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KR102490206B1 - 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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KR102490206B1
KR102490206B1 KR1020210039150A KR20210039150A KR102490206B1 KR 102490206 B1 KR102490206 B1 KR 102490206B1 KR 1020210039150 A KR1020210039150 A KR 1020210039150A KR 20210039150 A KR20210039150 A KR 20210039150A KR 102490206 B1 KR102490206 B1 KR 102490206B1
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prostatic hyperplasia
extract
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prostate
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이유현
김소혁
이정윤
김석호
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수원대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 겨우살이 추출물이 독성이 거의 없고, 전립선 비대증에서 증가된 인자의 수준 감소, 전립선 증식 억제 및 전립선 크기 감소 효과를 나타내며, 전립선 상피조직을 개선하는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 겨우살이 추출물은 전립선 비대증의 예방, 개선용 건강기능식품의 소재 또는 치료소재로 이용될 수 있다.

Description

겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, ameliorating or treating benign prostatic hyperplasia comprising Viscum album extract as an active ingredient}
본 발명은 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
전립선은 남성의 생식력에 관여하는 주요 남성 생식선으로 정자 활성화 및 수용 능력과 관련이 있으며 전립선염, 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia, BPH), 전립선암과 같은 양성 및 악성 질병의 직접적인 표적이 된다. 비뇨기과 질환의 발병률은 중년 남성에서 증가하며 나이가 들면서 유병률이 증가되어지는데, 전립선 비대증은 50세 이상 남성에게서 발생하는 일반적인 질환 중 하나로 전립선의 크기가 커지는 임상적인 특징을 가지고 있다.
전립선 비대증으로 전립선의 부피가 커지게 되면 요도를 막아 요도의 저항성의 증가 및 방광폐쇄의 원인이 될 수 있다. 전립선 비대증의 가장 흔한 증상은 하부요로증상(lower urinary tract symptoms, LUTS)이며, 하부요로증상은 배뇨의 빈도 증가, 야뇨증 및 약한 소변 등을 포함하는데 이런 증상은 전립선의 비대로 인한 방광 목, 요도의 구조적 왜곡 및 기능적 이상으로 발생하게 된다. 환자는 전립선 비대로 생긴 하부요로증상에 의해 밤에 잦은 배뇨 및 긴급뇨를 경험하며 신체적, 정신적 건강에 심각한 영향을 미치게 된다.
전립선 비대증은 주로 전립선 전이 영역 내에서 평활근과 상피세포의 증식을 특징으로 하며, 세포의 유의적인 성장과 관련하여 조직학적 변화를 특징으로 한다. 전립선 세포의 과도한 성장은 세포증식과 세포사멸의 불균형으로 인해 발생하는 것으로 알려져 있다. 실제로 최근 연구에 따르면 전립선 상피세포의 세포사멸의 수준이 전립선 비대를 유발한 군보다 정상 군에서 높았다는 연구가 보고되었다. 세포사멸 인자는 Bcl-2 protein family로 알려져 있는데, 친-세포사멸 인자인 Bax와 항-세포사멸 인자인 Bcl-2가 포함된다. 감소된 Bax와 증가된 Bcl-2는 세포사멸을 억제하여 전립선 비대증을 초래하게 된다.
아직 전립선 비대증에 대해 완전히 밝혀지지는 않았지만 전립선의 형태 변화와 함께 호르몬 신호전달, 세포증식 및 세포사멸을 포함한 여러 원인이 있는 질병으로 보여진다. 전립선 비대증의 기전에 대해서 연구가 계속되고 있으며, 안드로겐 수용체(androgen receptor, AR) 경로가 전립선 비대증 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 안드로겐 중 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)은 5-알파 환원효소(5-alpha reductase, 5AR)에 의해 테스토스테론(testosterone)으로부터 전환되어 생성된다. 테스토스테론과 DHT는 모두 AR에 결합하는데, DHT가 테스토스테론에 비하여 약 2-10배 더 큰 친화도로 수용체에 결합하며 수용체에서 더 느리게 분리되고 분해에 강한 저항성을 가지는 AR결합을 생성한다. 테스토스테론과 DHT는 AR과 결합하여 표적 유전자의 활성화를 유도하며 세포사멸의 억제와 세포증식의 유도로 전립선 비대증을 촉진하게 된다.
안드로겐 전환효소인 5AR은 세가지 이성질체가 있는 것으로 알려져 있다. 이성질체 중 type 1형인 5AR1은 간 및 피부에서 주로 발견되며 type 2형인 5AR2은 전립선 조직에서 발견된다. 이성질체 중 type 3형인 5AR3는 뇌와 췌장에서 발견되며 전립선암에서도 발견된다. 특히, 5AR2는 전립선 비대 조직에서 과발현 되는 경향이 있다.
5-알파 환원효소 억제제(5-alpha reductase inhibitor, 5ARI)는 5AR을 저해하여 테스토스테론에서 DHT의 생성을 막아 전립선 비대증을 억제한다. 피나스테리드(finasteride)와 같은 5ARI를 전립선 비대증의 치료를 위해 사용하는데 전립선의 5AR2의 수준을 80-90% 저해하는 것으로 나타났다. 그러나 피나스테리드는 내분비 교란 물질과 유사하게 작용하여 지속적으로 성적인 부작용을 일으키고 안드로겐의 농도를 변화시킬 수 있다. 따라서 상대적으로 부작용이 적은 천연 물질을 이용하여 전립선 비대증을 개선하는 시도가 필요하다.
한국 겨우살이는 겨우살이과(Loranthaceae)에 속하고, 참나무, 팽나무, 밤나무 등에 기생하는 늘푸른떨기나무로 학명은 Viscum albim var. coloratum이며, 우리나라 전역에 분포하고 있다. 특히 우리나라 한방에서 겨우살이를 요통, 고혈압, 유산 방지, 치통 등에 대한 약제로 사용해 왔다. 그러나, 아직까지 남성 비뇨기과 질환과 관련된 연구는 미흡하다.
이에, 본 발명자들은 부작용이 없고 안전성이 높으며, 전립선 비대증에 효과적인 천연 소재를 개발하기 위해 노력한 결과, 겨우살이 추출물이 독성이 거의 없고, 전립선 비대증 in vitro 또는 in vivo 모델에서 테스토스테론, DHT, 5AR2 및 AR의 수준 감소, 전립선 증식 억제 및 전립선 크기 감소 효과를 나타내며, 전립선 상피조직을 개선하는 것을 확인하였다. 이에 상기 겨우살이 추출물을 전립선 비대증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다는 점을 밝힘으로써, 본 발명의 출원에 이르렀다.
대한민국 공개특허 제10-2016-0010962호
Afify, H., Amira M.A.Y., Hanaa M., Abdel-Rahman, Shady A., and Amany A. Azouz. 2020. "The Modulatory Effects of Cinnamaldehyde on Uric Acid Level and IL-6/JAK1/STAT3 Signaling as a Promising Therapeutic Strategy against Benign Prostatic Hyperplasia." Toxicology and Applied Pharmacology 402: 115-122. Jin, B.R., Chung K.S., Kim H.J., and An H.J.. 2019. "Chinese Skullcap (Scutellaria Baicalensis Georgi) Inhibits Inflammation and Proliferation on Benign Prostatic Hyperplasia in Rats." Journal of Ethnopharmacology 235(October 2018): 481-488. Lin, G.G., and Scott J.G. 2012. "Androgen Receptor and Growth Factor Signaling Cross-Talk in Prostate Cancer Cells." Endocrine-Related Cancer 100(2): 130-34. Shirakawa, T., Okada H., Acharya B., Zhang Z., Hinata N., Wada Y., Uji T., Kamidono S., and Gotoh A. 2004. "Messenger RNA Levels and Enzyme Activities of 5 Alpha-Reductase Types 1 and 2 in Human Benign Prostatic Hyperplasia (BPH) Tissue." Prostate 58(1): 33-40. Wijerathne, C.U.B., Park H.S., Jeong H.Y., Song J.W., Moon O.S., Seo Y.W., Won Y.S., Son H.Y., Lim J.H., Yeon S.H., and Kwun H.J. 2017. "Quisqualis Indica Improves Benign Prostatic Hyperplasia by Regulating Prostate Cell Proliferation and Apoptosis." Biological and Pharmaceutical Bulletin 40(12):2125-2133.
본 발명의 목적은 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 추출물은 독성이 거의 없고, 전립선 비대증에서 증가된 인자, 구체적으로 테스토스테론(testosterone), 디하이드로테스토스테론(dihydrotestesterone, DHT), 5-알파 환원효소2(5-alpha reductase2) 및 안드로겐 수용체(androgen receptor, AR)의 수준 감소, 전립선 증식 억제 및 전립선 크기 감소 효과를 나타내며, 전립선 상피조직을 개선하는 것을 확인하였다. 이에 본 발명에 따른 겨우살이 추출물은 전립선 비대증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 추출물의 제조방법을 모식화한 도이다.
도 2는 전립선 비대증 in vitro 모델로 BPH-1 세포에서 본 발명의 겨우살이 99.9% 메탄올 수용액 추출물 및 6종의 식품 소재 추출물, 석창포(Acorus gramineus), 브로콜리(Brassica oleracea var. italica), 복분자(Rubus coreanus Miq), 조릿대(Sasa borealis (Hack.) Makino), 잇꽃(Carthamus tinctorius L) 및 해당화(Rosa rugosa Thunb . ) 99.9% 메탄올 수용액 추출물 각각의 처리에 의한 세포 생존율(cell viability) 변화를 확인한 도이다.
도 3은 전립선 비대증 in vitro 모델로 BPH-1 세포에서 본 발명의 겨우살이 99.9% 에탄올 수용액 추출물(도 3A), 겨우살이 30% 에탄올 수용액 추출물(도 3B) 및 겨우살이 열수 추출물(도 3C) 각각의 처리에 의한 세포 생존율 변화를 확인한 도이다.
도 4는 전립선 비대증 in vitro 모델로 BPH-1 세포에서 본 발명의 겨우살이 30% 에탄올 수용액 추출물(VA30E) 처리에 의한 안드로겐 수용체(androgen receptor, AR) mRNA 발현 변화를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 전립선 비대증 in vivo 모델의 제작 및 VA30E 투여 방법을 모식화한 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 전립선 비대증 in vivo 모델에서 VA30E 투여 후 전립선 내 테스토스테론(testosterone) 수준 변화를 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 전립선 비대증 in vivo 모델에서 VA30E 투여 후 전립선 내 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT) 수준 변화를 확인한 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 전립선 비대증 in vivo 모델에서 VA30E 투여 후 전립선 내 5-알파 환원효소2(5-alpha reductase2, 5AR2) 수준 변화를 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 전립선 비대증 in vivo 모델에서 VA30E 투여 후 전립선 내 Bcl-2 mRNA 발현(도 9A), Bax mRNA 발현(도 9B) 및 Bax/Bcl-2 비율(도 9C) 변화를 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 전립선 비대증 in vivo 모델에서 VA30E 투여 후 전립선 조직(도 10A), 전립선 무게(도 10B) 및 전립선 비율(도 10C) 변화를 확인한 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 전립선 비대증 in vivo 모델에서 VA30E 투여 후 전립선 조직의 조직학적 변화를 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 용어 "예방" 은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "치료"는 (ⅰ) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (ⅱ) 질환 또는 질병의 경감; 및 (ⅲ) 질환 또는 질병의 제거를 의미한다.
본 발명은 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 유효성분인 겨우살이 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:
1) 겨우살이에 추출용매를 가하여 추출하는 단계; 및
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1)의 겨우살이는 재배한 것 또는 시판되는 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 또한, 상기 겨우살이 추출물은 겨우살이의 뿌리, 줄기, 꽃, 잎, 열매 및/또는 종자를 사용할 수 있고, 구체적으로, 줄기 및/또는 잎을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물을 사용할 수 있다. 상기 알코올로는 C1 내지 C4의 저급 알코올을 사용할 수 있고, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 사용할 수 있다. 구체적으로, 추출용매는 물 및 에탄올의 혼합물, 즉 에탄올 수용액을 사용할 수 있고, 보다 구체적으로 10 내지 99.9% 에탄올 수용액을 사용할 수 있으며, 보다 더 구체적으로 20 내지 40% 에탄올 수용액을 사용할 수 있다. 추출방법으로는 초음파추출, 진탕추출, Soxhelt 추출 또는 환류 추출을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 추출용매를 세척하고 잘 건조된 겨우살이 분량의 1 내지 15배 첨가하여 추출할 수 있고, 구체적으로 2 내지 10배 첨가하여 추출할 수 있으며, 보다 구체적으로 3 내지 6배 첨가하여 추출할 수 있다. 추출 온도는 20 내지 130℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 추출 시간은 10분 내지 72시간일 수 있고, 1시간 내지 48시간일 수 있으며, 12시간 내지 30시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러 추출 횟수는 1 내지 5회일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 2)를 거친 후 하기의 단계들을 추가적으로 포함할 수 있다:
3) 단계 2)의 여과물을 감압 농축하는 단계; 및
4) 단계 3)의 농축물을 건조하는 단계.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 단계 3)의 감압농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 겨우살이 추출물은 하기 특성을 가지며, 하기 특성을 통해 전립선 비대증을 예방 또는 치료할 수 있다:
1) 전립선 비대증 관련 인자 감소;
2) 전립선의 증식 억제; 및
3) 전립선 크기 감소.
구체적으로, 상기 겨우살이 추출물은 전립선 비대증 관련 인자, 예컨대, 전립선 비대증에서 증가하는 인자인 테스토스테론(testosterone), 디하이드로테스토스테론(dihydrotestesterone, DHT), 5-알파 환원효소2(5-alpha reductase2) 및/또는 안드로겐 수용체(androgen receptor, AR)의 수준을 감소시켜, 전립선 비대증을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, 상기 겨우살이 추출물은 전립선 조직 내 친-세포사멸 단백질/항-세포사멸 단백질의 비율, 예컨대 Bax/Bcl-2의 비율을 증가시켜 세포사멸을 유도하여, 전립선의 증식을 억제 및 전립선 크기를 감소시킴으로써, 전립선 비대증을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 메탄올 수용액 추출물, 에탄올 수용액 추출물 및 열수 추출물을 제조하였다.
또한, 본 발명자들은 전립선 비대증 in vitro 모델에서 겨우살이 및 전립선 특이항원(Prostate specific antigen, PSA)의 발현 수준을 저하하는 것으로 알려진 6종의 식품 소재 메탄올 수용액 추출물의 세포증식 억제 효과를 비교한 결과, 겨우살이 메탄올 수용액 추출물의 세포증식 억제 효과가 가장 우수함을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 전립선 비대증 in vitro 모델에서 겨우살이 에탄올 수용액 추출물 및 열수 추출물이 세포증식 억제 효과를 나타냄을 확인하였고, 이 중 겨우살이 에탄올 수용액 추출물이 보다 세포증식 억제 효과가 우수하며, 특히 30% 에탄올 수용액 추출물이 세포증식 억제 효과가 가장 우수함을 확인하였다. 또한, 상기 에탄올 수용액 추출물이 안드로겐 수용체 발현을 억제하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 겨우살이 에탄올 수용액 추출물을 투여한 전립선 비대증 in vivo 모델의 전립선에서 전립선 비대증에서 증가하는 인자인 테스토스테론, DHT, 5-알파 환원효소2 수준이 감소하고, 전립선 조직의 세포사멸 유도로 전립선 증식이 억제되고 전립선 크기가 감소하며, 전립선 상피조직 두께가 얇아지고 내강(lumen)이 넓어지는 것을 확인하였다.
아울러, 본 발명자들은 겨우살이 에탄올 수용액 추출물을 투여한 전립선 비대증 in vivo 모델에서 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
따라서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 겨우살이 추출물이 독성이 거의 없고, 전립선 비대증에서 증가된 인자의 수준 감소, 전립선 증식 억제 및 전립선 크기 감소 효과를 나타내며, 전립선 상피조직을 개선하는 것을 확인하였으므로, 본 발명에 따른 겨우살이 추출물은 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제제, 외용제, 좌제 및 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 혼합 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 kg당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 1,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 500 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 겨우살이 추출물의 추출방법 및 추출대상, 특성에 대한 내용은 겨우살이 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 기재된 내용과 동일하므로, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 건강기능식품 조성물의 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
한편, 본 발명자들은 본 발명에 따른 겨우살이 추출물이 독성이 거의 없고, 전립선 비대증에서 증가된 인자의 수준 감소, 전립선 증식 억제 및 전립선 크기 감소 효과를 나타내며, 전립선 상피조직을 개선하는 것을 확인하였으므로, 본 발명에 따른 겨우살이 추출물은 전립선 비대증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 조정제물 또는 정제물 중에 어느 하나를 포함하는 것으로 한다.
상기 건강기능식품 조성물은 남성갱년기 증후근을 예방하거나 개선하기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다.
본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 겨우살이( Viscum album var. coloratum ) 추출물의 제조
<1-1> 겨우살이( Viscum album var. coloratum ) 에탄올 수용액 추출물의 제조
건조 겨우살이(Viscum album var. coloratum)는 지리산농부마을 협동영농조합법인에서 구매하였다. 건조 겨우살이는 도 1의 모식도와 같이 30% 에탄올로 추출하였다.
구체적으로, 건조 겨우살이 줄기와 잎 1 kg을 푸드믹서(Hynedae gajeonup, Incheon, Korea)를 이용하여 분쇄하고, 분쇄한 겨우살이 무게의 4배 분량의 30% 에탄올(w/v)로 24시간 간격으로 실온에서 총 3회 추출하여 12 L의 30% 에탄올 추출물을 얻었다. 추출물을 여과지(Whatman No.1, Whatman International Ltd.)로 여과하고, 감압농축기(N-1200A, EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 60℃에서 농축하였다. 농축한 추출물은 동결건조기(ilShinBioBase)를 이용하여 동결건조하여 겨우살이 30% 에탄올 수용액 추출물 25.93 g을 획득하였다. 획득한 겨우살이 30% 에탄올 수용액 추출물은 VA30E로 명명하였고, 사용할 때까지 -80℃에서 냉동 보관하였다.
<1-2> 겨우살이( Viscum album var. coloratum ) 에탄올 수용액 추출물의 제조
추출 용매로 99.9% 에탄올(w/v)를 가한 것을 제외하고 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 겨우살이 99.9% 에탄올 수용액 추출물을 제조하였다.
<1-3> 겨우살이( Viscum album var. coloratum ) 메탄올 수용액 추출물의 제조
추출 용매로 99.9% 메탄올(w/v)를 가한 것을 제외하고 상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 겨우살이 99.9% 메탄올 수용액 추출물을 제조하였다.
<1-4> 겨우살이( Viscum album var. coloratum ) 열수 추출물의 제조
상기 실시예 <1-1>에 기재된 방법으로 분쇄한 겨우살이 무게의 10배 분량의 증류수로 95℃에서 4시간 동안 2회 연속 추출하여 열수 추출물을 얻었다. 추출물을 여과지(Whatman No.1, Whatman International Ltd.)로 여과하고, 감압농축기(N-1200A, EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 60℃에서 농축하였다. 농축한 추출물은 동결건조기(ilShinBioBase)를 이용하여 동결건조하여 겨우살이 열수 추출물을 획득하였다.
<실험예 1> 전립선 비대증 in vitro 모델에서 겨우살이 추출물의 효능 평가
<1-1> 전립선 비대증 in vitro 모델 제작
전립선 비대증 in vitro 모델로서 전립선 비대증이 있는 백인 남성의 전립선 조직의 상피세포로부터 유래된 세포주인 BPH-1 세포(DSMZ, Braunschweig, Germany)를 사용하였다. 세포는 20% FBS, 1% 항생제-항진균제 용액(antibiotic antimycotic solution), 20 ng/mL 테스토스테론(testosterone), 5 μg/mL 트랜스페린(transferrin), 5 ng/mL 아셀렌산나트륨(sodium selenite), 5 μg/mL 인슐린(insulin)이 함유된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하였다.
<1-2> 전립선 비대증 in vitro 모델에서 겨우살이 및 다양한 소재 추출물 처리 후 세포증식 억제 효능 비교
전립선 비대증은 전립선 상피세포의 증식을 특징으로 한다. 이에, 전립선 비대증에 있어서 겨우살이 및 다양한 소재 추출물의 효능을 알아보기 위하여, 전립선 비대증 in vitro 모델에 겨우살이 및 전립선 특이항원(Prostate specific antigen, PSA)의 발현 수준을 저하하는 것으로 알려진 식품 소재 추출물을 처리하고 MTT 분석을 수행하여 세포증식 정도를 비교하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <1-1>에서 배양한 BPH-1 세포(1 × 104 cell/well)를 96-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 37 ℃, 5% CO2에서 배양하였다. 이후 1 × PBS로 세척하고, 실시예 <1-3>에서 제조한 겨우살이 99.9% 메탄올 수용액 추출물 100 μg/mL를 포함하는 배지를 100 μL씩 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 또한, 비교군의 경우 PSA 발현 수준을 저해하는 것으로 알려진 식품 소재 추출물로 석창포(Acorus gramineus), 브로콜리(Brassica oleracea var. italica), 복분자(Rubus coreanus Miq), 조릿대(Sasa borealis (Hack.) Makino), 잇꽃(Carthamus tinctorius L), 해당화(Rosa rugosa Thunb . ) 99.9% 메탄올 추출물 100 μg/mL 각각을 포함하는 배지를 처리하였다. 비교군으로 사용한 추출물들은 한국 식물 추출물 은행(Cheongju, Korea)에서 구매하였다.
배양 완료 후 2 mg/mL의 MTT 용액(Sigma) 100 μL를 처리하고 2시간 동안 배양하였다. 배지를 모두 제거한 뒤, DMSO 100 μL를 처리하여 포마잔(formazane)을 용해하고, 흡광도 570 nm에서 측정(Epoch, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA)하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 세포 생존율은 무처리 대조군과 비교하여 석창포 추출물 처리군에서 2.71% 감소, 브로콜리 추출물 처리군에서 4.31% 증가, 복분자 추출물 처리군에서 19.30% 증가, 조릿대 추출물 처리군에서 8.43% 증가, 겨우살이 추출물 처리군에서 32.62% 감소, 잇꽃 추출물 처리군에서 9.43% 증가, 해당화 추출물 처리군에서 0.75% 감소하는 것으로 나타났다.
상기 결과를 통해 본 발명의 겨우살이 추출물이 전립선 비대증 치료에 가장 적합한 소재임을 알 수 있다.
<1-3> 전립선 비대증 in vitro 모델에서 추출용매에 따른 겨우살이 추출물 처리 후 세포증식 억제 효능 비교
전립선 비대증에 있어서 추출용매에 따른 겨우살이 추출물의 효능을 알아보기 위하여, 상기 실험예 <1-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 BPH-1 세포에 실시예 <1-1> 및 <1-2>의 겨우살이 에탄올 수용액 추출물, 및 실시예 <1-4>의 겨우살이 열수 추출물 각각을 0, 25, 50, 100, 200 μg/mL로 처리하고 MTT 분석을 수행하여 세포증식 정도를 비교하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 모든 농도에서 실시예 <1-4>의 겨우살이 열수 추출물 처리군이 실시예 <1-1> 또는 <1-2>의 겨우살이 에탄올 수용액 추출물 처리군에 비해 세포증식 억제 효과가 낮은 것을 확인하였다. 겨우살이 에탄올 수용액 추출물 처리군의 경우 25 μg/mL 처리군을 제외하고 모든 농도에서 실시예 <1-1>의 겨우살이 30% 에탄올 수용액 추출물 처리군에서 세포증식 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 겨우살이 추출물 중에서도 겨우살이 30% 에탄올 수용액 추출물이 전립선 비대증에 있어서 보다 우수한 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
<1-4> 전립선 비대증 in vitro 모델에서 겨우살이 추출물 처리 후 안드로겐 수용체(androgen receptor) 발현 평가
테스토스테론(testosterone) 및 디하이드로테스토스테론(dihytrotestosterone, DHT)의 생물학적 활성은 안드로겐 수용체(androgen receptor, AR)와 결합하여 활성화 전사인자로 작용하며 전립선 비대증 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이에, 전립선 비대증에 있어서 겨우살이 추출물의 효능을 알아보기 위하여, 상기 실험예 <1-4>에서 보다 우수한 세포증식 억제 효과를 나타내는 실시예 <1-1>의 겨우살이 에탄올 수용액 추출물을 전립선 비대증 in vitro 모델에 처리하고 qPCR을 수행하여 AR mRNA 발현 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <1-1>에서 배양한 BPH-1 세포(3 × 105 cell/well)를 6-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 37 ℃, 5% CO2에서 배양하였다. 이후 1 × PBS로 세척하고, 실시예 <1-1>의 겨우살이 30% 에탄올 수용액 추출물(VA30E) 0, 100, 200, 500 μg/mL를 포함하는 배지를 1 mL씩 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후 배지를 모두 제거한 뒤 1 × PBS로 세척하였다. 그 다음, Total RNA extraction reagent인 RNAiso(TaKaRa)를 이용하여 BPH-1 세포에서 RNA를 추출하고, T100tmThermalCycler(BioRad)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. qPCR 측정은 HiPi Real-Time PCR 2x Master Mix(ELPIS, Daejeon, Korea)를 사용하여 Light Cyber 96(Roche)로 확인하였다. qPCR 조건은 다음과 같이 하였다: 95℃, 10분간 preincubation 후, 95℃에서 10초, 55℃에서 10초, 72℃에서 10초 순서로 총 40 Cycle의 PCR을 진행하고, 95℃에서 5초, 65℃에서 60초 Melting curve analysis와 37℃에서 30초의 Cooling time을 가졌다. 또한, 내부표준(Internal standard)으로 GAPDH를 확인하였고, 하기 [표 1]의 서열을 갖는 프라이머를 이용하여 AR 및 GAPDH를 확인하였다.
Primer 서열(5'→3') 서열번호
GAPDH Forward AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC 1
Reverse CGGAGTGAACGGATTTGGTCGTAT 2
AR Forward AGCACCATGCAACTCCTTCAG 3
Reverse CACCGACACTGCCTTACACAA 4
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, VA30E 처리군에서 농도 의존적으로 AR mRNA 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 본 발명의 겨우살이 추출물은 전립선 조직의 상피세포의 증식을 억제하고, AR 발현을 억제함으로써, 전립선 비대증을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있다.
<실험예 2> 전립선 비대증 in vivo 모델에서 겨우살이 추출물의 효능 평가
<2-1> 전립선 비대증 in vivo 모델 제작 및 겨우살이 추출물 투여
전립선 비대증에 있어서 겨우살이 추출물의 효능을 알아보기 위하여, 전립선 비대증 in vivo 모델을 제작하고 본 발명의 겨우살이 추출물을 투여하였다.
구체적으로, 7주령의 수컷 SD(Sprague-Dawley) 래트를 라온바이오(Youngin, Korea)에서 구매하여 1주일간의 적응 기간을 거친 뒤 실험을 진행하였다. 실험동물은 온도 22±2℃, 상대습도 55±5%, 명암 주기가 12시간인 상태 아래 사육하였다. 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였으며, 사료는 멸균 사료를 이용하여 자유롭게 섭취하게 하였다. 몸무게는 이틀에 한 번 측정하였으며 식이 효율을 위하여 사흘에 1회 사료 무게를 측정하였다. 실험은 수원대학교 동물 실험 윤리위원회의 승인(USW-IACUC-R-2020-005)을 받아 진행하였다.
일주일의 적응 기간을 거친 이후, 도 5와 같이 전립선 비대증을 유발하고, 전립선 비대증 in vitro 모델에서 가장 효과가 우수한 것으로 나타난 실시예 <1-1>의 겨우살이 30% 에탄올 수용액 추출물(VA30E)을 투여하였다. 보다 구체적으로, 하기 [표 2]와 같이 Control군, BPH군, VA30E - 50군, VA30E - 150군, Saw palmetto군 총 5개 군으로 나누고, Control군을 제외한 모든 래트는 중성화 수술을 하였다. 중성화 수술을 위하여 음낭을 절개하여 양측 고환을 제거한 후 출혈을 막고 회복을 위해 절개 부위의 봉합을 진행하였다. 중성화 수술은 내분비 교란 물질 테스트 및 평가에 대한 OECD Hershberger 분석을 위해 수행하였다(National Institute of Toxicological Research, Daejeon, Korea). 중성화 수술 이후 실험 전 회복을 위해 일주일간의 회복 기간을 두었다.
그 다음, 전립선 비대증의 유도를 위해 Control군을 제외한 실험군에 테스토스테론 프로피오네이트(testosteron propionate, TP)를 3 mg/kg의 농도로 옥수수기름(corn oil)에 녹여 0.1 mL씩 4주간 매일 피하주사(s.c.)하였다. 또한, BPH군은 식염수(saline solution)를, VA30E - 50군은 VA30E 50 mg/kg을, VA30E - 150군은 VA30E 150 mg/kg을, Saw palmetto군은 소팔메토(saw palmetto) 100 mg/kg을 4주간 매일 경구투여(p.o.)하였다. Control군은 옥수수기름 0.1 mL씩 4주간 매일 피하주사하고, 식염수를 4주간 매일 경구투여하였다.
그룹
(n=8/group)		 시험 방법
TP 시료
Control - (corn oil, s.c.) saline solution, p.o.
BPH 3 mg/kg of BW/day, s.c. 중성화 수술, saline solution, p.o.
VA30E - 50 3 mg/kg of BW/day, s.c. 중성화 수술, VA30E 50 mg/kg of BW/day, p.o.
VA30E - 150 3 mg/kg of BW/day, s.c. 중성화 수술, VA30E 150 mg/kg of BW/day, p.o.
Saw palmetto 3 mg/kg of BW/day, s.c. 중성화 수술, saw palmetto 100 mg/kg of BW/day, p.o.
<2-2> 전립선 비대증 in vivo 모델에서 겨우살이 추출물 투여 후 체중 및 간 무게 평가
전립선 비대증 in vivo 모델에서 본 발명의 겨우살이 추출물의 독성을 알아보기 위하여, 상기 실험예 <2-1>의 실험동물의 체중 및 간 무게를 측정하였다.
구체적으로, 중성화 수술 후 7일간의 회복기를 거친 후, 체중(body weight, BW)을 측정하여 처음 체중으로 하였다. 4주간의 TP 피하주사 및 VA30E 투여 후 희생 전 모든 래트는 12시간 금식을 하였고 희생 전 마지막 체중을 측정하였다. BW는 전 실험 기간 동안(4주) 이틀에 한 번 측정하였으며, 처음 체중과 마지막 체중의 차이를 계산하여 체중 증가량(BW gain, g)을 구하였다. FER(Food efficiency ratio)은 체중 증가량(g)에서 식이 섭취량(g)을 나누어 계산하였다.
또한, 희생 전 12시간 동안 금식을 진행하고, 실험동물을 CO2 챔버(chamber)에서 희생하였다. 희생된 실험동물의 혈액을 채취하였으며, 간 및 전립선을 채취하여 무게를 측정하였다. 채취한 혈액은 혈청 분리를 위해 3,000 rpm에서 20분 동안 원심분리(MF-80, Hanil Science industrial, Incheon, Korea)하였다. 수집된 모든 장기는 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 세척하고 -40℃에 저장하였다. 체중 및 간 무게 측정 결과는 하기 [표 3] 및 [표 4]에 나타내었다.
체중 증가량 및 FER
그룹 처음 체중(g) 마지막 체중(g) 체중 증가량1)(g) FER2)
Control 326.37±4.84a 417.84±9.20a 91.47±5.78a 0.14±0.01a
BPH 302.21±4.92b 361.19±7.38c 58.98±4.23c 0.10±0.01b
VA30E - 50 298.73±4.92b 362.22±6.25c 63.50±3.88bc 0.11±0.01b
VA30E - 150 303.39±4.19b 358.80±7.13c 55.41±4.36bc 0.09±0.01b
Saw palmetto 321.05±2.90a 393.12±5.07b 72.08±6.24b 0.11±0.01b
1) 체중 증가량(g) : 마지막 체중(g) - 처음 체중(g)
2) FER : 체중 증가량(g) / 식이 섭취량(g)
간 무게 및 비율
그룹 간 무게 (g) 간 비율1) (mg/100g of BW)
Control 15.29±0.72c 3.66±0.14a
BPH 11.23±0.19a 3.12±0.06b
VA30E - 50 11.84±0.40ab 3.27±0.12b
VA30E - 150 11.64±0.78b 3.22±0.25b
Saw palmetto 12.26±0.35ab 3.12±0.08b
1) 간 비율 : 간 무게(mg) / 체중 (mg) × 100 (g)
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, BPH군, VA30E군, Saw palmetto군 간 FER의 유의적 차이가 나타나지 않음을 확인하였다.
또한, 표 4에 나타낸 바와 같이, BPH군, VA30E군, Saw palmetto군 간 간 비율의 유의적 차이가 나타나지 않음을 확인하였다.
상기 결과를 통해 본 발명의 겨우살이 추출물은 독성이 없음을 알 수 있다.
<2-3> 전립선 비대증 in vivo 모델에서 겨우살이 추출물 투여 후 간세포 손상 지수 평가
ALT(alanine aminotransferase) 및 AST(aspartate aminotransferase)는 간세포 손상의 민감한 지표이며 ALT 및 AST의 상승은 간 손상을 반영한다. 이에, 전립선 비대증 in vivo 모델에서 겨우살이 추출물이 간에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기 실험예 <2-1>의 실험동물의 혈청에서 간세포 손상 지수인 ALT 및 AST를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <2-2>에서 획득한 혈청에서 생화학 분석기(FUJI DRY CHEM 500i, FUJI photo film Co., LTD, Tokyo, Japan)를 사용하여 ALT 및 AST를 분석하였다. 측정 결과는 [표 5]에 나타내었다.
혈청 내 ALT, AST
그룹 AST (U/I) ALT (U/I)
Control 62±3.46 22±1.25
BPH 63±3.36 17±1.36
VA30E - 50 64±4.87 17±1.69
VA30E - 150 68±3.02 17±1.27
Saw palmetto 72±6.30 22±2.73
그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, AST 및 ALT는 모든 실험군에서 유의적인 차이가 없음을 확인하였다.
상기 결과 및 실험예 <2-2>의 체중간 간 비욜 결과를 종합해볼 때, 본 발명의 겨우살이 추출물이 간 독성을 나타내지 않음을 알 수 있다.
<2-4> 전립선 비대증 in vivo 모델에서 겨우살이 추출물 투여 후 테스토스테론, DHT 및 5-알파 환원효소2 평가
테스토스테론은 전립선 비대증 발달에 중요한 DHT의 전구체이다. 또한, DHT는 테스토스테론의 대사물질로 5-알파 환원효소2(5-alpha reductase2, 5AR2)에 의해 전립선에서 생성된다. 특히, 전립선 비대증에서 5AR2가 증가하는 것으로 알려져 있다. 이에, 전립선 비대증 in vivo 모델에서 겨우살이 추출물이 상기 인자들의 수준에 미치는 영향을 알아보기 위하여, ELISA를 수행하여 상기 실험예 <2-1>의 실험동물의 전립선 내 테스토스테론, DHT 및 5AR2 수준을 측정하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <2-2>에서 수집한 전립선 조직 100 mg 당 1 × PBS(pH 7.4)를 1 mL씩 가하여 균질화를 진행하고, 5,000×g, 4℃에서 5분간 원심분리하여 상등액을 채취하였다. 채취한 상등액에서 testosteron, DHT 및 5AR2 ELISA kit(Cusabio, Wuhan, China)를 사용하여 제조사의 절차에 따라 테스토스테론(도 6), DHT(도 7) 및 5AR2(도 8) 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, Control군에 비해 BPH군에서 테스토스테론 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 반면, VA30E - 50군 및 VA30E - 150군에서는 BPH군에 비해 테스토스테론 수준이 각각 43.47%, 46.01% 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, Control군에 비해 BPH군에서 DHT 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 반면, VA30E - 50군 및 VA30E - 150군에서는 BPH군에 비해 DHT 수준이 각각 20.58%, 22.26% 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, Control군에 비해 BPH군에서 5AR2 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 반면, VA30E - 50군 및 VA30E - 150군에서는 BPH군에 비해 5AR2 수준이 각각 30.93%, 34.75% 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 본 발명의 겨우살이 추출물이 전립선 비대증에서 증가되어 있는 테스토스테론, DHT 및 5AR2 수준을 감소시키는 것을 알 수 있다.
<2-5> 전립선 비대증 in vivo 모델에서 겨우살이 추출물 투여 후 세포사멸 관련 인자 평가
전립선 비대증에서 전립선의 증식은 항-세포사멸 단백질인 Bcl-2(B-cell lymphoma 2)의 증가와 친-세포사멸 단백질인 Bax(Bcl-2 associated X protein)의 감소와 관련이 있고, Bax/Bcl-2 비율은 세포사멸에 대한 세포의 감수성에 비례하며 전립선 비대증의 발생은 Bax와 Bcl-2 균형 변화에 관여할 수 있다. 이에, 전립선 비대증 in vivo 모델에서 겨우살이 추출물이 전립선 조직의 세포사멸 수준에 미치는 영향을 알아보기 위하여, qPCR을 수행하여 상기 실험예 <2-1>의 실험동물의 전립선 내 Bcl-2, Bax mRNA 수준을 측정하였다.
구체적으로, Total RNA extraction reagent인 RNAiso(TaKaRa, Shiga, Japan)를 이용하여 상기 실험예 <2-2>에서 수집한 전립선 조직으로부터 RNA를 추출하였고, T100tmThermalCycler(BioRad, Munich, Germany)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 그 다음, 상기 실험예 <1-4>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 qPCR을 수행하여 상기 실험예 <2-1>의 실험동물의 전립선 내 Bcl-2, Bax mRNA 수준을 측정하였다. 이때 사용한 프라이머의 서열은 [표 6]에 나타내었다.
Primer 서열(5'→3') 서열번호
GAPDH Forward TCCCTCAAGATTGTCAGCAA 5
Reverse AGATCCACAACGGATACATT 6
Bax Forward GATCAGCTCGGGCACTTTA 7
Reverse TGTTTGCTGATGGCAACTTC 8
Bcl-2 Forward AGGATTGTGGCCTTCTTTGAGT 9
Reverse GCCGGTTCAGGTACTCAGTCAT 10
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, Control군에 비해 BPH군에서 Bax/Bcl-2 비율이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 반면, VA30E - 50군 및 VA30E - 150군에서는 BPH군에 비해 Bax/Bcl-2 비율이 각각 42.09%, 60.58% 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 본 발명의 겨우살이 추출물이 전립선 비대증에서 나타나는 전립선 조직의 증식을 억제하는 것을 알 수 있다.
<2-6> 전립선 비대증 in vivo 모델에서 겨우살이 추출물 투여 후 전립선 무게 및 비율 평가
전립선 비대증은 요도를 감싸고 있는 전립선 조직의 증식이 통제되지 않는 비종양성 성장을 특징으로 한다. 이에, 전립선 비대증 in vivo 모델에서 본 발명의 겨우살이 추출물의 전립선 조직에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 상기 실험예 <2-1>의 실험동물의 전립선 무게 및 전립선 비율을 측정하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <2-2>에서 확인한 전립선 무게 측정 결과를 하기 [표 7]에 나타내었다. 이때, 전립선 비율은 체중 100 g당 전립선 무게를 계산하였다. 또한, 전립선의 크기 비교를 위해 사진 촬영을 하였고, 전립선 무게, 전립선 비율을 사진과 함께 비교하기 위해 그래프화하였다.
전립선 무게 및 비율
그룹 전립선 무게 (g) 전립선 비율1) (mg/100g of BW)
Control 1.50±0.07c 0.36±0.02d
BPH 2.50±0.10a 0.69±0.02a
VA30E - 50 2.32±0.14ab 0.64±0.04ab
VA30E - 150 2.17±0.07b 0.60±0.01bc
Saw palmetto 2.21±0.10ab 0.56±0.03c
1) 전립선 비율 : 전립선 무게(mg) / 체중 (g) × 100 (g)
그 결과, 표 7 및 도 10에 나타낸 바와 같이, Control군에 비해 BPH군에서 전립선 비율이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 반면, VA30E - 50군 및 VA30E - 150군에서는 BPH군에 비해 전립선 비율이 각각 7.24%, 13.04% 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해 본 발명의 겨우살이 추출물이 전립선 비대증에서 나타나는 전립선 조직의 증식을 억제하여, 전립선 크기를 줄이는 것을 알 수 있다.
<2-7> 전립선 비대증 in vivo 모델에서 겨우살이 추출물 투여 후 전립선 조직의 조직학적 변화 평가
전립선 비대증 in vivo 모델에서 본 발명의 겨우살이 추출물의 전립선 조직에 미치는 영향을 알아보기 위하여, H&E(hematoxyline & Eosin) 염색을 수행하여 상기 실험예 <2-1>의 실험동물의 전립선 조직의 조직학적 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <2-2>에서 수집한 전립선 조직을 10% 포름알데히드(formaldehyde)에 고정 및 탈수하고, 파라핀(paraffin)에 고정하였다. 고정한 전립선 조직을 2 μm 두께로 절단하여 H&E로 염색하였다. 절단한 조직은 커버글라스로 덮어 광학 현미경으로 100배 확대하여 관찰하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, Control군(도 11A)과 비교하여 BPH군(도 11B)의 경우 전립선 상피세포가 두꺼워지고 내강(lumen)이 좁아진 것을 확인하였다. 반면, VA30E - 50군(도 11C) 및 VA30E - 150군(도 11D)의 경우 Saw palmetto군(도 11E)과 유사한 수준으로 전립선 상피세포가 얇아지고 내강이 넓어진 것을 확인하였다.
<110> Industry-university Cooperation of USW <120> Composition for preventing, ameliorating or treating benign prostatic hyperplasia comprising Viscum album extract as an active ingredient <130> KP2160051-SWUI <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer_forward <400> 1 agccttctcc atggtggtga agac 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer_reverse <400> 2 cggagtgaac ggatttggtc gtat 24 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AR primer_forward <400> 3 agcaccatgc aactccttca g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AR primer_reverse <400> 4 caccgacact gccttacaca a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer_forward <400> 5 tccctcaaga ttgtcagcaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer_reverse <400> 6 agatccacaa cggatacatt 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bax primer_forward <400> 7 gatcagctcg ggcacttta 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bax primer_reverse <400> 8 tgtttgctga tggcaacttc 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-2 primer_forward <400> 9 aggattgtgg ccttctttga gt 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-2 primer_reverse <400> 10 gccggttcag gtactcagtc at 22

Claims (12)

  1. 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 겨우살이 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는, 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 겨우살이 추출물은 에탄올 수용액으로 추출한 것을 특징으로 하는, 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 겨우살이 추출물은 20 내지 40% 에탄올 수용액으로 추출한 것을 특징으로 하는, 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 겨우살이 추출물은 겨우살이의 뿌리, 줄기, 꽃, 잎, 열매 및 종자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 추출물로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 겨우살이 추출물은 하기 특성 중 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 하는, 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
    1) 테스토스테론(testosterone), 디하이드로테스토스테론(dihydrotestesterone, DHT), 5-알파 환원효소2(5-alpha reductase2) 및 안드로겐 수용체(androgen receptor, AR)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 전립선 비대증 관련 인자 감소;
    2) 전립선의 증식 억제; 및
    3) 전립선 크기 감소.
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 전립선 비대증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 전립선 비대증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  12. 겨우살이(Viscum album var. coloratum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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