방법의 범위 또는 사상으로부터 벗어나지 않고서 다른 몇몇 구현예들 중 임의의 구현예의 특징과 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는 개별 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 언급된 방법은 언급된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 설명에 사용된 바와 같이, 용어 "자낭균 진균 세포"는 진균계의 자낭균 문(Division)의 임의의 유기체를 지칭한다. 자낭균 진균 세포의 예는 페지조마이코티나 아문(subphylum Pezizomycotina)의 사상 진균, 예컨대 트리코더마 종(Trichoderma spp.), 아스퍼질러스 종(Aspergillus spp.), 마이셀리오프토라 종(Myceliophthora spp.), 및 페니실리움 종(Penicillium spp.)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 설명에 사용된 바와 같이, 용어 "사상 진균"은 진균문(Eumycota) 및 난균문(Oomycota)의 아문의 모든 사상 형태를 지칭한다. 예컨대, 사상 진균은 아크레모늄(Acremonium), 아스퍼질러스(Aspergillus), 에메리셀라(Emericella), 푸사리움(Fusarium), 휴미콜라(Humicola), 무코르(Mucor), 마이셀리오프토라(Myceliophthora), 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 스키탈리디움(Scytalidium), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 또는 트리코더마(Trichoderma) 종을 제한 없이 포함한다. 일부 구현예에서, 사상 진균은 아스퍼질러스 아쿨레아투스(Aspergillus aculeatus), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스퍼질러스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 니게르(Aspergillus niger), 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)일 수 있다.
일부 구현예에서, 사상 진균은 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크룩웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 컬모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그래미니아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그래미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사르코크럼(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 설푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테시오이데스(Fusarium trichothecioides), 또는 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum)이다. 일부 구현예에서, 사상 진균은 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 라누지노사(Humicola lanuginosa), 뮤코어 미에헤이(Mucor miehei), 마이셀리오프토라 써모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 스키탈리디움 써모필룸(Scytalidium thermophilum), 또는 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris)이다.
일부 구현예에서, 사상 진균은 트리코더마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코더마 코닌기이(Trichoderma koningii), 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei) 또는 트리코더마 비리데(Trichoderma viride)이다. 일부 구현예에서, 사상 진균은 트리코더마 레에세이 주 "Rut-C30"으로부터 유래된 T. 레에세이 세포로, 이는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 트리코더마 레에세이 ATCC 수탁번호 56765로서 입수 가능하다. 일부 구현예에서, 사상 진균은 트리코더마 레에세이 주 "RL-P37"로부터 유래된 T. 레에세이 세포로, 이는 미국 농무부 북부 지역 연구소의 컬쳐 콜렉션으로부터 NRRL No. 15709로서 입수 가능하다.
본 설명에 사용되는 바와 같이, "변이체 사상 진균 세포(들)", "변이체 진균 세포(들)", "변이체 세포(들)" 등의 어구는 페지조마이코티나 아문에 속하는 모 (대조군) 사상 진균 세포로부터 유래된(즉, 수득된) 사상 진균 세포를 지칭한다. 따라서, 본 설명에 정의된 바와 같은 "변이체" 사상 진균 세포는 "모" 사상 진균 세포로부터 유래된 것으로, 이때, "변이체" 세포는 "모" 세포에서 발견되지 않는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 "모 사상 진균 세포"에 대해 "변이체 사상 진균 세포"를 비교할 때, "모" 세포는 적어도 하나의 유전자 변형을 포함하는 "변이체" 세포와 비교하여 유전적으로 변형되지 않은 (모) "대조군" 세포로서 작용한다.
본 설명에 사용되는 바와 같이, "유전자 변형"이라는 용어는 핵산 서열의 변경/변화를 지칭한다. 변형은 핵산 서열에서 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, 결실, 삽입 또는 화학적 변형을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 설명에 정의된 바와 같이, 어구 "유전자 변형을 포함하는 변이체 세포(들)" 및 "Ace3-L 단백질, Ace3-EL 단백질 및/또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는 변이체 세포(들)"은 적어도 하나의 카피의 Ace3-L 단백질, Ace3-EL 단백질 및/또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 유전자 또는 ORF의 사상 진균 세포 내로의 도입을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 외인성으로 도입된 적어도 하나의 카피의 Ace3-L 단백질, Ace3-EL 단백질 및/또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 유전자 또는 ORF를 포함하는 사상 진균 세포는 (변형되지 않은) 모 진균 세포에 비해, 유전자 변형을 포함하는 변형체 진균 세포이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 모 진균 세포는 본 설명에 개시된 Ace3 단백질 중 임의의 것을 암호화하는 내인성 ace3 유전자(즉, Ace3-S 단백질, Ace3-SC 단백질, Ace3-L 단백질, Ace3-LC 단백질, Ace3-EL 단백질 및 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 ace3 유전자)의 존재를 대상으로 스크리닝된다. 예를 들어, 모 진균 세포가 Ace3-L 단백질, Ace3-EL 단백질 또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 ace3 유전자의 내인성 카피를 포함한다고 결정되는 경우, 이의 변이체 진균 세포는 예컨대, ace3 유전자의 내인성 프로모터를 이종성 프로모터로 교체하는 것에 의한 것과 같이, 유전자 변형에 의해 생성될 수 있다. 마찬가지로, 모 진균 세포가 Ace3-S 단백질, Ace3-SC 단백질 또는 Ace3-LC 단백질을 암호화하는 ace3 유전자의 내인성 카피를 포함한다고 결정되는 경우, 이의 변이체 진균 세포는 유전자 변형에 의해, 예컨대, 진균 세포 내로 본 발명의 Ace3-L 단백질, Ace3-EL 단백질 및/또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체로서 이의 Ace3-S, Ace3-SC 또는 Ace3-LC 단백질을 암호화하는 내인성 ace3 유전자의 유전자 변형을 더 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 구성체를 도입함으로써, 생성될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명의 변이체 사상 진균 세포는 추가적인 유전자 변형을 포함할 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 그러한 변이체 사상 진균 세포(즉, 외인성으로 도입된 본 발명의 Ace3-L 단백질, Ace3-EL 및/또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 유전자 또는 ORF의 카피를 포함하는 변이체 사상 진균 세포)는 탄소 이화대사산물 억제인자 단백질 "Cre1" 또는 Ace1 억제인자 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 유전자 변형을 더 포함한다.
다른 구현예에서, 그러한 변이체 사상 진균 세포(즉, 외인성으로 도입된 본 발명의 Ace3-L 단백질, Ace3-EL 및/또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 유전자 또는 ORF의 카피를 포함하는 변이체 사상 진균 세포)는 서열 번호 25 또는 서열 번호 27에 기재된 자일라나아제 조절인자 1(Xyr1)의 적어도 하나의 카피를 도입하는 유전자 변형을 더 포함한다.
본 설명에 사용되는 바와 같이, "Ace3-L" 단백질 형태(서열 번호 6) 및 "Ace3-LN" 단백질 형태(서열 번호 14; 도 1b 참조)는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 그러나 항목 "Ace3-L" 및 "Ace3-LN"은 그러한 단백질 형태를 암호화하는 이의 일부 유전자와의 비교를 위해 본 발명의 일부 구현예에서 사용되며, 결코 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
본 설명에 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본 설명에 기술되는 바와 같이 새로 들어오는 서열(즉, 세포 내로 도입된 폴리뉴클레오티드 서열)을 위한 숙주 또는 발현 비히클로서 작용하는 능력을 갖는 사상 진균 세포를 지칭한다.
"이종성" 핵산 구성체 또는 서열은 이것이 발현되는 세포에 고유하지 않거나 천연 형태로 존재하지 않는 서열의 일부를 갖는다. 제어 서열과 관련하여 이종성은 그것이 현재 조절하고 있는 유전자의 발현과 동일한 유전자를 조절하는 기능은 본질적으로 하지 않는 제어 서열(즉, 프로모터 또는 인핸서)을 지칭한다. 일반적으로, 이종성 핵산 서열은 이들이 존재하는 세포 또는 게놈의 일부에 대해 내인성이 아니며, 감염, 형질감염, 형질전환, 미세주입, 전기천공 등에 의해 세포에 첨가되었다. "이종성" 핵산 구성체는 천연 세포에서 발견되는 제어 서열/DNA 암호화 서열 조합과 동일하거나 상이한 제어 서열/DNA 암호화 서열 조합을 함유할 수 있다. 마찬가지로, 이종성 단백질은 종종 서로에 대해 본질적으로 동일한 관계에서 발견되지 않는 둘 이상의 하위 서열을 지칭할 것이다(예컨대, 융합 단백질).
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "DNA 구성체" 또는 "발현 구성체"는 핵산 서열을 지칭하며, 이는 적어도 두 개의 DNA 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. DNA 또는 발현 구성체는 핵산 서열을 진균 숙주 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. DNA는 시험관 내에서(예컨대, PCR에 의해) 또는 임의의 기타 적합한 기법으로 생성될 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, DNA 구성체는 관심 서열(예컨대, Ace3-L 단백질을 암호화하는 서열)을 포함한다. 일부 구현예에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, DNA 구성체는 적어도 하나의 선택 가능한 마커를 더 포함한다. 추가적인 구현예에서, DNA 구성체는 숙주 세포 염색체에 대해 상동인 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, DNA 구성체는 숙주 세포 염색체에 대해 비-상동 서열을 포함한다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "셀룰라아제", "셀룰로오스 가수분해효소" 또는 "셀룰라아제 효소"는 엑소글루카나아제, 엑소셀로비오하이드롤라아제, 엔도글루카나아제 및/또는 β-글루코시다아제와 같은 세균 또는 진균 효소를 의미한다. 이러한 상이한 유형의 셀룰라아제 효소는 상승적으로 작용하여 셀룰로오스 및 그의 유도체를 글루코오스로 전환한다. 예를 들어, 목재 부패 진균인 트리코더마, 퇴비 세균인 서모모노스포라(Thermomonospora, 현재는 서모비피다(Thermobifida)), 바실루스(Bacillus), 및 셀로모나스(Cellulomonas); 스트렙토미세스(Streptomyces); 및 진균인 휴미콜라, 아스퍼질러스 및 푸사리움을 포함한 많은 미생물이 셀룰로오스를 가수분해하는 효소를 만든다. 이들 미생물이 만든 효소는 셀룰로오스의 글루코오스로의 전환에 유용한 세 가지 종류의 작용을 하는 단백질의 혼합물이다: 엔도글루카나아제(EG), 셀로비오하이드롤라아제(CBH) 및 β-글루코시다아제(BG). 본 설명에서 정의되는 바와 같이, 용어 "엔도글루카나아제"(EG), "셀로비오하이드롤라아제"(CBH) 및 "β-글루코시다아제"(BG)는 각각 그의 약어 "EG", "CBH" 및 "BG"와 상호 교환적으로 사용된다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "탄소 제한"은 미생물이 원하는 단백질 생성물을 생산할 만큼의 탄소는 가지고 있으나 유기체의 필요조건, 예컨대, 성장 지속을 완전히 충족할 만큼의 탄소는 가지고 있지 않은 상태이다. 따라서, 최대량의 탄소가 단백질 생산에 쓰인다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는 하류 유전자 또는 이의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 전사를 유도하는 기능을 하는 핵산 서열을 지칭한다. 프로모터는 일반적으로 표적 유전자가 발현되는 숙주 세포에 적절할 것이다. 프로모터는, 다른 전사 및 번역 조절 핵산 서열("제어 서열"로도 지칭됨)과 함께, 주어진 유전자의 발현에 필수적이다. 일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열은 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위, 전사 개시 및 종결 서열, 번역 개시 및 종결 서열, 및 인핸서 또는 활성화 인자 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 구성성 프로모터이다.
본 설명에 사용되는 바와 같이, "프로모터 서열"은 발현 목적을 위해 특정 사상 진균에 의해 인식되는 DNA 서열이다. "프로모터"는 핵산의 전사를 유도하는 핵산 제어 서열의 어레이로서 정의된다. 본 설명에서 사용되는 바와 같이, 프로모터는 폴리머라아제 II형 프로모터의 경우에 있어서 TATA 요소와 같은, 전사 개시 부위 근처의 필수적인 핵산 서열을 포함한다. "구성성" 프로모터는 대부분의 환경적 및 발달상 조건 하에서 활성을 나타내는 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경적 또는 발달상 조절 하에서 활성을 나타내는 프로모터이다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 (프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이와 같은) 핵산 발현 제어 서열과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 지칭하는데, 이때, 발현 제어 서열은 제2 서열에 해당하는 핵산의 전사를 유도한다. 따라서, 핵산이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있도록 위치될 때 이 핵산은 "작동 가능하게 연결된" 것이다. 예를 들어, 분비 리더(즉 신호 펩티드)를 암호화하는 DNA는, 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질(pre-protein)로서 발현되는 경우 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 작동 가능하게 연결된다; 프로모터 또는 인핸서는, 서열의 전사에 영향을 미칠 경우, 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 위치되는 경우 암호화 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열들이 인접해 있음을 의미하고, 분비 리더의 경우, 연결되는 DNA 서열들이 인접해 있고 해독기(reading phase)에 있음을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접해 있을 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관례에 따라 사용된다. 다른 구현예에서, 연결은 DNA가 서열 독립적이고 흔적이 없는 방식으로 이어진 심리스 클로닝(seamless cloning) 방법에 의해 달성된다. 심리스 클로닝은 전형적으로 깁슨(Gibson) 어셈블리(NEB), 네빌더 하이파이 DNA 어셈블리(NEBuilder HiFi DNA Assembly, NEB), 골든 게이트 어셈블리(Golden Gate Assembly, NEB), 및 진아트 심리스 클로닝 및 어셈블리 시스템(GeneArt Seamless cloning and Assembly system, 서모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))과 같은 상업적으로 이용 가능한 시스템을 이용하여(그러나 이에 한정되지 않음) 수행된다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암호화 서열"은 (암호화된) 단백질 생성물의 아미노산 서열을 직접적으로 특정하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 암호화 서열의 경계는 일반적으로 오픈 리딩 프레임에 의해 결정되는데, 이는 보통 ATG 개시 코돈으로 시작된다. 암호화 서열은 전형적으로 DNA, cDNA, 및 재조합 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 설명에서 정의되는 바와 같이, "오픈 리딩 프레임"(이하, "ORF")은 (i) 개시 코돈, (ii) 아미노산을 나타내는 일련의 2개 이상의 코돈, 및 (iii) 종결 코돈으로 구성되는 연속된(uninterrupted) 리딩 프레임을 포함하는 핵산 또는 핵산 서열(자연 발생적, 비자연 발생적, 또는 합성이든 관계 없이)을 의미하며, ORF는 5'에서 3' 방향으로 해독(또는 번역)된다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 암호화 영역의 전후 영역,(예컨대, 5' 비번역(5' UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러" 서열뿐만 아니라, 개별적인 암호화 단편(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는, 폴리펩티드 사슬을 생산하는 데 관여하는 DNA 단편을 의미한다. 유전자는 상업적으로 중요한 산업 단백질 또는 펩티드, 예컨대 효소(예컨대, 프로테아제, 만나아제, 자일라나아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 셀룰라아제, 옥시다아제, 리파아제 등)를 암호화할 수 있다. 관심 유전자는 자연 발생적인 유전자, 돌연변이된 유전자 또는 합성 유전자일 수 있다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합"은 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터에 관하여 사용될 때, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었음을 의미하거나, 그 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유래함을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 그 세포의 천연(비-재조합) 형태 내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 천연 유전자가 발현되거나 전혀 발현되지 않는 조건 하에서 재조합되지 않았다면 비정상적으로 발현되는 천연 유전자를 발현한다.
용어 "벡터"는 하나 이상의 세포 유형으로 도입되는 핵산 서열을 수송하도록 설계된 폴리뉴클레오티드로서 본 설명에서 정의된다. 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 파지 또는 바이러스 입자, DNA 구성체, 카세트 등을 포함한다. 발현 벡터는 프로모터, 신호 서열, 암호화 서열 및 전사 종결자와 같은 조절 서열을 포함할 수 있다.
본 설명에 사용되는 바와 같은 "발현 벡터"는 적합한 숙주에서 단백질의 발현을 가져올 수 있는 적합한 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 암호화 서열을 포함하는 DNA 구성체를 의미한다. 이러한 제어 서열은 전사를 가져오는 프로모터, 전사를 제어하는 선택적인 오퍼레이터 서열, mRNA 상의 적합한 리보솜 결합 자리를 암호화하는 서열, 인핸서 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함할 수 있다.
본 설명에 사용되는 바와 같이, 용어 "분비 신호 서열"은, 더 큰 폴리펩티드의 구성요소로서, 그것이 합성되는 세포의 분비 경로를 통해 더 큰 폴리펩티드를 유도하는, 폴리펩티드(즉, "분비 펩티드")를 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다. 더 큰 폴리펩티드는 보통 분비 경로를 통한 수송 중에 분비 펩티드를 제거하기 위하여 절단된다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유도"는 "유도인자"(즉, 유도 기질)의 존재에 반응하여 현저하게 증가된 속도로 사상 진균 세포에서 관심 단백질(이하, "POI")의 합성을 가져오는 유전자의 증가된 전사를 지칭한다. "관심 유전자"(이하, "GOI") 또는 POI를 암호화하는 "관심 ORF"의 "유도"를 측정하기 위하여, 변이체 사상 진균 (숙주) 세포는 후보 유도 기질(유도인자)로 처리되고, 유도 기질(유도인자)로 처리하지 않은 모 사상 진균 (대조군, 비변형) 세포에 대해 비교된다. 따라서, (미처리) 모 (대조군) 세포는 100%의 상대적인 단백질 활성치를 부여받는데, 이때, 변이체 숙주 세포에서 POI를 암호화하는 GOI의 유도는, 활성치(즉, 대조군 세포에 대한)가 100% 초과, 110% 초과, 더욱 바람직하게는 150%, 더욱 바람직하게는 200 내지 500%(즉, 대조군에 비해 2 내지 5배 초과), 또는 더욱 바람직하게는 1000 내지 3000% 초과일 때, 달성된다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유도인자", "유도 기질"은 상호 교환적으로 사용되고, 사상 진균 세포로 하여금 유도 기질이 부존재한 경우에 생산하는 것보다 "증가된 양"의 폴리펩티드(예컨대, 효소, 수용체, 항체 등) 또는 기타 화합물/물질을 생산하게 하는 임의의 화합물을 지칭한다. 유도 기질의 예는 소포로오스, 락토오스, 겐티오비오스 및 셀룰로오스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유도성 먹이"는 사상 진균 세포에 공급되는 적어도 "유도 기질"을 포함하는 조성물로서, 이러한 유도성 먹이가 POI의 생산을 유도하는 것인, 조성물을 지칭한다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된" 또는 "정제된"은 핵산 또는 아미노산이 자연적으로 회합되어 있는 적어도 하나의 구성요소로부터 제거되는 핵산 또는 아미노산을 지칭한다.
본 설명에서 정의되는 바와 같이, 용어 "관심 단백질" 또는 "POI"는 사상 진균 세포에서 발현되는 것이 요망되는 폴리펩티드를 지칭한다. 그러한 단백질은 효소, 기질-결합 단백질, 표면 활성 단백질, 구조적 단백질 등일 수 있고, 높은 수준으로 발현될 수 있으며, 상업화의 목적을 위한 것일 수 있다. 관심 단백질은 내인성 유전자 또는 이종성 유전자(즉, 변이체 세포 및/또는 모 세포에 대해)에 의해 암호화될 수 있다. 관심 단백질은 세포 내에서 발현될 수 있거나 분비된 (세포 외) 단백질로서 발현될 수 있다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질" (및/또는 그의 각각의 복수 형태)은 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 임의의 길이의 중합체를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1문자 또는 3문자 코드가 본 설명에서 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 이 용어는 또한, 자연적으로 또는 개입에 의해(예컨대, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지(labeling) 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해) 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함)뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 변형도 포함하는 폴리펩티드가 이 정의 내에 또한, 포함된다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 기능적으로 및/또는 구조적으로 유사한 단백질은 "관련 단백질"인 것으로 간주된다. 그러한 단백질은 상이한 속 및/또는 종의 유기체, 또는 심지어 상이한 강의 유기체(예컨대, 세균 및 진균)로부터 유래할 수 있다. 관련 단백질은 또한, 1차 서열 분석에 의해 결정되거나, 2차 또는 3차 구조 분석에 의해 결정되거나, 면역학적 교차반응성에 의해 결정된 상동물(homolog) 또한, 포함한다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 어구 "실질적으로 활성이 없는" 또는 유사한 어구는 소정의 활성이 혼합물에서 검출 불가능하거나 혼합물의 의도된 목적을 방해하지 않는 양으로 존재함을 의미한다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유도체 폴리펩티드"는 N 말단 및 C 말단 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두에 대한 하나 이상의 아미노산의 부가, 아미노산 서열에서의 하나의 또는 다수의 상이한 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 치환, 단백질의 어느 하나 또는 양 말단에서의 또는 아미노산 서열에서의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 결실, 및/또는 아미노산 서열에서의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 삽입에 의해 단백질로부터 유래되거나 유래될 수 있는 단백질을 지칭한다. 단백질 유도체의 제조는 천연 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 변형, 그 DNA 서열로 적합한 숙주를 형질전환시키는 것, 및 변형된 DNA 서열을 발현시켜 유도체 단백질을 형성하는 것에 의해 달성될 수 있다.
관련(및 유도체) 단백질은 "변이체 단백질"을 포함한다. 변이체 단백질은 소수의 아미노산 잔기에서의 치환, 결실, 및/또는 삽입에 의해 기준/모 단백질(예컨대, 야생형 단백질)과 상이하다. 변이체 단백질과 모 단백질 사이에서 차이가 있는 아미노산 잔기의 수는 1개 이상, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개, 또는 그보다 많은 아미노산 잔기일 수 있다. 변이체 단백질은 기준 단백질과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 심지어 적어도 약 99%, 또는 그보다 많은 아미노산 서열 동일성을 공유할 수 있다. 변이체 단백질은 또한, 선택된 모티프, 도메인, 에피토프, 보존 영역 등에서 기준 단백질과 상이할 수 있다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상동성 단백질"은 기준 단백질과 비슷한 활성 및/또는 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 상동물은 반드시 진화론상으로 관련되어 있는 것은 아니다. 따라서, 이 용어는 상이한 유기체로부터 수득된 동일한, 유사한, 또는 상응하는 효소(들)(즉, 구조 및 기능면에서)을 포괄하고자 한 것이다. 일부 구현예에서, 기준 단백질과 유사한 4차, 3차 및/또는 1차 구조를 갖는 상동물을 확인하는 것이 바람직하다. 일부 구현예에서, 상동성 단백질은 기준 단백질과 유사한 면역학적 반응(들)을 유도한다. 일부 구현예에서, 상동성 단백질은 원하는 활성(들)을 갖는 효소를 생산하도록 유전자 조작된다.
서열 사이의 상동성 정도는 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 결정될 수 있다(예컨대, Smith and Waterman, 1981; Needleman and Wunsch, 1970; Pearson and Lipman, 1988; 위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신 주 매디슨 소재)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 프로그램; 및 Devereux et al., 1984 참조).
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 어구 "실질적으로 유사한" 및 "실질적으로 동일한"은 적어도 2개의 핵산 또는 폴리펩티드의 맥락에서, 전형적으로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 기준(즉, 야생형) 서열과 비교하여, 적어도 약 70% 동일성, 적어도 약 75% 동일성, 적어도 약 80% 동일성, 적어도 약 85% 동일성, 적어도 약 90% 동일성, 적어도 약 91% 동일성, 적어도 약 92% 동일성, 적어도 약 93% 동일성, 적어도 약 94% 동일성, 적어도 약 95% 동일성, 적어도 약 96% 동일성, 적어도 약 97% 동일성, 적어도 약 98% 동일성, 또는 심지어 적어도 약 99% 동일성 이상을 갖는 서열을 포함함을 의미한다. 서열 동일성은 표준적인 파라미터를 이용하여 BLAST, ALIGN, 및 CLUSTAL과 같은 공지된 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 단백질 또는 RNA를 암호화하거나 이의 발현을 유도하는 핵산을 지칭한다는 점에서 용어 "대립 형질"과 같은 것을 의미한다. 사상 진균의 발육 형태는 일반적으로 반수체이며, 따라서 소정의 유전자의 단일 카피(즉, 단일 대립 형질)는 소정의 표현형을 부여하기에 충분하다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형" 및 "천연형"은 상호 교환적으로 사용되고, 자연계에서 발견되는 것과 같은 유전자, 단백질, 진균 세포 또는 균주를 지칭한다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, "유전자의 결실"은 숙주 세포의 게놈으로부터의 유전자의 제거를 지칭한다. 유전자가 유전자의 암호화 서열에 바로 인접하게 위치하지 않은 제어 요소(예컨대, 인핸서 요소)를 포함하는 경우, 유전자의 결실은 암호화 서열, 및 선택적으로, 예를 들어, 프로모터 및/또는 종결자 서열을 포함하나 이에 한정되지 않는, 인접한 인핸서 요소의 결실을 지칭을 지칭한다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, "유전자의 파괴"는 숙주 세포에서 세포가 기능성 유전자 생성물, 예컨대, 단백질을 생산하는 것을 실질적으로 방지하는, 임의의 유전적 또는 화학적 조작, 즉, 돌연변이를 광범위하게 지칭한다. 예시적인 파괴 방법은 폴리펩티드-암호화 서열, 프로모터, 인핸서, 또는 또 다른 조절 요소를 포함하는 유전자의 임의의 부분의 완전 또는 부분 결실, 또는 이의 돌연변이 유발을 포함하며, 여기서 돌연변이 유발은 치환, 삽입, 결실, 역전, 및 이의 조합 및 변이를 포괄하고, 이 돌연변이 중 임의의 돌연변이는 기능 유전자 생성물의 생산을 실질적으로 방지한다. 유전자는 또한, RNAi, 안티센스, CRISPR/Cas9 또는 유전자 발현을 무효화하거나 감소시키거나 완화하는 임의의 기타 방법을 이용하여 파괴될 수 있다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 어구 "본 발명의 Ace3-L 단백질, Ace3-EL 및/또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 '유전자 변형'을 포함하는 변이체 [숙주] 세포"는 숙주 세포 내로 그러한 Ace3-L 단백질, Ace3-EL 및/또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 ace3 유전자 형태(또는 이의 ORF)를 포함하는 플라스미드 또는 염색체 통합 카세트를 도입(예컨대, 형질전환을 통해)하는 것을 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 모 진균 세포가 천연적으로 Ace3-L 단백질, Ace3-EL 및/또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 내인성 유전자 형태를 포함할 때와 같이, 어구 "Ace3-L 단백질, Ace3-EL 및/또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 '유전자 변형'을 포함하는 변이체 [숙주] 세포"는 천연/야생형 ace3 유전자 프로모터를 이종성 프로모터로 교체하는 것을 포함한다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, "호기성 발효"는 산소의 존재 하에서의 성장을 지칭한다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 배양액(cell broth)"은 액체/액침 배양물 중의 배지 및 세포를 집합적으로 지칭한다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 용어 "세포량(cell mass)"은 액체/액침 배양물에 존재하는 세포 구성요소(온전한 세포와 용해된 세포를 포함)를 지칭한다. 세포량은 건조 또는 습윤 중량으로 표현될 수 있다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, "기능성 폴리펩티드/단백질"은 효소 활성, 결합 활성, 표면 활성 등과 같은 활성을 보유하는 단백질로서, 그 활성을 무효화하거나 감소시키기 위하여 돌연변이화되었거나, 절단되었거나, 달리 변형되었거나 하지 않은 단백질이다. 기능성 폴리펩티드는 지정한 대로, 열에 안정적이거나 열에 불안정할 수 있다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, "기능성 유전자"는 활성 유전자 생성물, 전형적으로 단백질을 생산하기 위하여 세포 구성성분에 의해 사용될 수 있는 유전자이다. 기능성 유전자는 파괴된 유전자와는 반대되는 것으로, 파괴된 유전자는 활성 유전자 생성물을 생산하기 위하여 세포 구성성분에 의해 사용될 수 없거나 활성 유전자 생성물을 생산하기 위하여 세포 구성성분에 의해 사용되는 능력이 감소되도록 변형된 것이다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, "관심 단백질"은 액침 배양물 또는 사상 진균 세포에서 생산될 것이 요망되는 단백질이다. 일반적으로, 관심 단백질은 산업, 제약, 동물 건강, 및 식품 및 음료 용도를 위해 상업적으로 중요하므로, 대규모로 생산하는 것이 바람직하다. 관심 단백질은 사상 진균 세포에 의해 발현되는 무수한 다른 단백질과 구별되는데, 다른 단백질은 일반적으로 제품으로서 관심 대상이 아니고, 주로 배경 단백질 오염물질로 간주된다.
본 설명에서 사용되는 바와 같이, 변이체 세포에 의해 생산된 단백질의 양이 모 세포에 비해 적어도 5% 증가, 적어도 10% 증가, 적어도 15% 증가, 또는 그보다 많이 증가되는 경우, "변이체 진균 숙주 세포"는 "모 진균 세포"보다 "바이오매스 단위량당 실질적으로 더 많은 단백질"을 생산하며, 이때, 단백질의 양은 단백질 생산이 측정되는 세포의 총 바이오매스량에 대해 정규화되며, 바이오매스는 습윤 중량(예컨대, 세포 펠릿의 습윤 중량) 또는 건조 중량면에서 표현될 수 있다.
III. 셀룰라아제 발현 활성화 인자 3(ace3)
최근, 셀룰라아제/헤미셀룰라아제 생산이 "유도된"(즉, 상이한 유도 조성물; 예컨대, 소포로오스, 락토오스의 첨가를 통해) 트리코더마 레에세이 배양물로부터의 전사 프로파일링 데이터(Hakkinen et al., 2014)는 셀룰라아제 및 헤미셀룰로아제 유전자 발현의 추정상의 "조절인자"를 확인하기 위하여 조사되었고, 조절 단백질을 암호화하는 후보 유전자가 확인되었다. Hakkinen 등 (2014)은 이 후보 유전자를 유전자 식별번호 77513(이때, 유전자 식별번호는 T. 레에세이 데이터베이스 2.0에서와 동일함)을 확인하였고(Hakkinen et al. 도 2 및 표 2 참조), 후보 유전자를 "셀룰라아제 발현 활성화 인자 3(activator of cellulase expression 3)"(이하, "ace3")으로 명명하고, 암호화된 단백질(즉, 후보 전사 인자)을 "Ace3"이라 명명하였다. 더욱 상세하게는, Hakkinen 등 (2014)의 연구에서는 T. 레에세이 주 QM6a의 공개적으로 이용 가능한 게놈 서열(genome.jgi.doe.gov/Trire2/Trire2.home.html 참조)에 기초하여 예상 ace3 ORF(서열 번호 2)를 이용하였는데, 이때, QM6a 예상 주석(유전자 식별번호 77513)은 2개의 엑손과 1개의 인트론으로 구성된다(예컨대, 도 1 참조).
본 설명에서 기술되고, 아래 실시예 섹션에 추가로 기재되는 바와 같이, 본 발명의 출원인들은 T. 레에세이 "RUT-C30 주" 주석을 기반으로 한 ace3 ORF에 대한 Hakkinen 등에 기술된(즉, Ace3의 T. 레에세이 "QM6a 주" 주석을 기반으로 한) 클로닝된 ace3 ORF를 비교 및 평가하였을 때, 놀랍고 예상치 못한 결과를 발견하였다. 예를 들어, 아래 실시예 1에 기재된 바와 같이, 서열 번호 1의 T. 레에세이 "QM6a 주" ace3 유전자(및 서열 번호 2의 ORF)는, 서열 번호 6의 더 긴 Ace3 단백질(이하, 본 설명에서 "Ace3-L"로 지칭됨)을 암호화하는 서열 번호 4의 T. 레에세이 "RUT-C30 주" ace3 유전자(또는 서열 번호 5의 ORF)에 비해, 서열 번호 3의 더 짧은 Ace3 단백질(이하, 본 설명에서 "Ace3-S"으로 지칭됨)을 암호화한다.
대조적으로, T. 레에세이 주 Rut-C30의 공개적으로 이용 가능한 게놈 서열(genome.jgi.doe.gov/TrireRUTC30_1/TrireRUTC30_1.home.html 참조)(유전자 식별번호 98455)로부터 예측된 ace3 ORF는 세 개의 엑손과 두 개의 인트론을 포함하는 더 긴 단백질 서열(즉, T. 레에세이 QM6a로부터의 Ace3-S에 비해)을 포함한다(도 1a). 더욱 상세하게는, "RUT-C30" 모델에 의해 예측된 개시 코돈은 "QM6a" 모델에서의 그것의 상류에 위치해 있으며, C 말단에 넌센스 돌연변이가 있어(Poggi-Parodi et al., 2014), 더 긴 N 말단 서열과 더 짧은 C 말단 서열을 가져온다(예컨대, 도 1b 참조).
마찬가지로, 아래 실시예 6에 기술된 바와 같이, ace3 유전자 암호화 영역의 5' 말단의 위치가 명백하지 않아, 출원인은 본 설명에 기술된 바와 같이 ace3 유전자의 5' 말단을 더 조사하였다. 위에서 간략하게 언급된 바와 같이, DNA 서열이 동일하더라도, 합동 게놈 연구소(Joint Genome Institute, JGI)의 DNA 서열의 주석은 돌연변이 균주 Rut-C30과 야생형 균주 QM6a 사이에 차이가 있었다. QM6a 사례에서는, 암호화 영역의 5' 말단은 (도 11에 도시된 바와 같이) 엑손 3의 상류이자 인트론 2의 내부인 것으로 제시되었다. Rut-C30 사례에서는, 암호화 영역의 5' 말단은 엑손 2의 내부에 있다(도 11).
게놈 DNA 서열 및 추가적인 cDNA 서열의 추가적인 분석은 (도 11에 도시된 바와 같이) "엑손 1"과 "인트론 1"의 가능성 있는 존재를 시사하였다. 또한, Rut-C30의 ace3 암호화 영역의 3' 말단은 야생형 단리물 QM6a의 서열에 비해 미성숙 종결 코돈을 생성하는 돌연변이를 포함하였다(도 11). 따라서, 실시예 6에 기술된 바와 같이, 출원인은 도 12에 도시된 바와 같이 이렇게 상이한 가능성 있는 ace3 유전자 형태들의 과발현 효과를 조사하였다.
나아가, 아래의 실시예에 기재된 바와 같이, 출원인은 "pYL1", "pYL2", "pYL3" 및 "pYL4"(도 2a 내지 2d 플라스미드 맵 참조)라는 명칭의 네 개의 상이한 ace3 발현 벡터 중 하나로 T. 레에세이 세포를 형질전환시켜, Ace3-S 단백질(서열 번호 3) 및 Ace3-L 단백질(서열 번호 6)을 암호화하는 유전자를 구성하고(실시예 1) 시험하였다(실시예 2 내지 4). 더욱 구체적으로는(실시예 1), 이들 발현 벡터는 대장균(E. coli)에서의 복제 및 선택을 위해 세균의 ColE1 ori 및 AmpR 유전자를 갖는 벡터 백본을 함유한다. 또한, 이 발현 벡터(도 2a 내지 도 2d 참조)는 T. 레에세이 pyr2 선택 마커 및 그것의 천연 종결자 서열과 함께 ace3 ORF 암호화 서열(ace3-L 또는 ace3-S)에 작동 가능하게 연결된 이종성 T. 레에세이 프로모터 서열(즉, hxk1 또는 pki1의 프로모터)를 포함한다.
이후에, 생성된 안정적인 T. 레에세이 형질전환체(즉, 변이체 숙주 세포 A4-7, B2-1, C2-28 및 D3-1)를 "유도" 및 "비유도" 조건 모두에서 완효성(slow release) 미세적정 플레이트(srMTP)(실시예 2), 진탕 플라스크(실시예 3) 및 소규모 발효(실시에 4)에서 시험/스크리닝하였고, 배양 상청액을 수확하고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해 분석하였다(도 3 내지 도 5 참조). 이들 실시예에서 제시된 바와 같이, 시험한 숙주 세포 모두(즉, 모 세포, 변이체 A4-7, 변이체 B2-1, 변이체 C2-28 및 변이체 D3-1)는 유도 기질(즉, 소포로오스 또는 락토오스)의 존재 하에 다량의 단백질을 분비하였다. 이와 대조적으로, "글루코오스"가 유일한 탄소 공급원인, 유도 기질(즉, 소포로오스 또는 락토오스)의 부존재 하에서는, 오로지 ace3-L ORF를 발현하는 변이체 숙주 세포(즉, 변이체 A4-7 및 C2-28)만이 분비 단백질을 생산할 수 있었고, 모 (대조군) 세포와 ace3-S ORF를 발현하는 변이체 숙주 세포(즉, 변이체 B2-1 및 D3-1)는 임의의 검출 가능한 분비 단백질을 생산하지 않았다.
다른 구현예에서, 본 발명은 ace3-L(실시예 5) 발현 구성체의 발현을 추진하기 위하여 13종의 상이한 프로모터를 이용하는 "비유도" 조건 하에서의 증진된 단백질 생산을 추가로 증명한다. 예를 들어, 시험한 13종의 프로모터에는 (i) 포름아미다아제 유전자(rev3; 단백질 ID 103041) 프로모터(서열 번호 15), (ii) β-자일로시다아제 유전자(bxl; 단백질 ID 121127) 프로모터(서열 번호 16), (iii) 트랜스케톨라아제 유전자(tkl1; 단백질 ID 2211) 프로모터(서열 번호 17), (iv) 미지의 기능의 유전자(단백질 ID 104295) 프로모터(서열 번호 18), (v) 옥시도리덕타아제 유전자(dld1; 단백질 ID 5345) 프로모터(서열 번호 19), (vi) 자일라나아제 IV 유전자(xyn4; 단백질 ID 111849) 프로모터(서열 번호 20), (vii) α-글루쿠로니다아제 유전자(단백질 ID 72526) 프로모터(서열 번호 21), (viii) 아세틸 자일란 에스테라아제 유전자 1(axe1; 단백질 ID 73632) 프로모터(서열 번호 22), (ix) 헥소오스 키나아제 유전자(hxk1; 단백질 ID 73665) 프로모터(서열 번호 23), (x) 미토콘드리아 수송 단백질 유전자(dic1; 단백질 ID 47930) 프로모터(서열 번호 24), (xi) 올리고펩티드 수송 유전자(opt; 단백질 ID 44278) 프로모터(서열 번호 25), (xii) 글리세롤 키나아제 유전자(gut1; 단백질 ID 58356) 프로모터(서열 번호 26) 및 (xiii) 피루베이트 키나아제 유전자(pki1; 단백질 ID 78439) 프로모터(서열 번호 27)가 포함되었다. 표 3에 나타난 바와 같이, 모 T. 레에세이 세포는 소포로오스 유도인자의 존재 하에서만 분비 단백질을 생산하였다. 이와 대조적으로, 13종의 상이한 프로모터 중 임의의 하나로부터 추진된 Ace3-L을 포함하고 발현하는 변이체 (딸) T. 레에세이 세포는 유도 및 비유도 조건 둘 다에서 비슷한 양의 분비 단백질을 생산하였다. 또한, 실시예 5에서 기술된 바와 같이, T. 레에세이 모 균주 및 이의 형질전환체를 진탕 플라스크 실험 및 소규모 발효에서 추가로 시험하였다. 도 8에 나타난 바와 같이, 모 (대조군) T. 레에세이 세포는 소포로오스("Sop") 유도인자의 존재 하에서만 분비 단백질을 생산하였지만, 딸 균주 LT83은 유도("Sop") 및 비유도("Glu") 조건 둘 다에서 비슷한 양의 분비 단백질을 생산하였다. 마찬가지로, 도 9에 나타난 바와 같이, 모 (대조군) T. 레에세이 균주는 소포로오스 유도인자("Sop")의 존재 하에서만 분비 단백질을 생산하였지만, 딸 균주 LT83은 유도("Sop") 및 비유도("Glu") 조건 둘 다에서 비슷한 양의 단백질을 생산하였다.
본 발명의 실시예 6은 ace3 유전자의 서로 다른 가능한 형태의 과발현 효과에 대한 실험적 연구를 설명한다(예컨대, 위의 돌연변이 균주 Rut-C30 / 야생형 균주 QM6a 게놈 서열 주석 논의, 도 11 및 도 12 참조). 따라서, 도 12에 도시된 서로 다른 형태의 ace3을 T. 레에세이에서 과발현시켰는데, 이때, T. 레에세이 ace3 유전자를 위한 과발현 벡터는 T. 레에세이의 글루코아밀라아제 유전자좌(gla1)에서 ace3의 표적화된 통합을 가능하게 하도록 설계되었다. 따라서, 표 5에 제시된 구성체는 ace3 유전자의 상이한 형태를 가짐으로써 차이가 있다. 마찬가지로, 표 7의 균주를 탄소 공급원으로서 2% 락토오스 또는 2% 글루코오스를 함유하는 액체 배지 중에서 24-웰 미세적정 플레이트에서 성장시켰는데, 이때, 총 분비 단백질의 양을 두 배지(즉, 2% 락토오스 또는 2% 글루코오스) 중의 배양 상청액으로부터 측정하였고, ace3-L, ace3-EL 및 ace3-LN 형태(즉, RutC-30 C 말단 돌연변이 함유)의 과발현은 총 단백질의 생산을 향상시켰다(표 8). 탄소 공급원으로서 락토오스를 함유하는 배지에서, ace3 유전자의 모든 형태의 과발현은 총 단백질의 생산을 어느 정도 향상시켰으나, 향상 수준은 ace3 유전자의 ace3-L, ace3-EL 및 ace3-LN 형태를 과발현하는 균주에서 가장 높았다(표 8). 따라서, ace3 유전자의 ace3-L, ace3-EL 및 ace3-LN 형태를 과발현시킬 때 높은 수준의 분비 단백질은 "비유도 조건"(즉, 글루코오스가 탄소 공급원으로 사용되었을 때) 하에서 관찰됨은 분명하다.
본 발명의 실시예 7은 ace3 유전자좌에 천연 프로모터의 5' 영역 상류를 포함하는 DNA 단편, loxP가 측면에 있는 하이그로마이신 B-저항성 선택 가능한 마커 카세트 및 ace3 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에 작동 가능하게 융합된 관심 프로모터를 포함하는 단편을 융합시켜 제조된 프로모터 교체 구성체(도 6 참조)를 설명한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 프로모터 교체 구성체는 트리코더마 레에세이 세포 내의 내인성 ace3 유전자 프로모터를 대안적인 프로모터로 교체하는 데 사용된다.
본 발명의 실시예 8은 내인성 비-리그노셀룰로오스 관심 유전자 프로모터를 리그노셀룰로오스 관심 유전자 프로모터로 교체하는 것을 설명한다. 예를 들어, T. 레에세이 글루코아밀라아제 발현 구성체를 DNA 폴리뉴클레오티드 단편으로부터 조립하였는데, 이때, T. 레에세이 글루코아밀라아제를 암호화하는 ORF 서열이 5'(상류) T. 레에세이 cbh1 프로모터에 작동 가능하게 연결되었고, 3'(하류) T. 레에세이 cbh1 종결자에 작동 가능하게 연결되었으며, 이 구성체는 선택 가능한 마커로서 T. 레에세이 pyr2 유전자를 더 포함하였다. 변이체(딸) T. 레에세이 세포(즉, Ace3-L 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는)를 글루코아밀라아제 발현 구성체로 형질전환시키고, 배양 중에 T. 레에세이 글루코아밀라아제 효소를 분비할 수 있는 형질전환체를 식별하기 위하여 탄소 공급원으로서 글루코오스를 함유하는(즉, 소포로오스 또는 락토오스와 같은 유도 기질이 없는) 액체 배지에서 형질전환체를 선택하고 배양하였다. 도 10에 제시된 바와 같이, 모 T. 레에세이 세포는 글루코오스/소포로오스를 함유하는 합성 배지(유도 조건)에서 1,029 μg/mL의 글루코아밀라아제를 생산하였고, 글루코오스를 함유하는 합성 배지(비유도 조건)에서는 겨우 38 μg/mL의 글루코아밀라아제를 생산한 반면, dic1 프로모터로부터 추진된 ace3-L을 포함하는 변형된 (딸) 균주 "LT88"은 "유도"("Sop") 조건 하에서 (즉, 모 (대조군) 균주에 비해) 3배 더 많은 글루코아밀라아제를 생산하였고, "비유도"("Glu") 조건 하에서(즉, 모 (대조군) 균주에 비해) 2.5배 더 많은 글루코아밀라아제를 생산하였다. 따라서, 이러한 결과는 Ace3-L ORF를 포함하는 변형된 (딸) 세포는 유도인자의 부존재 하에서 세포 외 단백질을 생산할 뿐만 아니라, 이들 변이체 세포는 이러한 유도 조건 하에서 모 (대조군) T. 레에세이 세포보다 더 많은 총 단백질을 생산함을 증명한다.
실시예 9는 천연적으로 관련된 이종성 관심 유전자 프로모터의 리그노셀룰로오스 관심 유전자 프로모터로의 교체를 설명한다. 예를 들어, 부티옥셀라 종(Buttiauxella sp.) 피타아제를 암호화하는 ORF(즉, 이종성 GOI)는 T. 레에세이 cbh1 프로모터에 대해 5' 말단에서, 그리고 T. 레에세이 cbh1 종결자에 대해 3' 말단에서 작동 가능하게 연결되는데, 이때, DNA 구성체는 선택 가능한 마커를 더 포함한다. 변이체 T. 레에세이 세포(즉, Ace3-L 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는)를 피타아제 발현 구성체로 형질전환시키고, 배양 중에 부티옥셀라 피타아제 효소를 분비할 수 있는 형질전환체를 식별하기 위하여 탄소 공급원으로서 글루코오스를 함유하는(즉, 소포로오스 또는 락토오스와 같은 유도 기질이 없는) 액체 배지에서 형질전환체를 선택하고 배양하였다.
본 발명의 실시예 10은 천연 ace3 프로모터 교체 벡터의 구성을 설명하는데, 이때, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) cas9 유전자를 함유하였고, T. 레에세이 pki1 프로모터 하에 발현하였으며, 가이드 RNA는 U6 프로모터 하에 발현하였다. 예를 들어, cas9 매개성 ace3 프로모터 교체 벡터(pCHL760 및 pCHL761)를 T. 레에세이 모 세포 내로 형질전환시켰고, ace3 프로모터 교체된 균주의 기능성을 시험하기 위하여, 진탕 플라스크의 50 ml 액침 배양액 중에서 유도 기질(소포로오스)의 존재 및 부존재 하에서 세포를 성장시켰다. SDS-PAGE에서 보여지는 바와 같이, 모 세포(도 23, ID 1275.8.1)는 글루코오스/소포로오스(유도)와 비교하여 글루코오스를 함유하는 합성 배지(비유도)에서 훨씬 적은 분비 단백질을 생산하였다. 이와 대조적으로, 형질전환체 2218, 2219, 2220, 2222 및 2223은 유도 조건 및 비유도 조건 하에서 비슷한 양의 분비 단백질을 생산하여, hxk1 또는 dic1 프로모터를 보유하는(즉, ace3 유전자좌에서 천연 ace3 프로모터를 교체하는) 변이체 세포는 유도인자의 부존재 하에 세포 외 단백질을 생산하였음을 증명하였다.
따라서, 본 설명에서 고려되고 설명되는 바와 같이, 본 발명의 일부 양태는 1종 이상의 내인성 사상 진균 리그노셀룰로오스 분해 효소(즉, 셀룰로오스 분해 효소, 예컨대, 셀로비오하이드롤라아제, 자일라나아제, 엔도글루카나아제 등)의 생산을 대상으로 한다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 일부 구현예는 유도 기질의 완전한 부존재 하에서 본 발명의 변이체 숙주 세포(즉, Ace3-L 단백질, Ace3-EL 및/또는 Ace3-LN 단백질의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는 변이체 숙주 세포)에서의 이러한 내인성 효소의 생산을 대상으로 한다. 본 발명의 변이체 숙주 세포, 조성물 및 방법은 특히, 본 발명의 이러한 변이체 숙주 세포가 전술된 셀룰로오스 분해 효소를 생산하기 위하여 유도 기질을 필요로 하지 않는다는 사실 때문에(즉, 유도 기질의 존재 하에서만 이러한 셀룰로오스 분해 효소를 생산하는 모 세포와는 대조적으로), 이러한 셀룰로오스 분해 효소 생산비용을 상당히 감소시키는 데 있어서 특별한 효용이 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명은 유도 기질의 부존재 하에서 1종 이상의 내인성 관심 단백질 및/또는 유도 기질의 부존재 하에서 1종 이상의 이종성 관심 단백질을 발현/생산할 수 있는 변이체 진균 숙주 세포를 대상으로 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 변이체 진균 숙주 세포(즉, Ace3-L 단백질, Ace3-EL 및/또는 Ace3-LN의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는 진균 숙주 세포)는 내인성, 비-리그노셀룰로오스 관심 단백질 및/또는 이종성 관심 단백질을 발현하도록 더 변형된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 내인성 비-리그노셀룰로오스 관심 단백질을 암호화하는 유전자가 변이체 진균 숙주 세포에서 변형된다. 따라서, 일부 구현예에서, 내인성, 비-리그노셀룰로오스 관심 단백질을 암호화하는 유전자(또는 ORF)와 천연적으로 관련된 프로모터는 리그노셀룰로오스 단백질을 암호화하는 사상 진균 유전자로부터의 프로모터(예컨대, 비-리그노셀룰로오스 관심 단백질을 암호화하는 내인성 유전자에 작동 가능하게 연결된 5'-리그노셀룰로오스 유전자 프로모터)로 교체된다. 마찬가지로, 일부 다른 구현예에서, 본 발명의 변이체 진균 숙주 세포(즉, Ace3-L 단백질, Ace3-EL 및/또는 Ace3-LN의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는 진균 숙주 세포)는 이종성 관심 단백질을 발현하도록 변형된다. 따라서, 일부 다른 구현예에서, 이종성 관심 단백질을 암호화하는 유전자와 천연적으로 관련된 프로모터는 리그노셀룰로오스 단백질을 암호화하는 사상 진균 유전자로부터의 프로모터(예컨대, 이종성 관심 단백질을 암호화하는 이종성 유전자에 작동 가능하게 연결된 5'-리그노셀룰로오스 유전자 프로모터)로 교체된다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 모 사상 진균 세포로부터 유래된 변이체 사상 진균 세포를 대상으로 하는데, 이때, 변이체 세포는 모 세포에 비해 Ace-L 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하며, 이때, 암호화된 Ace3-L 단백질은 서열 번호 6의 Ace3-L 단백질에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 서열 번호 6에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 암호화된 Ace3 단백질은 마지막 4개의 C 말단 아미노산으로 "Lys-Ala-Ser-Asp"를 포함한다. 다른 구현예에서, 서열 번호 6에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 암호화된 Ace3 단백질은 서열 번호 6에 작동 가능하게 연결되며 이에 앞서는 서열 번호 98의 N 말단 아미노산 단편을 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, Ace-3 단백질은 서열 번호 12에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함한다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4, 서열 번호 11 또는 서열 번호 13에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 5, 서열 번호 101 또는 서열 번호 102에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
IV. 사상 진균 숙주 세포
본 발명의 일부 구현예에서, Ace3-L 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 ORF의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는 변이체 사상 진균 세포(즉, 모 사상 진균 세포로부터 유래된 사상 진균 세포)가 제공된다. 더욱 구체적으로, 일부 구현예에서, 변이체 사상 진균 세포(즉, 모 (대조군) 세포에 대한)는 서열 번호 6의 Ace3-L 단백질을 암호화하는 유전자(또는 ORF)의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 서열 번호 6의 Ace3-L 단백질을 암호화하는 유전자(또는 ORF)의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는 변이체 진균 세포는 유도 기질의 부존재 하에 적어도 1종의 내인성 관심 단백질을 생산할 수 있다. 다른 구현예에서, 이러한 서열 번호 6의 Ace3-L 단백질을 암호화하는 유전자(또는 ORF)의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는 변이체 진균 세포는 유도 기질의 부존재 하에 적어도 1종의 이종성 관심 단백질을 생산할 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명에서 조작 및 사용을 위한 사상 진균 세포는 자낭균 문, 페지조마이코티나 아문의 사상 진균, 특히 영양 균사 상태를 갖는 진균을 포함한다. 이러한 유기체는 상업적으로 중요한 산업 단백질 및 제약 단백질의 생산에 사용되는 사상 진균 세포를 포함하며, 이는 트리코더마 종, 아스퍼질러스 종, 푸사리움 종, 스케도스포륨(Scedosporium) 종, 페니실리움 종, 크리소스포륨(Chrysosporium) 종, 세팔로스포륨(Cephalosporium) 종, 탈라로마이세스(Talaromyces) 종, 게오스미티아(Geosmithia) 종, 마이셀리오프토라(Myceliophthora) 종 및 뉴로스포라 종을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 사상 진균은 트리코더마 레에세이(이전에는 트리코더마 롱기브라키아툼 및 하이포크레아 제코리나로 분류됨), 아스퍼질러스 니게르, 아스퍼질러스 푸미가투스(fumigatus), 아스퍼질러스 이타코니쿠스(itaconicus), 아스퍼질러스 오리재(oryzae), 아스퍼질러스 니두란스, 아스퍼질러스 테레우스(terreus), 아스퍼질러스 소재(sojae), 아스퍼질러스 자포니쿠스(japonicus), 스케도스포륨 프롤리피칸스(prolificans), 뉴로스포라 크라사, 페니실리움 푸니쿨로숨(funiculosum), 페니실리움 크리소게눔(chrysogenum), 탈라로마이세스(게오스미티아) 에메르소니이(emersonii), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 마이셀리오프토라 써모필라(thermophila) 및 크리소스포륨 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
V. 재조합 핵산 및 분자생물학
일부 구현예에서, 본 발명은 Ace3-L, Ace3-EL 또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 유전자 또는 ORF의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는 변이체 사상 진균 숙주 세포를 대상으로 한다. 위에서 기재된 바와 같이, 이러한 변이체 숙주 세포는 유도 기질의 부존재 하에서(즉, 비변형 모 (대조군) 세포와 대조적으로) 1종 이상의 관심 단백질을 생산할 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 Ace3-L, Ace3-EL 또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 유전자 또는 ORF를 포함하는 재조합 핵산을 대상으로 한다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 사상 진균 숙주 세포에서의 Ace3-L, Ace3-EL 또는 Ace3-LN 단백질의 생산을 위한 폴리뉴클레오티드 발현 카세트를 포함한다. 다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 발현 카세트는 발현 벡터 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 발현 벡터는 플라스미드이다. 다른 구현예에서, 재조합 핵산, 폴리뉴클레오티드 발현 카세트 또는 이의 발현 벡터는 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 11, 서열 번호 101, 서열 번호 13 또는 서열 번호 102에 대해 적어도 85% 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 재조합 핵산, 폴리뉴클레오티드 발현 카세트 또는 이의 발현 벡터는 서열 번호 6에 대하여 약 90% 서열 동일성을 포함하는 Ace3-L 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 다른 구현예에서, 재조합 핵산(또는 이의 폴리뉴클레오티드 발현 카세트 또는 이의 발현 벡터)는 1종 이상의 선택 가능한 마커를 더 포함한다. 사상 진균에 사용하기 위한 선택 가능한 마커는 alsl, amdS, hygR, pyr2, pyr4, pyrG, sucA, 블레오마이신 내성 마커, 블라스티시딘 내성 마커, 피리티아민 내성 마커, 클로리뮤론 에틸 내성 마커, 네오마이신 내성 마커, 아데닌 경로 유전자, 트립토판 경로 유전자, 티미딘 키나아제 마커 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 선택 가능한 마커는 pyr2이며, 조성물 및 이용 방법은 PCT 공개 제WO2011/153449호에 일반적으로 기재되어 있다. 따라서, 일부 구현예예서, 본 발명의 Ace3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구성체는 이에 작동 가능하게 연결된 선택 가능한 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 재조합 핵산, 폴리뉴클레오티드 구성체, 폴리뉴클레오티드 발현 카세트 또는 이의 발현 벡터는 Ace3-L, Ace3-EL 또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 유전자(또는 ORF)의 발현을 추진하는 이종성 프로모터를 포함한다. 더욱 상세하게는, 일부 구현예에서, 이종성 프로모터는 구성성 또는 유도성 프로모터이다. 특정 구현예에서, 이종성 프로모터는 rev3 프로모터, bxl 프로모터, tkl1 프로모터, PID104295 프로모터, dld1 프로모터, xyn4 프로모터, PID72526 프로모터, axe1 프로모터, hxk1 프로모터, dic1 프로모터, opt 프로모터, gut1 프로모터 및 pki1 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 이론 또는 작동 메커니즘에 의해 얽매이는 것을 바라지는 않지만, 본 설명에서는 글루코오스 제한 조건(즉, 과량의 글루코오스 농도에 비해) 하에서의 높은 발현 수준을 가져오는 rev3, bxl, tkl, PID104295, dld1, xyn4, PID72526, axe1, hxk1, dic1, opt, gut1 및 pki1과 같은 프로모터는 본 발명에서 특별한 효용성을 갖는다고 여겨진다. 따라서, 일부 구현예에서, 재조합 핵산(또는 폴리뉴클레오티드 구성체, 폴리뉴클레오티드 발현 카세트 또는 이의 발현 벡터)은 Ace3 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 대해 5'이며 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.
또 다른 구현예예서, 재조합 핵산(또는 폴리뉴클레오티드 구성체, 폴리뉴클레오티드 발현 카세트 또는 이의 발현 벡터)은 천연 ace3 종결자 서열을 암호화하는 핵산 서열을 더 포함한다. 따라서, 일부 구현예예서, 재조합 핵산(또는 폴리뉴클레오티드 구성체, 폴리뉴클레오티드 발현 카세트 또는 이의 발현 벡터)은 Ace3 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 대해 5'이며 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 Ace3 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 대해 3'이며 작동 가능하게 연결된 천연 ace3 종결자 서열(예컨대, 5'-Pro-ORF-Term-3', 여기서 "Pro"는 구성성 프로모터이고, "ORF"는 Ace3을 암호화하며, "Term"은 천연 ace3 종결자 서열이다)을 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, 사상 진균의 형질전환 및 진균 배양을 위한 표준 기술(이는 당업자에게 잘 알려져 있다)이 본 발명의 진균 숙주 세포를 형질전환하는 데 사용된다. 따라서, DNA 구성체 또는 벡터를 진균 숙주 세포 내로 도입하는 것은 형질전환, 전기천공법, 핵 미세주입법, 형질도입, 형질감염(예컨대, 리포펙션 매개 및 DEAE-덱스트린 매개 형질감염), 인산칼슘을 이용한 인큐베이션에 의한 DNA 침전, DNA-코팅된 미세발사체(microprojectile)를 이용한 고속 충격(bombardment), 유전자 총 또는 바이오리스틱 형질전환(biolistic transformation) 및 원형질 융합 등과 같은 기법을 포함한다. 일반적인 형질전환 기법은 당해 분야에 공지되어 있다(예컨대, Ausubel et al., 1987, Sambrook et al., 2001 및 2012, 그리고 Campbell et al., 1989 참조). 트리코더마에서의 이종성 단백질의 발현은 예를 들어, 미국 특허 제6,022,725호; 제6,268,328호; Harkki et al., 1991 및 Harkki et al., 1989에 기술되어 있다. 또한, 아스퍼질러스 균주의 형질전환에 대해서는 Cao et al. (2000)을 참조한다.
일반적으로, 트리코더마 종의 형질전환은 투과성 처리된 원형질 또는 세포를 통상적으로 105 내지 107/mL, 특히 2x106/mL의 밀도로 사용한다. 적절한 용액(예컨대, 1.2 M 솔비톨 및 50 mM CaCl2) 중의 이러한 원형질 또는 세포의 100 μL의 부피가 목적하는 DNA와 혼합된다. 일반적으로, 높은 농도의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 흡수(uptake) 용액에 첨가된다. 첨가제, 예컨대 디메틸 설폭시드, 헤파린, 스페르미딘, 염화칼륨 등이 또한, 형질전환을 촉진하기 위해 흡수 용액에 첨가될 수 있다. 다른 진균 숙주 세포에 대해 유사한 절차가 이용 가능하다. 예컨대, 미국 특허 제6,022,725호 및 제6,268,328호(이들 모두는 참조로 포함됨) 참조.
일부 구현예에서, 본 발명은 사상 진균 숙주 세포에 대해 내인성인 1종 이상의 관심 단백질(즉, 내인성 단백질은 Ace3-L의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는 본 발명의 변이체 진균 숙주 세포에 의해 생산됨)의 발현 및 생산을 대상으로 한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 사상 진균 숙주 세포에 대해 이종성인 1종 이상의 관심 단백질의 발현 및 생산을 대상으로 한다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 재조합 유전학 분야의 일상적인 기술에 의존한다. 본 발명의 일반적인 이용 방법을 개시하고 있는 기본 문서는 Sambrook et al., (2nd Edition, 1989); Kriegler (1990) 및 Ausubel et al., (1994)을 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, 관심 단백질을 암호화하는 이종성 유전자 또는 ORF는 사상 진균 (숙주) 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 이종성 유전자 또는 ORF는 전형적으로는 복제 및/또는 발현을 위해 사상 진균 (숙주) 세포 내로 형질전환되기 전에 중간 벡터 내로 클로닝된다. 이러한 중간 벡터는 예컨대, 플라스미드와 같은 원핵 벡터, 또는 셔틀 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 이종성 유전자 또는 ORF의 발현은 그것의 천연 프로모터의 제어 하에 있다. 다른 구현예에서, 이종성 유전자 또는 ORF의 발현은 이종성 구성성 프로모터 또는 이종성 유도성 프로모터일 수 있는 이종성 프로모터의 제어 하에 위치된다.
당업자는 자연(천연) 프로모터가 그것의 기능을 변화시키지 않고 1개 이상의 뉴클레오티드의 교체, 치환, 첨가 또는 제거에 의해 변형될 수 있음을 알고 있다. 본 발명의 실시는 프로모터에 대한 이러한 변경을 포괄하지만, 그에 의해 제한되지 않는다.
발현 벡터/구성체는 전형적으로 이종성 서열의 발현에 필요한 추가적인 요소 전부를 함유하는 전사 단위 또는 발현 카세트를 함유한다. 예를 들어, 전형적인 발현 카세트는 관심 단백질을 암호화하는 이종성 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 5' 프로모터를 함유하고, 전사체, 리보솜 결합 부위의 효율적인 폴리아데닐화 및 번역 종결에 필요한 서열 신호를 더 포함할 수 있다. 카세트의 추가적인 요소는 인핸서를 포함할 수 있고, 게놈 DNA가 구조적 유전자로서 사용되는 경우, 기능적 스플라이스 공여자 및 수용자 자리가 있는 인트론을 포함할 수 있다.
프로모터 서열 이외에도, 발현 카세트는 또한, 효율적인 종결을 제공하기 위하여 구조적 유전자의 하류에 전사 종결 영역을 함유할 수 있다. 종결 영역은 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 수득될 수 있거나 상이한 유전자들로부터 수득될 수 있다. 임의의 진균 종결자가 본 발명에서 기능성일 가능성이 있지만, 바람직한 종결자에는 트리코더마 cbhI 유전자로부터의 종결자, 아스퍼질러스 니두란스 trpC 유전자로부터의 종결자(Yelton et al., 1984; Mullaney et al., 1985), 아스퍼질러스 아와모리(awamori) 또는 아스퍼질러스 니게르(niger) 글루코아밀라아제 유전자(Nunberg et al., 1984; Boel et al., 1984) 및/또는 뮤코어 미에헤이(Mucor miehei) 카르복실 프로테아제 유전자(EPO 공개 제0215594호)가 포함된다.
세포 내로 유전자 정보를 수송하는 데 사용되는 구체적인 발현 벡터는 특별히 결정적이지는 않다. 진핵 또는 원핵 세포에서의 발현에 사용되는 통상적인 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 표준적인 박테리아 발현 벡터에는 박테리오파지 λ 및 M13뿐만 아니라, 플라스미드, 예컨대 pBR322 기반 플라스미드, pSKF, pET23D, 및 융합 발현 시스템, 예컨대 MBP, GST, 및 LacZ가 포함된다. 에피토프 태그, 예컨대, c-myc 또한, 편리한 단리 방법을 제공하기 위해 재조합 단백질에 부가될 수 있다.
발현 벡터에 포함될 수 있는 요소는 또한, 레플리콘, 재조합 플라스미드를 보유하는 박테리아의 선택을 허용하는 항생제 내성을 암호화하는 유전자, 또는 이종성 서열의 삽입을 허용하는 플라스미드의 비필수 영역 내 고유한 제한 부위일 수 있다. 선택된 특정한 항생제 내성 유전자가 결정적인 것은 아니다; 당해 분야에 공지된 임의의 여러 내성 유전자가 적합할 수 있다. 원핵생물 서열은 바람직하게는 트리코더마 레에세이에서 DNA의 복제 또는 통합을 방해하지 않도록 선택된다.
본 발명의 형질전환 방법은 사상 진균 게놈 내로의 형질전환 벡터의 전부 또는 일부의 안정적인 통합을 가져올 수 있다. 그러나 자가-복제성 염색체 외 형질전환 벡터의 유지를 가져오는 형질전환 또한, 고려된다.
여러 표준적인 형질감염 방법이 다량의 이종성 단백질을 발현하는 트리코더마 레에세이 세포주를 생산하는 데 이용될 수 있다. 트리코더마의 셀룰라아제 생산 균주 내로의 DNA 구성체의 도입을 위한 공개된 방법 일부에는 문헌 [Lorito, Hayes, DiPietro and Harman, 1993, Curr. Genet. 24: 349-356; Goldman, VanMontagu and Herrera-Estrella, 1990, Curr. Genet. 17:169-174; Penttila, Nevalainen, Ratto, Salminen and Knowles, 1987, Gene 6: 155-164], 아스퍼질러스의 경우, 문헌 [Yelton, Hamer and Timberlake, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474], 푸사리움의 경우, 문헌 [Bajar, Podila and Kolattukudy, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8202-8212], 스트렙토미세스의 경우, 문헌 [Hopwood et al., 1985, The John Innes Foundation, Norwich, UK] 및 바실루스의 경우, 문헌 [Brigidi, DeRossi, Bertarini, Riccardi and Matteuzzi, 1990, FEMS Microbiol. Lett. 55: 135-138]이 포함된다.
숙주 세포 내로 외래 뉴클레오타이드 서열을 도입하기 위한 임의의 널리 공지된 절차가 이용될 수 있다. 이에는 칼슘 포스페이트 형질감염, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 바이오리스틱(biolistics), 리포좀, 마이크로주사, 플라즈마 벡터, 바이러스 벡터 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 외래 유전 물질의 숙주 세포 내로의 도입을 위한 임의의 다른 공지된 방법의 이용이 포함된다(예컨대, 문헌 [Sambrook et al., 위 문헌] 참조). 미국 특허 제6,255,115호에 기재된 것과 같은 아그로박테리움-매개 형질감염 방법 또한, 이용된다. 이용된 특정한 유전자 조작 절차가 이종성 유전자를 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 적어도 하나의 유전자를 성공적으로 도입할 수 있기만 하면 된다.
발현 벡터가 세포 내로 도입된 후, 형질감염된 세포는 셀룰라아제 유전자 프로모터 서열의 제어 하에 유전자의 발현을 선호하는 조건 하에 배양된다. 대규모 배치의 형질전환된 세포가 본 설명에 기술된 바와 같이 배양될 수 있다. 마지막으로, 표준적인 기술을 이용하여 배양물로부터 생성물이 회수된다.
따라서, 본 설명의 발명은, 발현이 자연 발생적인 셀룰라아제 유전자, 융합 DNA 서열 및 다양한 이종성 구성체를 포함하는 셀룰라아제 유전자 프로모터 서열의 제어 하에 있는, 원하는 폴리펩티드의 발현 및 증진된 분비를 위해 제공된다. 또한, 본 발명은 이러한 높은 수준의 원하는 폴리펩티드를 발현 및 분비하는 방법을 제공한다.
VI. 관심 단백질
위에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 일부 구현예는 (모 사상 진균 세포로부터 유래된 변이체 사상 진균 세포)를 대상으로 하는데, 이때, 변이체 세포는 (모 세포에 비해) Ace3-L, Ace3-EL 또는 Ace3-LN 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하며, 이때, 암호화된 Ace3-L, Ace3-EL 또는 Ace3-LN 단백질은 서열 번호 6의 Ace3-L 단백질에 대해 약 90% 서열 동일성을 포함하고, 변이체 세포는 유도 기질의 부존재 하에 적어도 1종의 관심 단백질(POI)을 발현한다.
본 발명의 일부 구현예는 유도 기질의 부존재 하에 단백질(즉, 관심 단백질)의 세포 내 및/또는 세포 외 생산을 증가시키는 데 특히 유용하다. 관심 단백질은 내인성 단백질(즉, 숙주 세포 내에서 내인성) 또는 이종성 단백질(즉, 숙주 세포에서 본래의 것이 아님)일 수 있다. 본 발명에 따라 생산될 수 있는 단백질은 호르몬, 효소, 성장 인자, 사이토카인, 항체 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 관심 단백질은 헤미셀룰라아제, 페록시다아제, 프로테아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 리파아제, 포스포리파아제, 에스테라아제, 큐티나아제, 펙티나아제, 케라티나아제, 리덕타아제, 옥시다아제, 페놀 옥시다아제, 리폭시게나아제, 리그니나아제, 풀루라나아제, 탄나아제, 펜토사나아제, 만나아제, β-글루카나아제, 히알루로니다아제, 콘드로이티나아제, 락카아제, 아밀라아제, 글루코아밀라아제, 아세틸 에스테라아제, 아미노펩티나아제, 아밀라아제, 아라비나아제, 아라비노시다아제, 아라비노푸라노시다아제, 카르복시펩티다아제, 카탈라아제, 데옥시리보뉴클레아제, 에피머라아제, α-갈락토시다아제, β-갈락토시다아제, α-글루카나아제, 글루칸 라이사아제, 엔도-β-글루카나아제, 글루코오스 옥시다아제, 글루쿠로니다아제, 인버타아제, 이소머라아제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일정 구현예에서, 관심 단백질은 PCT 출원 공개 제WO03/027306호, 제WO200352118호, 제WO200352054호, 제WO200352057호, 제WO200352055호, 제WO200352056호, 제WO200416760호, 제WO9210581호, 제WO200448592호, 제WO200443980호, 제WO200528636호, 제WO200501065호, 제WO2005/001036호, 제WO2005/093050호, 제WO200593073호, 제WO200674005호, 제WO2009/149202호, 제WO2011/038019호, 제WO2010/141779호, 제WO2011/063308호, 제WO2012/125951호, 제WO2012/125925호, 제WO2012125937호, 제WO/2011/153276호, 제WO2014/093275호, 제WO2014/070837호, 제WO2014/070841호, 제WO2014/070844호, 제WO2014/093281호, 제WO2014/093282호, 제WO2014/093287호, 제WO2014/093294호, 제WO2015/084596호 및 제WO2016/069541호에 개시된 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
단백질 합성을 위한 최적 조건은 숙주 세포의 선택 및 발현되는 단백질(들)의 선택에 따라 달라질 것이다. 이러한 조건은 통상적인 실험 및/또는 최적화를 통해 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
관심 단백질은 발현 후 정제 또는 단리될 수 있다. 관심 단백질은 어떤 다른 구성성분들이 샘플에 존재하는지에 따라 당업자에 공지된 다양한 방법으로 단리 또는 정제될 수 있다. 표준적인 정제 방법은 전기천공 기술, 분자적 기술, 면역학적 기술 및 이온 교환, 소수성, 친화도 및 역상 HPLC 크로마토그래피를 포함한 크로마토그래피 기술, 및 크로마토포커싱을 포함한다. 예를 들어, 관심 단백질은 표준적인 관심 항-단백질 항체 컬럼을 이용하여 정제될 수 있다. 단백질 농도와 함께, 한외여과 및 정용여과 또한, 유용하다. 필요한 정제도는 관심 단백질의 목적했던 용도에 따라 다를 것이다. 일부 예에서, 단백질의 정제는 전혀 필요하지 않을 것이다.
일부 다른 구현예에서, 본 발명의 유전자 변형된 진균 세포(즉, ace3-L의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는 변이체 진균 숙주 세포)가 증가된 수준의 관심 단백질을 생산할 수 있는 능력이 있음을 확인하기 위하여, 다양한 스크리닝 방법이 수행될 수 있다. 발현 벡터는 검출 가능한 표지로서 작용하는 표적 단백질에 융합된 폴리펩티드를 암호화할 수 있거나, 표적 단백질 그 자체가 선택 가능한 또는 스크리닝 가능한 마커로서 작용할 수 있다. 표지된 단백질은 웨스턴 블로팅, 도트 블로팅(콜드 스프링 하버 프로토콜즈(Cold Spring Harbor Protocols) 웹사이트에서 이용 가능한 방법), ELISA를 통해, 또는 표지가 GFP인 경우 전체(whole) 세포 형광 또는 FACS를 통해 검출될 수 있다. 예컨대, 6-히스티딘 태그가 표적 단백질에 대한 융합체로서 포함되며, 이 태그는 웨스턴 블로팅에 의해 검출된다. 표적 단백질이 충분히 높은 수준으로 발현되는 경우, 쿠마시/은(Coomassie/silver) 염색과 결합된 SDS-PAGE가 모 (대조군) 세포에 비해 변이체 숙주 세포 발현에서의 증가를 검출하기 위해 수행될 수 있으며, 이러한 경우에는 표지가 필요치 않다. 또한, 향상된 수준의 관심 단백질을 확인하기 위해 다른 방법들, 예컨대 세포 당 단백질 활성 또는 양, 배양 또는 발효가 더 오랜 기간 동안 효율적으로 지속되도록 하는, 배지 밀리리터 당 단백질 활성 또는 양의 증가의 검출, 또는 이러한 방법들의 조합이 사용될 수 있다.
비 생산성(specific productivity)의 검출은 단백질 생산을 평가하는 또 다른 방법이다. 비 생산성(Qp)은 다음 식에 의해 결정될 수 있다:
Qp = gP/gDCW·hr
여기서, "gP"는 탱크에서 생산된 단백질의 그램이고, "gDCW"는 탱크 내 건조 세포 중량(DCW)의 그램이고, "hr"은 접종 시점으로부터의 발효 시간(hour)으로서, 이는 생산 시간 및 성장 시간을 포함한다.
일부 구현예에서, 변이체 진균 숙주 세포는 (비변형) 모 세포에 대하여 비교하여, 관심 단백질을 적어도 약 0.5%, 예컨대 적어도 약 0.5%, 적어도 약 0.7%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.5%, 적어도 약 2.0%, 적어도 약 2.5%, 또는 심지어 적어도 약 3% 이상으로 생산할 수 있다.
VII. 발효
일부 구현예에서, 본 발명은 변이체 진균 세포를 발효시키는 단계를 포함하는, 관심 단백질의 생산 방법을 제공하는데, 이때, 변이체 진균 세포는 관심 단백질을 분비한다. 일반적으로, 당해 분야에 잘 알려져 있는 발효 방법이 변이체 진균 세포를 발효시키는 데에 사용된다. 일부 구현예에서, 진균 세포는 배치 또는 연속 발효 조건 하에서 성장시킨다. 전통적인 배치식 발효는 배지의 조성이 발효 개시 시 설정되고, 발효 중에는 변경되지 않는 폐쇄 시스템이다. 발효 개시 시, 배지에 요망되는 유기체(들)가 접종된다. 이 방법에서는, 이러한 시스템에 임의의 구성요소를 추가하지 않고도 발효가 일어날 수 있다. 전형적으로, 배치식 발효는 탄소 공급원의 첨가와 관련하여 "배치"로서의 자격이 있으며, pH 및 산소 농도와 같은 인자를 제어하기 위한 시도가 종종 이루어진다. 배치식 시스템의 대사 산물 및 바이오매스 조성은 발효가 중단되는 시점까지 지속적으로 변화한다. 배치 배양 내에서, 세포는 정적인 유도기(lag phase)에서 고 성장 대수기(log phase)로 진행하고, 최종적으로 정지기(stationary phase)가 되어, 성장률이 감소하거나 중단된다. 처리되지 않는 경우, 정지기에 있는 세포는 결국 사멸한다. 일반적으로, 대수기에 있는 세포는 생산물의 대량 생산의 원인이 된다.
표준적인 배치식 시스템에 대한 적합한 변형은 "유가식 발효" 시스템이다. 전형적인 배치식 시스템의 이러한 변형에서는, 발효가 진행됨에 따라 기질이 증분 첨가된다. 유가식 시스템은 이화대사산물 억제가 세포의 대사를 저해할 가능성이 있을 때, 그리고 배지 중에 제한된 양의 기질이 있는 것이 바람직한 경우 유용하다. 유가식 시스템에서 실제 기질 농도를 측정하는 것은 어렵고, 따라서 pH, 용존 산소 및 폐가스, 예컨대 CO2의 분압과 같은 측정 가능한 인자의 변화에 기초하여 계산된다. 배치식 및 유가식 발효는 당해 분야에서 일반적이며 널리 공지되어 있다.
연속식 발효는 합성 발효 배지가 생물 반응기에 연속적으로 첨가되고, 동량의 조정 배지가 프로세싱을 위하여 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 연속식 발효는 일반적으로 배양물을 일정한 고밀도로 유지하는데, 이때 세포는 주로 대수기 성장에 있다. 연속식 발효는 세포 성장 및/또는 생성물 농도에 영향을 미치는 하나 이상의 인자의 조절을 허용한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 비율로 유지되고 다른 모든 파라미터는 적정 수준이 되도록 한다. 다른 시스템에서는, 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도를 일정하게 유지하면서, 성장에 영향을 미치는 다수의 인자를 계속 변경할 수 있다. 연속식 시스템은 정상 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 배지의 배출로 인한 세포 손실은 발효에서 세포 성장 속도와 균형을 이룰 것이다. 연속식 발효 공정을 위한 영양소 및 성장 인자를 조절하는 방법뿐만 아니라, 생성물 형성 속도를 최대화하기 위한 기법은 산업 미생물학 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 일부 구현예는 진균 배양을 위한 발효 절차와 관련이 있다. 셀룰라아제 효소의 생산을 위한 발효 절차는 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 셀룰라아제 효소는 배치식, 유가식 및 연속 순환식 공정을 포함한 고체 또는 액침 배양에 의해 생산될 수 있다. 배양은 일반적으로 수성 미네랄 염 배지, 유기 성장 인자, 탄소 및 에너지 공급원 물질, 분자 산소, 그리고 물론, 이용되는 사상 진균 숙주의 개시 접종원을 포함하는 성장 배지 중에서 달성된다.
탄소 및 에너지 공급원, 산소, 동화성 질소, 및 미생물 접종원 이외에도, 적절한 미생물 성장을 확실하게 하기 위하여, 미생물 전환 공정에서 세포에 의한 탄소 및 에너지 공급원의 동화를 최대화하기 위하여, 그리고 발효 배지에서 최대 세포 밀도로 최대 세포 수율을 달성하기 위하여, 적절한 양의 미네랄 영양소를 적당한 비율로 공급하는 것이 필수적이다.
수성 미네랄 배지의 조성은 당해 분야에 공지된 바와 같이, 부분적으로는 사용되는 미생물 및 기질에 따라, 넓은 범위에 걸쳐 달라질 수 있다. 미네랄 배지는 질소 이외에도, 적절한 양의 인, 마그네슘, 칼슘, 칼륨, 황, 및 나트륨을 적절한 가용성의 동화 가능한 이온 형태 및 조합된 형태로 포함해야 하고, 또한, 바람직하게는 일부 미량 원소, 예컨대, 구리, 망간, 몰리브덴, 아연, 철, 붕소, 및 요오드 등이 다시, 적절한 가용성의 동화 가능한 형태로 존재해야 하며, 모두 당해 분야에 공지된 바와 같다.
발효 반응은 미생물 종이 번성하는 식으로 성장하도록 돕는 데 효과적인, 적절한 산소 부분압으로 발효 용기의 내용물을 유지하도록 제공된, 분자 산소를 함유하는 기체, 예컨대, 공기, 산소가 풍부한 공기, 또는 심지어 실질적으로 순수한 분자 산소에 의해 필요한 분자 산소가 공급되는 호기성 과정이다.
발효 온도는 다소 달라질 수 있으나, 트리코더마 레에세이와 같은 사상 진균의 경우, 온도는 일반적으로 약 20°C 내지 40°C의 범위 내, 일반적으로 바람직하게는 약 25°C 내지 34°C의 범위 내일 것이다.
미생물은 또한, 동화 가능한 질소의 공급원을 요구한다. 동화 가능한 질소원은 임의의 질소를 함유하는 화합물 또는 미생물에 의한 대사 이용에 적합한 형태로 질소를 방출할 수 있는 화합물일 수 있다. 단백질 가수분해물과 같은 다양한 유기 질소원 화합물이 이용될 수 있지만, 통상 값싼 질소 함유 화합물, 예컨대 암모니아, 수산화암모늄, 우레아, 및 다양한 암모늄염, 예컨대 인산암모늄, 황산암모늄, 피로인산암모늄, 염화암모늄, 또는 다양한 기타 암모늄 화합물이 이용될 수 있다. 암모니아 기체 자체는 대규모 작업에 편리하며, 적당한 양으로 수성 발효물(발효 배지)을 통한 버블링에 의해 이용될 수 있다. 동시에, 이러한 암모니아는 또한, pH 제어를 돕기 위해 이용될 수 있다.
수성 미생물 발효물(발효 혼합물) 내 pH 범위는 약 2.0 내지 8.0의 예시적 범위 내에 있어야 한다. 사상 진균으로는, pH는 보통 약 2.5 내지 8.0의 범위 내이고; 트리코더마 레에세이로는, pH는 보통 약 3.0 내지 7.0의 범위 내이다. 미생물의 pH 범위에 대한 선호는 이용되는 배지에 어느 정도 의존적일 뿐만 아니라, 특정 미생물에도 의존적이며, 따라서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있는 바와 같이, 배지의 변화에 따라 다소 변화한다.
바람직하게는, 발효는 탄소 함유 기질이 제한 인자로서 제어될 수 있는 방식으로 수행되어, 탄소 함유 기질의 세포로의 양호한 전환을 제공하며 실질적인 양의 비전환 기질로 세포가 오염되는 것을 방지한다. 기질로의 세포 오염은 수용성 기질에 따른 문제는 아닌데, 임의의 잔존 미량물은 용이하게 세척되기 때문이다. 그러나 비수용성 기질의 경우 이는 문제가 될 수 있으며, 적합한 세척 단계와 같은 추가된 생성물 처리 단계를 필요로 한다.
위에 기술된 바와 같이, 이 수준에 도달하는 시간은 중요하지 않으며 특정 미생물 및 수행하는 발효 공정에 따라 다를 수 있다. 그러나 발효 배지 내 탄소원 농도 및 원하는 수준의 탄소원이 달성되었는지를 어떻게 결정하는지는 당해 분야에 잘 알려져 있다.
발효는 배치식 또는 연속식 작업으로서 수행될 수 있지만, 유가식 작업이 제어의 용이함, 생성물의 균일량 제조 및 모든 기기의 가장 경제적인 사용을 위해 많이 선호된다.
원하는 경우, 수성 미네랄 배지를 발효기에 공급하기 전에, 일부 또는 모든 탄소원 및 에너지원 물질 및/또는 일부 동화성 질소원, 예컨대 암모니아가 수성 미네랄 배지에 첨가될 수 있다.
반응기 내로 도입된 각각의 스트림은 바람직하게는 사전에 결정된 속도로, 또는 탄소 및 에너지 기질의 농도, pH, 용존 산소, 발효기로부터의 배출 기체 내 산소 또는 이산화탄소, 건조 세포 중량, 광 투과율에 의해 측정 가능한 세포 밀도 등과 같은 모니터링에 의해 결정할 수 있는 필요성에 따라, 제어된다. 다양한 물질의 공급 속도는, 탄소원 및 에너지원의 효율적 이용과 일치하여, 가능한 한 빠른 세포 성장 속도가 수득되도록, 기질 충전에 대해 가능한 한 높은 수율의 미생물 세포가 수득되도록, 달라질 수 있다.
배치식, 또는 바람직한 유가식 작업에서, 모든 기기, 반응기, 또는 발효 수단, 관(vessel) 또는 용기, 배관, 부수 순환 또는 냉각 장치 등은, 통상 약 121℃에서와 같은 스팀을 적어도 약 15분 동안 이용하여 초기에 멸균된다. 그런 다음, 멸균된 반응기에 산소를 포함한 모든 필요한 영양소 및 탄소를 함유하는 기질의 존재 하에 선택된 미생물의 배양물을 접종한다. 이용되는 발효기의 종류는 중요하지 않다.
발효 배양액으로부터의 (예컨대, 셀룰라아제) 효소의 수집 및 정제는 또한, 당업자에 공지된 절차에 의해 수행될 수 있다. 발효 배양액은 일반적으로 세포를 포함한 세포 잔해, 다양한 부유 고체 및 기타 바이오매스 오염물뿐만 아니라, 원하는 셀룰라아제 효소 생성물을 함유할 것이며, 이는 바람직하게는 당해 분야에 공지된 수단에 의해 발효 배양액으로부터 제거된다.
이러한 제거를 위한 적합한 방법은 통상적인 고체-액체 분리 기술, 예를 들어 원심분리, 여과, 투석, 미세여과, 회전 진공 여과, 또는 세포 불포함 여과액을 생산하는 기타 공지된 방법들을 포함한다. 한외여과, 증발 또는 침전과 같은 기술을 사용하여 결정화 전에 발효 배양액 또는 세포 불포함 여과액을 추가로 농축하는 것이 바람직할 수 있다.
상청액 또는 여과액의 단백질 성분을 침전시키는 것은 염, 예를 들어 황산암모늄을 이용하고, 다음으로 다양한 크로마토그래피 절차, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 또는 비슷한, 업계에서 인지된 절차에 의한 정제가 이어질 수 있다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 구현예를 나타내지만, 단지 예시로서 제공되는 것임을 이해해야 한다. 위의 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 다양한 용도 및 조건에 맞도록 본 발명을 다양하게 변경하고 변형할 수 있다. 이러한 변형은 또한, 청구된 발명의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
실시예 1
사상 진균 세포에서의 ace3 과발현의 생성
1A. 개요
본 실시예에서, ace3 유전자를 발현하는 변이체 트리코더마 레에세이 세포(즉, 예시적인 사상 진균)는 모 T. 레에세이 세포를 원형질체 형질전환을 이용하여 pyr2 유전자, 이종성 프로모터 및 ace3 유전자를 함유하는 핵산으로 형질전환시킴으로써 생성하였다. 도 1 및 도 2에 일반적으로 제시된 바와 같이, 두 개의 상이한 프로모터 및 두 개의 상이한 버전의 ace3 ORF(도 1; ace3-SC 및 ace3-L)로 네 가지의 상이한 조합을 이용하여 네 개의 상이한 ace3-발현 벡터를 구성하였다(도 2a 내지 2d). hxk1(헥소키나아제를 암호화하는 유전자) 및 pki1(피루베이트 키나아제를 암호화하는 유전자)의 프로모터를 선택하여 ace3의 구성성 발현을 추진하였으나, 당업자에 의해 다른 프로모터 또한, 사용 및 선택될 수 있다.
1B. 트리코더마 레에세이 숙주 세포
다음 실시예에 기재된 T. 레에세이 모 숙주 세포는 T. 레에세이 균주 RL-P37(NRRL 수탁번호 15709)로부터 유래되었는데, 이때, 문헌 [Sheir-Neiss and Montenecourt, 1984]에서 일반적으로 설명된 바와 같이, T. 레에세이 pyr2 유전자는 결실되었다.
1C. Ace3 발현 벡터의 구성
위의 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 기재된 바와 같이, Ace3은 최근에 유도 조건 하(즉, 락토오스의 존재 하)에서 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제 생산에 필요하다고 밝혀진 T. 레에세이 전사 인자이다(Hakkinen et al., 2014). 더욱 상세하게는, Hakkinen 등 (2014)은 T. 레에세이 주 QM6a의 공개적으로 이용 가능한 게놈 서열(genome.jgi.doe.gov/Trire2/Trire2.home.html 참조)에 기초하여 예상 ace3 ORF를 이용하였는데, 이때, QM6a 예상 주석(단백질 ID 77513)은 2개의 엑손과 1개의 인트론으로 구성된다(예컨대, 도 1 참조).
또한, T. 레에세이 주 Rut-C30의 공개적으로 이용 가능한 게놈 서열(genome.jgi.doe.gov/TrireRUTC30_1/TrireRUTC30_1.home.html 참조)(단백질 ID 98455)로부터 예측된 ace3 ORF는 세 개의 엑손과 두 개의 인트론을 포함하는 더 긴 단백질 서열(즉, T. 레에세이 QM6a로부터의 (짧은) ace3에 비해)을 포함한다(도 1). 더욱 상세하게는, "RUT-C30" 모델에 의해 예측된 개시 코돈은 "QM6a" 모델에서의 그것의 상류에 위치해 있으며, C 말단에 넌센스 돌연변이가 있어(Poggi-Parodi et al., 2014), 더 긴 N 말단 서열과 더 짧은 C 말단 단백질 서열을 가져온다(도 1).
본 실시예에서, (QM6a 주석을 기초로 하나, 단백질의 C 말단을 절단한 RUT-C30 넌센스 돌연변이를 포함하는) 짧은 ace3 ORF(Ace3-S) 및 (RUT-C30 주석을 기초로 한) 긴 ace3 ORF(Ace3-L) 둘 다를 클로닝하였다. 도 1에 기재된 바와 같이, 짧은 ace3(Ace3-S) 및 긴 ace3(Ace3-L) ORF는 둘 다 RUT-C30에서 발견되는 바와 같이, C 말단 넌센스 돌연변이를 포함한다(도 1). ace3 ORF의 발현을 추진하기 위해, 이종성 헥소오스 키나아제(hxk1) 프로모터 및 이종성 피루베이트 키나아제(pki1) 프로모터를 시험하였다.
따라서, 표준 분자생물학 절차를 이용하여, 4종의 Ace3-발현 벡터 pYL1, pYL2, pYL3 및 pYL4(도 2a 내지 2d)를 구성하였다. 이들 발현 벡터는 대장균에서의 복제 및 선택을 위해 세균의 ColE1 ori 및 AmpR 유전자를 갖는 벡터 백본을 함유한다. T. 레에세이 pyr2 선택 마커 이외에도, T. 레에세이 프로모터 서열(즉, hxk1 또는 pki1의 프로모터), 그리고 그것의 천연 종결자와 함께 ace3 ORF(ace3-L 또는 ace3-SC) 또한, 존재한다. T. 레에세이 프로모터 및 ace3 ORF를 Q5 고성능 DNA 폴리머라아제(뉴잉글랜드 바이오랩스) 및 아래 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 T. 레에세이 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켰다.
각 벡터를 위한 단편의 PCR 증폭에 사용된 구체적인 프라이머는 다음과 같이 나열된다. 벡터 pYL1을 구성하기 위하여, hxk1 프로모터를 프라이머 쌍 TP13(서열 번호 7) 및 TP14(서열 번호 8)를 이용하여 증폭시키고, Ace3-L ORF는 프라이머 TP15(서열 번호 9) 및 TP16(서열 번호 10)을 이용하여 증폭시키고, 벡터 백본은 프라이머 쌍 TP17(서열 번호 11) 및 TP18(서열 번호 12)을 이용하여 증폭시켰다. 플라스미드 pYL1의 완전한 서열은 서열 번호 21로서 제공된다.
벡터 pYL2를 구성하기 위하여, hxk1 프로모터를 TP13(서열 번호 7) 및 TP19(서열 번호 13)의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭시키고, Ace3-SC ORF는 프라이머 TP20(서열 번호 14) 및 TP16(서열 번호 10)을 이용하여 증폭시키고, 벡터 백본은 프라이머 쌍 TP17(서열 번호 11) 및 TP18(서열 번호 12)을 이용하여 증폭시켰다. 플라스미드 pYL2의 완전한 서열은 서열 번호 22로서 제공된다.
벡터 pYL3을 구성하기 위하여, pki1 프로모터를 TP21(서열 번호 15) 및 TP22(서열 번호 16)의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭시키고, Ace3-L ORF는 프라이머 TP23(서열 번호 17) 및 TP16(서열 번호 10)을 이용하여 증폭시키고, 벡터 백본은 프라이머 쌍 TP17(서열 번호 11) 및 TP24(서열 번호 18)을 이용하여 증폭시켰다. 플라스미드 pYL3의 완전한 서열은 서열 번호 23으로서 제공된다.
벡터 pYL4를 구성하기 위하여, pki1 프로모터를 TP21(서열 번호 15) 및 TP25(서열 번호 19)의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭시키고, Ace3-SC ORF는 프라이머 TP26(서열 번호 20) 및 TP16(서열 번호 10)을 이용하여 증폭시키고, 벡터 백본은 프라이머 쌍 TP17(서열 번호 11) 및 TP24(서열 번호 18)을 이용하여 증폭시켰다. 플라스미드 pYL4의 완전한 서열은 서열 번호 24로서 제공된다.
각 벡터를 위해, 위에 기술된 3개의 PCR 단편을 조립하고, 제조사의 프로토콜에 따라 깁슨 어셈블리 클로닝 키트(뉴잉글랜드 바이오랩스; 카탈로그 번호: E5510S)를 이용하여 NEB DH5α 컴피턴트 세포 내로 형질전환시켰다. 생성된 벡터를 생어(Sanger) 시퀀싱을 이용하여 시퀀싱하고, 그것들의 맵을 도 2a 내지 2d에 나타내었다.
1D. T. 레에세이의 형질전환
pYL1, pYL2, pYL3 및 pYL4의 발현 벡터를 PacI 효소(뉴잉글랜드 바이오랩스)를 이용하여 선형화하고, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개성 원형질체 형질전환(Ouedraogo et al., 2015; Penttila et al., 1987)에 의해 T. 레에세이 모 숙주 세포 내로 형질전환시켰다. 형질전환체를 보겔 최소 배지 아가 플레이트 상에서 성장시켜 pyr2 마커에 의해 획득된 우리딘 원영양성을 대상으로 선택하였다. 2회 연속하여 보겔 아가 플레이트에 옮겨 안정적인 형질전환체를 획득하였고, 그 후, 포자 현탁액의 희석액을 플레이팅하여 단일 콜로니를 획득하였다. pYL1, pYL2, pYL3 및 pYL4를 보유하는 변이체(즉, 변형된) 숙주 세포를 각각 변이체 A4-7, 변이체 B2-1, 변이체 C2-28 및 변이체 D3-1이라 명명하였다.
실시예 2
완효성 미세적정 플레이트(srMTP)에서의 단백질 생산
본 실시예는 비유도 조건 하에서 효소를 분비하는 형질전환체(실시예 1 참조)를 확인하는 데 사용되는 스크리닝법을 설명한다. 예를 들어, 실시예 1에서 획득된 안정적인 형질전환체를 완효성 미세적정 플레이트(slow release microtiter plate, srMTP)에서 시험하였다. 사용된 srMTP는 PCT 국제 공개 제WO2014/047520호에 기술된 바와 같이 제조된 20% 글루코오스(wt/wt) 또는 20% 락토오스(wt/wt)를 함유하는 24-웰 PDMS 엘라스토머 플레이트였다.
실시예 1에 기술된 모 T. 레에세이 숙주 세포와 변이체 T. 레에세이 숙주 세포를 "비유도" 조건 및 "유도" 조건 둘 다에서 시험하였다. "비유도 조건"에서는, 세포를 20% 글루코오스(wt/wt)를 함유하는 srMTP 중 2.5% 글루코오스(wt/vol)가 첨가된 합성 배지의 1.25 ml 액체 배양액에서 성장시켰다. "유도 조건"에서는, 세포를 20% 락토오스(wt/wt)를 함유하는 srMTP 중 2.5% 글루코오스/소포로오스(wt/vol)가 첨가된 합성 배지의 1.25 ml 액체 배양액에서 성장시켰는데, 여기서 소포로오스와 락토오스는 셀룰라아제 효소 발현을 위한 강력한 유도인자로서 작용한다.
글루코오스/소포로오스의 제조는 미국 특허 제US7,713,725호에 기술된 바와 같이 수행하였다. 9 g/L 카사미노산, 5 g/L (NH4)2SO4, 4.5 g/L KH2PO4, 1 g/L MgSO4·7H2O, 1 g/L CaCl2·2H2O, 33 g/L PIPPS 완충액(pH 5.5에서), 0.25 ml/L T. 레에세이 미량 원소를 포함하는 합성 배지를 PCT 국제 공개 제WO2013/ 096056호에 일반적으로 기술된 바와 같이 제조하였다. T. 레에세이 미량 원소는 191.41 g/l 시트르산.H2O, 200 g/L FeSO4·7H2O, 16 g/L ZnSO4·7H2O, 0.56 g/L CuSO4·5H2O, 1.2 g/L MnSO4·H2O 및 0.8 g/L H3BO3을 함유한다. 모든 srMTP를 280 rpm에서 계속하여 진탕하면서 대략 120시간 동안 28°C에서 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 후, 모든 배양물로부터의 상청액을 수확하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 이용하여 분석하였다. 동일한 부피의 배양 상청액을 90°C에서 15분 동안 환원 환경을 겪게 한 후, 로딩 염료를 첨가한 후, MOPS-SDS 완충액을 이용하여 4 내지 12% NuPage™(인비트로젠(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하였다. 겔을 SimplyBlue™(인비트로젠)으로 염색하고, 영상화하였다(도 3 참조).
도 3에 도시된 바와 같이, 시험한 숙주 세포 전부가 유도인자(즉, 배지 중의 소포로오스 및 srMTP 중의 락토오스)의 존재 하에 다량의 단백질을 분비하였다. 그러나 글루코오스가 유일한 탄소원인, 유도인자(즉, 소포로오스 또는 락토오스)의 부존재 하에서는, Ace3-L ORF를 발현하는 변이체 숙주 세포만이(즉, 변이체 A4-7 및 변이체 C2-28) 분비 단백질을 생산하였고, 모 숙주 세포 또는 Ace3-SC ORF를 발현하는 변이체 세포(즉, 변이체 B1-1 및 변이체 D3-1)는 PAGE의 검출 한계 이상으로 세포 외 단백질을 생산하지 않았다. 이 결과는 Ace3-L(즉, Ace3-S와는 대조적으로)은 T. 레에세이에서 유도인자 없이 단백질을 생산할 수 있음을 명백히 증명한다.
정제된 효소를 기준물질로서 이용하여 Zorbax C3 역상(RP) 분석에 의해 분비 단백질의 상대적인 농도를 결정하였다. 예를 들어, 위에 기술된 숙주 세포의 분비 단백질 프로파일을 이 방법을 이용하여 분석하였는데, 이때, 모든 숙주 세포(즉, 모 세포 및 변이체 세포)가 유도 조건 하에서는 비슷한 셀룰라아제 단백질 프로파일을 생성하였으며, 셀룰라아제는 대략 40% CBH1, 20% CBH2, 10% EG1 및 7%의 EG2로 구성되었음이 관찰되었다. 비유도 조건 하에서는, 셀룰라아제 효소는 모 세포 및 변이체 Ace3-S 발현 숙주 세포에서는 검출 미만이었다. 대조적으로, 놀랍게도 변이체 Ace3-L 발현 숙주 세포(즉, 변이체 A4-7 및 C2-28)는 유도 조건 하에서와 비슷한 비율의 셀룰라아제 효소를 생산하였음이 발견되었다.
간략하게는, 이 분석 방법은 다음과 같이 수행되었다: 상청액 샘플을 50 mM 아세트산 나트륨 완충액, pH 5.0 중에 희석시키고, 20 ppm EndoH를 첨가하여 탈글리코실화하고, 3시간 동안 37°C에서 인큐베이션시켰다. 10 μl 90% 아세토니트릴을 100 μL EndoH 처리 샘플에 첨가하고, 주입 전에 0.22 μm 필터를 통과시켰다. 애질런트(Agilent) Zorbax300 SB C3 RRHD 1.8um (2.1x100mm) 컬럼을 구비한 DAD 검출(애질런트 테크놀로지스) HPLC와 함께 애질런트 1290을 이용하였다. 컬럼은 전개 완충액(running buffer) A로서 밀리큐(MiliQ) 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA), 전개 완충액 B로서 아세토니트릴 중 0.07% TFA를 이용하여 1.0 mL/분의 유속으로 60˚C에서 작동시켰다. DAD 검출기는 4 nm 창과 함께, 220 nm 및 280 nm에서 작동시켰다. 주입 부피는 10 μL였다.
추가적으로, 변이체 Ace3-L 발현 숙주 세포는 글루코오스를 함유하는 srMTP 중에서 대략 20 내지 30% 총 세포 외 단백질을(즉, 락토오스를 함유하는 srMTP 중에서 생산된 총 세포 외 단백질과 비교하여) 생산하였음이 눈에 띄었다. 이러한 상대적으로 낮은 발현은 글루코오스를 함유하는 srMTP에서의 높은 글루코오스 공급 속도로 인한 것일 수 있다. 예를 들어, 가장 높은 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제 생산 속도는 종종 낮은 성장 속도에서 관찰된다는 점은 잘 확립되어 있다(Arvas et al., 2011). 그럼에도, srMTP 성장 분석법은 단백질 생산을 위한 안정적인 콜로니를 스크리닝하는, 상대적으로 고성능 분석법이었다.
종합하면, Ace3-L ORF를 발현하는 변이체 T. 레에세이 숙주 세포는 비록 낮은 단백질 생산 속도라도, 유도인자의 부존재 하에 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제를 생산할 수 있었다. 더욱 상세하게는, 이 낮은 생산 속도는 아래의 실시예 3 및 실시예 4에 나타난 바와 같이, 숙주 세포의 생산 능력보다는, srMTP 성장법과 관련이 있었다.
실시예 3
진탕 플라스크에서의 단백질 생산
위에서 제시된 srMTP 결과를 더 분석하고 검증하기 위하여, 모 숙주 세포 및 변이체 Ace3-L 발현 숙주 세포를 진탕 플라스크 내 50 mL 액침 배양액 중 유도인자 기질의 존재 및 부존재 하에서 성장시켰다. 더욱 구체적으로는, 모 T. 레에세이 숙주 세포, 변이체 A4-7 세포 및 변이체 C2-28 세포를 액침 (액체) 배양액 중에서 유도 조건(즉, 탄소원으로서 글루코오스/소포로오스) 및 비유도 조건(즉, 탄소원으로서 글루코오스) 하에서 성장시키고, 각각의 세포 외 (분비) 단백질 생산 수준을 비교하였다. 간략하게는, 각각의 숙주 세포(즉, T. 레에세이 모 숙주 세포, 변이체 A4-7 숙주 세포 및 변이체 C2-28 숙주 세포)의 균사를 바닥 칸막이가 있는 250-mL 엘렌마이어 플라스크 내의 50-mL의 YEG 배양액에 따로따로 첨가하였다. YEG 배양액은 5g/L 효모 추출물 및 22 g/L 글루코오스를 함유한다. 세포 배양물을 48시간 동안 성장시키고, 이어서 또 다른 24시간 동안 새로운 YEG 내로 계대배양하였다. 그런 다음, 이들 종 배양물을 바닥 칸막이가 있는 250 mL 진탕 플라스크 내의 1.5% 글루코오스(비유도 조건)가 첨가된 50 mL의 합성 배지, 또는 1.5% 글루코오스/소포로오스(유도 조건)가 첨가된 50 mL의 합성 배지 내로 접종하였다.
모든 진탕 플라스크를 200 rpm에서 계속하여 진탕하면서 28˚C에서 인큐베이션시켰다. 3일의 인큐베이션 후, 모든 세포 배양물로부터의 상청액을 수확하고, 위의 실시예 2에 기술된 바와 같이 PAGE를 이용하여 분석하였다. 상청액 중 총 단백질을 바이오라드(Bio-Rad) 시약(서모 사이언티픽(Thermo Scientific®); 카탈로그 번호: 23236) 및 표준물질로서 소 혈청 알부민(BSA)의 다섯 가지 희석액을 이용하여 595 nm에서 브래드포드 염료 결합 분석법으로 측정하였다. 글루코오스 농도를 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석으로 측정하였고, 3일간의 인큐베이션 후 어떠한 글루코오스도 배양물에서 검출되지 않았다.
도 4에 도시된 바와 같이, 모 (대조군) T. 레에세이 세포는 글루코오스/소포로오스를 함유하는 합성 배지(유도)에서는 464 μg/mL 총 분비 단백질을 생산하였고, 글루코오스를 함유하는 합성 배지(비유도)에서는 오로지 140 μg/L의 총 분비 단백질을 생산하였다. 이와 대조적으로, 변이체 A4-7 세포와 C2-28 세포는 유도 및 비유도 조건 하에서 비슷한 양의 분비 단백질을 생산하였는데, 둘 다 소포로오스(유도)를 이용한 모 (대조군) 세포에서 생산된 분비 단백질보다 더 많다. 따라서, 이러한 결과는 Ace3-L ORF를 보유하는 변형된 세포(즉, 변이체 A4-7 및 C2-28 세포)는 유도인자의 부존재 하에서 세포 외 단백질을 생산할 뿐만 아니라, 이들 변이체 세포는 이러한 유도 조건 하에서 모 (대조군) T. 레에세이 세포보다 더 많은 총 단백질을 생산함을 증명한다.
실시예 4
소규모 유가식 발효에서의 단백질 생산
본 실시예는 변이체 Ace3-L 발현 세포(즉, 변이체 A4-7 및 C2-28 세포)가 소규모 발효에서 유도인자 기질의 존재 및 부존재 하에서 비슷한 양의 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제 효소를 생산하였음을 보여준다. 더욱 상세하게는, 2L 생물반응기에서 시트르산 최소 배지 내의 종 배양물을 이용하여, 일반적으로 미국 특허 제7,713,725호에 기술된 바와 같이, T. 레에세이 발효를 수행하였다. 더욱 구체적으로는, 발효 중에, 모든 배양물로부터의 상청액을 상이한 시점에서 수확하고, 동일한 부피의 배양 상청액을 대상으로 PAGE 분석하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 모 (대조군) T. 레에세이 세포는 소포로오스 유도인자의 존재 하에서만 분비 단백질을 생산하였다. 이와 대조적으로, 변이체 A4-7 및 C2-28 세포(도 5)는 유도 및 비유도 조건 둘 다에서 비슷한 양의 단백질을 생산하였다.
실시예 5
Ace3 발현을 위한 이종성 프로모터
본 실시예는 ace3-L의 발현을 추진하는 13종의 상이한 프로모터를 이용한 "비유도" 조건 하에서의 증진된 단백질 생산을 증명한다. 더욱 상세하게는, 원형질체 형질전환을 이용하여, pyr2 유전자, 이종성 프로모터 및 ace3-L 유전자를 함유하는 텔로미어 벡터로 모 T. 레에세이 세포를 형질전환하여 ace3-L 유전자를 발현하는 T. 레에세이 세포를 생성하였다.
따라서, 13종의 T. 레에세이 프로모터가 ace3-L ORF의 발현을 추진하기 위하여 선택되었는데, 이때, 시험한 13종의 프로모터에는 (i) 포름아미다아제 유전자(rev3; 단백질 ID 103041) 프로모터(서열 번호 15), (ii) β-자일로시다아제 유전자(bxl; 단백질 ID 121127) 프로모터(서열 번호 16), (iii) 트랜스케톨라아제 유전자(tkl1; 단백질 ID 2211) 프로모터(서열 번호 17), (iv) 미지의 기능의 유전자(단백질 ID 104295) 프로모터(서열 번호 18), (v) 옥시도리덕타아제 유전자(dld1; 단백질 ID 5345) 프로모터(서열 번호 19), (vi) 자일라나아제 IV 유전자(xyn4; 단백질 ID 111849) 프로모터(서열 번호 20), (vii) α-글루쿠로니다아제 유전자(단백질 ID 72526) 프로모터(서열 번호 21), (viii) 아세틸 자일란 에스테라아제 유전자 1(axe1; 단백질 ID 73632) 프로모터(서열 번호 22), (ix) 헥소오스 키나아제 유전자(hxk1; 단백질 ID 73665) 프로모터(서열 번호 23), (x) 미토콘드리아 수송 단백질 유전자(dic1; 단백질 ID 47930) 프로모터(서열 번호 24), (xi) 올리고펩티드 수송 유전자(opt; 단백질 ID 44278) 프로모터(서열 번호 25), (xii) 글리세롤 키나아제 유전자(gut1; 단백질 ID 58356) 프로모터(서열 번호 26) 및 (xiii) 피루베이트 키나아제 유전자(pki1; 단백질 ID 78439) 프로모터(서열 번호 27)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 단백질 ID(PID) 번호는 genome.jgi.doe.gov/Trire2/Trire2.home.html로부터 온 것이다. 따라서, 위에 기술된 13종의 프로모터를 발현을 추진하기 위해 선택하였는데, 이의 유전자들은 일반적으로 글루코오스 농도가 높을 때 성장 동안 낮은 수준으로 발현되고, 글루코오스 농도가 낮을 때, 또는 소포로오스 유도 조건 하에 있을 때는 높은 수준으로 발현되기 때문이다.
아래 표 2는 13종의 프로모터 및 이의 발현 벡터를 요약한 것으로, 발현 벡터는 표준적인 분자생물학 절차를 이용하여 구성되었다. 더욱 상세하게는, 본 실시예에서 시험한 발현 벡터(표 2)는 대장균에서의 복제 및 선택을 위해 세균의 ColE1 ori 및 AmpR 유전자 및 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서의 복제 및 선택을 위해 2μ ori 및 Ura3 유전자를 함유하는 벡터 백본을 포함한다. 또한, T. 레에세이 텔로미어 서열("TrTEL"), T. 레에세이 pyr2 선택 마커, T. 레에세이 프로모터 서열 및 ace3-L ORF가 그것의 천연 종결자 서열과 함께 존재한다. dic1 프로모터를 함유하는 벡터 pYL8을 도시하는 대표적인 벡터 맵을 도 7에 나타내었다. 따라서, 나머지 벡터(예컨대, pYL9, pYL12 등)는 상이한 프로모터 서열을 제외하고는 도 7에 제시된 동일한 서열을 갖는다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개성 원형질체 형질전환(Ouedraogo et al., 2015; Penttila et al., 1987)에 의해 (비기능성 pyr2 유전자를 포함하는) T. 레에세이 모 숙주 균주 내로 발현 벡터를 삽입하였다(형질전환시켰다). 형질전환체를 보겔 최소 배지 아가 플레이트 상에서 성장시켜 pyr2 마커에 의해 획득된 우리딘 원영양성을 대상으로 선택하였다. 보겔 아가 플레이트 상에서의 2회 연속 이송에 이어서, 비선택적 PDA 플레이트 상에서의 2회 연속 성장 및 보겔 아가 플레이트 상에서의 1회로써 안정적인 형질전환체를 획득하였고, 그 후, 포자 현탁액의 희석액을 플레이팅하여 단일 콜로니를 획득하였다.
위에 기술된 모 T. 레에세이 숙주 세포와 형질전환된 (딸) T. 레에세이 숙주 세포를 "비유도" 조건 및 "유도" 조건 둘 다에서 시험하였다. 예를 들어, "비유도 조건"에서는, 세포를 보통의 24웰 미세적정 플레이트(MTP) 중 2.5% 글루코오스(wt/vol)가 첨가된 합성 배지의 1.25 ml 액체 배양액에서 성장시켰다. "유도 조건"에서는, 세포를 MTP 중 2.5% 글루코오스/소포로오스(wt/vol)가 첨가된 합성 배지의 1.25 ml 액체 배양액에서 성장시켰는데, 여기서 소포로오스는 셀룰라아제 효소 발현을 위한 강력한 유도인자로서 작용한다. 인큐베이션 후, 모든 배양물로부터의 상청액을 수확하고, 바이오라드 시약(서모 사이언티픽; 카탈로그 번호: 23236) 및 표준물질로서 소 혈청 알부민(BSA)의 다섯 가지 희석액을 이용하여 595 nm에서 브래드포드 염료 결합 분석법으로 총 분비 단백질을 측정하였다.
표 3에 나타난 바와 같이, 모 T. 레에세이 세포는 소포로오스 유도인자의 존재 하에서만 높은 수준의 분비 단백질을 생산하였다. 이와 대조적으로, 13종의 상이한 프로모터로부터 추진된 Ace3-L을 포함하고 발현하는 변이체 (딸) T. 레에세이 세포는 유도 및 비유도 조건 둘 다에서 비슷한 양의 분비 단백질을 생산하였다. 표 3에 나타난 바와 같이, 각각의 변형된 (딸) 균주에 대한 단백질 수준을 글루코오스/소포로오스(Glu/Sop) 유도 조건 하에서의 모 균주(LT4)에 의해 생산된 단백질 (농도)에 대한 비율로서 제시하였다.
추가적으로, 위에 기술된 T. 레에세이 모 균주 및 이의 형질전환체를 실시예 3에 일반적으로 기술된 바와 같이 진탕 플라스크 실험에서 추가로 시험하였다. 예를 들어, T. 레에세이 딸 균주 "LT83"의 대표적인 결과를 도 8에 나타내었는데, 이때, 딸 균주 LT83은 dic1 프로모터(서열 번호 28)로부터 추진된 ace3-L ORF를 포함한다. 도 8에 나타난 바와 같이, 모 (대조군) T. 레에세이 세포는 소포로오스("Sop") 유도인자의 존재 하에서만 분비 단백질을 생산하였지만, 딸 균주 LT83은 유도("Sop") 및 비유도("Glu") 조건 둘 다에서 비슷한 양의 분비 단백질을 생산하였다.
마찬가지로, 실시예 4에 일반적으로 기술된 바와 같이 소규모 발효를 수행하였다. 더욱 상세하게는, 도 9에 나타난 바와 같이, 모 (대조군) T. 레에세이 균주는 소포로오스 유도인자("Sop")의 존재 하에서만 분비 단백질을 생산하였지만, 딸 균주 LT83은 유도("Sop") 및 비유도("Glu") 조건 둘 다에서 비슷한 양의 단백질을 생산하였다.
실시예 6
T. 레에세이 ACE3 과발현 구성체의 클로닝
T. 레에세이의 게놈 서열이 합동 게놈 연구소(Joint Genome Institute, https://genome.jgi.doe.gov/)에서 공개적으로 이용 가능하더라도, ace3 암호화 영역의 5' 말단의 위치는 명백하지 않다. 예를 들어, DNA 서열이 동일하더라도, 돌연변이 균주 Rut-C30(genome.jgi.doe.gov/TrireRUTC30_1/TrireRUTC30_1.home.html)과 야생형 균주 QM6a(genome.jgi.doe.gov/Trire2/Trire2.home.html) 사이에서 합동 게놈 연구소의 DNA 서열의 주석은 차이가 있었다. QM6a 사례에서는, ace3 암호화 영역의 5' 말단은 도 11, 화살표 3으로 도시된 바와 같이, 엑손 3의 상류(5')이자 인트론 2의 내부인 것으로 제시되었다. Rut-C30 사례에서는, ace3 암호화 영역의 5' 말단은 엑손 2의 내부에 있다(도 11, 화살표 2). 게놈 DNA 서열 및 추가적인 cDNA 서열의 추가적인 분석은 도 11에 도시된 바와 같이 엑손 1과 인트론 1의 가능성 있는 존재를 시사하였다. 또한, Rut-C30의 ace3 암호화 영역의 3' 말단은 야생형 단리물 QM6a의 서열(도 11, 화살표 5)에 비해 미성숙 종결 코돈(도 11, 화살표 4)을 생성하는 돌연변이를 포함한다. 따라서, 본 실시예에서, ace3 유전자의 이러한 상이한 가능성 있는 형태들의 과발현 효과를 본 설명에 기술된 바와 같이 실험적으로 연구하였다(예컨대, 도 11, 도 12 및 도 13 내지 18 참조).
따라서, 도 12에 도시된 서로 다른 형태의 ace3을 T. 레에세이에서 과발현시켰는데, 이때, T. 레에세이 ace3 유전자를 위한 과발현 벡터는 T. 레에세이의 글루코아밀라아제 유전자좌(gla1)에서 ace3의 표적화된 통합을 가능하게 하도록 설계되었다. 더욱 상세하게는, 모든 플라스미드(벡터) 구성체에서, T. 레에세이 ace3 유전자를 T. 레에세이 dic1 프로모터의 제어 하에, 그리고 천연 ace3 종결자로 발현시켰다. 이 벡터는 T. 레에세이 형질전환체의 선택을 위해 그것의 천연 프로모터 및 종결자와 함께 pyr4 마커를 더 포함한다. pyr4 프로모터의 반복부를 포함시켜, gla1 유전자좌에서의 통합 이후에 pyr4 유전자의 제거를 가능하게 하였다. 대장균에서의 복제 및 증폭을 가능하게 하는 벡터 백본은 EcoRI-XhoI 소화 pRS426이었다(Colot et al., 2006). 표적화된 통합에 필요한 T. 레에세이 gla1 유전자좌의 5' 및 3' 플랭크, dic1 프로모터, 상이한 형태의 ace3 암호화 영역 및 종결자를 표 4에 제공된 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 생산하였다. 플랭킹 단편을 위한 주형은 야생형 T. 레에세이 QM6a로부터의 게놈 DNA였다(ATCC 수탁번호 13631).
dic1 프로모터, ace3 유전자 및 종결자의 경우, 주형은 이들 단편을 전달하는 초기의 플라스미드 pYL8(실시예 5 참조)이었다. 선택 마커(pyr4)는 초기 플라스미드로부터 NotI 소화로 획득하였다. 원하는 DNA 단편을 생성하는 데 사용된 PCR 프라이머를 표 4에 나타내었다. PCR 생성물 및 소화된 단편을 아가로스 겔 전기영동을 이용하여 분리하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 겔 추출 키트(퀴아젠(Qiagen))로 겔로부터 정확한 단편을 단리하였다. (WO2013/102674로 공개된) PCT/EP2013/050126에 기술된 바와 같이 효모 상동 재조합 방법을 이용하여 위에 기술된 단편들로 플라스미드를 구성하였다. 플라스미드를 효모로부터 구하여 대장균에 형질전환시켰다. 소수의 클론들을 선택하고, 플라스미드 DNA를 단리하고, 시퀀싱하였다. 플라스미드의 개요를 표 5에 제시하였다.
따라서, 표 5에 제시된 구성체는 ace3 유전자의 상이한 형태를 가짐으로써 차이가 있다. SC 형태는 엑손 3 및 4뿐만 아니라, 인트론 3도 포함하는 유전자의 짧은 형태이다(도 12 및 도 13, 서열 번호 7 참조). 더욱 상세하게는, 서열 번호 7의 SC 형태는 1,713bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 144 bp 엑손 4를 포함한다. SC 형태의 (3' 말단) C 말단(즉, 엑손 4)은 T. 레에세이 RutC-30 주와 동일한 돌연변이를 갖는다.
S 형태는 엑손 3 및 4뿐만 아니라, 인트론 3도 포함하나, 엑손 4의 (3' 말단) C 말단의 돌연변이는 없는 유전자의 짧은 형태이다(도 12 및 도 14, 서열 번호 1 참조). 더욱 상세하게는, S 형태는 1,713bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 177 bp 엑손 4를 포함한다. 이러한 형태들(즉, "SC" 및 "S") 둘 다에서, 번역 개시 코돈은 T. 레에세이 QM6a 주에 대해 주석 달린 바와 같이, 긴 인트론 2에 있고(도 12 참조), "SC" 및 "S" 형태 둘 다는 추정상의 DNA 결합 도메인에 대한 암호화 영역의 누락 부분이다.
L 형태는 엑손 2, 3 및 4뿐만 아니라, 인트론 2(긴 인트론) 및 인트론 3도 포함하는 유전자의 긴 형태이다(예컨대, 도 12 및 도 15, 서열 번호 4 참조). 더욱 상세하게는, L 형태는 258 bp 엑손 2, 423 bp 인트론 2, 1,635 bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 144 bp 엑손 4를 포함한다. "L" 형태의 (3' 말단) C 말단은 T. 레에세이 RutC-30 주와 동일한 돌연변이를 갖는다.
LC 형태는 엑손 2, 3 및 4뿐만 아니라, 인트론 2(긴 인트론) 및 인트론 3도 포함하는 유전자의 긴 형태이다(예컨대, 도 12 및 도 16, 서열 번호 9 참조). 더욱 상세하게는, LC 형태는 258 bp 엑손 2, 423 bp 인트론 2, 1,635 bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 177 bp 엑손 4를 포함한다. LC 형태는 C 말단의 돌연변이가 없다. "L" 및 "LC" 형태들 둘 다에서, 번역 개시 코돈은 Rut-C30 주에 대하여 JGI에서 주석 달린 바와 같이, 엑손 2 내에 있다.
EL 형태는 엑손 1, 2, 3 및 4뿐만 아니라, 인트론 1, 인트론 2(긴 인트론) 및 인트론 3도 포함하는 ace3 유전자의 매우 긴 버전이다(예컨대, 도 12 및 도 17, 서열 번호 11 참조). 더욱 상세하게는, EL 형태는 61 bp 엑손 1, 142 bp 인트론 1, 332 bp 엑손 2, 423 bp 인트론 2, 1,635 bp 엑손 3, 148 bp 인트론 3 및 144 bp 엑손 4를 포함한다. EL 형태의 (3' 말단) C 말단은 T. 레에세이 RutC-30 주와 동일한 돌연변이를 갖는다.
LN 형태는 엑손 2, 3 및 4뿐만 아니라, 인트론 3도 함유하나, 인트론 2는 결여된 유전자의 긴 형태이다(예컨대, 도 12 및 도 18, 서열 번호 13 참조). LN 형태의 (3' 말단) C 말단은 T. 레에세이 RutC-30 주와 동일한 돌연변이를 갖는다. 따라서, 위에 기술된 바와 같이, ace3의 L, LC, LN 및 EL 형태는 완전한 추정상의 DNA 결합 도메인을 암호화한다.
T. 레에세이 RL-P37 균주 내로의 형질전환
표 5에 제시된 플라스미드 전부를 MssI로 소화시켜 표적화된 통합을 위한 단편들을 방출하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 예를 들어, 도 19는 T. 레에세이의 형질전환에 사용된 대표적인 단편 내의 DNA 서열들의 배열을 보여주는 도해를 제공한다. 제조사의 프로토콜에 따라 겔 추출 키트(퀴아젠)를 이용하여 겔로부터 정확한 단편을 단리하였다. 대략 10 μg의 정제된 단편을 이용하여 T. 레에세이 RL-P37 주의 pyr4- 돌연변이체의 원형질체를 형질전환하였다. 원형질체의 제조 및 형질전환은 pyr4 선택을 이용하여 PCT 공개 제WO2013/102674호에 기술된 바와 같이 수행하였다.
형질전환체를 선택적 배지 플레이트에 스트리킹하였다. 표 6에 열거된 프라이머를 이용하여 PCR에 의한 정확한 통합을 위해 성장하는 클론들을 스크리닝하였다. 예상한 신호를 제공하는 클론들을 단일 세포 클론까지 정제하고, 표 6에 열거된 프라이머를 이용하여 PCR뿐만 아니라, 서던 블로팅(데이터 미도시)에 의해서도, 정확한 통합 및 클론 순도를 위해 다시 스크리닝하였다.
상이한 ace3 형질전환체의 배양
표 7의 균주들을 탄소원으로서 2% 락토오스 또는 2% 글루코오스를 함유하는 액체 배지 중에 24-웰 미세적정 플레이트에서 성장시켰다. 배지의 다른 구성요소들은 0.45% KH2PO4, 0.5% (NH4)2SO4, 0.1% MgSO4, 0.1% CaCl2, 0.9% 카사미노산, 0.048% 시트르산xH2O, 0.05% FeSO4x7H2O, 0.0003% MnSO4xH2O, 0.004% ZnSO4x7H2O, 0.0002% H3BO3 및 0.00014% CuSO4x5H2O였다. 100 mM PIPPS(칼바이오켐(Calbiochem))을 포함시켜 pH를 5.5로 유지시켰다.
80 % 습도의 인포스(Infors) HT 마이크로톤 진탕기에서 28℃ 및 800 RPM에서 배양을 수행하였다. 배양물의 샘플링을 3 내지 7일에 수행하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 바이오라드 단백질 분석을 이용하여 배양물 상청액으로부터 총 분비 단백질의 양을 측정하였다. 두 배지에서, RutC-30 C 말단 돌연변이가 있는 ace3 L, EL 및 LN 형태의 과발현은 총 단백질의 생산을 향상시켰다. 탄소 공급원으로서 락토오스를 함유하는 배지에서, ace3 유전자의 모든 형태의 과발현은 총 단백질의 생산을 어느 정도 향상시켰으나, 향상 수준은 ace3 유전자의 L, EL 및 LN 형태를 과발현하는 균주에서 가장 높았다. 높은 수준의 분비 단백질(표 8)은 글루코오스(즉, 비유도 조건)가 탄소원으로서 사용되었을 때 ace3 유전자의 L, EL 또는 LN 형태가 과발현된 형질전환체에서 관찰되었음은 분명하다.
실시예 7
내인성 Ace3 이종성 프로모터 녹인(knock-in)
ace3 유전자좌에서 천연 프로모터의 5' 영역 상류를 포함하는 DNA 단편, loxP가 측면에 있는 하이그로마이신 B-저항성 선택 가능한 마커 카세트, 및 ace3 오픈 리딩 프레임의 5' 말단에 작동 가능하게 융합된 관심 프로모터를 포함하는 단편을 융합시켜 프로모터 교체 구성체(도 6 참조)를 제조한다(예컨대, 국제 PCT 출원 일련번호 PCT/US2016/017113 참조, 이는 사상 진균에서의 사용을 위한 유전자/프로모터 교체 카세트를 추가로 설명한다).
따라서, 트리코더마 레에세이 세포는 위에 기술된 프로모터 교체 구성체로 형질전환되는데, 이때, 형질전환체는 단리되고, 게놈 DNA는 진단 PCR을 위해 추출되어 천연 ace3 유전자좌에서의 프로모터 교체 구성체의 상동 재조합을 확인한다. 이 방법을 이용하여, 천연 ace3 프로모터가 하이그로마이신-B 저항성 카세트 및 임의의 관심 프로모터에 의해 교체된 형질전환체가 확인될 수 있다. 이후, 하이그로마이신 B-저항성 카세트는 cre 리콤비나아제의 작용에 의해 제거된다(Nagy, 2000).
ace3 유전자좌에서의 상동 통합의 효율은 국제 PCT 공개 제WO2016/100272호, 제WO2016/100571호 및 제WO2016/100568호에 예시된 바와 같은 적절하게 설계된 가이드 RNA에 의해 천연 ace3 프로모터 내로 유도된 cas9의 작용에 의해 증진될 수 있다.
조건적 프로모터 교체(conditional promoter replacement, CPR) 전략은 Hu 등 (2007)의 발표에서 아스퍼질러스 푸미가투스에 대해 설명되었는데, Hu 등(2007)은 일반적으로 선택된 유전자의 내인성 프로모터를 결실시키고 교체하기 위하여 A. 푸미가투스 니이아(NiiA) 질소 조절 가능 프로모터(pNiiA)를 이용하는 전략을 설명하고 있다. 따라서, 일부 구현예예서, 트리코더마 레에세이에서 ace3 유전자의 내인성 프로모터를 대안적인 프로모터로 교체하기 위하여 유사한 방법이 이용될 수 있다.
실시예 8
내인성 비-리그노셀룰로오스 관심 유전자 프로모터의 리그노셀룰로오스 관심 유전자 프로모터로의 교체
트리코더마 레에세이 글루코아밀라아제 발현 구성체를 DNA 폴리뉴클레오티드 단편(예컨대, 미국 특허 제7,413,879호 참조)으로부터 조립하였는데, 이때, T. 레에세이 글루코아밀라아제를 암호화하는 ORF 서열이 5' (상류) T. 레에세이 cbh1 프로모터에 작동 가능하게 연결되었고, 3' (하류) T. 레에세이 cbh1 종결자에 작동 가능하게 연결되었다. 이 DNA 구성체는 선택 가능한 마커로서 T. 레에세이 pyr2 유전자를 더 포함하였다.
따라서, 본 발명의 변이체 (딸) T. 레에세이 세포(즉, Ace3-L 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는)가 글루코아밀라아제 발현 구성체로 형질전환되었다. 배양 중에 T. 레에세이 글루코아밀라아제 효소를 분비할 수 있는 형질전환체를 확인하기 위하여 탄소원으로서 글루코오스를 함유하는(즉, 소포로오스 또는 락토오스와 같은 유도 기질이 없는) 액체 배지에서 형질전환체를 선택하고 배양하였다.
따라서, T. 레에세이 글루코아밀라아제 발현 (모) 균주(대조군) 및 변형된 T. 레에세이(딸) 글루코아밀라아제 발현 균주(즉, Ace3-L ORF를 포함하고 발현하는)를 진탕 플라스크에서 성장시키고, 모든 세포 배양물로부터의 상청액을 수확하고, 위의 실시예 2와 실시예 3에 일반적으로 기술된 바와 같이, PAGE를 이용하여 분석하였다.
더욱 상세하게는, 도 10에 도시된 바와 같이, 모 T. 레에세이 세포는 글루코오스/소포로오스를 함유하는 합성 배지(유도 조건)에서 1,029 μg/mL의 글루코아밀라아제를 생산하였고, 글루코오스를 함유하는 합성 배지(비유도 조건)에서는 오로지 38 μg/mL의 글루코아밀라아제를 생산하였다. 이와 대조적으로, dic1 프로모터로부터 추진된 ace3-L을 포함하는 변형된 (딸) 균주 "LT88"은 "유도"("Sop") 조건 하에서 3배 더 많은(즉, 유도 조건 하의 모 (대조군) 균주에 비해) 글루코아밀라아제를 생산하였고, "비유도"("Glu") 조건 하에서 2.5배 더 많은(즉, 유도 조건 하의 모 (대조군) 균주에 비해) 글루코아밀라아제를 생산하거나 비유도 조건 하의 모 (대조군) 균주에 비해 "비유도"("Glu") 조건 하에서 67배 더 많은 글루코아밀라아제를 생산하였다. 따라서, 이러한 결과는 Ace3-L ORF를 포함하는 변형된 (딸) 세포는 유도인자의 부존재 하에서 세포 외 단백질을 생산할 뿐만 아니라, 이들 변이체 세포는 이러한 유도 조건 하에서도 모 (대조군) T. 레에세이 세포보다 더 많은 총 단백질을 생산함을 증명한다.
실시예 9
천연적으로 관련된 이종성 관심 유전자 프로모터의 리그노셀룰로오스 관심 유전자 프로모터로의 교체
피타아제 발현 구성체를 다음과 같이 DNA 폴리뉴클레오티드 단편으로부터 조립하였다(예컨대, 미국 특허 제8,143,046호 참조). 부티옥셀라(Buttiauxella) 종 피타아제를 암호화하는 ORF가 5' 말단에서 T. 레에세이 cbh1 프로모터에, 그리고 3' 말단에서 T. 레에세이 cbh1 종결자에 작동 가능하게 연결된다. 이 DNA 구성체는 선택 가능한 마커인 아스퍼질러스 니두란스 amdS 유전자를 더 포함한다. 변이체 T. 레에세이 세포(즉, Ace3-L 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전자 변형을 포함하는)가 피타아제 발현 구성체로 형질전환된다. 배양 중에 부티옥셀라 피타아제 효소를 분비할 수 있는 형질전환체를 확인하기 위하여 탄소원으로서 글루코오스를 함유하는(즉, 소포로오스 또는 락토오스와 같은 유도 기질이 없는) 액체 배지에서 형질전환체를 선택하고 배양한다.
실시예 10
천연 ace3 프로모터 교체 벡터의 구성
본 실시예에서는, 표준적인 분자생물학 절차를 이용하여 두 개의 ace3 프로모터 교체 벡터 pCHL760 및 pCHL761을 구성하였다. 벡터 백본 pMCM3282(도 20)는 대장균에서의 복제 및 선택을 위하여 pMB1 ori 및 AmpR 유전자를 함유하였다. 또한, N. 크라사(crassa) cpc1 프로모터 및 A. 니두란스(nidulans) trpC 종결자 하에서 발현된, 트리코더마 레에세이를 위한 hph 하이그로마이신 선택 마커가 포함되었다. 프로모터 교체를 위해, 벡터는 옥수수를 위해 코돈 최적화된 스트렙토코커스 피오게네스 cas 9를 함유하였고, T. 레에세이 pki1 하에서 발현하였으며, 가이드 RNA는 U6 프로모터 하에서 발현하였다(예컨대, PCT 공개 제WO2016/100568호 및 제WO2016/100272호 참조).
따라서, pMCM3282를 EcoRV로 소화시키고, ace3 천연 프로모터를 교체하는 T. 레에세이 hxk1 또는 dic1 프로모터 영역의 측면에 있는 T. 레에세이 ace3 유전자좌로부터 대략 1kb의 5' 및 3' 상동성 서열을 갖는 3개의 단편을 깁슨 어셈블리에 의해 pMCM3282/EcoRV로 클로닝하여 pCHL760(도 21) 및 pCHL761(도 22)가 얻어졌다.
hxk1 또는 dic1 프로모터와 함께, 5' 및 3' ace3 상동성 서열을 Q5 고성능 DNA 폴리머라아제(뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 및 아래 표 9에 기재된 프라이머를 이용하여 T. 레에세이 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시켰다.
더욱 상세하게는, 각 벡터를 위한 단편의 PCR 증폭에 사용된 구체적인 프라이머는 다음과 같이 나열된다. pCHL760을 구성하기 위하여, 5' 상류 상동성 영역을 프라이머 쌍 CL1840 및 CL1791을 이용하여 증폭시켰고, 3' 하류 상동성 영역을 프라이머 CL1794 및 CL1831을 이용하여 증폭시켰고, dic1 프로모터를 프라이머 쌍 CL1792 및 CL1793을 이용하여 증폭시켰다.
pCHL761을 구성하기 위하여, 5' 상류 상동성 영역을 프라이머 쌍 CL1840 및 CL1800을 이용하여 증폭시켰고, 3' 하류 상동성 영역을 프라이머 CL1803 및 CL1831을 이용하여 증폭시켰고, hxk1 프로모터를 프라이머 쌍 CL1801 및 CL1802를 이용하여 증폭시켰다.
벡터 pMCM3282(도 20)는 5'에서 3' 방향으로 T. 레에세이 U6 프로모터, 대장균 ccdB 카세트, 및 U6 유전자로부터의 인트론을 포함하는, Cas9 결합에 관여하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 구조적 영역을 포함한다. ccdB 카세트를 트리코더마 ace3 유전자 내의 다섯 개의 상이한 표적 부위에 특이적인 서열들로 교체하였다. 최종 ace3 프로모터 교체 벡터를 구성하기 위한 가이드 RNA 서열의 pCHL760(도 21) 및 pCHL761(도 22) 내로의 삽입.
따라서, AarI 제한 부위가 있는, 표 10에 제시된 다음의 올리고뉴클레오티드를 상이한 sgRNA 서열의 생산을 위하여 설계하였다.
더욱 상세하게는, CL1821과 CL1822, CL1823와 CL1824, CL1825와 CL1826, CL1827과 CL1828, CL1829와 CL1830을 어닐링하여 이중 가닥 DNA를 생성하였고, 이를 개별적으로 IIS형 심리스 클로닝 방법을 이용하여 AarI 부위에서 pCHL760 및 pCHL761 내로 클로닝하였다. 정확하게 삽입된 가이드 RNA 서열이 있는 최종 플라스미드는 독성이 있는 ccdB 유전자를 잃었다.
T. 레에세이의 형질전환
pCHL760 및 pCHL761의 cas9 매개성 ace3 프로모터 교체 벡터를 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 매개성 원형질체 형질전환에 의해 T. 레에세이 모 세포 내로 형질전환시켰다. 하이그로마이신 저항성 형질전환체를 선택하기 위하여 하이그로마이신을 함유한 보겔 최소 배지 아가 상에 형질전환체를 성장시켰다. 이들 형질전환체 중 일부는 불안정하여 플라스미드를 흡수하였지만, 게놈 DNA 내로의 안정적인 통합은 없었다. 형질전환체를 보겔 비선택적 아가 배지로 옮겨 플라스미드 및 하이그로마이신-저항성 마커를 상실하게 하였다.
dic1 프로모터 교체 형질전환체를 스크리닝하기 위하여, 게놈 DNA를 추출하고, 프라이머 쌍 CL1858 및 CL1848(원하는 통합에 대한 예상 크기의 생성물은 2,412 bp였음), 그리고 CL1853 및 CL1818(원하는 통합에 대한 예상 크기의 생성물은 2,431 bp였음)(예컨대, 표 11 참조)을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이후, PCR 생성물을 DNA 시퀀싱으로 분석하여 원하는 프로모터 통합을 확인하였다.
hxk1 프로모터 교체 형질전환체를 스크리닝하기 위하여, 프라이머 쌍 CL1858 및 CL1898(원하는 통합에 대한 예상 크기의 생성물은 1,784 bp였음), 그리고 CL1853 및 CL1850(원하는 통합에 대한 예상 크기의 생성물은 2,178 bp였음)을 이용하여 PCR을 수행하였고, 이후 정확한 통합을 PCR 생성물에 대한 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다. 예컨대, 표 11 참조.
진탕 플라스크에서의 단백질 생산
ace3 프로모터 교체 균주의 기능성을 시험하기 위하여. 진탕 플라스크 내의 50 ml 액침 배양액에서 유도인자 기질(소포로오스)의 존재 및 부존재 하에서 세포를 성장시켰다. 모 T. 레에세이 숙주 세포(ID 번호 1275.8.1)와 변이체 세포 ID 번호 2218, 2219, 2220, 2221, 2222 및 2223을 액체 배양액 중 유도 조건(탄소원으로서 글루코오스/소포로오스) 및 비유도 조건(탄소원으로서 글루코오스) 하에서 성장시키고, 각각의 세포 외 분비 단백질 생산 수준을 비교하였다. 간략하게는, 각각의 숙주 세포(즉, T. 레에세이 모 숙주 세포 및 이의 변이체 세포)의 균사를 바닥 칸막이가 있는 250 mL 엘렌마이어 플라스크 내의 50 mL의 YEG 배양액에 따로따로 첨가하였다. YEG 배양액은 5g/L 효모 추출물 및 22 g/L 글루코오스를 함유하였다. 세포 배양물을 48시간 동안 성장시키고, 이어서 또 다른 24시간 동안 새로운 YEG 내로 계대배양하였다. 그런 다음, 이들 종 배양물을 바닥 칸막이가 있는 250 mL 진탕 플라스크 내의 2.5% 글루코오스(비유도 조건)가 첨가된 50 mL의 합성 배지, 또는 2.5% 글루코오스/소포로오스(유도 조건)가 첨가된 50 mL의 합성 배지 내로 접종하였다. 모든 진탕 플라스크를 200 rpm에서 계속하여 진탕하면서 28˚C에서 인큐베이션시켰다. 4일의 인큐베이션 후, 모든 세포 배양물로부터의 상청액을 수확하고, 도 23에 제시된 바와 같이, SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다.
위의 SDS-PAGE에서 보여지는 바와 같이, 모 세포(도 23, ID 1275.8.1)는 글루코오스/소포로오스(유도)와 비교하여 글루코오스를 함유하는 합성 배지(비유도)에서 훨씬 적은 분비 단백질을 생산하였다. 이와 대조적으로, 형질전환체 2218, 2219, 2220, 2222 및 2223은 유도 조건 및 비유도 조건 하에서 비슷한 양의 분비 단백질을 생산하였다. 따라서, 이러한 결과는 ace3 유전자좌에서 천연 ace3 프로모터를 교체하는 hxk1 또는 dic1 프로모터를 보유하는 변이체 세포가 유도인자의 부존재 하에서 세포 외 단백질을 생산하였음을 증명한다.
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reesei <400> 3 Met Leu Arg Tyr Ser Pro Val Leu His Leu Asp Thr Leu Ser Leu Pro 1 5 10 15 Pro Leu Thr Asn Ala Leu Pro Arg Pro Lys Cys Glu Tyr Leu Ser Ala 20 25 30 Val Asp Ser Cys Thr His Cys Arg Asp Ala His Val Gln Cys Thr Phe 35 40 45 Asp Leu Pro Leu Ala Arg Arg Gly Pro Lys Ala Arg Lys Lys Ser Asp 50 55 60 Gln Pro Gly Gln Pro Pro Pro Asp Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ala Ala 65 70 75 80 Arg Pro Gly Gln Met Pro Pro Pro Leu Thr Phe Ser Gly Pro Ala Val 85 90 95 Ala Ala Leu Gln Pro Phe Ala Ser Ser Ser Leu Ser Pro Asp Ala Ala 100 105 110 Trp Glu Pro Val Glu Pro Leu Ser Ile Asp Asn Gly Leu Pro Arg Gln 115 120 125 Pro Leu Gly Asp Leu Pro Gly Leu Ser Thr Ile Gln Asn Ile Ser Thr 130 135 140 Arg Gln Arg Trp Ile His Leu Ala Asn Ala Met Thr Leu Arg Asn Thr 145 150 155 160 Thr Leu Glu Arg Val Ser Lys Arg Cys Ile Asp Leu Phe Phe Asp Tyr 165 170 175 Leu Tyr Pro Leu Thr Pro Leu Val Tyr Glu Pro Ala Leu Arg Asp Val 180 185 190 Leu Ala Tyr Ile Phe Ser Gln Pro Leu Pro Gly Val Asn Gln Pro Ser 195 200 205 Pro Leu 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Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 agtctatcgg ccgcaatagc ttcctaatgt tt 32 <210> 89 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 tctaaaacat taggaagcta ttgcggccga ta 32 <210> 90 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 agtctatcgc agcgcaatca gtgcagtggt tt 32 <210> 91 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 tctaaaacca ctgcactgat tgcgctgcga ta 32 <210> 92 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 tggagagact cggagaggat agg 23 <210> 93 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 agcgtggagg cagttggagt gg 22 <210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 94 tggacaaagc ctgggtcctg ctcc 24 <210> 95 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 95 atcctgactc gtcctgtgtc gg 22 <210> 96 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 agtgcttcgt ttagtggact tg 22 <210> 97 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 ctcggtagct gcttgaatat ag 22 <210> 98 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EL form N-terminal extension <400> 98 Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Val Ala Ala 1 5 10 15 Gly Ala Asp Thr Gly Ala Ala Gly Ser Ser Ser Thr Gly Pro Pro Gly 20 25 30 Leu Pro Gly Leu Pro Gly Thr Arg Thr Gly Ser Val Ala 35 40 45 <210> 99 <211> 1857 <212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 99 atgctgcgct actcccccgt cttacacctg gatactctct ccttgccacc actgaccaat 60 gctcttcccc gcccaaagtg cgagtacctc agcgctgtcg atagctgcac gcactgccgc 120 gatgcccacg tgcagtgcac tttcgacctg cccctggcgc gacgcggccc caaagcgagg 180 aagaagagcg accagcccgg ccagccgcct cctgatccga gctcgctctc caccgcggct 240 cgacccggcc agatgccgcc gccgctgacc ttctccggcc ccgcagtagc cgcgctgcag 300 cccttcgcct cgtcgtcgct gtcgcccgac gcggcctggg agcccgtcga gccgctcagc 360 attgacaacg gcctgccccg gcagccgctg ggcgacctgc ccggcctctc caccatccag 420 aacatctcga cgcgccagcg atggatacac ctggccaacg ccatgacgct gcgcaacacg 480 acgctagagc gcgtctcgaa gcgatgtatc gacctcttct tcgactacct ctaccccctc 540 acccccctgg tgtacgagcc ggccctccgg gacgtgctcg catacatctt ctcccagccc 600 ttgcctggcg tcaaccaacc atcgccgctg tcacagctca cgccagaccc gaccaccggc 660 accacccccc tcaacgctgc cgagtcgtgg gccggctttg gccagcccag cggctcgcga 720 accgtcggca gcaggctggc tccctgggcc gactcgacct tcaccctggt cacggccgtc 780 tgcgcagagg cagcattcat gctacccaag gacattttcc ccgaaggaga atccgtctct 840 gagatcttgc tcgaagcctc tcgggactgc ctgcaccagc acctcgaggc cgacctggag 900 aatccgacgg ccaactcgat tgccattcgc tacttccact ccaactgcct ccacgctgcg 960 gggaagccca agtactcgtg gcacatattt ggcgaggcca tccgcctggc gcaggtcatg 1020 cagctgcacg aggaggctgc cctcgagggg ctcgtcccca tcgaggcaga gttccgccgt 1080 cgctgctttt ggatcctgta cttgggcgac aagtcagccg ctatactcaa caatcggccc 1140 atcaccatcc acaagtactg cttcgacgcc ggcatcacca cgctataccc gtcgggtatc 1200 gaggacgagt tcctgagcac ggcgtccgag ccgccccgga agagcttcat atccggcttc 1260 aacgcaaatg tgcggctctg gcagtccgcg gctgatttgc tgctggaaat ccgcgtgctg 1320 caagatcaga tgatgcagca ctttcgaggg accatgcccc cgaaccatgt gctgccctcc 1380 gccgacaggc agcatctcga ttctctctat gtccgcttca tcacctgctt ggacgatctc 1440 ccgccgtacc tccagtcgtg cactctggcg atggcagcga tggcagaagg caacgggtct 1500 gccgagtcca agcagtacgt gatacagtgc atcaacctgc aggtgacgtt tcactgtctg 1560 cgcatggtaa ttacgcagaa attcgaagac ctctcttatt ttgctcctgg cgttgagcag 1620 gctgatctca gaaagtcgga gattgtgcga gacatgctga gggtgatgaa cgaggcgccc 1680 ttttggggcc tgcaggccaa tggcgagcca aacgttgaaa agattcgcct tatcggagct 1740 agtttgctgg ccatcatcca tcgcaaccag gattcaccct tggctacgcg agccaggagc 1800 gacttttccg tgcttttgga tattctcacg cggctggact cgaaggcgtc ggactaa 1857 <210> 100 <211> 2070 <212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 100 atgggctcag cagctccggc ccagggctct gtagctgcag ctgcaggcgg ccctccagct 60 gctggcgctg gcgctggcgc tgtccacgcc ctcaccacct cgcccgagtc tgcctcggcc 120 tcgcagcccg gctcgccaac cgcctcaacc acgccgccgc agaactcact cgtgtcggct 180 gcaacctcgt tccaccacca tcccagaggc cgtctggtga gcagagcctg cgaccgctgc 240 cgccggcgca aggccaagtg cgagtacctc agcgctgtcg atagctgcac gcactgccgc 300 gatgcccacg tgcagtgcac tttcgacctg cccctggcgc gacgcggccc caaagcgagg 360 aagaagagcg accagcccgg ccagccgcct cctgatccga gctcgctctc caccgcggct 420 cgacccggcc agatgccgcc gccgctgacc ttctccggcc ccgcagtagc cgcgctgcag 480 cccttcgcct cgtcgtcgct gtcgcccgac gcggcctggg agcccgtcga gccgctcagc 540 attgacaacg gcctgccccg gcagccgctg ggcgacctgc ccggcctctc caccatccag 600 aacatctcga cgcgccagcg atggatacac ctggccaacg ccatgacgct gcgcaacacg 660 acgctagagc gcgtctcgaa gcgatgtatc gacctcttct tcgactacct ctaccccctc 720 acccccctgg tgtacgagcc ggccctccgg gacgtgctcg catacatctt ctcccagccc 780 ttgcctggcg tcaaccaacc atcgccgctg tcacagctca cgccagaccc gaccaccggc 840 accacccccc tcaacgctgc cgagtcgtgg gccggctttg gccagcccag cggctcgcga 900 accgtcggca gcaggctggc tccctgggcc gactcgacct tcaccctggt cacggccgtc 960 tgcgcagagg cagcattcat gctacccaag gacattttcc ccgaaggaga atccgtctct 1020 gagatcttgc tcgaagcctc tcgggactgc ctgcaccagc acctcgaggc cgacctggag 1080 aatccgacgg ccaactcgat tgccattcgc tacttccact ccaactgcct ccacgctgcg 1140 gggaagccca agtactcgtg gcacatattt ggcgaggcca tccgcctggc gcaggtcatg 1200 cagctgcacg aggaggctgc cctcgagggg ctcgtcccca tcgaggcaga gttccgccgt 1260 cgctgctttt ggatcctgta cttgggcgac aagtcagccg ctatactcaa caatcggccc 1320 atcaccatcc acaagtactg cttcgacgcc ggcatcacca cgctataccc gtcgggtatc 1380 gaggacgagt tcctgagcac ggcgtccgag ccgccccgga agagcttcat atccggcttc 1440 aacgcaaatg tgcggctctg gcagtccgcg gctgatttgc tgctggaaat ccgcgtgctg 1500 caagatcaga tgatgcagca ctttcgaggg accatgcccc cgaaccatgt gctgccctcc 1560 gccgacaggc agcatctcga ttctctctat gtccgcttca tcacctgctt ggacgatctc 1620 ccgccgtacc tccagtcgtg cactctggcg atggcagcga tggcagaagg caacgggtct 1680 gccgagtcca agcagtacgt gatacagtgc atcaacctgc aggtgacgtt tcactgtctg 1740 cgcatggtaa ttacgcagaa attcgaagac ctctcttatt ttgctcctgg cgttgagcag 1800 gctgatctca gaaagtcgga gattgtgcga gacatgctga gggtgatgaa cgaggcgccc 1860 ttttggggcc tgcaggccaa tggcgagcca aacgttgaaa agattcgcct tatcggagct 1920 agtttgctgg ccatcatcca tcgcaaccag gattcaccct tggctacgcg agccaggagc 1980 gacttttccg tgcttttgga tattctcacg cggctggact cgaaggcgtc ggaccaactg 2040 aggaatacgt ccactaccgt tgttggctaa 2070 <210> 101 <211> 2172 <212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 101 atggccacag cggccgcggc agcagctggc ggcgcggcgg ttgctgcggg tgcagacaca 60 ggcgctgcag gctccagctc tacaggccct ccaggccttc cagggcttcc aggcacccgg 120 acaggctccg tggcgatggg ctcagcagct ccggcccagg gctctgtagc tgcagctgca 180 ggcggccctc cagctgctgg cgctggcgct ggcgctgtcc acgccctcac cacctcgccc 240 gagtctgcct cggcctcgca gcccggctcg ccaaccgcct caaccacgcc gccgcagaac 300 tcactcgtgt cggctgcaac ctcgttccac caccatccca gaggccgtct ggtgagcaga 360 gcctgcgacc gctgccgccg gcgcaaggcc aagtgcgagt acctcagcgc tgtcgatagc 420 tgcacgcact gccgcgatgc ccacgtgcag tgcactttcg acctgcccct ggcgcgacgc 480 ggccccaaag cgaggaagaa gagcgaccag cccggccagc cgcctcctga tccgagctcg 540 ctctccaccg cggctcgacc cggccagatg ccgccgccgc tgaccttctc cggccccgca 600 gtagccgcgc tgcagccctt cgcctcgtcg tcgctgtcgc ccgacgcggc ctgggagccc 660 gtcgagccgc tcagcattga caacggcctg ccccggcagc cgctgggcga cctgcccggc 720 ctctccacca tccagaacat ctcgacgcgc cagcgatgga tacacctggc caacgccatg 780 acgctgcgca acacgacgct agagcgcgtc tcgaagcgat gtatcgacct cttcttcgac 840 tacctctacc ccctcacccc cctggtgtac gagccggccc tccgggacgt gctcgcatac 900 atcttctccc agcccttgcc tggcgtcaac caaccatcgc cgctgtcaca gctcacgcca 960 gacccgacca ccggcaccac ccccctcaac gctgccgagt cgtgggccgg ctttggccag 1020 cccagcggct cgcgaaccgt cggcagcagg ctggctccct gggccgactc gaccttcacc 1080 ctggtcacgg ccgtctgcgc agaggcagca ttcatgctac ccaaggacat tttccccgaa 1140 ggagaatccg tctctgagat cttgctcgaa gcctctcggg actgcctgca ccagcacctc 1200 gaggccgacc tggagaatcc gacggccaac tcgattgcca ttcgctactt ccactccaac 1260 tgcctccacg ctgcggggaa gcccaagtac tcgtggcaca tatttggcga ggccatccgc 1320 ctggcgcagg tcatgcagct gcacgaggag gctgccctcg aggggctcgt ccccatcgag 1380 gcagagttcc gccgtcgctg cttttggatc ctgtacttgg gcgacaagtc agccgctata 1440 ctcaacaatc ggcccatcac catccacaag tactgcttcg 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ctcaccacct cgcccgagtc tgcctcggcc 120 tcgcagcccg gctcgccaac cgcctcaacc acgccgccgc agaactcact cgtgtcggct 180 gcaacctcgt tccaccacca tcccagaggc cgtctggtga gcagagcctg cgaccgctgc 240 cgccggcgca aggccaagtg cgagtacctc agcgctgtcg atagctgcac gcactgccgc 300 gatgcccacg tgcagtgcac tttcgacctg cccctggcgc gacgcggccc caaagcgagg 360 aagaagagcg accagcccgg ccagccgcct cctgatccga gctcgctctc caccgcggct 420 cgacccggcc agatgccgcc gccgctgacc ttctccggcc ccgcagtagc cgcgctgcag 480 cccttcgcct cgtcgtcgct gtcgcccgac gcggcctggg agcccgtcga gccgctcagc 540 attgacaacg gcctgccccg gcagccgctg ggcgacctgc ccggcctctc caccatccag 600 aacatctcga cgcgccagcg atggatacac ctggccaacg ccatgacgct gcgcaacacg 660 acgctagagc gcgtctcgaa gcgatgtatc gacctcttct tcgactacct ctaccccctc 720 acccccctgg tgtacgagcc ggccctccgg gacgtgctcg catacatctt ctcccagccc 780 ttgcctggcg tcaaccaacc atcgccgctg tcacagctca cgccagaccc gaccaccggc 840 accacccccc tcaacgctgc cgagtcgtgg gccggctttg gccagcccag cggctcgcga 900 accgtcggca gcaggctggc tccctgggcc gactcgacct tcaccctggt cacggccgtc 960 tgcgcagagg cagcattcat gctacccaag gacattttcc ccgaaggaga atccgtctct 1020 gagatcttgc tcgaagcctc tcgggactgc ctgcaccagc acctcgaggc cgacctggag 1080 aatccgacgg ccaactcgat tgccattcgc tacttccact ccaactgcct ccacgctgcg 1140 gggaagccca agtactcgtg gcacatattt ggcgaggcca tccgcctggc gcaggtcatg 1200 cagctgcacg aggaggctgc cctcgagggg ctcgtcccca tcgaggcaga gttccgccgt 1260 cgctgctttt ggatcctgta cttgggcgac aagtcagccg ctatactcaa caatcggccc 1320 atcaccatcc acaagtactg cttcgacgcc ggcatcacca cgctataccc gtcgggtatc 1380 gaggacgagt tcctgagcac ggcgtccgag ccgccccgga agagcttcat atccggcttc 1440 aacgcaaatg tgcggctctg gcagtccgcg gctgatttgc tgctggaaat ccgcgtgctg 1500 caagatcaga tgatgcagca ctttcgaggg accatgcccc cgaaccatgt gctgccctcc 1560 gccgacaggc agcatctcga ttctctctat gtccgcttca tcacctgctt ggacgatctc 1620 ccgccgtacc tccagtcgtg cactctggcg atggcagcga tggcagaagg caacgggtct 1680 gccgagtcca agcagtacgt gatacagtgc atcaacctgc aggtgacgtt tcactgtctg 1740 cgcatggtaa ttacgcagaa attcgaagac ctctcttatt ttgctcctgg cgttgagcag 1800 gctgatctca gaaagtcgga gattgtgcga gacatgctga gggtgatgaa cgaggcgccc 1860 ttttggggcc tgcaggccaa tggcgagcca aacgttgaaa agattcgcct tatcggagct 1920 agtttgctgg ccatcatcca tcgcaaccag gattcaccct tggctacgcg agccaggagc 1980 gacttttccg tgcttttgga tattctcacg cggctggact cgaaggcgtc ggactaa 2037

Claims (57)

  1. 모 사상 진균 세포로부터 유래된 변이체 사상 진균 세포로서, 변이체 세포는 서열 번호 6 의 Ace3 단백질을 암호화하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
    이때, 변이체 세포는 모 세포에 비해 유도 기질의 부존재 하에 증가된 양의 관심 단백질 (POI) 을 생산하며, 상기 관심 단백질은 셀룰라아제 또는 헤미셀룰라아제이고,
    상기 유도 기질은 소포로오스, 락토오스, 겐티오비오스 및 셀룰로오스를 포함하고,
    상기 사상 진균 세포는 트리코더마 종 진균 세포인, 변이체 사상 진균 세포.
  2. 제1항에 있어서, 변이체 세포는 모 세포에 비해 유도 기질의 존재 하에서 증가된 양의 관심 단백질 (POI) 을 더 생산하며,
    상기 유도 기질은 소포로오스, 락토오스, 겐티오비오스 및 셀룰로오스를 포함하는 것인, 변이체 사상 진균 세포.
  3. 제1항에 있어서, POI는 내인성 POI 또는 이종성 POI인 변이체 사상 진균 세포.
  4. 제1항에 있어서, 이종성 POI를 암호화하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 변이체 사상 진균 세포.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서 셀룰라아제는 cbh1, cbh2, egl1, egl2, 및 egl3 로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 변이체 사상 진균 세포.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 진균 세포 게놈 내로 통합되는 것인, 변이체 사상 진균 세포.
  10. 제9항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 진균 세포 게놈의 텔로미어 부위 내로 통합되는 것인, 변이체 사상 진균 세포.
  11. 제9항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 진균 세포 게놈의 글루코아밀라아제 (gla1) 유전자좌 내로 통합되는 것인, 변이체 사상 진균 세포.
  12. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4 에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 변이체 사상 진균 세포.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 유도 기질의 부존재 하의 트리코더마 종 진균 세포 내에서 내인성 셀룰라아제 또는 헤미셀룰라아제의 생산 방법으로,
    (i) 5'에서 3' 방향으로 (a) 프로모터를 포함하는 제1 핵산 서열 및 (b) 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 진균 세포 내로 도입하는 단계로서, 이때, 제2 핵산 서열은 서열 번호 6 의 Ace3 단백질을 암호화하고, 마지막 네 개의 C 말단 아미노산으로서 "Lys-Ala-Ser-Asp"를 포함하는 것인, 단계, 및
    (ii) 진균 세포 성장 및 단백질 생산을 위한 조건 하에서 단계 (i)의 세포를 배양하는 단계로서, 이때, 그러한 성장 조건은 유도 기질을 포함하지 않는 것인, 단계를 포함하고,
    상기 유도 기질은 소포로오스, 락토오스, 겐티오비오스 및 셀룰로오스를 포함하는 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 제3 핵산 서열을 더 포함하고, 제2 핵산에 작동 가능하게 연결되는데, 이때, 제3 핵산 서열은 천연 ace3 종결자 서열을 포함하는 것인, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 진균 세포 게놈 내로 통합되는 것인, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 진균 세포 게놈의 텔로미어 부위 내로 통합되는 것인, 방법.
  21. 제17항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 진균 세포 게놈의 글루코아밀라아제 (gla1) 유전자좌 내로 통합되는 것인, 방법.
  22. 제17항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4 에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 방법.
  23. 삭제
  24. 제17항에 있어서, 프로모터는 rev3 프로모터(서열 번호 15), bxl 프로모터(서열 번호 16), tkl1 프로모터(서열 번호 17), PID104295 프로모터(서열 번호 18), dld1 프로모터(서열 번호 19), xyn4 프로모터(서열 번호 20), PID72526 프로모터(서열 번호 21), axe1 프로모터(서열 번호 22), hxk1 프로모터(서열 번호 23), dic1 프로모터(서열 번호 24), opt 프로모터(서열 번호 25), gut1 프로모터(서열 번호 26) 및 pki1 프로모터(서열 번호 27)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 유도 기질의 부존재 하의 트리코더마 종 진균 세포 내에서 이종성 관심 단백질의 생산 방법으로,
    (i) 5'에서 3' 방향으로 (a) 구성성 프로모터를 포함하는 제1 핵산 서열 및 (b) 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 진균 세포 내로 도입하는 단계로서, 이때, 제2 핵산 서열은 서열 번호 6 의 Ace3 단백질을 암호화하고, 마지막 네 개의 C 말단 아미노산으로서 "Lys-Ala-Ser-Asp"를 포함하는 것인, 단계, 및
    (ii) 진균 세포 성장 및 단백질 생산을 위한 조건 하에서 단계 (i)의 세포를 배양하는 단계로서, 이때, 그러한 성장 조건은 유도 기질을 포함하지 않는 것인, 단계를 포함하고,
    상기 유도 기질은 소포로오스, 락토오스, 겐티오비오스 및 셀룰로오스를 포함하고,
    상기 이종성 관심 단백질은 셀룰라아제 또는 헤미셀룰라아제인, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 진균 세포는 이종성 POI를 암호화하는 도입된 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 이때, 폴리뉴클레오티드는 단계 (i) 이전에, 단계 (i) 중에, 또는 단계 (i) 이후에 진균 세포 내로 도입되는 것인, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 제3 핵산 서열을 포함하고, 제2 핵산에 작동 가능하게 연결되는데, 이때, 제3 핵산 서열은 천연 ace3 종결자 서열을 포함하는 것인, 방법.
  36. 제33항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 진균 세포 게놈 내로 통합되는 것인, 방법.
  37. 제33항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 진균 세포 게놈의 텔로미어 부위 내로 통합되는 것인, 방법.
  38. 제33항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 진균 세포 게놈의 글루코아밀라아제 (gla1) 유전자좌 내로 통합되는 것인, 방법.
  39. 제33항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4 에 대해 90% 이상의 서열 동일성을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 방법.
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  42. 제33항에 있어서, 프로모터는 rev3 프로모터(서열 번호 15), bxl 프로모터(서열 번호 16), tkl1 프로모터(서열 번호 17), PID104295 프로모터(서열 번호 18), dld1 프로모터(서열 번호 19), xyn4 프로모터(서열 번호 20), PID72526 프로모터(서열 번호 21), axe1 프로모터(서열 번호 22), hxk1 프로모터(서열 번호 23), dic1 프로모터(서열 번호 24), opt 프로모터(서열 번호 25), gut1 프로모터(서열 번호 26) 및 pki1 프로모터(서열 번호 27)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
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  54. 유도 기질의 부존재 하에서의 내인성 셀룰라아제 또는 헤미셀룰라아제의 증가된 생산을 위하여 트리코더마 레에세이 주를 유전자 변형하는 방법으로,
    (i) 서열 번호 3의 Ace3-S 단백질, 서열 번호 8의 Ace3-SC 단백질 또는 서열 번호 10의 Ace3-LC 단백질을 암호화하는 ace3 유전자를 포함하는 T. 레에세이 주를 스크리닝하고 확인하는 단계로서, 이때, 확인된 T. 레에세이 주는 서열 번호 6의 Ace3-L 단백질, 서열 번호 14의 Ace3-LN 단백질 또는 서열 번호 12의 Ace3-EL 단백질을 암호화하는 ace3 유전자를 포함하지 않는 것인, 단계,
    (ii) 5'에서 3' 방향으로 (a) 프로모터를 포함하는 제1 핵산 서열 및 (b) 제1 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 단계 (i)에서 확인된 T. 레에세이 주 내로 도입하는 단계로서, 이때, 제2 핵산 서열은 서열 번호 6 의 Ace3 단백질을 암호화하고, 마지막 네 개의 C 말단 아미노산으로서 "Lys-Ala-Ser-Asp"를 포함하거나, 제2 핵산 서열은 서열 번호 12 의 Ace-3 단백질을 암호화하는 것인, 단계, 및
    (iii) 진균 세포 성장 및 단백질 생산을 위한 조건 하에서 단계 (ii)의 세포를 배양하는 단계로서, 이때, 그러한 성장 조건은 유도 기질을 포함하지 않는 것인, 단계를 포함하고,
    상기 유도 기질은 소포로오스, 락토오스, 겐티오비오스 및 셀룰로오스를 포함하는 것인, 방법.
  55. 모 사상 진균 세포로부터 유래된 변이체 사상 진균 세포로서, 변이체 세포는 이종성 프로모터를 갖는 서열 번호 6 의 Ace3-L 단백질, 서열 번호 14 의 Ace3-LN 단백질 또는 서열 번호 12 의 Ace3-EL 단백질을 암호화하는 ace3 유전자를 포함하고, 이때, 변이체 세포는 모 세포에 비해 유도 기질의 부존재 하에 증가된 양의 셀룰라아제 또는 헤미셀룰라아제를 생산하며,
    상기 유도 기질은 소포로오스, 락토오스, 겐티오비오스 및 셀룰로오스를 포함하고,
    상기 사상 진균 세포는 트리코더마 종 진균 세포인, 변이체 사상 진균 세포.
  56. 제55항에 있어서, 이종성 프로모터는 트리코더마 레에세이 프로모터인, 변이체 사상 진균 세포.
  57. 제56항에 있어서, 이종성 프로모터는 rev3 프로모터(서열 번호 15), bxl 프로모터(서열 번호 16), tkl1 프로모터(서열 번호 17), PID104295 프로모터(서열 번호 18), dld1 프로모터(서열 번호 19), xyn4 프로모터(서열 번호 20), PID72526 프로모터(서열 번호 21), axe1 프로모터(서열 번호 22), hxk1 프로모터(서열 번호 23), dic1 프로모터(서열 번호 24), opt 프로모터(서열 번호 25), gut1 프로모터(서열 번호 26) 및 pki1 프로모터(서열 번호 27)로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터인, 변이체 사상 진균 세포.
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