BRPI0719748A2 - Microrganismo modificados por engenharia para produzir n-butanol e métodos relacionados - Google Patents

Description

“MICRORGANISMOS MODIFICADOS POR ENGENHARIA PARA PRODUZIR N- butanol e métodos relacionados”

Por Thomas Buelter, Andrew C. Hawkins, Kalib Kersh, Peter Meinhold1 Matthew W. Peters e Ezhilkani Subbian

Referência Cruzada a Pedidos de Patente Relacionados

Este pedido de patente reivindica prioridade para pedido de patente provisório U.S. No. de série 60/868,326 depositado em 1 de dezembro de 2006, pedido de patente provisó- rio U.S. No. de série 60/940.877 depositado em 30 de maio de 2007, pedido de patente pro- visório U.S. No. de série 60/890.329 depositado em 16 de fevereiro de 2007, pedido de pa- tente provisório U.S. No. de série 60/905.550 depositado em 6 de março de 2007, e pedido de patente provisório U.S. No. de série 60/945.576 depositado em 21 de junho de 2007, to- dos aqui incorporados pela referência na sua íntegra.

Campo Técnico da Invenção

A presente descrição diz respeito a microrganismos modificados por engenharia. Em particular, diz respeito a microrganismos modificados por engenharia para produzir bio- combustíveis, tal como n-butanol, intermediários metabólicos destes e/ou derivados destes.

Antecedentes da Invenção

A bioconversão de carboidratos a partir de açúcares derivados de biomassa em n- butanol é conhecida e realizada em grande escala há cerca de 100 anos. Sua história volta a Louis Pasteur, que observou em 1861 que certas bactérias produzem n-butanol. Em 1912, Chaim Weizmann descobriu um microrganismo denominado Clostridium acetobutylicum, que foi capaz de fermentar amido a acetona, n-butanol, e etanol (então fermentação ABE). Este processo é baseado em um único conjunto de caminhos metabólicos encontrados em bactérias gram positivas anaeróbicas do gênero Clostridium (ver figura 1) que também for- nece produção de subprodutos, tais como acetona e etanol.

A instabilidade recente dos fornecedores de óleo do leste central, juntamente com um suprimento prontamente disponível de biomassa de base agricolamente renovável nos Estados Unidos, estimulou um interesse renovado na produção de n-butanol em Clostridium e tentativas rápidas de produzir butanol em outros microrganismos.

Cepas modificadas por engenharia de Clostridium foram geradas, as quais otimi- zam a produção de n-butanol de resíduo de biomassa tratada. Adicionalmente, foram de- senvolvidos novos processos de produção de n-butanol usando múltiplas cepas de Clostri- dium, otimizados tanto para a conversão de carboidratos em butirato quanto a subsequente conversão de butirato exógeno em n-butanol.

A produção de cepas modificadas por engenharia de outros microrganismos, tal como E.colli capazes de produzir uma quantidade detectável de butanol também foi regis- Sumário da Invenção

Microrganismos recombinantes são aqui descritos que podem fornecer n-butanol em altos rendimentos maiores que 70 % do valor teórico.

Em particular, os microrganismos recombinantes aqui descritos são modificados por engenharia para ativar um caminho heterólogo para a produção de n-butanol, para direcio- nar o fluxo de carbono para n-butanol e possivelmente equilibrar o dito caminho heterólogo com relação à produção e consumo de NADH para maximizar a rendimento obtenível.

De acordo com uma modalidade um microrganismo recombinante é descrito que é capaz de produzir n-butanol em um rendimento de pelo menos 5 porcento do valor teórico. 10 O microrganismo recombinante é em particular obtenível modificando por engenharia o mi- crorganismo para alcançar uma enzima heteróloga de um caminho dependente de NADH para a conversão de uma fonte de carbono a n-butanol por meio da produção de um ou mais intermediários metabólicos; modificando por engenharia o microrganismo para inativar uma enzima nativa de um ou mais caminhos para a conversão de um substrato a um produ- 15 to em que o substrato é um de um ou mais intermediários metabólicos, e modificando por engenharia o microrganismo para ativar pelo menos um de uma enzima que produto NADH e um caminho que produz NADH para equilibrar o dito caminho heterólogo dependente de NADH.

De acordo com uma outra modalidade um microrganismo recombinante é descrito 20 que é capaz de produzir n-butanol em um rendimento de pelo menos 2 porcento do valor teórico. O microrganismo recombinante obtenível modificando por engenharia o microrga- nismo para ativar uma enzima heteróloga de um caminho dependente de NADH para a con- versão de uma fonte de carbono a n-butanol por meio da produção de um ou mais interme- diários metabólicos; e modificando por engenharia o microrganismo para inativar uma enzi- 25 ma nativa de um ou mais caminhos para a conversão de um substrato a um produto em que o substrato é um de um ou mais intermediários metabólicos.

De acordo com uma modalidade adicional um microrganismo recombinante é des- crito que expressa um caminho heterólogo para a conversão de uma fonte de carbono a n- butanol. O caminho heterólogo compreendendo o seguinte substrato a produtos conversão: 30 acetil-CoA a acetoacetil-CoA; acetoacetil-CoA a hidroxibutiril-CoA; hidroxibutiril-CoA a croto- noil- CoA; crotonil-CoA a butiril-CoA; butiril-CoA a butiraldeído, e butiraldeído a n-butanol. O microrganismo recombinante é modificado por engenharia para inativar um ou mais cami- nhos nativos para a conversão de um substrato a um produto em que o substrato é piruvato ou acetilCoA. O microrganismo recombinante é adicionalmente modificado por engenharia 35 para ativar pelo menos um de um piruvato desidrogenase anaerobicamente ativo, um forma- to desidrogenase dependente de NADH, e um caminho heterólogo para a conversão de gli- cerol a piruvato. O microrganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um ren- dimento de pelo menos 5 porcento do valor teórico.

De acordo com um outro aspecto da modalidade um microrganismo recombinante é descrito que expressa um caminho heterólogo para a conversão de uma fonte de carbono a n-butanol. O caminho heterólogo compreendendo o seguinte substrato a produtos conver- 5 são: acetil-CoA a acetoacetil-CoA; acetoacetil-CoA a hidroxibutiril-CoA; hidroxibutiril-CoA a crotonoil- CoA; crotonil-CoA a butiril-CoA; butiril-CoA a butiraldeído, e butiraldeído a n- butanol. O microrganismo recombinante é modificado por engenharia para inativar um ou mais caminhos nativos para a conversão de um substrato a um produto em que o substrato é piruvato ou acetilCoA. O microrganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em 10 um rendimento de pelo menos XX porcento do valor teórico.

Os microrganismos recombinantes aqui descritos podem produzir n-butanol em al- tos rendimentos com uma produção de subprodutos minimizada que é vantajosa com rela- ção aos sistemas da tecnologia anterior em que n-butanol é produzido em Clostridium.

Os microrganismos recombinantes aqui descritos podem produzir n-butanol em rendimentos significativamente maiores que sistemas da tecnologia anterior em que n- butanol é produzido em microrganismos a não ser Clostridium.

De acordo com uma outra modalidade, um método para produzir n-butanol é descri- to o método compreendendo fornecer um microrganismo recombinante aqui descrito, e co- locar o microrganismo recombinante em contato com uma fonte de carbono por um tempo e 20 em condições suficientes para permitir a produção de n-butanol, até que uma quantidade recuperável de n-butanol seja produzida. O método também pode incluir recuperar a quanti- dade recuperável de n-butanol.

De acordo com uma outra modalidade um microrganismo recombinante é descrito que é capaz de produzir butirato em um rendimento de pelo menos 5 porcento do valor teó- 25 rico. O microrganismo recombinante obtenível modificando por engenharia o microrganismo para ativar um caminho heterólogo dependente de NADH para a conversão de uma fonte de carbono a butirato por meio da produção de um ou mais intermediários metabólicos; e modi- ficando por engenharia o microrganismo para inativar um caminho nativo para a conversão de um substrato a um produto em que o substrato é um de um ou mais intermediários meta- 30 bólicos.

De acordo com uma outra modalidade um microrganismo recombinante é descrito que é capaz de produzir misturas de butirato e n-butanol em um rendimento de pelo menos 5 porcento do valor teórico.. O microrganismo recombinante é obtenível modificando por engenharia o microrganismo para ativar um caminho heterólogo dependente de NADH para 35 a conversão de uma fonte de carbono a butirato por meio da produção de um ou mais inter- mediários metabólicos: modificando por engenharia o microrganismo para ativar um cami- nho heterólogo dependente de NADH para a conversão de uma fonte de carbono a n- butanol por meio da produção de um ou mais intermediários metabólicos; modificando por engenharia o microrganismo para inativar um caminho nativo para a conversão de um subs- trato a um produto em que o substrato é um de um ou mais intermediários metabólicos, e/ou modificando por engenharia o microrganismo para ativar pelo menos um de uma enzima 5 que produto NADH e um caminho que produz NADH para equilibrar o dito caminho heteró- logo dependente de NADH.

Os detalhes de uma ou mais modalidades da descrição são apresentados nos de- senhos em anexo e descrição a seguir. Outras características, objetos, e vantagens ficarão evidentes a partir da descrição e desenhos e das reivindicações.

Descrição Resumida dos Desenhos

Os desenhos em anexo, que estão incorporados e formam parte desta especifica- ção ilustram uma ou mais modalidades da presente descrição e, junto com a descrição deta- lhada, servem para explicar os princípios e implementações da descrição.

Figura 1 ilustra os caminhos metabólicos envolvidos na conversão de glicose a áci- 15 dos e solventes em Clostridium acetobutylicum. Hexoses (por exemplo, glicose) e pentoses são convertidos a piruvato, ATP e NADH. Subsequentemente, piruvato é oxidativamente descarboxilado a acetil-CoA por uma piruvato-ferredoxina oxidoredutase. Os equivalentes de redução gerados nesta etapa são convertidos a hidrogênio por um hidrogenase de ferro somente. AcetiI-CoA é o intermediário do ponto de derivação, que leva à produção de ácidos 20 orgânicos (acetato e butirato) e solventes (acetona, n-butanol e etanol).

Figura 2 ilustra um caminho químico para produzir n-butanol em microrganismos. Em condições ideais, este caminho gera uma molécula de n-butanol (máximo) por molécula de glicose metabolizada. O caminho que produz n-butanol apresentado é equilibrado com relação à produção e consumo de NADH, no quatro (4) NADH são produzidos e consumidos por glicose metabolizada.

Figura 3 ilustra fermentação ácida mista em E. coli, cujos produtos incluem succina- to, lactato, acetato, etanol, formato, dióxido de carbono e gás hidrogênio. As enzimas que são encaixotadas foram deletadas ou inativadas, tanto sozinhas ou em várias combinações de acordo com a descrição em uma ou mais cepas de E. coli.

Figura 4 ilustra uma estratégia de engenharia metabólica para produzir piruvato de-

sidrogenase anaerobicamente ativa em E. coli. Nesta estratégia, as enzimas nas caixas são deletadas/inativadas e as células crescem anaerobicamente em meio mínimo e uma fonte de carbono, tal como glicose. Nestas condições, as únicas células que crescem são as que produzem piruvato desidrogenase em virtude de elas serem capazes de equilibrar a produ- ção e consumo de NADH por meio do caminho indicado em negrito.

Figura 5 apresenta um fragmento de restrição 5614-bp EcoRI-BamHI que mostra os genes thl, adh, crt e hbd de C. acetobutylicum sintetizados como uma única transcrição (seq tach, que é expressa a partir do plasmídeo pGV1191.

Figura 6 apresenta um fragmento de restrição 3027-bp EcoRI-BamHI que mostra os genes bed, etfA e etfB de C. acetobutylicum sintetizados como uma única transcrição (seq Cbab1 que é expressa a partir do pGV1088.

Figura 7 apresenta um fragmento de restrição 3128-bp que mostra os genes bed,

etfA e etfB de M. elsdenii sintetizados como uma única transcrição (seq Mbab, que é ex- pressa a partir do pGV1052.

Figura 8 apresenta o plasmídeo Seq tach-pZA11 (= pGV1191) contendo thl, adhE2, crt, e hbd ORFS inseridos nos sítios EcoRI e BamHI no vetor MCS e à jusante de um pro- motor Iambda tetO de fago modificado (Puet)· O plasmídeo também carrega uma origem ρ15A de replicação e um gene de resistência à ampicilina.

Figura 9 apresenta o plasmídeo Seq Cbab-pZE32 (= pGV1088) contendo o bed, et- fA e etfB ORFS inseridos nos sítios EeoRI e BamHI no vetor MCS e à jusante de um promo- tor LacO Iambda de fago modificado (Puac)· O plasmídeo também carrega a origem CoIEI de replicação e um gene de resistência ao clorafenicol.

Figura 10 mostra uma placa de petri incluindo GEV01005 (£. coli W3110), GEV0922 (E. coli W3110 (AglpK, Δ glpD)), e GEV0926 (E coli W3110 (AglpK, AglpD, evol- vido)). GEV0926 é marcado com “G02XK0-I” na placa.

Figura 11 mostra um diagrama que ilustra a quantidade de glicerol consumido por um microrganismo recombinante aqui descrito (GEV0927) em comparação com a quantida- de consumida pelo microrganismo tipo selvagem correspondente (GEVO 1005, pGVIOIO) seguindo biotransformação anaeróbica em condições de não crescimento.

Figura 12 mostra um diagrama que ilustra a quantidade de 3-hidroxibutirato de etila produzido por um microrganismo recombinante aqui descrito (GEV0927) em comparação com a quantidade produzida pelo microrganismo tipo selvagem correspondente (GEV01005, pGVIOIO) seguindo biocatálise de não crescimento anaeróbico.

Figura 13 mostra um diagrama que ilustra o equilíbrio de carbono de um microrga- nismo aqui descrito (GEV01005, pGVIOIO) em termos de glicerol consumido e quantidade de acetato observada seguindo biocatálise de não crescimento anaeróbico.

Figura 14 mostra um diagrama que ilustra o equilíbrio de carbono de um microrga-

nismo recombinante aqui descrito (GEV0927) em termos de glicerol consumido e quantida- de de acetato observada seguindo biocatálise de não crescimento anaeróbico.

Figura 15 mostra formação de n-butanol com o tempo em fermentações usando ce- pas de E. coli que expressam caminhos de produção de n-butanol que utilizam TER de Eu- glena gracilis (pGV1191, pGV1113) e Aeromonas hydrophila (pGV1191, pGV1117) em comparação a E. coli que expressa caminhos de produção de n-butanol que não contém uma enzima TER (pGV1191). Experimentos foram conduzidos usando duas replicatas bio- lógicas.

Figura 16 mostra um diagrama que ilustra fermentações de n-butanol realizadas com microrganismos recombinantes aqui descritos que expressam diferentes homólogos TER (pGV1340; pGV1344; pGV1345; pGV1346; pGV1347; pGV1348; pGV1349; pGV1272 5 (Controle). pGV1344 contém o gene que codifica o Treponema denticola TER. pGV1272 contém o gene que codifica o Euglena gracilis TER. Experimentos foram conduzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 17 mostra um diagrama que ilustra fermentações de n-butanol com micror- ganismos recombinantes contendo o plasmídeos indicados que expressam diferentes homó- Iogos TER (pGV1341; pGV1342; pGV1343; pGV1272 (Controle). pGV1272 contém o gene que codifica o Euglena gracilis TER. Experimentos foram conduzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 18 mostra um diagrama que ilustra produção de Iactato por microrganismos recombinantes aqui descritos (cepa A: GEV01083, pGV1191, pGV1113; cepa B: GEVOI 121, pGVI 191, pGVI 113) durante a fermentação em garrafa anaeróbica. Experimentos fo- ram conduzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 19 mostra um diagrama que ilustra produção de n-butanol por microrganis- mos recombinantes de acordo com modalidades aqui descritas (cepa 1137: GEVOI 137, pGV1190, pGV1113; cepa 1083: GEV01083, pGV1190, pGV1113) modificadas por enge- nharia para inativar o caminho fermentativo de acetato. Experimentos foram conduzidos u- sando duas replicatas biológicas.

Figura 20A mostra um diagrama que ilustra produção de n-butanol por microrga- nismos recombinantes de acordo com modalidades da presente descrição (Cepa 1: GEVO 1083, pGVI 113, pGVI 190; Cepa 2: GEV01083, pGV1281, pGVI 190). Experimentos foram conduzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 20B mostra um diagrama que ilustra consumo de glicose por microrganismo recombinante de acordo com modalidades da presente descrição, (retângulos: GEV01083, pGV1113, pGV1190; triângulos: GEV01083, pGV1281, pGV1190). Experimentos foram conduzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 21A mostra um diagrama que ilustra fermentações realizadas com microrga-

nismos recombinantes de acordo com modalidades aqui descritas anaerobicamente sem neutralização ou alimentação (círculos: GEV0768, GV1191, GV1113; triângulos: GEV0768). Experimentos foram conduzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 21B mostra um diagrama que ilustra fermentações realizadas com microrga- nismos recombinantes da figura 2 IA, em que o caldo de fermentação foi neutralizado e gli- cose foi alimentada a cada 8 horas durante toda a fermentação e em que a fermentação foi realizada com uma fase de crescimento aeróbico e uma fase de crescimento anaeróbico (círculos: GEV0768, pGV1191, pGVI 113; triângulos: GEV0768). Experimentosforam con- duzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 22A mostra um diagrama que ilustra produção de n-butanol durante fermen- tações realizadas com microrganismos recombinantes de acordo com modalidades aqui 5 descritas (GEV01083, pGV1190, pGV1113) em diferentes transições de condições de cultu- ra aeróbicas para anaeróbicas. Fermentador 1 (F1) teve uma transição de 2 horas, fermen- tador 2 (F2) teve uma transição de 6 horas, fermentador 3 (F3) teve uma transição de 12 horas e no fermentador 4 a transição foi feita no tempo que as células levam para consumir o oxigênio deixado no fermentador depois que a fonte de oxigênio foi interrompida.

Figura 22B mostra um diagrama que ilustra produção durante fermentações reali-

zadas com microrganismos recombinantes de acordo com modalidades aqui descritas (GEV01083, pGV1190, pGV1113) em diferentes transições de condições de cultura aeróbi- cas para anaeróbicas. Fermentador 1 (FI) teve uma transição de 2 horas, fermentador 2 (F2) teve uma transição de 6 horas, fermentador 3 (F3) teve uma transição de 12 horas e no fer- 15 mentador 4 a transição foi feita no tempo que as células levam para consumir o oxigênio deixado no fermentador depois que a fonte de oxigênio foi interrompida.

Figura 23A mostra um diagrama que ilustra consumo de glicose por microrganismo recombinante de acordo com modalidades da presente descrição, (retângulos: GEVO 1034, pGV1248; triângulos: GEV01034, pGVI 111). Experimentos foram conduzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 23B mostra um diagrama que ilustra formato produção por microrganismo recombinante de acordo com modalidades da presente descrição, (retângulos: GEVOI 034, pGV1248; triângulos: GEVO 1034, pGVI 111). Experimentos foram conduzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 23C mostra um diagrama que ilustra produção de etanol por microrganismo

recombinante de acordo com modalidades da presente descrição, (retângulos: GEVOI 034, pGV1248; triângulos: GEV01034, pGVI 111). Experimentos foram conduzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 23D mostra um diagrama que ilustra produção de acetato por microrganismo recombinante de acordo com modalidades da presente descrição, (retângulos: GEVOI 034, pGV1248; triângulos: GEV01034, pGVI 111). Experimentos foram conduzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 24A mostra um diagrama que ilustra produção de Iactato por microrganismo recombinante de acordo com modalidades da presente descrição, (retângulos: GEVOI 034, pGV1248; triângulos: GEV01034, pGVI 111). Experimentos foram conduzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 24B mostra um diagrama que ilustra produção de succinato por microrga- Õ nismo recombinante de acordo com modalidades da presente descrição, (retângulos: GEV01034, pGV1248; triângulos: GEV01034, pGVI 111). Experimentosforam conduzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 25A mostra um diagrama que ilustra produção de etanol por microrganismo recombinante de acordo com modalidades da presente descrição, (retângulos: GEV0992, GV1278; triângulos: GEV0992, pGV1279; círculos: GEV0992, GV772). Experimentos foram conduzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 25B mostra um diagrama que ilustra produção de acetato por microrganismo recombinante de acordo com modalidades da presente descrição, (retângulos: GEV0992, pGV1278; triângulos: GEV0992, pGV1279; círculos: GEV0992, pGV772). Experimentos foram conduzidos usando duas replicatas biológicas.

Figura 26 mostra um diagrama que ilustra metabolismo de glicerol em E coli tipo selvagem e uma E coli GEV0926 que expressa um DHA quinase de plasmídeo pGV1563.

Figura 27 mostra um caminho químicoo para produzir misturas de n-butanol e buti- rato em microrganismos. O caminho que produz n-butanol apresentado é equilibrado com relação à produção e consumo de NADH, no quatro (4) NADH são produzidos e consumidos por glicose metabolizada.

Descrição Detalhada

Microrganismos recombinantes são descritos que são modificados por engenharia para converter uma fonte de carbono em n-butanol em alto rendimento. Em particular, mi- crorganismos recombinantes são descritos que são capazes de metabolizar uma fonte de carbono para produzir n-butanol em um rendimento de pelo menos 5 % porcento do valor teórico.

Da forma aqui usada, o termo “microrganismo” inclui espécies microbianas proca- 25 rióticas e eucarióticas do Domains Archaea, Bactéria e Eukaryote, o último incluindo levedu- ra e fungos filamentosos, protozoários, algas ou protista superior. Os termos “célula,” “célu- las microbianas,” e “micróbios” são usados indiferentemente com o termo microrganismo, em uma modalidade preferida, o microrganismo é E coli ou levedura (tais como S. pombe ou S. cerevisiae).

“Bactéria”, ou “Eubactéria”, refere-se a um domínio de organismos procarióticos.

Bactérias incluem pelo menos 11 grupos distintos como se segue: (1) Báctérias gram- positivas (Gram<+>), das quais existem duas divisões principais: (a) grupo G+C superior (Actinomicetos, Micobactéria, Micrococos, outros) (b) grupo G+C inferior {Bacilos, Clostró- dio, Lactobacilos, Estafilococos, Estreptococos, Micoplasmas); (2) Proteobactéria, por e- 35 xemplo, bactérias gram-negativas fotossintéticas e não fotossintéticas púrpuas (inclui a mai- oria das bactérias gram-negativas comuns): (3) Cianobactéria, por exemplo, fototrófos oxi- genóicos; (4) Spirochetes e espécies relacionadas; (5) Planctomicetos; (6) Bacteróides, Fla- vobactéria; (7) Clamídia; (8) Bactéria de enxofre verde; (9) BActéria não enxofre verde (tam- bém fototrófos anaeróbicos); (10) Micrococos radioresistentes e relativos; (11) Thermotoga e Thermosipho thermophiles.

“Bactérias gram negativas” incluem cocos, bastões não entéricos e bastões entéri- 5 cos. O gênero de bactérias gram-negativas inclui, por exemplo, Neisseria, Spirilium, Pasteu- rella, Brucella, Yersinia, Francisella, Haemophilus, Bordetella, Escherichia, Salmonella, Shi- gella, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Bacteroides, Acetobacter, Aerobacter, Agrobacte- rium, Azotobacter, Myxococcus, Spirilla, Serratia, Vibrio, Rhizobium, Chlamydia, Rickettsia, Treponema e Fusobacterium.

“Bactérias gram-positivas” incluem cocos, bastões não esporulados e bastões espo-

rulados. O gênero das bactérias gram-positivas inclui, por exemplo, Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Erysipelothrix, Lactobacillus, Listeria, Mycobacterium, Noear- dia, Staphyiocoeeus, Streptoeoeeus e Streptomyees.

O termo “fonte de carbono” no geral refere-se a um substrato ou composto adequa- do para ser usado como uma fonte de carbono para o crescimento de células procarióticas ou eucarióticas simples. Fontes de carbono podem ser de várias formas, incluindo, mas sem limitações, polímeros, carboidratos, ácidos, álcoois, aldeídos, cetonas, aminoácidos, peptí- deos, etc. Estes incluem, por exemplo, vários monossacarídeos, tais como glicose, oligos- sacarídeos, polissacarídeos, material celulósico, ácidos graxos saturados ou insaturados, succinato, lactato, acetato, etanol, etc., ou misturas destes. A fonte de carbono pode adicio- nalmente ser um produto de fotossíntese, incluindo, mas sem limitações, glicose. O termo “fonte de carbono” pode ser usado indiferentemente com o termo “fonte de energia,” uma vez que no metabolismo quimioorganotrópico a fonte de carbono é usada tanto como um doador de elétron durante o catabolismo, bem como uma fonte de carbono durante o cres- cimento celular.

Fontes de carbono que servem como materiais de partida adequados para a produ- ção de produtos de n-butanol incluem, mas sem limitações, hidrolisados de biomassa, glico- se, amido, celulose, hemicelulose, xilose, lignin, dextrose, frutose, galactose, milho, farinha de milho liqüefeita, licor inclinado de milho (um subproduto do processo de moagem do mi- 30 Iho úmido que contém nutrientes Iixiviados do milho durante o encharque), melaço, Iignoce- lulose, e maltose. Organismos fotossintéticos podem adicionalmente produzir uma fonte de carbono como um produto de fotossíntese. Em uma modalidade preferida, fontes de carbo- no podem ser selecionadas de hidrolisados de biomassa e glicose. Glicose, dextrose e ami- do podem ser de uma fonte endógena ou exógena.

Deve-se observar que outras fontes de carbono mais acessíveis e/ou baratas po-

dem ser substituídas por glicose com modificações relativamente menores para os micror- ganismos hospedeiros. Por exemplo, em certas modalidades, o uso de outros substratos renováveis e economicamente praticáveis podem ser preferidos. Estes incluem: resíduo a- grícola, materiais de empacotamento a base de amido, hidrolisado de fibra de milho, melaço de soja, resíduo da indústria de processamento de fruta e permeato de soro, etc.

Cinco açúcares de carbono somente são usados como fontes de carbono com ce- pas de microrganismo que são capazes de processar estes açúcares, por exemplo, E. coli

B. Em algumas modalidades, glicerol, um carboidrato de três carbonos, pode ser usado co- mo uma fonte de carbono para as biotransformações. Em outras modalidades, glicerina, ou glicerol impuro obtido pela hidrólise de triglicerídeos de gorduras e óleos de planta e animal, podem ser usados como uma fonte de carbono, desde que quaisquer impurezas não afetem adversamente os microrganismos hospedeiros.

Da forma aqui usada, o termo “rendimento” refere-se ao rendimento molar. Por e- xemplo, o rendimento iguala 100 % quando um mol de glicose é convertida a um mol de n- butanol. Em particular, o termo “rendimento” é definido como o mol de produto obtido por mol de monômero de fonte de carbono e pode ser expresso como porcentagem. A menos 15 que de outra forma observado, rendimento é expresso como uma porcentagem do rendi- mento teórico. “Rendimento teórico” é definido como o mol máximo de produto que pode ser gerado por um dado mol de substrato, da forma indicada pela estequiometria do caminho metabólico usado para preparar o produto. Por exemplo, o rendimento teórico para uma conversão típica de glicose a n-butanol é 100 %. Como tal, um rendimento de n-butanol a 20 partir de glicose de 95 % seria expresso como 95 % do teórico ou 95 % de rendimento teóri- co. Por exemplo, o rendimento teórico para uma conversão típica de glicerol a n-butanol é 50 %. Como tal, um rendimento de n-butanol a partir de glicerol de 45 % seria expressa co- mo 90 % do teórico ou 90 % de rendimento teórico.

Os microrganismos aqui descritos são modificados por engenharia usando técnicas de engenharia para fornecer microrganismos que utilizam enzimas expressas heterologa- mente para produzir n-butanol em alto rendimento e, em particular, um rendimento de pelo menos 5 % do teórico.

O termo “enzima” da forma aqui usada refere-se a qualquer substância que catalisa ou promove uma ou mais reações químicas ou bioquímicas, que normalmente inclui enzi- mas total ou parcialmente compostas de um polipeptídeo, mas pode incluir enzimas com- postas de uma molécula diferentes incluindo polinucleotídeos.

O termo “polinucleotídeo” é aqui usado indiferentemente com o termo “ácido nucléi- co” e refere-se a um polímero orgânico composto de dois ou mais monômeros incluindo nu- cleotídeos, nucleosídeos ou análogos destes, incluindo, mas sem limitações, ácido desoxir- 35 ribonucléico (DNA) de fita simples ou fita dupla, sentido ou antisentido de qualquer compri- mento e, onde apropriado, ácido ribonucléico (RNA) de fita simples ou fita dupla, sentido ou antisentido de qualquer comprimento, incluindo RNAsi. O termo “nucleotídeo” refere-se a qualquer um de vários compostos que consistem em um açúcar de ribose ou desoxirribose unido a uma base de purina ou uma pirimidina e a um grupo fosfato, e que são as unidades estruturais básicas de ácidos nucléicos. O termo “nucleosídeo” refere-se a um composto (como guanosina ou adenosina) que consiste em uma base de purina ou pirimidina combi- 5 nada com desoxirribose ou ribose e é encontrado especialmente em ácidos nucléicos. O termo “análogo de nucleotídeo” ou “análogo de nucleosídeo” referem-se, respectivamente, a um nucleotídeo ou nucleosídeo em que um ou mais átomos individuais foram substituídos por um átomo diferente ou por um grupo funcional diferente. Desta maneira, o termo polinu- cleotídeo inclui ácidos nucléicos de qualquer comprimento, DNA, RNA, análogos e fragmen- 10 tos destes. Um polinucleotídeo de três ou mais nucleotídeos também é denominado oligô- mero nucleotídico ou oligonucleotídeo.

O termo “proteína” ou “polipeptídeo” da forma aqui usada indica um polímero orgâ- nico composto de dois ou mais monômeros amino acídicos e/ou análogos destes. Da forma aqui usada, o termo “aminoácido” ou “monômero aminoacídico” refere-se a qualquer amino- 15 ácido natural e/ou sintético incluindo glicina e isômeros óticos tanto D quanto L. O termo “análogo de aminoácido” refere-se a um aminoácido em que um ou mais átomos individuais foram substituídos, tanto por um átomo diferente quanto por um grupo funcional diferente. Desta maneira, o termo polipeptídeo inclui polímero aminoacidóico de qualquer comprimento incluindo proteínas de cadeia completa e peptídeos, bem como análogos e fragmentos des- 20 tes. Um polipeptídeo de três ou mais aminoácidos também é denominado um oligômero ou oligopeptídeo de proteína.

O termo “heterólogo” ou “exógeno” da forma aqui usada com referência às molécu- las e, em particular, enzimas e polinucleotídeos, indica moléculas que são expressas em um organismo a não ser o organismo do qual eles originaram ou são encontrados na natureza, independentemente no nível de expressão que pode ser inferior, igual ou superior ao nível de expressão da molécula no microrganismo nativo.

Por outro lado, o termo “nativo” ou “endógeno” da forma aqui usada com referência às moléculas, e em particular enzimas e polinucleotídeos, indica moléculas que são expres- sas no organismo em que eles originaram ou são encontrados na natureza, independente- mente do nível de expressão que pode ser inferior, igual ou superior ao nível de expressão da molécula no microrganismo nativo.

Em certas modalidades, o microrganismo nativo, não modificado por engenharia é incapaz de converter uma fonte de carbono a n-butanol ou um ou mais dos intermediários metabólicos destes, em virtude, por exemplo, de tal hospedeiro tipo selvagem não ter uma ou mais das enzimas requeridas no caminho que produz n-butanol.

Em certas modalidades, o nativo, não modificado por engenharia é capaz de so- mente converter pequenas quantidades de uma fonte de carbono a n-butanol, em um ren- dimento de menor que 0,1 % do teórico.

Por exemplo, microrganismos, tais como E. coli ou Saccharomyces sp. Geralmente não têm um caminho metabólico para converter açúcares, tal como glicose em n-butanol, mas é possível transferir um caminho que produz n-butanol a partir de uma cepa que produz 5 n-butanol, {por exemplo, Clostridium) em um hospedeiro heterólogo bacteriano ou eucarióti- co, tais como E. coli ou Saccharomyces sp., e uso do microrganismo recombinante resultan- te para produzir n-butanol.

Microrganismos, no geral, são adequados como hospedeiros se eles possuem pro- priedades inerentes, tal como resistência ao solvente que permitirá que eles metabolizem uma fonte de carbono em ambientes contendo solvente.

Os termos “hospedeiro”, “células hospedeiras” e “células hospedeiras recombinan- tes” são usados indiferentemente aqui e referem-se não somente à célula do sujeito em questão, mas à progênie ou progênie potencial de uma célula como esta. Em virtude de cer- tas modificações poderem ocorrer em gerações sucessivas devido tanto a mutação quanto a 15 influências ambientais, tal progênie não pode, de fato, ser idêntica à célula pai, mas ainda estão incluídas no escopo do termo da forma aqui usada.

Hospedeiros úteis para produzir n-butanol podem ser microrganismos tanto eucarió- ticos quanto procarióticos. Embora E coli seja um dos hospedeiros preferidos, outros hos- pedeiros incluem cepas de levedura, tais como cepas de Saccharomyces, que podem ser tolerantes a níveis de n-butanol que são tóxicos a E coli.

Em certas modalidades, outros microrganismos hospedeiros eucarióticos adequa- dos incluem, mas sem limitações, espécies de Pichia, Hangeul, Yarrowia, Aspergillus, Kluy- veromyces, Pachysolen, Rhodotorula, Zygosaccharomyces, Galactomyces, Schizosaccha- romyces, Penicillhim, Torulaspora, Debaryomyces, Williopsis, Dekkera, Kloeckera, Metsch- nikowia e Candida.

Em uma outra modalidade preferida, os hospedeiros são hospedeiros bacterianos. Em uma modalidade mais preferida os hospedeiros incluem Arthrobacter, Bacillus, Brevibac- terium, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Gluconobacter, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus, Streptomyces, Xanthomonas. Em uma modalidade mais preferida, tais hos- 30 pedeiros são E coli ou Pseudomonas. Em uma modalidade ainda preferida, tais hospedei- ros são E coli (tais como E coli W3110 ou E coli B), Pseudomonas oleovorans, Pseudo- monas fluorescens, ou Pseudomonas putida.

Em certas modalidades, o microrganismo recombinante aqui descrito é resistente a certos níveis de n-butanol no meio de crescimento, de maneira tal que ele seja capaz de crescer em um meio com pelo menos cerca de 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1 %, 1,2 %, 1,5 %, 1,8 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 % ou mais de n- butanol, em uma taxa substancialmente a mesma que a do crescimento do microrganismo no meio sem n-butanol. Da forma aqui usada, “substancialmente a mesma” refere-se a pelo menos cerca de 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, ou 120 % da taxa de crescimento tipo selva- gem.

Em particular, os microrganismos recombinantes aqui descritos são modificados por engenharia para ativar, e em particular expressar, enzimas heterólogas que podem ser usa- das na produção de n-butanol. Em particular, em certas modalidades, os microrganismos recombinantes são modificados por engenharia para ativar enzima heterólogas que catali- sam a conversão de acetil-CoA a n-butanol.

Os termos “ativar” ou “ativação” da forma aqui usada com referência a uma molécu- Ia biologicamente ativa, tal como uma enzima, indica qualquer modificação no genoma e/ou proteoma de um microrganismo que aumenta a atividade biológica da molécula biologica- mente ativa no microrganismo. Ativações exemplares incluem, mas sem limitações, modifi- cações que resultam na conversão da molécula de uma forma biologicamente inativa a uma forma biologicamente ativa e de uma forma biologicamente ativa para uma forma biologica- mente mais ativa, e modificações que resultam na expressão da molécula biologicamente ativa em um microrganismo em que a molécula biologicamente ativa foi previamente não expressa. Por exemplo, ativação de uma molécula biologicamente ativa pode ser realizada expressando um polinucleotídeo nativo ou heterólogo que codifica a molécula biologicamen- te ativa no microrganismo, expressando um polinucleotídeo nativo ou heterólogo que codifi- ca uma enzima envolvida no caminho para a síntese da molécula biologicamente ativa no microrganismo, expressando uma molécula nativa ou heteróloga que melhora a expressão da molécula biologicamente ativa no microrganismo.

Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante pode expressar um ou mais genes heterólogos que codificam enzimas que conferem a capacidade para produzir n- butanol. Por exemplo, o microrganismo recombinante aqui descrito pode expressar genes heterólogos que codificam um ou mais de: um piruvato desidrogenase anaerobicamente ativo (Pdh), formato desidrogenase dependente de NADH (Fdli), acetil-CoA-acetiltransferase (tiolase), hidroxibutiril-CoA desidrogenase, crotonase, butiril-CoA desidrogenase, butiraldeí- do desidrogenase, n-butanol desidrogenase, butiraldeído bifuncional / n-butanol desidroge- nase. Tais seqüências de DNA heterólogas são preferivelmente obtidas de um microrganis- mo heterólogo (tais como Clostridium acetobutylicum ou Clostridium beijerinckii), e podem ser introduzidas em um hospedeiro apropriado usando técnicas de biologia molecular con- vencionais. Estas seqüências de DNA heterólogas possibilitam que o microrganismo recom- binante produza n-butanol, pelo menos produza n-butanol ou o intermediário(s) metabólico deste em uma quantidade maior que a produzida pelo microrganismo cópia tipo selvagem.

Em certas modalidades, o microrganismo recombinante aqui descrito expressa uma tiolase heterolóloga ou acetil-CoA-acetiltransferase, tal como um codificado por um gene thl de um Clostridium.

Tiolase (E.C. 2.3.1.19) ou acetil-CoA acetiltransferase, é uma enzima que catalisa a condensação de um grupo acetil em uma molécula de acetil-CoA. A enzima é, em C. aceto- butylicum, codificada pelo gene thl (acesso ao GenBank U08465, proteína ID AAA82724.1), 5 que foi sobre-expresso, entre outras enzimas, em E. coli no seu promotor nativo para a pro- dução de acetona (Bermejo et ah, Appl. Environ. Mirobiol. 64: 1079-1085, 1998). Enzimas homólogas também foram identificadas e podem facilmente ser identificadas por um versado na tecnologia realizando uma pesquisa BLAST contra a seqüência de proteína anterior. Es- tes homólogos também podem servir como tiolases adequadas em um caminho de n- 10 butanol heterologamente expresso. Apensa para nomear algumas, estas enzimas homólo- gas incluem, mas sem limitações as de C. acetobutylicum sp. (por exemplo, proteína TD AAC26026.1), C. pasteurianum (por exemplo, proteína ID ABA18857.1), C. beijerinckii sp. (por exemplo, proteína ID EAP59904.1 ou EAP59331.1), Clostridium perfringens sp. (por exemplo, proteína ID ABG86544.1, ABG83108.1), Clostridium difficile sp. (por exemplo, pro- 15 teína ID CAJ67900.1 ou ZP_01231975.1), Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (por exemplo, proteína ID CAB07500.1), Thermoanaerobacter tengcongensis (por exemplo, AAM23825.1), Carboxydothermus hydrogenoformans (por exemplo, proteína ID ABB 13995.1), Desulfotomaculum reducens Ml-I (por exemplo, proteína ID EAR45123.1), Candi- da tropicalis (por exemplo, proteína ID BAA02716.1 ou BAA02715.1), Saccharomyces cere- 20 visiae (por exemplo, proteína ID AAA62378.1 ou CAA30788.1), Bacillus sp., Megasphaera elsdenii, ou Butryivibrio fibrisolvens, etc. Além do maos, a tiolase de E. coli endógena tam- bém poderia ser ativa em um caminho de n-butanol heterologamente expresso. E. coli sinte- tiza duas tiolases de 3-ketoacil-CoA distintas. Um é um produto do gene fadA, o segundo é o produto do gene atoB.

Homólogos que compartilham pelo menos cerca de 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %

ou 80 % de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 65 %, 70 %, 80 % ou 90 % de homologia de seqüência, da forma calculada por NCBFs BLAST, são homólogos de tiolase adequados que podem ser usados nos microrganismos recombinantes aqui descritos. Tais homólogos incluem (sem limitação): Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 (ZP_00909576.1 30 ou ZP_00909989.1), Clostridium acetobutylicum ATCC 824 (NP_149242.1), Clostridium te- tani E88 (NP_781017.1), Clostridium perfringens str. 13 (NP_563111.1), Clostridium perfrin- gens SMIOI (YP_699470.1), Clostridium pasteurianum (ABA18857.1), Thermoanaerobacte- rium thermosaccharolyticum (CAB04793.1), Clostridium difficile QCD-32g58 (ZP_01231975.1), Clostridium difficile 630 (CAJ67900.1), etc.

Em certas modalidades, o microrganismo recombinante aqui descrito expressa uma

3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase heteróloga, tal como uma codificada por um gene hbd de um Clostridium. A 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (BHBD) é uma enzima que catalisa a conver- são de acetoacetil-CoA a 3-hidroxibutiril-CoA. Diferentes variantes desta enzima existem que produzem tanto o isômero (S) quanto o (R) de 3-hidroxibutiril-CoA. E. coli que abriga um vetor de transporte de E. coli-C. acetobutylicum contendo o gene ATCC 824 de C. acetobut- 5 ylicum para BHBD (hbd), entre outros, mostrou funcionalmente sobre-expressar esta enzi- ma. Muitas enzimas homólogas também foram identificadas. Enzimas homólogas adicionais podem ser identificadas por um versado na tecnologia, por exemplo, realizando uma pesqui- sa BLAST contra o C. acetobutylicum BHBD mencionado anteriormente. Todas estas enzi- mas homólogas podem servir como um BHBD em um caminho de n-butanol heterologamen- 10 te expresso. Estas enzimas homólogas incluem, mas sem limitações, o seguinte: Clostridium kluyveri expressa duas formas distintas desta enzima (Miller et al, J. Bacteriol. 138: 99-104, 1979). Butyrivibrio fibrisolvens contém um gene bhbd que é organizzdo no mesmo Iocus do resto de seu caminho de butirato (Asanuma et al, Current Microbiology 51: 91-94, 2005; A- sanuma et al, Current Microbiology Al: 203-207, 2003). Um gene que codifica uma acil-CoA 15 desidrogenase de cadeia curta (SCAD) foi clonado de Megasphaera elsdenii e expresso em E. coli. A atividade in vitro pode ser determinada (Becker et al, Biochemistry 32: 10736- 10742, 1993). Outros homólogos foram identificados em E. coli (fadB) onde ele é parte do caminho de oxidação de ácido graxo (Pawar et al, J. Biol. Chem. 256: 3894-3899, 1981), e outras cepas de Clostridium, tal como C. kluyveri (Hillmer et al, FEBS Lett. 21: 351-354, 20 1972; Madan et al, Eur. J. Biochem. 32: 51-56, 1973), C. beijerinckii, C. thermosaccharolyti- cum, C. tetani.

Em certas modalidades, em que um BHBD é expresso pode ser benéfico selecionar uma enzima do mesmo organismo que, à montante da tiolase ou à jusante da crotonase, origina dele. Isto pode evitar o rompimento das interações proteína-proteína potenciais entre proteínas adjacentes no caminho quando as enzimas de diferentes organismos forem ex- pressas.

Em certas modalidades, o microrganismo recombinante aqui descrito expressa uma crotonase heteróloga, tal como uma codificada por um gene crt de um Clostridium.

As crotonases ou EnoiI-CoA hidratases são enzimas que catalisam a hidratação re- 30 versível dos substratos cis e trans enoil-CoA aos derivados de β-hidroxiacil CoA correspon- dentes. Em C. acetobutylicum, esta etapa do metabolismo de butanoato é catalisada por EC 4.2.1.55, codificado pelo gene crt (Acesso à proteína do GenBank AAA95967, Kanehisa, Novartis Found Symp. 247: 91-101, 2002; discussão 01-3, 19-28, 244-52). A crotonase (Crt) de C. acetobutylicum foi purificada para homogeneidade e CARACTERIZADA (Waterson et 35 al, J. Biol. Chem. 247: 5266-5271, 1972). Ela se comporta como uma proteína homogênea nos estados tanto nativo quanto desnaturado. A enzima parece funcionar, como um tetrâme- ro com um peso molecular de subunidade de 28,2 kDa e 261 resíduos (Waterson et al. re- porta uma massa molecular de 40 kDa e um comprimento de 370 resíduos). A enzima purifi- cada perdeu atividade quando armazenada em soluções tampão a 4DC ou quando conge- lada (Waterson et al, J. Biol Chem. 247: 5266-5271, 1972). O pH ideal para a enzima é pH 8,4 (Schomburg et al, Mucleic Acids Res. 32: D431-433, 2004). Diferente das crotonases de 5 mamífero que têm uma ampla especificidade do substrato, a enzima bacteriana hidrata so- mente crotonil- CoA e hexenoil-CoA. Valores de Vmax e Km de 6,5 x 106 moles por minuto por mol e 3 x 10'5 M foram obtidos para crotonil-CoA. A enzima é inibida em concentrações de crotonil-CoA maiores que 7 x 105 M (Waterson et al, J. Biol. Chem. 247: 5252-5257, 1972; Waterson et al, J. Biol. Chem. 247: 5258-5265, 1972).

As estruturas de muitas famílias de crotonase de enzimas foram dissolvidas (Engel

et al, J. Mol. Biol. 275: 847-859, 1998). O gene crt é altamente expresso em E. coli e apre- senta uma maior atividade específica que a vista em C. acetobutylicum (187,5 U/mg sobre 128,6 U/mg) (Boynton et al, J. Bacteriol. 178: 3015-3024, 1996). Inúmeros homólogos dife- rentes de crotonase são codificados em eucariotas e procariotas que funcionam como parte 15 do metabolismo de butanoato, síntese de ácido graxo, β-oxidação e outros caminhos rela- cionados (Kanehisa, Novartis Found Symp. 247: 91-101, 2002; discussão 01-3, 19-28, 244- 52; Schomburg et al, Nucleic Acids Res. 32: D431-433, 2003). Inúmeras destas enzimas foram estudadas. EnoiI-CoA hidratase de fígado bovino é extremamente bem estudada e completamente caracterizada (Waterson et al, J. Biol Chem. 247: 5252-5257, 1972). Um 20 alinhamento CIustaIW dos 20 ortólogos mais próximos de crotonase de bactéria é gerado. Os homólogos variam na identidade de seqüência de 40-85 %. A seqüência de proteína de Crt e seqüência de DNA do crt de C. acetobutylicum é disponível (ver a seguir todas as se- qüências aqui incorporadas pela referência). A seqüência de proteína de4 crotonase (Crt) (acesso ao GenBank # AAA95967) é dada na SEQ ID NO:2.

Homólogos que compartilham pelo menos cerca de 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %

ou 70 % de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 55 %, 65 %, 75 % ou 85 % de homologia de seqüência, da forma calculada por NCBI's BLAST, são homólogos Crt ade- quados que podem ser usados nos microrganismos recombinantes aqui descritos. Tais ho- mólogos incluem (sem limitação): Clostridium tetani E88 (NP_782956.1), Clostridium perfrin- 30 gens SMIOI (YP_699562.1), Clostridium perfringens str. 13 (NP_563217.1), Clostridium bei- jerinckii NCIMB 8052 (ZP_00909698.1 ou ZP_00910124.1), Syntrophomonas wolfei subsp. wolfei str. Goettingen (YP_754604.1), Desulfotomaculum reducens Ml-I (ZP_01147473.1 ou ZP_01149651.1), Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (CAB07495.1), Carboxy- dothermus hydrogenoformans Z-2901 (YP_360429.1), etc.

Estudos em Clostridia demonstram que o gene crt que codifica a crotonase é codifi-

cado como parte do maior operon BCS. Entretanto, estudos em B. fibriosolvens, uma bacté- ria que produz butirato a partir do rúmem, mostra uma disposição ligeiramente diferente. Embora B. fibriosolvens tipo I tenha os genes thl, crt, hbd, bed, etfA e etjB agrupados e dis- postos como parte de um operon, cepas tipo Il têm um agrupamento similar, mas que não tem o gene crt (Asanuma et al, Curr. Microbiol 51 : 91-94, 2005; Asanuma et al, Curr. Micro- biol. 47: 203-207, 2003). Uma vez que a proteína é bem expressa em E. coli e completa- 5 mente caracterizada, a enzima C. acetobutylicum é a enzima preferida para o caminho de n- butanol heterologamente expresso. Outros alvos possíveis são genes homólogos de Fuso- bacterium nucleatum subsp. Vincentii (Q7P3U9-Q7P3U9_FUSNV), Clostridium difficile (P45361-CRT_CLODI), Clostridium pasteurianum (P81357- CRT_CLOPA), e Brucella meli- tensis (Q8YDG2-Q8YDG2_BRUME).

Em certas modalidades, o microrganismo recombinante aqui descrito expressa uma

butiril-CoA desidrogenase heteróloga e, se necessário, as proteínas de transferência de elé- tron correspondentes, tal como codificada pelos genes bed, etfA, e etJB de um Clostridium.

A butiril-CoA desidrogenase (Bed) de C. acetobutylicum é uma enzima que catalisa a redução da ligação dupla carbono-carbono em crotonil-CoA para render butiril-CoA. Esta redução é acoplada à oxidação de NADH. Entretanto, a enzima requer duas proteínas de transferência de elétron etfA e etfB (Bennett et al, Ferns Microbiology Reviews 17: 241-249, 1995).

Os genes ATCC 824 de Clostridium acetobutylicum que codificam as enzimas beta- hidroxibutiril-coenzima A (CoA) desidrogenase, crotonase e butiril-CoA desidrogenase são agrupados no operon BCS, cujo o número de acesso ao GenBank é U17110.

A seqüência de proteína de butiril-CoA desidrogenase (Bed) (Acesso ao Genbank # AAA95968.1) é dada em SEQ ID NO:3.

Homólogos que compartilham pelo menos cerca de 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % ou 80 % de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 70 %, 80 %, 85 % ou 90 % de 25 homologia de seqüência, da forma calculada por NCBFs BLAST, são homólogos Bed ade- quados que podem ser usados nos microrganismos recombinantes aqui descritos. Tais ho- mólogos incluem (sem limitação): Clostridium tetani E88 (NP_782955.1 ou NP_781376.1), Clostridium perfringens str. 13 (NP_563216.1), Clostridium beijerinckii (AF494018_2), Clos- tridium beijerinckii NCMB 8052 (ZP_00910125.1 ou ZP_00909697.1), Thermoanaerobacteri- 30 um thermosaccharolyticum (CAB07496.1), Thermoanaerobacter tengcongensis MB4 (NP_622217.1), etc.

A subunidade α da seqüência de proteína da flavoproteína de transferência de elé- tron (EtfA) (Acesso ao Genbank # AAA95970.1) é dada em SEQ ID N0.4):

A subunidade β da seqüência de proteína da flavoproteína de transderêncai de elé- tron (EtfB) (Acesso ao Genbank # AAA95969.1) é dada em SEQ ID NO:5.

A seqüência de proteína de 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (Hbd) (Acesso ao Genbank # AAA95971.1) é dada em SEQ ID NO:6. Homólogos que compartilham pelo menos cerca de 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 % ou 70 % de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 60 %, 70 %, 80 % ou 90 % de homologia de seqüência, da forma calculada por NCBI' s BLAST, são homólogos Hbd ade- quados que podem ser usados no microrganismo recombinante aqui descrito. Tais homólo- 5 gos incluem (sem limitação): Clostridium acetobutylicum ATCC 824 (NP_349314.1), Clostri- dium tetani E88 (NP_782952.1), Clostridium perfringens SMIOI (YP_699558.1), Clostridium perfringens str. 13 (NP_563213.1), Clostridium saccharobutylicum (AAA23208.1), Clostridi- um beijerinckii NCIMB 8052 (ZP_00910128.1), Clostridium beijerinckii (AF494Q18_5), Ther- moanaerobacter tengcongensis MB4 (NP_622220.1), Thermoanaerobacterium thermosac- 10 charolyticum (CAB04792.1), Alkaliphilus metalliredigenes QYMF (ZP_00802337.1), etc.

O Km de Bed para butiril-CoA é 5. O bed de C. acetobutylicum e os genes que codi- ficam os respectivos ETFs foram clonados em um vetor de transfer6encia de E. coli - C. ace- tobutylicum. Maior atividade Bed foi detectada em C. acetobutylicum ATCC 824 transforma- do com este plasmídeo (Boynton et al, Journal of Bacteriology 178: 3015-3024, 1996). O Km 15 do P262 Bed de C. acetobutylicum para butiril-CoA é aproximadamente 6 μΜ (DiezGonzaIez et al, Current Microbiology 34: 162-166, 1997). Homólogos de Bed e os ETFs relacionados foram identificados nos Megasphaera elsdenii anaeróbios que produzem butirato (William- son et al, Biochemical Journal 218: 521-529, 1984), Peptostreptococcus elsdenii (Engel et al, Biochemical Journal 125: 879, 1971), Syntrophospora bryanti (Dong et al, Antonie Van Le- 20 euwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 67: 345-350, 1995), e Treponema phagedemes (George et al, Journal of Bacteriology 152: 1049-1059, 1982). A estrutura do Bed de M. elsdenii foi dissolvida (Djordjevic et al, Biochemistry 34: 2163-2171, 1995). Uma pesquisa BLAST de ATCC 824 Bed de C. acetobutylicum identificou uma vasta quantidade de seqüências homólogas de uma ampla variedade de espécies, alguns dos 25 homólogos são listados aqui anteriormente. Qualquer um dos genes que codificam estes homólogos pode ser usado para a invenção em questão. Observa-se que o assunto de ex- pressão e/ou transferência de elétron podem surgir na expressão heterologamente destes genes em um microrganismo (tal como E. coli), mas não em um outro. Além do mais, uma enzima homóloga pode ter questões de expressão e/ou transferência de elétron em um da- 30 do microrganismo, mas outras enzimas homólogas podem não ter. A disponibilidade de ge- nes diferentes, amplamente equivalentes fornece escolhas mais projetadas na engenharia genética do microrganismo recombinante.

Um bed promissor que já foi clonado e expresso em E. coli é de Megasphaera els- denii, e a atividade in vitro da enzima expressa pode ser determinada (Becker et ah, Bio- chemistry 32: 10736-10742, 1993). O1NeiII et al. reportou a clonagem e expressão heterólo- ga em E. coli dos genes etfA e eftB e caracterização funcional das proteínas codificadas de Megasphaera elsdenii (0'Neill et ah, J. Biol. Chem. 273: 21015- 21024, 1998). A atividade foi medida com o ensaio ETF que acopla a oxidação de NADH para a redução de crotonil-CoA por meio de Bed. A atividade de ETF recombinante no ensaio ETF com Bed é similar à da enzima nativa, da forma reportada por Whitfield e Mayhew. Desta forma, a utilização do Bed de Megasphaera elsdenii e suas proteínas ETF fornece uma solução para sintetizar butiril- 5 CoA. O Km do Bed de M. elsdenii foi medido como 5 μΜ quando expresso recombinante- mente, e 14 μΜ quando expresso no hospedeiro nativo (DuPIessis et ah, Biochemistry 37: 10469-77, 1998). Bed de M. elsdenii parece ser inibido pelo acetoacetato em concentrações extremamente baixas (K1 de 0,1 μΜ) (Vanberkel et ah, Eur. J. Biochem. 178: 197-207, 1988). Um agrupamento de gene contendo thl, crt, hbd; bed, etfA, e etfB foi identificado em 10 duas cepas que produzem butirato de Butyrivibrio fibrisolvens. A similaridade da seqüência de aminoácidos destas proteínas é alta, comparada ao Clostridium acetobutylicum (Asanu- ma et ah, Current Microbiology 51: 91-94, 2005; Asanuma et ah, Current Microbiology 47: 203-207, 2003). Em sistemas mamíferos, uma enzima similar, envolvida na oxidação de ácido graxo de cadeia curta é encontrada na mitocôndria.

Em certas modalidades, o microrganismo recombinante aqui descrito expressa uma

“trans-2-enoil-CoA redutase” heteróloga ou “TER”.

Trans-2-enoil-CoA redutase ou TER é uma proteína que é capaz de catalisar a con- versão de crotonil-CoA a butiril-CoA. Em certas modalidades, o microrganismo recombinan- te expressa um TER que catalisa a mesma reação que Bcd/EtfA/EtfB de Clostridia e outras 20 espécies de bactéria. TER mitocondrial de E. gracilis foi descrito e muitas proteínas TER e proteínas com atividade TER derivadas de inúmeras das espécies foram identificadas for- mando uma família de proteína TER (pedido de patente U.S. 2007/0022497 to Cirpus et ah; Hoffrneister et ah, J. Biol. Chem., 280: 4329-4338, 2005, ambos os quais estão aqui incorpo- rados pela referência na sua íntegra). Um DNAc truncado do gene de E. gracilis foi funcio- 25 nalmente expresso em E coli. Este DNAc ou os genes de homólogos de outros microrga- nismos podem ser expressos juntos com os genes do caminho do n-butanol thl, crt, adhE2, e hbd para produzir n-butanol em E coli, S. cerevisiae ou outros hospedeiros.

Proteínas TER também podem ser identificadas por bioinformáicos conhecidos pe- los versados na tecnologia, tal como BLAST. Exemplos de proteínas TER incluem, mas sem limitações, TERs das seguintes espécies:

Euglena spp. incluindo mas sem limitações, E gracilis, Aeromonas spp. incluindo mas sem limitações, A. hydrophila, Psychromonas spp. incluindo mas sem limitações, P. ingrahamii, Photobacterium spp. incluindo mas sem limitações, P. profundum, Vibrio spp. incluindo mas sem limitações, Vangustum, V. cholerae, V alginolyticus, V parahaemolyticus, 35 V vulnificus, Vfischeri, V splendidus, Shewanella spp. incluindo mas sem limitações, S. ama- zonensis, S. woodyi, S. fi'igidimarina, S. paeleana, S. baltica, S. denitrificans, Oceanospiril- Ium spp., Xanihomonas spp. incluindo mas sem limitações, X oryzae, X campestris, Chro- mohalobacter spp. incluindo mas sem limitações, C. salexigens, Idiomarina spp. incluindo mas sem limitações, I. baltica, Pseudoalteromonas spp. incluindo mas sem limitações, P. atlantica, Alteromonas spp., Saccharophagus spp. incluindo mas sem limitações, S. degra- dans, S. marine gamma proteobacterium, S. alpha proteobacterium, Pseudomonas spp. in- 5 cluindo mas sem limitações, P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens, Burkholderia spp. in- cluindo mas sem limitações, B. phytofirmans, B. cenocepacia, B. cepacia, B. ambifaria, B. vietnamensis, B. multivorans, B. dolosa, MethyIBaciIIus spp. incluindo mas sem limitações, M. flageliatus, Stenotrophomonas spp. incluindo mas sem limitações, S. maltophilia, Con- gregibacter spp. incluindo mas sem limitações, C. Iitoralis, Serratia spp. incluindo mas sem 10 limitações, S. proteamaadans, Marinomonas spp., Xytella spp. incluindo mas sem limita- ções, Xfastidiosa, Reinekea spp., Colwellia spp. incluindo mas sem limitações, C. psychrery- thraea, Yersinia spp. incluindo mas sem limitações, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Meth- yloBacilIus spp. incluindo mas sem limitações, M flageliatus, Cytophaga spp. incluindo mas sem limitações, C. hutchinsonii, Flavobacterium spp. incluindo mas sem limitações, F. john- 15 soniae, Microscilla spp. incluindo mas sem limitações, M marina, Polaribaeter spp. incluindo mas sem limitações, P. irgensii, Clostridium spp. incluindo mas sem limitações, C. acetobut- ylicum, C. beijerenckii, C. cellulolyticum, Coxiella spp. incluindo mas sem limitações,

C.burnetii.

Além do anterior, os termos “trans-2-enoil-CoA redutase” ou “TER” referem-se às 20 proteínas que são capazes de catalisar a conversão de crotonil-CoA a butiril-CoA e que compartilham pelo menos cerca de 40 %,45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %,96 %,97 %,98 %,99 % ou mais de similaridade de seqüência, da forma calculada por NCBI BLAST, usando parâmetros pa- 25 drões, para qualquer um ou ambos de TER de E. gracilis truncado da forma dada na SEQ ID NO:7 ou as TER hidrófilas de comprimento total, da forma dada em SEQ ID NO: 8.

Da forma aqui usada, “identidade de seqüência” refere-se à ocorrência de exata- mente o mesmo nucleotídeo ou aminoácido na mesma posição em seqüências alinhadas. “Similaridade de seqüência” leva pareamento aproximado em consideração, e é significativa 30 somente quando as substituições são pontuadas de acordo com algumas medições de “dife- rença” ou “semelhança” com substituições conservativas ou altamente prováveis projetaram pontuações mais favoráveis que não conservativas ou as diferentes.

Uma outra vantagem de usar TER em vez de Bcd/EtfA/EtfB é são sensíveis ao oxi- gênio.

Da forma aqui usada, “homólogo de trans-2-enoil-CoA redutase (TER)” refere-se a

um polipeptídeos de enzima homóloga de outros organismos, por exemplo, que pertencem ao filo Euglena ou Aeromonas, que têm as mesmas características essenciais de TER, da forma definida anteriormente, mas compartilham menos que 40 % de identidade de seqüên- cia e 50 % de similaridade de seqüência padrões, da forma discutida anteriormente. Muta- ções englobam substituições, adições, deleções inversões ou inserções de um ou mais re- síduos de aminoácido. Isto permite a expressão da enzima durante um crescimento aeróbi- co e fase de expressão do processo de n-butanol, que pode potencialmente permitir um pro- cesso de produção de biocombustível mais eficiente.

Em certas modalidades, o microrganismo recombinante aqui descrito expressa um butiraldeído desidrogenase / n-butanol desidrogenase heterólogo, tal como codificado pelos genes bdhA /bdhB, aad, ou adhE2 de um Clostridium.

A Butiraldeído desidrogenase (BYDH) é uma enzima que catalisa a redução depen- dente de NADH de butiril-CoA a butiraldeído. Butiraldeído é ainda reduzido a n-butanol por uma n-butanol desidrogenase (BDH). Esta redução também é realizada pela oxidação de NADH. Clostridium acetobutylicum contém genes para várias enzimas que mostraram con- verter butiril-CoA a n-butanol.

Uma destas enzimas é codificada por aad (Nair et al, J. Bacteriol. 176: 871-885, 1994). Este gene é referido como adhE em cepa DSM 792 de C. acetobutylicum. A enzima é parte do operon sol e codifica um BYDH/BDH bifuncional (Fischer et al, Journal of Bacterio- Iogy 175: 6959-6969, 1993; Nair et al, J. Bacteriol 176: 871-885, 1994). A seqüência de pro- teína desta proteína (acesso ao GenBank # AAD04638.1) é dada em SEQ ID NO:9.

O produto do gene de aad foi funcionalmente expresso em E coli. Entretanto, em condições aeróbicas, a atividade resultante permaneceu muito baixa, indicando sensibilida- de ao oxigênio. Com uma atividade maior que 100 vezes para butiraldeído comparado ao acetaldeído, o papel principal de Aad é na formação de n-butanol em vez de etanol (Nair et al, Journal of Bacteriology 176: 5843-5846, 1994).

Homólogos que compartilham pelo menos cerca de 50 %, 55 %, 60 % ou 65 % de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 70 %, 75 % ou 80 % de homologia de seqüência, da forma calculada por NCBFs BLAST, são homólogos adequados que podem ser usados nos microrganismos recombinantes aqui descritos. Tais homólogos incluem (sem limitação): Clostridium tetani E88 (NP_781989.1), Clostridium perfringens str. 13 (NP_563447.1), Clostridium perfringens ATCC 13124 (YP_697219.1), Clostridium perfrin- gens SMIOI (YP_699787.1), Clostridium beijerincldi NCIMB 8052 (ZP_00910108.1), Clostri- dium acetobutylicum ATCC 824 (NP_149199.1), Clostridium difficile 630 (CAJ69859.1), Clostridium difficile QCD-32g58 (ZP_01229976.1), Clostridium thermocellum ATCC 27405 (ZP_00504828.1), etc.

Duas n-butanol desidrogenases dependentes de NADH adicionais (BDH I, BDH II) foram purificadas e seus genes (bdhA, bdhB) clonados. O acesso ao GenBank para BDH I é AAA23206.1, e a seqüência de proteína é dada em SEQ ID NO: 10. O acesso ao GenBank para BDH Il é AAA23207.1, e a seqüência de proteína é da- da em SEQ ID NO:11.

Estes genes são adjacentes no cromossomo, mas são transcritos por seus próprios promoteres (Walter et al, Gene 134: 107-111, 1993). BDH I utiliza NADPH como o cofator, enquanto que BDH Il utiliza NADH. Entretanto, nota-se que o cofator relativo de preferência é dependente do pH. A atividade de BDH I foi observada em Iisatos de E coli depois da ex- pressão de bdhA de um plasmídeo (Petersen et al, Journal of Bacteriology 173: 1831-1834, 1991). Reportou-se que BDH Il tem uma atividade 46 vezes superior com butiraldeído que com acetaldeído e é 50 vezes menos ativo na direção reversa. BDH I é somente cerca de duas vezes mais ativo com butiraldeído que com acetaldeído (Welch et al, Archives of Bio- chemistry and Biophysics 273: 309-318, 1989). Assim, em uma modalidade, BDH Il ou um homólogo de BDH Il é usado em um caminho de n-butanol heterologamente expresso. Além do mais, estas enzimas são mais ativas em um pH relativamente baixo de 5,5, cuja caracte- rística deve ser levada em consideração na escolha de um hospedeiro e/ou condições de processo adequados.

Embora os genes mencionados anteriormente sejam transcritos em condições sol- ventogênicas, um gene diferente, adhE2, é transcrito em condições alcoogenólicas (Fontai- ne et al, J. Bacteriol. 184: 821-830, 2002, acesso ao GenBank # AF321779). Estas condi- ções estão presentes em pH relativamente neutro. A enzima foi sobre-expressa em culturas 20 anaeróbicas de E coli e com atividades de BYDH e BDH dependentes de NADH altas. Em certas modalidades, esta enzima é a enzima preferida. A seqüência de proteína desta enzi- ma (acesso ao GenBank # AAK09379.1) é listada como SEQ ID NO:1.

Homólogos que compartilham pelo menos cerca de 50 %, 55 %, 60 % ou 65 % de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 70 %, 75 % ou 80 % de homologia de 25 seqüência, da forma calculada por NCBFs BLAST, são homólogos adequados que podem ser usados nos microrganismos recombinantes aqui descritos. Tais homólogos incluem (sem limitação): Clostridium perfringens SMIOI (YP_699787.1), Clostridium perfringens str. 13 (NP_563447.1), Clostridium perfringens ATCC 13124 (YP_697219.1), Clostridium tetani E88 (NP_781989.1), Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 (ZP_00910108.1), Clostridium dif- 30 ficile QCD-32g58 (ZP_01229976.1), Clostridium difficile 630 (CAJ69859.1), Clostridium ace- tobutylicum ATCC 824 (NP_149325.1), Clostridium thermocellum ATCC 27405 (ZP_00504828.1), etc.

Em certas modalidades, quaisquer enzimas homólogas que são pelo menos cerca de 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % idênticas, ou que compartilham pelo menos cerca de 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % de homologia de seqüência (similar) com qualquer um dos poli- peptídeos anteriores podem ser usadas no lugar destes polipeptídeos tipo selvagem. Estas enzimas que compartilham a identidade de seqüência ou similaridade requisito podem ser enzimas tipo selvagem de um organismo diferente, ou podem ser enzimas artificiais / re- combinantes.

Em certas modalidades, quaisquer genes que codificam enzimas com a mesma ati- vidade que qualquer uma das enzimas anteriores podem ser usados no lugar dos genes que codificam as enzimas anteriores. Estas enzimas podem ser enzimas tipo selvagem de um organismo diferente, ou podem ser enzimas idênticas, recombinantes ou modificadas por engenharia.

Adicionalmente, devido à degeneração inerente do código genético, outras seqüên- cias de ácidos nucléicos que codificam substancialmente a mesma seqüência de aminoáci- dos ou uma funcionalmente equivalente também podem ser usadas para clonar e expressar os polinucleotídeos que codificam tais enzimas. Conforme será entendido pelos versados na tecnologia, pode ser vantajoso modificar uma seqüência de codificação para melhorar sua expressão em um hospedeiro particular. Os códons que são utilizados mais frequentemente em uma espécie são denominados códons ideais, e os que não utilizam muito frequente- mente são classificados como códons raros ou de pouco uso. Códons podem ser substituí- dos para refletir o uso do códon preferido do hospedeiro, um processo algumas vezes de- nominado “otimização do códon” ou “controle para desvio de códon da espécie”. A metodo- logia para otimizar uma seqüência de nucleotídeos para a expressão em uma planta é for- necida, por exemplo, na patente U.S. No. 6.015.891, e as referências citadas nela.

Em certas modalidades, o microrganismo recombinante aqui descrito tem uma ou mais seqüências de DNA heterólogas de um Clostridia solventogênico, tais como Clostridi- um acetobutylicum ou Clostridium beijerinckii. Um Clostridium acetobutylicum exemplar é a cepa ATCC824, e um Clostridium beijerinckii exemplar é a cepa NCIMB 8052.

A expressão dos genes pode ser realizada por meios de biologia molecular conven- cional. Por exemplo, os genes heterólogos podem ser sobre o controle de um promotor indu- tível ou um promotor constitutivo. Os genes heterólogos podem tanto ser integrados em um cromossoma do microrganismo hospedeiro quanto existir como um elemento genético extra- cromossomal que pode ser estavelmente passado (“hereditário”) para as células filhas. Tais elementos genéticos extra-cromossômicos (tais como plasmídeos, BAC, YAC, etc.) podem adicionalmente conter marcadores de seleção que garantem a presença de tais elementos genéticos nas células filhas.

Em certas modalidades, o microrganismo recombinante aqui descrito também pode produzir um ou mais intermediários metabólicos do caminho que produz n-butanol, tais co- mo acetoacetil-CoA, hidroxibutiril-CoA, crotonil-CoA, butiril-CoA, ou butiraldeído, e/ou deri- vados destes, tal como butirato.

Em algumas modalidades, os microrganismos recombinantes aqui descritos modifi- cados por engenharia para ativar uma ou mais das enzimas heterólogas mencionadas ante- riormente para a produção de n-butanol, produzem n-butanol por meio de um caminho hete- rólogo.

Da forma aqui usada, o termo “caminho” refere-se a um processo biológico incluin- do uma ou mais reações químicas enzimaticamente controladas pelas quais um substrato é 5 convertido em um produto. Desta maneira, um caminho para a conversão de uma fonte de carbono a n-butanol é um processo biológico incluindo uma ou mais reações controladas enzimaticamente pelas quais a fonte de carbono é convertida em n-butanol. Um “caminho heterólogo” refere-se a um caminho em que pelo menos um de pelo menos uma ou mais reações químicas é catalisada por pelo menos uma enzima heteróloga. Por outro lado, um 10 “caminho nativo’* refere-se a um caminho em que uma ou mais reações químicas são catali- sadas por uma enzima nativa.

Em certas modalidades, o microrganismo recombinante aqui descrito é modificado por engenharia para ativar um caminho que produz n-butanol heterólogo (também aqui indi- cado como caminho de n-butanol) que compreende: (1) Conversão de 2 Acetil-CoA a aceto- 15 acetil-CoA, (2) Conversão de Acetoacetil CoA a Hidroxibutiril-CoA, (3) Conversão de Hidro- xibutiril- CoA a Crotonil-CoA, (4) Conversão de Crotonil CoA a Butiril-CoA, (5) Conversão de Butiraldeído a n-butanol, (ver a ilustração exemplar da figura 2).

A conversão de 2 Acetil-CoA a acetoacetil-CoA pode ser realizada expressando um gene nativo ou heterólogo que codifica uma acetil-CoA-acetil transferase (tiolase) ou Thl no 20 microrganismo recombinante. Tiolases exemplares adequadas no microrganismo recombi- nante aqui descrito são codificadas por thl de Clostridium acetobutylicum, e em particular da cepa ATCC824 ou um gene que codifica uma enzima homóloga de C. pasteurianum, C. bei- jenckii, em particular da cepa NCIMB 8052 ou cepa BAIOI, Candida tropicalis, Bacillus spp., Megasphaera elsdenii, ou Butyrivibrio fibrisolvens, ou uma tiolase de E coli selecionada de 25 fadA ou atoB.

A conversão de Acetoacetil CoA a Hidroxibutiril-CoA pode ser realizada expressan- do um gene nativo ou heterólogo que codifica hidroxibutiril-CoA desidrogenase Hbd no mi- crorganismo recombinante. Hbd exemplar adequado no microrganismo recombinante aqui descrito é codificado por hbd de Clostridium acetobutylicum, e em particular da cepa 30 ATCC824, ou um gene que codifica uma enzima homóloga de Clostridium kluyveri, Clostri- dium beijerinckii, e em particular da cepa NCIMB 8052 ou cepa BAIOI, Clostridium thermo- saccharolyticum, Clostridium tetani, Butyrivibrio fibrisolvens, Megasphaera elsdenii, ou E coli (fadB).

A conversão de Hidroxibutiril-CoA a Crotonil-CoA pode ser realizada expressando um gene nativo ou heterólogo que codifica uma crotonase ou Crt no microrganismo recom- binante. crt exemplar adequado no microrganismo recombinante aqui descrito é codificado por crt de Clostridium acetobutylicum, e em particular da cepa ATCC824, ou um gene que codifica uma enzima homóloga de B. fibriosolvens, Fusobacterium nucleatum subsp. Vincen- tii, Clostridium difficile, Clostridium pasteurianum, ox Brucella melitensis.

A conversão de Crotonil CoA a Butiril-CoA pode ser realizada expressando um ge- ne nativo ou heterólogo que codifica uma butiril-CoA desidrogenase no microrganismo re- 5 combinante. Butiril-CoA desidrogenases exemplares adequadas no microrganismo recombi- nante aqui descrito são codificados por bcdletfAletB de Clostridium acetobutylicum, e em particular da cepa ATCC824, ou um gene que codifica uma enzima homóloga de Megas- phaera elsdenii, Peptostreptococcus elsdenii, Syntrophospora bryanti, Treponema phage- demes, Butyrivibrio fibrisolvens, ou um homólogo Bed de mitocôntria de mamífero.

A conversão de butiraldeído a n-butanol pode ser realizada expressando um gene

nativo ou heterólogo que codifica uma butiraldeído desidrogenase ou uma n-butanol desi- drogenase no microrganismo recombinante. Butiraldeído desidrogenase / n-butanol desidro- genase exemplar adequado no microrganismo recombinante aqui descrito é codificada por bdhA, bdhB, aad, ou adhE2 de Clostridium acetobiitylicum, e em particular da cepa 15 ATCC824, ou um gene que codifica ADH-1, ADH-2, ou ADH-3 de Clostridium beijerinckii, em particular da cepa NCIMB 8052 ou cepa BA101.

Em certas modalidades, as enzimas do caminho metabólico de acetil-CoA a n- butanol são (i) tiolase (Thl), (ii) hidroxibutiril-CoA desidrogenase (Hbd), (iii) crotonase (Crt), (iv) pelo menos um de álcool desidrogenase (AdhE2), ou n-butanol desidrogenase (Aad) ou 20 butiraldeído desidrogenase (Aid) junto com um n-butanol desidrogenase monofuncional (B- dhA/BdhB), e (v) trans-2-enoil-CoA redutase (TER) (Figura 2). Em certas modalidades, o Thl, Hbd, Crt, AdhE2, Aid, BdhA/BdhB e Aad são de Clostridium. Em certas modalidades, o Clostridium é um C. acetobutylicum. Em certas modalidades, o TER é de Euglena gracilis ou de Aeromonas hydrophila.

Um microrganismo recombinante que expressa um caminho de n-butanol heterólo-

go produz n-butanol em rendimentos muito baixos em virtude de a maioria de carbono ser metabolizada pelos caminhos nativos. O rendimento de n-butanol de um microrganismo que expressa um caminho de n-butanol heterólogo pode ser limitado a níveis menores que 2 %. Da forma exemplificada no exemplo 19, E. coli W3110 tipo selvagem que expressa um ca- 30 minho de n-butanol nos plasmídeos pGV1191 e pGV1113 converte glicose a n-butanol em um rendimento de cerca de 1,4 % do teórico.

De maneira a fornecer o rendimento alto de n-butanol, o microrganismo recombi- nante incluindo enzimas ativadas para a produção de n-butanol, é adicionalmente modifica- do por engenharia para direcionar o fluxo de carbono que origina do metabolismo da fonte de carbono para n-butanol. Em particular, a direção do fluxo de carbono para n-butanol pode ser realizada inativando um caminho metabólico que compete com a produção de n-butanol.

Um “caminho de competição” com relação à produção de n-butanol indica um ca- minho para a conversão de um substrato em um produto em que pelo menos um dos subs- tratos é um intermediário metabólico na produção de n-butanol. Em certas modalidades, o caminho de competição também pode consumir NADH (competição com relação ao consu- mo de NADH). Caminhos exemplares que competem com a produção de n-butanol são ca- 5 minhos fermentativos endógenos que levam à subprodutos de fermentação indesejáveis e que possivelmente usam ou consomem NADH.

O termo “inativado” ou “inativação” da forma aqui usada com referência a um cami- nho indica um caminho em que qualquer enzima que controla ,uma reação no caminho é biologicamente inativo, que inclui, mas sem limitações, a inativação da enzima é realizado 10 deletando um ou mais genes que codificam enzimas do caminho. O termo “ativado” ou “ati- vação”, da forma aqui usada com referência a um caminho, indica um caminho em que qualquer enzima que controla uma reação no caminho é biologicamente ativa. Desta manei- ra, um caminho é inativado quando pelo menos uma enzima que controla uma reação no caminho é inativada, de maneira tal que a reação controlada pela dita enzima não ocorra. 15 Ao contrário, um caminho é ativado quando todas as enzimas que controlam uma reação no caminho são ativadas.

Em certas modalidades, a inativação de um caminho de competição é realizada ina- tivando uma enzima envolvida na conversão de um substrato para um produto no caminho de competição. A enzima que é inativada pode preferivelmente catalisar a conversão de um 20 intermediário metabólico para a produção de n-butanol ou pode catalisar a conversão de um intermediário metabólico do caminho de competição. Em certas modalidades, a enzima também consome NADH e, desta forma, também compete com a produção de n-butanol também com relação ao consumo de NADH.

Os termos "inativo" ou "inativação", da forma aqui usada em relação a uma molécu- Ia biologicamente ativa, tal como uma enzima, indicam qualquer modificação no genoma e/ou proteoma de um microrganismo que impede ou reduz a atividade biológica da molécula biologicamente ativa no microrganismo. Inativações exemplares incluem, mas sem limita- ções, modificações que resultam na conversão da molécula de uma forma biologicamente ativa em uma forma biologicamente inativa e de uma forma biologicamente ativa em uma forma menos biologicamente ativa ou com atividade biológica reduzida, e quaisquer modifi- cações que resultam na total ou parcial deleção da molécula biologicamente ativa. Por e- xemplo, a inativação da molécula biologicamente ativa pode ser realizada pela deleção ou mutação de um polinucleotídeo nativo ou heterólogo que codifica a molécula biologicamente ativa no microrganismo, pela deleção ou mutação de um polinucleotídeo nativo ou heterólo- go que codifica uma enzima envolvida no caminho para a síntese da molécula biologicamen- te ativa no microrganismo, pela ativação de uma molécula nativa ou heteróloga adicional que inibe a expressão da molécula biologicamente ativa no microrganismo. Em particular, em algumas modalidades, a inativação da molécula biologicamente ativa, tal como uma enzima, pode ser realizada pela deleção de um ou mais genes endóge- nos que codificam a enzima do genoma do microrganismo recombinante.

Dessa maneira, em certas modalidades, a inativação é realizada pela deleção de um gene que codifica uma enzima envolvida no caminho que compete com a produção do n-butanol do genoma do microrganismo para tornar disponível o carbono/NADH ao um ou mais polipeptídeos para produzir n-butanol ou seus intermediários metabólicos.

Em certas modalidades, a deleção dos genes que codificam estas enzimas melhora o rendimento de n-butanol em virtude de mais carbono e/ou NADH ficar disponível a um ou mais polipeptídeos para produzir n-butanol ou seus intermediários metabólicos.

Em certas modalidades, as seqüências de DNA deletadas do genoma do microrga- nismo recombinante codificam uma enzima selecionada do grupo que consiste em: D-Iactato deidrogenase, piruvato formato liase, acetaldeído/álcool deidrogenase, fosfato acetil transfe- rase, acetato quinase A, fumarato redutase, piruvato oxidase e metilglioxal sintase.

Em particular, quando o microrganismo é E. coli, a seqüência de DNA deletada do genoma pode ser selecionada do grupo que consiste em IdhA pflB, pfIDC, adhE, pta, ackA, frd, poxB e mgsA.

Genes que são deletados ou nocauteados para produzir os microrganismos aqui di- vulgados são exemplificados por E coli. Versados na técnica podem identificar facilmente genes homólogos correspondentes ou genes que codificam enzimas que competem com o caminho de produção de n-butanol em relação a carbono e/ou NADH em outros microrga- nismos por técnicas convencionais de biologia molcular (tais como, busca de homologia em seqüência, clonagem com base em seqüências homólogas, etc.). Uma vez identificados, os genes alvos podem ser deieíados ou nocauteados nestes organismos hospedeiros de acor- do com métodos de biologia molcular bem estabelecidos.

Em uma modalidade, a deleção do gene de interesse ocorre de acordo com o prin- cípio de recombinação homóloga. De acordo com esta modalidade, um cassete de integra- ção contendo um módulo que compreende pelo menos um gene marcador é flanqueado em ambos os lados pelos fragmentos de DNA homólogos àqueles das extremidades do sítio de integração alvejado. Depois de transformar o microrganismo hospedeiro com o cassete por métodos apropriados, recombinação homóloga entre as seqüências de flanqueamento fazer com que o marcador substitua a região cromossômica entre os dois sítios do genoma cor- respondentes às seqüências de flanqueamento do cassete de integração. O evento de re- combinação homóloga pode ser facilitado por uma enzima recombinase que pode ser nativa para o microrganismo hospedeiro ou pode ser sobrexpressa.

As enzimas D-Iactato deidrogenase, piruvato formato liase, acetaldeído/álcool dei- drogenase, fosfato acetil transferase, acetato quinase A, fumarato redutase, piruvato oxida- se e/ou metilglioxal sintase podem ser exigidas para certos caminhos endógenos concorren- tes que produzem succinato, lactato, acetato, etanol, formato, dióxido de carbono e/ou gás hidrogênio.

Em particular, a enzima D-Iactato deidrogenase (codificada em E coli por IdhA) a- copia a oxidação de NADH na redução de piruvato em D-lactato. Mostrou-se previamente que a deleção de IdhA elimina a formação de D-Iactato no caldo de fermentação (Causey, T.B. et al, 2003, Proc. Natl. Acad. Sei, 100, 825-32).

A enzima Piruvato formato liase (codificada em E coli por pflB) oxida piruvato em acetil-CoA e formato. Mostrou-se que a deleção de pflB é importante para a sobreprodução 10 de acetato (Causey, T.B. et al, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci., 100, 825-32), piruvato (Causey, T.B. et al, 2004, Proc. Natl. Acad. Sci., 101, 2235-40) e lactato (Zhou, S., 2005, Biotechnol. Lett., 27, 1891-96). Formato pode ser adicionalmente oxidado em CO2 e hidrogênio por um complexo formato hidrogênio liase, mas a deleção deste complexo não deve ser necessária na ausência de pflB. pfIDC é um homólogo de pflB e pode ser ativado por mutação. Da for- 15 ma supraindicada, o piruvato formato liase pode não precisar ser deletado para fermentação anaeróbica de n-butanol. Um formato deidrogenase dependente de NADH (heterólogo) pode ser fornecido, se já não estiver disponível no hospedeiro, para efetuar a conversão de piru- vato em acetil-CoA acoplado com a produção de NADH.

A enzima acetaldeído/álcool deidrogenase (codificada em E coli por adhE) é envol- 20 vida na conversão de acetil-CoA em acetaldeído deidrogenase e álcool deidrogenase. Em particular, em condições aeróbicas, piruvato também é convertido em acetil-CoA, acetaldeí- do deidrogenase e álcool deidrogenase, mas esta reação é catalisada por um complexo pi- ruvato deidrogenase multienzimas, rendendo CO2 e um equivalente de NADH. Acetil-CoA abastece o cicio de TCA, mas também pode ser oxidado em acetaldeído e etanol por ace- 25 taldeído deidrogenase e álcool deidrogenase, ambos codificados pelo gene adhE. Cada uma destas reações é acoplada na redução de um dos equivalentes de NADH.

As enzimas fosfato acetil transferase (codificada em E coli por pta) e acetato qui- nase A (codificada em E coli por ackA), são envolvidas no caminho que converte acetil-CoA em acetato por meio de acetil fosfato. A deleção de ackA foi previamente usada para dire- 30 cionar o fluxo metabólico para longe da produção de acetato (Underwood, S.A. et al, 2002, Appl. Environ. Microbiol., 68, 6263-72; Zhou, S.D. et al, 2003, Appl. Environ. Mirobiol., 69, 399-407), mas a deleção de pta deve alcançar o mesmo resultado.

A enzima fumarato redutase (codificada em E coli por frd) é envolvida no caminho que converte piruvato em succinato. Em particular, em condições anaeróbicas, fosfoenolpi- ruvato pode ser reduzido em succinato por meio de oxaloacetato, malato e fumarato, resul- tando na oxidação de dois equivalentes de NADH em NAD+. Cada uma das enzimas envol- vidas nestas conversões pode ser inativada para eliminar este caminho. Por exemplo, a rea- ção final catalisada por fumarato redutase converte fumarato em succinato. O doador de elétron para esta reação é menaquinona reduzida, e cada elétron transferido resulta na translocação de dois prótons. A deleção de frd tem se mostrado útil para a geração de pro- dutos de piruvato reduzido.

A enzima piruvato oxidase (codificada em E coli por poxB) é envolvida no caminho

que converte piruvato em acetato. Esta enzima não exige NADH. Entretanto, mediante a descarboxilação de piruvato, piruvato oxidase transfere elétrons de piruvato para ubiquinona para formar ubiquinol. Em virtude da transferência deste elétron para a reunião de quinona, piruvato oxidase aumenta indiretamente a necessidade de oxigênio do microrganismo. A 10 remoção do piruvato oxidase do microrganismo impedirá que oxigênio seja consumido por este caminho.

A enzima metilglioxal sintase (MGS, codificada em E coli por mgsA) é envolvida no caminho que converte piruvato em lactato. Descobriu-se que, mesmo quando o gene IdhA é inativado, significativas quantidades residuais de lactato ainda são produzidas. Grande parte do lactato residual pode ser atribuído ao desvio metilglioxal do caminho glicolítico. Em parti- cular, a primeira etapa do desvio metilglioxal é catalisada por metilglioxal sintase (MGS) (E.C. 4.2.99.11), que, em E coli, é codificado pelo gene mgsA, alternativamente conhecido como yccG. Homólogos de mgsA foram identificados por buscas em base de dados em Ha- emophilus influenzae (D6411169), Bacillus subtilis (P42980), Brucella abortus (BAU21919_2) e Synechocystis (SYCSLLLH_17) (Tõtemeyer et al., Molcular Microbiology 27: 553-562, 1998). MGS catalisa a conversão aparentemente irreversível de diidroxiaceto- na fosfato (DHAP) em metilglioxal e ortofosfato. Metilglioxal sintases foram identificadas na variedade de organismos que inclui Pseudomonas saccarophila, Pseudomonas doudoroffi, Clostridium tetanomorphum, Ciostridium pasteurianum, Desulfovibrio gigas e Proteus vulga- ris (veja, Saadat et al., Biochemistry 37: 10074-10086, 1998; Tõtemeyer et al., Molcular Mi- crobiology 27: 553-562, 1998). Metilglioxal é extremamente citotóxico em concentrações millimolares. Em E coli as enzimas glioxalase I e Il são as enzimas primárias usadas para desintoxicar metilglioxal pela catalisação da conversão dependente de glutationa de metilgli- oxal em D(-)-lactato. D(-)-Lactato pode ser convertido em piruvato por meio de deidrogena- ses ligadas por flavina.

A expressão de gene fnr é associada com uma série de atividades em E coli. Os caminhos associados à atividade expressa por fnr são usualmente relacionados à utilização de oxigênio que é infra-regulado à medida que oxigênio é esgotado e, de uma maneira recí- proca, caminhos anaeróbicos alternativos para fermentação são supra-regulados por Fnr. 35 Uma indicação destes caminhos pode ser encontrada em Chrystala Constantinidou et al., "A Reassessment of the FNR Regulon and Transcriptomic Analysis of the Effects of Nitrate, Nitrite, NarXL, and NarQP as Escherichia coli K12 Adapts from Aerobic to Anaerobic Grow- th", J. Biol. Chem., 2006, 281:4802-4815 Kirsty Salmon et al., "Global Gene Expression Pro- filing in Escherichia coli K12 - The Effects Of Oxygen Availability And FNR" J. Biol. Chem. 2003, 278(32):29837-55" e Kirsty A. Salmon et al. "Global Gene Expression Profiling in Es- cherichia coli K12 - The Effects of Oxygen Availability and ArcA" J. Biol. Chem., 2005, 5 280(15): 15084-15096, todos incorporados pela referência em suas íntegras no presente pedido.

Caminhos e conversões catalisados por algumas das enzimas mencionadas são esquematicamente ilustrados na representação exemplar da Figura 3.

Em vista do exposto e, em particular, dos caminhos que são inativados pela inativa- 10 ção das ditas enzimas, são aqui divulgados microrganismos recombinantes modificados por engenharia para ativar uma ou mais enzimas heterólogas para a produção de n-butanol, o microrganismo recombinante adicionalmente modificado por engenharia para inativar cami- nhos concorrentes que incluem: (1) Conversão de Piruvato em Lactato, (2) Conversão de Acetil-CoA em acetato, (3) Conversão de Acetil-CoA em Acetaldeído, (4) Conversão de Pi- 15 ruvato em Succinato, (5) Conversão de Piruvato em Acetato e (6) todos os caminhos meta- bólicos associados com a expressão de um gene fnr no microrganismo. Uma representação esquemática dos caminhos expostos é ilustrada na Figura 3.

Em particular, a deleção da conversão de piruvato em lactato pode ser realizada pela inativação das enzimas concorrente D-Iactato deidrogenase e/ou metilglioxal sintase, em particular, pela inativação de um gene que codifica no microrganismo para D-Iactato dei- drogenase e/ou um gene no microrganismo que codifica para metilglioxal sintase.

A deleção da conversão de Acetil-CoA em acetato pode ser realizada pela inativa- ção da enzima concorrente Acetaldeído/álcool deidrogenase, em particular, pela inativação de um gene no microrganismo que codifica para o Acetaldeído/álcool deidrogenase.

A deleção da conversão de Acetil-CoA em Acetaldeído pode ser realizada pela ina-

tivação da enzima concorrente fosfato acetil transferase e/ou da enzima concorrente acetato quinase A, em particular, pela inativação do gene no microrganismo que codifica para o fos- fato acetil transferase e/ou acetato quinase A.

A deleção da conversão de piruvato em succinato pode ser realizada pela inativa- ção da enzima concorrente fumarato redutase, em particular, pela inativação de um gene no microrganismo que codifica para fumarato redutase.

A deleção da conversão da de Piruvato em Acetato pode ser realizada pela inativa- ção da enzima concorrente piruvato oxidase, em particular, pela inativação de um gene no microrganismo que codifica para piruvato oxidase.

A deleção de todos os caminhos associados ao gene fnr pode ser realizada pela i-

nativação do gene relevante no microrganismo.

Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante é modificado por enge- nharia para inativar um destes caminhos. Em algumas modalidades o microrganismo re- combinante é modificado por engenharia para inativar alguns ou todos os caminhos expos- tos. Assim, percebe-se que nem todos estes caminhos devem ser removidos em todas as modalidades. Um ou mais dos caminhos pode permanecer amplamente ou parcialmente 5 intacto. Além do mais, um ou mais destes caminhos pode ser condicionalmente inativado, tal como pelo uso de um promotor indutível para direcionar a expressão de uma ou mais enzi- mas chaves nos caminhos, ou pelo uso de uma mutação sensível à temperatura de uma ou mais enzimas chaves nos caminhos. Isto é possível, embora, usualmente, não necessário para desabilitar todas as enzimas no mesmo caminho.

Em algumas modalidades, a inativação de lactato deidrogenase e da conversão re-

lacionada de piruvato em lactato pode aumentar o rendimento de n-butanol em cerca de 2 %. Por exemplo, espera-se que o rendimento de n-butanol de GEV01082 (E coli W3110, AldhA) seja de cerca de 2 % do teórico, que é 40 % maior, se comparado com a cepa sem nenhum caminho concorrente removido. Entretanto, esta cepa produz, principalmente, eta- 15 nol. Em uma tentativa de remover a produção de etanol e de aumentar adicionalmente o rendimento de n-butanol, a inativação da codificação de gene para um álcool deidrogenase que converte acetil-CoA em etanol pode ser removida.

Em algumas modalidades, a inativação de álcool deidrogenase e da conversão re- lacionada de acetil-coA em etanol pode aumentar o rendimento de n-butanol em cerca de 6 %. Por exemplo, espera-se que o rendimento de n-butanol de GEV01054 (E coli W3110, AadhEi) seja de cerca de 5 até 5,6 % do teórico.

Em algumas modalidades, a inativação de lactato deidrogenase e da conversão re- lacionada de piruvato em lactato e a inativação de álcool deidrogenase e da conversão rela- cionada de acetil-CoA em etanol podem diminuir a produção de lactato e etanol e podem 25 aumentar o rendimento de n-butanol em cerca de 7 %. Por exemplo, espera-se que o ren- dimento de n-butanol de GEV01084 (E. coli W3110, AldhA, AadhE) seja de cerca de 7 % do teórico.

Em algumas modalidades, a inativação de lactato deidrogenase, álcool deidrogena- se e fumarato redutase, e das conversões relacionadas de piruvato em lactato, acetil-CoA 30 em etanol e piruvato em succinato, respectivamente, pode diminuir a produção de lactato, etanol e succinato e pode aumentar o rendimento de n-butanol em cerca de 21 %. Da forma exemplificada no exemplo 17, GEV01083 (E coli W3110, AldhA, AadhE, Andh, Afrd) pode ser cerca de 20 até 22,4 % do teórico.

Em algumas modalidades, a inativação de lactato deidrogenase, álcool deidrogena- se, fumarato redutase e metilglioxal sintase, e da conversão relacionada de piruvato em lac- tato, acetil-CoA em etanol, piruvato em succinato e piruvato em metilglioxal, respectivamen- te, pode diminuir a produção de lactato, etanol e succinato e aumentar o rendimento de n- butanol em cerca de 21 %. Da forma exemplificada no exemplo 16, o rendimento de n- butanol de GEVO1121 (E coli W3110, AldhA, AadhE, Andh, Afrd, AmgsA) pode ser cerca de

19 % maior, se comparado com GEV01083 (E coli W3110, AldhA, AadhE, Andh, Afrd) e, assim, pode-se esperar que dê pelo menos um rendimento de até 25 % do teórico.

Em algumas modalidades, a inativação de um lactato deidrogenase, álcool deidro-

genase, fumarato redutase e acetato quinase, e das conversões relacionadas de piruvato em lactato, acetil-CoA em etanol, piruvato em succinato e acetil-CoA em acetato, respecti- vamente, pode diminuir a produção de lactato, etanol, succinato e acetato, e pode aumentar o rendimento de n-butanol em cerca de 25 %. Da forma exemplificada em exemplo 17, o 10 rendimento de n-butanol de GEV01121 (E. coli W3110, AldhA, AadhE, Andh, Afrd, AackA) é de cerca de 25 % do teórico.

Em certas modalidades, a produção de n-butanol nos microrganismos recombinan- tes aqui divulgados ocorre por meio de um caminho dependente de NADH, isto é, um cami- nho em que a conversão do substrato no produto exige reduzir equivalentes fornecidos por NAD(P)H em alguma etapa catalítica no dito caminho ou por alguma ou uma enzima ou mo- lécula biologicamente ativas no dito caminho.

Em particular, em modalidades em que o caminho de produção de n-butanol inclui a conversão de acetil-CoA em n-butanol (veja, por exemplo, o caminho de n-butanol, Figura

2), quatro moléculas de NADH são exigidas para as conversões de duas moléculas de ace- til-CoA em uma molécula de n-butanol. Entretanto, durante a conversão de glicose em ace- til-CoA em condições anaeróbicas, somente duas moléculas de NADH são geradas.

Microrganismos que fornecem somente duas moléculas de NADH ao caminho de n- butanol que exige quatro moléculas de NADH são não equilibrados e, assim, não podem produzir n-butanoi em um rendimento maior que 50 % do teórico. Portanto, o microrganismo 25 pode ser modificado por engenharia para aumentar os mols de NADH gerados a partir de um mol de glicose. Preferivelmente, os quatro mols de NADH são gerados a partir de um mol de glicose.

Dessa maneira, em algumas modalidades, a fim de fornecer o alto rendimento de n- butanol, as enzimas heterólogas com expressão de microrganismos recombinantes para a 30 produção de n-butanol são adicionalmente modificadas por engenharia para equilibrar a produção e o consumo de NADH em relação à produção de n-butanol, isto é, o número total de moléculas de NADH produzidas (por exemplo, as produzidas durante a glicólise e duran- te a conversão de piruvato em acetil-CoA) iguala o número total de moléculas de NADH consumidas pelo caminho de produção de n-butanol, assim, não deixando nenhum NADH 35 extra e não tendo nenhuma deficiência em NADH.

Dessa maneira, nestas modalidades, a conversão de uma fonte de carbono em n- butanol é equilibrada em relação à produção e ao consumo de NADH. NADH produzido du- rante as reações de oxidação da fonte de carbono iguala o NADH utilizado para converter acetil-CoA em n-butanol. Somente sob estas condições todo o NADH é reciclado. Sem reci- clagem, a razão NADH/NAD+ fica desequilibrada e fará com que os organismos essencial- mente morram, a menos que caminhos metabólicos alternativos fiquem disponíveis para manter um equilíbrio.

Em particular, em certas modalidades, o microrganismo recombinante é modificado por engenharia de forma que a produção de n-butanol ocorra por meio de um caminho hete- rólogo fermentativo, em que o microrganismo não modificado por engenharia não pode pro- duzir n-butanol por meio de uma fermentação equilibrada em virtude de o microrganismo não produzir NADH suficiente para converter acetil-CoA em n-butanol.

Assim, em certas modalidades, se necessário ou desejável, piruvato deidrogenase é ativado em condições de cultura nas quais n-butanol é produzido, preferivelmente, em condições anaeróbicas. Em certas modalidades, piruvato deidrogenase é modificado por engenharia para ficar ativo em condições anaeróbicas. Alternativamente, um piruvato dei- 15 drogenase proveniente de um hospedeiro heterólogo que utiliza a enzima em condições anaeróbicas pode ser expresso no microrganismo.

Em uma outra modalidade, formato hidrogênio liase é substituído por um formato deidrogenase dependente de NADH.

Em uma ainda outra modalidade, o microrganismo é modificado por engenharia pa- ra utilizar glicerol como uma fonte de carbono por meio de um caminho metabólico modifica- do por engenharia que produz NADH suficiente para converter acetil-CoA em n-butanol.

Por exemplo, em um microrganismo hospedeiro E coli, um caminho de produção de n-butanol representado na Figura 2 está equilibrado em relação à produção de NADH, uma vez que quatro moiécuias de NADH totais são geradas e, então, consumidas pelas en- 25 zimas do caminho. Isto pode ser alcançado de diversas maneiras. Em uma modalidade, o hospedeiro pode expressar funcionalmente o piruvato deidrogenase nativo em condições anaeróbicas. Em uma outra modalidade, piruvato deidrogenases proveniente de outros or- ganismos também pode ser usado com este propósito em condições anaeróbicas. Os poli- peptídeos codificados por estes E coli ou genes heterólogos podem ser colocados sob o 30 controle de um promotor induzível para efetuar a expressão funcional.

Em certas modalidades, o microrganismo recombinante aqui divulgado inclui um formato deidrogenase ativado dependente de NADH que é ativo em condições anaeróbicas ou microaeróbicas.

Formato deidrogenase dependente de NADH (Fdh; EC 1.2.1.2) catalisa a oxidação de formato em CO2 e a redução simultânea de NAD+ em NADH. Fdh pode ser usada de a- cordo com a presente divulgação para aumentar a disponibilidade intracelular de NADH no microrganismo hospedeiro, e pode ser usado para equilibrar o caminho de produção de n- butanol em relação a NADH. Em particular, um Fdh dependente de NADH biologicamente ativo pode ser ativado e, em particular, sobrexpresso no microrganismo hospedeiro. Na pre- sença deste caminho de formato deidrogenase recém-introduzido, um mol de NADH será formado quando um mol de formato for convertido em dióxido de carbono. Em certas moda- 5 lidades, no microrganismo nativo, um formato deidrogenase converte formato em CO2 e H2 sem nenhum envolvimento de cofator.

Em certas modalidades, tal como em modalidades em que o microrganismo é E coli, o hospedeiro utiliza um piruvato-formato-liase endógeno (codificado em E coli por pfl) para converter piruvato em acetil-CoA em condições anaeróbicas, NADH não é produzido 10 por esta reação, uma vez que piruvato-formato-liase não depende de NADH. Sob esta cir- cunstância, um formato deidrogenase dependente de NADH pode ser ativado no microrga- nismo, de forma que, em combinação com o piruvato-formato-liase endógeno não depen- dente de NADH, a seguinte reação estequiométrica é similarmente alcançada em condições anaeróbicas ou microaeróbicas (Berrios-Rivera, S.J. et al, 2002, Metabol. Eng., 2002, 217- 15 29):

Piruvato + NAD+ —> acetil-CoA + NADH + CO2

Em particular, um formato deidrogenase heterólogo dependente de NADH pode ser ativado, de forma que a conversão de piruvato resulte na mesma estequiometria líquida: para cada mol de piruvato, um mol de dióxido de carbono é formado, gerando o equivalente de NADH necessário. Isto permite que as células retenham o poder redutor que, em outras circunstâncias, seria perdido pela liberação de formato ou hidrogênio no caminho nativo.

fdh exemplar adequado nos microrganismos recombinantes aqui descritos inclui um Fdh 1 de Candida boidinii dependente de NADH (GenBank Accession NO: AF004096), fdh de Candida methylica (GenBank Accession NO: CAA57036), Arabidopsis thaliana (GenBank Accession NO: AAF19436), Pseodomonas sp. 101 (GenBank Accession NO: P33160) e Staphylococcus aureus (GenBankAccession NO: BAB94016).

Enzimas fdh exemplares adicionais adequadas nos microrganismos recombinantes aqui descritos compreendem fdh nativo dos seguintes microrganismos: Saccharomyces ser- vazzii, Saccharomyces bayanus, Zygosaccharomyces rouxii, Saccharomyces exiguus, Sac- 30 charomyces kluyveri, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces thermotolerans, Kluyveromyces marxianus, Debaryomyees hansenii, Piehia sorbitophila, Piehia angusta, Candida tropiealis e Yarrowia lipolytiea.

A ativação de um fdh pode ser realizada no hospedeiro usando diversas aborda- gens. Por exemplo, a expressão de Fdh de Candida boidinii (SEQ ID NO: 13) na cepa com menor atividade de piruvato-formato-liase aumenta a produção de etanol (veja Figure 23B), o que indica uma disponibilidade de NADH intracelular de pelo menos três mols de NADH por mol de glicose consumido. Além do mais, uma disponibilidade dependente de Fdh de até 4 mols de NADH por glicose consumida foi descrita (Berrios-Rivera et al, Metabol. Eng., 4, 217, 2007; US 2003/0175903 Al; Exemplo 8).

Assim, espera-se que a sobrexpressão de um formato deidrogenase dependente de NADH aumente os mols de NADH disponíveis no caminho de n-butanol para 2,5, 3, 3,5, 4, e, portanto, para alcançar o equilíbrio de um caminho de n-butanol no microrganismo. Da forma exemplificada em exemplo 21, a cepa de E coli GEV01034 que expressa Fdh de pGV1248 produz cerca de 3 mols de NADH por mol de glicose. Espera-se que a expressão de um caminho de produção de n-butanol em um microrganismo que expressa Fdh resulte em rendimentos de n-butanol maiores que 1,4 % se o caminho de produção de n-butanol puder concorrer com caminhos fermentativos endógenos. Da forma exemplificada no exem- plo 24, GEV0768 (E. coli W3110) que expressa um Fdh dependente de NADH e um cami- nho de produção de n-butanol de pGV1191 e pGV1583 produzem n-butanol em um rendi- mento que é 30 % maior (2 % do teórico), se comparado com uma cepa de controle GEV0768 que expressa um caminho de produção de n-butanol de plasmídeos pGV1191 e pGV1435.

Em certas modalidades, o microrganismo recombinante aqui divulgado inclui um pi- ruvato deidrogenase (Pdh) ativo em condições anaeróbicas ou microaeróbicas. O piruvato deidrogenase ou formato deidrogenase dependentes de NADH podem ser heterólogo em relação ao microrganismo recombinante, em que a seqüência de codificação que codifica

estas enzimas é heteróloga, ou a região regulatória transcricional é heteróloga (incluindo artificial), ou os polipeptídeos codificados compreendem mudanças de seqüência que criam a enzima resistente à inibição de realimentação por certos intermediários ou substratos me- tabólicos.

A enzima piruvato deidrogenase (Pdh) catalisa a conversão de piruvato em acetil- CoA com produção de dióxido de carbono. Durante a catalisação desta reação, Pdh produz um NADH e consome um ATP. Esta enzima é usualmente expressa em condições aeróbi- cas, em que ATP é abundante, e NADH pode ser facilmente consumido por enzimas deidro- genase NADH nos caminhos de respiração, resultando na razão NADH/NAD+ relativamente baixa. Em condições anaeróbicas, quando NADH adicional não for necessário, e quando a razão NADH/NAD+ for relativamente alta, piruvato formato liase é usado pela célula para converter piruvato em acetil-CoA e formato. Neste caso, os elétrons que são liberados pela reação de Pdh permanecem no formato, que é tanto secretado quanto convertido em dióxi- do de carbono e gás hidrogênio pelo formato hidrogênio liase. Para equilibrar um caminho de produção de n-butanol em E coli, a conversão de piruvato em acetil-CoA deve produzir um NADH em condições anaeróbicas.

Até recentemente, era amplamente aceito que Pdh não funciona em condições a- naeróbicas, mas diversos relatos recentes demonstraram que este não é o caso (de Graef, M. et al, 1999, Journal de Bacteriology1 181, 2351-57; Vernuri, G.N. et al, 2002, Applied and Environmental Microbiology, 68, 1715-27). Além do mais, outros microrganismos, tal como Enterococcus faecalis, exibem alta atividade in vivo do complexo Pdh, mesmo em condições anaeróbicas, contanto que as condições de crescimento fossem de maneira tal que a razão 5 NADH/NAD+ em estado estacionário fosse suficientemente baixa (Snoep, J.L. et al, 1991, Fems Microbiology Letters, 81, 63-66). Em vez da regulação de oxigênio da expressão e função de Pdh, mostrou-se que Pdh é regulado pela razão NADH/NAD+ (de Graef, M. et al, 1999, Journal de Bacteriology, 181, 2351-57). No geral, o Pdh de E. coli é inativado pelo aumento dos níveis de NADH que são associados com uma troca no metabolismo anaeróbi- 10 co, mas, se aceptores de elétron alternativos estiverem disponíveis para a célula para dimi- nuir os níveis de NADH, Pdh pode ser usado. Se o caminho de n-butanol expresso em E. coli consumir NADH rápido o suficiente para manter um baixo nível de NADH/NAD+ no inte- rior da célula, o Pdh endógeno pode permanecer ativo o suficiente para equilibrar o cami- nho, especialmente, se o gene para piruvato formato Iiase for nocauteado.

Assim, em algumas modalidades, o microrganismo recombinante expressa um Pdh

endógeno funcional no caminho de produção de n-butanol. Preferivelmente, nestas modali- dades, a enzima piruvato formato Iiase também é inativada. Alternativamente, uma estraté- gia evolucionária pode ser usada para aumentar a atividade de Pdh em condições anaeróbi- cas. Esta estratégia se baseia na utilização de uma variante de E coli modificada por enge- 20 nharia que tem todos os caminhos fermentativos, mas produção de etanol removida (Figura 4). Esta cepa é alimentada com glicose em condições anaeróbicas. Nestas condições, a fermentação de glicose em etanol somente é possível se um equivalente de NADH adicional for fornecido por um Pdh funcionalmente expresso. Pdh com maior atividade em condições anaeróbicas pode ser gerado usando este método e pode ser usado no microrganismo re- 25 combinante aqui divulgado.

Se modalidades em que o Pdh nativo não for ativo em condições anaeróbicas para acionar a produção de n-butanol (por exemplo, em E coli), um Pdh de um outro organismo pode ser expresso. Por exemplo, Pdh de Enterococcus faecalis é similar ao Pdh de E. coli, mas é inativado em níveis muito inferiores de NADH/NAD+. Adicionalmente, alguns organis- 30 mos, tais como Bacillus subtilis e quase todas as cepas de bactéria de ácido lático, usam um Pdh no metabolismo anaeróbico. Estas enzimas de Pdh podem equilibrar o caminho de n- butanol no microrganismo recombinante aqui divulgado.

Espera-se que a expressão de um Pdh que é funcional em condições anaeróbicas aumente os mols de NADH por mol de glicose. A evolução de Pdh da forma supradescrita pode aumentar sua atividade em condições anaeróbicas, o que é observável pelas maiores razões de etanol por acetato produzidas a partir da glicose. Da forma exemplificada no e- xemplo 22, a razão de etanol por acetato pode aumentar de 0,8 para 1,1, indicando que Pdh exibe maior atividade em condições anaeróbicas. Kim et al. descrevem o Pdh que torna dis- ponível em E coli até quatro mols de NADH por mol de glicose consumido (Kim Y. et al. Appl. Environ. Microbiol., 2007, 73, 1766-1771). Assim, espera-se que a utilização de um Pdh anaerobicamente ativo aumente os mols de NADH disponíveis ao caminho de n-butanol 5 para 2,5, 3, 3,5, 4 e, portanto, espera-se que alcance o equilíbrio de um caminho de n- butanol no microrganismo. Espera-se que a expressão de um caminho de produção de n- butanol no microrganismo que expressa um Pdh que é funcional em condições anaeróbicas resulte em rendimentos de n-butanol maiores que 1,4 % se o caminho de produção de n- butanol puder concorrer com caminhos fermentativos endógenos.

Em certas modalidades, a fonte de carbono que é mais reduzida que a glicose pode

ser usada para equilibrar o caminho de n-butanol. Em particular, a dita fonte de carbono po- de ser glicerol que, no geral, é metabolizado pela sua conversão na glicólise intermediária gliceraldeído-3-fosfato (Lin, E.C.C., 1976, Annu. Rev. Microbiol., 30, 535-78). Um rendimen- to de até duas moléculas de NADH por glicerol convertido em acetil-CoA pode ser alcança- do, assim, fornecendo NADH suficiente para a conversão de acetil-CoA em n-butanol.

Em certas modalidades, o microrganismo recombinante é modificado por engenha- ria para ativar um caminho heterólogo para converter glicerol em piruvato.

Em particular, em algumas modalidades, a fonte de carbono a ser convertida em n- butanol compreende glicerol, e é ativado um caminho de degradação de glicerol que evita 20 uma etapa de glicerol-3-fosfato deidrogenase catalisado que alimenta elétrons no interior da reunião de quinona. O caminho de degradação de glicerol pode ser ativado pela inativação de genes que codificam glicerol quinase e glicerol-3-fosfato deidrogenase (Jin, R.Z. et al, 1983, Journal of Molcular Evolução, 19, 429-36). O caminho torna-se mais eficiente pela expressão de uma DHA quinase que pode ser proveniente de Citrobacter freundii, S. cerevi- 25 siae ou outros organismos (Figura 26). A DHA quinase evita a fosforilação de DHA por um sistema fosfotransferase (PTS), que exige DHA saia da célula por difusão e reentre através do PTS1 ainda ficando fosforilado (Figura 26).

Em algumas modalidades, o microrganismo recombinante aqui divulgado é modifi- cado por engenharia para complementar a expressão ou sobrexpressão melhoradas por 30 evolução de um glicerol deidrogenase, em que o microrganismo nativo não metaboliza glice- rol por meio de diidroxiacetona (DHA) intermediária. Em particular, em certas modalidades, organismos hospedeiros têm um caminho nativo que converte glicerol por meio do DHA in- termediário, em que a conversão prossegue por meio da conversão de DHA de PTS depen- dente de PEP em diidroxiacetona-fosfato (DHAP). Pela expressão de uma DHA quinase 35 solúvel, por exemplo, de Citrobacter freundii, Klebsiella pneumonia ou Saccharomyces cere- visiae de forma recombinante, limitações dos caminhos de utilização de DHA nativo que exigem PEP e da difusão de DHA na membrana celular podem ser superadas, de forma que DHAP possa ser mais eficientemente disponível na célula. Portanto, os metabólitos subse- quentes do metabolismo de DHAP, tais como piruvato e acetil-CoA e equivalentes de NAD(P)H que podem ser utilizados pela célula para uma biotransformação, ser suas enzi- mas nativas ou expressas, também podem ser mais eficientemente disponíveis à célula.

Em uma modalidade, um gene que codifica DHA quinase de C. freundii, K. pneu-

moniae ou S. cerevisiae é clonado pela utilização da reação em cadeia de polimerase e ini- ciadores apropriados para obter DNA de fita dupla linear do gene completo por métodos bem conhecidos pelos versados na técnica.

A seqüência do gene que codifica DHA quinase de C. freundii (Genbank accession 10 # DQ473522.1) é dada como SEQ ID NO: 12. A seqüência do gene que codifica DHA quina- se nos genomas de K. pneumoniae é dada como SEQ ID NO: 14. A seqüência do gene que codifica DHA quinase DaH nos genomas de S. cerevisiae é dada como SEQ ID NO: 15. A seqüência do gene que codifica DHA quinase Dak2 nos genomas de S. cerevisiae é dada como SEQ ID NO: 16.

Em uma modalidade, o gene que codifica DHA quinase é usado sem deletar o ópe-

ron de DHA tipo selvagem do organismo hospedeiro. Em uma modalidade alternativa, o ó- peron de DHA tipo selvagem do organismo hospedeiro é deletado. Em uma modalidade, DHA quinase é sobrexpressa a partir de um plasmídeo com um dos muitos promotores e genes de resistência antibiótica apropriados para o nível de expressão exigido para uma dada cepa.

Em uma modalidade, o gene que codifica DHA quinase é cromossomicamente inte- grado. Métodos de integração cromossômica de um gene são conhecidos na tecnologia. De acordo com esta modalidade, pelo uso de técnicas padrões de biologia molecular, o gene de C. freundii, K. pneumoniae ou S. cerevisae para DHA quinase é inserido no genoma do mi- crorganismo.

A presença e a integridade da inserção do gene que codifica DHA quinase no cro- mossomo podem ser verificadas por PCR usando iniciadores que são adjacentes e exterio- res ao gene substituído, bem como complementar à seqüência do gene que codifica DHA quinase interna, de forma que produtos de PCR da dimensão esperada verifiquem a pre- 30 sença do gene inserido e as mudanças esperadas no DNA cromossômico. Desta maneira, a integridade das bordas da modificação, bem como a seqüência interna, podem ser verifica- das.

Em E. coli tipo selvagem e outras bactérias que metabolizam glicerol por meio do glicerol-3-fosfato intermediário, o metabolismo de diidroxiacetona (DHA) depende da sua fosforilação por proteínas do regulon de DHA que interage com proteínas do sistema fosfo- transferase (PTS) (Figura 26).

O sistema PTS fosforila DHA em DHAP (diidroxiacetonafosfato). DHAP é um inter- mediário de glicólise e, uma vez que ele é comum ao caminho do metabolismo de glicerol, ele conecta o metabolismo de glicerol com o metabolismo bacteriano central. O sistema PTS é ligado por membrana. Portanto, DHA que é formado por um glicerol deidrogenase solúvel, tal como o glicerol deidrogenase de E. coli, codificado por gldA, deve difundir até a membra- 5 na antes de ele poder ser convertido em DHAP, em um momento tal que ele possa entrar em metabolismo central, subsequentemente, rendendo NADH e ATP adicionais, bem como acetil-CoA, todos os quais podem ser utilizados por uma enzima ou caminho biocatalisado- res recombinantes.

A fosforilação mediada por PTS exige PEP, fosfoenolpiruvato. PEP doa seu grupo 10 fosforila com alta energia para a enzima I do PTS e, então, à enzima conhecida na tecnolo- gia como HPr, ambas as quais ficam localizadas no citoplasma. Entretanto, a proteína que liga especificamente DHA é um homólogo da enzima canônica Il do PTS, consistindo nas subunidades I IA, IIB e IIC1 das quais, IIC fica localizada na membrana celular. No geral, es- tas proteínas NA, BeC podem ser monômeros ou ligadas covalentemente. IIA e IIB são 15 hidrofílicas, enquanto que IIC é uma proteína transmembrana de seis ou oito segmentos. Acredita-se que o grupo fosforila seja transferido de P-HPr para IIA, então, para NB, e, final- mente, sobre o açúcar subsequentemente fosforilado, sem que IIC nunca seja fosforilado.

O caminho da utilização de DHA similar tanto em C. freundii quanto em K. pneumo- niae envolve uma única enzima dependente de ATP que é solúvel no citoplasma, e porta 20 alguma similaridade com a enzima Il do PTS. A expressão recombinante em um microrga- nismo com uma rota da utilização de DHA com base em PTS, tais como E coli e outras bac- térias, pode aliviar uma ou mais limitações notadas previamente, tal como uma exigência de PEP, e difusão de DHA até a membrana (mesmo se o DHA for formado no citoplasma).

A título de exempio, em uma modalidade, as reações do caminho de glicerol até pi- ruvato são como segue:

Glicerol —► Diidroxiacetona + NADH (1)

Diidroxiacetona —» Diidroxiacetona-Fosfato + ADP (2)

Diidroxiacetona-Fosfato —► Piruvato + NADH + 2 ATP (3)

Em que a reação líquida é como segue:

Glicerol + 2NAD+ + 2H+ + 1ADP Piruvato + 1 ATP + 2 NADH (4)

Em uma modalidade, uma enzima GIdA glicerol deidrogenase dependente de NADH catalisa a reação (1) e a enzima DHA quinase derivada de C. freundii ou de K. pneu- moniae catalisando a reação (2). (veja a Figura 26).

Em uma modalidade, os genes glpK (que codifica glicerol quinase) e glpD (que co- difica deidrogenase G3P) são deletados do genoma de um microrganismo hospedeiro, e gldA (que codifica um glicerol deidrogenase ligado por NADH) e uma diidroxiacetona (DHA) quinase dependente de PEP (fosfoenolpiruvato) emerge como a rota ativa de degradação de glicerol. Em uma modalidade, o organismo hospedeiro metaboliza glicerol por meio de um caminho de conversão que prossegue por meio de uma conversão do PTS (sistema fos- fotransferase) dependente de PEP de DHA em DHAP. Nestes hospedeiros, pela expressão da DHA quinase solúvel tanto de Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae quanto de Sac- 5 charomyces cerevisiae de forma recombinante, limitações dos caminhos de utilização de DHA nativo que exigem PEP e difusão do DHA na membrana celular podem ser superadas. Desse modo, DHAP pode ser mais eficientemente disponível à célula. Portanto, os subse- quentes metabólitos do metabolismo de DHAP, tal como acetil-CoA, e equivalentes de NAD(P)H que podem ser utilizados pela célula para biocatálise, ser suas enzimas nativas ou 10 expressas de forma heteróloga, também podem ser mais eficientemente disponíveis à célu- la.

Espera-se que a expressão de um caminho de utilização de glicerol funcional, da forma aqui descrita, aumente os mols de NADH por mol de glicerol. Especificamente, os mols de NADH por mol de glicerol podem ser aumentados até dois mols de NADH por mol 15 de glicerol. Assim, espera-se que a expressão de um caminho de utilização de glicerol fun- cional, da forma aqui descrita, aumente os mols de NADH disponíveis ao caminho de n- butanol até 1,25, 1,5, 1,75, 2 e, portanto, que alcance o equilíbrio de um caminho de n- butanol em um microrganismo. Da forma exemplificada no exemplo 4, GEV0926 produz cerca de dois mols de NADH por mol de glicerol. A expressão de um caminho de produção 20 de n-butanol em um microrganismo que expressa um caminho de utilização de glicerol fun- cional da forma supradescrita pode resultar em rendimentos de n-butanol maiores que 1,4 % se o caminho de produção de n-butanol puder concorrer com caminhos fermentativos endó- genos.

Em certas modalidades, um microrganismo recombinante aqui descrito que expres- 25 sa uma enzima heteróloga para a produção de n-butanol e, em particular, um caminho hete- rólogo dependente de NADH para a produção de n-butanol, tal como o caminho de n- butanol, são adicionalmente modificados por engenharia para inativar um caminho concor- rente e para equilibrar a produção e o consumo de NADH no microrganismo em relação à produção de n-butanol.

Em particular, em algumas modalidades, espera-se que a inativação de Iactato dei-

drogenase e a conversão relacionada de piruvato em lactato, além da modificação por en- genharia do microrganismo para o suprimento de NADH suficiente ao caminho de produção de n-butanol pela ativação e, em particular, sobrexpressão, de Fdh, pela ativação de um Pdh anaerobicamente ativo, ou pela utilização de glicerol como fonte de carbono, aumentem 35 o rendimento de n-butanol para cerca de 5 % do teórico. Nestas modalidades, a maior parte do carbono ainda pode ser desviada para etanol. Em particular, da forma exemplificada no exemplo 27, espera-se que o rendimento de n-butanol de GEV01082 (e modificado por en- genharia para deletar o gene que codifica Iactato deidrogenase) seja de cerca de 5 % do teórico.

Em algumas modalidades, em microrganismos recombinantes em que álcool dei- drogenase e a conversão relacionada de acetil-CoA em etanol é inativada, espera-se que a ativação e, em particular, sobrexpressão, de um Fdh dependente de NADH, além da inativa- ção dos caminhos metabólicos concorrente, aumentem adicionalmente o rendimento de n- butanol para pelo menos cerca de 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % e 95 % em relação à teoria, dependendo dos caminhos concorrentes que são inativados no micror- ganismo. Em particular, da forma exemplificada no Exemplo 18, o rendimento esperado de n-butanol por um microrganismo recombinante, tal como de GEV01083 que expressa Fdh e com Iactato deidrogenase inativado, álcool deidrogenase e fumarato redutase, é de cerca de 42 % superior, se comparado com a cepa que não expressa Fdh (pGV1281 do Exemplo 18). Fdh expresso a partir de um sistema de expressão similar, como pGV1281 em GEV01034, resultou somente em três mols de NADH por mol de glicose, o que indica que a expressão de Fdh leva a um aumento na disponibilidade de NADH. Entretanto, este aumento não é suficiente para permitir o equilíbrio do caminho de n-butanol, assim, limitando o rendimento esperado em cerca de 35 %.

Em algumas modalidades em que álcool deidrogenase e a conversão relacionada de acetil-CoA em etanol é inativada, espera-se que a ativação e, em particular, a expressão 20 de um Pdh anaerobicamente ativo, além da inativação dos caminhos metabólicos concor- rente, aumentem adicionalmente o rendimento de n-butanol em pelo menos cerca de 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % e 95 % do teórico, dependendo dos caminhos concorrentes que são inativados no microrganismo. Em particular, da forma exemplificada no exemplo 23, espera-se que o rendimento de n-butanol do microrganismo recombinante, 25 tal como GEV01510, que expressa Pdh em condições anaeróbicas e com Iactato deidroge- nase, álcool deidrogenase, fumarato redutase, metilglioxal sintase e acetato quinase inativa- dos, seja de cerca de 73 % do teórico.

Em algumas modalidades em que álcool deidrogenase e a conversão relacionada de acetil-CoA em etanol é inativada, espera-se que a ativação e, em particular, a expressão 30 do Fdh funcional, além da inativação de caminhos metabólicos concorrente, aumentem adi- cionalmente o rendimento de n-butanol para pelo menos cerca de 30 %, 35 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % e 95 % do teórico, dependendo dos caminhos concorrentes que são inativados no microrganismo. Em particular, da forma exemplificada no exemplo 27, espera-se que o rendimento de n-butanol de um microrganismo recombinante, tal como 35 GEV01507 (E. coli W3110, AldhA, AadhE, Afrd, AackA, AmgsA), que expressa Fdh e com Iactato deidrogenase, álcool deidrogenase, fumarato redutase, metilglioxal sintase e acetato quinase inativados seja de cerca de 70 % do teórico. Em algumas modalidades em que o álcool deidrogenase e a conversão relacionada de acetil-CoA em etanol é inativada, espera-se que a ativação e, em particular, a expressão de um caminho de utilização de glicerol funcional, além da inativação de caminhos metabóli- cos concorrentes aumentem o rendimento de n-butanol para níveis de pelo menos 50 % 60 5 %, 70 %, 80 %, 90 % e 95 % do teórico, dependendo dos caminhos concorrentes que são inativados no microrganismo. Em particular, da forma exemplificada no exemplo, espera-se que o rendimento de n-butanol de um E. coli (W3110, AldhA, AadhE, Andh, Afrd, AackA, AmgsA) que utiliza glicerol com uma fonte de carbono e com lactatodeidrogenase, álcool deidrogenase, fumarato redutase, metilglioxal sintase e acetato quinase inativados seja de 10 cerca de 70 % do teórico.

Em algumas modalidades, espera-se que a inativação de um álcool deidrogenase que converte acetil-CoA em etanol, além da modificação por engenharia do microrganismo para o suprimento de NADH suficiente ao caminho de produção de n-butanol pela ativação e, em particular, sobrexpressão, de Fdh, pela ativação de um Pdh anaerobicamente ativo ou 15 pela utilização de glicerol como a fonte de carbono, aumentem o rendimento de n-butanol para pelo menos cerca de 40 % do teórico. Em particular, da forma exemplificada no exem- plo 27, espera-se que o rendimento de n-butanol de GEV01084 modificado por engenharia para deletar o gene que codifica álcool deidrogenase seja de cerca de 40 % do teórico.

Em algumas modalidades, espera-se quê a inativação de Iactato deidrogenase e 20 álcool deidrogenase e das conversões relacionadas de piruvato em Iactato e de acetil-CoA em etgno!, respectivamente, aiérn do suprimento de NADH suficiente ao caminho de produ- ção de n-butanol pela ativação e, em particular, sobrexpressão, de Fdh, pela ativação de um Pdh anaerobicamente ativo ou pela utilização de glicerol como a fonte de carbono, aumen- tem o rendimento de n-butanol para cerca de 50 % do teórico. Em particular, da forma e- 25 xemplificada no exemplo 27, espera-se que o rendimento de n-butanol de GEV01084, (mo- dificado por engenharia para deletar o gene que codifica álcool deidrogenase e Iactato dei- drogenase) seja de cerca de 50 % do teórico.

Em algumas modalidades, espera-se que a inativação da Iactato deidrogenase, ál- cool deidrogenase e fumarato redutase e das conversões relacionadas de piruvato em Iacta- 30 to, acetil-CoA em etanol e fumarato em succinato, respectivamente, além da modificação por engenharia dos microrganismos para o suprimento de NADH suficiente ao caminho de produção de n-butanol pela ativação e, em particular, sobrexpressão, de Fdh, pela ativação de um Pdh anaerobicamente ativo ou pela utilização de glicerol como a fonte de carbono, aumentem o rendimento de n-butanol para cerca de 55 %. Da forma exemplificada no e- 35 xemplo 27, espera-se que o rendimento de n-butanol de um microrganismo recombinante, tal como GEV01508, (modificado por engenharia· para deletar o gene que codifica álcool deidrogenase, Iactato deidrogenase e fumarato redutase) seja de cerca de 55 % do teórico. Em algumas modalidades, a inativação da Iactato deidrogenase, álcool deidrogena- se, fumarato redutase e metilglioxal sintase e das conversões relacionadas de piruvato em lactato, acetil-CoA em etanol, fumarato em succinato e diidroxi-acetona fosfato em metilglio- xal, respectivamente, além da modificação por engenharia do microrganismo para o supri- 5 mento de NADH suficiente ao caminho de produção de n-butanol pela ativação e, em parti- cular, sobrexpressão, de Fdh, pela ativação de um Pdh anaerobicamente ativo ou pela utili- zação de glicerol como a fonte de carbono, podem aumentar o rendimento de n-butanol para cerca de 60 %. Em particular, da forma exemplificada no exemplo 27, espera-se que o ren- dimento de n-butanol de um microrganismo recombinante, tal como GEV01509, modificado 10 por engenharia para deletar os genes que codificam álcool deidrogenase, lactato deidroge- nase, fumarato redutase e metilglioxal sintase seja de cerca de 60 % do teórico.

Em algumas modalidades, espera-se que a inativação de um lactato deidrogenase, álcool deidrogenase, fumarato redutase e acetato quinase e das conversões relacionadas de piruvato em lactato, acetil-CoA em etanol, fumarato em succinato e acetil-fosfato em ace- 15 tato, respectivamente, além da modificação por engenharia do microrganismo para o supri- mento de NADH suficiente ao caminho de produção de n-butanol pela ativação e, em parti- cular, sobrexpressão, de Fdh, pela ativação de um Pdh anaerobicamente ativo ou pela utili- zação de glicerol como a fonte de carbono, aumentem o rendimento de n-butanol para cerca de 65 % do teórico. Da forma exemplificada no exemplo 27 espera-se que o rendimento de 20 n-butanol de um microrganismo recombinante, tal como GEV01085, modificado por enge- nharia para deletar o gene que codifica álcool deidrogenase, lactato deidrogenase, fumarato redutase e acetato quinase seja de cerca de 65 % do teórico.

Em algumas modalidades, a inativação de um lactato deidrogenase, álcool deidro- genase, fumarato redutase, acetato quinase e metilgloxal sintase e das conversões relacio- 25 nadas de piruvato em lactato, acetil-CoA em etanol, fumarato em succinato, acetil-fosfato em acetato e diidroxi-acetona fosfato em metilglioxal, respectivamente, além da modificação por engenharia do microrganismo para o suprimento de NADH suficiente ao caminho de produção de n-butanol pela ativação e, em particular, sobrexpressão, de Fdh, pela ativação um Pdh anaerobicamente ativo ou pela utilização de glicerol como a fonte de carbono po- 30 dem aumentar o rendimento de n-butanol para cerca de 70 %. Em particular, da forma e- xemplificada no exemplo 27, espera-se que o rendimento de n-butanol de um microrganismo recombinante, tal como GEV01507, (modificado por engenharia para deletar os genes que codificam álcool deidrogenase, lactato deidrogenase, fumarato redutase, metilglioxal sintase e acetato quinase) seja de cerca de 70 % do teórico.

Dessa maneira, em certas modalidades, microrganismos recombinantes aqui divul-

gados incluem microrganismos recombinantes, tais como cepas e seus derivados, tais como GEV0788, GEV0789, GEVQ800, GEV0801, GEV0802, GEVQ803, GEV0804, GEVQ805, GEV0817, GEV0818, GEV0821, GEV0822, GEV01054, GEV01084, GEV01085, GEV01083, GEV01493, GEV01494, GEV01495, GEV01496, GEV01497, GEV01498, GEV01499, GEV01500, GEV01501, GEV01502, GEV01503, GEV01504, GEV01505, GEV01507, GEV01508, GEV01509, GEV01510 e GEV01511. Microrganismos preferidos 5 incluem GEV01495 e GEV01505. Estes microrganismos, sua produção e uso são descritos com detalhes na seção de exemplo.

Em certas modalidades, o rendimento de n-butanol pode ser adicionalmente eleva- do pela modificação por engenharia do caminho de produção de n-butanol para aumentar sua eficiência. Em particular, estas são modalidades em que um ou mais biocatalisadores 10 expressos de forma heteróloga não devem ser inicialmente otimizados para uso como uma enzima metabólica no interior de um microrganismo hospedeiro. Entretanto, estas enzimas podem ser usualmente melhoradas, por exemplo, pelo uso de abordagens evolucionárias.

Por exemplo, usando os microrganismos modificados por engenharia supradescri- tos, que contêm a variante mais efetivo de um caminho de produção de n-butanol desejado, 15 pressão seletiva pode ser aplicada para obter melhores biocatalisadores. Nesta abordagem, o caminho de produção de n-butanol é transformado em um microrganismo hospedeiro ade- quado, em que a velocidade de crescimento depende da eficiência do caminho, isto é, em que o caminho de n-butanol é o único meio de reoxidar NADH. Podem ser identificados, a partir desta biblioteca, microrganismos que exibem um aumento detectável na velocidade de 20 crescimento que não é atribuído à formação de um outro produto de fermentação. Outros produtos de fermentação podem ser identificados pela análise do caldo de fermentação por meio de métodos analíticos conhecidos pelos versados na técnica. Este processo pode ser repetido iterativamente.

Por exemplo, usando as cepas de E. coli modificadas por engenharia supradescri- tas, que contêm a variante mais efetiva de um caminho de produção de n-butanol desejado, evolução direcionada pode ser realizada para obter melhores biocatalisadores. Nesta abor- dagem, uma enzima, preferivelmente a enzima limitadora de velocidade do caminho de pro- dução de n-butanol, passa por mutação usando métodos conhecidos pelos versados na téc- nica. A biblioteca de genes mutantes é incorporada no caminho de produção de n-butanol que é transformado em um microrganismo hospedeiro adequado, em que a velocidade de crescimento depende da eficiência do caminho, isto é, em que o caminho de n-butanol é o único meio de reoxidar NADH. Podem ser identificados a partir desta biblioteca microrga- nismos que exibem uma maior velocidade de crescimento em função de uma mutação be- néfica no gene e não em função da formação de um outro produto de fermentação. Outros produtos de fermentação podem ser identificados pela análise do caldo de fermentação por meio de métodos analíticos conhecidos pelos versados na técnica. Este processo pode ser repetido iterativamente. Por exemplo, enzimas do caminho de produção de n-butanol podem ser otimizadas pela evolução direcionada de acordo com métodos conhecidos pelos versa- dos na técnica.

Metabolismo de glicose por meio do caminho de n-butanol expresso de forma hete- róloga é a única maneira de as células modificadas por engenharia poderem gerar ATP e, 5 também, a única maneira de elas poderem manter uma razão NAD7NADH estacionária. Portanto, as velocidades de crescimento dependem da velocidade de formação do n-butano. A seleção para maior velocidade de crescimento pode ser facilmente realizada por diluição serial ou evolução quimiostática.

A mesma técnica pode ser utilizada para selecionar mutantes com maior tolerância 10 ao n-butanol. N-butanol é uma substância tóxica para todos os microrganismos, principal- mente, em virtude de ele romper a membrana celular. E. coli foi previamente modificado por engenharia usando uma estratégia evolucionária para maior resistência ao etanol (Yomano, L.P. et al, 1998, Journal de Industrial Microbiology & Biotechnology, 20, 132-38). Portanto, espera-se que mutantes que exibem maior resistência ao n-butanol possam ser modificados 15 por engenharia da mesma maneira.

Dessa maneira, em algumas modalidades, são descritos microrganismos recombi- nantes que são obteníveis pelo fornecimento de um microrganismo recombinante modifica- do por engenharia para ativar um caminho heterólogo para a conversão da fonte de carbono em n-butanol, e tendo uma primeira velocidade de crescimento que depende da produção 20 de n-butanol, o microrganismo recombinante também podendo produzir butanol em uma primeira velocidade de produção; pela identificação de uma enzima no caminho heterólogo que tem velocidade limitada em relação ao caminho heterólogo; pela mutação da dita enzi- ma; pelo contato do microrganismo recombinante que compreende a enzima mutante com um meio de cuitura por um tempo e em condição para detectar uma segunda velocidade de 25 crescimento que aumenta em relação à primeira velocidade de crescimento; e pela seleção do microrganismo recombinante com a segunda velocidade de crescimento, o microrganis- mo recombinante selecionado podendo produzir n-butanol em uma segunda velocidade de produção, a segunda velocidade de produção maior do que a primeira velocidade de produ- ção.

Processo similar também pode ser usado para identificar / isolar cepas com um

maior rendimento de n-butanol por glicose metabolizada.

Em uma outra modalidade, o microrganismo é modificado por engenharia para ati- var um caminho metabólico usado para converter a fonte de carbono em intermediários me- tabólicos na produção de n-butanol ou seus derivados. Em particular, em algumas modali- 35 dades, o microrganismo recombinante é modificado por engenharia para ativar um butirato no caminho metabólico. Neste caminho, genes são sobrexpressos para converter acetil-CoA em butiril-CoA. Por exemplo, genes que codificam tiolase, hidroxibutiril-CoA-deidrogenase, crotonase e butiril-CoA deidrogenase podem ser expressos para converter acetil-CoA em butiril-CoA.

Então, Butiril-CoA é convertido em butirato por duas enzimas, fosfato butiriltransfe- rase e butirato quinase. Fosfato butiriltransferase codificado, por exemplo, pelo gene ptb proveniente de C. acetobutylicum converte butiril-CoA em butiril-fosfato mediante liberação de CoA:

Pi CoASH

Butiril-CoA * Butiril-P

Então, butiril-fosfato é defosforilado em butirato por butirato quinase, codificado, por exemplo, pelo gene buk proveniente de C. acetobutylicum mediante a liberação de ATP:

ADP ATP

Butiril-P ► Butirato

Em uma modalidade, E. coli é modificado por engenharia para converter a fonte de carbono em butirato. Neste caminho, genes que codificam tiolase, hidroxibutiril-CoA deidro- genase, crotonase, butiril-CoA deidrogenase, fosfato butiriltransferase e butirato quinase podem ser expressos para converter acetil-CoA em butirato.

Em uma modalidade, C. tyrobutyricum é usado como um organismo hospedeiro pa-

ra produzir butirato. Em uma modalidade, o C. tyrobutyricum utiliza uma enzima heteróloga TER para catalisar a conversão de crotonil-CoA em butiril-CoA. De acordo com esta modali- dade, genes ack e pta que codificam enzimas AK e PTA envolvidos no caminho de forma- ção de acetato concorrente podem ser nocauteados, da forma descrita em X. Liu and S. T. 20 Yang, Construction and Characterization of pta Gene Deleted Mutant of Clostridium tyrobut- yricum for Butyric Acid Fermentation, Biotechnol. Bioeng., 90:154-166 (2005), Y. Yang, S. Basu, D.L. Tomasko, L.J. Lee, and S.T. Yang, que é aqui incorporado pela referência em sua íntegra.

Uma vez que somente dois mols de NADH são exigidos para converter acetil-CoA em butirato, piruvato formato Iiase pode ser usado para converter piruvato em acetil-CoA. A remoção de caminhos concorrentes pode aumentar o rendimento da conversão de glicose em n-butirato e diminuir os níveis de subprodutos.

A remoção de genes que codificam um lactato deidrogenase, álcool deidrogenase, fumarato redutase e acetato quinase, que convertem piruvato em lactato, acetil-CoA em e- tanol, fumarato em succinato e acetil-fosfato em acetato, respectivamente, pode diminuir a produção de lactato, etanol, succinato e acetato e pode aumentar o rendimento de butirato.

Em uma outra modalidade, o microrganismo é modificado por engenharia para con- verter a fonte de carbono em um produto, em que o produto é uma mistura de butirato e n- butanol. O microrganismo expressa genes para a conversão de acetil-CoA em butiril-CoA, genes para a conversão de butiril-CoA em n-butanol, e genes para a conversão de butiril- CoA em butirato.

Em uma modalidade, genes expressos para a conversão de acetil-CoA em butiril- CoA podem incluir aqueles que codificam tiolase, hidroxibutiril-CoA deidrogenase, crotona- 5 se, butiril-CoA deidrogenase, genes expressos para a conversão de butiril-CoA em n-butanol podem incluir aqueles que codificam butiraldeído deidrogenase e n-butanol deidrogenase ou um butiraldeído/butanol deidrogenase bifuncional, e genes para a conversão de butiril-CoA em butirato podem incluir aqueles que codificam fosfato butiriltransferase e butirato quinase, da forma ilustrada na Figura 27.

A razão desta mistura pode depender da disponibilidade de NADH, uma vez que

quatro moléculas de NADH são exigidas para a conversão de acetil-CoA em n-butanol, mas somente duas moléculas de NADH são exigidas para a conversão de acetil-CoA em butira- to. Portanto, para produzir uma mistura equimolar de butirato e n-butanol, três moléculas de NADH são geradas por glicose convertida em acetil-CoA.

Um método para produzir n-butanol é aqui divulgado adicionalmente, o método

compreendendo cultivar um microrganismo recombinante aqui divulgado em um meio de cultura adequado.

Em certas modalidades, o método compreende adicionalmente isolar n-butanol do meio de cultura. Por exemplo, n-butanol pode ser isolado do meio de cultura por qualquer um dos métodos reconhecidos na tecnologia, tais como pervaporação, extração líquido- líquido, ou remoção de gás (veja mais detalhes a seguir).

Em certas modalidades, o rendimento de n-butanol é o mais alto se o microrganis- mo não usar respiração aeróbica ou anaeróbica, uma vez que carbono é perdido na forma de dióxido de carbono nestes casos.

Em certas modalidades, o microrganismo produz n-butanol de forma fermentativa

em condições anaeróbicas, e assim carbono não se perde na forma de dióxido de carbono.

O termo "respiração aeróbica" significa um caminho respiratório no qual oxigênio é o aceptor de elétron final e a energia é tipicamente produzida na forma de uma molécula de ATP. O termo "caminho respiratório aeróbico" é aqui usado indiferentemente nas expres- sões "metabolismo aeróbico", "metabolismo oxidativo" ou "respiração celular".

Por outro lado, o termo "respiração anaeróbica" significa um caminho respiratório no qual oxigênio não é o aceptor de elétron final e a energia é tipicamente produzida na for- ma de uma molécula de ATP, que inclui um caminho respiratório, em que uma molécula orgânica ou inorgânica diferente de oxigênio (por exemplo, nitrato, fumarato, dimetilssulfoxe- 35 to, compostos de enxofre, tal como sulfato, e óxidos de metal) é o aceptor de elétron final. A expressão "caminho respiratório anaeróbico" é aqui usada indiferentemente nas expressões "metabolismo anaeróbico" e "respiração anaeróbica". "Respiração anaeróbica" deve ser distinguida de "fermentação". Em "fermentação", NADH doa seus elétrons a uma molécula produzida pelo mesmo caminho metabólico que produziu os elétrons conduzidos em NADH. Por exemplo, em um dos caminhos fermentati- vos de E. coli, NADH gerado por meio de glicólise transfere seus elétrons em piruvato, ren- dendo lactato.

Um microrganismo que opera em condições fermentativas somente pode metaboli- zar uma fonte de carbono se a fermentação for "equilibrada". A fermentação é dita "equili- brada" quando o NADH produzido durante as reações de oxidação da fonte de carbono i- gualar o NADH utilizado para converter acetil-CoA em produtos finais de fermentação. So- 10 mente nestas condições, todo o NADH é reciclado. Sem reciclagem, a razão NADH/NAD+ se torna desequilibrada, o que leva o organismo, essencialmente, a morrer, a menos que cami- nhos metabólicos alternativos sejam disponíveis para manter uma razão NADH/NAD+ em equilíbrio. De acordo com White, 2000 #168, "uma fermentação escrita é dita 'equilibrada' quando os hidrogênios produzidos durante as oxidações igualarem os hidrogênios transferi- 15 dos aos produtos finais de fermentação. Somente nestas condições todo o NADH e ferredo- xina reduzida são reciclados para formas oxidadas. É importante saber se uma fermentação está equilibrada, em virtude de, se ela não estiver, então, uma reação escrita geral fica in- correta.

Condições anaeróbicas são preferidas para microrganismos que produzem um alto rendimento de n-butanol.

Em algumas modalidades, um método para gerar um microrganismo recombinante aqui divulgado compreende: (1) gerar uma biblioteca de microrganismos recombinantes por: (a) introdução, nas contrapartes de microrganismos tipo selvagem, de uma ou mais sequên- cia(s) de DNA heteróloga(s) que codificam um ou mais polipeptídeo(s) que podem utilizar 25 NADH para converter acetil-CoA e um ou mais intermediário(s) metabólico(s) de um cami- nho de produção de n-butanol, (b) deleção, do genoma da contraparte de microrganismos tipo selvagem, de uma ou mais sequência(s) de DNA endógena(s) que codificam uma enzi- ma ou enzimas que consomem direta ou indiretamente NADH e intermediários metabólicos para (endógeno concorrente) fermentação anaeróbica, em que as etapas (a) e (b) são reali- 30 zadas em ambas as ordens, (2) selecionar os microrganismos recombinantes gerados na etapa (1) para um ou mais microrganismos recombinantes que podem crescer anaerobica- mente enquanto produzem n-butanol, em que a contraparte do microrganismo tipo selvagem não pode crescer anaerobicamente enquanto produz n-butanol.

No método, uma ou mais sequência(s) de DNA heteróloga(s) que codifica(m) um ou mais polipeptídeo(s) que podem utilizar NADH para converter acetil-CoA e um ou mais in- termediário(s) metabólico(s) de um caminho de produção de n-butanol são introduzidos em um microrganismo hospedeiro pré-selecionado. Também, no microrganismo hospedeiro, uma ou mais sequência(s) de DNA endógena(s) que codifica(m) uma enzima ou enzimas que competem com o caminho de produção de n-butanol para carbono e/ou NADH são de- Ietadas para tornar disponível o carbono/NADH ao um ou mais polipeptídeo(s) para a produ- ção de n-butanol ou de seus intermediários metabólicos. Então, os microrganismos recom- 5 binantes gerados como tal são sujeitos a pressão de seleção, de forma que aqueles que podem crescer mais rápido anaerobicamente enquanto produzem o crescimento de n- butanol da população e são enriquecidos.

Opcionalmente, os microrganismos recombinantes podem ser aleatoriamente mu- tagenizados através de meios reconhecidos na tecnologia, tal como pela adição de agentes 10 mutagênicos químicos, tais como etil metano sulfonato ou N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina, em culturas. Além do mais, quaisquer microrganismos produtores de n- butanol gerados pelo método em questão podem ser sujeitos a rodadas adicionais de muta- gênese e seleção para produzir cepas com maior rendimento.

Em certas modalidades, o método também pode incluir etapas para selecionar ce- pas de microrganismos tolerantes a n-butanol, tanto antes quanto depois da seleção de mi- crorganismos recombinantes que podem sobreviver no n-butanol produzido. Por exemplo, o método pode incluir uma etapa que seleciona um ou mais microrganismos recombinantes que podem crescer anaerobicamente em um meio com pelo menos cerca de 0,1 %, 0,2 %,

0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1 %, 1,2 %, 1,5 %, 1,8 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 % ou mais de n-butanol, em uma velocidade substancialmente igual àquela da contraparte do microrganismo tipo selvagem que cresce no meio sem n-butanol.

Em certas modalidades, o método para produzir n-butanol compreende cultivar um microrganismo recombinante da invenção em um meio de cultura adequado em condições de cultura adequadas.

Condições de cultura adequadas dependem da temperatura ideal, do pH ideal e de

exigências de nutriente do microrganismo hospedeiro, e são conhecidas pelos versados na técnica. Estas condições de cultura podem ser controladas por métodos conhecidos pelos versados na técnica.

Por exemplo, células E. coli crescem tipicamente em temperaturas de cerca de 25 30 0C até cerca de 40 cC e em um pH de cerca de pH 4,0 até pH 8,0. Meio de crescimento u- sado para produzir n-butanol de acordo com a presente invenção inclui meio comum, tais como caldo Luria Bertani (LB)1 meio EZ-Rich, e meio mínimo comercialmente relevante que utiliza fontes econômicas de Nitrogênio, sais minerais, elementos traços e uma fonte de car- bono definidos.

Fermentações podem ser realizadas em condições aeróbicas ou anaeróbicas, em

que as condições anaeróbicas ou microaeróbicas são preferidas durante a fase de produção de n-butanol. Em uma modalidade, a fermentação consiste em uma fase aeróbica e uma fase anaeróbica. Biomassa é produzida e as enzimas do caminho são expressas em condições aeróbicas mais eficientemente do que em condições anaeróbicas. A biotransformação, isto é, a conversão de glicose em n-butanol, ocorre durante a fase anaeróbica.

A produção de biomassa e a expressão da proteína são mais eficientes em condi-

ções aeróbicas, uma vez que o rendimento energético de uma fonte de carbono maior. Isto permite maior rendimento de crescimento, velocidade de crescimento e taxa de expressão da proteína. Estas vantagens sobrepujam os custos da desaeração do vaso de fermentação.

A quantidade de 1-butanol produzido no meio de fermentação pode ser determina- da usando inúmeros métodos conhecidos na tecnologia, por exemplo, cromatografia líquida ou cromatografia gasosa de alto desempenho.

Em algumas modalidades, é fornecido um método para produzir n-butanol que compreende cultivar todos os microrganismos recombinantes da presente divulgação por um tempo e em condições aeróbicas ou condições macroaeróbicas para produzir uma mas- sa celular, em particular, na faixa de cerca de 1 até cerca de 190 g de litro de células seca ou, preferivelmente, na faixa de cerca de 1 até cerca 50 g de litro'1 de células secas, então, alterar as condições de cultura por um tempo e em condições para produzir um ou mais bio- combustíveis e/ou precursores de biocombustível, em particular, por um tempo e em condi- ções em que o um ou mais biocombustíveis são detectáveis na cultura, e recuperar o um ou mais biocombustíveis e/ou precursores de biocombustível. Em certas modalidades, as con- dições de cultura são alteradas de condições aeróbicas ou condições macroaeróbicas para condições anaeróbicas. Em certas modalidades, as condições de cultura são alteradas de condições aeróbicas para condições macroaeróbicas. Em certas modalidades, as condições de cultura são alteradas de condições aeróbicas ou condições macroaeróbicas para condi- ções microaeróbicas.

O termo "condições aeróbicas" de uma cultura significa condições em que o oxigê- nio dissolvido na fração de líquido da cultura é 10 % ou mais em relação à saturação do ar, levando em consideração as modificações em função da variabilidade do equipamento.

O termo "condições microaeróbicas" da cultura significa condições em que o oxigê- nio dissolvido na fração de líquido da cultura é de cerca de 0,5 % até cerca de 5 % em rela- ção à saturação do ar, levando em consideração as modificações em função da variabilida- de do equipamento.

O termo "condições microaeróbicas" de uma cultura refere-se a condições em que o oxigênio dissolvido na fração líquida da cultura é de cerca de 5% a cerca de 10% de satu- ração do ar, levando em conta as modificações em virtude da variabilidade do equipamento.

A produtividade em reatores intermitentes é frequentemente baixa em virtude do tempo de parada, longa fase de latência e inibição do produto. Embora tempo de parada e fase de latência possam ser eliminados usando uma cultura contínua, o problema de inibi- ção do produto permanece. Este problema pode ser eliminado pela aplicação de técnicas de remoção de produto inédito. Além da cultura contínua, técnicas de lote alimentado também podem ser aplicadas ao processo de fermentação. Entretanto, a fermentação tem que ser 5 combinada com uma técnica de remoção de produto adequada. Além disso, sabe-se que a aplicação de cultura de célula imobilizada e reatores de reciclagem celular aumenta a produ- tividade do reator 40-50 vezes comparada aos reatores intermitentes. Um aumento na pro- dutividade resulta na redução do volume do processo e tamanho do reator, melhorando as- sim a economia do processo.

Uma das razões da baixa produtividade do reator é a baixa concentração de células

no biorreator. Em um reator intermitente, a concentração celular acima de 3 g/L é raramente atingida. Portanto, a produtividade do reator pode ser melhorada aumentando a concentra- ção celular no reator. Uma maior concentração celular pode ser atingida tanto fixando célu- las em suportes quanto em partículas de gel. Uma outra opção para aumentar a concentra- 15 ção celular é a aplicação de uma membrana que retorna células ao reator enquanto a solu- ção aquosa contendo o produto permeia a membrana.

As seguintes três subseções descrevem os diferentes reatores que podem ser ade- quados para a produção de n-butanol.

A) Lote, lote alimentado e fermentação contínua de célula livre O processo em lotes é um método simples de fermentação para a produção de n-

butanol. Durante o resfriamento do meio, dióxido de nitrogênio ou carbono é soprado atra- vés da superfície para manter o meio anaeróbico. Após a inoculação, o meio é aspergido com estes gases para misturar o inóculo.

A fermentação de lote alimentado é uma técnica industrial, que é aplicada aos pro- 25 cessos onde uma alta concentração de substrato é tóxica para a cultura. Em tais casos, o reator é iniciado em um modo de lote com uma baixa concentração de substrato (não inibitó- ria para a cultura) e um baixo volume de meio, usualmente menor que a metade do volume do fermentador. A medida que o substrato é usado pela cultura, é substituído adicionando uma solução de substrato concentrado em uma taxa lenta, mantendo por meio disso a con- 30 centração de substrato no fermentador abaixo do nível tóxico para a cultura. Neste tipo de sistema, o volume da cultura aumenta no reator com o tempo. A cultura é colhida quando o volume do líquido é aproximadamente 75% do volume do reator.

Uma vez que n-butanol é tóxico para os microrganismos recombinantes, a técnica de fermentação de lote alimentado não pode ser aplicada a menos que uma das técnicas de recuperação de produto inédito seja aplicada para separação simultânea do produto. Como resultado da redução de substrato e inibição do produto reduzido, maior crescimento celular ocorre e a produtividade do reator é melhorada. A técnica de cultura contínua pode ser usada para melhorar a produtividade do rea- tor e estudar a fisiologia da cultura em um estado estacionário. Em tais sistemas, o reator é iniciado em um modo de lote e o crescimento celular é permitido até que as células estejam na fase exponencial. Como uma precaução, não é permitido que a fermentação entre na 5 fase estacionária porque o acúmulo de n-butanol mataria as células. Enquanto as células estão na fase exponencial, o reator é alimentado continuamente com o meio e uma corrente do produto é removida na mesma vazão da alimentação, mantendo assim um volume cons- tante no reator. Correndo a fermentação desta maneira, elimina-se o tempo de parada, me- lhorando assim a produtividade do reator. Adicionalmente, a fermentação corre muito mais 10 tempo que em um processo em lotes típico.

Em uma cultura contínua, pode existir um sério problema no qual a produção de solvente pode não ser estável por longos períodos e pode finalmente declinar com o tempo com um aumento concomitante na produção ácida. Em um sistema contínuo de estágio úni- co, alta produtividade do reator pode ser obtida, mas isto ocorre à custa de baixa concentra- ção do produto quando comparada àquela em um processo em lotes.

B) Reatores contínuos de célula imobilizada

Altas concentrações celulares resultam em alta produtividade do reator. Tais siste- mas são contínuos quando o alimento é introduzido em um reator tubular no fundo com pro- duto escapando no topo. Estes sistemas são frequentemente reatores do tipo sem mistura 20 onde a inibição do produto é significativamente reduzida. Para melhorar a produtividade do reator, as células podem ser imobilizadas em partículas de tijolo de argila por absorção e atingir uma maior produtividade do reator, resultando em vantagem econômica.

C) Reatores de reciclagem de membrana celular

Os reatores de reciclagem de membrana celular são uma outra opção para melho- 25 rar a produtividade do reator. Em tais sistemas, o reator é iniciado em um modo de lote e o crescimento celular é permitido. Antes de alcançar a fase estacionária, o caldo da fermenta- ção é circulado através da membrana. A membrana permite que a solução de produto aquo- so passe, retendo ao mesmo tempo as células. A alimentação do reator e a remoção do produto (permeação) são contínuas e um volume constante é mantido no reator. Em tais 30 sistemas de reciclagem celular, as concentrações celulares de até 100 g/L podem ser atin- gidas. Entretanto, para manter as células produtivas, uma pequena sangria seria removida (<10 % de taxa de diluição) do reator.

A) Destilação

O custo de recuperar n-butanol por destilação é alto, em decorrência de sua con- centração no caldo da fermentação ser baixa em virtude da inibição do produto. Além da baixa concentração do produto, o ponto de ebulição de n-butanol é maior que o da água (118 °C). A concentração usual de solventes totais no caldo da fermentação é 18-33 g/L (usando amido ou glicose) no qual n-butanol é apenas cerca de 13-18 g/L. Isto torna a recu- peração de n-butanol por destilação intensa em energia. Uma grande quantidade de energia pode ser economizada se a concentração de n-butanol no caldo da fermentação puder ser aumentada de 10 a 40 g/L.

Para reduzir o custo da recuperação de n-butanol, inúmeras técnicas de recupera-

ção têm sido investigadas incluindo remoção de gás in situ, extração líquido-líquido, e per- vaporação. Os detalhes destas técnicas foram descritos em outros locais (ver Maddox, Bio- technol. & Genetic Eng. Revs. 7: 190, 1989; Groot et al, Processo Biochem. 27: 61, 1992; aqui incorporado pela referência). Estas técnicas podem ser aplicadas para remoção de n- 10 butanol in situ, removendo assim n-butanol do reator simultaneamente com sua produção. O objetivo é prevenir a concentração de n-butanol de exceder o nível de tolerância da cultura. O produto é subsequentemente recuperado tanto por condensação (remoção de gás ou pervaporação) quanto por destilação (extração).

B) Tecnologias economicamente possíveis alternativas Remoção de gás

Remoção de gás é uma técnica simples para recuperar n-butanol (acetona ou eta- nol) do caldo da fermentação. Tanto o nitrogênio quanto os gases de fermentação (CO2 e H2) são borbulhados por meio do caldo da fermentação seguido pela passagem do gás (ou gases) por meio de um condensador. A medida que o gás é borbulhado através do fermen- 20 tador, ele captura os solventes (por exemplo, n-butanol). Os solventes a seguir condensam no condensador e são coletados em um receptor. Uma vez que os solventes são condensa- dos, o gás é reciclado de volta no fermentador para capturar mais solventes. Este processo continua até que todo o açúcar no fermentador seja utilizado pela cultura. Em alguns casos, um removedor separado pode ser usado na remoção dos solventes seguido pela reciciagem 25 do efluente removedor que é menor em solventes. Remoção de gás tem sido aplicada satis- fatoriamente para remover solventes de uma variedade de reatores.

Para reduzir a inibição do substrato, a fermentação de lote alimentado pode ser in- tegrada com remoção de gás. Com este propósito, um reator pode ser iniciado com 100 g/L de glicose. A medida que o açúcar é consumido pela cultura, a glicose usada é substituída 30 adicionando um volume conhecido de solução de açúcar concentrado (500 g/L). O nível de açúcar dentro do reator é mantido abaixo do nível tóxico, preferivelmente menor que 80 g/L. A inibição celular que é causada pelos solventes é reduzida removendo-os por remoção de gás.

Extração líquido-líquido

Extração líquido-líquido é uma outra técnica que pode ser usada para remover sol-

ventes (por exemplo, n-butanol) do caldo da fermentação. Neste processo, um solvente de extração é misturado com o caldo da fermentação. N-butanol é extraído do solvente de ex- tração e recuperado por retro-extração em um outro solvente de extração ou por destilação.

Algumas das exigências para fermentação de n-butanol extrativa são:

1. Não tóxico para o organismo produtor

2. Alto coeficiente de partição para os produtos de fermentação

3. Imiscível e não formador de emulsão com o caldo da fermentação

4. Solvente de extração barato e facilmente disponível

5. O solvente de extração pode ser esterilizado e não apresenta riscos à saúde.

Por exemplo, óleo de milho pode ser usado como o solvente de extração. Muitos

solventes de extração de n-butanol têm sido relatados na literatura. Entre eles, álcool de oleíla parece satisfazer algumas das exigências anteriores.

A toxicidade extratante é um problema principal com fermentações extrativas. Para evitar o problema da toxicidade efetuado pelo solvente de extração, uma membrana pode ser usada para separar o solvente de extração da cultura celular. Por exemplo, em um sis- tema de reciclagem celular de fermentação contínua, o caldo da fermentação pode ser circu- 15 lado através da membrana e as bactérias retornam ao fermentador enquanto o permeado é extraído com decanol para remover o n-butanol.

Uma outra abordagem para reduzir a toxicidade e melhorar o coeficiente de parti- ção tem sido misturar um alto coeficiente de partição, alto extratante de toxicidade com um baixo coeficiente de partição, baixo extratante de toxicidade. A mistura resultante é um ex- tratante com um alto coeficiente de partição geral e baixa toxicidade. O álcool de oleíla pode ser usado com este propósito.

Pervaporacão

A pervaporação é um processo a base de membrana que é usado para remover solventes do caldo de fermentação usando uma membrana seletiva. Os líquidos ou soiven- 25 tes difundem em uma membrana sólida, deixando para trás nutrientes, açúcar e células mi- crobianas. A concentração de solventes através da membrana depende da composição da membrana e seletividade da membrana, que é uma função da concentração do solvente de alimentação.

Por exemplo, uma membrana líquida contendo álcool de oleíla pode ser sustentada 30 em uma folha fina de polipropileno microporoso de 25 mm de espessura. Os líquidos que difundiram através da membrana mostram uma seletividade de 180 comparada à seletivida- de de uma membrana de silicone de aproximadamente 45. Estima-se que, se esta membra- na de pervaporação for usada como um processo de pré-tratamento para separação de n- butanol, as exigências de energia seriam apenas 10% daquela exigida por destilação con- 35 vencional.

Para desenvolver uma membrana estável com um alto grau de seletividade, silicali- to, um absorvente, pode ser incluído em uma membrana de silicone. Isto pode melhorar o nível de seletividade da membrana de silicone-silicalito. A vida útil da membrana é de vários anos. A membrana pode ser usada tanto com soluções modelo de n-butanol quanto com caldos de fermentação.

EXEMPLOS

A presente revelação também é ilustrada nos seguintes exemplos, que são forneci-

dos como ilustração e não pretende-se que seja limitante.

Certas cepas, mencionadas na revelação e em particular descritas nos seguintes exemplos estão listadas na tabela 1.

Tabela 1: Cepas

Cepa Genótipo GEV0709 (E. coli E. coli B, gal-151, met-100, [malB+(LamS)], hsdR11, A46 WA837) CGSC 90266 GEV0768 E. coli W3110, attB:: (Sp+Iaclq+ tetR+) E. coli DH5a E. coli F endAI glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG ct>è0dlacZAM15 0(lacZYA-argF)U169, hsdRI7(rK' mK+), λ- GEV0788 E. coli W3110, AIdhA GEV0789 E. coli WA837, AIdhA GEV0800 E. coli W3110, AadhE GEV0801 E. coli W3110, ApoxB GEV0802 E. coli W3110, AfocA pfíB GEV0803 E. coli WA837, AadhE GEV0804 E coli WA837, ApoxB r GEV0805 E. coli WA837, AfocA pflB GEV0817 E. coli W3110, AackA GEV0818 E. coli W3110, Afrd GEV0821 E. coli WA837, AackA GEV0822 E. coli WA837, Dfrd GEV0914 E. coli W3110, Aldh , ApoxB, Afrd GEV0916 E. coli W3110, AgIpD GEV0917 E. coli W3110, AgIpK GEV0922 E. coli W3110, AgIpKlAgIpD GEV0926 E. coli W3110, AgIpD , AgIpK * GEV0927 E. coli W3110, AgIpD , AgIpK *, pGV1010 GEV0954 DSMZ 615 E. coli B GEV0992 E. coli W3110, AldhA, Afrd GEV01005 (E. coli E. coli F-L-rph-1 INV(rrnD, rrnE) W3110) DSMZ 5911 GEV01007 E. coli W3110, Aldh , ApoxB, AackA GEVO1034 E. coli W3110, AfdhF GEV01039 E. coli W3110, Andh, Aldh, AadhE, AfocA pflB, Afrd, A- fnr.attB:: (Sp+ Iaclq+ tetR+) GEV01043 E. coli W3110, Andh, Aldh, AadhE, AfoeA pflB, AackA, Afrd, Afnr attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+) GEV01044 E. coli W3110, Andh, ApoxB, AackA, A (fnr-ldhA), attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+) GEVO1047 E. coli W3110, AldhA, Afrd,attB:: (Sp+ Iaclq+ tetR+) GEV01054 E. coli W3110, AadhE, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+) GEV01082 E. coli W3110, AldhA, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+) GEV01083 E. coli W3110, Andh, Aldh, AadhE, Afrd, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+) GE V01084 E. coli W3110, AldhA, AadhE, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+) GEV01085 E. coli W3110, AldhA, AadhE, Afrd, AackA, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+) GEV01086 E. coli W3110, AldhA, Afrd, AackA, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+) GEV01121 E. coli W3110, Andh, Aldh, AadhE, Afrd, AmgsA, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+) GEV01137 E. coli W3110, Andh, Aldh, AadhE, Afrd, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+), AackA GEV01200 E. coli W3110, AldhA, AackA GEV01227 E. coli W3110, AIpdA GEV01228 E. coli WA837, AIpdA GEV01229 E. coli W3110, AlpdA:JpdAmut G EV01230 E. coli W3110, AlpdA::lpd.AN GEV01470 E. coli W3110, Andh, Aldh, AadhE, Afrd, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+) * GEV01493 E. coli W3110, AIdhA GEV01494 E. coli W3110, AldhA, AackA GEV01495 E. coli W3110, Aldh, ApoxB, AackA, AadhE GEV01496 E. coli W3110, Aldh, ApoxB, AackA, AadhE, AfocApfIB GEV01497 E. coli W3110, ApfIDC GEV01498 E. coli W3110, Aldh, ApoxB, AackA, AadhE, AfocApfIB, Ap- flDC GEV01499 E. coli W3110, Aldh, ApoxB, AackA, AadhE, AfocApfIB, Afrd GEV01500 E. coli W3110, Aldh, ApoxB, AackA, AfocApfIB I GEV01501 E. coli W3110, Aldh, ApoxB, AackA, ApfIDC GEV01502 E. coli W3110, Aldh, ApoxB, AackA, ApflDC, Afrd GEV01503 E. coli W3110, Afnr G E V01504 E. coli W3110, Aldh, ApoxB, AackA, ApfIDC, Afnr GEV01505 E. coli W3110, Aldh, ApoxB, AackA, ApfIDC, Afnr, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+) GEV01507 E. coli W3110, Aldh A, AadhE, AackA, AmgsA, AackA, Afrd, attB::(Sp+ Iaclq.+ tetR+) GEV01508 E. coli W3110, Aldh, AadhE, Afrd, attB::(Sp+laclq+tetR+) G EV01509 E. coli W3110, Aldh, AadhE, Afrd, AmgsA attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+) GEV01510 E. coli W3110, Aldh, AadhE, ApflB, ApfIDC, Afrd, AmgsA attB:: (Sp+ Iaclq+ tetR+)* GEV01511 E. coli W3110, Aldh, AadhE, ApflB, ApfIDC, Afrd, AmgsA attB:: (Sp+ Iaclq+ tetR+) Certos plasmídeos mencionados na revelação e usados nos experimentos descritos nos seguintes exemplos, estão listados na seguinte tabela 2.

Tabela 2 - Plasmídeos

pGV772 PLtetOI, KanR, colE1 SEQ ID NO: 1 PGV1010 PLIacOI::AA3, CmR, colEI SEQ ID NO: 1 pGV1035 P LIacO 1 :: thl(C . a.), Cm", colEI SEQ ID NO: 1 pGV1 037 PLIacO 1 ::hbd(C.a.), CmK, colEI SEQ ID NO: 2 pGV1039 PLIacOI ::thl(B.f.), Cm R1 colEI SEQ ID NO: 2 pGV1040 PLIacOI ::crt(B.f.), CmR, colEI SEQ ID NO: 2 PGV1041 PLIaeOI ::hbd(B.f.), CmK, colEI SEQ ID NO: 2 pGV1049 PLIaeOI ::crt(C.b.), CmK, colEI SEQ ID NO: 2 PGV1050 PLIaeOI ::hbd(C.b.), CmK, colEI SEQ ID NO: 2 pGV1052 PL1ae01 ::bed ::etfB ::etfA (M. elsdenii), CmK, colEI SEQ ID NO: 2 pGV1054 PLIaeOI ::thl(C.a.), CmR, colEI SEQ ID NO: 2 pGV1088 PLIaeOI ::bcd ::etfB ::etfA (C. acetobutylicum), CmR, colEI SEQ ID NO: 2 pGV1094 PL1ac01::crt(C.a.), CmR, colEI SEQ ID NO: 2 pGV1111 PLIaeOI, CmK, colEI SEQ ID NO: 3 pGV1113 PLIaeO 1 : : TER(E.g.), CmR, colEI SEQ ID NO: 3 pGV1117 PL1ae01::TER(A.h.), CmR, colEI SEQ ID NO: 3 pGV1154 PLIaeO 1 : :hbd(C.a. eo), CmR, colEI SEQ ID NO: 3 pGV1188 PLIaeO 1 ::thl(C.a.co), Cm R, colEI SEQ ID NO: 3 pGV1189 PL1ac01::crt(C.a.co), CmR, colEI SEQ ID NO: 3 PGV1190 PLIacO 1 ::thl(C.a.co) : :adhE2(C.a.) : crt(C.a. eo): SEQ ID NO: 3 :hbd(C.a.co), Amp R, p15A pGV1191 PLIacO 1 : :thl(C.a.co): :adhE2(C.a.co): crt(C.a. co): SEQ ID NO: 3 :hbd(C.a.eo), Amp R, p15A PGV1248 PLIaeOI ::fdh(C.b.), Cm R, colEI SEQ ID NO: 3 pGV1252 PLIaeOI ::MCS, Cm R, colEI SEQ ID NO: 3 pGV1272 PLIaeOI ::TER(E.g.), Cm R1 colEI SEQ ID NO: 4 pGV1278 P LtetO 1 :: lpdAmut(E. c.), Kan R1 colEI SEQ ID NO: 4 pGV1279 PLtetOI ::lpdAwt(E.c.), KanK, colEI SEQ ID NO: 4 PGV1281 PLIaeO 1 : :TER(E.g.): :fdh(C.b.), Cm R, colEI SEQ ID NO: 4 pGV1300 TER (Bulkholderia cenocepacia) Contém SEQ ID NO: 44 pGV1301 TER (Coxiella burnetti) Contém SEQ ID NO: 45 pGV1302 TER (Reinekea) Contém SEQ ID NO: 46 PGV1303 TER (Shewanella woodyi) Contém SEQ ID NO: 47 pGV1304 TER (Treponema denticola) Contém SEQ ID NO: 48 pGV1305 TER (Xanthomonas orycae orycae KACC1033) Contém SEQ iD NO: 49 PGV1306 TER (Yersinia pestis) Contém SEQ ID NO: 50 pGV1307 TER (alpha proteobacterium HTCC2255) Contém SEQ ID NO: 51 PGV1308 TER (Cytophaga hutchinsonii) Contém SEQ ID NO: 52 PGV1309 TER (Vibrio Ex25) Contém SEQ ID NO: 53 PGV1340 PL1 ac01 ::TER(Bulkholderia cenocepacia), Cm R, colEI SEQ ID NO: 5, pGV1341 PL1ac01::TER (Coxiella burnetti), Cm R1 c01n SEQ ID NO: 5. pGV1342 PLIaeOI ::TER ( Reinekea), Cm R1 colEI SEQ ID NO: 51 pGV 1343 PL1ac01 ::TER (Shewanella woodyi), Cm R1 colEI SEQ ID NO: 5' pGV1344 PL1ac01::TER (Treponema denticola), Cm R1 colE 1 SEQ ID NO: 5, pGV1345 PLIacOI ::TER (Xanthomonas orycae orycae KACC1033), SEQ ID NO: 5! Cm R, colEI PGV1346 PL1ac01::TER (Yersinia pestis), Cm R, colEI SEQ ID NO: 61 pGV1347 PLIacOI::TER (alpha proteobacterium HTCC2255), Cm', colEI SEQ ID NO: 6 pGV1348 PL1ac01::TER (Cytophaga hutchinsonii), Cm R, colE 1 SEQ ID NO: 6! pGV1349 PLIacOI ::TER (Vibrio Ex25), CmK, colEI SEQ ID NO: 6: pGV1435 PLIacOI::TER (Treponema denticola), Cm R, colEI SEQ ID NO: 6, pGV1563 PLIacOI ::DHA kinase (Citrobacter freundii), kanR, SC101’ SEQ ID NO: 6: pGV1569 Ptac, AmpR, colEI, SEQ ID NO: 61 pGV1582 Ptac::fdh (C. boidinii), AmpK, Co1E1, SEQ ID NO: 6' pGV1583 Ptac::fdh (C. boidinii)::TER (Treponema denticola), Amprt1 SEQ ID NO: 6 ColEI, Certos iniciadores mencionados na presente revelação e usados nos experimentos descritos nesta seção são listados na seguinte tabela 3.

Tabela 3 - Iniciadores

Cac_th1F AATT GAATT CTTATT ATTT AG G AG GAGTAAAACAT (SEQ ID NO:69) Cac_th1R AATTGGAT CCTTAGT CT CTTT CAACT ACGAG AGCT (SEQ IDNO:70) Cac aadF AATTGAATTCAΙΆΤΤΤ T AG AAAG AAGT GTATAl TI (SEQIDN0:71) CacaadR AATTACGCGI I rAAGGTTGTTTTTTAAAACAATT I AIAIACA (SEQ ID NO:72) Cac_bdhF AATT GAATT CATT AGAT G CTT GT ATT AAAATAATAA (SEQIDNO:73) CacbdhR AATTGGATCCTTACACAGAI I I I I IGAATATTTGTA (SEQ ID NO:74) CaehbdF AATT GAATT CATT GATAGTTT CTTTAAATTTAGGG (SEQ ID NO:75) Cac_hbdR AATTGGATCCI ΓΑΙ I I IGAAIAAICGIAGAAACCΓ (SEQIDNO:76) Cac_crtF AATTGAATTCCTATCl Al I I I IGAAGCCI ICAAI I (SEQIDNO:77) Cac_crtR AATT GGAT CCAATATTTTAGGAGGATTAGT CATGGA (SEQ ID NO:78 ) Cac_bcdF AATT GGTACCTTAATTATT AG CAG CTTT AACTT GAGC (SEQ IDNO:79) Cac_bcdR AATTGGAT CCAAAATT GAAGGCTT CAAAAATAGATAGGAG (SEQ ID N0:80 ) Cac_adhF AATT GT CGACATTTTATAAAGGAGT GTATATAAAT GAAAGTTAC (SEQ ID N0:81 ) CacadhR TTAAT CTAGATTAAAAT GATTTT AT AT AGAT A TCCT (SEQ IDNO:82) glpDchk F CCGTGGGTGAAACAGTTCTT . (SEQ ID NO:83 ) glpDchk R CGTAAGTGCGAGCGTAAT GA (SEQ ID NO:84) glpKchk_F AAAGCTCCACGCTGGTAGAA (SEQ ID NO:85) glpKchk_R GT CACGCGT CT GATAAG CAA (SEQIDNO:86) Exemplo 1: Remoção de caminhos metabólicos concorrentes do qenoma do mi- crorqanismo hospedeiro

Este exemplo ilustra a construção de cepas hospedeiras de produção de n-butanol. Caminhos concorrentes do organismo hospedeiro são caminhos fermentativos que acoplam a oxidação de NADH à produção de compostos tais como succinato, lactato, etanol, dióxido de carbono e gás hidrogênio e caminhos que competem pelo carbono a partir da fonte de carbono tais como o caminho de acetato e a produção de formato.

As cepas listadas na tabela 1 foram obtidas por deleção de genes no genoma bac- teriano. Os genes foram deletados por técnicas de recombinação homólogas. As deleções de genes foram transferidas de cepa para cepa usando transdução de fago P1. As deleções de genes foram combinadas por deleção seqüencial de genes individuais.

Cepas mães usadas para a engenharia metabólica de GEV01005 (E. coli W3110 (DSMZ 5911)) e E. coli B (DSMZ 613). Para a transferência de deleções genômicas, inser- ções e rompimentos do gene de E. coli K12 para cepa E. coli B, E. coli WA837 (CGSC 15 90266) foi usado como um hospedeiro intermediário. Durante a construção da cepa, as cul- turas foram crescidas em meio ou ágar Luria-Bertani (LB) (Sambrook e Russel, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3rd ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). A menos que de outra forma declarada, métodos padrões foram usados, tais como transdução com fago P1, PCR e sequenciamento (Miller, A short Curso in 20 Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bactéria. 1992, Cold Spring Harbor, N. Y.: Cold Spring Harbor Press; Sambrook e Russel, Molecular Cloning1 A Laboratory Manual. 3 ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). O DNA para a inserção de genes e cassetes de expressão no cromossomo de E. coli foi construído com entrançamento por método de extensão so- breposta (SOE) de Horton, Mol. Biotechnol. 3: 93-99, 1995. As integrações cromossômicas 5 e deleções foram verificadas com os marcadores apropriados e por análise de PCR, ou, no caso de integrações, por sequenciamento.

Desidroaenase D-Iactato (codificada por IdhA): A maioria dos genes que codificam a desidrogenase Iactato em E. coli (LdhA) foram deletados (nucleotídeos 11 - 898 foram deletados). As cepas resultantes contendo a deleção de LdhA são:

A deleção de LdhA foi combinada com as deleções de nuoAJN e ndh. GEV0914 foi

transduzida com um Iisado de P1 preparado a partir de GEV0788 e a cepa resultante é de- signada GEV0915. Para a construção da cepa E coli B correspondente, GEV0916 é trans- duzida com um Iisado de P1 preparado a partir de GEV0789 e a cepa transduzida é desig- nada GEV0917.

Acetato auinase A (codificada por ackA): O gene que codifica acetato quinase em

E. coli (ackA) foi rompido com uma deleção (nucleotídeos 29 - 1.062 foram deletados). As cepas contendo a deleção de ackA são GEV0817 e GEV0821.

A deleção de ackA é combinada com a deleção de LdhA. GEV01493 é transduzida com um Iisado de P1 preparado a partir de GEV0817 e a cepa resultante é designada G EV01494.

Piruvato Oxidase (codificada por poxB): O gene que codifica piruvato oxidase em E. coli (poxB) foi rompido com uma deleção em poxB (nucleotídeos 30 - 1.600 foram deleta- dos). As cepas resultantes são GEV0801 e GEV0804.

A deleção de poxB é combinada com as deleções de LdhA e ackA. GEV01494 é transduzida com um Iisado de P1 preparado a partir de GEV0801 e a cepa resultante é de- signada GEV01007.

Desidrogenase de acetaldeído/álcool (codificada por adhE): O gene que codifica o desidrogenase de álcool em E. coli (adhE) foi rompido com uma deleção (nucleotídeos -308 - 2.577 foram deletados). As cepas resultantes são GEV0800 e GEV0803.

A deleção de adhE é combinada com a deleção de IdhA, ackA e poxB. GEV01007

é transduzida com um Iisado de P1 preparado a partir de GEV0800 e a cepa resultante é designada GEVO 1495. Para a construção da cepa E. coli B correspondente GEV01211 é transduzida com um Iisado de P1 preparado a partir de GEV0803 e a cepa transduzida é designada GEV01212.

Em Saccharomyces, o piruvato é convertido em acetaldeído por piruvato descarbo-

xilase. São conhecidas pelo menos cinco álcool desidrogenases dependentes de NADH independentes que então reduzem acetaldeído a etanol. Estas são ADHI, ADH2, ADH3, ADH4, e ADH5.

Piruvato formato Iiase (codificada por o/78): O gene que codifica o piruvato formato Iiase em E. coli (pflB) foi rompido pela deleção de focA e pflB (nucleotídeos -69(focA) - 22A0{pflB) foram deletados). As cepas resultantes são GEV0802 e GEV0805.

A deleção de pflB é combinada com as deleções de LdhA, ackA, poxB e adhE. A

cepa resultante GEVO 1495 é transduzida com um Iisado de P1 preparado a partir de GEV0802 e a cepa resultante é designada GEV01496.

Piruvato formato Iiase 2 (codificada por pflDC): O gene que codifica o piruvato for- mato Iiase 2 em E. coli (pflDC) foi rompido pela deleção de pflDC (nucleotídeos -69(pflD) - 2240(pflC) foram deletados). As cepas resultantes são GEV02000 e GEV02001.

A deleção de pflDC é combinada com as deleções de LdhA, ackA,poxB, adhE e p- flB. A cepa resultante GEV01496 é transduzida com um Iisado de P1 preparado a partir de GEV01497 e a cepa resultante é designada GEVO 1498.

Fumarato redutase (codificada por frc/V. Os genes que codificam a fumarato reduta- se em E coli (frdABCD) foram rompidos com uma deleção de frdABCD (nucleotídeos - 86(frdA) - M8(frdD) foram deletados). As cepas resultantes são GEV0818 e GEV0822.

A deleção de frdABCD é combinada com as deleções de LdhA, ackA, poxB, adhE e focA-pfIB. GEV01496, é transduzida com um Iisado de P1 preparado a partir de GEV0818 e a cepa resultante é designada GEV01499.

Exemplo 2: (prognóstico) E coli recombinante modificada por engenharia para usar

uma fonte de carbono reduzido (GIiceroI) para equilibrar um caminho heterólooo de produ- ção de n-butanol

Um método para equilibrar o caminho de n-butanol em E coli é usar glicerol como uma fonte de carbono. Para crescimento em glicerol, o caminho de degradação de glicerol alternativo que evita a etapa de glicerol fosfato desidrogenase catalisada que alimenta elé- trons no agrupamento de quinona tem que ser ativo.

O caminho alternativo pode ser ativado inativando-se genes que codificam glicerol quinase e glicerol-3 -fosfato desidrogenase. O caminho torna-se mais eficiente expressando uma quinase DHA a partir de C. freundii, K. pneumonia, S. cerevisiae ou outros organismos. 30 A expressão de uma quinase DHA evita a fosforilação acoplada ao sistema fosfotransferase (PTS) de DHA1 que exige que DHA difunda da célula e entre novamente por meio do pts enquanto está sendo fosforilada.

O gene que codifica quinase DHA é clonado a partir de C. freundii utilizando a rea- ção em cadeia da polimerase e iniciadores apropriados para obter DNA de dupla fita linear do gene completo. O gene é clonado em um plasmídeo de expressão que é compatível com os plasmídeos de expressão do caminho de n-butanol.

O constructo resultante é pGV1563. GEV0926 (E coli W3110 (F-L-rph-1 INV(m?D, rrnE)), ÂglpD, AglpK) é transformado com pGV1191 e pGV1113 para a expressão do cami- nho de n-butanol (Cepa A) e GEVO 926 é transformado com pGV1191, pGV1113 e pGV1563 para expressão do caminho de n-butanol e a expressão de quinase DHA a partir de C. freundii. A cepa A (GEV0926, pGV1191, pGV1113) e cepa B (GEV0926, pGV1191, pGV1113, pGV1563) são comparadas por fermentação em garrafa de n-butanol.

As cepas AeB são crescidas aerobicamente em meio B (meio rico EZ contendo glicerol a 0,4 %, 100 mg/L de Cm, e 200 mg/L de Amp e 50 mg/L de Kan) em tubos por toda a noite a 37 0C e 250 rpm. 60 ml_ de meio B em frascos de agitação são inoculados em 2% das culturas crescidas por toda a noite e as culturas são crescidas em um OD600 de 0,6. As 10 culturas são induzidas com IPTG 1 mM e 100 ng/mL de aTc e são incubadas a 30 °C, 250 rpm por 12 horas. 50 mL da cultura são transferidos para frascos anaeróbicos e incubados a 30 °C, 250 rpm por 36 horas. As amostras são coletadas em diferentes pontos de tempo e as culturas são alimentadas com glicose e neutralizadas com NaOH se necessário. As a- mostras são analisadas com GC e HPLC.

Os resultados mostram que a cepa A produz n-butanol com um rendimento de 60%

e a cepa B produz n-butanol com um rendimento de 70%. Este exemplo mostra que uma cepa de produção com uma deleção do caminho de degradação de glicerol nativo fornece NADH suficiente para atingir rendimentos de n-butanol maiores que 50% do rendimento teó- rico. Além do mais, estes resultados mostram que a expressão de quinase DHA aumenta o 20 rendimento da produção de n-butanol a partir do glicerol em uma cepa de deleção do cami- nho de glicerol como esta.

Exemplo 3: Produção de uma E. coli recombinante capaz de metabolizar glicerol por meio de diidroxiacetona e fosfato de diidroxiacetona

Este exemplo demonstra a geração de uma cepa que converte glicerol em acetil- CoA gerando ao mesmo tempo duas moléculas de NADH por molécula de glicerol.

A cepa GEV01005 (£. coli W3110 (F-L-rph-1 INV(rrnD, rrnE))) foi usada como a cepa mãe. Os genes glpD e glpK foram deletados do genoma do hospedeiro. O knockout glpD glpK duplo foi construído por transdução de P1. A cepa resultante foi GEV0922.

GEV0922 foi submetido a um protocolo de evolução de enriquecimento, uma vez 30 que mostrou crescimento muito pobre em meios de glicerol mínimo, comparado com a cepa mãe tipo selvagem. Durante o curso de 4 semanas desta evolução de enriquecimento, que começou com 2,4 X 1012 células, o glicerol foi usado como a fonte de carbono e foi alimen- tado dia sim, dia não. O glicerol foi alimentado em uma concentração final de 2 mM, dia sim dia não para as primeiras 2 semanas, 1 mM para a terceira semana e 0,5 mM para a quarta 35 e última semana. No final deste processo, diversos mutantes foram isolados.

Consistente com o genótipo esperado, com glicerol como única fonte de carbono e energia, GEV0922, o knockout glpD glpK duplo, cresceu lentamente comparado com a cepa mãe tipo selvagem. Subsequente à evolução de enriquecimento de quatro semanas, um clone (GEV0926) que cresceu rápido em placas de glicerol M9 mínimo foi selecionado para estudo posterior. GEV0926 teve uma taxa de crescimento similar aos níveis tipo selvagem, em placas de meios mínimos com glicerol como fonte de carbono (Figura 10).

Após o processo de evolução de enriquecimento, as deleções de genes nas cepas

envolvidas foram verificadas por PCR, usando os iniciadores de PCR listados na tabela 4.

Tabela 4 - Iniciadores de PCR usados para verificar a manutenção de mudanças no DNA cromossômico

CCG TG G GTG glpD,hk_F Iniciador se liga à montante e fora do gene A 4A C~4 L, TTC TT SEQ ID NO:83 glpD para verificar gene knockout de glpD COT,4A r T GC gipDchk R: Iniciador se liga à jusante e fora do gene GAG CGTAAT GA SEQ ID NO:84 glpD para verificar gene knockout de glpD AAA OCT CCA CGC gipKonk_F Iniciador se liga à montante e fora do gene TGG TAG . ~ 1 4 8E0 ID NO:85 glpK para verificar gene knockout de glpK GTC ACG COT gipKchk R SEQ Iniciador se liga à jusante e fora do gene CTG:gipKobk_R ID N0.86 glpk para verificar gene knockout de glpk .AA ATA AGC Finalmente, tanto o GEV01005 tipo selvagem quanto o GEV0926 knockout duplo 10 envolvido no enriquecimento foram transformados com pGV1010, um plasmídeo contendo o marcador genético de resistência ao antibiótico cloranfenicol e o gene que codifica uma ce- torredutase/desidrogenase de levedura dependente de NADPH, sob controle de um promo- tor lac. Entretanto, uma vez que GEV01005 é um derivado da cepa E coli K- 12, ele tem apenas um único gene repressor Iac no cromossomo, e a produção da cetorredutase em 15 ambas as cepas é constitutiva. Nenhum indutor foi usado no crescimento das células bioca- talíticas, uma vez que foi mostrado que os níveis de expressão com e sem indutor foram aproximadamente os mesmos.

Exemplo 4: E coli recombinante modificada por engenharia para uso de uma fonte de carbono reduzido (Glicerol) para equilibrar um caminho heterólooo de produção de n- butanol

Este exemplo demonstra que um microrganismo modificado por engenharia conver- te um mol de glicerol em acetil-CoA e rende dois mols de NADH e satisfaz a exigência com relação ao NADH para utilizar glicerol para produzir n-butanol usando um caminho de pro- dução de n-butanol equilibrado. Ao contrário, uma cepa não produzida por engenharia e não modificada tipo selvagem, gera apenas um mol de NADH.

O caminho de n-butanol equilibrado exige quatro mols de NADH e dois mois de a- cetil-CoA para cada mol de n-butanol produzido. O equilíbrio redox de um caminho é crítico para atingir os rendimentos mais altos. A modificação por engenharia descrita nos exemplos 5 2 e 3 produz efetivamente um biocatalisador de E. coli que produz um total de dois mols de NADH e um mol de acetil-CoA para cada mol de glicerol metabolizado anaerobicamente em condições de não crescimento; ao contrário, a cepa tipo selvagem não modificada por enge- nharia produz apenas um mol de NADH por acetil-CoA gerado anaerobicamente em condi- ções de não crescimento, deste modo, portanto, não pode funcionar como um biocatalisador 10 eficiente para a produção de n-butanol usando glicerol como uma fonte de carbono. Verifi- cou-se que a E coli modificada por engenharia, produzida como um resultado do exemplo 3, produz ós intermediários metabólicos exigidos para funcionar como um biocatalisador com um caminho de produção de n-butanol equilibrado. Biocatálise

GEV01005 e GEV0926 foram transformados com pGV1010 e plaqueados em pla- cas LB suplementadas com 50 mg/mL de cloranfenicol para assegurar que as células manti- vessem o plasmídeo com marcador de resistência ao antibiótico cloranfenicol e o gene que codifica cetorredutase AA3 em levedura. A partir de colônias individuais três réplicas biológi- cas de culturas iniciadoras de 3 mL de M9Y + glicerol a 0,4 % foram inoculadas e crescidas por toda a noite em um incubador de agitação a 37 0C e 250 rpm. Usando 1,2 mL de cada cultura iniciadora como inóculo, uma cultura de 120 mL de M9Y + glicerol a 0,4 % foi inocu- Iada e crescida em fase estacionária a 37 0C e 250 rpm As culturas foram colhidas por cen- trifugação a 4.000 g por 15 minutos, com OD6oo sendo medido no momento da colheita. As células foram lavadas uma vez com 60 mL de meios sem fonte de carbono e nitrogênio para biocatálise (meio de biocatálise). Este meio não permite crescimento celular. A cultura foi centrifugada novamente a 4.000 g por 15 minutos, e ressuspensa em um volume de meio de biocatálise igual a 10 vezes o OD6oo no momento da colheita. Para a biocatálise anaeróbica, da primeira etapa de lavagem em diante, todo o trabalho foi realizado em condições anaeró- bicas.

A fase de crescimento antes da biocatálise foi conduzida aerobicamente em um 30 meio rico, M9Y + glicerol a 0,4 %, para promover altos ODs da colheita. Com o meio rico, em virtude da presença do extrato de levedura, as células não têm que sintetizar todas as biomoléculas de novo de glicerol como no meio mínimo. Entretanto, apesar de glpK ter sido eliminado na cepa modificada por engenharia, quantidades muito pequenas de G3P podem ser sintetizadas por meio da enzima GpsA por meio de DHAP e NAD+ para síntese de tria- 35 cilglicerol. Portanto, a deleção do gene glpK não previne a cepa GEV0926 de produzir tria- cilglicerol.

A fase de biocatálise foi realizada em meio de biocatálise anaeróbico apenas com glicerol como fonte de carbono para considerar precisamente o carbono consumido. A bio- catálise foi conduzida anaerobicamente para combinar as condições de biocatálise da fer- mentação de n-butanol e para simplificar bastante a participação de carbono complicado pela perda aeróbica de carbono por meio de dióxido de carbono. Aerobicamente, mais 5 NADH é gerado pelo metabolismo de glicerol do que pode ser usado pelo caminho, e assim, o caminho de n-butanol não seria equilibrado; acetil-CoA é perdida no ciclo TCA como CO2. Anaerobicamente, a cepa modificada por engenharia, GEV0926, produz dois mois de NADH, e assim, o caminho de n-butanol é equilibrado.

A reação de cetorredutase for usada para monitorar a disponibilidade de NADH ser gerado pelo metabolismo de glicerol, visto que uma molécula de 3-hidroxibutirato de etila enzimaticamente formada exige 1 NAD(P)H e acetoacetato de etila. Assume-se que as tran- sidrogenases de NAD(P)H convertem facilmente NADH no NADPH preferivelmente utilizado pela cetorredutase. A reação de biocatálise foi realizada como a seguir. As células ressus- pensas foram armazenadas no gelo até que estivessem prontas para ser usadas para a bio- catálise anaeróbica a 30 0C. O substrato da cetorredutase, acetoacetato de etila, foi adicio- nado à concentração 40 mM, e a reação foi iniciada com adição de glicerol a 10 % esterili- zado por filtro em uma concentração de 5,5 mM. Dependendo do experimento, as reações de fundo com substrato, mas nenhuma fonte de carbono, também foram corridas em parale- lo às reações experimentais para monitorar quaisquer metabólitos ou produto da reação enzimática quando nenhuma fonte de carbono foi alimentada. As amostras foram coletadas periodicamente, pelo menos a cada meia hora.

Ensaios: Peso seco celular

As taxas de consumo de glicerol, formação de produto e geração de metabólito fo- ram normalizadas para os pesos secos ceiuiares. Os pesos secos celulares foram determi- 25 nados coletando alíquotas de 10 mL em triplicata das células ressuspensas em tubos côni- cos de 15 mL pesados anteriormente para cada réplica biológica, centrifugando a 4.000 g por 15 minutos e descartando o sobrenadante. Os precipitados foram secos em um forno a 80 °C, resfriados, e os pesos do precipitado celular foram registrados.

Ensaios: Géis de proteína Os géis de proteína verificaram que massas celulares similares tiveram uma quan-

tidade abundante e similar da enzima cetorredutase.

Cromatoarafia analítica: preparação de amostra

As amostras da biocatálise foram preparadas por cromatografia líquida e gasosa. Em particular, as amostras em todos os experimentos foram manuseadas com o devido cui- dado para minimizar a exposição de amostras à temperatura ambiente e ar. As amostras foram congeladas a -80 0C imediatamente após todas as amostras de um dado ponto de tempo terem sido coletadas. A seguir, as amostras foram precipitadas em uma microcentrí- fuga por 15 minutos a 12.000 g sem descongelamento prévio, removidas uma vez do arma- zenamento a -80 °C. O sobrenadante foi transferido para poços individuais de uma placa de filtro de múltiplos poços (placa de filtro Pall AcroPrep 96, 0,2 micrometro GH Polipropileno) no topo de uma placa de múltiplos poços de poços profundos. Com um aspirador e um cole- 5 tor de uso específico, as amostras foram retiradas por meio dos filtros e para placas inferio- res. Cada amostra foi subsequentemente transferida para garrafas para análise cromatográ- fica líquida (LC) e análise cromatográfica gasosa (GC). Tipicamente, as amostras foram pro- cessadas na LC, e a seguir, padrão interno para análise GC foi adicionado, e análise GC foi subsequentemente realizada.

Cromatoqrafia analítica: análise LC de metabólitos ácidos, glicerol. acetoacetato de

etila e 3-hidroxibutirato de etila misturados

A fim de determinar a razão de NADH disponível por glicerol metabolizado, foi ne- cessária a quantificação de glicerol, e o produto da conversão dependente de NADH, 3- h- droxibutirato de etila. Para considerar todo o NADH gerado, quaisquer outros metabólitos 15 possíveis que foram produzidos por meio de conversões dependentes de NADH foram i- gualmente quantificados, uma vez que esses compostos refletem NADH desviados da cetor- redutase. Estes metabólitos incluem succinato e lactato. Formato e acetato são outros me- tabólitos que foram quantificados. Acetato é de particular interesse, visto que indica a dispo- nibilidade de acetil-CoA.

Os parâmetros da análise LC são realizados como descrito na tabela 5 A seguir.

Os padrões foram preparados independentemente pesando componentes sólidos ou voláteis em triplicata em frascos volumétricos de 10 mL em uma balança analítica, e a seguir conduzindo a solução até o volume com água grau HPLC ou milliQ. A preparação dos padrões foi validada conforme combinação entre as três curvas preparadas individualmente. , Os padrões foram preparados em vários dias de uso e armazenados a 4 0C entre os usos.

Cromatografia analítica: análise GC de etanol

Os parâmetros da análise GC de etanol são descritos na tabela 6 a seguir

Tabela 6: Parâmetros para análise GC Coluna: J & W DB-FFAP (Ácido nitrotereftálico modificado

Comprimento da 30 m, diâmetro da coluna, 0,32 mm, espessura do filme: 0,25 micro- coluna: metro

Volume da serin- 1 microlitro

Coluna Fase móvel: Temperatura: Detectores:

Tabela 5: Parâmetros para análise LC

BioRad Aminex 87H (coluna derivada de sulfato)

H2SO4 a 0,4 N

temperatura da coluna a 60 0C RID, UV a 210 nm ga:

Tempo de corrida: 14,7 minutos

Programa da tem- Temperatura inicial: 50 0C 8 °C/minuto a 80 °C.

peratura: 13 °C/min a 170 0C 50 °C/minuto a 220 °C.

Detector FID

Os padrões para quantificação de etanol foram preparados pesando etanol absoluto em frascos volumétricos de 10 mL em uma balança analítica e capeando imediatamente os frascos. A seguir, o frasco foi preenchido em volume com água grau HPLC ou milliQ purifi- cada. Três conjuntos de diluições preparados independentemente foram preparados e corri- 5 dos para validar os padrões. Um padrão interno de 1-pentanol foi adicionado, 50 μί, para cada mililitro de amostra preparada. O suporte da amostra da GC foi recirculado com água resfriada a 4 °C para prevenir a evaporação de voláteis da fase líquida.

A seguir, com base nos pesos secos celulares medidos, as concentrações brutas de produtos, metabólitos e taxas de consumo de glicerol foram normalizadas em peso seco celular mmol/g.

Resultados: Biocatálise anaeróbica - Determinação de NADH por glicerol. derivado de taxas O rendimento de produtos dependentes de NAD(P)H indicam que o caminho modi- ficado por engenharia produziu dois mols de NADH por glicerol versus o um mol de NADH por glicerol do caminho tipo selvagem. O seguinte explica a primeira de duas abordagens 15 que indicam que a cepa modificada por engenharia, GEVO 926, pode fornecer os intermedi- ários metabólicos necessários para produzir n-butanol com glicerol como uma fonte de car- bono.

A concentração do produto do biocatalisador formado por unidade de glicerol con- sumido foi usada como o indicador de NAD(P)H disponibilizado por metabolismo por glicerol consumido. A figura 11 ilustra o glicerol consumido por biocatálise anaeróbica. A figura 12 ilustra a quantidade de produto formado com o tempo. As taxas de formação de produto e consumo de glicerol com relação a primeira hora da reação foram calculadas por regressão linear. Durante este período, a formação de produto e consumo de glicerol foram lineares e nem a fonte de carbono nem o substrato foram limitantes. Usando as taxas desses cálculos para cada cepa, o razão produto para glicerol para cada cepa foi avaliado. Estas razões são listadas na tabela 8. Note que GEV0927 é a cepa desenvolvida, modificada por engenharia GEV0926 contendo o plasmídeo pGV1010, cujo gene cetorredutase é expresso. As taxas para formação de produto e consumo de glicerol foram normalizadas para os pesos secos celulares de cada uma das suspensões celulares de réplicas individuais usadas para cada biocatálise.

A seguir, visto que essencialmente nenhum outro metabólito que indica disponibili- dade de NADH foi observado, conclui-se que quase todos os NADH disponibilizados por metabolismo de glicerol foram utilizados pela enzima cetorredutase para formar 3- hidroxibutirato de etila. Portanto, a razão de produto formado para glicerol consumido de cada cepa é equivalente à razão de NADH por glicerol. A razão de NADH modificado por engenharia para NADH tipo selvagem por glicerol foi calculada para determinar a razão de maior disponibilidade de NADH para a cepa modificada por engenharia com relação ao tipo selvagem. O caminho modificado por engenharia funcional em GEV0926 gerou praticamen- te duas vezes a quantidade de NAD(P)H por glicerol comparado ao caminho tipo selvagem funcional em GEV01005. Sem nenhum oxigênio disponível, o caminho modificado por en- genharia poderia render teoricamente um NADH adicional com relação ao caminho tipo sel- vagem, a medida que o glicerol é metabolizado em piruvato. A eliminação da enzima GIpD ligada ao FADH2 faz com que um equivalente redutor não seja perdido para a cadeia de transporte de elétrons. Na cepa modificada por engenharia a enzima glicerol desidrogenase dependente de NADH (GIdA) transfere o equivalente redutor disponível do glicerol para NADH.

As razões produto para glicerol para cada cepa foram um pouco maiores que teori- camente esperado. Isto pode ser uma conseqüência da pequena sobre-estimativa da con- centração de produto formado. Qualquer que seja a contribuição para uma infra-estimativa de glicerol consumido ou um sobre-estimativa de produto formado, este erro sistemático 20 cancela na razão cepa a cepa. Derivada de taxas, a comparação cepa a cepa indica que dois mols de NADH estão disponíveis em GEV0926, referentes à cepa não modificada por engenharia GEV01005. A razão calculada de 1,74 +/- 0,5 está na faixa de erro da razão esperada de 2.

Uma razão produto para giicerol maior do que teoricamente esperado também po- 25 deria refletir a fonte de carbono sem ser o glicerol que foi alimentado no curso da biocatáli- se, possivelmente células autolisadas na suspensão ou metabolismo de fonte de carbono intracelular. Usando a comparação de ambas as cepas, contribuições tais como as postula- das se cancelam, supondo que os mesmos processos ocorrem em cada cepa. Se, durante a evolução de enriquecimento, a cepa modificada por engenharia tiver adquirido uma adapta- 30 ção para se diferenciar, esta comparação deve ser submetida a notificação. Discussão deta- lhada das possíveis diferenças entre as duas cepas que poderiam invalidar esta hipóteses é feita posteriormente.

A figura 13 e a figura 14 comparam o glicerol consumido com o acetato produzido por GEV01005, pGV1010, e o cepa modificada por engenharia, GEVO 927. Isto mostra que a cepa desenvolvida fornece uma porção quantitativa de acetato por glicerol consumido. Desde que o caminho de produção de n-butanol seja expresso nas células, acetil-CoA pro- duzido de glicerol pode ser convertido em n-butanol em vez de acetato. Tabela 7: Parâmetros de biocatálise anaeróbica

GEV01005, pGV1010 GEVO 927 A partir da primeira hora mmol/g-cdw/hr mmol/g-cdw/hr de dados Taxa de formação do pro¬ 0,319+/-0,026 1,67+/-0,15 duto Taxa de consumo de glice¬ 0,228 +/- 0,023 0,688 +/-0,053 rol Produto / Glicerol GEVO 927 / GEV01005, pGV1010 Razão cepa a cepa, deri¬ 1,74+1-0,50 vada das taxas Razão PIG, derivada das 1,40 +/-0,29 2,42 +/-0.47 taxas com relação a primei¬ ra hora Razão produto/glicérol, das 1,43 +/-0,11 2,83 +/-0,17 medições de ponto final Razão cepa a cepa, das 1,98 +/-0,19 medições de ponto final Resultados: Biocatálise anaeróbica - ensaio de ponto final

Em um experimento independente, uma biocatálise anaeróbica foi realizada como descrito anteriormente com a exceção de que uma quantidade Iimitante de glicerol foi ali- 5 mentada na biocatálise. Assim procedendo, independente do tempo, a quantidade de produ- to formado por glicerol total consumido refletiria a mesma razão calculada pela abordagem a base de taxas descrita anteriormente. Usando a quantidade absoluta de produto formado quando todo o glicerol é consumido em uma biocatálise anaeróbica, a razão produto para glicerol é consistente com as mudanças esperadas no metabolismo do glicerol. Como mos- 10 trado na tabela 7, a cepa modificada por engenharia GEV0927 dá origem a produtos de- pendentes de NAD(P)H, por exemplo 3-hidroxibutirato de etila, relativo a GEV01005, pGV1010, a partir da mesma quantidade de glicerol consumido.

Se nenhum outro aspecto do sistema for Iimitante e o substrato disponível para o biocatalisador estiver em excesso, mesmo se toda a fonte de carbono for consumida, a quantidade de produto dependente de NAD(P)H formado indicaria a quantidade de NADH disponibilizado por metabolismo da fonte de carbono. A fim de que o substrato nunca se torne limitante, a concentração da fonte de carbono seria menor do que a quantidade de substrato fornecido para a reação pelo número de NADH equivalentes esperados por molé- cula de fonte de carbono. Neste caso, independente do tempo, se toda a fonte de carbono 5 for consumida, então o produto formado indica a quantidade de NAD(P)H disponibilizado para o catalisador por uma dada quantidade de fonte de carbono. Isto assume as condições delineadas anteriormente, por exemplo, que nenhum equivalente de NAD(P)H está sendo desviado de outros caminhos que consomem NAD(P)H. É de se esperar que esta aborda- gem confirmasse os resultados da determinação derivada das taxas, como ocorre.

Se a fonte de carbono for limitante, a quantidade de produto formado pelo biocatali-

sador é proporcional ao NAD(P)H disponível para a célula por metabolismo desta fonte de carbono, indiferente das taxas de formação de produto ou consumo de glicerol. Equilíbrio de carbono.

Os cálculos do equilíbrio de carbono também confirmam que a maior parte do eta- nol origina-se da fonte abiótica, uma vez que incluir concentrações de etanol incorretas faria com que os cálculos do equilíbrio de carbono fossem impossivelmente altos, 7,4 a 3,5 vezes maiores para o tipo selvagem, e 4,3 a 2,4 vezes maiores para a cepa modificada por enge- nharia, em termos de % de carbono recuperado. (Ver figuras 13 e 14) O resultado que inva- lidaria a hipótese de que a cepa modificada por engenharia, GEV0926 está produzindo mais NADH por glicerol do que o tipo selvagem seria a observação de que mais metabólitos re- duzidos foram produzidos pela cepa tipo selvagem desviando NADH dos caminhos fermen- tativos, gerando produtos reduzidos do tipo etanol, succinato e lactato. Entretanto, a alta % de carbono recuperado do tipo selvagem indica que pouco NADH está sendo desviado de metabólitos reduzidos. A quantidade totai de metabólitos dependentes de NADH entre as duas cepas não foi idêntica. Entretanto, a quantidade de NADH que foi gasta para formar estes metabólitos é pequena comparada com a quantidade que foi para o biocatalisador. Em metabolismo anaeróbico, o carbono recuperado como metabólito seria igual ao carbono consumido como glicerol. Se todos os equivalentes redutores forem para o biocatalisador, então espera-se que o carbono do metabolismo mostre-se como produtos não reduzidos, acetato ou formato, que podem ser decompostos em CO2 e H2 pela ação de formato desi- drogenase. A figura 13 é um gráfico de barra do equilíbrio de carbono de GEV01005, pGV1010. A figura 14 é um gráfico de barra de equilíbrio de carbono de GEV0927.

A taxa de formação de produto pelo biocatalisador de cetorredutase dependente de NADH indica a taxa de formação de NADH por conversão de glicerol consumido se o siste- ma satisfizer certas exigências: (1) O catalisador e substrato não são limitantes, de maneira tal que a reação é de primeira ordem com relação a NADH. Isto significa que existe catalisa- dor suficiente, em termos de concentração e atividade da proteína, para converter facilmente substrato em produto, uma vez que o cofator reduzido se torna disponível na célula, uma vez que é formado por metabolismo. Se o catalisador não for suficientemente ativo, então o NADH disponibilizado será para outras enzimas que utilizam NADH, especialmente cami- nhos de fermentação. Mesmo neste cenário, os perfis de metabólitos entre as duas cepas 5 mostrariam maiores quantidades de produtos reduzidos de fermentação na cepa que produz mais equivalentes redutores.

Entretanto, os resultados indicam que quase todos os NAD(P)H estão indo para a cetorredutase, uma vez que qualquer NADH disponível mostraria metabólitos ou produtos reduzidos da conversão enzimática dependente de NADH. O NAD(P)H que é gerado por 10 metabolismo está sendo diferentemente usado para propósitos biossintéticos, uma vez que a síntese protéica é inibida pela falta de nitrogênio nos meios. NADH desidrogenases são ativas apenas em condições respiratórias, e assim a dissipação potencial é improvável nas condições anaeróbicas.

Um exemplo de uma etapa no metabolismo tipo selvagem de glicerol que seria hi- 15 poteticamente inibida pela falta de FAD+ é a desidrogenação ligada a FADH2 de glicerol- 3 - fosfato em fosfato de diidroxiacetona (DHAP) em metabolismo anaeróbico de glicerol sem aceptor de elétron exógeno. E. coli crescida anaerobicamente não metaboliza glicerol e não pode crescer sem aceptor de elétron exógeno, tal como fumarato ou nitrato. Entretanto, de maneira interessante, a biocatálise anaeróbica neste estudo revela que mesmo sem adição 20 de um aceptor de elétron conhecido, de algum modo, as células tipo selvagem consomem glicerol e geram equivalentes redutores como NAD(P)H1 refletidos pela formação de meta- bólitos e produtos reduzidos dependentes de NADPH, indicando que o metabolismo do gli- cerol está funcionando.

Note que, em virtude da inanição de nitrogênio das células no meio não crescente, 25 considera-se que as proteínas celulares são bloqueadas na maquinaria metabólica aeróbica, ainda que a célula esteja em um ambiente anaeróbico. Uma vez que a etapa que gera NADH é subsequente à etapa que exige FAD+, deve-se concluir que FAD+ é disponível pa- ra a conversão de G3P em DHAP, ou que os equivalentes redutores por meio da cadeia de transporte de elétrons estão sendo movimentados de algumas maneiras desconhecidas. 30 Outros estudos têm relatado casos nos quais não foi possível determinar como a célula fun- cionava em condições anaeróbicas, uma vez que nenhum aceptor terminal de elétron pode- ria ser identificado, mas o crescimento ocorreu indiferentemente. (Crescimento anaeróbico em glicerol capacitado por genes de K. pneumoniae).

A tabela 8 descreve as fórmulas de meios usados nos exemplos revelados.

Tabela 8 - Fórmulas dos meios

M9Y + glicerol a 0,4%, 1L

200 mL Sais M9 2 mL 0,1 mL mL 100mL 678 mL

MgSO4, 1Μ CaCI2, 1Μ Glicerol a 20 %

Extrato de levedura (20 g/L) H2O milliQ

Meio de biocatálise: M9M (- carbono/ - amônio), 1L

200 mL 2 mL 10mL mL 1 mL 0,1 mL Sais de M9 64 gramas gramas 2,5 gramas gramas

Sais M9 a/o NH4CI MgSO4lIM

Solução de vitamina VA Tiamina a 0,0324 %

Estoque de micronutriente, 100X CaCI2, 1M

Na2HP04*7H20

KH2PO4

NaCI

NaCI (não incluído em meios sem nitrogê- nio)

Tiamina 0,02 M Pantotenato 0,02 M Ácido p-aminobenzóico 0,02 M Ácido p-hidroxibenzóico 0,02 M Ácido diidroxibenzóico0,02 M H2O milliQ

Solução de vitamina VA 100X, 500 mL mL mL mL mL mL 375 mL

Estoque de micronutriente, em 50 mL de volume total de H2O milliQ NH4 molibdato * H2O 0,009 gramas

Ácido bórico 0,062 gramas

Cloretodecobalto 0,018 gramas

Sulfato cúprico 0,006 gramas

Cloreto de manganês 0,040 gramas

Sulfato de zinco 0,007 gramas

Exemplo 5: Evolução in vivo de E. coli para expressão funcional de piruvato desi- drogenase em condições anaeróbicas

Uma maneira de equilibrar o caminho de n-butanol em E. coli é produzir um produto do gene pdh anaerobicamente ativo. Para produzir tais cepas, pode-se usar um sistema de seleção que acopla o equilíbrio redox e, portanto, o crescimento desta cepa de E. coli com atividade anaeróbica de Pdh. Por exemplo, pode-se construir uma cepa que contenha knoc- kouts nos caminhos de fermentação para deixar apenas o caminho de produção de etanol intacto resumido na figura 4. Uma cepa como esta não pode crescer anaerobicamente em 5 meio mínimo de glicose, uma vez que o equilíbrio redox não pode ser mantido. Dois NADH por glicose são produzidos na glicólise e quatro NADH têm que ser oxidados no caminho de etanol. Uma mutação que induz a atividade Pdh anaeróbica equilibra o metabolismo e per- mite o crescimento anaeróbico em glicose.

Construção de cepa para o sistema de seleção: GEV01007 é adequado para este sistema de seleção. A cepa cresce muito lentamente no meio mínimo de glicose (M9). Para cepas que não crescem em todo o meio mínimo de glicose, knockouts adicionais de frd e de pflB são adicionados a estas cepas cepas. Além do mais, um Pfl silencioso codificado por pflDC em E. coli foi deletado para evitar sua ativação mutacional sob pressão de seleção.

Piruvato formato Iiase (codificada por pflB). GEV01007 é transduzida com um Iisa- do de P1 preparado a partir de GEV0802, e a cepa resultante é designada GEVO 1500.

Piruvato formato Iiase 2 (codificada por pflDC): GEV01007 é transduzida com um Iisado de P1 preparado a partir de GEV01497, e a cepa resultante é designada GEV01501.

Fumarato redutase (codificada por frd): GEV01501 é transduzida com um Iisado de P1 preparado a partir de GEV0818 e a cepa resultante é designada GEV01502. Para a construção da cepa E. coli B correspondente, GEVO 1225 é transduzida com um Iisado de P1 preparado a partir de GEV0822 e a cepa transduzida é designada GEV01226. Caracte- rização de cepas para seleção: 3 mL de culturas LB de GEV01007 e GEV01501 inoculadas de placas LB1 e incubadas a 37 0C e 250 rpm por toda a noite. Estas culturas são usadas para inocular culturas M9 de primeiro passe (3 mL) a 5%. As culturas M9 são incubadas a 37 0C e 250 rpm por todo o dia. As culturas M9 aeróbicas crescidas por todo o dia são usa- das para inocular culturas M9 de segundo passe por toda a noite a 2%. Os tubos são incu- bados a 37 0C e 250 rpm. As culturas M9 crescidas por toda a noite são usadas para inocu- lar culturas M9 aeróbicas de terceiro passe (3 mL) a 2%. As culturas M9 crescidas por toda a noite também foram usadas para inocular tubos anaeróbicos com meio M9 a 5%. Os tubos foram incubados a 37 0C e 250 rpm. No tubo anaeróbico, GEV01007 mostra crescimento lento em um OD de 0,2 após 2 dias de incubação. GEV01501 não cresce nos tubos anae- róbicos.

Cepas GEV01007 e 1501 foram riscadas em placas M9 e as placas foram incuba- das anaerobicamente em uma jarra anaeróbica a 37 °C. Nenhuma das cepas produziu colô- nias visíveis após 3 dias de incubação.

Evolução in vivo: As culturas anaeróbicas de GEV01007 são transferidas diaria- mente diluindo 1:100 em 10 mL de caldo fresco contendo glicose como a única fonte de car- bono. As culturas são incubadas por 24 horas a 37 0C sem agitação. Para enriquecer para a atividade Pdh anaeróbica, as culturas são diluídas e espalhadas em meio sólido contendo gluconato como a única fonte de carbono uma vez por semana. As placas são a seguir in- cubadas em um ambiente anaeróbico. As colônias que crescem muito rapidamente são 5 descartadas no caldo fresco tratado como descrito anteriormente. Este processo é repetido iterativamente até que nenhum aumento adicional na taxa de crescimento seja observado.

Exemplo 6: Mutaaênese sítio dirigida e evolução dirigida de IodA

Deidrolipoato desidrogenase (codificada por IpdA) é a subunidade do complexo de multienzimas Pdh que se liga a NADH. Sua mutagênese pode induzir variantes que aliviam 10 a inibição de Pdh em altas razões NADH/NAD típias do metabolismo anaeróbico. Com este propósito, o gene IpdA no cromossomo de E coli é deletado e substituído por IpdA , que é tanto expresso por um plasmídeo quanto pelo cromossomo.O gene IpdA foi clonado no vetor pCRBIunt (Invitrogen) do DNA genômico preparado a partir de E. coli W3110 e sequenciado. O plasmídeo pCRBIpdA resultante foi usado como o molde para mutagênese sítio dirigida 15 do códon 55, que é parte da bolsa de ligação de NADH. A seqüência de IpdA foi mutageni- zada por SOE para produzir a mutação A55V (Horton, supra).

Em uma mutagênese paralela, PCR foi realizada para produzir as mutações A55V, I, L, F (Horton, supra).

O gene que codifica o deidrolipoato desidrogenase em E. coli (IpdA) é rompido pela deleção de nucleotídeos 107- 1400 do gene. As cepas resultantes são GEV01227, e GEV01228.

Para a construção da substituição de IpdA com IpdA mutado, o gene foi amplificado de pCRB/pdAmut ou pCRB/pdAN usando iniciadores de PCR. Os genes IpdA mutados fo- ram inseridos no genoma de GEV01227 A cepa resultante GEV01229 contém IpdA, JpdA- mut mutados e a cepa resultante GEV01230 contém IpdA1 IpdAN mutados no lugar do gene IpdA tipo selvagem.

Exemplo 7: Desregulagem da expressão de pdh

A expressão do complexo de multienzimas Pdh é regulada no nível transcricional pelos reguladores ArcA e Fnr em resposta a anaerobiose. A fim de evitar infrarregulagem da expressão do gene pdh em condições anaeróbicas, o gene que codifica o regulator Fnr (fnr) é deletado do genoma de E. coli.

Regulador dual transcricional Fnr:

O gene que codifica o regulator de resposta Fnr em E coli (fnr) é rompido com uma deleção (nucleotídeos -87 - 646 foram deletados), resultando na cepa GEVOI 503. A dele- ção de fnr é combinada com a deleção de IdhA, ackA, poxB, pflB, e frd.

A cepa GEV01501 é transduzida com um Iisado de P1 preparado a partir de GEV01503 e a cepa resultante é designada GEVO 1504. Otimização do nível de expressão do caminho de n-butanol O nível de expressão dos genes do caminho de n-butanol no operon sintetizado é modificado usando o promotor indutível PLtetOI e PLIacOI. Em E. coli W3110 tipo selvagem, PLtetOI é constitutivo, uma vez que o repressor tetR não está presente na célula. O promo- tor PLIacOI não é completamente reprimido pelo repressor codificado pelo gene cromossô- mico lacl, que limita a faixa regulatória deste promotor. A cepa GEVOI 504 é transduzida com um Iisado de P1 preparado de DH5aZ1, e a cepa resultante é designada GEV01505. Exemplo 8: (prognóstico) Expressão heteróloaa de formato Desidrogenase A formato hidrogênio Iiase independente de cofator nativo é substituída por um Fdh dependente de NADH descrito (Berrios-Rivera et al., Metabol. Eng. 2002: 217-229, 2002).

Exemplo 9: Expressão heterólooa de genes de Clostridium acetobutvlicum para a conversão de Acetil-CoA em n-Butanol

Um conjunto de genes que pode ser usado para expressão heteróloga do caminho de fermentação de n-butanol em E coli codifica tiolase (thl), hidroxibutiril-CoA desidrogena- 15 se (hbd), crotonase (erf), butiril-CoA desidrogenase (bcd), proteínas d etransferência de elé- trons (etfA e etfB), e desidrogenase de álcool (adhE2). O gene que codifica desidrogenase de álcool (adhE2) pode ser substituído tanto por genes que codificam butiraldeído desidro- genase (bdhA/bdhB) quanto por gene que codifica n-butanol desidrogenase (aad).

A expressão de cada proteína em E. coli foi então primeiro testada e sua atividade calibrada.

Calibracão de ensaios de atividade para cada enzima: Os genes anteriores são primeiro clonados individualmente do DNA genômico de Clostridium acetobutylicum ATCC 824 que foi obtido comercialmente. Usando o iniciador senso e anti-senso listado na tabela 3, cada gene é amplificado por PCR a partir do DNA genômico e clonado individualmente no 25 vetor pZE32 usando sítios de enzima de restrição apropriados. Os genes junto com seus ribossomos nativos ligando sítios são clonados em um promotor fago Iambda (Puac) modifi- cado (Lutz et al, Nucleic Acids Res. 25: 1203-1210, 1997). Os genes são a seguir expressos em células de E. coli e ensaiados para atividade.

O vetor pZE32 que carrega o gene respectivo é transformado em células de E coli 30 W3110 eletrocompetentes por eletroporação. As células transformadas são crescidas tanto aerobicamente quanto anaerobicamente em 50 mL de meio Luria Bertani (LB) com 0,1 mg/mL de ampicillina. Na fase de crescimento mid-log, as células são induzidas com 0,1 mM de IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida). Após as células alcançarem a fase estacio- nária, os transformados são colhidos por centrifugação. A atividade das enzimas é monito- 35 rada usando ensaios específicos de enzima (Boynton et al, J. Bacteriol. 178(11): 3015-3024, 1996; Bermejo et al, Applied e Environmental Microbiology 64: 1079-1085, 1998).

As células crescidas em condições anaeróbicas são ressuspensas em tampão de ácido 4-morfolina-propanossulfônico (MOPS) 50 mM (pH 7,0) contendo 1,4-ditiotreitol 1 mM. A suspensão celular é sonicada em potência a 60% por 9-15 minutos. Os restos celulares são removidos por centrifugação a 30.000 g por 30 minutos a 4 °C. O sobrenadante é testa- do quanto a atividade da enzima. As células crescidas em condições anaeróbicas são res- 5 suspensas em tampão MOPS anaeróbico na ausência de 1,4-ditiotreitol. As suspensões celulares são tratadas com lisozima, e a seguir rompidas por vortexação vigorosa por 10 minutos dentro da câmara anaeróbica a O °C. A amostra é centrifugada a 9.000 g por 20 minutos para separar o Iisado e o precipitado. A suspensão é firmemente capeada durante a centrifugação. Após a centrifugação, o sobrenadante é transferido para ampolas que são 10 hermeticamente seladas para prevenir contato com o ar (Boynton et al, J. Bacteriol. 178: 3015-3024, 1996). , ,

As células são ensaiadas com relação a tiolase usando a reação de tiólise. A rea- ção de tiólise é acoplada em temperatura ambiente para a arsenólise de acetil-CoA com o auxílio de fosfotransacetilase. Cada ensaio contém Tris cloridrato 67 mM (pH 8,0), CoA não 15 combinada 0,2 mM, acetoacetil-CoA 0,2 mM, arsenato de potássio 25 mM (pH 8,1) e 2U de fosfotransacetilase. A reação é iniciada pela adição de acetoacet-CoA. A redução na absor- bância a 232 nm que resulta da clivagem da ligação acyl-CoA é monitorada. Uma unidade de enzima é definida como a quantidade de enzima que catalisa a clivagem tiolítica de 1 Mmol de acetoacetil-CoA por minuto por mg de proteína (Petersen et al, Applied and Envi- 20 ronmental Microbiology 57: 2735-2741, 1991).

A atividade de Hbd é determinada monitorando a taxa de oxidação de NADH, me- dida pela redução na absorbância a 340 nm, com acetoacetil-CoA como o substrato (Boyn- ton et al, Journal of Bacteriology 178: 3015-3024, 1996). Uma reação controle é realizada na ausência do substrato para monitorar a atividade de fundo. A atividade da crotonase é anali- 25 sada observando a redução na absorbância de crotonil-CoA na faixa de absorção específica a 263 nm (Boynton et al, Journal of Bacteriology 178: 3015-3024, 1996). A atividade de Bcd é monitorada acoplando a oxidação de NADH á redução de crotonil-CoA. O ensaio conterá em um volume final de 1 mL, crotonil-CoA 30 μΜ, fosfato de potássio 60 mM pH 6,0 e NADH 0,1 mM. A redução na absorbância a 340 nm de NADH é usada para estabelecer a atividade 30 de Bed, EtfA e EtfB (Becker et al, Biochemistry 32: 10736-10742, 1993). A atividade de Aad, AdhE2 e BdhA/B é determinada medindo a taxa de oxidação de NADH na presença de seus respectivos substrato, a saber, butiraldeído ou butiril CoA.

A concentração protéica é medida pelo método de ligação de corante de Bradford com albumina sérica bovina (Bio-Rad) como o padrão. Para cada enzima, as unidades da atividade em E. coli tipo selvagem são estabelecidas, onde uma unidade é a quantidade de enzima que converte 1 pmol de substrato em produto em 1 minuto.

Exemplo 10: Expressão heteróloqa de genes de Clostridium acetobutvlicum otimi- zados por códon para a conversão de acetil-CoA em n-Butanol

A otimização do códon de genes para a expressão do hospedeiro aumenta tanto a expressão protéica quanto estabilidade (Gustafsson et al, Trends Biotechnol. 22: 346-353, 2004). Para melhorar a expressão dos genes (Figura 2) de C. acetobutylicum, o genes fo- 5 ram otimizados no códon para E. coli e sintetizados comercialmente. Para expressão do caminho completo em E. coli, os genes são expressos usando um sistema de dois plasmí- deos. Os genes thl, hbd, crt e adhE2 são expressos como um único transcrito (Figura 5), enquanto os genes bcd, etfA e etfB são expressos juntos como um segundo transcrito (Figu- ras 6 e 7). O dois plasmídeos (Figuras 8 e 9) são transformados separadamente e juntos em 10 células de E. coli e testados quanto a atividade.

Expressão de thl. adhE2. crt e hbd: Os genes thl, adh, crt e hbd de C. acetobutyli- cum são sintetizados como um único transcrito (seq tach) com sítios de enzima de restrição únicos flanqueando cada gene (Figura 5). Os genes são códons otimizados usando o algo- ritmo de otimização do códon prioritário do Codon Devices, Inc. (Cambridge, MA). O sítio de 15 ligação de ribossomo nativo é localizado a jusante de cada gene. O fragmento contendo os quatro ORFs é clonado no vetor pZA11 (Lutz et al, Nucleic Acids Res. 25: 1203-1210, 1997, Figura 8) usando sítios de enzima de restrição EcoRI e BamHI disponíveis no vetor MCS.

Este vetor carrega origem de replicação p15A, um promotor fago Iambda modifica- do (P|_-tet) e um gene de resistência à ampicilina. O fragmento seq tach é clonado à montante 20 do promotor PL.tet. O plasmídeo pZA11 seq tach é transformado em células de E coli W3110 por eletroporação. Os transformados são crescido aerobicamente ou anaerobicamente em 50 mL de meios Luria Bertani (LB) contendo 0,1 mg/mL de ampicilina a 37 °C. Na fase mid- log, a expressão do gene é induzida usando 100 ng/mL de anidrotetraciclina. As células são colhidas 24 horas após a indução por centrifugação a 4.000 g por 15 minutos. As células 25 colhidas são ressuspensas em tampão de ácido 4- morfolinopropanossulfônico (MOPS) 50 mM (pH 7,0) contendo 1,4-ditiotreitol 1 mM. A suspensão celular é sonicada em potência a 60% por 9 a 15 minutos. Os restos celulares são removidos por centrifugação a 30.000 g por 30 minutos a 4 °C. O sobrenadante é testado quanto a expressão e atividade da enzima.

A expressão de cada enzima é monitorada por eletroforese SDS-PAGE (Sambrook, 2001 #172) comparando amostras de cultura coletadas antes e após a indução. A atividade de Crt, Thl, Hbd e AdhE2 é determinada usando ensaios específicos de atividade da enzima resumidos anteriormente.

Expressão de bcd. etfA e etfB: Os genes bcd, etfA e etfB de C. acetobutylicum (seq Mbab) e de M.elsdenii (seq Mbab) são sinstetizados em dois constructos separados resumi- dos nas figuras 6 e 7, respectivamente. Os genes otimizados por códon usando o algoritmo de otimização do códon prioritário de DNA 2,0, Inc. O sítio de ligação de ribossomo e regi- ões intergênicas são mantidos idênticos ao operon nativo de Clostridium (Boynton et al, Ap- plied and Environmental Microbiology 62: 2758-2766, 1996). Ambas as seqüências são clo- nadas no vetor pZE32 (Lutz et al, Nucleic Aeids Res. 25: 1203-1210, 1997, Figura 9) usando os sítios de enzima de restrição EeoRI e BamBI disponíveis no vetor MCS. Este vetor carre- ga origem de replicação ColEI, um promotor fago Iambda modificado (PL-iac) e gene de re- 5 sistência ao cloranfenicol. Os fragmentos seqCbab e seqMbab são clonados individualmente à jusante do promotor PL-iac.

Os plasmídeos seqCbab-pZE32 e seqMbab-pZE32 são transformados em células de E. coli- W3110 por eletroporação. Os transformados são crescidos anaerobicamente em 50 mL de meios Luria Bertani contendo 0,05 mg/mL de cloranfenicol a 37 °C. NA fase mid- 10 log, a expressão do gene é induzida usando IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida) 1 mM. As células são colhidas 24 horas após a indução por centrifugação a 4.000 g por 15 minutos e ressuspensas em tampão MOPS anaeróbico na ausência de 1,4-ditiotreitol. A suspensão celular é tratada com Iisozima e a seguir interrompida por vortexação vigorosa por 10 minutos dentro da câmara anaeróbica a 0 °C. A amostra é centrifugada a 9.000 g por 15 20 minutos para separar o Iisado e o precipitado. A suspensão é firmemente capeada duran- te a centrifugação. Após a centrifugação, o sobrenadante é transferido para ampolas que são hermeticamente seladas para prevenir contato com o ar.

A expressão de bcd, etfA e etfB é monitorada por eletroforese SDS-PAGE (Sam- brook, 2001 #172) comparando amostras de cultura coletadas antes e após a indução. A 20 atividade de Bcd é monitorada acoplando a oxidação de NADH à redução de crotonil- CoA. O ensaio conterá em um volume final de 1 mL, crotonil-CoA 30 μΜ, fosfato de potássio 60 mM pH 6,0 e NADH 0,1 mM. A redução na absorbância a 340 nm de NADH é usada para estabelecer a atividade de Bcd, EtfA e EtfB (Boynton et al., Applied and Environmental Mi- crobiology 62: 2758-2766, 1996; O1NeiII etal., J. Biol. Chem. 273(33): 21015-21024, 1998). 25 Expressão de caminho completo: Os plasmídeos seqCbab-pZE32 e seqtach-pZA11

são transformados nas células de E coli-W3110 por eletroporação. Os transformados são crescidos anaerobicamente em 250 mL de meios Luria Bertani contendo 0,05 mg/mL de cloranfenicol e 0,1 mg/mL de ampicilina a 37 °C. Na fase mid-log, a expressão do gene é induzida usando IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosida) 1 mM e 100 ng/mL de anidro- tetraciclina.

Em 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a indução, as amostras são coletadas e analisadas com relação a uma variedade de propriedades. 2,5 mL das células são colhidos por centrifugação a 4.000 g por 15 minutos e ressuspensos em tampão MOPS anaeróbico na ausência de 1,4-ditiotreitol. A suspensão celular é tratada com Iisozima e a seguir rompi- 35 da por vortexação vigorosa por 10 minutos dentro da câmara anaeróbica a 0 °C. A suspen- são é firmemente capeada durante a centrifugação. Após a centrifugação, o sobrenadante é transferido para ampolas que são hermeticamente seladas para prevenir contato com o ar. O Iisado é a seguir testado quanto a expressão protéica e atividade da enzima da maneira resumida anteriormente. A concentração de glicose e metabólitos no meio de reação é ana- lisada por cromatografia líquida de alto desempenho (Causey et al, Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 100: 825-832, 2003) de acordo com protocolos padrões. A concentração de n-butanol 5 e outros intermediários de caminho é medida por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) de acordo com procedimentos estabelecidos (Fontaine, 2002 #5). Razões de molé- culas de n-butanol formadas para molécula de glicose consumida são calculadas a partir destes dados. A análise da expressão, da atividade e do produto anterior é repetida nas ce- pas GEVAs modificadas por engenharia. Com os caminhos fermentativos nocauteados, as 10 células podem crescer apenas com um caminho de n-butanol ativo.

Exemplo 11: (prognóstico) Movimento do Caminho de genes homólogos em Clos- tridium acetobutylicum para a conversão de acetil-CoA em n-butanol

Para cada uma das enzimas que catalisam as reações metabólicas que vão de ace- til-CoA a n-butanol, foram identificados diversos homólogos a partir de uma variedade de organismos. A fim de avaliar a adequação destas enzimas alternativas e de todas as combi- nações destas enzimas para a produção de DNA de n-butanol, todas as combinações pos- síveis das enzimas do caminho podem ser expressas de construções de DNA separados.

O caminho de n-butanol é sintetizado como dois operons expressos primeiro de dois plasmídeos (pZE32 e pZA11). Os genes thl, crt, adh e hbd são expressos a partir de 20 pZA11 sob controle do promotor PLtetO e os genes bcd, etfB e etfA são expressos a partir de pZE32 sob controle do promotor PlacOI. A biblioteca contém todas as combinações dos genes homólogos descritos anteriormente com a exceção de etfA e etfB que são sempre do mesmo organismo. Todos os genes homólogos são otimizados por códon para a expressão na E. coli hospedeira. Todos os genes são precedidos por suas seqüências SD e UTR nati- 25 vas. As bibliotecas de plasmídeo são transformadas em GEVO 1505.

As colônias das placas de seleção desta transformação são lavadas da placas e a biblioteca da cepa resultante é usada para inocular culturas em 9 LB contendo os indutores anidrotetraciclina (aTc) e IPTG em diferentes concentrações (IPTG 0,01, 0,1, 1 mM x 1, 10, 100 ng/mL de aTc). Após 24 horas de incubação a 37 0C e 250 rpm em um incubador de 30 agitação, estas culturas são usadas para inocular 9 tubos contendo meio definido com glico- se como a única fonte de carbono. Após 12 horas de incubação a 37 0C e 250 rpm em um incubador de agitação, as culturas são usadas para inocular 100 mL do mesmo meio, e os níveis indutores em tubos anaeróbicos para um OD inicial de 0.1. Os tubos são incubadas a 37 0C e 250 rpm em um incubador de agitação.

A taxa de crescimento anaeróbico das cepas depende da expressão funcional do

caminho de n-butanol. Os elementos da biblioteca de caminho combinatório que permitem crescimento mais rápido em condições anaeróbicas são selecionados por diluição em série dos tubos anaeróbicos.

Exemplo 12: (prognóstico) Evolução In vivo de E.coli recombinante para aumentar a taxa de produção de n- butanol

Culturas anaeróbicas de E. coli contendo o caminho de n-butanol completo são 5 transferidas diariamente diluindo 1:100 em 10 mL de caldo fresco contendo glicose como a única fonte de carbono. As culturas são incubadas por 24 horas a 37 0C sem agitação. Uma vez que a taxa de crescimento está correlacionada com as taxas de produção de n-butanol, enriquecimento para aumentar as taxas de produção de n-butanol é obtido diluindo culturas e espalhando-as no meio sólido contendo glicose como a única fonte de carbono uma vez 10 por semana. As placas são em seguida incubadas em um ambiente anaeróbico. Colônias que crescem mais rapidamente são descartadas em caldo fresco e tratadas da maneira descrita anteriormente. Este processo é repetido iterativamente até que nenhum aumento adicional na taxa de crescimento seja observado.

Exemplo 13: Teste de E. coli para resistência a n-butanol Butanol inibe o nível máximo de crescimento celular da produção de n-butanol não

apenas em Clostridium acetobutylicum mas também em E. coli. Experimentos iniciais foram realizados para determinar o nível de toxicidade de n-butanol em células E. coli. Células DH5a E. coli foram usadas nestes experimentos.

Resumidamente, 50 mL de meio LB em 250 mL frascos Erlenmeyer inutilizados fo- 20 ram suplementados com 0 a 5 % de n-butanol em 0,5 % de incrementos. Taxas de cresci- mento e OD6OO máximo foram determinados após inoculação com 500 pL de uma cultura por toda a noite. A 0,5 % de n-butanol, a taxa de crescimento e OD6OO máximo foram dividi- das aproximadamente ao meio. A 1 % de n-butanol, as taxas de crescimento não seriam quantificadas, e o OD6OO máximo foi cerca de 40 vezes menor.

Exemplo 14: Evolução in vivo de E. coli para aumentar resistência a n-butanol

Para aumentar o nível de tolerância a n-butanol, culturas anaeróbicas de culturas E. coli são transferidas diariamente diluindo 1:100 em 10 mL de caldo fresco contendo n- butanol e glicose. Estas culturas são incubadas por 24 horas a 37 0C sem agitação. Uma vez que as culturas aumentaram de densidade durante as transferências subsequentes, 30 concentrações de n-butanol são progressivamente aumentadas para selecionar mutantes resistentes. Uma vez por semana, as culturas são diluídas e espalhadas no meio sólido para enriquecer mutantes resistentes a n-butanol. As colônias que crescem mais rápido são des- cartadas dessas placas e usadas para inocular o meio fresco. Estas culturas são em segui- da tratadas da maneira descrita anteriormente. A concentração de n- butanol inicial no meio 35 é 0,5 %. A cada semana, esta concentração é aumentada por 0,1 %. isto é repetido até que nenhum aumento adicional em tolerância de n-butanol torne-se aparente.

Exemplo 15: Microorganismos recombinantes oue expressam um caminho de n- butanol otimizado - BCD / CCR / TER E. aracilis / treponema

Enzimas alternativas para a etapa de butirilCoA desidrogenase no caminho de n- butanol foram testadas. Bed1 EtfB1 e EtfA de Megasphaera elsdenii e Bed1 EtfB1 e EtfA de Clostridium acetobutylicum não renderam nenhum n-butanol nos experimentos de fermenta- 5 ção. Crotonil- CoA redutase (Ccr) de Streptomyces collinus foi funcionalmente expresso e foi ativo em experimentos de fermentação de n- butanol. Trans-2-Enoil-CoA Redutase (TER) de Euglena gracilis foi mais ativo em experimentos de fermentação de n-butanol do que Ccr de Streptomyces collinus.

Também, TER de Euglena gracilis foi mais ativo em experimentos de fermentação 10 de n-butanol do que TER de Aeromonas hydrophila. Isto foi observado após os experimen- tos onde GEV0768 (W311 OZI ) foi transformado com pGVI 191 e pGVI 113 (TEREg - Eu- glena gracilis) e pGV1117 (TERAh - Aeromonas hydrophila) respectivamente. Os transfor- mantes foram comparados por fermentação de n-butanol. Os resultados são ilustrados na Figura 15. A produtividade média da cepa com o TERAh foi 1,6*10- g/L/h e a produtividade 15 média da cepa com o TEREg foi 3,2*10"4 g/L/h.

Adicionalmente o homólogo TER bacteriano de Treponema denticola foi mais ativo na fermentação de n-butanol do que TER de Euglena gracilis. Isto foi observado após os experimentos em que os 10 genes que codificam homólogos TER bacterianos de Coxiella burnetii, alpha proteobacterium HTCC2255, Bulkholderia cenocepacia, Cytophaga hutchin- sonii, Reinekea, Shewanella woodyi, Treponema denticola, Vibrio Ex25, Xanthomonas ory- cae KACC 10331 e Yersinia pestis serem otimizados no códon para expressão em E. coli e sintetizados. Os genes TER foram clonados em um vetor pGV1252 que é compatível com o caminho de n-butanol e assegura baixa expressão do TER com relação aos outros genes do caminho. Os derivados de pGV1252 pGV1272, pGV1300-1309 e pGV1190 foram usados como um sistema de dois vetores modificados que permitem a comparação dos genes TER em condições que renderam atividade TER limitante para o caminho. GEVO 1121 (E. coli W3110, Andh, Aldh, AadhE, Afrd, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+), AmgsA) foi usado como a cepa hospedeira para a fermentação para testar os homólogos. Os 10 clones foram testados em dois experimentos de fermentação em garrafa independente com pGV1272 (TER - Euglena gracilis) como controle.

Os resultados ilustrados nas Figuras 16 e 17, mostraram que o homólogo bacteria- no da Treponema denticola (pGV1344) aumentou a titulação final da fermentação 4 vezes e aumentou a produtividade da fermentação mais do que 4 vezes com relação à fermentação feita com TER Euglena gracilis. (Figura 16). Todos os outros homólogos bacterianos testa- 35 das mostraram menor produtividade com relação à fermentação feita com TER Euglena gracilis. Com o TER de Treponema denticola, foram atingidos uma titulação de 0,81 g/L e uma produtividade de 0,022 g/L/h. Com o TER de Euglena gracilis, foram atingidos uma titu- lação de 0,2 g/L e uma produtividade de 0,005 g/L/h. O TER de Treponema denticola asse- gura que bastante atividade enzimática seja expressa para assegurar que a redução de Cro- tonil-CoA não seja a etapa limitante no caminho, quando o gene for expresso no sistema de dois plasmídeos regulares (derivado de pGV1113 + pGV1190).

Experimentos adicionais mostraram adicionalmente que para tiolase, hidroxil butiril

CoA desidrogenase e crotonase, os genes otimizados no códon de Clostridium acetobutyli- cum têm as atividades in vitro superiores a todos homólogos testados desses genes.

Em particular, homólogos das enzimas do caminho hidroxil butiril CoA desidrogena- se (Hbd), crotonase (Crt) e tiolase (Thl) foram expressos e comparados pelo ensaio da ativi- 10 dade in vitro. Os homólogos hidroxil butiril CoA desidrogenase testados foram pGV1037 (Hbd de Clostridium acetobutylicum), pGV1041 (Hbd de Butyrivibrio fibrisolvens), pGV1050 (Hbd de Clostridium beijerinkii), e pGV1154 (Hbd de Clostridium acetobutylicum, seqüência do gene otimizado no códon). Os homólogos de crotonase testados foram pGV1040 (Crt de Butyrivibrio fibrisolvens), pGV1049 (Crt de Clostridium beijerinkii), pGV1094 (Crt de Clostri- 15 dium acetobutylicum) e pGV1189 (Crt de Clostridium acetobutylicum, seqüência do gene otimizado no códon). Os homólogos de tiolase testados foram pGV1035 (Thl de Clostridium acetobutylicum), pGV1039 (Thl de Butyrivibrio fibrisolvens), e pGV1188 (Thl de Clostridium acetobutylicum, seqüência do gene otimizado no códon). Os genes foram expressos e en- saiados pelo protocolo esboçado a seguir.

GEV0768 (E.coli W3110Z1) foi transformado com cada um dos plasmídeos e os

transformantes foram plaqueados nos meios LB com 100 pg/mL de cloramfenicol. As placas foram incubadas a 37 0C por 14-16 horas. Colônias únicas dos clones foram usadas para inocular 3 mL de meios LB com 100 Mg/mL de cloramfenicol. As culturas foram incubadas por toda a noite a 37 0C a 250 rpm. As culturas foram usadas por toda a noite para inocular 25 50 mL de meio rico em EZ em frascos agitados com 100 pg/mL de cloramfenicol. As culturas foram incubadas a 37 0C a 250 rpm. Na fase de crescimento exponencial média (OD6OO 0,6- 0,8) as culturas foram induzidas com IPTG1 mM. Isto ativou a expressão dos genes clona- dos sob o controle do promotor lac. Após 4 horas, as células foram centrifugadas a 4.000 g por 10 minutos. As células foram ressuspensas em tampão pH 7,5 de Tris 100 mM e Iisadas 30 usando um batedor de microesfera. As células foram centrifugadas a 22.000 g por 5 minutos para separar o lisado. Os Iisados foram cuidadosamente transferidos para um tubo fresco e testados para a atividade enzimática e diversas quantidades de proteína.

Para testar a atividade de Hbd, 10 pL do lisado foram adicionados a 190 pL de tampão pH 7,0 de MOPS 50 mM contendo acetoacetil CoA 0,1 mM, e NADH 0,2 mM. A ati-

vidade de Hbd foi medida monitorando o consumo de NADH a 340 nm. Para testar a ativi- dade de Crt, 10 pL de lisado foram adicionados a 190 pL de tampão pH 7,6 de Tris 100 mM contendo 30 pM Crotonil CoA. A atividade enzimática foi medida monitorando o consumo de Crotonil CoA a 263 nm. Para testar a atividade de Thl, 10 μί de lisado foram adicionados a 190 μί de tampão pH 8,0 Tris contendo MgCI2 10 mM, 250 μΜ de acetoacetil CoA e 200 μΜ de CoA. A atividade enzimática foi medida monitorando o consumo de acetoacetil CoA a 303 nm. Todos os clones foram testados com réplicas biológicas e cada ensaio foi feito em duplicata.

As enzimas dos genes otimizados por códon têm a expressão mais alta e conse- quentemente a mais alta atividade entre os clones testados. A mais alta atividade específica (normalizada para proteína celular total) para essas três conversões do caminho de n- butanol são 11,6 nmol/min/pg proteína celular total para Hbd (Tabela 9), 1178 nmol/min/pg 10 proteína celular total para crotonase (Tabela 10), e 2,96 nmol/min/pg proteína celular total para tiolase (Tabela 11). Os genes otimizados por códon para o tiolase, crotonase e hidróxi- butiril desidrogenase resultam na atividade enzimática in vitro mais alta e são provavelmente os genes que renderão a mais alta produtividade do caminho.

Tabela 9: Atividades específicas de homólogos da enzima do caminho de n-butanol

Hbd

hbd Organismo fonte Atividade específica (nmoL/min^g de proteína celular total) pGV 1037 C. acetobutylicum 3,51 pGV 1041 B. fibrisolvens 0,85 pGV 1050 C. beijerinkii 2,91 pGV1154 C. acetobutylicum, códon 11,69 otimizado pGV1111 controle do Vetor 0,20 Tabela 10: Atividade específica de homólogos de Crt

crt Organismo fonte Atividade específica (nmoL/min^g de proteína celular total) pGV1 094 C.acetobutylicum 83,39 pGV1 040 B.fibrisolvens 0,04 pGV 1049 C beyerinkii 10,84 GV1189 C.acetobutylicum, códon 916,99 otimizado pGV1111 controle do Vetor 0,17 Tabela 11: Atividade específica de homólogos de Thl. thl Organismo fonte Atividade específica (nmoL/min/pg de proteína celular total) pGV1035 C.acetobutylicum 0,36 pGV 1039 B.fibrisolvens 2,44 PGV1188 C.acetobutylicum, códon 2,50 otimizado pGV1111 controle do Vetor 0,18 Exemplo 16: Microorganismo recombinante modificado por engenharia para equili- brar produção de n-butanol com relação a produção e consumo de carbono - MasA

Uma cepa GEV01083 com uma deleção adicional no gene mgsA (Gevol 121) mostrou maior rendimento de n-butanol e foi descrito em outro lugar.

GEVOI083 (E coli W3110 ,Andh, Aldh, AadhE, Afrd,attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+)), pGV1191, pGV1113 (A) e GEV01121 (GEV01083, AmgsA), pGV1191, pGV1113 (B) foram comparados por fermentação em garrafa de n-butanol.

Os resultados são ilustrados na Figura 18. Cepa A produziu 0,32 g/L de Iactato em

36 horas a despeito do nocaute de IdhA que eliminou o caminho fermentativo para lactato. Cepa B produziu apenas 0,065 g/L de lactato em 36 horas (Figura 5). Cepa B produziu n- butanol como o produto de fermentação reduzido principal. Cepa A atingiu uma titulação de 0,21 g/L, um rendimento de 0,048 g/g, e uma produtividade de 0,006 g/L/h. A cepa B atingiu uma titulação de 0,22 g/L, um rendimento de 0,057 g/g, e uma produtividade de 0,006 g/L/h.

Esses experimentos mostraram que a deleção de mgsA na produção de cepa de n- butanol leva a maior rendimento em fermentação de n-butanol. Em particular, esses experi- mentos mostram que a deleção de mgsA leva a produção de lactato 5 vezes inferior que resulta em uma melhoria de 19 % do rendimento de n-butanol.

Exemplo 17: E.coli recombinante modificado por engenharia para equilibrar a pro- dução de n-butanol com relação a produção e consumo de carbono - Caminhos de acetato O caminho fermentativo principal para acetato foi deletado pela deleção de ackA. O efeito deste nocaute foi investigado com o seguinte experimento:

GEVO 1083 (E coli W3110, Andh, Aldh, AadhE, Afrd, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+)), pG- Vl 190, pGVI 113 (A) e GEVO 1137 (GEVO 1083, AackA), pGVI 190, pGVI 113 (B) foram comparados pela fermentação em garrafa de n-butanol.

As cepas cresceram aerobicamente em meio B (meio rico em EZ contendo 0,4 % de glicose, Cm 100 mg/L, e Amp 200 mg/L) em tubos por toda a noite a 37 0C e 250 rpm. 60 mL de meio B em frascos agitados foram inoculados a 2 % a partir das culturas por toda a noite e as culturas cresceram até um OD6OO de 0,6. As culturas foram induzidas com IPTG e aTc e foram incubadas a 30 0C, 250 rpm por 12 horas. 50 mL da cultura foram transferidos em frascos anaeróbicos e incubados a 30 0C1 250 rpm por 36 horas. As amostras foram tira- das em diferentes pontos de tempo e as culturas foram alimentadas com glicose e neutrali- zadas com NaOH se necessário. As amostras foram analisadas com GC e HPLC.

Os resultados da análise ilustrados na Figura 19 e Tabela 12 mostram que a cepa com a deleção em ackA atingiu um rendimento maior que 10 %, e produtividade e titulação maior que 50 % (Tabela 13) ( Figura 19). A produção de acetato foi reduzida 5 vezes na ce- pa que teve a deleção do gene em ackA quando comparado com a mesma cepa sem a de- leção em ackA Figura 19).

Tabela 12: parâmetro de processo para a comparação de GEV01083 e GEV01137.

Rendimento Produtividade Titulação Amostra g n-butanol/g Glicose g/L/h g/L 1137A 0,1011 0,0174 0,627 1137B 0,1034 0,0183 0,660 1083C 0,0921 0,0117 0,422 1083D 0,0921 0,0123 0,442

Conclusivamente o nocaute ackA reduz a produção de acetato e aumenta o rendi- mento, produtividade e titulação. Isto mostra que a deleção de caminhos de E. coli nativo que compete com o caminho de n-butanol para carbono aumenta os parâmetros do proces- so de um processo de produção de n-butanol. Estes experimentos mostram que a deleção do caminho fermentativo de acetato

aumenta rendimento, produtividade e titulação da cepa de produção na fermentação de n- butanol

Exemplo 18; Microorganismo recombinante modificado por engenharia para equili- brar a produção de n-butanol com relação a produção e consumo de NADH - fdh em E.coli. O gene fdh foi clonado em pGV1113 em um operon detrás do TER para permitir co-

expressão de fdh e o caminho de n-butanol (pGV1281). GEVO 1083 (E. coli W3110, Andh, Aldh, AadhE, Afrd, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+)) foi transformado com pGVI 113 e pGVI 190 (1) e com pGV1281 e pGV1190 (2). As cepas 1 e 2 foram comparadas por fermentação em garra- fa de n-butanol. As cepas cresceram aerobicamente em meio B (meio rico em EZ contendo 0,4 % de glicose, Cm 100 mg/L, e Amp 200 mg/L) em tubos por toda a noite a 37 0C e 250 rpm. 60 mL de meio B em frascos agitados foram inoculados a 2 % a partir das culturas por toda a noite e as culturas cresceram até um OD6OO de 0,6. As culturas foram induzidas com IPTG e aTc e foram incubadas a 30 0C1 250 rpm por 12 horas. 50 mL da cultura foram trans- feridos em frascos anaeróbicos e incubados a 30 0C, 250 rpm por 36 horas. As amostras foram tiradas em diferentes pontos de tempo e as culturas foram alimentadas com glicose e neutralizadas com NaOH se necessário. As amostras foram analisadas com GC e HPLC.

Os resultados ilustrados nas Fijguras 20A e 20B mostram que cepa 1 que expres- sou Fdh dependente de NADH além do caminho de n-butanol produziu n-butanol a um ren- dimento de 0,086 g/g, que foi 42 % maior do que o rendimento de n-butanol da cepa de comparação 2 que somente expressou o caminho de n-butanol (Figuras 20A e 20B;).

Este resultado mostrou que a expressão de Fdh dependente de NADH na produção de cepa de n-butanol aumenta o rendimento de fermentação de n-butanol.

Exemplo 19: Método para produzir n-butanol - uso de neutralização de cultura e condições anaeróbicas

As cepas listadas na Tabela I anterior foram testadas por seu rendimento de n- butanol, sua produtividade e para a titulação máxima obtenível. Em particular, as condições de cultura mudaram de um crescimento anaeróbico completo e biocatálise para uma fase aeróbica de crescimento e uma fase de biocatálise anaeróbica de acordo com o procedi- mento seguinte.

A cepa a ser testada foi frescamente transformada com os plasmídeos apropriados para o caminho de n-butanol. As colônias únicas foram em seguida coletadas para inocular culturas por toda a noite em duplicatas usando 3 mL do meio rico em EZ + 0,4 % de glicose e adicionar 3 pL de Amp (100 mg/mL) e 3 μΙ_ de Cm (50 mg/mL) diluídas em acetona. Uma vez que os meios ricos em EZ são facilmente contaminados, os meios foram usados na coi- fa estéril. Os antibióticos usados foram diluídos em solventes sem ser etanol (isto é, Cm).

leituras O.D. das culturas foram em seguida feitas por toda a noite para normalizar a quantidade de inóculo necessária. 2 % de inóculo de cultura por toda um noite foram usa- dos em 60 mL de EZ-Rich Meios + 0,4 % de glicose e adicionou-se 60 pL de Amp (100 mg/mL) e 60 pL de Cm (50 mg/mL) diluídos em acetona e incubados a 37 °C/250 rpm. No- vamente, os meios foram usados em uma coifa estéril para evitar contaminação dos meios ricos em EZ.

Em um O.D ~ 600 as culturas foram induzidas adicionando-se 60 pL de IM IPTG e 6 pL de 10,000 χ ATC[diluídas em metanol], certificando-se que após a adição dos induto- res, as culturas foram mantidas fora da luz em vista de sensibilidade a luz de ATC. Metanol foi usado para mascarar picos de metanol no GC. As culturas foram em seguida incubadas a 30 °C/250 rpm por 6-8 horas. Uma amostra de 100 pL de cada cultura foi em seguida tira- da mantendo as amostras no gelo. Leitura do pH e glicose foram também feitas, com leitu- ras O.D. tomadas na absorbância de 600 nm usando água como uma referência. Em parti- cular, tiras de papel do pH com 5-10 faixa de pH foram usados para fazer leituras do pH. Monitor de glicose OneTouch Ultra foi usado para fazer leituras de glicose.

O pH foi ajustado a 7,5 quando necessário adicionando-se NaOH 2 M e 40 % de glicose para manter ~ 0,2 % de glicose (-500-600 mg/dl no medidor de glicose). Uma amos- tra de 2 ml_, foi em seguida retirada por centrifugação a 25.000 g por 5 minutos a 4 0C. O sobrenadante foi em seguida removido para análise de GC/LC e o precipitado salvo em uma caixa no congelador. Esta amostra foi marcada como ponto de tempo a zero hora.

50 mL de cultura foram transferidos em um frasco selado agrafado cheio de ar ana-

eróbico de 100 mL e as culturas foram colocadas de volta no incubador. As culturas foram incubadas a 30 °C/250 rpm, 50 pL de Amp (100 mg/ml_) e 50 pL de Cm (50 mg/ml_) diluídos em acetona foram adicionados. Diluição do Cm em acetona foi feita para evitar o uso de antibióticos diluídos em etanol. Aproximadamente a cada 12 horas, 2 mL das amostras foram tirados na câmera

anaeróbica usando uma seringa. Usando os 2 mL da amostra, O.D., pH, leituras de glicose foram feitos, e o resto da amostra foi usado para análise de GC/LC. A cada 24 horas 25 pL de Amp (100 mg/mL) e 25 pL de Cm (50 mg/mL) diluídos em acetona foram adicionados às culturas para evitar o uso de antibióticos diluídos em etanol. O pH foi ajustado a 7,5 quando necessário, adicionando-se NaOH 2 M e 40 % de

glicose para manter -0,2 % de glicose (-500-600 mg/dL no medidor de glicose).

Os resultados desses experimentos ilustrados nas Figuras 21A e 21B mostram que aumentando o tempo de fermentação e reduzindo os intervalos entre os eventos de alimen- tação e neutralização, a titulação aumentou 4,7 vezes de 0,011 g/L para 0,0525 g/L. A pro- dutividade foi aumentada mais que 2 vezes de 0,000323 g/L/h para 0,000795 g/L/h e o ren- dimento foi aumentado 4 vezes de 0,001373 g/g para 0,005831 g/g (butanol/glicose) (TB002-74).

Estas fermentações foram feitas com cepa GEV0768 (W3110Z1).

Estes experimentos mostram que a modificação das condições de fermentação aumenta a produtividade, rendimento e titulação do processo de produção de n-butanol

Exemplo 20: Método de produzir n-butanol - otimização e condições de fermenta- ção

A otimização da transição de crescimento para biocatálise no fermentador aumen- tou a produtividade e titulação de n-butanol. Fermentações de n-butanol em diferentes tran- sições aeróbicas para anaeróbicas foram realizadas usando GEVO 1083 (E. coli W3110 ndh, idhA, adhE, frd) transformado com os plasmídeos pGVI 190 e pGVI 113. Cultura por toda a noite da cepa transformada foi usada para inocular 4 vasos fermentadores, 1, 2, 3, e 4 cada qual cheio com 200 mL de meio rico em EZ contendo os antibióticos apropriados. Os fermentadores foram mantidos a 37 0C durante a fase de crescimento e o pH foi controlado a 7,0. Os fermentadores foram ajustados a uma velocidade do agitador de 400 rpm e eles foram gaseificados a 1 sL/h com 100 % de ar. Na fase exponencial média as culturas foram induzidas com IPTG 1 mM e 100 ng/mL de anidrotetraciclina. A temperatura do fermentador foi reduzida a 30 0C subsequente para indução. Após 6 horas de indução, os fermentadores 1, 2, e 3 foram programados para diminuir a porcentagem de concentração de oxigênio dis- solvida de 10 % para 0 % controlando a porcentagem de oxigênio na entrada de gás.

O tempo exigido para esta transição foi 2 horas por fermentador 1, 6 hora para o fermentador 2 e 12 horas para o fermentador 3. Uma vez que a concentração de oxigênio dissolvida foi a 0 % a mistura do gás de entrada mudou para 100 % de nitrogênio a uma vazão de gás de 5 sL/h. No fermentador 4, o fluxo de gás fechado completamente 6 horas após a indução para deixar a cultura consumir o oxigênio restante no fermentador até que as condições anaeróbicas fossem atingidas. Após 2 horas, a mistura de gás mudou para 100 % de nitrogênio a uma vazão de 5 sL/h. Todas as fermentações correram por 40 horas e as amostras foram tiradas em vários pontos de tempo. As amostras foram analisadas por HPLC e GC para determinar as concentrações de ácidos orgânicos, glicose, etanol e n- butanol nos fermentadores.

Os resultados são ilustrados nas Figuras 22A e 22B e na Tabela 1 a seguir. A mais alta titulação de 0,88 g/L foi atingida no fermentador 1 com as 2 horas de transição das con- dições aeróbicas para anaeróbicas. Fermentador 1 também teve a mais alta produtividade de 0,022 g/L/h (Tabela 13).

Tabela 13: Titulações e produtividades atingidos na fermentação com diferentes transições de condições de cultura aeróbica para anaeróbica

Fermentador titulação Produtividade g/L g/L/h F 1 0,88 0,022 F2 0,73 0,018 F3 0,79 0,02 F4 0,58 0,015

Estes resultados mostram qual otimização das condições do processo de fermenta- ção melhora o rendimento, produtividade e titulação do processo de produção de n-butanol.

Exemplo 21: Microorganismo recombinante modificado por engenharia para equili- brar a produção de n-butanol com relação a produção e consumo - mutante NADH - Fdh em cepa E. coli tipo selvagem

Formato desidrogenase dependente de NADH de Candida boidinii foi sobre- expressa em GEV01034 (E. coli W3110, AfdhF) de Fdh dependente de NADH em uma cepa E. coli que teve uma deleção em seu gene fdhF nativo.

GEV01034 (E. coli W3110, AfdhF), pGV1248 (fdhl de C. boidinii expresso do pla- mídeo da cópia do meio) (A), e GEV01034, pGV1111 (controle apenas do vetor (B), foram comparados por fermentação em garrafa de n-butanol de acordo com o SOP "fermentação de butanol em frascos anaeróbicos". As cepas cresceram aerobicamente em meio B (meio rico em EZ contendo 0,4 % de glicose, Cm 100 mg/L, e Amp 200 mg/L) em tubos por toda a noite a 37 0C e 250 rpm. 60 mL de meio B em frascos agitados foram inoculados a 2 % a partir das culturas por toda a noite e as culturas cresceram a um OD6OO de 0,6.

As culturas foram induzidas com IPTG e aTc e foram incubadas a 30 0C, 250 rpm por 12 horas. 50 mL da cultura foram transferidos em frascos anaeróbicos e incubados a 30 0C, 250 rpm por 36 horas. As amostras foram tiradas em diferentes pontos de tempo e as culturas foram alimentadas com glicose e neutralizadas com NaOH se necessário. As amos- tras foram analisadas com GC e HPLC.

Os resultados ilustrados nas Figuras 23A, 23B, 23C, 23D, 24A e 24B mostram que Cepa A produziu etanol e acetato a uma razão de 0,6+/-0,15. A cepa A produziu etanol e acetato a uma razão de 3,43. A cepa B produziu etanol e acetato a uma razão de 0,63. A cepa A produziu 2,97 NADH por glicose e a cepa B produziu 1,91 NADH por glicose. Conclusivamente este resultado indica que expressão de fdhl de Candida boidinii

aumenta o NADH disponível nos números atualizados de célula:

Estes experimentos mostram que expressão de Fdh dependente de NADH aumen- ta a razão de NADH por glicose produzida pela célula

Exemplo 22: Microorganismos recombinantes modificados por engenharia para e- guilibrar a produção de n-butanol com relação a produção e consumo de NADH - mutante pdh em cepa E.coli tipo selvagem

As cepas GEV0992 (E. co//'W3110, AldhA, Afrd) pGV1278 (mutante PLtet::lpdA) (A), GEVO 992, pGV1279 (mutante PLtet::lpdA) (B), GEV0992, pGV772 (controle apenas de vetor) (C)1 foram comparados por fermentação em garrafa de n-butanol. As cepas cres- ceram aerobicamente em meio B (meio rico em EZ contendo glicose 0,4 %, Cm 100 mg/L, e Amp 200 mg/L) em tubos por toda a noite a 37 0C e 250 rpm. 60 mL de meio B em frascos agitados foram inoculados a 2 % a partir das culturas por toda a noite e as culturas cresce- ram a um OD6OO de 0,6.

As culturas foram induzidas com IPTG e aTc e foram incubadas a 30 0C1 250 rpm por 12 horas. 50 mL da cultura foram transferidos em frascos anaeróbicos e incubados a 30 0C1 250 rpm por 36 horas. As amostras foram tiradas em diferentes pontos de tempo e as culturas foram alimentadas com glicose e neutralizadas com NaOH se necessário. As amos- tras foram analisadas com GC e HPLC.

Os resultados ilustrados nas Figuras 25A e 25B mostram que Cepa A produziu eta- nol e acetato a uma razão de 1.1. Cepa B produziu etanol e acetato a uma razão de 0,8. Cepa C produziu etanol e acetato a uma razão de 0,8. A razão de Cepa A que expressa o mutante IpdA é 1,4 vezes maior do que a razão da cepa B e cepa C. Estes resultados indicam que expressão do mutante LpdA aumenta o NADH dispo- nível na célula, em particular, estes resultados mostram que a expressão de Pdh que é mu- tada para evitar inibição por altos níveis de NADH/NAD aumenta a razão de NADH por gli- cose produzida pela célula em condições anaeróbicas.

Exemplo 23: (prognóstico): produção de n-butanol em rendimentos maiores do que

50 % do valor teórico

As cepas Gevol 510 (E. CO//W3110, AldhA, ApflB, ApfIDC, AadhE, Afrd, AackA, AmgsA) pGV1191. pGV1113 (A), e GEVO 1511 (E. coli W3110, AldhA, vpflB, ApfIDC, AadhE, Afrd, AackA, AmgsA) pGV1191, pGV1113 (B)1 foram comparadas pela fermentação em garrafa de n-butanol. GEV01510 é desenvolvida para expressar Pdh em condições a- naeróbicas. As cepas crescem aerobicamente em meio B (meio rico em EZ contendo glico- se 0,4 %, Cm 100 mg/L, e Amp 200 mg/L) em tubos por toda a noite a 37 0C e 250 rpm. 60 mL de meio B em frascos agitados são inoculados a 2 % a partir das culturas por toda a noi- te e as culturas crescem a um OD6OO de 0,6. As culturas são induzidas com IPTG 1 mM e aTc 100 ng/mL e são incubadas a 30 0C C, 250 rpm por 12 horas. 50 mL da cultura são transferidos em frascos anaeróbicos e incubados a 30 0C, 250 rpm por 36 horas. Amostras são tiradas em diferentes pontos de tempo e as culturas são alimentadas com glicose e neu- tralizadas com NaOH se necessário. As amostras são analisadas com GC e HPLC.

Cepa A que é desenvolvida da maneira supradescrita para aumentar produção de NADH produz n-butanol a um rendimento de 0,3 g/g, que corresponde a 73,2 % do rendi- mento teórico. Cepa B atinge um rendimento de 0,1 g/g (24,4 % do rendimento teórico). Este resultado mostrou que desenvolver uma produção de cepa de n-butanol para produção mai- or de NADH aumenta o rendimento de fermentação de n-butanol acima de 50 % do rendi- mento teórico.

Estes resultados mostram que uma cepa que produz mais que 2 mois de NADH por

mol de glicose permitindo anaerobicamente rendimentos de n-butanol maior do que 50 %.

Exemplo 24 (prognóstico): Microorganismo recombinante modificado por engenha- ria para equilibrar a produção de n-butanol com relação a produção e consumo de NADH - fdh em E. coli.

Gevo 768 (E. coli W3110, afffí::(Sp+ Iaclq+ tetR+)) foi transformado com pGV1583

e pGV1191 (1) e com pGV1435 e pGV1191 (2). As cepas 1 e 2 foram comparadas por fer- mentação em garrafa de n-butanol. As cepas cresceram aerobicamente em meio B (meio rico em EZ contendo glicose 0,4 %, Cm 100 mg/L, e Amp 200 mg/L) em tubos por toda a noite a 37 0C e 250 rpm. 60 mL de meio B em frascos agitados foram inoculados a 2 % a partir das culturas por toda a noite e as culturas cresceram a um OD6OO de 0,6. As culturas foram induzidas com IPTG e aTc e foram incubadas a 30 0C, 250 rpm por 12 horas. 50 mL da cultura foram transferidos em frascos anaeróbicos e incubados a 30 0C, 250 rpm por 36 horas. As amostras foram tiradas em diferentes pontos de tempo e as culturas foram alimen- tadas com glicose e neutralizadas com NaOH se necessário. As amostras foram analisadas com GC e HPLC.

Os resultados mostram que cepa 1 que expressou Fdh dependente de NADH além do caminho de n-butanol, produziu n-butanol a um rendimento de 1,82 % do valor teórico, que foi 30 % maior do que o rendimento de n-butanol da cepa de comparação 2 que expres- sou apenas o caminho de n-butanol.

Este resultado mostrou que a expressão de Fdh dependente de NADH na produção de cepa de n-butanol aumenta o rendimento de fermentação de n-butanol. Exemplo 25: (prognóstico): produção de n-butanol em rendimentos maiores do que

50 % do valor teórico

As cepas Gevol 083, pGV1191, pGV1583(A), e Gevo 1083, pGV1191, pGV1435 (B), foram comparadas por fermentação em garrafa de n-butanol. As cepas cresceram aero- bicamente em meio B (meio rico em EZ contendo glicose 0,4 %, Cm 100 mg/L, e Amp 200 mg/L) em tubos por toda a noite a 37 0C e 250 rpm. 60 mL de meio B em frascos agitados foram inoculados a 2 % a partir das culturas por toda a noite e as culturas cresceram a um OD6OO de 0,6. As culturas foram induzidas com IPTG 1 mM e aTc 100 ng/mL e foram incu- badas a 30 0C, 250 rpm por 12 horas. 50 mL da cultura foram transferidos em frascos anae- róbicos e incubados a 30 0C1 250 rpm por 36 horas. As amostras foram tiradas em diferentes pontos de tempo e as culturas foram alimentadas com glicose e neutralizadas com NaOH se necessário. As amostras foram analisadas com GC e HPLC.

Cepa A que expressa Fdh dependente de NADH de C. boidinii de um plasmídeo de alta cópia produziu n-butanol a um rendimento de 0,29 g/g, que corresponde a 70,7 % do rendimento teórico. Cepa B atingiu um rendimento de 0,1 g/g (29 % do rendimento teórico). Exemplo 26: (prognóstico) Microorganismo recombinante modificado por engenha-

ria para equilibrar a produção de n-butanol com relação a produção e consumo de NADH - Fdh mutante em cepa E.coli tipo selvagem

Formato desidrogenase dependente de NADH de Candida boidinii foi sobre- expressa em Gevol 034 (E. coli W3110, ÁfdhF) de Fdh dependente de NADH em um Cepa E. coli que tem uma deleção em seu gene fdhF nativo.

Gevol 034 (E. coli W3110, AfdhF), pGV1582 (fdhl de C. boidinii expressou com o forte promotor de tac) (A), e Gevo 1034, pGV1569 (controle apenas de vetor (B), foram comparados por fermentação em garrafa de n-butanol de acordo com o SOP "fermentação de butanol em frascos anaeróbicos". As cepas cresceram aerobicamente em meio B (meio rico em EZ contendo glicose 0,4 %, Cm 100 mg/L, e Amp 200 mg/L) em tubos por toda a noite a 37 0C e 250 rpm. 60 mL de meio B em frascos agitados foram inoculados a 2 % a partir das culturas por toda a noite e as culturas cresceram a um OD6QO de 0,6. As culturas foram induzidas com PTG e aTc e foram incubadas a 30 0C1 250 rpm por 12 horas. 50 mL da cultura foram transferidos em frascos anaeróbicos e incubados a 30 0C, 250 rpm por 36 horas. As amostras foram tiradas em diferentes pontos de tempo e as culturas foram alimentadas com glicose e neutralizadas com NaOH se necessário. As amos- tras foram analisadas com GC e HPLC.

Os resultados mostram que Cepa A produziu 4 NADH por glicose e Cepa B produ- ziu 2 NADH por glicose. Conclusivamente, este resultado indica que expressão de fdhl de Candida boidinii aumenta o NADH disponível na célula.

Estes experimentos mostram que expressão de Fdh dependente de NADH aumen- ta a razão de NADH por glicose produzida pela célula

Exemplo 27 (prognóstico): Microorganismo recombinante modificado por engenha- ria para equilibrar a produção de n-butanol com relação a produção e consumo de NADH - fdh em E coli.

Diversas Cepas E. colis foram transformadas com plasmídeos para a expressão de um caminho de butanol e para a expressão de Fdh dependente de NADH de C. boidinii. As cepas GEV01082 (E coli W3110, Aldh, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+)) (Cepa A), GEV01054 (E. coli W3110, AadhE, attB::(Sp+ Iaclg+ tetR+)) (Cepa B), GEV01084 (E. coli W3110, Aldh, AadhE, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+)) (Cepa C), GEV01508 (E. coli W3110, Aldh, AadhElAfrd, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+)) (Cepa D), Gevol 509 (E. coli W3110, Aldh, AadhE, Afrd, AmgsA, attB::(Sp+ Iaclq/ tetR+)) (Cepa E), GEV01085 (E. coli W3110, Aldh, AadhE, Afrd, AackA, attB::(Sp+ Iaclq/tetR+)) (Cepa F), GEV01507 (E. coli W3110, Aldh, AadhE, Afrd, AackA, AmgsA, attB::(Sp+ Iaclq+ tetR+)) (Cepa G) foram transformadas com pGV1191 e pGV1583. (2). Cepas A-F contendo estes plasmídeos foram comparadas por fermentação em garrafa de n-butanol. As cepas cresceram aerobicamente em meio B (meio rico em EZ contendo glicose 0,4 %, Cm 100 mg/L, e Amp 200 mg/L) em tubos por toda a noite a 37 0C e 250 rpm. 60 mL de meio B em frascos agitados foram inoculados a 2 % a partir das culturas por toda a noite e as culturas cresceram a um OD6OO de 0,6. As culturas foram induzidas com IPTG e aTc e foram incubadas a 30 0C C, 250 rpm por 12 horas. 50 mL da cultura foram transferi- dos em frascos anaeróbicos e incubadas a 30 0C1 250 rpm por 36 horas. As amostras foram tiradas em diferentes pontos de tempo e as culturas foram alimentadas com glicose e neu- tralizadas com NaOH se necessário. As amostras foram analisadas com GC e HPLC.

Os resultados mostram que Cepa A produziu butanol com um rendimento de 5 %, Cepa B produziu butanol com um rendimento de 40 %, Cepa C produziu butanol com um rendimento de 50 %, Cepa D produziu butanol com um rendimento de 55 %, Cepa E produ- ziu butanol com um rendimento de 60 %, Cepa F produziu butanol com um rendimento de 65 %, Cepa G produziu butanol com um rendimento de 70 %.

Os exemplos apresentados anteriormente são fornecidos para dar aos versados na tecnologia uma revelação e descrição completa de como fazer uso das modalidades dos dispositivos, sistemas e métodos da revelação, e não devem se limitar ao escopo do que os inventores consideram sua revelação. Modificações dos modos supradescritos para realizar a revelação que são óbvios aos versados na tecnologia devem estar no escopo das seguin- tes reivindicações. Todas as patentes e publicações mencionadas na especificação são in- dicativos dos níveis de conhecimento dos versados na tecnologia aos quais a revelação diz respeito. Todas as referências citadas nesta revelação são incorporadas pela referência até o mesmo ponto como se cada referência tivesse sido incorporada pela referência individu- almente na sua íntegra.

A revelação na íntegra de cada documento citado (incluindo patentes, pedidos de patente, artigos de jornal, resumos, manuais de laboratório, livros, ou outras revelações) nos antecedentes da invenção, Descrição detalhada da invenção, e Exemplos está dessa forma incorporada aqui pela referência. Adicionalmente, a cópia legível da listagem de seqüência submetida anexa e a forma legível por computador correspondente estão ambos aqui incor- porados pela referência na sua íntegra.

Deve-se entender que as revelações não estão limitadas a composições particula- res ou sistemas biológicos, que podem, é claro, variar. Deve-se também entender que a terminologia aqui usada é com o propósito de descrever apenas as modalidades particulares e não devem ser limitantes. Conforme usado nesta especificação e nas reivindicações ane- xas, as formas singulares "um," "uma," e "o" incluem plural referente a menos que o conteú- do dite claramente de outra forma. Assim, por exemplo, referência a "um intermediário bios- sintético" inclui uma pluralidade de intermediários como esses, referência a "um ácido nu- cléico" inclui uma pluralidade de ácidos nucléicos como esses e referência a "a célula hos- pedeira geneticamente modificada" inclui referência a uma ou mais células hospedeiras ge- neticamente modificadas e equivalentes destas conhecidas pelos versados na tecnologia e assim por diante. Conforme usado nesta especificação o termo uma "pluralidade" refere-se a duas ou mais referências da maneira indicada, a menos que o conteúdo dite claramente de outra forma.

A menos que de outra forma definida, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado comumente entendido pelos versados na tecnologia aos quais a revelação diz respeito. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equiva- lente aos aqui descritos possam ser usados na prática para teste da(s) revelação(s), exem- plos específicos de materiais apropriados e métodos são aqui descritos. Todas as publica- ções aqui mencionadas estão incorporadas aqui pela referência para revelar e descrever os métodos e/ou materiais com relação aos quais as publicações são citadas.

Enquanto modalidades específicas das revelações em questão são explicitamente aqui reveladas, as especificação e exemplos aqui anteriores são ilustrativos e não restriti- vos. Deve-se entender que várias modificações podem ser feitas sem fugir do espírito e es- copo da revelação. Muitas variações das revelações tornarão aparente aos versados na tecnologia mediante revisão desta especificação e a modalidades a seguir. O escopo total das revelações será determinado pela referência às modalidades, junto com seu escopo total de equivalentes e a especificação, junto com tais variações. Consequentemente, outras modalidades estão no escopo das seguintes reivindicações. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Gevo1 Inc. Buelter1 Thomas Hawkins, Andrew Kersh1 Kalib Meinhold, Peter Peters1 Matthew Subbian1 Ezhilkani

<120> "MICRORGANISMOS MODIFICADOS POR ENGENHARIA PARA PRODUZIR N- BUTANOL E MÉTODOS RELACIONADOS"

<130> 56836.830004.US1

<150> 60/868,326 <151 > 01-12-2006

<150> 60/945,576 <151> 21-06-2007

<150> 60/890,329 <151 > 2007-02-16

<150> 60/905,550 <151 > 06-03-2007

<150> 60/940,877 <151 > 30-05-2007

<160> 86

<170> Patentln versão 3.4

<210> 1 <211> 858 <212> PRT <213> Clostridiumacetobutylicum <400> 1

Met Lys Val Thr Asn Gln Lys Glu Leu Lys Gln Lys Leu Asn Glu Leu 10 15

Arg Glu Ala Gln Lys Lys Phe Ala Thr Tyr Thr Gln Glu Gln Val Asp 25 30

Lys Ile Phe Lys Gln Cys Ala Ile Ala Ala Ala Lys Glu Arg Ile Asn 40 45

Leu Ala Lys Leu Ala Val Glu Glu Thr Gly Ile Gly Leu Val Glu Asp 50 55 60

Lys Ile Ile Lys Asn His Phe Ala Ala Glu Tyr Ile Tyr Asn Lys Tyr 65 70 75 80

Lys Asn Glu Lys Thr Cys Gly Ile Ile Asp His Asp Asp Ser Leu Gly 85 90 95

Ile Thr Lys Val Ala Glu Pro Ile Gly Ile Val Ala Ala Ile Val Pro 100 105 110

Thr Thr Asn Pro Thr Ser Thr Ala Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu 115 120 125

Lys Thr Arg Asn Ala Ile Phe Phe Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Lys 130 135 140

Ser Thr Ile Ala Ala Ala Lys Leu Ile Leu Asp Ala Ala Val Lys Ala 145 150 155 160

Gly Ala Pro Lys Asn Ile Ile Gly Trp Ile Asp Glu Pro Ser Ile Glu 165 170 175 Leu Ser Gln Asp Leu Met Ser Glu Ala Asp Ile Ile Leu Ala Thr Gly 180 185 190

Gly Pro Ser Met Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ala Ile 195 200 205

Gly Val Gly Ala Gly Asn Thr Pro Ala Ile Ile Asp Glu Ser Ala Asp 210 215 220

Ile Asp Met Ala Val Ser Ser Ile Ile Leu Ser Lys Thr Tyr Asp Asn 225 230 235 240

Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Ile Leu Val Met Asn Ser Ile 245 250 255

Tyr Glu Lys Val Lys Glu Glu Phe Val Lys Arg Gly Ser Tyr Ile Leu 260 265 270

Asn Gln Asn Glu Ile Ala Lys Ile Lys Glu Thr Met Phe Lys Asn Gly 275 280 285

Ala Ile Asn Ala Asp Ile Val Gly Lys Ser Ala Tyr Ile Ile Ala Lys 290 295 300

Met Ala Gly Ile Glu Val Pro Gln Thr Thr Lys Ile Leu Ile Gly Glu 305 310 315 320

Val Gln Ser Val Glu Lys Ser Glu Leu Phe Ser His Glu Lys Leu Ser 325 330 335

Pro Val Leu Ala Met Tyr Lys Val Lys Asp Phe Asp Glu Ala Leu Lys 340 345 350

Lys Ala Gln Arg Leu Ile Glu Leu Gly Gly Ser Gly His Thr Ser Ser 355 360 365

Leu Tyr Ile Asp Ser Gln Asn Asn Lys Asp Lys Val Lys Glu Phe Gly 370 375 380

Leu Ala Met Lys Thr Ser Arg Thr Phe Ile Asn Met Pro Ser Ser Gln 385 390 395 400

Gly Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Ala Ile Ala Pro Ser Phe Thr 405 410 415

Leu Gly Cys Gly Thr Trp Gly Gly Asn Ser Val Ser Gln Asn Val Glu 420 425 430

Pro Lys His Leu Leu Asn Ile Lys Ser Val Ala Glu Arg Arg Glu Asn 435 440 445

Met Leu Trp Phe Lys Val Pro Gln Lys Ile Tyr Phe Lys Tyr Gly Cys 450 455 460

Leu Arg Phe Ala Leu Lys Glu Leu Lys Asp Met Asn Lys Lys Arg Ala 465 470 475 480

Phe Ile Val Thr Asp Lys Asp Leu Phe Lys Leu Gly Tyr Val Asn Lys 485 490 495

Ile Thr Lys Val Leu Asp Glu Ile Asp Ile Lys Tyr Ser Ile Phe Thr 500 505 510

Asp Ile Lys Ser Asp Pro Thr Ile Asp Ser Val Lys Lys Gly Ala Lys 515 520 525

Glu Met Leu Asn Phe Glu Pro Asp Thr Ile Ile Ser Ile Gly Gly Gly 530 535 540

Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Val Met His Leu Leu Tyr Glu Tyr Pro 545 550 555 560

Glu Ala Glu Ile Glu Asn Leu Ala Ile Asn Phe Met Asp Ile Arg Lys 565 570 575 Arg Ile Cys Asn Phe Pro Lys Leu Gly Thr Lys Ala Ile Ser Val Ala 580 585 590

Ile Pro Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ser Glu Ala Thr Pro Phe Ala Val 595 600 605

Ile Thr Asn Asp Glu Thr Gly Met Lys Tyr Pro Leu Thr Ser Tyr Glu 610 615 620

Leu Thr Pro Asn Met Ala Ile Ile Asp Thr Glu Leu Met Leu Asn Met 625 630 635 640

Pro Arg Lys Leu Thr Ala Ala Thr Gly Ile Asp Ala Leu Val His Ala 645 650 655

Ile Glu Ala Tyr Val Ser Val Met Ala Thr Asp Tyr Thr Asp Glu Leu 660 665 670

Ala Leu Arg Ala Ile Lys Met Ile Phe Lys Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr 675 680 685

Lys Asn Gly Thr Asn Asp Ile Glu Ala Arg Glu Lys Met Ala His Ala 690 695 700

Ser Asn Ile Ala Gly Met Ala Phe Ala Asn Ala Phe Leu Gly Val Cys 705 710 715 720

His Ser Met Ala His Lys Leu Gly Ala Met His His Val Pro His Gly 725 730 735

Ile Ala Cys Ala Val Leu Ile Glu Glu Val Ile Lys Tyr Asn Ala Thr 740 745 750

Asp Cys Pro Thr Lys Gln Thr Ala Phe Pro Gln Tyr Lys Ser Pro Asn 755 760 765

Ala Lys Arg Lys Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Tyr Leu Asn Leu Lys Gly 770 775 780

Thr Ser Asp Thr Glu Lys Val Thr Ala Leu Ile Glu Ala Ile Ser Lys 785 790 795 800

Leu Lys Ile Asp Leu Ser Ile Pro Gln Asn Ile SerAIa Ala Gly Ile 805 810 815

Asn Lys Lys Asp Phe Tyr Asn Thr Leu Asp Lys Met Ser Glu Leu Ala 820 825 830

Phe Asp Asp Gln Cys Thr Thr Ala Asn Pro Arg Tyr Pro Leu Ile Ser 835 840 845

Glu Leu Lys Asp Ile Tyr Ile Lys Ser Phe 850 855

<210> 2 <211> 261 <212> PRT

<213> Clostridiumacetobutylicum <400> 2

Met Glu Leu Asn Asn Val Ile Leu Glu Lys Glu Gly Lys Val Ala Val 10 15

Val Thr Ile Asn Arg Pro Lys Ala Leu Asn Ala Leu Asn Ser Asp Thr 25 30

Leu Lys Glu Met Asp Tyr Val Ile Gly Glu Ile Glu Asn Asp Ser Glu 40 45

Val Leu Ala Val Ile Leu Thr Gly Ala Gly Glu Lys Ser Phe Val Ala 50 55 60

Gly Ala Asp Ile Ser Glu Met Lys Glu Met Asn Thr Ile Glu Gly Arg 65 70 75 80

Lys Phe Gly Ile Leu Gly Asn Lys Val Phe Arg Arg Leu Glu Leu Leu 85 90 95

Glu Lys Pro Val Ile Ala Ala Val Asn Gly Phe Ala Leu Gly Gly Gly 100 105 110

Cys Glu Ile Ala Met Ser Cys Asp Ile Arg Ile Ala Ser Ser Asn Ala 115 120 125

Arg Phe Gly Gln Pro Glu Val Gly Leu Gly Ile Thr Pro Gly Phe Gly 130 135 140

Gly Thr Gln Arg Leu Ser Arg Leu Val Gly Met Gly Met Ala Lys Gln 145 150 155 160

Leu Ile Phe Thr Ala Gln Asn Ile Lys Ala Asp Glu Ala Leu Arg Ile 165 170 175

Gly Leu Val Asn Lys Val Val Glu Pro Ser Glu Leu Met Asn Thr Ala 180 185 190

Lys Glu Ile Ala Asn Lys Ile Val Ser Asn Ala Pro Val Ala Val Lys 195 200 205

Leu Ser Lys Gln Ala Ile Asn Arg Gly Met Gln Cys Asp Ile Asp Thr 210 215 220

Ala Leu Ala Phe Glu Ser Glu Ala Phe Gly Glu Cys Phe Ser Thr Glu 225 230 235 240

Asp Gln Lys Asp Ala Met Thr Ala Phe Ile Glu Lys Arg Lys Ile Glu 245 250 255

Gly Phe Lys Asn Arg 260 δ <210> 3 <211> 379 <212> PRT

<213> Clostridiumacetobutylicum <400> 3

Met Asp Phe Asn Leu Thr Arg Glu Gln Glu Leu Val Arg Gln Met Val 1 5 10 15

Arg Glu Phe Ala Glu Asn Glu Val Lys Pro Ile Ala Ala Glu Ile Asp 25 30

Glu Thr Glu Arg Phe Pro Met Glu Asn Val Lys Lys Met Gly Gln Tyr 40 45

Gly Met Met Gly Ile Pro Phe Ser Lys Glu Tyr Gly Gly Ala Gly Gly 50 55 60

Asp Val Leu Ser Tyr Ile Ile Ala Val Glu Glu Leu Ser Lys Val Cys 65 70 75 80

Gly Thr Thr Gly Val Ile Leu Ser Ala His Thr Ser Leu Cys Ala Ser 85 90 95

Leu Ile Asn Glu His Gly Thr Glu Glu Gln Lys Gln Lys Tyr Leu Val 100 105 110

Pro Leu Ala Lys Gly Glu Lys Ile Gly Ala Tyr Gly Leu Thr Glu Pro 115 120 125

Asn Ala Gly Thr Asp Ser Gly Ala Gln Gln Thr Val Ala Val Leu Glu 130 135 140

Gly Asp His Tyr Val Ile Asn Gly Ser Lys Ile Phe Ile Thr Asn Gly 145 150 155 160 Gly Val Ala Asp Thr Phe Val Ile Phe Ala Met Thr Asp Arg Thr Lys 165 170 175

Gly Thr Lys Gly Ile SerAIa Phe Ile Ile Glu Lys Gly Phe Lys Gly 180 185 190

Phe Ser Ile Gly Lys Val Glu Gln Lys Leu Gly Ile Arg Ala Ser Ser 195 , 200 205

Thr Thr Glu Leu Val Phe Glu Asp Met Ile Val Pro Val Glu Asn Met 210 215 220

Ile Gly Lys Glu Gly Lys Gly Phe Pro Ile Ala Met Lys Thr Leu Asp 225 230 235 240

Gly Gly Arg Ile Gly Ile Ala Ala Gln Ala Leu Gly Ile Ala Glu Gly 245 250 255

Ala Phe Asn Glu Ala Arg Ala Tyr Met Lys Glu Arg Lys Gln Phe Gly 260 265 270

Arg Ser Leu Asp Lys Phe Gln Gly Leu Ala Trp Met Met Ala Asp Met 275 280 285

Asp Val Ala Ile Glu Ser Ala Arg Tyr Leu Val Tyr Lys Ala Ala Tyr 290 295 300

Leu Lys Gln Ala Gly Leu Pro Tyr Thr Val Asp Ala Ala Arg Ala Lys 305 310 315 320

Leu His Ala Ala Asn Val Ala Met Asp Val Thr Thr Lys Ala Val Gln 325 330 335

Leu Phe Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Lys Asp Tyr Pro Val Glu Arg Met

340 345 350

Met Arg Asp Ala Lys Ile Thr Glu Ile Tyr Glu Gly Thr Ser Glu Val 355 360 365 Gln Lys Leu Val Ile Ser Gly Lys Ile Phe Arg 370 375

<210> 4 <211> 337 <212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum <400> 4

Met Asn Lys Ala Asp Tyr Lys Gly Val Trp Val Phe Ala Glu Gln Arg 10 15

Asp Gly Glu Leu Gln Lys Val Ser Leu Glu Leu Leu Gly Lys Gly Lys 25 30

Glu Met Ala Glu Lys Leu Gly Val Glu Leu ThrAIa Val Leu Leu Gly 40 45

His Asn Thr Glu Lys Met Ser Lys Asp Leu Leu Ser His Gly Ala Asp 50 55 60

Lys Val Leu Ala Ala Asp Asn Glu Leu Leu Ala His Phe Ser Thr Asp 65 70 75 80

Gly Tyr Ala Lys Val Ile Cys Asp Leu Val Asn Glu Arg Lys Pro Glu 85 90 95

Ile Leu Phe Ile Gly Ala Thr Phe Ile Gly Arg Asp Leu Gly Pro Arg 100 105 110

Ile Ala Ala Arg Leu Ser Thr Gly Leu Thr Ala Asp Cys Thr Ser Leu 115 120 125

Asp Ile Asp Val Glu Asn Arg Asp Leu Leu Ala Thr Arg Pro Ala Phe 130 135 140 Gly Gly Asn Leu Ile Ala Thr Ile Val Cys Ser Asp His Arg Pro Gln 145 150 155 160

Met Ala Thr Val Arg Pro Gly Val Phe Phe Glu Lys Leu Pro Val Asn 165 170 175

Asp Ala Asn Val Ser Asp Asp Lys Ile Glu Lys Val Ala Ile Lys Leu 180 185 190

Thr Ala Ser Asp Ile Arg Thr Lys Val Ser Lys Val Val Lys Leu Ala 195 200 205

Lys Asp Ile Ala Asp Ile Gly Glu Ala Lys Val Leu Val Ala Gly Gly 210 215 220

Arg Gly Val Gly Ser Lys Glu Asn Phe Glu Lys Leu Glu Glu Leu Ala 225 230 235 240

Ser Leu Leu Gly Gly Thr Ile Ala Ala Ser Arg Ala Ala Ile Glu Lys 245 250 255

Glu Trp Val Asp Lys Asp Leu Gln Val Gly Gln Thr Gly Lys Thr Val 260 265 270

Arg Pro Thr Leu Tyr Ile Ala Cys Gly Ile Ser Gly Ala Ile Gln His 275 280 285

Leu Ala Gly Met Gln Asp Ser Asp Tyr Ile Ile Ala Ile Asn Lys Asp 290 295 300

Val Glu Ala Pro Ile Met Lys Val Ala Asp Leu Ala Ile Val Gly Asp 305 310 315 320

Val Asn Lys Val Val Pro Glu Leu Ile Ala Gln Val Lys Ala Ala Asn 325 330 335

Asn <210> 5 <211> 252 <212> PRT

<213> Clostridiumacetobutylicum <400> 5

Met Asn Ile Val Val Cys Leu Lys Gln Val Pro Asp Thr Ala Glu Val 10 15

Arg Ile Asp Pro Val Lys Gly Thr Leu Ile Arg Glu Gly Val Pro Ser 25 30

Ile Ile Asn Pro Asp Asp Lys Asn Ala Leu Glu Glu Ala Leu Val Leu 40 45

Lys Asp Asn Tyr Gly Ala His Val Thr Val Ile Ser Met Gly Pro Pro 50 55 60

Gln Ala Lys Asn Ala Leu Val Glu Ala Leu Ala Met Gly Ala Asp Glu 65 70 75 80

Ala Val Leu Leu Thr Asp Arg Ala Phe Gly Gly Ala Asp Thr Leu Ala 85 90 95

Thr Ser His Thr Ile Ala Ala Gly Ile Lys Lys Leu Lys Tyr Asp Ile 100 105 110

Val Phe Ala Gly Arg Gln Ala Ile Asp Gly Asp Thr Ala Gln Val Gly 115 120 125

Pro Glu Ile Ala Glu His Leu Gly Ile Pro Gln Val Thr Tyr Val Glu 130 135 140

Lys Val Glu Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Ile Arg Lys Ala Trp Glu 145 150 155 160 Asp Gly Tyr Glu Val Val Glu Val Lys Thr Pro Val Leu Leu Thr Ala 165 170 175

Ile Lys Glu Leu Asn Val Pro Arg Tyr Met Ser Val Glu Lys Ile Phe 180 185 190

Gly Ala Phe Asp Lys Glu Val Lys Met Trp Thr Ala Asp Asp Ile Asp 195 200 205

Val Asp Lys Ala Asn Leu Gly Leu Lys Gly Ser Pro Thr Lys Val Lys 210 215 220

Lys Ser Ser Thr Lys Glu Val Lys Gly Gln Gly Glu Val Ile Asp Lys 225 230 235 240

Pro Val Lys Glu Ala Ala Asp Met Leu Ser Gln Asn 245 250

<210> 6 <211> 282 <212> PRT

<213> Clostridiumacetobutylicum <400> 6

Met Lys Lys Val Cys Val Ile Gly Ala Gly Thr Met Gly Ser Gly Ile 10 15

Ala Gln Ala Phe Ala Ala Lys Gly Phe Glu Val Val Leu Arg Asp Ile 25 30

Lys Asp Glu Phe Val Asp Arg Gly Leu Asp Phe Ile Asn Lys Asn Leu 40 45

Ser Lys Leu Val Lys Lys Gly Lys Ile Glu Glu Ala Thr Lys Val Glu 50 55 60 Ile Leu Thr Arg Ile Ser Gly Thr Val Asp Leu Asn Met Ala Ala Asp 65 70 75 80

Cys Asp Leu Val Ile Glu Ala Ala Val Glu Arg Met Asp Ile Lys Lys 85 90 95

Gln Ile Phe Ala Asp Leu Asp Asn Ile Cys Lys Pro Glu Thr Ile Leu 100 105 110

Ala Ser Asn Thr Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Val Ala Ser Ala Thr 115 120 125

Lys Thr Asn Asp Lys Val Ile Gly Met His Phe Phe Asn Pro Ala Pro 130 135 140

Val Met Lys Leu Val Glu Val Ile Arg Gly Ile Ala Thr Ser Gln Glu 145 150 155 160

Thr Phe Asp Ala Val Lys Glu Thr Ser Ile Ala Ile Gly Lys Asp Pro 165 170 175

Val Glu Val Ala Glu Ala Pro Gly Phe Val Val Asn Arg Ile Leu Ile 180 185 190

Pro Met Ile Asn Glu Ala Val Gly Ile Leu Ala Glu Gly Ile Ala Ser 195 200 205

Val Glu Asp Ile Asp Lys Ala Met Lys Leu Gly Ala Asn His Pro Met 210 215 220

Gly Pro Leu Glu Leu Gly Asp Phe Ile Gly Leu Asp Ile Cys Leu Ala 225 230 235 240

Ile Met Asp Val Leu Tyr Ser Glu Thr Gly Asp Ser Lys Tyr Arg Pro 245 250 255

His Thr Leu Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Gly Trp Leu Gly Arg Lys 260 265 270 Ser Gly Lys Gly Phe Tyr Asp Tyr Ser Lys 275 280

<210> 7

<211> 405

<212> PRT

<213> E. gracilis

<400> 7

Met Ala Met Phe Thr Thr Thr Ala Lys Val Ile Gln Pro Lys Ile Arg 10 15

Gly Phe Ile Cys Thr Thr Thr His Pro Ile Gly Cys Glu Lys Arg Val 25 30

Gln Glu Glu Ile Ala Tyr Ala Arg Ala His Pro Pro Thr Ser Pro Gly 40 45

Pro Lys Arg Val Leu Val Ile Gly Cys Ser Thr Gly Tyr Gly Leu Ser 50 55 60

Thr Arg Ile Thr Ala Ala Phe Gly Tyr Gln Ala Ala Thr Leu Gly Val 65 70 75 80

Phe Leu Ala Gly Pro Pro Thr Lys Gly Arg Pro Ala Ala Ala Gly Trp 85 90 95

Tyr Asn Thr Val Ala Phe Glu Lys Ala Ala Leu Glu Ala Gly Leu Tyr 100 105 110

Ala Arg Ser Leu Asn Gly Asp Ala Phe Asp Ser Thr Thr Lys Ala Arg 115 120 125

Thr Val Glu Ala Ile Lys Arg Asp Leu Gly Thr Val Asp Leu Val Val 130 135 140 Tyr Ser Ile Ala Ala Pro Lys Arg Thr Asp Pro Ala Thr Gly Val Leu 145 150 155 160

His Lys Ala Cys Leu Lys Pro Ile Gly Ala Thr Tyr Thr Asn Arg Thr 165 170 175

Val Asn Thr Asp Lys Ala Glu Val Thr Asp Val Ser Ile Glu Pro Ala 180 185 190

Ser Pro Glu Glu Ile Ala Asp Thr Val Lys Val Met Gly Gly Glu Asp 195 200 205

Trp Glu Leu Trp Ile Gln Ala Leu Ser Glu Ala Gly Val Leu Ala Glu 210 215 220

Gly Ala Lys Thr Val Ala Tyr Ser Tyr Ile Gly Pro Glu Met Thr Trp 225 230 235 240

Pro Val Tyr Trp Ser Gly Thr Ile Gly Glu Ala Lys Lys Asp Val Glu 245 250 255

Lys Ala Ala Lys Arg Ile Thr Gln Gln Tyr Gly Cys Pro Ala Tyr Pro 260 265 270

Val Val Ala Lys Ala Leu Val Thr Gln Ala Ser Ser Ala Ile Pro Val 275 280 285

Val Pro Leu Tyr Ile Cys Leu Leu Tyr Arg Val Met Lys Glu Lys Gly 290 295 300

Thr His Glu Gly Cys Ile Glu Gln Met Val Arg Leu Leu Thr Thr Lys 305 310 315 320

Leu Tyr Pro Glu Asn Gly Ala Pro Ile Val Asp Glu Ala Gly Arg Val 325 330 335

Arg Val Asp Asp Trp Glu Met Ala Glu Asp Val Gln Gln Ala Val Lys 17

345 350

Asp Leu Trp Ser Gln Val Ser Thr Ala Asn Leu Lys Asp Ile Ser Asp 355 360 365

Phe Ala Gly Tyr Gln Thr Glu Phe Leu Arg Leu Phe Gly Phe Gly Ile 370 375 380

Asp Gly Val Asp Tyr Asp Gln Pro Val Asp Val Glu Ala Asp Leu Pro 385 390 395 400

Ser Ala Ala Gln Gln 405

<210> 8

<211> 397

<212> PRT

<213> A. hydrophila

<400> 8

Met Ile Ile Lys Pro Lys Val Arg Gly Phe Ile Cys Thr Thr Thr His 10 15

Pro Val Gly Cys Glu Ala Asn Val Arg Arg Gln Ile Ala Tyr Thr Lys 25 30

Ala Lys Gly Thr Ile Glu Asn Gly Pro Lys Lys Val Leu Val Ile Gly 40 45

Ala Ser Thr Gly Tyr Gly Leu Ala Ser Arg Ile Ala Ala Ala Phe Gly 50 55 60

Ser Gly Ala Ala Thr Leu Gly Val Phe Phe Glu Lys Ala Gly Ser Glu 65 70 75 80

Thr Lys Thr Ala Thr Ala Gly Trp Tyr Asn Ser Ala Ala Phe Asp Lys 85 90 95

Ala Ala Lys Glu Ala Gly Leu Tyr Ala Lys Ser Ile Asn Gly Asp Ala 100 105 110

Phe Ser Asn Glu Cys Arg Ala Lys Val Ile Glu Leu Ile Lys Gln Asp 115 120 125

Leu Gly Gln Ile Asp Leu Val Val Tyr Ser Leu Ala Ser Pro Val Arg 130 135 140

Lys Leu Pro Asp Thr Gly Glu Val Val Arg Ser Ala Leu Lys Pro Ile 145 150 155 160

Gly Glu Val Tyr Thr Thr Thr Ala Ile Asp Thr Asn Lys Asp Gln Ile 165 170 175

Ile Thr Ala Thr Val Glu Pro Ala Asn Glu Glu Glu Ile Gln Asn Thr 180 185 190

Ile Thr Val Met Gly Gly Gln Asp Trp Glu Leu Trp Met Ala Ala Leu 195 200 205

Arg Asp Ala Gly Val Leu Ala Asp Gly Ala Lys Ser Val Ala Tyr Ser 210 215 220

Tyr Ile Gly Thr Asp Leu Thr Trp Pro Ile Tyr Trp His Gly Thr Leu 225 230 235 240

Gly Arg Ala Lys Glu Asp Leu Asp Arg Ala Ala Ala Ala Ile Arg Gly 245 250 255

Asp Leu Ala Gly Lys Gly Gly Thr Ala His Val Ala Val Leu Lys Ser 260 265 270

Val Val Thr Gln Ala Ser Ser Ala Ile Pro Val Met Pro Leu Tyr Ile 275 280 285 Ser Met Ala Phe Lys Ile Met Lys Glu Lys Gly Ile His Glu Gly Cys 290 295 300

Met Glu Gln Val Asp Arg Met Met Arg Thr Arg Leu Tyr Ala Ala Asp 305 310 315 320

Met Ala Leu Asp Asp Gln Ala Arg Ile Arg Met Asp Asp Trp Glu Leu 325 330 335

Arg Glu Asp Val Gln Gln Thr Cys Arg Asp Leu Trp Pro Ser Ile Thr 340 345 350

Ser Glu Asn Leu Cys Glu Leu Thr Asp Tyr Thr Gly Tyr Lys Gln Glu 355 360 365

Phe Leu Arg Leu Phe Gly Phe Gly Leu Glu Glu Val Asp Tyr Asp Ala 370 375 380

Asp Val Asn Pro Asp Val Lys Phe Asp Val Val Glu Leu 385 390 395

<210> 9 <211> 318 <212> PRT

<213> Clostridiumacetobutylicum <400> 9

Met Asn Leu Leu Asn Leu Phe Thr Tyr Val Ile Pro Ile Ala Ile Cys 10 15

Ile Ile Leu Pro Ile Phe Ile Ile Val Thr His Phe Gln Ile Lys Ser 25 30

Leu Asn Lys Ala Val Thr Ser Phe Asn Lys Gly Asp Arg Ser Asn Ala 40 45

Leu Glu Ile Leu Ser Lys Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Asn Val Lys 50 55 60

Ala Asn Ala Tyr Ile Thr Arg Glu Arg Ile Tyr Phe Tyr Ser Arg Asp 65 70 75 80

Phe Glu Leu Ser Leu Arg Asp Leu Leu Gln Ala Ile Lys Leu Arg Pro 85 90 95

Lys Thr Ile Asn Asp Val Tyr Ser Phe Ala Leu Ser Tyr His Ile Leu 100 105 110

Gly Glu Pro Glu Arg Ala Leu Lys Tyr Phe Leu Arg Ala Val Glu Leu 115 120 125

Gln Pro Asn Val Gly Ile Ser Tyr Glu Asn Leu Ala Trp Phe Tyr Tyr 130 135 140

Leu Thr Gly Lys Tyr Asp Lys Ala Ile Glu Asn Phe Glu Lys Ala Ile 145 150 155 160

Ser Met Gly Ser Thr Asn Ser Val Tyr Arg Ser Leu Gly Ile Thr Tyr 165 170 175

Ala Lys Ile Gly Asp Tyr Lys Lys Ser Glu Glu Tyr Leu Lys Lys Ala 180 185 190

Leu Asp Ala Glu Pro Glu Lys Pro Ser Thr His Ile Tyr Phe Ser Tyr 195 200 205

Leu Lys Arg Lys Thr Asn Asp Ile Lys Leu Ala Lys Glu Tyr Ala Leu 210 215 220

Lys Ala Ile Glu Leu Asn Lys Asn Asn Phe Asp Gly Tyr Lys Asn Leu 225 230 235 240

Ala Glu Val Asn Leu Ala Glu Asp Asp Tyr Asp Gly Phe Tyr Lys Asn 245 250 255 Leu Glu Ile Phe Leu Glu Lys Ile Asn Phe Val Thr Asn Gly Glu Asp 260 265 270

Phe Asn Asp Glu Val Tyr Asp Lys Val Lys Asp Asn Glu Lys Phe Lys 275 280 285

Glu Leu Ile Ala Lys Thr Lys Val Ile Lys Phe Lys Asp Leu Gly Ile 290 295 300

Glu Ile Asp Asp Lys Lys Ile Leu Asn Gly Lys Phe Leu Val 305 310 315

<210> 10 <211> 389 <212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum ATCC 824 <400> 10

Met Leu Ser Phe Asp Tyr Ser Ile Pro Thr Lys Val Phe Phe Gly Lys 10 15

Gly Lys Ile Asp Val Ile Gly Glu Glu Ile Lys Lys Tyr Gly Ser Arg 25 30

Val Leu Ile Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Lys Arg Asn Gly Ile Tyr 40 45

Asp Arg Ala Thr Ala Ile Leu Lys Glu Asn Asn Ile Ala Phe Tyr Glu 50 55 60

Leu Ser Gly Val Glu Pro Asn Pro Arg Ile Thr Thr Val Lys Lys Gly 65 70 75 80

Ile Glu Ile Cys Arg Glu Asn Asn Val Asp Leu Val Leu Ala Ile Gly 85 90 95 Gly Gly Ser Ala Ile Asp Cys Ser Lys Val Ile Ala Ala Gly Val Tyr 100 105 110

Tyr Asp Gly Asp Thr Trp Asp Met Val Lys Asp Pro Ser Lys Ile Thr 115 120 125

Lys Val Leu Pro Ile Ala Ser Ile Leu Thr Leu Ser Ala Thr Gly Sér 130 135 140

Glu Met Asp Gln Ile Ala Val Ile Ser Asn Met Glu Thr Asn Glu Lys 145 150 155 160

Leu Gly Val Gly His Asp Asp Met Arg Pro Lys Phe Ser Val Leu Asp 165 170 175

Pro Thr Tyr Thr Phe Thr Val Pro Lys Asn Gln Thr Ala Ala Gly Thr 180 185 190

Ala Asp Ile Met Ser His Thr Phe Glu Ser Tyr Phe Ser Gly Val Glu 195 200 205

Gly Ala Tyr Val Gln Asp Gly Ile Arg Glu Ala Ile Leu Arg Thr Cys 210 215 220

Ile Lys Tyr Gly Lys Ile Ala Met Glu Lys Thr Asp Asp Tyr Glu Ala 225 230 235 240

Arg Ala Asn Leu Met Trp Ala Ser Ser Leu Ala Ile Asn Gly Leu Leu

245 250 255

Ser Leu Gly Lys Asp Arg Lys Trp Ser Cys His Pro Met Glu His Glu 260 265 270

Leu Ser Ala Tyr Tyr Asp Ile Thr His Gly Val Gly Leu Ala Ile Leu 275 280 285

Thr Pro Asn Trp Met Glu Tyr Ile Leu Asn Asp Asp Thr Leu His Lys 290 295 300 Phe Val Ser Tyr Gly Ile Asn Val Trp Gly Ile Asp Lys Asn Lys Asp 305 310 315 320

Asn Tyr Glu Ile Ala Arg Glu Ala Ile Lys Asn Thr Arg Glu Tyr Phe 325 330 335

Asn Ser Leu Gly Ile Pro Ser Lys Leu Arg Glu Val Gly Ile Gly Lys 340 345 350

Asp Lys Leu Glu Leu Met Ala Lys Gln Ala Val Arg Asn Ser Gly Gly 355 360 365

Thr Ile Gly Ser Leu Arg Pro Ile Asn Ala Glu Asp Val Leu Glu Ile 370 375 380

Phe Lys Lys Ser Tyr 385

<210> 11 <211> 390 <212> PRT

<213> Clostridium acetobutylicum ATCC 824 <400> 11

Met Val Asp Phe Glu Tyr Ser Ile Pro Thr Arg Ile Phe Phe Gly Lys 10 15

Asp Lys Ile Asn Val Leu Gly Arg Glu Leu Lys Lys Tyr Gly Ser Lys 25 30

Val Leu Ile Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Lys Arg Asn Gly Ile Tyr 40 45

Asp Lys Ala Val Ser Ile Leu Glu Lys Asn Ser Ile Lys Phe Tyr Glu 50 55 60 Leu Ala Gly Val Glu Pro Asn Pro Arg Val Thr Thr Val Glu Lys Gly 65 70 75 80

Val Lys Ile Cys Arg Glu Asn Gly Val Glu Val Val Leu Ala Ile Gly 85 90 95

Gly Gly Ser Ala Ile Asp Cys Ala Lys Val Ile Ala Ala Ala Cys Glu 100 105 110

Tyr Asp Gly Asn Pro Trp Asp Ile Val Leu Asp Gly Ser Lys Ile Lys 115 120 125

Arg Val Leu Pro Ile Ala Ser Ile Leu Thr Ile Ala Ala Thr Gly Ser 130 135 140

Glu Met Asp Thr Trp Ala Val Ile Asn Asn Met Asp Thr Asn Glu Lys 145 150 155 , 160

Leu Ile Ala Ala His Pro Asp Met Ala Pro Lys Phe Ser Ile Leu Asp 165 170 175

Pro Thr Tyr Thr Tyr Thr Val Pro Thr Asn Gln Thr Ala Ala Gly Thr 180 185 190

Ala Asp Ile Met Ser His Ile Phe Glu Val Tyr Phe Ser Asn Thr Lys 195 200 205

Thr Ala Tyr Leu Gln Asp Arg Met Ala Glu Ala Leu Leu Arg Thr Cys 210 215 220

Ile Lys Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Glu Lys Pro Asp Asp Tyr Glu Ala 225 230 235 240

Arg Ala Asn Leu Met Trp Ala Ser Ser Leu Ala Ile Asn Gly Leu Leu 245 250 255

Thr Tyr Gly Lys Asp Thr Asn Trp Ser Val His Leu Met Glu His Glu 260 265 270

Leu Ser Ala Tyr Tyr Asp Ile Thr His Gly Val Gly Leu Ala Ile Leu 275 280 285

Thr Pro Asn Trp Met Glu Tyr Ile Leu Asn Asn Asp Thr Val Tyr Lys 290 295 300

Phe Val Glu Tyr Gly Val Asn Val Trp Gly Ile Asp Lys Glu Lys Asn 305 310 315 320

His Tyr Asp Ile Ala His Gln Ala Ile Gln Lys Thr Arg Asp Tyr Phe 325 330 335

Val Asn Val Leu Gly Leu Pro Ser Arg Leu Arg Asp Val Gly Ile Glu 340 345 350

Glu Glu Lys Leu Asp Ile Met Ala Lys Glu Ser Val Lys Leu Thr Gly 355 360 365

Gly Thr Ile Gly Asn Leu Arg Pro Val Asn Ala Ser Glu Val Leu Gln 370 375 380

Ile Phe Lys Lys Ser Val 385 390 <210> 12 <211> 552 <212> PRT <213> Citrobacter freundii

<400> 12

Met Ser Gln Phe Phe Phe Asn Gln Arg Thr His Leu Val Ser Asp Val 10 15

Ile Asp Gly Thr Ile Ile Ala Ser Pro Trp Asn Asn Leu Ala Arg Leu 26

30

Glu Ser Asp Pro Ala Ile Arg Ile Val Val Arg Arg Asp Leu Asn Lys 40 45

Asn Asn Val Ala Val Ile Ser Gly Gly Gly Ser Gly His Glu Pro Ala 50 55 60

His Val Gly Phe Ile Gly Lys Gly Met Leu Thr Ala Ala Val Cys Gly 65 70 75 80

Asp Val Phe Ala Ser Pro Ser Val Asp Ala Val Leu Thr Ala Ile Gln 85 90 95

Ala Val Thr Gly Glu Ala Gly Cys Leu Leu Ile Val Lys Asn Tyr Thr 100 105 110

Gly Asp Arg Leu Asn Phe Gly Leu Ala Ala Glu Lys Ala Arg Arg Leu 115 120 125

Gly Tyr Asn Val Glu Met Leu Ile Val Gly Asp Asp Ile Ser Leu Pro 130 135 140

Asp Asn Lys His Pro Arg Gly Ile Ala Gly Thr Ile Leu Val His Lys 145 150 155 160

Ile Ala Gly Tyr Phe Ala Glu Arg Gly Tyr Asn Leu Ala Thr Val Leu 165 170 175

Arg Glu Ala Gln Tyr Ala Ala Asn Asn Thr Phe Ser Leu Gly Val Ala 180 185 190

Leu Ser Ser Cys His Leu Pro Gln Glu Ala Asp Ala Ala Pro Arg His 195 200 205

His Pro Gly His Ala Glu Leu Gly Met Gly Ile His Gly Glu Pro Gly 210 215 220 Ala Ser Val Ile Asp Thr Gln Asn Ser Ala Gln Val Val Asn Leu Met 225 230 235 240

Val Asp Lys Leu Met Ala Ala Leu Pro Glu Thr Gly Arg Leu Ala Val 245 250 255

Met Ile Asn Asn Leu Gly Gly Val Ser Val Ala Glu Met Ala Ile Ile 260 265 270

Thr Arg Glu Leu Ala Ser Ser Pro Leu His Pro Arg Ile Asp Trp Leu 275 280 285

Ile Gly Pro Ala Ser Leu Val Thr Ala Leu Asp Met Lys Ser Phe Ser 290 295 300

Leu Thr Ala Ile Val Leu Glu Glu Ser Ile Glu Lys Ala Leu Leu Thr 305 310 315 320

Glu Val Glu Thr Ser Asn Trp Pro Thr Pro Val Pro Pro Arg Glu Ile 325 330 335

Ser Cys Val Pro Ser Ser Gln Arg Ser Ala Arg Val Glu Phe Gln Pro 340 345 350

Ser Ala Asn Ala Met Val Ala Gly Ile Val Glu Leu Val Thr Thr Thr 355 360 365

Leu Ser Asp Leu Glu Thr His Leu Asn Ala Leu Asp Ala Lys Val Gly 370 375 380

Asp Gly Asp Thr Gly Ser Thr Phe Ala Ala Gly Ala Arg Glu Ile Ala 385 390 395 400

Ser Leu Leu His Arg Gln Gln Leu Pro Leu Asp Asn Leu Ala Thr Leu 405 410 415

Phe Ala Leu Ile Gly Glu Arg Leu Thr Val Val Met Gly Gly Ser Ser 420 425 430

Gly Val Leu Met Ser Ile Phe Phe Thr Ala Ala Gly Gln Lys Leu Glu 435 440 445

Gln Gly Ala Ser Val Ala Glu Ser Leu Asn Thr Gly Leu Ala Gln Met 450 455 460

Lys Phe Tyr Gly Gly Ala Asp Glu Gly Asp Arg Thr Met Ile Asp Ala 465 470 475 480

Leu Gln Pro Ala Leu Thr Ser Leu Leu Thr Gln Pro Gln Asn Leu Gln 485 490 495

Ala Ala Phe Asp Ala Ala Gln Ala Gly Ala Glu Arg Thr Cys Leu Ser 500 505 510

Ser Lys Ala Asn Ala Gly Arg Ala Ser Tyr Leu Ser Ser Glu Ser Leu 515 520 525

Leu Gly Asn Met Asp Pro Gly Ala His Ala Val Ala Met Val Phe Lys 530 535 540

Ala Leu Ala Glu Ser Glu Leu Gly 545 550

<210> 13

<211> 364

<212> PRT

<213> Candidaboidinii

<400> 13

Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp 10 15 Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn 25 30

Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu 40 45

Gly Glu Thr Ser Glu Leu Asp Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile 50 55 60

Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Leu Asp 65 70 75 80

Lys Ala Lys Asn Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp 85 90 95

His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val 100 105 110

Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val 115 120 125

Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln 130 135 140

Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr 145 150 155 160

Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly 165 170 175

Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Leu Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu 180 185 190

Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ala Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly 195 200 205

Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile 210 215 220

Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn 225 230 235 240

Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr 245 250 255

Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu 260 265 270

Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro 275 280 285

Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala 290 295 300

Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln 305 310 315 320

Thr Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr 325 330 335

Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu

340 345 350

Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys 355 360

<210> 14 <211> 549 <212> PRT

<213> Klebsiellapneumoniae <400> 14

Met Ser Gln Phe Phe Phe Asn Gln Arg Ala Ser Leu Val Asn Asp Val 10 15 Ile Glu Gly Thr Ile Ile Ala Ser Pro Trp Asn Asn Leu Ala Arg Leu 25 30

Glu Ser Asp Pro Ala Ile Arg Val Val Val Arg Arg Asp Leu Asn Lys 40 45

Asn Asn Val Ala Val Ile Ser Gly Gly Gly Ala Gly His Glu Pro Ala 50 55 60

His Val Gly Phe Ile Gly Lys Gly Met Leu Thr Ala Ala Val Cys Gly 65 70 75 80

Asp Leu Phe Ala Ser Pro Ser Val Asp Ala Val Leu Thr Ala Ile Gln 85 90 95

Ala Val Thr Gly Glu Ala Gly Cys Leu Leu Ile Val Lys Asn Tyr Thr 100 105 110

Gly Asp Arg Leu Asn Phe Gly Leu Ala Ala Glu Lys Ala Arg Arg Leu 115 120 125

Gly Tyr Asn Val Glu Met Leu Ile Val Gly Asp Asp Ile Ser Leu Pro 130 135 140

Asp Asn Lys Gln Pro Arg Gly Ile Ala Gly Thr Ile Leu Val His Lys 145 150 155 160

Val Ala Gly Tyr Phe Ala Glu Arg Gly Phe Asn Leu Ala Thr Val Leu 165 170 175

Arg Glu Ala Gln Tyr Ala Ala Ser His Thr Ala Ser Ile Gly Val Ala 180 185 190

Leu Ala Ser Cys His Leu Pro Gln Glu Ala Asp Ser Ala Pro Arg His 195 200 205

Gln Ala Gly His Ala Glu Leu Gly Met Gly Ile His Gly Glu Pro Gly 210 215 220

Ala Ser Thr Ile Ala Thr Gln Asn Ser Ala Glu Ile Val Asn Leu Met 225 230 235 240

Val Glu Lys Leu Thr Ala Ala Leu Pro Glu Thr Gly Arg Leu Ala Val 245 250 255

Met Leu Asn Asn Leu Gly Gly Val Ser Val Ala Glu Met Ala Ile Leu 260 265 270

Thr Arg Glu Leu Ala Asn Thr Pro Leu Gln Ala Arg Ile Asp Trp Leu 275 280 285

Ile Gly Pro Ala Ser Leu Val Thr Ala Leu Asp Met Lys Gly Phe Ser 290 295 300

Leu ThrAIa Ile Val Leu Glu Glu Ser Ile Glu Lys Ala Leu Leu Ser 305 310 315 320

Asp Val Glu Thr Ala Ser Trp Gln Lys Pro Val Gln Pro Arg Thr Ile 325 330 335

Asn Ala Val Pro Ser Thr Leu Asp Ser Ala Arg Val Asp Phe Thr Pro 340 345 350

Ser Ala Asn Pro Gln Val Gly Asp Tyr Val Ala Gln Val Thr Gly Ala 355 360 365

Leu Ile Asp Leu Glu Glu His Leu Asn Ala Leu Asp Ala Lys Val Gly 370 375 380

Asp Gly Asp Thr Gly Ser Thr Phe Ala Ala Gly Ala Arg Glu Ile Ala 385 390 395 400

Glu Arg Leu Glu Arg Gln Gln Leu Pro Leu Asn Asp Leu Pro Thr Leu 405 410 415 Phe Ala Leu Ile Gly Glu Arg Leu Thr Val Val Met Gly Gly Ser Ser 420 425 430

Gly Val Leu Met Ser Ile Phe Phe Thr Ala Ala Gly Gln Lys Leu Gly 435 440 445

Gln Gly Ala Ser Val Ala Glu Ala Leu Asn Ala Gly Leu Glu Gln Met 450 455 460

Lys Phe Tyr Gly Gly Ala Asp Glu Gly Asp Arg Thr Met Ile Asp Ala 465 470 475 480

Leu Gln Pro Ala Leu Ala Ala Leu Leu Ala Glu Pro Glu Asn Leu Gln 485 490 495

Ala Ala Phe Ala Ala Ala Gln Ala Gly Ala Asp Arg Thr Cys Gln Ser 500 505 510

Ser Lys Ala Gly Ala Gly Arg Ala Ser Tyr Leu Asn Ser Asp Ser Leu 515 520 525

Leu Gly Asn Met Asp Pro Gly Ala His Ala Val Ala Met Val Phe Lys

530 535 540

Ala Leu Ala Glu Arg 545

<210> 15 <211> 584 <212> PRT

<213> Saccharomycescerevisiae <400> 15

Met Ser Ala Lys Ser Phe Glu Val Thr Asp Pro Val Asn Ser Ser Leu 10 15

Lys Gly Phe Ala Leu Ala Asn Pro Ser Ile Thr Leu Val Pro Glu Glu 25 30

Lys Ile Leu Phe Arg Lys Thr Asp Ser Asp Lys Ile Ala Leu Ile Ser 40 45

Gly Gly Gly Ser Gly His Glu Pro Thr His Ala Gly Phe Ile Gly Lys 50 55 60

Gly Met Leu Ser Gly Ala Val Val Gly Glu Ile Phe Ala Ser Pro Ser 65 70 75 80

Thr Lys Gln Ile Leu Asn Ala Ile Arg Leu Val Asn Glu Asn Ala Ser 85 90 95

Gly Val Leu Leu Ile Val Lys Asn Tyr Thr Gly Asp Val Leu His Phe 100 105 110

Gly Leu Ser Ala Glu Arg Ala Arg Ala Leu Gly Ile Asn Cys Arg Val 115 120 125

Ala Val Ile Gly Asp Asp Val Ala Val Gly Arg Glu Lys Gly Gly Met 130 135 140

Val Gly Arg Arg Ala Leu Ala Gly Thr Val Leu Val His Lys Ile Val 145 150 155 160

Gly Ala Phe Ala Glu Glu Tyr Ser Ser Lys Tyr Gly Leu Asp Gly Thr 165 170 175

Ala Lys Val Ala Lys Ile Ile Asn Asp Asn Leu Val Thr Ile Gly Ser 180 185 190

Ser Leu Asp His Cys Lys Val Pro Gly Arg Lys Phe Glu Ser Glu Leu 195 200 205

Asn Glu Lys Gln Met Glu Leu Gly Met Gly Ile His Asn Glu Pro Gly 210 215 220 Val Lys Val Leu Asp Pro Ile Pro Ser Thr Glu Asp Leu Ile Ser Lys 225 230 235 240

Tyr Met Leu Pro Lys Leu Leu Asp Pro Asn Asp Lys Asp Arg Ala Phe 245 250 255

Val Lys Phe Asp Glu Asp Asp Glu Val Val Leu Leu Val Asn Asn Leu 260 265 270

Gly Gly Val Ser Asn Phe Val Ile Ser Ser Ile Thr Ser Lys Thr Thr 275 280 285

Asp Phe Leu Lys Glu Asn Tyr Asn Ile Thr Pro Val Gln Thr Ile Ala 290 295 300

Gly Thr Leu Met Thr Ser Phe Asn Gly Asn Gly Phe Ser Ile Thr Leu 305 310 315 320

Leu Asn Ala Thr Lys Ala Thr Lys Ala Leu Gln Ser Asp Phe Glu Glu 325 330 335

Ile Lys Ser Val Leu Asp Leu Leu Asn Ala Phe Thr Asn Ala Pro Gly 340 345 350

Trp Pro Ile Ala Asp Phe Glu Lys Thr Ser Ala Pro Ser Val Asn Asp 355 360 365

Asp Leu Leu His Asn Glu Val Thr Ala Lys Ala Val Gly Thr Tyr Asp 370 375 380

Phe Asp Lys Phe Ala Glu Trp Met Lys Ser Gly Ala Glu Gln Val Ile 385 390 395 400

Lys Ser Glu Pro His Ile Thr Glu Leu Asp Asn Gln Val Gly Asp Gly 405 410 415

Asp Cys Gly Tyr Thr Leu Val Ala Gly Val Lys Gly Ile Thr Glu Asn 420 425 430

Leu Asp Lys Leu Ser Lys Asp Ser Leu Ser Gln Ala Val Ala Gln Ile 435 440 445

Ser Asp Phe Ile Glu Gly Ser Met Gly Gly Thr Ser Gly Gly Leu Tyr 450 455 460

Ser Ile Leu Leu Ser Gly Phe Ser His Gly Leu Ile Gln Val Cys Lys 465 470 475 480

Ser Lys Asp Glu Pro Val Thr Lys Glu Ile Val Ala Lys Ser Leu Gly 485 490 495

Ile Ala Leu Asp Thr Leu Tyr Lys Tyr Thr Lys Ala Arg Lys Gly Ser 500 505 510

Ser Thr Met Ile Asp Ala Leu Glu Pro Phe Val Lys Glu Phe Thr Ala 515 520 525

Ser Lys Asp Phe Asn Lys Ala Val Lys Ala Ala Glu Glu Gly Ala Lys

530 535 540

Ser Thr Ala Thr Phe Glu Ala Lys Phe Gly Arg Ala Ser Tyr Val Gly 545 550 555 560

Asp Ser Ser Gln Val Glu Asp Pro Gly Ala Val Gly Leu Cys Glu Phe 565 570 575

Leu Lys Gly Val Gln Ser Ala Leu 580

<210> 16 <211> 591 <212> PRT

<213> Saccharomycescerevisiae

<400> 16 Met Ser His Lys Gln Phe Lys Ser Asp Gly Asn Ile Val Thr Pro Tyr 10 15

Leu Leu Gly Leu Ala Arg Ser Asn Pro Gly Leu Thr Val Ile Lys His 25 30

Asp Arg Val Val Phe Arg Thr Ala Ser Ala Pro Asn Ser Gly Asn Pro 40 45

Pro Lys Val Ser Leu Val Ser Gly Gly Gly Ser Gly His Glu Pro Thr 50 55 60

His Ala Gly Phe Val Gly Glu Gly Ala Leu Asp Ala Ile Ala Ala Gly 65 70 75 80

Ala Ile Phe Ala Ser Pro Ser Thr Lys Gln Ile Tyr Ser Ala Ile Lys 85 90 95

Ala Val Glu Ser Pro Lys Gly Thr Leu Ile Ile Val Lys Asn Tyr Thr 100 105 110

Gly Asp Ile Ile His Phe Gly Leu Ala Ala Glu Arg Ala Lys Ala Ala 115 120 125

Gly Met Lys Val Glu Leu Val Ala Val Gly Asp Asp Val Ser Val Gly 130 135 140

Lys Lys Lys Gly Ser Leu Val Gly Arg Arg Gly Leu Gly Ala Thr Val 145 150 155 160

Leu Val His Lys Ile Ala Gly Ala Ala Ala Ser His Gly Leu Glu Leu 165 170 175

Ala Glu Val Ala Glu Val Ala Gln Ser Val Val Asp Asn Ser Val Thr 180 185 190

Ile Ala Ala Ser Leu Asp His Cys Thr Val Pro Gly His Lys Pro Glu 195 200 205

Ala Ile Leu Gly Glu Asn Glu Tyr Glu Ile Gly Met Gly Ile His Asn 210 215 220

Glu Ser Gly Thr Tyr Lys Ser Ser Pro Leu Pro Ser Ile Ser Glu Leu 225 230 235 240

Val Ser Gln Met Leu Pro Leu Leu Leu Asp Glu Asp Glu Asp Arg Ser 245 250 255

Tyr Val Lys Phe Glu Pro Lys Glu Asp Val Val Leu Met Val Asn Asn 260 265 270

Met Gly Gly Met Ser Asn Leu Glu Leu Gly Tyr Ala Ala Glu Val Ile 275 280 285

Ser Glu Gln Leu Ile Asp Lys Tyr Gln Ile Val Pro Lys Arg Thr Ile 290 295 300

Thr Gly Ala Phe Ile Thr Ala Leu Asn Gly Pro Gly Phe Gly Ile Thr 305 310 315 320

Leu Met Asn Ala Ser Lys Ala Gly Gly Asp Ile Leu Lys Tyr Phe Asp 325 330 335

Tyr Pro Thr Thr Ala Ser Gly Trp Asn Gln Met Tyr His Ser Ala Lys 340 345 350

Asp Trp Glu Val Leu Ala Lys Gly Gln Val Pro Thr Ala Pro Ser Leu 355 360 365

Lys Thr Leu Arg Asn Glu Lys Gly Ser Gly Val Lys Ala Asp Tyr Asp 370 375 380

Thr Phe Ala Lys Ile Leu Leu Ala Gly Ile Ala Lys Ile Asn Glu Val 385 390 395 400 Glu Pro Lys Val Thr Trp Tyr Asp Thr Ile Ala Gly Asp Gly Asp Cys 405 410 415

Gly Thr Thr Leu Val Ser Gly Gly Glu Ala Leu Glu Glu Ala Ile Lys 420 425 430

Asn His Thr Leu Arg Leu Glu Asp Ala Ala Leu Gly Ile Glu Asp Ile 435 440 445

Ala Tyr Met Val Glu Asp Ser Met Gly Gly Thr Ser Gly Gly Leu Tyr 450 455 460

Ser Ile Tyr Leu Ser Ala Leu Ala Gln Gly Val Arg Asp Ser Gly Asp 465 470 475 480

Lys Glu Leu Thr Ala Glu Thr Phe Lys Lys Ala Ser Asn Val Ala Leu 485 490 495

Asp Ala Leu Tyr Lys Tyr Thr Arg Ala Arg Pro Gly Tyr Arg Thr Leu

500 505 510

Ile Asp Ala Leu Gln Pro Phe Val Glu Ala Leu Lys Ala Gly Lys Gly 515 520 525

Pro Arg Ala Ala Ala Gln Ala Ala Tyr Asp Gly Ala Glu Lys Thr Arg 530 535 540

Lys Met Asp Ala Leu Val Gly Arg Ala Ser Tyr Val Ala Lys Glu Glu 545 550 555 560

Leu Arg Lys Leu Asp Ser Glu Gly Gly Leu Pro Asp Pro Gly Ala Val 565 570 575

Gly Leu Ala Ala Leu Leu Asp Gly Phe Val Thr Ala Ala Gly Tyr 580 585 590

<210> 17 <211> 2253 <212> DNA <213> pGV772

<400> 17

ctcgagtccc tatcagtgat agagattgac atccctatca gtgatagaga tactgagcac 60 atcagcagga cgcactgacc gaattcatta aagaggagaa aggtaccggg ccccccctcg 120 aggtcgacgg tatcgataag cttgatatcg aattcctgca gcccggggga tcccatggta 180 cgcgtgctag aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt 240 tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatccgccgc cctagaccta 300 ggcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 360 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 420 cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 480 aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 540 tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 600 ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat 660 ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 720 cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 780 ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 840 gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 900 atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 960 aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1020 aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 1080

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg actagtgctt ggattctcac caataaaaaa 1140

cgcccggcgg caaccgagcg ttctgaacaa atccagatgg agttctgagg tcattactgg 1200

atctatcaac aggagtccaa gcgagctctc gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg 1260

tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg 1320

aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct 1380

atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg 1440

ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg 1500

ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc 1560

tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg 1620 atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc 1680

cgcattgcat cagccatgat ggatactttc tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga 1740

tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg 1800

agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc 1860

tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc 1920

gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag 1980

ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc 2040

atgcgaaacg atcctcatcc tgtctcttga tcagatcttg atcccctgcg ccatcagatc 2100

cttggcggca agaaagccat ccagtttact ttgcagggct tcccaacctt accagagggc 2160 gccccagctg gcaattccga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa 2220

aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctt cac 2253

<210> 18 <211> 3068 <212> DNA <213> pGV1010

<400> 18

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagataaatg tgagcggata acattgacat 1020 tgtgagcgga taacaagata ctgagcacat cagcaggacg cactgaccga attcattjaaa 1080 gaggagaaag gtaccatgtc agttttcgtt tcaggtgcta acgggttcat tgcccaacac 1140 attgtcgatc tcctgttgaa ggaagactat aaggtcatcg gttctgccag aagtcaagaa 1200 aaggccgaga atttaacgga ggcctttggt aacaacccaa aattctccat ggaagttgtc 1260 ccagacatat ctaagctgga cgcatttgac catgttttcc aaaagcacgg caaggatatc 1320 aagatagttc tacatacggc ctctccattc tgctttgata tcactgacag tgaacgcgat 1380 ttattaattc ctgctgtgaa cggtgttaag ggaattctcc actcaattaa aaaatacgcc 1440 gctgattctg tagaacgtgt agttctcacc tcttcttatg cagctgtgtt cgatatggca 1500 aaagaaaacg ataagtcttt aacatttaac gaagaatcct ggaacccagc tacctgggag 1560 agttgccaaa gtgacccagt taacgcctac tgtggttcta agaagtttgc tgaaaaagca 1620 gcttgggaat ttctagagga gaatagagac tctgtaaaat tcgaattaac tgccgttaac 1680 ccagtttacg tttttggtcc gcaaatgttt gacaaagatg tgaaaaaaca cttgaacaca 1740 tcttgcgaac tcgtcaacag cttgatgcat ttatcaccag aggacaagat accggaacta 1800 tttggtggat acattgatgt tcgtgatgtt gcaaaggctc atttagttgc cttccaaaag 1860 agggaaacaa ttggtcaaag actaatcgta tcggaggcca gatttactat gcaggatgtt 1920 ctcgatatcc ttaacgaaga cttccctgtt ctaaaaggca atattccagt ggggaaacca 1980 ggttctggtg ctacccataa cacccttggt gctactcttg ataataaaaa gagtaagaaa 2040 ttgttaggtt tcaagttcag gaacttgaaa gagaccattg acgacactgc ctcccaaatt 2100 ttaaaatttg agggcagaat ataaggatcc catggtacgc gtgctagagg catcaaataa 2160 aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg 2220 ctctcctgag taggacaaat ccgccgccct agacctaggc gttcggctgc ggcgagcggt 2280 atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 2340 gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 2400 gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 2460 gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 2520 gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 2580 aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 2640 ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 2700 taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 2760 tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 2820 gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 2880 taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 2940 tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 3000 tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 3060 ggtcatga 3068 <210> 19 <211> 3231 <212> DNA <213> pGV1035

<400> 19

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60

tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120

atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180

gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240

cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300

attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420

ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480

aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540

cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600

aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660

cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720

aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780

ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840

tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900

tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020

gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccggg aattcttatt 1080

atttaggagg agtaaaacat gagagatgta gtaatagtaa gtgctgtaag aactgcaata 1140

ggagcatatg gaaaaacatt aaaggatgta cctgcaacag agttaggagc tatagtaata 1200

aaggaagctg taagaagagc taatataaat ccaaatgaga ttaatgaagt tatttttgga 1260

aatgtacttc aagctggatt aggccaaaac ccagcaagac aagcagcagt aaaagcagga 1320

ttacctttag aaacacctgc gtttacaatc aataaggttt gtggttcagg tttaagatct 1380

ataagtttag cagctcaaat tataaaagct ggagatgctg ataccattgt agtaggtggt 1440

atggaaaata tgtctagatc accatatttg attaacaatc agagatgggg tcaaagaatg 1500 ggagatagtg aattagttga tgaaatgata aaggatggtt tgtgggatgc atttaatgga 1560

tatcatatgg gagtaactgc agaaaatatt gcagaacaat ggaatataac aagagaagag 1620

caagatgaat tttcacttat gtcacaacaa aaagctgaaa aagccattaa aaatggagaa 1680

tttaaggatg aaatagttcc tgtattaata aagactaaaa aaggtgaaat agtctttgat 1740

caagatgaat ttcctagatt cggaaacact attgaagcat taagaaaact taaacctatt 1800

ttcaaggaaa atggtactgt tacagcaggt aatgcatccg gattaaatga tggagctgca 1860

gcactagtaa taatgagcgc tgataaagct aacgctctcg gaataaaacc acttgctaag 1920

attacttctt acggatcata tggggtagat ccatcaataa tgggatatgg agctttttat 1980

gcaactaaag ctgccttaga taaaattaat ttaaaacctg aagacttaga tttaattgaa 2040

gctaacgagg catatgcttc tcaaagtata gcagtaacta gagatttaaa tttagatatg 2100 agtaaagtta atgttaatgg tggagctata gcacttggac atccaatagg tgcatctggt 2160

gcacgtattt tagtaacatt actatacgct atgcaaaaaa gagattcaaa aaaaggtctt 2220

gctactctat gtattggtgg aggtcaggga acagctctcg tagttgaaag agactaagga 2280

tccgatccga tcccatggta cgcgtgctag aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg 2340

aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 2400

aatccgccgc cctagaccta ggcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 2460

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 2520

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 2580

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 2640 gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 2700

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 2760

aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 2820

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 2880

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 2940

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 3000

ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 3060

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3120

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 3180

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg a 3231 <210> 20 <211> 2908 <212> DNA <213> pGV1037

<400> 20

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60

tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120

atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180

gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240

cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300

attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420

ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480

aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540

cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600

aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660

cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720

aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780

ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840

tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900

tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020

gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgga attcattgat 1080

agtttcttta aatttaggga ggtctgttta atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt 1140

actatgggtt caggaattgc tcaggcattt gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga 1200

gatattaaag atgaatttgt tgatagagga ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa 1260

ttagttaaaa aaggaaagat agaagaagct actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc 1320

ggaacagttg accttaatat ggcagctgat tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa 1380

agaatggata ttaaaaagca gatttttgct gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca 1440

attcttgcat caaatacatc atcactttca ataacagaag tggcatcagc aactaaaaga 1500 cctgataagg ttataggtat gcatttcttt aatccagctc ctgttatgaa gcttgtagag 1560

gtaataagag gaatagctac atcacaagaa acttttgatg cagttaaaga gacatctata 1620

gcaataggaa aagatcctgt agaagtagca gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata 1680

ttaataccaa tgattaatga agcagttggt atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa 1740

gacatagata aagctatgaa acttggagct aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt 1800

gattttatag gtcttgatat atgtcttgct ataatggatg ttttatactc agaaactgga 1860

gattctaagt atagaccaca tacattactt aagaagtatg taagagcagg atggcttgga 1920

agaaaatcag gaaaaggttt ctacgattat tcaaaataag gatccgatcc catggtacgc 1980

gtgctagagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat 2040

ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgccct agacctaggc 2100 gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 2160

tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 2220

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 2280

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 2340

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 2400

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc 2460

agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 2520

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 2580

tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 2640 acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 2700

tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 2760

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 2820

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 2880

aactcacgtt aagggatttt ggtcatga 2908

<210> 21 <211> 3285 <212> DNA <213> pGV1039

<400> 21

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagataaatg tgagcggata acattgacat 1020 tgtgagcgga taacaagata ctgagcacat cagcaggacg cactgaccga attcgctcaa 1080 ttacacaacg gaggtataat aatgggcaaa gaaagtagtt ttagctgtgc atgtcgtaca 1140 gccatcggaa caatgggtgg atctcttagc acaattcctg cagtagattt aggtgctatc 1200 gttatcaaag aggctcttaa ccgcgcaggt gttaaacctg aagatgttga tcacgtatac 1260 atgggatgcg ttattcaggc aggacaggga cagaacgttg ctcgtcaggc ttctatcaag 1320

gctggtcttc ctgtagaagt acctgcagtt acaactaacg ttgtatgtgg ttcaggtctt 1380

aactgtgtta accaggcagc tcagatgatc atggctggag atgctgatat cgttgttgcc 1440

ggtggtatgg aaaacatgtc acttgcacca tttgcacttc ctaatggccg ttacggatat 1500

cgtatgatgt ggccaagcca gagccagggt ggtcttgtag acactatggt taaggatgct 1560

ctttgggatg ctttcaatga ttatcatatg atccagacag cagacaacat ctgcacagag 1620

tggggtctta cacgtgaaga gctcgatgag tttgcagcta agagccagaa caaggcttgt 1680

gcagcaatcg aagctggcgc attcaaggat gagatcgttc ctgtagagat caagaagaag 1740

aaagagacag ttatcttcga tacagatgaa ggcccaagac agggtgttac acctgaatct 1800 ctttcaaagc ttcgtcctat caacaaggat ggattcgtta cagctggtaa cgcttcaggt 1860

atcaacgacg gtgctgcagc actcgtagtt atgtctgaag agaaggctaa ggagctcggc 1920

gttaagccta tggctacatt cgtagctgga gcacttgctg gtgttcgtcc tgaagttatg 1980

ggtatcggtc ctgtagcagc tactcagaag gctatgaaga aggctggtat cgagaacgta 2040

tctgagttcg atatcatcga ggctaacgaa gcattcgcag ctcagtctgt agcagttggt 2100

aaggatcttg gaatcgacgt ccacaagcag ctcaatccta acggtggtgc tatcgctctt 2160

ggacacccag ttggagcttc aggtgctcgt atccttgtta cacttcttca cgagatgcag 2220

aagaaagacg ctaagaaggg tcttgctaca ctttgcatcg gtggcggtat gggatgcgct 2280

actatcgttg agaagtacga ataattaaac tttcagaggg tgtgaaggtc atataagatc 2340

aggatcccat ggtacgcgtg ctagaggcat caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac 2400 tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag gacaaatccg 2460

ccgccctaga cctaggcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 2520

tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 2580

aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 2640

ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 2700

aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 2760

cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 2820

cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 2880

aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 2940 cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 3000

ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 3060

ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 3120

gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 3180

agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 3240

acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catga 3285

<210> 22 <211> 2877 <212> DNA <213> pGV1040

<400> 22

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120

atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180

gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240

cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300

attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360

catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420

ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480

aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540

cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660

cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720

aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780

ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840

tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900

tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960

cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagataaatg tgagcggata acattgacat 1020

tgtgagcgga taacaagata ctgagcacat cagcaggacg cactgaccga attcccacac 1080

cctcttaata ctgctaataa ttggaggacg aatcaatgag ttttgtttta tatgaacaga 1140

aagataagat cgctgttgta actatcaacc gtccggaagc acttaatgct cttaactcag 1200 cagttctcga tgagcttaat gaagttctcg ataacgttga tcttaataca gttagagcac 1260

tcgttcttac cggtgctgga gataagtctt ttgtagctgg tgctgatatt ggagagatgt 1320

ccacacttac aaaggctgaa ggtgaagctt ttggtaagaa gggtaacgat gtattccgta 1380

agcttgagac acttcctatc cctgtaattg cagctgttaa cggctttgca cttggcggcg 1440

gatgtgagat ctctatgagc tgcgatatcc gtatctgctc agacaacgct atgttcggtc 1500

agcctgaagt tggtcttgga attactcctg gattcggcgg aacacagaga cttgcaagaa 1560

cagttggtgt tggtatggct aaacagctta tctacacagc tcgtaatatc aaagctgacg 1620

aagcacttcg tatcggcctt gtaaacgctg tatacactca ggaagagctt cttcctgcag 1680

ctgagaagct tgcaacaaca atcgctggta acgctcctat agctgttcgt gcttgtaaga 1740 aagctatcaa cgatggtctt cagactgata tcgacagcgc acttgtaatc gaagaaaagc 1800

tctttggttc atgcttcgag tcagaagatc aggtagaagg aatggctaac ttccttcgta 1860

agaaagatga tcctaagaag gttaagcacg tagatttcaa gaatgcttaa tatcgatctt 1920

tgatgtgata ttcggatccc atggtacgcg tgctagaggc atcaaataaa acgaaaggct 1980

cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt 2040

aggacaaatc cgccgcccta gacctaggcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 2100

caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 2160

caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 2220

ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 2280

cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 2340 ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 2400

tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 2460

gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 2520

ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 2580

ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 2640

gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 2700

aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 2760

tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 2820

ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatga 2877

<210> 23

<211> 2994

<212> DNA

<213> pGV1041

<400> 23

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480

aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540

cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600

aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660

cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720

aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780

ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840

tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900

tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagataaatg tgagcggata acattgacat 1020

tgtgagcgga taacaagata ctgagcacat cagcaggacg cactgaccga attctacaag 1080

gtgagtatta cagtcaaata atcggggatt aaatagacat atatcattta acggaaaata 1140

atagataaaa tatatctaag gaggatttac aatgaaagta gctgtaattg gtgcaggaac 1200

aatgggttct ggtattgcac aggcattcgc acagtgtgac gctgttgaga cagtttatct 1260

ttgcgatatc aagcaggagt tcgctgatgg cggtaagagc aagatcgaga agaatcttgg 1320

acgtcttgtt aagaaggaaa agatgactca ggaagctgct gatgcaatcg tagcaaaggt 1380

taagacaggt cttaacacaa tcgctacaga tcctgatctc gtagttgagg ctgcacttga 1440

agttatggat atcaagaaag cttgcttcaa ggaacttcag gagaacatcg ttaagaatcc 1500

tgattgtatc tatgcttcaa acacatcatc tctttcaatc acagagatcg gtgcaggtct 1560 taagactcct atcatcggaa tgcacttgtt caacccagct cctgttatga agctcatcga 1620

ggttatctca ggcgctaaca cacctaagga gacaacagag aaggttatcg agatctccaa 1680

gactcttggt aagacacctg tacaggttaa cgaggctcct ggattcgttg ttaaccgtat 1740

tcttattcca cttatcaacg aaggtatctt cgtatattca gaaggaattt ctgatatcga 1800

aggcatcgat acagctatga agcttggatg taaccatcct atgggacccc ttgaactggg 1860

tgactatgta ggtcttgata tcgttcttgc tatcatggat gtactttaca atgagactaa 1920

ggattccaag tatcgtgcat gcggactcct tcgtaagatg gttcgtgcag gtcaccttgg 1980

cgttaagtca ggaatcggtt tctacaagta caacgaagac agaacaaaga ctcctgttga 2040

caagctttaa ggatcccatg gtacgcgtgc tagaggcatc aaataaaacg aaaggctcag 2100 tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg 2160

acaaatccgc cgccctagac ctaggcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 2220

aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 2280

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 2340

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 2400

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 2460

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 2520

ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 2580

gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 2640

agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 2700 gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 2760

acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 2820

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 2880

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 2940

cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atga 2994

<210> 24 <211> 2855 <212> DNA <213> pGV1049

<400> 24

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120

atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180

gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240

cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300

attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360

catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420

ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480

aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540

cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600

aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720

aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780

ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840

tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900

tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960

cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020

gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttcattaaag 1080

aggagaaagg taccaaaata agcaagtttg aaggaggtcc ttagaatgga attaaaaaat 1140

gttattcttg aaaaagaagg gcatttagct attgttacaa tcaatagacc aaaggcatta 1200 aatgcattga attcagaaac actaaaagat ttaaatgttg ttttagatga tttagaagca 1260

gacaacaatg tgtatgcagt tatagttaca ggtgctggtg agaaatcttt tgttgctgga 1320

gcagatattt cagaaatgaa agatcttaat gaagaacaag gtaaagaatt tggtatttta 1380

ggaaacaatg tcttcagaag attagaaaaa ttggataagc cagttatcgc agctatatca 1440

ggatttgctc ttggtggtgg atgtgaactt gctatgtcat gtgacataag aatagcttca 1500

gttaaagcta aatttggtca accagaagca ggacttggaa taactccagg atttggtgga 1560

actcaaagat tagctagaat tgtagggcca ggaaaagcta aagaattaat ttatacttgt 1620

gaccttataa atgcagaaga agcttataga ataggtttag ttaataaagt agttgaatta 1680

gaaaaattga tggaagaagc aaaagcaatg gctaacaaga ttgcagctaa tgctccaaaa 1740

gcagttgcat attgtaaaga tgctatagac agaggaatgc aagttgatat agatgcagct 1800 atattaatag aagcagaaga ctttggaaag tgctttgcaa cagaagatca aacagaagga 1860 atgactgcgt tcttagaaag aagagcagaa aagaattttc aaaataaata aggatcccat 1920 ggtacgcgtg ctagaggcat caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc 1980 gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag gacaaatccg ccgccctaga 2040 cctaggcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 2100 cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 2160 gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 2220 tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 2280 ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 2340 atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag 2400 gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 2460 tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 2520 cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcágagcga ggtatgtagg 2580 cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt 2640 tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 2700 cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 2760 cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 2820 gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catga 2855

<210> 25 <211> 2891 <212> DNA <213> pGV1050

<400> 25

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60

tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120

atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180

gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240

cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300

attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360

catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480

aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540

cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600

aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660

cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720

aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780

ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840

tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900

tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960

cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020 gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttcaaaagat 1080

ttagaggagg aataattcat gaaaaagatt tttgtacttg gagcaggaac aatgggtgct 1140

ggtatcgttc aagcattcgc tcaaaaaggt tgtgaagtaa ttgtaagaga cataaaggaa 1200

gaatttgttg acagaggaat agctggaatc actaaaggat tagaaaagca agttgctaaa 1260

ggaaaaatgt ctgaagaaga taaagaagct atactttcaa gaatttcagg aacaactgat 1320

atgaaattag ctgctgactg tgatttagta gttgaagctg caatcgaaaa catgaaaatt 1380

aagaaggaaa tcttcgctga attagatgga atttgtaagc cagaagcgat tttagcttca 1440

aacacttcat ctttatcaat tactgaagtt gcttcagcta caaagagacc tgataaagtt 1500

atcggaatgc atttctttaa tccagctcca gtaatgaagc ttgttgaaat tattaaagga 1560 atagctactt ctcaagaaac ttttgatgct gttaaggaat tatcagttgc tattggaaaa 1620

gaaccagtag aagttgcaga agctccagga ttcgttgtaa acagaatatt aatcccaatg 1680

attaacgaag cttcatttat cctacaagaa ggaatagctt cagttgaaga tattgataca 1740

gctatgaaat atggtgctaa ccatccaatg ggacctttag ctttaggaga tcttattgga 1800

ttagacgttt gcttagctat catggatgtt ttattcactg aaacaggtga taacaagtac 1860

agagctagca gcatattaag aaaatatgtt agagctggat ggcttggaag aaaatcagga 1920

aaaggattct atgattattc taaataagga tcccatggta cgcgtgctag aggcatcaaa 1980

taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga 2040

acgctctcct gagtaggaca aatccgccgc cctagaccta ggcgttcggc tgcggcgagc 2100

ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 2160 aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 2220

ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 2280

gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 2340

cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 2400

gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 2460

tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 2520

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 2580

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 2640

gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 2700 agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 2760

cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 2820

tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 2880

tttggtcatg a 2891

<210> 26 <211> 5125 <212> DNA <213> pGV1052

<400> 26

aattctaaac taactatacg ctaaggagag tggaacatca tggattttaa cttaacagat 60

attcagcaag acttcctgaa gctggcacac gactttggtg aaaagaaact ggcccctact 120

gttaccgaac gcgaccacaa aggtatctac gataaagaac tgattgacga actgctgtct 180 ctgggtatca ccggcgcata cttcgaagaa aaatacggcg gtagcggtga cgacggtggc 240

gatgtactgt cttatatcct ggccgtagaa gaactggcga aatacgacgc tggtgttgct 300

atcactctgt ctgccaccgt aagcctgtgt gcgaatccga tttggcagtt tggtactgag 360

gctcagaaag aaaagtttct ggttccactg gtcgaaggta ctaaactggg tgcgtttggt 420

ctgaccgaac cgaacgcggg cactgatgcg agcggccagc aaactattgc tactaaaaac 480

gatgacggca cgtacaccct gaacggtagc aaaatcttca tcaccaacgg tggcgctgcc 540

gatatctaca tcgtatttgc gatgaccgac aaaagcaagg gtaaccatgg catcaccgcg 600

ttcatcctgg aagatggcac tccgggtttc acctacggca aaaaggaaga taaaatgggt 660

atccacacct ctcagactat ggaactggtt ttccaggacg ttaaggtccc ggccgagaac 720 atgctgggcg aagaaggcaa aggcttcaag attgcaatga tgaccctgga cggcggtcgc 780

attggcgttg cggcccaggc actgggcatc gcagaggcag cgctggccga cgctgttgaa 840

tacagcaaac agcgtgttca gtttggcaaa cctctgtgca aattccaatc cattagcttt 900

aagctggccg atatgaaaat gcagatcgaa gccgcacgca acctggtata taaagctgca 960

tgcaagaaac aagaaggtaa accgttcacc gtagacgctg cgatcgcgaa acgtgtagcc 1020

agcgatgtgg caatgcgcgt gactaccgaa gcagttcaga ttttcggtgg ctatggttac 1080

tctgaagaat acccggtggc tcgccacatg cgcgacgcaa aaatcactca gatctacgag 1140

ggtacgaacg aagtgcagct gatggtcacc ggcggtgctc tgttaagtta attaaagttt 1200

atgctcggcc tgccctttgc tgggcccgtt acataaaaaa agattttagg aggcaaaacg 1260

taaatggaaa tattggtatg tgtcaaacaa gtgccggata ctgcagaagt caaaattgat 1320 ccggttaaac acaccgtgat tcgtgcgggt gtgccgaata tcttcaaccc gttcgaccaa 1380

aacgcgctgg aagcggcgct ggcgctgaag gacgcggata aagacgttaa gattactctg 1440

ctgtctatgg gcccggacca ggcaaaagat gttctgcgtg aaggcctggc catgggcgct 1500

gatgacgcgt acctgctgtc cgatcgtaaa ctgggtggct ccgacactct ggccaccggt 1560

tatgctctgg cccaggctat taagaaactg gctgcggaca agggtattga gcaattcgac 1620

atcatcctgt gtggtaagca agcgattgac ggtgataccg ctcaggtagg tccacagatc 1680

gcttgtgagc tgggcatccc gcagatcact tatgctcgtg acatcaaggt tgagggcgat 1740

aaggttactg tgcagcagga aaacgaagag ggttacatcg tgaccgaagc gcagttcccg 1800

gttctgatca ccgcggttaa agacctgaac gaacctcgtt tcccgaccat ccgtggcacc 1860 atgaaggcga agcgtcgtga aatcccgaac ctggacgcag ctgcagttgc cgcggacgac 1920

gcgcagatcg gcctgtccgg ttctccgacc aaagtacgca aaattttcac cccaccgcag 1980

cgttccggcg gtctggtact gaaagtggaa gacgacaacg aacaggccat tgtcgaccag 2040

gttatggaaa aactggttgc ccagaaaatc atttaatcta aggaggaaca gtgaaaatgg 2100

atttagcaga atacaaaggc atctacgtga tcgcagagca gttcgaaggt aaactgcgtg 2160

acgtttcttt cgaactgctg ggtcaagcgc gcatcctggc ggacacgatc ggcgacgaag 2220

taggcgcaat cctgattggc aaagatgtaa aaccactggc gcaggaactg atcgcgcatg 2280

gtgctcataa agtgtacgtc tatgacgacc cgcagctgga acattacaac acgactgcct 2340

atgccaaagt gatttgcgac ttctttcatg aagagaaacc aaacgttttc ctggttggtg 2400

caactaacat cggtcgtgac ctgggtccac gtgtagcgaa cagcctgaaa accggtctga 2460 ctgcggattg tacccagctg ggtgttgatg atgataagaa aaccatcgtt tggacccgtc 2520

cggcactggg cggcaacatc atggcggaaa ttatctgtcc agataaccgc ccgcagatgg 2580

gcactgtgcg tcctcatgtc ttcaaaaagc cggaagccga cccgagcgca actggtgaag 2640

tcattgaaaa gaaagcgaac ctgtctgacg ctgatttcat gactaagttc gtagaactga 2700

tcaaactggg tggtgaaggc gttaaaatcg aggatgccga tgttattgtt gctggtggcc 2760

gtggcatgaa tagcgaagag ccttttaaaa ccggtatcct gaaagagtgc gcggacgtac 2820

tgggcggtgc tgtcggtgcc agccgtgccg ccgtggacgc gggctggatc gacgctctgc 2880

accaggtcgg ccagactggc aaaaccgttg gtccgaaaat ctacattgct tgtgcgatta 2940

gcggtgctat ccagccgctg gcaggcatga cgggctctga ttgtattatc gcaattaaca 3000 aagatgaaga cgcgcctatt ttcaaggtgt gcgactatgg cattgtgggc gatgtgttca 3060

aagtgctgcc actgctgact gaggcgatca agaaacagaa aggcattgca taaggatccc 3120

atggtacgcg tgctagaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt 3180

tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgcccta 3240

gacctaggcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 3300

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 3360

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 3420

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 3480

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 3540

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt 3600 aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 3660

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 3720

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 3780

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 3840

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 3900

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 3960

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 4020

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgacta gtgcttggat tctcaccaat 4080

aaaaaacgcc cggcggcaac cgagcgttct gaacaaatcc agatggagtt ctgaggtcat 4140 tactggatct atcaacagga gtccaagcga gctcgatatc aaattacgcc ccgccctgcc 4200

actcatcgca gtactgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag ccatcacaga 4260

cggcatgatg aacctgaatc gccagcggca tcagcacctt gtcgccttgc gtataatatt 4320

tgcccatggt gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt ggccacgttt aaatcaaaac 4380

tggtgaaact cacccaggga ttggctgaga cgaaaaacat attctcaata aaccctttag 4440

ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg ccacatcttg cgaatatatg tgtagaaact 4500

gccggaaatc gtcgtggtat tcactccaga gcgatgaaaa cgtttcagtt tgctcatgga 4560

aaacggtgta acaagggtga acactatccc atatcaccag ctcaccgtct ttcattgcca 4620

tacgaaactc cggatgagca ttcatcaggc gggcaagaat gtgaataaag gccggataaa 4680

acttgtgctt atttttcttt acggtcttta aaaaggccgt aatatccagc tgaacggtct 4740 ggttataggt acattgagca actgactgaa atgcctcaaa atgttcttta cgatgccatt 4800

gggatatatc aacggtggta tatccagtga tttttttctc cattttagct tccttagctc 4860

ctgaaaatct cgataactca aaaaatacgc ccggtagtga tcttatttca ttatggtgaa 4920

agttggaacc tcttacgtgc cgatcaacgt ctcattttcg ccagatatcg acgtctaaga 4980

aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct 5040

tcacctcgag aaatgtgagc ggataacaat tgacattgtg agcggataac aagatactga 5100

gcacatcagc aggacgcact gaccg 5125

<210> 27 <211> 2982 <212> DNA <213> pGV1054 <400> 27

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600

aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660

cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720

aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780

ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840

tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900

tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960

cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagataaatg tgagcggata acattgacat 1020

tgtgagcgga taacaagata ctgagcacat cagcaggacg cactgaccga attcattaaa 1080 gaggagaaag gtaccaagaa ttatttaaag cttattatgc caaaatactt atatagtatt 1140

ttggtgtaaa tgcattgata gtttctttaa atttagggag gtctgtttaa tgaaaaaggt 1200

atgtgttata ggcgcgggaa ccatgggtag cggtattgcc caggcatttg ctgcaaaagg 1260

tttcgaagtg gttctgcgtg atatcaagga cgagtttgtc gatcgcggct tagacttcat 1320

taataaaaac ctgtctaaac tggtaaagaa agggaaaatc gaagaggcga cgaaggtgga 1380

aattttaact cggatcagtg gaacagttga tctgaatatg gccgctgact gcgatctggt 1440

cattgaagcg gccgtagagc gtatggatat caaaaaacaa atttttgcag acttagataa 1500

catctgtaag ccggaaacca ttctggcttc aaatacgtcc tcgctgagca tcactgaggt 1560

ggcgtctgcc acaaaacgcc cagacaaagt tattggcatg catttcttta accctgcacc 1620

ggtcatgaag ttagtggaag taatccgtgg gattgctacc agtcaggaaa cgttcgatgc 1680 ggttaaagag acctcaatcg ccattggaaa agacccagtg gaagtcgcag aggcgcctgg 1740

ctttgttgta aatcgcattc tgatcccgat gattaacgaa gctgtgggaa tcctggccga 1800

aggaattgca tccgtcgagg atatcgacaa ggcgatgaaa ttaggcgcta atcacccgat 1860

gggtccactg gaactgggcg acttcattgg tctggatatc tgcttagcca ttatggacgt 1920

tctgtattcg gagactgggg atagcaaata ccggcctcat acactgttaa agaaatatgt 1980

gcgtgcagga tggctgggcc gcaaatctgg taagggtttc tacgattatt caaaataagg 2040

atcccatggt acgcgtgcta gaggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg 2100

gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg 2160

ccctagacct aggcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 2220 ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 2280

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 2340

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 2400

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 2460

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 2520

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 2580

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 2640

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 2700

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 2760

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 2820 cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 2880

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 2940

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat ga 2982

<210> 28 <211> 5125 <212> DNA <213> pGV1088

<400> 28

aattctaaac taactatacg ctaaggagag tggaacatca tggattttaa cttaacagat 60

attcagcaag acttcctgaa gctggcacac gactttggtg aaaagaaact ggcccctact 120

gttaccgaac gcgaccacaa aggtatctac gataaagaac tgattgacga actgctgtct 180 ctgggtatca ccggcgcata cttcgaagaa aaatacggcg gtagcggtga cgacggtggc 240

gatgtactgt cttatatcct ggccgtagaa gaactggcga aatacgacgc tggtgttgct 300

atcactctgt ctgccaccgt aagcctgtgt gcgaatccga tttggcagtt tggtactgag 360

gctcagaaag aaaagtttct ggttccactg gtcgaaggta ctaaactggg tgcgtttggt 420

ctgaccgaac cgaacgcggg cactgatgcg agcggccagc aaactattgc tactaaaaac 480

gatgacggca cgtacaccct gaacggtagc aaaatcttca tcaccaacgg tggcgctgcc 540

gatatctaca tcgtatttgc gatgaccgac aaaagcaagg gtaaccatgg catcaccgcg 600

ttcatcctgg aagatggcac tccgggtttc acctacggca aaaaggaaga taaaatgggt 660

atccacacct ctcagactat ggaactggtt ttccaggacg ttaaggtccc ggccgagaac 720

atgctgggcg aagaaggcaa aggcttcaag attgcaatga tgaccctgga cggcggtcgc 780 attggcgttg cggcccaggc actgggcatc gcagaggcag cgctggccga cgctgttgaa 840

tacagcaaac agcgtgttca gtttggcaaa cctctgtgca aattccaatc cattagcttt 900

aagctggccg atatgaaaat gcagatcgaa gccgcacgca acctggtata taaagctgca 960

tgcaagaaac aagaaggtaa accgttcacc gtagacgctg cgatcgcgaa acgtgtagcc 1020

agcgatgtgg caatgcgcgt gactaccgaa gcagttcaga ttttcggtgg ctatggttac 1080

tctgaagaat acccggtggc tcgccacatg cgcgacgcaa aaatcactca gatctacgag 1140

ggtacgaacg aagtgcagct gatggtcacc ggcggtgctc tgttaagtta attaaagttt 1200

atgctcggcc tgccctttgc tgggcccgtt acataaaaaa agattttagg aggcaaaacg 1260

taaatggaaa tattggtatg tgtcaaacaa gtgccggata ctgcagaagt caaaattgat 1320 ccggttaaac acaccgtgat tcgtgcgggt gtgccgaata tcttcaaccc gttcgaccaa 1380

aacgcgctgg aagcggcgct ggcgctgaag gacgcggata aagacgttaa gattactctg 1440

ctgtctatgg gcccggacca ggcaaaagat gttctgcgtg aaggcctggc catgggcgct 1500

gatgacgcgt acctgctgtc cgatcgtaaa ctgggtggct ccgacactct ggccaccggt 1560

tatgctctgg cccaggctat taagaaactg gctgcggaca agggtattga gcaattcgac 1620

atcatcctgt gtggtaagca agcgattgac ggtgataccg ctcaggtagg tccacagatc 1680

gcttgtgagc tgggcatccc gcagatcact tatgctcgtg acatcaaggt tgagggcgat 1740

aaggttactg tgcagcagga aaacgaagag ggttacatcg tgaccgaagc gcagttcccg 1800

gttctgatca ccgcggttaa agacctgaac gaacctcgtt tcccgaccat ccgtggcacc 1860

atgaaggcga agcgtcgtga aatcccgaac ctggacgcag ctgcagttgc cgcggacgac 1920 gcgcagatcg gcctgtccgg ttctccgacc aaagtacgca aaattttcac cccaccgcag 1980

cgttccggcg gtctggtact gaaagtggaa gacgacaacg aacaggccat tgtcgaccag 2040

gttatggaaa aactggttgc ccagaaaatc atttaatcta aggaggaaca gtgaaaatgg 2100

atttagcaga atacaaaggc atctacgtga tcgcagagca gttcgaaggt aaactgcgtg 2160

acgtttcttt cgaactgctg ggtcaagcgc gcatcctggc ggacacgatc ggcgacgaag 2220

taggcgcaat cctgattggc aaagatgtaa aaccactggc gcaggaactg atcgcgcatg 2280

gtgctcataa agtgtacgtc tatgacgacc cgcagctgga acattacaac acgactgcct 2340

atgccaaagt gatttgcgac ttctttcatg aagagaaacc aaacgttttc ctggttggtg 2400

caactaacat cggtcgtgac ctgggtccac gtgtagcgaa cagcctgaaa accggtctga 2460 ctgcggattg tacccagctg ggtgttgatg atgataagaa aaccatcgtt tggacccgtc 2520

cggcactggg cggcaacatc atggcggaaa ttatctgtcc agataaccgc ccgcagatgg 2580

gcactgtgcg tcctcatgtc ttcaaaaagc cggaagccga cccgagcgca actggtgaag 2640

tcattgaaaa gaaagcgaac ctgtctgacg ctgatttcat gactaagttc gtagaactga 2700

tcaaactggg tggtgaaggc gttaaaatcg aggatgccga tgttattgtt gctggtggcc 2760

gtggcatgaa tagcgaagag ccttttaaaa ccggtatcct gaaagagtgc gcggacgtac 2820

tgggcggtgc tgtcggtgcc agccgtgccg ccgtggacgc gggctggatc gacgctctgc 2880

accaggtcgg ccagactggc aaaaccgttg gtccgaaaat ctacattgct tgtgcgatta 2940

gcggtgctat ccagccgctg gcaggcatga cgggctctga ttgtattatc gcaattaaca 3000

aagatgaaga cgcgcctatt ttcaaggtgt gcgactatgg cattgtgggc gatgtgttca 3060 aagtgctgcc actgctgact gaggcgatca agaaacagaa aggcattgca taaggatccc 3120

atggtacgcg tgctagaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt 3180

tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgcccta 3240

gacctaggcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 3300

tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc 3360

aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag 3420

catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac 3480

caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc 3540

ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt 3600 aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc 3660

gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga 3720

cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta 3780

ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta 3840

tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 3900

tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg 3960

cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag 4020

tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgacta gtgcttggat tctcaccaat 4080

aaaaaacgcc cggcggcaac cgagcgttct gaacaaatcc agatggagtt ctgaggtcat 4140

tactggatct atcaacagga gtccaagcga gctcgatatc aaattacgcc ccgccctgcc 4200 actcatcgca gtactgttgt aattcattaa gcattctgcc gacatggaag ccatcacaga 4260

cggcatgatg aacctgaatc gccagcggca tcagcacctt gtcgccttgc gtataatatt 4320

tgcccatggt gaaaacgggg gcgaagaagt tgtccatatt ggccacgttt aaatcaaaac 4380

tggtgaaact cacccaggga ttggctgaga cgaaaaacat attctcaata aaccctttag 4440

ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg ccacatcttg cgaatatatg tgtagaaact 4500

gccggaaatc gtcgtggtat tcactccaga gcgatgaaaa cgtttcagtt tgctcatgga 4560

aaacggtgta acaagggtga acactatccc atatcaccag ctcaccgtct ttcattgcca 4620

tacgaaactc cggatgagca ttcatcaggc gggcaagaat gtgaataaag gccggataaa 4680

acttgtgctt atttttcttt acggtcttta aaaaggccgt aatatccagc tgaacggtct 4740 ggttataggt acattgagca actgactgaa atgcctcaaa atgttcttta cgatgccatt 4800

gggatatatc aacggtggta tatccagtga tttttttctc cattttagct tccttagctc 4860

ctgaaaatct cgataactca aaaaatacgc ccggtagtga tcttatttca ttatggtgaa 4920

agttggaacc tcttacgtgc cgatcaacgt ctcattttcg ccagatatcg acgtctaaga 4980

aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct 5040

tcacctcgag aaatgtgagc ggataacaat tgacattgtg agcggataac aagatactga 5100

gcacatcagc aggacgcact gaccg 5125

<210> 29 <211> 2836 <212> DNA <213> pGV1094

<400> 29 ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60

tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120

atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180

gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240

cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300

attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360

catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420

ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480

aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600

aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660

cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720

aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780

ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840

tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900

tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960

cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020

gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccggg aattcctatc 1080

tatttttgaa gccttcaatt tttcttttct ctatgaaagc tgtcattgca tccttttgat 1140 cctctgttga aaagcattct ccaaatgctt ctgattcaaa tgctaaagca gtatcaatat 1200 cacactgcat tcctctatta atagcctgtt tgcttaactt aacagctact ggagcattgc 1260 tcacaatttt gtttgcaatt tcttttgctg tattcattaa ttcactaggt tctactacct 1320 tatttacaag tccgattctt aatgcttcat ctgcctttat attttgtgca gtaaatataa 1380 gctgctttgc catgcccatt ccaactaatc ttgaaagtct ttgtgtacca ccaaaaccag 1440 gtgttattcc gagacctact tctggttgac caaatcttgc gttgcttgaa gctattctta 1500 tatcacaaga catagctatt tcgcatccgc ctcctaaagc aaaaccatta acagctgcta 1560 ttacaggctt ttcaagaagt tctaatcttc taaacacttt atttccaagt atcccgaatt 1620 ttctaccttc aatggtattc atttccttca tctcagaaat atctgctcct gctacaaatg 1680 atttttctcc tgctccagtt aaaattactg caagtacttc gctatcattt tcaatttcac 1740 ctataacata atccatttct tttagtgtat cactatttaa cgcatttaat gctttaggtc 1800 tgttaatggt aactacagca actttacctt ccttttcaag gatgacattg tttagttcca 1860 tgactaatcc tcctaaaata ttggatccga tccgatccca tggtacgcgt gctagaggca 1920 tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc 1980 ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgccctag acctaggcgt tcggctgcgg 2040 cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 2100 gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 2160 ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 2220 agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 2280 tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 2340

ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 2400

gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 2460

ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 2520

gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 2580

aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg 2640

aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 2700

ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 2760

gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 2820 gggattttgg tcatga 2836

<210> 30 <211> 2018 <212> DNA <213> pGV1111

<400> 30

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaattgtg agcggataac aattgacatt 1020 gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttcggatccc 1080 atggtacgcg tgctagaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt 1140 tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgcccta 1200 gacctagggc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 1260 atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 1320 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 1380 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 1440 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 1500 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 1560

taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 1620

cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 1680

acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 1740

aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 1800

atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 1860

atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 1920

gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 1980

gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatga 2018

<210> 31 <211> 3258 <212> DNA <213> pGV1113

<400> 31

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480

aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540

cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600

aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660

cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720

aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780

ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840

tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960

cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagataaatg tgagcggata acaattgaca 1020

ttgtgagcgg ataacaagat actgagcaca tcagcaggac gcactgaccg aattcattaa 1080

agaggagaaa ggtaccatgg ccatgttcac cactaccgcc aaggttattc agccgaaaat 1140

ccgtggtttt atctgtacga ccacccaccc gattggctgt gaaaaacgcg tgcaggaaga 1200

aattgcttac gcacgtgcac atccaccgac cagcccgggt ccgaaacgtg tcctggtcat 1260

cggctgttcc actggctacg gcctgtctac tcgtatcacc gcagctttcg gctatcaggc 1320

ggctactctg ggcgtgttcc tggctggtcc gccgactaaa ggtcgcccgg ctgcggccgg 1380

ttggtataac accgtagctt tcgaaaaagc ggccctggaa gccggtctgt atgcccgctc 1440

cctgaacggt gacgcttttg actctactac caaagcacgc accgtggaag ctatcaaacg 1500

tgacctgggc accgttgacc tggtggttta tagcattgca gctccgaaac gtaccgatcc 1560 ggctaccggc gtgctgcaca aagcgtgtct gaaaccgatc ggtgcgacct acaccaaccg 1620 tacggtaaat actgacaaag ctgaagttac ggacgtgtcc atcgaaccgg cgagcccaga 1680 agaaattgca gacactgtga aagtaatggg tggcgaagac tgggaactgt ggattcaggc 1740 tctgtctgaa gccggcgttc tggcagaagg cgcgaaaacc gtcgcatact cttatatcgg 1800 tccggagatg acctggccgg tgtactggtc cggcaccatt ggtgaagcca aaaaggatgt 1860 tgaaaaagcc gctaaacgta ttacccagca gtacggctgt ccggcatacc cggttgtggc 1920 aaaagcactg gtgacgcagg catcctccgc gatcccggtc gtcccgctgt atatttgtct 1980 gctgtaccgt gtaatgaaag aaaaaggcac tcacgaaggt tgcatcgaac aaatggtgcg 2040 tctgctgacc acgaaactgt acccggaaaa cggtgccccg atcgttgatg aagcgggccg 2100 tgttcgtgtg gacgattggg aaatggcaga agacgttcag caagccgtta aagacctgtg 2160 gagccaggtg agcacggcaa acctgaaaga tatttccgac ttcgccggtt accaaaccga 2220 gttcctgcgc ctgtttggtt ttggtatcga tggcgtggac tatgaccagc cggttgacgt 2280 agaggcagac ctgccgagcg cagctcagca gtaaggatcc catggtacgc gtgctagagg 2340 catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg 2400 tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgccct agacctaggc gttcggctgc 2460 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 2520 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 2580 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 2640 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 2700 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 2760

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 2820

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 2880

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 2940

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 3000

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 3060

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 3120

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 3180 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 3240

aagggatttt ggtcatga 3258

<210> 32 <211> 3233 <212> DNA <213> pGV1117

<400> 32

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagataaatg tgagcggata acattgacat 1020 tgtgagcgga taacaagata ctgagcacat cagcaggacg cactgaccga attcattaaa 1080 gaggagaaag gtaccatgat cattaaaccg aaagttcgtg gcttcatttg taccaccact 1140 catccggttg gctgtgaagc taatgtacgc cgccagatcg cgtataccaa agcaaaaggc 1200 actatcgaaa acggccctaa gaaagtgctg gtgattggtg cgagcaccgg ttacggtctg 1260 gcgtcccgca ttgcagcggc gttcggtagc ggcgccgcga ccctgggtgt tttcttcgaa 1320 aaagcgggct ccgaaactaa aaccgcgacc gcaggttggt acaactctgc cgcgtttgac 1380 aaagccgcca aagaggctgg cctgtatgcg aaatctatta acggtgacgc gttcagcaac 1440 gaatgccgtg ctaaagtgat cgaactgatc aaacaggatc tgggccaaat tgatctggtt 1500 gtttattctc tggcctcccc ggttcgtaaa ctgccggata ccggcgaagt tgtgcgcagc 1560 gctctgaaac ctattggtga agtgtacacc acgaccgcaa ttgatactaa taaggaccag 1620 attatcaccg caaccgtcga gccggccaac gaggaagaga tccagaatac catcactgtg 1680 atgggcggtc aagactggga actgtggatg gcagcactgc gcgacgcagg tgttctggca 1740 gacggtgcaa agagcgtcgc ttactcttac atcggcactg acctgacttg gccgatctac 1800 tggcatggca ccctgggtcg cgcgaaagag gatctggatc gcgcagcggc agcgatccgc 1860 ggtgatctgg ccggtaaggg cggtactgcg cacgttgccg ttctgaaatc cgtggtcacc 1920 caggcatctt ctgcaatccc ggtgatgccg ctgtatattt ctatggcctt taaaatcatg 1980 aaagagaagg gtatccacga aggctgtatg gagcaagtgg accgcatgat gcgtactcgc 2040 ctgtacgcgg cggacatggc actggatgac caggcgcgta tccgtatgga cgattgggaa 2100 ctgcgtgaag atgttcagca gacttgccgt gatctgtggc cgtccattac ctccgaaaac 2160 ctgtgcgagc tgaccgatta cactggttac aaacaggaat ttctgcgtct gttcggtttc 2220 ggtctggaag aagtagacta cgatgcagac gttaacccgg acgttaaatt tgatgttgtc 2280 gaactgtgag gatcccatgg tacgcgtgct agaggcatca aataaaacga aaggctcagt 2340 cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga 2400 caaatccgcc gccctagacc taggcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 2460 ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 2520 aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 2580 ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 2640 aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 2700

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 2760

tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 2820

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 2880

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 2940

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 3000

cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 3060 agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 3120

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 3180

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tga 3233

<210> 33 <211> 2908 <212> DNA <213> pGV1154

<400> 33

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020 gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgga attcattgat 1080 agtttcttta aatttaggga ggtctgttta atgaaaaagg tatgtgttat aggtgcaggt 1140 actatgggtt caggaattgc tcaggcattt gcagctaaag gatttgaagt agtattaaga 1200 gatattaaag atgaatttgt tgatagagga ttagatttta tcaataaaaa tctttctaaa 1260 ttagttaaaa aaggaaagat agaagaagct actaaagttg aaatcttaac tagaatttcc 1320 ggaacagttg accttaatat ggcagctgat tgcgatttag ttatagaagc agctgttgaa 1380 agaatggata ttaaaaagca gatttttgct gacttagaca atatatgcaa gccagaaaca 1440 attcttgcat caaatacatc atcactttca ataacagaag tggcatcagc aactaaaaga 1500 cctgataagg ttataggtat gcatttcttt aatccagctc ctgttatgaa gcttgtagag 1560 gtaataagag gaatagctac atcacaagaa acttttgatg cagttaaaga gacatctata 1620 gcaataggaa aagatcctgt agaagtagca gaagcaccag gatttgttgt aaatagaata 1680 ttaataccaa tgattaatga agcagttggt atattagcag aaggaatagc ttcagtagaa 1740 gacatagata aagctatgaa acttggagct aatcacccaa tgggaccatt agaattaggt 1800 gattttatag gtcttgatat atgtcttgct ataatggatg ttttatactc agaaactgga 1860 gattctaagt atagaccaca tacattactt aagaagtatg taagagcagg atggcttgga 1920 agaaaatcag gaaaaggttt ctacgattat tcaaaataag gatccgatcc catggtacgc 1980 gtgctagagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat 2040 ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgccct agacctaggc 2100 gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 2160 tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 2220 aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 2280 aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 2340 ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 2400 tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc 2460 agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 2520 gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 2580 tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 2640 acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 2700 tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 2760

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 2820

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 2880

aactcacgtt aagggatttt ggtcatga 2908

<210> 34 <211> 3278 <212> DNA <213> pGV1188

<400> 34

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaattgtg agcggataac aattgacatt 1020 gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttcaacaata 1080 aaaaccgtat caaaatttag gaggttagtt agaatgaaag aagttgtaat agctagcgcg 1140 gtgcgtaccg ccattggctc ttatggtaaa agtctgaagg atgttccggc agtcgactta 1200 ggggctacgg cgatcaaaga agccgtaaaa aaggcaggaa ttaaaccaga ggatgtgaat 1260 gaagttatcc tgggcaacgt cctgcaggct ggtttagggc aaaatcctgc gcgccaggcc 1320 tcatttaaag caggactgcc ggtagagatt ccagctatga ctatcaacaa ggtgtgcggc 1380 tccggtctgc ggacagtttc gttagcggcc caaattatca aagcaggcga cgctgatgtc 1440 attatcgcgg gtgggatgga aaatatgagc cgtgcccctt acctggcaaa caatgcgcgc 1500 tggggatatc gtatgggcaa cgctaaattc gtggacgaaa tgattaccga tggtctgtgg 1560 gatgccttta atgactacca tatgggcatc acggcagaga acattgcgga acgctggaat 1620 atctctcggg aggaacagga tgagttcgct ttagccagtc agaagaaagc agaggaagcg 1680 attaaatcag gtcaatttaa ggacgagatc gtaccggttg tgattaaagg gcgtaaagga 1740 gaaactgtcg ttgatacaga cgaacacccg cgcttcggct ccaccattga gggtctggct 1800 aagctgaaac cagcctttaa aaaggatggg acggtaaccg caggcaacgc gtcgggttta 1860 aatgattgtg ccgcagtgct ggtcatcatg agcgcggaaa aagctaaaga gctgggagtt 1920 aagcctctgg ccaaaattgt gtcttatggc agtgcgggtg tagacccggc tatcatgggg 1980 tacggcccgt tctatgcaac taaagccgcg attgaaaagg ctggttggac agtcgatgaa 2040 ttagacctga tcgagtcaaa cgaagcattt gccgcgcagt ccctggctgt tgcaaaagat 2100 ttaaaattcg atatgaataa ggtgaacgta aatggaggcg ccattgcgct gggtcatcca 2160 atcggggctt cgggagcacg tattctggtt acgttagtgc acgccatgca aaaacgcgac 2220 gcgaaaaagg gcctggctac cctgtgcatc ggtgggggcc agggtactgc aatattgcta 2280 gaaaagtgct agacttaatt aacaataatc gatgggccca aggtacctaa gcttggatcc 2340 catggtacgc gtgctagagg catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct 2400 ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgccct 2460 agacctaggc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 2520 atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 2580 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 2640 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 2700 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 2760 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 2820 taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 2880 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 2940 acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 3000 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt 3060

atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 3120

atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 3180

gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 3240

gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatga 3278

<210> 35

<211> 2863

<212> DNA

<213> pGV1189

<400> 35

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaattgtg agcggataac attgacattg 1020 tgagcggata acaagatact gagcacatca gcaggacgca ctgaccgaat tcagtattaa 1080 ttaacaataa tcgatatatt ttaggaggat tagtcatgga actaaacaat gtcatcctgg 1140 aaaaagaggg caaggtggcg gttgtcacca ttaatcgtcc gaaagcctta aacgcactga 1200 atagcgatac gctgaaagaa atggactatg taatcggtga gattgaaaac gattctgaag 1260 tgttagctgt tatcctgact ggggcgggag agaagagttt tgtcgccggc gcagacattt 1320 cagaaatgaa agagatgaat acaatcgaag gtcgcaaatt cgggattctg ggaaacaagg 1380 tatttcggcg tttagaactg ctggagaaac cagtgatcgc tgcggttaat ggcttcgcct 1440 taggtggcgg ttgcgaaatt gcaatgtcct gtgatatccg cattgcttcg agcaacgcgc 1500 gttttgggca gcctgaggtc ggactgggca tcacaccggg tttcggcggt acgcaacgcc 1560 tgtctcggtt agtggggatg ggaatggcca aacagctgat ttttactgca caaaatatca 1620 aggctgacga agcgctgcgt attggcctgg taaacaaagt tgtggaacca agtgagttaa 1680 tgaatacagc caaagaaatc gcaaacaaga ttgtctcaaa tgcgcctgtt gctgtaaaac 1740 tgtccaaaca ggccattaac cgcggtatgc agtgcgatat cgacaccgca ctggcgttcg 1800 agtcggaagc ttttggggaa tgtttcagca cggaggacca aaaggatgcc atgaccgcat 1860

ttattgaaaa acgtaaaatt gaaggcttca aaaatagata ggataggtac ctaagcttgg 1920

atcccatggt acgcgtgcta gaggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg 1980

gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg 2040

ccctagacct agggcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 2100 cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 2160

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 2220

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 2280

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 2340

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 2400

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 2460

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 2520

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 2580

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 2640

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 2700

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 2760

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 2820

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tga 2863 <210> 36 <211> 7813 <212> DNA <213> pGV1190

<400> 36

ctcgagtccc tatcagtgat agagattgac atccctatca gtgatagaga tactgagcac 60

atcagcagga cgcactgacc gaattcacaa taaaaaccgt atcaaaattt aggaggttag 120

ttagaatgaa agaagttgta atagctagcg cggtgcgtac cgccattggc tcttatggta 180 aaagtctgaa ggatgttccg gcagtcgact taggggctac ggcgatcaaa gaagccgtaa 240

aaaaggcagg aattaaacca gaggatgtga atgaagttat cctgggcaac gtcctgcagg 300

ctggtttagg gcaaaatcct gcgcgccagg cctcatttaa agcaggactg ccggtagaga 360

ttccagctat gactatcaac aaggtgtgcg gctccggtct gcggacagtt tcgttagcgg 420

cccaaattat caaagcaggc gacgctgatg tcattatcgc gggtgggatg gaaaatatga 480

gccgtgcccc ttacctggca aacaatgcgc gctggggata tcgtatgggc aacgctaaat 540

tcgtggacga aatgattacc gatggtctgt gggatgcctt taatgactac catatgggca 600

tcacggcaga gaacattgcg gaacgctgga atatctctcg ggaggaacag gatgagttcg 660

ctttagccag tcagaagaaa gcagaggaag cgattaaatc aggtcaattt aaggacgaga 720

tcgtaccggt tgtgattaaa gggcgtaaag gagaaactgt cgttgataca gacgaacacc 780

cgcgcttcgg ctccaccatt gagggtctgg ctaagctgaa accagccttt aaaaaggatg 840

ggacggtaac cgcaggcaac gcgtcgggtt taaatgattg tgccgcagtg ctggtcatca 900

tgagcgcgga aaaagctaaa gagctgggag ttaagcctct ggccaaaatt gtgtcttatg 960 gcagtgcggg tgtagacccg gctatcatgg ggtacggccc gttctatgca actaaagccg 1020 cgattgaaaa ggctggttgg acagtcgatg aattagacct gatcgagtca aacgaagcat 1080

ttgccgcgca gtccctggct gttgcaaaag atttaaaatt cgatatgaat aaggtgaacg 1140

taaatggagg cgccattgcg ctgggtcatc caatcggggc ttcgggagca cgtattctgg 1200

ttacgttagt gcacgccatg caaaaacgcg acgcgaaaaa gggcctggct accctgtgca 1260

tcggtggggg ccagggtact gcaatattgc tagaaaagtg ctagacttaa ttaaatttta 1320 taaaggagtg tatataaatg aaagttacaa atcaaaaaga actaaaacaa aagctaaatg 1380

aattgagaga agcgcaaaag aagtttgcaa cctatactca agagcaagtt gataaaattt 1440

ttaaacaatg tgccatagcc gcagctaaag aaagaataaa cttagctaaa ttagcagtag 1500

aagaaacagg aataggtctt gtagaagata aaattataaa aaatcatttt gcagcagaat 1560

atatatacaa taaatataaa aatgaaaaaa cttgtggcat aatagaccat gacgattctt 1620

taggcataac aaaggttgct gaaccaattg gaattgttgc agccatagtt cctactacta 1680

atccaacttc cacagcaatt ttcaaatcat taatttcttt aaaaacaaga aacgcaatat 1740

tcttttcacc acatccacgt gcaaaaaaat ctacaattgc tgcagcaaaa ttaattttag 1800

atgcagctgt taaagcagga gcacctaaaa atataatagg ctggatagat gagccatcaa 1860

tagaactttc tcaagatttg atgagtgaag ctgatataat attagcaaca ggaggtcctt 1920

caatggttaa agcggcctat tcatctggaa aacctgcaat tggtgttgga gcaggaaata 1980

caccagcaat aatagatgag agtgcagata tagatatggc agtaagctcc ataattttat 2040

caaagactta tgacaatgga gtaatatgcg cttctgaaca atcaatatta gttatgaatt 2100 caatatacga aaaagttaaa gaggaatttg taaaacgagg atcatatata ctcaatcaaa 2160 atgaaatagc taaaataaaa gaaactatgt ttaaaaatgg agctattaat gctgacatag 2220 ttggaaaatc tgcttatata attgctaaaa tggcaggaat tgaagttcct caaactacaa 2280 agatacttat aggcgaagta caatctgttg aaaaaagcga gctgttctca catgaaaaac 2340 tatcaccagt acttgcaatg tataaagtta aggattttga tgaagctcta aaaaaggcac 2400 aaaggctaat agaattaggt ggaagtggac acacgtcatc tttatatata gattcacaaa 2460 acaataagga taaagttaaa gaatttggat tagcaatgaa aacttcaagg acatttatta 2520 acatgccttc ttcacaggga gcaagcggag atttatacaa ttttgcgata gcaccatcat 2580 ttactcttgg atgcggcact tggggaggaa actctgtatc gcaaaatgta gagcctaaac 2640 atttattaaa tattaaaagt gttgctgaaa gaagggaaaa tatgctttgg tttaaagtgc 2700 cacaaaaaat atattttaaa tatggatgtc ttagatttgc attaaaagaa ttaaaagata 2760 tgaataagaa aagagccttt atagtaacag ataaagatct ttttaaactt ggatatgtta 2820 ataaaataac aaaggtacta gatgagatag atattaaata cagtatattt acagatatta 2880 aatctgatcc aactattgat tcagtaaaaa aaggtgctaa agaaatgctt aactttgaac 2940 ctgatactat aatctctatt ggtggtggat cgccaatgga tgcagcaaag gttatgcact 3000 tgttatatga atatccagaa gcagaaattg aaaatctagc tataaacttt atggatataa 3060 gaaagagaat atgcaatttc cctaaattag gtacaaaggc gatttcagta gctattccta 3120 caactgctgg taccggttca gaggcaacac cttttgcagt tataactaat gatgaaacag 3180 gaatgaaata ccctttaact tcttatgaat tgaccccaaa catggcaata atagatactg 3240 aattaatgtt aaatatgcct agaaaattaa cagcagcaac tggaatagat gcattagttc 3300 atgctataga agcatatgtt tcggttatgg ctacggatta tactgatgaa ttagccttaa 3360 gagcaataaa aatgatattt aaatatttgc ctagagccta taaaaatggg actaacgaca 3420 ttgaagcaag agaaaaaatg gcacatgcct ctaatattgc ggggatggca tttgcaaatg 3480 ctttcttagg tgtatgccat tcaatggctc ataaacttgg ggcaatgcat cacgttccac 3540 atggaattgc ttgtgctgta ttaatagaag aagttattaa atataacgct acagactgtc 3600 caacaaagca aacagcattc cctcaatata aatctcctaa tgctaagaga aaatatgctg 3660 aaattgcaga gtatttgaat ttaaagggta ctagcgatac cgaaaaggta acagccttaa 3720 tagaagctat ttcaaagtta aagatagatt tgagtattcc acaaaatata agtgccgctg 3780 gaataaataa aaaagatttt tataatacgc tagataaaat gtcagagctt gcttttgatg 3840 accaatgtac aacagctaat cctaggtatc cacttataag tgaacttaag gatatctata 3900 taaaatcatt ttaaatcgat atattttagg aggattagtc atggaactaa acaatgtcat 3960 cctggaaaaa gagggcaagg tggcggttgt caccattaat cgtccgaaag ccttaaacgc 4020 actgaatagc gatacgctga aagaaatgga ctatgtaatc ggtgagattg aaaacgattc 4080 tgaagtgtta gctgttatcc tgactggggc gggagagaag agttttgtcg ccggcgcaga 4140 catttcagaa atgaaagaga tgaatacaat cgaaggtcgc aaattcggga ttctgggaaa 4200 caaggtattt cggcgtttag aactgctgga gaaaccagtg atcgctgcgg ttaatggctt 4260 cgccttaggt ggcggttgcg aaattgcaat gtcctgtgat atccgcattg cttcgagcaa 4320 cgcgcgtttt gggcagcctg aggtcggact gggcatcaca ccgggtttcg gcggtacgca 4380 acgcctgtct cggttagtgg ggatgggaat ggccaaacag ctgattttta ctgcacaaaa 4440 tatcaaggct gacgaagcgc tgcgtattgg cctggtaaac aaagttgtgg aaccaagtga 4500 gttaatgaat acagccaaag aaatcgcaaa caagattgtc tcaaatgcgc ctgttgctgt 4560 aaaactgtcc aaacaggcca ttaaccgcgg tatgcagtgc gatatcgaca ccgcactggc 4620 gttcgagtcg gaagcttttg gggaatgttt cagcacggag gaccaaaagg atgccatgac 4680 cgcatttatt gaaaaacgta aaattgaagg cttcaaaaat agataggata ggtaccaaga 4740 attatttaaa gcttattatg ccaaaatact tatatagtat tttggtgtaa atgcattgat 4800 agtttcttta aatttaggga ggtctgttta atgaaaaagg tatgtgttat aggcgcggga 4860 accatgggta gcggtattgc ccaggcattt gctgcaaaag gtttcgaagt ggttctgcgt 4920 gatatcaagg acgagtttgt cgatcgcggc ttagacttca ttaataaaaa cctgtctaaa 4980 ctggtaaaga aagggaaaat cgaagaggcg acgaaggtgg aaattttaac tcggatcagt 5040 ggaacagttg atctgaatat ggccgctgac tgcgatctgg tcattgaagc ggccgtagag 5100 cgtatggata tcaaaaaaca aatttttgca gacttagata acatctgtaa gccggaaacc 5160 attctggctt caaatacgtc ctcgctgagc atcactgagg tggcgtctgc cacaaaacgc 5220 ccagacaaag ttattggcat gcatttcttt aaccctgcac cggtcatgaa gttagtggaa 5280 gtaatccgtg ggattgctac cagtcaggaa acgttcgatg cggttaaaga gacctcaatc 5340 gccattggaa aagacccagt ggaagtcgca gaggcgcctg gctttgttgt aaatcgcatt 5400 ctgatcccga tgattaacga agctgtggga atcctggccg aaggaattgc atccgtcgag 5460 gatatcgaca aggcgatgaa attaggcgct aatcacccga tgggtccact ggaactgggc 5520 gacttcattg gtctggatat ctgcttagcc attatggacg ttctgtattc ggagactggg 5580

gatagcaaat accggcctca tacactgtta aagaaatatg tgcgtgcagg atggctgggc 5640

cgcaaatctg gtaagggttt ctacgattat tcaaaataag gatcccatgg tacgcgtgct 5700

agaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 5760

gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc gccctagacc taggggaíat 5820

attccgcttc ctcgctcact gactcgctac gctcggtcgt tcgactgcgg cgagcggaaa 5880 tggcttacga acggggcgga gatttcctgg aagatgccag gaagatactt aacagggaag 5940

tgagagggcc gcggcaaagc cgtttttcca taggctccgc ccccctgaca agcatcacga 6000

aatctgacgc tcaaatcagt ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 6060

tccccctggc ggctccctcg tgcgctctcc tgttcctgcc tttcggttta ccggtgtcat 6120

tccgctgtta tggccgcgtt tgtctcattc cacgcctgac actcagttcc gggtaggcag 6180

ttcgctccaa gctggactgt atgcacgaac cccccgttca gtcogaccgc tgcgccttat 6240

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg aaagacatgc aaaagcacca ctggcagcag 6300

ccacíggtaa ttgatttaga ggagttagtc ttgaagtcat gcgccggtta aggctaaact 6360

gaaaggacaa gttttggtga ctgcgctcct ccaagccagt tacctcggtt caaagagttg 6420

gtagctcaga gaaccttcga aaaaccgccc tgcaaggcgg ttttttcgtt ttcagagcaa 6480

gagattacgc gcagaccaaa acgatctcaa gaagatcatc ttattaatca gataaaatat 6540

ttctagattt cagtgcaatt tatctcttca aatgtagcac ctgaagtcag ccccatacga 6600

tataagttgt tacíagtgct tggattctca ccaataaaaa acgcccggcg gcaaccgagc 6660 gttctgaaca aatccagatg gagttctgag gtcattactg gatctatcaa caggagtcca 6720 agcgagctcg taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 6780 agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 6840 gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 6900 accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 6960 tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 7020 tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 7080 acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 7140 atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 7200 aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 7260 tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 7320 agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 7380 gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 7440 ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 7500 atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 7560 tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt 7620 tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 7680 tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 7740 cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc 7800 ctttcgtctt cac 7813 <210> 37 <211> 7814 <212> DNA <213> pGV1191

<400> 37

ctcgagtccc tatcagtgat agagattgac atccctatca gtgatagaga tactgagcac 60

atcagcagga cgcactgacc gaattcacaa taaaaaccgt atcaaaattt aggaggttag 120 ttagaatgaa agaagttgta atagctagcg cggtgcgtac cgccattggc tcttatggta 180

aaagtctgaa ggatgttccg gcagtcgact taggggctac ggcgatcaaa gaagccgtaa 240

aaaaggcagg aattaaacca gaggatgtga atgaagttat cctgggcaac gtcctgcagg 300

ctggtttagg gcaaaatcct gcgcgccagg cctcatttaa agcaggactg ccggtagaga 360

ttccagctat gactatcaac aaggtgtgcg gctccggtct gcggacagtt tcgttagcgg 420

cccaaattat caaagcaggc gacgctgatg tcattatcgc gggtgggatg gaaaatatga 480

gccgtgcccc ttacctggca aacaatgcgc gctggggata tcgtatgggc aacgctaaat 540

tcgtggacga aatgattacc gatggtctgt gggatgcctt taatgactac catatgggca 600

tcacggcaga gaacattgcg gaacgctgga atatctctcg ggaggaacag gatgagttcg 660

ctttagccag tcagaagaaa gcagaggaag cgattaaatc aggtcaattt aaggacgaga 720

tcgtaccggt tgtgattaaa gggcgtaaag gagaaactgt cgttgataca gacgaacacc 780

cgcgcttcgg ctccaccatt gagggtctgg ctaagctgaa accagccttt aaaaaggatg 840

ggacggtaac cgcaggcaac gcgtcgggtt taaatgattg tgccgcagtg ctggtcatca 900 tgagcgcgga aaaagctaaa gagctgggag ttaagcctct ggccaaaatt gtgtcttatg 960 gcagtgcggg tgtagacccg gctatcatgg ggtacggccc gttctatgca actaaagccg 1020 cgattgaaaa ggctggttgg acagtcgatg aattagacct gatcgagtca aacgaagcat 1080 ttgccgcgca gtccctggct gttgcaaaag atttaaaatt cgatatgaat aaggtgaacg 1140 taaatggagg cgccattgcg ctgggtcatc caatcggggc ttcgggagca cgtattctgg 1200 ttacgttagt gcacgccatg caaaaacgcg acgcgaaaaa gggcctggct accctgtgca 1260 tcggtggggg ccagggtact gcaatattgc tagaaaagtg ctagacttaa ttaaaatttt 1320 ataaaggagt gtatataaat gaaagttaca aatcaaaaag aactgaaaca gaagttaaat 1380 gagctgcgtg aggcgcaaaa aaaatttgcc acctatacgc aggaacaagt ggataagatt 1440 ttcaaacagt gcgcaatcgc tgcggccaaa gaacgcatta acctggcaaa gttagctgtt 1500 gaagagactg gcatcggtct ggtcgaggac aaaattatca aaaatcattt tgcggccgag 1560 tacatttata acaagtacaa aaacgagaaa acctgtggga tcattgacca cgatgatagc 1620 ctgggaatca caaaggtagc agaaccgatt ggcatcgtgg ctgcgattgt tccaacgact 1680 aatcctacat ctaccgccat cttcaaaagt ttaatttcac tgaaaacgcg gaatgcaatc 1740 tttttctccc cgcatccacg tgctaagaaa tcgaccattg cggccgcaaa actgatttta 1800 gacgcggctg tcaaggccgg tgcacctaaa aacatcattg ggtggatcga cgaaccgagc 1860 attgaactgt ctcaggatct gatgagtgag gcggacatca ttttagctac tggaggcccg 1920 tcaatggtaa aagccgcata ttcctcgggt aagccagcga tcggcgtggg tgctgggaat 1980 actcctgcca ttatcgacga aagcgcagac attgatatgg cggtttctag tatcattctg 2040 tcaaaaacgt acgacaacgg agtcatctgc gcctccgaac agtcgattct ggtgatgaat 210O agcatctatg agaaagtaaa ggaagagttt gttaaacgcg gctcttacat tctgaaccag 2160 aatgaaattg caaaaatcaa ggaaaccatg ttcaaaaacg gtgcgattaa tgctgatatc 2220 gtgggcaaaa gtgcctatat tatcgcgaag atggctggta ttgaggtccc gcaaactaca 2280 aaaatcttaa ttggggaagt tcagtcagta gaaaaatccg agctgtttag ccacgaaaag 2340 ctgtcgccgg tgttagcaat gtataaagtc aaagatttcg acgaggccct gaagaaagcg 2400 cagcgtctga tcgaattagg aggctctggt cataccagtt cactgtacat tgatagccaa 2460 aacaataaag acaaggttaa agaatttggg ctggctatga aaacgtcccg cacctttatc 2520 aacatgccat cgtctcaggg cgcaagtggt gatttatata atttcgccat tgcgcctagc 2580 tttactctgg gatgtggcac atggggtggg aactcagtgt cccaaaatgt agagccgaag 2640 catctgctga acatcaaatc ggtcgctgaa cggcgtgaga atatgttatg gttcaaagtt 2700 ccacagaaga tttactttaa atatggctgc ctgcgcttcg cactgaaaga attaaaggat 2760 atgaacaaaa aacgtgcctt tatcgtgacg gacaaggatc tgttcaaact gggttacgta 2820 aataaaatta ccaaggtttt agacgaaatt gatatcaaat attctatttt tactgacatc 2880 aaaagcgatc cgacaattga tagtgtgaag aaaggagcga aagagatgct gaacttcgaa 2940 cctgacacga tcatttcaat cggcggtggg tccccgatgg atgctgcaaa ggtcatgcat 3000 ctgttatacg agtatccaga agccgaaatt gagaatctgg cgatcaactt tatggacatt 3060 cgcaaacgga tctgtaattt tccgaaactg ggaaccaagg ctattagcgt tgcaatccct 3120 actacggccg gcaccggttc ggaagcgaca ccgttcgctg tgattaccaa cgatgagact 3180 gggatgaaat atccactgac atcttacgaa ttaacgccga atatggcaat cattgatacc 3240 gaactgatgc tgaacatgcc tcgtaaatta actgccgcga cgggcattga cgcactggta 3300

cacgccatcg aggcgtatgt cagtgttatg gcaaccgatt acacagacga actggcgtta 3360

cgcgctatta agatgatctt taaatatctg ccacgtgcct acaaaaatgg tactaacgat 3420

attgaagcgc gcgagaagat ggctcatgca tcaaatatcg ccggaatggc gttcgctaac 3480

gcatttctgg gcgtgtgcca cagcatggcc cataaattag gtgcgatgca ccatgtaccg 3540 catgggattg cttgtgcagt cctgatcgaa gaggttatta aatataatgc cacggactgc 3600

cctaccaagc agacagcgtt cccgcaatac aaatccccaa acgctaaacg gaagtatgca 3660

gaaatcgccg aatatctgaa tctgaaaggc acttcggata cggagaaagt gaccgcgtta 3720

attgaagcta tctctaagct gaaaattgat ctgagtatcc cgcagaacat ttcagcagcc 3780

ggtattaata aaaaggactt ttacaacacc ttagataaaa tgagcgagct ggcgttcgac 3840

gatcaatgta caactgctaa tcctcgttat ccgctgatct ccgaattaaa agatatctat 3900

ataaaatcat tttaaatcga tatattttag gaggattagt catggaacta aacaatgtca 3960

tcctggaaaa agagggcaag gtggcggttg tcaccattaa tcgtccgaaa gccttaaacg 4020

cactgaatag cgatacgctg aaagaaatgg actatgtaat cggtgagatt gaaaacgatt 4080

ctgaagtgtt agctgttatc ctgactgggg cgggagagaa gagttttgtc gccggcgcag 4140

acatttcaga aatgaaagag atgaatacaa tcgaaggtcg caaattcggg attctgggaa 4200

acaaggtatt tcggcgttta gaactgctgg agaaaccagt gatcgctgcg gttaatggct 4260

tcgccttagg tggcggttgc gaaattgcaa tgtcctgtga tatccgcatt gcttcgagca 4320 acgcgcgttt tgggcagcct gaggtcggac tgggcatcac accgggtttc ggcggtacgc 4380 aacgcctgtc tcggttagtg gggatgggaa tggccaaaca gctgattttt actgcacaaa 4440 atatcaaggc tgacgaagcg ctgcgtattg gcctggtaaa caaagttgtg gaaccaagtg 4500 agttaatgaa tacagccaaa gaaatcgcaa acaagattgt ctcaaatgcg cctgttgctg 4560 taaaactgtc caaacaggcc attaaccgcg gtatgcagtg cgatatcgac accgcactgg 4620 cgttcgagtc ggaagctttt ggggaatgtt tcagcacgga ggaccaaaag gatgccatga 4680 ccgcatttat tgaaaaacgt aaaattgaag gcttcaaaaa tagataggat aggtaccaag 4740 aattatttaa agcttattat gccaaaatac ttatatagta ttttggtgta aatgcattga 4800 tagtttcttt aaatttaggg aggtctgttt aatgaaaaag gtatgtgtta taggcgcggg 4860 aaccatgggt agcggtattg cccaggcatt tgctgcaaaa ggtttcgaag tggttctgcg 4920 tgatatcaag gacgagtttg tcgatcgcgg cttagacttc attaataaaa acctgtctaa 4980 actggtaaag aaagggaaaa tcgaagaggc gacgaaggtg gaaattttaa ctcggatcag 5040 tggaacagtt gatctgaata tggccgctga ctgcgatctg gtcattgaag cggccgtaga 5100 gcgtatggat atcaaaaaac aaatttttgc agacttagat aacatctgta agccggaaac 5160 cattctggct tcaaatacgt cctcgctgag catcactgag gtggcgtctg ccacaaaacg 5220 cccagacaaa gttattggca tgcatttctt taaccctgca ccggtcatga agttagtgga 5280 agtaatccgt gggattgcta ccagtcagga aacgttcgat gcggttaaag agacctcaat 5340 cgccattgga aaagacccag tggaagtcgc agaggcgcct ggctttgttg taaatcgcat 5400 tctgatcccg atgattaacg aagctgtggg aatcctggcc gaaggaattg catccgtcga 5460 ggatatcgac aaggcgatga aattaggcgc taatcacccg atgggtccac tggaactggg 5520 cgacttcatt ggtctggata tctgcttagc cattatggac gttctgtatt cggagactgg 5580 ggatagcaaa taccggcctc atacactgtt aaagaaatat gtgcgtgcag gatggctggg 5640 ccgcaaatct ggtaagggtt tctacgatta ttcaaaataa ggatcccatg gtacgcgtgc 5700 tagaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt 5760 tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgccctagac ctaggggata 5820 tattccgctt cctcgctcac tgactcgcta cgctcggtcg ttcgactgcg gcgagcggaa 5880 atggcttacg aacggggcgg agatttcctg gaagatgcca ggaagatact taacagggaa 5940 gtgagagggc cgcggcaaag ccgtttttcc ataggctccg cccccctgac aagcatcacg 6000 aaatctgacg ctcaaatcag tggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 6060 ttccccctgg cggctccctc gtgcgctctc ctgttcctgc ctttcggttt accggtgtca 6120 ttccgctgtt atggccgcgt ttgtctcatt ccacgcctga cactcagttc cgggtaggca 6180 gttcgctcca agctggactg tatgcacgaa ccccccgttc agtccgaccg ctgcgcctta 6240 tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gaaagacatg caaaagcacc actggcagca 6300 gccactggta attgatttag aggagttagt cttgaagtca tgcgccggtt aaggctaaac 6360 tgaaaggaca agttttggtg actgcgctcc tccaagccag ttacctcggt tcaaagagtt 6420 ggtagctcag agaaccttcg aaaaaccgcc ctgcaaggcg gttttttcgt tttcagagca 6480 agagattacg cgcagaccaa aacgatctca agaagatcat cttattaatc agataaaata 6540 tttctagatt tcagtgcaat ttatctcttc aaatgtagca cctgaagtca gccccatacg 6600 atataagttg ttactagtgc ttggattctc accaataaaa aacgcccggc ggcaaccgag 6660 cgttctgaac aaatccagat ggagttctga ggtcattact ggatctatca acaggagtcc 6720 aagcgagctc gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 6780 cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctigact ccccgtcgtg tagataacta 6840 cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 6900 caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 6960 gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 7020 gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 7080 cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 7140 catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 7200 gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 7260 ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 7320 gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 7380 cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 7440 tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 7500 gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 7560 atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 7620 ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 7680 gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 7740 acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 7800 cctttcgtct tcac 7814

<210> 38 <211> 3126 <212> DNA <213> pGV1248

<400> 38

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900

tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960

cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020

gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttcaggagga 1080

atttaaaatg aagatcgttt tagtcttata tgatgctggt aaacacgctg ccgatgaaga 1140

aaaattatac ggttgtactg aaaacaaatt aggtattgcc aattggttga aagatcaagg 1200 acatgaatta atcaccacgt ctgataaaga aggcggaaac agtgtgttgg atcaacatat 1260

accagàtgcc gatattatca ttacaactcc tttccatcct gcttatatca ctaaggaaag 1320

aatcgacaag gctaaaaaat tgaaattagt tgttgtcgct ggtgtcggtt ctgatcatat 1380

tgatttggat tatatcaacc aaaccggtaa gaaaatctcc gttttggaag ttaccggttc 1440

taatgttgtc tctgttgcag aacacgttgt catgaccatg cttgtcttgg ttagaaattt 1500

tgttccagct cacgaacaaa tcattaacca cgattgggag gttgctgcta tcgctaagga 1560

tgcttacgat atcgaaggta aaactatcgc caccattggt gccggtagaa ttggttacag 1620

agtcttggaa agattagtcc cattcaatcc taaagaatta ttatactacg attatcaagc 1680

tttaccaaaa gatgctgaag aaaaagttgg tgctagaagg gttgaaaata ttgaagaatt 1740

ggttgcccaa gctgatatag ttacagttaa tgctccatta cacgctggta caaaaggttt 1800

aattaacaag gaattattgt ctaaattcaa gaaaggtgct tggttagtca atactgcaag 1860

aggtgccatt tgtgttgccg aagatgttgc tgcagcttta gaatctggtc aattaagagg 1920

ttatggtggt gatgtttggt tcccacaacc agctccaaaa gatcacccat ggagagatat 1980 gagaaacaaa tatggtgctg gtaacgccat gactcctcat tactctggta ctactttaga 2040 tgctcaaact agatacgctc aaggtactaa aaatatcttg gagtcattct ttactggtaa 2100 gtttgattac agaccacaag atatcatctt attaaacggt gaatacgtta ccaaagctta 2160 cggtaaacac gataagaaat aaggatccca tggtacgcgt gctagaggca tcaaataaaa 2220 cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct 2280 ctcctgagta ggacaaatcc gccgccctag acctaggcgt tcggctgcgg cgagcggtat 2340 cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 2400 acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 2460 ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 2520 ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 2580 gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 2640 gcgtggcgct ttctcaatgc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 2700 ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 2760 actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 2820 gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 2880 ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 2940 ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 3000 gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 3060 tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 3120 tcatga 3126

<210> 39 <211> 2106 <212> DNA <213> pGV1252

<400> 39

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020 gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttctgaggag 1080 aagtcgactt ggaagcggcc gcttaggatc cttgaggaga ttggtacctt aacgatcggt 1140 tggcgcctta ggattcccgg gagatcccca tggtacgcgt gctagaggca tcaaataaaa 1200 cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct 1260 ctcctgagta ggacaaatcc gccgccctag acctaggcgt tcggctgcgg cgagcggtat 1320 cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 1380 acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 1440 ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 1500 ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 1560 gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa ‘ 1620 gcgtggcgct ttctcaatgc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 1680 ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 1740 actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 1800 gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 1860 ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 1920 ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 1980 gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 2040 tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 21OO tcatga 2106

<210> 40 <211> 3311 <212> DNA <213> pGV1272

<400> 40

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaattgt gagcggataa caattgacat 1020 tgtgagcgga taacaagata ctgagcacat cagcaggacg cactgaccga attctgagga 1080 gaagtcgact tggaagcggc cgcttaggat ccttgaggag attggtacca tggccatgtt 1140 caccactacc gccaaggtta ttcagccgaa aatccgtggt tttatctgta cgaccaccca 1200 cccgattggc tgtgaaaaac gcgtgcagga agaaattgct tacgcacgtg cacatccacc 1260 gaccagcccg ggtccgaaac gtgtcctggt catcggctgt tccactggct acggcctgtc 1320 tactcgtatc accgcagctt tcggctatca ggcggctact ctgggcgtgt tcctggctgg 1380 tccgccgact aaaggtcgcc cggctgcggc cggttggtat aacaccgtag ctttcgaaaa 1440 agcggccctg gaagccggtc tgtatgcccg ctccctgaac ggtgacgctt ttgactctac 1500 taccaaagca cgcaccgtgg aagctatcaa acgtgacctg ggcaccgttg acctggtggt 1560 ttatagcatt gcagctccga aacgtaccga tccggctacc ggcgtgctgc acaaagcgtg 1620 tctgaaaccg atcggtgcga cctacaccaa ccgtacggta aatactgaca aagctgaagt 1680 tacggacgtg tccatcgaac cggcgagccc agaagaaatt gcagacactg tgaaagtaat 1740 gggtggcgaa gactgggaac tgtggattca ggctctgtct gaagccggcg ttctggcaga 1800 aggcgcgaaa accgtcgcat actcttatat cggtccggag atgacctggc cggtgtactg 1860 gtccggcacc attggtgaag ccaaaaagga tgttgaaaaa gccgctaaac gtattaccca 1920 gcagtacggc tgtccggcat acccggttgt ggcaaaagca ctggtgacgc aggcatcctc 1980 cgcgatcccg gtcgtcccgc tgtatatttg tctgctgtac cgtgtaatga aagaaaaagg 2040 cactcacgaa ggttgcatcg aacaaatggt gcgtctgctg accacgaaac tgtacccgga 2100 aaacggtgcc ccgatcgttg atgaagcggg ccgtgttcgt gtggacgatt gggaaatggc 2160 agaagacgtt cagcaagccg ttaaagacct gtggagccag gtgagcacgg caaacctgaa 2220 agatatttcc gacttcgccg gttaccaaac cgagttcctg cgcctgtttg gttttggtat 2280 cgatggcgtg gactatgacc agccggttga cgtagaggca gacctgccga gcgcagctca 2340 gcagtaaggc gccttaggat tcccgggaga tcccatggta cgcgtgctag aggcatcaaa 2400 taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga 2460 acgctctcct gagtaggaca aatccgccgc cctagaccta ggcgttcggc tgcggcgagc 2520 ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 2580 aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 2640 ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 2700 gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 2760 cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 2820 gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 2880 tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 2940 cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 3000 cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 3060 gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 3120 agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 3180 cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 3240

tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 3300

tttggtcatg a 3311

<210> 41 <211> 3620 <212> DNA <213> pGV1278 <400> 41

ctcgagtccc tatcagtgat agagattgac atccctatca gtgatagaga tactgagcac 60 atcagcagga cgcactgacc gaattcatta aagaggagaa aggtaccatg agtactgaaa 120 tcaaaactca ggtcgtggta cttggggcag gccccgcagg ttactccgct gccttccgtt 180 gcgctgattt aggtctggaa accgtaatcg tagaacgtta caacaccctt ggcggtgttt 240 gcctgaacgt cggctgtatc ccttctaaag tactgctgca cgtagcaaaa gttatcgaag 300 aagccaaagc gctggctgaa cacggtatcg tcttcggcga accgaaaacc gatatcgaca 360 agattcgtac ctggaaagag aaagtgatca atcagctgac cggtggtctg gctggtatgg 420 cgaaaggccg caaagtcaaa gtggtcaacg gtctgggtaa attcaccggg gctaacaccc 480 tggaagttga aggtgagaac ggcaaaaccg tgatcaactt cgacaacgcg atcattgcag 540 cgggttctcg cccgatccaa ctgccgttta ttccgcatga agatccgcgt atctgggact 600 ccactgacgc gctggaactg aaagaagtac cagaacgcct gctggtaatg ggtggcggta 660 tcatcggtct ggaaatgggc accgtttacc acgcgctggg ttcacagatt gacgtggttg 720 aaatgttcga ccaggttatc ccggcagctg acaaagacat cgttaaagtc ttcaccaagc 780 gtatcagcaa gaaattcaac ctgatgctgg aaaccaaagt taccgccgtt gaagcgaaag 840 aagacggcat ttatgtgacg atggaaggca aaaaagcacc cgctgaaccg cagcgttacg 900 acgccgtgct ggtagcgatt ggtcgtgtgc cgaacggtaa aaacctcgac gcaggcaaag 960 caggcgtgga agttgacgac cgtggtttca tccgcgttga caaacagctg cgtaccaacg 1020 taccgcacat ctttgctatc ggcgatatcg tcggtcaacc gatgctggca cacaaaggtg 1080 ttcacgaagg tcacgttgcc gctgaagtta tcgccggtaa gaaacactac ttcgatccga 1140 aagttatccc gtccatcgcc tataccgaac cagaagttgc atgggtgggt ctgactgaga 1200 aagaagcgaa agagaaaggc atcagctatg aaaccgccac cttcccgtgg gctgcttctg 1260 gtcgtgctat cgcttccgac tgcgcagacg gtatgaccaa gctgattttc gacaaagaat 1320 ctcaccgtgt gatcggtggt gcgattgtcg gtactaacgg cggcgagctg ctgggtgaaa 1380 tcggcctggc aatcgaaatg ggttgtgatg ctgaagacat cgcactgacc atccacgcgc 1440 acccgactct gcacgagtct gtgggcctgg cggcagaagt gttcgaaggt agcattaccg 1500 acctgccgaa cccgaaagcg aagaagaagt aattggatcc catggtacgc gtgctagagg 1560 catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg 1620 tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgccct agacctaggc gttcggctgc 1680 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 1740 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 1800 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 1860 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 1920 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 1980 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 2040 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 2100 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 2160 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 2220 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 2280 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 2340 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 2400 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 2460 aagggatttt ggtcatgact agtgcttgga ttctcaccaa taaaaaacgc ccggcggcaa 2520 ccgagcgttc tgaacaaatc cagatggagt tctgaggtca ttactggatc tatcaacagg 2580 agtccaagcg agctctcgaa ccccagagtc ccgctcagaa gaactcgtca agaaggcgat 2640 agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag 2700 cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc 2760 ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca 2820 tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc 2880 gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat 2940 catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg 3000 cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag 3060 ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca 3120

cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc 3180

aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc agttcattca 3240

gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga 3300

acacggcggc atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct 3360

ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatg cgaaacgatc 3420

ctcatcctgt ctcttgatca gatcttgatc ccctgcgcca tcagatcctt ggcggcaaga 3480

aagccatcca gtttactttg cagggcttcc caaccttacc agagggcgcc ccagctggca 3540

attccgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca 3600

cgaggccctt tcgtcttcac 3620

<210> 42 <211> 3620 <212> DNA <213> pGV1279

<400> 42

ctcgagtccc tatcagtgat agagattgac atccctatca gtgatagaga tactgagcac 60 atcagcagga cgcactgacc gaattcatta aagaggagaa aggtaccatg agtactgaaa 120 tcaaaactca ggtcgtggta cttggggcag gccccgcagg ttactccgct gccttccgtt 180 gcgctgattt aggtctggaa accgtaatcg tagaacgtta caacaccctt ggcggtgttt 240 gcctgaacgt cggctgtatc ccttctaaag cactgctgca cgtagcaaaa gttatcgaag 300 aagccaaagc gctggctgaa cacggtatcg tcttcggcga accgaaaacc gatatcgaca 360 agattcgtac ctggaaagag aaagtgatca atcagctgac cggtggtctg gctggtatgg 420 cgaaaggccg caaagtcaaa gtggtcaacg gtctgggtaa attcaccggg gctaacaccc 480 tggaagttga aggtgagaac ggcaaaaccg tgatcaactt cgacaacgcg atcattgcag 540 cgggttctcg cccgatccaa ctgccgttta ttccgcatga agatccgcgt atctgggact 600 ccactgacgc gctggaactg aaagaagtac cagaacgcct gctggtaatg ggtggcggta 660 tcatcggtct ggaaatgggc accgtttacc acgcgctggg ttcacagatt gacgtggttg 720 aaatgttcga ccaggttatc ccggcagctg acaaagacat cgttaaagtc ttcaccaagc 780 gtatcagcaa gaaattcaac ctgatgctgg aaaccaaagt taccgccgtt gaagcgaaag 840 aagacggcat ttatgtgacg atggaaggca aaaaagcacc cgctgaaccg cagcgttacg 900 acgccgtgct ggtagcgatt ggtcgtgtgc cgaacggtaa aaacctcgac gcaggcaaag 960 caggcgtgga agttgacgac cgtggtttca tccgcgttga caaacagctg cgtaccaacg 1020 taccgcacat ctttgctatc ggcgatatcg tcggtcaacc gatgctggca cacaaaggtg 1080 ttcacgaagg tcacgttgcc gctgaagtta tcgccggtaa gaaacactac ttcgatccga 1140 aagttatccc gtccatcgcc tataccgaac cagaagttgc atgggtgggt ctgactgaga 1200 aagaagcgaa agagaaaggc atcagctatg aaaccgccac cttcccgtgg gctgcttctg 1260 gtcgtgctat cgcttccgac tgcgcagacg gtatgaccaa gctgattttc gacaaagaat 1320 ctcaccgtgt gatcggtggt gcgattgtcg gtactaacgg cggcgagctg ctgggtgaaa 1380 tcggcctggc aatcgaaatg ggttgtgatg ctgaagacat cgcactgacc atccacgcgc 1440 acccgactct gcacgagtct gtgggcctgg cggcagaagt gttcgaaggt agcattaccg 1500 acctgccgaa cccgaaagcg aagaagaagt aattggatcc catggtacgc gtgctagagg 1560

catcaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg 1620

tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat ccgccgccct agacctaggc gttcggctgc 1680

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 1740

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 1800 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 1860

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 1920

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 1980

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 2040

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 2100

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 2160

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 2220

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 2280

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 2340

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 2400

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 2460

aagggatttt ggtcatgact agtgcttgga ttctcaccaa taaaaaacgc ccggcggcaa 2520

ccgagcgttc tgaacaaatc cagatggagt tctgaggtca ttactggatc tatcaacagg 2580 agtccaagcg agctctcgaa ccccâgagtc ccgctcagaa gaactcgtca agaaggcgat 2640

agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag 2700

cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc 2760

ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca 2820

tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc 2880

gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat 2940 catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg 3000

cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag 3060

ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca 3120

cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc 3180

aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc agttcattca 3240

gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga 3300

acacggcggc atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct 3360

ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatg cgaaacgatc 3420

ctcatcctgt ctcttgatca gatcttgatc ccctgcgcca tcagatcctt ggcggcaaga 3480

aagccatcca gtttactttg cagggcttcc caaccttacc agagggcgcc ccagctggca 3540

attccgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca 3600

cgaggccctt tcgtcttcac 3620

<210> 43 <211> 4244 <212> DNA <213> pGV1281

<400> 43

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagataaatg tgagcggata acattgacat 1020 tgtgagcgga taacaagata ctgagcacat cagcaggacg cactgaccga attcattaaa 1080 gaggagaaag gtaccatggc catgttcacc actaccgcca aggttattca gccgaaaatc 1140 cgtggtttta tctgtacgac cacccacccg attggctgtg aaaaacgcgt gcaggaagaa 1200 attgcttacg cacgtgcaca tccaccgacc agcccgggtc cgaaacgtgt cctggtcatc 1260 ggctgttcca ctggctacgg cctgtctact cgtatcaccg cagctttcgg ctatcaggcg 1320 gctactctgg gcgtgttcct ggctggtccg ccgactaaag gtcgcccggc tgcggccggt 1380 tggtataaca ccgtagcttt cgaaaaagcg gccctggaag ccggtctgta tgcccgctcc 1440 ctgaacggtg acgcttttga ctctactacc aaagcacgca ccgtggaagc tatcaaacgt 1500 gacctgggca ccgttgacct ggtggtttat agcattgcag ctccgaaacg taccgatccg 1560 gctaccggcg tgctgcacaa agcgtgtctg aaaccgatcg gtgcgaccta caccaaccgt 1620 acggtaaata ctgacaaagc tgaagttacg gacgtgtcca tcgaaccggc gagcccagaa 1680 gaaattgcag acactgtgaa agtaatgggt ggcgaagact gggaactgtg gattcaggct 1740 ctgtctgaag ccggcgttct ggcagaaggc gcgaaaaccg tcgcatactc ttatatcggt 1800 ccggagatga cctggccggt gtactggtcc ggcaccattg gtgaagccaa aaaggatgtt 1860 gaaaaagccg ctaaacgtat tacccagcag tacggctgtc cggcataccc ggttgtggca 1920 aaagcactgg tgacgcaggc atcctccgcg atcccggtcg tcccgctgta tatttgtctg 1980 ctgtaccgtg taatgaaaga aaaaggcact cacgaaggtt gcatcgaaca aatggtgcgt 2040 ctgctgacca cgaaactgta cccggaaaac ggtgccccga tcgttgatga agcgggccgt 2100 gttcgtgtgg acgattggga aatggcagaa gacgttcagc aagccgttaa agacctgtgg 2160 agccaggtga gcacggcaaa cctgaaagat atttccgact tcgccggtta ccaaaccgag 2220 ttcctgcgcc tgtttggttt tggtatcgat ggcgtggact atgaccagcc ggttgacgta 2280 gaggcagacc tgccgagcgc agctcagcag taaggatcca ggaggaattt aaaatgaaga 2340 tcgttttagt cttatatgat gctggtaaac acgctgccga tgaagaaaaa ttatacggtt 2400 gtactgaaaa caaattaggt attgccaatt ggttgaaaga tcaaggacat gaattaatca 2460 ccacgtctga taaagaaggc ggaaacagtg tgttggatca acatatacca gatgccgata 2520 ttatcattac aactcctttc catcctgctt atatcactaa ggaaagaatc gacaaggcta 2580 aaaaattgaa attagttgtt gtcgctggtg tcggttctga tcatattgat ttggattata 2640 tcaaccaaac cggtaagaaa atctccgttt tggaagttac cggttctaat gttgtctctg 2700 ttgcagaaca cgttgtcatg accatgcttg tcttggttag aaattttgtt ccagctcacg 2760 aacaaatcat taaccacgat tgggaggttg ctgctatcgc taaggatgct tacgatatcg 2820 aaggtaaaac tatcgccacc attggtgccg gtagaattgg ttacagagtc ttggaaagat 2880 tagtcccatt caatcctaaa gaattattat actacgatta tcaagcttta ccaaaagatg 2940 ctgaagaaaa agttggtgct agaagggttg aaaatattga agaattggtt gcccaagctg 3000 atatagttac agttaatgct ccattacacg ctggtacaaa aggtttaatt aacaaggaat 3060 tattgtctaa attcaagaaa ggtgcttggt tagtcaatac tgcaagaggt gccatttgtg 3120 ttgccgaaga tgttgctgca gctttagaat ctggtcaatt aagaggttat ggtggtgatg 3180 tttggttccc acaaccagct ccaaaagatc acccatggag agatatgaga aacaaatatg 3240 gtgctggtaa cgccatgact cctcattact ctggtactac tttagatgct caaactagat 3300 acgctcaagg tactaaaaat atcttggagt cattctttac tggtaagttt gattacagac 3360 cacaagatat catcttatta aacggtgaat acgttaccaa agcttacggt aaacacgata 3420

agaaataacc tagggcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 3480

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 3540

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 3600

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 3660

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 3720

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc 3780

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 3840

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 3900

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 3960

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 4020

gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 4080

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 4140

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 4200

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atga 4244

<210> 44 <211> 1395 <212> DNA <213> synthetic <400 44 atgaatcgtt ccgcaatcgg cgtctcctct atggtgggta acctggtttt ctctgttatc 60 tccgttaaac gtgagatcac gggccagtct ggtactttcc gtgcccgtcc gccagccatc 120 ggctgcttcc tgtacaacgc acgcgatttc tccgatttcc gcccgtctcc gccgtttcgt 180 caggaagtat ctatgatcat caaacctcgc gttcgtggct tcatctgcgt taccacccac 240 ccagttggct gtgaggcgaa cgttaaagaa cagatcgact acgttacgag ccacggcccg 300 attgcaaacg gtccgaaaaa ggtactggta attggtgcga gcaccggtta cggcctggcc 360 gctcgcatca gcgccgcttt cggtagcggc gcagacactc tgggtgtttt cttcgaacgt 420 gcaggtagcg aaaccaagcc gggcaccgcg ggttggtaca actccgccgc cttcgaaaaa 480 ttcgctgcgg aaaagggcct gtacgctcgt tccatcaatg gcgatgcgtt cagcgacaaa 540 gtaaaacagg tgaccatcga caccattaag caggacctgg gtaaggtgga cctggttgtt 600 tattctctgg ctgcgccacg ccgtacccat ccgaagacgg gtgaaaccat ctccagcacc 660 ctgaagcctg tgggtaaagc ggttactttc cgcggcctgg atacggacaa agaggttatc 720 cgcgaagtat ccctggaacc ggcaacccaa gaagagattg acggcaccgt ggcagttatg 780 ggcggcgagg attggcagat gtggatcgac gctctggatg aggcaggcgt actggccgac 840 ggcgctaaaa ctaccgcttt cacttacctg ggtgaacaga tcacccatga catctattgg 900 aacggcagca ttggcgaagc taaaaaggac ctggacaaga aagtgctgag cattcgcgac 960 aagctggccg cgcacggcgg cgatgctcgc gtaagcgtcc tgaaagcagt cgtgacccaa 1020 gcgtcttctg caatcccgat gatgccgctg tatctgagcc tgctgttcaa agtgatgaag 1080 gagactggca ctcatgaagg ttgtatcgaa caggtgtacg gcctgctgaa agacagcctg 1140 tatggtgcta ctccacacgt agacgaagag ggccgtctgc gtgctgacta taaagaactg 1200

gacccgcagg tacaagataa agtggtagct atgtgggata aagttaccaa cgaaaatctg 1260

tacgaaatga ctgacttcgc gggttacaaa accgaatttc tgcgcctgtt cggctttgaa 1320

atcgcaggtg ttgattatga tgccgacgtt aatcctgatg ttaagattcc gggcattatt 1380

gatactacgg tttga 1395

<210> 45

<211> 1221

<212> DNA

<213> synthetic

<400> 45

atgatcgtcc agccgaaagt tcgcggtttt atctgcacta ccgcacaccc agaaggctgc 60 gcgcgtcacg ttggtgagtg gatcaattat gctaagcagg agccttccct gaccggcggt 120 ccgcagaaag tactgattat cggtgcgagc acgggctttg gtctggcgtc tcgtatcgtg 180 gctgccttcg gtgcgggtgc taaaacgatt ggtgtgtttt tcgaacgtcc ggcttctggc 240 aaacgcaccg cgtcccctgg ttggtacaat actgcagcgt tcgagaagac cgctctggcg 300 gctggcctgt acgcgaaatc tatcaacggc gacgcgttca gcgacgaaat taaacagcaa 360 accatcgacc tgatccagaa agattggcag ggcggtgttg acctggtaat ttactctatc 420 gcgagcccgc gtcgcgtaca cccgcgtact ggtgaaatct tcaactctgt cctgaaacct 480 attggtcaga cctaccacaa caaaactgtg gacgtaatga ccggcgaagt ttccccggta 540 tctattgagc cggcaacgga aaaggaaatc cgcgacactg aagcggtaat gggtggcgac 600 gactgggcgc tgtggatcaa cgcgctgttc aaatacaact gcctggccga aggcgtcaaa 660 accgttgcgt tcacctatat tggtccggaa ctgacccacg cggtatatcg taacggcact 720

atcggccgtg cgaaactgca cctggaaaag actgctcgcg aactggatac ccagctggag 780

agcgcgctgt ctggtcaggc tctgatttct gttaacaaag ccctggtgac ccaggcttcc 840

gcagctatcc cggtagttcc gctgtatatc tccctgctgt ataaaatcat gaaagagaaa 900

aacatccacg agggttgcat cgagcagatg tggcgtctgt ttaaggagcg cctgtactct 960

aaccagaaca tccctactga ctccgaaggc cgcatccgta ttgatgactg ggaaatgcgc 1020

gaagacgtac aagcggaaat caaacgtctg tgggaatcca tcaacaccgg taacgttgaa 1080

actgtctctg atatcgctgg ctatcgtgag gacttctata aactgttcgg tttcggtctg 1140

aacggtatcg actacgaacg tggcgttgaa attgaaaagg ctatcccgtc catcactgtt 1200

actcctgaaa acccggaata a 1221

<210> 46

<211> 1179

<212> DNA

<213> synthetic

<400> 46

atgatcatta aaccgaaggt gcgtggcttt atctgcacta ctgctcatcc ggtcggctgt 60 gcagagaatg ttcaacagca gatcgactac gtagcagccc agaacgcccc gtctagcggc 120 ccgaaaaatg tactggtcat cggttgcagc aacggttacg gtctggcgtc ccgcatcacc 180 agcgcattcg gctttggtgc gaacaccctg ggcgtcatgt tcgaaaaaga accgaccgaa 240 cgccgtccgg catctgccgg ttggtataac acccgtgcgc tggagaaagc ggctcaggaa 300 aaaggtctgt acgcgcaatc tctgaatgtg gatgcgttct ccgatgaagc taaaaccgca 360 gtaatcgagg ctgtgaaagc taacatgggt aaaattgatc tggtcgttta cagcctgggt 420

gcaccgcgtc gtaaagatcc ggaaaccggc actgtctact ccagcacgct gaaacctatt 480

ggcaaagctg tgacccgtaa aaacctgaac actgacaccc gtgaggtagg tgaagtgact 540

ctggaaccag cgaccgaaga agaaattttc aacacggtga aagtaatggg cggtgaagac 600

tgggaacgct ggatgaccgc tctggacgac gctggcgtgc tggcagacgg cgttaaaact 660

accgcgtata cctacattgg taaagagctg acctggccga tctacggcgg tgcgaccatc 720

ggcaaggcta aagaagatct ggatcgcgca tccgttgcta ttaacaagaa actggcagac 780

aaatatcagg gtgttagcta cgtcgcagtg ctgaaagcgc tggtaactca gtcttcttcc 840

gccatcccag taatgccgct gtacatttct gctctgtatc gtgttatgaa ggaagaaggc 900

acgcacgaag gctgcatcga gcagatcacg ggcctgtttt tcgaccagct gttctctgaa 960

aacgccctga acctggatga taccggccgt atccgcatgg aagataacga actgaaagcg 1020

tctgtacagg agaaagttgc tgcgatctgg gaacaggtta acacggaaaa tctggacgag 1080

ctgaccgact tcaaaggtta ccaggaagaa tttttcaaac tgttcggttt cggcttcgaa 1140

ggtgttgatt acgacgcaga cgtagatcca gtggtgtga 1179

<210> 47 <211> 1203 <212> DNA <213> synthetic

<400> 47

atgattatca aaccgaaaac gcgtggcttt atctgcacta ccacccaccc ggttggttgt 60 gaagccaacg ttctggaaca aatcaacacc actaaagcca aaggcccgat caccaatggt 120 ccaaaaaaag ttctggttat tggcagctcc agcggttacg gtctgtcttc ccgtatcgct 180 gcggcgtttg gttccggtgc agcgaccctg ggtgtattct tcgaaaaacc gggcaccgag 240 aagaaacctg gcaccgctgg ttggtataac agcgctgctt tcgataaatt cgctaaggca 300 gatggcctgt actctaaatc tattaacggt gacgcgttct cccacgaagc caaacagaaa 360 gcgatcgacc tgatcaaagc ggatctgggc caaattgaca tggttgtgta ctctctggct 420 tctccggttc gtaaactgcc ggattccggc gaactgattc gttctagcct gaaaccaatc 480 ggcgaaactt acaccgctac tgctgttgac acgaacaaag acctgatcat tgaaacgagc 540 gttgaaccag cgagcgaaca ggaaatccaa gatactgtaa ccgtaatggg cggtgaagac 600 tgggaactgt ggctggccgc gctgagcgat gctggtgtcc tggcggatgg ctgcaaaacc 660 gttgcgtact cttacattgg tacggaactg acctggccga tctactggca cggcgctctg 720 ggcaaggcaa aaatggacct ggaccgtgcc gcaaaagcgc tggacgaaaa actgagcacg 780 accggtggct ctgcaaatgt ggctgtgctg aaatctgtag tgacccaggc gtcctccgct 840 atcccggtga tgccgctgta catcgccatg gtattcaaaa agatgcgcga agaaggtctg 900 cacgaaggct gcatggaaca gatcaaccgt atgttcgcgg aacgtctgta ccgtgaagat 960 ggtcaggctc cgcaggtcga tgatgcaaat cgtctgcgcc tggacgattg ggaactgcgc 1020 gaggagatcc agcagcactg ccgtgatctg tggccgtctg tgactactga gaacctgagc 1080 gagctgaccg actaccgtga atataaagat gagttcctga aactgttcgg tttcggcgtt 1140 gaaggtgtag attacgacgc cgacgttaac ccggaagtaa acttcgacgt agaacagttc 1200 taa 1203

<210> 48 <211> 1194 <212> DNA <213> synthetic

<400> 48

atgatcgtaa agcctatggt tcgtaacaat atttgcctga acgctcatcc gcagggttgc 60 aagaaaggtg tcgaggatca gattgaatac accaagaaac gtattaccgc tgaagttaaa 120 gcaggtgcta aagcgccgaa aaacgtgctg gttctgggct gttccaacgg ctacggcctg 180 gcgtctcgca tcactgctgc gtttggttat ggtgcggcta ctatcggtgt ttcttttgaa 240 aaagcgggct ccgaaaccaa atatggcacc ccaggttggt acaacaacct ggcgttcgat 300 gaagcggcta aacgcgaggg cctgtactct gtgactatcg acggtgacgc cttcagcgat 360 gaaatcaaag cacaggttat cgaggaagcc aaaaagaaag gcattaagtt tgacctgatt 420 gtgtactctc tggctagccc ggtgcgtacc gatccggata ccggcatcat gcacaaatcc 480 gtcctgaaac cgttcggcaa aactttcacc ggtaaaacgg tagatccgtt cactggtgag 540 ctgaaagaaa tctctgccga gccagctaac gatgaagagg cagctgctac tgtcaaagtc 600 atgggtggtg aagattggga acgttggatc aaacagctgt ctaaagaagg tctgctggag 660 gaaggctgca ttaccctggc atactcctac attggtccag aggccactca ggcgctgtat 720 cgtaaaggta ctatcggtaa agctaaagaa cacctggaag ctacggctca ccgtctgaac 780 aaagaaaacc cgtccatccg tgcattcgtt tccgtcaaca agggcctggt cacccgtgca 840 tccgcagtta tcccggtcat ccctctgtat ctggcttccc tgttcaaggt tatgaaggaa 900 aaaggtaacc atgagggttg tatcgaacag atcacccgtc tgtacgccga acgtctgtac 960 cgcaaggatg gcaccatccc ggttgatgag gaaaaccgca ttcgtatcga cgactgggaa 1020

ctggaagaag atgttcaaaa agctgtgtct gcgctgatgg aaaaagtgac cggcgaaaat 1080

gcggaatccc tgacggacct ggcgggctat cgtcatgact ttctggcgtc caacggtttt 1140

gatgttgagg gcatcaacta tgaagcggaa gtagagcgtt ttgaccgcat ttaa 1194

<210> 49 <211> 1386 <212> DNA <213> synthetic

<400> 49

atgcgtctgc tgttcgaagc agttcacgcg cgtaagcgtt ggcatcgtac tgcgccggct 60 gccgcattca ctcgttttca caccgctgca tgcgtgactc atcaggcagt ttcccgtgct 120 ccacacgccc tgcgttgtcg ccagcacctg gcagatcagg agtccacgct gatcattcac 180 ccgaaagtac gtggtttcat ctgcacgacc actcaccctc tgggttgcga acgtaacgtc 240 ctggaacaga tcgcggctac tcgtgctcgc ggtgttcgta acgatggtcc gaagaaagtt 300 ctggtgatcg gcgcgtctag cggttacggt ctggccagcc gcattaccgc cgcattcggt 360 ttcggtgcgg ataccctggg tgttttcttc gaaaaaccgg gtactgcctc taaagctggc 420 acggcgggtt ggtacaactc cgcagcattc gacaagcacg caaaagcggc tggtctgtac 480 tctaaatcta tcaatggtga tgcgttcagc gatgcggcgc gtgcacaggt gatcgaactg 540 atcaaaactg agatgggtgg tcaagttgac ctggttgttt actctctggc ctccccggta 600 cgtaaactgc cgggctctgg tgaagttaaa cgttctgcgc tgaagccaat cggccagacc 660 tacaccgcaa cggcgatcga caccaacaag gacactatca tccaggcttc cattgaacct 720 gcttctgcgc aggaaatcga ggataccatc accgtgatgg gcggccaaga ctgggaactg 780

tggatcgacg cactggaagg tgcaggcgta ctggcagatg gcgctcgttc tgtagcgttc 840

tcctatatcg gcaccgaaat cacttggccg atctactggc atggcgcact gggcaaagca 900

aaagtggacc tggaccgtac cgctcaacgt ctgaatgccc gtctggcaaa acacggtggt 960

ggcgcaaacg tggcagttct gaagagcgta gtgacccaag cttctgccgc tattccggtt 1020

atgccgctgt acatttccat ggtgtataaa atcatgaaag aaaaaggtct gcatgagggt 1080

actatcgaac agctggatcg cctgtttcgt gaacgtctgt accgccagga cggtcagccg 1140

gcagaagtag atgaagttga tgaacagaac cgtctgcgcc tggacgattg ggaactgcgc 1200

gacgatgtac aggacgcctg caaggctctg tggccgcagg taactactga aaatctgttc 1260

gagctgaccg attacgcggg ctacaaacat gagttcctga aactgtttgg cttcggccgt 1320

accgacgttg attacgatgc ggatgttgca actgacgtgg ctttcgattg tatcgaactg 1380

gcctga 1386

<210> 50

<211> 1200

<212> DNA

<213> synthetic

<400> 50

atgatcatta aaccgcgtgt tcgtggcttt atctgtgtta ccgctcatcc gaccggctgc 60 gaagcgaacg tcaaaaagca gatcgactac gttaccactg aaggcccgat cgctaacggc 120 cctaaacgcg ttctggtaat tggcgcttct accggttacg gcctggcggc acgtatcacc 180 gccgcgtttg gttgcggcgc tgacaccctg ggtgtgttct tcgaacgtcc gggtgaagaa 240

ggcaaaccgg gcacttctgg ctggtacaac tccgcagcgt ttcacaaatt tgccgctcag 300

aaaggtctgt acgcaaaatc tatcaacggc gacgctttca gcgacgaaat caaacagctg 360

accattgacg cgatcaaaca ggacctgggc caggtagatc aggtgatcta ctccctggcc 420

tctccgcgtc gcacccaccc taaaaccggt gaagtattca attccgccct gaagccgatc 480

ggtaacgcag taaacctgcg cggcctggat accgacaagg aggtgatcaa agaaagcgtg 540

ctgcagccgg caacccagtc tgaaattgae tccactgttg cggtgatggg tggcgaagat 600

tggcagatgt ggatcgacgc gctgctggat gcaggcgtac tggcagaagg cgctcagact 660

accgcgttca cgtacctggg cgaaaagatc acccatgaca tttattggaa cggttccatt 720

ggcgctgcca aaaaggacct ggatcagaaa gttctggcta tccgtgaatc cctggctgct 780

cacggtggtg gcgatgcacg tgtctccgtg ctgaaagcag tcgtcaccca ggcgtcctcc 840

gcgattccaa tgatgccgct gtatctgagc ctgctgttta aagtcatgaa ggaaaaaggc 900

acccacgagg gctgcattga acaggtgtac tctctgtata aagattctct gtgtggtgat 960

agcccacata tggaccagga aggtcgtctg cgtgctgact ataaagagct ggacccggaa 1020

gtgcagaacc aggttcagca gctgtgggat caagttacta acgacaacat ttaccagctg 1080

acggatttcg taggctacaa atctgagttt ctgaacctgt tcggtttcgg tatcgacggt 1140

gtggactatg atgccgatgt caacccggat gtaaagattc cgaacctgat ccaaggttaa 1200

<210> 51 <211> 1188 <212> DNA <213> synthetic <400> 51

atggttattt ctcctaaggt tcgcggcttt atttgcacta atgcgcaccc ggttggttgt 60 gcgaaaagcg tggaaaacca gatcgcttac gttaaagcgc agggtctgtc tgctgaggcg 120

c

gcagatgcac cgaaaaacgt gctggttctg ggctgttcca ccggctatgg tctggcgtct 180 cgtatcactg cgtcctttgg ctatggtgcc aacactgtag gcgtttgttt cgaaaaagct 240 ccgacggaac gcaaaaccgg tactgcgggt tggtataaca cggcggcgtt ccacagcgaa 300 gcaaaagccg caggcgttca ggcccatacc ctgaatggcg acgcattctc caacgaactg 360 aaagcacaga ccatcgaaac cctgaagaac accatcggta aagttgacct ggtggtgtac 420 tctctggcgt ccccgcgtcg taccgacccg gaaactggtg aagtgtataa gagcaccctg 480 aaaccggttg gtcaggcata tgagaccaag acctacgaca ctgacaaaga tctgatccac 540 acggtggctc tggaaccggc ttctcaggat gaaattgata acaccatcaa agtgatgggt 600 ggtgaagact gggaactgtg gatcaaagcg ctggcggaag cggatctgct ggcggagggt 660 gctaaaacca ccgcttacac ctacatcggc aaaaagctga cctggccgat ctacggctcc 720 gccactatcg gcaaagcaaa agaagacctg gatcgcgctg ccaccgcgat caacaccacc 780 tacgcaaacc tgaacgttga tgctcacgta tctagcctga aagccctggt gacccaagcc 840 tcttccgcta tcccggtcat gcctctgtat atcagcctga tttacaaagt tatgaaagaa 900 gagggcactc acgaaggttg tatcgaacag atcgttggtc tgtttactca gtgcctgctg 960 aacgacggcg cgactctgga tgaagttaac cgttatcgta tggatggtaa agaaactaac 1020 gacgccactc aggctaaaat tgaagagctg tggcaccagg tgacccagga caactttcac 1080 gaactgtccg actacgctgg ttataacgct gatttcctga acctgtttgg ttttggcatc 1140

gaaggtgttg attacgaagc ggacgttgat ccgcaggtgt cctggtaa 1188

<210> 52 <211> 1198 <212> DNA <213> synthetic

<400> 52

ggtaccatga ttattgaacc taagatgcgt ggctttattt gtctgacctc ccacccgacg 60 ggttgtgaac agaacgttat caaccagatc aactacgtga aaagcaaagg cgttattaat 120 ggcccgaaga aagttctggt tattggcgca tccactggct tcggcctggc gtctcgtatc 180 acttctgctt tcggtagcaa tgctgcgacg atcggtgtct tcttcgaaaa accggcgcag 240 gagggtaaac cgggctctcc gggctggtat aacaccgtag ctttccagaa tgaggccaaa 300 aaggctggca tttacgctaa aagcatcaac ggtgatgcct tttccactga agtaaagcag 360 aaaaccatcg acctgattaa agctgatctg ggtcaagtgg acctggttat ctacagcctg 420 gcaagccctg ttcgtaccaa cccggtaacc ggtgtaaccc accgctctgt actgaaaccg 480 attggtggtg cgttctctaa caaaactgtt gacttccata ccggcaacgt aagcaccgtt 540 accatcgaac cagcgaacga agaagatgtt accaacaccg tcgctgttat gggtggtgag 600 gattggggca tgtggatgga cgcgatgctg gaagcaggcg ttctggccga aggcgcaact 660 acggttgcat attcctacat cggtccggct ctgaccgaag cggtgtatcg taagggcact 720 atcggccgtg cgaaagacca cctggaggca tctgctgcaa ccattactga taaactgaaa 780 tctgttaaag gtaaagccta cgtgtctgtg aacaaagcgc tggtcaccca ggcttccagc 840 gcaattccgg ttattccgct gtacatctct ctgctgtaca aggttatgaa agcagagggc 900

attcacgaag gttgtatcga acagattcag cgtctgtacg ctgaccgtct gtacacgggc 960

aaagctatcc caacggacga gcagggccgt atccgtatcg acgattggga aatgcgtgaa 1020

gatgtccagg cgaacgttgc agcactgtgg gaacaagtta cttctgaaaa cgtttccgac 1080

atctctgacc tgaaaggtta taagaacgac tttctgaacc tgttcggttt cgcggttaac 1140

aaagttgatt atctggctga cgtgaacgaa aacgttacga tcgaaggtct ggtatgag 1198

<210> 53 <211> 1203 <212> DNA <213> synthetic

<400> 53

atgatcatta aacctcgtat ccgtggcttt atctgcacca cgactcaccc ggtaggttgc 60 gaagctaacg tcaaagaaca aatcgcatac actaaagctc agggcccgat caaaaacgcc 120 cctaaacgtg ttctggttgt tggtgcctcc tccggttatg gtctgtcttc tcgtatcgcg 180 gcagcgtttg gcggcggtgc ttccaccatc ggcgtgttct tcgaaaagga aggcaccgaa 240 aagaaacctg gtactgctgg cttctacaac gctgcggcgt tcgaaaaact ggcgcgtgaa 300 gagggcctgt acgccaagag cctgaacggc gatgcattct ccaacgaggc gaaacagaaa 360 accattgaac tgatcaaaga agacctgggt caaattgata tggtggttta cagcctggca 420 tccccggtgc gcaaaatgcc ggaaaccggt gaactggtgc gcagcgcact gaaaccgatt 480 ggtgagactt atacctctac cgcggtcgat acgaataagg atgtgatcat tgaagcgagc 540 gttgaaccgg cgaccgaaga ggaaatcaaa gataccgtga ctgtaatggg tggtgaggat 600 tgggaactgt ggatcaatgc gctgagcgat gcaggcgtgc tggctgaagg ttgcaaaact 660

gttgcttata gctacattgg caccgaactg acctggccta tctactggga cggtgcactg 720

ggtaaagcta aaatggatct ggatcgtgca gccaaagcac tgaacgacaa actggcggca 780

accggtggct ctgcgaatgt cgctgttctg aaatccgttg taacccaagc ttcctccgca 840

atcccggtta tgccgctgta tatcgcaatg gtgttcaaga aaatgcgcga agaaggtgta 900

cacgaaggct gcatggaaca gatttaccgt atgttctctc agcgtctgta caaggaagac 960

ggctctgctg ccgaggttga tgaaatgaac cgtctgcgtc tggacgattg ggagctgcgc 1020

gacgacattc agcagcactg ccgtgaactg tggccgcaga ttaccaccga aaatctgaaa 1080

gaactgaccg attacgttga atataaggaa gagttcctga aactgttcgg tttcggtgtt 1140

gagggcgttg attacgaagc agacgtgaac ccggctgtgg aagccgattt catccagatc 1200

taa 1203

<210> 54 <211> 3487 <212> DNA <213> pGV1340

<400> 54

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020 gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttctgaggag 1080 aagtcgactt ggaagcggcc gcttaggatc cttgaggaga ttggtaccat gaatcgttcc 1140 gcaatcggcg tctcctctat ggtgggtaac ctggttttct ctgttatctc cgttaaacgt 1200 gagatcacgg gccagtctgg tactttccgt gcccgtccgc cagccatcgg ctgcttcctg 1260 tacaacgcac gcgatttctc cgatttccgc ccgtctccgc cgtttcgtca ggaagtatct 1320 atgatcatca aacctcgcgt tcgtggcttc atctgcgtta ccacccaccc agttggctgt 1380 gaggcgaacg ttaaagaaca gatcgactac gttacgagcc acggcccgat tgcaaacggt 1440 ccgaaaaagg tactggtaat tggtgcgagc accggttacg gcctggccgc tcgcatcagc 1500 gccgctttcg gtagcggcgc agacactctg ggtgttttct tcgaacgtgc aggtagcgaa 1560 accaagccgg gcaccgcggg ttggtacaac tccgccgcct tcgaaaaatt cgctgcggaa 1620 aagggcctgt acgctcgttc catcaatggc gatgcgttca gcgacaaagt aaaacaggtg 1680 accatcgaca ccattaagca ggacctgggt aaggtggacc tggttgttta ttctctggct 1740 gcgccacgcc gtacccatcc gaagacgggt gaaaccatct ccagcaccct gaagcctgtg 1800 ggtaaagcgg ttactttccg cggcctggat acggacaaag aggttatccg cgaagtatcc 1860 ctggaaccgg caacccaaga agagattgac ggcaccgtgg cagttatggg cggcgaggat 1920 tggcagatgt ggatcgacgc tctggatgag gcaggcgtac tggccgacgg cgctaaaact 1980 accgctttca cttacctggg tgaacagatc acccatgaca tctattggaa cggcagcatt 2040 ggcgaagcta aaaaggacct ggacaagaaa gtgctgagca ttcgcgacaa gctggccgcg 2100 cacggcggcg atgctcgcgt aagcgtcctg aaagcagtcg tgacccaagc gtcttctgca 2160 atcccgatga tgccgctgta tctgagcctg ctgttcaaag tgatgaagga gactggcact 2220 catgaaggtt gtatcgaaca ggtgtacggc ctgctgaaag acagcctgta tggtgctact 2280 ccacacgtag acgaagaggg ccgtctgcgt gctgactata aagaactgga cccgcaggta 2340 caagataaag tggtagctat gtgggataaa gttaccaacg aaaatctgta cgaaatgact 2400 gacttcgcgg gttacaaaac cgaatttctg cgcctgttcg gctttgaaat cgcaggtgtt 2460 gattatgatg ccgacgttaa tcctgatgtt aagattccgg gcattattga tactacggtt 2520 tgaggcgcct taggattccc gggagatccc atggtacgcg tgctagaggc atcaaataaa 2580

acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc 2640

tctcctgagt aggacaaatc cgccgcccta gacctaggcg ttcggctgcg gcgagcggta 2700

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 2760

aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 2820

tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 2880

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 2940

cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 3000

agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 3060

tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 3120

aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 3180

ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 3240

cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 3300

accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 3360

ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 3420

ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 3480

gtcatga 3487

<210> 55 <211> 3313 <212> DNA <213> pGV1341 <400> 55

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020 gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttctgaggag 1080 aagtcgactt ggaagcggcc gcttaggatc cttgaggaga ttggtaccat gatcgtccag 1140 ccgaaagttc gcggttttat ctgcactacc gcacacccag aaggctgcgc gcgtcacgtt 1200 ggtgagtgga tcaattatgc taagcaggag ccttccctga ccggcggtcc gcagaaagta 1260 ctgattatcg gtgcgagcac gggctttggt ctggcgtctc gtatcgtggc tgccttcggt 1320 gcgggtgcta aaacgattgg tgtgtttttc gaacgtccgg cttctggcaa acgcaccgcg 1380 tcccctggtt ggtacaatac tgcagcgttc gagaagaccg ctctggcggc tggcctgtac 1440 gcgaaatcta tcaacggcga cgcgttcagc gacgaaatta aacagcaaac catcgacctg 1500 atccagaaag attggcaggg cggtgttgac ctggtaattt actctatcgc gagcccgcgt 1560 cgcgtacacc cgcgtactgg tgaaatcttc aactctgtcc tgaaacctat tggtcagacc 1620 taccacaaca aaactgtgga cgtaatgacc ggcgaagttt ccccggtatc tattgagccg 1680 gcaacggaaa aggaaatccg cgacactgaa gcggtaatgg gtggcgacga ctgggcgctg 1740 tggatcaacg cgctgttcaa atacaactgc ctggccgaag gcgtcaaaac cgttgcgttc 1800 acctatattg gtccggaact gacccacgcg gtatatcgta acggcactat cggccgtgcg 1860 aaactgcacc tggaaaagac tgctcgcgaa ctggataccc agctggagag cgcgctgtct 1920 ggtcaggctc tgatttctgt taacaaagcc ctggtgaccc aggcttccgc agctatcccg 1980 gtagttccgc tgtatatctc cctgctgtat aaaatcatga aagagaaaaa catccacgag 2040 ggttgcatcg agcagatgtg gcgtctgttt aaggagcgcc tgtactctaa ccagaacatc 2100 cctactgact ccgaaggccg catccgtatt gatgactggg aaatgcgcga agacgtacaa 2160 gcggaaatca aacgtctgtg ggaatccatc aacaccggta acgttgaaac tgtctctgat 2220 atcgctggct atcgtgagga cttctataaa ctgttcggtt tcggtctgaa cggtatcgac 2280 tacgaacgtg gcgttgaaat tgaaaaggct atcccgtcca tcactgttac tcctgaaaac 2340 ccggaataag gcgccttagg attcccggga gatcccatgg tacgcgtgct agaggcatca 2400 aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt 2460 gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc gccctagacc taggcgttcg gctgcggcga 2520 gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 2580 ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 2640 ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 2700 cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 2760 ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 2820 tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 2880 gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 2940 tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 3000 gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 3060 tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 3120 ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 3180 agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 3240 gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 3300 attttggtca tga 3313 <210> 56 <211> 3271 <212> DNA <213> pGV1342

<400> 56

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020 gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttctgaggag 1080 aagtcgactt ggaagcggcc gcttaggatc cttgaggaga ttggtaccat gatcattaaa 1140 ccgaaggtgc gtggctttat ctgcactact gctcatccgg tcggctgtgc agagaatgtt 1200 caacagcaga tcgactacgt agcagcccag aacgccccgt ctagcggccc gaaaaatgta 1260 ctggtcatcg gttgcagcaa cggttacggt ctggcgtccc gcatcaccag cgcattcggc 1320 tttggtgcga acaccctggg cgtcatgttc gaaaaagaac cgaccgaacg ccgtccggca 1380 tctgccggtt ggtataacac ccgtgcgctg gagaaagcgg ctcaggaaaa aggtctgtac 1440 gcgcaatctc tgaatgtgga tgcgttctcc gatgaagcta aaaccgcagt aatcgaggct 1500 gtgaaagcta acatgggtaa aattgatctg gtcgtttaca gcctgggtgc accgcgtcgt 1560 aaagatccgg aaaccggcac tgtctactcc agcacgctga aacctattgg caaagctgtg 1620 acccgtaaaa acctgaacac tgacacccgt gaggtaggtg aagtgactct ggaaccagcg 1680 accgaagaag aaattttcaa cacggtgaaa gtaatgggcg gtgaagactg ggaacgctgg 1740 atgaccgctc tggacgacgc tggcgtgctg gcagacggcg ttaaaactac cgcgtatacc 1800 tacattggta aagagctgac ctggccgatc tacggcggtg cgaccatcgg caaggctaaa 1860 gaagatctgg atcgcgcatc cgttgctatt aacaagaaac tggcagacaa atatcagggt 1920 gttagctacg tcgcagtgct gaaagcgctg gtaactcagt cttcttccgc catcccagta 1980 atgccgctgt acatttctgc tctgtatcgt gttatgaagg aagaaggcac gcacgaaggc 2040 tgcatcgagc agatcacggg cctgtttttc gaccagctgt tctctgaaaa cgccctgaac 21OO ctggatgata ccggccgtat ccgcatggaa gataacgaac tgaaagcgtc tgtacaggag 2160 aaagttgctg cgatctggga acaggttaac acggaaaatc tggacgagct gaccgacttc 2220 aaaggttacc aggaagaatt tttcaaactg ttcggtttcg gcttcgaagg tgttgattac 2280 gacgcagacg tagatccagt ggtgtgaggc gccttaggat tcccgggaga tcccatggta 2340 cgcgtgctag aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt 2400 tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatccgccgc cctagaccta 2460 ggcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 2520 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 2580 cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 2640 aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 2700 tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 2760 ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat 2820 ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 2880 cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 2940 ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 3000 gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 3060 atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 3120 aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 3180 aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 3240 gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg a 3271

<210> 57 <211> 3295 <212> DNA <213> pGV1343

<400> 57

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggáaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020 gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttctgaggag 1080 aagtcgactt ggaagcggcc gcttaggatc cttgaggaga ttggtaccat gattatcaaa 1140 ccgaaaacgc gtggctttat ctgcactacc acccacccgg ttggttgtga agccaacgtt 1200 ctggaacaaa tcaacaccac taaagccaaa ggcccgatca ccaatggtcc aaaaaaagtt 1260 ctggttattg gcagctccag cggttacggt ctgtcttccc gtatcgctgc ggcgtttggt 1320 tccggtgcag cgaccctggg tgtattcttc gaaaaaccgg gcaccgagaa gaaacctggc 1380 accgctggtt ggtataacag cgctgctttc gataaattcg ctaaggcaga tggcctgtac 1440 tctaaatcta ttaacggtga cgcgttctcc cacgaagcca aacagaaagc gatcgacctg 1500 atcaaagcgg atctgggcca aattgacatg gttgtgtact ctctggcttc tccggttcgt 1560 aaactgccgg attccggcga actgattcgt tctagcctga aaccaatcgg cgaaacttac 1620 accgctactg ctgttgacac gaacaaagac ctgatcattg aaacgagcgt tgaaccagcg 1680 agcgaacagg aaatccaaga tactgtaacc gtaatgggcg gtgaagactg ggaactgtgg 1740 ctggccgcgc tgagcgatgc tggtgtcctg gcggatggct gcaaaaccgt tgcgtactct 1800 tacattggta cggaactgac ctggccgatc tactggcacg gcgctctggg caaggcaaaa 1860 atggacctgg accgtgccgc aaaagcgctg gacgaaaaac tgagcacgac cggtggctct 1920 gcaaatgtgg ctgtgctgaa atctgtagtg acccaggcgt cctccgctat cccggtgatg 1980 ccgctgtaca tcgccatggt attcaaaaag atgcgcgaag aaggtctgca cgaaggctgc 2040 atggaacaga tcaaccgtat gttcgcggaa cgtctgtacc gtgaagatgg tcaggctccg 2100 caggtcgatg atgcaaatcg tctgcgcctg gacgattggg aactgcgcga ggagatccag 2160 cagcactgcc gtgatctgtg gccgtctgtg actactgaga acctgagcga gctgaccgac 2220 taccgtgaat ataaagatga gttcctgaaa ctgttcggtt tcggcgttga aggtgtagat 2280 tacgacgccg acgttaaccc ggaagtaaac ttcgacgtag aacagttcta aggcgcctta 2340 ggattcccgg gagatcccat ggtacgcgtg ctagaggcat caaataaaac gaaaggctca 2400 gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag 2460 gacaaatccg ccgccctaga cctaggcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 2520 aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 2580 aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 2640 ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 2700 acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 2760 ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 2820 tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 2880 tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 2940 gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 3000 agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 3060 tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 3120 agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 3180 tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 3240

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catga 3295

<210> 58 <211> 3286 <212> DNA <213> pGV1344

<400> 58

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020 gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttctgaggag 1080 aagtcgactt ggaagcggcc gcttaggatc cttgaggaga ttggtaccat gatcgtaaag 1140 cctatggttc gtaacaatat ttgcctgaac gctcatccgc agggttgcaa gaaaggtgtc 1200 gaggatcaga ttgaatacac caagaaacgt attaccgctg aagttaaagc aggtgctaaa 1260 gcgccgaaaa acgtgctggt tctgggctgt tccaacggct acggcctggc gtctcgcatc 1320 actgctgcgt ttggttatgg tgcggctact atcggtgttt cttttgaaaa agcgggctcc 1380 gaaaccaaat atggcacccc aggttggtac aacaacctgg cgttcgatga agcggctaaa 1440 cgcgagggcc tgtactctgt gactatcgac ggtgacgcct tcagcgatga aatcaaagca 1500 caggttatcg aggaagccaa aaagaaaggc attaagtttg acctgattgt gtactctctg 1560 gctagcccgg tgcgtaccga tccggatacc ggcatcatgc acaaatccgt cctgaaaccg 1620 ttcggcaaaa ctttcaccgg taaaacggta gatccgttca ctggtgagct gaaagaaatc 1680 tctgccgagc cagctaacga tgaagaggca gctgctactg tcaaagtcat gggtggtgaa 1740 gattgggaac gttggatcaa acagctgtct aaagaaggtc tgctggagga aggctgcatt 1800 accctggcat actcctacat tggtccagag gccactcagg cgctgtatcg taaaggtact 1860 atcggtaaag ctaaagaaca cctggaagct acggctcacc gtctgaacaa agaaaacccg 1920 tccatccgtg cattcgtttc cgtcaacaag ggcctggtca cccgtgcatc cgcagttatc 1980 ccggtcatcc ctctgtatct ggcttccctg ttcaaggtta tgaaggaaaa aggtaaccat 2040 gagggttgta tcgaacagat cacccgtctg tacgccgaac gtctgtaccg caaggatggc 2100 accatcccgg ttgatgagga aaaccgcatt cgtatcgacg actgggaact ggaagaagat 2160 gttcaaaaag ctgtgtctgc gctgatggaa aaagtgaccg gcgaaaatgc ggaatccctg 2220 acggacctgg cgggctatcg tcatgacttt ctggcgtcca acggttttga tgttgagggc 2280 atcaactatg aagcggaagt agagcgtttt gaccgcattt aaggcgcctt aggattcccg 2340 ggagatccca tggtacgcgt gctagaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga 2400 ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc 2460 gccgccctag acctaggcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 2520 atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 2580 caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 2640 cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 2700 taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 2760 ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc 2820 tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 2880 gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 2940 ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 3000 aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 3060 aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 3120 agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 3180

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 3240

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatga 3286

<210> 59 <211> 3479 <212> DNA <213> pGV1345

<400> 59

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020 gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttctgaggag 1080 aagtcgactt ggaagcggcc gcttaggatc cttgaggaga ttggtaccat gcgtctgctg 1140 ttcgaagcag ttcacgcgcg taagcgttgg catcgtactg cgccggctgc cgcattcact 1200 cgttttcaca ccgctgcatg cgtgactcat caggcagttt cccgtgctcc acacgccctg 1260 cgttgtcgcc agcacctggc agatcaggag tccacgctga tcattcaccc gaaagtacgt 1320 ggtttcatct gcacgaccac tcaccctctg ggttgcgaac gtaacgtcct ggaacagatc 1380 gcggctactc gtgctcgcgg tgttcgtaac gatggtccga agaaagttct ggtgatcggc 1440 gcgtctagcg gttacggtct ggccagccgc attaccgccg cattcggttt cggtgcggat 1500 accctgggtg ttttcttcga aaaaccgggt actgcctcta aagctggcac ggcgggttgg 1560 tacaactccg cagcattcga caagcacgca aaagcggctg gtctgtactc taaatctatc 1620 aatggtgatg cgttcagcga tgcggcgcgt gcacaggtga tcgaactgat caaaactgag 1680 atgggtggtc aagttgacct ggttgtttac tctctggcct ccccggtacg taaactgccg 1740 ggctctggtg aagttaaacg ttctgcgctg aagccaatcg gccagaccta caccgcaacg 1800 gcgatcgaca ccaacaagga cactatcatc caggcttcca ttgaacctgc ttctgcgcag 1860 gaaatcgagg ataccatcac cgtgatgggc ggccaagact gggaactgtg gatcgacgca 1920 ctggaaggtg caggcgtact ggcagatggc gctcgttctg tagcgttctc ctatatcggc 1980 accgaaatca cttggccgat ctactggcat ggcgcactgg gcaaagcaaa agtggacctg 2040 gaccgtaccg ctcaacgtct gaatgcccgt ctggcaaaac acggtggtgg cgcaaacgtg 2100 gcagttctga agagcgtagt gacccaagct tctgccgcta ttccggttat gccgctgtac 2160 atttccatgg tgtataaaat catgaaagaa aaaggtctgc atgagggtac tatcgaacag 2220 ctggatcgcc tgtttcgtga acgtctgtac cgccaggacg gtcagccggc agaagtagat 2280 gaagttgatg aacagaaccg tctgcgcctg gacgattggg aactgcgcga cgatgtacag 2340 gacgcctgca aggctctgtg gccgcaggta actactgaaa atctgttcga gctgaccgat 2400 tacgcgggct acaaacatga gttcctgaaa ctgtttggct tcggccgtac cgacgttgat 2460 tacgatgcgg atgttgcaac tgacgtggct ttcgattgta tcgaactggc ctgaggcgcc 2520 ttaggattcc cgggagatcc ccatggtacg cgtgctagag gcatcaaata aaacgaaagg 2580 ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctcctga 2640 gtaggacaaa tccgccgccc tagacctagg cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 2700 ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 2760 agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 2820 taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 2880 cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 2940 tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 3000 gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 3060 gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 3120

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 3180

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 3240

cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 3300

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 3360

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 3420

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatga 3479

<210> 60 <211> 3292 <212> DNA <213> pGV1346

<400> 60

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020 gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttctgaggag 1080 aagtcgactt ggaagcggcc gcttaggatc cttgaggaga ttggtaccat gatcattaaa 1140 ccgcgtgttc gtggctttat ctgtgttacc gctcatccga ccggctgcga agcgaacgtc 1200 aaaaagcaga tcgactacgt taccactgaa ggcccgatcg ctaacggccc taaacgcgtt 1260 ctggtaattg gcgcttctac cggttacggc ctggcggcac gtatcaccgc cgcgtttggt 1320 tgcggcgctg acaccctggg tgtgttcttc gaacgtccgg gtgaagaagg caaaccgggc 1380 acttctggct ggtacaactc cgcagcgttt cacaaatttg ccgctcagaa aggtctgtac 1440 gcaaaatcta tcaacggcga cgctttcagc gacgaaatca aacagctgac cattgacgcg 1500 atcaaacagg acctgggcca ggtagatcag gtgatctact ccctggcctc tccgcgtcgc 1560 acccacccta aaaccggtga agtattcaat tccgccctga agccgatcgg taacgcagta 1620 aacctgcgcg gcctggatac cgacaaggag gtgatcaaag aaagcgtgct gcagccggca 1680 acccagtctg aaattgactc cactgttgcg gtgatgggtg gcgaagattg gcagatgtgg 1740 atcgacgcgc tgctggatgc aggcgtactg gcagaaggcg ctcagactac cgcgttcacg 1800 tacctgggcg aaaagatcac ccatgacatt tattggaacg gttccattgg cgctgccaaa 1860 aaggacctgg atcagaaagt tctggctatc cgtgaatccc tggctgctca cggtggtggc 1920 gatgcacgtg tctccgtgct gaaagcagtc gtcacccagg cgtcctccgc gattccaatg 1980 atgccgctgt atctgagcct gctgtttaaa gtcatgaagg aaaaaggcac ccacgagggc 2040 tgcattgaac aggtgtactc tctgtataaa gattctctgt gtggtgatag cccacatatg 2100 gaccaggaag gtcgtctgcg tgctgactat aaagagctgg acccggaagt gcagaaccag 2160 gttcagcagc tgtgggatca agttactaac gacaacattt accagctgac ggatttcgta 2220 ggctacaaat ctgagtttct gaacctgttc ggtttcggta tcgacggtgt ggactatgat 2280 gccgatgtca acccggatgt aaagattccg aacctgatcc aaggttaagg cgccttagga 2340 ttcccgggag atcccatggt acgcgtgcta gaggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc 2400 gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac 2460 aaatccgccg ccctagacct aggcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 2520 gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 2580 ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 2640 cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 2700 ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 2760 accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 2820 caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 2880

gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ceggtaacta tcgtcttgag 2940

tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 3000

agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 3060

actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 3120

gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 3180

aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 3240

gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat ga 3292

<210> 61 <211> 3280 <212> DNA <213> pGV1347

<400> 61

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020

«

gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttctgaggag 1080 aagtcgactt ggaagcggcc gcttaggatc cttgaggaga ttggtaccat ggttatttct 1140 cctaaggttc gcggctttat ttgcactaat gcgcacccgg ttggttgtgc gaaaagcgtg 1200 gaaaaccaga tcgcttacgt taaagcgcag ggtctgtctg ctgaggcggc agatgcaccg 1260 aaaaacgtgc tggttctggg ctgttccacc ggctatggtc tggcgtctcg tatcactgcg 1320 tcctttggct atggtgccaa cactgtaggc gtttgtttcg aaaaagctcc gacggaacgc 1380 aaaaccggta ctgcgggttg gtataacacg gcggcgttcc acagcgaagc aaaagccgca 1440 ggcgttcagg cccataccct gaatggcgac gcattctcca acgaactgaa agcacagacc 1500 atcgaaaccc tgaagaacac catcggtaaa gttgacctgg tggtgtactc tctggcgtcc 1560 ccgcgtcgta ccgacccgga aactggtgaa gtgtataaga gcaccctgaa accggttggt 1620 caggcatatg agaccaagac ctacgacact gacaaagatc tgatccacac ggtggctctg 1680 gaaccggctt ctcaggatga aattgataac accatcaaag tgatgggtgg tgaagactgg 1740 gaactgtgga tcaaagcgct ggcggaagcg gatctgctgg cggagggtgc taaaaccacc 1800 gcttacacct acatcggcaa aaagctgacc tggccgatct acggctccgc cactatcggc 1860 aaagcaaaag aagacctgga tcgcgctgcc accgcgatca acaccaccta cgcaaacctg 1920 aacgttgatg ctcacgtatc tagcctgaaa gccctggtga cccaagcctc ttccgctatc 1980 ccggtcatgc ctctgtatat cagcctgatt tacaaagtta tgaaagaaga gggcactcac 2040 gaaggttgta tcgaacagat cgttggtctg tttactcagt gcctgctgaa cgacggcgcg 2100 actctggatg aagttaaccg ttatcgtatg gatggtaaag aaactaacga cgccactcag 2160 gctaaaattg aagagctgtg gcaccaggtg acccaggaca actttcacga actgtccgac 2220 tacgctggtt ataacgctga tttcctgaac ctgtttggtt ttggcatcga aggtgttgat 2280 tacgaagcgg acgttgatcc gcaggtgtcc tggtaaggcg ccttaggatt cccgggagat 2340 cccatggtac gcgtgctaga ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc 2400 ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccgcc 2460 ctagacctag gcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 2520 ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 2580 gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 2640 gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 2700 taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 2760 accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc 2820

tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 2880

cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 2940 agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 3000

gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 3060

gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 3120

tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 3180

acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 3240

cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 3280

<210> 62 <211> 3283 <212> DNA <213> pGV1348

<400> 62

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020 gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttctgaggag 1080 aagtcgactt ggaagcggcc gcttaggatc cttgaggaga ttggtaccat gattattgaa 1140 cctaagatgc gtggctttat ttgtctgacc tcccacccga cgggttgtga acagaacgtt 1200 atcaaccaga tcaactacgt gaaaagcaaa ggcgttatta atggcccgaa gaaagttctg 1260 gttattggcg catccactgg cttcggcctg gcgtctcgta tcacttctgc tttcggtagc 1320 aatgctgcga cgatcggtgt cttcttcgaa aaaccggcgc aggagggtaa accgggctct 1380 ccgggctggt ataacaccgt agctttccag aatgaggcca aaaaggctgg catttacgct 1440 aaaagcatca acggtgatgc cttttccact gaagtaaagc agaaaaccat cgacctgatt 1500 aaagctgatc tgggtcaagt ggacctggtt atctacagcc tggcaagccc tgttcgtacc 1560 aacccggtaa ccggtgtaac ccaccgctct gtactgaaac cgattggtgg tgcgttctct 1620 aacaaaactg ttgacttcca taccggcaac gtaagcaccg ttaccatcga accagcgaac 1680 gaagaagatg ttaccaacac cgtcgctgtt atgggtggtg aggattgggg catgtggatg 1740 gacgcgatgc tggaagcagg cgttctggcc gaaggcgcaa ctacggttgc atattcctac 1800 atcggtccgg ctctgaccga agcggtgtat cgtaagggca ctatcggccg tgcgaaagac 1860 cacctggagg catctgctgc aaccattact gataaactga aatctgttaa aggtaaagcc 1920 tacgtgtctg tgaacaaagc gctggtcacc caggcttcca gcgcaattcc ggttattccg 1980 ctgtacatct ctctgctgta caaggttatg aaagcagagg gcattcacga aggttgtatc 2040 gaacagattc agcgtctgta cgctgaccgt ctgtacacgg gcaaagctat cccaacggac 2100 gagcagggcc gtatccgtat cgacgattgg gaaatgcgtg aagatgtcca ggcgaacgtt 2160 gcagcactgt gggaacaagt tacttctgaa aacgtttccg acatctctga cctgaaaggt 2220 tataagaacg actttctgaa cctgttcggt ttcgcggtta acaaagttga ttatctggct 2280 gacgtgaacg aaaacgttac gatcgaaggt ctggtatgag gcgccttagg attcccggga 2340 gatcccatgg tacgcgtgct agaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 2400 ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc 2460 gccctagacc taggcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 2520 cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 2580 aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 2640 gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 2700 agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 2760

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca 2820

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 2880

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 2940

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 3000

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 3060

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 3120

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 3180

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 3240

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tga 3283

<210> 63 <211> 3295 <212> DNA <213> pGV1349

<400> 63

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaàa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagaaatgtg agcggataac aattgacatt 1020 gtgagcggat aacaagatac tgagcacatc agcaggacgc actgaccgaa ttctgaggag 1080 aagtcgactt ggaagcggcc gcttaggatc cttgaggaga ttggtaccat gatcattaaa 1140 cctcgtatcc gtggctttat ctgcaccacg actcacccgg taggttgcga agctaacgtc 1200 aaagaacaaa tcgcatacac taaagctcag ggcccgatca aaaacgcccc taaacgtgtt 1260 ctggttgttg gtgcctcctc cggttatggt ctgtcttctc gtatcgcggc agcgtttggc 1320 ggcggtgctt ccaccatcgg cgtgttcttc gaaaaggaag gcaccgaaaa gaaacctggt 1380 actgctggct tctacaacgc tgcggcgttc gaaaaactgg cgcgtgaaga gggcctgtac 1440 gccaagagcc tgaacggcga tgcattctcc aacgaggcga aacagaaaac cattgaactg 1500 atcaaagaag acctgggtca aattgatatg gtggtttaca gcctggcatc cccggtgcgc 1560 aaaatgccgg aaaccggtga actggtgcgc agcgcactga aaccgattgg tgagacttat 1620 acctctaccg cggtcgatac gaataaggat gtgatcattg aagcgagcgt tgaaccggcg 1680 accgaagagg aaatcaaaga taccgtgact gtaatgggtg gtgaggattg ggaactgtgg 1740 atcaatgcgc tgagcgatgc aggcgtgctg gctgaaggtt gcaaaactgt tgcttatagc 1800 tacattggca ccgaactgac ctggcctatc tactgggacg gtgcactggg taaagctaaa 1860 atggatctgg atcgtgcagc caaagcactg aacgacaaac tggcggcaac cggtggctct 1920 gcgaatgtcg ctgttctgaa atccgttgta acccaagctt cctccgcaat cccggttatg 1980 ccgctgtata tcgcaatggt gttcaagaaa atgcgcgaag aaggtgtaca cgaaggctgc 2040 atggaacaga tttaccgtat gttctctcag cgtctgtaca aggaagacgg ctctgctgcc 2100 gaggttgatg aaatgaaccg tctgcgtctg gacgattggg agctgcgcga cgacattcag 2160 cagcactgcc gtgaactgtg gccgcagatt accaccgaaa atctgaaaga actgaccgat 2220 tacgttgaat ataaggaaga gttcctgaaa ctgttcggtt tcggtgttga gggcgttgat 2280 tacgaagcag acgtgaaccc ggctgtggaa gccgatttca tccagatcta aggcgcctta 2340 ggattcccgg gagatcccat ggtacgcgtg ctagaggcat caaataaaac gaaaggctca 2400 gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag 2460 gacaaatccg ccgccctaga cctaggcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 2520 aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 2580 aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 2640 ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 2700

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 2760

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 2820

tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 2880

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 2940

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 3000

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 3060

tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 3120

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 3180

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 3240

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catga 3295

<210> 64 <211> 3234 <212> DNA <213> pGV1563

<400> 64

ctagtgcttg gattctcacc aataaaaaac gcccggcggc aaccgagcgt tctgaacaaa 60 tccagatgga gttctgaggt cattactgga tctatcaaca ggagtccaag cgagctcgat 120 atcaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt tgtaattcat taagcattct 180 gccgacatgg aagccatcac agacggcatg atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac 240 cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat 300 attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa 360 catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc 420 ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga 480 aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac 540 cagctcaccg tctttcattg ccatacgaaa ctccggatga gcattcatca ggcgggcaag 600 aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc 660 cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc 720 aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt 780 ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag 840 tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt 900 tcgccagata tcgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 960 cgtatcacga ggccctttcg tcttcacctc gagataaatg tgagcggata acaattgaca 1020 ttgtgagcgg ataacaagat actgagcaca tcagcaggac gcactgaccg aattcattaa 1080 agaggagaaa ggtaccatga tcgtaaagcc tatggttcgt aacaatattt gcctgaacgc 1140 tcatccgcag ggttgcaaga aaggtgtcga ggatcagatt gaatacacca agaaacgtat 1200 taccgctgaa gttaaagcag gtgctaaagc gccgaaaaac gtgctggttc tgggctgttc 1260 caacggctac ggcctggcgt ctcgcatcac tgctgcgttt ggttatggtg cggctactat 1320 cggtgtttct tttgaaaaag cgggctccga aaccaaatat ggcaccccag gttggtacaa 1380 caacctggcg ttcgatgaag cggctaaacg cgagggcctg tactctgtga ctatcgacgg 1440 tgacgccttc agcgatgaaa tcaaagcaca ggttatcgag gaagccaaaa agaaaggcat 1500 taagtttgac ctgattgtgt actctctggc tagcccggtg cgtaccgatc cggataccgg 1560 catcatgcac aaatccgtcc tgaaaccgtt cggcaaaact ttcaccggta aaacggtaga 1620 tccgttcact ggtgagctga aagaaatctc tgccgagcca gctaacgatg aagaggcagc 1680 tgctactgtc aaagtcatgg gtggtgaaga ttgggaacgt tggatcaaac agctgtctaa 1740 agaaggtctg ctggaggaag gctgcattac cctggcatac tcctacattg gtccagaggc 1800 cactcaggcg ctgtatcgta aaggtactat cggtaaagct aaagaacacc tggaagctac 1860 ggctcaccgt ctgaacaaag aaaacccgtc catccgtgca ttcgtttccg tcaacaaggg 1920 cctggtcacc cgtgcatccg cagttatccc ggtcatccct ctgtatctgg cttccctgtt 1980 caaggttatg aaggaaaaag gtaaccatga gggttgtatc gaacagatca cccgtctgta 2040 cgccgaacgt ctgtaccgca aggatggcac catcccggtt gatgaggaaa accgcattcg 2100 tatcgacgac tgggaactgg aagaagatgt tcaaaaagct gtgtctgcgc tgatggaaaa 2160 agtgaccggc gaaaatgcgg aatccctgac ggacctggcg ggctatcgtc atgactttct 2220 ggcgtccaac ggttttgatg ttgagggcat caactatgaa gcggaagtag agcgttttga 2280 ccgcatttaa ggatcccatg gtacgcgtgc tagaggcatc aaataaaacg aaaggctcag 2340 tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg 2400 acaaatccgc cgccctagac ctaggcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 2460 aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 2520 aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 2580 tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 2640

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 2700

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 2760

ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 2820

gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 2880

agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 2940

gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 3000

acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 3060

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 3120

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 3180

cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atga 3234

<210> 65 <211> 5241 <212> DNA <213> pGV1563

<400> 65

taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt 60 cgtcttcacc tcgagaattg tgagcggata acaattgaca ttgtgagcgg ataacaagat 120 actgagcaca tcagcaggac gcactgaccg aattcattaa agaggagaaa ggtaccatgt 180 ctcaattctt ttttaatcaa cgcacccatc tcgtgagcga cgtcatcgac ggtacgatta 240 tcgccagccc gtggaataac ctggcgcgtc tggaaagcga tccggccatt cgcatcgtgg 300 tccgtcgtga cctcaacaaa aataacgtgg cggtaatttc cggcggtggt tcagggcacg 360 aacccgcgca cgttgggttt atcggtaaag gcatgctaac cgctgcggtt tgcggcgacg 420 ttttcgcttc cccgagcgtg gatgcggtac tgaccgccat ccaggcggta accggtgagg 480 cgggctgttt attgatcgtg aaaaattaca ccggtgaccg tcttaatttc ggtctcgccg 540 ccgagaaagc ccgtcgcctt ggttacaacg ttgaaatgct gattgttggc gacgacatct 600 ccctgcctga taacaaacac ccacgcggca ttgcgggaac catcctggtg cataaaatcg 660 caggctattt tgccgaacgc ggctacaacc tcgccaccgt cctgcgtgaa gcgcagtacg 720 cggccaataa caccttcagc ctgggcgttg cgctttccag ctgtcatctg ccgcaagaag 780 ccgacgccgc cccgcgtcat catccgggcc acgcggaact gggcatgggc attcacggcg 840 aaccaggcgc atcggttatc gacacccaga acagtgcgca ggtggtgaac ctgatggtgg 900 ataagctgat ggcagccctg cctgaaaccg gccgtctggc ggtgatgatt aacaatcttg 960 gcggcgtttc tgttgccgaa atggccatca ttacccgcga actggccagc agcccgctgc 1020 acccacgtat cgactggctg attggcccgg cctcactggt caccgctctg gatatgaaaa 1080 gcttttcact gacggccatc gtgctggaag aaagcatcga aaaagcgtta ctcaccgagg 1140 tggaaaccag caactggccg acgccggtcc cgccgcgtga aatcagttgt gtaccatcat 1200 ctcagcgtag cgcacgcgtg gaattccagc cttcggcgaa cgccatggtg gccgggattg 1260 tggaacttgt caccacaacc ctttccgatc tggagactca tcttaatgcg ctggacgcca 1320 aagtcggcga tggcgatacc ggttcgacct ttgccgctgg cgcgcgtgaa attgccagtc 1380 tgttgcatcg ccagcagttg ccgctggata accttgccac gctgttcgcg ctgattggcg 1440 aacgtctgac cgtagtgatg ggtggttcca gcggtgtgct gatgtctatt ttctttaccg 1500 ctgcggggca gaaactggaa cagggagcta gcgttgccga atccctgaat acgggactgg 1560 cgcagatgaa gttctacggc ggcgcagacg aaggcgatcg caccatgatt gatgcgctgc 1620 aaccagccct gacttcgctg ctcacgcagc cgcaaaatct gcaggecgca ttcgacgccg 1680 cgcaagcggg agccgaacga acctgtttgt cgagcaaagc caatgccggt cgcgcatcgt 1740 atctcagcag cgaaagcctg ctcggaaata tggaccccgg cgcgcacgcc gtagcgatgg 1800 tgtttaaagc gctagcggag agtgagctgg gctaatctag aggcatcaaa taaaacgaaa 1860 ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct 1920 gagtaggaca aatccgccgc cctagaccta gggtacgggt tttgctgccc gcaaacgggc 1980 tgttctggtg ttgctagttt gttatcagaa tcgcagatcc ggcttcaggt ttgccggctg 2040 aaagcgctat ttcttccaga attgccatga ttttttcccc acgggaggcg tcactggctc 2100 ccgtgttgtc ggcagctttg attcgataag cagcatcgcc tgtttcaggc tgtctatgtg 2160 tgactgttga gctgtaacaa gttgtctcag gtgttcaatt tcatgttcta gttgctttgt 2220 tttactggtt tcacctgttc tattaggtgt tacatgctgt tcatctgtta cattgtcgat 2280 ctgttcatgg tgaacagctt taaatgcacc aaaaactcgt aaaagctctg atgtatctat 2340 cttttttaca ccgttttcat ctgtgcatat ggacagtttt ccctttgata tctaacggtg 2400 aacagttgtt ctacttttgt ttgttagtct tgatgcttca ctgatagata caagagccat 2460 aagaacctca gatccttccg tatttagcca gtatgttctc tagtgtggtt cgttgttttt 2520 gcgtgagcca tgagaacgaa ccattgagat catgcttact ttgcatgtca ctcaaaaatt 2580 ttgcctcaaa actggtgagc tgaatttttg cagttaaagc atcgtgtagt gtttttctta 2640 gtccgttacg taggtaggaa tctgatgtaa tggttgttgg tattttgtca ccattcattt 2700 ttatctggtt gttctcaagt tcggttacga gatccatttg tctatctagt tcaacttgga 2760 aaatcaacgt atcagtcggg cggcctcgct tatcaaccac caatttcata ttgctgtaag 2820 tgtttaaatc tttacttatt ggtttcaaaa cccattggtt aagcctttta aactcatggt 2880 agttattttc aagcattaac atgaacttaa attcatcaag gctaatctct atatttgcct 2940 tgtgagtttt cttttgtgtt agttctttta ataaccactc ataaatcctc atagagtatt 3000 tgttttcaaa agacttaaca tgttccagat tatattttat gaattttttt aactggaaaa 3060 gataaggcaa tatctcttca ctaaaaacta attctaattt ttcgcttgag aacttggcat 3120 agtttgtcca ctggaaaatc tcaaagcctt taaccaaagg attcctgatt tccacagttc 3180 tcgtcatcag ctctctggtt gctttagcta atacaccata agcattttcc ctactgatgt 3240 tcatcatctg agcgtattgg ttataagtga acgataccgt ccgttctttc cttgtagggt 3300 tttcaatcgt ggggttgagt agtgccacac agcataaaat tagcttggtt tcatgctccg 3360 ttaagtcata gcgactaatc gctagttcat ttgctttgaa aacaactaat tcagacatac 3420 atctcaattg gtctaggtga ttttaatcac tataccaatt gagatgggct agtcaatgat 3480 aattactagt ccttttcccg ggagatctgg gtatctgtaa attctgctag acctttgctg 3540 gaaaacttgt aaattctgct agaccctctg taaattccgc tagacctttg tgtgtttttt 3600 ttgtttatat tcaagtggtt ataatttata gaataaagaa agaataaaaa aagataaaaa 3660 gaatagatcc cagccctgtg tataactcac tactttagtc agttccgcag tattacaaaa 3720 ggatgtcgca aacgctgttt gctcctctac aaaacagacc ttaaaaccct aaaggcttaa 3780 gtagcaccct cgcaagctcg ggcaaatcgc tgaatattcc ttttgtctcc gaccatcagg 3840 cacctgagtc gctgtctttt tcgtgacatt cagttcgctg cgctcacggc tctggcagtg 3900 aatgggggta aatggcacta caggcgcctt ttatggattc atgcaaggaa actacccata 3960 atacaagaaa agcccgtcac gggcttctca gggcgtttta tggcgggtct gctatgtggt 4020 gctatctgac tttttgctgt tcagcagttc ctgccctctg attttccagt ctgaccactt 4080 cggattatcc cgtgacaggt cattcagact ggctaatgca cccagtaagg cagcggtatc 4140 atcaacaggc ttacccgtct tactgtccct agtgcttgga ttctcaccaa taaaaaacgc 4200 ccggcggcaa ccgagcgttc tgaacaaatc cagatggagt tctgaggtca ttactggatc 4260 tatcaacagg agtccaagcg agctctcgaa ccccagagtc ccgctcagaa gaactcgtca 4320 agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg 4380 aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg 4440 tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca 4500 ttttccacca tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg 4560 tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct 4620 tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg 4680 cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc 4740 attgcatcag ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc 4800 tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc 4860 acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc 4920

agttcattca gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct 4980

gacagccgga acacggcggc atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg 5040

aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatg 5100

cgaaacgatc ctcatcctgt ctcttgatca gatcttgatc ccctgcgcca tcagatcctt 5160

ggcggcaaga aagccatcca gtttactttg cagggcttcc caaccttacc agagggcgcc 5220

ccagctggca attccgacgt c 5241

<210> 66 <211> 2302 <212> DNA <213> pGV1569

<400> 66

ctcgagagct tactccccat ccccctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg 60 gaattgtgag cggataacaa ttgaattcat taaagaggag aaagtcgaca ttatgcggcc 120 gcggatccat aaggaggatt aattaagact tcccgggtga tcccatggta cgcgtgctag 180 aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt 240 ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatccgccgc cctagaccta ggcgttcggc 300 tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 360 ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 420 ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 480 gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 540 gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 600 ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 660 tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 720 gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 7.80 tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 840 tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 900 tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 960 ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 1020 ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 1080 gttaagggat tttggtcatg actagtgctt ggattctcac caataaaaaa cgcccggcgg 1140 caaccgagcg ttctgaacaa atccagatgg agttctgagg tcattactgg atctatcaac 1200 aggagtccaa gcgagctcgt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 1260 acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 1320 gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 1380 cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 1440 cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 1500 tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 1560 cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 1620 gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 1680 cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 1740

ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 1800

gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 1860

taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 1920

gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 1980

acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 2040

aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 2100

cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 2160

atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 2220

gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat 2280

cacgaggccc tttcgtcttc ac 2302

<210> 67 <211> 3384 <212> DNA <213> pGV1582

<400> 67

ctcgagagct tactccccat ccccctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg 60 gaattgtgag cggataacaa ttgaattcat taaagaggag aaagtcgaca tgaagatcgt 120 tttagtctta tatgatgctg gtaaacacgc tgccgatgaa gaaaaattat acggttgtac 180 tgaaaacaaa ttaggtattg ccaattggtt gaaagatcaa ggacatgaat taatcaccac 240 gtctgataaa gaaggcggaa acagtgtgtt ggatcaacat ataccagatg ccgatattat 300 cattacaact cctttccatc ctgcttatat cactaaggaa agaatcgaca aggctaaaaa 360 attgaaatta gttgttgtcg ctggtgtcgg ttctgatcat attgatttgg attatatcaa 420 ccaaaccggt aagaaaatct ccgttttgga agttaccggt tctaatgttg tctctgttgc 480 agaacacgtt gtcatgacca tgcttgtctt ggttagaaat tttgttccag ctcacgaaca 540 aatcattaac cacgattggg aggttgctgc tatcgctaag gatgcttacg atatcgaagg 600 taaaactatc gccaccattg gtgccggtag aattggttac agagtcttgg aaagattagt 660 cccattcaat cctaaagaat tattatacta cgattatcaa gctttaccaa aagatgctga 720 agaaaaagtt ggtgctagaa gggttgaaaa tattgaagaa ttggttgccc aagctgatat 780 agttacagtt aatgctccat tacacgctgg tacaaaaggt ttaattaaca aggaattatt 840 gtctaaattc aagaaaggtg cttggttagt caatactgca agaggtgcca tttgtgttgc 900 cgaagatgtt gctgcagctt tagaatctgg tcaattaaga ggttatggtg gtgatgtttg 960 gttcccacaa ccagctccaa aagatcaccc atggagagat atgagaaaca aatatggtgc 1020 tggtaacgcc atgactcctc attactctgg tactacttta gatgctcaaa ctagatacgc 1080 tcaaggtact aaaaatatct tggagtcatt ctttactggt aagtttgatt acagaccaca 1140 agatatcatc ttattaaacg gtgaatacgt taccaaagct tacggtaaac acgataagaa 1200 ataaggatcc ataaggagga ttaattaaga cttcccgggt gatcccatgg tacgcgtgct 1260 agaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 1320 gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc gccctagacc taggcgttcg 1380 gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 1440 ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 1500 ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 1560 acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 1620 tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 1680 ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc 1740 ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 1800 ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 1860 actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 1920 gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 1980 tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 2040 caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 2100 atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 2160 acgttaaggg attttggtca tgactagtgc ttggattctc accaataaaa aacgcccggc 2220 ggcaaccgag cgttctgaac aaatccagat ggagttctga ggtcattact ggatctatca 2280 acaggagtcc aagcgagctc gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 2340 gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 2400 tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 2460 gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 2520 cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 2580 gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 2640

atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 2700

aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 2760

atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 2820

aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 2880

aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 2940

gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 3000

gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 3060

gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 3120

ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 3180

ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 3240

atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 3300

gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt 3360

atcacgaggc cctttcgtct tcac 3384

<210> 68 <211> 4570 <212> DNA <213> pGV1583

<400> 68

ctcgagagct tactccccat ccccctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg 60 gaattgtgag cggataacaa ttgaattcat taaagaggag aaagtcgaca tgaagatcgt 120 tttagtctta tatgatgctg gtaaacacgc tgccgatgaa gaaaaattat acggttgtac 180 tgaaaacaaa ttaggtattg ccaattggtt gaaagatcaa ggacatgaat taatcaccac 240 gtctgataaa gaaggcggaa acagtgtgtt ggatcaacat ataccagatg ccgatattat 300 cattacaact cctttccatc ctgcttatat cactaaggaa agaatcgaca aggctaaaaa 360 attgaaatta gttgttgtcg ctggtgtcgg ttctgatcat attgatttgg attatatcaa 420 ccaaaccggt aagaaaatct ccgttttgga agttaccggt tctaatgttg tctctgttgc 480 agaacacgtt gtcatgacca tgcttgtctt ggttagaaat tttgttccag ctcacgaaca 540 aatcattaac cacgattggg aggttgctgc tatcgctaag gatgcttacg atatcgaagg 600 taaaactatc gccaccattg gtgccggtag aattggttac agagtcttgg aaagattagt 660 cccattcaat cctaaagaat tattatacta cgattatcaa gctttaccaa aagatgctga 720 agaaaaagtt ggtgctagaa gggttgaaaa tattgaagaa ttggttgccc aagctgatat 780 agttacagtt aatgctccat tacacgctgg tacaaaaggt ttaattaaca aggaattatt 840 gtctaaattc aagaaaggtg cttggttagt caatactgca agaggtgcca tttgtgttgc 900 cgaagatgtt gctgcagctt tagaatctgg tcaattaaga ggttatggtg gtgatgtttg 960 gttcccacaa ccagctccaa aagatcaccc atggagagat atgagaaaca aatatggtgc 1020 tggtaacgcc atgactcctc attactctgg tactacttta gatgctcaaa ctagatacgc 1080 tcaaggtact aaaaatatct tggagtcatt ctttactggt aagtttgatt acagaccaca 1140 agatatcatc ttattaaacg gtgaatacgt taccaaagct tacggtaaac acgataagaa 1200 ataaggatcc ataaggagga ttaattaaat gatcgtaaag cctatggttc gtaacaatat 1260 ttgcctgaac gctcatccgc agggttgcaa gaaaggtgtc gaggatcaga ttgaatacac 1320 caagaaacgt attaccgctg aagttaaagc aggtgctaaa gcgccgaaaa acgtgctggt 1380 tctgggctgt tccaacggct acggcctggc gtctcgcatc actgctgcgt ttggttatgg 1440 tgcggctact atcggtgttt cttttgaaaa agcgggctcc gaaaccaaat atggcacccc 1500 aggttggtac aacaacctgg cgttcgatga agcggctaaa cgcgagggcc tgtactctgt 1560 gactatcgac ggtgacgcct tcagcgatga aatcaaagca caggttatcg aggaagccaa 1620 aaagaaaggc attaagtttg acctgattgt gtactctctg gctagcccgg tgcgtaccga 1680 tccggatacc ggcatcatgc acaaatccgt cctgaaaccg ttcggcaaaa ctttcaccgg 1740 taaaacggta gatccgttca ctggtgagct gaaagaaatc tctgccgagc cagctaacga 1800 tgaagaggca gctgctactg tcaaagtcat gggtggtgaa gattgggaac gttggatcaa 1860 acagctgtct aaagaaggtc tgctggagga aggctgcatt accctggcat actcctacat 1920 tggtccagag gccactcagg cgctgtatcg taaaggtact atcggtaaag ctaaagaaca 1980 cctggaagct acggctcacc gtctgaacaa agaaaacccg tccatccgtg cattcgtttc 2040 cgtcaacaag ggcctggtca cccgtgcatc cgcagttatc ccggtcatcc ctctgtatct 2100 ggcttccctg ttcaaggtta tgaaggaaaa aggtaaccat gagggttgta tcgaacagat 2160 cacccgtctg tacgccgaac gtctgtaccg caaggatggc accatcccgg ttgatgagga 2220 aaaccgcatt cgtatcgacg actgggaact ggaagaagat gttcaaaaag ctgtgtctgc 2280 gctgatggaa aaagtgaccg gcgaaaatgc ggaatccctg acggacctgg cgggctatcg 2340 tcatgacttt ctggcgtcca acggttttga tgttgagggc atcaactatg aagcggaagt 2400 agagcgtttt gaccgcattc ccgggtgatc ccatggtacg cgtgctagag gcatcaaata 2460 aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac 2520 gctctcctga gtaggacaaa tccgccgccc tagacctagg cgttcggctg cggcgagcgg 2580 tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 2640 agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 2700 cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 2760 ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 2820 tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 2880 gaagcgtggc gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 2940 gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 3000 gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 3060 ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 3120 ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 3180 ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 3240 gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 3300 ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 3360 tggtcatgac tagtgcttgg attctcacca ataaaaaacg cccggcggca accgagcgtt 3420 ctgaacaaat ccagatggag ttctgaggtc attactggat ctatcaacag gagtccaagc 3480 gagctcgtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 3540 gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 3600 acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 3660 ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 3720 tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 3780 ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 3840 ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 3900 atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 3960 taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 4020 catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 4080 atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 4140 acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 4200 aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 4260 ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 4320 cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 4380 atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 4440 ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 4500 ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt 4560 tcgtcttcac 4570 <210> 69 <211> 35 <212> DNA <213> CacJhIF

<400> 69

aattgaattc ttattattta ggaggagtaa aacat

<210> 70

<211> 35

<212> DNA

<213> Cac_thlR

<400> 70

aattggatcc ttagtctctt tcaactacga gagct

<210> 71 <211> 35 <212> DNA <213> Cac_aadF

<400> 71

aattgaattc atattttaga aagaagtgta tattt

<210> 72 <211> 42 <212> DNA <213> Cac_aadR

<400> 72

aattacgcgt ttaaggttgt tttttaaaac aatttatata

<210> 73 <211> 36 <212> DNA <213> Cac bdhF <400> 73 aattgaattc attagatgct tgtattaaaa taataa

<210> 74 <211> 36 <212> DNA <213> Cac_bdhR <400> 74

aattggatcc ttacacagat tttttgaata tttgta

<210> 75 <211> 35 <212> DNA <213> Cac_hbdF

<400> 75

aattgaattc attgatagtt tctttaaatt taggg

<210> 76 <211> 35 <212> DNA <213> Cac_hbdR

<400> 76

aattggatcc ttattttgaa taatcgtaga aacct

<210> 77 <211> 35 <212> DNA <213> Cac_crtF

<400> 77

aattgaattc ctatctattt ttgaagcctt caatt

<210> 78 <211> 36 <212> DNA <213> Cac_crtR <400> 78

aattggatcc aatattttag gaggattagt catgga 36

<210> 79 <211> 37 <212> DNA <213> Cac_bcdF

<400> 79

aattggtacc ttaattatta gcagctttaa cttgagc 37

<210> 80 <211> 40 <212> DNA <213> Cac_bcdR

<400> 80

aattggatcc aaaattgaag gcttcaaaaa tagataggag 40

<210> 81 <211> 44 <212> DNA <213> Cac_adhF

<400> 81

aattgtcgac attttataaa ggagtgtata taaatgaaag ttac 44

<210> 82 <211> 36 <212> DNA <213> Cac_adhR

<400> 82

ttaatctaga ttaaaatgat tttatataga tatcct

36 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> glpDchk_F

<400> 83

ccgtgggtga aacagttctt

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> glpDchk_R

<400> 84

cgtaagtgcg agcgtaatga

<210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> glpKchk_F

<400> 85

aaagctccac gctggtagaa

<210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> glpKchk_R

<400 86

gtcacgcgtc tgataagcaa

Claims (44)

1. Microorganismo recombinante capaz de produzir n-butanol em um rendimento de pelo menos 5 porcento do valor teórico, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorga- nismo recombinante é obtenível por: modificar por engenharia o microorganismo para ativar uma enzima heteróloga de um caminho dependente de NADH para conversão de uma fonte de carbono a n-butanol através da produção de um ou mais intermediários metabólicos; modificar por engenharia o microorganismo para inativar uma enzima nativa de um ou mais caminhos para a conversão de um substrato em um produto no qual o substrato é um dos um ou mais intermediários metabólicos; e modificar por engenharia o microorganismo para ativar pelo menos um de uma en- zima de produção de NADH e um caminho de produção de NADH para equilibrar o dito ca- minho heterólogo dependente de NADH.

2. Microorganismos recombinantes, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais caminhos nativos é um caminho depen- dente de NADH.

3. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima heteróloga é selecionada do grupo que con- siste em um piruvato desidrogenase anaerobicamente ativo, formato desidrogenase depen- dente de NADH, acetil-CoA-acetiltransferase (tiolase), hidroxibutiril-CoA desidrogenase, cro- tonase, butiril-CoA desidrogenase, butiraldeído desidrogenase e n- butanol desidrogenase.

4. Microorganismos recombinantes, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima nativa compreende um álcool desidrogenase que catalisa a conversão de acetil-CoA em etanol e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um rendimento de pelo menos 30 % do valor teórico.

5. Microorganismos recombinantes, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima de produção de NADH é um formato desidro- genase dependente de NADH.

6. Microorganismos recombinantes, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima de produção de NADH é um piruvato desi- drogenase ativo em condição anaeróbica.

7. Microorganismos recombinantes, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o caminho de produção de NADH é um caminho para a conversão de glicerol em piruvato, o microorganismo recombinante capaz de produzir n- butanol em um rendimento de pelo menos 50 % do valor teórico.

8. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as enzimas nativas são selecionadas do grupo que consiste em D-Iactato desidrogenase, piruvato formate liase, acetaldeído/álcool desidroge- nase, fosfato acetil transferase, acetato quinase A, fumarato redutase, piruvato oxidase e metilglioxal sintase.

9. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima nativa compreende adicionalmente um Iactato desidrogenase e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um ren- dimento de pelo menos 50 % do valor teórico.

10. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima nativa compreende adicionalmente um fuma- rato redutase e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um ren- dimento de pelo menos 55 % do valor teórico.

11. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima nativa compreende adicionalmente um metil- glioxal sintase e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um ren- dimento de pelo menos 60 % do valor teórico.

12. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima nativa compreende adicionalmente um aceta- to quinase e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um rendi- mento de pelo menos 65 % do valor teórico.

13.. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima de produção de NADH é um piruvato desi- drogenase ativo em condição anaeróbica e o microorganismo recombinante é capaz de pro- duzir n-butanol em um rendimento de pelo menos 73 % do valor teórico.

14. Microorganismo recombinante capaz de produzir n-butanol em um rendimento de pelo menos 2 % da porcentagem do valor teórico, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo recombinante é obtenível por: modificar por engenharia o microorganismo para ativar uma enzima heteróloga de um caminho dependente de NADH para conversão de uma fonte de carbono em n-butanol através da produção de um ou mais intermediários metabólicos; e modificar por engenharia o microorganismo para inativar uma enzima nativa de um ou mais caminhos para a conversão de um substrato em um produto em que o substrato é um dos um ou mais intermediários metabólicos.

15. Microorganismos recombinantes, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais caminhos nativos são caminhos depen- dentes de NADHs.

16. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima heteróloga é selecionada do grupo que con- siste em um piruvato desidrogenase anaerobicamente ativo, formato desidrogenase depen- dente de NADH, acetil-CoA-acetiltransferase (tiolase), hidroxibutiril-CoA desidrogenase, cro- tonase, butiril-CoA desidrogenase, butiraldeído desidrogenase e n- butanol desidrogenase.

17. Microorganismos recombinantes, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima nativa compreende um álcool desidrogenase que catalisa a conversão de acetil-CoA em etanol e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um rendimento de pelo menos 5 % do valor teórico.

18. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima nativa compreende adicionalmente um Iactato desidrogenase e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um ren- dimento de pelo menos 7 % do valor teórico.

19. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima nativa compreende adicionalmente um fuma- rato redutase e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um ren- dimento de pelo menos 20 % do valor teórico.

20. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima nativa compreende adicionalmente um metil- glioxal sintase e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um ren- dimento de pelo menos 25 % do valor teórico.

21. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima nativa compreende adicionalmente um aceta- to quinase e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um rendi- mento de pelo menos 25 % do valor teórico.

22. Microorganismo recombinante que expressa um caminho heterólogo para a conversão de uma fonte de carbono em n-butanol, CARACTERIZADO pelo fato de que o caminho heterólogo compreende o substrato seguinte para conversões do produto: acetil- CoA em acetoacetil-CoA, acetoacetil-CoA em hidroxibutiril-CoA, hidroxibutiril-CoA em croto- noil-CoA, CrotoniI-CoA em butiril-CoA, butiril-CoA em butiraldeído, e butiraldeído em n- butanol, o microorganismo recombinante modificado por engenharia para inativar um ou mais caminhos nativos para a conversão de um substrato em um produto em que o substra- to é piruvato ou acetilCoA, o microorganismo recombinante adicionalmente modificado por engenharia para ativar pelo menos um de um piruvato desidrogenase anaerobicamente ati- vo, um formato desidrogenase dependente de NADH, e um caminho heterólogo para a con- versão de glicerol em piruvato, e o microorganismo recombinante capaz de produzir n- butanol em um rendimento de pelo menos 5 porcento do valor teórico.

23. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito um ou mais caminhos nativos são caminho de- pendente de NADHs.

24. Microorganismos recombinantes, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que os caminhos inativados compreendem pelo menos um da conversão de acetilcoA em etanol, conversão de piruvato em lactato, conversão de piru- vato em succinato e conversão de diidroxiacetonafosfato em metilglioxal, conversão de ace- til-CoA em acetato, e conversão de piruvato em acetato.

25. Microorganismos recombinantes, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais caminhos nativos compreendem a con- versão de acetil-CoA em etanol e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n- butanol em um rendimento de pelo menos 30 % do valor teórico.

26. Microorganismos recombinantes, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o caminho de produção de NADH é um caminho para a conversão de glicerol em piruvato, e o microorganismo recombinante capaz de produzir n- butanol em um rendimento de pelo menos 50 % do valor teórico.

27. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que os caminhos inativados compreendem adicionalmente conversão de piruvato em lactato e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n- butanol em um rendimento de pelo menos 50 % do valor teórico.

28. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que os caminhos inativados compreendem adicionalmente a conversão de piruvato em succinato, e o microorganismo recombinante é capaz de produ- zir n-butanol em um rendimento de pelo menos 55 % do valor teórico.

29. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que os caminhos inativados compreendem adicionalmente a conversão de piruvato em metilglioxal, e o microorganismo recombinante é capaz de pro- duzir n-butanol em um rendimento de pelo menos 60 % do valor teórico.

30. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que os caminhos inativados adicionalmente compreendem a conversão de acetil-CoA em acetato e o microorganismo recombinante é capaz de produ- zir n-butanol em um rendimento de pelo menos 65 % do valor teórico.

31. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima de produção de NADH é um piruvato desi- drogenase ativo em condição anaeróbica, e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um rendimento de pelo menos 73 % do valor teórico.

32. Microorganismo recombinante, que expressa um caminho heterólogo para a conversão de uma fonte de carbono em n-butanol, CARACTERIZADO pelo fato de que o caminho heterólogo compreende o substrato seguinte para conversões do produto: acetil- CoA em acetoacetil-CoA; acetoacetil-CoA em hidroxibutiril-CoA; hidroxibutiril-CoA em croto- noil-CoA; CrotoniI-CoA em butiril-CoA; butiril-CoA em butiraldeído, e butiraldeído em n- butanol, o microorganismo recombinante modificado por engenharia para inativar um ou mais caminhos nativos para a conversão de um substrato em um produto em que o substra- to é piruvato ou acetilCoA, o microorganismo recombinante capaz de produzir n-butanol em um rendimento de pelo menos 2 % porcentagem do valor teórico.

33. Microorganismos recombinantes, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que os caminhos inativados compreendem pelo menos uma da conversão de acetil-CoA em etanol, conversão de piruvato em lactato, conversão de pi- ruvato em succinato e conversão de piruvato em metilglioxal, conversão de acetil-CoA em acetato e conversão de piruvato em acetato.

34. Microorganismos recombinantes, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais caminhos nativos compreendem conver- são de acetil-CoA em etanol e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n- butanol em um rendimento de pelo menos 5 % do valor teórico.

35. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais caminhos nativos compreendem adicio- nalmente conversão de piruvato em lactato e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um rendimento de pelo menos 7 % do valor teórico.

36. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que os caminhos inativados compreendem adicionalmente conversão de piruvato em succinato e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um rendimento de pelo menos 20 % do valor teórico.

37. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que os caminhos inativados compreendem adicionalmente conversão de piruvato em metilglioxal, e o microorganismo recombinante é capaz de produ- zir n-butanol em um rendimento de pelo menos 25 % do valor teórico.

38. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que os caminhos inativados compreendem adicionalmente conversão de acetil-CoA em acetato e o microorganismo recombinante é capaz de produzir n-butanol em um rendimento de pelo menos 35 % do valor teórico.

39. Método para produzir n-butanol o método, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende fornecer um microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 1, colocando em contato o microorganismo recombinante com uma fonte de carbono por um tempo e em condições suficientes para permitir a produção de n-butanol, até uma quantida- de recuperável de n-butanol ser produzida e recuperar a quantidade recuperável de n- butanol.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo cresce em condições aeróbicas e em que a biocatálise é conduzida em condições anaeróbicas.

41. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo é cultivado com controle de pH a pH5-7 e em que a temperatura de culti- vo é controlada a 25-37C.

42. Microorganismo recombinante capaz de produzir butirato em um rendimento de pelo menos 5 porcento do valor teórico, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorga- nismo recombinante é obtenível por: modificar por engenharia o microorganismo para ativar um caminho heterólogo de- pendente de NADH para conversão de uma fonte de carbono em butirato através de produ- ção de um ou mais intermediários metabólicos; e modificar por engenharia o microorganismo para inativar um caminho nativo para a conversão de um substrato em um produto em que o substrato é um dos um ou mais inter- mediários metabólicos.

43. Microorganismo recombinante capaz de produzir misturas de butirato e n- butanol em um rendimento de pelo menos 5 porcento do valor teórico, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo recombinante é obtenível por: modificar por engenharia o microorganismo para ativar um caminho heterólogo de- pendente de NADH para conversão de uma fonte de carbono em butirato através de produ- ção de um ou mais intermediários metabólicos; modificar por engenharia o microorganismo para ativar um caminho heterólogo de- pendente de NADH para conversão de uma fonte de carbono em n-butanol através de pro- dução de um ou mais intermediários metabólicos; e modificar por engenharia o microorganismo para inativar um caminho nativo para a conversão de um substrato em um produto em que o substrato é um dos um ou mais inter- mediários metabólicos.

44. Microorganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo recombinante é obtenível para modi- ficar adicionalmente por engenharia o microorganismo para ativar pelo menos uma de uma enzima de produção de NADH e um caminho de produção de NADH para equilibrar o dito caminho heterólogo dependente de NADH.