KR102592438B1

KR102592438B1 - 안드로겐 시그널링 관련 인자 ar 및 5ar2 발현 저해용 시약 조성물

Info

Publication number: KR102592438B1
Application number: KR1020220049607A
Authority: KR
Inventors: 김은경; 최영진; 범미기; 김중엽
Original assignee: 주식회사 뷰렌코리아
Priority date: 2020-04-20
Filing date: 2022-04-21
Publication date: 2023-11-06
Also published as: KR20220071155A; KR20210129565A

Abstract

본 발명은 병풀(Centella asiatica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증 또는 안드로겐성 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 이에 의하여 천연재료로 인체에 무해하고 부작용을 최소화할 수 있으며 특히 안드로겐 시그널링(androgen signaling) 관련 인자의 발현을 억제할 수 있는 효과가 있다.

Description

안드로겐 시그널링 관련 인자 AR 및 5AR2 발현 저해용 시약 조성물{Reagent composition for inhibiting AR and 5AR2 of androgen signaling related factors}

본 발명은 전립선 비대증 또는 안드로겐성 탈모증 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

전립선 비대증은 50 세 이상의 남성들에게 요로계의 흔한 만성 질환이다 (Berry S.J. et al., 1984). 전립선 비대증은 또한 요로 간헐적 증가, 요로 빈도 증가, 요로 응급, 요로 흐름 약화 및 불완전한 방광 비움을 포함한 요로 증상 저하(LUTS)와 관련이 있으며, 이로 인해 노인의 삶의 질이 나빠지며 일상 생활에 부정적인 영향을 미치게 된다 (Sarma, A.V. et al., 2012).

전립선 비대증의 근본적인 원인은 알려져 있지 않지만, 노화된 남성의 전립선은 안드로겐에 의해 영향을 받는다는 것이 잘 알려져 있다 (Kim S.K. et al., 2015). 전립선 비대증가 진행되는 동안, 안드로겐은 자가 분비 또는 파라 크린 방식으로 전립선에서 상피 세포 또는 기질 세포의 증식을 촉진하여 전립선 세포 증식 및 세포 자살의 불균형을 초래한다. 이것은 BPH의 중요한 원인으로 여겨져 왔다 (Choi, H.M. et al., 2016).

특히, 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosteron, DHT)은 전립선 비대증의 발달과 관련이 있는 것으로 잘 알려져 있다. 나이가 들면서 남성의 성호르몬인 테스토스테론(testosteron)이 전립선에서 디하이드로테스토스테론(DHT)으로 높은 비율로 전환되기 시작하는데, 이것은 일차적으로 테스토스테론을 DHT로 전환시키는 효소인 리덕타아제(reductase) 효소의 농도가 높아지는 것이 원인이다. DHT는 안드로겐 수용체(AR)에 대한 결합력이 높기 때문에 TST와 비교하여 더 강력한 안드로겐이다. 5α환원효소 유형-2(5AR2)는 전립선에서 TST를 DHT로 변환하며, DHT는 AR과 결합하여 안드로겐-의존성 유전자의 전사를 증가시키고, 궁극적으로 전립선 증식과 관련된 단백질 합성의 자극을 유발하며, 전립선-특이적 항원(PSA) 수준을 향상시킨다. 한편, BPH 및 전립선암이 진행되는 동안 PSA 수준이 증가하는데, 이 때문에 PSA는 BPH의 진단에 널리 사용된다(Chen, Y. et al., 1996).

세포주기는 전립선 기질 및 상피 세포에서 발생하여 이들의 분열 및 복제로 이어진다. G1 / S 진행은 사이클린 D1 에 의해 고도로 규제된다. 또한 증식 세포핵 항원 (PCNA)은 세포주기에서 G1 / S 단계에 대한 조직 학적 마커로 인식된 산성 핵 단백질이다. 따라서 PCNA와 사이클린 D1의 발현은 BPH 동안 전립선 세포의 증식 상태를 반영할 수 있다 (Wang, W., et al., 2004).

반대로, 전립선 상피의 세포 자살은 전립선 비대증보다 정상적인 상태에서 전립선에서 더 자주 발생한다. 세포 자살을 억제하는 Bcl-2는 또한 전립선 상피에서 발견되며, 전립선 조직의 증식으로 이어진다 (Cardillo, M., et al., 1997).

디하이드로테스토스테론 (DHT) 등의 남성 호르몬에 의한 또 다른 증상 중의 하나는 남성형 탈모증(male pattern baldness)이다. 탈모의 원인으로는 혈액순환 불량설, 남성호르몬 작용 과잉설, 피지 분비 과잉설, 비듬균 및 기타세균 등에 의한 두피기능 저하설, 유전적 요인, 노화 스트레스 등이 제시되어 왔으나, 현재까지 남성호르몬 과잉 분비에 직접적인 관계가 있는 탈모중의 가장 흔한 유형인 안드로겐성 탈모증(androgenic alopecia)의 원인이 밝혀지고 있다.

안드로겐성 탈모증이 있는 경우 건강한 모발은 점차로 가늘어지고, 짧아지며, 모발이 약해져서 쉽게 부서지는 현상이 나타나게 되는데 이러한 현상을 축소화(miniaturization)라고 한다. 축소화가 일어나는 모낭은 결국 가늘고 눈에 잘 보이지 않으며 짧은 솜털로 변해 탈모가 진행되는 것이다. 이에 따라 최근 남성호르몬 활성 억제를 통한 탈모의 예방 및 치료를 위한 많은 연구가 보고 되고 있다.

테스토스테론(testosterone)이 5α환원효소(5α-reductase)에 의해 활성형 남성호르몬인 디히드로테스토스테론(dihydrotestosterone, DHT)으로 전환되고, 이렇게 활성화된 디히드로테스토스테론이 안드로겐 수용체와 결합하여 모낭세포의 단백질 합성을 지연시켜 모낭의 생장기가 단축되고 모낭을 위축시켜 탈모를 유발한다. 또한 안드로겐성 탈모 과정에서 피지가 과잉 생성되기도 하며 그 결과로서 두피에서는 염증을 동반한 탈모가 나타나기도 한다 (Dennis A. Holt, et. al,. 1990).

현재 개발된 테라조신, 독사조신, 탐술래신, 알푸조신 등과 같은 alpha-1 adrenergic blocker 로 사용되는 전립선 비대증 치료제의 경우 전립선 평활근을 이완시켜 요도 폐쇄 증상을 완화시키나 교감신경 차단으로 저혈압, 혈관 확장성 두통 등의 부작용이 보고되고 있다.

5α환원효소 억제제인 피나스테라이드(Fi)와 두타스테라이드는 테스토스테론이 5α환원효소에 의해 활성 대사물질인 디하이드로테스토스테론 (DHT)으로의 전환을 억제하여 전립선 크기를 줄이고 BPH 및 탈모증에 사용되는 효과적인 것으로 알려져 있으나(Park, E.S., et al., 2018), 이들 약물은 발기 부전, 성욕 감소 및 사정에서의 정액 부피 감소와 같은 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있다. 이렇듯 현재 사용하고 있는 약물치료가 다소 효과가 있다고는 하나, 그 부작용이 문제가 되며, 사실상, 전립선 비대증은 지속적인 노화현상 중 하나로 근본적 치료가 어려운 문제점이 있다.

따라서 부작용이 적은 효과적인 치료 전략을 찾는 연구자들은 천연 재료로 제조된 약제를 포함한 대체 의학에 관심이 증가되고 있다. 현재 천연 재료 중에서 쏘팔메토 추출물만이 전립선 비대증에 효과를 갖는 기능성 식품으로 널리 알려져 있다 (Marks, L.S., et al., 2000).

한국등록특허 제10-1881417호 한국등록특허 제 10-2017187호

본 발명의 목적은 천연재료로 인체에 무해하고 부작용을 최소화할 수 있는 병풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증 또는 안드로겐성 탈모증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적은 천연재료로 인체에 무해하고 부작용을 최소화할 수 있는 병풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증 또는 안드로겐성 탈모증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 하나의 측면에 따르면,

병풀(Centella asiatica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증 또는 안드로겐성 탈모증 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.

상기 병풀 추출물은 물, 탄소수 1-4의 알코올, 또는 이들의 혼합용매에 의해 추출된 것일 수 있다.

상기 약학 조성물은 안드로겐 시그널링(androgen signaling) 관련 인자의 발현 저해용일 수 있다.

상기 안드로겐 시그널링 관련 인자는 SRC-1(steroid receptor coactivator), AR(androgen receptor), 5AR2(5alpha reductase), 및 PSA(prostate specific antigen) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 약학 조성물은 전립선 내 성장인자의 발현 억제용일 수 있다.

상기 전립선 내 성장인자는 EGF(Epidermal growth factor), IGF-1(Insulin like growth factor I), TGF-1β(Transforming growth factor beta 1), 및 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 약학 조성물은 PI3K/Akt 및 HIF-1 시그널링 관련 인자의 발현 억제용일 수 있다.

상기 PI3K/Akt 및 HIF-1 시그널링 관련 인자는 PI3K(phosphatidylinositol-3-kinase), Akt(protein kinase B), 및 HIF-1(Hypoxia-inducible factors) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 약학 조성물은 전립선 조직 내 세포증식 관련 인자 발현 억제용일 수 있다.

상기 전립선 조직 내 세포증식 관련 인자는 PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen) 또는 사이클린 D1(Cyclin D1) 일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,

병풀(Centella asiatica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증 또는 안드로겐성 탈모증 예방 또는 개선용 식품 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,

병풀(Centella asiatica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 포함하는 전립선 비대증 또는 안드로겐성 탈모증 예방 또는 개선용 건강기능식품이 제공된다.

본 발명의 병풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증 또는 안드로겐성 탈모증 예방 또는 치료용 약학 조성물은 천연재료로 인체에 무해하고 부작용을 최소화할 수 있으며 특히 안드로겐 시그널링(androgen signaling) 관련 인자의 발현을 억제할 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 병풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증 또는 안드로겐성 탈모증 예방 또는 개선용 식품 조성물은 천연재료로 인체에 무해하고 부작용을 최소화할 수 있으며 특히 안드로겐 시그널링(androgen signaling) 관련 인자의 발현을 억제할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 실험예 1에 따른 웨스턴 블롯 결과이다.
도 2는 실험예 1에 따른 AR 단백질 발현량 측정 결과이다.
도 3은 실험예 1에 따른 5AR2 단백질 발현량 측정 결과이다.
도 4는 실험예 1에 따른 PSA 단백질 발현량 측정 결과이다.
도 5는 실험예 2에 따라 분리된 각 실험군의 전립선 사진과 전립선의 무게를 측정하여 비교한 결과이다.
도 6은 실험예 2에 따른 전립선 지수(prostate index) 측정결과이다.
도 7은 실험예 2에 따른 전립선 상피세포의 현미경 사진과 상피세포 두께를 측정한 결과이다.
도 8은 실험예 3에 따른 안드로겐 시그널링 관련 인자 발현 억제능 분석 결과이다.
도 9는 실험예 4의 참고문헌의 대표도이다.
도 10은 실험예 4에 따른 성장인자(Grow factor) 발현 억제능 분석 결과이다.
도 11은 PI3K/Akt 및 HIF 1 시그널링 경로의 개략도이다.
도 12는 실험예 5에 따른 웨스턴 블롯 실험결과이다.
도 13은 실험예 6에 따른 전립선 조직 내 세포증식 관련 인자 발현 억제능 분석 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 전립선 비대증 또는 안드로겐성 탈모증 예방 또는 치료용 약학 조성물은 병풀(Centella asiatica) 추출물을 유효성분으로 포함한다.

병풀(Centella asiatica)은 가장자리에 톱니를 두른 작은 부채 모양의 잎에 흰색 또는 연보라색의 꽃을 피우는 미나리과 식물이다. 인도에서는 상처를 입은 호랑이가 병풀나풀이 많이 난 곳에서 뒹굴어 치료하는 것을 보고 호랑이풀이라고 부르며 오래 전부터 약으로 활용해 왔다.

상기 병풀 추출물을 추출하는 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 에틸렌글리콜, 에틸에테르 또는 이들의 혼합용매이다. 상기 저급알코올로는 20 내지 80%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올을 들 수 있다.

상기 추출용매로는 특별히 한정하는 것은 아니지만 60 내지 80%의 에탄올 수용액으로 추출된 추출물이 바람직하다.

본 명세서에서 병풀 추출물을 언급하면서 사용되는 용어 '추출물'은 추출용매를 처리하여 얻은 조추출물뿐만 아니라 병풀 추출물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 병풀 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 병풀 추출물은 광의로는 병풀을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 병풀 가공물, 예컨대, 병풀 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 병풀로 실험을 진행하긴 하였으나, 병풀 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상 가능할 것이다.

한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 병풀 추출물 또는 이의 분획물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 병풀 추출물 또는 이의 분획물은 10 내지 1500 ㎍/㎖, 바람직하게는 100 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 병풀 추출물 또는 이의 분획물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 병풀 추출물 또는 이의 분획물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

또한, 본 발명은 병풀(Centella asiatica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증 또는 안드로겐성 탈모증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물은 안드로겐 시그널링(androgen signaling) 관련 인자의 발현 저해용으로 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 전립선 내 성장인자의 발현 억제용으로 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 PI3K/Akt 및 HIF-1 시그널링 관련 인자의 발현 억제용으로 사용될 수 있다.

상기 약학 조성물은 전립선 조직 내 세포증식 관련 인자 발현 억제용으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 병풀(Centella asiatica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증 또는 안드로겐성 탈모증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 병풀 추출물 또는 이의 분획물 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 병풀 추출물 또는 이의 분획물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명은 병풀(Centella asiatica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증 또는 안드로겐성 탈모증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 병풀 추출물 또는 이의 분획물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 병풀 추출물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명은 전립선 비대증 또는 안드로겐성 탈모증 예방, 치료 또는 개선을 위한 의약 또는 식품의 제조를 위한 병풀(Centella asiatica) 추출물의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 병풀(Centella asiatica) 추출물을 투여하는 것을 포함하는 아토피의 개선, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 병풀(Centella asiatica) 추출물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

[실시예]

실시예 1: 병풀 추출물 제조

상업적으로 판매되는 건조된 인도네시아산 병풀(Centella asiatica)을 구입하여 100g의 시료에 D.W 1L를 가해 항온수조에 100℃에서 1시간 동안 추출하였다. 이 추출물을 여과지로 여과한 뒤 진공회전농축기를 이용하여 감압 농축하였다. 이후 딥 프리저(deep freezer)에서 하루 냉각하고 동결건조 하였다. 동결건조한 병풀 열수추출물은 DMSO(dimethyl sulfoxide)용매에 1 g/㎖ 농도로 용해시켜 세포실험에 사용하고 D.W에 용해시켜 동물실험에 사용하였다.

[실험예: 생체 외 실험]

실험예 1: 안드로겐 시그널링 관련 인자 발현 억제능 분석

LNCaP 세포에 테스토스테론(testosterone propionate, TP)를 처리하여 세포증식을 유도하고 실시예 1의 병풀(Centella asiatica) 추출물을 처리한 후 AR(androgen receptor), 5AR2(5 alpha reductase), PSA(prostate specific antigen)의 발현억제 효능을 확인하였다.

구체적으로, LNCaP 세포 내에서 병풀의 안드로겐 시그널링(androgen signaling) 관련 인자의 억제능 확인하였다. LNCaP 세포를 6 웰 플레이트에 2 x 10⁶ 개 시딩(seeding)한 뒤 100 nM의 테스토스테론(testosterone propionate, TP) 과 실시예 1의 병풀추출물(CA)을 농도별 250, 500 또는 1000 ㎍/㎖로 24시간 처리하였다. 이때 안드로겐 억제약물인 피나스테리드(finasteride, Fi) 1㎍/㎖ 처리군은 양성대조군으로 사용하였다.

세포에 처리가 끝난 후 웨스턴 블롯법을 이용하여 안드로겐 시그널링 관련 인자 AR, 5AR2 및 PSA 단백질 발현량을 측정하였으며 밴드 세기는 image J(NIH ver. 1.48, USA)를 이용하여 각 샘플의 면적을 설정한 후 상대되는 β-Actin의 면적을 동일한 방법으로 설정하여 그 값을 나누는 방식으로 계산함으로써 정량하였다. 이에 따른 웨스턴 블롯 실험 결과를 도 1에 나타내었으며, AR 단백질 발현량 측정 결과를 도 2에 나타내었고, 5AR2 단백질 발현량 측정 결과를 도 3에 나타내었고, PSA 단백질 발현량 측정 결과를 도 4에 나타내었다.

이에 따르면, 실시예 1의 병풀추출물의 처리에 따라 AR, 5AR2 및 PSA 단백질 발현량이 농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었으며, 특히 5AR2 및 PSA 단백질 발현량은 500 ㎍/㎖ 처리군에서 급격히 발현량이 감소하였고, 1000 ㎍/㎖ 처리군에서는 피나스테리드 약물처리군 보다 약간 높은 수준으로 매우 높은 발현량 억제능을 나타내었다.

[실험예: 생체 내 실험]

8주령의 수컷 SD 래트(체중 200±5 g) 실험동물군을 아래의 표 1에 정리된 바와 같이 5그룹으로 나눈 다음, BPH 유발 그룹은 1주일 안정기 후 페노바비탈(phenobarbital) 50mg/kg을 복강 내 주사하여 마취한 후 고환과 부고환을 제거한 뒤 봉합실을 이용하여 수술 부위를 봉합하였다. 모든 실험은 무균 환경에서 이루어졌다. 3일간의 수술 안정기를 가진 다음 전립선 비대증(benign prostatic hyperplasia) 유발군(BPH)은 테스토스테론을 옥수수 오일(corn oil)에 녹여 3mg/kg의 농도로 매일 피하 주사하여 전립선 비대증을 유발시켰다. 병풀 투여군(BPH+CA200)은 실시예 1의 병풀 추출물을 멸균된 증류수에 녹여 200mg/k을 주간 존데를 이용하여 경구 투여하였다. 양성대조군인 쏘팔메토 투여군(BPH+Saw)은 쏘팔메토를 멸균된 증류수에 녹여 100mg/kg투여하였고, 피나스테리드 투여군(BPH+Fi)은 1mg/kg을 4주간 매일 존데를 이용하여 경구투여 했다. 실험 종료 후, 졸레틸(zoletil)을 이용하여 쥐를 희생시킨 후 심장 천공(heart puncture)를 통해 혈액을 수집한 뒤 혈청을 분리하여 -80℃에 보관하였다. RNAse가 제거된 수술기구로 전립선을 분리하여 -80℃에 보관한 뒤 웨스턴 블롯 실험을 실시하였다.

그룹	개체수	투여물질 및 농도
Con	6	-
BPH	6	테스토스테론 (3 mg/kg)
BPH+CA200	6	병풀추출물(200 mg/kg)
BPH+Saw	6	쏘팔메토(100 mg/kg)
BPH+Fi	6	피나스테리드(1 mg/kg)

실험예 2: 전립선 크기 및 상피세포 두께 측정

분리된 각 실험군의 전립선 사진과 전립선의 무게를 측정하여 비교한 결과를 도 5에 나타내었으며, 전립선 지수(prostate index) 측정결과를 도 6에 타내었다.

이에 따르면, 전립선 비대증 유발군(BPH)은 대조군에 비해 유의적으로 전립선의 크기가 증가함을 확인하였다. 반면 병풀 투여군(BPH+CA200)은 전립선 비대증 유발군(BPH)에 비해 전립선의 크기(무게)와 전립선 지수(prostate index)가 유의적으로 감소하였다.

한편, 상기 각 실험군의 전립선 상피세포의 현미경 사진과 상피세포 두께를 측정한 결과를 도 7에 나타내었다.

이에 따르면, 전립선 비대증 유발군(BPH)은 대조군에 비해 유의적으로 전립선 상피세포 두께가 증가하였음을 확인하였다. 반면 병풀 투여군(BPH+CA200)은 전립선 비대증 유발군(BPH)에 비해 전립선의 상피세포 두께가 유의적으로 감소함을 확인하였다.

*

실험예 3: 안드로겐 시그널링 관련 인자 발현 억제능 분석

상기 동물실험군들에 대하여 안드로겐 시그널링(androgen signaling) 관련 인자 SRC-1(steroid receptor coactivator), AR(androgen receptor), 5AR2(5alpha reductase), PSA(prostate specific antigen)의 단백질 발현을 상술한 웨스턴 블롯 실험으로 분석한 결과를 도 8에 나타내었다.

이에 따르면, 병풀 투여군(BPH+CA200)에서 안드로겐 시그널링 관련 인자의 발현이 전립선 비대증 유발군(BPH)과 대비하여 전반적으로 유의적인 감소를 보였고, 특히 AR발현량이 현저히 감소하는 것으로 나타났다.

실험예 4: 성장인자(Grow factor) 발현 억제능 분석

British journal of cancer, 101(12), 1949-1956 에 따르면, 표피성장인자(Epidermal growth factor)가 전립선 암에서 안드로겐의 제어를 벗어나도록 하는 역할을 한다고 알려져 있으며, 참고로 상기 논문의 대표도를 도 9에 나타내었다. 안드로겐 시그널링으로 인해 ARE(androgen response element) 에서 성장인자(Grow factor)의 전사가 이루어져 발현량이 증가되는 경향을 보인다. 성장인자는 전립선 비대증을 유도하는 큰 요인으로 볼 수 있다.

이에 따라 본 실험예에서 병풀 추출물 투여가 전립선 비대증을 유도시킨 쥐의 전립선 내 성장인자의 발현을 감소시키는지 확인하기 위하여 상기 실험군들에 대해 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯 실험을 수행하고 그 결과를 도 10에 나타내었다. 이에 따르면, 전립선 비대증은 병풀 투여군(BPH+CA200)에서 성장인자인 EGF(Epidermal growth factor), IGF-1(Insulin like growth factor I), TGF-1β(Transforming growth factor beta 1), VEGF(Vascular endothelial growth factor)의 발현량이 전립선 비대증 유발군(BPH)에 비해 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5: PI3K/Akt 및 HIF-1 시그널링 경로(signaling pathway) 관련 인자 발현 억제능 분석

앞서 실험예 4에서 병풀 투여군(BPH+CA200)은 안드로겐 시그널링을 억제하고 이로 인해 표피성장인자(EGF)의 발현을 억제함을 확인하였다. 한편, 이로 인한 PI3K/Akt 및 HIF-1 시그널링 경로(signaling pathway) 관련 인자인 PI3K(phosphatidylinositol-3-kinase), Akt(protein kinase B), PTEN(phosphatase and tensin homologue), HIF-1(Hypoxia-inducible factors)의 발현이 억제되는지 확인하기 위하여 상술한 바와 같이 웨스턴 블롯 실험을 수행하였다. 참고로 PI3K/Akt 및 HIF-1 시그널링 경로의 개략도를 도 11에 나타내었으며, 웨스턴 블롯 실험결과를 도 12에 나타내었다.

이에 따르면, 병풀 투여군(BPH+CA200)에서 표피성장인자(EGF)로부터 유도된 PI3K/Akt 및 HIF-1 시그널링 경로의 관련 인자들 중 PI3K를 억제해주는 인자인 PTEN을 제외하고 모든 관련 인자 단백질의 발현이 높은 것으로 나타났다.

실험예 6: 전립선 조직 내 세포증식 관련 인자 발현 억제능 분석

전립선 조직 내 세포증식과 관련된 대표적인 인자인 PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen)와 사이클린 D1(Cyclin D1) 단백질 발현을 상술한 웨스턴 블롯 실험으로 분석하여 그 결과를 도 13에 나타내었다. 이에 따르면, 분석했다. 병풀 투여군(BPH+CA200)에서 전립선 비대증 유발군(BPH)에 비해 PCNA와 Cyclin D1 단백질 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다.

이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims

병풀(Centella asiatica) 추출물을 유효성분으로 포함하고,
상기 병풀 추출물은 열수 추출물이고,
생체 외(in vitro) 조건의 LNCaP 세포에서 안드로겐 시그널링(androgen signaling) 관련 인자인 AR(androgen receptor) 및 5AR2(5alpha reductase) 중에서 선택된 1종 이상의 발현 저해용 시약 조성물.
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