[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

MX2013010512A - Metodo para reducir la viscosidad en un proceso de sacarificacion. - Google Patents

Metodo para reducir la viscosidad en un proceso de sacarificacion.

Info

Publication number
MX2013010512A
MX2013010512A MX2013010512A MX2013010512A MX2013010512A MX 2013010512 A MX2013010512 A MX 2013010512A MX 2013010512 A MX2013010512 A MX 2013010512A MX 2013010512 A MX2013010512 A MX 2013010512A MX 2013010512 A MX2013010512 A MX 2013010512A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
weight
polypeptide
sec
ident
activity
Prior art date
Application number
MX2013010512A
Other languages
English (en)
Inventor
Colin Mitchinson
Mian Li
Bradley R Kelemen
Suzanne E Lantz
Keith D Wing
William D Hitz
Original Assignee
Danisco Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Danisco Inc filed Critical Danisco Inc
Publication of MX2013010512A publication Critical patent/MX2013010512A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones que se pueden usar para hidrolziar biomasa, tal como composiciones que comprenden un polipéptido que tiene actividad de glicosil hidrolasa de la familia 61/endoglucanasa, a métodos para hidrolizar material de biomasa y a métodos para reducir la viscosidad de la mezcla de biomasa con el uso de una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de glicosil hidrolasa de la familia 61/endoglucanasa.

Description

METODO PARA REDUCIR LA VISCOSIDAD EN UN PROCESO DE SACARIFICACION CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones útiles para hidrolizar biomasa, a métodos para usar las composiciones para hidrolizar materiales de biomasa y a métodos para reducir la viscosidad de mezclas de sacarificación de biomasa.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La bioconversión de biomasa lignocelulósica renovable en un azúcar fermentable que, posteriormente, se fermenta para producir alcohol (por ejemplo, etanol) como una alternativa a los combustibles líquidos generó mucho interés entre los investigadores desde la década de los 70, cuando se produjo la crisis del petróleo (Bungay, H. R. , "Energy: the biomass options" . NY: iley; 1981; Olsson L, Hahn-Hagerdal B. Enzyme Microb Technol 1996, 18: 312-31; Zaldivar, J et al., Appl Microbiol Biotechnol 2001, 56: 17-34; Galbe, M et al., Appl Microbiol Biotechnol 2002, 59:618-28). Desde hace tiempo se conoce la producción de azúcares a partir de materiales de biomasa lignocelulósica al igual que la fermentación y destilación posterior de los azúcares en etanol. Una gran parte del desarrollo anterior se produjo en los tiempos de la Segunda Guerra Mundial cuando los combustibles escaseaban en REF: 242814 países como Alemania, Japón y la Unión Soviética. Estos procesos iniciales estaban dirigidos, principalmente, a la hidrólisis de ácidos con una ingeniería y diseño complejo y, típicamente, eran sensibles a variaciones pequeñas en los procesos, tales como la temperatura, presión y/o concentraciones de ácidos. Una discusión detallada sobre estos procesos iniciales se encuentra en "Production of Sugars from Wood Using High-pressure Hydrogen Chloride" , Biotechnology and Bioengineering, volumen XXV, en 2757-2773 (1983) .
El suministro abundante de petróleo en el periodo que abarca desde la Segunda Guerra Mundial hasta principios de la década del 70 desaceleró la investigación de la conversión de etanol . Sin embargo, la crisis del petróleo de 1973 hizo que los investigadores incrementaran sus esfuerzos para desarrollar procesos de uso de subproductos de madera y agrícolas para la producción de etanol . Esta investigación fue especialmente importante para el desarrollo del etanol como un aditivo de gasolina para reducir la dependencia de los Estados Unidos en la producción de petróleo de otros países, para aumentar la clasificación de octanos de los combustibles y para reducir los contaminantes de escape como una medida ambiental .
Durante la "crisis del petróleo" , la Agencia de Protección del Medio Ambiente de los Estados Unidos promulgó reglamentaciones que exigen aditivos con menor contenido de plomo. En tanto que el etanol es prácticamente un reemplazo del plomo, algunas refinerías han elegido el etanol como sustituto debido a que se puede incorporar fácilmente en la operación de una refinería sin necesidad de realizar una gran inversión de capital en equipos.
La mejora de los procesos de sacarificación a alta presión y alta temperatura desarrollados hace unas décadas aun continúa. Las investigaciones nuevas y actuales se enfocan mayormente en los procesos de conversión enzimática que usan enzimas a partir de diversos organismos, tales como hongos mesofílieos y termofílicos, levadura y bacterias, que degradan la celulosa en azúcares fermentables . Aun continúa la incertidumbre con respecto a estos procesos, principalmente en relación con su capacidad de ampliación para comercialización y a la eficacia de la producción de etanol .
La celulosa y la hemicelulosa son los materiales vegetales más abundantes que produce la fotosíntesis. Se pueden degradar para usar como fuente de energía por parte de microorganismos numerosos que incluyen bacterias, levaduras y hongos que producen enzimas capaces de hidrolizar los sustratos poliméricos a azúcares monoméricos (Aro et al., 2001). Frecuentemente, los organismos son limitantes con respecto a la clase de azúcares que usan y esto determina cuáles son los mejores azúcares para producir durante la conversión. A medida que nos acercamos a los límites de los recursos no renovables, reconocemos el enorme potencial de la celulosa para convertirse en un recurso de energía renovable importante (Krishna et al., 2001) . El uso eficaz de celulosa por medio de procesos biológicos puede ser una solución potencial a la escasez de alimentos, productos alimenticios y combustibles (Ohmiya et al., 1997).
Las celulasas son enzimas que hidrolizan la celulosa (enlaces beta- 1 , 4 -glucano o D-glucosídicos) , lo que da lugar a la formación de glucosa, celobiosa, celooligosacáridos y similares. Tradicionalmente , las celulasas se han dividido en 3 clases principales: endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ("EG"), exoglucanasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) ( "CBH" ) y beta-glucosidasas ( [beta] -D-glucósido glucohidrolasa EC 3.2.1.21) ("BG") (Kno les et al., 1987 y Shulein, 1988). Las endoglucanasas actúan principalmente en las partes amorfas de la fibra de celulosa, mientras que las celobiohidrolasas son capaces, además, de degradar la celulosa cristalina.
Además, se ha demostrado que las celulasas son útiles en la degradación de biomasa de celulosa a etanol (en donde las celulasas degradan celulosa a glucosa, y la levadura u otros microbios, además, fermentan la glucosa en etanol), en el tratamiento de pulpa mecánica (Pere et al., 1996), para usar como un aditivo de productos alimenticios (patente núm. WO 91/04673) y en el prensado de granos en húmedo. El proceso de sacarificación y fermentación por separado es un proceso por el cual la celulosa presente en la biomasa, por ejemplo, rastrojo de maíz, se convierte a glucosa y, posteriormente, las cepas de levadura convierten la glucosa en etanol . El proceso de sacarificación y fermentación simultáneas es un proceso por el cual la celulosa presente en la biomasa, por ejemplo, rastrojo de maíz, se convierte en glucosa y, al mismo tiempo y en el mismo reactor, las cepas de levadura convierten la glucosa en etanol. La producción de etanol a partir de fuentes fáciles de obtener proporciona una fuente de combustible renovable estable.
Las celulasas son producidas por varias bacterias, levaduras y hongos. Algunos hongos producen un sistema de celulasa completa (es decir, una celulasa entera) capaz de degradar formas cristalinas de celulosa. Sin embargo, una celulasa completa, especialmente, una de origen natural no es necesariamente capaz de degradarse eficazmente ya que posiblemente no incluya todos los componentes/actividades necesarias para esta eficacia, por ejemplo, actividades de cada una de las clasificaciones CBH, EG y BG. (Filho et al., 1996) . Se conoce que los componentes de CBH, EG y BG individuales solos no generan una hidrólisis eficaz, pero la combinación de celulasas de tipo EG y celulasas de tipo CBH produce una interacción que degrada la celulosa con mayor eficacia que cualquier enzima usada sola (Wood, 1985; Baker et al., 1994; y Nieves et al., 1995) .
En la técnica se conoce la utilidad de las celulasas para el tratamiento de telas, para mejorar la capacidad de limpieza de las composiciones detergentes, para usar como un agente suavizante, para mejorar la sensación impartida y el aspecto de las telas de algodón y similares (Kumar et al., 1997) . Se han descrito composiciones detergentes que contienen celulasa con un mejor desempeño de limpieza (patente de los Estados Unidos núm. 4,435,307; solicitudes de patente de Gran Bretaña núms . 2,095,275 y 2,094,826) y para usar en el tratamiento de telas para mejorar la sensación impartida y el aspecto de la tela (patentes de los Estados Unidos núms. 5,648,263, 5,691,178 y 5,776,757 y la solicitud de Gran Bretaña núm. 1,358,599) .
En consecuencia, se ha prestado mucha atención a las celulasas producidas en hongos y bacterias. Particularmente, se ha demostrado que la fermentación de Trichoderma spp. (por ejemplo, T. longibrachiatum o T. reesei) produce un sistema de celulasa completa capaz de degradar formas cristalinas de celulosa. En el transcurso de los años ha mejorado la producción de celulasa de Trichoderma por mutagénesis clásica, análisis, selección y desarrollo de condiciones de fermentación económica y altamente refinada a gran escala. Si bien el sistema de celulasa de componentes múltiples de Trichoderma spp. puede hidrolizar celulosa a glucosa, existen celulasas de otros organismos, particularmente, cepas bacterianas, con propiedades diferentes para hidrolizar celulosa eficazmente, y sería ventajoso expresar estas proteínas en un hongo filamentoso para la producción de celulasa a escala industrial. Sin embargo, los resultados de muchos estudios demuestran que la producción obtenida por la expresión de enzimas bacterianas a partir de hongos filamentosos es baja (Jeeves et al., 1991) .
Los azúcares solubles, tales como glucosa y celobiosa, tienen muchos usos para la producción de sustancias químicas y productos biológicos. La optimización de la hidrólisis de celulosa permite usar menos enzimas y aumentar la rentabilidad para la producción de azúcares solubles.
Una conversión eficaz de biomasa lignocelulósica en azúcares fermentables es fundamental para producir bioetanol en forma rentable y compatible con el ambiente. Para reducir el costo de procesamiento y la energía, particularmente, para la destilación, la concentración mínima de etanol producido por un proceso viable debería ser de por lo menos 4 % (p/v) . La mayor concentración de etanol puede obtenerse por el procesamiento de sustratos con un alto contenido de materia sólida seca. Sin embargo, un problema común asociado con la sacarificación de una biomasa con alto contenido de materia seca es la viscosidad alta de la suspensión lo que produce una suspensión que no se puede bombear o que requiere una entrada alta de energía durante el manejo. Cuando se trata el manejo de una materia con alto contenido de sólidos, surgen problemas tales como 1) mezclado insuficiente con transferencia de masa limitada, 2) aumento de la concentración de inhibidores, tales como ácido acético, furfural, 5-hidroximetil furfural, degradación de lignina fenólica, 3) inhibición de la producción, tal como glucosa, celobiosa, etanol y 4) viabilidad de microorganismos de fermentación. La alta viscosidad limita el nivel de sustrato seco en el proceso, aumenta la energía y el consumo de agua, reduce la eficacia de separación, la evaporación y el intercambio de calor y, en última instancia, la producción de etanol. Por lo tanto, la reducción de la viscosidad es benéfica, y las enzimas tienen un rol principal en la descomposición de los compuestos solubles/insolubles lo que causa una alta viscosidad.
Se han realizado estudios para aumentar la carga de sólidos y/o reducir la viscosidad de procesos de sacarificación. Por ejemplo, varios estudios usaron operaciones de alimentación discontinua para aumentar el nivel de sólidos en la carga de sustrato de biomasa. Se usó un diseño de reactor de mezclado gravimétrico que permitió la licuación enzimática discontinua y la hidrólisis de paja de trigo pretratada a una concentración de hasta 40 % de sólidos. Esta estrategia de alimentación discontinua carga en secuencia el sustrato de biomasa o el sustrato combinado con las enzimas durante la hidrólisis enzimática para hidrolizar una gran cantidad de sustrato, una viscosidad relativamente baja durante la hidrólisis y una concentración de glucosa relativamente alta durante el proceso. Alternativamente, se puede realizar la prehidrólisis enzimática de una biomasa lignocelulósica por un periodo de tiempo a la temperatura óptima de las enzimas, por ejemplo, 50 °C, para reducir la viscosidad de la suspensión y permitir el bombeado y agitación. La reducción de la viscosidad durante la prehidrólisis posibilita la fermentación posterior (SSF, por sus siglas en inglés) .
A pesar del desarrollo de muchos métodos, en la técnica persiste la necesidad de contar con otras formas para reducir la viscosidad y mejorar la producción de azúcares fermentables deseables.
Todas las referencias citadas en la presente descripción, incluidas las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones se incorporan como referencia en su totalidad.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente descripción se basa, en parte, en el descubrimiento sorprendente de que la inclusión de una cierta enzima endoglucanasa (por ejemplo, un polipéptido que tiene actividad de la familia de glicosil hidrolasa 61 ( "GH61" ) /endoglucanasa, tal como la endoglucanasa de T. reesei ("Eg4")) en una mezcla de sacarificación de biomasa reduce sustancialmente la viscosidad de la mezcla. La descripción se refiere, además, a la inclusión de la enzima o enzimas para mejorar sustancialmente la sacarificación y la producción de azúcares fermentables deseables a partir de un sustrato de biomasa determinado.
En la presente descripción se proporciona polipéptidos que tienen actividad de la familia glicosil hidrolasa 61 ("GH61")/ endoglucanasa. "Actividad de GH6l/endoglucanasa" significa que el polipéptido tiene actividad de GH61 y/o actividad de endoglucanasa. En algunos aspectos, el polipéptido está aislado. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, un polipéptido aislado) es una endoglucanasa de GH61 o una endoglucanasa IV ( "EG IV") de varias especies o un polipéptido que se corresponde (por ejemplo, comparte homología, comparte dominios funcionales, comparte un motivo o motivos de GH61 y/o comparte residuos conservativos) con una endoglucanasa de GH61 (por ejemplo, un polipéptido de EG4 de T. reesei) . Tales especies incluyen Trichoderma, Humicola , Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora , Endothia, Mucor, Cochliobolus, Pyricularia, Chrysosporium, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium gra inum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosu , Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora , Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Hu icola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Neurospora intermedia, Penicilliu purpurogenum, Penicillium canescens, Penicillium solitu , Penicillium funiculosum Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radíate, Pleurotus eryngii , Talaromyces flavus, Thielavia terrestris, Trametes villosa , Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Geosmithia emersonii o G. stearothermophilus .
En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, un polipéptido aislado) es una endoglucanasa de GH61 seleccionada del grupo que consiste en los polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran en las Figs. lA-lEde la presente descripción. Por ejemplo, las endoglucanasas de GH61 adecuadas incluyen aquellas que están representadas por los números de registro en GenBank CAB97283.2, CAD70347.1, CAD21296.1, CAE81966.1, CAF05857.1, EAA26873.1, EAA29132.1, EAA30263.1, EAA33178.1, EAA33408.1, EAA34466.1, EAA36362.1, EAA29018.1 y EAA29347.1 o aquellas designadas como St61 de S. thermophilum 24630, St61A de S. thermophilum 23839c, St61B de S. thermophilum 46583, St61D de S. thermophilum 80312, Afu61a de A.fumigatus Afu3g03870 (núm. de ref. de NCBI : XP_748707) , una endoglucanasa con el núm. de ref. de NCBI: XP_750843.1 de A. fumigatus Afu6g09540, una endoglucanasa de A. fumigatus EDP47167, una endoglucanasa de T.terrestris 16380, una endoglucanasa de T. terrestris 155418, una endoglucanasa de T.terrestris 68900, Cg61A (EAQ86340.1) de C. globosum, Eg7 de T. reesei, Eg4 de T. reesei y una endoglucanasa con el núm. de registro en GenBank: XP_752040 de A. fumigatus Af293. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, polipéptido aislado) comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 60 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 ¾, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %) de identidad de secuencia con cualquiera de las sec. con núms. de ident . : 1-29 y 148. En ciertos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, polipéptido aislado) comprende una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más motivos de secuencia seleccionados del grupo que consiste en: (1) las sec. con núms. de ident. :84 y 88; (2) las sec. con núms. de ident. : 85 y 88; (3) la sec. con núm. de ident. :86; (4) la sec. con núm. de ident. :87; (5) las sec. con núms. de ident . : 84 , 88 y 89; (6) las sec. con núms. de ident. :85, 88 y 89; (7) las sec. con núms. de ident. : 84, 88 y 90; (8) las sec. con núms. de ident. : 85, 88 y 90; (9) las sec. con núms. de ident. :84, 88 y 91; (10) las sec. con núms. de ident. : 85, 88 y 91; (11) las sec. con núms. de ident. : 84, 88, 89 y 91; (12) las sec. con núms. de ident. : 84, 88, 90 y 91; (13) las sec. con núms. de ident. : 85, 88, 89 y 91: y (14) las sec. con núms. de ident. : 85, 88, 90 y 91. En algunas modalidades, el polipéptido tiene una longitud de por lo menos aproximadamente 100 (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240 o más) residuos de aminoácidos.
En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa es una variante de una endoglucanasa de GH61 tal como, por ejemplo, una variante seleccionada de las enumeradas en la Fig. 1. Los polipéptidos adecuados incluyen, por ejemplo, los polipéptidos identificados con los núms . de registro en GenBank CAB97283.2, CAD70347.1, CAD21296.1, CAE81966.1, CAF05857.1, EAA26873.1, EAA29132.1, EAA30263.1, EAA33178.1, EAA33408.1, EAA34466.1, EAA36362.1, EAA29018.1 o EAA29347.1 o St61 de S. thermophilum 24630, St61A de S. thermophilum 23839c, St61B de S. thermophilum 46583, St61D de S. thermophilum 80312, Afu61a de A. fumigatus Afu3g03870 (núm. de ref. de NCBI : XP_748707) , una enzima de A. fumigatus Afu6g09540 (núm. de ref. de NCBI: XP_750843.1) , una enzima de A. fumigatus EDP47167, una enzima de T. terrestris 16380, una enzima de T. terrestris 155418, una enzima de T. terrestris 68900 y C.globosum Cg61A (EAQ86340.1) , Eg7 de T. reesei, Eg4 de T. reesei y una enzima de A. fumigatus Af293 (con el núm. de registro en GenBank: XP_752040) . En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa es una variante de una enzima que comprende cualquiera de las sec . con núms. de ident . : 1-29 y 148. El polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa puede ser una variante de una enzima que tiene una longitud de por lo menos aproximadamente 100 (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240 o más) residuos de aminoácidos, que comprende uno o más de los motivos de secuencias seleccionados de: (1) las sec. con núms. de ident. :84 y 88; (2) las sec. con núms. de ident. : 85 y 88; (3) la sec. con núm. de ident.:86; (4) la sec . con núm. de ident.:87; (5) las sec. con núms . de ident . : 84 , 88 y 89; (6) las sec. con núms. de ident. :85, 88 y 89; (7) las sec. con núms. de ident.: 84, 88 y 90; (8) las sec. con núms. de ident.: 85, 88 y 90; (9) las sec. con núms. de ident. :84, 88 y 91; (10) las sec. con núms. de ident.: 85, 88 y 91; (11) las sec. con núms. de ident.: 84, 88, 89 y 91; (12) las sec. con núms. de ident.: 84, 88, 90 y 91; (13) las sec. con núms. de ident.: 85, 88, 89 y 91: y (14) las sec. con núms. de ident.: 85, 88, 90 y 91. El polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa puede ser una variante de una endoglucanasa de GH61, en donde la secuencia de aminoácidos de la variante tiene por lo menos aproximadamente 60 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 ¾, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad con cualquiera de las sec. con núms. de ident.: 1-18.
En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, un polipéptido aislado que incluye una variante de endoglucanasa de GH61) tiene actividad de endoglucanasa. La variante puede comprender por lo menos un motivo (por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 motivos) seleccionado de las sec. con núms. de ident .: 84 -91. Para los fines de la presente descripción se puede hacer referencia a las enzimas por sus funcionalidades. Por ejemplo, se puede hacer referencia a un polipéptido de endoglucanasa, además, como un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa o viceversa.
En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (que incluye una variante de endoglucanasa de GH61) comprende uno o más motivos de secuencia seleccionados de: (1) las sec. con núms . de ident.:84 y 88; (2) las sec. con núms. de ident.:85 y 88; (3) la sec. con núm. de ident.:86; (4) la sec. con núm. de ident.:87; (5) las sec. con núms. de ident.:84, 88 y 89; (6) las sec. con núms. de ident. :85, 88 y 89; (7) las sec. con núms. de ident.: 84, 88 y 90; (8) las sec. con núms. de ident.: 85, 88 y 90; (9) las sec. con núms. de ident. :84, 88 y 91; (10) las sec. con núms. de ident.: 85, 88 y 91; (11) las sec. con núms. de ident.: 84, 88, 89 y 91; (12) las sec. con núms. de ident.: 84, 88, 90 y 91; (13) las sec. con núms. de ident. : 85, 88, 89 y 91: y (14) las sec. con núms. de ident. : 85, 88, 90 y 91.
En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (que incluye una variante) comprende un dominio de CBM (por ejemplo, un dominio de CBM funcional) . En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (que incluye una variante de endoglucanasa de GH61) comprende un dominio catalítico (por ejemplo, un dominio catalítico funcional) .
Además, en la presente descripción se proporciona variantes de polipéptidos de EG IV. Por ejemplo, tales variantes pueden tener por lo menos aproximadamente 60 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %) de identidad de secuencia con cualquiera de las sec. con núms . de ident.: 1-29 y 148 o con un polipéptido maduro de estas. Por ejemplo, en la presente descripción se proporciona variantes del polipéptido de Eg4 de T. reesei. Las variantes pueden tener por lo menos aproximadamente 60 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92.5 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad de secuencia con los residuos 22 a 344 de la sec. con núm. de ident. :27. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este está aislado. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este tiene actividad de endoglucanasa . En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende residuos que corresponden a por lo menos aproximadamente 5 residuos (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12) de H22, D61, G63, C77, H107, R177, E179, H184, Q193, C198, Y195 y Y232 de la sec. con núm. de ident. :27 o cualquier residuo conservado correspondiente en cualquiera de los otros polipéptidos. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende residuos que corresponden a H22, D61, G63, C77, H107, R177, E179, H184, Q193, C198, Y195 y Y232 de la sec . con núm. de ident.:27. El polipéptido o una variante de este puede comprender residuos que corresponden a por lo menos 5 residuos (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19) de 6313, Q314, C315, G316, G317, S321, G322, P323, T324, C326, A327, T331, C332, N336, Y338, Y339, Q341, C342 y L343 de la sec. con núm. de ident.:27. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende residuos que corresponden a G313, Q314, C315, G316, G317, S321, G322, P323, T324, C326, A327, T331, C332, N336, Y338, Y339, Q341, C342 y L343 de la sec. con núm. de ident.:27. El polipéptido o una variante de este puede comprender un dominio de CBM (por ejemplo, un dominio funcional de CBM) . En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende un dominio catalítico (por ejemplo, un dominio catalítico funcional) .
Además, en la presente descripción se proporciona ácidos nucleicos o polinucleótidos que codifican cualquiera de los polipéptidos de la presente descripción. Por ejemplo, la descripción proporciona polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 60 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %) de identidad de secuencia con cualquiera de las sec. con núms . de ident. : 1-29 y 148. Por ejemplo, en la presente descripción se proporciona ácidos nucleicos aislados que tienen por lo menos aproximadamente 60 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92.5 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad con la sec . con núm. de ident.:30. Además, se proporcionan casetes de expresión, vectores y células que comprenden los ácidos nucleicos descritos anteriormente.
Además, en la presente descripción se proporciona composiciones enzimáticas (por ejemplo, composiciones que no son de origen natural) que comprenden un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa . En algunos aspectos, la composición comprende una celulasa completa que comprende el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) . El polipéptido que tiene actividad de GH6 l/endoglucanasa es, por ejemplo, una endoglucanasa IV de T. reesei ("Eg4 de T. Reesei") o una variante de este. Una variante de Eg4 de T. reesei puede ser cualquiera de las variantes que se proporcionan en la presente descripción.
En algunos aspectos, la composición enzimática es una composición de celulasa. La composición enzimática puede comprender, además, una o más hemicelulasas y, por lo tanto, puede ser, además, una composición de hemicelulasa . En algunos aspectos, la composición enzimática comprende por lo menos un (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) polipéptido de celulasa. En algunos aspectos, por lo menos un polipéptido de una celulasa es un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa, un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa o un polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa . En algunos aspectos, la composición comprende, además, por lo menos un (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) polipéptido de hemicelulasa . En algunos aspectos, por lo menos un polipéptido de hemicelulasa es un polipéptido que tiene actividad de xilanasa, un polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa o un polipéptido que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa o un polipéptido que tiene actividad combinada de xilanasa/ -xilosidasa, actividad combinada de ß-xilosidasa/L-a-arabinofuranosidasa o actividad combinada de xilanasa/ L-oí-arabinofuranosidasa . En algunos aspectos, la composición comprende por lo menos un (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) polipéptido de celulasa y por lo menos un (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) polipéptido de hemicelulasa.
En algunos aspectos, la composición enzimática comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa y que comprende, además, por lo menos 1 (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5) polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa, por lo menos 1 (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5) polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa, por lo menos 1 (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5) polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa, por lo menos 1 (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5) polipéptido que tiene actividad de xilanasa, por lo menos 1 (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5) polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa y/o por lo menos 1 (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5) polipéptido que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa .
En algunos aspectos, la composición comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de G. reesei o una variante de este) y por lo menos un polipéptido que tiene actividad de xilanasa (por ejemplo, Xyn3 de T. reesei, Xyn2 de T. reesei, AfuXyn2, AfuXyn5 o. una variante de estos) . En algunos aspectos, la composición comprende, además, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B, Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G, Tn3B o una variante de estos) . En algunos aspectos, la composición comprende, además, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 de T. reesei, A. fumigatus 7A, 7B, C. globosum 7A, 7B, T. terrestris 7A, 7B, CBH2 de T. reesei, T. terrestris 6A, S. thermophile 6A, 6B o una variante de estos) . En algunos aspectos, la composición comprende, además, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa distinto a la enzima GH61 (por ejemplo, EG1 de T. reesei, EG2 de T. reesei EG2 o una variante de estos) .
La composición puede comprender un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B , Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G, Tn3B o una variante de estos) . La composición puede comprender un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa y por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 de T. reesei, A. fumigatus 7A, 7B, C. globosum 7A, 7B, T. terrestris 7A, 7B, CBH2 de T. reesei, T. terrestris 6A, S. thermophile 6A, 6B o una variante de estos) . La composición puede comprender un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa y por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa (por ejemplo, EG1 de T. reesei, EG2 de T. reesei o una variante de estos) . La composición puede comprender un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa y por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa (por ejemplo, Fv3A, Fv43A, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Bxll de T. reesei o una variante de estos) . La composición puede comprender un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa y por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa {por ejemplo, Af43A, Fv43B, Pf51A, Pa51A, Fv51A o una variante de estos) .
Cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción puede comprender una celulasa completa. Por ejemplo, se proporciona una composición que comprende una celulasa completa que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa . Alternativamente, se proporciona una composición que comprende una celulasa completa combinada con un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa . En algunos aspectos, se proporciona una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa y un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa distinto al polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa, un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa y un polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa. La composición comprende, además, uno o más polipéptidos de hemicelulasa . Por ejemplo, la composición puede comprender uno o más polipéptidos que tienen actividad de xilanasa, uno o más polipéptidos que tienen actividad de ß-xilosidasa y/o uno o más polipéptidos que tienen actividad de L-a-arabinofuranosidasa. Una composición puede comprender un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de xilanasa (por ejemplo, Xyn3 de T. reesei, Xyn2 de T. reesei, AfuXyn2 , AfuXyn5 o una variante de estos) y una celulasa completa. En algunos aspectos, se proporciona una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de xilanasa (por ejemplo, Xyn3 de T. reesei, Xyn2 de T. reesei, AfuXyn2 , AfuXyn5 o una variante de estos) y por lo menos otro polipéptido que tiene actividad de hemicelulasa .
En algunos aspectos, la celulasa completa comprende por lo menos un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa (por ejemplo, EG1 de T. reesei, EG2 de T. reesei o una variante de estos) que no es el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa . La celulasa completa puede comprender por lo menos un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 de T. reesei, A. fumigatus 7A, 7B, C. globosu 7A, 7B, T. terrestris 7A, 7B, CBH2 de T. reesei, T. terrestris 6A, S. thermophile 6A, 6B o una variante de estos) . La celulasa completa puede comprender por lo menos un polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B, Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G, Tn3B o una variante de estos) .
En algunos aspectos, en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa, pero que no es el que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa es, por ejemplo, EG1 de T. reesei (o una variante de este) y/o EG2 de T. reesei (o una variante de este). En algunos aspectos, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa es, por ejemplo, CBH1 de T. reesei, A. fumigatus 7A, 7B, C. globosum 7A, 7B, T. terrestris ??, 7B, CBH2 de T. reesei, T. terrestris 6A, S. thermophile 6A, 6B o una variante de estos. En algunos aspectos, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa es, por ejemplo, Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B, Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G y/o Tn3B o variantes de estos. En algunos aspectos, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de xilanasa es, por ejemplo, Xyn3 de T. reesei, Xyn2 de T. reesei, AfuXyn2 y/o AfuXyn5 o variantes de estos. En algunos aspectos, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa es, por ejemplo, una ß-xilosidasa del Grupo 1 o una ß-xilosidasa del Grupo 2, en donde la ß-xilosidasa del Grupo 1 puede ser Fv3A, un polipéptido de Fv43A o una variante de estos y la ß-xilosidasa del Grupo 2 puede ser Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, un polipéptido Bxll de G. reesei o una variante de estos. En algunos aspectos, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa es, por ejemplo, Fv3A (o una variante de este) y/o Fv43D (o una variante de este) . En algunos aspectos, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de L- -arabinofuranosidasa puede ser Af43A, Fv43B, Pf5lA, Pa5lA y/o Fv5lA o variantes de estos.
En algunos aspectos, se proporciona una composición que comprende un polipéptido aislado que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) . En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) es expresado por una célula hospedera, en donde el ácido nucleico que codifica el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa se ha diseñado por ingeniería genética en la célula hospedex'a. Por ejemplo, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa está expresado por una célula hospedera y el ácido nucleico que codifica ese polipéptido es heterólogo a la célula hospedera.
En algunos aspectos, se proporciona una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y que comprende, además, uno o más polipéptidos de celulasa y/o uno o más polipép idos de hemicelulasa, en donde el polipéptido de celulas y/o el polipéptido de hemicelulasa está expresado por una célula hospedera y el polipéptido de celulasa y/o polipéptido de hemicelulasa es heterólogo a la célula hospedera. En algunos aspectos, se proporciona una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa y que comprende, además, por lo menos un polipéptido de una celulasa y/o por lo menos un polipéptido de hemicelulasa y el polipéptido de celulasa y/o el polipéptido de hemicelulasa está expresado por una célula hospedera y el polipéptido de celulasa y/o polipéptido de hemicelulasa es endógeno a la célula hospedera. En algunos aspectos, el polipéptido de celulasa comprende un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa {por ejemplo, EG1 de T. reesei , EG2 de T. reesei o una variante de estos) que es diferente al polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa , un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 de T. reesei, A. fumigatus 7A, 7B, C. globosum 7A, 7B, T. terrestris 7A, 7B, CBH2 de T. reesei, T. terrestris 6A, S. thermophile 6A, 6B o una variante de estos) o un polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B, Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G, Tn3B o una variante de estos) . En algunos aspectos, el polipéptido de hemicelulasa comprende un polipéptido que tiene actividad de xilanasa (por ejemplo, Xyn3 de T. reesei, Xyn2 de T. reesei, AfuXyn2 , AfuXyn5 o una variante de estos) , un polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa (por ejemplo, Fv3A, Fv43A, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Bxll de T. reesei o una variante de estos) o un polipéptido que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa (por ejemplo, Af43A, Fv43B, PÍ51A, Pa51A, Fv51A o una variante de estos) .
En algunos aspectos, la composición se prepara a partir de un caldo de fermentación. En algunos aspectos, la composición se prepara a partir del caldo de fermentación de una cepa integrada (por ejemplo, H3A/Eg4, núm. 27, tal como se describe en los ejemplos de la presente descripción) , en donde el gen de endoglucanasa de GH61 se integra en los materiales genéticos de la cepa huésped. En algunos aspectos, la composición se prepara a partir del caldo de fermentación de una cepa, en donde un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) es heterólogo a la célula hospedera, en donde la endoglucanasa de GH61, por ejemplo, se ha integrado en la cepa o expresado por un vector introducido en la cepa huésped.
Cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en la presente descripción que comprenden un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede ser una celulasa completa. La composición puede ser un caldo de fermentación expuesto a un procesamiento mínimo después de la producción (por ejemplo, purificación, filtración, una etapa de exterminio de células y/o ultrafiltración, etc.) y se usa como una formulación de caldo entero.
En algunos aspectos, se proporciona una composición (por ejemplo, una composición que no es de origen natural) que comprende Eg4 de T. reesei, Bgll de T. reesei, xyn3 de G. reesei, Fv3A, Fv43D y Fv51A o las variantes respectivas de estos. La composición puede ser una celulasa completa. La composición puede ser un caldo de fermentación expuesto a un procesamiento mínimo después de la producción (por ejemplo, filtración, purificación, ultrafiltración, una etapa de exterminio de células, etc.) y, por lo tanto, se usa como una formulación de caldo entero. En algunos aspectos, la composición comprende Eg4 de T. reesei aislado o una variante de este. En algunos aspectos, la composición comprende por lo menos Bgll de T. reesei aislado, xyn3 de T. reesei aislado, Fv3A aislado, Fv43D aislado o Fv51A aislado. Por ejemplo, cualquiera de los polipéptidos mencionados anteriormente se puede introducir en la composición por medio de adición o mezclado simple de polipéptidos purificados o aislados. Alternativamente, la cepa huésped puede expresar los polipéptidos de la presente descripción con el uso de técnicas recombinantes adecuadas y algunos de los polipéptidos mencionados anteriormente se pueden sobreexpresar o subexpresar en comparación con sus niveles de origen natural en la célula hospedera. En algunos aspectos, los genes que codifican cualquiera de los polipéptidos mencionados anteriormente se pueden integrar en la cepa huésped. En algunos aspectos, la composición de la presente descripción se prepara a partir de un caldo de fermentación de la cepa huésped. En algunos aspectos, la composición es de un caldo de fermentación de una cepa integrada (por ejemplo, H3A/Eg4, núm. 27, tal como se describe en los ejemplos de la presente descripción) . En algunas modalidades, el caldo de fermentación se expone a un procesamiento mínimo después de la producción y se usa como una formulación de caldo entero. En algunos aspectos, el ácido nucleico que codifica la endoglucanasa de GH61 es heterólogo a la célula hospedera. En algunos aspectos, por lo menos uno de los ácidos nucleicos que codifican Bgll de G. reesei, xyn3 de T. reesei , Fv3A, Fv43D o Fv51A es heterólogo a la célula hospedera que expresa la endoglucanasa de GH61 de la invención. En algunos aspectos, por lo menos un ácido nucleico que codifica Bgll de T. reesei, xyn3 de T. reesei, Fv3A, Fv43D o Fv51A es endógeno a la célula hospedera que expresa la endoglucanasa de GH61.
El polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede estar presente en una composición enzimática o en una mezcla de sacarificación de biomasa en una cantidad suficiente para aumentar la producción de azúcares fermentables a partir de la hidrólisis de un material de biomasa (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %) en comparación con la producción obtenida por una composición enzimática de control o una mezcla de sacarificación de biomasa de control comparable en términos de los tipos y concentraciones de componentes enzimáticos u otros en ella, pero sin el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de GH6l/endoglucanasa . El polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa puede estar presente en la composición enzimática o en una mezcla de sacarificación de biomasa en una cantidad suficiente para reducir la viscosidad de la mezcla de sacarificación de biomasa durante la hidrólisis del material de biomasa en ella (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %) en comparación con la viscosidad de una mezcla de control comparable en términos de los tipos y concentraciones de los componentes enzimáticos u otros componentes en ella, pero sin el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa . En algunos aspectos, la composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa comprende por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa , por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa, en cantidades totales suficientes para causar la hidrólisis del material de biomasa con el cual los polipéptidos entran en contacto. La composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa puede comprender, además, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de xilanasa, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de L-ot-arabinofuranosidasa y/o una celulasa completa o una mezcla de estos, en cantidades totales suficientes para causar la hidrólisis del material de biomasa con el cual los polipéptidos entran en contacto.
En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) está presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 % en peso a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 20 % en peso, de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 20 % en peso, de aproximadamente 7 % en peso a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 8 a aproximadamente 15 % en peso) del peso total de proteínas en la composición enzimática o en la mezcla de sacarificación de biomasa. Por ejemplo, el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa está presente en una cantidad de aproximadamente 8 % en peso, aproximadamente 10 % en peso o aproximadamente 12 % en peso del peso total de proteínas en la composición enzimática o en la mezcla de sacarificación de biomasa. La composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa puede comprender más de un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa . Por ejemplo, la composición enzimática o mezcla de sacarificación de biomasa puede comprender Eg4 de T. reesei o una variante de este, así como Eg7 de T. reesei (o una variante de este) , en donde la cantidad total de polipéptidos que tienen actividad de GH61/endoglucanasa (Eg4 + Eg7) es de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 % en peso a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 2 % en peso a aproximadamente 20 % en peso, de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 20 % en peso, de aproximadamente 7 % en peso a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 8 % en peso a aproximadamente 15 % en peso) del peso total de proteínas en la composición enzimática o en la mezcla de sacarificación de biomasa. El polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de GH61/endoglucanasa se pueden expresar a partir de polinucleótidos heterologos o endógenos a la célula hospedera. Alternativamente, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa se puede introducir en la composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa en forma aislada o purificada.
En algunos aspectos, un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 de T. reesei, A. fumigatus 7A, 7B, C. globosum 7A, 7B, T. terrestris 7A, 7B, CBH2 de T. reesei, T. terrestris 6A, S. thermophile 6A, 6B o una variante de estos) está presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 80 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 70 % en peso, de aproximadamente 10 % en peso a aproximadamente 60 % en peso, de aproximadamente 20 % en peso a aproximadamente 50 % en peso o de aproximadamente 25 % en peso a aproximadamente 50 % en peso) del peso total de proteínas en la composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa. La composición enzimática o mezcla de sacarificación de biomasa puede comprender más de un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 de T. reesei, A. fumigatus 7A, 7B, C. glohosum 7A, 7B, T. terrestris 7A, 7B, CBH2 de T. reesei, T. terrestris 6A, S. thermophile 6A, 6B o una variante de estos) , en donde la cantidad total de polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa es de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 80 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 70 % en peso, de aproximadamente 10 % en peso a aproximadamente 60 % en peso, de aproximadamente 20 % en peso a aproximadamente 50 % en peso o de aproximadamente 25 % en peso a aproximadamente 50 % en peso) del peso total de proteínas en la composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa se expresa a partir de un ácido nucleico heterólogo o endógeno a la célula hospedera. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa se puede introducir en la composición enzimática o mezcla de sacarificación de biomasa en forma aislada o purificada.
La composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa puede comprender uno o más polipéptidos que tienen actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B , Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G, Tn3B o una variante de estos) , en donde la cantidad total de polipéptidos que tienen actividad de ß-glucosidasa es de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 2 % en peso a aproximadamente 20 % en peso, de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 8 % en peso a aproximadamente 15 % en peso) del peso total de proteínas en la composición enzimática o mezcla de sacarificación de biomasa. El polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa se puede expresar a partir de un ácido nucleico heterólogo o endógeno a la célula hospedera. El polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa puede introducirse, alternativamente, en la composición enzimática o mezcla de sacarificación de biomasa en forma aislada o purificada.
En algunos aspectos, la composición enzimática o mezcla de sacarificación de biomasa puede comprender uno o más los polipéptidos que tienen actividad de xilanasa (por ejemplo, Xyn3 de T. reesei, Xyn2 de T. reesei, AfuXyn2 , AfuXynB o una variante de estos) , en donde la cantidad total de polipéptidos que tienen actividad de xilanasa es de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 4 % en peso a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 8 % en peso a aproximadamente 15 % en peso) del peso total de proteínas en la composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa. El polipéptido que tiene actividad de xilanasa se puede expresar a partir de un ácido nucleico heterólogo o endógeno a la célula hospedera. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa se puede introducir o mezclar en la composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa en forma aislada o purificada.
La composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa puede comprender uno o más polipéptidos que tienen actividad de L- -arabinofuranosidasa {por ejemplo, Af43A, Fv43B, Pf51A, Pa51A, Fv51A o una variante de estos) , en donde la cantidad total de polipéptidos que tienen actividad de L- a-arabinofuranosidasa es de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 2 % en peso a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 4 % en peso a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 15 % en peso) del peso total de proteínas en la composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa. El polipéptido que tiene actividad de L- -arabinofuranosidasa se puede expresar a partir de un ácido nucleico heterólogo o endógeno a la célula hospedera. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa se puede introducir o mezclar en la composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa en forma aislada o purificada.
La composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa puede comprender uno o más polipéptidos que tienen actividad de ß-xilosidasa (por ejemplo, Fv3A, Fv43A, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Bxll de T. reesei o una variante de estos) , en donde la cantidad total de los polipéptidos que tienen actividad de ß-xilosidasa es de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 4 % en peso a aproximadamente 35 % en peso, de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 25 % en peso o de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 20 % en peso) del peso total de proteínas en la composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa. El polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa se puede expresar a partir de un ácido nucleico heterologo o endógeno a la célula hospedera. El polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa puede introducirse, alternativamente, en la composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa en forma aislada o purificada.
En algunos aspectos, la composición enzimática que se proporciona en la presente descripción puede ser una celulasa completa. La celulasa completa puede comprender uno o más polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa (tales como, por ejemplo, Eg4 , Egl, Eg2 , Eg7 de G. reesei o una variante de estos) expresados a partir de un ácido nucleico heterologo o endógeno a la célula hospedera. La celulasa completa puede comprender, además, uno o más polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa {por ejemplo, CBH1 de T. reesei, A. fu.miga.tus 7A, 7B, C. globosum 7A, 7B, T. terrestris 7A, 7B, CBH2 de T. reesei, T. terrestris 6A, S. thermophile 6A, 6B o una variante de estos) expresados a partir de un ácido nucleico heterologo o endógeno a la célula hospedera. La celulasa completa puede comprender, además, uno o más polipéptidos que tienen actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B, Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G, Tn3B o una variante de estos) expresados a partir de un ácido nucleico heterólogo o endógeno a la célula hospedera. La celulasa completa se puede usar en la forma de un caldo de fermentación de la célula hospedera. El caldo se puede exponer al procesamiento mínimo después de la producción, que incluye, por ejemplo, filtración, purificación, ultrafiltración, una etapa de exterminio celular, etc. y, por lo tanto, el caldo puede usarse para la hidrólisis de la biomasa en una formulación de caldo entero.
En algunos aspectos, la composición enzimática proporcionada en la presente descripción puede convertir un material de biomasa en azúcares fermentables (por ejemplo, glucosa, xilosa, arabinosa y/o celobiosa) . En algunos aspectos, la composición enzimática puede producir por lo menos aproximadamente 0.1 (por ejemplo, 0.1 a 0.4) de producto de fracción según se determina por medio del ensayo de calcoflúor descrito en la presente descripción.
En algunos aspectos, la composición enzimática puede ser una composición de celulasa o una composición de hemicelulasa . La composición enzimática puede comprender el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa y, además, puede comprender uno o más polipéptidos de celulasa y/o uno o más polipéptidos de hemicelulasa, en donde uno o más polipéptidos que tienen actividad de GH6l/endoglucanasa y uno o más polipéptidos de celulasa y/o uno o más polipéptidos de hemicelulasa se combinan en una mezcla antes de usar la mezcla para el contacto y la hidrólisis de un sustrato de biomasa en una mezcla de sacarificación de biomasa.
En algunos aspectos, uno o más polipéptidos que tienen actividad de GH61/endoglucanasa, uno o más polipéptidos de celulasa y uno o más polipéptidos de hemicelulasa se añaden a un material de biomasa en momentos diferentes. Por ejemplo, un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa se añade a un material de biomasa antes o después de que se añade un polipéptido de celulasa y/o un polipéptido de hemicelulasa al mismo material de biomasa.
En algunos aspectos, una composición de la invención comprende por lo menos un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa y un material de biomasa, por ejemplo, en una mezcla. Por ejemplo, la composición puede ser una mezcla de hidrólisis, una mezcla del caldo de fermentación o una mezcla de sacarificación de biomasa. La mezcla puede comprender uno o más azúcares fermentables .
Además, en la presente descripción se proporciona métodos para hidrolizar un material de biomasa que comprende poner en contacto el material de biomasa con una composición enzimática (por ejemplo, una composición que no es de origen natural) que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa en una cantidad suficiente para hidrolizar el material de biomasa en la mezcla de sacarificación de biomasa resultante.
Además, en la presente descripción se proporciona métodos para reducir la viscosidad de una mezcla de biomasa y/o una mezcla de sacarificación de biomasa; los métodos comprenden poner la mezcla en contacto con una composición enzimática (por ejemplo, una composición que no es de origen natural) que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa que está presente en la composición en una cantidad suficiente para reducir la viscosidad de la mezcla. En algunos aspectos, la mezcla de biomasa o la mezcla de sacarificación de biomasa comprende un material de biomasa, opcionalmente , además, azúcares fermentables , una celulasa completa y/o una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de celulasa y/o un polipéptido que tiene actividad de hemicelulasa . La viscosidad de la mezcla se puede reducir por lo menos aproximadamente 5 %, (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %) en comparación con la viscosidad de una mezcla de control que comprende los mismos componentes en las mismas concentraciones excepto que el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa está ausente de la mezcla. El material de biomasa puede comprender hemicelulosa , celulosa o una mezcla de estos. El material de biomasa puede comprender glucano, xilano y/o lignina o una mezcla de estos.
En algunos aspectos, el material de biomasa se puede tratar o pretratar adecuadamente con un ácido o una base. En algunos aspectos, la base es amoniaco. El método de la invención puede comprender, además, ajustar el pH de la mezcla de biomasa hasta un pH de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 6.5 (por ejemplo, pH de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 5.5). En algunos aspectos, el método se realiza a un pH de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 6.5 (por ejemplo, pH de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 5.5) . En algunos aspectos, el método se realiza por aproximadamente 2 h a aproximadamente 7 d (por ejemplo, de aproximadamente 4 h a aproximadamente 6 d, de aproximadamente 8 h a aproximadamente 5 d o de aproximadamente 8 h a aproximadamente 3 d) . Este ajuste del pH puede realizarse, adecuadamente, antes de poner la mezcla de biomasa en contacto con los polipéptidos o las composiciones enzimáticas .
En algunos aspectos, el material de biomasa está presente en una mezcla de sacarificación en un nivel de sólidos alto, por ejemplo, el material de biomasa en su estado sólido constituye por lo menos aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 60 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 10 % en peso a aproximadamente 50 % en peso, de aproximadamente 15 % en peso a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 15 % en peso a aproximadamente 30 % en peso o de aproximadamente 20 % en peso a aproximadamente 30 % en peso) del peso total de enzimas y material de biomasa en la mezcla de sacarificación. "Peso del material de biomasa en su estado sólido" se refiere al peso del material de biomasa en su estado seco, en su estado sólido seco, en su estado natural o en su estado sin procesar o antes de que la biomasa entre en contacto con los polipéptidos en la composición enzimática. Preferentemente, el material de biomasa en su estado sólido constituye por lo menos aproximadamente 15 % en peso y, aún con mayor preferencia, por lo menos aproximadamente 20 % en peso o 25 % en peso del peso total de enzimas y materiales de biomasa en la mezcla de sacarificación.
En algunos aspectos, el método comprende la etapa de producir azúcares fermentables. Con el uso del método de la invención la cantidad de azúcares fermentables producidos puede ser mayor. Por ejemplo, la cantidad de azúcares fermentables producidos con el uso de los métodos o las composiciones de la presente descripción aumenta por lo menos aproximadamente 5 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 ¾, 80 % o 90 %) en comparación con la cantidad de los azúcares fermentables producidos cuando el mismo material de biomasa se hidroliza por medio de una composición enzimática que comprende los mismos componentes de polipéptidos en las mismas concentraciones, excepto que el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa está ausente.
En algunos aspectos, la cantidad de la composición enzimática que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa es suficiente para aumentar la producción de azúcares fermentables por lo menos aproximadamente 5 %, (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %) , en comparación con la producción de azúcares fermentables a partir del mismo material de biomasa por medio de una composición enzimática que tiene los mismos componentes en las mismas concentraciones, excepto que el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa está ausente. En algunos aspectos, la cantidad del polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa en la mezcla de sacarificación de biomasa es suficiente para reducir la viscosidad de la mezcla por lo menos aproximadamente 5 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %) en comparación con la viscosidad de una mezcla de sacarificación de biomasa de control que comprende la misma biomasa y el mismo panel de polipéptidos en las mismas concentraciones, excepto que el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa está ausente .
En algunos aspectos, la cantidad de la composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa usada en un proceso de sacarificación o hidrólisis es de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 50 mg de proteína (por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 40 mg de proteína, de aproximadamente 0.5 mg a . aproximadamente 30 mg de proteína, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg de proteína o de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 15 mg de proteína) por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa en el material de biomasa. La cantidad de proteína descrita en la presente descripción se refiere al peso de proteína total en la composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa. Las proteínas incluyen un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa y pueden incluir otras enzimas tales como polipéptidos de celulasa y/o polipéptidos de hemicelulasa . En algunos aspectos, la cantidad del polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa usado en el proceso de hidrólisis o sacarificación es de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg (por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg) de proteína por gramo de celulosa, hemicelulosa o celulosa y hemicelulosa contenidas en el material de biomasa.
La composición enzimática o mezcla de sacarificación de biomasa que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa y por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa (por ejemplo, Egl de T. reesei, Eg2 de T. reesei y/o una variante de estos) en el proceso de hidrólisis o sacarificación puede contener de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg [por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg) de proteína por gramo de celulosa, hemicelulosa o celulosa y hemicelulosa en el material de biomasa.
La composición enzimática o mezcla de sacarificación de biomasa que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa y por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 de T. reesei, A. fumigatus 7A, 7B, C. globosum 7A, 7B, T. terrestrís 7A, 7B, CBH2 de T. reesei, T. terrestris SA, S. thermophile 6A, 6B o una variante de estos) en el proceso de hidrólisis o sacarificación puede contener de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg (por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg , de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg) de proteína por gramo de celulosa, hemicelulosa o celulosa y hemicelulosa en el material de biomasa.
En algunos aspectos, la composición enzimática o mezcla de sacarificación de biomasa que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa y por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B, Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G, Tn3B o una variante de estos) en el proceso de hidrólisis o sacarificación puede contener de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg (por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg o de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 5 mg) de proteína por gramo de celulosa, hemicelulosa o celulosa y hemicelulosa en el material de biomasa.
La composición enzimática o mezcla de sacarificación de biomasa que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa y por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de xilanasa (por ejemplo, Xyn3 de T. reesei, Xyn2 de T. reesei, AfuXyn2 , AfuXyn5 o una variante de estos) en el proceso de hidrólisis o sacarificación puede contener de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg (por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 5 mg) de proteína por gramo de celulosa, hemicelulosa o de celulosa y hemicelulosa en el material de biomasa.
La composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa y por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa (por ejemplo, Fv3A, Fv43A, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B , Pa51A, Gz43A, Bxll de T. reesei y/o una variante de estos) usada en el proceso de hidrólisis o sacarificación puede contener de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg (por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg o de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 5 mg) de proteína por gramo de celulosa, hemicelulosa o celulosa y hemicelulosa en el material de biomasa.
La composición enzimática o la mezcla de sacarificación de biomasa que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa y por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa (por ejemplo, Af43A, Fv43B, Pf51A, Pa51A, Fv51A y/o una variante de estos) usada en el proceso de hidrólisis o sacarificación puede contener de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg (por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg o de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 5 mg) de proteína por gramo de celulosa, hemicelulosa o celulosa y hemicelulosa en el material de biomasa.
En algunos aspectos, el método de la invención se realiza a una temperatura de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 65 °C (por ejemplo, de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 60 °C, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °C o de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 55 °C) .
El método de la invención puede comprender, además, la etapa de poner en contacto el material de biomasa con una composición enzimática que comprende una celulasa completa. En algunos aspectos, la etapa de poner en contacto el material de biomasa con una composición que comprende una celulasa completa se realiza antes, después o simultáneamente con el contacto del material de biomasa con una composición enzimática que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa .
En algunos aspectos, el método de la invención comprende, además, la etapa de poner en contacto el material de biomasa con una composición enzimática que comprende un polipéptido que tiene actividad de celulasa y/o un polipéptido que tiene actividad de hemicelulasa . La etapa de poner en contacto el material de biomasa con una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de celulasa y/o un polipéptido que tiene actividad de hemicelulasa se puede realizar antes, después o simultáneamente con el contacto del material de biomasa con una composición enzimática que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa .
En algún aspecto, la composición comprende el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa y comprende, además, por lo menos 1 polipéptido de celulasa y/o por lo menos un polipéptido de hemicelulasa, en donde el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa y por lo menos un polipéptido de una celulasa y/o por lo menos 1 polipéptido de hemicelulasa se combinan en una mezcla antes de usar la mezcla para el contacto con el material de biomasa.
En algunos aspectos, la composición comprende el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa y comprende, además, 1 o más polipéptidos de celulasa y/o 1 o más polipéptidos de hemicelulasa, en donde el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa y 1 o más polipéptidos de celulasa y/o 1 o más polipéptidos de hemicelulasa se añaden al material de biomasa en momentos diferentes . Por ejemplo, el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) se añade antes o después de que se añade 1 o más polipéptidos de celulasa y/o 1 o más polipéptidos de hemicelulasa .
En algunos aspectos, se contemplan métodos para aplicar la invención en un entorno industrial y/o en un entorno comercial. En consecuencia, un método o un método de fabricación, comercial o de cualquier otra forma de comercialización de las composiciones de la presente que comprenden endoglucanasas de GH61 adecuadas está dentro del alcance de la descripción. El método incluye, por ejemplo, la aplicación de las composiciones o los polipéptidos de endoglucanasa GH61 o variantes de estos en un modelo de suministro comercial de enzimas, en donde las enzimas y variantes, así como las composiciones de la invención se suministran o venden a productores de azúcar celulósico, ciertas refinerías de etanol (bioetanol) u otros fabricantes de bioquímicos o materiales biológicos. En algunos aspectos, el método puede ser, además, la aplicación de las composiciones o los polipéptidos de endoglucanasa de GH61 o variantes de estos en un modelo de biorefinería en el sitio, en donde los polipéptidos o variantes o las composiciones de hemicelulasa o celulasa que no son de origen natural, descritas en la presente invención, se producen en un sistema de producción de enzimas construido por el fabricante de enzimas en un sitio que está en o cerca de la planta de azúcar celulósico, refinerías de bioetanol o fabricantes de bioquímicos/materiales biológicos. En algunos aspectos, los sustratos de biomasa adecuados, preferentemente, expuestos a tratamientos previos apropiados tal como se describen en la presente descripción pueden hidrolizarse con el uso de los métodos de sacarificación y las enzimas y/o composiciones enzimáticas de la presente descripción en o cerca de las refinerías de bioetanol o instalaciones de fabricación de bioquímicos/biomateriales . Los azúcares fermentables resultantes pueden exponerse después a fermentación en las mismas instalaciones o en instalaciones del área adyacente.
Se entenderá que una, algunas o todas las propiedades de las modalidades descritas en la presente descripción pueden combinarse para formar otras modalidades de la presente invención. Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes para una persona con experiencia en la técnica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS El técnico con experiencia comprenderá que las figuras se incluyen solamente para propósitos ilustrativos y no están previstas para limitar de ninguna manera el alcance de las enseñanzas de la presente descripción.
Figs . 1A-1E: representan ciertas secuencias de aminoácidos de varios polipéptidos que tienen actividad de GH6l/endoglucanas .
Figs. 2A-2D: representa el porcentaje de identidad y divergencia con el uso de ClustalV (PAM250) que compara un número de secuencias de aminoácidos de varios polipéptidos que tienen actividad de GH6l/endoglucanasa, tal los ilustrados en las Figs . 1A-1E (sec. con núms . de ident . : 1-28) .
Figs. 3A-3L: representa el alineamiento de varios polipéptidos que tienen actividad de GH6l/endoglucanasa, tal como los ilustrados en laS Figs. 1A-1E (sec. con núms. de ident . : 1-28) .
Figs. 4A-4B: la Fig. 4A representa una secuencia de nucleótidos de Eg4 de T. reesei (sec. con núm. de ident. :30) . La Fig. 4B representa una secuencia de aminoácidos de Eg4 de T. reesei (sec. con núm. de ident. :27) . La secuencia señal prevista aparece subrayada, los dominios conservados previstos aparecen en negrita y el conector previsto está en cursiva.
Fig. 5: representa un alineamiento de secuencias de aminoácidos de Eg4 de T. reesei (TrEG4) (sec. con núm. de ident. :27) con Eg7 de T. reesei (TrEG7 o TrEGb) (sec. con núm. de ident. :26) y TtEG (sec. con núm. de ident. :29) .
Figs. 6A-6B: la Fig. 6A proporciona residuos conservados de Eg4 de T. reesei (TrEg4) inferidos del alineamiento de secuencias y las estructuras conocidas de TrEG7 (estructura cristalina indicada en el Registro del banco de datos de proteínas como pdb:2vtc) y TtEG (estructura cristalina indicada en el Registro del banco de datos de proteínas como pdb:3EII) . La Fig. 6B proporciona residuos del dominio CBM conservados inferidos del alineamiento de secuencias con secuencias de Tr6A y Tr7A conocidas.
Fig. 7 enumera una cantidad de motivos de secuencias de aminoácidos de endoglucanasas de GH61. Cada una de las "a" en los motivos de secuencias representa un aminoácido que puede ser alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina o valina.
Figs . 8A-8I: la Fig. 8A representa el plásmido pENTR- TOPO-Bgll-943/942. La Fig. 8B representa el vector de expresión pTrex3g 943/942. La Fig. 8C representa el plásmido pENTR/ Xyn3 de T. reesei. La Fig. 8D representa el vector de expresión pTrex3g/Xyn3 de T. reesei. La Fig. 8E representa el plásmido pENTR-Fv3A. La Fig. 8F representa el plásmido pTrex6g. La Fig. 8G representa el vector de expresión pTrex6g/Fv3A. La Fig. 8H representa el plásmido TOPO ' Blunt/Pegll-Fv43D . La Fig. 81 representa el plásmido TOPO Blunt/Pegll-Fv51A.
Fig. 9: proporciona la composición enzimática de la cepa integrada H3A de T. reesei .
Fig. 10: enumera las enzimas (purificadas o no purificadas) añadidas individualmente a cada muestra en el Ejemplo 2 y las concentraciones de iniciales de protelna de estas enzimas.
Figs. 11A-11D: la Fig. 11A representa la liberación de glucosa después de la sacarificación de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido mediante la adición de las composiciones enzimáticas que comprenden varias enzimas purificadas o no purificadas de la Fig. 10 que se añadieron a la cepa integrada de T. reesei H3A, de conformidad con el Ejemplo 2. La Fig. 11B representa la liberación de celobiosa después de la sacarificación de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido por medio de la adición de las composiciones enzimáticas que comprenden varias enzimas purificadas o no purificadas de la Fig. 10 que se añadieron a la cepa integrada de G. reesei H3A, de conformidad con el Ejemplo 2; la Fig. 11C representa la liberación de xilobiosa después de la sacarificación de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido por medio de la adición de las composiciones enzimáticas que comprenden varias enzimas purificadas o no purificadas de la Fig. 10 que se añadieron a la cepa integrada de T. reesei H3A, de conformidad con el Ejemplo 2; la Fig. 11D representa la liberación de xilosa después de la sacarificación de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido por medio de la adición de las composiciones enzimáticas que comprenden varias enzimas purificadas o no purificadas de la Fig. 10 que se añadieron a la cepa integrada de T. reesei H3A, de conformidad con el Ejemplo 2.
Figs. 12A-12B: la Fig. 12A representa el cásete de expresión Pegll-eg4-sucA, tal como se describe en el Ejemplo 3; la Fig. 12B representa el mapa de plásmidos de pCR Blunt II TOPO que contiene el cásete de expresión pEGl-EG4-sucA, tal como se describe en el Ejemplo 3.
Fig. 13: representa la cantidad o porcentaje de conversión de glucano y xilano a celobiosa, glucosa, xilobiosa y xilosa por medio de una composición enzimática que comprende enzimas producidas por los transformantes de la cepa integrada H3A de T. reesei que expresan Eg4 de T. reesei, de conformidad con el Ejemplo 3.
Fig. 14: representa el porcentaje incrementado de conversión de glucano observado con el uso de una cantidad creciente de una composición enzimática producida por transformantes de H3A que expresa Eg4 de T. reesei. Los detalles experimentales se describen en el Ejemplo 3.
Fig. 15: proporciona un cuadro de dosificación de Eg4 de T. reesei para el Ejemplo 4 (Experimento 1) . La muestra "núm. 27" es una cepa integrada H3A/Eg4 tal como se describe en el Ejemplo 4. Las cantidades de Eg4 de T. reesei purificado que se añadieron se enumeran bajo "Descripción de la muestra" por % en peso o por masa (en mg de proteína/g de G+X) .
Figs. 16A-16B: la Fig. 16A representa el efecto de Eg4 de G. reesei en la liberación de glucosa en la sacarificación de mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido de conformidad con el Ejemplo 4. La Fig. 16B representa el efecto de Eg4 de T. reesei en la liberación de xilosa a partir de la sacarificación de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido. Los ejes Y de las figuras 16A-16B se refieren a las concentraciones de glucosa o xilosa liberadas en las mezclas de reacción. Los ejes X indican los nombres/descripciones breves de las muestras de la composición enzimática. Esto es de conformidad con el Ejemplo 4 (Experimento 1) .
Figs . 17A-17B: la Fig. 17A proporciona otro cuadro de dosificación de Eg4 de T. reesei para el Ejemplo 4 (Experimento 2) . Las muestras se describen de manera similar a las de la Fig. 15. Las cantidades de Eg4 de T. reesei purificado añadido variaron en incrementos menores que los del Ejemplo 4, Experimento 1 (anterior). La Fig. 17B proporciona otro cuadro de dosificación de Eg4 de T. reesei para el Ejemplo 4 (Experimento 3) . Las muestras se describen de manera similar a las de las Figs. 16A-16B y 17A. Las cantidades de Eg4 de T. reesei purificado añadido variaron en incrementos aun más pequeños que los del Ejemplo 4, experimentos 1 y 2 (anteriores) .
Figs. 18A-18B: la Fig. 18A representa el efecto de Eg4 de T. reesei en varias cantidades (0.05 mg/g a 1.0 mg/g) en la liberación de glucosa a partir de la sacarificación de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido, tal como se describe en el Ejemplo 4. La Fig. 18B representa el efecto de Eg4 de T. reesei en varias cantidades (0.1 mg/g a 0.5 mg/g) en la liberación de glucosa a partir de la sacarificación de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido, tal como se describe en el Ejemplo 4.
Fig. 19: representa el efecto de Eg4 de G. reesei en una composición enzimática en la liberación de glucosa/ xilosa a partir de la sacarificación de cargas sólidas diferentes de rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido, tal como se describe en el Ejemplo 5. La carga sólida se indica en el eje x como #% .
Fig. 20: proporciona el porcentaje de producción de monómeros de xilosa liberados a partir de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido con el uso de una composición enzimática que comprende Eg4 de T. reesei, de conformidad con el Ejemplo 6.
Fig. 21: proporciona el porcentaje de producción de monómeros de glucosa liberados a partir de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido con el uso de una composición enzimática que comprende Eg4 de T. reesei, de conformidad con el Ej emplo 6.
Fig. 22: proporciona la producción (mg/ml) de monómeros fermentables totales liberados a partir de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido con el uso de una composición enzimática que comprende Eg4 de T. reesei, de conformidad con el Ejemplo 6.
Fig. 23: compara las cantidades de glucosa liberada como resultado de la hidrólisis por una composición enzimática sin Eg4 de T. reesei comparada con una composición que comprende Eg4 de T. reesei a 0.53 mg/g. El experimento se describe en el Ejemplo 7.
Fig. 24: representa la liberación del monómero de glucosa como resultado del tratamiento de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco con el uso de Eg4 de T. reesei purificado solo, de conformidad con el Ejemplo 7.
Fig. 25: representa y compara el desempeño de sacarificación de las composiciones enzimáticas producidas por la cepa integrada H3A de G. reesei y la cepa integrada H3A/Eg4 (cepa núm. 27) , en una dosificación de enzimas de 14 mg/g. Esto es de conformidad con la descripción del Ejemplo 8.
Fig. 26: representa el desempeño de sacarificación de las composiciones enzimáticas producidas por la cepa integrada H3A de T. reesei y la cepa integrada H3A/Eg4 (cepa núm. 27) , en varias dosificaciones de enzimas, en el rastrojo de maíz pretratado con ácido. Esto es de conformidad con la descripción del Ejemplo 9.
Fig. 27: representa el desempeño de la sacarificación de las composiciones enzimáticas producidas por la cepa integrada de G. reesei H3A y la cepa integrada H3A/Eg4 (cepa núm. 27) en hojas, tallos o mazorcas de maíz pretratados con amoníaco diluido, de conformidad con el Ejemplo 10.
Fig. 28: compara el desempeño de sacarificación, en términos de las cantidades de glucosa o xilosa liberada, de composiciones enzimáticas producidas por la cepa integrada H3A de T. reesei y la cepa integrada H3A/Eg4 (cepa núm. 27) . Esto es de conformidad con el Ejemplo 11.
Fig. 29: representa el cambio en porcentaje de la conversión de glucano y xilano en cantidades crecientes de una composición enzimática producida por la cepa integrada de T. reesei H3A/Eg4 (cepa núm. 27) . Esto es de acuerdo con la descripción del Ejemplo 12.
Fig. 30: es una tabla que enumera el efecto de la adición de Eg4 de T. reesei en la sacarificación de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido. Las condiciones experimentales se describen en el Ejemplo 13.
Fig. 31: representa la hidrólisis de CMC por medio de Eg4 de T. reesei. Las condiciones experimentales se describen en el Ejemplo 13.
Fig. 32: representa la hidrólisis de celobiosa por medio de Eg4 de T. reesei. Las condiciones experimentales se describen en el Ejemplo 13.
Figs . 33A-33C: representan cantidades para diversas composiciones enzimáticas para sacarificación. Las condiciones experimentales se describen en el Ejemplo 14.
Figs. 34A-34C: representan la cantidad de glucosa, glucosa + celobiosa o xilosa producida con cada composición enzimática que corresponde a las Figs. 33A-33C. Las condiciones experimentales se describen en el Ejemplo 14.
Fig. 35: representa las diversas relaciones de mezclas de CBHl, CBH2 y Eg2 de T. reesei, tal como se describe en el Ejemplo 15.
Figs. 36A-36B: representan la conversión de glucano (%) con el uso de diversas composiciones enzimáticas. Las condiciones experimentales se describen en el Ejemplo 15.
Fig. 37: representa el efecto del ácido ascórbico cuando se usa una composición que comprende Eg4 de T. reesei para tratar Avicel en presencia o ausencia de CBH I, de conformidad con el Ejemplo 22.
Fig. 38: representa el efecto del ácido ascórbico en una composición que comprende Eg4 de T. reesei usada para tratar Avicel en presencia/ausencia de CBH II, de conformidad con el Ejemplo 22 Figs. 39A-39B: la Fig. 39A representa la cantidad de sustrato y diversas enzimas usadas en el experimento del Ejemplo 22, con el resultado representado en la Fig. 37. Fig. 39B representa la cantidad de sustrato y varias enzimas usadas en el experimento del Ejemplo 22, con el resultado representado en la Fig. 38.
Fig. 40: representa la producción de glucosa a partir de la hidrólisis de la mazorca de maíz con el uso de varias composiciones enzimáticas, de conformidad con los experimentos descritos en el Ejemplo 16.
Fig. 41: representa la producción de xilosa a partir de la hidrólisis de la mazorca de maíz con el uso de varias composiciones enzimáticas de conformidad con la descripción del Ejemplo 16.
Fig. 42: representa la viscosidad de la mezcla de sacarificación con el uso de H3A y H3A añadida con Eg4 purificado con el paso del tiempo de conformidad con la descripción del Ejemplo 17.
Fig. 43: representa la viscosidad de la mezcla de sacarificación con el uso de H3A y H3A/Eg4 núm. 27 con el paso del tiempo de conformidad con la descripción del Ejemplo 18.
Fig. 44: representa la viscosidad de la sacarificación de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido a 25 ¾ y 30 % de sólidos, con el uso de caldos de fermentación de H3A o de caldo de H3A/Eg4 núm. 27 a 14 mg/g de celulosa, de conformidad con la descripción del Ejemplo 19.
Fig. 45: representa la concentración de glucosa en la sacarificación de 6 h, 25 % de materia seca, 50 °C, pH 5.0 con el uso de diversas composiciones enzimáticas de conformidad con el Ejemplo 20.
Fig. 46: representa la concentración de glucosa en la sacarificación de 24 horas, 25 % de materia seca, 50 °C, pH 5.0 con el uso de diversas composiciones enzimáticas de conformidad con el Ejemplo 20.
Fig. 47: representa la concentración de glucosa en la sacarificación con el paso del tiempo, 25 % de materia seca, 50 °C, pH 5.0 con el uso de diversas composiciones enzimáticas de conformidad con el Ejemplo 20.
Fig. 48: representa la conversión de glucano en la sacarificación con el paso del tiempo, 25 % de materia seca, 50 °C, pH 5.0 con el uso de diversas composiciones enzimáticas de conformidad con el Ejemplo 20.
Figs. 49A-49E resumen las identificaciones de secuencias de la presente descripción.
Figs. 50A-50B: la Fig. 50A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fv3A (sec. con núm. de ident.:35). La Fig. 50B representa una secuencia de aminoácidos de Fv3A (sec. con núm. de ident.:36). La secuencia señal prevista aparece subrayada y el dominio conservado previsto aparece en negrita.
Figs. 51A-51B: la Fig. 51A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Pf43A (sec. con núm. de ident..-37). La Fig. 51B representa una secuencia de aminoácidos de Pf43A (sec. con núm. de ident. :38) . La secuencia señal prevista aparece subrayada, el dominio conservado previsto aparece en negrita, el módulo de unión a carbohidratos ( "CBM" , por sus siglas en inglés) previsto está en mayúscula y el conector previsto que separa el CD y el CBM está en cursiva.
Figs. 52A-52B: la Fig. 52A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fv43E (sec. con núm. de ident. :39) . La Fig. 52B representa una secuencia de aminoácidos de Fv43E (sec. con núm. de ident. :40) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y el dominio conservado previsto aparece en negrita .
Figs. 53A-53B: la Fig. 53A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fv39A (sec. con núm. de ident. :41) . La Fig. 53B representa una secuencia de aminoácidos de Fv39A (sec. con núm. de ident. :42) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y el dominio conservado previsto aparece en negrita.
Figs. 54A-54B: la Fig. 54A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fv43A (sec. con núm. de ident. :43) . La Fig. 54B representa una secuencia de aminoácidos de Fv43A (sec. con núm. de ident. :44) . La secuencia señal prevista aparece subrayada, el dominio conservado previsto aparece en negrita, el CBM previsto está en mayúscula y el conector previsto que conecta el dominio conservado y el CBM aparece en cursiva.
Figs. 55A-55B: la Fig. 55A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fv43B (sec. con núm. de ident. :45) .
La Fig. 55B representa una secuencia de aminoácidos de Fv43B (sec. con núm. de ident. :46) . La secuencia señal prevista está subrayada. El dominio conservado previsto aparece en negrita .
Figs . 56A-56B: la Fig. 56A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Pa51A (sec. con núm. de ident. :47) . La Fig. 56B representa una secuencia de aminoácidos de Pa51A (sec. con núm. de ident. :48) . La secuencia señal prevista está subrayada. El dominio conservado de L-a-arabinofuranosidasa previsto aparece en negrita. Para la expresión en G. reesei se usó ADN genómico con codones optimizados (ver la Fig. 73C) .
Figs. 57A-57B: la Fig. 57A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Gz43A (sec. con núm. de ident. :49) . La Fig. 57B representa una secuencia de aminoácidos de Gz43A (sec. con núm. de ident . :50) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y el dominio conservado previsto aparece en negrita. Para la expresión en T. reesei, la secuencia señal prevista se reemplazó por la secuencia señal de CBH1 de T. reesei (myrklavisaflatara (sec. con núm. de ident. : 120)) .
Figs. 58A-58B: la Fig. 58A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fo43A (sec. con núm. de ident. :51) . La Fig. 58B representa una secuencia de aminoácidos de Fo43A (sec. con núm. de ident. :52) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y el dominio conservado previsto aparece en negrita. Para la expresión en T. reesei, la secuencia señal prevista se reemplazó por la secuencia señal de CBH1 de T. reesei (myrklavisaflatara (sec. con núm. de ident.:120)) Figs. 59A-59B: la Fig. 59A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Af43A (sec. con núm. de ident.:53). La Fig. 59B representa una secuencia de aminoácidos de Af43A (sec. con núm. de ident.:54). El dominio conservado previsto aparece en negrita.
Figs. 60A-60B: la Fig. 60A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Pf51A (sec. con núm. de ident . :55) . La Fig. 60B representa una secuencia de aminoácidos de Pf51A (sec. con núm. de ident. :56). La secuencia señal prevista aparece subrayada y el dominio conservado de L-a-arabinofuranosidasa previsto aparece en negrita. Para la expresión en T. reesei, la secuencia señal prevista se reemplazó por una secuencia señal de CBH1 de T. reesei con codones optimizados (myrklavisaflatara (sec. con núm. de ident.: 120)) (subrayada) y la secuencia de nucleótidos de Pf51A tenía codones optimizados para la expresión.
Figs. 61A-61B: la Fig. 61A representa una secuencia de nucleótidos que codifican AfuXyn2 (sec. con núm. de ident. :57) . La Fig. 61B representa una secuencia de aminoácidos de AfuXyn2 (sec. con núm. de ident. :58) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y el dominio conservado de GHll previsto aparece en negrita.
Figs. 62A-62B: la Fig. 62A representa una secuencia de nucleótidos que codifican AfuXyn5 (sec. con núm. de ident.:59). La Fig. 62B representa una secuencia de aminoácidos de AfuXyn5 (sec. con núm. de ident.:60) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y el dominio conservado de GHll previsto aparece en negrita.
Figs. 63A-63B: la Fig. 63A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fv43D (sec. con núm. de ident.:61). La Fig. 63B representa una secuencia de aminoácidos de Fv43D (sec. con núm. de ident.:62). La secuencia señal prevista está subrayada. El dominio conservado previsto aparece en negrita .
• Figs. 64A-64B: la Fig. 64A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Pf43B (sec. con núm. de ident.:63). La Fig. 64B representa una secuencia de aminoácidos de Pf43B (sec. con núm. de ident.:64). La secuencia señal prevista aparece subrayada y el dominio conservado previsto aparece en negrita .
Figs. 65A-65B: la Fig. 65A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fv51A (sec. con núm. de ident . :65) . La Fig. 65B representa una secuencia de aminoácidos de Fv51A (sec. con núm. de ident. :66). La secuencia señal prevista aparece subrayada y el dominio conservado de L-a-arabinofuranosidasa previsto aparece en negrita.
Figs. 66A-66B: la Fig. 66A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Cg51B (sec. con núm. de ident. :67) . La Fig. 66B representa una secuencia de aminoácidos de Cg51B (sec. con núm. de ident. :68) . La secuencia señal prevista correspondiente aparece subrayada y el dominio conservado previsto aparece en negrita.
Figs . 67A-67B: la Fig. 67A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fv43C (sec. con núm. de ident. :69) . La Fig. 67B representa una secuencia de aminoácidos de Fv43C (sec. con núm. de ident. :70) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y el dominio conservado previsto aparece en negrita .
Figs. 68A-68B: la Fig. 68A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fv30A (sec. con núm. de ident. :71) . La Fig. 68B representa una secuencia de aminoácidos de Fv30A (sec. con núm. de ident . :72) . La secuencia señal prevista está subrayada.
Figs. 69A-69B: la Fig. 69A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fv43F (sec. con núm. de ident. :73) . La Fig. 69B representa una secuencia de aminoácidos de Fv43F (sec. con núm. de ident. :74) . La secuencia señal prevista está subrayada.
Figs. 70A-70B: la Fig. 70A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Xyn3 de T. reesei (sec. con núm. de ident. :75) . La Fig. 70B representa una secuencia de aminoácidos de Xyn3 (sec. con núm. de ident. :76) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y el dominio conservado previsto aparece en negrita.
Figs . 71A-71B: la Fig. 71A representa una secuencia de aminoácidos de Xyn2 de G. reesei (sec. con núm. de ident . :77) . La secuencia señal aparece subrayada. El dominio conservado previsto aparece en negrita. La secuencia codificante se puede encontrar en Tórrónen et al. Biotechnology, 1992, 10:1461-65. La Fig. 71B representa la secuencia de nucleótidos que codifican Xyn2 (sec. con núm. de ident . : 160) .
Figs. 72A-72B: la Fig. 72A representa una secuencia de aminoácidos de Bxll de T. reesei (sec. con núm. de ident. :78). La secuencia señal aparece subrayada. El dominio conservado previsto aparece en negrita. La secuencia codificante puede encontrarse en Margolles-Clark et al. Appl . Environ. Microbiol . 1996, 62 (10) : 3840-46. La Fig. 72B representa una secuencia de nucleótidos que codifican Bxll (sec. con núm. de ident.: 159) Figs. 73A-73F: la Fig. 73A representa una secuencia de aminoácidos de Bgll de T. reesei (sec. con núm. de ident. :79). La secuencia señal aparece subrayada. El dominio conservado previsto aparece en negrita. La secuencia codificante puede encontrarse en Barnett et al. Bio-Technology, 1991, 9 (6) : 562-567. La Fig. 73B representa el ADNc deducido para Pa51A (sec. con núm. de ident. :80) . La Fig. 73C representa el ADNc con codones optimizados para Pa51A (sec. con núm. de ident. :81) . Fig. 73D: representa la secuencia codificante para un constructo que comprende una secuencia señal de CBH1 (subrayada) corriente arriba del ADN genómico que codifica Gz43A maduro (sec. con núm. de ident. :82) . Fig. 73E: representa la secuencia codificante para un constructo que comprende una secuencia señal de CBH1 (subrayada) corriente arriba del ADN genómico que codifica Fo43A maduro (sec. con núm. de ident . :83) . Fig. 73F: representa la secuencia codificante con codones optimizados para un constructo que comprende una secuencia señal de CBH1 (subrayada) corriente arriba del ADN con codones optimizados que codifican Pf51A maduro (sec. con núm. de ident. :92) .
Figs. 74A-74B: la Fig. 74A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Pa3D (sec. con núm. de ident. :93) . La Fig. 74B representa una secuencia de aminoácidos de Pa3D (sec. con núm. de ident. :94) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y los dominios conservados previstos aparecen en negrita.
Figs. 75A-75B: la Fig. 75A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fv3G (sec. con núm. de ident. :95) . La Fig. 75B representa una secuencia de aminoácidos de Fv3G (sec. con núm. de ident. :96) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y los dominios conservados previstos aparecen en negrita.
Figs . 76A-76B: la Fig. 76A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fv3D (sec. con núm. de ident.:97). La Fig. 76B representa una secuencia de aminoácidos de Fv3D (sec. con núm. de ident.:98). La secuencia señal prevista aparece subrayada y los dominios conservados previstos aparecen en negrita.
Figs. 77A-77B: la Fig. 77A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fv3C (sec. con núm. de ident.:99). La Fig. 77B representa una secuencia de aminoácidos de Fv3C (sec. con núm. de ident.:100) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y los dominios conservados previstos aparecen en negrita.
Figs. 78A-78B: la Fig. 78A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Tr3A (sec. con núm. de ident. :101). La Fig. 78B representa una secuencia de aminoácidos de Tr3A (sec. con núm. de ident.:102) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y los dominios conservados previstos aparecen en negrita.
Figs. 79A-79B: la Fig. 79A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Tr3B (sec. con núm. de ident . :103) . La Fig. 79B representa una secuencia de aminoácidos de Tr3B (sec. con núm. de ident. :104) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y los dominios conservados previstos aparecen en negrita.
Figs. 80A-80B: la Fig. 80A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Te3A (sec. con núm. de ident.:105). La Fig. 80B representa una secuencia de aminoácidos de Te3A (sec. con núm. de ident.:106). La secuencia señal prevista aparece subrayada y los dominios conservados previstos aparecen en negrita.
Figs. 81A-81B: la Fig. 81A representa una secuencia de nucleótidos que codifican An3A (sec. con núm. de ident.:107). La Fig. 81B representa una secuencia de aminoácidos de An3A (sec. con núm. de ident.:108). La secuencia señal prevista aparece subrayada y los dominios conservados previstos aparecen en negrita.
Figs. 82A-82B: la Fig. 82A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Fo3A (sec. con núm. de ident.:109). La Fig. 82B representa una secuencia de aminoácidos de Fo3A (sec. con núm. de ident.:110) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y los dominios conservados previstos aparecen en negrita.
Figs. 83A-83B: la Fig. 83A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Gz3A (sec. con núm. de ident.:lll). La Fig. 83B representa una secuencia de aminoácidos de Gz3A (sec. con núm. de ident.:112). La secuencia señal prevista aparece subrayada y los dominios conservados previstos aparecen en negrita.
Figs. 84A-84B: la Fig. 84A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Nh3A (sec. con núm. de ident.:113).
La Fig. 84B representa una secuencia de aminoácidos de Nh3A (sec. con núm. de ident. :114) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y los dominios conservados previstos aparecen en negrita.
Figs . 85A-85B: la Fig. 85A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Vd3A (sec. con núm. de ident. :115) . La Fig. 85B representa una secuencia de aminoácidos de Vd3A (sec. con núm. de ident. :116) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y los dominios conservados previstos aparecen en negrita.
Figs. 86A-86B: la Fig. 86A representa una secuencia de nucleótidos que codifican Pa3G (sec. con núm. de ident. :117) . La Fig. 86B representa una secuencia de aminoácidos de Pa3G (sec. con núm. de ident. :118) . La secuencia señal prevista aparece subrayada y los dominios conservados previstos aparecen en negrita.
Fig. 87: representa una secuencia de aminoácidos que codifican Tn3B (sec. con núm. de ident. :119) . El programa de predicción de señal estándar, Signal P (www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/) no proporcionó ninguna señal prevista.
Fig. 88: representa un alineamiento de secuencias de aminoácidos parcial de los dominios CBM de Eg4 de G. reesei (sec. con núm. de ident. :27) con Tr6A (sec. con núm. de ident. :31) y con Tr7A (sec. con núm. de ident. :32) .
Figs. 89A-89C: la Fig. 89A representa una secuencia de aminoácidos de Eg6 (sec. con núm. de ident. :33) de T. reesei. La secuencia de aminoácidos en negrita es la secuencia de péptidos señal prevista. La Fig. 89B representa una secuencia de aminoácidos de endoglucanasa de S. coccosporum, sec. con núm. de ident. :34; la Fig. 89C representa la secuencia de nucleótidos que codifican una GH61A de Thermoascus aurantiacus, sec. con núm. de ident. :149.
Figs. 90A-90I: la Fig. 90A representa una secuencia de aminoácidos de Afu7A (sec. con núm. de ident. :150), un homólogo de CBHl de T. reesei. La Fig. 90B representa una secuencia de aminoácidos de Afu7B (sec. con núm. de ident. :151) , un homólogo de CBHl de G. reesei. La Fig. 90C representa una secuencia de aminoácidos de Cg7A (sec. con núm. de ident.:152), un homólogo de CBHl de T. reesei. La Fig. 90D representa una secuencia de aminoácidos de Cg7B (sec. con núm. de ident. :153) , un homólogo de CBHl de T. reesei. La Fig. 90E representa una secuencia de aminoácidos de Tt7A (sec. con núm. de ident. :154) , un homólogo de CBHl de T. reesei. La Fig. 90F representa una secuencia de aminoácidos de Tt7B (sec. con núm. de ident. :155) , un homólogo de CBHl de T. reesei. La Fig. 90G representa una secuencia de aminoácidos de St6A (sec. con núm. de ident. :156) , un homólogo de CBH2 de T. reesei. La Fig. 90H representa una secuencia de aminoácidos de St6B (sec. con núm. de ident.:157), un homólogo de CBH2 de T. reesei. La Fig. 901 representa una secuencia de aminoácidos de Tt6A (sec. con núm. de ident.:158), un homólogo de CBH2 de T. reesei .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que comprende comúnmente una persona con experiencia en la técnica a la que pertenece la presente invención. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2.° ED . , John Wiley and Sons, New York (1994) y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan al experto en la técnica un diccionario general de muchos de los términos usados en esta invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente descripción puede usarse en la práctica de la presente invención, se describen los métodos y materiales preferidos. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. La invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos ya que estos pueden variar.
Los encabezados en la presente descripción se proporciona no limitan los diversos aspectos o modalidades de la invención que se pueden usar como referencia para la especificación en general. Por lo tanto, los términos definidos más abajo se definen con mayor detalle en referencia a la especificación en general.
La presente descripción proporciona composiciones que comprenden un polipéptido que tiene actividad de la familia glicosil hidrolasa 61 ( "GH61" ) /endoglucanasa, polipéptidos que tienen actividad de GH61/endoglucanasa, nucleótidos que codifican un polipéptido proporcionado en la presente descripción, vectores que contienen nucleótidos en la presente descripción se proporciona y células que contienen nucleótidos y/o vectores en la presente descripción se proporciona. La presente descripción proporciona, además, métodos para hidrolizar un material de biomasa y métodos para reducir la viscosidad de una mezcla que contiene biomasa con el uso de una composición proporcionada en la presente descripción .
El término "aislado" , como se usa en la presente descripción con respecto a ácidos nucleicos, tal como ADN o AR , se refiere a moléculas separadas de otros ADN o ARN, respectivamente, que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Además, "ácido nucleico aislado" incluye fragmentos de ácido nucleico que no son fragmentos de origen natural y que podrían no encontrarse en estado natural . Además, el término "aislado" se usa en la presente descripción para referirse a polipéptidos que se aislan de otras proteínas celulares y abarca polipéptidos purificados y recombinantes . El término "aislado", como se usa en la presente descripción, se refiere, además, a un ácido nucleico o polipéptido que puede estar prácticamente libre de material celular, material viral o medio de cultivo cuando se produce por medio de técnicas de ADN recombinante . El término "aislado", como se usa en la presente descripción, se refiere, además, a un ácido nucleico o polipéptido que puede estar prácticamente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetiza químicamente.
Como se usa en la presente descripción, una "variante" del polipéptido X se refiere a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido X con uno o más residuos de aminoácidos alterados. La variante puede tener cambios conservativos o no conservativos. La guía para determinar qué residuos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o eliminarse sin afectar la actividad biológica puede encontrarse con el uso de programas de computadora conocidos en la técnica, por ejemplo, el programa LASERGENE (DNASTAR) . Una variante de la invención incluye polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos alteradas en comparación con una secuencia de aminoácidos de enzimas precursoras, en donde la enzima variante retiene la naturaleza celulósica característica de la enzima precursora, pero puede tener propiedades alteradas, por ejemplo, en 7 algunos aspectos específicos, por ejemplo, un pH óptimo incrementado o reducido, una estabilidad oxidativa incrementada o reducida; una estabilidad térmica incrementada o reducida y un nivel incrementado o reducido de actividad específica con respecto a uno o más sustratos, en comparación con la enzima precursora.
Como se usa en la presente descripción, un polipéptido o ácido nucleico que es "heterólogo" a una célula hospedera se refiere a un polipéptido o ácido nucleico que no se produce de manera natural en una célula hospedera.
La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente descripción incluye (y describe) variaciones dirigidas a ese valor o parámetro propiamente dicho. Por ejemplo, la descripción que indica "aproximadamente X" incluye la descripción de "X" .
Como se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un/una" y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Se entiende que los aspectos y variaciones de los métodos y composiciones descritas en la presente descripción incluyen los aspectos y variaciones "que consiste en" y/o "que consiste prácticamente en" .
Polipéptidos La descripción proporciona polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes) que tienen actividad de GH61/endoglucanasa. Por ejemplo, la presente descripción proporciona endoglucanasas de GH61 de varias especies o variantes de estas, polipéptidos de endoglucanasa IV (o endoglucanasa 4) (descritos, además, en la presente descripción como "Eg4" o "EG4", que se usan indistintamente en la presente descripción) de varias especies o variantes de estas y polipéptidos de Eg4 de Trichoderma reesei o variantes de este. En algunos aspectos, el polipéptido está aislado.
Enzimas de la familia glicósido hidrolasa 61 ("GH61") Las enzimas de la familia glicósido hidrolasa 61 ("GH61", por sus siglas en inglés) se han identificado en Eukaryota. Se ha observado una actividad de endoglucanasa débil para Cel61A de Hypocrea jecorina (Karlsson et al, Eur J Biochem, 2001, 268 (24) : 6498-6507) y, por lo tanto, se dice que este tiene actividad de GH61/endoglucanasa . Los polipéptidos de GH61 potencian la hidrólisis enzimática de sustratos lignocelulósicos por parte de celulasas (Harris et al, 2010, Biochemistry, 49(15) 3305-16). Los estudios sobre polipéptidos homólogos implicados en la degradación de quitina prevén que los polipéptidos de GH61 pueden usar un mecanismo de hidrólisis oxidativa que requiere un sustrato donante de electrones y en el cual están implicados los iones de metales divalentes (Vaaj e-Kolstad, 2010, Science, 330(6001), 219-22) . Esto concuerda con la observación de que el efecto sinérgico de los polipéptidos de GH61 en la degradación del sustrato lignocelulosico depende de los iones divalentes (Harris et al, 2010, Biochemistry, 49(15) 3305-16) . Varias estructuras de polipéptidos de GH61 disponibles tienen átomos divalentes unidos por un número de residuos de aminoácidos conservados (Karkehabadi , 2008, J. Mol. Biol . , 383(1) 144-54; Harris et al, 2010, Biochemistry, 49(15) 3305-16) . Se ha reportado que los polipéptidos de GH61 tienen una estructura plana en el sitio de unión a metales que se forma por los residuos conservados y que podría estar involucrada en la unión de sustratos (Karkehabadi, 2008, J. Mol. Biol., 383 (1) , 144-54) .
La presente descripción proporciona polipéptidos que tienen actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, polipéptido aislado) que pueden ser una endoglucanasa de GH61 o endoglucanasa IV ("EG IV") de varias especies o pueden ser, además, un polipéptido de varias especies que se corresponde (comparte homología, comparte dominios funcionales, comparte uno o más de un motivo de GH61 y/o comparte residuos conserva ivos) con una endoglucanasa de GH61 (por ejemplo, un polipéptido de Eg4 de Trichoderma reesei) . Tales especies incluyen Trichoderma, Humicola , Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus, Pyricularia, Chrysosporium, Aspergillus awa ori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Neurospora intermedia, Penicillium purpurogenum, Penicillium canescens, Penicillium solitum, Penicillium funiculosum Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radíate, Pleurotus eryngii , Talaromyces flavus, Thielavia terrestris, Trametes villosa , Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Geosmithia emersonii o G. stearothermophilus .
Los polipéptidos que tienen actividad de GH6l/endoglucanasa incluyen varias endoglucanasas de GH61 enumeradas en las Figs . 1A-1E. Por ejemplo, las endoglucanasas de GH61 adecuadas incluyen aquellas que comprenden secuencias de aminoácidos que son por lo menos aproximadamente 60 % idénticas a las diversas secuencias enumeradas en las Figs. 1A-1E que incluyen, por ejemplo, aquellas representadas por su núm. de registro en GenBank CAB97283.2, CAD70347.1, CAD21296.1, CAE81966.1, CAF05857.1, EAA26873.1, EAA29132.1, EAA30263.1, EAA33178.1, EAA33408.1, EAA34466.1, EAA36362.1, EAA29018.1 y EAA29347.1 o St61 de S. thermophilum 24630, St61A de S. thermophilum 23839c, St61B de S. thermophilum 46583, St61D de S. thermophilum 80312, Afu61a de A. fumigatus Afu3g03870 (núm. de ref. de NCBI : XP_748707) , una endoglucanasa con el núm. de ref. de NCBI: XP 750843.1 de A. fumigatus Afu6g09540, una endoglucanasa de A. fumigatus EDP47167, una endoglucanasa de T. terrestris 16380, una endoglucanasa de G. terrestris 155418, una endoglucanasa de T. terrestris 68900, Cg61A (núm. de registro EAQ86340.1) de C. glojbosum, Eg7 de T. reesei, Eg4 de T. reesei y una endoglucanasa con el núm. de registro en GenBank XP_752040 de A. fumigatus Af293. En algunos aspectos, un polipéptido de endoglucanasa de GH61 adecuado de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 60 % (po.r ejemplo, por lo menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %) de identidad de secuencia con cualquiera de las sec. con núms . de ident.: 1-29 y 148. En algunos aspectos, un polipéptido de endoglucanasa de GH61 adecuado de la invención comprende uno o más de los motivos de secuencias de aminoácidos seleccionados de: (1) las sec. con núms. de ident. :84 y 88; (2) las sec. con núms. de ident. :85 y 88; (3) la sec. con núm. de ident. :86; (4) la sec. con núm. de ident. :87; (5) las sec. con núms. de ident. :84, 88 y 89; (6) las sec. con núms. de ident. :85, 88 y 89; (7) las sec. con núms. de ident.: 84, 88 y 90; (8) las sec. con núms. de ident.: 85, 88 y 90; (9) las sec. con núms. de ident. :84, 88 y 91; (10) las sec. con núms. de ident.: 85, 88 y 91; (11) las sec. con núms. de ident.: 84, 88, 89 y 91; (12) las sec. con núms. de ident.: 84, 88, 90 y 91; (13) las sec. con núms. de ident.: 85, 88, 89 y 91: y (14) las sec. con núms. de ident.: 85, 88, 90 y 91. El polipéptido puede tener una longitud de por lo menos 100 (por ejemplo, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 200, 220, 250 o más) residuos.
Los polipéptidos que tienen actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, polipéptido aislado) que se proveen en la presente descripción pueden ser, además, una variante de una endoglucanasa de GH61, por ejemplo, cualquiera de los polipéptidos con las secuencias de aminoácidos que se muestran en las Figs . lA-lEde la presente descripción. Por ejemplo, las endoglucanasas de GH61 adecuadas incluyen aquellas que están representadas por los números de registro en GenBank CAB97283.2, CAD70347.1, CAD21296.1, CAE81966.1, CAF05857.1, EAA26873.1, EAA29132.1, EAA30263.1, EAA33178.1, EAA33408.1, EAA34466.1, EAA36362.1, EAA29018.1 y EAA29347.1 o St61 de S. thermophilum 24630, St61A de S. thermophilum 23839c, St61B de S. thermophilum 46583, St61D de S. thermophilum 80312, Afu61a de A. fumigatus Afu3g03870 (núm. de ref . de NCBI : XP^748707) , una endoglucanasa con núm. de ref. de NCBI: XP_750843.1 de A. fumigatus Afu6g09540, una endoglucanasa de A. fumigatus EDP47167, una endoglucanasa de T. terrestris 16380, una endoglucanasa de T. terrestris 155418, una endoglucanasa de T. terrestris 68900, Cg61A (EAQ86340.1) de C. globosum, Eg7 de T. reesei, Eg4 de T. reesei y una endoglucanasa con el núm. de registro en GenBank: XP_752040 de A. fumigatus Af293. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, polipéptido aislado) es una variante de EG IV. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, polipéptido aislado) es una variante de una endoglucanasa de GH61, en donde la variante tiene una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 60 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las sec. con núms . de ident.: 1-29 y 148.
Se realizó un alineamiento con el uso de las secuencias de aminoácidos sec. con núms. de ident.: 1-29 y 148 y el resultado del alineamiento se muestra en las Figs. 3A-3L. Las Figs. 2A-2D muestran los resultados del porcentaje de identidad y divergencia a partir de la comparación de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos . El alineamiento indicó que los polipéptidos de endoglucanasa de GH61 comparten ciertos motivos de secuencias y los motivos se muestran en la Fig. 7 de la presente descripción.
En consecuencia, la presente descripción proporciona polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos aislados, sintéticos o recombinan es) que tienen actividad de GH61/endoglucanasa, que puede ser una endoglucanasa de GH61 o una variante de esta, y la variante puede comprender por lo menos un motivo (por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) seleccionado de las sec. con núms. de ident. :84-91. Cada una de las "a" en los motivos con las sec. con núms. de ident. :84-91 (descritas en la Fig. 7) representa un aminoácido que puede ser alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina o valina. Por ejemplo, en algunos aspectos, la descripción proporciona polipéptidos (por ej mplo, polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes) que comprenden por lo menos un motivo de secuencia, tal como por lo menos una (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) de las sec. con núms . de ident . : 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 y 91. En algunos aspectos, la descripción proporciona polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos aislados, sintéticos o recombinantes) que comprenden uno o más de los motivos de secuencias seleccionados del grupo que consiste en: (1) las sec. con núms. de ident. : 84 y 88; (2) las sec. con núms. de ident. :85 y 88; (3) la sec. con núm. de ident. :86; (4) la sec. con núm. de ident. :87; (5) las sec. con núms. de ident. :84, 88 y 89; (6) las sec. con núms. de ident. :85, 88 y 89; (7) las sec. con núms. de ident.: 84, 88 y 90; (8) las sec. con núms. de ident.: 85, 88 y 90; (9) las sec. con núms. de ident. :84, 88 y 91; (10) las sec. con núms. de ident.: 85, 88 y 91; (11) las sec. con núms. de ident.: 84, 88, 89 y 91; (12) las sec. con núms. de ident.: 84, 88, 90 y 91; (13) las sec. con núms. de ident.: 85, 88, 89 y 91: y (14) las sec. con núms. de ident.: 85, 88, 90 y 91 en una región de por lo menos aproximadamente 10, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325 o 350 residuos o en toda la longitud completa del polipéptido inmaduro, el polipéptido maduro de longitud completa, la longitud total del dominio conservado y/o el CBM de longitud completa. El dominio conservado puede ser un dominio catalítico ("CD", por sus siglas en inglés) previsto. Los polipéptidos ilustrativos incluyen, además, fragmentos con una longitud de por lo menos aproximadamente 10, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 o 600 residuos. Los fragmentos pueden comprender un dominio conservado y/o un CBM. Cuando un fragmento comprende un dominio conservado y un CBM de una enzima, el fragmento incluye, opcionalmente , un conector que los separa. El conector puede ser un conector nativo o un conector heterólogo. En algunos aspectos, el polipéptido tiene actividad de GH61/endoglucanasa .
En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa es una endoglucanasa de GH61 o una variante de esta, una enzima que comprende cualquiera de las sec. con núms . de ident . : 1-29 y 148 o una variante de estas, una EG IV o una variante de esta o un Eg4 de T. reesei o una variante de este. Una variante descrita en la presente descripción tiene actividad de endoglucanasa. El polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (que incluye una variante) puede comprender un dominio de CBM (por ejemplo, dominio de CBM funcional) . El polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (que incluye una variante) puede comprender un dominio catalítico (por ejemplo, dominio catalítico funcional) .
Eg4 de T. reesei es un polipéptido de endoglucanasa de GH61. La secuencia de aminoácidos de Eg4 de T. reesei (sec. con núm. de ident . :27) se muestra en las Figs . 1A-7E, 4B y 5. La sec. con núm. de ident. :27 es la secuencia del Eg4 de T. reesei inmaduro. Eg4 de T. reesei tiene una secuencia señal prevista correspondiente a los residuos de 1 a 21 de la sec. con núm. de ident. 27 (subrayada); se prevé que el clivaje de la secuencia señal producirá un polipéptido maduro con una secuencia que corresponde a los residuos 22 a 344 de la sec. con núm. de ident.: 27. Los dominios conservados previstos corresponden a los residuos 22-256 y 307-343 de la sec. con núm. de ident. :27, el último es el dominio de unión a carbohidratos (CBM) previsto. Se demostró que Eg4 de T. reesei tiene actividad de endoglucanasa, por ejemplo, en un ensayo enzimático con el uso de carboximetilcelulosa como sustrato Una persona con experiencia en la técnica conoce, además, los métodos para medir la actividad de endoglucanasa.
La descripción proporciona, además, una variante del polipéptido de Eg4 de Trichoderma reesei que puede comprender una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente 60 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 65 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad de secuencia con por lo menos aproximadamente 50 (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 o 300) residuos de aminoácidos contiguos entre los residuos 22 a 344 de la sec . con núm. de ident.:27. Por ejemplo, la descripción proporciona variantes del polipéptido de Eg4 de T. reesei . Las variantes pueden tener por lo menos aproximadamente 70 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92.5 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad con los residuos 22 a 344 de la sec. con núm. de ident.:27. El polipéptido o una variante de este puede estar aislado. El polipéptido o una variante de este pueden tener actividad de endoglucanasa .
Se previo que los residuos de Eg4 de T. reesei H22, H107, H184, Q193 y Y195 funcionaban como residuos coordinadores de metales; se previo que los residuos D61 y G63 eran residuos de superficie conservados; y se previo que el residuo Y232 estaba implicado en la actividad, en base a un alineamiento de secuencias de aminoácidos de una cantidad de endoglucanasas conocidas, por ejemplo, una endoglucanasa de T. terrestris (núm. de registro ACE10234, mencionada, además, como "TtEG" en la presente descripción) (sec. con núm. de ident.:29) y otra endoglucanasa Eg7 (núm. de registro ADA26043.1) de T. reesei (mencionada, además, como "TrEGb" o "TrEG7" en la presente descripción) , con Eg4 de T. reesei (ver, la Fig. 5) . Los residuos conservados previstos en Eg4 de T. reesei se muestran en las Figs. 6A y 6B. Una variante del polipéptido de Eg4 de T. reesei puede estar inalterado en comparación con un Eg4 de T. reesei nativo, en los residuos H22, H107, H184, Q193, Y195, D61, G63 y Y232. Una variante del polipéptido de Eg4 de T. reesei puede estar inalterada en por lo menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de los residuos de aminoácidos conservados entre TrEGb, TtEG y Eg4 de T. reesei, tal como se muestra en el alineamiento de la Fig. 5. Una variante del polipéptido de Eg4 de T. reesei puede comprender los dominios conservados previstos completos del Eg4 de T. reesei nativo. Ver las Figs. 5 y 6A-6B. Una variante ilustrativa del polipéptido de Eg4 de T. reesei comprende una secuencia que tiene por lo menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de Eg4 de T. reesei madura que se muestra en la Fig. 4B (por ejemplo, residuos 22 a 344 de la sec . con núm. de ident.:27) . En algunos aspectos, la variante del polipéptido de Eg4 de T. reesei tiene actividad de endoglucanasa (por ejemplo, endoglucanasa IV (EGIV) ) .
En algunos aspectos, una variante del polipéptido de Eg4 de T. reesei tiene actividad de endoglucanasa y comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident . :27 o con los residuos (i) 22-255, (ii) 22-343, (iii) 307-343, (iv) 307-344 o (v) 22-344 de la sec. con núm. de ident. :27.
En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende residuos que corresponden a por lo menos aproximadamente 3 residuos (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, lio 12) de H22, D61, G63, C77, H107, R177, E179, H184, Q193, C198, Y195 y Y232 de la sec. con núm. de ident. :27. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende residuos que corresponden a H22, D61, G63, C77, H107, R177, E179, H184, Q193, C198, Y195 y Y232 de la sec. con núm. de ident. :27. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende residuos que corresponden a por lo menos 3 residuos (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19) de G313, Q314, C315, G316, G317, S321, G322, P323, T324, C326, A327, T331, C332, N336, Y338, Y339, Q341, C342 y L343 de la sec. con núm. de ident..-27. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende residuos que corresponden a G313, Q314, C315, G316, G317, S321, G322, P323, T324, C326, A327, T331, C332, N336, Y338, Y339, Q341, C342 y L343 de la sec. con núm. de ident. :27. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende un dominio de CBM (por ejemplo, dominio de CBM funcional). En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende un dominio catalítico (por ejemplo, dominio catalítico funcional) . El polipéptido tiene, adecuadamente, actividad de endoglucanasa.
Una variante de endoglucanasa de GH61, una endoglucanasa que comprende cualquiera de las sec. con núms . de ident.:l-29 y 148, una EG IV o un polipéptido de Eg4 de Trichoderma reesei se puede preparar con el uso de sustitución de aminoácidos. Las sustituciones conservativas se muestran en la tabla incluida más abajo bajo el encabezamiento de "sustituciones conservativas" . Las sustituciones pueden ser, además, una sustitución ilustrativa que se muestra en la siguiente tabla.
Tabla 1. Sustituciones de aminoácidos.
Las modificaciones sustanciales en las propiedades enzimáticas del polipéptido se obtienen por medio de la selección de sustituciones que difieren significativamente en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos en base a las propiedades comunes de las cadenas laterales : (1) no polares: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) polares sin carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídicos (de carga negativa) : Asp, Glu; (4) básicos (de carga positiva) : Lys, Arg; (5) residuos que afectan la orientación de la cadena: Gly, Pro; y (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe, His.
Las sustituciones no conservativas se realizan por el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del polipéptido puede sustituirse, además, generalmente, con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar la reticulación anormal. Por el contrario, puede añadirse uno o varios enlaces de cisteína al polipéptido para mejorar su estabilidad.
En algunos aspectos, un polipéptido (por ejemplo, polipéptido aislado, sintético o recombinante) que tiene actividad de GH61/endoglucanasa es un polipéptido de fusión o quimérico que incluye un dominio de un polipéptido de la presente descripción unido a uno o más segmentos de fusión que son, típicamente, heterólogos al polipéptido (por ejemplo, derivados de una fuente diferente al polipéptido de la descripción) . Los segmentos de fusión o quiméricos adecuados incluyen, pero no se limitan a, segmentos que pueden mejorar la estabilidad de un polipéptido, proporcionar otra actividad biológica deseable o niveles mejorados de actividad biológica deseable y/o facilitar la purificación del polipéptido (por ejemplo, por medio de cromatografía por afinidad) . Un segmento de fusión adecuado puede ser un dominio de cualquier tamaño que tiene la función deseada (por ejemplo, imparte una mayor estabilidad, solubilidad, acción o actividad biológica; y/o simplifica la purificación de un polipéptido) . Un polipéptido de fusión o híbrido de la invención puede construirse a partir de dos o más segmentos de fusión o quiméricos, cada uno de los cuales o por lo menos dos de los cuales se derivan de una fuente de microorganismos diferente. Los segmentos de fusión o híbridos pueden unirse a terminales amino y/o carboxilo del dominio o dominios de un polipéptido de la presente descripción. Los segmentos de fusión pueden ser sensibles al clivaje. Esta sensibilidad puede proporcionar cierta ventaja, por ejemplo, puede permitir la recuperación directa del polipéptido de interés. Los polipéptidos de fusión se pueden producir por medio del cultivo de una célula recombinante transfectada con un ácido nucleico de fusión que codifica un polipéptido, que incluye un segmento de fusión unido al extremo terminal carboxilo o amino o segmentos de fusión unidos a los extremos terminales carboxilo y amino, de una proteína o un dominio de esta.
Por consiguiente, los polipéptidos de la presente descripción incluyen, además, productos de expresión de fusiones génicas (por ejemplo, una forma sobreexpresada, soluble y activa del producto de expresión) o genes mutagenizados (por ejemplo, genes que tienen modificaciones de codones para mejorar la transcripción y traducción génica) y de genes truncados (por ejemplo, genes en los cuales se eliminaron secuencias señal o se sustituyeron por una secuencia señal heteróloga) .
Las glicosil hidrolasas que usan sustratos insolubles son, frecuentemente, enzimas modulares. Estas pueden comprender módulos catalíticos unidos a uno o más dominios de unión a carbohidratos (CBM) no catalíticos. Se piensa que los CBM promueven naturalmente la interacción de la glicosil hidrolasa con su polisacárido del sustrato objetivo. Por lo tanto, la descripción proporciona enzimas quiméricas con especificidad del sustrato alterada, que incluyen, por ejemplo, enzimas quiméricas que tienen sustratos múltiples como resultado de los CBM heterólogos "empalmados" . Los CBM heterólogos de las enzimas quiméricas de la descripción pueden diseñarse, además, de modo que sean modulares y se unan a un módulo catalítico o dominio catalítico (un "CD" , por ejemplo, en un sitio activo) que puede ser, además, heterologo u homólogo a la glicosil hidrolasa.
Por lo tanto, la descripción proporciona péptidos y polipéptidos que consisten en o comprenden módulos CBM/CD, que pueden aparearse o unirse homólogamente para formar pares CBM/CD quiméricos (heterólogos) . Por lo tanto, estos polipéptidos/péptidos quiméricos pueden usarse para mejorar o alterar el desempeño de una enzima de interés.
En algunos aspectos, se proporciona un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa, que comprende por lo menos un CD y/o CBM de cualquiera de los polipéptidos con las secuencias que se muestran en las Figs. 1A-1E de la presente descripción. Por ejemplo, los polipéptidos de endoglucanasa de GH61 adecuados de las Figs. 1A-1E incluyen aquellos representados por los núms . de registro en GenBank CAB97283.2, CAD70347.1, CAD21296.1, CAE81966.1, CAF05857.1, EAA26873.1, EAA29132.1, EAA30263.1, EAA33178.1, EAA33408.1, EAA34466.1, EAA36362.1, EAA29018.1 y EAA29347.1 o St61 de S. thermophilum 24630, St61A de S. ther ophilum 23839c, St61B de S. thermophilum 46583, St61D de S. thermophilum 80312, Afu61a de A. fumigatus Afu3g03870 (núm. de ref. de NCBI : XP_748707) , una endoglucanasa con el núm. de ref. de NCBI: XP_750843.1 de A. fumigatus Afu6g09540, una endoglucanasa de A. fumigatus EDP47167, una endoglucanasa de T. terrestris 16380, una endoglucanasa de T. terrestris 155418, una endoglucanasa de T. terrestris 68900, Cg61A (EAQ86340.1) de C. globosum, Eg7 de T. reesei, Eg4 de T. reesei y una endoglucanasa con el núm. de registro en GenBank: XP_752040 de A. fumigatus Af293. El polipéptido puede ser, adecuadamente, un polipéptido de fusión que comprende dominios funcionales de dos o más polipéptidos diferentes (por ejemplo, un CBM de un polipéptido unido a un CD de otro polipéptido) .
Los polipéptidos de la descripción pueden obtenerse y/o usarse, adecuadamente, en una forma "prácticamente pura" . Por ejemplo, un polipéptido de la descripción constituye por lo menos aproximadamente 80 % en peso (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 85 % en peso, 90 % en peso, 91 % en peso, 92 % en peso, 93 % en peso, 94 % en peso, 95 % en peso, 96 % en peso, 97 % en peso, 98 % en peso o 99 % en peso) de la proteína total en una composición determinada que incluye, además, otros ingredientes, tales como un regulador o solución.
Además, los polipéptidos de la descripción pueden obtenerse y/o usarse, adecuadamente, en caldos de cultivo (por ejemplo, un caldo de cultivo fúngico filamentoso) . El caldo de cultivo puede ser una composición enzimática diseñada por ingeniería genética, por ejemplo, el caldo de cultivo puede producirse por medio de una célula hospedera recombinante diseñada por ingeniería genética para expresar un polipéptido heterólogo de la descripción o por medio de una célula hospedera recombinante diseñada por ingeniería genética para expresar un polipéptido endógeno de la descripción en cantidades mayores o menores que los niveles de expresión endógena (por ejemplo, en una cantidad que es 1, 2, 3, 4, 5 o más veces mayor o menos que los niveles de expresión endógena) . Además, los caldos de cultivo pueden producirse por medio de ciertas cepas de células hospederas "integradas" diseñadas por ingeniería genética para expresar una pluralidad de los polipéptidos de la descripción en relaciones deseadas. Ácidos nucleicos, casetes de expresión, vectores y células hospederas La descripción proporciona ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes) que codifican polipéptidos proporcionados anteriormente, por ejemplo, polipéptidos que tienen actividad de GH6l/endoglucanasa, endoglucanasa de GH61 o una variante de este, EG IV o una variante de este, Eg4 de T. reesei o una variante de este. En ciertos aspectos, la descripción proporciona ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes) que codifican un polipéptido que comprende cualquiera de las sec . con núms . de ident. : 1-29 - y 148 o un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con cualquiera de las sec. con núms. de ident. : 1-29 y 148.
En ciertos aspectos, la descripción proporciona ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes) que codifican cualquiera de los polipéptidos que tienen actividad de GH61/endoglucanasa (que incluye una variante de una endoglucanasa de GH61) y que comprenden uno o más motivos de secuencia seleccionados de: (1) las sec . con núms . de ident.:84 y 88; (2) las sec. con núms . de ident.:85 y 88; (3) la sec. con núm. de ident . :86; (4) la sec. con núm. de ident. :87; (5) las sec. con núms. de ident. :84, 88 y 89; (6) las sec. con núms. de ident. :85, 88 y 89; (7) las sec. con núms. de ident.: 84, 88 y 90; (8) las sec. con núms. de ident.: 85, 88 y 90; (9) las sec. con núms. de ident. :84, 88 y 91; (10) las sec. con núms. de ident.: 85, 88 y 91; (11) las sec. con núms. de ident.: 84, 88, 89 y 91; (12) las sec. con núms. de ident.: 84, 88, 90 y 91; (13) las sec. con núms. de ident.: 85, 88, 89 y 91: y (14) las sec. con núms. de ident.: 85, 88, 90 y 91. La descripción proporciona, además, ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes) que codifican un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (que incluye una variante de una endoglucanasa de GH61) y que comprende un dominio de CBM (por ejemplo, dominio de CBM funcional) y/o un dominio catalítico (por ejemplo, dominio catalítico funcional) .
La descripción proporciona, además, ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes) que codifican variantes de un polipéptido de Eg4 de T. reesei. Las variantes pueden tener por lo menos aproximadamente 60 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 92.5 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad de secuencia con los residuos 22 a 344 de la sec. con núm. de ident.:27. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este tiene actividad de endoglucanasa . El polipéptido o una variante de este puede comprender residuos que corresponden a por lo menos aproximadamente 5 residuos (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12) de H22, D61, G63, C77, H107, R177, E179, H184, Q193, C198, Y195 y Y232 de la sec. con núm. de ident.:27. El polipéptido o una variante de este puede comprender residuos que corresponden a H22, D61, G63, C77, H107, R177, E179, H184, Q193, C198, Y195, y Y232 de la sec. con núm. de ident.:27. El polipéptido o una variante de este puede comprender residuos que corresponden a por lo menos 5 residuos (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19) de G313, Q314, C315, G316, G317, S321, G322, P323, T324, C326, A327, T331, C332, N336, Y338, Y339, Q341, C342 y L343 de la sec. con núm. de ident.:27. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende residuos que corresponden a G313, Q314, C315, G316, G317, S321, G322, P323, T324, C326, A327, T331, C332, N336, Y338, Y339, Q341, C342 y L343 de la sec. con núm. de ident . :27.
La descripción proporciona ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos aislados, sintéticos o recombinantes) que comprenden una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos aproximadamente 70 %, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 80 81 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 87 %, 88 %; 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 97 %, 98 % O 99 % o 100 % (total) de identidad con secuencia de ácido nucleico sec. con núm. de ident.:30, en una región de por lo menos aproximadamente 10, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 o 1050 nucleótidos. En algunos aspectos, la descripción proporciona ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos que se proporcionan en la presente invención. Además, en la presente invención se proporciona ácidos nucleicos aislados que tienen por lo menos aproximadamente 80 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 85 %, 88 %, 90 %, 92.5 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad con la sec. con núm. de ident. :30.
En algunos aspectos, se proporciona un ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico aislado, sintético o recombinante) que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident. :27 o los residuos (i) 22-255, (ii) 22-343, (iii) 307-343, (iv) 307-344 o (v) 22-344 de la sec. con núm. de ident.:27. En algunos aspectos, se proporciona un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico aislado, sintético o recombinante) que tiene por lo menos 70 % (por ejemplo, por lo menos 70 %, 75 %, 80 g, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % , 96 % , 97 %, 98 %, 99 % o más) de identidad de secuencia con la sec . con núm. de ident.:30 o un ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones de rigurosidad alta a un complemento de la sec. con núm. de ident. :30 o a un fragmento de esta. Como se usa en la presente descripción, el término "se híbrida en condiciones de rigurosidad baja, de rigurosidad media, de rigurosidad alta o de rigurosidad muy alta" describe condiciones para hibridación y lavado. La guía para realizar reacciones de hibridación puede encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6. Los métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia, y se puede usar cualquier método. Las condiciones de hibridación específicas mencionadas en la presente descripción son las siguientes: 1) condiciones de hibridación de rigurosidad baja en cloruro de sodio 6X/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido de dos lavados en SSC 0.2X, SDS al 0.1 % por lo menos a 50 °C (la temperatura de los lavados se puede incrementar a 55 °C para condiciones de rigurosidad baja) ; 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en SSC 6X a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en SSC 0.2X, SDS al 0.1 % a 60 °C; 3) condiciones de hibridación de rigurosidad alta en SSC 6X a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en SSC 0.2.X, SDS al 0.1 % a 65 °C y, preferentemente, 4) condiciones de hibridación de rigurosidad muy alta son fosfato de sodio 0.5 M, SDS al 7 % a 65 °C, seguido de uno o más lavados a SSC 0.2 X, SDS al 1 % a 65 °C. Se prefieren las condiciones de rigurosidad muy alta (4) , a menos que se especifique lo contrario.
La descripción proporciona, además, casetes de expresión y/o vectores que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente. El ácido nucleico que codifica un polipéptido tal como una enzima de la descripción se puede unir operativamente a un promotor. Específicamente, cuando se desea obtener la expresión recombinante en un huésped fúngico filamentoso el promotor puede ser un promotor fúngico filamentoso. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden estar controlados por promotores heterólogos. Los ácidos nucleicos pueden expresarse, además, bajo el control de promotores constitutivos o inducibles. Los ejemplos de promotores que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, un promotor de celulasa, un promotor de xilanasa, el promotor 1818 (identificado anteriormente como una proteína altamente expresada por mapeo de EST de Trichoderma) . Por ejemplo, el promotor puede ser, adecuadamente, un promotor de celobiohidrolasa, endoglucanasa o ß-glucosidasa . Un promotor particularmente adecuado puede ser, por ejemplo, un promotor de celobiohidrolasa, endoglucanasa o ß-glucosidasa de T. reesei. Por ejemplo, el promotor es un promotor de celobiohidrolasa I (cbhl) . Los ejemplos no limitantes de promotores incluyen un promotor de cbhl, cbh2, egll, egl2, egl3, egl4, egl5, pkil, gpdl , xynl, o xyn2. Otros ejemplos no limitantes de promotores incluyen un promotor de T. reesei cbhl, cbh2 , egll, egl2, egl3 , egl4 , egl5, pkil, gpdl, xynl o xyn2.
Como se usa en la presente descripción, el término "unida operativamente" significa que la secuencia de nucleótidos seleccionada (por ejemplo, que codifica un polipéptido descrito en la presente descripción) está próxima a un promotor para permitir que el promotor regule la expresión del ADN seleccionado. Además, el promotor está corriente arriba de la secuencia de nucleótidos seleccionada en términos de la dirección de transcripción y traducción. "Unida operativamente" significa que una secuencia de nucleótidos y una o más secuencias reguladoras están conectadas de tal manera que permiten la expresión génica cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras de transcripción) están unidas a la secuencia o secuencias reguladoras.
La presente descripción proporciona, además, células hospederas que contienen cualquiera de los vectores de polinucleótidos o casetes de expresión descritos en la presente descripción. La presente descripción proporciona, además, células hospederas que pueden usarse para expresar uno o más polipéptidos de la descripción. Las células hospederas adecuadas incluyen células de cualquier microorganismo (por ejemplo, células de una bacteria, un protista, un alga, un hongo (por ejemplo, una levadura u hongo filamentoso) u otro microbio) y son, preferentemente, células de una bacteria, una levadura o un hongo filamentoso.
Las células hospederas adecuadas de los géneros de bacterias incluyen, pero no se limitan a, células de Escherichia, Bacillus, LactoBacillus, Pseudomonas y Streptomyces. Las células adecuadas de especies bacterianas incluyen, por ejemplo, células de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, LactoBacillus brevis, Pseudomonas aeruginosa o Streptomyces lividans.
Las células hospederas adecuadas de los géneros de levadura incluyen, pero no se limitan a, células de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia, Kluyvero yces y Phaffia. Las células de especies de levadura adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida albicans, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, P. canadensis , Kluyveromyces marxianus y Phaffia rhodozyma.
Las células hospederas adecuadas de hongos filamentosos incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina. Las células de géneros fúngicos filamentosos adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysoporium, Coprinus, Coriolus, Corynascus, Chaertomium, ¦ Cryptococcus, Filobasidium, Fusarium, Gibberella, Humicola , Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Mucor, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Scytaldium, Schizophyllum, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thíelavia, Tolypocladium, Trametes y Trichoderma. Las células adecuadas de especies fúngicas filamentosas incluyen, pero no se limitan a, células de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus , Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Fusarium bactridioides , Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides , Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Neurospora intermedia, Penicillium purpurogenu , Penicillium canescens, Penicillium solitum, Penicillium funiculosum Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radíate, Pleurotus eryngii, Talaromyces flavus, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei y Trichoderma viride.
La descripción proporciona una célula hospedera, por ejemplo, una célula hospedera fúngica recombinante o un hongo filamentoso recombinante diseñado por ingeniería genética para expresar en forma recombinante un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) .
La presente descripción proporciona, además, una célula hospedera recombinante, por ejemplo, una célula hospedera fúngica recombinante o un microorganismo recombinante, por ejemplo, un hongo filamentoso, tal como T. reesei recombinante, diseñado por ingeniería genética para expresar en forma recombinante polipéptidos de Xyn3 de T. reesei, Bgll de T. reesei (mencionado, además, como "Tr3A" ) , Fv3A, Fv43D y Fv51A. Por ejemplo, la célula hospedera recombinante es, adecuadamente, una célula hospedera de T. reesei. El hongo recombinante es, adecuadamente, T. reesei recombinante. La descripción proporciona, por ejemplo, una célula hospedera de T. reesei diseñada por ingeniería genética para expresar en forma recombinante polipéptidos de Eg4 de T. reesei, Xyn3 de T. reesei, Bgll de T. reesei, Fv3A, Fv43D y Fv51A. Alternativamente, la presente descripción proporciona, además, una célula hospedera recombinante o un microorganismo recombinante que es, por ejemplo, una célula hospedera de Aspergillus (tales como A. oryzae, A. niger) o Aspergillus recombinante diseñado por ingeniería genética para expresar en forma recombinante los polipéptidos descritos en la presente descripción.
Además, la descripción proporciona una célula hospedera recombinante u organismo recombinante diseñado por ingeniería genética para expresar una mezcla enzimática que comprende enzimas adecuadas en relaciones adecuadas para la sacarificación. La célula hospedera recombinante es, por ejemplo, una célula hospedera fúngica o una célula hospedera bacteriana. El hongo recombinante es, por ejemplo, un hongo de T. reesei, A. oryzae, A. niger o levadura recombinante. La célula hospedera fúngica recombinante puede ser, por ejemplo, una célula de T. reesei, A. oryzae, A. niger o levadura. La célula hospedera bacteriana recombinante puede ser, por ejemplo, una célula de Bascillus subtilis o de E.Coli. El organismo bacteriano recombinante puede ser, por ejemplo, Bascillus subtilis o E.Coli. Los ejemplos de relaciones/cantidades de enzimas presentes en mezclas enzimáticas adecuadas se describen a continuación en la presente descripción.
Composiciones La descripción proporciona, además, composiciones (por ejemplo, composiciones que no son de origen natural) tales como composiciones enzimáticas que contienen celulasas y/o hemicelulasas que se pueden usar para hidrolizar material de biomasa y/o reducir la viscosidad de la mezcla de biomasa (por ejemplo, mezcla de sacarificación de biomasa que contiene enzima y sustrato) .
Las celulasas incluyen enzimas capaces de hidrolizar polímeros de celulosa (enlaces beta- 1 , 4 -glucano o beta D-glucosídicos) a glucosa, celobiosa, celooligosacáridos y similares. Tradicionalmente , las celulasas se han dividido en tres clases principales: endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ( "EG" ) , exoglucanasas o celobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) ("CBH") y ß-glucosidasas (ß -D-glucósido glucohidrolasa ; EC 3.2.1.21) ( "BG" ) (Knowles et al., 1987, Trends in Biotechnology 5 (9) : 255-261 ; Shulein, 1988, Methods in Enzymology, 160:234-242) . Las endoglucanasas actúan principalmente en las partes amorfas de la fibra de celulosa, mientras que las celobiohidrolasas son capaces, además, de degradar la celulosa cristalina. Las hemicelulasas incluyen, por ejemplo, xilanasas, ß-xilosidasas y L-a-arabinofuranosidasas .
La composición de la invención puede ser una combinación multienzimática que comprende más de una enzima. La composición enzimática de la invención puede incluir, adecuadamente, una o más enzimas adicionales derivadas de otros microorganismos, plantas u organismos. Se contemplan combinaciones de enzimas sinérgicas y métodos relacionados. La descripción incluye métodos para identificar las relaciones óptimas de las enzimas incluidas en las composiciones enzimáticas para degradar diversos tipos de biomasa lignocelulósica . Estos métodos incluyen, por ejemplo, pruebas para identificar la proporción óptima o los pesos relativos de enzimas que se incluirán en la composición enzimática de la invención para realizar la conversión eficaz de varios sustratos (por ejemplo, sustratos lignocelulósicos) en sus azúcares fermentables constituyentes.
Las paredes celulares de las plantas altas están compuestas de una variedad de componentes de polímeros de carbohidratos (CP) . Estos CP interactúan a través de medios covalentes y no covalentes y proporcionan la integridad estructural que las plantas necesitan para formar paredes celulares rígidas y resistir la presión de la rigidez. El CP principal que se encuentra en las plantas es la celulosa, que forma el esqueleto estructural de las paredes celulares. Durante la biosíntesis de la celulosa, las cadenas de poli-ß-1 , 4 -D-glucosa se autoasocian mediante enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas para formar microfibrillas de celulosa. Las microfibrillas de celulosa son, frecuentemente, de estructura irregular y contienen regiones de diversa cristalinidad. El grado de cristalinidad de las fibrillas de celulosa depende de cuán estrechamente ordenados estén los enlaces de de hidrógeno entre las cadenas de celulosa de sus componentes. Las áreas, con enlaces menos ordenados y, por lo tanto, cadenas de glucosa más accesibles, se denominan regiones amorfas. El modelo general para la despolimerización de celulosa a glucosa implica un mínimo de tres actividades enzimáticas distintas. Las endoglucanasas clivan cadenas de celulosa internamente a cadenas más cortas en un proceso que incrementa la cantidad de extremos accesibles que son más sensibles a la actividad de exoglucanasa que las cadenas de celulosa intacta. Estas exoglucanasas (por ejemplo, celobiohidrolasas) son específicas para reducir los extremos o para no reducir los extremos y liberan, en la mayoría de los casos, celobiosa, el dímero de glucosa. Después, la celobiosa que se acumula se expone al clivaje por parte de las celobiasas (por ejemplo, ß-l, 4-glucosidasas) a glucosa. La celulosa contiene solamente anhidroglucosa . En contraposición, la hemicelulosa contiene varios monómeros de azúcar diferentes. Por ejemplo, aparte de la glucosa, los monómeros de azúcar en la hemicelulosa pueden incluir, además, xilosa, mañosa, galactosa, ramnosa y arabinosa. Las hemicelulosas contienen principalmente azúcares de D-pentosa y, ocasionalmente, pequeñas cantidades de azúcares L. Típicamente, la xilosa está presente en la mayor cantidad, pero también el ácido manurónico y el ácido galacturónico suelen estar presentes. Las hemicelulosas incluyen xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano.
Las composiciones (por ejemplo, enzimas y composiciones multienzimáticas) de la descripción se pueden usar para sacarificar materiales de celulosa (por ejemplo, glucano) y/o materiales de hemicelulosa (por ejemplo, xilano, arabinoxilano y sustratos que contienen xilano o arabinoxilano) . La mezcla/composición enzimática es, adecuadamente, una composición cuyo origen no es natural.
Las composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción pueden comprender una mezcla de enzimas que hidrolizan xilano, enzimas que hidrolizan hemicelulosa y/o celulosa que incluyen por lo menos una, varias o todas las celulasas, que incluyen una glucanasa; una celobiohidrolasa ; una L-a-arabinofuranosidas ; una xilanasa; una ß-glucosidasa; y una ß-xilosidasa . La presente descripción proporciona, además, composiciones enzimáticas que pueden ser composiciones cuyo origen no es natural. Como se usa en la presente descripción, el término "composiciones enzimáticas" se refiere a: (1) una composición producida mediante la combinación de enzimas componentes, ya sea en forma de un caldo de fermentación o parcialmente o completamente aisladas o purificadas; (2) una composición producida por un organismo modificado para expresar una o más enzimas componentes; en ciertas modalidades, el organismo usado para expresar una o más enzimas componentes puede modificarse para eliminar uno o más genes; en otras modalidades, el organismo usado para expresar una o más enzimas componentes puede comprender, además, proteínas que afectan la hidrólisis de xilano, la hidrólisis de hemicelulosa y/o la hidrólisis de celulosa; (3) una composición producida por la combinación de enzimas componentes simultáneamente, en forma separada o en secuencia durante una reacción de sacarificación o fermentación; (4) una mezcla enzimática producida in situ, por ejemplo, durante una reacción de sacarificación o fermentación; (5) una composición producida de conformidad con alguno o todos los puntos (l)-(4) anteriores.
El término "caldo de fermentación" , como se usa en la presente descripción, se refiere a una preparación enzimática producida por fermentación que no se recupera y/o purifica o que se recupera y/o purifica en un nivel mínimo después de la fermentación. Por ejemplo, los cultivos microbianos se cultivan hasta la saturación y se incuban en condiciones de carbono limitado para permitir la síntesis de proteínas (por ejemplo, expresión de enzimas) . Después, una vez que la enzima o enzimas se secretan en el medio de cultivo celular se puede usar los caldos de fermentación. Los caldos de fermentación de la descripción pueden incluir un contenido fraccionado o no fraccionado de los materiales de fermentación obtenidos al final de la fermentación. Por ejemplo, los caldos de fermentación de la invención no son fraccionados y comprenden el medio de cultivo usado y los residuos celulares presentes después de que las células microbianas (por ejemplo, células fúngicas filamentosas) experimentan un proceso de fermentación. El caldo de fermentación puede contener, adecuadamente, el medio de cultivo celular usado, enzimas extracelulares y células microbianas vivas o muertas. Alternativamente, los caldos de fermentación se pueden fraccionar para eliminar las células microbianas. En esos casos, los caldos de fermentación pueden comprender, por ejemplo, el medio de cultivo celular usado y las enzimas extracelulares.
Las composiciones enzimáticas, tales como las composiciones de celulasa proporcionadas en la presente descripción, pueden ser capaces de producir por lo menos 0.1 (por ejemplo, 0.1 a 0.4) de producto de fracción tal como se determina por medio del ensayo de calcofluor. Todas las sustancias químicas usadas eran de grado analítico. Se adquirió Avicel PH-101 de FMC BioPolymer (Philadelphia, PA) . La celobiosa y el blanco de calcoflúor se adquirieron de Sigma (St. Louise, MO) . La celulosa dilatada tratada con ácido fosfórico (PASC, por sus siglas en inglés) se preparó a partir de Avicel PH-101 con el uso de un protocolo adaptado de Walseth, TAPPI 1971, 35:228 y Wood, Biochem. J. 1971, 121:353-362. En síntesis, se solubilizó Avicel en ácido fosfórico concentrado y, después, se precipitó con el uso de agua desionizada fría. Después de recolectar la celulosa y lavarla con más agua para neutralizar el pH, se diluyó hasta 1 % de sólidos en acetato de sodio 50 mM pH5. Todas las diluciones de enzimas se prepararon en un regulador de acetato de sodio 50 mM, pH5.0. La celulasa GC220 (Danisco US Inc., Genencor) se diluyó en 2.5 , 5, 10 y 15 mg de proteína/G de PASC para producir una curva de calibración lineal. Las muestras para la evaluación se diluyeron hasta ajustarse al intervalo de la curva de calibración, es decir, para obtener como respuesta de 0.1 a 0.4 de producto de fracción. Se añadió 150 µ? de PASC al 1 % frío en 20 µ? de solución enzimática en placas de microtitulación de 96 pocilios. La placa se cubrió y se incubó por 2 h a 50 °C, 200 rpm en un incubador/agitador Innova. La reacción se enfrió con 100 µ? de 50 ug/ml de calcoflúor en glicina 100 mM, HlO. La fluorescencia se leyó en un lector de microplacas de fluorescencia (SpectraMax M5 de Molecular Devices) a una longitud de onda de excitación Ex = 365 nm y longitud de onda de emisión Em = 435 nm. El resultado se expresa como el producto de fracción de acuerdo con la ecuación: FP = 1 - (muestra Fl - regulador Fl con celobiosa) / (enzima cero Fl - regulador Fl con celobiosa) , en donde FP es el producto de fracción y Fl son las unidades de fluorescencia Cualquiera de las enzimas descritas específicamente en la presente descripción se puede combinar con una o más enzimas descritas en la presente descripción o con cualquier otra enzima disponible y adecuada, para producir una mezcla/composición multienzimática apropiada. La descripción no está restringida ni limitada a las combinaciones ilustrativas específicas que se enumeran más abajo.
Composiciones ilustrativas Se proporcionan composiciones que no son de origen natural que comprenden un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa . La invención proporciona, además, una composición que no es de origen natural que comprende celulasa completa que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6 l/endoglucanasa (por ejemplo, celulasa completa enriquecida con un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa tal como endoglucanasa IV (por ejemplo, celulasa completa enriquecida con polipéptido de Eg4 de T. reesei) ) . El polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa puede ser cualquier polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa proporcionado en la presente descripción. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa es Eg4 de T. reesei o una variante de este. Una variante de Eg4 de T. reesei puede ser cualquiera de las variantes proporcionadas anteriormente.
En la presente descripción y en las figuras se hace referencia a la endoglucanasa como "Eg" o "Egl", indistintamente.
Como se usa en la presente descripción, el término "composición de origen natural" se refiere a una composición producida por una fuente de origen natural, que comprende uno o más componentes o actividades enzimáticas, en donde cada componente o actividad se encuentra en la relación y el nivel producido por la fuente de origen natural tal como se encuentra en la naturaleza, intacto, sin modificar por parte del ser humano. En consecuencia, una composición de origen natural es, por ejemplo, una composición producida por un organismo no modificado con respecto a las enzimas celulolíticas o hemicelulolíticas , de manera que las proporciones o los niveles de las enzimas componentes sean iguales a los producidos por el organismo nativo en su ambiente natural. Por otra parte, una "composición que no es de origen natural" se refiere a una composición producida por: (1) la combinación de enzimas celulolíticas o hemicelulolíticas componentes ya sea en una proporción que existe en la naturaleza o no, es decir, en una. proporción alterada; o (2) la modificación de un organismo para expresar, sobreexpresar o subexpresar una o más enzimas endógenas o exógenas; o (3) la modificación de un organismo de manera que se elimine al menos una enzima endógena. Una "composición que no es de origen natural" se refiere, además, a una composición producida por un organismo de origen natural, sin modificar, pero cultivado en un medio o ambiente artificial diferente al ambiente natural del organismo de modo que las cantidades de enzimas en la composición sean diferentes a las existentes en una composición elaborada por un organismo natural cultivado en su hábitat natural.
Cualquiera de los polipéptidos de endoglucanasa de GH61 o una variante de estos puede usarse en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción. Una endoglucanasa de GH61 adecuada puede incluir uno de los polipéptidos que se muestran en las Figs . lA-lEde la presente descripción. Las endoglucanasas de GH61 adecuadas incluyen aquellas que están representadas por los números de registro en GenBank CAB97283.2, CAD70347.1, CAD21296.1, CAE81966.1, CAF05857.1, EAA26873.1, EAA29132.1, EAA30263.1, EAA33178.1, EAA33408.1, EAA34466.1, EAA36362.1, EAA29018.1 y EAA29347.1 o St61 de S. thermophilum 24630, St61A de S. thermophilum 23839c, St61B de S. thermophilum 46583, St61D de S. thermophilum 80312, Afu61a de A. fumigatus Afu3g03870 (núm. de ref. de NCBI : XP_748707) , una endoglucanasa con el núm. de ref. de NCBI : XP_750843.1 de A. fumigatus Afu6g09540, una endoglucanasa de A. fumigatus EDP47167, una endoglucanasa de T. terrestris 16380, una endoglucanasa de T.terrestris 155418, una endoglucanasa de T.terrestris 68900, Cg61A (EAQ86340.1) de C.globosum, Eg7 de G. reesei, Eg4 de T. reesei y una endoglucanasa con el núm. de registro en GenBank: XP_752040 de A.fumigatus Af293. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, polipéptido aislado) es una variante de endoglucanasa de GH61 o EG IV.
En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (que incluye una variante de endoglucanasa de GH61) es un polipéptido que comprende cualquiera de las sec . con núms . de ident . : 1-29 y 148 o un polipéptido que comprende un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92.5 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de las sec. con núms. de ident.: 1-29 y 148. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (que incluye una variante de endoglucanasa de GH61) puede comprender por lo menos un motivo (por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) seleccionado de las sec . con núms . de ident . : 84 - 91. Puede comprender uno o más motivos de secuencia seleccionados del grupo que consiste en: (1) las sec. con núms. de ident .: 84 y 88; (2) las sec. con núms. de ident. :85 y 88; (3) la sec. con núm. de ident. :86; (4) la sec. con núm. de ident. :87; (5) las sec. con núms. de ident. :84, 88 y 89; (6) las sec. con núms. de ident. :85, 88 y 89; (7) las sec. con núms. de ident.: 84, 88 y 90; (8) las sec. con núms. de ident.: 85, 88 y 90; (9) las sec. con núms. de ident. :84, 88 y 91; (10) las sec. con núms. de ident. : 85, 88 y 91; (11) las sec. con núms. de ident. : 84, 88, 89 y 91; (12) las sec. con núms. de ident.: 84, 88, 90 y 91; (13) las sec. con núms. de ident.: 85, 88, 89 y 91: y (14) las sec. con núms. de ident.: 85, 88, 90 y 91.
En algunos aspectos de cualquiera de las composiciones o métodos descritos en la presente descripción, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (que incluye una variante de endoglucanasa GH61) puede tener por lo menos aproximadamente . 60 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %( 85 %, 88 %, 90 %, 92.5 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de identidad de secuencia con los residuos 22 a 344 de la sec. con núm. de ident. :27. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende residuos que corresponden a por lo menos aproximadamente 5 residuos (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12) de H22, D61, G63, C77, H107, R177, E179, H184, Q193, C198, Y195 y Y232 de la sec . con núm. de ident.:27. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende residuos que corresponden a H22, D61, G63, C77, H107, R177, E179, H184, Q193, C198, Y195 y Y232 de la sec. con núm. de ident.:27. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende residuos que corresponden a por lo menos 5 residuos (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19) de G313, Q314, C315, G316, G317, S321, G322, P323, T324, C326, A327, T331, C332, N336, Y338, Y339, Q341, C342 y L343 de la sec. con núm. de ident.:27. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende residuos que corresponden a G313, Q314, C315, G316, G317, S321, G322, P323, T324, C326, A327, T331, C332, N336, Y338, Y339, Q341, C342 y L343 de la sec. con núm. de ident.:27. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende un dominio de CBM (por ejemplo, dominio de CBM funcional) . En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este comprende un dominio catalítico (por ejemplo, dominio catalítico funcional) . En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este está aislado. En algunos aspectos, el polipéptido o una variante de este tiene actividad de endoglucanasa.
En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa es endoglucanasa IV, por ejemplo, un polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este. Por ejemplo, la descripción proporciona composiciones que no son de origen natural que comprenden un polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este. Una variante del polipéptido de Eg4 de T. reesei puede ser cualquiera de las variantes del polipéptido de Eg4 de G. reesei descrito en la presente descripción. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa incluye la secuencia de aminoácidos sec . con núm. de ident.:27 o los residuos 22 a 344 de la sec. con núm. de ident . :27.
En algunos aspectos, se proporciona una composición que comprende un polipéptido aislado (o prácticamente purificado) que tiene actividad de glicosil hidrolasa de la familia 61 ("GH61")/ endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) . Una persona con experiencia en la técnica conoce los métodos para producir un polipéptido, recuperar el polipéptido y aislar o purificar el polipéptido.
En algunos aspectos de cualquiera de las composiciones o métodos descritos en la presente descripción, el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) se expresa a partir de una célula hospedera, en donde el ácido nucleico que codifica el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa se ha diseñado por ingeniería genética en la célula hospedera. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) es heterólogo a la célula hospedera que expresa el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa .
La presente descripción proporciona composiciones que comprenden' un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa y comprenden por lo menos un polipéptido de celulasa y/o por lo menos un polipéptido de hemicelulasa o una mezcla de estos. En algunos aspectos, la composición comprende por lo menos un (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) polipéptido de celulasa. En algunos aspectos, el polipéptido de celulasa es un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa, un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa o un polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa. En algunos aspectos, la composición comprende por lo menos un (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) polipéptido de hemicelulasa. En algunos aspectos, el polipéptido de hemicelulasa es un polipéptido que tiene actividad de xilanasa, un polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa o un polipéptido que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa . En algunos aspectos, la composición comprende por lo menos un (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) polipéptido de celulasa y por lo menos un (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) polipéptido de hemicelulasa. Diversas cantidades del polipéptido o polipéptidos incluidos en las composiciones proporcionadas en la presente descripción se indican más abajo en la sección "Cantidad de componentes en las composiciones" .
Las celulasas y hemicelulasas para usar de conformidad con los métodos y composiciones de la descripción pueden obtenerse o producirse en forma recombinante, entre otros, a partir uno o más de los siguientes organismos: Crinipellis scapella, Macrophomina phaseolina, Myceliophthora ther ophila, Sordaria fimicola, Volutella colletotrichoides, Thielavia terrestris, Acremonium sp . , Exidia glandulosa , Fomes fomentarius, Spongipellis sp., Rhizophlyctis rosea, Rhizomucor pusillus, Phycomyces niteus, Chaetostylum fresenii , Diplodia gossypina, Ulospora bilgramii , Saccobolus dilutellus, Penicillium verruculosum, Penicillium chrysogenum, Thermomyces verrucosus, Diaporthe syngenesia, Colletotrichum lagenarium, Nigrospora sp., Xylaria hypoxylon, Nectria pinea, Sordaria macrospora, Thielavia thermophila, Chaetomium mororum, Chaetomium virscens, Chaeto ium brasiliensis, Chaetomium cunicolorum, Syspastospora boninensis, Cladorrhinum foecundissimum, Scytalidium thermophila , Gliocladium catenulatum, Fusarium oxysporum ssp. lycopersici , Fusarium oxysporum ssp. passiflora, Fusarium solani, Fusarium anguioides, Fusarium poae, Humicola nigrescens, Humicola grísea, Panaeolus retirugis, Trametes sanguínea, Schizophyllum commune, Trichothecium roseum, Microsphaeropsis sp., Acsobolus stictoideus spej . , Poronia punctata, Nodulisporum sp., Trichoderma sp. {por ejemplo, Trichoderma reesei) y Cylindrocarpon sp.
En la presente descripción, la celulasa o hemicelulasa puede prepararse a partir de cualquier método o métodos de cultivo de microorganismos conocido de modo que se produzca la expresión de enzimas capaces de hidrolizar un material celulósico. La fermentación puede incluir el cultivo en un matraz de agitación, la fermentación a pequeña o gran escala, tal como la fermentación continua, por lote alimentado o en estado sólido en termentadores de laboratorio o industriales, realizada en un medio adecuado y en condiciones que permitan la expresión o el aislamiento de la celulasa. Generalmente, se cultiva el microorganismo en un medio de cultivo celular adecuado para la producción de enzimas capaces de hidrolizar un material celulósico. El cultivo se lleva a cabo en un medio de nutrientes adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, mediante el uso de los procedimientos conocidos en la técnica. Los medios de cultivo adecuados, los intervalos de temperatura y demás condiciones adecuadas para el crecimiento y la producción de celulasa son conocidos en la técnica. Como ejemplo no limitante, el intervalo de temperatura normal para la producción de celulasas por medio de T. reesei es de 24 °C a 28 °C.
La presente descripción proporciona composiciones que no son de origen natural que comprenden un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, polipéptido de endoglucanasa IV, tal como polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este), en donde la composición comprende, además, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa) , por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa) , por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de glucosidasa (por ejemplo, ß-glucosidasa) (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de ß-glucosidasa) , por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de xilanasa (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de xilanasa) , por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de xilosidasa (por ejemplo, ß-xilosidasa) (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de ß-xilosidasa) y/o por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de arabinofuranosidasa (por ejemplo, L-a-arabinofuranosidasa) (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de L-a-arabinofuranosidasa) . Diversas cantidades del polipéptido o polipéptidos incluidos en las composiciones proporcionadas en la presente descripción se indican más abajo en la sección "Cantidad de componentes en las composiciones" .
La presente descripción proporciona composiciones que no son de origen natural que comprenden celulasa completa que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, celulasa completa enriquecida con polipéptido de endoglucanasa IV, tal como, por ejemplo, polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este), en donde la composición comprende, además, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa) , por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa) , por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de glucosidasa (por ejemplo, ß-glucosidasa) (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de ß-glucosidasa) , por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de xilanasa (por ej mplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de xilanasa) , por lo menos un polipéptido que tiene actividad de xilosidasa (por ejemplo, ß-xilosidasa) (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de ß-xilosidasa) y/o por lo menos un polipéptido que tiene actividad de arabinofuranosidasa (por ejemplo, L-a-arabinofuranosidasa) (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de L- -arabinofuranosidasa) . Diversas cantidades del polipéptido o polipéptidos incluidos en las composiciones proporcionadas en la presente descripción se indican más abajo en la sección "Cantidad de componentes en las composiciones" .
En algunos aspectos, la composición comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de xilanasa (por ejemplo, Xyn3 de T. reesei, Xyn2 de T. reesei, AfuXyn2 , AfuXyn5 o una variante de estos) . En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa es Xyn3 de T. reesei. La composición puede comprender, además, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B, Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G y/o Tn3B) . La composición puede comprender, además, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B, Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G, Tn3B y/o una variante de estos) . La composición puede comprender, además, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 de T. reesei, A. fumigatus 7A, 7B, C. globosum 7A, 7B, T. terrestris 7A, 7B, CBH2 de T. reesei, T. terrestris 6A, S. thermophile 6A, 6B o una variante de estos) . La composición puede comprender, además, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa (por ejemplo, EG1 de T. reesei (o una variante de este) y/o EG2 de T. reesei (o una variante de este) ) .
En algunos aspectos, la composición comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B, Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G, Tn3B o una variante de estos) . La composición puede comprender un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos 1 polipéptido (o por lo menos 2 polipéptidos) que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 de T. reesei, A. fumigatus 7A, 7B, C. globosum 7A, 7B, T. terrestris 7A, 7B, CBH2 de T. reesei, T. terrestris 6A, S. thermophile 6A, 6B o una variante de estos) . La composición puede comprender un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y comprende, además, por lo menos 1 polipéptido (o por lo menos 2 polipéptidos) que tiene actividad de endoglucanasa (por ejemplo, EG1 de T. reesei (o una variante de este) y/o EG2 de T. reesei (o una variante de este) ) . La composición puede comprender un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos 1 polipéptido (o por lo menos dos polipéptidos) que tiene actividad de ß-xilosidasa (por ejemplo, Fv3A, Fv43A, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A y/o Bxll de T. reesei) . La composición puede comprender un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos 1 polipéptido (o por lo menos 2 polipéptidos) que tiene actividad de ß-xilosidasa (por ejemplo, Fv3A, Fv43A, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Bxll de T. reesei y/o una variante de estos) . La composición puede comprender un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos un polipéptido (por lo menos 2 polipéptidos) que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa (por ejemplo, Af43A, Fv43B, Pf51A, Pa51A, Fv51A o una variante de estos) .
En algunos aspectos, cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente descripción (por ejemplo, polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa, polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa, polipéptido que tiene actividad de glucosidasa (por ejemplo, ß-glucosidasa) , polipéptido que tiene actividad de xilanasa, polipéptido que tiene actividad de xilosidasa (por ejemplo, ß-xilosidasa) o polipéptido que tiene actividad de arabinofuranosidasa (por ejemplo, L-a-arabinofuranosidasa) ) puede ser un componente de una celulasa completa, tal como una celulasa completa descrita en la presente descripción. Cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente descripción puede producirse por la expresión de un gen endógeno o exógeno que codifica el polipéptido o polipéptidos correspondientes. En algunos casos, el polipéptido o polipéptidos se pueden sobreexpresar o subexpresar.
Con respecto a cualquiera de las composiciones descritas anteriormente, diversas cantidades para el polipéptido o los polipéptidos incluidos en las composiciones se proporcionan más abajo en la sección "Cantidad de componentes en las composiciones" .
Polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa Un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa incluye un polipéptido que cataliza el clivaje de enlaces ß-1,4 internos. Endoglucanasa ( "EG" ) se refiere a un grupo de enzimas de celulasa clasificadas como EC 3.2.1.4. Una enzima de EG hidroliza enlaces beta-1,4 glucosídicos internos de la celulosa. La EG cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glicosídicos en celulosa, derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa) , liquenina, enlaces beta-1,4 en beta- 1,3 glucanos mezclados tales como beta-D-glucanos o xiloglucanos de cereal y otros componentes celulósicos que contienen material vegetal. La actividad de EG puede 1 determinarse con el uso de hidrólisis de carboximetilcelulosa (CMC) de conformidad con el procedimiento de Ghose, 1987, Puré and Appl . Chem. 59: 257-268. En algunos aspectos, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa incluye un polipéptido de EG1 de T. reesei (núm. de registro en GenBank HM641862.1) y/o EG2 de T. reesei (núm. de registro en GenBank ABA64553.1) .
En otro ejemplo, una endoglucanasa de T. terrestris termoestable (Kvesitadaze et al., Applied Biochem. Biotech. 1995, 50:137-143) se usa en los métodos y composiciones de la presente descripción. Además, EG3 de T. reesei (núm. de registro en GenBank AAA34213.1) (Okada et al. Appl. Environ. Microbiol. 1988, 64:555-563), EG5 (núm. de registro en GenBank AAP57754) (Saloheimo et al. Molecular Microbiology 1994, 13:219-228), EG6 (Fig. 89A) (publicación de patente de los Estados Unidos núm. 20070213249) o EG7 (núm. de registro en GenBank AAP57753) (publicación de patente de los Estados Unidos núm. 20090170181) , endoglucanasa de El de A. cellulolyticus (registro en Swiss-Prot P54583.1) (patente de los Estados Unidos núm. 5,536,655), endoglucanasa V de H. insolens (EGV) (registro en el Banco de datos de proteínas 4ENG) , endoglucanasa de 3. coccosporum (Fig. 89B) (publicación de patente de los Estados Unidos núm. 20070111278) , endoglucanasa de A. aculeatus Fl-CMC (registro en Swiss-Prot P22669.1) (Ooi et al. Nucleic Acid Res. 1990, 18:5884), endoglucanasa de CMCase-1 de A. kawachii IFO 4308 (registro en S iss-Prot Q96 Q8.1) (Sakamoto et al. Curr. Genet. 1995, 27:435-439), endoglucanasa CelS de E. carotovara (núm. de registro en GenBank AAA24817.1) (Saarilahti et al. Gene 1990, 90:9-14); o endoglucanasa de A. thermophilum ALK04245 (publicación de patente de los Estados Unidos núm. 20070148732). Otras endoglucanasas adicionales adecuadas se describen, por ejemplo, en la patente núm. WO 91/17243, patente núm. WO 91/17244, patente núm. WO 91/10732, patente de los Estados Unidos núm. 6,001,639. Un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa puede ser una variante de cualquiera de las endoglucasas proporcionadas en la presente descripción .
Polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa Un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa incluye un polipéptido que tiene actividad de 1 , 4 -D-glucano celobiohidrolasa (E.C. 3.2.1.91) que cataliza la hidrólisis de enlaces 1 , 4 -beta-D-glucosídicos en celulosa, celotetriosa o cualquier polímero que contiene beta- 1 , 4 -glucosa enlazada, de modo que se libera celobiosa de los extremos de la cadena. Para los propósitos de la presente invención, la actividad de celobiohidrolasa puede determinarse por la liberación de azúcar reductora soluble en agua a partir de celulosa, según se mide por medio del método PHBAH de Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-2 '9. Se puede hacer una distinción entre el modo de ataque" de exoglucanasa de una celobiohidrolasa y el modo de ataque de endoglucanasa por una medición similar de la liberación de azúcar reductor a partir de celulosa sustituida tal como carboximetilcelulosa o hidroxietilcelulosa (Ghose, 1987, Puré & Appl . Chem. 59: 257-268) . Una celobiohidrolasa verdadera tendrá una relación de actividad muy alta en la celulosa no sustituida comparada con la celulosa sustituida (Bailey et al, 1993, Biotechnol . Ap l. Biochem. 17: 65-76).
Los CBH adecuados pueden seleccionarse de CBH1 de A. bisporus (núm. de registro en Swiss Prot Q92400) , CBH1 de A. aculeatus (núm. de registro en Swiss Prot 059843) , CBHA de A. nidulans (núm. de registro en GenBank AF420019) o CBHB (núm. de registro en GenBank AF420020) , CBHA de A. niger (núm. de registro en GenBank AF156268) o CBHB (núm. de registro en GenBank AF156269) , CBH1 de C. purpurea (núm. de registro en Swiss Prot 000082) , CBH1 de C. carbonarum (núm. de registro en Swiss Prot Q00328) , CBH1 de C. parasítica (núm. de registro en Swiss Prot Q00548) , CBH1 de F. oxysporum (Cel7A) (núm. de registro en Swiss Prot P46238), CBH1.2 de H. grísea (núm. de registro en GenBank U50594), CBH1 de H. grísea var. thermoidea (núm. de registro en GenBank D63515) , CBHI . 2 (núm. de registro en GenBank AF123441) o exol (núm. de registro en GenBank AB003105) , Cel7B de M. albomyces (núm. de registro en GenBank AJ515705) , CBHI de N. crassa (núm. de 13 registro en GenBank X77778) , CBHI de P. funiculosum (Cel7A) (núra. de registro en GenBank AJ312295) (publicación de patente de los Estados Unidos núm. 20070148730) , CBHI de P.janthinellum (núm. de registro en GenBank S56178) , CBH de P. chrysosporium (núm. de registro en GenBank M22220) o CBHI -2 (Cel7D) (núm. de registro en GenBank L22656) , CBHIA de T. emersonii (núm. de registro en GenBank AF439935) , CBHI de T. viride (núm. de registro en GenBank X53931) o CBHI de V. volvacea V14 (núm. de registro en GenBank AF156693) . Un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa puede ser una variante de cualquiera de las CBH proporcionadas en la presente descripción.
En algunos aspectos, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa incluye un polipéptido de CBH 1 de T.reesei (registro en S iss-Prot P62694.1) (o una variante de este) y/o CBH2 de T. reesei (registro en Swiss-Prot P07987.1) (o una variante de este) . Ver Shoemaker et al. Bio/Technology 1983, 1:691-696; ver, además, Teeri et al. Bio/Technology 1983, 1:696-699, A. fumigatus 7A, 7B, C. glojosum 7A, 7B, T. terrestris 7A, 7B, que son homólogos de CBHI de T. reesei; T. terrestris 6A, S. thermophile 6A, 6B, que son homólogos de CBH2 de T. reesei o una variante de estos.
Polipéptido que tiene actividad de glucosidasa Un polipéptido que tiene actividad de glucosidasa incluye un polipéptido que tiene actividad de beta-D-glucósido glucohidrolasa (E.C. 3.2.1.21) que cataliza la hidrólisis de celobiosa con la liberación de beta-D-glucosa . Para los propósitos de la presente invención, la actividad de ß-glucosidasa puede medirse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, HPLC. Un polipéptido que tiene actividad de glucosidasa incluye miembros de ciertas familias de GH que incluyen, pero no se limitan a, miembros de las familias de GH 1, 3, 9 o 48 que catalizan la hidrólisis de celobiosa para liberar ß-D-glucosa. Un polipéptido que tiene actividad de glucosidasa incluye ß-glucosidasa tal como la ß-glucosidasa obtenida a partir de varios microorganismos, por medios recombinantes o adquirida de fuentes comerciales. Los ejemplos de ß- glucosidasas de microorganismos incluyen, pero no se limitan a, las obtenidas de bacterias y hongos. Por ejemplo, una ß-glucosidasa se obtiene adecuadamente a partir de un hongo filamentoso. En algunos aspectos, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de glucosidasa (por ejemplo, actividad de ß-glucosidasa) es un polipéptido de Bgll de T. reesei .
Las ß-glucosidasas pueden obtenerse o producirse en forma recombinante , entre otros, a partir de A. aculeatus (Kawaguchi et al. Gene 1996, 173: 287-288), A. kawachi (Iwashita et al. Appl . Environ. Microbiol . 1999, 65: 5546-5553) , A. oryzae (patente núm. O 2002/095014) , C. biazotea ( ong et al. Gene, 1998, 207:79-86), P. funiculosum (patente núm. O 2004/078919), S.fibuligera (Machida et al. Appl. Environ. Microbiol. 1988, 54: 3147-3155), S. pombe ( ood et al. Nature 2002, 415: 871-880) o T. reesei (por ejemplo, ß -glucosidasa 1 (patente de los Estados Unidos núm. 6,022,725), ß -glucosidasa 3 (patente de los Estados Unidos núm. 6,982,159), ß- glucosidasa 4 (patente de los Estados Unidos núm. 7,045,332), ß-glucosidasa 5 (patente de los Estados Unidos núm. 7,005,289), ß -glucosidasa 6 (publicación de patente de los Estados Unidos núm. 20060258554), ß-glucosidasa 7 (publicación de patente de los Estados Unidos núm. 20060258554)). Un polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa puede ser una variante de cualquiera de las ß -glucosidasas proporcionadas en la presente descripción.
La ß-glucosidasa se puede producir por la expresión de un gen endógeno o exógeno que codifica una ß-glucosidasa . Por ejemplo, la ß-glucosidasa puede ser secretada en el espacio extracelular, por ejemplo, por organismos Gram-positivos (por ejemplo, Bacillus o Actinomycetes) o por huéspedes eucariotas (por ejemplo, Trichoderma, Aspergillus, Saccharomyces o Pichia) . En algunos casos, la ß-glucosidasa se puede sobreexpresar o subexpresar.
La ß-glucosidasa puede obtenerse, además, de fuentes comerciales. Los ejemplos de preparaciones comerciales de ß- glucosidasa adecuadas para usar en la presente descripción incluyen, por ejemplo, ß-glucosidasa de T. reesei en Accellerase® BG (Danisco US Inc., Genencor) ; NOVOZYM™ 188 (una ß -glucosidasa de A. niger) ; ß -glucosidasa de Agrojbacterium sp. y ß -glucosidasa de T. marítima de Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd. , Irlanda) .
La actividad de ß-glucosidasa se puede determinar por varios medios adecuados conocidos en la técnica, tal como el ensayo descrito por Chen et al. en Biochimica et Biophysica Acta 1992, 121:54-60, en donde 1 pNPG representa 1 umoL de nitrofenol liberado a partir de 4-nitrofe??-ß-?-glucopiranosida en 10 min a 50 °C (122 °F) y pH 4.8.
Polipéptido que tiene actividad de xilanasa La actividad de xilanasa se puede medir con el uso de un ensayo colorimétrico de azo-xilano de madera de abedul (S-AXBL, Megazyme International Ireland Ltd. , Irlanda) .
Un polipéptido que tiene actividad de xilanasa puede incluir xilanasas del Grupo A seleccionadas, por ejemplo, de un polipéptido de Xyn, Xyn2 , AfuXyn2 y/o AfuXyn5 o una variante de estos.
Cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción puede comprender, opcionalmente , una o más xilanasas además de o en lugar de una o más xilanasas del Grupo A. Cualquier xilanasa (EC 3.2.1.8) se puede usár'cón la xilanasa o xilanasas adicionales. Las xilanasas adecuadas incluyen, por ejemplo, una xilanasa de C. saccharolyticum (Luthi et al. 1990, Appl . Environ. Microbiol . 56(9):2677-2683), xilanasa de T. marítima (Winterhalter & Liebel, 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61 (5) : 1810-1815) , xilanasa de la cepa de Thermatoga Sp. FJSS-B. 1 (Simpson et al. 1991, Biochem. J. 277, 413-417), xilanasa de B . circulans (BcX) (patente de los Estados Unidos núm. 5,405,769), xilanasa de A. niger (Kinoshita et al. 1995, Journal of Fermentation and Bioengineering 79 (5) :422-428) , xilanasa de S. lividans (Shareck et al. 1991, Gene 107:75-82; Morosoli et al. 1986 Biochem. J. 239:587-592; Kluepfel et al. 1990, Biochem. J. 287:45-50), xilanasa de B . subtilis (Bernier et al. 1983, Gene 26 (1) : 59-65) , xilanasa de C.fimi (Clarke et al., 1996, FEMS Microbiology Letters 139:27-35), xilanasa de P. fluorescens (Gilbert et al. 1988, Journal of General Microbiology 134:3239-3247), xilanasa de C. t ermocellum (Domínguez et al., 1995, Nature Structural Biology 2:569-576), xilanasa de B.pumilus (Nuyens et al. Applied Microbiology and Biotechnology 2001, 56:431-434; Yang et al. 1998, Nucleic Acids Res. 16 ( 14B) : 7187 ) , xilanasa de C. acetobutylicum P262 (Zappe et al. 1990, Nucleic Acids Res. 18(8):2179) o xilanasa de T. harzianum (Rose et al. 1987, J. Mol. Biol . 194 (4) : 755-756) . Un polipéptido que tiene actividad de xilanasa puede ser una variante de cualquiera de las xilanasas proporcionadas en la presente descripción.
Polipéptido que tiene actividad de xilosidasa (por ejemplo, ß-xilosidasa) La actividad de xilosidasa (por ejemplo, ß-xilosidasa) se puede medir con el uso de 4-nitrofenil beta-D-xilopiranosida (pNPX, Sigma-Aldrich N2132) de sustrato cromogénico .
Un polipéptido que tiene actividad de xilosidasa (por ejemplo, ß-xilosidasa) puede ser una enzima de ß-xilosidasa del Grupo 1 (por ejemplo, Fv3A o Fv43A) o una enzima de ß-xilosidasa del Grupo 2 (por ejemplo, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Bxll de T. reesei o una variante de estos) . En algunos aspectos, cualquiera de las composiciones proporcionadas en la presente descripción puede comprender, adecuadamente, una o más ß-xilosidasas del Grupo 1 y una o más ß-xilosidasas del Grupo 2.
Cualquiera de las composiciones proporcionadas en la presente descripción, tal como las combinaciones/composiciones enzimáticas de la descripción puede comprender, opcionalmente, una o más ß-xilosidasas, además o en lugar de las ß-xilosidasas del Grupo 1 y/o Grupo 2 anteriores. Cualquier ß-xilosidasa (EC 3.2.1.37) se puede usar como la ß-xilosidasa adicional. Las ß-xilosidasas adecuadas incluyen, por ejemplo, Bxll de T. emersonii (Reen et al. 2003, Biochem Biophys Res Commun. 305 (3 ) : 579-85 ) , ß-xilosidasas de G. stearothermophilus (Shallom et al. 2005, Biochemistry 44:387-397), ß-xilosidasas de S. thermophilum (Zanoelo et al . 2004, J. Ind. Microbiol. Biotechnol . 31:170-176), ß-xilosidasa de T. lignorum (Schmidt, 1998, Methods Enzymol. 160:662-671), ß-xilosidasa de A. awamori (Kurakake et al. 2005, Biochim. Biophys . Acta 1726:272-279), ß-xilosidasa de A. versicolor (Andrade et al. 2004, Process Biochem. 39:1931-1938), ß-xilosidasa de Streptomyces sp . (Pinphanichakarn et al. 2004, World J. Microbiol. Biotechnol. 20:727-733), ß-xilosidasa de T. marítima (Xue and Shao, 2004, Biotechnol. Lett . 26:1511-1515), ß-xilosidasa de Trichoderma sp. SY (Kim et al. 2004, J. Microbiol. Biotechnol. 14:643-645), ß-xilosidasa de A. niger (Oguntimein and Reilly, 1980, Biotechnol. Bioeng. 22:1143-1154) o ß-xilosidasa de P. wortmanni (Matsuo et al. 1987, Agrie. Biol . Chem. 51:2367-2379) . Un polipéptido que tiene actividad de xilosidasa (por ejemplo, ß-xilosidasa) puede ser una variante de cualquiera de las xilosidasas proporcionadas en la presente descripción.
La actividad de arabinofuranosidasa se puede medir por medio de sustrato cromogénico de 4-nitrofenil alfa-L-arabinofuranosida (pNPA, Sigma-Aldrich N36 1) .
Cualquiera de las composiciones proporcionadas en la presente descripción, tal como las combinaciones/composiciones enzimáticas de la descripción puede comprender, adecuadamente, por ejemplo, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de arabinofuranosidasa (por ejemplo, actividad de L-a-arabinofuranosidasa) tal como L-a-arabinofuranosidasa . La L-a-arabinofuranosidasa puede ser, por ejemplo, Af 3A, Fv43B, Pf51A, Pa51A, Fv51A o una variante de estos.
Las combinaciones/composiciones enzimáticas de la descripción pueden comprender, opcionalmente , una o más L-a-arabinofuranosidasas además o en lugar de las L-a-arabinofuranosidasas anteriores. Las L-a-arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55) de cualquier organismo adecuado se pueden usar como las L-a-arabinofuranosidasas adicionales. Las L-a-arabinofuranosidasas adecuadas incluyen, por ejemplo, L-a-arabinofuranosidasas de A. oryzae (Numan & Bhosle, J". Ind. Microbiol.' Biotechnol. 2006, 33:247-260), A.sojae (Oshima et al. J. Appl. Glycosci. 2005, 52:261-265), B.brevis (Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260), B . stearothermophilus (Kim et al., J. Microbiol. Biotechnol. 2004, 14:474-482), B . breve (Shin et al., Ap l. Environ. Microbiol. 2003, 69:7116-7123), B.longum (Margolles et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69:5096-5103), C. thermocellum (Taylor et al., Biochem. J. 2006, 395:31-37), F. oxysporum (Panagiotou et al., Can. J. Microbiol. 2003, 49:639-644), F. oxysporum f. sp . dianthi (Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260), G. stearothermophilus T-6 (Shallom et al., J. Biol . Chem. 2002, 277:43667-43673), H. vulgare (Lee et al., J. Biol. Chem. 2003, 278:5377-5387), P. chrysogenum (Sakamoto et al., Biophys. Acta 2003, 1621:204-210) , Penicillium sp. (Rahman et al . , Can. J. Microbiol. 2003, 49:58-64) , P.cellulosa (Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol . 2006, 33:247-260) , R.pusillus (Rahman et al., Carbohydr. Res. 2003, 338:1469-1476) , S. chartreusis, S. thermoviolacus, T. ethanolicus, T. xylanilyticus (Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260), T. fusca (Tuncer and Ball, Folia Microbiol. 2003, (Praha) 48:168-172) , T. marítima (Miyazaki, Extremophiles 2005, 9:399-406) , Trichoderma sp. SY (Jung et al. Agrie. Chem. Biotechnol. 2005, 48:7-10), ñ.kawachii (Koseki et al., Biochim. Biophys. Acta 2006, 1760:1458-1464), F.oxysporum f. sp. dianthi (Chacon-Martinez et al., Physiol.Mol. Plant Pathol . 2004,64:201-208) , T. xylanilyticus (Debeche et al., Protein Eng. 2002, 15:21-28) , H.insolens, M.giganteus (Sorensen et al., Biotechnol. Prog. 2007, 23:100-107) o R.sativus (Kotake et al. J. Ex . Bot . 2006, 57:2353-2362) . Un polipéptido que tiene actividad de arabinofuranosidasa puede ser una variante de cualquiera de las arabinofuranosidasas descritas en la presente descripción.
En algunos aspectos de cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa comprende EG1 de T. reesei (o una variante de este) y/o EG2 de T. reesei (o una variante de este) . En algunos aspectos de cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa ( "CBH" ) comprende CBH1 de T. reesei, A. fumigatus 7A, 7B, C. globosum 7A, 7B, T. terrestris 7A, 7B, CBH2 de . reesei, T. terrestris 6A, S. thermophile 6A, 6B o una variante de estos . En algunos aspectos de cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de ß -glucosidasa comprende Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B , Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G y/o Tn3B . En algunos aspectos de cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa comprende Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B, Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G, Tn3B y/o una variante de estos. En algunos aspectos de cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de xilanasa comprende Xyn3 de T. reesei, Xyn2 de T. reesei, AfuXyn2 y/o Af Xyn5. En algunos aspectos de cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de xilanasa comprende Xyn3 de T. reesei, Xyn2 de T. reesei, AfuXyn2 , AfuXyn5 y/o una variante de estos. En algunos aspectos de cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa es una ß-xilosidasa del Grupo 1 o una ß-xilosidasa del Grupo 2, en donde la ß-xilosidasa del Grupo 1 comprende Fv3A, Fv43A o una variante de estos y la ß-xilosidasa del Grupo 2 comprende Pf43A, Fv43Df Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Bxll de G. reesei o una variante de estos. En algunos aspectos, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa comprende Fv3A de F. verticillioides, Fv43D de F. verticillioides o una variante de estos. En algunos aspectos de cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa comprende Af43A, Fv43B, Pf51A, Pa51A y/o Fv51A. En algunos aspectos de cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa comprende Af 3A, Fv43B, Pf51A, Pa51A, Fv51A y/o una variante de estos .
Celulasa completa Cualquiera de las composiciones proporcionadas en la presente descripción tal como las combinaciones/composiciones enzimáticas de la descripción puede comprender celulasa completa .
Como se usa en la presente descripción, una "celulasa completa" se refiere a una composición que contiene celulasa de origen natural o de origen no natural que comprende por lo menos 3 tipos de enzimas diferentes: (1) una endoglucanasa, (2) una celobiohidrolasa y (3) una ß-glucosidasa o que comprende por lo menos 3 actividades enzimáticas diferentes: (1) actividad de endoglucanasa, que cataliza el clivaje de enlaces ß-1,4 internos y produce glucooligosacáridos más cortos, (2) actividad de celobiohidrolasa que cataliza una liberación de tipo "exo" de unidades de celobiosa (glucosas de ß-l, 4-disacárido de glucosa) y (3) actividad de ß-glucosidasa que cataliza la liberación del monómero de glucosa a partir de celooligosacáridos cortos (por ejemplo, celobiosa) . La celulasa completa puede comprender por lo menos un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa (por ejemplo, EG2 (o una variante de este) y/o EG4 (o una variante de este) ) , por lo menos un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 (o una variante de este) y/o CBH2 (o una variante de este) ) , y por lo menos un polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, Bgll o una variante de este) .
Una composición "que contiene celulasa de origen natural" es una composición producida por una fuente natural, que comprende uno o más componentes o actividades de tipo celobiohidrolasa, uno o más componentes o actividades de tipo endoglucanasa y uno o más componentes o actividades de tipo ß-glucosidasa, en donde cada uno de estos componentes o actividades está presente en las proporciones y niveles producidos en la naturaleza, no modificados por el ser humano. En consecuencia, una composición que contiene celulasa de origen natural es, por ejemplo, una composición producida por un organismo no modificado con respecto a las enzimas celulolíticas , de manera que las proporciones o los niveles de las enzimas componentes sean iguales a los producidos por el organismo nativo en la naturaleza. Una "composición que contiene celulasa que no es de origen natural" se refiere a una composición producida por: (1) la combinación de enzimas celulolíticas componentes ya sea en una proporción que existe en la naturaleza o no, es decir, en una proporción alterada; o (2) la modificación de un organismo para que sobreexprese o subexprese una o más enzimas celulolíticas; o (3) la modificación de un organismo de manera que se elimine al menos una enzima celulolític . Una composición "que contiene celulosa no presente en la naturaleza" puede referirse, además, a una composición que resulte de ajustar las condiciones del cultivo para un organismo natural, de manera que este crezca en condiciones no nativas y produzca un nivel o una proporción modificados de enzimas. En consecuencia, en algunas modalidades, la preparación de celulasa completa de la presente desci-ipción puede tener una o más EG y/o CBH y/o ß-glucosidasas eliminadas y/o sobreexpresadas.
En algunos aspectos, se proporciona una composición que no es de origen natural que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, polipéptido de endoglucanasa IV tal como un polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este) o una composición que no es de origen natural que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, celulasa completa enriquecida con polipéptido de endoglucanasa IV tal como polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este) , en donde la composición comprende, además, una celulasa completa, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa) , por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa) , por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de glucosidasa (por ejemplo, ß-glucosidasa) (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de ß-glucosidasa) , por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de xilanasa (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de xilanasa) , por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de xilosidasa (por ejemplo, ß-xilosidasa) (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de ß-xilosidasa) y/o por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de arabinof ranosidasa (por ejemplo, L-a- arabinofuranosidasa) (por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4 o 5 polipéptidos que tienen actividad de L-a-arabino-furanosidasa) . Los polipéptidos que tienen varias actividades enzimáticas se describieron anteriormente.
En algunos aspectos, la celulasa completa comprende por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa tales como EG1 de T. reesei, EG2 de T. reesei o una variante de estos. En algunos aspectos, la celulasa completa comprende por lo menos un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa tales como CBH1 de T. reesei, CBH2 de T. reesei o una variante de estos. En algunos aspectos, la celulasa completa comprende por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa tales como Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B, Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G, Tn3B o una variante de estos.
En la presente descripción, una preparación de celulasa completa se puede realizar a partir de cualquier microorganismo capaz de hidrolizar un material celulósico. En algunas modalidades, la preparación de celulasa completa es una celulasa completa fúngica o bacteriana. Por ejemplo, la preparación de celulasa completa puede ser de una especie de Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium, Emericella, Fusariu , Humicola, Mucor, Myceliophthora , Neurospora, Penicillium, Scytalidium, Thielavia , Tolypocladium, Trichoderma o levadura.
La preparación de celulasa completa puede ser, por ejemplo, una celulasa completa de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori , Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulas, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae. Además, la preparación de celulasa completa puede ser una preparación de celulasa completa de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellenoe, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminu , Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatu , Fusarium roseum, Fusarium sa bucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides o Fusarium venenatum. La preparación de celulasa completa puede ser, además, una preparación de celulasa completa de Chrysosporium lucknowence, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Penicillium funiculosum, Scytalidium thermophilum o Thielavia terrestris . La preparación de celulasa completa puede ser, además, una preparación de celulasa completa de Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei (por ejemplo, RL-P37 (Sheir-Neiss G et al. Ap l . Microbiol. Biotechnology , 1984, 20, pp . 46-53), QM9414 (ATCC núm. 26921), NRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56466, 56767) o Trichoderma viride (por ejemplo, ATCC 32098 y 32086) .
La preparación de celulasa completa puede ser una preparación de la cepa integrada de T.reesei H3A o H3A/Eg4 núm. 27 (tal como se describe en los ejemplos de la presente descripción) .
La preparación de celulasa completa puede ser, adecuadamente, una preparación de celulasa completa de RutC30 de T. reesei , que está disponible de la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection) como T.reesei ATCC 56765. Por ejemplo, la preparación de celulasa completa puede ser, además, adecuadamente, una celulasa completa de P. funiculosum, que está disponible de la Colección Americana de Cultivos Tipo como P. funiculosum ATCC núm. : 10446.
La preparación de celulasa completa también se puede obtener de fuentes comerciales. Los ejemplos de preparaciones de celulasa comerciales adecuadas para usar en los métodos y composiciones de la presente descripción incluyen, por ejemplo, CELLUCLAST™ y Cellic™ (Novozymes A/S) y LAMINEX™ BG, IndiAge™ 44L, Primafast™ 100, Primafast™ 200, Spezyme™ CP, Accellerase® 1000 y Accellerase® 1500 (Danisco US. Inc., Genencor) .
Las preparaciones de celulasa completa adecuadas se pueden producir con el uso de cualquier método de cultivo de microorganismos conocido, especialmente, fermentación, que resulta en la expresión de enzimas capaces de hidrolizar un material celulósico. Como se usa en la presente descripción, "fermentación" se refiere a la fermentación a pequeña o gran escala del cultivo en un matraz de agitación, tales como fermentaciones por lote, por lote alimentado o en estado sólido en termentadores de laboratorio o industriales, realizadas en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan la expresión o el aislamiento de la celulasa y/o las enzimas de interés. Generalmente, se cultiva el microorganismo en un medio de cultivo celular adecuado para la producción de enzimas capaces de hidrolizar un material celulósico. El cultivo se lleva a cabo en un medio de nutrientes adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, con el uso de los procedimientos y variaciones conocidas en la técnica. Se conocen los medios de cultivo, intervalos de temperatura y demás condiciones para el crecimiento y la producción de celulasa. Como ejemplo no restrictivo, un intervalo de temperatura típico para la producción de celulasas por medio de T. reesei es de 24 °C a 28 °C.
La preparación de celulasa completa se puede usar tal como se la produce mediante fermentación con una recuperación y/o purificación mínimas o sin estas. En tal sentido, la preparación de celulasa completa se puede usar en una formulación de caldo entero. Por ejemplo, una vez que se secretan las celulasas en el medio de cultivo celular, el medio de cultivo celular que contiene las celulasas se puede usar directamente. La preparación de celulasa completa puede comprender el contenido no fraccionado del material de fermentación, que incluyen el medio de cultivo celular usado, las enzimas extracelulares y las células. Por otro lado, la preparación de celulasa completa se puede someter, además, a un procesamiento adicional en una serie de etapas de rutina, por ejemplo, precipitación, centrifugación, cromatografía de afinidad, filtración o similares. Por ejemplo, la preparación de celulasa completa se puede concentrar y, después, usar sin una purificación posterior. Por ejemplo, la preparación de celulasa completa se puede formular de modo que comprenda ciertos agentes químicos que reducen la viabilidad celular o matan las células después de la fermentación. Por ejemplo, las células se pueden lisar o permeabilizar con el uso de métodos conocidos .
La actividad endoglucanasa de la preparación de celulasa completa se puede determinar mediante el uso de celulosa de carboximetilo (CMC) como un sustrato. Un ensayo adecuado mide la producción de los extremos reductores creados por la mezcla de enzimas que actúa en la CMC, en donde 1 unidad es la cantidad de enzimas que liberan 1 µp^.^ de producto/min (Ghose, T.K., Puré & Ap l . Chem. 1987, 59, págs . 257-268) .
La celulasa completa se puede enriquecer con un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa, por ejemplo, una celulasa enriquecida con EG IV (tal como, por ejemplo, enriquecida con polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este) . La celulasa completa enriquecida con EG IV comprende, generalmente, un polipéptido de EG IV (tal como, por ejemplo, un polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este) y una preparación de celulasa completa. Las composiciones de celulasa completa enriquecidas con EG IV se pueden producir con el uso de métodos recombinantes . Por ejemplo, una preparación de celulasa completa de esas características se puede obtener por la expresión de una EG IV en un microorganismo capaz de producir una celulasa completa. La composición de celulasa completa enriquecida con EG IV, además, puede comprender, por ejemplo, una preparación de celulasa completa y una EG IV (tal como, por ejemplo, polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este) . Por ejemplo, la composición de celulasa completa enriquecida con EG IV (por ejemplo, enriquecida con polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede comprender, adecuadamente, por lo menos 0.1 % en peso, 1 % en peso, 2 % en peso, 5 % en peso, 7 % en peso, 10 % en peso, 15 % en peso o 20 % en peso y hasta 25 % en peso, 30 % en peso, 35 % en peso, 40 % en peso o 50 % en peso de EG IV en base al peso total de proteínas en esa combinación/composición.
La celulasa completa puede ser una celulasa enriquecida con ß-glucosidasa . La celulasa completa enriquecida con ß-glucosidasa comprende, generalmente, una ß-glucosidasa y una preparación de celulasa completa. Las composiciones de celulasa completa enriquecidas con ß-glucosidasa se pueden producir con el uso de métodos recombinantes . Por ejemplo, la preparación de celulasa completa puede obtenerse por la expresión de una ß-glucosidasa en un microorganismo capaz de producir una celulasa completa. La composición de celulasa completa enriquecida con ß -glucosidasa puede comprender, además, por ejemplo, una preparación de celulasa completa y una ß-glucosidasa . Por ejemplo, la composición de celulasa completa enriquecida con ß-glucosidasa puede comprender, adecuadamente, por lo menos 0.1 % en peso, 1 % en peso, 2 % en peso, 5 % en peso, 7 % en peso, 10 % en peso, 15 % en peso o 20 % en peso y hasta 25 % en peso, 30 % en peso, 35 % en peso, 40 % en peso o 50 % en peso de ß-glucosidasa en base al peso total de proteínas en esa combinación/composición.
Ciertos hongos producen sistemas de celulasa -completa que incluyen exo-celobiohidrolasas o celulasas de tipo CBH, endoglucanasas o celulasas del tipo EG y ß-glucosidasa o celulasas de tipo BG (Schulein, 1988) . Sin embargo, algunas veces estos sistemas carecen de celulasas de tipo CBH, por ejemplo, las celulasas bacterianas incluyen, además, típicamente, una cantidad reducida o nula de celulasas de tipo CBH. Además, se ha demostrado que los componentes de EG y componentes de CBH interactúan sinérgicamente para degradar la celulosa con mayor eficacia. Ver, por ejemplo, Wood, 1985.
Los distintos componentes, es decir, las diversas ? endoglucanasas y exocelobiohidrolasas en un sistema de celulasa completa o multicomponente tienen, generalmente, propiedades diferentes tales como el punto isoeléctrico, peso molecular, grado de glicosilación, especificidad del sustrato y patrones de acción enzimática.
En algunos aspectos, la celulasa se usa tal como se produce por medio de fermentación con un nivel nulo o mínimo de recuperación y/o purificación. Por ejemplo, una vez que una célula secreta celulasas en el medio de cultivo celular, el medio de cultivo celular que contiene las celulasas ya se puede usar. En algunos aspectos, la preparación de celulasa completa comprende el contenido no fraccionado del material de fermentación, que incluye el medio de cultivo celular, las enzimas extracelulares y células. Alternativamente, la preparación de celulasa completa se puede procesar por cualquier método. conveniente, por ejemplo, por precipitación, centrifugación, afinidad, filtración o cualquier otro método conocido en la técnica. En algunos aspectos, la preparación de celulasa completa puede concentrarse, por ejemplo, y después usarse sin purificación adicional. En algunos aspectos, la preparación de celulasa completa comprende agentes químicos que reducen la viabilidad celular o eliminan las células. En algunos aspectos, las células se lisan o permeabilizan con el uso de métodos conocidos en la técnica.
Se proporciona una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y comprende, además, por lo menos un polipéptido de una celulasa y/o por lo menos un polipéptido de hemicelulasa, en donde el polipéptido de celulasa y/o el polipéptido de hemicelulasa es heterólogo a la célula hospedera que expresa el polipéptido de celulasa y/o el polipéptido de hemicelulasa. En algunos aspectos, se proporciona una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y comprende, además, por lo menos 1 polipéptido de celulasa y/o por lo menos 1 polipéptido de hemicelulasa, en donde el polipéptido de celulasa; y/p el polipéptido de hemicelulasa se expresa a partir de una célula hospedera, y en donde el polipéptido de celulasa y/o un polipéptido de hemicelulasa es endógeno a la célula hospedera. El polipéptido de celulasa puede comprender un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa (por ejemplo, EG1 de T. reesei o una variante de este, EG2 de T. reesei o una variante de este) , un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 de T. reesei, A. fumigatus 7A, 7B, C. globosum 7A, 7B, T. terrestris 7A, 7B, CBH2 de T. reesei, T. terrestris 6A, S. ther ophile 6A, 6B o una variante de estos) o un polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B , Te3A, An3A, Fo3A, Gz3Af Nh3A, Vd3A, Pa3G, Tn3B o una variante de estos) . El polipéptido de hemicelulasa puede comprender un polipéptido que tiene actividad de xilanasa (por ejemplo, Xyn3 de T. reesei, Xyn2 de T. reesei, AfuXyn2 , AfuXyn5 o una variante de estos), un polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa (por ejemplo, Fv3A, Fv43A, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Bxll de T. reesei o una variante de estos) o un polipéptido que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa (por ejemplo, Af43A, Fv43B, Pf51A, Pa51A, Fv51A o una variante de estos) .
En algunos aspectos, la composición es una composición de caldo de fermentación. La composición puede ser una composición del caldo de fermentación de una cepa, en donde un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) es heterólogo a la célula hospedera que expresa el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, integrado en la cepa o expresado a partir de un vector en la cepa huésped) . La composición puede ser del caldo de fermentación de una cepa integrada (por ejemplo, H3A/Eg4, núm. 27 como en los ejemplos) .
La composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede comprender celulasa completa. Por lo tanto, se proporciona una composición (por ejemplo, una composición que no es de origen natural) que comprende Eg4 de T. reesei (o una variante de este) , Bgll de T. reesei (o una variante de este) , xyn3 de T. reesei (o una variante de este) , Fv3A (o una variante de este) , Fv43D (o una variante de este) y Fv51A (o una variante de este) .
En algunos aspectos, la composición comprende Eg4 de T. reesei aislado. En algunos aspectos, la composición comprende por lo menos uno (por lo menos 2, 3, 4 o 5) de Bgll de T. reesei aislado, xyn3 de T. reesei aislado, Fv3A aislado, Fv43D aislado o Fv51A aislado.
En algunos aspectos, la composición es una composición de caldo de fermentación. En algunos aspectos, la composición es de un caldo de fermentación de una cepa integrada (por ejemplo, H3A/Eg4, núm. 27 tal como se describe en los ejemplos de la presente descripción) . El Eg4 de T. reesei o el ácido nucleico que codifica Eg4 de T. reesei puede ser heterólogo a la célula hospedera que expresa Eg4 de T. reesei. Por lo menos un ácido nucleico que codifica Bgll de T. reesei, xyn3 de T. reesei, Fv3A, Fv43D, Fv51A o una variante de estos puede ser heterólogo a la célula hospedera tal como la célula hospedera que expresa Eg4 de T. reesei . En algunos aspectos, por lo menos un ácido nucleico que codifica Bgll de T. reesei, xyn3 de T. reesei, Fv3A, Fv43D, Fv51A o una variante de estos es endógeno a la célula hospedera tal como la célula hospedera que expresa Eg4 de T. reesei.
Con respecto a cualquiera de las composiciones descritas anteriormente, diversas cantidades para el polipéptido o los polipéptidos incluidos en las composiciones se describen más abajo en la sección "Cantidad de componentes en las composiciones" .
Cantidad de componentes en las composiciones Una composición que no es de origen natural que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (o una composición que no es de origen natural que comprende celulasa completa que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa) proporcionada en la presente descripción puede comprender varios componentes tal como se describe en la presente descripción, en donde cada componente está presente,, en la composición en diversas cantidades.
En algunos aspectos de cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en la presente descripción, el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) está presente en la composición en una cantidad suficiente para aumentar la producción de azúcares fermentables a partir de la hidrólisis de material de biomasa (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %) en comparación con la producción en ausencia del polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) . En cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en la presente descripción, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede estar presente en la composición en una cantidad suficiente para reducir la viscosidad de una mezcla de biomasa durante la hidrólisis de un material de biomasa (por ejemplo, por. lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %) en comparación con la viscosidad de la mezcla de biomasa durante la hidrólisis en ausencia del polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) . La composición puede comprender, además, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa , por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de xilanasa, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa, por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa y/o celulasa completa o una mezcla de estos. La cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa, la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa, la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de ß-glucosidasa, la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de xilanasa, la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen, actividad de ß-xilosidasa, la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de L-a-arabinofuranosidasa o la cantidad de celulasa completa es suficiente para aumentar la producción de azúcares fermentables a partir de la hidrólisis de material de biomasa (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %) en comparación con la producción en ausencia del polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) , el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa, el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa, el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de ß-glucosidasa, el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de xilanasa, el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de ß-xilosidasa, el 4 polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de L-a-arabinofuranosidasa o la celulasa completa. En algunos aspectos, la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa, la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa, la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de ß-glucosidasa, la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de xilanasa, la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de ß-xilosidasa, la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de L-a-arabinofuranosidasa o la cantidad de celulasa completa es suficiente para reducir la viscosidad de una mezcla de biomasa durante la hidrólisis de un material de biomasa (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 ¾, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %) en comparación con la viscosidad de una mezcla de biomasa en ausencia del polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) , el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa, el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa, el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de ß-glucosidasa, el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de xilanasa, el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de ß -xilosidasa , el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de L-a-arabinofuranosidasa o la celulasa completa.
Un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (tal como EG IV que incluye un polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede estar presente en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción (tal como en cualquiera de las combinaciones/composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción) en una cantidad de por lo menos aproximadamente 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso o 50 % en peso del peso total de proteínas en la composición. En algunos aspectos, un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (tal como EG IV que incluye, por ejemplo, un polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede estar presente en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción (tal como en cualquiera de las combinaciones/composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción) en una cantidad no mayor que aproximadamente 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 % en peso, 70 % en peso, 75 % en peso u 80 % en peso del peso total de proteínas en la composición. Un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (tal como EG IV que incluye, por ejemplo, un polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede estar presente en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción (tal como en cualquiera de las combinaciones/composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción) en una cantidad que tiene un intervalo con un límite superior y un límite inferior. Por ejemplo, el límite inferior para un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa es de aproximadamente 0.01 % en peso, 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso o 50 % en peso del peso total de proteínas en la composición. El límite superior para un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa puede ser de aproximadamente 10 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 35 % en peso, 40 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 % en peso o 70 % en peso del peso total de proteínas en la composición. En algunos aspectos, un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (tal como EG IV que incluye, por ejemplo, un polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede estar presente en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción (tal como en cualquiera de las combinaciones/composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción) en una cantidad de aproximadamente 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 % en peso, 70 % en peso, 75 % en peso u 80 % en peso del peso total de proteínas en la composición. El polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 10 % en peso o 12 % en peso del peso total de proteínas en la composición. La composición puede tener por lo menos dos polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei, Egl de T. reesei y/o Eg2 de T. reesei o una variante de estos) , en donde la cantidad total de polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa es de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 45 % en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 % en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 8 a aproximadamente 15 % en peso) del peso total de proteínas en la composición. El polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa puede ser heterólogo o endógeno a la célula hospedera que expresa el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa . El polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa incluido en la composición puede estar aislado.
En algunos aspectos, la composición enzimática (por ejemplo, la composición enzimática) descrita en la presente descripción es una composición de celulasa completa que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa . En algunos aspectos, un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (tal como EG IV que incluye, por ejemplo, un polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede estar presente en una cantidad de por lo menos aproximadamente 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso o 50 % en peso del peso total de la celulasa completa. En algunos aspectos, un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (tal como EG IV que incluye, por ejemplo, un polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede estar presente en una cantidad no mayor que aproximadamente 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 % en peso, 70 % en peso, 75 % en peso u 80 % en peso del peso total de la celulasa completa. En algunos aspectos, un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (tal como EG IV que incluye, por ejemplo, un polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede estar presente en una cantidad que tiene un límite inferior de aproximadamente 0.01 % en peso, 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso o 50 % en peso del peso total de la celulasa completa y un límite superior de aproximadamente 10 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 35 % en peso, 40 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 ¾ en peso o 70 % en peso del peso total de la celulasa completa. En algunos aspectos, un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (tal como EG IV que incluye, por ejemplo, un polipéptido de Eg4 de G. reesei o una variante de este) puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 13 % en peso, 14 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 % en peso, 70 % en peso, 75 % en peso u 80 % en peso del peso total de la celulasa completa. En algunos aspectos, un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (tal como EG IV que incluye, por ejemplo, un polipéptido de Eg4 de T. reesei o una variante de este) está presente en una cantidad de aproximadamente 10 % en peso o 12 % en peso del peso total de la celulasa completa.
En algunos aspectos, cualquiera de las composiciones proporcionadas en la presente descripción puede comprender por lo menos un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa (por ejemplo, además de un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa) que incluye Egl de T. reesei o una variante de este y/o Eg2 de G. reesei o una variante de este. En algunos aspectos, el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa pueden estar presente en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción (tal como en cualquiera de las combinaciones/composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción) en una cantidad de por lo menos aproximadamente 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso o 50 % en peso del peso total de proteínas en la composición. En algunos aspectos, el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa pueden estar presente en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción (tal como en cualquiera de las combinaciones/composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción) en una cantidad no mayor que aproximadamente 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % . en peso, 45 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 % en peso, 70 % en peso, 75 % en peso u 80 % en peso del peso total de proteínas en la composición. En algunos aspectos, el • polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa pueden estar presente en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción (tal como en cualquiera de las combinaciones/composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción) en una cantidad que tiene un intervalo con un límite superior y un límite inferior. Por ejemplo, el límite inferior para la cantidad total del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa es de aproximadamente 0.01 % en peso, 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso o 50 % en peso del peso total de proteínas en la composición. El límite superior para la cantidad total del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa puede ser de aproximadamente 10 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 35 % en peso, 40 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 % en peso o 70 % en peso del peso total de proteínas en la composición. En algunos aspectos, el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa pueden estar presente en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción (tal como en cualquiera de las combinaciones/composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción) en una cantidad de aproximadamente 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 % en peso, 70 % en peso, 75 % en peso u 80 ¾ en peso del peso total de proteínas en la composición.
En algunos aspectos, cualquiera de las composiciones proporcionadas en la presente descripción puede comprender uno o más polipéptidos con diversas actividades enzimáticas, tal como el polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa, polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de glucosidasa (por ejemplo, ß-glucosidasa) , polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de xilanasa, polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de xilosidasa y/o polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de arabinofuranosidasa . En algunos aspectos, puede haber múltiples polipéptidos que tienen la misma actividad enzimática. Cada uno de los polipéptidos mencionados anteriormente (o la cantidad total de los polipéptidos que tienen una actividad enzimática específica, por ejemplo, cantidad total de los polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa, actividad de glucosidasa (por ejemplo, ß-glucosidasa) , actividad de xilanasa, actividad de xilosidasa o actividad de arabinofuranosidasa) puede estar presente en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción (tal como en cualquiera de las combinaciones/composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción) en una cantidad de por lo menos aproximadamente 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso o 50 % en peso del peso total de proteínas en la composición. En algunos aspectos, cada uno de los polipéptidos mencionados anteriormente (o la cantidad total de los polipéptidos que tienen una actividad enzimática específica, por ejemplo, cantidad total de los polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa, actividad de glucosidasa (por ejemplo, ß-glucosidasa) , actividad de xilanasa, actividad de xilosidasa o actividad de arabinofuranosidasa) puede ser no mayor que aproximadamente 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 % en peso, 70 % en peso, 75 % en peso u 80 % en peso del peso total de proteínas en la composición. Cada uno de los polipéptidos mencionados anteriormente (o la cantidad total de los polipéptidos que tienen una actividad enzimática específica, por ejemplo, cantidad total de los polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa, actividad de glucosidasa (por ejemplo, ß -glucosidasa) , actividad de xilanasa, actividad de xilosidasa o actividad de arabinofuranosidasa) puede estar presente en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción (tal como en cualquiera de las combinaciones/composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción) en una cantidad que tiene un intervalo con límites superior e inferior. Por ejemplo, el límite inferior para la cantidad total del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa es de aproximadamente 0.01 % en peso, 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso o 50 % en peso del peso total de proteínas en la composición. El límite superior puede ser de aproximadamente 10 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 35 % en peso, 40 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 % en peso o 70 % en peso del peso total de proteínas en la composición. En algunos aspectos, cada uno de los polipéptidos mencionados anteriormente (o la cantidad total de los polipéptidos que tienen una actividad enzimática específica, por ejemplo, cantidad total de los polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa, actividad de glucosidasa (por ejemplo, ß-glucosidasa) , actividad de xilanasa, actividad de xilosidasa o actividad de arabinofuranosidasa) puede estar presente en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción (tal como en cualquiera de las combinaciones/composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción) en una cantidad de aproximadamente 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 % en peso, 70 % en peso, 75 % en peso u 80 % en peso del peso total de proteínas en la composición.
En algunos aspectos, cualquiera de las composiciones proporcionadas en la presente descripción puede comprender, además, celulasa completa. La celulasa completa puede estar presente en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción (tal como en cualquiera de las combinaciones/composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción) en una cantidad de por lo menos aproximadamente 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 % en peso, 70 % en peso, 75 % en peso, 80 % en peso, 85 % en peso, 90 % en peso o 95 % en peso del peso total de proteínas en la composición. La celulasa completa puede estar presente en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción (tal como en cualquiera de las combinaciones/composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción) en una cantidad no mayor que aproximadamente 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 % en peso, 70 % en peso, 75 % en peso, 80 % en peso, 85 % en peso, 90 % en peso o 95 % en peso del peso total de proteínas en la composición. La celulasa completa puede estar presente en cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción (tal como en cualquiera de las combinaciones/composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción) en una cantidad de aproximadamente 1 % en peso, 2 % en peso, 3 % en peso, 4 % en peso, 5 % en peso, 6 % en peso 7 % en peso, 8 % en peso, 9 % en peso, 10 % en peso, 11 % en peso, 12 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso, 60 % en peso, 65 % en peso, 70 % en peso, 75 % en peso, 80 % en peso, 85 % en peso, 90 % en peso o 95 % en peso del peso total de proteínas en la composición.
En algunos aspectos de cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en la presente descripción, el polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 de G. reesei, CBH2 de T. reesei o una variante de estos) está presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 70 % en peso (por ejemplo, aproximadamente 0.5 a aproximadamente 60 % en peso, aproximadamente 5 a aproximadamente 70 % en peso, aproximadamente 10 a aproximadamente 60 % en peso, aproximadamente 20 a aproximadamente 50 % en peso o de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 % en peso) del peso total de proteínas en la composición. En algunos aspectos, la composición tiene por lo menos dos polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 de T. reesei (o una variante de este) y CBH2 de T. reesei (o una variante de este) ) , en donde la cantidad total de polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa es de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 70 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 60 % en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 70 % en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 % en peso, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 % en peso o de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 % en peso) del peso total de proteínas en la composición. El polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa se puede expresar a partir de un ácido nucleico heterólogo o endógeno a la célula hospedera. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa incluido en la composición está aislado.
En algunos aspectos de cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en la presente descripción, el polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, un Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B, Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G,- Tn3B o una variante de estos) está presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 % en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 8 a aproximadamente 15 % en peso) del peso total de proteínas en la composición. En algunos aspectos, la composición tiene por lo menos dos polipéptidos que tienen actividad de ß-glucosidasa, en donde la cantidad total de polipéptidos que tienen actividad de ß-glucosidasa es de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 % en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 8 a aproximadamente 15 % en peso) del peso total de proteínas en la composición. El polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa se puede expresar a partir de un ácido nucleico heterólogo o endógeno a la célula hospedera. En algunos aspectos, el polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa incluido en la composición está aislado.
En cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en la presente descripción, el polipéptido que tiene actividad de xilanasa (por ejemplo, Xyn3 de T. reesei, Xyn2 de T. reesei, AfuXyn2 , AfuXyn5 o una variante de estos) puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 8 a aproximadamente 15 % en peso) del peso total de proteínas en la composición. La composición puede tener por lo menos 2 polipéptidos que tienen actividad de xilanasa, en donde la cantidad total de polipéptidos que tienen actividad de xilanasa es de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 8 a aproximadamente 15 % en peso) del peso total de proteínas en la composición. El polipéptido que tiene actividad de xilanasa se puede expresar a partir de un ácido nucleico heterólogo o endógeno a la célula hospedera. El polipéptido que tiene actividad de xilanasa incluido en la composición puede estar aislado.
En cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en la presente descripción, el polipéptido que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa (por ejemplo, Af43A, Fv43B, Pf51A, Pa51A, Fv51A o una variante de estos) puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 45 % en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 % en peso) del peso total de enzimas en la composición. La composición puede tener por lo menos 2 polipéptidos que tienen actividad de L-a-arabinof ranosidasa, en donde la cantidad total de polipéptidos que tienen actividad de L-a-arabinofuranosidasa es de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 45 % en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 % en peso) del peso total de proteínas en la composición. El polipéptido que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa se puede expresar a partir de un ácido nucleico heterólogo o heterólogo a la célula hospedera. El polipéptido que tiene actividad de L-a-arabinofuranosidasa incluido en la composición puede estar aislado.
En cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en la presente descripción, el polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa (por ejemplo, un Fv3A, Fv43A, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Bxll de T. reesei o una variante de estos) puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 45 % en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 4 a aproximadamente 35 % en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 % en peso o de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 % en peso) del peso total de enzimas en la composición. La composición puede tener por lo menos 2 polipéptidos que tienen actividad de ß-xilosidasa, en donde la cantidad total de polipéptidos que tienen actividad de ß-xilosidasa es de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 45 % en peso, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 4 a aproximadamente 35 % en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 % en peso o de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 % en peso) del peso total de proteínas en la composición. El polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa se puede expresar a partir de un ácido nucleico heterólogo o endógeno a la célula hospedera. El polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa incluido en la composición puede estar aislado.
En cualquiera de las composiciones o métodos proporcionados en la presente descripción, la celulasa completa en la composición puede ser de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 % en peso (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 95 % en peso, de aproximadamente 5 a aproximadamente 90 % en peso, de aproximadamente 10 a aproximadamente 85 % en peso, de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 % en peso o de aproximadamente 30 a aproximadamente 75 % en peso) del peso total de proteínas en la composición. La celulasa completa puede comprender por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa (tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este, Egl de T. reesei o una variante de este, Eg2 de T. reesei o una variante de este) expresado a partir de un ácido nucleico heterólogo o endógeno a la célula hospedera. La celulasa completa puede comprender por lo menos 1 polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 de T. reesei o una variante de este, CBH2 de T. reesei o una variante de este) expresado a partir de un ácido nucleico heterólogo o endógeno a la célula hospedera. La celulasa completa puede comprender por lo menos un polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B, Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G, Tn3B o una variante de estos) expresado a partir de un ácido nucleico heterologo o endógeno a la célula hospedera.
En algunos aspectos, la composición de la invención puede convertir un material de biomasa en azúcares fermentables (por ejemplo, glucosa, xilosa, arabinosa y/o celobiosa) . En algunos aspectos, la composición puede producir por lo menos 0.1 (por ejemplo, de 0.1 a 0.4) de producto de fracción según se determina por medio del ensayo de calcofluor.
En algunos aspectos, la composición comprende el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y comprende, además, por lo menos un polipéptido de una celulasa y/o por lo menos un polipéptido de hemicelulasa, en donde el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos un polipéptido de una celulasa y/o por lo menos un polipéptido de hemicelulasa se mezclan entre sí antes del contacto con un material de biomasa.
En algunos aspectos, la composición comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y comprende, además, por lo menos un polipéptido de una celulasa y/o por lo menos un polipéptido de hemicelulasa, en donde el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos un polipéptido de una celulasa y/o por lo menos un polipéptido de hemicelulasa se añaden a un material de biomasa en momentos diferentes (por ejemplo, un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa se añade a un material de biomasa antes o después de la adición de por lo menos un polipéptido de una celulasa y/o por lo menos un polipéptido de hemicelulasa en el material de biomasa) .
En algunos aspectos, la composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) es una mezcla que comprende un material de biomasa, por ejemplo, la composición es una mezcla de hidrólisis, una mezcla de fermentación o una mezcla de sacarificación. La mezcla puede incluir, además, azúcares fermentables .
Otros componentes Las composiciones enzimáticas de la descripción pueden comprender, además, adecuadamente, 1 o más proteínas auxiliares. Los ejemplos de proteínas auxiliares incluyen, pero no se limitan a, mananasas (por ejemplo, endomananasas , exomananasas y ß-manosidasas) , galactanasas (por ejemplo, endo y exo-galactanasas) , arabinasas (por ejemplo, endo-arabinasas y exo-arabinasas) , ligninasas, amilasas, glucuronidasas , proteasas, esterasas (por ejemplo, esterasas de ácido ferúlico, acetil xilan esterasas, esterasas de ácido cumárico o pectin metil esterasas) , lipasas, otras glicósido hidrolasas, xiloglucanasas, CIP1, CIP2, swoleninas, expansinas y proteínas que alteran la celulosa. Por ejemplo, las proteínas que alteran la celulosa son módulos de unión a celulosa .
Métodos y procesos La descripción proporciona métodos y procesos para la sacarificación de biomasa con el uso de enzimas y mezclas/composiciones enzimáticas de la descripción. Particularmente, la descripción proporciona métodos y procesos para usar cualquiera de los polipéptidos o composiciones proporcionadas en la presente descripción para hidrolizar un material de biomasa. Además, la descripción proporciona métodos para usar cualquiera de los polipéptidos o composiciones proporcionadas en la presente descripción para reducir la viscosidad de una mezcla de biomasa (por ejemplo, una mezcla de biomasa que contiene sustrato de biomasa y enzima durante el proceso de sacarificación) . En algunos aspectos, se proporcionan métodos para hidrolizar un material de biomasa; los métodos comprenden poner en contacto el material de biomasa con una composición que no es de origen natural que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa . En algunos aspectos, el polipéptido está en una cantidad suficiente para hidrolizar el material de biomasa.
El término "biomasa" , como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier composición que comprende celulosa y/o hemicelulosa (que incluye lignina en materiales de biomasa lignocelulósica) . Como se usa en la presente descripción, biomasa incluye, pero no se limita a, semillas, granos, tubérculos, desechos vegetales o subproductos del procesamiento de alimentos o procesamiento industrial (por ejemplo, tallos), maíz (que incluye, por ejemplo, mazorcas, rastrojo y similares) , césped (que incluye, por ejemplo, pasto indio, tal como Sorg astrum nutans; o césped de pradera, por ejemplo, especies Panicum, tal como Panicum virgatum) , cañas perennes (por ejemplo, cañas bravas) , madera (que incluye, por ejemplo, astillas, desechos de procesamiento) , papel (que incluye desechos de papel) , pulpa y papel reciclado (que incluye, por ejemplo, papel de Ti periódico, papel para impresora y similares) . Otros materiales de biomasa incluyen, pero no se limitan a, papas, soja (por ejemplo, semilla de colza) , cebada, centeno, avena, trigo, betabel y bagazo de caña de azúcar. Los materiales de biomasa lignocelulósica adecuados incluyen, pero no se limitan a, semillas, granos, tubérculos, desechos vegetales o subproductos del procesamiento de alimentos o procesamiento industrial (por ejemplo, tallos) , maíz (que incluye, por ejemplo, mazorcas, rastrojo y similares) , césped (por ejemplo, pasto indio, tal como Sorghastrum nutans; o césped de pradera, por ejemplo, especies Panicum, tales como Panicum virgatum) , cañas perennes, por ejemplo, cañas bravas, madera (que incluye, por ejemplo, astillas, desechos de procesamiento) , papel, pulpa, papel reciclado (por ejemplo, papel de periódico) , pulpa de madera o aserrín. Los ejemplos de césped incluyen, pero no se limitan a, pasto indio o césped de pradera. Los ejemplos de juncos incluyen, pero no se limitan a, ciertas cañas perennes tales como cañas bravas. Los ejemplos de papel de desecho incluyen, pero no se limitan a, papel de fotocopias, papel de impresora de computadora, papel de cuaderno, papel de anotador, papel de máquina de escribir, periódicos, revistas, cartón y materiales de embalaje a base de papel desechados o usados.
La biomasa sacarificada se puede elaborar en varios productos de base biológica, a través de procesos tales como, por ejemplo, fermentación microbiana y/o síntesis química. Como se usa en la presente descripción, "fermentación microbiana" se refiere a un proceso de cultivo y recolección de microorganismos de fermentación en condiciones adecuadas. El microorganismo de fermentación puede ser cualquier microorganismo adecuado para usar en un proceso de fermentación deseado para la producción de productos de base biológica. Los microorganismos de fermentación adecuados incluyen, pero no se limitan a, hongos filamentosos, levadura y bacterias. La biomasa sacarificada puede producir, por ejemplo, combustible (por ejemplo, un biocombustible tal como bioetanol, biobutanol, biometanol, biopropanol, biodiesel, combustible de reactor o similares) por medio de fermentación y/o síntesis química. La biomasa sacarificada puede producir, además, por ejemplo, un producto químico (por ejemplo, ácido ascórbico, isopreno, 1, 3-propanodiol) , lípidos, aminoácidos, proteínas y enzimas por medio de fermentación y/o síntesis química.
El material de biomasa puede incluir celulosa, hemicelulosa o una mezcla de estos. Por ejemplo, un material de biomasa puede incluir glucano y/o xilano.
En algunos aspectos, se proporcionan métodos para reducir la viscosidad de una mezcla de biomasa que comprenden poner en contacto la mezcla de biomasa con una composición que no es de origen natural que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa . El polipéptido está en una cantidad suficiente para reducir la viscosidad. La mezcla de biomasa puede comprender material de. biomasa (por ejemplo, material de biomasa pretratado) . La mezcla de biomasa puede comprender una composición enzimática tal como cualquiera de las composiciones enzimáticas proporcionadas en la presente descripción o una mezcla de estas.
En algunos aspectos, cualquiera de los polipéptidos de 1 las composiciones proporcionadas en la presente descripción puede usarse para hidrolizar un sustrato tal como un material de biomasa o para reducir la viscosidad de una mezcla enzimática del sustrato durante el proceso de sacarificación. El sustrato puede ser un material de biomasa. El sustrato puede ser celulosa aislada o hemicelulosa aislada. El sustrato puede ser glucano y/o xilano. En algunos aspectos, el material de biomasa es material de biomasa pretratado.
Tratamiento previo del material de biomasa Antes de la sacarificación, un material de biomasa se expone, preferentemente, a una o más etapas de tratamiento previo para hacer que el material de xilano, hemicelulosa, celulosa y/o lignina sea más accesible o sensible a las enzimas y, por lo tanto, más fácil de hidrolizar por medio de la enzima o enzimas y/o mezclas/composiciones enzimáticas de la descripción El tratamiento previo puede incluir un tratamiento previo químico, físico y biológico. Por ejemplo, las técnicas de tratamiento previo físico pueden incluir, pero no se limitan a, varios tipos de molienda, compresión, exposición al valor/explosión de vapor, irradiación e hidrotermólisis . Las técnicas de tratamiento previo químico pueden incluir, pero no se limitan a, ácido diluido, alcalino, solvente orgánico, amoníaco, dióxido de azufre, dióxido de carbono e hidrotermólisis controlada por pH. Las técnicas de tratamiento previo biológico pueden incluir, pero no se limitan a, aplicar microorganismos que solubilizan lignina. El tratamiento previo puede durar entre varios minutos y varias horas, tal como de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 120.
En algunos aspectos, cualquiera de los métodos o procesos proporcionados en la presente descripción puede comprender, además, el tratamiento previo del material de biomasa, tal como el tratamiento previo de la biomasa con ácido o base. El ácido o base puede ser amoníaco, hidróxido de sodio o ácido fosfórico. El método puede comprender, además, el tratamiento previo del material de biomasa con amoniaco. El tratamiento previo puede ser explosión de vapor, reducción a pulpa, triturado, hidrólisis ácida o combinaciones de estos.
En una modalidad, el tratamiento previo puede ser la aplicación de temperatura elevada y la adición de ácido diluido, ácido concentrado o solución alcalina diluida. La solución de tratamiento previo puede añadirse por un tiempo suficiente, por lo menos para hidrolizar parcialmente los componente de hemicelulosa y, después, neutralizarse.
En una modalidad ilustrativa, el tratamiento previo implica exponer el material de biomasa a un catalizador que comprende una solución diluida de un ácido fuerte y una sal de metal en un reactor. El material de biomasa puede ser, por ejemplo, una materia prima o un material secado. Este tratamiento previo puede reducir la energía de activación o la temperatura de hidrólisis de la celulosa y, en última instancia, puede permitir una mayor producción de azúcares fermentables . Ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos núms. 6,660,506; 6,423,145.
Otro método de tratamiento previo ilustrativo implica hidrolizar la biomasa mediante la exposición del material de biomasa a una primera etapa de hidrólisis en un medio acuoso a una temperatura y con un nivel de presión seleccionados para efectuar, principalmente, la despolimerización de la hemicelulosa sin una despolimerización significativa de celulosa a glucosa. Esta etapa produce una suspensión en la cual la fase líquida acuosa contiene monosacáridos disueltos que resultan de la despolimerización de hemicelulosa y una fase sólida que contiene celulosa y lignina. Después, la suspensión se expone a una segunda etapa de hidrólisis en condiciones que permiten la despolimerización de una porción importante de la celulosa lo que produce una fase acuosa líquida que contiene productos de despolimerización de celulosa disueltos/solubles. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 5,536,325.
Otro ejemplo de un método implica procesar un material de biomasa en una o más etapas de hidrólisis con ácido diluido mediante el uso de aproximadamente 0.4 % a aproximadamente 2 % de un ácido fuerte; seguido del tratamiento del componente lignocelulósico sólido sin reaccionar del material hidrolizado con ácido con deslignificación alcalina. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 6,409,841.
Otro ejemplo de un método de tratamiento previo comprende la hidrólisis previa de la biomasa (por ejemplo, materiales lignocelulósicos) en un reactor de hidrólisis previa; la adición de un líquido acídico en el material lignocelulósico sólido para formar una mezcla; el calentamiento de la mezcla hasta la temperatura de la reacción; el mantenimiento de la temperatura de reacción durante un período de tiempo suficiente para fraccionar el material lignocelulósico en una parte solubilizada que contiene al menos 20 % de la lignina del material lignocelulósico y una fracción sólida que contiene celulosa; la separación de la parte solubilizada de la fracción sólida y la eliminación de la parte solubilizada mientras está a la temperatura de reacción o a una temperatura cercana a ella; y la recuperación de la parte solubilizada. De este modo, la celulosa en la fracción sólida facilita la digestión enzimática. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 5,705,369.
Otros métodos de tratamiento previo pueden implicar el uso de peróxido de hidrógeno H20 . Ver Gould, 1984, Biotech, and Bioengr. 26:46-52.
El tratamiento previo puede comprender, además, poner en contacto un material de biomasa con cantidades estequiométricas de hidróxido de sodio e hidróxido de amonio a una concentración muy baja. Ver Teixeira et al., 1999, Appl . Biochem.and Biotech. 77-79:19-34. El tratamiento previo puede comprender, además, poner en contacto una lignocelulosa con una sustancia química (por ejemplo, una base, tal como carbonato de sodio o hidróxido de potasio) a un pH de aproximadamente 9 a aproximadamente 14 a temperatura, presión y pH moderados. Ver la publicación del PCT núm. WO2004/081185.
El amoníaco puede usarse en un método de tratamiento previo. Ese método de tratamiento previo comprende exponer material de biomasa a una concentración baja de amoniaco en condiciones de sólidos elevados. Ver, por ejemplo, la publicación de patente de los Estados Unidos núm. 20070031918 y la publicación del PCT núm. WO 06110901.
Proceso de sacarificación y reducción de la viscosidad La presente descripción proporciona métodos para reducir la viscosidad de una mezcla de biomasa; los métodos comprenden poner en contacto la mezcla de biomasa con una composición (por ejemplo, una composición que no es de origen natural) que comprende un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa de la familia de glicosil hidrolasa 61 ("GH61") en una cantidad suficiente para reducir la viscosidad de la mezcla de biomasa. En algunos aspectos, la mezcla de biomasa comprende un material de biomasa, azúcares fermentables , celulasa completa, una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de celulasa y/o un polipéptido que tiene actividad de hemicelulasa . En algunos aspectos, la viscosidad se reduce por lo menos aproximadamente 5 %, {por ejemplo, por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %) en comparación con la viscosidad de una mezcla de biomasa en ausencia de un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) . En algunos aspectos de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el material de biomasa comprende hemicelulosa , celulosa o una mezcla de estos. En algunos aspectos, el material de biomasa comprende glucano, xilano y/o lignina.
Los métodos y procesos proporcionados en la presente descripción se pueden realizar en diversas condiciones. Por ejemplo, cualquiera de los métodos proporcionados en la presente descripción se puede realizar a un pH en el intervalo de pH de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 7.0, por ejemplo, un pH de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 6.5, un pH de aproximadamente 4.4 a aproximadamente 6.0, un pH de aproximadamente 4.8 a aproximadamente 5.6 o de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 5.5. La mezcla de sacarificación que contiene material de biomasa se puede ajustar hasta el pH deseado con el uso de base o ácido (tal como ácido sulfúrico) de conformidad con cualquiera de los métodos conocidos para una persona con experiencia en la técnica. Por ejemplo, el material de biomasa tratado previamente se puede añadir con base o ácido (tal como ácido sulfúrico) para alcanzar el pH deseado para la sacarificación. Cualquiera de los métodos para hidrolizar un material de biomasa o reducir la viscosidad de la mezcla de biomasa puede realizarse a un pH de aproximadamente 4.8 a aproximadamente 5.6 (por ejemplo, un pH de aproximadamente 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5 o 5.6) . En algunos aspectos, el método comprende, además, ajustar el pH de la mezcla de biomasa hasta un pH de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 6.5 (por ejemplo, un pH de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 5.5).
Los métodos y procesos proporcionados en la presente descripción se pueden realizar durante cualquier periodo de tiempo, por ejemplo 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 10 días, 14 días, 3 semanas o 4 semanas. Después de cualquier periodo de sacarificación descrito en la presente descripción, se incrementa la cantidad de azúcares fermentables y/o se reduce la viscosidad de la mezcla de sacarificación. En algunos aspectos, el método se realiza por aproximadamente 2 horas a aproximadamente 7 días (por ejemplo, de aproximadamente 4 horas a aproximadamente 6 días, de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 5 días o de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 3 días) .
Una composición (por ejemplo, una composición que no es de origen natural) que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede añadirse después de realizar el tratamiento previo del material de biomasa. Una composición (por ejemplo, una composición que no es de origen natural) que comprende el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este) se puede añadir al material de biomasa antes o después de que se añade otra composición enzimática (tal como una composición enzimática que comprende hemicelulosa, celulasa o celulasa completa) en el material de biomasa. Una composición (por ejemplo, una composición que no es de origen natural) que comprende el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede añadirse a la mezcla de biomasa que contiene (a) material de biomasa y/o azúcares fermentables y (b) enzima (tal como hemicelulasa o celulasa que incluye celulasa completa) . En algunos aspectos, una composición (por ejemplo, una composición que no es de origen natural) que comprende polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este) se añade a la mezcla de biomasa, en donde el material de biomasa se ha hidrolizado por un periodo de tiempo (tal como aproximadamente 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días o 5 días) .
Una composición (por ejemplo, una composición que no es de origen natural) que comprende polipéptido aislado que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este) puede añadirse al material de biomasa durante la sacarificación. Una composición (por ejemplo, una composición que no es de origen natural) que comprende celulasa completa puede añadirse al material de biomasa durante la sacarificación, en donde la celulasa completa comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este) .
Un material de biomasa usado en cualquiera de los métodos puede estar en forma líquida, en forma sólida o una mezcla de estos . Un material de biomasa usado en cualquiera de los métodos puede estar en forma húmeda, forma seca, como un material que tiene diversos grados de humedad o una mezcla de estos . Un material de biomasa usado en cualquiera de los métodos puede estar en una forma de sólido seco (tal como un sólido seco como materia prima) . El material de biomasa se puede procesar en cualquiera de las siguientes formas : forma húmeda, forma seca, forma sólida, forma líquida o una mezcla de estas de conformidad con cualquier método conocido para una persona con experiencia en la técnica.
Un material de biomasa usado en cualquiera de los métodos puede estar presente en la mezcla de sacarificación en una cantidad de por lo menos aproximadamente 0.5 % en peso, 1 % en peso, 5 % en peso, 10 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 35 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso o 60 % en peso del peso total de la mezcla de hidrólisis o mezcla de sacarificación, en donde la cantidad del material de biomasa se refiere al peso del material de biomasa en su estado sólido (o el material de biomasa en su estado seco, estado sólido seco, estado natural o estado sin procesar) . El material de biomasa puede estar, además, en una cantidad de aproximadamente 0.5 % en peso a aproximadamente 55 % en peso, de 1 % en peso a aproximadamente 40 % en peso, de 5 % en peso a aproximadamente 60 % en peso, de aproximadamente 10 % en peso a aproximadamente 55 % en peso, de aproximadamente 10 % en peso a aproximadamente 50 % en peso, de aproximadamente 15 % en peso a aproximadamente 50 % en peso, de aproximadamente 15 % en peso a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 15 % en peso a aproximadamente 35 % en peso, de aproximadamente 15 % en peso a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 20 % en peso a aproximadamente 35 % en peso o de aproximadamente 20 % en peso a aproximadamente 30 % en peso de una mezcla hidrolizante que contiene material de biomasa, en donde la cantidad del material de biomasa se refiere al peso del material de biomasa en su estado sólido (o el material de biomasa en su estado seco, estado sólido seco, estado natural o estado sin procesar) . Un material de biomasa usado en cualquiera de los métodos puede estar presente en la mezcla de sacarificación en una cantidad de aproximadamente 0.5 % en peso, 1 % en peso. 5 % en peso, 10 % en peso, 15 % en peso, 20 % en peso, 25 % en peso, 30 % en peso, 35 % en peso, 40 % en peso, 45 % en peso, 50 % en peso, 55 % en peso o 60 % en peso del peso total de la mezcla de hidrólisis o mezcla de sacarificación, en donde la cantidad del material de biomasa se refiere al peso del material de biomasa en su estado sólido (o el material de biomasa en su estado seco, estado de sólido seco, estado natural o estado sin procesar) .
La mezcla de hidrólisis o mezcla de sacarificación incluye material de biomasa, enzima o enzimas (por ejemplo, cualquiera dé los polipéptidos proporcionados en la presente descripción) , composición enzimática (por ejemplo, cualquiera de las composiciones proporcionadas en la presente descripción) y/u otros componentes tales como los componentes necesarios para la sacarificación.
Cualquiera de las composiciones proporcionadas en la presente descripción se puede usar en los métodos descritos en la presente descripción tal como cualquiera de las composiciones proporcionadas anteriormente en la sección "Composiciones ilustrativas" . La cantidad de cualquiera de las composiciones descritas en la presente descripción usada en cualquiera de los métodos proporcionados en la presente descripción puede estar en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 0 .1 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 0 .2 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 0 .5 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 2 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg o de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 25 mg de proteína por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el material de biomasa. Una composición que no es de origen natural que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesel o una variante de este) usada en cualquiera de los métodos para hidrolizar un material de biomasa y/o métodos para reducir la viscosidad de la mezcla de biomasa puede estar en una cantidad de aproximadamente 0.05 mg a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 2 mg a aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg o de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 25 mg de proteína por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el sustrato tal como material de biomasa.
En algunos aspectos, una composición que no es de origen natural que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este) usada en cualquiera de los métodos para hidrolizar un material de biomasa y/o métodos para reducir la viscosidad de la mezcla de biomasa está en una cantidad de por lo menos aproximadamente 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg , 0.5 mg, 1 mg , 2 mg, 5 mg, 7.5 mg , 10 mg, 12 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17.5 mg, 18 mg, 20 mg, 22.5 mg, 25 mg, 27.g mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg o 50 mg de proteína por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el sustrato, tal como material de biomasa. En algunos aspectos, una composición que no es de origen natural que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este) usada en cualquiera de los métodos para hidrolizar un material de biomasa y/o métodos para reducir la viscosidad de la mezcla de biomasa está en una cantidad de no más de aproximadamente 0.1 mg, 0.2 mg, 0.5 mg, 1 mg, 2 mg, 5 mg, 7.5 mg, 10 mg, 12 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17.5 mg, 18 mg, 20 mg, 22.5 mg, 25 mg, 27.5 g mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg, 50 mg, 55 mg, 60 mg, 65 mg, 75 mg o 100 mg de proteína por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el sustrato, tal como material de biomasa. En algunos aspectos, una composición que no es de origen natural que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de G. reesei o una variante de este) usada en cualquiera de los métodos para hidrolizar un material de biomasa y/o métodos para reducir la viscosidad de la mezcla de biomasa está en una cantidad de aproximadamente 0.05 mg, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.5 mg, 1 mg, 2 mg, 5 mg, 7.5 mg, 10 mg, 12 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17.5 mg, 18 mg, 20 mg, 22.5 mg, 25 mg, 27.5 g mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg, 45 mg o 50 mg de proteína por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el sustrato tal como material de biomasa. La cantidad de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el sustrato tal como material de biomasa se puede calcular con el uso de cualquier método conocido para una persona con experiencia en la técnica. El material de biomasa puede comprender glucano, xilano y/o lignina.
En algunos aspectos de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, la cantidad de la composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa {por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) es de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 50 mg de proteína (por ' ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 40 mg de proteína, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 30 mg de proteína, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg de proteína o de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 15 mg de proteína) por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el material de biomasa. La cantidad de proteína descrita en la presente descripción se refiere al peso de proteína total en la composición. Las proteínas incluyen un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y pueden incluir, además, otras enzimas tales como polipéptidos de celulasa y/o polipéptidos de hemicelulasa en la composición.
En algunos aspectos de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, la cantidad del polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) es de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg (por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg de proteína, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg de proteína o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg de proteína) por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el material de biomasa .
En algunos aspectos de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, la composición comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa (por ejemplo, Egl de T. reesei, Eg2 de T. reesei y/o una variante de estos) , en donde la cantidad total de los polipéptidos que tienen actividad de endoglucanasa es de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg (por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg de proteína, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg de proteína o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg de proteína) por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el material de biomasa.
En algunos aspectos, la composición comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa (por ejemplo, CBH1 de T. reesei, CBH2 de T. reesei y/o una variante de estos) , en donde la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa es de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg (por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg de proteína, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg de proteína o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg de proteína) por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el material de biomasa.
En algunos aspectos de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, la composición comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos un polipéptido que tiene actividad de ß-glucosidasa (por ejemplo, un Fv3C, Pa3D, Fv3G, Fv3D, Tr3A, Tr3B, Te3A, An3A, Fo3A, Gz3A, Nh3A, Vd3A, Pa3G, Tn3B o una variante de estos) , en donde la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de ß-glucosidasa es de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg (por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg de proteína, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg de proteína o de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 5 mg de proteína) por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el material de biomasa.
En algunos aspectos, la composición comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de G. reesei o una variante de este) y por lo menos un polipéptido que tiene actividad de xilanasa (por ejemplo, Xyn3 de T. reesei, Xyn2 de T. reesei, AfuXyn2, AfuXyn5 o una variante de estos) , en donde la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de xilanasa es de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg (por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg de proteína, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg de proteína o de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 5 mg de proteína) por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el material de biomasa.
En algunos aspectos, la composición comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos un polipéptido que tiene actividad de ß-xilosidasa (por ejemplo, Fv3A, Fv43A, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Bxll de T. reesei o una variante de estos) , en donde la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de ß-xilosidasa es de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg (por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg de proteína, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg de proteína o de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 5 mg de proteína) por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el material de biomasa.
En algunos aspectos, la composición comprende un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos un polipéptido que tiene actividad de L-ot-arabinofuranosidasa (por ejemplo, Af43A, Fv43B, Pf51A, Pa51A, Fv51A o una variante de estos) , en donde la cantidad del polipéptido o polipéptidos que tienen actividad de L-ot-arabinofuranosidasa es de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg (por ejemplo, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg de proteína, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg de proteína o de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 5 mg de proteína) por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el material de biomasa.
En cualquiera de los métodos proporcionados en la presente descripción, la viscosidad de la mezcla de biomasa se puede reducir por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % en comparación con la viscosidad de la mezcla de biomasa en ausencia de una composición enzimática proporcionada en la presente descripción. Por ejemplo, se proporcionan métodos para reducir la viscosidad de una mezcla de biomasa; los métodos comprenden poner en contacto la mezcla de biomasa con una composición que no es de origen natural que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este) , en donde la viscosidad se reduce por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % en comparación con la viscosidad de la mezcla de biomasa en ausencia de un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este) . En algunos aspectos, la viscosidad se reduce aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % en comparación con la viscosidad de la mezcla de biomasa en ausencia de un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa {por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de G. reesei o una variante de este) . La reducción de la viscosidad descrita en la presente descripción se observa después de un cierto periodo de sacarificación. Por ejemplo, la reducción de la viscosidad se observa después de 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días o 5 días de sacarificación. En la técnica se conocen los métodos para medir la viscosidad. Por ejemplo, la viscosidad se puede medir a simple vista o por medio de un viscosímetro, tal como un viscosímetro Brookfield (Brookfield Engineering, Inc) . Por ejemplo, la viscosidad de la mezcla de reacción de sacarificación se puede medir con el uso de un medidor de viscosidad con un sustrato tal como mazorca de maíz pretratada con amoníaco. Un medidor de viscosidad puede medir la resistencia (torque) necesaria para rotar un husillo a una velocidad constante en la suspensión.
Los métodos proporcionados en la presente descripción se pueden realizar a una temperatura adecuada para la sacarificación. Por ejemplo, cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción se puede realizar a una temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 75 °C, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 70 °c, de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 65 °c, de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 60 °c, de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 60 °c, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 60 °c, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 55 °c, de aproximadamente 40 °C a aproximadamente 50 °C o de aproximadamente 45 °C a aproximadamente 50 °C. En algunos aspectos, cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción se puede realizar a una temperatura de aproximadamente 20 °C, aproximadamente 25 °C, aproximadamente 30 °C, aproximadamente 35 °C, aproximadamente 37 °C, aproximadamente 40 °C, aproximadamente 45 °C, aproximadamente 48 °C, aproximadamente 50 °C, aproximadamente 55 °C, aproximadamente 60 °C, aproximadamente 65 °C, aproximadamente 70 °C o de aproximadamente 75 °C.
En algunos aspectos de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el método comprende producir azúcares fermentables, en donde la cantidad de los azúcares fermentables aumenta por lo menos aproximadamente 5 % (por ejemplo, por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %) en comparación con la cantidad de los azúcares fermentables producidos en ausencia de un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) .
Además, en la presente descripción se proporciona métodos para aumentar la cantidad de azúcares fermentables (y/o aumentar la conversión de un material de biomasa en azúcares fermentables tal como la conversión de glucano) con el uso de una composición (por ejemplo, una composición que no es de origen natural) que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este) durante la hidrólisis del material de biomasa. Varios azúcares fermentables se producen a partir de la hidrólisis del material de biomasa que incluyen, pero no se limitan a, glucosa, xilosa y/o celobiosa. En algunos aspectos, la cantidad de azúcares fermentables producidos a partir de la hidrólisis de material de biomasa puede aumentar por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % en comparación con la cantidad de azúcares fermentables en ausencia de una composición enzimática proporcionada en la presente descripción. Por ejemplo, se proporcionan métodos para aumentar la cantidad de azúcares fermentables; los métodos comprenden poner en contacto el material de biomasa con una composición que no es de origen natural que comprende un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa {por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este) (para comenzar o añadir a un proceso de sacarificación) , en donde la cantidad de azúcares fermentables de la sacarificación aumenta por lo menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % en comparación con la cantidad de azúcares fermentables de la sacarificación en ausencia de un polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este) . En algunos aspectos, la cantidad de azúcares fermentables de la sacarificación aumenta aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 ¾, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % en comparación con la cantidad de azúcares fermentables de la sacarificación en ausencia de un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, EG IV tal como Eg4 de T. reesei o una variante de este) . El aumento en la cantidad de azúcares fermentables producidos a partir de la hidrólisis del material de biomasa descrito en la presente descripción se observa después de un cierto periodo de sacarificación. Por ejemplo, el aumento en la cantidad de azúcares fermentables se observa después de 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 18 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 4 días o 5 días de sacarificación. Una persona con experiencia en la técnica conoce los métodos para medir la cantidad de azúcares fermentables y/o la conversión de glucano.
La reducción de la viscosidad de la mezcla de sacarificación se puede correlacionar con una mayor producción de azúcares fermentables deseables.
En algunos aspectos, el método comprende, además, la etapa de poner en contacto el material de biomasa con una composición que comprende celulasa completa. En algunos aspectos, la etapa de contacto adicional del material de biomasa con una composición que comprende celulasa completa se realiza antes, después o al mismo tiempo que el contacto del material de biomasa con la composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa de la familia glicosil hidrolasa 61 ("GH61") (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) .
En algunos aspectos de cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción, el método comprende la etapa del contacto adicional del material de biomasa con una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de celulasa y/o un polipéptido que tiene actividad de hemicelulasa. En algunos aspectos, la etapa de contacto adicional del material de biomasa con una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de celulasa y/o un polipéptido que tiene actividad de hemicelulasa se realiza antes, después o al mismo tiempo que el contacto del material de biomasa con una composición que comprende un polipéptido que tiene actividad de endoglucanasa de glicosil hidrolasa familia 61 ("GH61") (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) .
En algunos aspectos, la composición comprende el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y comprende, además, por lo menos un polipéptido de una celulasa y/o por lo menos un polipéptido de hemicelulasa, en donde el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos un polipéptido de una celulasa y/o por lo menos un polipéptido de hemicelulasa se mezclan entre sí antes de poner en contacto el material de biomasa con una composición que comprende el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de G. reesei o una variante de este) .
En algunos aspectos, la composición comprende el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y comprende, además, por lo menos un polipéptido de una celulasa y/o por lo menos un polipéptido de hemicelulasa ( en donde el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) y por lo menos un polipéptido de una celulasa y/o por lo menos un polipéptido de hemicelulasa se añaden al material de biomasa en momentos diferentes {por ejemplo, el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa (por ejemplo, Eg4 de T. reesei o una variante de este) se añade antes o después de la adición de por lo menos un polipéptido de una celulasa y/o por lo menos un polipéptido de hemicelulasa al material de biomasa) .
La conversión de celulosa mejorada puede obtenerse a temperaturas más altas con el uso de los polipéptidos de CBH descritos, por ejemplo, en cualquiera de las siguientes publicaciones de patente de los Estados Unidos núms . US20050054039, US20050037459 , US20060205042 , US20050048619A1 y US20060218671. En la técnica se conocen métodos para sobreexpresar ß-glucosidasa . Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 6,022,725. Ver, además, por ejemplo, la publicación de patente de los Estados Unidos núm. 20050214920.
Los métodos de la presente descripción se pueden usar en la producción de monosacáridos, disacáridos y polisacáridos como materias primas químicas de fermentación para microorganismos e inductores para la producción de proteínas, productos orgánicos, sustancias químicas y combustibles, plásticos y otros productos o intermedios. Particularmente, el valor del procesamiento de residuos (granos secos de destilería, granos gastados de la fermentación de cerveza, bagazo de caña de azúcar, etc.) puede aumentar por la solubilización parcial o completa de celulosa o hemicelulosa . Además del etanol, las sustancias químicas que pueden producirse a partir de celulosa y hemicelulosa incluyen acetona, acetato, glicina, lisina, ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido láctico), 1 , 3 -propanodiol , butanodiol, glicerol, etilenglicol , furfural, polihidroxialcanoatos , cis, ácido cis-mucónico, alimentos para animales y xilosa.
Métodos comerciales Las composiciones de celulasa y/o hemicelulasa de la descripción pueden usarse, además, en entornos industriales y/o comerciales. Por consiguiente, se contempla, además, un método de fabricación, comercial o de comercialización de las composiciones de hemicelulasa y/o celulasa de origen no natural de la presente.
En una modalidad específica, las composiciones de hemicelulasa y/o celulasa de origen no natural de la invención, por ejemplo, que comprenden una o más endoglucanasas de GH61 o variantes de estas, tal como se describe en la presente descripción, pueden suministrarse o venderse a ciertas refinerías de etanol (bioetanol) u otros fabricantes de bioquímicos o materiales biológicos. En un primer ejemplo, las composiciones de celulasa y/o hemicelulasa que no son de origen natural se pueden fabricar en una instalación de fabricación de enzimas especializada en la fabricación de enzimas a escala industrial. Después, las composiciones de celulasa y/o hemicelulasa que no son de origen natural pueden envasarse o venderse a clientes del fabricante de enzimas. Esta estrategia operativa se menciona como el "modelo de suministro comercial de enzimas" en la presente descripción.
En otra estrategia operativa, las composiciones de celulasa y hemicelulasa que no son de origen natural de la invención pueden producirse en un sistema de producción de enzimas de avanzada construido por el fabricante de enzimas en el sitio que está en o cerca de las refinerías de bioetanol o de los fabricantes de bioquímicos/biomateriales ("en el sitio") . En algunas modalidades, el fabricante de enzimas y la refinería de bioetanol o el fabricante de bioquímicos/biomateriales formalizan un acuerdo de suministro de enzimas. El fabricante de enzimas diseña, controla y opera el sistema de producción de enzimas en el sitio, con el uso de la célula hospedera, la expresión y métodos de producción tal como se describen en la presente descripción para producir las composiciones de celulasa y/o hemicelulasa que no son de origen natural. En ciertas modalidades, la biomasa adecuada, preferentemente, expuesta a tratamientos previos apropiados tal como se describen en la presente descripción puede hidrolizarse con el uso de los métodos de sacarificación y las enzimas y/o composiciones enzimáticas de la presente descripción en o cerca de las refinerías de bioetanol o las instalaciones de fabricación de bioquímicos/biomateriales. Los azúcares fermentables resultantes pueden exponerse después a fermentación en las mismas instalaciones o en instalaciones del área adyacente. Esta estrategia operativa se menciona como el "modelo de biorefinería en el sitio" en la presente descripción.
El modelo de biorefinería en el sitio proporciona ciertas ventajas en comparación con el modelo de suministro comercial de enzimas que incluyen, por ejemplo, la provisión de una operación autosuficiente que permite depender mínimamente de los proveedores de enzimas. A su vez, esto permite que las refinerías de bioetanol o los fabricantes de bioquímicos/biomateriales controlen mejor la cadena de enzimas en base a la demanda en tiempo real o casi en tiempo real. En ciertas modalidades, se contempla que dos o más refinerías de bioetanol y/o los. fabricantes de bioquímicos/biomateriales que están cerca uno del otro compartan una instalación de producción de enzimas en el sitio lo que reduce el costo de transporte y almacenamiento de enzimas. Además, esto permite obtener mejoras inmediatas en la tecnología "alternativa" en la instalación de producción de enzimas en el sitio, reducir el intervalo entre las mejoras de composiciones enzimáticas para obtener una mayor producción de azúcares fermentables y, en última instancia, de bioetanol y bioquímicos.
El modelo de biorefinería en el sitio tiene una aplicabilidad más general en la producción industrial y comercialización de bioetanoles y bioquímicos, ya que puede usarse para fabricar, suministrar y producir no solamente las composiciones de celulasa y hemicelulasa de origen no natural de la presente descripción, sino, además, las enzimas y composiciones enzimáticas que procesan almidón (por ejemplo, maíz) para permitir una conversión directa más eficaz y eficiente de almidón en bioetanol o bioquímicos. En ciertas modalidades, las enzimas de procesamiento de almidón pueden producirse en la biorefinería en el sitio y, después, integrarse rápida y fácilmente en la refinería de bioetanol o la instalación de fabricación de bioquímicos/biomaterial para producir bioetanol.
Por lo tanto, en ciertos aspectos, la invención se refiere, además, a cierto método comercial para aplicar las enzimas (por ejemplo, ciertas endoglucanasas de GH61 y variantes de estas), células, composiciones (por ejemplo, que comprenden una endoglucanasa de GH61 adecuada o una variante de esta) y procesos en la presente descripción para la fabricación y comercialización de bioetanol, biocombustible , bioquímicos u otros biomateriales determinados . En algunas modalidades, la invención se relaciona con la aplicación de tales enzimas, células, composiciones y procesos en un modelo de biorefinería en el sitio. En otras modalidades, la invención se relaciona con la aplicación de tales enzimas, células, composiciones y procesos en un modelo de suministro comercial de enzimas.
En relación con ello, la descripción proporciona el uso de las enzimas y/o las composiciones enzimáticas de la invención en un entorno comercial. Por ejemplo, las enzimas y/o composiciones enzimáticas de la descripción se pueden vender en el mercado adecuado combinadas con instrucciones sobre los métodos de uso típicos o preferidos para las enzimas y/o composiciones. Por consiguiente, las enzimas y/o composiciones enzimáticas de la descripción se pueden usar o comercializar dentro de un modelo de suministro comercial de enzimas, en donde las enzimas y/o composiciones enzimáticas de la descripción se venden a un fabricante de bioetanol, una refinería de combustible o un fabricante de bioquímicos o biomateriales que está en el negocio de la producción de combustibles o productos biológicos. En algunos aspectos, la enzima y/o composición enzimática de la descripción se puede vender o comercializar con el uso de un modelo de biorefinería en el sitio, en donde la enzima y/o composición enzimática se produce o prepara en una instalación en o cerca de una refinería de combustibles o instalación del fabricante de bioquímicos/materiales biológicos, y la enzima y/o composición enzimática de la invención se adapta a las necesidades específicas de la refinería de combustibles o fabricante de bioquímicos/materiales biológicos en tiempo real. Además, la descripción se refiere al suministro a estos fabricantes del apoyo técnico y/o las instrucciones de uso de las enzimas y/o composiciones enzimáticas para fabricar y comercializar el producto biológico deseado (por ejemplo, biocombustible , bioquímicos, materiales biológicos, etc.) Los siguientes son e emplos de los métodos y composiciones de la invención. Se entiende que pueden practicarse otras modalidades diversas, en base a la descripción general proporcionada anteriormente.
EJEMPLOS Ejemplo 1. Ensayos/Métodos En los ejemplos descritos más abajo se usaron, generalmente, los siguientes ensayos/métodos. Cualquier desviación de los protocolos proporcionados más abajo se indican en los ejemplos específicos.
A. Tratamiento previo de sustratos de biomasa La mazorca de maíz, el rastrojo de maíz y el césped de pradera se trataron antes de la hidrólisis enzimática de conformidad con los métodos e intervalos de procesamiento descritos en la publicación de patente internacional núm. WO 06110901A (a menos que se indique de cualquier otra forma) .
Estas referencias para el tratamiento previo se incluyen, además, en las descripciones de las publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos núms . 20070031918- Al, 20070031919-A1, 20070031953 -Al y/o 20070037259-A1.
Se obtuvo rastrojo de maíz tratado por explosión de fibras por amoniaco (AFEX, por sus siglas en inglés) de Michigan Biotechnology Institute International (MBI) . La composición del rastrojo de maíz se determinó por MBI (Teymouri, F et al . Applied Biochemistry and Biotechnology, 2004, 113:951-963) con el uso del procedimiento del Laboratorio Nacional de Energía Renovable (NREL) , NREL LAP-002. Los procedimientos de NREL están disponibles en: http://www.nrel.gov/ biomass/analytical_procedures . html .
Los sustratos de pulpa y papel de FPP se obtuvieron de SMURFIT KAPPA CELLULOSE DU PIN, Francia.
Se obtuvo bagazo de caña de azúcar expandida por vapor (SEB, por sus siglas en inglés) de SunOpta (Glasser, WG et al. Biomass and Bioenergy 1998, 14(3): 219-235; Jollez, P et al. Advances in thermochemical biomass conversión, 1994, 2 -.1659-1669) .
B. Análisis composicional de la biomasa El método de hidrólisis ácida de 2 etapas descrito en "Determination of structural carbohydrates and lignin in the biomass" (National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO 2008 http://www.nrel.gov/biomass/pdfs/42618.pdf) se usó para medir la composición de los sustratos de biomasa. Con el uso de este método se reportaron resultados de hidrólisis enzimática en la presente descripción en términos de porcentaje de conversión con respecto a · la producción teórica a partir del contenido inicial de glucano y xilano del sustrato .
C. Ensayo de proteínas totales El ensayo de proteínas de BCA es un ensayo colorimétrico que mide la concentración de proteínas con un espectrofotómetro . El kit del ensayo de proteínas de BCA (Pierce Chemical, núm. de producto 23227) se usó según las instrucciones del fabricante. Las diluciones de enzimas se prepararon en tubos de prueba con el uso de un regulador acetato de sodio 50 mM, pH 5. La solución enzimática diluida (0.1 mi) se añadió en tubos de centrífuga Eppendorf de 2 mi que contenían 1 mi de ácido tricloroacético (TCA) al 15 %. Los tubos se procesaron en vórtice y se colocaron en un baño de hielo por 10 min. Después, las muestras se centrifugaron a 14,000 rpm por 6 min. El sobrenadante se vertió, el gránulo se resuspendió en 1 mi de NaOH 0.1 N y los tubos se procesaron en vórtice hasta que el gránulo se disolvió. Se preparó soluciones estándar de BSA a partir de una solución inicial de 2 mg/ml. Se preparó la solución de trabajo de BCA por el mezclado de 0.5 mi del reactivo B con 25 mi del reactivo A. Se añadió 0.1 mi de la muestra de enzima resuspendida en 3 tubos de centrífuga Eppendorf. Se (2) añadió dos mi de solución de trabajo de BCA Pierce en cada muestra y tubos Eppendorf estándar de BSA. Todos los tubos se incubaron en un baño maría a 37 °C por 30 min. Después, las muestras se enfriaron hasta temperatura ambiente (15 min) y se midió la absorbancia a 562 nm en un espectrofotómetro .
Se calculó los valores promedio para la absorbancia de proteínas para cada estándar. Se gráfico el estándar de proteínas promedio, la absorbancia en el eje x y la concentración (mg/ml) en el eje y. Los puntos se ajustaron en una ecuación lineal: y=mx +b La concentración en bruto de las muestras de enzimas se calculó mediante la sustitución de la absorbancia para el valor x. La concentración total de proteínas se calculó por la multiplicación con el factor de dilución.
La proteína total de muestras purificadas se determinó por medio de A280 (Pace, CN, et al. Protein Science, 1995, 4 :2411-2423) .
El contenido de proteínas totales de los productos de fermentación se midió algunas veces como el nitrógeno total por combustión, captura y medición de nitrógeno liberado ya sea por Kjeldahl (rtech laboratories , www.rtechlabs.com) o internamente por el método de Dumas (TruSpec CN, www.leco.com) (Sader, A. P.O. et al., Archives of Veterinary Science, 2004, 9(2):73-79). Para las muestras que contienen proteínas complejas, por ejemplo caldos de fermentación, se usó un contenido de N promedio de 16 % y el factor de conversión de 6.25 para nitrógeno a proteína. En algunos casos, la proteína precipitable total se midió para eliminar el nitrógeno no proteico interférente . Se usó una concentración de TCA final de 12.5 % y el gránulo de TCA que contiene proteínas se resuspendió en NaOH 0.1 M.
En algunos casos se usó el ensayo Coomassie combinado con el ensayo Better Bradford (Thermo Scientific, Rockford, IL, núm. de producto 23238) según las instrucciones del fabricante. En otros casos, la proteína total se midió con el uso del método de Biuret con las modificaciones realizadas por Weichselbaum y Gornall con el uso de albúmina sérica bovina como un calibrador (Weichselbaum, T. Amer. J. Clin. Path. 1960,16:40; Gornall, A. et al. J. Biol . Chem. 1949, 177 : 752) .
D. Determinación de glucosa con el uso de ABTS El ensayo de ABTS (ácido 2, 2 ' -azino-bis (3-etilentiazolina-6) -sulfónico) para determinar la glucosa se basa en el principio que indica que en presencia de 02, la glucosa oxidasa cataliza la oxidación de glucosa y al mismo tiempo produce cantidades estequiométricas de peróxido de hidrógeno (H202) . Esta reacción es seguida por la oxidación de ABTS catalizada por peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés) que se correlaciona linealmente con la concentración de H202. La emergencia de ABTS oxidado se indica por la evolución de un color verde que se cuantifica a una OD de 405 nm. Se preparó una mezcla de ABTS en polvo (Sigma, núm. A1888-5g 2.74 mg/ml), 0.1 U/ml de HRP (100 U/ml , Sigma, núm. P8375) y 1 U/ml de glucosa oxidasa, (OxyGO® HP L5000, 5000 U/ml, Genencor División, Danisco USA) en regulador acetato de Na 50 mM, pH 5.0 y se mantuvo en la oscuridad (sustrato). Se preparó estándares de glucosa (0, 2, 4, 6, 8, 10 nmol) en regulador acetato de Na 50 mM, pH 5.0 y 10 µ? de cada estándar se añadió en una MTP de fondo plano de 96 pocilios por triplicado. Además, en la MTP se añadió diez (10) µ? de muestras diluidas en serie. Se añadió cien (100) µ? de solución de sustrato de ABTS en cada pocilio y la placa se colocó en un lector de placa espectrofotométrico para leer cinéticamente la oxidación de ABTS por 5 min a 405 nm.
Alternativamente, se midió la absorbancia a 405 nm después de 15-30 min de incubación seguido del enfriamiento de la reacción con regulador acetato de Na 50 mM, pH 5.0 que contiene SDS al 2 % .
E. Análisis del azúcar por HPLC Se prepararon muestras a partir de la sacarificación de biomasa por centrifugación para aclarar el material insoluble, filtración a través de un filtro de nailon de 0.22 µ?? (filtro de tubo de centrífuga Spin-X, Corning Incorporated, Corning, NY) y dilución hasta una concentración de azúcares solubles apropiada con agua destilada. Se determinó los azúcares de los monómeros en un equipo Shodex Sugar SH-G SH1011, 8x300 mm con una columna de protección SH-1011P de 6x50 mm (www.shodex.net) . Como solvente se usó H2S04 0.01 N a 0.6 ml/min. La temperatura de la columna se mantuvo a 50 °C y se realizó la detección por índice de refracción. Alternativamente, se analizaron los azúcares con el uso de una columna Biorad Aminex HPX-87H con un detector del índice de refracción aters 2410. Se usó un tiempo de análisis de 20 min, un volumen de inyección de 20 µ? de muestra diluida, una fase móvil de ácido sulfúrico 0.01 N, 0.2 µp? de filtrado y desgasificado, un régimen de flujo de 0.6 ml/min y una temperatura de columna de 60 °C. Los estándares externos de glucosa, xilosa y arabinosa se usaron con cada conjunto de muestras .
Los azúcares oligoméricos se separaron por cromatografía de exclusión de tamaño en HPLC con el uso de una columna Tosoh Biosep G2000PW de 7.5 mmx60 cm (www.tosohbioscience.de). Como solvente se usó agua destilada a 0.6 ml/min y la columna se usó a temperatura ambiente. Se usó seis estándares de azúcar de carbono para la calibración del tamaño: estaquiosa, rafinosa, celobiosa y glucosa; y 5 azúcares de carbono: xilohexosa, xilopentosa, xilotetrosa, xilotriosa, xilobiosa y xilosa. Se obtuvo xilooligómeros de Megazyme (www.megazyme.com). La detección se realizó por índice de refracción y los resultados se reportaron cuantitativamente en unidades de área pico o áreas pico relativas en porcentaje.
Los azúcares solubles totales se determinaron por hidrólisis de las muestras clarificadas centrifugadas y filtradas descritas anteriormente. La muestra clarificada se diluyó 1 a 1 con H2S04 0.8 N y la solución resultante se procesó en autoclave en un frasco con tapa por un tiempo de ciclo total de 1 h a 121 °C. Los resultados se reportan sin corrección para la pérdida de azúcar monomérica durante la hidrólisis.
F. Preparación de oligómeros a partir de mazorca y ensayos de enzimas Se preparó oligómeros a partir de la hidrólisis de Xyn3 de T. reesei de mazorcas de maíz por la incubación de 8 mg de Xyn3 de T. reesei por g de glucano + xilano con 250 g de peso seco de mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido en regulador acetato Na 50 mM pH 5.0 (pH ajustado con ácido sulfúrico 1 N) . La reacción continuó por 72 h a 48 °C, agitación rotativa a 180 rpm. El sobrenadante se centrifugó 9000 x G, después se filtró a través de filtros de 0.22 pm Nalgene para recuperar los azúcares solubles . Para los ensayos de enzimas posteriores, se incubó alícuotas de 100 µ? del sobrenadante que contenía oligómero de Xyn3 de T. reesei con 1 ig/il de cada cepa integrada de T. reesei H3A, 1 g/pl de cepa integrada de T. reesei H3A/EG4 núm. 27 o control de agua en tubos Eppendorf a 48 °C por 2.5 h. Después, los sobrenadantes se diluyeron 4X con agua MilliQ helada, se filtraron y analizaron por HPLC para determinar la liberación de glucosa de los oligómeros.
G. Ensayo de sacarificación de la mazorca de maíz Para un ejemplo típico de la presente descripción, a menos que se describa específicamente de cualquier otra forma con los ejemplos particulares, la sacarificación de la mazorca de maíz se realizó en un formato de placa de microtitulación de conformidad con los siguientes procedimientos. El sustrato de biomasa, por ejemplo, una mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido se diluyó en agua y el pH se ajustó con ácido sulfúrico para crear una suspensión de celulosa al 7 % pH 5 que, después, se usó directamente sin procesamiento adicional en los ensayos. Las muestras enzimáticas se cargaron en base a los mg de proteína total por g de celulosa (según se determinó con el uso de métodos de análisis de composición convencionales, tales como, por ejemplo, con el uso del método descrito en el Ejemplo 1A anterior) en el sustrato (por ejemplo, la mazorca de maíz) . Después, las enzimas se diluyeron en acetato de sodio 50 mM, pH 5.0, para obtener la concentración de carga deseada. Se añadió cuarenta (40) µ? de solución enzimática en 70 mg de mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido con celulosa al 7 % por pocilio (equivalente a celulosa al 4.5 % final por pocilio) . Las placas del ensayo se cubrieron con selladores de placa de aluminio, se mezclaron a temperatura ambiente y se incubaron a 50 °C, 200 rpm, por 3 días ("3d") . Al final del periodo de incubación, la reacción de sacarificación se enfrió mediante la adición en cada pocilio de 100 µ? de un regulador de glicina 100 mM, pHlO.0. La placa se centrifugó por 5 min a 3000 rpm. Después, se añadió diez (10) µ? del sobrenadante en 200 µ? de agua MilliQ en una placa de HPLC de 96 pocilios y los azúcares solubles se midieron con el uso de HPLC.
Ejemplo 2. Construcción de una cepa de expresión integrada de Trichoderma reesei Se construyó una cepa de expresión integrada de Trichoderma reesei que coexpresaba cinco genes: el gen de ß-glucosidasa de T. reesei bgll, el gen de endoxilanasa de T. reesei xyn3 , el gen de ß-xilosidasa de F. verticillioides fv3A, el gen de ß-xilosidasa de F. verticillioides fv43D y el gen de a-arabinofuranosidasa de F. verticillioides fv51A.
La construcción de los casetes de expresión para estos genes diferentes y la transformación de T. reesei se describen más abajo.
A. Construcción del vector de expresión de ß-glucosidasa DNA 2.0 (Menlo Park, Estados Unidos) realizó la optimización con codones de la parte N-terminal del gen nativo de ß-glucosidasa de T. reesei bgll. La parte sintetizada comprendía las primeras 447 bases de la región codificante. Este fragmento se amplificó por PCR con el uso de los iniciadores SK943 y SK941. La región restante del gen bgll nativo se amplificó por PCR a partir de una muestra de ADN genómico extraído de la cepa de T. reesei RL-P37 (Sheir-Neiss , G et al. Appl . Microbiol . Biotechnol . 1984, 20:46-53), con el uso de los iniciadores SK940 y SK942. Estos dos fragmentos de PCR del gen bgll se fusionaron entre sí en una reacción de PCR de fusión con el uso de los iniciadores SK943 y SK942: iniciador directo SK943 : ( 5 ' -CACCATGAGATATAGAACAGCTGCCGCT-3 ' ) (sec. con núm. de ident.:121) iniciador inverso SK941: (5'- CGACCGCCCTGCGGAGTCTTGCCCAGTGGTCCCGCGACAG-3 ' ) (sec. con núm. de ident . : 122 ) iniciador directo (SK940) : (5'- CTGTCGCGGGACCACTGGGCAAGACTCCGCAGGG CGGTCG-3') (sec. con núm. de ident . : 123) iniciador inverso (SK942): (5 ' -CCTACGCTACCGACAGAGTG-3 ' ) (sec. con núm. de ident. :124) Los fragmentos de la PCR de fusión resultantes se clonaron en el vector de entrada Gateway ® pENTR™/D-TOPO® y se transformaron en células químicamente compatibles de E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen) de modo que se obtuvo el vector intermedio, pENTR-TOPO-Bgll- (943/942 ) (Fig. 8A) . Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADN insertado. El vector pENTR-943/942 con la secuencia de bgll correcta se recombinó con pTrex3g con el uso de un protocolo de reacción LR clonase® producido por Invitrogen. La mezcla de reacción LR clonase se transformó en células químicamente competentes de E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen) , de modo que se obtuvo el vector de expresión final, pTrex3g 943/942 (Fig. 8B) . El vector contiene, además, el gen amdS de Aspergillus nidulans que codifica acetamidasa, como un marcador seleccionable para la transformación de T. reesei. El cásete de expresión se amplificó por PCR con los iniciadores SK745 y SK771 para generar un producto para la transformación de T. reesei.
Iniciador directo SK771: (5 ' -GTCTAGACTGGAAACGCAAC -3') (sec. con núm. de ident.:125) iniciador inverso SK745: (5 ' -GAGTTGTGAAGTCGGTAATCC -3') (sec. con núm. de ident . :126) B. Construcción del cásete de expresión de endoxilanasa El gen de endoxilanasa nativo de T. reesei xyn3 se amplificó por PCR a partir de una muestra de ADN genómico extraído de G. reesei con el uso de los iniciadores xyn3F-2 y xyn3R-2.
Iniciador directo xyn3F-2: (5'-CACCATGAAAGCAAACGTCATCTTGTGCCTCCTGG-3 ' ) (sec. con núm. de ident . : 127) iniciador inverso (xyn3R-2) : (5'- CTATTGTAAGATGCCAACAATGCTGTTATATGC CGGCTTGGGG-3 ' ) (sec. con núm. de ident. :128) Los fragmentos de la PCR resultantes se clonaron en el vector de entrada Gateway® pENTR™/D-T0P0® y se transformaron en células químicamente competentes E. coli One Shot® TOP10, (Fig. 8C) . Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADN insertado. El vector pENTR/Xyn3 con la secuencia de xyn3 correcta se recombinó con pTrex3g con el uso de un protocolo de reacción LR clonase® producido por Invitrogen. La mezcla de reacción LR clonase se transformó en células químicamente competentes de E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen) , de modo que se obtuvo el vector de expresión final, pTrex3g/Xyn3 (Fig. 8D) . El vector contiene, además, el gen amdS de Aspergillus nidulans que codifica acetamidasa, como un marcador seleccionable para la transformación de T. reesei. El cásete de expresión se amplificó por PCR con los iniciadores SK745 y SK822 para generar un producto para la transformación de T. reesei. iniciador directo SK745: (5 ' -GAGTTGTGAAGTCGGTAATCC -3') (sec. con núm. de ident.:129) iniciador inverso SK822 : (5 ' -CACGAAGAGCGGCGATTC-3 ' ) (sec. con núm. de ident.:130) C. Construcción del vector de expresión de Fv3A de ß-xilosidasa El gen de ß-xilosidasa de F. verticillioides fv3A se amplificó a partir de una muestra de ADN genómico de F. verticillioides con el uso de los iniciadores MH124 y MH125. iniciador directo MH124 : (5'-CAC CCA TGC TGC TCA ATC TTC AG -3') (sec. con núm. de ident.:131) iniciador inverso MH125: (5'-TTA CGC AGA CTT GGG GTC TTG AG -3') (sec. con núm. de ident.:132) Los fragmentos de la PCR se clonaron en el vector de entrada Gateway® pENTR™/D-TOPO® y se transformaron en células químicamente compatibles de E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen) de modo que se obtuvo el vector intermedio, pENTR-Fv3A (Fig. 8E) . Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADN insertado. El vector pENTR-Fv3A con la secuencia de fv3A correcta se recombinó con pTrex6g (Fig. 8F) con el uso de un protocolo de reacción LR clonase® producido por Invitrogen. La mezcla de reacción LR clonase se transformó en células químicamente competentes de E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen) , de modo que se obtuvo el vector de expresión final, pTrex6g/Fv3A (Fig. 8G) . El vector contiene, además, un mutante resistente al clorimuron etil del gen nativo de T. reesei acetolactato sintasa (ais) designado como alsR que se usa junto con su promotor nativo y terminador como un marcador seleccionable para la transformación de T. reesei (patente núm. WO2008/039370 Al) . El cásete de expresión se amplificó por PCR con los iniciadores SK1334, SK1335 y SK1299 para generar un producto para la transformación de T. reesei. iniciador directo SK1334: ( 5 ' -GCTTGAGTGTATCGTGTAAG -3') (sec. con núm. de ident.:133) iniciador directo SK1335: ( 5 ' -GCAACGGCAAAGCCCCACTTC -3') (sec. con núm. de ident. : 134) iniciador inverso SK1299: (5'- GTAGCGGCCGCCTCATCTCATCTCATCCATCC -3') (sec. con núm. de ident . : 135) 23 D. Construcción del cásete de expresión de Fv43D de ß-xilosidasa Para la construcción del cásete de expresión de Fv43D de ß-xilosidasa de F. verticillioides, el producto génico de fv43D se amplificó a partir de una muestra de ADN genómico de F. verticillioides con el uso de los iniciadores SK1322 y SK1297. Una región del promotor del gen de endoglucanasa egll se amplificó por PCR a partir de una muestra de ADN genómico de T. reesei extraído de la cepa RL-P37 con el uso de los iniciadores SK1236 y SK1321. Estos dos fragmentos de ADN amplificados por PCR se fusionaron posteriormente en una reacción de PCR de fusión con el uso de los iniciadores SK1236 y SK1297. El fragmento de la PCR de fusión resultante se clonó en el vector pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) para producir el plásmido TOPO Blunt/Pegll-Fv43D (Fig. 8H) y células químicamente competentes de E. coli One Shot® TOP10 (Invitrogen) se transformaron con el uso de este plásmido. Se extrajo el ADN del plásmido de los diversos clones de E.Coli y se confirmó por medio de digestión restrictiva.
Iniciador directo SK1322: (5 ' -CACCATGCAGCTCAAGTTTCTGTC-3 ' ) (sec. con núm. de ident.:136) iniciador inverso SK1297: (5'- GGTTACTAGTCAACTGCCCGTTCTGTAGCGAG-3 ' ) (sec. con núm. de ident . : 137) iniciador directo SK1236: ( 5 ' -CATGCGATCGCGACGTTTTGGTCAGGTCG- 3') (sec. con núm. de ident.:138) iniciador inverso SK1321: (5 ' -GACAGAAACTTGAGCTGCATGGTGTGGGACA ACAAGAAGG-3 ' ) (sec. con núm. de ident.:139) El cásete de expresión se amplificó por PCR a partir de TOPO Blunt/Pegll-Fv43D con los iniciadores SK1236 y SK1297 para generar un producto para la transformación de T. reesei .
E. Construcción del cásete de expresión de otarabinofuranosidasa Para la construcción del cásete de expresión del gen de a-arabinofuranosidasa de F. verticillioides fv51A, el producto génico de fv51A se amplificó a partir de un ADN genómico de F. verticillioides con el uso de los iniciadores SK1159 y SK1289. Una región del promotor del gen de endoglucanasa egll se amplificó por PCR a partir de una muestra de ADN genómico de T. reesei extraído de la cepa RL-P37 con el uso de los iniciadores SK1236 y SK1262. Estos dos fragmentos de ADN amplificados por PCR se fusionaron posteriormente en una reacción de PCR de fusión con el uso de los iniciadores SK1236 y SK1289. El fragmento de la PCR de fusión resultante se clonó en el vector pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen) para producir el plásmido TOPO Blunt/Pegll-Fv51A (Fig. 81) y células químicamente competentes de E. coli One Shot® ???10 (Invitrogen) se transformaron con el uso de este plásmido. Iniciador directo SK1159: ( 5 ' -CACCATGGTTCGCTTCAGTTCAATCCTAG-3') (sec. con núm. de ident.:140) iniciador inverso SK1289: (5 ' -GTGGCTAGAAGATATCCAACAC-3 ' ) (sec. con núm. de ident.:141) iniciador directo SK1236: ( 5 '-CATGCGATCGCGACGTTTTGGTCAGGTCG-3') (sec. con núm. de ident.:142) iniciador inverso SK1262: (5'- GAACTGAAGCGAACCATGGTGTGGGACAACAAGAA GGAC-3') (sec. con núm. de ident . : 143) El cásete de expresión se amplificó por PCR con los iniciadores SK1298 y SK1289 para generar un producto para la transformación de T. reesei . iniciador directo SK1298: (5 ' -GTAGTTATGCGCATGCTAGAC-3 ' ) (sec. con núm. de ident. :144) iniciador inverso SK1289: ( 5 ' -GTGGCTAGAAGATATCCAACAC-3 ' ) (sec. con núm. de ident.: 145) F. Cotransformación de casetes de expresión de T. reesei para ß-glucosidasa y endoxilanasa Se cotransformó una cepa mutante de Trichoderma reesei derivada de RL-P37 (Sheir-Neiss , G et al. Appl . Microbiol. Biotechnol . 1984, 20:46-53) y seleccionada para una producción alta de celulasa con el cásete de expresión de ß-glucosidasa (promotor de cbhl , gen de ß-glucosidasa 1 de T. reesei, terminador de cbhl y marcador de amdS) y el cásete de expresión de endoxilanasa (promotor de cbhl, xyn3 de T. reesei y terminador de cbhl) con el uso de transformación mediada por PEG (Penttila, M et al . Gene 1987, 61 (2) : 155-64) .
Se aislaron numerosos transformantes y se los examinó para determinar la producción de ß-glucosidasa y endoxilanasa. Un transformante denominado cepa de T. reesei núm. 229 se usó para la transformación con los otros casetes de expresión. G. Cotransformación de la cepa de T. reesei núm. 229 con casetes de expresión para dos ß-xilosidasas y una otarabinofuranosidasa La cepa de T. reesei nüm. 229 se cotransformó con el cásete de expresión de fv3A de ß-xilosidasa (promotor de cbhl, gen fv3A, terminador de cbhl y marcador de alsR) , el cásete de expresión de fv43D de ß-xilosidasa (promotor de egll, gen de fv43D, terminador de fv43D nativo) y el cásete de expresión de ??51? de a-arabinofuranosidasa (promotor de egll, gen de fv51A, terminador nativo de fv51A) con el uso de electroporación (ver, por ejemplo, la patente núm. WO 08153712). Los transformantes se seleccionaron en placas de agar de Vogel que contenían clorimurón etil (80 ppm) . El agar de Vogel se preparó de la siguiente manera, por litro.
Solución inicial de Vogel 50 x 20 mi (receta más abajo) Agar de BBL 20 g Con H20 desionizada hasta 980 mi Adición posterior a la esterilización: Glucosa al 50 20 mi Solución inicial de Vogel 50 x, por litro; En 750 ral de H20 desionizada, disolver sucesivamente : Citrato de Na3*2H20 125 g KH2P04 (anhidro) 250 g NH4NO3 (anhidro) 100 g MgS04*7H20 10 g CaCl2*2H20 5 g Solución de oligoelementos de Vogel 5 mi (receta más abajo) D-biotina 0.1 g Con H20 desionizada, hasta 1 1 Solución de oligoelementos de Vogel: Ácido cítrico 50 g ZnS04.*7H20 50 g Fe (NH4) 2S04. *6H20 10 g CuS04.5H20 2.5 g MnS04.4H20 0.5 g H3BO3 0.5 g Na2Mo04.2H20 0.5 g Se aislaron numerosos transformantes y se los examinó para determinar la producción de ß-xilosidasa y L-a-arabinofuranosidasa . Los transformantes se analizaron, además, para determinar el desempeño de conversión de la biomasa de conformidad con el ensayo de sacarificación de la mazorca descrito en el Ejemplo 1 (más arriba) . Los ejemplos de cepas de expresión integradas de T. reesei descritos en la presente descripción son H3A, 39A, A10A, 11A y G9A que expresan todos los genes para beta-glucosidasa 1 de T. reesei, Xyn3 de T. reesei, Fv3A, Fv51A y Fv43D, en diferentes relaciones. Otras cepas de T. reesei integradas incluyen aquellas en donde la mayor parte de los genes para beta-glucosidasa 1 de T. reesei, Xyn3 de T. reesei, Fv3A, FV51A y Fv43D se expresaron en relaciones diferentes. Por ejemplo, una cepa carecía de Xyn3 de T. reesei sobreexpresado; otra carecía de Fv51A según se determinó por medio de análisis Western Blot; otras dos carecían de Fv3A, una carecía de Bgll sobreexpresado (por ejemplo, la cepa H3A-5) .
H. Composición de la cepa integrada de T. reesei H3A La fermentación de la cepa integrada de T. reesei H3A produce las siguientes proteínas Xyn3 de T. reesei, Bgl 1 de G. reesei, Fv3A, Fv51A y Fv43D en relaciones determinadas tal como se describe en la presente descripción y se muestra en la Fig. 9.
I. Análisis de proteínas por HPLC Se realizó cromatografía en líquido (LC, por sus siglas en inglés) y espectroscopia de masa (MS, por sus siglas en inglés) para separar, identificar y cuantificar las enzimas contenidas en caldos de fermentación. Las muestras de enzimas se trataron primero con una endoH glicosidasa expresada en forma recombinante de S. plicatus (por ejemplo, NEB P0702L) . La endoH se usó en una relación de 0.01-0.03 µg de proteína endoH por ig de proteína total de la muestra y se incubó por 3 h a 37 °C, pH 4.5-6.0 para eliminar enzimáticamente la glicosilación enlazada por N antes del análisis por HPLC. Después, se inyectó aproximadamente 50 ig de proteína para la cromatografía por interacción hidrófoba con el uso de un sistema de HPLC Agilent 1100 con una columna de HIC-fenilo y un gradiente de sal alto a bajo durante 35 min. El gradiente se obtuvo con el uso de regulador con alto contenido de sal A: sulfato de amonio 4 M que contenía fosfato de potasio 20 mM pH 6.75 y regulador con bajo contenido de sal B: fosfato de potasio 20 mM pH 6.75. Los picos se detectaron con luz UV a 222 nm y las fracciones se recolectaron e identificaron por espectroscopia de masa. Las concentraciones de proteínas se reportan como el porcentaje de cada área pico relativa al área integrada total de la muestra.
J. Efecto de la adición de proteínas purificadas en el caldo de fermentación de la cepa integrada de T. reesei H3A en la sacarificación de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido Las proteínas purificadas (y una proteína sin purificar) se diluyeron en serie a partir de la solución inicial y se añadieron a un caldo de fermentación de la cepa integrada de T. reesei ?3? para determinar su beneficio para la sacarificación de la biomasa pretratada. La mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido se cargó en pocilios de una placa de microtitulación (MTP, por sus siglas en inglés) en una concentración de 20 % de sólidos (p/p) (~5 mg de celulosa por pocilio), pH 5. La proteína de H3A (en la forma de un caldo de fermentación) se añadió en cada pocilio a 20 mg de proteína/g de celulosa. Se añadió volúmenes de 10, 5, 2 y 1 µ? de cada proteína diluida (Fig. 10) en pocilios individuales y se añadió agua de modo que la adición de líquido en cada pocilio alcanzó un total de 10 µ? . Los pocilios de referencia incluyeron adiciones de 10 µ? de agua o diluciones de caldo de fermentación de H3A adicional. Las MTP se sellaron con lámina de metal y se incubaron a 50 °C con agitación a 200 RPM en el agitador de un incubador Innova por tres días. Las muestras se enfriaron con 100 µ? de glicina 100 mM, pH 10. Las muestras enfriadas se cubrieron con un sello plástico y se centrifugaron a 3000 RPM por 5 min a 4 °C. Se diluyó una alícuota (5 µ?) de las reacciones enfriadas con 100 µ? de agua y la concentración de glucosa producida en las reacciones se determinó con el uso de HPLC. Los datos de la glucosa se graficaron como una función de la concentración de proteínas añadidas en los 20 mg/g de H3A (las concentraciones de las adiciones de proteínas fueron variables debido a concentraciones iniciales diferentes y a las adiciones por volumen) . Los resultados se muestran en las Figs. 11A-11D.
Ejemplo 3. Construcción de cepas de T. reesei A. Construcción y análisis de la cepa de T. reesei H3A/EG4 núm. 27 Se clonó un cásete de expresión que contenía el promotor de egll de T. reesei (mencionado, además, como "Cel 7B" ) , el marco de lectura abierto de Eg4 de G. reesei (mencionado, además, como "TrEG4" o "Cel 61A") y la secuencia terminadora de cbhl (Cel 7A) (Fig. 12A) de Trichoder a reesei y el marcador seleccionábale sucA (ver, Boddy et al., Curr. Genet . 1993, 24:60-66) de Aspergillus niger en pCR Blunt II TOPO (Invitrogen) (Fig. 12B) .
El cásete de expresión Pegll-eg -sucA se amplificó por medio de PCR con los iniciadores: SK1298: 5 ' -GTAGTTATGCGCATGCTAGAC-3 ' (sec. con núm. de ident . : 146) 214: 5 ' -CCGGCTCAGTATCAACCACTAAGCACAT-3 ' (sec. con núm. de ident . : 147) Pfu Ultra II (Stratagene) se usó como la polimerasa para la reacción de PCR. Los productos de la reacción de PCR se purificaron con el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) según el protocolo del fabricante. Después, los productos de la reacción de PCR se concentraron con el uso de un concentrador al vacío hasta 1-3 µg/µl. La cepa huésped de T. reesei objetivo de la transformación (H3A) se cultivó hasta obtener la esporulación completa en placas de agar dextrosa y papa por 5 d a 28 °C. Las esporas de 2 placas se recolectaron con agua MilliQ y se filtraron a través de un filtro celular de 40 µ? (BD Falcon) . Las esporas se transfirieron a un tubo cónico de 50 mi y se lavaron 3 veces por centrifugación repetida con 50 mi de agua. Se realizó un lavado final con solución de sorbitol 1.1 M. Las esporas se resuspendieron en un pequeño volumen (menos de 2 veces el volumen del gránulo) con el uso de solución de sorbitol 1.1 M. Después, la suspensión de esporas se mantuvo en hielo. La suspensión de esporas (60 µ?) se mezcló con 10-20 µg de ADN y se transfirió a la cubeta de electroporacion (E-shot, cubeta de electroporacion estándar de 0.1 cm de Invitrogen) . Las esporas se electroporaron con el uso del Biorad Gene Pulser Xcell configurado a 16 kV/cm, 25 pF, 400 O. Después de la electroporacion se añadió 1 mi de solución de sorbitol 1.1. M en la suspensión de esporas. La suspensión de esporas se colocó en placas sobre agar de Vogel (ver el Ejemplo 2G) que contenía sacarosa al 2 % como la fuente de carbono.
Las placas de transformación se incubaron a 30 °C por 5-7 d. Los transformantes iniciales se inocularon otra vez por estrías sobre placas de Vogel secundarias con sacarosa y se cultivaron a 30 °C por otros 5-7 d. Después, las colonias sencillas cultivadas en placas de selección secundarias se cultivaron en pocilios de placas de microtitulación con el uso del método descrito en la patente núm. WO/2009/114380. Los sobrenadantes se analizaron en SDS-PAGE para controlar los niveles de expresión antes del análisis del desempeño de la sacarificación.
Un total de 94 transformantes sobreexpresaron EG4 en la cepa H3A. Dos cepas de control H3A se cultivaron en placas de microtitulación junto con las cepas H3A/EG4. El análisis del desempeño de cepas de T. reesei que expresan la proteína EG4 se realizó con el uso de la mazorca de maíz pretratada con amoniaco. La mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido se suspendió en agua y se ajustó hasta pH 5.0 con ácido sulfúrico para obtener celulosa al 7 %. La suspensión de despachó en una placa de microtitulación de 96 pocilios de fondo plano (Nunc, 269787) y se centrifugó a 3000 rpm por 5 min .
Las reacciones de sacarificación de la mazorca de maíz se iniciaron por la adición de 20 µ? de H3A o caldo de cultivo de la cepa H3A/EG4 por pocilio de sustrato. Las reacciones de sacarificación de la mazorca de maíz se sellaron con aluminio (E&K scientific) y se mezclaron por 5 min a 650 rpm, 24 °C. Después, la placa se colocó en un incubador Innova a 50 °C y 200 rpm por 72 h. Al final de la sacarificación de 72 h, las reacciones se enfriaron por medio de la adición de 100 µ? de glicina 100 mM, pH 10.0. Después, la placa se mezcló bien y se centrifugó a 3000 rpm por 5 min. Se añadió sobrenadante (10 µ?) en 200 µ? de agua en una. placa de microtitulación de 96 pocilios para HPLC (Agilent, 5042-1385) . Las concentraciones de glucosa, xilosa, celobiosa y xilobiosa se midieron por HPLC con el uso de una columna Aminex HPX-87P (300 mm x 7.8 mm, 125-0098) preequipada con una columna de protección.
El análisis en la mazorca de maíz identificó las siguientes cepas de H3A/EG4 como cepas que tienen una conversión de glucano y xilano mejorada en comparación con las cepas de control de H3A : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 14, 22, 27, 43 y 49 (Fig. 13) .
Las cepas de H3A/EG4 seleccionadas se volvieron a cultivar en frascos de agitación. Se recolectó un total de 30 mi de cultivo de proteínas por matraz de agitación por cepa. Los filtrados de cultivo se concentraron 10 veces con el uso de concentradores centrífugos de membrana de 10 kDa (Sartorious, VS2001) y la concentración total de proteínas se determinó por BCA tal como se describe en el Ejemplo 1C. Se realizó una reacción de sacarificación de la mazorca de maíz con el uso de 2.5 , 5, 10 o 20 mg de proteína de muestras de cepa de H3A/EG4 por g de celulosa por pocilio de sustrato de mazorca de maíz. Una cepa de H3A producida a una escala de fermentación de 14 1 y una muestra de bajo rendimiento identificada previamente (cepa de H3A/EG4 núm. 20) producida en matraz de agitación se incluyeron como controles. Las reacciones de sacarificación se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 4 (más abajo) . Se observó una mayor conversión de glucano con el incremento de la dosis de proteína con el sobrenadante de cultivo de todas las cepas de expresión de EG4 (Fig. 14) . La cepa integrada de T. reesei H3A/EG4 núm. 27 se usó en reacciones de sacarificación adicionales y la cepa se purificó por medio de inoculación por estrías de una sola colonia sobre una placa de dextrosa y papa a partir de la cual se aisló una sola colonia.
Ejemplo 4. Intervalo de concentraciones de EG4 de T. reesei para la sacarificación mejorada de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido Para determinar la dosificación preferida, se realizó la hidrólisis de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido (25 % de sólidos, 8.7 % de celulosa, 7.3 % de xilano) a pH 5.3 con el uso de caldo de fermentación de la cepa integrada de T. reesei H3A/EG4 núm. 27 o H3A con EG4 purificada añadida en la mezcla de reacción. La carga total de la cepa integrada de T. reesei H3A/EG4 núm. 27 o H3A fue de 14 mg de proteína por gramo de glucano (G) y xilano (X) .
La mezcla de reacción (masa total 5 g) se cargó en frascos de escintilación de 20 mi en un volumen de reacción total de 5 mi de conformidad con el cuadro de dosificación en las Figs. 15, 17A y 17B.
La configuración para el Experimento 1 se muestra en la Fig. 15. Se mezcló agua MilliQ y ácido sulfúrico 6 N en un tubo cónico y se añadió en los frascos respectivos y los frascos se agitaron para mezclar el contenido. Se añadió muestras de enzimas en los frascos y los frascos se incubaron por 6 d a 50 °C. En diversos momentos, se extrajo 100 µ? de muestra de los frascos diluida con 900 µ? de ácido sulfúrico 5 mM, se agitó en vórtice, se centrifugó y el sobrenadante se usó para medir las concentraciones de azúcares solubles producidos con el uso de HPLC . Los resultados de la conversión de glucano y xilano se muestran en las Figs . 16A y 16B, respectivamente.
La configuración para el Experimento 2 se muestra en la Fig. 17A. Para determinar aun más la concentración de EG4 preferida, se realizó la sacarificación de la mazorca de maíz diluida con amoniaco (25 % de sólidos, 8.7 % de celulosa, 7.3 % de xilano) a pH 5.3 con el uso de caldo de fermentación de la cepa integrada de T. reesei H3A/EG4 núm. 27 o H3A con EG4 purificada añadida (de 0.05 a 1.0 mg de proteína/g de G+X) en la mezcla de reacción. La carga total de la cepa integrada de T. reesei H3A/EG4 núm. 27 o H3A fue de 14s mg de proteína/g de glucano + xilano. Los resultados experimentales se muestran en la Fig. 18A.
La configuración para el Experimento 3 se muestra en la Fig. 17B. Para determinar el intervalo de concentración preferido de Eg4 de T. reesei con mayor precisión, se hidrolizó la mazorca de maíz diluida con amoníaco (25 % de sólidos, 8.7 % de celulosa y 7.3 % de xilano) a pH 5.3 con el uso de la cepa integrada de T. reesei H3A/EG4 núm. 27 o H3A con EG4 purificado añadido en concentraciones de 0.1-0.5 mg de proteína/g de G+X. La carga total de la cepa integrada de T. reesei H3A/EG4 núm. 27 o H3A fue de 14 mg de proteína por g de glucano y xilano.
Los resultados se muestran en la Fig. 18B.
Ejemplo 5. Efecto de Eg4 de T. reesei en la sacarificación del rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido a cargas de sólidos diferentes El rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido se incubó con caldo de fermentación de la cepa integrada de T. reesei H3A o H3A/EG4 núm. 27 (14 mg de proteína/g de glucano y xilano) a 7, 10, 15, 20 y 25 % de sólidos (%S) por tres días a 50 °C, pH 5.3 (5 g de biomasa húmeda total en frascos de 20 mi) . Las reacciones se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 4 anterior. La glucosa y xilosa se analizaron por medio de HPLC. Los resultados se muestran en la Fig. 19. Todas las muestras que contenían hasta 20 % de sólidos estaban visiblemente licuadas en el día 1.
Ejemplo 6. Efecto de la sobreexpresion de EG4 de T. reesei en la hidrólisis de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido El efecto de la sobreexpresion de Eg4 de T. reesei en la cepa H3A en la sacarificación de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido se probó con el uso de caldos de fermentación de cepas H3A/EG4 núm. 27 y H3A. La sacarificación de la mazorca de maíz en una escala de 3 g se realizó en frascos de vidrio de 20 mi de la siguiente manera. Se añadió la preparación enzimática, el ácido sulfúrico 1 N y el regulador de acetato de sodio 50 mM pH 5.0 (con azida sódica al 0.01 % y MnCl2 5 mM) para producir una suspensión final de 3 g de reacción total, 22 % de sólidos secos, pH 5.0 con cargas de enzimas entre 1.7 y 21.0 mg de proteínas totales por gramo de glucano + xilano. Todos los frascos de sacarificación se incubaron a 48 °C con rotación a 180 rpm. Después de 72 h, se añadió 12 mi de agua MilliQ filtrada en cada frasco para diluir 5 veces toda la reacción de sacarificación. Las muestras se centrifugaron a 14000 x g por 5 min, después, se filtraron a través de un filtro de nailon de 0.22 µ?t? (filtro de tubo de centrífuga Spin-X, Corning Incorporated, Corning, NY) y se diluyó 4 veces más con agua MilliQ filtrada para crear una dilución final de 20X. Se analizaron inyecciones de 20 µ? por HPLC para medir los azúcares liberados.
La sobreexpresión o adición de Eg4 de G. reesei permitió obtener una liberación de monómeros de glucosa y xilosa mejorada en comparación con el uso de H3A sola (Figs. 20 y 21) . La adición de H3A/EG4 núm. 27 en dosis diferentes resultó en una producción mayor de xilosa en comparación con la cepa H3A o en comparación con Eg4 + una constante de 1.12 mg de Xyn3 por g de glucano + xilano (Fig. 20) .
La adición de H3A/EG4 núm. 27 en dosis diferentes resultó en una producción mayor de glucosa en comparación con la cepa H3A o en comparación con Eg4 + una constante de 1.12 mg de Xyn3 por g de glucano + xilano (Fig. 21) .
El efecto de Eg4 de T. reesei en la liberación del monómero fermentable total (xilosa, glucosa y arabinosa) por las cepas integradas H3A/EG4 núm. 27 o H3A se ilustra en la Fig. 22. La cepa integrada H3A/EG4 núm. 27 resultó en una liberación de monómeros fermentables totales mejorada en comparación con la cepa integrada H3A o con Eg4 + 1.12 mg de Xyn3/g de glucano + xilano.
Ejemplo 7. El EG4 de G. reesei purificado produce liberación de glucosa en la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido Se probó el efecto de Eg4 de T. reesei purificado en la concentración de azúcares liberados con el uso de 1.05 g de mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido en presencia o ausencia de 0.53 mg de Xyn3 por g de glucano + xilano. Los experimentos se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 6. Los resultados se muestran en la Fig. 23. Los datos indican que Eg4 de G. reesei purificada produce la liberación del monómero de glucosa sin la acción de otras celulasas tales como endoglucanasas , celobiohidrolasas y ß-glucosidasas .
Además, se realizaron los experimentos de sacarificación con el uso de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido con Eg4 purificada añadida sola (sin Xyn3 agregado) . Se añadió 3.3 µ? de Eg4 purificada (15.3 mg/ml) en 872 µ? de regulador de acetato de sodio 50 mM, pH 5.0 (que incluía azida sódica al 0.01 % y MnCl2 5 mM) , 165 mg de mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido (67.3 % de sólidos secos, 111 mg de sólidos secos añadidos) y 16.5 µ? de ácido sulfúrico 1 N en frascos de 5 mi . Los frascos se incubaron a 48 °C y se rotaron a 180 rpm. Periódicamente, se extrajeron alícuotas de 20 µ?, se diluyeron 10 veces con agua destilada doble esterilizada con filtro y se filtraron a través de un filtro de nailon antes del análisis para determinar la glucosa liberada en un sistema de cromatografía de iones Dionex. Las soluciones de glucosa auténticas se usaron como estándares externos. Los resultados se muestran en la Fig. 24, y estos indican que la adición de Eg4 purificada produce la liberación de monómero de glucosa a partir de mazorcas de maíz pretratadas con amoníaco diluido durante una incubación de 72 h a 48 °C en ausencia de otras celulasas o endoxilanas . Ejemplo 8: Desempeño de la sacarificación de las cepas integradas de T. reesei H3A y H3A/EG4 núm. 27 en varios sustratos En este experimento, se probó el caldo de fermentación de la cepa integrada de T. reesei H3A o H3A/EG4 núm. 27 dosificada a 14 mg de proteína por g de glucano + xilano, para determinar el desempeño de la sacarificación en sustratos diferentes que incluyen: mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido, mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido lavado, rastrojo de maíz con fibra de amoniaco expandida (AFEX CS) , bagazo de caña de azúcar expandido con vapor (SEB, por sus siglas en inglés) y pulpas de papel pretratadas con kraft FPP27 (pulpa de madera blanda industrial no blanqueada y deslignificada-Kappa 13.5, 81.9 % de glucano, 8.0 % de xilano, 1.9 % de lignina Klason) , FPP-31 (pulpa de madera dura no blanqueada y deslignificada-Kappa 10.1, 75.1 % de glucano, 19.1 % de xilano, 2.2 % de lignina Klason) y FPP-37 (pulpa de madera blanda no blanqueada secada al aire-Kappa 82, 71.4 % de glucano, 8.7 % de xilano, 11.3 % de lignina Klason) .
Las reacciones de sacarificación se determinaron en frascos de vidrio de 25 mi con una masa final de 10 g en regulador de citrato de sodio 0.1 M, pH 5.0 y se incubaron a 50 °C, 200 rpm por 6 d. Al final de los 6 d, se diluyó alícuotas de 100 µ? 1:10 en ácido sulfúrico 5 mM y las muestras se analizaron por HPLC para determinar la formación de glucosa y xilosa. Los resultados se muestran en la Fig. 25. Ejemplo 9. Efecto de EG4 de T. reesei en la sacarificación del rastrojo de maíz pretratado con ácido Se probó el efecto de Eg4 en la sacarificación del rastrojo de maíz pretratado con ácido. Se obtuvo rastrojo de maíz pretratado con ácido sulfúrico diluido (Schell, DJ, et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 2003, 105 (1-3) : 69-85) de NREL, se ajustó en 20 % de sólidos y se acondicionó hasta un pH 5.0 con la adición de solución de ceniza de sosa. La sacarificación del sustrato pretratado se realizó en una placa de microtitulación con el uso de 20 % de sólidos totales. La proteína total en los caldos de fermentación se midió por medio del ensayo de Biuret (ver el Ejemplo 1 anterior) . Se añadió cantidades cada vez mayores de caldo de fermentación de las cepas integradas de T. reesei H3A/EG4 núm. 27 y H3A en el sustrato y se midió el desempeño de la sacarificación después de la incubación a 50 °C, 5 d, agitación de 200 RPM. La formación de glucosa (mg/g) se midió con el uso de HPLC. Los resultados se muestran en la Fig. 26. Ejemplo 10. Desempeño de la sacarificación de cepas integradas de T. reesei H3A y H3A/EG4 núm. 27 en hojas, tallos y mazorcas de maíz pretratados con amoníaco diluido Se comparó el desempeño de la sacarificación de cepas integradas de G. reesei H3A y H3A/EG4 núm. 27 en rastrojo, hojas, tallos o mazorcas de maíz pretratados con amoníaco diluido. El tratamiento previo se- realizó tal como se describe en la patente núm. O 06110901A. Se hidrolizó cinco (5) g de masa total (7 % de sólidos) en frascos de 20 mi a pH 5.3 (pH ajustado con H2S04 6 N) con el uso de 14 mg de proteína por g de glucano +xilano. Las reacciones de sacarificación se realizaron a 50 °C y las muestras se analizaron por HPLC para determinar la glucosa y xilosa liberada en el día 4. Los resultados se muestran en la Fig. 27.
Ejemplo 11. Desempeño de la sacarificación en mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido en respuesta al EG4 de G. reesei sobreexpresado Se realizaron las reacciones de sacarificación a una escala de 3 g con el uso de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido. Se midió una cantidad suficiente de preparación de mazorca pretratada en frascos de vidrio de 20 mi para producir 0.75 g de sólido seco. Se añadió la preparación enzimática, ácido sulfúrico 1 N y regulador de acetato de sodio 50 mM pH 5.0 (con azida sódica al 0.01 %) para producir una suspensión final de 3 g, reacción total, 25 % de sólidos secos, pH 5.0. Se añadió proteína extracelular (caldo de fermentación) de la cepa integrada de T. reesei H3A en 14 mg de proteína/ g (glucano+xilano) con o sin un 5 % adicional de la carga de 14 mg de proteína como el sobrenadante del cultivo no purificado de una cepa de T. reesei (¿\cbhl chh.2 Aegl Aeg2) (Ver la publicación internacional núm. WO 05/001036) que sobreexpresa Eg4. Las reacciones de sacarificación se incubaron por 72 h a 50 °C. Después de la incubación, el contenido de la reacción se diluyó 3 veces, se filtró y se analizó por HPLC para determinar la concentración de glucosa y xilosa. Los resultados se muestran en la Fig. 28. La adición de proteína Eg4 en la forma de proteína extracelular de una cepa de T. reesei que sobreexpresa Eg4 a H3A incrementó sustancialmente la liberación de monómero de glucosa e incrementó ligeramente la liberación de xilosa monomérica.
Ejemplo 12. Desempeño de la sacarificación de la cepa H3A/EG4 núm. 27 en césped de pradera pretratado con amoníaco Se comparó el desempeño de sacarificación de la cepa H3A/EG4 núm. 27 en césped de pradera pretratado con amoníaco (publicación de patente internacional núm. WO06110901A) a dosis de proteínas crecientes con el de la cepa H3A (18.5 % de sólidos) . Las preparaciones de césped de pradera pretratado se midieron en frascos de vidrio de 20 mi para producir 0.925 g de sólido seco. Se añadió ácido sulfúrico 1 N y regulador de acetato de sodio 50 mM pH 5.3 (con azida sódica al 0.01 %) para producir una suspensión final de 5 gramos de la reacción total. Se probó dosificaciones de enzimas de H3A de 14, 20 y 30 mg/g (glucano + xilano) ; y dosificaciones de H3A-EG4 núm. 27 de 5, 8, 11, 14, 20 y 30 mg/g (glucano + xilano) . Las reacciones se incubaron a 50 °C por 3 d. Después de la incubación, el contenido de la reacción se diluyó 3 veces, se filtró y se analizó por HPLC para determinar la concentración de glucosa y xilosa. La conversión de glucano y xilano se calculó en base a la composición del sustrato de césped de pradera. Los resultados (Fig. 29) indican que el desempeño de H3A-EG4 núm. 27 es más eficaz para la conversión de glucano que H3A en las mismas dosis de enzimas.
Ejemplo 13. Efecto de las adiciones de EG4 de T. reesei en la sacarificación de la mazorca de maíz y en la hidrólisis de CMC y celobiosa A. Sacarificación de la mazorca de maíz: La mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido se ajustó hasta 20 % de sólidos, 7 % de celulosa y se suministró 65 mg por pocilio en una placa de microtitulación . Las reacciones de sacarificación se iniciaron por la adición de 35 µ? de regulador de acetato de sodio 50 mM (pH 5.0) que contenía CBH1 de T. reesei a 5 mg de proteína/g de glucano (final) y las enzimas relevantes (CBH1 o Eg4) , en concentraciones finales de 0, 1, 2, 3, 4 y 5 mg/g de glucano. Un control de Eg4 recibió solamente EG4 en las mismas dosis y, como tal, la proteína añadida total en estos pocilios fue menor. Las placas de microtitulación se sellaron con un sello de placa de aluminio (E&K scientific) y se mezclaron por 2 min a 600 rpm, 24 °C. Después, la placa se colocó en un incubador Innova a 50 °C y 200 rpm por 72 h.
Al final de la sacarificación de 72 h, la placa se enfrió por medio de la adición de 100 µ? de glicina 100 mM, pH 10.0. Después, la placa se centrifugó a 3000 rpm por 5 min. Se añadió sobrenadante (20 µ?) en 100 µ? de agua en una placa de microtitulación de 96 pocilios para HPLC (Agilent 5042-1385) . Se midió las concentraciones de glucosa y celobiosa por medio de HPLC con el uso de una columna Aminex HPX-87P (300 mm x 7.8 mm, 125-0098) equipada previamente con columna de protección. Se calculó el % de conversión de glucano por 100 x (mg de celobiosa + mg de glucosa) /glucano total en sustrato (Fig. 30).
B. Hidrólisis de CMC: Se diluyó carboximetilcelulosa (CMC, Sigma C4888) hasta 1 % con acetato de sodio 50 mM, H 5.0. Las reacciones de hidrólisis se iniciaron por la adición separada de cada una de las tres enzimas purificadas de T. reesei - EG4 , EG1 y CBH1 en concentraciones finales de 20, 10, 5, 2.5, 1.25 y 0 mg/g en 100 µ? de CMC al 1 % en una placa de microtitulación de 96 pocilios (NUNC núm. 269787) . Se añadió acetato sódico, pH 5.0 50 mM en cada pocilio hasta una volumen final de 150 µ? . Las reacciones de hidrólisis de CMC se sellaron con un sello de placa de aluminio (E&K scientific) y se mezclaron por 2 min a 600 rpm, 24 °C. Después, la placa se colocó en un incubador Innova a 50 °C y 200 rpm por 30 min.
Al final de los 30 min de incubación, la placa se colocó en agua helada por 10 min para detener la reacción y las muestras se transfirieron a tubos Eppendorf . En cada tubo se añadió 375 µ? de solución de ácido dinitrosalicílico (DNS) (ver más abajo) . Después, las muestras se llevaron a la ebullición por 10 min y se midió la O.D a 540 nm por Spectra AX 250 (Molecular Devices) . Los resultados se muestran en la Fig. 31.
SOLUCIÓN DE DNS: 40 g de ácido dinitrosalicílico 3.5 (Sigma, D0550) 8 g de fenol 2 g de sulfito de sodio (Na2S03) 800 g de tartrato de Na-K (sal de Rochelle) Se añade todo lo anterior en 2 1 de NaOH al 2 % Se agita de la noche a la mañana, cubierto con papel de aluminio Se añade agua desionizada destilada hasta un volumen final de 4 L Se mezcla bien Se almacena en una botella oscura, refrigerada C. Hidrólisis de celobiosa Se diluyó celobiosa hasta 5 g/1 con acetato de sodio 50 mM, pH 5.0. Las reacciones de hidrólisis se iniciaron por la adición separada de cada una de las dos enzimas - EG4 y BGLl en concentraciones finales de 20, 10, 5, 2.5 y 0 mg/g en 100 µ? de solución de celobiosa a 5 g/1. Se añadió acetato de sodio, pH 5.0 en cada pocilio hasta un volumen final de 120 µ? . Las placas de reacción se sellaron con un sello de placa de aluminio (E&K scientific) y se mezclaron por 2 min a 600 rpm, 24 °C. Después, la placa se colocó en un incubador Innova a 50 °C y 200 rpm por 2 h.
Al final de la etapa de hidrólisis de 2 h, la placa se enfrió por medio de la adición de 100 µ? de glicina 100 mM, pH 10.0. Después, la placa se centrifugó a 3000 rpm por 5 min. La concentración de glucosa se midió por medio del ensayo de ABTS (ácido 2 , 2 ' -azino-bis 3 -etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (Ejemplo 1) . Se añadió diez (10) µ? de sobrenadante en 90 µ? de solución de ABTS en una placa de microtitulación de 96 pocilios (placa Corning costar 9017 EIA/RIA, 96 pocilios de fondo plano, unión media) . La OD 420 nm se midió con SpectraMAX 250, Molecular Devices. Los resultados se muestran en la Fig. 32.
Ejemplo 14. La EG4 purificada mejora la producción de glucosa a partir de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido cuando se mezcla con varias mezclas de celulasa El efecto de la Eg4 purificada combinada con celulasas purificadas (EG1, EG2 , CBH1, CBH2 y Bgll de T. reesei) en la concentración de azúcares liberados se probó con el uso de 1.05 g de mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido en presencia de 0.53 mg de Xyn3 de T. reesei por g de glucano + xilano. Las reacciones de 1.06 g se determinaron en frascos de 5 mi que contenían 0.111 g de sólidos de mazorca seca (10.5 % de sólidos). Se añadió la preparación enzimática (Figs. 33A-33C) , ácido sulfúrico 1 N y regulador de acetato de sodio 50 mM pH 5.0 (con azida sódica al 0.01 % y MnCl2) 5 mM para producir el peso de la reacción final. Los frascos de la reacción se incubaron a 48 °C con rotación a 180 rpm. Después de 72 h, se añadió agua MilliQ filtrada para diluir 5 veces cada reacción de sacarificación. Las muestras se centrifugaron a 14000 x g por 5 min, después, se filtraron a través de un filtro de nailon de 0.22 µp? (filtro de tubo de centrífuga Spin-X, Corning Incorporated, Corning, NY Milli-Q) y se diluyó 4 veces más con agua filtrada para crear una dilución final de 20X. Se analizó inyecciones de (20) µ? por HPLC para medir los azúcares liberados (glucosa, celobiosa y xilosa) .
Las Figs . 34A-34C muestra la glucosa (fig. 34A) , glucosa + celobiosa (fig. 34B) o xilosa (fig. 34C) producidas con cada combinación. La Eg4 purificada mejoró el desempeño de celulasas individuales y mezclas. Cuando estaban presentes todas las celulasas purificadas, la adición de 0.53 mg de Eg4 por g de glucano + xilano mejoró la conversión, prácticamente, un 40 %. La mejora se observó, además, cuando se añadió Eg4 en una combinación de CBH1, Egll y Bgll. Cuando había celulasas individuales con la mazorca, las cantidades absolutas de liberación de glucosa total eran sustancialmente menores que las observadas en el experimento en el cual había combinaciones de celulasas con la mazorca, pero en los dos casos el porcentaje de mejora fue significativo en presencia de Eg . La adición de Eg4 de T. reesei en celulasas purificadas produjo las siguientes mejoras porcentuales en la liberación total de glucosa-Bgll (121 %) , Egl2 (112 %) , CBH2 (239 %) y CBH1 (71 %) . Esto muestra que Eg4 generó un efecto significativo y amplio en la mejora del desempeño de celulasa en la biomasa.
Ejemplo 15. Efectos sinérgicos observados cuando se mezcló EG4 con CBH1, CBH2 y EG2 - Sustrato: mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido Las reacciones de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido se prepararon por la adición de mezclas enzimáticas de la siguiente manera en la mazorca de maíz (65 mg por pocilio de 20 % de sólidos, 7 % de celulosa) en placas de microtitulación de 96 pocilios (VWR) . Se añadió, además, ochenta (80) µ? de acetato de sodio 50 mM (pH 5.0) , 1 mg de Bgll/g de glucano y 0.5 mg de Xyn3/g de fondo de glucano en todos los pocilios.
Para probar el efecto del mezclado de Eg4 individualmente con CBH1, CBH2 y EG2 , cada CBH1, CBH2 y EG2 se añadió en 0, 1.25, 2.5, 5, 10 y 20 mg/g de glucano y se añadió EG4 en concentraciones de 20, 18.75, 17.5, 15, 10 y 0 mg/g de glucano en los pocilios respectivos lo que conformó las proteínas totales en 20 mg/g de glucano en pocilios individuales. En los pocilios de control se añadió solamente CBH1 o CBH2 o EG2 o EG4 en las mismas dosis, de modo que en estos pocilios se añadió una cantidad total de proteínas menor que 20 mg/g.
Para probar el efecto de Eg4 en combinaciones de celulasas se añadió mezclas de CBH1, CBH2 y EG2 en relaciones diferentes (ver la Fig. 35) a 0, 1.25, 2.5, 5, 10 y 20 mg de proteína/g de glucano y se añadió EG4 en las mezclas en concentraciones de 20, 18.75, 17.5, 15, 10 y 0 mg de proteína/g de glucano, de modo que la cantidad de proteínas totales en pocilios individuales era de 20 mg de proteína/g de glucano. Igual que antes, en los pocilios de control se añadió solamente una proteína de modo que la cantidad total de proteínas añadidas fue menor que 20 mg de proteína/g.
Las reacciones de sacarificación de la mazorca de maíz se sellaron con un sello de placa de aluminio (E&K scientific) y se mezclaron por 2 min a 600 rpm, 24 °C. Después, la placa se colocó en un agitador del incubador Innova 44 (New Brunswick Scientific) a 50 °C y 200 rpm por 72 h. Al final de la etapa de sacarificación de 72 h, la placa se enfrió por medio de la adición de 100 µ? de glicina 100 mM, pH 10.0. Después, la placa se centrifugó a 3000 rpm por 5 min (Rotanta 460R Centrifuge, Hettich Zentrifugen) . Se añadió veinte (20) µ? de sobrenadante en 100 µ? de agua en una placa de microtitulación de 96 pocilios para HPLC (Agilent, 5042-1385) . Las concentraciones de glucosa y celobiosa se midieron por medio de HPLC con el uso de una columna Arainex HPX-87P (300 mm x 7.8 mm, 125-0098) y columna de protección (BioRad) .
Los resultados se indican en la tabla de la Fig. 36, en donde la conversión de glucano (%) se define como 100 x (glucosa + celulobiosa) / total de glucano.
Este experimento indica que, cuando se añade Eg4 a una CBH1 , CBH2 y/o EG2 , se obtiene como beneficio la mejora en la sacarificación de la mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido. Además, la mejora más importante se observó cuando se añadió Eg4 y la otra enzima (CBH1, CBH2 o EG2) en la mezcla de sacarificación en una cantidad igual. Además, se observó que el efecto de Eg4 es considerable en la mezcla de CBH1 y CBH2. La mejora óptima producida por Eg4 se observó con una relación entre Eg4 y CBH1 y CBH2 de 1:1.
Ejemplo 16. EG4 mejora el desempeño de la sacari icación de varias composiciones de celulasa La concentración total de proteínas de preparaciones enzimáticas de celulasas comerciales Spezyme® CP, Accellerase®1500 y Accellerase®DUET (Genencor División, Danisco US) se determinaron por medio del ensayo de Biuret modificado (descrito en la presente descripción) .
Se añadió EG4 de G. reesei en cada preparación enzimática y las muestras se ensayaron, después, para determinar el desempeño de la sacarificación con el uso de una carga de 25 % de sólidos de mazorca de maíz pretratada con amoníaco, en una dosis de 14 mg de proteínas totales por g de sustrato de glucano y xilano (5 mg de EG4 por g de glucano y xilano, más 9 mg de celulasa completa por g de glucano y xilano) . La reacción de sacarificación se realizó con el uso de 5 g de mezcla de reacción total en un frasco de 20 mi a pH 5, con incubación a 50 °C en un agitador rotativo a 200 rpm por 7 d. Las muestras de sacarificación se diluyeron lOx con ácido sulfúrico 5 mM, se filtraron a través de un filtro de 0.2 µp? antes de la inyección en la HPLC . El análisis por HPLC se realizó con el uso de una columna de exclusión de iones BioRad Aminex HPX-87H (300 mm x 7.8 mm) .
La sustitución de EG4 purificada en celulasas completas mejoró la conversión de glucano en todos los productos de celulasa probados tal como se ilustra en la Fig. 40. Como se ilustra en la Fig. 41, aparentemente, la sustitución de Eg4 no afectó la conversión de xilano.
Ejemplo 17. Reducción de la viscosidad en la sacarificación de la biomasa En este experimento se usó paja de trigo pretratada por medio de expansión con vapor acidificada Inbicon como biomasa, con la siguiente composición (Tabla 2) : La paja de trigo pretratada se diluyó en agua y el pH se ajustó con ácido sulfúrico hasta pH 5.0 y un nivel de sólidos de 10.5 % de este se mezcló, en una primera muestra, con un caldo de fermentación de una cepa de T. reesei H3A (Fig. 9) a una concentración de proteínas total de 20.5 mg de proteína/g de celulosa en el sustrato de biomasa a 50 °C o en una segunda muestra, el caldo de fermentación de G. reesei H3A (Fig. 9) a una concentración de proteínas total de 18.5 mg de proteína/g celulosa en el sustrato de biomasa y 2 mg/g de celulosa de Eg4 de T. reesei purificado. La reducción de viscosidad se midió con el uso de un viscosímetro Brookfield (Brookfield Engineering, Inc) y se controló el cambio de viscosidad hasta aproximadamente 6 h. Los resultados se indican en la Fig. 42. Ejemplo 18. Reducción de la viscosidad en la sacarificación de la biomasa En este experimento se usó como biomasa rastrojo de maíz pretratado con ácido diluido de NREL (PCS sin lavar) .
El rastrojo de maíz pretratado sin lavar se mezcló a una temperatura de 50 °C, pH de 5.0 y un nivel de sólidos de 20 % de sólidos secos, en una primera muestra, con un caldo de fermentación de una cepa de T. reesei H3A (Fig. 9) a una concentración de proteínas total de 20 mg/g celulosa en el sustrato de biomasa y en una segunda muestra, un caldo de fermentación de la cepa integrada de T. reesei H3A/Eg4 núm. 27, además, a 20 mg/g de celulosa. La reducción de viscosidad se midió con el uso de un viscosímetro Brookfield (Brookfield Engineering, Inc.) y se controló el cambio de viscosidad durante más de 160 h. Los resultados se indican en la Fig. 43. Ejemplo 19. Reducción de la viscosidad en la sacarificación de la biomasa En este experimento se usó mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido como biomasa.
La mazorca de maíz pretratada con amoníaco diluido se mezcló con composiciones enzimáticas en dos condiciones de carga de sólidos: 25 % de sólidos secos y 30 % de sólidos secos. Específicamente, la biomasa pretratada se mezcló a 50 °C y pH 5.0 con 14 mg de proteína/g de celulosa a partir de un caldo de fermentación de H3A de T. reesei (Fig. 9) o cepa H3A/Eg4 núm. 27. La reducción de viscosidad se midió con el uso de un viscosímetro Brookfield (Brookfield Engineering, Inc.) . Los resultados se indican en la Fig. 44.
Ejemplo 20. Determinación de los efectos de varias celulasas en la reducción de la viscosidad y en la producción de glucosa en un proceso de sacarificación Este estudio usó varias enzimas reductoras de viscosidad, tales como OPTIMASH™ BG, OPTIMASH™ TBG, OPTIMASH™ VR; o beta-glucosidasa tal como Accellerase® BG, en presencia de Accellerase® DUET en el proceso de sacarificación y se determinó los efectos de estas enzimas reductoras de la viscosidad en la producción de glucosa y la reducción de la viscosidad. Además, se incluyó la composición enzimática producida a partir de la cepa integrada de H3A/EG4 núm. 27. Accellerase® 1500, Accellerase® DUET, Accellerase® BG, OPTIMASH™ BG, OPTIMASH™ TBG y OPTIMASH™ VR son productos disponibles de Danisco US Inc., Genencor.
Se usó paja de trigo pretratada tal como se describió anteriormente. La composición se analizó y se detalla en la Tabla 2 (ver el Ejemplo 17) .
El proceso de sacarificación se realizó mediante la incubación de la paja de trigo pretratada (25 % de materia seca) con diversas enzimas en cámaras de reacción. Ver, Larsen et al., The IBUS Process- Lignocelulosic Bioethanol Cióse to A commercial Reality, (2008) Chem. Eng. Tech. 31 (5) : 765-772. Las condiciones experimentales se muestran en las Tablas 3 y . En cada cámara, la masa total era de 10 kg. El pH inicial de la paja de trigo era de aproximadamente 3.50 y se ajustó mediante la adición de Na2C03 hasta pH 5.0. Se midió la concentración de glucosa en el tiempo y se calculó la conversión de glucosa.
Tabla 3.
Las condiciones experimentales 1-6 se realizaron el primer día ("Día 1") y las condiciones experimentales 7-12 se realizaron el segundo día ("Día 2") .
La concentración de glucosa se midió después de 6 horas de sacarificación para cada condición experimental. Con el uso de Accellerase® DUET a 0.25 ml/g de celulosa se obtuvo 40.8 g de glucosa/kg después de 6 h de sacarificación. Ver la Fig. 45. La concentración de glucosa para Accellerase® DUET + OPTIMASH BG (o TBG) (0.15 + 6) (es decir, 0.15 mi de Accellerase® DUET/g de celulosa + 6 g de OPTIMASH BG (o TBG) / kg de materia seca) era similar a la concentración de glucosa para Accellerase® 1500 a 0.22 ml/g de celulosa. Ver la Fig. 45. La concentración de glucosa para Accellerase® DUET + Accellerase BG a 0.15 + 6 (es decir, 0.15 mi de Accellerase® DUET/g de celulosa + 6 g de Accellerase BG / kg de materia seca) era similar a la concentración de glucosa para Accellerase® 1500 a 0.22 ml/g de celulosa y más alta que la concentración de glucosa para Accellerase® DUET a 0.15 ml/g de celulosa. Ver la Fig. 45. Con una concent ación alta de Accellerase® BG se pudo reducir la viscosidad de la mezcla de reacción de sacarificación. Con el uso de la composición enzimática producida a partir de la fermentación de H3A/EG4 núm . 27 en una cantidad de 0.15 ml/g de celulosa se obtuvo 37.5 g/kg de glucosa después de 6 h de sacarificación, una producción sustancialmente más alta que la producción de glucosa para Accellerase® 1500 a 0.22 ml/g de celulosa y Accellerase® DUET a 0.15 ml/g de celulosa. Ver la Fig. 45.
Las concentraciones de glucosa para varias condiciones experimentales del experimento del Día 1 se midieron otra vez después de 24 h de sacarificación. Ver la Fig. 46. La concentración de glucosa y la conversión de celulosa se midieron en el tiempo para las condiciones experimentales 7-12 en el experimento del Día 2 y los resultados se muestran en las Figs . 47 y 48.
La viscosidad se observó a simple vista en el experimento del Día 1 después de 6 h de sacarificación y se resume en la Tabla 6. Una cantidad mayor de " + " indica una mezcla de reacción de sacarificación menos viscosa. Generalmente, una mezcla de reacción de sacarificación menos viscosa (por ejemplo, una suspensión menos espesa) se correlacionó con una mayor producción de glucosa.
Tabla 6. Observación de la viscosidad para el experimento del Día 1 a 6 h La viscosidad de las mezclas de reacción de sacarificación en varias cámaras en el experimento del Día 2 se observó visualmente con referencia a la visibilidad de las partes de metal en cada cámara. Después de 6 días de sacarificación a 50 °C, la mezcla de sacarificación en la cámara 3 (Condición experimental 9, Accellerase® DUET a 0.15 ml/g de celulosa) era más viscosa que la mezcla de sacarificación en la cámara 1 (Condición experimental 7) o 2 (Condición experimental 8, Accellerase® 1500 a 0.22 ml/g de celulosa) . Las partes metálicas en la cámara 3 no se podían ver. La viscosidad de la mezcla de sacarificación en la cámara 4 (Condición experimental 10, Accellerase DUET® a 0.15 ml/g de celulosa + Accellerase® BG a 0.1 g/kg de materia seca) se redujo en comparación con la viscosidad de la mezcla de sacarificación en la cámara 3 (Accellerase® DUET a 0.15 ml/g de celulosa) . La viscosidad de la mezcla de sacarificación en la cámara 5 (Condición experimental 11, Accellerase DUET® a 0.15 ml/g de celulosa + Accellerase BG a 6 g/kg de materia seca) era menor en comparación con la viscosidad de la mezcla de sacarificación en la cámara 4 (Accellerase® DUET a 0.15 ml/g de celulosa + Accellerase BG a 0.1 g/kg de materia seca) . Aun con una cantidad alta de Accellerase BG, la mezcla de sacarificación (cámara 5, Accellerase DUET® a 0.15 ml/g de celulosa + Accellerase BG a 6 g/kg de materia seca) era más viscosa que Accellerase® 1500 a 0.22 ml/g de celulosa (cámaras 1 y 2) . Sin embargo, con la adición de la composición enzimática producida a partir de la fermentación de H3A/EG4 núm. 27, se encontró, sorprendentemente, que la viscosidad de la mezcla de sacarificación (cámara 6) se redujo sustancialmente en comparación con la viscosidad de la mezcla de sacarificación en la cámara 4 o 5. Las partes metálicas en la cámara 6 no se podían ver.
Ejemplo 21. Determinación de los efectos de varias celulasas en la reducción de la viscosidad y en la producción de glucosa en un proceso de sacarificación Un proceso de sacarificación se realizó mediante la incubación de la paja de trigo pretratada Inbicon (25 % de materia seca) con diversas enzimas en cámaras de reacción. Las condiciones experimentales se muestran en la Tabla 7. En cada cámara, la masa total era de 10 kg. El pH inicial de la paja de trigo era de aproximadamente 3.50 y se ajustó mediante la adición de Na2C03 hasta pH 5.0. Accellerase® 1500, Accellerase® DUET, Accellerase® BG, Optimash™ BG y Primafast® LUNA son productos disponibles de Genecor.
Tabla 7 7 La concentración de glucosa se midió después de 6 h, 24 h, 50 h y 6 d de sacarificación. La viscosidad de la mezcla de reacción de sacarificación se observó visualmente y se midió con un medidor de viscosidad con el uso de métodos conocidos para una persona con experiencia en la técnica después de 6 h, 24 h, 50 h y 6 d de sacarificación.
Se encontró que la producción de glucosa de cada condición experimental 3-16 aumentó en comparación con la producción de glucosa de la Condición experimental 1. Además, se encontró que la viscosidad de cada Condición experimental 3-16 se redujo en comparación con la viscosidad de la Condición experimental 1.
Este estudio analizó, además, la producción de glucosa y la reducción de viscosidad en un proceso de sacarificación con las mismas condiciones experimentales indicadas anteriormente, pero después de un tiempo de hidrólisis previa prolongado (tal como 6 h, 9 h, 12 h, 24 h) .
Ejemplo 22. Efecto del ácido ascórbico en la hidrólisis con Avicel por medio de CBH1 y EG4 Se iniciaron reacciones de celulosa cristalina (50 µ? de Avicel al 10 % en acetato de sodio 50 mM, pH 5.0) por medio del mezclado entre sí de combinaciones de CBH1 de T. reesei purificado (5 mg/g de concentración final) , Eg4 de T. reesei purificado (10 mg/g de concentración final) , ácido ascórbico (materia prima de 50 mM, 8.8 g/1 de concentración final) y solución de manganeso (concentración final de 10 mM) tal como se indica en la Fig. 39A. Se añadió regulador acetato de sodio cincuenta (50) mM, pH 5.0 en cada muestra hasta un volumen final de 300 µ? .
Se procesaron en vórtice tubos Eppendorf de reacción y, después, se colocaron en un incubador Innova 44 (New Brunswick Scientific) a 50 °C, 200 rpm. Se recolectaron muestras de cincuenta (50) µ? de cada tubo en tres momentos diferentes (2.5, 4.5, 24 h) y se enfriaron con 50 µ? de regulador glicina 100 mM, pH 10.0. Las muestras se centrifugaron a 3000 rpm por 5 minutos (centrífuga Rotanta 460R, Hettich Zentrifugen) y se añadió sobrenadante (20 µ?) en 100 µ? de agua en una placa de microtitulación de 96 pocilios para HPLC (Agilent, 5042-1385) . Las concentraciones de glucosa y celobiosa se midieron por HPLC con el uso de una columna Aminex HPX-87P (300 mm x 7.8 mm, 125-0098) preequipada con una columna de protección. Los resultados se muestran en la Fig. 37.
Después, se midió el efecto del ácido ascórbico en la hidrólisis de Avicel producida por CBH2 y EG . Se iniciaron reacciones de celulosa cristalina (80 µ? de Avicel al 10 % en acetato de sodio 50 mM, pH 5.0) por medio del mezclado entre sí de combinaciones de CBH2 de T. reesei purificado (5 mg/g de concentración final) , Eg4 de T. reesei purificado (10 mg/g de concentración final) , ácido ascórbico (solución inicial de 50 mM, 8.8 g/1 de concentración final) y solución de manganeso (10 mM de concentración final) tal como se indica en la Fig. 39B. Se añadió regulador acetato de sodio cincuenta (50) mM, pH 5.0 en cada muestra hasta un volumen final de 500 µ? .
Se procesaron en vórtice tubos Eppendorf de reacción y, después, se colocaron en un incubador Innova 44 (New Brunswick Scientific) a 50 °C, 200 rpm. Se recolectaron muestras de cincuenta (50) µ? de cada tubo en tres momentos diferentes (5, 24, 48 h) y se enfriaron con 50 µ? de regulador glicina 100 mM, pH 10.0. Las muestras se centrifugaron a 3000 rpm por 5 minutos (centrífuga Rotanta 460R, Hettich Zentrifugen) y se añadió sobrenadante (20 µ?) en 100 µ? de agua en una placa de microtitulación de 96 pocilios para HPLC (Agilent, 5042-1385) . Las concentraciones de glucosa y celobiosa se midieron por HPLC con el uso de una columna Aminex HPX-87P (300 mm x 7.8 mm, 125-0098) preequipada con una columna de protección. Los resultados se muestran en la Fig. 38.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (43)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una mezcla de sacarificación de biomasa caracterizada porque comprende : a. un material de biomasa b. una composición enzimática que comprende una enzima de la familia de glicosil hidrolasa 61 que tiene actividad de endoglucanasa : i. que tiene por lo menos 65 % de identidad de secuencia con cualquiera de las sec . con núms . de ident. :l-29 y 148; ii. que tiene por lo menos 65 % de identidad de secuencia con los residuos 22-344 de la sec. con núm. de ident . : 27 iii. que comprende por lo menos un motivo de secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste en: las secs. con núms. de ident.: 84-91; iv. que comprende uno o más motivos de secuencias seleccionados del grupo que consiste en: (1) las sec. con núms. de ident. :84 y 88; (2) las sec. con núms. de ident. : 85 y 88; (3) la sec. con núm. de ident. :86; (4) la sec. con núm. de ident. :87; (5) las sec. con núms. de ident.:84, 88 y 89; (6) las sec. con núms . de ident.: 84, 88 y 91; (10) las sec. con núms. de ident.: 85, 88 y 91; (11) las sec. con núms. de ident.: 84, 88, 89 y 91; (12) las sec. con núms. de ident.: 84, 88, 90 y 91; (13) las sec. con núms. de ident.: 85, 88, 89 y 91; y (14) las sec. con núms. de ident.: 85, 88, 90 y 91; v. que está codificada por una secuencia de polinucleótidos o un complemento de esta que tiene por lo menos 65 % de identidad de secuencia con la sec. con núm. de ident . : 30 ; o vi. que está codificada por una secuencia de polinucleótidos que se híbrida en condiciones de rigurosidad alta con la sec. con núm. de ident.: 30 o con un complemento de esta; en donde la mezcla de sacarificación de biomasa tiene una viscosidad menor que una mezcla de sacarificación de biomasa sin la enzima de glicosil hidrolasa de la familia 61 y/o es capaz de aumentar el nivel de sacarificación en la mezcla en comparación con el nivel de sacarificación en una mezcla que no tiene una enzima de la familia de glicosil hidrolasa 61 o que tiene un nivel menor de esta.
2. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el nivel de sacarificación se mide en función de la producción de azúcar fermentable después de que la mezcla se incuba por un periodo de tiempo suficiente para sacarificar la biomasa.
3. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque la enzima glicosil hidrolasa de la familia 61 se deriva de un hongo filamentoso.
4. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el hongo filamentoso se selecciona del siguiente grupo: Trichoder a, Humicola, Fusarium, Aspergillus, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus, Pyricularia, Chrysosporium, Aspergillus awamori , Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseu , Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Neurospora intermedia, Penicillium purpurogenum, Penicillium canescens, Penicillium solitum, Penicillium funiculosu Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radíate, Pleurotus eryngii, Talaromyces flavus, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatu , Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Geosmithia emersonii o G. stearothermophilus .
5. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque la composición enzimática comprende, además, por lo menos un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa y por lo menos un polipéptido que tiene actividad de beta-glucosidasa .
6. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque por lo menos un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa es un polipéptido que codifica CBH1 de T. reesei, Af 7A (sec. con núm. de ident.:150), Af7B (sec. con núm. de ident.:151), Cg7A (sec. con núm. de ident . :152) , Cg7B (sec. con núm. de ident.:153), Tt7A (sec. con núm. de ident. :154), Tt7B (sec. con núm. de ident. :155), CBH2 de T. reesei, Tt6A (sec. con núm. de ident. :156), St6A (sec. con núm. de ident. :157), St6B (sec. con núm. de ident.:158) o una variante de estos que tiene por lo menos 90 % de identidad de secuencia con ellos.
7. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizada porque por lo menos un polipéptido que tiene actividad de beta-glucosidasa : a. es un polipéptido que codifica Fv3C (sec. con núm. de ident . : 100 ) , Pa3D (sec. con núm. de ident.:94), Fv3G (sec. con núm. de ident. :96), Fv3D (sec. con núm. de ident. :98), Tr3A (sec. con núm. de ident.: 102), Tr3B (sec. con núm. de ident.: 104), Te3A (sec. con núm. de ident. :106), An3A (sec. con núm. de ident. :108), Fo3A (sec. con núm. de ident. :110), Gz3A (sec. con núm. de ident. :112), Nh3A (sec. con núm. de ident. :114), Vd3A (sec. con núm. de ident. :116), Pa3G (sec. con núm. de ident.: 118), Tn3B (sec. con núm. de ident.: 119) o una variante de estos que tiene por lo menos 90 % de identidad de secuencia con ellos; o b. es un polipéptido codificado por un polinucleótido (1) que tiene por lo menos 90 % de identidad de secuencia con las sec. con núms . de ident.: 99, 93, 95, 97, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115 o 117; (2) se híbrida en condiciones de rigurosidad alta con las sec. con núms. de ident.: 99, 93, 95, 97, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115 o 117 o con un complemento de estas .
8. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, caracterizada porque la composición enzimática comprende, además, uno o más de: (1) un polipéptido que tiene actividad de xilanasa, (2) un polipéptido que tiene actividad de beta-xilosidasa; y (3) un polipéptido que tiene actividad de L-alfa-arabinofuranosidasa .
9. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el polipéptido que tiene actividad de xilanasa: a. es un polipéptido que codifica Xyn3 de T. reesei (sec. con núm. de ident.:76), Xyn2 de T. reesei (sec. con núm. de ident.:77), AfuXyn2 (sec. con núm. de ident.:58) y AfuXyn5 (sec. con núm. de ident.:60) o una variante de estos que tiene por lo menos 90 % de identidad de secuencia con ellos; o b. es un polipéptido codificado por un polinucleótido (1) que tiene por lo menos 90 % de identidad de secuencia con las sec. con núms . de ident.:75, 57 o 59; o (2) se híbrida en condiciones de rigurosidad alta con las sec. con núms. de iden . : 75, 57 o 59 o con un complemento de estas.
10. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque por lo menos un polipéptido que tiene actividad de beta-xilosidasa : a. es un polipéptido que codifica Fv3A (sec. con núm. de ident.:36), Fv43A (sec. con núm. de ident.:44), Pf43A (sec. con núm. de ident.:38), Fv43D (sec. con núm. de ident.:62), Fv39A (sec. con núm. de ident.:42), Fv43E (sec. con núm. de ident.:40), Fo43A (sec. con núm. de ident.:52), Fv43B (sec. con núm. de ident.:46), Pa51A (sec. con núm. de ident.:48), Gz43A (sec. con núm. de ident.:50), Bxll de T. reesei (sec. con núm. de ident.:78) o una variante de estos que tiene por lo menos 90 % de identidad de secuencia con ellos; o b. es un polipéptido codificado por un polinucleótido (1) que tiene por lo menos 90 % de identidad de secuencia con las sec. con núms . de ident.:35, 43, 37, 61, 41, 39, 51, 45, 47, 49 o 159; (2) se híbrida en condiciones de rigurosidad alta con las sec. con núms. de ident . : 35, 43, 37, 61, 41, 39, 51, 45, 47, 49, 159 o con un complemento de estas.
11. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque por lo menos un polipéptido que tiene actividad de L-alfa-arabinofuranosidasa : a. es un polipéptido que codifica Af43A (sec. con núm. de ident.:54), Fv43B (sec. con núm. de ident.:46), Pf51A (sec. con núm. de ident.:56), Pa51A (sec. con núm. de ident.:48), Fv51A (sec. con núm. de ident.:66) o una variante de estos que tiene por lo menos 90 % de identidad de secuencia con ellos; o b. es un polipéptido codificado por un polinucleótido (1) que tiene por lo menos 90 % de identidad de secuencia con las sec. con núms . de ident.:53, 45, 55, 47 o 65; (2) se híbrida en condiciones de rigurosidad alta con las sec. con núms. de ident . : 53, 45, 55, 47 o 65 o con un complemento de estas. 12. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizada porque la composición enzimática comprende (1) de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 50 % en peso, de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 20 % en peso, de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 15 % en peso del polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa, con referencia al peso total de proteínas en la composición enzimática; o (2) de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg del polipéptido que tiene actividad de
GH61/endoglucanasa por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa contenida en el material de biomasa .
13. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-12, caracterizada porque la composición enzimática comprende celulobiohidrolasa en una cantidad (1) de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 80 % en peso, de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 70 % en peso, de aproximadamente 10 % en peso a aproximadamente 60 % en peso, de aproximadamente 20 % en peso a aproximadamente 50 % en peso o de aproximadamente 25 % en peso a aproximadamente 50 % en peso del peso total de proteínas en la composición enzimática; o (2) de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg o de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 5 mg por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa en la mezcla de sacarificación de biomasa; y comprende beta-glucosidasa en una cantidad (1) de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 50 % en peso, de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 2 % en peso a aproximadamente 20 % en peso, de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 8 % en peso a aproximadamente 15 % en peso del peso total de proteínas en la composición enzimática; o (2) de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg o de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 5 mg por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa en la mezcla de sacarificación de biomasa.
14. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-13, caracterizada porque la composición enzimática comprende (1) de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 50 % en peso, de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 4 % en peso a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 8 % en peso a aproximadamente 15 % en peso del polipéptido que tiene actividad de xilanasa, con referencia al peso total de proteínas en la composición enzimática; o (2) de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg o de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 5 mg del polipéptido que tiene actividad de xilanasa por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa en la mezcla de sacarificación de biomasa.
15. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-14, caracterizada porque la composición enzimática comprende (1) de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 50 % en peso, de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 2 % en peso a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 4 % en peso a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 15 % en peso del polipéptido que tiene actividad de beta-xilosidasa, con referencia al peso total de proteínas en la composición enzimática; o (2) de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg o de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 5 mg del polipéptido que tiene actividad de beta-xilosidasa por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa en la mezcla de sacarificación de biomasa.
16. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-15, caracterizada porque la composición enzimática comprende (1) de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 50 % en peso, de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 50 % en peso, de aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 2 % en peso a aproximadamente 30 % en peso, de aproximadamente 4 % en peso a aproximadamente 20 % en peso o de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 15 % en peso del polipéptido que tiene actividad de L-alfa-arabinofuranosidasa, con referencia al peso total de proteínas en la composición enzimática; o (2) de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 10 mg o de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 5 mg del polipéptido que tiene actividad de L-alfa-arabinofuranosidasa por gramo de celulosa, hemicelulosa o una mezcla de celulosa y hemicelulosa en la mezcla de sacarificación de biomasa.
17. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizada porque la composición enzimática es una composición de celulasa completa.
18. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la composición de celulasa completa se deriva de una célula hospedera que expresa un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa .
19. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene actividad enzimática de la familia GH61 es heterólogo a la célula hospedera.
20. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-19, caracterizada porque la composición de celulasa completa se deriva de una célula hospedera que, además, expresa un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa y un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de beta-glucosidasa.
21. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa y/o el polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene beta-glucosidasa son heterólogos a la célula hospedera.
22. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-21, caracterizada porque la composición de celulasa completa se deriva de una célula hospedera que expresa (1) un polinucleótido que codifica un péptido que tiene actividad de beta-xilosidasa y/o (2) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de xilanasa y/o (3) un péptido o un polinucleótido que tiene actividad de L-alfa-arabinofuranosidasa .
23. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene actividad de beta-xilosidasa, el polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene actividad de xilanasa o el polinucleótido que codifica el polipéptido que tiene actividad de L-alfa-arabinofuranosidasa es heterólogo a la célula hospedera.
24. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-23, caracterizada porque la composición enzimática es una formulación de caldo entero.
25. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, caracterizada porque: (1) el gen que codifica el polipéptido que tiene actividad de GH6l/endoglucanasa y/o (2) el gen que codifica el polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa y/o (3) el gen que codifica el polipéptido que tiene actividad de beta-glucosidasa y/o (4) el gen que codifica el polipéptido que tiene actividad de beta-xilosidasa y/o (5) el gen que codifica el polipéptido que tiene actividad de xilanasa y/o (6) el gen que codifica el polipéptido que tiene actividad de L-alfa-arabinofuranosidasa se integran en el material genético de la célula hospedera.
26. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-25, caracterizada porque la célula hospedera es una célula hospedera bacteriana, célula hospedera de levadura o célula hospedera fúngica .
27. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la célula hospedera es una célula hospedera fúngica filamentosa.
28. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la célula hospedera fúngica filamentosa se selecciona de una célula de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium lucknowense, Trichoderma reesei, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus , Aspergillus nidulans , Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis , Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporu , Fusarium negundi , Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides , Fusarium venenatum, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus , Coriolus hirsutus , Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Neurospora intermedia, Penicillium purpurogenum, Penicillium canescens, Penicillium solitum, Penicillium funiculosum Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radíate, Pleurotus eryngii, Talaromyces flavus, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum o Trichoderma viride.
29. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, caracterizada porque para preparar la mezcla de sacarificación primero se combina la composición enzimática que comprende el polipéptido que tiene actividad de GH61/endoglucanasa y, después, se mezcla la composición enzimática con la biomasa.
30. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29, caracterizada porque el material de biomasa comprende hemicelulosa, celulosa o una mezcla de hemicelulosa y celulosa.
31. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-30, caracterizada porque el material de biomasa comprende glucano, xilano y/o lignina.
32. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-30, caracterizada porque el material de biomasa se selecciona de semillas, granos, tubérculos, desechos vegetales, subproductos del procesamiento de alimentos o procesamiento industrial, mazorcas de maíz, rastrojo de maíz, césped, Sorghastrum nutans, césped de pradera, cañas perennes, madera, astillas, desechos del procesamiento de madera, aserrín, papel, desechos de papel, pulpa y papel reciclado, papas, frijol de soja, cebada, centeno, avena, trigo, betable, caña de azúcar, bagazo y paja.
33. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizada porque el material de biomasa se expone a tratamiento previo con un ácido o una base.
34. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la biomasa pretratada se ajusta hasta un pH de aproximadamente 4.0 a 6.5 antes del mezclado con la composición enzimática.
35. La mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-34, caracterizada porque el material de biomasa está presente en la mezcla en una cantidad de aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 60 % en peso, de aproximadamente 10 % en peso a aproximadamente 50 % en peso, de aproximadamente 15 % en peso a aproximadamente 40 % en peso, de aproximadamente 15 % en peso a aproximadamente 30 % en peso o de aproximadamente 20 % en peso a aproximadamente 30 % en peso, con referencia a la cantidad de material de biomasa en su estado sólido con respecto al peso total de la mezcla.
36. Un método para hidrolizar un material de biomasa caracterizado poque comprende incubar la mezcla de sacarificación de biomasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-35, en condiciones adecuadas para hidrolizar los materiales de biomasa en la mezcla de sacarificación de biomasa y por un periodo de tiempo suficiente .
37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque las condiciones adecuadas para hidrolizar los materiales de biomasa en la mezcla de sacarificación de biomasa comprenden: (1) un pH de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 7.0; (2) un periodo de aproximadamente 2 horas o mayor; y/o (3) una temperatura de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 75 °C.
38. El método de conformidad con la reivindicación 36 o 37, caracterizado porque el periodo de tiempo suficiente comprende un periodo de tiempo de aproximadamente 8 horas a aproximadamente 72 horas.
39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, caracterizado porque en cualquier tiempo determinado superior a 2 horas, la cantidad de azúcares fermentables producida por la mezcla de sacarificación de biomasa aumenta por lo menos aproximadamente 5 % en comparación con la cantidad de azúcares fermentables producida por una mezcla de sacarificación de biomasa de control que comprende la misma cantidad y tipo de material de biomasa, y la misma composición de componentes enzimáticos, pero sin GH61/endog1ucanasa .
40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la cantidad de azúcares fermentacbles producida por la sacarificación de la biomasa aumenta por lo menos aproximadamente 10 % en comparación con la cantidad de azúcares fermentables producida por la mezcla de sacarificación de biomasa de control.
41. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36-40, caracterizado porque el material de biomasa está presente en una cantidad de aproximadamente 10 % en peso a aproximadamente 50 % en peso en su estado sólido.
42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la viscosidad de la mezcla de sacarificación de biomasa se reduce por lo menos aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 % o más, en comparación con la viscosidad de la mezcla de sacarificación de biomasa de control que comprende la misma cantidad y tipo de material de biomasa y la misma composición de componentes enzimáticos, pero sin GH61/endoglucanasa .
43. Un método para usar la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-35, caracterizado porque es para convertir un material de biomasa en azúcares fermentables en un modelo comercial de suministro de enzimas o en un modelo de biorefinería en el sitio.
MX2013010512A 2011-03-17 2012-03-16 Metodo para reducir la viscosidad en un proceso de sacarificacion. MX2013010512A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161453923P 2011-03-17 2011-03-17
PCT/US2012/029445 WO2012125925A2 (en) 2011-03-17 2012-03-16 Method for reducing viscosity in saccharification process

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2013010512A true MX2013010512A (es) 2013-10-07

Family

ID=45922826

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2013010512A MX2013010512A (es) 2011-03-17 2012-03-16 Metodo para reducir la viscosidad en un proceso de sacarificacion.

Country Status (15)

Country Link
US (3) US20140134677A1 (es)
EP (1) EP2686434B1 (es)
JP (2) JP6290626B2 (es)
KR (1) KR20140017612A (es)
CN (1) CN103842515A (es)
BR (1) BR112013023757A2 (es)
CA (1) CA2830508A1 (es)
DK (1) DK2686434T3 (es)
HK (1) HK1198659A1 (es)
MX (1) MX2013010512A (es)
RU (1) RU2013146245A (es)
SG (1) SG192098A1 (es)
UA (1) UA115306C2 (es)
WO (1) WO2012125925A2 (es)
ZA (1) ZA201305619B (es)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7056721B2 (en) * 2001-12-18 2006-06-06 Genencor International, Inc. EGVI endoglucanase and nucleic acids encoding the same
MX353237B (es) 2009-09-23 2018-01-08 Danisco Us Inc Enzimas de glicosil hidrolasa novedosas y usos de las mismas.
CN102844429B (zh) 2009-11-20 2015-11-25 丹尼斯科美国公司 具有改善的特性的β-葡萄糖苷酶I变体
US10138499B2 (en) 2009-12-23 2018-11-27 Danisco Us Inc. Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions
US9493802B2 (en) 2010-08-20 2016-11-15 Codexis, Inc. Use of glycohydrolase 61 protein variants with improved thermostability for processing cellulose
MX2013010512A (es) 2011-03-17 2013-10-07 Danisco Inc Metodo para reducir la viscosidad en un proceso de sacarificacion.
WO2013028701A1 (en) * 2011-08-22 2013-02-28 Codexis, Inc. Gh61 glycoside hydrolase protein variants and cofactors that enhance gh61 activity
JP2013169154A (ja) * 2012-02-17 2013-09-02 Toyota Motor Corp セルロース系バイオマス分解増強活性ポリペプチド
CN113234695A (zh) 2012-04-27 2021-08-10 诺维信股份有限公司 Gh61多肽变体以及编码其的多核苷酸
BR112015009201A2 (pt) * 2012-10-31 2017-11-14 Danisco Us Inc composição compreendeendo um polipeptídeo recombinante, ácido nucleico codificando o mesmo, célula hospedeira, bem como métodos para produzir uma beta-glucosidase e para hidrolisar um substrato de biomassa lignocelulósica
WO2014088940A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Danisco Us Inc. Compositions and methods of use
DK2943577T3 (da) * 2013-01-11 2019-07-29 Dsm Ip Assets Bv Fremgangsmåde til enzymatisk hydrolyse af lignocellulosemateriale
DK3447136T3 (da) 2013-02-04 2020-08-03 Dsm Ip Assets Bv Carbohydratdegraderende polypeptid og anvendelser deraf
WO2014138672A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
WO2014140171A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-18 Dsm Ip Assets B.V. Novel cell wall deconstruction enzymes of thielavia australiensis and uses thereof
CN105283546A (zh) 2013-05-10 2016-01-27 诺维信公司 具有木聚糖酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸
AU2014296574A1 (en) 2013-07-29 2016-02-18 Danisco Us Inc. Variant enzymes
JP6325214B2 (ja) * 2013-08-29 2018-05-16 アサヒグループホールディングス株式会社 セルラーゼの製造方法及び液体培地
WO2015035029A1 (en) 2013-09-04 2015-03-12 Novozymes A/S Processes for increasing enzymatic hydrolysis of cellulosic material
EP3074513A1 (en) 2013-11-26 2016-10-05 Novozymes A/S Enzyme compositions and uses thereof
FR3014903B1 (fr) * 2013-12-17 2017-12-01 Ifp Energies Now Procede d'hydrolyse enzymatique avec production in situ de glycosides hydrolases par des microorganismes genetiquement modifies (mgm) et non mgm
EP3511418B1 (en) 2014-01-07 2020-07-15 Novozymes A/S Corollospora maritima mannanase and its use
EP3152315B1 (en) 2014-06-06 2018-08-15 Novozymes A/S Enzyme compositions and uses thereof
CA2958034A1 (en) 2014-08-28 2016-03-03 Renescience A/S Solubilization of msw with blend enzymes
WO2016037096A1 (en) 2014-09-05 2016-03-10 Novozymes A/S Carbohydrate binding module variants and polynucleotides encoding same
CN107109346B (zh) 2014-09-23 2021-07-20 诺维信公司 用于生产乙醇的方法和发酵生物
KR101719778B1 (ko) * 2015-01-13 2017-04-03 대한민국 신규 페니실리움 솔리텀 ｍ２４３９ 균주 및 이의 용도
EP3739045B1 (en) 2015-02-24 2024-08-14 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
EP3268484B1 (en) 2015-03-12 2020-06-17 Novozymes A/S Multi-stage enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass
US10513721B2 (en) 2015-03-12 2019-12-24 Novozymes A/S Two-stage process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass
US20180051306A1 (en) 2015-03-12 2018-02-22 Novozymes A/S Enzymatic Hydrolysis with Hemicellulolytic Enzymes
WO2016188459A1 (en) 2015-05-27 2016-12-01 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
BR112017027729A2 (pt) 2015-07-07 2018-09-11 Danisco Us Inc indução de expressão de gene com o uso de uma mistura de açúcar de concentração alta
US20180216089A1 (en) 2015-07-24 2018-08-02 Novozymes, Inc. Polypeptides Having Beta-Xylosidase Activity And Polynucleotides Encoding Same
BR112018001041A2 (pt) 2015-07-24 2018-09-11 Novozymes Inc polipeptídeo isolado, composição, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células, célula hospedeira recombinante, métodos para produção de um polipeptídeo e para produção de uma proteína, planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, e, processos para degradação de um material celulósico ou hemicelulósico, para produção de um produto de fermentação e para fermentação de um material celulósico ou hemicelulósico.
EP3353195B1 (en) 2015-09-22 2021-11-10 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
CN108136452A (zh) 2015-11-02 2018-06-08 雷内科学有限公司 用混合酶溶解城市固体废物
WO2018053058A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Danisco Us Inc. Lignocellulosic biomass fermentation-based processes
KR102593668B1 (ko) 2016-10-04 2023-10-24 다니스코 유에스 인크. 유도 기질 부재 하의 사상 진균 세포에서의 단백질 생산
EP3558026A1 (en) 2016-12-21 2019-10-30 DuPont Nutrition Biosciences ApS Methods of using thermostable serine proteases
CN107328883A (zh) * 2017-09-05 2017-11-07 南京凯通粮食生化研究设计有限公司 一种鼠李糖生产企业快速准确测定鼠李糖含量的方法
WO2019074828A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Danisco Us Inc CELLOBIOSE DEHYDROGENASE VARIANTS AND METHODS OF USE
EP3781697A1 (en) 2018-04-20 2021-02-24 Renescience A/S Method for determining chemical compounds in waste
CN110713998B (zh) * 2019-11-29 2021-11-02 江南大学 一种阿拉伯木聚糖降解酶系的制备方法及其应用
EP4240543A1 (en) 2020-11-04 2023-09-13 Renescience A/S Method for enzymatic and/or microbial processing of waste comprising recirculation of process water
EP4015642A1 (en) * 2020-12-16 2022-06-22 Clariant Produkte (Deutschland) GmbH Process for the production of a filamentous fungus whole broth enzyme composition with low biomass formation and high protein yield
EP4015640A1 (en) * 2020-12-16 2022-06-22 Clariant Produkte (Deutschland) GmbH Process for the production of a filamentous fungus whole broth enzyme composition with low viscosity
EP4015641A1 (en) * 2020-12-16 2022-06-22 Clariant Produkte (Deutschland) GmbH Process for the production of a filamentous fungus whole broth enzyme composition with low biomass formation and high protein yield
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
CN112522117B (zh) * 2020-12-29 2022-06-28 中国科学院成都生物研究所 一株粪壳菌及其应用

Family Cites Families (135)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1358599A (en) 1970-12-22 1974-07-03 Monacelli Umberto Gun for firing tacks
US5366558A (en) 1979-03-23 1994-11-22 Brink David L Method of treating biomass material
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
GB2095275B (en) 1981-03-05 1985-08-07 Kao Corp Enzyme detergent composition
GB2094826B (en) 1981-03-05 1985-06-12 Kao Corp Cellulase enzyme detergent composition
US4797361A (en) 1983-10-24 1989-01-10 Lehigh University Microorganism and process
US5648263A (en) 1988-03-24 1997-07-15 Novo Nordisk A/S Methods for reducing the harshness of a cotton-containing fabric
EP0406314B1 (en) 1988-03-24 1993-12-01 Novo Nordisk A/S A cellulase preparation
CA1333777C (en) 1988-07-01 1995-01-03 Randy M. Berka Aspartic proteinase deficient filamentous fungi
US5536655A (en) 1989-09-26 1996-07-16 Midwest Research Institute Gene coding for the E1 endoglucanase
DK494089D0 (es) 1989-10-06 1989-10-06 Novo Nordisk As
DK16490D0 (da) 1990-01-19 1990-01-19 Novo Nordisk As Enzym
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
ES2068586T5 (es) 1990-05-09 2004-12-01 Novozymes A/S Una preparacion de celulasa que comprende una enzima endoglucanasa.
US5997913A (en) 1990-12-10 1999-12-07 Genencor International, Inc. Method enhancing flavor and aroma in foods by overexpression of β-glucosidase
DE69133100T3 (de) 1990-12-10 2015-09-03 Danisco Us Inc. Verbesserte saccharifizierung von zellulose durch klonierung und vervielfältigung des beta-glukosidase genes aus trichoderma reesei
ATE166386T1 (de) 1991-03-18 1998-06-15 Gist Brocades Nv Klonierung und expression einer acetylxylanesterase aus fungi
US5405769A (en) 1993-04-08 1995-04-11 National Research Council Of Canada Construction of thermostable mutants of a low molecular mass xylanase
DK81293D0 (da) 1993-07-06 1993-07-06 Novo Nordisk As Enzym
DK83993D0 (es) 1993-07-13 1993-07-13 Novo Nordisk As
US5437992A (en) 1994-04-28 1995-08-01 Genencor International, Inc. Five thermostable xylanases from microtetraspora flexuosa for use in delignification and/or bleaching of pulp
US6099844A (en) 1994-08-22 2000-08-08 Triarco Industries, Inc. Increasing yield of extractable substances from botanicals with an enzyme composition
US5705369A (en) 1994-12-27 1998-01-06 Midwest Research Institute Prehydrolysis of lignocellulose
WO1996029397A1 (en) 1995-03-17 1996-09-26 Novo Nordisk A/S Novel endoglucanases
JPH11507837A (ja) 1995-06-23 1999-07-13 ダニスコ・イングレディエンツ・アー／エス（ダニスコ・アー／エス） 新規β−キシロシダーゼ、それをコードするヌクレオチド配列、およびそれらの使用
CN1152025A (zh) * 1995-12-13 1997-06-18 高广仁 啤酒生产中添加纤维素酶的糖化工艺
US7883872B2 (en) 1996-10-10 2011-02-08 Dyadic International (Usa), Inc. Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose
US5811381A (en) 1996-10-10 1998-09-22 Mark A. Emalfarb Cellulase compositions and methods of use
DE69826490T2 (de) 1997-07-11 2005-12-01 Genencor International, Inc. Trichoderma reesei swollenin protein und dafür kodierende dns sequenz
US20020084046A1 (en) 1998-09-29 2002-07-04 Jay Chiehlung Hsu Enzymatic paper and process of making thereof
BRPI9914278B1 (pt) 1998-10-06 2016-03-08 Dyadic Internat Usa Inc cepa recombinante de chrysosporium, e, método para produzir um polipeptídeo de interesse
US6409841B1 (en) 1999-11-02 2002-06-25 Waste Energy Integrated Systems, Llc. Process for the production of organic products from diverse biomass sources
US6248535B1 (en) 1999-12-20 2001-06-19 University Of Southern California Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens
DK1242601T3 (da) 1999-12-30 2005-06-13 Genencor Int Trichoderma reesei-xylanase
US6423145B1 (en) 2000-08-09 2002-07-23 Midwest Research Institute Dilute acid/metal salt hydrolysis of lignocellulosics
DE10043662A1 (de) 2000-08-30 2001-02-22 Saechsisches Inst Fuer Angewan Verfahren zur enzymatischen Aktivierung von lignocellulosen Faserstoffen zur Herstellung von Werkstoffen
CN1509330A (zh) 2001-05-18 2004-06-30 ŵ��ø�ɷ����޹�˾ 具有纤维二糖酶活性的多肽和编码其的多核苷酸
US6982159B2 (en) 2001-09-21 2006-01-03 Genencor International, Inc. Trichoderma β-glucosidase
US7056721B2 (en) 2001-12-18 2006-06-06 Genencor International, Inc. EGVI endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7045331B2 (en) 2001-12-18 2006-05-16 Genencor International, Inc. EGVII endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7005289B2 (en) 2001-12-18 2006-02-28 Genencor International, Inc. BGL5 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7045332B2 (en) 2001-12-18 2006-05-16 Genencor International, Inc. BGL4 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7049125B2 (en) 2001-12-18 2006-05-23 Genencor International, Inc. EGVIII endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US20040005674A1 (en) 2002-04-30 2004-01-08 Athenix Corporation Methods for enzymatic hydrolysis of lignocellulose
EP2295559B1 (en) 2002-08-16 2015-09-16 Danisco US Inc. Novel variant Hyprocrea jecorina CBH1 cellulases with increase thermal stability comprising substitution or deletion at position T255
DE60335574D1 (de) 2002-10-04 2011-02-10 Du Pont Verfahren zur biologischen herstellung von 1,3-propandiol mit hoher ausbeute
EP1556512B1 (en) 2002-11-07 2016-06-15 Danisco US Inc. Bgl6 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7407788B2 (en) 2002-11-21 2008-08-05 Danisco A/S, Genencor Division BGL7 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same
AU2003219956A1 (en) 2003-02-27 2004-09-28 Midwest Research Institute Superactive cellulase formulation using cellobiohydrolase-1 from penicillium funiculosum
US20040231060A1 (en) 2003-03-07 2004-11-25 Athenix Corporation Methods to enhance the activity of lignocellulose-degrading enzymes
WO2005028636A2 (en) 2003-03-21 2005-03-31 Genencor International, Inc. Novel cbh1 homologs and variant cbh1 cellulases
WO2005001065A2 (en) 2003-04-01 2005-01-06 Genencor International, Inc. Variant humicola grisea cbh1.1
ATE458041T1 (de) 2003-05-29 2010-03-15 Genencor Int Neue trichoderma-gene
US20050048619A1 (en) 2003-08-25 2005-03-03 Novozymes Biotech, Inc. Variants of glycoside hydrolases
BRPI0414370A (pt) * 2003-09-15 2006-11-14 Genencor Int enzimas modificadas, processos para produzir enzimas modificadas e usos das mesmas
US7244605B2 (en) 2003-10-28 2007-07-17 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
ES2575526T3 (es) 2003-12-03 2016-06-29 Meiji Seika Pharma Co., Ltd. Endoglucanasa STCE y preparación de celulasa que contiene la misma
DK2314605T3 (da) * 2004-01-30 2014-06-16 Novozymes Inc Polypeptider med cellulolytisk forøgende aktivitet og polynukleotider, der koder for disse
EP1733033B1 (en) * 2004-02-06 2012-06-20 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US8097445B2 (en) 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
DK3219806T3 (da) 2004-03-25 2020-07-13 Novozymes Inc Fremgangsmåder til nedbrydning eller omdannelse af plantecellevægspolysaccharider
BRPI0509212A (pt) 2004-03-25 2007-08-28 Genencor Int proteìna de fusão de celulase e construto de fusão de celulase heterólogo codificando a mesma
AU2005249422B2 (en) 2004-05-27 2011-03-17 Genencor International, Inc. Acid-stable alpha amylases having granular starch hydrolyzing activity and enzyme compositions
CA2586779A1 (en) 2004-06-03 2005-12-15 Novozymes A/S Mashing process and enzyme composition useful therein
US20060075522A1 (en) 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
BRPI0519456A2 (pt) 2004-12-30 2009-01-27 Genecor Int Inc celulases de nova cbh2 variante de hypocrea jecorina
ATE492633T1 (de) 2005-01-06 2011-01-15 Novozymes Inc Polypeptide mit cellobiohydrolaseaktivität und dafür kodierende polynukleotide
WO2006110902A1 (en) 2005-04-12 2006-10-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company System and process for biomass treatment
US7781191B2 (en) 2005-04-12 2010-08-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Treatment of biomass to obtain a target chemical
WO2006114095A1 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Novozymes A/S Hydrolysis of arabinoxylan
WO2007089290A2 (en) * 2005-09-30 2007-08-09 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
US7256032B2 (en) 2005-12-22 2007-08-14 Ab Enzymes Oy Enzymes
FI120045B (fi) * 2005-12-22 2009-06-15 Roal Oy Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit
EP2444489B1 (en) * 2006-02-10 2014-02-12 Verenium Corporation Cellucloytic enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
WO2008008793A2 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Dyadic International Inc. Methods and compositions for degradation of lignocellulosic material
US8017373B2 (en) 2006-08-31 2011-09-13 Iogen Energy Corporation Process for enzymatic hydrolysis of pretreated lignocellulosic feedstocks
EP2069512B1 (en) 2006-09-22 2010-06-16 Danisco US, INC., Genencor Division Acetolactate synthase from trichoderma reesei as selectable marker
US7993884B2 (en) 2006-10-10 2011-08-09 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Beta-xylosidase for conversion of plant cell wall carbohydrates to simple sugars
CN105441509A (zh) 2006-11-13 2016-03-30 丹尼斯科美国公司 改善纤维素转化过程产率的方法
DK2069491T3 (en) 2007-05-10 2018-04-09 Novozymes Inc COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR IMPROVING THE DECOMPOSITION OR CONVERSION OF CELLULOSE SUBSTANCES
US8450098B2 (en) 2007-05-21 2013-05-28 Danisco Us Inc. Method for introducing nucleic acids into fungal cells
KR101507402B1 (ko) 2007-05-31 2015-04-02 노보자임스 인코포레이티드 폴리펩티드의 셀룰로오스 가수분해 증진 활성을 증가시키는 방법
US8044264B2 (en) * 2007-05-31 2011-10-25 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US9969993B2 (en) 2007-05-31 2018-05-15 Novozymes, Inc. Filamentous fungal host cells and methods of recombinantly producing proteins
US20100323426A1 (en) 2007-06-08 2010-12-23 Bower Benjamin S Heterologous and Homologous Cellulase Expression System
MX2009013188A (es) 2007-06-27 2010-02-24 Novozymes As Metodos para producir productos de fermentacion.
EP2380988A3 (en) 2007-07-10 2012-04-11 Mosanto Technology LLC Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US7819976B2 (en) 2007-08-22 2010-10-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Biomass treatment method
EP2197893B1 (en) 2007-09-07 2013-07-24 Dyadic International, Inc. Novel fungal enzymes
CA2698765A1 (en) 2007-09-07 2009-03-19 Danisco Us Inc. Beta-glucosidase enhanced filamentous fungal whole cellulase compositions and methods of use
DK2708602T3 (da) 2007-10-03 2019-06-03 Bp Corp North America Inc Xylanaser, nukleinsyrer der koder for dem og fremgangsmåder til fremstilling og anvendelse af dem
EP2209901B1 (en) 2007-10-12 2016-02-17 Danisco US Inc. Methods and compositions for enhanced production of organic sustances from fermenting microorganisms
WO2009074685A1 (en) * 2007-12-12 2009-06-18 Novozymes A/S Enzymatic degradation of biomass substrates comprising mannan
WO2009076676A2 (en) 2007-12-13 2009-06-18 Danisco Us Inc. Compositions and methods for producing isoprene
BRPI0821048A2 (pt) * 2007-12-19 2015-06-16 Novozymes As Polipeptídeo e polinucleotídeo isolados, construção de ácido nucléico, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptídeo, um mutante de uma célula precursora, uma proteína e um produto de fermentação, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para degradar ou converter um material celulósico, e para fermentar um material celulósico, planta trangênica, parte vegetal ou célula vegetal, e, melécula de rna inibidora
AU2008343105A1 (en) * 2007-12-19 2009-07-09 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP2260105B1 (en) 2008-02-29 2016-08-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Production and use of plant degrading materials
CN101960006B (zh) 2008-03-07 2015-03-11 丹尼斯科美国公司 在木霉中表达过氧化氢酶
CN106222150A (zh) 2008-03-21 2016-12-14 丹尼斯科美国公司 用于增加生物量水解的富含半纤维素酶的组合物
WO2009132008A2 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Chromatin, Inc. Methods and materials for processing a feedstock
AU2009243081B2 (en) 2008-04-29 2013-08-15 Danisco Us Inc. Swollenin compositions and methods of increasing the efficiency of a cellulase
EP2628796A1 (en) 2008-06-06 2013-08-21 Danisco US Inc. Compositions and methods comprising cellulase variants with reduced affinity to non-cellulosic materials
US8518684B2 (en) * 2008-11-18 2013-08-27 Novozymes, Inc. Methods and compositions for degrading cellulosic material
EP2373788A1 (en) * 2008-12-04 2011-10-12 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US8337663B2 (en) * 2008-12-19 2012-12-25 Novozymes, Inc. Methods for increasing hydrolysis of cellulosic material
US8679824B2 (en) 2009-02-20 2014-03-25 Danisco Us Inc. Fermentation broth formulations
MX2011009009A (es) * 2009-02-27 2011-09-15 Iogen Energy Corp Enzimas de celulosa resistentes a lignina.
US20120135465A1 (en) * 2009-04-08 2012-05-31 Bergsma Martien H Endoglucanase For Reducing The Viscosity Of A Plant Materials Slurry
US8129591B2 (en) * 2009-04-30 2012-03-06 Novozymes, Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
BRPI1011597B1 (pt) * 2009-05-29 2019-08-20 Novozymes, Inc. Métodos para degradar um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, e para fermentar um material celulósico, e, composição de enzima
MX2011012841A (es) 2009-06-03 2012-01-27 Danisco Inc Variantes de celulasa con expresion, actividad y/o estabilidad mejoradas y usos de las mismas.
EP2443235A4 (en) 2009-06-16 2013-07-31 Codexis Inc ß-glucosidase VARIANTS
MX353237B (es) 2009-09-23 2018-01-08 Danisco Us Inc Enzimas de glicosil hidrolasa novedosas y usos de las mismas.
CN101671698A (zh) * 2009-10-12 2010-03-17 天津科技大学 用木聚糖酶提高淀粉质原料酒精发酵速度和出酒率的方法
CN102844429B (zh) 2009-11-20 2015-11-25 丹尼斯科美国公司 具有改善的特性的β-葡萄糖苷酶I变体
US8647850B2 (en) * 2009-12-23 2014-02-11 E I Du Pont De Nemours And Company Process for simultaneous saccharification and fermentation for production of ethanol
US10138499B2 (en) 2009-12-23 2018-11-27 Danisco Us Inc. Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions
US8906235B2 (en) 2010-04-28 2014-12-09 E I Du Pont De Nemours And Company Process for liquid/solid separation of lignocellulosic biomass hydrolysate fermentation broth
US8721794B2 (en) 2010-04-28 2014-05-13 E I Du Pont De Nemours And Company Production of high solids syrup from lignocellulosic biomass hydrolysate fermentation broth
CN105441414A (zh) 2010-06-01 2016-03-30 加州理工学院 稳定的功能嵌合纤维二糖水解酶i类酶
EP2397491A1 (en) 2010-06-21 2011-12-21 Technische Universität Wien LeaA from Trichoderma reesei
EP2611901B1 (en) 2010-08-30 2016-05-11 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
US8476048B2 (en) * 2010-12-17 2013-07-02 E I Du Pont De Nemours And Company Xylose utilizing zymomonas mobilis with improved ethanol production in biomass hydrolysate medium
MX2013010512A (es) 2011-03-17 2013-10-07 Danisco Inc Metodo para reducir la viscosidad en un proceso de sacarificacion.
MX2013010509A (es) 2011-03-17 2013-10-17 Danisco Inc Composiciones de celulasa y sus metodos de uso para mejorar la conversions de biomasa lignocelulosica en azucares.
KR20140027154A (ko) 2011-03-17 2014-03-06 다니스코 유에스 인크. 글리코실 가수분해효소 및 바이오매스 가수분해를 위한 그의 용도
CN103547672B (zh) 2011-05-10 2017-10-27 丹尼斯科美国公司 热稳定性碳酸酐酶及其使用方法
WO2013028701A1 (en) 2011-08-22 2013-02-28 Codexis, Inc. Gh61 glycoside hydrolase protein variants and cofactors that enhance gh61 activity
CN104011222A (zh) 2011-12-13 2014-08-27 丹尼斯科美国公司 从混合培养物制备的酶合剂
CA2888753A1 (en) 2012-10-31 2014-05-08 Danisco Us Inc. Beta-glucosidase from magnaporthe grisea
BR112015009201A2 (pt) 2012-10-31 2017-11-14 Danisco Us Inc composição compreendeendo um polipeptídeo recombinante, ácido nucleico codificando o mesmo, célula hospedeira, bem como métodos para produzir uma beta-glucosidase e para hidrolisar um substrato de biomassa lignocelulósica
EP2931887A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 Danisco US Inc. Variants of cellobiohydrolases
ES2727390T3 (es) 2013-05-20 2019-10-15 Abengoa Bioenergia Nuevas Tecnologias Sa Expresión de enzimas beta-xilosidasas recombinantes
AU2014296574A1 (en) 2013-07-29 2016-02-18 Danisco Us Inc. Variant enzymes
BR112016012627A2 (pt) 2013-12-04 2017-09-26 Danisco Us Inc composições compreendendo um polipeptídeo de beta-glicosidase e métodos de uso

Also Published As

Publication number Publication date
US20170096651A1 (en) 2017-04-06
HK1198659A1 (en) 2015-05-22
UA115306C2 (uk) 2017-10-25
US10190108B2 (en) 2019-01-29
DK2686434T3 (da) 2021-10-11
WO2012125925A2 (en) 2012-09-20
RU2013146245A (ru) 2015-04-27
ZA201305619B (en) 2014-10-29
KR20140017612A (ko) 2014-02-11
US20190249160A1 (en) 2019-08-15
JP2018075020A (ja) 2018-05-17
US20140134677A1 (en) 2014-05-15
EP2686434A2 (en) 2014-01-22
CN103842515A (zh) 2014-06-04
EP2686434B1 (en) 2021-07-14
WO2012125925A3 (en) 2012-12-27
CA2830508A1 (en) 2012-09-20
JP2014511673A (ja) 2014-05-19
SG192098A1 (en) 2013-08-30
BR112013023757A2 (pt) 2017-06-06
JP6290626B2 (ja) 2018-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190249160A1 (en) Method for reducing viscosity in saccharification process
AU2012229042B2 (en) Glycosyl hydrolase enzymes and uses thereof for biomass hydrolysis
US10273465B2 (en) Glycosyl hydrolase enzymes and uses thereof
AU2012229042A1 (en) Glycosyl hydrolase enzymes and uses thereof for biomass hydrolysis
US20140073017A1 (en) Cellulase compositions and methods of using the same for improved conversion of lignocellulosic biomass into fermentable sugars
AU2012228968A1 (en) Cellulase compositions and methods of using the same for improved conversion of lignocellulosic biomass into fermentable sugars
AU2016203478A1 (en) Method for reducing viscosity in saccharification process
AU2012229030A1 (en) Method for reducing viscosity in saccharification process