KR101596166B1 - 유방암 진단 및 치료를 위한 마이크로 ｒｎａ의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유방암 진단 및 치료와 관련된 특정 마이크로RNA(miRNA)의 p130Cas의 조절 기능에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 p130Cas의 기능을 조절하는 특정 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)인 3종류의 miRNA(miR24, miR362, miR329의 용도에 관한 것으로, 유방암 진단능, p130Cas 하향 조절에 따른 유방암 치료능 및 타목시펜(Tamoxifen) 항암제의 내성 억제능에 따른 항암적 용도에 관한 것이다.

Description

유방암 진단 및 치료를 위한 마이크로 ＲＮＡ의 용도{A Use of microRNA for Ddiagnosing and Treating Brest Cancer}

본 발명은 유방암 진단 및 치료와 관련된 특정 마이크로RNA(miRNA)의 p130Cas의 조절 기능에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 p130Cas의 기능을 조절하는 특정 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)인 3종류의 miRNA(miR24, miR362, miR329의 용도에 관한 것으로, 유방암 진단능, p130Cas 하향 조절에 따른 유방암 치료능 및 타모시펜(Tamoxifen) 항암제의 내성 억제능에 따른 항암적 용도에 관한 것이다.

유방암 (BCa)는 여성에서 가장 흔한 암 진단물이며, 여성들 간에 암-관련 사망의 제2의 주요 원인이다 [참조:Ries LAG, et al. (eds). SEER Cancer Statistics Review, 1975-2003, National Cancer Institute, Bethesda,MD]. 지난 20년간 유방암 치료에 있어서의 주요한 진전은 무병 생존 (disease-free survival: DFS) 비율을 상당히 개선시켰다. 예를 들어, 종양-관련된 항원에 대해 반응성인 항체를 사용하는 요법을 이용하여 질환 진행을 느리게 하거나 질환 재발을 예방하도록 특정 세포성 과정을 차단하였다. 유방암 치료에 있어 최근의 진전에도 불구하고, 상당수의 환자들이 종국에는 재발된 질환에 의해 사망하고 있다. 따라서, 재발 질환의 진전을 방지하거나 느리게 하거나 막는 처리가 필요하다.

유방암 환자에 대해 시행되는 수술전 항암 화학요법은 일반적으로 인체에 독성 부작용을 유발하고 경제적인 면에서도 비용이 많이 드는 고가의 치료이다. 특히 실제 항암제 치료에 의해 유의한 생존율의 향상은 극히 소수의 환자에서만 관찰되기 때문에 최근에는 환자의 개별치료(Personalized therapy)적 관점에서 항암제에 반응하는 환자군을 선별해 내려는 노력이 진행중이다.

최근에는 수술전 항암 화학요법은 삶의 질 향상뿐만 아니라, 약제개발이나 항암제 저항 관련 기초 연구의 플랫폼(flatform)으로서의 역할이 더욱 큰 주목을 받고 있다. NSABP B-18 연구에서 수술전 항암 화학요법 후 병리학적 완전 관해(Pathologic Complete Response; pCR)는 환자의 예후를 예측할 수 있는 유일한 인자라고 보고되었다. 이를 이용하여 수술전 항암요법 후 pCR 여부는 새로운 치료법의 유효성을 짧은 기간 안에 확인할 수 있는 대체인자 (surrogate marker)로 이용되고 있다.

나아가, 보다 빠른 시기에 수술전 항암화학요법의 유효성을 확인할 수 있는 항암제 사용 직후의 변화 물질(acquired resistance related marker)이나 종양에 내재 되어 있는 항암제 반응/내성 관련 물질(intrinsic resistance related marker)을 발굴하기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있으며, 이러한 연구들은 대부분 수술전 항암화학요법 플랫폼(plarform)에서 이루어지고 있다

또한 최근에는 기능적 분자 영상 기법을 이용하여 수술전 항암 화학요법을 이용함으로써 항암제 사용 중에 발생하는 종양세포의 변화, 병리학적 완전 관해의 예측, 그리고 수술 전까지의 종양의 반응 경과를 예측하려는 시도가 진행 중에 있다.

항암제의 독성 부작용은 개인 및 민족적 특성에 따라 편차가 있으며, 사용하고 있는 치료 용량에 따라 생명에 위협까지 줄 수 있어 그 독성 및 부작용은 항암제 사용시 신중하게 관찰되고 관리되어야 한다. 이런 이유로 환자 예후 인자에 대한 많은 연구가 수행되었으며, 이러한 연구를 바탕으로 항암제의 선택적 투여를 결정하려 하였으나 현재까지 만족할 만한 결과는 없었다

그러므로, 앞으로 항암제의 연구개발은 기존 항암제의 문제점인 부작용, 전이, 내성 극복을 위해 '분자생물학'과 '지놈프로젝트' 유전정보 활용 연구가 가속화될 것으로 전망된다.

특히, 암 치료시 항암제에 대한 내성(耐性)이 흔히 발생, 완치가 어려운 것으로 알려져 있다. 따라서 암을 치료하는데 있어 일차적으로 암을 제거하기 위하여 항암제를 사용하는 것 못지 않게 중요한 것이 항암제 사용으로 인한 내성 발현을 어떻게 조절하느냐와 처음부터 항암제에 대한 내성 때문에 효과적으로 항암제를 사용할 수 없는 경우의 문제점을 해결해야 한다는 것이다.

따라서, 당해 기술 분야에서는 항암제에 대한 내성을 가지는, 임상적 완화 상태에 있는 유방암 환자에게 질환의 재발에 대해 신뢰할 수 있는 보호를 제공할 내성 진단 마커 및 백신을 개발할 필요가 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래 기술의 한계를 극복하기 위해 예의 노력한 결과, p130Cas의 조절자로서의 특정 마이크로 RNA의 신규 용도을 발견하고, 이를 이용하여 조기에 유방암의 진단, 치료 및 항암제 내성을 억제할 수 있는 기능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허출원 제2014-0067001호

본 발명은 특정 마이크로 RNA의 p130Cas의 조절자로서의 신규 용도에 기초하여, 본 발명의 목적은 p130Cas가 활성화되는 암에 대한 항암용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 특정 miRNA를 포함하는 유방암 진단용 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 특정 miRNA를 포함하는 유방암 치료용 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항암제 타목시펜(Tamoxifen)에 대한 내성을 억제하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은

마이크로 RNA-24(miR24), 마이크로 RNA-362(miR362)및 마이크로 RNA-329(miR329) 중 선택된 1종 이상의 마이크로 RNA에 특이적인 프라이머 서열을 포함하는 유방암 진단 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 마이크로 RNA 또는 상기 마이크로 RNA의 발현 또는 작용 촉진제를 유효성분으로 포함하는, p130Cas가 활성화되는 암에 대한 항암용 조성물을 제공한다.

miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 마이크로 RNA, 상기 마이크로 RNA의 발현 또는 작용 촉진제는 p130Cas의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다. 이 때, miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현 또는 작용 촉진제는 이들 유전자가 발현토록 도입된 벡터 형태가 가장 대표적이다.

특히, 상기 miR24, miR362 및 miR329 유전자는 각각, 예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3으로 구성된 서열을 사용할 수 있다

상기 p130Cas가 활성화되는 암은 유방암, 피부암, 골암, 전립선암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 뇌암, 후두암, 담낭암, 췌장암, 직장암, 부갑상선암, 갑상선암, 부신암, 신경조직암, 두경부암, 결장암, 위암, 기관지암으로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 암질환일 수 있는데, 가장 바람직하게는 유방암이다.

본 발명의 상기 항암용 조성물은, (i) 암세포의 활성도 저하; (ii) 콜로니 형성능 저하; (iii) 세포이동성 저하; (iv) 암 초기발달의 저해(종양 형성 능력 저하) 효과를 가진다.

또한, 본 발명은 다른 태양으로서, 마이크로 RNA-24(miR24), 마이크로 RNA-362(miR362)및 마이크로 RNA-329(miR329) 중 선택된 1종 이상의 유전자의 발현 또는 작용 촉진제를 유효성분으로 포함하는, 항암제 타목시펜(Tamoxifen)에 대한 내성 억제용 조성물을 제공한다.

이 때, 상기 miR24, miR362 및 miR329 유전자에 대한 설명은 앞서 설명한 바와 같다.

특히, 상기 항암제 타목시펜(Tamoxifen)에 대한 내성 억제 효과는, 타목시펜(Tamoxifen)에 대한 내성을 가지는 경우 p130Cas가 활성화되어 있음을 이용한 것으로 본 발명의 miRNA의 발현 촉진을 통해 상기 p130Cas의 발현감소를 유도하고, 이에 따른 타목시펜(Tamoxifen)에 대한 내성 억제 효과가 나타나는 메커니즘에 기반한 것이다.

또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 유방암 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 마이크로 RNA-24(miR24), 마이크로 RNA-362(miR362)및 마이크로 RNA-329(miR329) 중 선택된 1종 이상의 유전자를 발현하는 동물세포에 항암 후보 물질을 처리하는 단계; 및

(b) 상기 동물세포에서 항암 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 마이크로 RNA-24(miR24), 마이크로 RNA-362(miR362)및 마이크로 RNA-329(miR329) 중 선택된 1종 이상의 유전자 발현이 촉진되는 경우의 물질을 유방암 치료용 물질로 선택하는 단계.

이 때, 상기 방법은 추가로 항암 후보 물질 유무에 따른 p130Cas의 발현을 확인하고, p130Cas의 발현을 억제하는 경우의 물질을 유방암 치료용 물질로 선택하는 단계를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명은 miR24, miR362 및/또는 miR329 유전자의 상향-조절작용(up-regulating)을 통해서 p130Cas의 발현이 억제됨으로써 암세포의 발생 및 성장이 억제되는 분자적 메커니즘을을 기반으로 하는, 상기 마이크로 RNA의 진단적 용도, 항암적 용도 및 타목시펜(Tamoxifen)에 대한 내성 억제 용도에 관한 것으로, p130Cas 관련 암질환의 유전적 치료에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 마이크로 RNA의 결합예상 지점 확인을 위한 제작한 외부 유전체의 모식도 및 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 p130Cas 과발현 세포주와 대조군의 사진 및 발현을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 마이크로 RNA 처리 후 p130Cas 발현저하 관찰한 웨스턴 블럿 분석 결과이다.
도 4는 본 발명의 마이크로 RNA를 MCF7 내로 주입하여 p130Cas mRNA의 발현을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 마이크로 RNA가 결합을 한 경우 발현이 저해되는 리포터 단백질인 GFP 발현정도에 대한 웨스턴 블럿 분석 결과이다.
도 6은 p130Cas 의 발현 저하에 따른 세포활성도를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 마이크로 RNA의 과다발현에 의한 MCF 세포주의 콜로니 형성능을 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 마이크로 RNA를 과다 발현시킨 실험군 및 대조군에 대해, 타목시펜 처리에 따른 세포 생존율 비교 결과이다.
도 9는 p130Cas의 발현 저하에 따른 세포이동성 변화를 관찰하기 위한 Scratch wound healing assay 분석 결과이다.
도 10은 본 발명의 마이크로 RNA가 세포의 이동성 및 침습성에 미치는 영향을 알아보기 위한 migration assay와 invasion assay 분석 결과이다.
도 11은 본 발명의 마이크로 RNA가 실제로 체내에서 암발달에 영향을 미치는지를 확인하기 위한 이종이식(xenograft) 분석 결과이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"암", "종양" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 본 발명에서의 암의 예는 p130Cas 조절에 의해 영향을 받는 경우로, 특히 p130Cas가 과발현되어 활성화되는 암을 포함한다.

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"유전자 발현"이란 용어는 일반적으로 생물학적 활성이 있는 폴리펩티드가 DNA 서열로부터 생성되고 세포에서 생물학적 활성을 나타내는 세포 과정을 의미한다. 그런 의미로, 유전자 발현은 전사 및 해독 과정을 포함할 뿐만 아니라, 유전자 또는 유전자 산물의 생물학적 활성에 영향을 끼칠 수 있는 전사후 및 해독후 과정을 포함한다. 상기 과정들은 RNA 합성, 가공 및 수송뿐만 아니라, 폴립펩티드 합성, 수송 및 폴리펩티드의 해독후 변형을 포함하지만, 이들에 국한되는 것은 아니다. 단백질 산물을 암호화하지 않는 유전자, 예컨대, miRNA 유전자의 경우에, "유전자 발현"이란 용어는 전구체 miRNA 가 유전자로부터 생성되는 과정을 의미한다. 통상, 상기 과정은, 단백질 암호 유전자에 대해 RNA 폴리머라제 II에 의해 유도되는 전사와는 달리, miRNA 유전자의 전사 산물이 해독되어 단백질을 생성하지 않지만, 전사로 언급된다. 그럼에도 불구하고, miRNA 유전자로부터 성숙 miRNA의 생성은 그 용어가 본원에 사용되는 대로 "유전자 발현"이란 용어에 의해 포함된다

"진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 그 중에서도 본 발명은 특히 유방암 진단에 유용하다. 본 발명에서는 유방암의 재발(Recurrence) 진행(progression), 전이(metastasis)를 예측하는 것을 포함한다.

"진단용 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 유방암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 유방암을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 다당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

"단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다

"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.

"조절자 (modulator)"란 용어는 폴리펩티드, 핵산, 거대 분자, 복합체, 분자, 소분자, 화합물, 종 등 (자연 발생적 또는 비자연 발생적), 또는 조절을 일으킬 수 있는 박테리아, 식물, 곰팡이, 또는 동물 세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질로부터 만들어지는 추출물을 의미한다. 조절자는 분석에 포함되어 기능적 성질, 생물학적 활성 또는 과정의 억제제 또는 활성화제 (직접 또는 간접), 또는 그 조합물 (예컨대, 작동물질, 부분적 길항물질,부분적 작동물질, 역 작동물질, 길항물질, 항-미생물제, 미생물 감염 또는 증식의 억제제 등)로서의 잠재적인 활성에 대해 평가할 수 있다.

"형질감염 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다. 본 명세서에서는 형질감염 및 트랜스펙션이라는 용어를 혼용하여 사용하고 있다.

" 벡터" 라는 용어는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.

"microRNA(마이크로 RNA, miRNA)"는 생물의 유전자 발현을 제어하는 역할을 하는 작은 RNA를 의미하며, 타겟 mRNA 3'UTR(untranslated region)과의 상보적인 염기쌍 배열에 의한 타겟 mRNA 번역의 억제를 통해, 유전자 발현 과정에서 중요한 조절 역할을 할 수 있는 20~25개의 뉴클레오티드를 포함하는 작은 RNA이다. 상기 microRNA는 증식, 분화, 세포사멸 등을 포함하는 세포 기능에 있어서 중요한 역할을 하며, 모든 동물에 존재하는 진화적으로 보존된 조절물질로서, 일부 microRNA는 그 프로모터 부위와 관련된 후성유전학적 조절 기작(히스톤 변형, DNA 메틸화 등)을 통해 유전자 발현 조절을 일으킨다고 알려져 있다.

"억제제 또는 저해제(inhibitor)"는 특정 유전자의 발현 또는 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 p130Cas 저해제는 각각 p130Cas의 발현 또는 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질이다. 억제제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다. 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함한다.

"촉진제(activator)"는 특정 유전자의 발현 또는 활성을 촉진, 강화 또는 증가시키는 물질을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 miR24, miR362 또는 miR329 p130Cas 발현 또는 활성 촉진제는 각각의 마이크로 RNA의 발현 또는 활성을 촉진, 강화 또는 증가시키는 물질이다. 촉진제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다. 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함한다.

"상향조절"이라는 표현은, 정상조직세포에 비하여, 활성화된 세포에서 세포내 전사(gene transcription) 또는 번역(gene translation)에 의해서 특정 유전자의 mRNA로의 발현 또는 단백질로 발현량이 현저하게 증가된 것을 의미한다.

"항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 무손상 모노클로날(단일클론) 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.

"항암효과"는 상기 암세포 억제 효능을 포함하는 의미로, 이 또한 종양발생(tumorigenesis), 악성화(malignance) 및/또는 전이(metastasis), 침윤(invasion)에서의 암세포의 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 효과를 포함할 수 있다.

"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

"유전자 치료(gene therapy)"란 통상적인 방법으로는 치료가 곤란한 선천적 또는 후천적 유전자 이상을 유전공학적 방법으로 치료하는 방법을 일컫는다. 구체적으로, 유전자 치료는 선천적 또는 후천적 유전자 결함, 바이러스성 질병, 암 또는 심혈관계 질환 등과 같은 만성 질환의 치료와 예방을 위하여, DNA 및 RNA 등의 유전 물질을 인체 내에 투여하여 치료 단백질을 발현시키거나 특정 단백질의 발현을 억제하도록 하는 치료 방법으로서, 질병의 원인을 유전자 차원에서 해석하여 근본적으로 치료할 수 있기 때문에 난치병의 극복은 물론 기존 의료 방식의 대체 수단으로 기대되고 있는 방법이다.

"유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명이 대상으로 하는 질병은 p130Cas의 기능 조절과 관련된 암(종양)을 모두 포함할 수 있지만, 가장 바람직하게는 유방암(Breast Cancer)이다.

본 발명자들은 유방암 조직에서 특정 마이크로 RNA인 miR24, miR362 및 miR329의 발현이 p130Cas의 발현과 깊은 관련성을 가지고 있음을 발견하였다. 즉, 유방암에서의 상기 특정 유전자들의 p130Cas 조절자로서의 기능에 대해 최초로 규명하였다.

또한, 항암제 내성을 가진 유방암 세포주에 p130Cas가 상대적으로 강하게 발현된다는 공지 사실에 근거하여, 항암제인 타목시펜의 내성 억제 용도에 대해서도 최초로 규명하였다.

<miRNA>

그러므로, 본 발명은 p130Cas의 조절자로서의 특정 miRNA인 miR24, miR362 및 miR329에 관한 것이다.

miRNA(microRNA)는 21-25 뉴클레오티드(nt)의 단일 가닥 RNA 분자로써, 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 조절물질로서, miRNA는 두 단계의 프로세싱으로 이루어진다. 최초의 miRNA 전사체(primary miRNA)가 핵 안에서 Drosha라는 RNaseⅢ type 효소에 의해 70-90 nt 정도의 stem-loop 구조, 즉 pre-miRNA로 만들어지고, 이후 세포질로 이동하여 Dicer라는 효소에 의해 절단되어 21-25 nt의 mature miRNA로 만들어진다. 성숙(mature) miRNA는 더 긴 전사체로부터 가공되어 ~22개 뉴클레오티드 (nt)의 길이를 가진다.

1차-miRNA (pri-miRNA)는 독립 전사 단위로서 RNA Pol II에 의해 전사되거나 또는 숙주 유전자의 접속된 인트론으로부터 발생할 수 있다. 현재 1000개가 넘는 인간 miRNA가 발견되고 있으나. 이들의 고유한 생물학적 의미에 대해서는 극히 일부만 규명되어져 있다. 특정한 miRNAs의 연구는 다양한 형태의 세포에서 세포 성장, 죽음, 분화, 발생 등의 생명현상을 이해하는데 기여할 수 있으며, 비정상적인 miRNA의 발현은 여러 인간 질환의 발병과 밀접히 연관되어 있으며, 특히 본 발명에서는 유방암 형성 및 발달을 촉진하는 p130Cas 활성을 조절하는 특정 miRNA들에 대한 역학을 최초로 제시하고 있다.

본 발명에서의 miR24, miR362 및 miR329는 이들의 pri-miRNA, pre-miRNA, mature-miRNA 또는 기능적 등가물로부터 생성되는 약 17 내지 24개 뉴클레오티드의 핵산 분자를 포함한다. 서열번호 1 내지 3의 miRNA 서열을 예로 들 수 있다:

3' gacaaggacgaCUUGACUCGGu 5' (서열번호 1)

3' acuuaggaacuuAUCCACACAa 5' (서열번호 2)

3' uuucUCCAAUUGGUCCACACAa 5' (서열번호 3)

마이크로RNAs(miRNAs)는 특이적 메신저 RNAs(mRNAs)를 표적으로 하고 이들의 분해 또는 번역 억제를 유도함으로써 유전자 발현을 음성적으로 제어할 수 있다. 본 발명의 마이크로RNAs는 p130Cas의 조절자로서, p130Cas mRNA를 표적으로 하여 이의 발현을 억제하는, 음성적 조절 기능을 가지는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 이러한 p130Cas의 조절 메커니즘을 기초로 하는, 암진단능 및 항암활성을 조절할 수 있는 특정 miRNA인 miR24, miR362 및 miR329에 관한 것이다.

miR24, miR362 또는 miR329 유전자의 과발현은 다음과 같은 기능을 발휘한다:

(i) p130Cas 발현의 저하

p130Cas 단백질이 TGF-beta 신호를 매개하는 단백질인 Smad3와 결합해 TGF-beta가 갖고 있는 세포증식 억제효과를 없애 결과적으로 세포의 증식을 촉진한다는 사실은 공지되어 있는 바, p130Cas 단백질 발현을 억제하면 암세포의 증식을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 마이크로 RNA은 p130Cas mRNA의 직접적인 파괴에 관여하는 것이 아니라, p130Cas mRNA와 직접적으로 결합하여 표적 단백질의 발현을 저해한다. 본 발명의 일 실시예에서는 마이크로 RNA의 과다발현이 일어난 MCF7 3가지 실험군에서 모두 p130Cas의 단백질 발현이 저해되어 있는 것을 확인하였다.

(ii) 세포 활성도 저하

본 발명의 마이크로 RNA들이 과발현하면 암세포의 활성도를 저하시킨다 특히, 바람직하게는 miR-362-3p 와 329가 과다 발현된 실험군의 경우 세포 활성도 저하효과가 크다.

본 발명의 일 실시예에서는 대조군과 비교하여 약 20%정도의 저하된 세포 활성도를 나타냄을 확인하였다.

(iii) 유방암 세포주에서의 콜로니 형성능 저하

본 발명의 마이크로 RNA의 과다발현에 의한 유방암 세포주 예를 들어 MCF 세포주의 콜로니 형성능의 저하가 나타난다. 그리고 이는 마이크로 RNA의 p130Cas의 발현 저하에 따른 효과이다.

본 발명의 일 실시예에서는 대조군과 비교하여 약 50~30% 정도의 콜로니 형성능이 저하되는 것을 확인하였다. 특히, 마이크로 RNA의 영향을 받지 않는 p130Cas가 과다 발현된 MCF7의 경우, 마이크로 RNA가 과다발현 되더라도 콜로니 형성능에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되어 마이크로 RNA의 p130Cas의 발현 저하가 콜로니 형성능 저하에 영향을 미친 것으로 확인할 수 있었다

(iv) 세포이동성 저하

본 발명의 마이크로 RNA의 과다발현에 의해 세포의 이동성이 저하된다. 이 또한, 마이크로 RNA의 세포 내 과다 발현이 직접적으로 p130Cas의 발현을 저해하여 세포의 이동성에 변화를 야기한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 migration assay의 경우 대조군과 비교하여 3가지 실험군에서 30~50% 정도 감소된 세포의 이동성을 확인하였고, invasion assay에서도 30~50% 정도의 세포 이동성의 저하를 확인할 수 있었다. 또한, 마이크로 RNA의 영향을 받지 않는 p130Cas가 과다 발현된 경우와 비교하여, 상기 세포의 이동성 및 침습성의 변화는 마이크로 RNA의 세포 내 과다 발현이 직접적으로 p130Cas의 발현을 저해하여 이루어짐을 확인하였다.

(v) 암 초기발달의 저해

이종이식 분석(xenograft assay)을 통해, 본 발명의 마이크로 RNA의 과발현을 통한 p130Cas의 발현감소가 체내에서의 종양 형성 능력 저하를 유도할 수 있음을 확인하였다

(vi) 약물 반응성에 영향을 끼침

항암제 내성을 가진 MCF7세포주에 p130Cas가 상대적으로 강하게 발현되는 것은 기존에 알려진 사실이다.

본 발명의 마이크로 RNA는 p130Cas의 발현저하를 유도하므로, 이러한 항암제 내성에, 즉 약물반응성에 변화를 줄 수 있다. 바람직하게는 상기 항암제는 타목시펜(Tamoxifen)이다. 그러므로, 유방암 치료에 이용되는 항암치료에서 항암제의 내성을 극복하거나 사용 효율성을 높이는 방법에 본 발명이 응용될 수 있을 것이다.

<진단조성물>

우선, 본 발명은 일 관점에서, miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 진단 마커로서의 용도에 관한 것으로, miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현 감소 및/또는 p130Cas 과발현 여부의 확인을 통해 유방암을 예측하여 진단할 수 있다.

구체적인 예로서, 본 발명은 상기 진단마커 또는 이를 포함하는 진단용 조성물; 및 이을 이용하여 유방암 조기 진단 방법 또는 유방암 조기 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.

상기 유방암의 진단은 발생(generation), 재발(Recurrence) 및 진행(progression)을 포함한다.

유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 유방암 진단 마커는, 유방암의 발병과 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 항상 증가하는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.

본 발명의 특정 유전자들은 유방암이 있는 환자에서 상향조절되어 발현되는 것을 특징으로 한다. 따라서, miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현 감소 및/또는 p130Cas 과발현 확인을 통해 유방암의 발병 여부를 확인할 수 있다. 특히, 상기 마커들을 이용함에 있어서, 개별적인 유전자의 발현을 확인하는 것도 무방하지만, 바람직하게는 상기 유전자들의 2이상의 조합, 더욱 바람직하게는 3가지 miRNA조합으로 측정할 수 있다.

유전자 발현 수준은, 유방암 발병에 의해 유방암 마커의 유전자 발현 수준이 차이나는, 비제한적으로 조직,세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하는 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있다.

mRNA 발현수준 측정이란 유방암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

이에, 본 발명의 구체적인 일 양태에서는, miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 유전자에 특이적인 프라이머 서열을 포함하는 유방암 진단 마커 조성물을 제공할 수 있다. 이 때, miR362는 pri- miRNA 362를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 단백질 발현수준 측정이란 유방암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 유방암 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

유사한 관점에서, 본 발명은 인간의 유방암 조기 진단용 키트에 관한 것이다. 앞서 설명한 기능들에 기초하여, 유방암 발달의 초기 단계, 즉 조기 진단에 대한 정보들을 제공할 수 있다

상기 키트는 miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현을 분석하여 유방암 유무를 판단하는데 쓰이는데, 이는 크게 두 가지 방법으로 실시할 수 있다: 유전적 분석(genetic analysis) 및 면역분석(immunoassay).

이를 위해, 상기 키트는 miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 혹은 프로브; 또는 miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 유전자에 의해 발현되는 단백질 중 선택되는 1종 이상 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.

본 발명의 인간 유방암 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 그리고, 본 발명의 인간 유방암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

상기 유방암 진단방법은, 특정 마커의 발현을 조사하는 것에 관한 것이고, 본 명세서에 개시된 방법은 유방암 환자 치료를 위해 적절하거나 효과적인 요법을 평가할 때 유용한 데이터 및 정보를 얻기 위한 편리하고, 효율적이며, 비용 효과적인 수단을 제공할 수 있을 것이다.

한편, 다른 구체예로서, 본 발명은 miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 발현을 촉진시키거나 및/또는 p130Cas의 발현을 억제시킬 수 있는 유방암 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 일 구체예로,

(a) 후보 물질의 존재하에, miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 유전자를 발현시키는 단계; 및

(b) 후보물질이 없이 miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 유전자를 발현시킨 경우에 비하여, 상기 유전자들의 발현이 촉진되는 경우의 후보물질을 유방암 치료용 물질로 선택하는 단계를 포함할 수 있다.

이 때, 바람직하게는, p130Cas의 발현을 억제시키는지 여부를 함께 확인하여 p130Cas의 발현을 억제하는 경우의 후보물질을 선택하는 것이 더욱 좋다.

이처럼 본 발명은 miR24, miR362 또는 miR329 유전자의 과발현 특성에 기초한, 유방암 진단 기능과 관련된 다양한 용도를 모두 포함할 수 있으며, 특히 발병여부의 판단과 더불어 유방암 발병 후 치료과정에서 질병의 예후를 예측할 수 있는 예후예측 인자로도 활용할 수도 있다.

즉, 유방암 발병에 따른 수술 또는 약물 등과 같은 치료처치 후, 병변 조직/세포 또는 병변 주변부위의 조직/세포에서 이들 miRNA들의 발현정도 및 p130Cas의 발현정도를 분석하여 치료효과 정도를 예측할 수 있는데, miR24, miR362 또는 miR329의 발현이 유방암 발병시의 발현 정도에 비해 과발현되어 있거나 p130Cas의 발현이 억제되어 있는 경우, 유방암 치료가 적절하게 수행되고 있어 예후가 좋은 것으로 예측할 수 있으며 반면, miR24, miR362 또는 miR329의 발현이 유방암 발병시의 발현 정도와 비슷하거나 억제되어 있고, p130Cas의 발현이 유방암 발병시의 발현 정도와 비슷하거나 증가되어 있는 경우에는 치료 예후가 좋지 않은 것으로 예측할 수 있다.

<항암조성물>

한편, 본 발명은 다른 관점에서, miR24, miR362 또는 miR329 유전자의 p130Cas의 발현 저해능에 기반하는 항암 용도를 제공한다.

이는, miR24, miR362 또는 miR329 유전자의 과발현에 의해서 p130Cas의 발현이 억제되는 효과에 따른 것이다. 즉, 본 발명의 마이크로 RNA의 발현의 암세포에 미치는 영향이 p130Cas의 조절에 의한 것이라는 발견에 기초하는 용도이다.

그러므로, 본 발명의 miR24, miR362 또는 miR329 유전자는 p130Cas의 활성 관련 암, 예를 들어, 유방암의 진단 기능뿐만 아니라, 그 자체로서 유방암 치료 기능을 보유하고 있음을 특징으로 하고 있다.

앞서 설명한, p130Cas 발현의 저하에 따른 세포 활성도 저하, 콜로니 형성능 저하, 세포이동성 저하, 암 초기발달의 저해, 종양 형성능 저하, 타목시펜(Tamoxifen) 항암제 내성 억제 등의 기능들에 기반하여, 본 발명은 일 구체예로서, miR24, miR362 또는 miR329 유전자의 발현 또는 활성 촉진제를 유효성분으로 포함하는, p130Cas 관련 암, 즉, p130Cas가 활성화되는 암에 대한 항암용 조성물을 제공한다.

이 때, 상기 p130Cas가 활성화되는 암은, 유방암, 피부암, 골암, 전립선암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 뇌암, 후두암, 담낭암, 췌장암, 직장암, 부갑상선암, 갑상선암, 부신암, 신경조직암, 두경부암, 결장암, 위암, 기관지암, 신장암, 기저세포암종, 궤양성 및 유두상 유형 편평세포 암종, 전이성 피부 암종, 골 육종, 유잉스(Ewing) 육종, 세망세포 육종,골수종, 거대세포 종양, 소세포 폐 종양, 담석, 섬세포 종양, 원발성 뇌종양, 급성 및 만성 림프구 및 과립구 종양, 모상세포 종양, 선종, 과다형성증, 수질 암종, 크롬친화세포종, 점막 신경종, 장 신경절신경종, 과다형성 각막 신경 종양, 마르파노이드 체질 종양, 윌름(Willm) 종양, 정상피종, 난소 종양, 평활근 종양, 자궁경부 이형성 및 상피내 암종, 신경아세포종, 망막아세포종, 연조직 육종, 악성 카르시노이드, 국소 피부 병변, 균상 식육종, 횡문근육종, 카포시(Kaposi) 육종, 골원성 육종, 악성 고칼슘혈증, 신장세포 종양, 진성 다혈구증, 선암종, 다형성 신경교아종, 백혈병, 림프종, 악성 흑색종, 및 표피양 암종으로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 암일 수 있다. 가장 바람직하게는 유방암이다.

"촉진제"는 목적 유전자의 발현 또는 활성을 촉진, 강화 또는 증가시키는 물질을 의미한다. 촉진제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다. 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함한다. 예를 들어, '촉진제'는 이들 miRNA의 발현 또는 활성을 촉진, 강화 또는 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 화학적으로 또는 생화학적으로 개질 될 수 있거나, 조성물로 제형화되어 표적 세포에 임의의 다수 수단으로 투여되거나 발현 구조체를 통해 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 miRNA 분자 또는 miRNA 전구체 분자는 핵산 벡터 (일반적으로 재조합 벡터 또는 발현 벡터로 언급되기도 함) 내로 삽입된 전사 단위로부터 발현된다. 벡터를 사용하여 miRNA를 암호화하는 핵산 분자를 세포 내로 전달하여 특이 유전자를 표적화할 수 있다. 재조합 벡터의 예로는 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 들 수 있다. 다양한 발현 벡터가 당해 분야에 공지되어 있다. 적합한 발현 벡터의 선택은 발현을 의도하는 세포 유형을 비롯하여 (이에 국한되는 것은 아님) 여러 인자에 근거하여 이루어질 수 있다.

상기 miR24, miR362 및 miR329 유전자 중1 이상을 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 염기서열을 가지는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 상기 핵산은 이들의 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 예를 들어 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 핵산을 사용할 수 있다.

상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 마이크로 RNA 서열들과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서, 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 생리활성'이란 p130Cas의 발현을 저해하여 종양 세포의 기능을 억제하는 활성을 의미한다. 또한 상기 핵산은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다(Sambrook, Fritsch and Maniatis, 'Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory press, 1989; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992).

본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법 등에 의해 세포 내로 도입할 수 있다.

일반적으로, 표적 유전자를 발현하는 세포에 형질감염시키는데,형질감염을 위해서는 예를 들어, 일렉트로포레이션 (electroporation), 형질감염을 위한 헬퍼로서 양이온성 리피드 또는 양이온성 폴리머의 사용과 같은 다양한 방법이 사용될 수 있다. 그 후, 세포를 표적 유전자의 발현을 가능하게 하는 적합한 조건 하에서 배양한다. 이어서 표적 유전자의 발현을 예를 들어, RT-PCR 또는 리포터 유전자의 양의 측정과 같은 적합한 기술을 사용하여 측정한다. 기본적으로, 어떤 종류의 세포라도 형질감염전환을 위해서 사용될 수 있지만, 바람직한 구체예에서 세포는 진핵세포, 바람직하게는 동물 세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다.

본 발명에 따른 항암용 조성물은 p130Cas이 하향 조절되도록 치료적 유효량의 miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1이상의 miRNA; 또는 이들의 미믹(mimics, 유사체)를 포함하여야 한다. 치료적 유효량은 공지의 투여 경로에 의하여 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 구현예는 상기 miRNA들; 또는 이들의 미믹을 p130Cas이 관여하는 암세포 내로 형질감염시킬 수 있도록 적용된다.

본 발명의 조성물은 이에 제한되지 않으나 유전자 물질을 표적 세포 내로 형질감염시키기 위한 상기한 수단들 중 임의의 것을 포함 또는 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 조성물은 양이온성 지질을 포함할 수 있고, 상기 miRNA 및 이들의 유사체가 암세포 내로 방출될 수 있도록 양이온성 양친매성 물질을 추가로 포함할 수도 있다.

형질감염된 세포 내에서, miRNA의 결합을 통한 이중 가닥 RNA의 형성은 RNA 간섭 (RNAi)과 유사한 과정을 통하여 p130Cas mRNA 전사체의 분해를 유발하면서 단백질 번역 시스템을 블록킹하거나, 또는 p130Cas mRNA의 분해를 야기하지 않으면서 단백질 번역을 억제함으로써, 궁극적으로 p130Cas 발현을 저해한다.

따라서, 본 발명의 구체예로서, 상기 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물, 및 암을 치료하는 방법을 제공한다. 구체적으로 상기 방법은 본 발명의 발현벡터를 암 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예로서, p130Cas이 활성화되는 암세포를 miR24, miR362 및 miR329 유전자 중1 이상의 유전자로 형질감염시켜 p130Cas 발현을 저해하고 감소시킴으로써, p130Cas 활성 관련 암, 예를 들어, 유방암 등을 치료하는 방법을 제공한다.

한편, 본 발명의 핵산 분자 및 촉진제는 통상적인 약학 합성 기법에 따라 제조되는 항암용 약학 조성물로 제형화 될 수도 있다. 상기 항암용 약학 조성물은 암세포가 아닌 세포에서는 세포독성을 갖지 않는다.

조성물은 활성 제제 또는 활성 제제의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 동시적, 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 하나의 활성 물질 이외에, 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 버퍼, 안정화제 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 비독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 방해해서는 안된다. 담체는 투여를 위해 바람직한 제제 형태, 예를 들어, 국소형, 정맥내, 경구, 뇌막, 신경상막 또는 비경구인지에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 일반적으로 충진제, 확장제, 결합제, 습윤제(wetting agent), 붕해제(disintegrating agent), 계면 활성제와 같은 희석제, 부형제와 혼합함으로써 제조할 수 있다.

나아가, 추가의 요법을 본 발명의 방법에 사용할 수 있음이 고려된다. 하나 이상의 다른 요법제는 당업계에 공지되고 특히 상기에서 추가로 정의된 방사선요법,수술요법, 면역요법, 사이토킨(들), 성장억제제(들), 화학요법제(들), 세포독성제(들), 티로신 키나제 억제제, ras파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 혈관 형성 억제제, 및 사이클린 의존성 키나제 억제제를 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 그 중에서 화학요법 약물은 알킬화제, 항대사화제, 식물 알칼로이드, 토포아이소머라아제 저해제, 및 항종양제로 나눌 수 있다. 이 모든 약물은 세포 분열 또는 DNA 합성 및 일부 경로에서의 기능에 영향을 준다. 일부 제제는 티로신 키나아제 억제제(Gleevec　)와 같이 DNA에 직접적으로 간섭하지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 종양내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 외과적 수술요법 등의 보조 치료 방법들과 병행하여 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제(chemotherapeutic agent)는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴 carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드 (ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아 (nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 마이토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 타목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum),5-플루오로우라실(5-fluorouracil),빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다.

특히, 상기 타목시펜(Tamoxifen) 항암제에 대해 내성을 효과적으로 극복(억제)함으로써, 유방암 조직에서 암세포의 성장억제 및 사멸을 유도함으로써 항암 내성 치료제의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다

<내성 억제>

그러므로, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 miRNA 들의 항암제에 대한 내성 억제능에 관한 것으로, 특히, miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 유전자의 항암제 타목시펜(Tamoxifen)에 대한 내성을 억제하는 기능에 관한 것이다.

항암제 "내성"이란 암세포가 항암제에 대응하여 유전자 변화를 일으킴으로써 항암제의 공격을 피해 항암치료의 효과를 약화시키는 것을 말한다. 상기 "내성"이라는 용어는 "저항성"이라는 용어와 동일한 의미로 사용될 수 있다.

본 발명의 miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 유전자를 과발현시킴으로써, 항암제 내성관련 유전자인 p130Cas 발현저하를 유도하여 항암제 내성을 억제할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 miR24, miR362 및 miR329 유전자들은 p130Cas mRNA와 직접적으로 결합하여 표적단백질 p130Cas의 발현을 저해함으로써 타목시펜(Tamoxifen)에 대한 내성이 억제되게 되는 것이다.

따라서 본 발명에 따른 상기 miR24, miR362 및 miR329 중 선택되는 1종 이상의 유전자는 항암제 보조제로서의 용도로 사용할 수 있으며, 특히 타목시펜(Tamoxifen)의 보조제로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 p130Cas의 발현을 억제함으로써 타목시펜(Tamoxifen) 사용을 감소시켜 고용량으로 사용하였을 때 발생할 수 있는 부작용은 감소시키고 항암 효과는 증강시키는데 이용하는 방법을 포함한다.

<스크리닝>

또한, 다른 관점에서 본 발명은 앞서 설명한 사실을 기반으로 하여, miR24, miR362 및 miR329 유전자 중1 이상의 유전자의 발현을 촉진 및/또는 p130Cas 발현을 억제시키는 암 치료용, 바람직하게는 유방암 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 일 구체예로,

(a) miR24, miR362 및 miR329 유전자 중1 이상의 유전자를 발현하는 동물세포에 항암 후보 물질을 처리하는 단계; 및

(b) 상기 동물세포에서 항암 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 iR24, miR362 및 miR329 유전자 중1 이상의 유전자 발현이 촉진되는 경우의 물질을 유방암 치료용 물질로 선택하는 단계.

이 때, 추가로 p130Cas 발현에 관해 함께 확인하는 것이 가장 바람직하다. 항암 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 p130Cas 발현이 억제되는 경우의 물질을 선택한다.

사용하는 동물세포로서는, 예를 들면 유방암 세포, 또는 인위적으로 제조한 유방암세포 등을 들 수 있고, 바람직하게는 인간 유방암 세포이다. 배양은 당업자의 통상적인 지식에 따라서 선택할 수 있는 배지 및 배양 조건에서 배양한다.

본 방법에서, miRNA 및/또는 p130Cas의 발현을 측정하는 것은 이들과 관련된 RNA, DNA, 단백질 등 그 바이오마커 대상의 형태를 제한하지 않는다.

한편, 본 발명의 다양한 용도는 miR24, miR362 및 miR329 유전자 중1 이상의 유전자의 상향 조절 또는 하향 조절에 따른 p130Cas의 발현조절과 관련하는 유전적 접근까지 확장한다.

즉, p130Cas RNA의 번역(translation)을 억제하거나 파괴시켜 전사후 조절(post-transciptional gene silencing)에 관여함으로써 p130Cas mRNA의 발현을 억제시킴으로써, 암 세포의 성장을 저해시킬 수 있다.

< 실시예 >

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

재료 및 방법

1.조직 준비

본 실험에 이용된 조직은 가톨릭 연구조직은행에서 구입하여 실험에 이용하였다. 총 6개의 환자로부터 정상 유방 상피조직 세포와 암세포를 구입하여 실험에 이용하였다. 인체조직 사용의 모든 규정은 가톨릭대학교 기관윤리 위원회의 규정을 준수하여 실험을 진행하였다.

2.세포 배양

실험에 이용된 모든 세포주의 배양에는 10%의 소혈청이 포함된 DMEM 배양액을 사용하였다. 37℃ 가 유지되는 항온 배양기 내에서 5% CO₂ 농도를 유지시킨 환경에서 세포주를 배양하였다. 외부유전체의 세포 내 주입시에는 35mm² 배양접시를 이용하여 실시하였으며 그 외의 모든 상황에서는 100mm² 배양접시를 이용하여 세포주를 배양 및 유지하였다.

3. 외부 유전체 전달자 제작

총 4가지의 플라스미드 형태와 3가지의 마이크로 RNA 형태의 외부유전체가 세포내 주입법을 통하여 실험에 이용되었다. 3가지의 마이크로 RNA의 경우 바이오니어사의 제품을 구입하여 이용하였으며, 4가지 플라스미드는 BD Bioscience사에서 구입한 pEGFP-C1 전달체를 기본으로 하여 형광단백질 후방에 p130Cas 및 p130Cas의 3` 말단을 삽입하는 방법으로 제작하였으며, 마이크로 RNA의 정확한 결합지점을 확인하기 위한 실험을 위하여 마이크로 RNA의 결합예상지점의 염기서열을 변형시킨 돌연변이 p130Cas의 3` 말단을 삽입된 리포터 플라스미드 2종류를 제작하였다(miR-362-3p/329용, miR-24-3p용). 플라스미드 형태의 외부유전체의 대조군으로는 pEGFP-C1 전달체를 사용하였다.

또한, 도 1에는 마이크로 RNA의 결합 예상 지점 확인을 위한 제작한 외부 유전체의 구조물에 대한 모식도를 나타내었다.

4.외부 유전체의 세포 내 주입

실험에 이용된 모든 외부 유전체의 주입에는 Invitrogen 사에서 나온 리포펙타민 2000을 이용하여 진행하였다. 각각의 외부유전체를 실험에 따라 일정량을 제조사의 매뉴얼대로 리포펙타민 2000으로 처리한 후 세포배양액에 혼합하는 방법을 통하여 외부 유전체를 세포 내로 주입하였다.

5. p130Cas 과발현 세포주 제작

마이크로 RNA의 발현이 세포에 미치는 영향이 p130Cas의 조절에 의한 것인지를 확인하기 위한 실험을 위하여 p130Cas가 과발현되는 세포주와 대조군 세포주를 제작하였다. 3` 말단을 포함하지 않은 p130Cas가 과 발현된 외부 유전체를 제작하여 세포 내로 리포펙타민 2000을 이용해 주입 후 G418 항생제처리를 통하여 제대로 주입된 세포를 선별하였다. 항생제가 포함된 배양액 내에서의 2주간의 배양을 통하여 살아남은 콜로니 형태의 세포를 수득하여 단일 외부유전체를 가진 세포주를 확립하였으며, 도 2에는 제작된 p130Cas 과발현 세포주와 대조군에 대한 사진 등을 도시하였다.

6. 세포 및 조직 내 유전자 발현 변화 분석

구입한 조직 및 실험에 이용된 세포의 유전자 발현 및 변화양상의 분석을 위하여 Invitrogen 사의 트라이졸 용액을 이용하였다. 조직분쇄 및 세포포집 후 트라이졸 용액을 처리하여 mRNA를 수득한 후 Toyobo사의 cDNA 합성 Kit를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 이용하여 real-time quantitative PCR 방법을 통해 실험군 및 대조군의 유전자 발현 및 변화양상을 정량화하였다.

7. 세포 내 단백질 발현 변화 분석

표집된 세포를 RIPA용액을 이용하여 세포내의 단백질을 수득한 후 동일한 양의 전체 단백질을 SDS-PAGE 젤 내에서 전기영동을 통하여 크기에 따라 분리하였다.

분리된 단백질 중 확인하고자 하는 특정사이즈 부분을 PVDF 막으로 옮긴 후 해당 단백질의 항체를 PVDF 막에 붙였다. 특정단백질을 발현 정도를 정량화할 수 있는 2차 항체를 처리한 후 X-ray 필름에 특정 단백질에서 조사되는 빛을 기록하여 관찰하고자 하는 단백질의 발현 변화를 정량적으로 분석하였다.

8. 세포 활성도 분석

마이크로 RNA가 p130Cas 조절을 통하여 암세포주에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT assay를 통하여 대조군과 실험군의 세포활성도를 측정하였다. 대조군과 실험군 세포를 동일한 양으로 96-well 배양접시에 접종 후 2일간 배양 후 세포 활성도를 측정하여 정량화 하였다.

9. 세포의 약물반응성 분석

유방암 세포주에 항암제로 작용하는 타목시펜을 이용하여 마이크로 RNA를 처리한 실험군과 대조군에서의 약물반응성 차이를 분석하였다. 타목시펜을 배양액에 10μM의 농도로 희석하여 처리한 후 2일간 배양하였다. 2일간 배양 후 MTT assay를 통하여 살아있는 세포를 측정하여 세포의 약물 반응성을 정량화하였다.

10. 세포의 콜로니 형성능 분석

암세포주의 초기 암발생 능력 정도를 측정할 수 있는 콜로니 형성능 분석을 통하여 마이크로 RNA 가 세포주의 초기 암발생 능력에 영향을 줄 수 있는지를 확인하였다. 대조군과 실험군을 각각 6-well 배양접시에 세포를 500개씩 접종한 후 3주간 배양을 하였다. 배양접시에 콜로니 형성을 확인 후 크리스탈 바이올렛 염색을 통하여 콜로니 개수를 정량화하였다.

11. 세포의 종양 형성능 분석

마이크로 RNA의 체내에서의 암 발달에 미치는 영향을 알아보고자 xenograft assay를 실시하여 체내에서의 암 발달 변화를 확인하였다. 면역 결핍성 누드 마우스 피하에 대조군과 실험군의 세포를 2×10⁶ 개 주입한 후 종양 형성을 관찰하였다. 주입 후 4주 후 종양을 수거하여 크기 비교를 통하여 마이크로 RNA의 체내에서의 암발달에 미치는 영향을 정량화하였다.

12. 세포 이동성 분석

세포의 이동성 변화를 관찰하기 위하여 3가지 방법의 실험을 진행하였다.

직접적인 세포의 이동성 확인을 위하여 Scratch wound healing assay를 진행하였으며, 체내에서의 암세포의 이동과 유사한 환경을 실험관 내에서 확인할 수 있는 migration assay 와 체내에서의 세포이동의 기작 중에 하나인 침습성 변화를 확인할 수 있는 Invasion assay를 진행하였다.

Scratch wound healing assay의 경우 대조군과 실험군의 세포주를 35-mm² 배양접시에서 배양 후 90%이상의 밀도로 배양이 되었을 때 200μl 파이펫 팁을 이용하여 긁어내는 형태로 배양접시 중간에 있는 세포들을 일정한 간격으로 제거 한 후 저농도의 혈청이 포함된 (1%) 배양액을 첨가 후 48시간 뒤에 줄어든 간격을 측정하여 세포의 이동성을 정량화하였다.

migration assay의 경우 BD Bioscience사에서 나온 migration chamber를 이용하여 측정하였다. migration chamber상단에 3 x 10⁴ 개의 세포를 접종한 뒤 24시간 뒤에 chamber 하단으로 이동한 세포의 수를 염색을 통하여 확인한 후 정량하였다.

invasion assay의 경우 동일한 챔버 상단에 세포를 접종하기 전 매트리겔(matrigel) 코팅을 실시하였다. 코팅이 된 이동 챔버(migration chamber) 상단에 1 x 10⁵ 개의 세포를 접종한 뒤 24시간 뒤에 챔버 하단으로 이동한 세포의 수를 염색을 통하여 확인한 후 정량하였다.

실시예 1: 마이크로 RNA 처리 후 항암제 내성관련 유전자인 p130Cas 발현저하

유방암 유래 세포주인 MCF7 세포주에 리포펙타민 2000을 이용하여 마이크로 RNA를 세포내로 주입하여 과다 발현을 유도하였다. 마이크로 RNA의 과다발현이 유도된 세포를 48시간 배양하였다. 마이크로 RNA가 과다 발현된 상태에서 배양된 MCF7 세포주를 수거하여 세포내에 단백질을 분리해 내어 특정 단백질의 발현양을 정량화 할 수 있는 웨스턴 실험법을 이용하여 세포내에 p130Cas의 발현양의 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 3에 도시하고 있는 바와 같이, 마이크로 RNA의 과다발현이 일어난 MCF7 3가지 실험군에서 모두 p130Cas의 단백질 발현이 저해되어 있는 것을 확인하였다. 대조군과 비교하여 3가지 실험군 모두 40% 정도 저하된 p130Cas의 단백질 발현을 보였으며 반복실험을 통하여 유의성을 확인하였다.

또한, 마이크로 RNA의 영향이 p130Cas의 mRNA에 어떠한 영향을 미쳐서 p130Cas 의 발현을 저해하는지 확인하고자 하였다.

마이크로 RNA의 영향은 크게 두 가지 형태로 표적 mRNA의 발현을 저해 시키는데, 그 중 직접적으로 표적 mRNA 파괴시키는 것인지를 확인하기 위하여 마이크로 RNA를 MCF7 내로 주입하여 과다발현을 유도한 시험군에서 p130Cas mRNA의 발현정도를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 것처럼, 3가지 마이크로 RNA 모두 실험군과 대조군에서 유의적인 차이를 발견하지 못하였다. 3가지 마이크로 RNA를 처리한 실험군 모두에서 실험적으로 발생할 수 있는 오차범위 이내의 차이만을 나타내었다.

따라서, 이러한 결과를 바탕으로 마이크로 RNA의 역할이 mRNA의 직접적인 파괴에 관여하는 것이 아니라는 것을 확인하였다.

실시예 2: 마이크로 RNA 의 직접적인 p130Cas mRNA 와의 결합을 통한 p130Cas 의 발현 저해 확인

마이크로 RNA의 p130Cas mRNA와의 정확한 결합지점을 확인하기 위하여 리포터를 제작하여 실험을 진행하였다. In silico analysis를 통하여 결합이 예상되는 지점을 추정하였다. 추정된 부분이 포함된 p130Cas의 3`말단이 포함된 리포터를 제작하여 발현저해를 확인하고, 추정된 부분의 염기서열을 변형시킨 리포터를 제작하여 추정한 부분이 제대로 마이크로 RNA가 결합을 못하는지를 확인하였다. 제작된 플라스미드를 이용하여 마이크로 RNA가 결합을 한 경우 발현이 저해되는 리포터 단백질인 GFP 발현정도를 웨스턴 실험을 통하여 관찰하고 정량화 하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 3가지 마이크로 RNA모두 In silico analysis를 통하여 p130Cas mRNA와 결합할 것이라고 예상한 지점에 직접적으로 결합하여 표적단백질의 발현을 저해하는 것을 확인하였고, 변형된 리포터에서는 그 효과가 저해되는 것을 확인하였다.

3가지 마이크로 RNA모두 정량화 결과 40% 정도의 발현저하를 나타내었으며 통계적으로 유의하다는 것이 확인하였다. 변형된 리포터에서는 통계적으로 유의한 변화가 관찰 되지 않았다.

실시예 3: p130Cas 의 발현 저하에 따른 세포활성도의 저하 확인

p130Cas의 경우 세포 내에서 다양한 신호전달 단계에서 중간 전달자의 역할을 담당하고 있고 세포의 활성도를 증가시키는 역할도 가지고 있다고 알려져 있다.

따라서, 마이크로 RNA를 처리한 실험군에서, 대조군에 비하여 p130Cas의 발현이 저하되는 것이 세포의 활성도에 미치는 영향을 실험을 통해서 알아보고자 하였다.

3가지의 마이크로 RNA를 MCF7에 리포펙타민을 이용하여 세포 내에서의 과다발현을 유도한 후 48시간 동안 배양하였다. 배양한 세포에 MTT assay를 통하여 세포활성도 변화를 비교하였다.

그 결과, 도 6에 도시한 바와 같이, 3가지 마이크로 RNA 중 miR-362-3p 와 329 가 과다 발현된 실험군의 경우, 대조군과 비교하여 약 20%정도의 저하된 세포 활성도를 나타내었고 통계적으로 유의한 차이를 보였다.. 하지만 마이크로 RNA중 miR-24-3p에서는 세포활성도가 약간 저해되는 경향성을 보였으나 통계적으로 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 각각의 마이크로 RNA가 세포의 활성도에 미치는 영향에는 차이가 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4 : 마이크로 RNA 의 과다발현에 의한 MCF 세포주의 콜로니 형성능의 저하 확인

암 발생 과정 중에 초기의 종양 형성 능력과 밀접한 관련이 있는 세포의 콜로니 형성실험을 통하여 마이크로 RNA가 세포의 콜로니 형성에 미치는 영향을 관찰 하였다.

대조군과 3가지 마이크로 RNA가 과다 발현된 MCF7 세포주를 이용하여 실험을 진행하였다. 대조군과 실험군세포를 6-well 배양접시에 500개씩 접종하여 3주간 배양을 통하여 콜로니 형성결과를 관찰하였다. 형성된 콜로니는 크리스탈 바이올렛 용액을 이용하여 염색하여 형성된 콜로니 개수를 측정하여 콜로니 형성능을 정량화 하였다.

실험결과, 대조군 MCF7 세포주에서는 마이크로 RNA의 과다 발현 유도 시 50~30% 정도의 콜로니 형성능이 저하되는 것을 확인하였다(도 7). 모든 실험군에서 통계적 유의성을 확인하였다.

추가로, 실제적으로 이런 암세포가 가진 능력저하가 마이크로 RNA 가 p130Cas를 저하시켜서 일어나는 것인지를 확인하기 위하여 마이크로 RNA 의 결합부위인 3`말단이 제거된 p130Cas가 과다 발현된 세포주를 이용하여 동일한 실험을 진행해 보았다.

그 결과, 마이크로 RNA의 영향을 받지 않는 p130Cas가 과다 발현된 MCF7의 경우 마이크로 RNA 가 과다발현 되더라도 콜로니 형성능에 영향을 미치지 않는 것으로 확인되어 마이크로 RNA의 p130Cas의 발현 저하가 콜로니 형성능 저하에 영향을 미친 것으로 확인할 수 있었다(도 7).

실시예 5 : p130Cas 의 발현 저하에 따른 약물반응성 변화

또한, 유방암 치료에 이미 이용하고 있는 항암제의 한 종류인 타목시펜을 이용하여 마이크로 RNA의 과다 발현이 세포의 약물반응성에 미치는 영향을 관찰하였다.

항암제 내성을 가진 MCF7세포주에 p130Cas가 상대적으로 강하게 발현되는 것은 기존에 알려진 사실이므로 마이크로 RNA처리를 통하여 p130Cas의 발현저하를 유도할 경우 세포의 약물반응성에도 영향을 미칠 것이라 추정하였다.

실험 결과, 추정대로 마이크로 RNA를 과다 발현시킨 3가지의 실험군에서 대조군과 비교하여 타목시펜을 처리할 경우, 10% 정도 더 높은 세포치사율을 보였다(도 8)

실험군과 대조군에 10μM 농도의 타목시펜을 배양액에 첨가하여 48시간 동안 처리한 다음 타목시펜을 처리하지 않고 기른 세포주와 생존률을 비교하였을 경우 대조군의 경우 40%정도의 치사율을 보인 반면, 실험군의 경우 50% 정도의 치사율을 나타내었다.

그리고 이 결과가 마이크로 RNA의 과다발현에 의한 p130Cas의 발현 저하가 직접적인 원인인지 확인을 위하여 마이크로 RNA의 결합부위인 3`말단이 제거된 p130Cas가 과다 발현된 세포주를 이용하여 동일한 실험을 진행해 보았다.

그 결과, 마이크로 RNA의 영향을 받지 않는 p130Cas가 과다 발현된 MCF7의 경우 마이크로 RNA의 과다발현을 하더라도 약물반응성에서 유의적인 차이를 나타내지 않는 것으로 확인되었다.

이러한 결과는 3가지 마이크로 RNA의 세포 내 과다 발현이 직접적으로 p130Cas의 발현을 저해하여 약물반응성에 변화를 야기한 것으로 확인할 수 있으며 이러한 결과는 유방암 치료에 이용되는 항암치료에서 항암제의 내성을 극복하거나 사용 효율성을 높이는 방법에 응용될 수 있음을 시사한다.

실시예 6 : p130Cas 의 발현 저하에 따른 세포이동성 변화

세포의 이동성을 실험하는 방법 중 하나인 Scratch wound healing assay를 통하여 마이크로 RNA가 과다 발현된 세포에서 세포의 이동성에 나타나는 변화를 관찰 하였다.

그 결과, 도 9에 도시한 바와 같이, 3가지의 마이크로 RNA 세포 내 주입을 통해 과다 발현된 MCF7을 이용한 실험군에서 세포의 이동성이 대조군에 비하여 저하된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 대조군 및 실험군 세포를 동일한 양으로 배양접시에 접종한 다음, 동일한 면적의 세포를 제거하여 빈공간 형성 후, 세포가 제거된 빈 공간으로 이동한 인접 세포의 이동 거리를 측정하여 정량화한 결과, 마이크로 RNA가 과다 발현된 세포주에서 3가지 실험군 모두 30%~40% 정도 대조군에 비하여 저하된 세포 이동성을 보였으며, 반복실험을 통하여 확인한 결과 통계적으로 유의한 이동성 차이를 나타내었다.

이러한 결과가 마이크로 RNA의 과다발현에 의한 p130Cas의 발현 저하가 직접적인 원인인지 확인을 위하여 마이크로 RNA의 결합부위인 3`말단이 제거된 p130Cas가 과다 발현된 세포주를 이용하여 동일한 실험을 진행해 보았다.

그 결과, 마이크로 RNA의 영향을 받지 않는 p130Cas가 과다 발현된 MCF7의 경우 마이크로 RNA의 과다발현을 하더라도 세포의 이동성에서 유의적인 차이를 나타내지 않는 것으로 확인되었다.

이러한 결과는 3가지 마이크로 RNA의 세포 내 과다 발현이 직접적으로 p130Cas의 발현을 저해하여 세포의 이동성에 변화를 야기한 것으로 확인할 수 있다.

추가로, 마이크로 RNA가 세포의 이동성 및 침습성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 migration assay와 invasion assay를 실시하였다.

3차원적 세포의 이동성을 실험할 수 있는 이동 챔버(migration chamber)를 이용해 실험을 진행하였다. 다공성을 가진 막구조 상단에 실험군과 대조군의 세포의 동일한 양을 접종 후 막 구조의 구멍을 통과하여 하단으로 이동한 세포만 염색하여 이동한 세포의 수를 측정하여 세포의 이동을 정량화하였다.

migration assay의 경우 대조군과 비교하여 3가지 실험군에서 30~50% 정도 감소된 세포의 이동성을 확인할 수 있었다(도 10).

invasion assay의 경우에도 동일한 이동 챔버(migration chamber) 상단에 세포 접종전 매트리겔 매트릭스(matrigel matrix)를 형성하여 체내의 세포 결합조직과 비슷한 환경을 형성한 다음 매트릭스를 침습하여 막 구조 하단으로 내려온 세포를 염색하여 수를 측정하여 정량화하였다.

그 결과, migration assay와 마찬가지로 invasion assay에서도 30~50% 정도의 세포 이동성의 저하를 관찰할 수 있었다.

이러한 결과가 마이크로 RNA의 과다발현에 의한 p130Cas의 발현 저하가 직접적인 원인인지 확인을 위하여 마이크로 RNA의 결합부위인 3`말단이 제거된 p130Cas가 과다 발현된 세포주를 이용하여 동일한 실험을 진행해 보았다.

그 결과, 마이크로 RNA의 영향을 받지 않는 p130Cas가 과다 발현된 MCF7의 경우 마이크로 RNA의 과다발현을 하더라도 세포의 이동성에서 유의적인 차이를 나타내지 않는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 3가지 마이크로 RNA의 세포 내 과다 발현이 직접적으로 p130Cas의 발현을 저해하여 세포의 이동성 및 침습성의 변화를 야기한 것으로 확인할 수 있다.

실시예 7 : p130Cas 의 발현 저하에 따른 체내에서의 종양형성능 변화

마이크로 RNA가 실제로 체내에서 암 발달에 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 이종이식 분석(xenograft assay)을 실시하였다. 대조군과 3가지 마이크로 RNA를 과다발현 시킨 실험군 세포의 동일한 양(2×10⁶ 개)을 누드마우스의 피하에 주입한 후 4주간 종양 형성 여부를 관찰하였다. 일정한 크기의 종양이 확인되는 4주후 실험 동물 내에서 형성된 종양을 수거하여 종양의 무게 분석을 통하여 실험군과 대조군의 차이를 정량화하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 3가지의 실험군 세포가 형성한 종양의 크기가 대조군에 비하여 85~70% 가량 줄어들어 있는 것을 확인하였으며, 통계처리를 통하여 유의적인 차이를 가지는 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 통하여 마이크로 RNA의 과발현을 통해 p130Cas의 변화는 암세포의 체내에서 종양 형성 능력이 저하를 유도할 수 있는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> A Use of microRNA for Ddiagnosing and Treating Brest Cancer <130> PN1408-259 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> miR24 sequence <400> 1 gacaaggacg acuugacucg gu 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> miR362 sequence <400> 2 acuuaggaac uuauccacac aa 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> miR329 sequence <400> 3 uuucuccaau ugguccacac aa 22

Claims (14)

1. 마이크로 RNA-24(miR24) 또는 마이크로 RNA-362(miR362)를 유효성분으로 포함하는, p130Cas가 활성화되는 암에 대한 항암용 약학적 조성물에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 서열로 구성되는 마이크로 RNA-24(miR24) 또는 서열번호 2로 표시되는 마이크로 RNA-362(miR362)는 p130Cas의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 p130Cas가 활성화되는 암은 유방암, 피부암, 골암, 전립선암, 간암, 폐암, 비소세포 폐암, 뇌암, 후두암, 담낭암, 췌장암, 직장암, 부갑상선암, 갑상선암, 부신암, 신경조직암, 두경부암, 결장암, 위암, 기관지암으로 구성되는 군에서 선택되는 1종 이상의 암질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 p130Cas가 활성화되는 암은 유방암인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 마이크로 RNA는 마이크로 RNA-24(miR24) 또는 마이크로 RNA-362(miR362)가 발현되도록 도입된 벡터 형태로 상기 조성물에 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 마이크로 RNA-24(miR24) 또는 마이크로 RNA-362(miR362)를 유효성분으로 포함하는, 항암제 타목시펜(Tamoxifen)에 대한 내성 억제용 약학적 조성물에 있어서, 상기 마이크로 RNA-24(miR24) 또는 마이크로 RNA-362(miR362)는 각각 서열번호 1 또는 2로 표시되는 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 제10항에 있어서,
    상기 마이크로 RNA는 마이크로 RNA-24(miR24) 또는 마이크로 RNA-362(miR362)가 발현되도록 도입된 벡터 형태로 상기 조성물에 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 삭제
13. 다음 단계를 포함하는 유방암 치료용 물질의 스크리닝 방법:
    (a) 마이크로 RNA-24(miR24) 또는 마이크로 RNA-362(miR362)를 발현하는 동물세포에 항암 후보 물질을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 동물세포에서 항암 후보 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 마이크로 RNA-24(miR24) 또는 마이크로 RNA-362(miR362) 발현이 촉진되는 경우의 물질을 유방암 치료용 물질로 선택하는 단계에 있어서, 상기 방법은 추가로 항암 후보 물질 유무에 따른 p130Cas의 발현을 확인하고, p130Cas의 발현을 억제하는 경우의 물질을 유방암 치료용 물질로 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 삭제

Images