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JP7285780B2 - 誘導基質の非存在下における糸状菌細胞内でのタンパク質の産生 - Google Patents

誘導基質の非存在下における糸状菌細胞内でのタンパク質の産生 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１６年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６２／４０３，７８７号明細書の優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
ＥＦＳを介し、添付して提出した配列表テキストファイルには、２０１７年１０月２日に作成した、サイズが１５７キロバイトのファイル「ＮＢ４１１５９ＷＯＰＣＴ＿ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ」が含まれている。この配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）に適合しており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
分野
本開示は、一般に、分子生物学、生化学、タンパク質の産生および糸状菌の分野に関する。本開示の特定の実施形態は、１つ以上の目的タンパク質の産生を増加させるための、変異糸状菌細胞、その組成物、およびその方法に関する。より詳しくは、特定の実施形態において、本開示は、親糸状菌細胞由来の変異糸状菌（宿主）細胞に関し、この変異宿主細胞は、誘導基質の非存在下での１つ以上の目的タンパク質（ＰＯＩ）の発現／産生を可能にする遺伝子の改変を含む。
リグノセルロース植物物質の成分であるセルロースは、自然界に見られる最も豊富な多糖類である。同様に、糸状菌は植物バイオマスの効率的な分解菌であることが当該技術分野で知られており、実際、工業に関連したリグノセルロース分解酵素（以下、集合的に「セルラーゼ」酵素と呼ぶ）の主要な供給源である。例えば、糸状菌はセルロースのβ－（１，４）結合グリコシド結合を加水分解してグルコースを生成する細胞外セルラーゼ酵素（例えば、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β－グルコシダーゼ）を産生することが知られている（すなわち、そのことにより、これらの糸状菌が増殖のためにセルロースを利用する能力を付与する）。
特に、糸状菌トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）；真菌ハイポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）のアナモルフ）は、セルラーゼ酵素の効率的な生産体であることが知られている（例えば、国際公開第１９９８／１５６１９号パンフレット、同第２００５／０２８６３６号パンフレット、同第２００６／０７４００５号パンフレット、同第１９９２／０６２２１号パンフレット、同第１９９２／０６２０９号パンフレット、同第１９９２／０６１８３号パンフレット、同第２００２／１２４６５号パンフレットなどを参照されたい）。したがって、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）などの糸状菌は、セルロース由来エタノール、布帛および衣類、洗剤、繊維、食品および飼料添加物、ならびに他の工業用途などの商品の製造に有用な酵素を産生する能力を有することから、これまで利用されてきた。
これらの工業関連酵素のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）中における発現（および産生）は、増殖に利用できる炭素源に依存することが知られている。より詳しくは、糸状菌によるセルラーゼ酵素の産生は、エネルギー消費プロセスであり、したがって、これらの酵素の効率的な産生を確実にするために、誘導および抑制の両機構が糸状菌の中で発達してきた。例えば、植物細胞壁物質の分解に必要な酵素（すなわち、セルラーゼ／ヘミセルラーゼ）をコードする種々の遺伝子は、「誘導」基質の存在下で「活性化」され、そして植物バイオマスよりも好ましい、容易に代謝される炭素源（例えば、Ｄ－グルコース）の存在下では「炭素カタボライト抑制」（以下、「ＣＣＲ」）として知られる機構により「抑制」される。このように、セルラーゼ遺伝子はグルコースによって強く抑制され、セルロースおよび特定の二糖類（例えば、ソホロース、ラクトース、ゲンチオビオース）によって数千倍誘導される。例えば、主要なセロビオヒドロラーゼ１（ｃｂｈ１）の発現レベルは、グルコース含有培地と比較して、セルロースまたはソホロースなどの誘導炭素源を含有する培地で数千倍「アップレギュレート」される（Ｉｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。さらに、「誘導された」Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）培養物に「抑制」炭素源を添加すると（セルロースまたはソホロース）誘導に打ち勝ち、セルラーゼ遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらすことが示された（ｅｌ－Ｇｏｇａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｉｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。このように、セルラーゼ系（酵素）を含む遺伝子（この系の遺伝子メンバーは相乗的に作用し、上記のように、セルロースの可溶性オリゴ糖への効率的な加水分解に必要である）の発現は、転写レベルで少なくとも調整および調節される。
より具体的には、ゲノムワイド分析で、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中に少なくとも１０個のセルロース分解酵素および１６個のキシラン分解酵素をコードする遺伝子の存在が明らかになった（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ、２００８）。特に、最も豊富に分泌される酵素は、２つの主要なセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ．３．２．１．９１）、ｃｂｈ１（セロビオヒドロラーゼ１）およびｃｂｈ２（セロビオヒドロラーゼ２）、ならびに２つの主要な特異的エンド－β－１，４－キシラナーゼ（ＥＣ３．３．１．８）、ｘｙｎ１（エンド－１，４－β－キシラナーゼ１）およびｘｙｎ２（エンド－１，４－β－キシラナーゼ２）であり、本明細書では「主要な工業関連ヘミセルラーゼおよびセルラーゼ」または「ＭＩＨＣ」と呼ぶ。これらのＭＩＨＣは、セルロースおよびキシランを分解する追加の酵素と共に作用し、その結果、可溶性オリゴ糖および単糖、例えば、セロビオース、Ｄ－グルコース、キシロビオースおよびＤ－キシロースを生成する。さらに、ソホロースは、これらの酵素のいくつかのトランスグリコシル化活性の産物である（Ｖａｈｅｒｉ ｅｔ ａｌ，１９７９）。より詳しくは、これらの可溶性オリゴ糖および単糖（すなわち、セロビオース、Ｄ－グルコース、キシロビオース、Ｄ－キシロースおよびソホロース）はＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）中でのＭＩＣＨの発現に影響することがこの文献で報告されている。例えば、Ｄ－グルコースの存在はＣＣＲを引き起こし、これは、少量のＭＩＨＣの分泌をもたらす。ソホロースは、ｃｂｈ１およびｃｂｈ２の発現のための最も強力なインデューサーであると考えられている。Ｄ－キシロースは、濃度に依存してｘｙｎ１およびｘｙｎ２の発現を調節する。
一般に、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などの糸状菌による酵素／ポリペプチドの商業規模生産は、一般に、バッチ法、流加法、および連続フロープロセスなどの、固体培養または浸漬培養による。例えば、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）における工業的セルラーゼ生産で最も問題であり、かつ高価な態様の１つは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞に適切なインデューサー（すなわち、誘導基質）を提供することにある。例えば、研究室規模実験の場合と同様、商業規模のセルラーゼ（酵素）の生産は、固体セルロース（すなわち、誘導基質）上で真菌細胞を増殖させることによって、または「ラクトース」などの二糖インデューサー（すなわち、誘導基質）の存在下で細胞を培養することによって「誘導」される。
残念ながら、工業規模では、両「誘導」方法とも、セルラーゼ生産に関連する高コストをもたらすという欠点を有する。例えば、上記のように、セルラーゼ合成は、セルロース誘導とグルコース抑制の両方を受ける。このように、誘導性プロモーター制御下でのセルラーゼ酵素の収率に影響を及ぼす重要な因子は、セルロース基質とグルコース濃度との間の適切なバランスの維持である（すなわち、これは、調節された遺伝子産物の妥当な商業的収率を得るために重要である）。セルロースは有効で安価なインデューサーであるが、糸状菌細胞が固体セルロース上で増殖する場合、グルコース濃度の制御が問題となり得る。低濃度のセルロースでは、グルコースの産生が遅すぎて、活発な細胞増殖および機能の代謝要求を満たすことができない。他方、グルコース生成がその消費よりも速い場合、セルラーゼ合成はグルコース抑制によって停止され得る。したがって、基質添加を遅くし、かつグルコース濃度をモニタリングするために、高価なプロセス制御スキームが必要とされる（Ｊｕ ａｎｄ Ａｆｏｌａｂｉ，１９９９）。さらに、セルロース物質の固体特性のために、基質のゆっくりした連続的な送達を行うことは困難であり得る。
「誘導基質」としてのセルロースの使用に伴う問題のいくつかは、「ラクトース」、「ソホロース」または「ゲンチオビオース」などの可溶性「誘導基質」の使用によって克服することができる。例えば、「誘導基質」としてラクトースを使用する場合、ラクトースはインデューサーおよび炭素源として機能するよう、高濃度で提供されなければならない（例えば、Ｓｅｉｂｏｔｈ，ｅｔ．ａｌ．，２００２を参照されたい）。ソホロースはセルロースよりも強力なインデューサーであるが、ソホロースは高価であり、かつ製造が困難である。例えば、グルコース、ソホロースおよび他の二糖類の混合物（すなわち、グルコースの酵素変換により生成される）は、セルラーゼの効率的な生産のために使用することができるが、これはグルコースの単独使用よりも大きな（生産）コストを招く。このように、固体セルロースよりも取り扱いおよび制御が容易であるものの、誘導基質としてのソホロースの使用は、セルラーゼを製造するコストを法外に高価にする可能性がある。
上記に基づけば、生産のために費用のかかる誘導基質（例えば、ソホロース、ラクトースなど）の提供が必要または要件でない、糸状菌による酵素／ポリペプチドの費用効率の高い商業的規模生産のための、進行中で対処されていないニーズが当該技術分野に依然存在することは明らかである。より詳しくは、糸状菌宿主細胞により１種以上の内因性リグノセルロース分解酵素を商業規模で生産する（このような糸状菌細胞は誘導基質の非存在下でこれらの遺伝子の１種以上を発現し得る）ニーズが当該技術分野に残されている。さらに、そのような糸状菌宿主細胞中で発現し産生される、１つ以上の異種タンパク質産物（このようなタンパク質をコードする異種遺伝子が真菌宿主細胞に導入され、この細胞が誘導基質の非存在下でそのような異種遺伝子を発現し得る）を高い費用効率で産生するという、未だ対処されていないさらなるニーズが当該技術分野に存在している。
本開示の特定の実施形態は、産生のために高価な誘導基質（例えば、ソホロース、ラクトースなど）を提供することを必要または要件としない、糸状菌による酵素／ポリペプチドの商業規模の生産に関する。したがって、他の特定の実施形態は、１つ以上の目的タンパク質の産生を増加させるための、変異糸状菌細胞、その組成物、およびその方法に関する。例えば、本開示の特定の実施形態は、親糸状菌細胞に由来する変異糸状菌細胞に関し、この変異細胞は、配列番号６のＡｃｅ３タンパク質に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードする、導入されたポリヌクレオチドコンストラクトを含み、この変異細胞は、変異細胞と親細胞が類似の条件下で培養された場合、親細胞と比較して誘導基質の非存在下でより多くの量の目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する。他の特定の実施形態では、変異細胞と親細胞が類似の条件下で培養された場合、変異細胞は親細胞と比較して誘導基質の存在下でより多くの量のＰＯＩを産生する。
変異細胞の別の実施形態では、配列番号６に対して約９０％の配列同一性を有する、コードされたＡｃｅ３タンパク質は、最後の４つのＣ末端アミノ酸として「Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ」を含む。別の実施形態では、配列番号６に対して約９０％の配列同一性を有する、コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６に作動可能に連結し、かつ同配列に先行する配列番号９８のＮ末端アミノ酸フラグメントを含む。変異細胞の、他の特定の実施形態では、Ａｃｅ－３タンパク質は、配列番号１２に対して約９０％の配列同一性を有する。別の実施形態では、Ａｃｅ３タンパク質をコードする導入されたポリヌクレオチドは、配列番号５に対して約９０％の同一性を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を含む。
変異細胞のさらに他の実施形態では、ＰＯＩは内因性ＰＯＩまたは異種ＰＯＩである。このように、特定の実施形態では、変異細胞は、異種ＰＯＩをコードする、導入されたポリヌクレオチドコンストラクトを含む。別の実施形態では、異種ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドコンストラクトは、セルロース誘導性遺伝子プロモーターの制御下で発現する。他の特定の実施形態では、内因性ＰＯＩは、リグノセルロース分解酵素である。このように、他の実施形態では、リグノセルロース分解酵素は、セルラーゼ酵素、ヘミセルラーゼ酵素、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。他の特定の実施形態では、リグノセルロース分解酵素は、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｅｇｌ６、ｂｇｌ１、ｂｇｌ２、ｘｙｎ１、ｘｙｎ２、ｘｙｎ３、ｂｘｌ１、ａｂｆ１、ａｂｆ２、ａｂｆ３、ａｘｅ１、ａｘｅ２、ａｘｅ３、ｍａｎ１、ａｇｌ１、ａｇｌ２、ａｇｌ３、ｇｌｒ１、ｓｗｏ１、ｃｉｐ１およびｃｉｐ２からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、異種ＰＯＩは、α－アミラーゼ、アルカリα－アミラーゼ、β－アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ、キシラナーゼ、インベルターゼ、ラクターゼ、ナリンガナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ブロメライン、中性プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、ペプチダーゼ、レンネット、レニン、キモシン、スブチリシン、テルモリシン、アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリプシン、リパーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、アミダーゼ、イミノアシラーゼ、グルタミナーゼ、リゾチーム、ペニシリンアシラーゼ、イソメラーゼ、オキシドレダクターゼ、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、リアーゼ、アスパラギン酸β－デカルボキシラーゼ、フマラーゼ、ヒスタダーゼ、トランスフェラーゼ、リガーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、ラッカーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼおよびトランスグルタミナーゼからなる群から選択される。
変異細胞の別の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、配列番号６に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の５’に作動可能に連結されたプロモーター配列を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、配列番号６に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の３’に作動可能に連結された天然のａｃｅ３ターミネーター配列をさらに含む。他の特定の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞のゲノムに組み込まれる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞ゲノムのテロメア部位に組み込まれる。他の特定の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞ゲノムのグルコアミラーゼ（ｇｌａ１）遺伝子座に組み込まれる。さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、配列番号４、配列番号１１または配列番号１３に対して約９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４に対して９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。したがって、他の実施形態では、コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
他の実施形態では、変異細胞は、配列番号４８の野生型キシラナーゼレギュレーター１（Ｘｙｒ１）タンパク質、または配列番号４６の変異キシラナーゼレギュレーター１（Ｘｙｒ１）タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを発現する遺伝子改変を含む。他の特定の実施形態では、変異細胞は、内因性炭素カタボライトリプレッサー１（Ｃｒｅ１）タンパク質またはＡｃｅ１タンパク質をコードする遺伝子の発現を減少または抑制する遺伝子改変を含む。さらに別の実施形態では、変異細胞は、Ａｃｅ２タンパク質の発現を含む遺伝子改変を含む。他の実施形態では、糸状菌細胞は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の亜門のチャワンタケ亜門（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）細胞である。他の特定の実施形態では、糸状菌細胞は、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の細胞である。
他の実施形態では、開示は、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドＯＲＦに関する。
他の実施形態では、開示は、本開示の変異細胞によって産生されるリグノセルロース分解酵素に関する。他の実施形態では、開示は、本開示の変異細胞によって産生される異種ＰＯＩに関する。
他の実施形態では、開示は、誘導基質の非存在下、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の真菌細胞中で、目的内因性タンパク質を産生する方法に関し、この方法は（ｉ）５’から３’の方向に（ａ）プロモーターを含む第１の核酸配列、および（ｂ）第１の核酸配列に作動可能に連結した第２の核酸配列（第２の核酸配列は、配列番号６に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードし、最後の４つのＣ末端アミノ酸として「Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ」を含む）を含むポリヌクレオチドコンストラクトを真菌細胞に導入する工程と、（ｉｉ）真菌細胞の増殖およびタンパク質の産生に好適な条件下で（このような好適な増殖条件は誘導基質を含まない）工程（ｉ）の細胞を発酵させる工程とを含む。本方法の特定の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、第２の核酸の３’に作動可能に連結された第３の核酸配列を含み、この第３の核酸配列は天然のａｃｅ３ターミネーター配列を含む。別の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞のゲノムに組み込まれる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞ゲノムのテロメア部位に組み込まれる。他の特定の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞ゲノムのグルコアミラーゼ（ｇｌａ１）遺伝子座に組み込まれる。本方法の他の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、配列番号４、配列番号１１または配列番号１３に対して約９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４に対して９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
本方法の特定の実施形態では、工程（ｉ）のプロモーターは、ｒｅｖ３プロモーター（配列番号１５）、ｂｘｌプロモーター（配列番号１６）、ｔｋｌ１プロモーター（配列番号１７）、ＰＩＤ１０４２９５プロモーター（配列番号１８）、ｄｌｄ１プロモーター（配列番号１９）、ｘｙｎ４プロモーター（配列番号２０）、ＰＩＤ７２５２６プロモーター（配列番号２１）、ａｘｅ１プロモーター（配列番号２２）、ｈｘｋ１プロモーター（配列番号２３）、ｄｉｃ１プロモーター（配列番号２４）、ｏｐｔプロモーター（配列番号２５）、ｇｕｔ１プロモーター（配列番号２６）、およびｐｋｉ１プロモーター（配列番号２７）からなる群から選択される。
本方法の関連する実施形態では、内因性ＰＯＩはリグノセルロース分解酵素である。特定の実施形態では、リグノセルロース分解酵素は、セルラーゼ酵素、ヘミセルラーゼ酵素、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、セルラーゼ酵素は、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｅｇｌ６、ｂｇｌ１、ｂｇｌ２、ｓｗｏ１、ｃｉｐ１およびｃｉｐ２からなる群から選択される。別の実施形態では、ヘミセルラーゼ酵素は、ｘｙｎ１、ｘｙｎ２、ｘｙｎ３、ｘｙｎ４、ｂｘｌ１、ａｂｆ１、ａｂｆ２、ａｂｆ３、ａｘｅ１、ａｘｅ２、ａｘｅ３、ｍａｎ１、ａｇｌ１、ａｇｌ２、ａｇｌ３およびｇｌｒ１からなる群から選択される。
本方法の他の実施形態では、工程（ｉ）は、異種ＰＯＩをコードする、導入されたポリヌクレオチドコンストラクトをさらに含む。特定の実施形態では、異種ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドコンストラクトは、セルロース誘導性遺伝子プロモーターの制御下で発現する。特定の実施形態では、セルロース誘導性遺伝子プロモーターはｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｘｙｎ２またはｓｔｐ１から選択される。
他の実施形態では、本方法は、配列番号４８の野生型キシラナーゼレギュレーター１（Ｘｙｒ１）タンパク質、または配列番号４６の変異キシラナーゼレギュレーター１（Ｘｙｒ１）タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを発現する遺伝子改変をさらに含む。他の実施形態では、本方法は、内因性炭素カタボライトリプレッサー１（Ｃｒｅ１）タンパク質またはＡｃｅ１タンパク質をコードする遺伝子の発現を減少または抑制する遺伝子改変をさらに含む。さらに別の実施形態では、本方法は、Ａｃｅ２タンパク質の発現を含む遺伝子改変をさらに含む。
他の実施形態では、本開示は、誘導基質の非存在下、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の真菌細胞中で目的内因性タンパク質を産生する方法に関し、この方法は、（ｉ）５’から３’の方向に（ａ）プロモーターを含む第１の核酸配列、および（ｂ）第１の核酸配列に作動可能に連結した第２の核酸配列（この第２の核酸配列は、配列番号１２に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードする）を含むポリヌクレオチドコンストラクトを真菌細胞に導入する工程と、（ｉｉ）真菌細胞の増殖およびタンパク質の産生に好適な条件下で（このような好適な増殖条件は誘導基質を含まない）工程（ｉ）の細胞を発酵させる工程を含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、第２の核酸の３’に作動可能に連結された第３の核酸配列を含み、この第３の核酸配列は天然のａｃｅ３ターミネーター配列を含む。本方法の他の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞のゲノムに組み込まれる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞のゲノムのテロメア部位に組み込まれる。他の特定の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞ゲノムのグルコアミラーゼ（ｇｌａ１）遺伝子座に組み込まれる。本方法の別の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、配列番号４、配列番号１１または配列番号１３に対して約９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４に対して９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
したがって、他の実施形態の方法８では、内因性ＰＯＩはリグノセルロース分解酵素である。特定の実施形態では、リグノセルロース分解酵素は、セルラーゼ酵素、ヘミセルラーゼ酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、セルラーゼ酵素は、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｅｇｌ６、ｂｇｌ１、ｂｇｌ２、ｓｗｏ１、ｃｉｐ１およびｃｉｐ２からなる群から選択される。他の実施形態では、ヘミセルラーゼ酵素は、ｘｙｎ１、ｘｙｎ２、ｘｙｎ３、ｘｙｎ４、ｂｘｌ１、ａｂｆ１、ａｂｆ２、ａｂｆ３、ａｘｅ１、ａｘｅ２、ａｘｅ３、ｍａｎ１、ａｇｌ１、ａｇｌ２、ａｇｌ３およびｇｌｒ１からなる群から選択される。
本方法の別の実施形態では、工程（ｉ）は、異種ＰＯＩをコードする、導入されたポリヌクレオチドコンストラクトをさらに含む。特定の実施形態では、異種ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドコンストラクトは、セルロース誘導性遺伝子プロモーターの制御下で発現する。本方法の、他の特定の実施形態では、工程（ｉ）のプロモーターは、ｒｅｖ３プロモーター（配列番号１５）、ｂｘｌプロモーター（配列番号１６）、ｔｋｌ１プロモーター（配列番号１７、ＰＩＤ１０４２９５プロモーター（配列番号１８）、ｄｌｄ１プロモーター（配列番号１９）、ｘｙｎ４プロモーター（配列番号２０）、ＰＩＤ７２５２６プロモーター（配列番号２１）、ａｘｅ１プロモーター（配列番号２２）、ｈｘｋ１プロモーター（配列番号２３）、ｄｉｃ１プロモーター（配列番号２４）、ｏｐｔプロモーター（配列番号２５）、ｇｕｔ１プロモーター（配列番号２６）、およびｐｋｉ１プロモーター（配列番号２７）からなる群から選択される。別の実施形態では、本方法は、配列番号４８の野生型キシラナーゼレギュレーター１（Ｘｙｒ１）タンパク質、または配列番号４６の変異キシラナーゼレギュレーター１（Ｘｙｒ１）タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを発現する遺伝子改変をさらに含む。他の特定の実施形態では、本方法は、内因性炭素カタボライトリプレッサー１（Ｃｒｅ１）タンパク質またはＡｃｅ１タンパク質をコードする遺伝子の発現を減少または抑制する遺伝子の改変をさらに含む。さらに他の実施形態では、本方法はＡｃｅ２タンパク質を発現する遺伝子の改変をさらに含む。
他の特定の実施形態では、本開示は誘導基質の非存在下、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の真菌細胞中で目的異種タンパク質を産生する方法に関し、この方法は（ｉ）５’から３’の方向に（ａ）構成的プロモーターを含む第１の核酸配列、および（ｂ）第１の核酸配列に作動可能に連結した第２の核酸配列（この第２の核酸配列は、配列番号６に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードし、最後の４つのＣ末端アミノ酸として「Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ」を含む）を含むポリヌクレオチドコンストラクトを真菌細胞に導入する工程と、（ｉｉ）真菌細胞の増殖およびタンパク質の産生に好適な条件下で（このような好適な増殖条件は誘導基質を含まない）工程（ｉ）の細胞を発酵させる工程とを含む。したがって、本方法の特定の実施形態では、真菌細胞は、異種ＰＯＩをコードする、導入されたポリヌクレオチドコンストラクトを含み、このコンストラクトは、工程（ｉ）の前、工程（ｉ）の間、または工程（ｉ）の後に真菌細胞に導入される）。別の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、第２の核酸の３’に作動可能に連結された第３の核酸配列を含み、この第３の核酸配列は天然のａｃｅ３ターミネーター配列を含む。本方法の他の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞のゲノムに組み込まれる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞のゲノムのテロメア部位に組み込まれる。他の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞ゲノムのグルコアミラーゼ（ｇｌａ１）遺伝子座に組み込まれる。
本方法の他の特定の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、配列番号４、配列番号１１または配列番号１３に対して約９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４に対して９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４のアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、異種ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドコンストラクトは、セルロース誘導性遺伝子プロモーターの制御下で発現する。他の特定の実施形態では、異種ＰＯＩは、α－アミラーゼ、アルカリα－アミラーゼ、β－アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ、キシラナーゼ、インベルターゼ、ラクターゼ、ナリンガナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ブロメライン、中性プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、ペプチダーゼ、レンネット、レニン、キモシン、スブチリシン、テルモリシン、アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリプシン、リパーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、アミダーゼ、イミノアシラーゼ、グルタミナーゼ、リゾチーム、ペニシリンアシラーゼ、イソメラーゼ、オキシドレダクターゼ、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、リアーゼ、アスパラギン酸β－デカルボキシラーゼ、フマラーゼ、ヒスタダーゼ、トランスフェラーゼ、リガーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、ラッカーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼおよびトランスグルタミナーゼからなる群から選択される。
本方法の他の実施形態では、工程（ｉ）のプロモーターはｒｅｖ３プロモーター（配列番号１５）、ｂｘｌプロモーター（配列番号１６）、ｔｋｌ１プロモーター（配列番号１７、ＰＩＤ１０４２９５プロモーター（配列番号１８）、ｄｌｄ１プロモーター（配列番号１９）、ｘｙｎ４プロモーター（配列番号２０）、ＰＩＤ７２５２６プロモーター（配列番号２１）、ａｘｅ１プロモーター（配列番号２２）、ｈｘｋ１プロモーター（配列番号２３）、ｄｉｃ１プロモーター（配列番号２４）、ｏｐｔプロモーター（配列番号２５）、ｇｕｔ１プロモーター（配列番号２６）、およびｐｋｉ１プロモーター（配列番号２７）からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、本方法は、配列番号４８の野生型キシラナーゼレギュレーター１（Ｘｙｒ１）タンパク質、または配列番号４６の変異キシラナーゼレギュレーター１（Ｘｙｒ１）タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを発現する遺伝子改変をさらに含む。別の実施形態では、本方法は、内因性炭素カタボライトリプレッサー１（Ｃｒｅ１）タンパク質またはＡｃｅ１タンパク質をコードする遺伝子の発現を減少または抑制する遺伝子改変をさらに含む。さらに他の実施形態では、本方法は、Ａｃｅ２タンパク質の発現を含む遺伝子改変をさらに含む。
別の実施形態では、本開示は、誘導基質の非存在下、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の真菌細胞中で目的異種タンパク質を産生する方法に関し、この方法は（ｉ）５’から３’の方向に（ａ）構成的プロモーターを含む第１の核酸配列、および（ｂ）第１の核酸配列に作動可能に連結した第２の核酸配列（この第２の核酸配列は、配列番号１２に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードする）を含むポリヌクレオチドコンストラクトを真菌細胞に導入する工程と、（ｉｉ）真菌細胞の増殖およびタンパク質の産生に好適な条件下で（このような好適な増殖条件は誘導基質を含まない）工程（ｉ）の細胞を発酵させる工程とを含む。特定の実施形態では、真菌細胞は異種ＰＯＩをコードする、導入されたポリヌクレオチドコンストラクトを含む（このコンストラクトは、工程（ｉ）の前、工程（ｉ）の間、または工程（ｉ）の後に真菌細胞に導入される）。他の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、第２の核酸の３’に作動可能に連結された第３の核酸配列を含み、この第３の核酸配列は天然のａｃｅ３ターミネーター配列を含む。本方法の他の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞のゲノムに組み込まれる。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞のゲノムのテロメア部位に組み込まれる。他の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、真菌細胞ゲノムのグルコアミラーゼ（ｇｌａ１）遺伝子座に組み込まれる。さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチドコンストラクトは、配列番号４、配列番号１１または配列番号１３に対して約９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４に対して９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６、配列番号１２または配列番号１４のアミノ酸配列を含む。本方法の別の実施形態では、異種ＰＯＩをコードするポリヌクレオチドコンストラクトは、セルロース誘導性遺伝子プロモーターの制御下で発現する。特定の実施形態では、異種ＰＯＩは、α－アミラーゼ、アルカリα－アミラーゼ、β－アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ、キシラナーゼ、インベルターゼ、ラクターゼ、ナリンガナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ブロメライン、中性プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、ペプチダーゼ、レンネット、レニン、キモシン、スブチリシン、テルモリシン、アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリプシン、リパーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、アミダーゼ、イミノアシラーゼ、グルタミナーゼ、リゾチーム、ペニシリンアシラーゼ、イソメラーゼ、オキシドレダクターゼ、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、リアーゼ、アスパラギン酸β－デカルボキシラーゼ、フマラーゼ、ヒスタダーゼ、トランスフェラーゼ、リガーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、ラッカーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼおよびトランスグルタミナーゼからなる群から選択される。
本方法の他の実施形態では、工程（ｉ）のプロモーターはｒｅｖ３プロモーター（配列番号１５）、ｂｘｌプロモーター（配列番号１６）、ｔｋｌ１プロモーター（配列番号１７、ＰＩＤ１０４２９５プロモーター（配列番号１８）、ｄｌｄ１プロモーター（配列番号１９）、ｘｙｎ４プロモーター（配列番号２０）、ＰＩＤ７２５２６プロモーター（配列番号２１）、ａｘｅ１プロモーター（配列番号２２）、ｈｘｋ１プロモーター（配列番号２３）、ｄｉｃ１プロモーター（配列番号２４）、ｏｐｔプロモーター（配列番号２５）、ｇｕｔ１プロモーター（配列番号２６）、およびｐｋｉ１プロモーター（配列番号２７）からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、本方法は、配列番号４８の野生型キシラナーゼレギュレーター１（Ｘｙｒ１）タンパク質、または配列番号４６の変異キシラナーゼレギュレーター１（Ｘｙｒ１）タンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを発現する遺伝子の改変をさらに含む。別の実施形態では、本方法は、内因性炭素カタボライトリプレッサー１（Ｃｒｅ１）タンパク質またはＡｃｅ１タンパク質をコードする遺伝子の発現を減少または抑制する遺伝子の改変をさらに含む。さらに他の実施形態では、本方法はＡｃｅ２タンパク質を発現する遺伝子の改変をさらに含む。
他の特定の実施形態では、本開示は、誘導基質の非存在下、内因性タンパク質の産生を増加させるためにトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）株を遺伝子的に改変する方法に関し、この方法は、（ｉ）配列番号３のＡｃｅ３－Ｓタンパク質、配列番号８のＡｃｅ３－ＳＣタンパク質または配列番号１０のＡｃｅ３－ＬＣタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子のゲノムコピーを含む、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株をスクリーニングし、同定する工程（同定されたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株は、配列番号６のＡｃｅ３－Ｌタンパク質、配列番号１４のＡｃｅ３－ＬＮタンパク質または配列番号１２のＡｃｅ３－ＥＬタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子のゲノムコピーを含まない）と、（ｉｉ）工程（ｉ）で同定されたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株に、５’から３’の方向に、（ａ）プロモーターを含む第１の核酸配列、および（ｂ）第１の核酸配列に作動可能に連結した第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドコンストラクト導入する工程（第２の核酸配列は、配列番号６に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードし、最後の４つのＣ末端アミノ酸として「Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ」を含む、または第２の核酸配列は、配列番号１２に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ－３タンパク質をコードする）と、（ｉｉｉ）真菌細胞の増殖およびタンパク質の産生に好適な条件下（このような好適な増殖条件は誘導基質を含まない）で工程（ｉｉ）の細胞を発酵させる工程とを含む。
他の特定の実施形態では、本開示は、親糸状菌細胞に由来する変異糸状菌細胞に関し、この変異細胞は、代替プロモーターで置換された天然のａｃｅ３遺伝子プロモーターを含み、この変異細胞は、変異細胞と親細胞が類似の条件下で培養された場合、誘導基質の非存在下で親細胞と比較してより多くの量の目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生する。特定の実施形態では、代替プロモーターはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）プロモーターである。別の実施形態では、代替プロモーターは、ｒｅｖ３プロモーター（配列番号１５）、ｂｘｌプロモーター（配列番号１６）、ｔｋｌ１プロモーター（配列番号１７）、ＰＩＤ１０４２９５プロモーター（配列番号１８）、ｄｌｄ１プロモーター（配列番号１９）、ｘｙｎ４プロモーター（配列番号２０）、ＰＩＤ７２５２６プロモーター（配列番号２１）、ａｘｅ１プロモーター（配列番号２２）、ｈｘｋ１プロモーター（配列番号２３）、ｄｉｃ１プロモーター（配列番号２４）、ｏｐｔプロモーター（配列番号２５）、ｇｕｔ１プロモーター（配列番号２６）、およびｐｋｉ１プロモーター（配列番号２７）からなる群から選択されるプロモーターである。
図１は、Ａｃｅ３タンパク質コード領域の模式図を示す。より詳しくは、図１Ａは、ゲノム中の同じＤＮＡ配列にアラインされた（図１Ａ）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＱＭ６ａおよびＲＵＴ－Ｃ３０のアノテーションに基づく、Ａｃｅ３タンパク質コード領域の模式図を示す。予測されるエクソンおよびイントロンを、それぞれ矢印および破線で示す。破線の垂直線は、ＲＵＴ－Ｃ３０ゲノムのナンセンス変異を示す。配列番号２のクローン化ａｃｅ３－Ｓ（短い）オープンリーディングフレームおよび配列番号５のクローン化ａｃｅ３－Ｌ（長い）オープンリーディングフレームは、本願に記載のようにスクリーニングし、試験した。図１Ｂに、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＵＴ－Ｃ３０由来のＡｃｅ３－Ｌタンパク質（配列番号６）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＱＭ６ａ由来のＡｃｅ３－Ｓタンパク質（配列番号３）、Ａｃｅ３－ＳＣタンパク質（配列番号８）、Ａｃｅ３－ＬＮタンパク質（配列番号１４）、Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質（配列番号１０）およびＡｃｅ３－ＥＬタンパク質（配列番号１２）のアミノ酸アラインメントを示す。 図２は、Ａｃｅ３発現ベクターｐＹＬ１（図２Ａ）、ｐＹＬ２（図２Ｂ）、ｐＹＬ３（図２Ｃ）およびｐＹＬ４（図２Ｄ）の模式図を示す。 図３は、親および変異細胞を、２０％ラクトース（ｌａｃ）または２０％グルコース（ｇｌｕ）を含有するｓｒＭＴＰ中の規定培地中で増殖させた場合の、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親および変異細胞上清のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を示す。各レーンで、等容量の培養上清を使用した。Ｍは分子量マーカーであり、親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株を対照株とした。 図４は、１．５％グルコース／ソホロース（ｓｏｐ）または１．５％グルコース（ｇｌｕ）を補充した規定培地中、振盪フラスコ内で親および変異細胞を増殖させた場合の、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親および変異細胞上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。各レーンで、等容量の培養上清を使用した。培養上清の全タンパク質濃度を、各対応するレーンの下に示す。Ｍは分子量マーカーであり、ＫＤはキロダルトンである。 図５は、炭素源としてグルコース／ソホロース（ｓｏｐ）またはグルコース（ｇｌｕ）を補充した規定培地中、２Ｌ発酵槽内で増殖させた、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親および変異細胞のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。Ｍは分子量マーカーであり、ゼロ（０）は種培養上清である。 図６は、ａｃｅ３遺伝子座の天然プロモーター上流の５’領域を含むＤＮＡフラグメント、ｌｏｘＰ隣接ハイグロマイシンＢ耐性（選択マーカー）カセット、およびａｃｅ３ＯＲＦの５’末端に作動可能に融合（連結）した目的プロモーターを含むＤＮＡフラグメントを融合することによって作製されたプロモーター置換コンストラクトの模式図を示す。 図７は、ｄｉｃ１プロモーターを含むＡｃｅ３発現ベクターｐＹＬ８の模式図を示す。 図８は、２．５％グルコース／ソホロース（「Ｓｏｐ」、誘導条件）または２．５％グルコース（「Ｇｌｕ」、非誘導条件）を補充した規定培地中、振盪フラスコ内で親および改変株を増殖させた場合の、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親およびその改変（娘）細胞上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。各レーンで、等容量の培養上清を使用した。Ｍは分子量マーカーであり、ＫＤはキロダルトンである。 図９は、小規模（２Ｌ）発酵におけるタンパク質の産生を示す。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親株および娘株「ＬＴ８３」を、炭素源としてグルコース／ソホロース（Ｓｏｐ、誘導条件）またはグルコース（Ｇｌｕ、非誘導条件）を含む規定培地中で増殖させた。発酵の終わりにグルコース／ソホロース上で親株によって産生された全タンパク質を任意で１００に設定し、各時点で各株によって産生されたタンパク質の相対量をプロットした。 図１０は、２．５％グルコース／ソホロース（「Ｓｏｐ」、誘導条件）または２．５％グルコース（「Ｇｌｕ」、非誘導条件）を補充した規定培地中、振盪フラスコ内で親および改変株を増殖させた場合の、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親およびその変異（娘）細胞上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。各レーンで、等容量の培養上清を使用した。Ｍは分子量マーカーであり、ＫＤはキロダルトンである。 図１１は、ａｃｅ３遺伝子座の模式図を示す。ａｃｅ３遺伝子座の５’末端（Ｎ末端）の矢印は、ｃＤＮＡ配列によって示唆される形態（矢印１）、ＲｕｔＣ－３０アノテーション形態（矢印２）およびＱＭ６ａアノテーション形態（矢印３）における異なる転写開始部位を示す。ａｃｅ３遺伝子座の３’末端（Ｃ末端）の矢印は、ＲｕｔＣ－３０アノテーション形態（矢印４）およびＱＭ６ａアノテーション形態（矢印５）における異なる停止コドンを示す。 図１２は、クローン化された異なるａｃｅ３形態の模式図を示す。したがって、図１２に示され、そして実施例６に記載されるように、以下のａｃｅ３形態をクローン化し、試験した：１，７１３ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１７７ｂｐのエクソン４を含む配列番号１の「ａｃｅ３－Ｓ」、１，７１３ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１４４ｂｐのエクソン４を含む配列番号７の「ａｃｅ３－ＳＣ」、２５８ｂｐのエクソン２、４２３ｂｐのイントロン２、１，６３５ｂｐエクソン３、１４８ｂｐイントロン３および１４４ｂｐのエクソン４を含む配列番号４の「ａｃｅ３－Ｌ」、２５８ｂｐのエクソン２、４２３ｂｐのイントロン２、１，６３５ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１７７ｂｐのエクソン４を含む配列番号９の「ａｃｅ３－ＬＣ」、６１ｂｐのエクソン１、１４２ｂｐのイントロン１、３３２ｂｐのエクソン２、４２３ｂｐのイントロン２、１，６３５ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１４４ｂｐのエクソン４を含む配列番号１１の「ａｃｅ３－ＥＬ」、ならびに２５８ｂｐのエクソン２、１，６３５ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１４４ｂｐのエクソン４を含む配列番号１３の「ａｃｅ３－ＬＮ」。 図１３は、ａｃｅ３－ＳＣ遺伝子形態の核酸配列（配列番号７；１，７１３ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１４４ｂｐのエクソン４を含む）、ならびにコードされたＡｃｅ３－ＳＣタンパク質配列（配列番号８）を示す。ａｃｅ３－ＳＣ遺伝子形態について図１３に示すように、太字の黒色テキストで示されるヌクレオチドは、イントロン配列を表す。 図１４は、ａｃｅ３－Ｓ遺伝子形態の核酸配列（配列番号１；１，７１３ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１７７ｂｐのエクソン４を含む）ならびにコードされたＡｃｅ３－Ｓタンパク質配列（配列番号３）を示す。ａｃｅ３－Ｓ遺伝子形態について図１４に示すように、太字の黒色テキストで示すヌクレオチドは、イントロン配列を表す。 図１５は、ａｃｅ３－Ｌ遺伝子形態の核酸配列（配列番号４；２５８ｂｐのエクソン２、４２３ｂｐのイントロン２、１，６３５ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１４４ｂｐのエクソン４を含む）、ならびにコードされたＡｃｅ３－Ｌタンパク質配列（配列番号６）を示す。ａｃｅ３－Ｌ遺伝子形態について図１５に示すように、太字の黒色テキストで示すヌクレオチドは、イントロン配列を表す。 図１６は、ａｃｅ３－ＬＣ遺伝子形態の核酸配列（配列番号９、２５８ｂｐのエクソン２、４２３ｂｐのイントロン２、１，６３５ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１７７ｂｐのエクソン４を含む）、ならびにコードされたＡｃｅ３－ＬＣタンパク質配列（配列番号１０）を示す。ａｃｅ３－ＬＣ遺伝子形態について図１６に示すように、太字の黒色テキストで示すヌクレオチドは、イントロン配列を表す。 図１７は、ａｃｅ３－ＥＬ遺伝子形態の核酸配列（配列番号１１；６１ｂｐのエクソン１、１４２ｂｐのイントロン１、３３２ｂｐのエクソン２、４２３ｂｐのイントロン２、１，６３５ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１４４ｂｐのエクソン４を含む）、ならびにコードされたＡｃｅ３－ＥＬタンパク質配列（配列番号１２）を示す。ａｃｅ３－ＥＬ遺伝子形態について図１７に示すように、太字の黒色テキストで示すヌクレオチドは、イントロン配列を表す。 図１８は、ａｃｅ３－ＬＮ遺伝子形態の核酸配列（配列番号１３；２５８ｂｐのエクソン２、１，６３５ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１４４ｂｐのエクソン４を含む）、ならびにコードされたＡｃｅ３－ＬＮタンパク質配列（配列番号１４）を示す。ａｃｅ３－ＬＮ遺伝子形態について図１８に示すように、太字の黒色テキストで示すヌクレオチドは、イントロン配列を表す。 図１９は、ｇｌａ１遺伝子座へのａｃｅ３形態の組み込みのために設計されたＤＮＡフラグメント配置の模式図を示す。 図２０は、ベクターｐＭＣＭ３２８２の模式図を示す。 図２１は、ベクターｐＣＨＬ７６０の模式図を示す。 図２２は、ベクターｐＣＨＬ７６１の模式図を示す。 図２３は、誘導（「Ｇｌｕ／Ｓｏｐ」）および非誘導（「Ｇｌｕ」）培養条件下で、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親細胞（図２３、細胞識別番号１２７５．８．１）および変異Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）（娘）細胞（図２３、細胞識別番号２２１８、２２１９、２２２０、２２２２および２２２３）の浸漬培養（すなわち、振盪フラスコ）によって産生された分泌タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。
生物学的配列の簡単な説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１－１．８２５（“Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ―ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ”）に適合しており、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（２００９）、欧州特許条約（ＥＰＣ）および特許協力条約（ＰＣＴ）規則５．２および４９．５（ａ－ｂｉｓ）、ならびに実施細則の第２０８章および附属書Ｃの配列表要件と一致している。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用した記号およびフォーマットは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に規定された規則を順守している。
配列番号１は、配列番号３のＡｃｅ３－Ｓタンパク質をコードする遺伝子を含む、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）野生型株ＱＭ６ａ核酸配列である。
配列番号２は、配列番号３のＡｃｅ３－Ｓタンパク質をコードする核酸配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）である。
配列番号３は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（ＱＭ６ａ株）Ａｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列であり、以下「Ａｃｅ３－Ｓ」と称する。
配列番号４は、配列番号６のＡｃｅ３－Ｌタンパク質をコードする遺伝子を含む、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）Ｒｕｔ－Ｃ３０株の核酸配列である。
配列番号５は、配列番号６のＡｃｅ３－Ｌタンパク質をコードする核酸配列のＯＲＦである。
配列番号６は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（Ｒｕｔ－Ｃ３０株）Ａｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列であり、以下「Ａｃｅ３－Ｌ」と称する。
配列番号７は、配列番号８のＡｃｅ３－ＳＣタンパク質をコードする遺伝子を含む、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の核酸配列である。
配列番号８は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）Ａｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列であり、以下「Ａｃｅ３－ＳＣ」と称する。
配列番号９は、配列番号１０のＡｃｅ３－ＬＣタンパク質をコードする遺伝子を含む、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の核酸配列である。
配列番号１０は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）Ａｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列であり、以下「Ａｃｅ３－ＬＣ」と称する。
配列番号１１は、配列番号１２のＡｃｅ３－ＥＬタンパク質をコードする遺伝子を含む、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の核酸配列である。
配列番号１２は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）Ａｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列であり、以下「Ａｃｅ３－ＥＬ」と称する。
配列番号１３は、配列番号１４のＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする遺伝子を含む、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の核酸配列である。
配列番号１４は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）Ａｃｅ３タンパク質のアミノ酸配列であり、以下「Ａｃｅ３－ＬＮ」と称する。
配列番号１５は、ｒｅｖ３プロモーター配列を含む核酸配列である。
配列番号１６は、β－ｘｙｌプロモーター配列を含む核酸配列である。
配列番号１７は、ｔｋｉ１プロモーター配列を含む核酸配列である。
配列番号１８は、ＰＩＤ１０４２９５プロモーター配列を含む核酸配列である。
配列番号１９は、ｄｌｄ１プロモーター配列を含む核酸配列である。
配列番号２０は、ｘｙｎ４プロモーター配列を含む核酸配列である。
配列番号２１は、ＰＩＤ７２５２６プロモーター配列を含む核酸配列である。
配列番号２２は、ａｘｅ３プロモーター配列を含む核酸配列である。
配列番号２３は、ｈｘｋ１プロモーター配列を含む核酸配列である。
配列番号２４は、ｄｉｃ１プロモーター配列を含む核酸配列である。
配列番号２５は、ｏｐｔプロモーター配列を含む核酸配列である。
配列番号２６は、ｇｕｔ１プロモーター配列を含む核酸配列である。
配列番号２７は、ｐｋｉ１プロモーター配列を含む核酸配列である。
配列番号２８は、プライマーＴＰ１３の核酸配列である。
配列番号２９は、プライマーＴＰ１４の核酸配列である。
配列番号３０は、プライマーＴＰ１５の核酸配列である。
配列番号３１は、プライマーＴＰ１６の核酸配列である。
配列番号３２は、プライマーＴＰ１７の核酸配列である。
配列番号３３は、プライマーＴＰ１８の核酸配列である。
配列番号３４は、プライマーＴＰ１９の核酸配列である。
配列番号３５は、プライマーＴＰ２０の核酸配列である。
配列番号３６は、プライマーＴＰ２１の核酸配列である。
配列番号３７は、プライマーＴＰ２２の核酸配列である。
配列番号３８は、プライマーＴＰ２３の核酸配列である。
配列番号３９はプライマーＴＰ２４の核酸配列である。
配列番号４０は、プライマーＴＰ２５の核酸配列である。
配列番号４１は、プライマーＴＰ２６の核酸配列である。
配列番号４２は、プラスミドｐＹＬ１の核酸配列である。
配列番号４３は、プラスミドｐＹＬ２の核酸配列である。
配列番号４４は、プラスミドｐＹＬ３の核酸配列である。
配列番号４５は、プラスミドｐＹＬ４の核酸配列である。
配列番号４６は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｘｙｒ１（Ａ８２４Ｖ）変異タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４７は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ａｃｅ２タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４８は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）野生型ｘｙｒ１タンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４９は、プライマーの核酸配列である。
配列番号５０は、プライマーの核酸配列である。
配列番号５１は、プライマーの核酸配列である。
配列番号５２は、プライマーの核酸配列である。
配列番号５３はプライマーの核酸配列である。
配列番号５４は、プライマーの核酸配列である。
配列番号５５は、プライマーの核酸配列である。
配列番号５６は、プライマーの核酸配列である。
配列番号５７は、プライマーの核酸配列である。
配列番号５８は、プライマーの核酸配列である。
配列番号５９は、プライマーの核酸配列である。
配列番号６０は、プライマーの核酸配列である。
配列番号６１は、プライマーの核酸配列である。
配列番号６２は、プライマーの核酸配列である。
配列番号６３は、プライマーの核酸配列である。
配列番号６４はプライマーの核酸配列である。
配列番号６５は、プライマーの核酸配列である。
配列番号６６は、プライマーの核酸配列である。
配列番号６７は、プライマーの核酸配列である。
配列番号６８は、プライマーの核酸配列である。
配列番号６９は、プライマーの核酸配列である。
配列番号７０は、プライマーの核酸配列である。
配列番号７１は、プライマーの核酸配列である。
配列番号７２は、プライマーの核酸配列である。
配列番号７３は、プライマーの核酸配列である。
配列番号７４は、プライマーの核酸配列である。
配列番号７５は、プライマーの核酸配列である。
配列番号７６は、プライマーの核酸配列である。
配列番号７７は、プライマーの核酸配列である。
配列番号７８は、プライマーの核酸配列である。
配列番号７９は、プライマーの核酸配列である。
配列番号８０は、プライマーの核酸配列である。
配列番号８１は、プライマーの核酸配列である。
配列番号８２は、人工核酸配列である。
配列番号８３は、人工核酸配列である。
配列番号８４は、人工核酸配列である。
配列番号８５は、人工核酸配列である。
配列番号８６は、人工核酸配列である。
配列番号８７は、人工核酸配列である。
配列番号８８は、人工核酸配列である。
配列番号８９は、人工核酸配列である。
配列番号９０は、人工核酸配列である。
配列番号９１は、人工核酸配列である。
配列番号９２は、プライマーの核酸配列である。
配列番号９３は、プライマーの核酸配列である。
配列番号９４は、プライマーの核酸配列である。
配列番号９５は、プライマーの核酸配列である。
配列番号９６は、プライマーの核酸配列である。
配列番号９７は、プライマーの核酸配列である。
配列番号９８は、配列番号１２のＡｃｅ３－ＥＬタンパク質のＮ末端配列の４５（４５）位のアミノ酸フラグメントを含むアミノ酸配列である。
配列番号９９は、Ａｃｅ３－ＳＣタンパク質をコードする核酸配列のＯＲＦである。
配列番号１００は、Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質をコードする核酸配列のＯＲＦである。
配列番号１０１は、Ａｃｅ３－ＥＬタンパク質をコードする核酸配列のＯＲＦである。
配列番号１０２は、Ａｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする核酸配列のＯＲＦである。
Ｉ．概要
本開示の特定の実施形態は、１つ以上の目的タンパク質の産生を増加させるための、変異糸状菌細胞、その組成物、およびその方法に関する。より詳しくは、本開示の特定の実施形態は、誘導飼料（すなわち、ラクトース、ソホロース、ゲンチオビオース、セルロースなどの誘導基質）の非存在下で、１つ以上の目的タンパク質を産生することができる変異糸状菌細胞に関する。したがって、本開示の特定の実施形態は、親糸状菌細胞由来の変異糸状菌（宿主）細胞に関し、その変異宿主細胞は、誘導基質の非存在下で、（目的タンパク質をコードする）目的遺伝子の発現を可能にする遺伝子の改変を含む。（目的タンパク質をコードする）目的遺伝子は、内因性の糸状菌細胞遺伝子（例えば、ｃｂｈ１、ｃｈｂ２、ｘｙｎ１、ｘｙｎ２、ｘｙｎ３、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｂｇｌ１、ｂｇｌ２など）または糸状菌細胞に対して異種の遺伝子であり得る。
したがって、他の特定の実施形態では、本開示の変異真菌宿主細胞は、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質（配列番号６）、Ａｃｅ３－ＥＬタンパク質（配列番号１２）およびＡｃｅ３－ＬＮタンパク質（配列番号１４）からなる群から選択される、Ａｃｅ３タンパク質をコードする「セルラーゼ発現の活性化因子３」（ａｃｅ３）遺伝子の発現を増加させる遺伝子改変を含む。他の実施形態では、本開示の変異真菌宿主細胞は、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質（配列番号６）、Ａｃｅ３－ＥＬタンパク質（配列番号１２）およびＡｃｅ３－ＬＮタンパク質（配列番号１４）からなる群から選択される、Ａｃｅ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現を増加させる遺伝子改変を含む。したがって、特定の実施形態では、本開示の変異真菌宿主細胞は、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質（配列番号６）、Ａｃｅ３－ＥＬタンパク質（配列番号１２）およびＡｃｅ３－ＬＮタンパク質（配列番号１４）からなる群から選択される、Ａｃｅ３タンパク質に対して、約９０％～約９９％の配列同一性を有するＡｃｅ３タンパク質をコードするＡｃｅ３遺伝子またはそのＯＲＦの発現／産生を増加させる遺伝子改変を含む。
特定の実施形態では、Ａｃｅ３タンパク質（すなわち、Ａｃｅ３－Ｌ、Ａｃｅ３－ＥＬまたはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質）の発現を増加させる遺伝子改変は、糸状菌宿主細胞のゲノム（染色体）に組み込まれたａｃｅ３発現カセットである。他の実施形態では、糸状菌細胞内でＡｃｅ３タンパク質の発現を増加させる遺伝子改変は、ａｃｅ３発現カセット（すなわち、Ａｃｅ３－Ｌ、Ａｃｅ３－ＥＬまたは、Ａｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする）を含むエピソーム的に維持されたプラスミドコンストラクトである。他の実施形態では、糸状菌細胞内でＡｃｅ３－Ｌ、Ａｃｅ３－ＥＬまたはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子の発現を増加させる遺伝子改変は、テロメア部位に組み込まれたテロメアベクター／プラスミドである。特定の実施形態では、そのような発現カセットまたはプラスミドは、２つ以上のコピー数で存在する。他の特定の実施形態では、ａｃｅ３遺伝子またはａｃｅ３のＯＲＦは、異種プロモーターに作動可能に連結している。他の実施形態では、糸状菌細胞内でＡｃｅ３－Ｌ、Ａｃｅ３－ＥＬまたはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子（またはそのＯＲＦ）の発現を増加させる遺伝子改変は、Ａｃｅ３－Ｌ、Ａｃｅ３－ＥＬまたはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子の発現を変化させる天然ａｃｅ３プロモーター（すなわち、ａｃｅ３遺伝子に天然に関連したａｃｅ３プロモーター領域）の改変である。
ＩＩ．定義
本組成物および方法をさらに詳細に説明する前に、以下の用語および語句を定義する。定義されない用語は、使用され、かつ当業者に知られている通常の意味と一致すべきである。
本明細書に引用されている全ての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
ある範囲の値が示されている場合、文脈上別段の明確な指示がなければ、その範囲の上限と下限の間にある下限値の単位の１０分の１までの各介在値、およびその範囲内の任意の他の記載された値または介在値は、本組成物および方法の範囲内に包含されると理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さい範囲に含まれ、また、記載された範囲における任意の具体的に除外された限界に従うことを条件として、本発明の組成物および方法に包含される。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限界の一方または両方を除く範囲もまた、本発明の組成物および方法に含まれる。
いくつかの範囲は、本明細書では、「約」という用語が先行する数値で示される。「約」という用語は、本明細書では、それが先行する正確な数、ならびにそれが先行する数に近い、または近似する数についてのリテラルサポート（ｌｉｔｅｒａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ）を提供するために使用される。数字が具体的に挙げられた数に近いまたは近似するかを決定する際に、挙げられていない近いまたは近似する数は、それが提示される文脈において、具体的に挙げられた数の実質的に等価な数を提供する数であり得る。例えば、数値に関連して「約」という用語は、その用語が文脈において特に明確に定義されていない限り、その数値の－１０％～＋１０％の範囲を指す。別の例では、「約６のｐＨ値」という句は、ｐＨ値が特に他に定義されていなければ、５．４～６．６のｐＨ値を指す。
本明細書に示した見出しは、本明細書全体を参照することによって得ることができる本組成物および方法の様々な態様または実施形態を限定するものではない。したがって、すぐ下で定義する用語は、本明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
この発明を実施するための形態によると、以下の略語および定義が適用される。単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上別段の明確な指示がなければ、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「酵素」への言及は、複数のそのような酵素を含み、「用量」への言及は、１つ以上の用量、および当業者に知られたその等価物への言及を含むなどである。
特許請求の範囲が、任意選択の要素を排除するように記載されていることにもさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の構成要素の列挙に関連して「唯一（ｓｏｌｅｌｙ）」、「ただ～のみ（ｏｎｌｙ）」、「～を除いて（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を含まない（ｎｏｔ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの排他的な用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための先行文として機能することを意図している。
さらに、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の後の成分を「含むが、それに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味することに留意されたい。「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の後の成分は必要または必須であるが、その成分を含む組成物は他の非必須または任意選択の成分をさらに含んでもよい。
「～から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）という用語は、本明細書で使用されるとき、「～から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）という用語の後の成分を「含み、かつそれに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味することに留意されたい。「～から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）という用語の後の成分は、したがって、必要または必須であり、かつその組成物には他の成分は含まれない。
本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載および例示する個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載する本組成物および方法の範囲または精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離または組み合わせることができる別個の構成要素および特徴を有する。記載した方法はいずれも、記載した事象の順序で、または論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
本明細書で使用されるとき、「子嚢菌真菌細胞」という用語は、菌界における子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）の任意の生物を指す。子嚢菌真菌細胞の例には、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種、およびペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種などのチャワンタケ（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門内の糸状菌が含まれるが、それらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「糸状菌」という用語は、真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）亜門および卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門の全ての糸状形態の菌を指す。例えば、糸状菌には、限定されないが、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、エメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、スキタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種が含まれる。いくつかの実施形態では、糸状菌は、アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フェチダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、またはアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）であり得る。
いくつかの実施形態では、糸状菌は、フザリウム・バクトリディオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロックウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウムオキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテチオデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）またはフザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）である。いくつかの実施形態では、糸状菌は、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、シタリジウム・テルモフィルム（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、またはチエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）である。
いくつかの実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）である。いくつかの実施形態では、糸状菌は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ寄託番号５６７６５としてＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能な、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株「Ｒｕｔ－Ｃ３０」由来のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞である。いくつかの実施形態では、糸状菌は、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの培養物コレクションからＮＲＲＬ番号１５７０９として入手可能な、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株「ＲＬ－Ｐ３７」由来のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞である。
本明細書で使用されるとき、「変異糸状菌細胞」、「変異真菌細胞」、「変異細胞」などという語句は、チャワンタケ（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門に属する親（対照）糸状菌細胞に由来する（すなわち、得られる）糸状菌細胞を指す。したがって、本明細書で定義される「変異」糸状菌細胞は「親」糸状菌細胞に由来するが、この「変異」細胞は、「親」細胞にはない少なくとも１つの遺伝子改変を含む。例えば、本開示の「変異糸状菌細胞」と「親糸状菌細胞」を比較する場合、「親」細胞は、少なくとも１つの遺伝子改変を含む「変異」細胞に対して、遺伝子的に改変されていない（親）「対照」細胞としての役割を果たす。
本明細書で使用されるとき、「遺伝子改変」という用語は、核酸配列の改変／変化を指す。改変には、限定されないが、核酸配列中の少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失、挿入または化学的修飾が含まれ得る。
本明細書の定義では、「遺伝子改変を含む変異細胞」および「Ａｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬタンパク質および／またはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させる遺伝子改変を含む変異細胞」という語句は、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬタンパク質および／またはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする遺伝子またはＯＲＦの少なくとも１つのコピーを糸状菌細胞へ導入することを含むが、これに限定されない。したがって、外因的に導入された、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬタンパク質、および／またはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする遺伝子またはＯＲＦの少なくとも１つのコピーを含む糸状菌細胞は、親真菌細胞（改変されていない）と比較して、遺伝子改変を含む変異真菌細胞である。
他の実施形態では、本開示の親真菌細胞は、本明細書で開示されるＡｃｅ３タンパク質のいずれかをコードする内因性ａｃｅ３遺伝子（すなわち、Ａｃｅ３－Ｓタンパク質、Ａｃｅ３－ＳＣタンパク質、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＬＣタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬタンパク質およびＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子）の存在に関してスクリーニングされる。例えば、親真菌細胞が、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬタンパク質、またはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子の内因性コピーを含むと決定された場合、その改変真菌細胞は、遺伝子改変によって、例えば、ａｃｅ３遺伝子の内因性プロモーターを異種プロモーターで置換することによって生成し得る。同様に、親真菌細胞がＡｃｅ３－Ｓタンパク質、Ａｃｅ３－ＳＣタンパク質、またはＡｃｅ３－ＬＣタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子の内因性コピーを含むと決定された場合、その変異真菌細胞は、遺伝子改変によって、例えば、本開示のＡｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬタンパク質、および／またはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトを真菌細胞に導入することによって生成することができ、これは、Ａｃｅ３－Ｓ、Ａｃｅ３－ＳＣ、またはＡｃｅ３－ＬＣタンパク質をコードする内因性ａｃｅ３遺伝子の遺伝子改変をさらに含み得る。
他の実施形態では、本開示の変異糸状菌細胞は、さらなる遺伝子改変を含むであろう。例えば、特定の実施形態では、そのような変異糸状菌細胞（すなわち、本開示のＡｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬおよび／またはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする遺伝子またはＯＲＦの外因的に導入されたコピーを含む）は、炭素カタボライトリプレッサータンパク質「Ｃｒｅ１」またはＡｃｅ１リプレッサータンパク質をコードする遺伝子の発現および／または活性を低下させる遺伝子改変をさらに含む。
他の実施形態では、そのような変異糸状菌細胞（すなわち、本開示のＡｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬおよび／またはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする遺伝子またはＯＲＦの外因的に導入されたコピーを含む）は、配列番号２５または配列番号２７に示されるキシラナーゼレギュレーター１（Ｘｙｒ１）の少なくとも１つのコピーを導入する遺伝子改変をさらに含む。
本明細書で使用されるとき、「Ａｃｅ３－Ｌ」タンパク質形態（配列番号６）および「Ａｃｅ３－ＬＮ」タンパク質形態（配列番号１４；図１Ｂを参照されたい）は、同一のアミノ酸配列を含む。しかしながら、見出し「Ａｃｅ３－Ｌ」および「Ａｃｅ３－ＬＮ」は、そのようなタンパク質形態をコードするその特定の遺伝子との比較のために、本開示の特定の実施形態で使用されるが、これは決して本開示を限定するものではない。
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」という用語は、本明細書に記載されているように、入ってくる配列（すなわち、細胞に導入されるポリヌクレオチド配列）のための、宿主および発現ビヒクルとして作用する能力を有する糸状菌細胞を指す。
「異種」核酸コンストラクトまたは配列は、それが発現される細胞に対して天然でないか、または天然の形態で存在しない配列の一部を有する。制御配列に関して、異種とは、現在発現を調節している同じ遺伝子に対して天然においては調節作用をしない制御配列（すなわち、プロモーターまたはエンハンサー）を指す。一般に、異種核酸配列は、それらが存在する細胞またはゲノムの一部に対して内因性ではなく、感染、トランスフェクション、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞に加えられたものである。「異種」核酸コンストラクトは、天然細胞に見出される制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同一であるか、または異なる制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせを含み得る。同様に、異種タンパク質は、天然において互いに同じ関係で見出されない２つ以上のサブ配列（例えば、融合タンパク質）を指すことが多い。
本明細書で使用されるとき、「ＤＮＡコンストラクト」または「発現コンストラクト」という用語は、少なくとも２つのＤＮＡポリヌクレオチドフラグメントを含む核酸配列を指す。ＤＮＡまたは発現コンストラクトを用いて、核酸配列を真菌宿主細胞に導入することができる。このＤＮＡはインビトロで（例えば、ＰＣＲで）または任意の他の好適な手法によって生成し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは目的配列（例えば、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質をコードする）を含む。特定の実施形態では、目的ポリヌクレオチド配列は、プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは少なくとも１つの選択マーカーをさらに含む。さらなる実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞染色体に相同な配列を含む。他の実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞染色体とは非相同な配列を含む。
本明細書で使用されるとき、「セルラーゼ」、「セルロース分解酵素」または「セルラーゼ酵素」という用語は、エキソグルカナーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼおよび／またはβ－グルコシダーゼなどの細菌酵素または真菌酵素を意味する。これらの異なるタイプのセルラーゼ酵素は、セルロースおよびその誘導体をグルコースに変換するのに相乗的に働く。例えば、多くの微生物、例えば、木材腐朽菌のトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、堆肥化細菌のテルモモノスポラ属（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）（現在は、テルモビフィダ属（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびセルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）；ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）；ならびに真菌フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、およびフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）は、セルロースを加水分解する酵素を産生する。これらの微生物が産生する酵素は、セルロースのグルコースへの変換に有用な３種類の作用を有するタンパク質の混合物、すなわちエンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、およびβ－グルコシダーゼ（ＢＧ）の混合物である。本明細書の定義では、「エンドグルカナーゼ」（ＥＧ）、「セロビオヒドロラーゼ」（ＣＢＨ）および「β－グルコシダーゼ」（ＢＧ）という用語は、それぞれ、それらの略語「ＥＧ」、「ＣＢＨ」および「ＢＧ」と互換的に使用される。
本明細書で使用されるとき、「炭素制限」という用語は、微生物が所望のタンパク質産物を辛うじて産生することができるだけの炭素は存在するが、生物の要求を完全に満たす、例えば、増殖を維持することができるだけの炭素は存在しない状態である。したがって、炭素の最大量はタンパク質の産生に使用される。
本明細書で使用されるとき、「プロモーター」という用語は、下流の遺伝子またはそのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の転写を指示するように機能する核酸配列を指す。プロモーターは一般に、標的遺伝子が発現している宿主細胞に適切である。プロモーターは他の転写および翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも呼ばれる）と共に、所与の遺伝子を発現させるために必要である。一般に、転写および翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および転写停止配列、翻訳開始および翻訳停止配列、ならびにエンハンサーまたは活性化因子の配列が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは構成的プロモーターである。
本明細書で使用されるとき、「プロモーター配列」は、発現目的のために特定の糸状菌によって認識されるＤＮＡ配列である。「プロモーター」は、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイと定義される。本明細書で使用されるとき、プロモーターには、転写開始部位近傍の必要な核酸配列を、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合にはＴＡＴＡエレメントを、含む。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導性プロモーター」は、環境的または発生的調節下で活性なプロモーターである。
「作動可能に連結された」という用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、または転写因子結合部位のアレイ）と、第２の核酸配列との機能的な連結を指し、発現制御配列が第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。したがって、核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に配置されたとき、「作動可能に連結されて」いる。例えば、分泌リーダー（すなわち、シグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合、コード配列に作動可能に連結されており；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」とは、連結されるＤＮＡ配列は隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合では、隣接し、かつリーディングフェースにあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、適当な制限部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法にしたがって、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。他の実施形態では、連結は、ＤＮＡを配列に依存せず瘢痕を残さない方法で結合するシームレスクローニング法によって行われる。シームレスクローニングは、通常、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）、およびＧｅｎｅＡｒｔ Ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの商業的に入手可能なシステムを用いて実行されるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「コード配列」という用語は、その（コードする）タンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定するヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は、一般に、通常ＡＴＧ開始コドンで始まるオープンリーディングフレームによって決まる。コード配列には、通常、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および組換えヌクレオチド配列が含まれる。
本明細書の定義では、「オープンリーディングフレーム」（以下「ＯＲＦ」）は、（ｉ）開始コドン、（ｉｉ）アミノ酸を示す一連の２以上のコドン、および（ｉｉｉ）終止コドンからなる連続するリーディングフレームを含む核酸または核酸配列（天然に存在するか、天然に存在しないか、または合成であるかにかかわらず）を意味し、ＯＲＦは、５’から３’の方向に読み取られる（または翻訳される）。
本明細書で使用されるとき、「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、これは、コード領域の前後の領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）配列または「リーダー」配列、および３’ＵＴＲ配列または「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでいても含んでいなくてもよい。遺伝子は、酵素（例えば、プロテアーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、リパーゼなど）などの商業的に重要な工業用タンパク質またはペプチドをコードし得る。目的遺伝子は、天然に存在する遺伝子、変異遺伝子または合成遺伝子であり得る。
細胞、核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用する場合の「組換え」という用語は、本明細書で使用されるとき、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸または異種タンパク質の導入によって、または天然の核酸またはタンパク質の改変によって改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内には見出されない遺伝子を発現するか、またはさもなければ異常に発現する、過少発現する、もしくは全く発現しない天然遺伝子を発現する。
「ベクター」という用語は、本明細書では、１つ以上の細胞型に導入する核酸配列を保有するように設計されたポリヌクレオチドとして定義される。ベクターには、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージまたはウイルス粒子、ＤＮＡコンストラクト、カセットなどが含まれる。発現ベクターには、プロモーター、シグナル配列、コード配列および転写ターミネーターなどの調節配列が含まれ得る。
本明細書で使用される「発現ベクター」は、好適な宿主中でタンパク質を発現させることができる好適な制御配列に、作動可能に連結されたコード配列を含むＤＮＡコンストラクトを意味する。このような制御配列には、転写を生じさせるプロモーター、転写を制御する任意選択的オペレーター配列、ｍＲＮＡ上の好適なリボソーム結合部位をコードする配列、エンハンサー、ならびに転写および翻訳の終了を制御する配列が含まれ得る。
本明細書で使用されるとき、「分泌シグナル配列」という用語は、より大きなポリペプチドの成分として、そのより大きなポリペプチドに、それが合成された細胞の分泌経路を通過させるポリペプチド（すなわち、「分泌ペプチド」）をコードするＤＮＡ配列を意味する。より大きなポリペプチドは、通常、分泌経路を通る過程で切断され、分泌ペプチドが除去される。
本明細書で使用されるとき、「誘導」という用語は、「インデューサー」（すなわち、誘導基質）の存在に応じて、極めて大きい速度で糸状菌細胞中での目的タンパク質（以下、「ＰＯＩ」）の合成をもたらす遺伝子の転写の増加を指す。ＰＯＩをコードする「目的遺伝子」（以下、「ＧＯＩ」）または「目的ＯＲＦ」の「誘導」を測定するために、変異糸状菌（宿主）細胞を候補誘導基質（インデューサー）で処理し、誘導基質（インデューサー）で処理していない親糸状菌（対照、非改変）細胞と比較する。したがって、（未処理の）親（対照）細胞に１００％の相対タンパク質活性値を割り当てると、変異宿主細胞においてＰＯＩをコードするＧＯＩの誘導は、活性値（すなわち、対照細胞に対する値）が１００％より大きい、１１０％より大きい、より好ましくは１５０％より大きい、より好ましくは２００～５００％（すなわち、対照に対して２～５倍高い）、またはより好ましくは１０００～３０００％高いときに達成される。
本明細書で使用されるとき、「インデューサー（ｉｎｄｕｃｅｒ）」、「インデューサー（ｉｎｄｕｃｅｒｓ）」、「誘導基質（ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」または「誘導基質（ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）」は互換的に使用され、糸状菌細胞に「増加した量」のポリペプチド（例えば、酵素、レセプター、抗体など）を産生させる、または誘導基質が存在しない場合に産生するもの以外の化合物／物質を産生させる任意の化合物を指す。誘導基質の例には、ソホロース、ラクトース、ゲンチビオースおよびセルロースが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「誘導飼料」という用語は、少なくとも「誘導基質」を含む、糸状菌細胞に与える組成物を指し、そのような誘導飼料は、ＰＯＩの産生を誘導する。
本明細書で使用されるとき、「単離（された）」または「精製（された）」という用語は、それが天然に結合している少なくとも１つの成分から除去される核酸またはアミノ酸を指す。
本明細書での定義では、「目的タンパク質」または「ＰＯＩ」という用語は、糸状菌細胞において発現することが所望されるポリペプチドを指す。そのようなタンパク質は、酵素、基質結合タンパク質、表面活性タンパク質、構造タンパク質などであり得、高レベルで発現させることができ、商業化を目的とすることができる。目的タンパク質は、内因性遺伝子または異種遺伝子（すなわち、変異細胞および／または親細胞に対して）によってコードすることができる。目的タンパク質は、細胞内で、または分泌（細胞外）タンパク質として発現させることができる。
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」および「タンパク質」（ならびに／またはそれらのそれぞれの複数形）という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結したアミノ酸残基を含む任意長のポリマーを指す。本明細書では、アミノ酸残基に対する従来の１文字コードまたは３文字コードが使用される。ポリマーは直鎖状または分枝状であってよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。これらの用語はまた、天然に、または介入（例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合などの他の任意の操作もしくは修飾）によって改変されているアミノ酸ポリマーを包含する。また、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、および当該技術分野で知られている他の修飾を含むポリペプチドも、この定義内に含まれる。
本明細書で使用されるとき、機能的にかつ／または構造的に類似したタンパク質は、「関連タンパク質」であると見なされる。そのようなタンパク質は、属および／または種が異なる生物、あるいは異なる分類の生物（例えば、細菌および真菌）に由来し得る。関連タンパク質はまた、一次配列分析によって決定されるか、二次または三次構造分析によって決定されるか、または免疫学的交差反応性によって決定される相同体を包含する。
本明細書で使用されるとき、「実質的に活性を有しない」という語句、または類似の語句は、特定の活性が混合物中で検出できないか、または混合物の意図する目的を妨害しない量で存在することを意味する。
本明細書で使用されるとき、「誘導ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方への１つ以上のアミノ酸の付加、アミノ酸配列中の１つまたは多数の異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、タンパク質の一方もしくは両方の末端での、またはアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、ならびに／あるいはアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入によって、タンパク質から得られるか、または得ることができるタンパク質を指す。タンパク質誘導体の調製は、天然のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変し、そのＤＮＡ配列を好適な宿主に形質転換し、その改変ＤＮＡ配列を発現させて誘導タンパク質を形成することによって達成することができる。
関連（および誘導）タンパク質には、「変異タンパク質」が含まれる 変異タンパク質は、少ない数のアミノ酸残基における置換、欠失、および／または挿入によって、参照／親タンパク質（例えば、野生型タンパク質）とは異なる。変異タンパク質と親タンパク質との間の異なるアミノ酸残基の数は、１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上のアミノ酸残基であり得る。変異タンパク質は、参照タンパク質と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を共有し得る。変異タンパク質はまた、選択されたモチーフ、ドメイン、エピトープ、保存領域などにおいて、参照タンパク質と異なっていてもよい。
本明細書で使用されるとき、「相同タンパク質」という用語は、参照タンパク質と類似の活性および／または構造を有するタンパク質を指す。相同体が必ずしも進化的に関連しているということではない。したがって、この用語は異なる生物から得られる同一の、類似の、または対応する酵素（すなわち、構造および機能に関して）を包含することが意図されている。いくつかの実施形態では、参照タンパク質に類似の四次、三次および／または一次構造を有する相同体を特定することが望ましい。いくつかの実施形態では、相同タンパク質は、参照タンパク質と類似の免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態では、相同タンパク質は、所望の活性を有する酵素を産生するように遺伝子操作される。
配列間の相同性の程度は、当該技術分野で周知の任意の好適な方法を使用して決定し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡなどのプログラム；ならびにＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４を参照されたい）。
本明細書で使用されるとき、「実質的に類似（の）」および「実質的に同一（の）」という句は、少なくとも２つの核酸またはポリペプチドとの関連では、通常、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが対照（すなわち、野生型）配列と比較して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、もしくは少なくとも約９９％の同一性、またはそれ以上を有する配列を含むことを意味する。配列同一性は、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、およびＣＬＵＳＴＡＬなどの既知のプログラムにより、標準的なパラメータを用いて決定することができる。
本明細書で使用されるとき、「遺伝子」という用語は、タンパク質またはＲＮＡの発現をコードし、かつ指示する核酸を指す場合、「対立遺伝子」という用語と同義である。糸状菌の栄養型は一般に一倍体であるため、特定の表現型を与えるには、特定の遺伝子の単一コピー（すなわち、単一の対立遺伝子）で十分である。
本明細書中で使用されるとき、「野生型」および「天然」という用語は、互換的に使用され、そして天然に見出されるような遺伝子、タンパク質、真菌細胞または菌株を指す。
本明細書で使用されるとき、「遺伝子の欠失」は、宿主細胞のゲノムからの遺伝子の除去を指す。遺伝子が遺伝子のコード配列に直接隣接して位置しない制御エレメント（例えば、エンハンサーエレメント）を含む場合、遺伝子の欠失は、コード配列の欠失を指し、また、場合により、例えばプロモーター配列および／またはターミネーター配列（これらに限定されない）を含む隣接エンハンサーエレメントの欠失を指す。
本明細書で使用されるとき、「遺伝子の破壊」は、細胞が宿主細胞内で機能的遺伝子産物、例えば、タンパク質を産生するのを実質的に妨げる任意の遺伝子操作または化学的操作、すなわち、変異を広く指す。例示的な破壊方法には、ポリペプチドコード配列、プロモーター、エンハンサー、もしくは別の調節エレメントを含む、遺伝子の任意の部分の完全または部分的な欠失、またはその変異誘発が含まれ、変異誘発は置換、挿入、欠失、逆位、ならびにそれらの組み合わせおよびバリエーションを包含し、その変異はいずれも機能的遺伝子産物の産生を実質的に妨げる。遺伝子はまた、ＲＮＡｉ、アンチセンス、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、または遺伝子発現を消失、減少または低減する任意の他の方法を使用して破壊することができる。
本明細書で使用されるとき、「本開示のＡｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬおよび／またはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させる「遺伝子改変」を含む変異［宿主］細胞」という語句は、そのようなＡｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬおよび／またはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードするａｃｅ３遺伝子形態（またはそのＯＲＦ）を含むプラスミドまたは染色体組み込みカセットを宿主細胞に導入すること（例えば、形質転換により）を含む。他の特定の実施形態では、例えば、親真菌細胞がＡｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬおよび／またはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする内因性遺伝子形態を天然に含む場合、「Ａｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬおよび／またはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させる「遺伝子改変」を含む、変異［宿主］細胞」という語句は、天然／野生型ａｃｅ３遺伝子プロモーターを異種プロモーターで置換することを含む。
本明細書で使用されるとき、「好気性発酵」は、酸素の存在下における増殖を指す。
本明細書で使用されるとき、「細胞ブロス」という用語は、液体培養／浸漬培養における培地および細胞を集合的に指す。
本明細書で使用されるとき、「細胞量」という用語は、液体培養／浸漬培養において存在する細胞成分（無傷細胞および溶解細胞を含む）を指す。細胞量は、乾燥重量または湿潤重量で表すことができる。
本明細書で使用されるとき、「機能性ポリペプチド／タンパク質」は、酵素活性、結合活性、表面活性特性などの活性を有し、かつ、その活性を消失または減少させるために、変異誘発されたり、切断されたり、またはその他の改変がなされていないタンパク質である。機能性ポリペプチドは、明細書に記載されているように、熱的に安定または不安定であり得る。
本明細書で使用されるとき、「機能性遺伝子」は、活性な遺伝子産物、すなわち、一般的にはタンパク質を産生するために、細胞成分が使用し得る遺伝子である。機能性遺伝子は、細胞成分が活性遺伝子産物を産生するために使用することができないか、または細胞成分が活性遺伝子産物を産生するために使用する能力が低下するように改変された、破壊された遺伝子とは正反対である。
本明細書で使用されるとき、「目的タンパク質」は、糸状菌細胞の浸漬培養において産生が所望されるタンパク質である。一般に、目的タンパク質は、工業、医薬、動物の健康、ならびに食品および飲料の用途において商業的に重要なものであり、大量に生産することが望ましい。目的タンパク質は、糸状菌細胞によって発現される、数え切れないほどの他のタンパク質と区別されるべきであり、それらは一般に産物として目的物ではなく、主にバックグラウンドのタンパク質混入物と考えられる。
本明細書で使用されるとき、「変異真菌宿主細胞」は、変異細胞によって産生されるタンパク質の量が親細胞と比較して、少なくとも５％増加、少なくとも１０％増加、少なくとも１５％増加、またはそれ以上の増加であるなら、「親真菌細胞」よりも「バイオマス１単位量当たり実質的により多くのタンパク質」を産生している（ここで、このタンパク質の量はタンパク質産生が測定される細胞のバイオマスの総量に対して正規化されたものであり、バイオマスは湿潤重量（例えば、細胞ペレット）または乾燥重量で表すことができる）。
ＩＩＩ．Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ３（ａｃｅ３）
最近、セルラーゼ／ヘミセルラーゼ産生が「誘導された」（すなわち、異なる誘導組成物；例えば、ソホロース、ラクトースの添加によって）トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）培養物（Ｈａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）からの転写プロファイリングデータが調べられ、セルラーゼおよびヘミセルラーゼ遺伝子発現の推定「レギュレーター」が同定され、また調節タンパク質をコードする候補遺伝子が同定された。Ｈａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、遺伝子ＩＤ番号７７５１３（遺伝子ＩＤ番号はＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）データベース２．０と同じである）として、この候補遺伝子を同定し（Ｈａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．図２および表２を参照されたい）、この候補遺伝子を「Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ３」（以下、「ａｃｅ３」）と命名し、コードされたタンパク質（すなわち、候補転写因子）を「Ａｃｅ３」と命名した。より詳しくは、Ｈａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）の研究では、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａ株（ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／Ｔｒｉｒｅ２／Ｔｒｉｒｅ２．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌを参照されたい）の、公的に利用可能なゲノム配列に基づく予測されたａｃｅ３ ＯＲＦ（配列番号：２）が使用されたが、このＱＭ６ａの予測されたアノテーション（遺伝子ＩＤ ７７５１３）は、２つのエクソンおよび１つのイントロンからなる（例えば、図１を参照されたい））。
本明細書中に記載し、そして下記実施例の項でさらに記述するように、本開示の出願人らは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）「ＲＵＴ－Ｃ３０株」アノテーションに基づくａｃｅ３ ＯＲＦに対して、Ｈａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４に記載のクローン化ａｃｅ３ ＯＲＦ（すなわち、Ａｃｅ３のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）「ＱＭ６ａ株」アノテーションに基づく）を比較し評価したとき、驚くべき予期しなかった結果を見出した。例えば、下記実施例１に記載のように、配列番号６のより長いＡｃｅ３タンパク質（本明細書では「Ａｃｅ３－Ｌ」と呼ぶ）をコードする、配列番号４のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）「ＲＵＴ－Ｃ３０株」ａｃｅ３遺伝子（または配列番号５のＯＲＦ）に対して、配列番号１のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）「ＱＭ６ａ株」ａｃｅ３遺伝子（および配列番号２のＯＲＦ）は、配列番号３のより短いＡｃｅ３タンパク質（本明細書では「Ａｃｅ３－Ｓ」と呼ぶ）をコードする。
対照的に、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｒｕｔ－Ｃ３０株の公的に利用可能なゲノム配列（ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／ＴｒｉｒｅＲＵＴＣ３０＿１／ＴｒｉｒｅＲＵＴＣ３０＿１．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌを参照されたい）から予測されるａｃｅ３ ＯＲＦ（遺伝子ＩＤ ９８４５５）は、３つのエクソンと２つのイントロンを含み、より長いタンパク質配列（すなわち、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａ由来のＡｃｅ３－Ｓと比較して）を含む（図１Ａ）。より詳細には、「ＲＵＴ－Ｃ３０」モデルによって予測される開始コドンは「ＱＭ６ａ」モデルのそれより上流に位置し、Ｃ末端にナンセンス変異があり（Ｐｏｇｇｉ－Ｐａｒｏｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、より長いＮ末端配列およびより短いＣ末端配列をもたらす（例えば、図１Ｂを参照されたい）。
同様に、下記実施例６に記載するように、ａｃｅ３遺伝子コード領域の５’末端の位置は明らかではなく、したがって、出願人は本明細書に記載のように、ａｃｅ３遺伝子の５’末端をさらに評価した。上で簡潔に述べたように、Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ）におけるＤＮＡ配列のアノテーションは、ＤＮＡ配列が同じであっても、変異株Ｒｕｔ－Ｃ３０と野生型株ＱＭ６ａとでは異なった。ＱＭ６ａの場合、コード領域の５’末端は、エクソン３の上流にあり、イントロン２内にあることが示唆された（図１１に示すように）。Ｒｕｔ－Ｃ３０の場合、コード領域の５’末端はエクソン２内にある（図１１）。
ゲノムＤＮＡ配列および追加のｃＤＮＡ配列のさらなる分析により、「エクソン１」および「イントロン１」が存在する可能性のあることが示唆された（図１１に示すように）。さらに、Ｒｕｔ－Ｃ３０のａｃｅ３コード領域の３’末端は、野生型分離株ＱＭ６ａの配列と比較して、未成熟終止コドンを作り出す変異を含んでいた（図１１）。したがって、実施例６に記載のように、出願人は図１２に示すように、ａｃｅ３遺伝子のこれらの異なる可能な形態の過剰発現の効果を調べた。
さらに、下記実施例に記載のように、出願人は、「ｐＹＬ１」、「ｐＹＬ２」、「ｐＹＬ３」および「ｐＹＬ４」（図２Ａ～２Ｄプラスミドマップを参照されたい）と命名された４つの異なるａｃｅ３発現ベクターの１つを用いて、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞を形質転換することによって、Ａｃｅ３－Ｓタンパク質（配列番号３）およびＡｃｅ３－Ｌタンパク質（配列番号６）をコードする遺伝子を構築し（実施例１）かつテストした（実施例２～４）。より詳細には（実施例１）、これらの発現ベクターは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製と選択のための細菌ＣｏｌＥ１ ｏｒｉおよびＡｍｐＲ遺伝子を有するベクター骨格を含む。さらに、発現ベクター（図２Ａ～２Ｄを参照されたい）はＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２選択マーカー、およびその天然ターミネーターを有するａｃｅ３ ＯＲＦコード配列（ａｃｅ３－Ｌまたはａｃｅ３－Ｓ）に作動可能に連結した異種Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロモーター配列（すなわち、ｈｘｋ１またはｐｋｉ１プロモーター）を含む。
続いて、生成された安定なＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）形質転換体（すなわち、変異宿主細胞Ａ４－７、Ｂ２－１、Ｃ２－２８およびＤ３－１）を、「誘導」および「非誘導」の両条件下で、徐放性マイクロタイタープレート（ｓｒＭＴＰ）（実施例２）、振盪フラスコ（実施例３）および小規模発酵（実施例４）において試験／スクリーニングし、培養上清を回収し、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した（図３～図５を参照されたい）。これらの実施例に示すように、試験した宿主細胞の全て（すなわち、親、変異Ａ４－７、変異Ｂ２－１、変異Ｃ２－２８および変異Ｄ３－１）は、誘導基質（すなわち、ソホロースまたはラクトース）の存在下で多量のタンパク質を分泌した。対照的に、驚くべきことに、誘導基質（すなわち、ソホロースまたはラクトース）の非存在下、「グルコース」が唯一の炭素源である場合、ａｃｅ３－Ｌ ＯＲＦを発現する変異宿主細胞（すなわち、変異Ａ４－７およびＣ２－２８）のみが分泌タンパク質を産生することができ、親（対照）細胞およびａｃｅ３－Ｓ ＯＲＦを発現する変異宿主細胞（すなわち、変異Ｂ２－１およびＤ３－１）は検出可能な分泌タンパク質を産生しないことが観察された。
他の実施形態では、本開示は、ａｃｅ３－Ｌ（実施例５）発現コンストラクトの発現を駆動する１３種の異なるプロモーターを使用し、「非誘導」条件下でタンパク質の産生が増強されることをさらに示す。例えば、試験した１３のプロモーターには、（ｉ）ホルムアミダーゼ遺伝子（ｒｅｖ３；タンパク質ＩＤ １０３０４１）プロモーター（配列番号１５）、（ｉｉ）β－キシロシダーゼ遺伝子（ｂｘｌ；タンパク質ＩＤ １２１１２７）プロモーター（配列番号１６）、（ｉｉｉ）トランスケトラーゼ遺伝子（ｔｋｌ１；タンパク質ＩＤ ２２１１）プロモーター（配列番号１７）、（ｉｖ）機能の知られていない遺伝子（タンパク質ＩＤ １０４２９５）プロモーター（配列番号１８）、（ｖ）オキシドレダクターゼ遺伝子（ｄｌｄ１；タンパク質ＩＤ ５３４５）プロモーター（配列番号１９）、（ｖｉ）キシラナーゼＩＶ遺伝子（ｘｙｎ４；タンパク質ＩＤ １１１８４９）プロモーター（配列番号２０）、（ｖｉｉ）α－グルクロニダーゼ遺伝子（タンパク質ＩＤ ７２５２６）プロモーター（配列番号２１）、（ｖｉｉｉ）アセチルキシランエステラーゼ遺伝子１（ａｘｅ１；タンパク質ＩＤ ７３６３２）プロモーター（配列番号２２）、（ｉｘ）ヘキソースキナーゼ遺伝子（ｈｘｋ１；タンパク質ＩＤ ７３６６５）プロモーター（配列番号２３）、（ｘ）ミトコンドリアキャリアタンパク質遺伝子（ｄｉｃ１；タンパク質ＩＤ ４７９３０）プロモーター（配列番号２４）、（ｘｉ）オリゴペプチドトランスポーター遺伝子（ｏｐｔ；タンパク質ＩＤ ４４２７８）プロモーター（配列番号２５）、（ｘｉｉ）グリセロールキナーゼ遺伝子（ｇｕｔ１；タンパク質ＩＤ ５８３５６）プロモーター（配列番号２６）および（ｘｉｉｉ）ピルビン酸キナーゼ遺伝子（ｐｋｉ１；タンパク質ＩＤ ７８４３９）プロモーター（配列番号２７）が含まれた。表３に示すように、親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、ソホロースインデューサーの存在下でのみ、分泌タンパク質を産生した。対照的に、１３の異なるプロモーターのいずれか１つで駆動されるＡｃｅ３－Ｌを含み、かつ発現させる、変異（娘）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、誘導条件下および非誘導条件下の両方で類似量の分泌タンパク質を産生した。また、実施例５に記載のように、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親株およびその形質転換体を、振盪フラスコ実験および小規模発酵でさらに試験した。図８に示すように、親（対照）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、ソホロース（「Ｓｏｐ」）インデューサーの存在下でのみ分泌タンパク質を産生したが、娘株ＬＴ８３は誘導（「Ｓｏｐ」）および非誘導（「Ｇｌｕ」）の両条件下で、類似量の分泌タンパク質を産生した。同様に、図９に示すように、親（対照）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株は、ソホロースインデューサー（「Ｓｏｐ」）の存在下でのみ分泌タンパク質を産生したが、娘株ＬＴ８３は誘導（「Ｓｏｐ」）および非誘導（「Ｇｌｕ」）条件の両方で、類似量の分泌タンパク質を産生した。
本開示の実施例６には、ａｃｅ３遺伝子の異なる可能な形態を過剰発現することの効果の実験的研究が記載されている（例えば、変異株Ｒｕｔ－Ｃ３０／野生型株ＱＭ６ａゲノム配列アノテーションの上記議論、図１１および図１２を参照されたい）。したがって、図１２に示したａｃｅ３の異なる形態は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ａｃｅ３遺伝子の過剰発現ベクターが、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のグルコアミラーゼ遺伝子座（ｇｌａ１）にａｃｅ３の標的化組み込みを可能にするよう設計されている場合に、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）内で過剰発現されたものである。したがって、表５に示すコンストラクトは、異なる形態のａｃｅ３遺伝子を有することによって異なる。 同様に、２４ウェルマイクロタイタープレート中、炭素源として２％ラクトースまたは２％グルコースを含む液体培地で表７の株を増殖させ、培養上清から全分泌タンパク質の量を測定した。ａｃｅ３－Ｌ、ａｃｅ３－ＥＬおよびａｃｅ３－ＬＮ形態の過剰発現（すなわち、ＲｕｔＣ－３０Ｃ末端変異を有する）は、両培地（すなわち、２％ラクトースまたは２％グルコース）共に、全タンパク質の産生が改善された（表８）。炭素源としてラクトースを有する培地では、ａｃｅ３遺伝子の全ての形態の過剰発現は、全タンパク質の産生をある程度改善したが、改善のレベルは、ａｃｅ３遺伝子のａｃｅ３－Ｌ、ａｃｅ３－ＥＬおよびａｃｅ３－ＬＮ形態を過剰発現する株で最も高かった（表８）。したがって、ａｃｅ３遺伝子のａｃｅ３－Ｌ、ａｃｅ３－ＥＬおよびａｃｅ３－ＬＮ形態を過剰発現する場合、「非誘導条件」で（すなわち、グルコースを炭素源として使用したとき）高レベルの分泌タンパク質が観察されることが明らかである。
本開示の実施例７には、ａｃｅ３遺伝子座の天然プロモーターの上流の５’領域を含むＤＮＡフラグメント、ｌｏｘＰ隣接ハイグロマイシンＢ耐性選択マーカーカセット、およびａｃｅ３オープンリーディングフレームの５’末端に作動可能に融合した目的プロモーターを含むフラグメントを融合することによって作製されたプロモーター置換コンストラクト（図６を参照されたい）について記載されている。例えば、特定の実施形態では、プロモーター置換コンストラクトは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞内の内因性ａｃｅ３遺伝子プロモーターを代替プロモーターで置換するために使用される。
本開示の実施例８には、目的内因性非リグノセルロース遺伝子プロモーターを、目的リグノセルロース遺伝子プロモーターで置換することが記載されている。例えば、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ発現コンストラクトを、ＤＮＡポリヌクレオチドフラグメントから組み立てた（ここで、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼをコードするＯＲＦ配列は、５’（上流）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１プロモーターに作動可能に連結し、３’（下流）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１ターミネーターに作動可能に連結し、このコンストラクトは選択マーカーとしてＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子をさらに含んだ）。培養過程でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ酵素を分泌することができる形質転換体を同定するために、変異（娘）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞（すなわち、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させる遺伝子改変を含む）を、グルコアミラーゼ発現コンストラクトで形質転換し、形質転換体を選択し、炭素源としてグルコースを含む液体培地中で（すなわち、ソホロースまたはラクトースなどの誘導基質なしで）培養した。図１０に示すように、親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞はグルコース／ソホロース（誘導条件）を含む規定培地で１，０２９μｇ／ｍＬのグルコアミラーゼを産生し、グルコース（非誘導条件）を含む規定培地では、わずかに３８μｇ／ｍＬのグルコアミラーゼを生成するのみであったが、ｄｉｃ１プロモーターで駆動されるａｃｅ３－Ｌを含む改変（娘）株「ＬＴ８８」は、「誘導」（「Ｓｏｐ」）条件で３倍高いグルコアミラーゼを産生し（すなわち、親（対照）株と比較して）、「非誘導」（「Ｇｌｕ」）条件において２．５倍高いグルコアミラーゼを産生した（すなわち、親（対照）株と比較して）。したがって、これらの結果は、Ａｃｅ３－Ｌ ＯＲＦを含む変異（娘）細胞は、インデューサーの非存在下で細胞外タンパク質を産生するだけでなく、これらの変異細胞はまたそのような誘導条件下で、親（対照）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞よりも多くの総タンパク質を産生することを示している。
実施例９には、天然に関連した異種の目的遺伝子プロモーターを、目的リグノセルロース遺伝子プロモーターで置換することが記載されている。例えば、ブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種のフィターゼ（すなわち、異種ＧＯＩ）をコードするＯＲＦが、５’末端でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１プロモーターに、かつ３’末端でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１ターミネーターに作動可能に連結され、このＤＮＡコンストラクトは選択マーカーをさらに含む。培養過程でブティアウクセラ属フィターゼ酵素を分泌することができる形質転換体を同定するために、変異Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞（すなわち、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させる遺伝子改変を含む）を、フィターゼ発現コンストラクトで形質転換し、形質転換体を選択し、炭素源としてグルコースを含む液体培地中で（すなわち、ソホロースまたはラクトースなどの誘導基質なしで）培養する。
本開示の実施例１０には、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｋｉ１プロモーターの下で発現するストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｃａｓ９遺伝子、およびＵ６プロモーターの下で発現されるガイドＲＮＡを含む、天然ａｃｅ３プロモーター置換ベクターの構築が記載されている。例えば、ｃａｓ９媒介ａｃｅ３プロモーター置換ベクター（ｐＣＨＬ７６０およびｐＣＨＬ７６１）をＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親細胞に形質転換し、ａｃｅ３プロモーター置換株の機能性を試験するために、振盪フラスコ中、５０ｍｌの浸漬培養でインデューサー基質（ソホロース）の存在下および非存在下で細胞を増殖させた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥに見られるように、親細胞（図２３、ＩＤ １２７５．８．１）では、グルコース／ソホロース（誘導）の場合と比較して、グルコース（非誘導）を含む規定培地では分泌タンパク質の産生は非常に少なかった。対照的に、形質転換体２２１８、２２１９、２２２０、２２２２および２２２３は、誘導条件下および非誘導条件下で類似した量の分泌タンパク質を産生し、ｈｘｋ１またはｄｉｃ１プロモーターを有する変異細胞（すなわち、ａｃｅ３遺伝子座で天然ａｃｅ３プロモーターを置換）が、インデューサーの非存在下で細胞外タンパク質を産生したことを示した。
このように、本明細書中で考察し記載するように、本開示の特定の態様は、１種以上の内因性糸状菌リグノセルロース分解酵素（すなわち、セルロース分解酵素、例えば、セロビオヒドロラーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼなど）の産生に関する。より詳細には、本開示の特定の実施形態は、誘導基質の完全な非存在下で、本開示の変異宿主細胞（すなわち、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬおよび／またはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質の発現を増加させる遺伝子改変を含む変異宿主細胞）中で、このような内因性酵素を産生することに関する。本開示の変異宿主細胞、組成物および方法は、特に、本開示のそのような変異宿主細胞が、そのようなセルロース分解酵素を産生するために誘導基質を必要としないという事実のために（すなわち、誘導基質の存在下でのみそのようなセルロース分解酵素を産生する親細胞とは対照的に）、前述のセルロース分解酵素を産生するコスト／経費を大きく削減するのに特に有用である。
例えば、特定の実施形態では、本開示は、誘導基質の非存在下で１種以上の内因性の目的タンパク質、および／または誘導基質の非存在下で１種以上の異種の目的タンパク質を発現／産生することができる変異真菌宿主細胞に関する。したがって、特定の実施形態では、本開示の変異真菌宿主細胞（すなわち、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬおよび／またはＡｃｅ３－ＬＮの発現を増加させる遺伝子改変を含む）は、内因性の目的非リグノセルロースタンパク質および／または異種の目的タンパク質を発現するようにさらに改変される。例えば、特定の実施形態では、内因性の目的非リグノセルロースタンパク質をコードする遺伝子は、変異真菌宿主細胞において改変される。したがって、特定の実施形態では、内因性の目的非リグノセルロースタンパク質をコードする遺伝子（またはＯＲＦ）と天然に関連したプロモーターは、リグノセルロースタンパク質をコードする糸状菌遺伝子由来のプロモーター（例えば、目的の非リグノセルロースタンパク質をコードする内因性遺伝子に作動可能に連結された５’－リグノセルロース遺伝子プロモーター）で置換される。同様に、他の特定の実施形態では、本開示の変異真菌宿主細胞（すなわち、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質、Ａｃｅ３－ＥＬおよび／またはＡｃｅ３－ＬＮの発現を増加させる遺伝子改変を含む）は、異種の目的タンパク質を発現するように改変される。したがって、他の特定の実施形態では、異種の目的タンパク質をコードする遺伝子と天然に関連したプロモーターは、リグノセルロースタンパク質をコードする糸状菌遺伝子由来のプロモーター（例えば、異種の目的タンパク質をコードする異種遺伝子に作動可能に連結した５’－リグノセルロース遺伝子プロモーター）で置換される。
したがって、特定の実施形態では、本開示は親糸状菌細胞に由来する変異糸状菌細胞に関し、この変異細胞は、親細胞と比較して、Ａｃｅ－Ｌタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させる遺伝子改変を含み、このコードされたＡｃｅ３－Ｌタンパク質は配列番号６のＡｃｅ３－Ｌタンパク質に対して約９０％の配列同一性を有する。例えば、特定の実施形態では、配列番号６に対して約９０％の配列同一性を有する、コードされたＡｃｅ３タンパク質は、最後の４つのＣ末端アミノ酸として「Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ」を含む。他の実施形態では、配列番号６に対して約９０％の配列同一性を有する、コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６に作動可能に連結し、かつ同配列に先行する配列番号９８のＮ末端アミノ酸フラグメントをさらに含む。別の実施形態では、Ａｃｅ－３タンパク質は、配列番号１２に対して約９０％の配列同一性を有する。
他の特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号１１または配列番号１３に対して、約９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号５、配列番号１０１または配列番号１０２に対して、約９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
ＩＶ．糸状菌宿主細胞
本開示の特定の実施形態では、Ａｃｅ３－Ｌポリペプチドをコードする遺伝子またはＯＲＦの発現を増加させる遺伝子改変を含む、変異糸状菌細胞（すなわち、親糸状菌細胞に由来する）が提供される。より詳しくは、特定の実施形態では、変異糸状菌細胞（すなわち、親（対照）細胞に対して）は、配列番号６のＡｃｅ３－Ｌタンパク質をコードする遺伝子（またはＯＲＦ）の発現を増加させる遺伝子改変を含む。好ましい実施形態では、配列番号６のＡｃｅ３－Ｌタンパク質をコードする遺伝子（またはＯＲＦ）の発現を増加させる遺伝子改変を含む、そのような変異真菌細胞は、誘導基質の非存在下で、内因性の目的タンパク質の少なくとも１つを産生することができる。他の実施形態では、配列番号６のＡｃｅ３－Ｌタンパク質をコードする遺伝子（またはＯＲＦ）の発現を増加させる遺伝子改変を含む、そのような変異真菌細胞は、誘導基質の非存在下で、異種の目的タンパク質の少なくとも１つを産生することができる。
したがって、特定の実施形態では、本開示の操作および使用のための糸状菌細胞には、アスコマイコタ門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、チャワンタケ亜門（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、特に栄養菌糸状態を有する真菌由来の糸状菌が含まれる。そのような生物には、限定されないが、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、スケドスポリウム属（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、セファロスポリウム属（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ゲオスミチア属（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ）種、マイセリオフトーラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種、およびニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種を含む、商業的に重要な産業用および医薬用タンパク質の産生に使用される糸状菌細胞が含まれる。
特定の糸状菌には、限定されないが、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（以前はトリコデルマ・ロンギブラチアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）およびヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ）として分類）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・イタコニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｉｔａｃｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニデユランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ソーヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、スケドスポリウム・プロリフィカンス（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐｒｏｌｉｆｉｃａｎｓ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、タラロマイセス（ゲオスミチア）・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ）ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）およびクリソスポリウム・ルクノウエンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）が含まれる。
Ｖ．組換え核酸および分子生物学
特定の実施形態では、本開示は、Ａｃｅ３－Ｌ、Ａｃｅ３－ＥＬまたはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする遺伝子またはＯＲＦの発現を増加させる遺伝子改変を含む変異糸状菌宿主細胞に関する。上記のように、そのような変異宿主細胞は、誘導基質の非存在下で、１つ以上の目的タンパク質を産生し得る（すなわち、非改変親（対照）細胞とは対照的に）。
したがって、特定の実施形態では、本開示は、Ａｃｅ３－Ｌ、Ａｃｅ３－ＥＬまたはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする遺伝子またはＯＲＦ含む組換え核酸に関する。特定の実施形態では、組換え核酸は、糸状菌宿主細胞内でＡｃｅ３－Ｌ、Ａｃｅ３－ＥＬまたはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質を産生するためのポリヌクレオチド発現カセットを含む。他の実施形態では、ポリヌクレオチド発現カセットは、発現ベクター内に含まれる。特定の実施形態では、発現ベクターはプラスミドである。他の実施形態では、組換え核酸、ポリヌクレオチド発現カセットまたはその発現ベクターは、配列番号４、配列番号５、配列番号１１、配列番号１０１、配列番号１３または配列番号１０２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、組換え核酸、ポリヌクレオチド発現カセットまたはその発現ベクターは、配列番号６に対して約９０％の配列同一性を有するＡｃｅ３－Ｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
他の特定の実施形態では、組換え核酸（またはそのポリヌクレオチド発現カセットもしくはその発現ベクター）は、１つ以上の選択マーカーをさらに含む。糸状菌に使用するための選択マーカーには、限定されないが、ａｌｓｌ、ａｍｄＳ、ｈｙｇＲ、ｐｙｒ２、ｐｙｒ４、ｐｙｒＧ、ｓｕｃＡ、ブレオマイシン耐性マーカー、ブラスチシジン耐性マーカー、ピリチアミン耐性マーカー、クロリムロンエチル耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、アデニン経路遺伝子、トリプトファン経路遺伝子、チミジンキナーゼマーカーなどが含まれる。特定の実施形態では、選択マーカーはｐｙｒ２であり、その成分および使用方法は、国際公開第２０１１／１５３４４９号パンフレットに一般的に記載されている。したがって、特定の実施形態では、本開示のＡｃｅ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドコンストラクトは、それに作動可能に連結された、選択マーカーをコードする核酸配列を含む。
別の実施形態では、組換え核酸、ポリヌクレオチドコンストラクト、ポリヌクレオチド発現カセットまたはその発現ベクターは、Ａｃｅ３－Ｌ、Ａｃｅ３－ＥＬまたはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする遺伝子（またはＯＲＦ）の発現を駆動する異種プロモーターを含む。より詳しくは、特定の実施形態では、異種プロモーターは構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである。特定の実施形態では、異種プロモーターは、ｒｅｖ３プロモーター、ｂｘｌプロモーター、ｔｋｌ１プロモーター、ＰＩＤ１０４２９５プロモーター、ｄｌｄ１プロモーター、ｘｙｎ４プロモーター、ＰＩＤ７２５２６プロモーター、ａｘｅ１プロモーター、ｈｘｋ１プロモーター、ｄｉｃ１プロモーター、ｏｐｔプロモーター、ｇｕｔ１プロモーターおよびｐｋｉ１プロモーターからなる群から選択される。特定の理論または作用機序に拘束されることを望むものではないが、本明細書では、グルコース制限条件下でより高い発現レベル（すなわち、過剰グルコース濃度に対して）を与える、ｒｅｖ３、ｂｘｌ、ｔｋｌ、ＰＩＤ１０４２９５、ｄｌｄ１、ｘｙｎ４、ＰＩＤ７２５２６、ａｘｅ１、ｈｘｋ１、ｄｉｃ１、ｏｐｔ、ｇｕｔ１およびｐｋｉ１などのプロモーターは、本開示に特に有用であると考える。したがって、特定の実施形態では、組換え核酸（またはポリヌクレオチドコンストラクト、ポリヌクレオチド発現カセットもしくはその発現ベクター）は、Ａｃｅ３タンパク質をコードする核酸配列の５’に作動可能に連結したプロモーターを含む。
別の実施形態では、組換え核酸（またはポリヌクレオチドコンストラクト、ポリヌクレオチド発現カセット、またはその発現ベクター）は、天然ａｃｅ３ターミネーター配列をコードする核酸配列をさらに含む。したがって、特定の実施形態では、組換え核酸（またはポリヌクレオチドコンストラクト、ポリヌクレオチド発現カセット、またはその発現ベクター）は、Ａｃｅ３タンパク質をコードする核酸配列の５’に作動可能に連結したプロモーター、およびＡｃｅ３タンパク質をコードする核酸配列の３’に作動可能に連結した天然ａｃｅ３ターミネーター配列を含む（例えば、５’－Ｐｒｏ－ＯＲＦ－Ｔｅｒｍ－３’。ここで「Ｐｒｏ」は構成的プロモーターであり、「ＯＲＦ」はＡｃｅ３をコードし、「Ｔｅｒｍ」は天然ａｃｅ３ターミネーター配列である）。
したがって、特定の実施形態では、本開示の真菌宿主細胞を形質転換するために、糸状菌の形質転換および真菌の培養のための標準的な手法（これは、当業者によく知られている）が使用される。したがって、真菌宿主細胞へのＤＮＡコンストラクトまたはベクターの導入法には、形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション（例えば、リポフェクション媒介およびＤＥＡＥ－デキストリン媒介トランスフェクション）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＮＡ被覆微粒子を用いる高速銃、遺伝子銃またはバイオリスティック形質転換、プロトプラスト融合などの手法が含まれる。一般的な形質転換技術は当該技術分野で知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１および２０１２、ならびにＣａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）内での異種タンパク質の発現は、例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書；同第６，２６８，３２８号明細書；Ｈａｒｋｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１およびＨａｒｋｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９に記載されている。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株の形質転換については、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）も参照されたい。
一般に、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の形質転換は、通常、１０５～１０７／ｍＬ、特に２×１０６／ｍＬの密度で透過性処理を施したプロトプラストまたは細胞を使用する。適切な溶液中（例えば、１．２Ｍソルビトールおよび５０ｍＭ ＣａＣｌ２）の１００μＬの容量のこれらのプロトプラストまたは細胞を、所望のＤＮＡと混合する。一般に、高濃度のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が取り込み溶液に添加される。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウムなどの添加剤もまた、形質転換を促進するために取り込み溶液に添加し得る。同様の手順は、他の真菌宿主細胞についても利用可能である。例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書および同第６，２６８，３２８号明細書を参照されたい（これらは両者とも参照により組み込まれる）。
特定の実施形態では、本開示は、糸状菌宿主細胞に対して内因性である１つ以上の目的タンパク質の発現および産生に関する（すなわち、Ａｃｅ３－Ｌの発現を増加させる遺伝子改変を含む、本開示の変異真菌宿主細胞によって、内因性タンパク質が産生される）。他の実施形態では、本開示は、糸状菌宿主細胞に対して異種である１つ以上の目的タンパク質の発現および産生に関する。したがって、本開示は一般に、組換え遺伝学の分野におけるルーチンの手法に頼っている。本開示で使用する一般的な方法を開示する基本的なテキストには、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ（１９９０）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）が含まれる。
したがって、特定の実施形態では、目的タンパク質をコードする異種遺伝子またはＯＲＦが糸状菌（宿主）細胞に導入される。特定の実施形態では、異種遺伝子またはＯＲＦは、典型的には、複製および／または発現のために糸状菌（宿主）細胞に形質転換される前に、中間ベクターにクローニングされる。これらの中間ベクターは、例えば、プラスミドまたはシャトルベクターなどの原核生物ベクターであり得る。特定の実施形態では、異種遺伝子またはＯＲＦの発現は、その天然のプロモーターの制御下にある。他の実施形態では、異種遺伝子またはＯＲＦの発現は、異種構成性プロモーターまたは異種誘導性プロモーターであり得る異種プロモーターの制御下に置かれる。
当業者は、自然（天然）のプロモーターは、その機能を変化させることなく、１つ以上のヌクレオチドの置換、置換、付加または削除によって改変できることを知っている。本発明の実施は、プロモーターに対するそのような改変を包含するが、それらを強いるものではない。
発現ベクター／コンストラクトは、通常、異種配列の発現に必要な全ての追加のエレメントを含む転写ユニットまたは発現カセットを含有する。例えば、典型的な発現カセットは、目的タンパク質をコードする異種核酸配列に作動可能に連結した５’プロモーターを含有し、転写物、リボソーム結合部位、および翻訳終結の効率的なポリアデニル化に必要な配列シグナルをさらに含み得る。カセットの追加のエレメントには、エンハンサーと、ゲノムＤＮＡが構造遺伝子として使用される場合には、機能性スプライスドナー部位およびアクセプター部位を有するイントロンが含まれ得る。
プロモーター配列に加えて、発現カセットはまた、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含み得る。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得てもよく、または異なる遺伝子から得てもよい。本発明においては、任意の真菌ターミネーターは、機能的である可能性が高いが、好ましいターミネーターには、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ｃｂｈＩ遺伝子由来のターミネーター、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｍｕｌｌａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）もしくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｂｏｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４）、および／またはムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）カルボキシルプロテアーゼ遺伝子（欧州特許第０２１５５９４号明細書）が含まれる。
遺伝子情報を細胞に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、特に重要ではない。真核細胞または原核細胞における発現に使用される、従来のベクターのいずれも使用し得る。標準的な細菌発現ベクターには、バクテリオファージλおよびＭ１３、ならびにｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、ＭＢＰ、ＧＳＴ、およびＬａｃＺなどの融合発現系が含まれる。便宜的な単離方法を提供するために、組換えタンパク質にエピトープタグ、例えば、ｃ－ｍｙｃを添加することもできる。
発現ベクター中に含むことができるエレメントには、また、レプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、または異種配列の挿入を可能にするためのプラスミドの非必須領域における固有の制限部位があり得る。当該技術分野で知られている多くの耐性遺伝子のいずれもが好適であり得るため、選択された特定の抗生物質耐性遺伝子は確定的ではない。原核生物配列は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）におけるＤＮＡの複製または組み込みを妨害しないように選択することが好ましい。
本発明の形質転換方法は、形質転換ベクターの全部または一部の、糸状菌ゲノムへの安定な組み込みをもたらし得る。しかしながら、自己複製する染色体外形質転換ベクターの維持をもたらす形質転換も考えられる。
多くの標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量の異種タンパク質を発現するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞株を作製することができる。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のセルラーゼ産生株にＤＮＡコンストラクトを導入するための出版された方法には、Ｌｏｒｉｔｏ，Ｈａｙｅｓ，ＤｉＰｉｅｔｒｏ ａｎｄ Ｈａｒｍａｎ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３４９－３５６；Ｇｏｌｄｍａｎ，ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ ａｎｄ Ｈｅｒｒｅｒａ－Ｅｓｔｒｅｌｌａ，１９９０，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１６９－１７４；Ｐｅｎｔｔｉｌａ，Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｒａｔｔｏ，Ｓａｌｍｉｎｅｎ ａｎｄ Ｋｎｏｗｌｅｓ，１９８７，Ｇｅｎｅ ６：１５５－１６４が、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）については、Ｙｅｌｔｏｎ，Ｈａｍｅｒ ａｎｄ Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０－１４７４が、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）については、Ｂａｊａｒ，Ｐｏｄｉｌａ ａｎｄ Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８２０２－８２１２は、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）については、Ｈｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫが、そしてバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）については、Ｂｒｉｇｉｄｉ，ＤｅＲｏｓｓｉ、Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ，Ｒｉｃｃａｒｄｉ ａｎｄ Ｍａｔｔｅｕｚｚｉ，１９９０，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１３５－１３８）が含まれる。
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する既知の手順はいずれも使用し得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション法、ポリブレン法、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、バイオリスティックス法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、血漿ベクター法、ウイルスベクター法、および宿主細胞にクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝子物質を導入する方法として知られる他の任意の方法の使用が含まれる（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。米国特許第６，２５５，１１５号明細書に記載されているような、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介トランスフェクション法も有用である。使用する特定の遺伝子工学の手順が、異種遺伝子を発現し得る宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を首尾よく導入し得ることのみが必要である。
発現ベクターが細胞に導入された後、トランスフェクトされた細胞は、セルラーゼ遺伝子プロモーター配列の制御下で遺伝子の発現に有利な条件下で培養される。形質転換細胞の大きなバッチは、本明細書に記載のようにして培養することができる。最後に、標準的な手法を用いて培養物から生成物を回収する。
このように、本明細書における発明は、その発現が天然に存在するセルラーゼ遺伝子、融合ＤＮＡ配列、および種々の異種コンストラクトを含む、セルラーゼ遺伝子プロモーター配列の制御下にある、所望のポリペプチドの発現および増強された分泌を提供する。本発明はまた、このような所望産物を高レベルで発現および分泌させる方法を提供する。
ＶＩ．目的タンパク質
上記のように、本開示の特定の実施形態は、変異糸状菌細胞（親糸状菌細胞に由来する）に関し、この変異細胞は、Ａｃｅ３－Ｌ、Ａｃｅ３－ＥＬまたはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質をコードする、遺伝子の発現を増加（親細胞と比較して）させる遺伝子改変を含み、このコードされたＡｃｅ３－Ｌ、Ａｃｅ３－ＥＬまたはＡｃｅ３－ＬＮタンパク質は、配列番号６のＡｃｅ３－Ｌタンパク質に対して約９０％の配列同一性を有し、かつ変異細胞は、誘導基質の非存在下で、少なくとも１つの目的タンパク質（ＰＯＩ）を発現する。
本開示の特定の実施形態は、誘導基質の非存在下において、タンパク質（すなわち、目的タンパク質）の細胞内産生および／または細胞外産生を増強するために特に有用である。目的タンパク質は、内因性タンパク質（すなわち、宿主細胞において内因性）または異種タンパク質（すなわち、宿主細胞において天然でない）であり得る。本開示にしたがって産生することができるタンパク質には、限定されないが、ホルモン、酵素、成長因子、サイトカイン、抗体などが含まれる。
例えば、目的タンパク質には、限定されないが、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マンナナーゼ、β－グルカナーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ類、アラビナーゼ、アラビノシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－グルカナーゼ、グルカンライザーゼ、エンド－β－グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼなどが含まれ得る。
特定の実施形態では、目的タンパク質には、限定されないが、国際公開第０３／０２７３０６号パンフレット、同第２００３５２１１８号パンフレット、同第２００３５２０５４号パンフレット、同第２００３５２０５７号パンフレット、同第２００３５２０５５号パンフレット、同第２００３５２０５６号パンフレット、同第２００４１６７６０号パンフレット、同第９２１０５８１号パンフレット、同第２００４４８５９２号パンフレット、同第２００４４３９８０号パンフレット、同第２００５２８６３６号パンフレット、同第２００５０１０６５号パンフレット、同第２００５／００１０３６号パンフレット、同第２００５／０９３０５０号パンフレット、同第２００５９３０７３号パンフレット、同第２００６７４００５号パンフレット、同第２００９／１４９２０２号パンフレット、同第２０１１／０３８０１９号パンフレット、同第２０１０／１４１７７９号パンフレット、同第２０１１／０６３３０８号パンフレット、同第２０１２／１２５９５１号パンフレット、同第２０１２／１２５９２５号パンフレット、同第２０１２１２５９３７号パンフレット、同第／２０１１／１５３２７６号パンフレット、同第２０１４／０９３２７５号パンフレット、同第２０１４／０７０８３７号パンフレット、同第２０１４／０７０８４１号パンフレット、同第２０１４／０７０８４４号パンフレット、同第２０１４／０９３２８１号パンフレット、同第２０１４／０９３２８２号パンフレット、同第２０１４／０９３２８７号パンフレット、同第２０１４／０９３２９４号パンフレット、同第２０１５／０８４５９６号パンフレットおよび同第２０１６／０６９５４１号パンフレットに開示されている酵素が含まれる。
タンパク質の産生の最適条件は、宿主細胞の選択および発現されるタンパク質の選択によって変化する。そのような条件は、ルーチンの実験および／または最適化によって、当業者には容易に確かめ得る。
目的タンパク質は、発現後に精製または単離することができる。目的タンパク質は、どのような他の成分が試料中に存在するかによって、当業者に知られた様々な方法で単離または精製し得る。標準的な精製方法には、電気泳動手法、分子的手法、免疫学的手法、クロマトグラフィー手法、例えば、イオン交換、疎水性、親和性、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、ならびにクロマトフォーカシングが含まれる。例えば、目的タンパク質は、標準的な抗目的タンパク質抗体カラムを用いて精製し得る。タンパク質濃度と関連して、限外ろ過およびダイアフィルトレーション手法もまた有用である。必要な精製の程度は、目的タンパク質の使用目的により異なる。ある場合には、タンパク質の精製は不要である。
他の特定の実施形態では、本開示の遺伝子的に改変された真菌細胞（すなわち、ａｃｅ３－Ｌの発現を増加させる遺伝子改変を含む変異真菌宿主細胞）が、増加したレベルの目的タンパク質を産生する能力を有することを確認するために、種々のスクリーニング法を実施し得る。発現ベクターは、検出可能な標識として機能する標的タンパク質へのポリペプチド融合物をコードし得る、または標的タンパク質自体が選択可能なもしくはスクリーニング可能なマーカーとして機能し得る。標識タンパク質は、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓウェブサイトで入手可能な方法）、ＥＬＩＳＡ、または標識がＧＦＰである場合、全細胞蛍光法もしくはＦＡＣＳによって検出し得る。例えば、６－ヒスチジンタグは標的タンパク質への融合体として含まれ、そしてこのタグはウェスタンブロッティングによって検出される。標的タンパク質が十分に高いレベルで発現する場合、クマシー／銀染色と組み合わされたＳＤＳ－ＰＡＧＥを、変異宿主細胞において親（対照）細胞を越える発現の増加を検出するために実施することができ、この場合は標識を必要としない。さらに、細胞１個あたりのタンパク質の活性または量、培地１ミリリットルあたりのタンパク質の活性または量の増加を検出するなどの他の方法を使用して、目的タンパク質の改善されたレベルを確認することができ、これにより、またはこれらの方法の組み合わせにより、より長時間、培養または発酵を効率的に継続することが可能になる。
比生産性の検出は、タンパク質の産生を評価する別の方法である。比生産性（Ｑｐ）は、次式により求めることができる：
Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ
（式中、「ｇＰ」はタンク内で生成されたタンパク質のグラム数であり、「ｇＤＣＷ」はタンク内の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラム数であり、「ｈｒ」は生成時間と増殖時間を含む、接種時からの発酵時間（時間）である）。
他の実施形態では、変異真菌宿主細胞は（改変されていない）親細胞と比較して、少なくとも約０．５％、例えば、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．７％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、少なくとも約２．０％、少なくとも約２．５％、もしくは少なくとも約３％、またはそれ以上の目的タンパク質を産生することができる。
ＶＩＩ．発酵
特定の実施形態では、本開示は、変異真菌細胞の発酵を含む、目的タンパク質を産生する方法（ここで、変異真菌細胞は、目的タンパク質を分泌する）を提供する。一般に、当該技術分野でよく知られた発酵方法が、変異真菌細胞を発酵させるために使用される。いくつかの実施形態では、真菌細胞は、バッチまたは連続発酵条件下で増殖させる。古典的なバッチ発酵は、クローズドシステムであり、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵中に変更されない。発酵の開始時に、培地に所望の生物を接種する。この方法では、系にいかなる成分も添加することなく醗酵を行うことができる。一般には、バッチ発酵は炭素源の添加に関して「バッチ」であると見なされ、ｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御することが頻繁に行われる。バッチシステムの代謝産物およびバイオマス組成は、発酵が停止される時まで絶えず変化する。バッチ培養内で、細胞は静的誘導期を経て高増殖対数期に進み、最終的に増殖速度が低下または停止する静止期に進む。未処理のまま放置すると、静止期にある細胞は最終的には死滅する。一般に、対数期の細胞は、生成物の大部分の産生を担っている。
標準的なバッチシステムの好適なバリエーションは、「流加発酵」システムである。一般的なバッチシステムのこのバリエーションでは、発酵が進行するにつれて基質が少しずつ添加される。流加システムは、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する可能性が高い場合、および培地中の基質量が限られた量であることが望ましい場合に有用である。流加システムでは、実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ２などの廃ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ発酵および流加発酵は、当該技術分野において一般的であり、よく知られている。
連続発酵は規定の発酵培地をバイオリアクターに連続的に添加し、処理のために等量の馴化培地を同時に除去するオープンシステムである。連続発酵は、一般に、培養物を一定の高密度に維持し、細胞は主として対数増殖期にある。連続発酵は、細胞の増殖および／または産生物の濃度に影響する１つ以上の因子の調節を可能にする。例えば、一実施形態では、炭素源または窒素源などの制限栄養素は一定比率で維持され、他の全てのパラメータは調節することができる。他のシステムでは、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響する多くの因子を連続的に変化させることができる。連続システムは、定常状態の増殖条件を維持しようとする。したがって、培地を取り出すことによる細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度とバランスさせなければならない。連続発酵プロセスで栄養素および増殖因子を調節する方法、ならびに産生物形成速度を最大化するための手法は、工業微生物学の分野においてはよく知られている。
本開示の特定の実施形態は、真菌を培養するための発酵手順に関する。セルラーゼ酵素の産生のための発酵手順は、当該技術分野で知られている。例えば、セルラーゼ酵素は、バッチ、流加および連続フロープロセスなどの、固体または浸漬培養によって産生することができる。培養は一般に、水性無機塩培地、有機増殖因子、炭素およびエネルギー源物質、分子状酸素、および、当然に、使用される糸状菌宿主の出発接種材料を含む増殖培地中で行われる。
適切な微生物増殖を確実にし、微生物変換プロセスで細胞による炭素およびエネルギー源の吸収を最大にし、発酵培地において最大細胞密度で最大細胞収率を達成するには、炭素およびエネルギー源、酸素、吸収可能な窒素、ならびに微生物接種材料に加えて、好適な量の無機栄養素を適切な割合で供給する必要がある。
水性無機培地の組成は、当該技術分野で知られているように、使用する微生物および基質に部分的に依存して、広範囲にわたって変えることができる。無機培地には、窒素に加えて、好適な量のリン、マグネシウム、カルシウム、カリウム、硫黄、およびナトリウムが、好適な可溶性の吸収可能なイオン性の複合形態で含まれ、また、好ましくは、銅、マンガン、モリブデン、亜鉛、鉄、ホウ素、およびヨウ素などのいくつかの微量元素も、これもまた好適な可溶性の吸収可能な形態で含まれるが、これらは全て当該技術分野で知られていることである。
発酵反応は、微生物種が盛んに増殖するのを助けるのに有効な好適な酸素分圧で、発酵槽の内容物を維持するために提供される、空気、酸素富化空気、または実質的に純粋な分子状酸素などの分子状酸素含有ガスによって必要な分子状酸素が供給される好気的プロセスである。
発酵温度はいくらか変えることができるが、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などの糸状菌の場合、温度は一般に約２０℃～４０℃の範囲内、一般に好ましくは約２５℃～３４℃の範囲内である。
微生物はまた、吸収可能な窒素源を必要とする。吸収可能な窒素源は、任意の窒素含有化合物、または微生物による代謝利用に好適な形態で窒素を放出することができる任意の化合物であり得る。タンパク質加水分解物などの、様々な有機窒素源化合物を使用することができるが、通常、アンモニア、水酸化アンモニウム、尿素などの安価な窒素含有化合物、およびリン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピロリン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、または他の様々なアンモニウム化合物などの各種アンモニウム塩を利用することができる。アンモニアガス自体は、大規模な操作に便利であり、好適な量で水性発酵物（発酵培地）をバブリングして使用することができる。同時に、そのようなアンモニアは、ｐＨ制御を助けるために用いることもできる。
水性微生物発酵物（発酵混合物）のｐＨ範囲は、約２．０～８．０の例示的な範囲であるべきである。糸状菌では、ｐＨは、通常、約２．５～８．０の範囲であり、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）では、ｐＨは、通常、約３．０～７．０の範囲である。微生物の好ましいｐＨ範囲は、使用する培地および特定の微生物にある程度まで依存し、したがって、当業者ならば容易に決定できることであるが、培地の変化と共にいくらか変化する。
制限因子として炭素含有基質を制御することができるようなやり方で醗酵を行うことが好ましく、それによって炭素含有基質の細胞への良好な転換が提供され、相当量の未転換基質による細胞の汚染が回避される。後者は、水溶性基質では、微量の残存物は容易に洗い流せるので、問題にならない。しかしながら、非水溶性基質の場合には問題となる可能性があり、好適な洗浄工程などの追加の生成物処理工程が必要になる。
上記のように、このレベルに到達する時間は重要ではなく、特定の微生物および実施する発酵プロセスによって変化し得る。しかしながら、発酵培地中の炭素源濃度の決定方法、および所望の炭素源レベルが達成されているか否かの決定方法は、当該技術分野ではよく知られている。
発酵はバッチまたは連続操作として行うことができ、流加操作は、制御の容易さ、均一な量の生成物の生産、および全ての装置の最も経済的な使用という点で非常に好ましい。
必要ならば、水性無機培地を発酵槽に供給する前に、炭素およびエネルギー源物質の一部または全部および／またはアンモニアなどの吸収可能な窒素源の一部を水性無機培地に加えることができる。
反応器に導入される流れの各々は、所定の速度に制御するか、炭素およびエネルギー基質の濃度、ｐＨ、溶存酸素、発酵槽排ガス中の酸素または二酸化炭素、乾燥細胞重量により測定可能な細胞密度、透光度などの、モニタリングによって決定可能な必要性に応じて制御することが好ましい。炭素およびエネルギー源の効率的な利用と一致して、可能な限り迅速な細胞増殖速度を得、基質の供給に対して可能な限り高い微生物細胞の収率を得るために、各種材料の供給速度は変化させることができる。
バッチまたは好ましい流加操作においては、全ての装置、反応器、または発酵手段、槽または容器、配管、付随する循環または冷却装置などは、最初に、通常、蒸気を使用して、例えば、約１２１℃で少なくとも約１５分間、滅菌する。次いで、酸素を含む必要な栄養素の全て、および炭素含有基質を存在下で、滅菌した反応器に選択された微生物の培養物を接種する。使用する発酵槽の種類は重要ではない。
発酵ブロスからの酵素（例えば、セルラーゼ）の回収および精製もまた、当業者に知られた手順によって行うことができる。発酵ブロスは、一般に、細胞残屑、例えば、細胞、種々の懸濁固体および他のバイオマス混入物質、ならびに所望のセルラーゼ酵素産物を含み、これらは、当該技術分野で知られた手段によって発酵ブロスから除去することが好ましい。
そのような除去に好適なプロセスには、無細胞ろ液を生成するための、例えば、遠心分離、ろ過、透析、精密ろ過、回転真空ろ過、または他の知られたプロセスなどの従来の固液分離手法が含まれる。結晶化の前に、限外ろ過、蒸発または沈殿などの手法を使用して、発酵ブロス、または細胞を含まないろ液をさらに濃縮することが好ましい。
上清またはろ液のタンパク質成分の沈澱が、塩、例えば硫酸アンモニウムによって行われ、続いて、各種のクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、または類似の分野で認められている方法によって精製が行われ得る。
以下の実施例は本開示の実施形態を示しているが、それらは例示としてのみ与えられていることを理解されたい。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者は種々の使用および条件に適合させるために、本開示の種々の変更および修正を行うことができる。このような修正もまた、特許請求の範囲に記載された発明の範囲に含まれるものとする。
実施例１
糸状菌細胞内でのａｃｅ３過剰発現の生成
１Ａ．概要
本実施例では、ａｃｅ３遺伝子を発現する変異トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞（すなわち、例示的な糸状菌）を、プロトプラスト形質転換を用い、ｐｙｒ２遺伝子、異種プロモーター、およびａｃｅ３遺伝子を含む核酸により、親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞を形質転換することによって作製した。図１および図２に概ね示すように、２つの異なるプロモーターおよび２つの異なるバージョンのａｃｅ３ ＯＲＦ（図１；ａｃｅ３－ＳＣおよびａｃｅ３－Ｌ）を４つの異なる組み合わせで用い、４つの異なるａｃｅ３－発現ベクターを構築した（図２Ａ～２Ｄ）。ｈｘｋ１（ヘキソキナーゼをコードする遺伝子）およびｐｋｉ１（ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子）のプロモーターが、ａｃｅ３の構成的発現を駆動するために選択されたが、他のプロモーターもまた使用することができ、当業者によって選択され得る。
１Ｂ．トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞
以下の実施例に示すＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親宿主細胞は、Ｓｈｅｉｒ－Ｎｅｉｓｓ ａｎｄ Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ，１９８４により一般的に記述されているように、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子が欠失したＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＲＬ－Ｐ３７（ＮＲＲＬ寄託番号１５７０９）に由来した。
１Ｃ．Ａｃｅ３発現ベクターの構築
上の本開示の［発明を実施するための形態］に記載されているように、Ａｃｅ３は、誘導条件下（すなわち、ラクトースの存在下）のセルラーゼおよびヘミセルラーゼの産生に必要であることが最近示されたＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）転写因子である（Ｈａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。より詳しくは、Ｈａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株ＱＭ６ａ（ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／Ｔｒｉｒｅ２／Ｔｒｉｒｅ２．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌを参照されたい）の、公的に利用可能なゲノム配列に基づく予測ａｃｅ３ ＯＲＦを使用したが、このＱＭ６ａの予測アノテーション（タンパク質ＩＤ ７７５１３）は、２つのエクソンと１つのイントロンからなる（例えば、図１を参照されたい））。
さらに、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｒｕｔ－Ｃ３０株の公的に利用可能なゲノム配列（ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／ＴｒｉｒｅＲＵＴＣ３０＿１／ＴｒｉｒｅＲＵＴＣ３０＿１．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌを参照されたい）から予測されたａｃｅ３ ＯＲＦ（タンパク質ＩＤ ９８４５５）は、３つのエクソンと２つのイントロンを含むより長いタンパク質配列（すなわち、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａ由来の（短い）ａｃｅ３－Ｓに対して）を含む（図１）。より詳しくは、「ＲＵＴ－Ｃ３０」モデルによって予測された開始コドンは「ＱＭ６ａ」モデルのそれより上流に位置し、Ｃ末端にナンセンス変異があり（Ｐｏｇｇｉ－Ｐａｒｏｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、より長いＮ末端配列およびより短いＣ末端タンパク質配列をもたらす（図１）。
本実施例では、短いａｃｅ３ ＯＲＦ（ＱＭ６ａアノテーションに基づくが、タンパク質のＣ末端を切断するＲＵＴ－Ｃ３０ナンセンス変異を含む（Ａｃｅ３－Ｓ））および長いａｃｅ３ ＯＲＦ（ＲＵＴ－Ｃ３０アノテーションに基づく（Ａｃｅ３－Ｌ））の両方をクローニングした。図１に示すように、短いａｃｅ３（Ａｃｅ３－Ｓ）および長いａｃｅ３（Ａｃｅ３－Ｌ）ＯＲＦはいずれも、ＲＵＴ－Ｃ３０に見られるＣ末端のナンセンス変異を含む（図１）。ａｃｅ３ ＯＲＦの発現を駆動するために、異種ヘキソースキナーゼ（ｈｘｋ１）プロモーターおよび異種ピルビン酸キナーゼ（ｐｋｉ１）プロモーターを試験した。
したがって、標準的な分子生物学的手順を用い、４つのＡｃｅ３発現ベクターｐＹＬ１、ｐＹＬ２、ｐＹＬ３およびｐＹＬ４（図２Ａ～２Ｄ）を、構築した。これらの発現ベクターは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製と選択のための細菌ＣｏｌＥ１ ｏｒｉおよびＡｍｐＲ遺伝子を有するベクター骨格を含む。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２選択マーカーに加えて、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロモーター配列（すなわち、ｈｘｋ１またはｐｋｉ１プロモーター）およびその天然ターミネーターを有するａｃｅ３ ＯＲＦ（ａｃｅ３－Ｌまたはａｃｅ３－ＳＣ）も存在する。Ｑ５ Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および下記の表１に示すプライマーを使用して、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ゲノムＤＮＡから、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロモーターおよびａｃｅ３ ＯＲＦをＰＣＲ増幅した。
各ベクターのフラグメントをＰＣＲ増幅するために使用した特異的プライマーは、以下の通りである。ベクターｐＹＬ１を構築するために、ｈｘｋ１プロモーターはプライマー対ＴＰ１３（配列番号７）およびＴＰ１４（配列番号８）を用いて増幅し、Ａｃｅ３－Ｌ ＯＲＦはプライマーＴＰ１５（配列番号９）およびＴＰ１６（配列番号１０）を用いて増幅し、ベクター骨格はプライマー対ＴＰ１７（配列番号１１）およびＴＰ１８（配列番号１２）を用いて増幅した。プラスミドｐＹＬ１の完全配列を配列番号２１として提供する。
ベクターｐＹＬ２を構築するために、ｈｘｋ１プロモーターはプライマー対ＴＰ１３（配列番号７）およびＴＰ１９（配列番号１３）を用いて増幅し、Ａｃｅ３－ＳＣ ＯＲＦはプライマーＴＰ２０（配列番号１４）およびＴＰ１６（配列番号１０）を用いて増幅し、ベクター骨格はプライマー対ＴＰ１７（配列番号１１）およびＴＰ１８（配列番号１２）を用いて増幅した。プラスミドｐＹＬ２の完全配列を配列番号２２として提供する。
ベクターｐＹＬ３を構築するために、ｐｋｉ１プロモーターはプライマー対ＴＰ２１（配列番号１５）およびＴＰ２２（配列番号１６）を用いて増幅し、Ａｃｅ３－Ｌ ＯＲＦはプライマーＴＰ２３（配列番号１７）およびＴＰ１６（配列番号１０）を用いて増幅し、ベクター骨格はプライマー対ＴＰ１７（配列番号１１）およびＴＰ２４（配列番号１８）を用いて増幅した。プラスミドｐＹＬ３の完全配列を配列番号２３として提供する。
ベクターｐＹＬ４を構築するために、ｐｋｉ１プロモーターはプライマー対ＴＰ２１（配列番号１５）およびＴＰ２５（配列番号１９）を用いて増幅し、Ａｃｅ３－ＳＣ ＯＲＦはプライマーＴＰ２６（配列番号２０）およびＴＰ１６（配列番号１０）を用いて増幅し、ベクター骨格はプライマー対ＴＰ１７（配列番号１１）およびＴＰ２４（配列番号１８）を用いて増幅した。プラスミドｐＹＬ４の完全配列を配列番号２４として提供する。
各ベクターについて、上記３つのＰＣＲフラグメントを組み立て、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；カタログ番号Ｅ５５１０Ｓ）を用いて、製造業者のプロトコルにしたがってＮＥＢ ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換した。得られたベクターの配列をサンガー配列決定法を用いて決定し、それらのマップを図２Ａ～２Ｄに示す。
Figure 0007285780000001
１Ｄ．Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の形質転換
ｐＹＬ１、ｐＹＬ２、ｐＹＬ３およびｐＹＬ４の発現ベクターを、ＰａｃＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて線状化し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介プロトプラスト形質転換によってＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親宿主細胞を形質転換した（Ｏｕｅｄｒａｏｇｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。形質転換体をＶｏｇｅｌ最小培地寒天プレート上で増殖させ、ｐｙｒ２マーカーによって獲得したウリジン原栄養性について選択した。Ｖｏｇｅｌ寒天プレート上に２回連続してトランスファーすることによって安定な形質転換体を得、その後、胞子懸濁液の平板希釈法により単一コロニーを得た。ｐＹＬ１、ｐＹＬ２、ｐＹＬ３およびｐＹＬ４を有する変異（すなわち、改変）宿主細胞を、それぞれ変異Ａ４－７、変異Ｂ２－１、変異Ｃ２－２８および変異Ｄ３－１と命名した。
実施例２
徐放性マイクロタイタープレート（ｓｒＭＴＰ）中でのタンパク質産生
本実施例は、非誘導条件下で酵素を分泌する形質転換体（実施例１を参照されたい）を同定するために使用するスクリーニング方法を記載する。例えば、実施例１から得られた安定な形質転換体を、徐放性マイクロタイタープレート（ｓｒＭＴＰ）中で試験した。使用したｓｒＭＴＰは、２０％グルコース（重量／重量）または２０％ラクトース（重量／重量）を含有する２４ウェルＰＤＭＳエラストマープレートであり、国際公開第２０１４／０４７５２０号パンフレットに記載の通り調製した。
「非誘導」および「誘導」の両条件で、実施例１に記載の親および変異Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞を試験した。「非誘導条件」では、２０％グルコース（重量／重量）を含有するｓｒＭＴＰ中で、２．５％グルコース（重量／体積）を補充した規定培地の１．２５ｍｌ液体ブロス中で細胞を増殖させた。「誘導条件」では、２０％ラクトース（重量／重量）を含有するｓｒＭＴＰ中で、２．５％グルコース／ソホロース（重量／体積）を補充した規定培地（ソホロースおよびラクトースはセルラーゼ酵素発現の強力なインデューサーとして働く）の１．２５ｍｌ液体ブロス中で細胞を増殖させた。
グルコース／ソホロースの調製は、米国特許第７，７１３，７２５号明細書に記載のように行った。規定培地は、国際公開第２０１３／０９６０５６号パンフレットに一般的に記載されているように調製し、９ｇ／Ｌのカザミノ酸、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、３３ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ緩衝液（ｐＨ５．５）、０．２５ｍｌ／ＬのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量成分を含んだ。Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量成分は、１９１．４１ｇ／ｌのクエン酸・Ｈ２Ｏ、２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５６ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．２ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏおよび０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３を含有する。全てのｓｒＭＴＰを、２８０ｒｐｍで連続的に振盪しながら、２８℃で約１２０時間インキュベートした。
インキュベーション後、全ての培養物からの上清を回収し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分析した。９０℃で１５分間、等容量の培養上清を還元環境に供した後、ＭＯＰＳ－ＳＤＳ緩衝液を含む４～１２％のＮｕＰａｇｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）ポリアクリルアミドゲルにローディングダイを添加し、溶解させた。ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でゲルを染色し、画像化した（図３を参照されたい）。
図３に示すように、試験した全ての宿主細胞は、インデューサー（すなわち、培地中のソホロースおよびｓｒＭＴＰ中のラクトース）の存在下で大量のタンパク質を分泌した。しかしながら、グルコースが唯一の炭素源であって、インデューサー（すなわち、ソホロースおまたはラクトース）の非存在下では、Ａｃｅ３－Ｌ ＯＲＦを発現する変異宿主細胞（すなわち、変異Ａ４－７および変異Ｃ２－２８）のみが分泌タンパク質を産生することができ、Ａｃｅ３－ＳＣ ＯＲＦを発現する親宿主細胞および変異細胞（すなわち、変異Ｂ１－１および変異Ｄ３－１）はＰＡＧＥの検出限界を超える細胞外タンパク質を産生しなかった。この結果は、Ａｃｅ３－Ｌが（すなわち、Ａｃｅ３－Ｓとは対照的に）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）においてインデューサーなしのタンパク質産生をできることを明確に示している。
分泌タンパク質の相対濃度を、参照として精製酵素を用いたＺｏｒｂａｘ Ｃ３逆相（ＲＰ）分析により決定した。例えば、上記の宿主細胞の分泌タンパク質プロファイルをこの方法を用いて分析し、全ての宿主細胞（すなわち、親細胞および変異細胞）が誘導条件下で、類似のセルラーゼタンパク質プロファイル（セルラーゼは、約４０％のＣＢＨ１、２０％のＣＢＨ２、１０％のＥＧ１および７％のＥＧ２からなる）を産生することが観察された。非誘導条件下では、親細胞およびＡｃｅ３－Ｓ発現変異宿主細胞でセルラーゼ酵素は検出されなかった。対照的に、驚くべきことに、Ａｃｅ３－Ｌ発現変異宿主細胞（すなわち、変異Ａ４－７およびＣ２－２８）は、誘導条件下と類似の比率のセルラーゼ酵素を産生することがわかった。
簡単に記載すると、この分析方法は次のように行った：上清サンプルを５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で希釈し、２０ｐｐｍのＥｎｄｏＨを加えて脱グリコシル化し、３７℃で３時間インキュベートした。１０μｌの９０％アセトニトリルを１００μｌのＥｎｄｏＨ処理サンプルに加え、０．２２μｍフィルターを通過させた後、注入した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ３００ ＳＢ Ｃ３ ＲＲＨＤ １．８ｕｍ（２．１×１００ｍｍ）カラムを備えた、ＤＡＤ検出（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＨＰＬＣを有するＡｇｉｌｅｎｔ１２９０を使用した。カラムは、６０℃、流量１．０ｍＬ／ｍｉｎで操作し、ランニングバッファーＡとしてＭｉｌｉＱ水中０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびランニングバッファーＢとしてアセトニトリル中０．０７％のＴＦＡを使用した。ＤＡＤ検出器は４ｎｍのウインドウで２２０ｎｍおよび２８０ｎｍで操作した。注入容量は１０μＬであった。
さらに、注目すべきことに、Ａｃｅ３－Ｌ発現変異宿主細胞は、グルコースを含むｓｒＭＴＰで約２０～３０％の総細胞外タンパク質を産生した（すなわち、ラクトースを含むｓｒＭＴＰで産生された総細胞外タンパク質と比較して）。この比較的低い発現は、グルコースを含むｓｒＭＴＰ中での高いグルコース供給速度に起因し得る。例えば、最大のセルラーゼおよびヘミセルラーゼ産生速度が低い増殖速度で多く観察されることは、十分に立証されている（Ａｒｖａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。それにもかかわらず、ｓｒＭＴＰ増殖アッセイは、タンパク質産生について安定なコロニーをスクリーニングするための比較的高スループットのアッセイであった。
総合すると、Ａｃｅ３－Ｌ ＯＲＦを発現する変異Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞は、比較的低いタンパク質産生速度ではあるが、インデューサーの非存在下でセルラーゼおよびヘミセルラーゼを産生することができた。より詳しくは、この低産生速度は、下記の実施例３および実施例４に示すように、宿主細胞の産生能力よりもむしろ、ｓｒＭＴＰ増殖方法に関連した。
実施例３
振盪フラスコ内でのタンパク質の産生
上で示したｓｒＭＴＰの結果をさらに調査し、検証するために、インデューサー基質の存在下および非存在下、振盪フラスコにおける５０ｍＬ浸漬培養で、親宿主細胞およびＡｃｅ３－Ｌ発現変異宿主細胞を増殖させた。より詳しくは、誘導条件（すなわち、炭素源としてのグルコース／ソホロース）および非誘導条件（すなわち、炭素源としてのグルコース）の両条件下の浸漬（液体）培養で、親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞、変異Ａ４－７細胞および変異Ｃ２－２８細胞を増殖させ、それらのそれぞれの細胞外（分泌）タンパク質産生レベルを比較した。簡単に記載すると、底部バッフルを有する２５０ｍＬ三角フラスコ中の５０ｍＬのＹＥＧブロスに、各宿主細胞（すなわち、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親宿主細胞、変異Ａ４－７宿主細胞および変異Ｃ２－２８宿主細胞）の菌糸を別々に加えた。ＹＥＧブロスは、５ｇ／Ｌの酵母抽出物および２２ｇ／Ｌのグルコースを含有する。細胞培養物を４８時間増殖させ、続いてさらに２４時間、新鮮なＹＥＧ中で二次培養した。次いで、これらの種培養物を、底部バッフルを有する２５０ｍＬ振盪フラスコ中の、１．５％のグルコースを補充した５０ｍＬの規定培地（非誘導条件）、または１．５％のグルコース／ソホロースを含む５０ｍＬの規定培地（誘導条件）に接種した。
全ての振盪フラスコを、２００ｒｐｍで継続的に振盪しながら、２８℃でインキュベートした。インキュベーションの３日後、全ての細胞培養物からの上清を回収し、上記実施例２に記載のようにＰＡＧＥを用いて分析した。Ｂｉｏ－Ｒａｄ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）；カタログ番号２３２３６）、および標準として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の５倍希釈を使用し、５９５ｎｍで、Ｂｒａｄｆｏｒｄ色素結合アッセイによって上清中の総タンパク質を測定した。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によりグルコース濃度を測定したが、インキュベーション３日後の培養物中にグルコースは検出されなかった。
図４に示すように、親（対照）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、グルコース／ソホロース（誘導性）を含む規定培地中で４６４μｇ／ｍＬの全分泌タンパク質を産生したが、グルコース（非誘導性）を含む規定培地中ではわずかに１４０μｇ／Ｌの全分泌タンパク質を産生しただけであった。対照的に、変異Ａ４－７細胞およびＣ２－２８細胞は、誘導および非誘導条件下で類似した量の分泌タンパク質を産生し、その両方が、ソホロース（誘導）により親（対照）細胞で産生された分泌タンパク質よりも多かった。したがって、これらの結果は、Ａｃｅ３－Ｌ ＯＲＦを有する変異細胞（すなわち、変異Ａ４－７およびＣ２－２８細胞）は、インデューサーの非存在下で細胞外タンパク質を産生するだけでなく、これらの変異細胞はまたそうした誘導条件下で、親（対照）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞よりも多く全タンパク質を産生することを示している。
実施例４
小規模流加発酵におけるタンパク質の生産
本実施例は、変異Ａｃｅ３－Ｌ発現細胞（すなわち、変異Ａ４－７およびＣ２－２８細胞）が、インデューサー基質の存在下および非存在下の小規模醗酵で類似量のセルラーゼおよびヘミセルラーゼ酵素を産生したことを示す。より詳しくは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の発酵を概ね米国特許第７，７１３，７２５号明細書に記載のように、２Ｌバイオリアクター内、クエン酸塩最小培地中で種培養物を使用して実施した。より具体的には、発酵の間、全ての培養物からの上清を異なる時点で回収し、等容量の培養上清をＰＡＧＥ分析に供した。図５に示すように、親（対照）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、ソホロースインデューサーの存在下でのみ、分泌タンパク質を産生した。対照的に、変異Ａ４－７およびＣ２－２８細胞（図５）は、誘導および非誘導の両方の条件下で、類似量のタンパク質を産生した。
実施例５
Ａｃｅ３発現のための異種プロモーター
本実施例は、ａｃｅ３－Ｌの発現を駆動する１３の異なるプロモーターを使用し、「非誘導」条件下でタンパク質の産生が増強されることを示す。より詳しくは、プロトプラスト形質転換を用い、ｐｙｒ２遺伝子、異種プロモーター、およびａｃｅ３－Ｌ遺伝子を含むテロメアベクターで親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞を形質転換することにより、ａｃｅ３－Ｌ遺伝子を発現するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞を作製した。
したがって、ａｃｅ３－Ｌ ＯＲＦの発現を駆動する１３のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロモーターを選択した。試験した１３種のプロモーターには、限定されないが、（ｉ）ホルムアミダーゼ遺伝子（ｒｅｖ３；タンパク質ＩＤ １０３０４１）プロモーター（配列番号１５）、（ｉｉ）β－キシロシダーゼ遺伝子（ｂｘｌ；タンパク質ＩＤ １２１１２７）プロモーター（配列番号１６）、（ｉｉｉ）トランスケトラーゼ遺伝子（ｔｋｌ１；タンパク質ＩＤ ２２１１）プロモーター（配列番号１７）、（ｉｖ）機能の知られていない遺伝子（タンパク質ＩＤ １０４２９５）プロモーター（配列番号１８）、（ｖ）オキシドレダクターゼ遺伝子（ｄｌｄ１；タンパク質ＩＤ ５３４５）プロモーター（配列番号１９）、（ｖｉ）キシラナーゼＩＶ遺伝子（ｘｙｎ４；タンパク質ＩＤ １１１８４９）プロモーター（配列番号２０）、（ｖｉｉ）α－グルクロニダーゼ遺伝子（タンパク質ＩＤ ７２５２６）プロモーター（配列番号２１）、（ｖｉｉｉ）アセチルキシランエステラーゼ遺伝子１（ａｘｅ１；タンパク質ＩＤ ７３６３２）プロモーター（配列番号２２）、）（ｉｘ）ヘキソースキナーゼ遺伝子（ｈｘｋ１；タンパク質ＩＤ ７３６６５）プロモーター（配列番号２３）、（ｘ）ミトコンドリアキャリアタンパク質遺伝子（ｄｉｃ１；タンパク質ＩＤ ４７９３０）プロモーター（配列番号２４）、（ｘｉ）オリゴペプチドトランスポーター遺伝子（ｏｐｔ；タンパク質ＩＤ ４４２７８）プロモーター（配列番号２５）、（ｘｉｉ）グリセロールキナーゼ遺伝子（ｇｕｔ１；タンパク質ＩＤ ５８３５６）プロモーター（配列番号２６）および（ｘｉｉｉ）ピルビン酸キナーゼ遺伝子（ｐｋｉ１；タンパク質ＩＤ ７８４３９）プロモーター（配列番号２７）が含まれる。タンパク質ＩＤ（ＰＩＤ）番号は、ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／Ｔｒｉｒｅ２／Ｔｒｉｒｅ２．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌからのものである。したがって、上記１３のプロモーターは、その遺伝子が、グルコース濃度が高い場合には、一般に増殖中、低レベルで発現され、グルコース濃度が低い場合またはソホロース誘導条件下では、より高いレベルで発現されるので、発現を駆動するために選択された。
下記表２に、標準的な分子生物学的手順を用いて構築した１３のプロモーターおよびその発現ベクターをまとめる。より詳しくは、本実施例で試験した発現ベクター（表２）は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製および選択のための細菌ＣｏｌＥ１ ｏｒｉおよびＡｍｐＲ遺伝子、ならびにサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の複製および選択のための２μ ｏｒｉおよびＵｒａ３遺伝子を有するベクター骨格を含む。さらに、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）テロメア配列（「ＴｒＴＥＬ」）、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２選択マーカー、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロモーター配列、およびその天然ターミネーター配列を有するａｃｅ３－Ｌ ＯＲＦが存在する。代表的なベクターマップとして、ｄｉｃ１プロモーターを含むベクターｐＹＬ８を図７に示す。したがって、他のベクター（例えば、ｐＹＬ９、ｐＹＬ１２など）は、異なるプロモーター配列を除いて、図７に示したものと同じ配列を有する。
Figure 0007285780000002
この発現ベクターを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介プロトプラスト形質転換によってＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親宿主細胞（非機能性ｐｙｒ２遺伝子を含む）に挿入（形質転換）した（Ｏｕｅｄｒａｏｇｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。形質転換体をＶｏｇｅｌ最小培地寒天プレート上で増殖させ、ｐｙｒ２マーカーによって獲得したウリジン原栄養性で選択した。Ｖｏｇｅｌ寒天プレート上で２回連続してトランスファーすることによって安定な形質転換体を得、続いて非選択的ＰＤＡプレート上で２回連続して増殖させ、Ｖｏｇｅｌ寒天プレート上で１回増殖させ、その後、胞子懸濁液を平板希釈することによって単一コロニーを得た。
「非誘導」および「誘導」の両条件で、上記親および形質転換した（娘）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞を試験した。例えば、「非誘導条件」で、標準の２４ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中、２．５％グルコース（重量／体積）を補充した規定培地の１．２５ｍｌ液体ブロス中で細胞を増殖させた。「誘導条件」では、ＭＴＰ中、２．５％グルコース／ソホロース（重量／体積）を補充した規定培地の１．２５ｍｌ液体ブロス（ソホロースがセルラーゼ酵素発現の強力なインデューサーとして働く）中で細胞を増殖させた。インキュベーションに続いて、全培養物からの上清を回収し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）；カタログ番号２３２３６）および標準として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の５倍希釈を使用し、５９５ｎｍでＢｒａｄｆｏｒｄ色素結合アッセイにより全分泌タンパク質を測定した。
表３に示すように、親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、ソホロースインデューサーの存在下でのみ、高レベルの分泌タンパク質を産生した。対照的に、１３の異なるプロモーターで駆動されたＡｃｅ３－Ｌを含み、かつ発現させる変異（娘）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、誘導条件下および非誘導条件下の両方で類似した量の分泌タンパク質を産生した。表３に示すように、各改変（娘）株のタンパク質レベルは、グルコース／ソホロース（Ｇｌｕ／Ｓｏｐ）誘導条件下で親株（ＬＴ４）によって産生されたタンパク質（濃度）に対する比として示されている。
Figure 0007285780000003
さらに、実施例３で一般的に記載した振盪フラスコ実験で、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親株および上記のその形質転換体をさらに試験した。例えば、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）娘株「ＬＴ８３」（ここで、娘株ＬＴ８３は、ｄｉｃ１プロモーター（配列番号２８）で駆動されるａｃｅ３－Ｌ ＯＲＦを含む）の代表的な結果を図８に示す。図８に示すように、親（対照）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、ソホロース（「Ｓｏｐ」）インデューサーの存在下でのみ分泌タンパク質を産生したが、娘株ＬＴ８３は誘導（「Ｓｏｐ」）および非誘導（「Ｇｌｕ」）の両条件下で、類似した量の分泌タンパク質を産生した。
同様に、実施例４で一般的に記載したようにして、小規模発酵を行った。より詳しくは、図９に示すように、親（対照）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）株は、ソホロースインデューサー（「Ｓｏｐ」）の存在下でのみ分泌タンパク質を産生したが、娘株ＬＴ８３は誘導（「Ｓｏｐ」）および非誘導（「Ｇｌｕ」）の両条件下で、類似した量の分泌タンパク質を産生した。
実施例６
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＡＣＥ３過剰発現コンストラクトのクローニング
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のゲノム配列は、Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／）から公的に入手可能であるが、ａｃｅ３コード領域の５’末端の位置が明らかでない。例えば、Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅにおけるＤＮＡ配列のアノテーションは、ＤＮＡ配列が同じであっても、変異株Ｒｕｔ－Ｃ３０（ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／ＴｒｉｒｅＲＵＴＣ３０＿１／ＴｒｉｒｅＲＵＴＣ３０＿１．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）と野生型株ＱＭ６ａ（ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／Ｔｒｉｒｅ２／Ｔｒｉｒｅ２．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）とでは異なった。ＱＭ６ａの場合、ａｃｅ３コード領域の５’末端は、図１１の矢印３で示すようにエクソン３の上流（５’末端）、イントロン２内にあると示唆された。Ｒｕｔ－Ｃ３０の場合、ａｃｅ３コード領域の５’末端はエクソン２内にある（図１１、矢印２）。ゲノムＤＮＡ配列および追加のｃＤＮＡ配列のさらなる分析により、図１１に示すようにエクソン１およびイントロン１が存在する可能性のあることが示唆された。さらに、Ｒｕｔ－Ｃ３０のａｃｅ３コード領域の３’末端は、野生型分離株ＱＭ６ａの配列（図１１、矢印５）と比較して、未成熟終止コドン（図１１、矢印４）を作り出す変異を含んでいる。したがって、本実施例では、ａｃｅ３遺伝子のこれらの異なる可能な形態を過剰発現することの効果を、本明細書に記載するように実験的に研究した（例えば、図１１、図１２、および図１３～１８を参照されたい）。
したがって、図１２に示すａｃｅ３の異なる形態が、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）において過剰発現した。ここで、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ａｃｅ３遺伝子のための過剰発現ベクターは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）のグルコアミラーゼ遺伝子座（ｇｌａ１）にａｃｅ３の標的組み込みを可能にするように設計された。より詳細には、全てのプラスミド（ベクター）コンストラクトで、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ａｃｅ３遺伝子は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｄｉｃ１プロモーターの制御下、天然のａｃｅ３ターミネーターにより発現した。これらのベクターは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）形質転換体の選択のために、ｐｙｒ４マーカーをその天然のプロモーターおよびターミネーターと共にさらに含む。ｇｌａ１遺伝子座に組み込んだ後のｐｙｒ４遺伝子の切除を可能にするために、ｐｙｒ４プロモーターの反復が含まれた。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での複製と増幅を可能にするベクター骨格は、ＥｃｏＲＩ－ＸｈｏＩ消化ｐＲＳ４２６であった（Ｃｏｌｏｔ ｅｔ ａｌ，２００６）。標的組み込みに必要なＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｇｌａ１遺伝子座の５’末端および３’末端フランク、ｄｉｃ１プロモーター、異なる形態のａｃｅ３コード領域、およびターミネーターを、表４に示すプライマーを用いてＰＣＲにより作製した。フランキングフラグメントの鋳型は、野生型Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａ（ＡＴＣＣ寄託番号１３６３１）由来のゲノムＤＮＡであった。
Figure 0007285780000004
ｄｉｃ１プロモーター、ａｃｅ３遺伝子およびターミネーターについては、鋳型は、これらのフラグメントを保持する先のプラスミドｐＹＬ８（実施例５を参照されたい）であった。選択マーカー（ｐｙｒ４）は、ＮｏｔＩ消化を有する先のプラスミドから得た。所望のＤＮＡフラグメントを生成するために使用したＰＣＲプライマーを表４に示す。ＰＣＲ産物および消化フラグメントを、アガロースゲル電気泳動を用いて分離した。製造業者のプロトコルにしたがって、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲルから正しいフラグメントを単離した。プラスミドは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５０１２６号明細書（国際公開第２０１３／１０２６７４号パンフレットとして公開）に記載されている酵母相同組換え法を用い、上記のフラグメントにより構築した。プラスミドを酵母からレスキューし、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。少数のクローンを選択し、プラスミドＤＮＡを単離し、配列を決定した。プラスミドの概要を表５に示す。
Figure 0007285780000005
したがって、表５に示されるコンストラクトは、異なる形態のａｃｅ３遺伝子を有することによって異なる。ＳＣ形態は、エクソン３および４、ならびにイントロン３を含む遺伝子の短い形態である（図１２および図１３、配列番号７を参照されたい）。より詳しくは、配列番号７のＳＣ形態は、１，７１３ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１４４ｂｐのエクソン４を含む。ＳＣ形態の（３’末端）Ｃ末端（すなわち、エクソン４）は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＲｕｔＣ－３０株と同じ変異を有する。
Ｓ形態は、エクソン３および４、ならびにイントロン３を含む遺伝子の短い形態であるが、エクソン４の（３’末端）Ｃ末端に変異を有しない（図１２および図１４、配列番号１を参照されたい）。より詳しくは、Ｓ形態は、１，７１３ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１７７ｂｐのエクソン４を含む。これらの両形態（すなわち、「ＳＣ」および「Ｓ」）において、翻訳開始コドンは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａ株のアノテーションにあるように、長いイントロン２（図１２を参照されたい）にあり、「ＳＣ」および「Ｓ」の両形態は、推定ＤＮＡ結合ドメインのコード領域の一部を欠いている。
Ｌ形態は、エクソン２、３および４、ならびにイントロン２（長いイントロン）およびイントロン３を含む遺伝子の長い形態である（例えば、図１２および図１５、配列番号４を参照されたい）。より詳しくは、Ｌ形態は、２５８ｂｐのエクソン２、４２３ｂｐのイントロン２、１，６３５ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１４４ｂｐのエクソン４を含む。Ｌ形態の（３’末端）Ｃ末端は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＲｕｔＣ－３０株と同じ変異を有する。
ＬＣ形態は、エクソン２、３および４、ならびにイントロン２（長いイントロン）およびイントロン３を含む遺伝子の長い形態である（例えば、図１２および図１６、配列番号９を参照されたい）。より詳しくは、ＬＣ形態は、２５８ｂｐのエクソン２、４２３ｂｐのイントロン２、１，６３５ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１７７ｂｐのエクソン４を含む。ＬＣ形態は、Ｃ末端に変異がない。「Ｌ」および「ＬＣ」の両形態では、翻訳開始コドンはＲｕｔ－Ｃ３０株に対してＪＧＩでアノテートされているように、エクソン２にある。
ＥＬ形態は、エクソン１、２、３および４、ならびにイントロン１、イントロン２（長いイントロン）およびイントロン３を含むａｃｅ３遺伝子の特に長いバージョンである（例えば、図１２および図１７、配列番号１１を参照されたい）。より詳しくは、ＥＬ形態は、６１ｂｐのエクソン１、１４２ｂｐのイントロン１、３３２ｂｐのエクソン２、４２３ｂｐのイントロン２、１，６３５ｂｐのエクソン３、１４８ｂｐのイントロン３および１４４ｂｐのエクソン４を含む。ＥＬ形態の（３’末端）Ｃ末端は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＲｕｔＣ－３０株と同じ変異を有する。
ＬＮ形態は、エクソン２、３および４、ならびにイントロン３を含むがイントロン２を欠く遺伝子の長い形態である（例えば、図１２および図１８、配列番号１３を参照されたい）。ＬＮ形態の（３’末端）Ｃ末端は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＲｕｔＣ－３０株と同じ変異を有する。したがって、上記のように、ａｃｅ３のＬ、ＬＣ、ＬＮおよびＥＬ形態は、完全な推定ＤＮＡ結合ドメインをコードする。
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＲＬ－Ｐ３７株への形質転換
表５に示した全てのプラスミドをＭｓｓＩで消化して、標的組み込みのためにフラグメントを放出させ、アガロースゲル電気泳動で分離した。例えば、図１９は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の形質転換に使用される代表的なフラグメント内のＤＮＡ配列の配置を示す図である。ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造業者のプロトコルにしたがって、ゲルから正しいフラグメントを単離した。約１０μｇの精製フラグメントを使用して、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＲＬ－Ｐ３７株のｐｙｒ４－変異体のプロトプラストを形質転換した。プロトプラストの調製および形質転換は、国際公開第２０１３／１０２６７４号パンフレットに記載されているように、ｐｙｒ４選択を使用して行った。
形質転換体を選択培地プレート上に画線した。増殖クローンを、表６に列挙したプライマーを用い、正確な組み込みについてＰＣＲによりスクリーニングした。予想されたシグナルを与えるクローンを単細胞クローンに精製し、表６に列挙したプライマーを用いるＰＣＲにより、そしてまたサザンブロッティングにより、正確な組み込みおよびクローン純度について再スクリーニングした（データは示さず）。
Figure 0007285780000006
異なるａｃｅ３形質転換体の培養
２４ウェルマイクロタイタープレートにおいて、炭素源として２％ラクトースまたは２％グルコースを含む液体培地中で表７に示す株を増殖させた。培地の他の成分は、０．４５％ＫＨ２ＰＯ４、０．５％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ＭｇＳＯ４、０．１％ＣａＣｌ２、０．９％カザミノ酸、０．０４８％クエン酸×Ｈ２Ｏ、０．０５％ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０００３％ＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ、０．００４％ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０００２％Ｈ３ＢＯ３および０．０００１４％ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏであった。ｐＨを５．５に維持するために、１００ｍＭのＰＩＰＰＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含めた。
Figure 0007285780000007
湿度８０％のＩｎｆｏｒｓ ＨＴ ｍｉｃｒｏｔｏｎシェーカー中、２８℃、８００ＲＰＭで培養を行った。３～７日目に培養物のサンプリングを行った。Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用い、製造業者のプロトコルにしたがって、培養上清から全分泌タンパク質の量を測定した。両培地で、ＲｕｔＣ－３０Ｃ末端に突然変異を有するａｃｅ３Ｌ、ＥＬおよびＬＮ形態の過剰発現により、全タンパク質の産生が改善された。炭素源としてラクトースを有する培地では、ａｃｅ３遺伝子の全形態の過剰発現により、全タンパク質の産生はある程度改善されたが、改善のレベルは、ａｃｅ３遺伝子のＬ、ＥＬおよびＬＮ形態を過剰発現する株で最も高かった。ａｃｅ３遺伝子のＬ、ＥＬまたはＬＮ形態を過剰発現する形質転換体と共に、グルコース（すなわち、非誘導条件）を使用したとき、高レベルの分泌タンパク質（表８）が観察されたことは明らかである。
Figure 0007285780000008
実施例７
内因性Ａｃｅ３異種プロモーターのノックイン
プロモーター置換コンストラクト（図６を参照されたい）を、ａｃｅ３遺伝子座の天然プロモーター上流の５’領域を含むＤＮＡフラグメント、ｌｏｘＰ隣接ハイグロマイシンＢ耐性選択マーカーカセット、およびａｃｅ３オープンリーディングフレームの５’に作動可能に融合した目的プロモーターを含むフラグメントを融合することによって作製した（例えば、糸状菌で使用するための遺伝子／プロモーター置換についてより詳しい記載のあるＰＣＴ出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１７１１３号明細書を参照されたい）。
したがって、上記のプロモーター置換コンストラクトでトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）細胞を形質転換し、形質転換体を単離し、診断ＰＣＲのためにゲノムＤＮＡを抽出して、天然ａｃｅ３遺伝子座におけるプロモーター置換コンストラクトの相同組換えを確認する。この方法を使用して、ハイグロマイシンＢ耐性カセットおよび任意の目的プロモーターにより、天然ａｃｅ３プロモーターが置換された形質転換体を同定し得る。続いて、ハイグロマイシンＢ耐性カセットを、ｃｒｅリコンビナーゼの作用によって除去する（Ｎａｇｙ、２０００）。
ａｃｅ３遺伝子座における相同組み込みの効率は、国際公開第２０１６／１００２７２号パンフレット、国際公開第２０１６／１００５７１号パンフレット、および国際公開第２０１６／１００５６８号パンフレットに例示されているように、好適に設計されたガイドＲＮＡによって天然ａｃｅ３プロモーターへと導かれたｃａｓ９の作用によって向上させ得る。
条件付きプロモーター置換（ＣＰＲ）戦略は、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）の刊行物でアスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）について記載されており、これは、Ａ．フミガツス（Ａｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＮｉｉＡ窒素調節可能プロモーター（ｐＮｉｉＡ）を使用し、選択された遺伝子の内因性プロモーターを欠失および置換する戦略を一般的に記載している。したがって、特定の実施形態では、類似の方法を使用して、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）におけるａｃｅ３遺伝子の内因性プロモーターを代替プロモーターで置き換えることができる。
実施例８
内因性非リグノセルロース目的遺伝子プロモーターの、リグノセルロース目的遺伝子プロモーターによる置換
トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ発現コンストラクトを、ＤＮＡポリヌクレオチドフラグメントから組み立てた（例えば、米国特許第７，４１３，８７９号明細書を参照されたい）。ここで、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼをコードするＯＲＦ配列は、５’（上流）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１プロモーターに作動可能に連結され、３’（下流）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１ターミネーターに作動可能に連結された。このＤＮＡコンストラクトは、選択マーカーとしてＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｙｒ２遺伝子をさらに含んだ。
したがって、本開示の変異（娘）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞（すなわち、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させる遺伝子改変を含む）を、グルコアミラーゼ発現コンストラクトで形質転換した。培養中にＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ酵素を分泌することができる、それらの形質転換体を同定するために、形質転換体を選択し、炭素源としてグルコースを含む液体培地で（すなわち、ソホロースまたはラクトースなどの誘導基質を含まない）培養した。
したがって、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ発現（親）株（対照）、および改変Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）（娘）グルコアミラーゼ発現株（すなわち、Ａｃｅ３－Ｌ ＯＲＦを含み、発現する）を振盪フラスコ内で増殖させ、全ての細胞培養物の上清を回収し、上記実施例２および実施例３で一般的に記載したように、ＰＡＧＥを用いて分析した。
より詳しくは、図１０に示すように、親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞は、グルコース／ソホロースを含む規定培地中（誘導条件）で１，０２９μｇ／ｍＬのグルコアミラーゼを産生したが、グルコースを含む規定培地中（非誘導条件）ではわずかに３８μｇ／Ｌのグルコアミラーゼを産生しただけであった。対照的に、ｄｉｃ１プロモーターから駆動されるａｃｅ３－Ｌを含む改変（娘）株「ＬＴ８８」は、「誘導」（「Ｓｏｐ」）条件下で３倍高いグルコアミラーゼを産生（すなわち、誘導条件下の親（対照）株と比較して）し、かつ「非誘導」（「Ｇｌｕ」）条件下で２．５倍高いグルコアミラーゼを産生（すなわち、誘導条件下の親（対照）株と比較して）し、または非誘導条件下の親（対照）株と比較して、「非誘導」（「Ｇｌｕ」）条件下で６７倍高いグルコアミラーゼを産生した。したがって、これらの結果は、Ａｃｅ３－Ｌ ＯＲＦを含む改変（娘）細胞は、インデューサーの非存在下で細胞外タンパク質を産生するだけでなく、これらの変異細胞はそのような誘導条件下で、親（対照）Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞よりも多く、全タンパク質を産生することを示している。
実施例９
天然に関連した異種の目的遺伝子プロモーターの、リグノセルロース目的遺伝子プロモーターによる置換
フィターゼ発現コンストラクトを、以下のようにＤＮＡポリヌクレオチドフラグメントから組み立てる（例えば、米国特許第８，１４３，０４６号明細書を参照されたい）。ブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種のフィターゼをコードするＯＲＦは、５’末端でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１プロモーターに作動可能に連結し、かつ３’末端でＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１ターミネーターに作動可能に連結している。ＤＮＡコンストラクトは、選択マーカー、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子をさらに含む。変異Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）細胞（すなわち、Ａｃｅ３－Ｌタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させる遺伝子改変を含む）を、フィターゼ発現コンストラクトで形質転換する。培養中にブティアウクセラ属（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ酵素を分泌することができる形質転換体を同定するために、形質転換体を選択し、炭素源としてグルコースを含む液体培地中で（すなわち、ソホロースまたはラクトースなどの誘導基質を含まない）培養した。
実施例１０
天然ａｃｅ３プロモーター置換ベクターの構築
本実施例では、２つのａｃｅ３プロモーター置換ベクターｐＣＨＬ７６０およびｐＣＨＬ７６１を、標準的な分子生物学的手順を用いて構築した。ベクター骨格ｐＭＣＭ３２８２（図２０）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での複製および選択のために、ｐＭＢ１ ｏｒｉおよびＡｍｐＲ遺伝子を含んだ。さらに、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）ｃｐｃ１プロモーターおよびＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣターミネーターの下で発現する、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のためのｈｐｈハイグロマイシン選択マーカーを含んだ。プロモーター置換のために、ベクターは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｐｋｉ１プロモーター下で発現する、トウモロコシ用に最適化されたストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｃａｓ９コドン、およびＵ６プロモーター下で発現するガイドＲＮＡを含んだ（例えば、国際公開第２０１６／１００５６８号パンフレットおよび国際公開第２０１６／１００２７２号パンフレットを参照されたい）。
したがって、ｐＭＣＭ３２８２をＥｃｏＲＶで消化し、ａｃｅ３天然プロモーターを置換するＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｈｘｋ１またはｄｉｃ１プロモーター領域に隣接する、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ａｃｅ３遺伝子座からの約１ｋｂの５’末端および３’末端相同配列を有する３つのフラグメントを、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙによってｐＭＣＭ３２８２／ＥｃｏＲＶにクローン化し、ｐＣＨＬ７６０（図２１）およびｐＣＨＬ７６１（図２２）を得た。
Ｑ５ Ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメ―ラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）および下記の表９に記載のプライマーを使用して、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ゲノムＤＮＡから、ｈｘｋ１またはｄｉｃ１と共に５’ａｃｅ３相同配列および３’ａｃｅ３相同配列をＰＣＲ増幅した。
Figure 0007285780000009
より詳しくは、各ベクターのフラグメントをＰＣＲ増幅するために使用した特定のプライマーは次の通りである。ｐＣＨＬ７６０を構築するために、プライマー対ＣＬ１８４０およびＣＬ１７９１を用いて５’上流相同領域を増幅し、プライマー対ＣＬ１７９４およびＣＬ１８３１を用いて、３’下流相同領域を増幅し、プライマー対ＣＬ１７９２およびＣＬ１７９３を用いてｄｉｃ１プロモーターを増幅した。
ｐＣＨＬ７６１を構築するために、プライマー対ＣＬ１８４０およびＣＬ１８００を用いて５’上流相同領域を増幅し、プライマー対ＣＬ１８０３およびＣＬ１８３１を用いて、３’下流相同領域を増幅し、プライマー対ＣＬ１８０１およびＣＬ１８０２を用いてｄｉｃ１プロモーターを増幅した。
ベクターｐＭＣＭ３２８２（図２０）は、５’から３’方向に、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）Ｕ６プロモーター、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｃｃｄＢカセット、およびＣａｓ９結合に関与する一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の構造領域を含み、Ｕ６遺伝子由来のイントロンを含む。ｃｃｄＢカセットを、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ａｃｅ３遺伝子内の５つの異なる標的部位に特異的な配列で置換した。最終ａｃｅ３プロモーター置換ベクターを構築するための、ｐＣＨＬ７６０（図２１）およびｐＣＨＬ７６１（図２２）へのガイドＲＮＡ配列の挿入。
したがって、異なるｓｇＲＮＡ配列の産生のために、ＡａｒＩ制限部位を有する以下の表１０に示すオリゴヌクレオチドを設計した。
Figure 0007285780000010
より詳細には、ＣＬ１８２１およびＣＬ１８２２、ＣＬ１８２３およびＣＬ１８２４、ＣＬ１８２５およびＣＬ１８２６、ＣＬ１８２７およびＣＬ１８２８、ＣＬ１８２９およびＣＬ１８３０をアニールして、二本鎖ＤＮＡを作製し、それらを、タイプＩＩＳシームレスクローニング法を使用して、ＡａｒＩ部位でｐＣＨＬ７６０およびｐＣＨＬ７６１に個々にクローニングした。正しく挿入されたガイドＲＮＡ配列を有する最終プラスミドは、毒性のｃｃｄＢ遺伝子を失っていた。
Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の形質転換
ｐＣＨＬ７６０およびｐＣＨＬ７６１のｃａｓ９媒介ａｃｅ３プロモーター置換ベクターを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介プロトプラスト形質転換法によりＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親細胞に形質転換した。ハイグロマイシン耐性形質転換体を選択するために、ハイグロマイシンを含むＶｏｇｅｌ最小培地寒天上で形質転換体を増殖させた。これらの形質転換体のいくつかは、プラスミドを取り込んではいたが、ゲノムＤＮＡへの安定な組み込みがなく、不安定であった。形質転換体をＶｏｇｅｌの非選択的寒天培地に移し、プラスミドおよびハイグロマイシン耐性マーカーを無くした。
ｄｉｃ１プロモーター置換形質転換体についてスクリーニングするために、ゲノムＤＮＡを抽出し、プライマー対ＣＬ１８５８およびＣＬ１８４８（所望の組み込みについて予想されるサイズの産物は２，４１２ｂｐであった）ならびにＣＬ１８５３およびＣＬ１８１８（所望の組み込みについて予想されるサイズの産物は２，４３１ｂｐであった）を用いてＰＣＲした（例えば、表１１を参照されたい）。続いて、ＰＣＲ産物をＤＮＡ配列の決定により分析し、所望のプロモーターの組み込みを確認した。
ｈｘｋ１プロモーター置換形質転換体についてスクリーニングするために、プライマー対ＣＬ１８５８およびＣＬ１８９８（所望の組み込みについて予想されるサイズの産物は１，７８４ｂｐであった）ならびにＣＬ１８５３およびＣＬ１８５０（所望の組み込みについて予想されるサイズの産物は２，１７８ｂｐであった）を用いてＰＣＲし、続いてＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定により、正しい組み込みを確認した（例えば、表１１を参照されたい）。
Figure 0007285780000011
振盪フラスコ中でのタンパク質の産生
ａｃｅ３プロモーター置換株の機能性を試験するために、インデューサー基質（ソホロース）の存在下および非存在下、振盪フラスコ内、５０ｍｌの浸漬培養で細胞を増殖させた。誘導条件（炭素源としてグルコース／ソホロース）および非誘導条件（炭素源としてのグルコース）の両条件下の（液体培養で、親Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞（ＩＤ番号１２７５．８．１）、変異細胞ＩＤ番号２２１８、２２１９、２２２０、２２２１、２２２２および２２２３を増殖させ、それらのそれぞれの細胞外分泌タンパク質産生レベルを比較した。簡単に記載すると、底部バッフルを有する２５０ｍＬ三角フラスコ中の５０ｍＬのＹＥＧブロスに、各宿主細胞（すなわち、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）親宿主細胞およびその変異細胞）の菌糸を別々に加えた。ＹＥＧブロスは、５ｇ／Ｌの酵母抽出物および２２ｇ／Ｌのグルコースを含有した。細胞培養物を４８時間増殖させ、続いてさらに２４時間、新鮮なＹＥＧ中で二次培養した。次いで、これらの種培養物を、底部バッフルを有する２５０ｍＬの振盪フラスコ中、２．５％のグルコースを補充した５０ｍＬの規定培地（非誘導条件）、または２．５％のグルコース／ソホロースを含む５０ｍＬの規定培地（誘導条件）に接種した。全ての振盪フラスコを、２００ｒｐｍで継続的に振盪しながら、２８℃でインキュベートした。インキュベーションの４日後、全ての細胞培養物からの上清を回収し、図２３に示されているようにＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて分析した。
上記ＳＤＳ－ＰＡＧＥに見られるように、親細胞（図２３、ＩＤ１２７５．８．１）では、グルコース／ソホロース（誘導）の場合と比較して、グルコース（非誘導）を含む規定培地では分泌タンパク質の産生は非常に少なかった。対照的に、形質転換体２２１８、２２１９、２２２０、２２２２および２２２３は、誘導および非誘導条件下で類似量の分泌タンパク質を産生した。したがって、これらの結果は、ａｃｅ３遺伝子座において天然ａｃｅ３プロモーターを置換したｈｘｋ１またはｄｉｃ１プロモーターを有する変異細胞がインデューサーの非存在下で細胞外タンパク質を産生したことを示している。
参考文献
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欧州特許出願第２４４，２３４号明細書
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Claims (8)

  1. 親糸状菌細胞由来の変異糸状菌細胞であって、配列番号６のＡｃｅ３タンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ最後の４つのＣ末端アミノ酸として「Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ」を含むＡｃｅ３タンパク質をコードする下流（３’）の核酸に作動可能に連結した上流（５’）の異種プロモーターを含む、導入されたポリヌクレオチドコンストラクトを含み、前記導入されたポリヌクレオチドコンストラクトを含まない前記親細胞と比較して、誘導基質の非存在下でもＰＡＧＥで検出可能なレベルで目的タンパク質（ＰＯＩ）を産生し、前記ポリヌクレオチドコンストラクトは、前記変異糸状菌細胞の遺伝子座に組み込まれている、変異細胞。
  2. 前記変異細胞は、前記親細胞と比較して、誘導基質の存在下でより多くの量の目的タンパク質（ＰＯＩ）をさらに産生するか、または前記変異細胞は、異種ＰＯＩをコードする導入されたポリヌクレオチドコンストラクトを含む、請求項１に記載の変異細胞。
  3. 前記ＰＯＩは、内因性ＰＯＩまたは異種ＰＯＩである、請求項１または２に記載の変異細胞。
  4. 前記内因性ＰＯＩは、リグノセルロース分解酵素である、請求項３に記載の変異細胞。
  5. 前記リグノセルロース分解酵素は、（ａ）セルラーゼ酵素、ヘミセルラーゼ酵素、またはそれらの組み合わせからなる群、または（ｂ）ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｅｇｌ３、ｅｇｌ４、ｅｇｌ５、ｅｇｌ６、ｂｇｌ１、ｂｇｌ２、ｘｙｎ１、ｘｙｎ２、ｘｙｎ３、ｂｘｌ１、ａｂｆ１、ａｂｆ２、ａｂｆ３、ａｘｅ１、ａｘｅ２、ａｘｅ３、ｍａｎ１、ａｇｌ１、ａｇｌ２、ａｇｌ３、ｇｌｒ１、ｓｗｏ１、ｃｉｐ１およびｃｉｐ２からなる群から選択される、請求項４に記載の変異細胞。
  6. 前記異種ＰＯＩは、α－アミラーゼ、アルカリα－アミラーゼ、β－アミラーゼ、セルラーゼ、デキストラナーゼ、α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ、キシラナーゼ、インベルターゼ、ラクターゼ、ナリンガナーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、酸プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ブロメライン、中性プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、ペプチダーゼ、レンネット、レニン、キモシン、スブチリシン、テルモリシン、アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリプシン、リパーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、アミダーゼ、イミノアシラーゼ、グルタミナーゼ、リゾチーム、ペニシリンアシラーゼ；イソメラーゼ、オキシドレダクターゼ、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、リアーゼ、アスパラギン酸β－デカルボキシラーゼ、フマラーゼ、ヒスタダーゼ、トランスフェラーゼ、リガーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、ラッカーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼおよびトランスグルタミナーゼからなる群から選択される、請求項２または３に記載の変異細胞。
  7. 前記ポリヌクレオチドコンストラクトは、前記変異糸状菌細胞のゲノムのテロメア部位またはグルコアミラーゼ（ｇｌａ１）遺伝子座に組み込まれている、請求項１に記載の変異細胞。
  8. 前記ポリヌクレオチドコンストラクトは、配列番号４に対して９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、または前記コードされたＡｃｅ３タンパク質は、配列番号６に対して９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の変異細胞。
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