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KR102339240B1 - 펩타이드 키메라 항원 수용체 t 세포 스위치 및 이의 용도 - Google Patents

펩타이드 키메라 항원 수용체 t 세포 스위치 및 이의 용도 Download PDF

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KR102339240B1
KR102339240B1 KR1020167012414A KR20167012414A KR102339240B1 KR 102339240 B1 KR102339240 B1 KR 102339240B1 KR 1020167012414 A KR1020167012414 A KR 1020167012414A KR 20167012414 A KR20167012414 A KR 20167012414A KR 102339240 B1 KR102339240 B1 KR 102339240B1
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트래비스 영
김찬혁
피터 지. 슐츠
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더 스크립스 리서치 인스티튜트
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Publication date
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Abstract

본 발명에는 키메라 항원 수용체 효과기 세포(CAR-EC) 및 CAR-EC 스위치가 개시된다. 전환가능한 CAR-EC는 일반적으로 T 세포이다. 하나 이상의 키메라 항원 수용체는 CAR-EC 스위치 상에서 펩타이드 항원을 인식할 수 있다. CAR-EC 및 스위치는 병태의 치료가 필요한 대상체에서 해당 병태의 치료를 위해 사용될 수 있다.

Description

펩타이드 키메라 항원 수용체 T 세포 스위치 및 이의 용도{PEPTIDIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T CELL SWITCHES AND USES THEREOF}
상호참조
본 출원은 2013년 10월 15일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/891,347호; 2013년 10월 25일자로 출원된 미국 가출원 특허 제61/895,704호; 2014년 6월 6일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/009,054호; 2014년 7월 29일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/030,526호; 및 2014년 7월 29일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/030,514호의 유익을 주장하며; 이들 기초출원 모두는 그들의 전문이 참고로 포함된다.
악성 종양 세포를 인식하고 제거하는 면역계를 "재교육(reteach)"하기 위해 유전자 변형된 T 세포의 양자 전달(adoptive transfer)을 사용하는 면역요법을 포함하는 면역요법은 화학요법에 대한 매력적인 대안이 된다. 유전자 변형된 T 세포는 표적 악성 세포 상에서 종양-관련 항원에 대해 수용체 특이성을 제공하는 단클론성 항체로부터 유래된 세포밖 단일쇄 가변 단편(extracellular single-chain variable fragment: scFv), 신호전달 엔도도메인 및 CD3-제타 막관통 도메인으로 일반적으로 이루어진 키메라 항원 수용체를 발현시킨다. 키메라 항원 수용체를 통해 종양-관련 항원과 결합 시, 키메라 항원 수용체 발현 T 세포(CAR T-세포)는 악성 세포에 대해 세포독성인 면역 반응을 시작한다. 이러한 요법은 화학요법 내성을 피할 수 있고, 재발/난치성 질환에 대해 활성이 되는 것으로 나타났는데, 이는 일부 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 환자에 대해 지속적인 관해를 야기한다. 그러나, 이들 요법은 추가 조사 및 최적화를 필요로 하는데, 그들이 독성 림프구 감소증, 혈액학적 표적에 대한 만성 저감마글로부민혈증, 고형 종양 표적에 대한 치명적인 표적을 벗어난 세포용해, CAR T-세포를 발현시키는 항-CD19 항체의 사용과 함께 지속적 B 세포 무형성증, 및 일부 경우에 사망과 같은 원치않는 효과를 야기하기 때문이다.
CAR T-세포의 활성을 제어하는 스위치의 도입은 신생 세포가 제거된 후에 CAR T-세포 활성 및 관련된 면역 반응이 끊어지게 하며, B 세포를 재증식시킬 것이다. 최근의 전임상 연구는 CAR T-세포 시스템이 항체 기반 스위치를 통해 제어될 수 있다는 것을 입증하였고, 항체는 표적 세포(예를 들어, 암세포)에 결합하여, CAR T-세포가 표적 세포에 결합하는 것을 차단하고, CAR-T 활성의 "스위치를 끈다". 이들 시스템이 CAR T-세포를 이용하여 종양의 교환가능한 표적화를 개념적으로 허용하지만, 그들은 일련의 제한으로 고통받을 수 있다. 시스테인 또는 라이신을 이용하는 항체의 비특이적 표지는 비기능적일 수 있는 변이체를 포함하는 이종성 생성물을 생성하며, 예측불가능한 약동학 및/또는 면역원성을 가지며, 최적화가 어려울 수 있다.
본 명세서에서 효과기 세포 상에서 키메라 항원 수용체에 결합하는 펩타이드 항원; 및 표적 세포 상에서 세포 표면 분자에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치가 개시된다. 펩타이드 항원은 천연 유래 펩타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드 항원은 비-인간 펩타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드 항원은 진핵생물 펩타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드 항원은 펩타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있되, 펩타이드는 효모에 의해 발현된다. 펩타이드 항원은 효모 전사 인자 GCN4에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드 항원은 비-천연 유래 펩타이드를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 합성 펩타이드 태그를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 서열번호 2 내지 7로부터 선택된 서열에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드 항원은 서열번호 2 내지 7로부터 선택된 펩타이드 서열에 대해 적어도 약 50% 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 표적화 펩타이드를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 표적화 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 면역글로불린, Fc 삭제(null) 면역글로불린, 및 Fab, 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 표적화 모이어티는 항-EGFR 항체, 항-Her2 항체, 항-EGFRvIII 항체, 항-CD33 항체, 항-CLL-1 항체, 항-CEA 항체, 항-CD19 항체, 항-CD22 항체, 항-BCMA 항체, 및 항-CS1 항체 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 경쇄 및 중쇄쌍을 포함할 수 있되, 경쇄 및 중쇄는 서열번호 8과 9; 서열번호 8과 10; 서열번호 11과 12; 서열번호 13과 14; 서열번호 15와 16; 서열번호 17과 18; 및 서열번호 19와 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열쌍에 기반하거나 또는 유래된 핵산 서열에 의해 암호화된다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 경쇄 및 중쇄쌍을 포함할 수 있되, 경쇄 및 중쇄는 서열번호 21과 22; 서열번호 23과 24; 서열번호 25와 26; 서열번호 27과 28; 및 서열번호 27과 29로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열쌍에 기반하거나 또는 유래된 아미노산 서열에 의해 암호화된다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 경쇄 및 중쇄쌍을 포함할 수 있되, 경쇄 및 중쇄는 서열번호 30과 29; 서열번호 36과 29; 서열번호 31과 28; 서열번호 27과 32; 서열번호 27과 33; 서열번호 27과 34; 및 서열번호 27과 35로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열쌍에 기반하거나 또는 유래된 아미노산 서열에 의해 암호화된다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 경쇄의 N 말단, 경쇄의 C 말단, 중쇄의 N 말단, Fab 중쇄의 C 말단 및 불변 영역 중쇄의 C 말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화 항체 또는 항체 단편의 영역에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 모이어티에 접합될 수 있다. 표적화 모이어티는 표적화 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CL 도메인, VH 도메인, VL 도메인 및 힌지 영역으로부터 선택된 표적화 항체 또는 항체 단편의 영역 내로 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CL 도메인, VH 도메인, VL 도메인, 중쇄, 경쇄 및 힌지 영역으로부터 선택된 표적화 항체 또는 항체 단편의 두 영역 사이에 접합될 수 있되, 두 영역은 인접해 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 루프 내로 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 불변 도메인의 루프 내로 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 힌지 영역과 중쇄 불변 도메인 사이에 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 하나 이상의 아미노산을 대체할 수 있다. 펩타이드 항원은 아미노산을 대체하는 일 없이 표적화 항체 또는 항체 단편에 접합될 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포는 펩타이드 항원과 표적화 모이어티를 연결하는 링커를 추가로 포함할 수 있다. 링커는 펩타이드 항원과 표적화 모이어티를 연결하는 펩타이드일 수 있되, 표적화 모이어티는 표적화 폴리펩타이드를 포함한다. 링커는 약 1 내지 약 20개의 아미노산을 포함할 수 있다. 링커는 서열번호 38 내지 42로부터 선택된 서열에 기반하거나 또는 유래된 서열을 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 효모 전사 인자 GCN4 또는 이의 상동체를 포함할 수 있고, 표적화 모이어티는 항-Her2 항체, 항-BCMA 항체, 항-CD19 항체, 항-CEA 항체 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 표적 세포는 암세포일 수 있다. 세포 표면 분자는 종양 관련 항원일 수 있다. 세포 표면 분자는 분화 단백질의 클러스터, 수용체, 내재막 단백질(integral membrane protein) 및 당단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치의 동질성은 적어도 약 90%일 수 있다.
추가로 본 명세서에서 효과기 세포 상에서 키메라 항원 수용체에 결합하는 펩타이드 항원; 및 표적 상에서 세포 표면 분자에 결합하는 표적화 모이어티; 및 약제학적으로 허용가능한 염, 부형제 및/또는 비히클을 포함하는 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치를 포함하는 약제학적 조성물이 개시된다.
본 명세서에서 효과기 세포 상에서 키메라 항원 수용체에 결합하는 펩타이드 항원; 및 표적 세포 상에서 세포 표면 분자에 결합하는 표적화 모이어티; 및 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치의 펩타이드 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 키메라 항원 수용체-효과기 세포를 포함하는 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치를 포함하는 키트가 개시된다. 표적화 모이어티는 표적화 펩타이드를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 표적화 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 펩타이드 항원은 표적화 모이어티 내에 접합된다. 키트는 제1 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치 및 제2 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치를 포함할 수 있되, 제1 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 제1 펩타이드 항원 및 제1 표적화 모이어티를 포함하고, 제2 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 제2 펩타이드 항원 및 제2 표적화 모이어티를 포함한다. 제1 펩타이드 항원과 제2 펩타이드 항원은 동일할 수 있다. 제1 표적화 모이어티는 제1 표적 세포 상에서 제1 세포 표면 분자에 결합할 수 있고, 제2 표적화 모이어티는 제2 표적 세포 상에서 제2 세포 표면 분자에 결합할 수 있되, 제1 세포 표면 분자와 제2 세포 표면 분자는 상이하다. 효과기 세포는 T 세포, 효과기 B 세포, 자연 살해 세포, 대식세포 및 이들의 전구체로부터 선택될 수 있다. 효과기 세포는 나이브(naive) T 세포, 기억 줄기 세포 T 세포, 중추 기억 T 세포, 효과기 기억 T 세포, 헬퍼 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD8/CD4+ T 세포, αβ T 세포, γδ T 세포, 세포독성 T 세포, 자연 살해 T 세포, 자연 살해 세포, 대식세포로부터 선택될 수 있다.
추가로 본 명세서에서 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치의 펩타이드 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체가 개시된다. 키메라 항원 수용체는 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치의 펩타이드 항원에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체 단편 또는 항체 단편은 진핵생물 항원에 결합할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 비-천연 유래 펩타이드에 결합할 수 있다. 항체 단편은 scFv일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 항-효모 전사 인자 GCN4 항체, 항-FLAG(등록상표) 항체, 항-HTP 항체 및 이들의 단편으로부터 선택될 수 있다. 키메라 항원 수용체는 서열번호 1에 기반하거나 또는 유래된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있다.
본 명세서에서 키메라 항원 수용체를 포함하는 효과기 세포가 개시되되, 키메라 항원 수용체는 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치의 펩타이드 항원에 결합된다. 효과기 세포는 T 세포일 수 있다. 효과기 세포는 서열번호 1에 기반하거나 또는 유래된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 추가로 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치를 암호화하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 개시되되, 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 펩타이드 항원 및 표적화 모이어티를 포함하고, 표적화 모이어티는 펩타이드를 포함하며, 표적 세포 상에서 세포 표면 분자에 결합한다.
본 명세서에서 표적화 항체 또는 항체 단편의 중쇄를 암호화하는 제1 서열을 갖는 제1 폴리뉴클레오타이드; 표적화 항체 또는 항체 단편의 경쇄를 암호화하는 제2 서열을 갖는 제2 폴리뉴클레오타이드; 및 펩타이드 항원을 암호화하는 제3 서열을 갖는 제3 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 개시되되, 벡터의 발현은 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치를 생성한다. 제3 서열은 제1 서열 및 제2 서열로부터 선택된 서열에 인접할 수 있다. 제3 서열은 제1 서열 및 제2 서열로부터 선택된 서열 내에 위치될 수 있다.
본 명세서에서 추가로 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 벡터(표적화 항체 또는 항체 단편의 중쇄를 암호화하는 제1 서열; 표적화 항체 또는 항체 단편의 경쇄를 암호화하는 제2 서열; 및 펩타이드 항원을 암호화하는 제3 서열)로부터 발현시키는 단계를 포함하는 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치를 생성하는 방법이 개시되되, 벡터의 발현은 키메라 항원 수용체- 효과기 세포 스위치를 생성한다.
도 1A는 키메라 항원 수용체-T 세포(CAR T-세포), 및 본 명세서에 개시된 스위치를 이용하는 CAR T-세포 스위치 요법의 일반적 검토를 도시한 도면. 림프구는 대상체로부터 단리되며, 키메라 항원 수용체를 암호화하는 발현 벡터는 후속적으로 키메라 항원 수용체 발현 세포를 생성하기 위해 림프구 내로 도입된다. 얻어진 공학 처리 림프구는 CAR T-세포 스위치와 함께 대상체에게 투여된다.
도 1B는 표적 세포에 대해 선택적인 CAR T-세포 및 표적화 항체의 키메라 항원 수용체에 의해 결합된 펩타이드를 포함하는 CAR T-세포 스위치를 도시한 도면. CAR T-세포에 대한 CAR T-세포 스위치의 결합은 CAR T-세포 스위치에 또한 결합된 악성 세포에 대해 세포독성인 면역 반응을 유도한다.
도 2는 효모 전사 인자 GCN4(7P-14P)(진한 회색은 GCN4 펩타이드를 나타냄)로부터 유래된 펩타이드에 결합된 친화도 성숙 scFv(밝은 그리고 중간의 회색은 경쇄 및 중쇄를 나타냄)의 PDB 1P4B 결정 구조를 도시한 도면.
도 3은 항-CD19-Fab- GCN4CL1 CAR-EC 스위치의 질량 스펙트럼을 도시한 도면의 질량 스펙트럼을 도시한 도면. 계산치: 49533, 예상치: 49537.09.
도 4는 항-CD19 항체 또는 항체 단편의 다양한 영역 또는 도메인에 접합 또는 융합된 GCN4 펩타이드를 이용하는 다양한 항-CD19 항체 또는 항체 단편을 지니는 항-GCN4 CAR T-세포의 세포독성을 도시한 도면.
도 5a는 항체 또는 항체 단편의 다양한 영역 또는 도메인에 접합 또는 융합된 GCN4 펩타이드를 이용하는 항-CD19 항체 또는 항체 단편의 비-환원성 SDS-PAGE 겔을 도시한 도면.
도 5b는 항체 또는 항체 단편의 다양한 영역 또는 도메인에 접합 또는 융합된 GCN4 펩타이드를 이용하는 항-CD19 항체 또는 항체 단편의 환원성 SDS-PAGE 겔을 도시한 도면.
도 6은 항-CD19 Fab(FMC63)에서 효모 GCN4 펩타이드 접합 위치를 도시한 도면.
도 7은 이종이식 종양 마우스 모델에서 항-CD19 Fab - GCN4 펩타이드 CAR T-세포 스위치 및 항-GCN4 CAR T-세포의 생체내 효능을 도시한 도면. 도 7A는 비치료 마우스 대 치료 마우스에서 종양의 정량화를 나타낸다. 도 7B는 비치료 마우스 대 치료 마우스에서 생체내 치료 요법 및 종양 세포의 시각화를 도시한다.
도 8은 BCMA-양성 세포(OPM2)에 대해 항-GCN4 CAR T-세포 및 CAR T-세포 스위치(경쇄 불변 도메인에 접합된 항-BCMA 항체-GCN4 펩타이드)의 세포독성을 도시한 도면.
현재의 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR T-세포) 요법은 CAR T-세포 활성을 제어하기 위한 수단의 결여 때문에 신뢰 가능하지 않을 수 있다. 본 명세서에서 현재 시험 및 투여되는 것보다 더 안전하고 더 다재다능한 면역요법을 제공할 수 있는, 키메라 항원 수용체 T 세포를 선택적으로 활성화 및 불활성화하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 본 명세서에서 전환가능한 키메라 항원 수용체 효과기 세포(CAR-EC) 및 키메라 항원 수용체 효과기 세포(CAR-EC) 스위치가 개시되되, CAR-EC 스위치는 CAR-EC 상에서 키메라 항원 수용체에 의해 결합하는 제1 영역 및 표적 세포 상에서 세포 표면 분자에 결합하는 제2 영역을 가지고, 이에 의해 결합된 표적 세포에 대해 세포독성인 CAR-EC로부터 면역 반응을 자극한다. 일반적으로, CAR-EC는 T 세포이다. 이 방법으로, CAR-EC 스위치는 CAR-EC 활성에 대해 "켜짐-스위치"로서 작용할 수 있다. 활성은 스위치의 투여를 감소 또는 중단시킴으로써 "끌 수 있다". 이들 CAR-EC 스위치는 암과 같은 질환 또는 병태의 치료를 위해 본 명세서에 개시된 CAR-EC뿐만 아니라 존재하는 CAR T-세포에 의해 사용될 수 있되, 표적 세포는 악성 세포이다. 이러한 치료는 예시적인 개략적 검토가 도 1에서 도시되는 전환가능한 면역요법으로서 본 명세서에서 지칭될 수 있다.
본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치는 표적 세포 상에서 세포 표면 분자에 결합하는 제1 영역 및 키메라 항원 수용체에 의해 결합하는 제2 영역을 포함한다. 일반적으로, 제1 영역은 표적화 폴리펩타이드이다. 표적화 폴리펩타이드는 표적 세포 상에서 항원에 결합하는 표적화 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제1 영역은 비-펩타이드 소분자(예를 들어, 비타민, 대사물질)를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 펩타이드 항원에 결합하는 키메라 항원(CAR-BP)으로서 지칭되는 제2 영역은 펩타이드를 포함한다. 단순함을 위해, 용어 키메라 항원 결합 펩타이드 항원은 본 명세서에서 단순히 펩타이드 항원으로서 지칭될 수 있다. 일반적으로, CAR-BP는 표적화 폴리펩타이드의 말단에 융합되거나 또는 표적화 폴리펩타이드 내에 접합된다. 표적화 폴리펩타이드에 대한 CAR-BP의 융합 또는 접합은 목적으로 하는 순서 또는 조합으로 제1 영역 및 제2 영역을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 폴리뉴클레오타이드 발현 벡터 내로 클로닝시킴으로써 수행될 수 있다.
본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치를 투여하는 단계를 포함하는 질환 또는 병태를 치료하는 방법은 CAR-EC 스위치의 투여를 감소 또는 중단시킴으로써 CAR-EC 활성의 적정가능한 반응, 개선된 안전성 및/또는 중단을 제공할 수 있다. CAR에 결합하기 위해 표적 세포 표면 분자와 경쟁함으로써 CAR-EC 활성을 "끄는" CAR-EC 활성을 제어하는 다른 접근과 대조적으로, 본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치는 일반적으로 CAR-EC 활성제 또는 "켜짐" 스위치로서 작용한다.
추가로 본 명세서에서 표적 세포의 하나 이상의 유형의 순차적 표적화(예를 들어, 이종성 종양의 치료)를 제공하는, 다중 CAR-EC 스위치에 결합할 수 있는 보편적 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 효과기 세포 및 CAR-EC 스위치를 포함하는 CAR-EC 플랫폼이 개시된다. CAR은 스위치에 대해 초-고 친화도 항체 또는 항체 단편(예를 들어, scFv)을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치를 생성하는 방법은 유리하게는 CAR-EC 스위치 펩타이드/항체의 부위 특이적 접합/융합을 통한 친화도, 원자가, 기하학, 길이 및/또는 화학에 의한 CAR-EC 세포 활성의 제어, 표적을 벗어난 반응성의 적정, 종양 용해 증후군(TLS)의 폐기, 사이토카인 방출 증후군(CRS)의 약화, 및/또는 친화도에 의한 CAR-EC 스위치 결합의 최적화를 제공할 수 있다.
"스위치" 및 "CAR-EC 스위치"는 상호호환적으로 사용되고, 펩타이드 스위치를 지칭할 수 있다. 펩타이드 항체 스위치의 항체 부분은 항체의 적어도 일부 또는 전체 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 항체 스위치의 항체 일부는 중쇄의 적어도 일부, 경쇄의 일부, 가변 영역의 일부, 불변 영역의 일부, 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)의 일부, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 펩타이드 항체 스위치 및/또는 합텐 항체 스위치의 항체 부분은 Fc(단편, 결정성) 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 펩타이드 항체 스위치의 항체 부분은 상보성 결정 영역(예를 들어, CDR1, CDR2, CDR3)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체 스위치의 항체 부분은 Fab(단편, 항원-결합) 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 펩타이드 스위치는 펩타이드-Fab 스위치일 수 있다.
본 방법에 앞서, 키트 및 조성물은 더 상세하게 기재되며, 본 발명은 기재되는 특정 방법, 키트 또는 조성물로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 하며, 이들은 물론 변할 수 있다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시형태를 기재하는 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범주는 첨부하는 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 실시예는 본 발명을 제조 및 사용하는 방법의 완전한 개시내용 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시하며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 여기는 것의 범주를 제한하는 것으로 의도되어서도 안 되고, 이하의 실험이 수행되는 모든 또는 유일한 실험이라는 것을 나타내는 것으로 의도되어서도 안 된다. 사용한 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 관한 정확성을 보장하기 위한 노력을 하였지만, 일부 실험적 오차 및 편차는 고려되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부분은 중량부이며, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이며, 압력은 대기압이거나 대기압 근처이다.
값의 범위를 제공하는 경우 달리 명확하게 표시되지 않는 한, 하한 단위의 1/10까지 해당 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재 값은 또한 구체적으로 개시된 것으로 이해된다. 언급한 범위 내의 임의의 언급된 값 또는 개재 값과 해당 언급 범위 내의 임의의 다른 언급한 또는 개재된 값 사이의 각각의 더 작은 범위는 본 발명 내에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한과 하한은 해당 범위에서 독립적으로 포함 또는 제외될 수 있고, 제한 중 하나이거나, 둘 다 아니거나, 또는 둘 다인 경우의 각각의 범위는 더 작은 범위에 포함되며, 또한 본 발명 내에서 언급된 범위 내에 포함되고, 임의의 구체적으로 제외되는 제한을 받는다. 언급된 범위가 제한 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이들 포함된 제한 중 하나 또는 둘 다를 제외하는 범위가 또한 본 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 또는 동일한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 일부 잠재적이고 바람직한 방법 및 물질이 이제 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물은 인용되는 간행물과 관련하여 방법 및/또는 물질을 개시 및 기재하기 위해 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 개시내용은 포함된 임의의 개시내용을 상충되는 정도로 대체한다는 것을 이해한다.
본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백할 바와 같이, 본 명세서에 기재 및 예시된 개개의 실시형태 각각은 본 발명의 범주 또는 정신으로부터 벗어나는 일 없이 임의의 다른 몇몇 실시형태의 특징으로부터 용이하게 분리되거나 또는 조합될 수 있는 별도의 구성성분 및 특징을 가진다. 임의의 인용된 방법은 나열된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되고 첨부하는 청구범위에서 사용되는 바와 같은 단수 형태는 달리 문맥에서 명확하게 표시하지 않는 한 복수의 대상을 포함하는 것이 주목되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수의 이러한 세포를 포함하고, "펩타이드"에 대한 언급은 하나 이상의 펩타이드 및 이의 동등물, 예를 들어, 당업자에게 공지된 폴리펩타이드 등에 대한 언급을 포함한다.
본 명세서에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 전의 그들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본 명세서에서 본 발명은 이러한 간행물을 선행 발명이라는 이유로 선행한다는 자격을 부여하는 용인으로서 해석되어서는 안 된다. 추가로, 제공되는 간행물의 일자는 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있는 실제 공개일과 상이할 수 있다.
대상체에서 표적과 함께 효과기 세포를 가져오기 위해 사용되는 CAR-EC 플랫폼 및 CAR-EC 스위치를 생성하기 위한 방법, 키트 및 조성물이 제공된다. 이들 방법, 키트 및 조성물은 다수의 질환에서 치료적 용도를 발견한다. 예를 들어, 이질적 종양 및 혈액 세포 악성 종양(예를 들어, 급성 림프모구성 백혈병 및 만성 림프성 백혈병)은 CAR-EC 스위치 연결의 길이, 원자가 및 배향뿐만 아니라 CAR-EC 스위치 세포 표적화 모이어티가 최적화될 때 CAR-EC 플랫폼에 의해 더 효과적으로 치료될 수 있다. 이질적 종양은 하나 이상의 항원을 표적화하는 다중 CAR-EC 스위치에 의해 더 효과적으로 치료될 수 있다. 본 발명의 이점 및 특징은 이하에 더 완전하게 기재하는 조성물 및 방법의 상세한 설명을 읽을 때 당업자에게 명확하게 될 것이다.
본 발명의 바람직한 실시형태를 본 명세서에 나타내고 기재하였지만, 이러한 실시형태가 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 수많은 변형, 변화 및 대체가 본 발명으로부터 벗어나는 일 없이 이제 당업자에게 일어날 것이다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실행함에 있어서 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 다음의 청구범위는 본 발명의 범주를 정하며, 이렇게 해서 이들 청구범위의 범주 내의 방법 및 구조 및 이들의 동등물을 아우르는 것으로 의도된다.
IA. 펩타이드 스위치
효과기 세포 상에서 키메라 항원 수용체에 결합하는 펩타이드 항원; 및 표적 상에서 세포 표면 분자에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치가 본 명세서에서 개시된다. 표적화 모이어티는 세포 표면 분자에 결합하는 표적화 펩타이드를 포함하는 표적화 폴리펩타이드일 수 있다. 표적화 모이어티는 표적화 펩타이드를 포함하는 표적화 항체 또는 항체 단편일 수 있되, 표적화 펩타이드는 표적화 항체 또는 항체 단편의 항원 결합 부위이다. 표적화 펩타이드는 항체 단편의 적어도 일부일 수 있고, 세포 표면 분자는 항원일 수 있다. 표적화 모이어티는 하나 이상의 항원을 인식하고/하거나 결합하는 하나 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다. 표적화 모이어티는 단지 하나의 항원을 인식하고/하거나 결합하는 하나 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 항원을 인식하고/하거나 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하지 않을 수도 있다.
추가로 본 명세서에서 효과기 세포(여기서, CAR-BP) 상에서 CAR(CAR-BP)에 결합하는 펩타이드 항원; 및 표적 세포 상에서 세포 표면 분자에 결합하는 표적화 폴리펩타이드를 포함하는 CAR-EC 스위치가 개시된다. 펩타이드 항원은 표적화 폴리펩타이드의 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 폴리펩타이드 내로(예를 들어, 표적화 폴리펩타이드의 선택된 아미노산 사이에) 접합될 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 펩타이드 항원의 말단에 융합될 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 펩타이드 항원 내로(예를 들어, 펩타이드 항원의 선택된 아미노산 사이에) 접합될 수 있다.
본 명세서에서 효과기 세포 상에서 CAR(CAR-BP)에 결합하는 펩타이드 항원; 및 표적 상에서 항원에 결합하는 표적화 항체 또는 항체 단편을 포함하는 CAR-EC 스위치가 개시된다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 면역글로불린, Fab, Fab', F(ab')2 및 scFv로부터 선택될 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 경쇄를 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 중쇄를 포함할 수 있다.
펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 경쇄의 N 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 경쇄의 C 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 중쇄의 N 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 중쇄의 C 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 VL 도메인의 N 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 VH 도메인의 N 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 CL 도메인의 C 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 Fc 도메인의 C 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 IgG의 VL 도메인의 N 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 IgG의 VH 도메인의 N 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 IgG의 CL 도메인의 C 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 IgG의 Fc 도메인의 C 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 Fab의 VL 도메인의 N 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 Fab의 VH 도메인의 N 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 Fab의 CL 도메인의 C 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 Fab의 CH1 도메인의 C 말단에 융합될 수 있다.
펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 내부 부위 내로(예를 들어, 표적화 항체 또는 항체 단편의 선택된 아미노산 사이에) 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 중쇄 내로 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 경쇄 내로 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 불변 도메인/영역 내로 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 가변 도메인/영역 내로 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 Fab의 내부 부위 내로 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 면역글로불린(예를 들어, IgG)의 내부 부위 내로 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 CL 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, VL 도메인, VH 도메인 및 힌지 도메인으로부터 선택된 표적화 항체 또는 이의 단편의 도메인 내로 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 CL 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, VL 도메인, VH 도메인 및 힌지 도메인으로부터 선택된 항체 또는 이의 단편의 두 도메인 사이에 접합될 수 있되, 두 도메인은 인접해있다. 펩타이드 항원은 항체 또는 이의 단편의 CL 도메인에 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 항체 또는 이의 단편의 CH1 도메인 내로 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 항체 또는 이의 단편의 힌지 도메인 내로 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 항체 또는 이의 단편의 루프 내로 접합될 수 있다. 펩타이드 항원은 항체 또는 이의 단편의 CL 도메인 루프 내로 접합될 수 있다.
CAR-BP는 항체 또는 항체 단편의 C 말단 내로 접합될 수 있고, 따라서, 키메라 항원 수용체와 표적 사이의 거리는 CAR-EC 스위치의 크기에 실질적으로 의존하여 실질적으로 다를 수 있다(대략 scFv에 대해 40Å, Fab에 대해 70Å, 및 IgG에 대해 120Å). 큰 거리가 시험관내 효능에 부정적으로 영향을 미칠 수도 있지만, 전장 항체의 증가된 체류 시간은 생체내에서 우수할 수 있다.
CAR-BP는 추가로 링커를 포함할 수 있다. 링커는 표적 세포 상에서 CAR-EC의 상호작용 또는 효과를 용이하게 하기 위한 CAR-EC 스위치 가요성, 길이 또는 기하학적 최적을 제공할 수 있다. CAR-BP는 하나 이상의 링커를 추가로 포함할 수 있다. CAR-BP는 2개의 링커를 포함할 수 있다. 링커는 펩타이드를 포함할 수 있다. 링커는 길이로 적어도 약 1, 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9 또는 적어도 약 10개의 아미노산일 수 있다. 하나 이상의 링커는 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 약 50, 약 55, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90 또는 약 100개의 아미노산을 포함할 수 있다. 링커는 표적화 폴리펩타이드에 CAR-BP를 접합시키기 위해 CAR-BP의 N 말단 또는 C 말단에 위치될 수 있다. 제1 링커는 CAR-BP의 N 말단에 융합될 수 있고, 제2 링커는 CAR-BP의 C 말단에 융합될 수 있다. 링커는 서열(GGGGS)n, (서열번호 40)을 포함할 수 있되, n은 1, 2, 3, 4, 5 이상일 수 있다. 링커는 서열(GGS)n, (서열번호40)을 포함할 수 있되, n은 1, 2, 3, 4, 5 이상일 수 있다. CAR-BP는 CAR-BP의 말단 중 하나 상에서 링커를 지니는 표적화 폴리펩타이드의 내부 부위 내로 접합될 수 있다. 링커는 서열번호 40 내지 44로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다.
펩타이드 항원
펩타이드 항원(CAR-BP)은 키메라 항원 수용체(CAR)에 의해 결합하는 펩타이드일 수 있다. 펩타이드 항원은 일반적으로 펩타이드에 대해 인간에서 높은 단백질분해 안정성 및 낮은 면역원성을 가질 수 있다. CAR-BP는 호르몬, 사이토카인, 케모카인, 성장 인자, 세포 부착 분자, 신호전달 펩타이드, 수용체, 세포 표면 펩타이드 및 이들의 단편으로부터 선택될 수 있다. CAR-BP는 펩토이드일 수 있다. CAR-BP는 펩타이드 핵산(PNA)일 수 있다. CAR-BP는 리간드 또는 이의 단편일 수 있다. 리간드는 호르몬 리간드일 수 있다. 리간드는 펩타이드 리간드일 수 있다. CAR-BP는 환식 펩타이드일 수 있다. CAR-BP는 선형 펩타이드일 수 있다. CAR-BP는 약 2 내지 약 10, 약 10 내지 약 20, 약 20 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 60, 약 60 내지 약 70, 약 70 내지 약 80, 내지 약 80 내지 약 90개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. CAR-BP는 항원일 수 있다. CAR-BP는 에피토프일 수 있다. CAR-BP는 비선형 에피토프일 수 있다. CAR-BP는 제2 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.
펩타이드 항원은 항체 또는 항체 단편을 포함하지 않을 수도 있다. 펩타이드 항원은 항체 또는 항체 단편의 10개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 항체 또는 항체 단편의 12개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 항체 또는 항체 단편의 15개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 항체 또는 항체 단편의 20개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 항체 또는 항체 단편의 22개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 항체 또는 항체 단편의 30개 미만의 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 항체 또는 항체 단편의 파라토프를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 표적화 모이어티 및 펩타이드 항원을 포함하는 키메라 항원 수용체 효과기 세포 스위치가 개시되되, 표적화 모이어티는 표적화 폴리펩타이드이다. 표적화 폴리펩타이드는 표적화 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 가변 도메인을 포함할 수 있다. 가변 도메인은 VH 도메인 및 VL 도메인으로부터 선택될 수 있다. 펩타이드 항원은 VH 도메인의 N 말단에서 또는 근처에 위치되지 않을 수도 있다. 펩타이드 항원은 VL 도메인의 N 말단에서 또는 근처에 위치되지 않을 수도 있다.
펩타이드 항원은 비-천연 유래 펩타이드를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 합성 펩타이드를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 비-동물 펩타이드(예를 들어, 동물에서 발현되지 않은 펩타이드)를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 비-포유류 펩타이드를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 비-인간 펩타이드를 포함할 수 있다. 펩타이드는 식물, 효모, 박테리아, 파충류, 조류 또는 곤충으로부터 유래된 펩타이드를 포함할 수 있다.
펩타이드 항원은 myc-태그를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 His-태그를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 HA-태그를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 페리디닌 엽록소 단백질 복합체를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 녹색 형광 단백질(GFP)을 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 적색 형광 단백질(RFP)을 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 피코에리트린(PE)을 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 스트렙타비딘을 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 아비딘을 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 호스 래디쉬 페록시다제(HRP)를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 알칼린 포스파타제를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 글루코스 옥시다제를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)를 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 말토스 결합 단백질을 포함할 수 있다. 비제한적 예에 의한 펩타이드 항원은 c-myc 태그, 폴리히스티딘 태그, V5, VSVG, sof태그 1, sof태그 3, 발현 태그, S 태그, 팔미토일화, 나이트로실화, SUMO 태그, 티오레독신, 폴리(NANP), 폴리-Arg, 카모듈린 결합 단백질, PurF 단편, 케토스테로이드 이성화효소, PaP3.30, TAF12 히스톤 폴드 도메인, FKBP-태그, SNAP 태그, Halo-태그, RNAse I로부터의 펩타이드일 수 있다. 펩타이드 항원은 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 프로테아제 절단 부위는 트롬빈, 인자 Xa, TEV 프로테아제 또는 엔테로키나제에 의해 인식될 수 있다.
펩타이드 항원은 작은 선형 친수성 펩타이드일 수 있다. 작은 선형 친수성 펩타이드는 링커를 포함할 수 있다. 작은 선형 친수성 펩타이드는 친수성 표적 펩타이드(HTP)일 수 있다. 작은 선형 친수성 펩타이드는 서열 GGGGSDYKDDDDK(서열번호 5)를 포함할 수 있다. 작은 선형 친수성 펩타이드는 서열 GGGGSDYKDDDDKP(서열번호 6)를 포함할 수 있다. 작은 선형 친수성 펩타이드는 서열 GGGGSDYKDDDDK(서열번호 5)로 본질적으로 이루어질 수 있다. 작은 선형 친수성 펩타이드는 서열 GGGGSDYKDDDDKP(서열번호 6)로 본질적으로 이루어질 수 있다. 작은 선형 친수성 펩타이드는 서열번호 5 또는 6에 대해 적어도 약 50% 상동성일 수 있다. 작은 선형 친수성 펩타이드는 서열번호 5 또는 6에 대해 적어도 약 60% 상동성일 수 있다. 작은 선형 친수성 펩타이드는 서열번호 5 또는 6에 대해 적어도 약 70% 상동성일 수 있다. 작은 선형 친수성 펩타이드는 서열번호 5 또는 6에 대해 적어도 약 80% 상동성일 수 있다. 작은 선형 친수성 펩타이드는 서열번호 5 또는 6에 대해 적어도 약 85% 상동성일 수 있다. 작은 선형 친수성 펩타이드는 서열번호 5 또는 6에 대해 적어도 약 90% 상동성일 수 있다. 작은 선형 친수성 펩타이드는 당업계에 공지된 다른 펩타이드에 대해 감소된 비-특이적 결합을 가질 수 있다. 작은 선형 친수성 펩타이드는 본 명세서에 개시된 다른 펩타이드에 대해 감소된 비-특이적 결합 및 감소된 융합 단백질 불안정성을 가질 수 있다. 펩타이드 항원은 FLAG(등록상표) 태그(서열번호 7) 또는 이들의 유도체 또는 상동체를 포함할 수 있다.
펩타이드는 천연 유래 펩타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드는 인간 펩타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드는 침팬지, 원숭이, 래트, 마우스, 조류, 어류, 돼지, 말, 소, 염소, 닭, 토끼 및 기닉픽으로부터 선택된 동물에서 발현되는 펩타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드는 포유류 펩타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드는 비-포유류 펩타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드는 식물에서 발현된 펩타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드는 박테리아에서 발현된 펩타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드는 원핵생물 펩타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드는 진핵생물 펩타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드는 효모로부터 발현된 펩타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 펩타이드 항원은 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드 또는 이의 유도체 또는 상동체를 포함할 수 있다. 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드는 서열 RMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGER(서열번호 2)을 포함할 수 있다. 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드는 서열 NYHLENEVARLKKL(서열번호 3)을 포함할 수 있다. 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드는 서열 RMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGER(서열번호 2)로 본질적으로 이루어질 수 있다. 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드는 서열 NYHLENEVARLKKL(서열번호 3)로 본질적으로 이루어질 수 있다. 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드는 서열번호 2의 일부를 포함할 수 있다. 서열번호 2의 일부는 적어도 4개의 아미노산 길이일 수 있다. 서열번호 2의 일부는 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12 또는 약 13개 아미노산 길이일 수 있다. 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드는 서열번호 2 또는 3에 대해 적어도 약 50% 상동성일 수 있다. 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드는 서열번호 2 또는 3에 대해 적어도 약 60% 상동성일 수 있다. 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드는 서열번호 2 또는 3에 대해 적어도 약 70% 상동성일 수 있다. 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드는 서열번호 2 또는 3에 대해 적어도 약 80% 상동성일 수 있다. 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드는 서열번호 2 또는 3에 대해 적어도 약 85% 상동성일 수 있다. 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드는 서열번호 2 또는 3에 대해 적어도 약 90% 상동성일 수 있다. CAR-EC 스위치는 효모 GCN4 펩타이드 및 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다. CAR-EC 스위치는 서열번호 4를 포함할 수 있다.
표적화 모이어티
표적화 모이어티는 표적 상에서 세포 표면 분자에 결합할 수 있다. 세포 표면 분자는 항원을 포함할 수 있다. 세포 표면 분자는 단백질, 지질 모이어티, 당단백질, 당지질, 탄수화물, 다당류, 핵산, MHC-결합 펩타이드 또는 이들의 조합물로부터 선택될 수있다. 세포 표면 분자는 박테리아, 바이러스 및 기타 미생물유기체의 부분(예를 들어, 외피, 캡슐, 세포벽, 편모, 섬모 및 독소)을 포함할 수 있다. 세포 표면 분자는 표적 세포에 의해 발현될 수 있다. 세포 표면 분자는 표적 세포에 의해 발현되지 않을 수도 있다. 비제한적 예로서, 세포 표면 분자는 표적 세포가 아니고 표적 세포 또는 표적 세포의 세포 표면 분자에 결합하는 세포에 의해 발현되는 리간드일 수 있다. 또한, 비제한적 예로서, 세포 표면 분자는 표적 세포의 세포 표면 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 독소, 외인성 분자 또는 바이러스 단백질일 수 있다.
표적화 폴리펩타이드는 표적화 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 면역글로불린(Ig)일 수 있다. 면역글로불린은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 이들의 단편 또는 이들의 변형으로부터 선택될 수 있다. 면역글로불린은 IgG일 수 있다. IgG는 IgG1일 수 있다. IgG는 IgG2일 수 있다. IgG는 CAR-EC 스위치에 대한 내인성 T 세포 FcR 결합을 조절하기 위해 하나 이상의 Fc 돌연변이를 가질 수 있다. IgG는 FcR-양성 세포의 FcR에 대한 Fc 결합 능력을 제거하기 위해 하나 이상의 Fc 돌연변이를 가질 수 있다. Fc 결합 능력의 제거는 FcR 양성 세포에 대해 CAR-EC의 가교 기회를 감소시킬 수 있되, FcR 양성 세포에 대한 CAR-EC의 가교는 표적 세포가 없을 때 CAR-EC를 활성화시킨다. 이와 같이, CAR-EC 스위치에 대한 내인성 T 세포 FcR 결합은 비효과적인 또는 원치않는 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 하나 이상의 Fc 돌연변이는 글리코실화 부위를 제거할 수 있다. 하나 이상의 Fc 돌연변이는 E233P, L234V, L235A, delG236, A327G, A330S, P331S, N297Q 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 Fc 돌연변이는 IgG1에 있을 수 있다. IgG1에서 하나 이상의 Fc 돌연변이는 L234A, L235A, 또는 둘 다일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, IgG1에서 하나 이상의 Fc 돌연변이는 L234A, L235E, 또는 둘 다일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, IgG1에서 하나 이상의 Fc 돌연변이는 N297A일 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 하나 이상의 돌연변이는 IgG2일 수 있다. IgG2에서 하나 이상의 Fc 돌연변이는 V234A, V237A, 또는 둘 다일 수 있다.
표적화 항체 또는 항체 단편은 Fc 삭제 면역글로불린 또는 이들의 단편일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "항체 단편"은 전장 형태 이외의 임의의 형태의 항체를 지칭한다. 본 명세서의 항체 단편은 전장 항체 내에 존재하는 더 작은 구성성분인 항체, 공학 처리된 항체를 포함한다. 항체 단편은 Fv, Fc, Fab 및 (Fab')2, 단일쇄 Fv (scFv), 다이어바디(diabody), 트라이어바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 2작용성 혼성 항체, CDRl, CDR2, CDR3, CDR의 조합, 가변 영역, 프레임워크 영역, 불변 영역, 중쇄, 경쇄, 대안의 스캐폴드 비-항체 분자, 및 이중특이성 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 용어 "항체" 또는 "항체들"을 사용하는 언급 및 청구범위는 구체적으로 "항체 단편" 및 "항체 단편"을 포함할 수 있다.
표적화 항체 단편은 인간, 완전한 인간, 인간화, 인간 공학 처리, 비-인간 및/또는 키메라 항체일 수 있다. 비-인간 항체는 인간에 대해 면역원성을 감소시키도록 인간화될 수 있는 한편, 모 비-인간 항체의 선택성 및 친화도를 보유할 수 있다. 키메라 항체는 별도의 항체에 대해 선택적으로 암호화된 2 이상의 항체 유전자의 결합을 통해 생성된 항체를 지칭할 수 있다. 키메라 항체는 제1 항체로부터의 적어도 하나의 아미노산 및 제2 항체로부터의 적어도 하나의 아미노산을 포함할 수 있되, 제1 항체와 제2 항체는 상이하다. 항체 또는 항체 단편의 적어도 일부는 소 종, 인간 종, 또는 뮤린 종으로부터 유래될 수 있다. 항체 또는 항체 단편의 적어도 일부는 래트, 염소, 기닉픽 또는 토끼로부터 유래될 수 있다. 항체 또는 항체 단편의 적어도 일부는 인간으로부터 유래될 수 있다. 항체 또는 항체 단편 항체의 적어도 일부는 사이노몰거스 원숭이로부터 유래될 수 있다.
표적화 항체 또는 항체 단편은 포유류, 새, 어류, 양서류, 및 파충류로부터의 항체 또는 항체 단편에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 포유류는 육식동물, 설치류, 코끼리, 유대목 동물, 토끼, 박쥐, 영장류, 바다표범, 개미핥기, 고래, 말목 및 소목을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 포유류는 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 양, 고양이, 개, 소, 말, 염소 또는 돼지일 수 있다.
표적화 항체 또는 항체 단편은 비-제한적 예로서, CD19, Her2, CLL-1, CD33, EGFRvIII, CD20, CD22, BCMA 또는 이들의 단편으로부터 선택된 항원을 표적화할 수 있다. 항원은 야생형 항원을 포함할 수 있다. 항원은 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
표적화 항체 또는 항체 단편은 항-CD19 항체 또는 이들의 단편일 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 항-CD22 항체일 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 항-BCMA 항체 또는 이들의 단편일 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 항-CS1 항체 또는 이들의 단편일 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 항-EGFRvIII 항체 또는 이들의 단편일 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 항-Her2 항체 또는 이들의 단편일 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 항-CD20 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 리툭시맙을 포함할 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 항-EGFR 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 항-CEA 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 항-CLL-1 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 항-CD33 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 항-EpCAM 항체 또는 이의 단편을 포함하지 않을 수도 있다.
표적화 항체 또는 항체 단편은 선택된 임의의 상업적으로 입수가능한 항체일 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 아도-트라스투주맙 엠탄신, 알렘투주맙, 베바시주맙, 브렌툭시맙, 베도틴, 겜투주맙, 오조가미신, 이필리무맙, 이브리투모맙, 티욱세탄, 파니투무맙, 세툭시맙, 에르비툭스, 리툭시맙, 트라스투주맙 및 이들의 단편으로부터 선택될 수 있다.
표적화 항체 또는 항체 단편은 항-CD19 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 이의 단편은 항-CD19 항체 또는 이의 단편의 경쇄를 포함할 수 있다. 항-CD19 항체 또는 이의 단편의 경쇄는 서열번호 8에 기반하거나 또는 유래된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 8에 대해 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 92%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5% 또는 약 2% 상동성일 수 있다. 표적화 항체 또는 이의 단편은 항-CD19 항체 또는 이의 단편의 중쇄를 포함할 수 있다. 항-CD19 항체 또는 이의 단편의 중쇄는 서열번호 9에 기반하거나 또는 유래된 서열에 의해 암호화될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9에 대해 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 92%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5% 또는 약 2% 상동성일 수 있다.
표적화 항체 또는 항체 단편은 항-CD19 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 이의 단편은 항-CD19 항체 또는 이의 단편의 경쇄를 포함할 수 있다. 항-CD19 항체 또는 단편의 경쇄는 서열번호 27에 기반하거나 또는 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 서열번호 27에 대해 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 92%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5% 또는 약 2% 상동성일 수 있다. 표적화 항체 또는 이의 단편은 항-CD19 또는 이의 단편의 중쇄를 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 이의 단편은 항-CD19 IgG의 중쇄를 포함할 수 있다. 항-CD19 IgG의 중쇄는 서열번호 28에 기반하거나 또는 유래된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 서열번호 28에 대해 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 92%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5% 또는 약 2% 상동성일 수 있다. 표적화 항체 또는 이의 단편은 항-CD19 Fab의 중쇄를 포함할 수 있다. 항-CD19 Fab의 중쇄는 서열번호 29에 기반하거나 또는 유래된 서열을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 서열번호 29에 대해 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 92%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5% 또는 약 2% 상동성일 수 있다.
표적화 항체 또는 항체 단편은 서열번호 8 내지 20으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 서열번호 8 내지 20으로부터 선택된 뉴클레오타이드에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 서열번호 21 내지 29로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 서열번호 21 내지 29로부터 선택된 아미노산 서열에 기반하거나 또는 유래될 수 있다.
본 명세서에서 펩타이드 항원 및 표적 세포 상에서 세포 표면 분자에 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는 키메라 항원 수용체 효과기 세포(CAR-EC) 스위치가 개시된다. 일반적으로, CAR-EC 스위치 작제물에 대한 효과기 세포 및 표적 세포의 결합은 표적 세포 상에서 효과를 갖기 위해 효과기 세포의 활성에 충분히 근접한 효과기 세포와 근위로 표적 세포를 가져온다. 예를 들어, T 세포 및 표적 세포가 CAR-EC 스위치에 결합될 때, T 세포는 표적 세포 상에서 세포독성 효과를 갖는 면역 반응을 생성할 수 있다.
CAR-EC 스위치는 복수의 표적 세포와 상호작용할 수 있다. 표적 세포는 감염된 세포일 수 있다. 표적 세포는 병원으로 감염된 세포일 수 있다. 표적 세포는 병에 걸린 세포일 수 있다. 표적 세포는 유전자-변형 세포일 수 있다. 표적 세포는 숙주 세포가 아닐 수도 있다. 표적 세포는 침입 유기체(예를 들어, 효모, 벌레, 박테리아, 진균)로부터 유래될 수 있다. 추가로 본 명세서에서 비-세포 표적 상에서 분자와 상호작용하는 CAR-EC 스위치가 개시된다. 비-세포 표적은 바이러스 또는 이의 일부일 수 있다. 비-세포 표적은 세포의 단편일 수 있다. 비-세포 표적은 세포밖 기질 구성성분 또는 단백질일 수 있다.
표적 세포는 조직으로부터 유래될 수 있다. 조직은 뇌, 식도, 유방, 결장, 폐, 신경교, 난소, 자궁, 고환, 전립선, 위장관, 방광, 간, 흉선, 뼈 및 피부로부터 선택될 수 있다. 표적 세포는 하나 이상의 내분비샘으로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 표적 세포는 하나 이상의 내분비샘으로부터 유래될 수 있다. 내분비샘 림프샘, 뇌하수체, 갑상선, 부갑상선, 췌장, 생식샘 또는 송과선일 수 있다.
표적 세포는 줄기 세포, 만능 세포, 조혈줄기세포 또는 전구세포로부터 선택될 수 있다. 표적 세포는 순환 세포일 수 있다. 표적 세포는 면역 세포일 수 있다.
표적 세포는 암 줄기 세포일 수 있다. 표적 세포는 암세포일 수 있다. 암세포는 조직으로부터 유래될 수 있다. 조직은 뇌, 식도, 유방, 결장, 폐, 신경교, 난소, 자궁, 고환, 전립선, 위장관, 방광, 간, 갑상선, 뼈 및 피부로부터 선택될 수 있다. 암세포는 뼈로부터 유래될 수 있다. 암세포는 혈액으로부터 유래될 수 있다. 암세포는 B 세포, T 세포, 단핵구, 혈소판, 백혈구, 호중구, 호산구, 호염구, 림프구, 조혈 줄기 세포 또는 내피세포 조상으로부터 유래될 수 있다. 암성 세포는 CD19-양성 B 림프구로부터 유래될 수 있다. 암세포는 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 암세포는 다능성 세포로부터 유래될 수 있다. 암세포는 하나 이상의 내분비샘으로부터 유래될 수 있다. 내분비샘은 림프샘, 뇌하수체, 갑상선, 부갑상선, 췌장, 생식샘 또는 송과선일 수 있다.
암세포는 CD19-양성 세포일 수 있다. 암세포는 CD19-양성 B 림프구일 수 있다. 암세포는 Her2-양성 세포일 수 있다. Her2-양성 세포는 Her2-양성 유방암세포일 수 있다. 표적 세포는 BCMA-양성 세포일 수 있다. 암세포는 BCMA-양성 다발성 골수종 세포일 수 있다. 암세포는 CS1-양성 세포일 수 있다. CS1-양성 세포는 다발성 골수종 세포일 수 있다. 암세포는 EGFRvIII-양성 세포일 수 있다. 암세포는 EGFRvIII-양성 교모세포종 세포일 수 있다. 암세포는 CD20-양성 세포일 수 있다. 암세포는 CD22-양성 세포일 수 있다.
세포 표면 분자는 항원일 수 있다. 항원은 세포 상에서 표면 항원 또는 세포 표면 마커의 적어도 일부일 수 있다. 항원은 세포 상의 수용체 또는 공-수용체일 수 있다. 항원은 주조직 적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC)에 의해 결합되고 T-세포 수용체에 대해 제시될 수 있는 분자 또는 분자 단편을 지칭할 수 있다. 용어 "항원"은 또한 면역원을 지칭할 수 있다. 면역원은 대상체에게 그 자체로 주사된다면, 적응 면역 반응을 유발할 수 있다. 면역원은 단독으로 면역 반응을 유발할 수 있다. 항원은 초항원, T-의존적 항원 또는 T-독립적 항원일 수 있다. 항원은 외인성 항원일 수 있다. 외인성 항원은 전형적으로는, 예를 들어, 흡입, 섭취 또는 흡입에 의해 외부로부터 신체 내로 유입되는 항원이다. 일부 항원은 외인성 항원으로서 시작될 수 있고, 이후에 내인성(예를 들어, 세포내 바이러스)일 수 있다. 항원은 내인성 항원일 수 있다. 내인성 항원은 정상 세포 대사의 결과로서, 또는 병원성 감염(예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충)때문에 세포 내에서 생성된 항원일 수 있다. 항원은 자기항원일 수 있다. 자기 항원은 특이적 자가면역 질환으로 고통받고 있는 환자의 면역계에 의해 인식되는 정상 단백질 또는 단백질의 복합체(및 일부 DNA 또는 RNA)일 수 있다. 이들 항원은 정상 조건 하에서 면역계의 표적이 아니어야 하지만, 유전자 및/또는 환경적 인자에 기인하여, 이러한 항원에 대한 정상 면역학적 내약성은 이들 환자에서 존재하지 않는다. 항원은 병태 또는 질환에 기인하여 존재하거나 또는 과발현될 수 있다. 병태 또는 질환은 암 또는 백혈병일 수 있다. 병태는 염증성 질환 또는 병태일 수 있다. 병태 또는 질환은 대사 질환일 수 있다. 병태는 유전자 장애일 수 있다.
세포 표면 분자는 종양 항원으로서 표기되는 항원일 수 있다. 종양 항원 또는 신항원은 종양 세포의 표면에 대한 MHC I 또는 MHC II 항원에 의해 제시되는 항원일 수 있다. 이들 항원은 때때로 종양 세포에 의해 제시될 수 있고, 정상 세포에 의해서는 결코 제시될 수 없다. 이 경우에, 그들은 종양-특이적 항원(tumor-specific antigen: TSA)으로 불리며, 일반적으로, 종양-특이적 돌연변이로부터 초래된다. 종양 세포 및 정상 세포에 의해 제시되는 항원은 더 흔하며, 그들은 종양-관련 항원(tumor-associated antigen: TAA)으로 불린다. 이들 항원을 인식하는 세포독성 T 림프구는 그들이 증식 또는 전이되기 전에 종양 세포를 파괴할 수 있다. 종양 항원은 또한, 예를 들어 돌연변이된 수용체의 형태로 종양의 표면 상에 있을 수 있고, 이 경우에, 그들은 B 세포에 의해 인식될 수 있다. 달리 구체화되지 않는 한, 용어 "종양 항원", "종양 특이적 항원" 및 "종양 관련 항원"은 본 명세서에서 상호호환적으로 사용된다.
세포 표면 분자는 수용체일 수 있다. 수용체는 세포밖 수용체일 수 있다. 수용체는 세포 표면 수용체일 수 있다. 비제한적 예로서, 수용체는 호르몬, 신경전달물질, 사이토카인, 성장 인자 또는 세포 인식 분자에 결합될 수 있다. 수용체는 막관통 수용체일 수 있다. 수용체는 효소-결합 수용체일 수 있다. 수용체는 G-단백질 결합 수용체(GPCR)일 수 있다. 수용체는 성장 인자 수용체일 수 있다. 비제한적 예로서, 성장 인자 수용체는 표피 성장인자 수용체, 섬유아세포 성장인자 수용체, 혈소판 유래 성장인자 수용체, 신경 성장인자 수용체, 형질전환 성장인자 수용체, 뼈 형태형성 단백질 성장인자 수용체, 간세포 성장인자 수용체, 혈관 내피 성장인자 수용체, 줄기 세포 인자 수용체, 인슐린 성장인자 수용체, 소마토메딘 수용체, 에리트로포이에틴 수용체 및 이들의 상동체 및 단편으로부터 선택될 수 있다. 수용체는 호르몬 수용체일 수 있다. 수용체는 인슐린 수용체일 수 있다. 비제한적 예로서, 수용체는 에이코사노이드 수용체, 프로스타글란딘 수용체, 에스트로겐 수용체, 여포자극 호르몬 수용체, 프로게스테론 수용체, 성장 호르몬 수용체 또는 성선자극호르몬-방출 호르몬 수용체, 이들의 상동체 및 이들의 단편으로부터 선택될 수 있다. 수용체는 아드레날린 작용성 수용체일 수 있다. 수용체는 인테그린일 수 있다. 수용체는 Eph 수용체일 수 있다. 수용체는 황체형성 호르몬 수용체일 수 있다. 세포 표면 분자는 황체형성 호르몬 수용체에 대해 적어도 약 50% 상동성일 수 있다. 수용체는 면역 수용체일 수 있다. 비제한적 예로서, 면역 수용체는 패턴 인식 수용체, 톨-유사 수용체, NOD 유사 수용체, 킬러 활성화 수용체, 킬러 저해제 수용체, Fc 수용체, B 세포 수용체, 보체 수용체, 케모카인 수용체 및 사이토카인 수용체로부터 선택될 수 있다. 사이토카인 수용체의 비제한적 예는 인터류킨 수용체, 인터페론 수용체, 형질전환 성장인자 수용체, 종양 괴사 인자 수용체 또는 집락 자극 인자 수용체, 이들의 상동체 및 이들의 단편일 수 있다. 수용체는 수용체 키나제일 수 있다. 수용체는 키나제는 타이로신 키나제 수용체일 수 있다. 수용체 키나제는 세린 키나제 수용체일 수 있다. 수용체 키나제는 트레오닌 키나제 수용체일 수 있다. 비제한적 예로서, 수용체 키나제는 Ras, Raf, PI3K,단백질 키나제 A, 단백질 키나제 B, 단백질 키나제 C, AKT, AMPK 또는 포스포리파제, 이의 상동체 및 이의 단편으로부터 선택된 신호전달 단백질을 활성화시킬 수 있다. 수용체 키나제는 MAPK/ERK 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있다. 수용체 키나제는 Jak, Stat 또는 Smad를 활성화시킬 수 있다.
세포 표면 분자는 비-수용체 세포 표면 단백질일 수 있다. 세포 표면 분자는 분화 단백질의 클러스터일 수 있다. 비제한적 예로서, 세포 표면 분자는 CD34, CD31, CD117, CD45, CD11b, CD15, CD24, CD114, CD182, CD14, CD11a, CD91, CD16, CD3, CD4, CD25, CD8, CD38, CD22, CD61, CD56, CD30, CD13, CD33, 이의 단편, 및 이의 상동체로부터 선택될 수 있다.
세포 표면 분자는 펩타이드를 포함하지 않는 분자일 수 있다. 세포 표면 분자는 지질을 포함할 수 있다. 세포 표면 분자는 지질 모이어티 또는 지질기를 포함할 수 있다. 지질 모이어티는 스테롤을 포함할 수 있다. 지질 모이어티는 지방산을 포함할 수 있다. 항원은 당지질을 포함할 수 있다. 세포 표면 분자는 탄수화물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 (a) 효모 전사 인자 펩타이드로부터의 펩타이드를 포함하는 키메라 항원 수용체 결합 펩타이드 항원; 및 (b) 표적화 폴리펩타이드를 포함하는 CAR-EC 스위치가 개시된다. 효모 전사 인자 펩타이드는 GCN4 펩타이드일 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 표적화 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 항체의 중쇄를 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 항체의 경쇄를 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 항체의 Fab를 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 항-CD19 항체 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 항-Her2 항체 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 항-CS1 항체, 항-BCMA 항체, 항-EGFRvIII 항체, 항-CD20 항체, 항-EGFR 항체, 항-CEA 항체, 항-CLL-1 항체, 항-CD33 항체 및 이들의 단편으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에서 (a) 친수성 표적 펩타이드(HTP) 태그를 포함하는 CAR 결합 영역; 및 (b) 표적화 폴리펩타이드를 포함하는 CAR-EC 스위치가 추가로 개시된다. 표적화 폴리펩타이드는 표적화 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 항체의 중쇄를 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 항체의 경쇄를 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 항체의 Fab를 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 항-CD19 항체 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 항-Her2 항체 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 표적화 항체 또는 항체 단편은 항-CS1 항체, 항-BCMA 항체, 항-EGFRvIII 항체, 항-CD20 항체, 항-EGFR 항체, 항-CEA 항체, 항-CLL-1 항체, 항-CD33 항체 및 이들의 단편으로부터 선택될 수 있다.
키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 38로부터 선택된 중쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 38로부터 선택된 서열에 대해 적어도 50% 상동성인 중쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 38로부터 선택된 서열에 대해 적어도 60% 상동성인 중쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 38로부터 선택된 서열에 대해 적어도 70% 상동성인 중쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 38로부터 선택된 서열에 대해 적어도 80% 상동성인 중쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35 및 서열번호 38로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90% 상동성인 중쇄를 포함할 수 있다.
키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 36 및 서열번호 37로부터 선택된 경쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 36 및 서열번호 37로부터 선택된 서열에 대해 적어도 50% 상동성인 경쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 36 및 서열번호 37에 대해 적어도 60% 상동성인 경쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 36 및 서열번호 37에 대해 적어도 70% 상동성인 경쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 36 및 서열번호 37에 대해 적어도 80% 상동성인 경쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 36 및 서열번호 37에 대해 적어도 90% 상동성인 경쇄를 포함할 수 있다.
키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 29의 중쇄 및 서열번호 30의 경쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 29의 중쇄 및 서열번호 36의 경쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 28의 중쇄 및 서열번호 31의 경쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 32의 중쇄 및 서열번호 27의 경쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 33의 중쇄 및 서열번호 27의 경쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 34의 중쇄 및 서열번호 27의 경쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 35의 중쇄 및 서열번호 27의 경쇄를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 서열번호 38의 중쇄 및 서열번호 37의 경쇄를 포함할 수 있다.
다가 CAR-EC 스위치
본 명세서에서 키메라 항원 수용체 결합 펩타이드 항원(CAR-BP) 및 표적화 폴리펩타이드를 포함하는 CAR-EC 스위치가 예시된다. 그러나, 당업자는 이들 스위치가 추가적인 표적화 폴리펩타이드 및/또는 추가적인 CAR-BP를 추가로 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 하나 이상의 CAR-BP는 표적화 폴리펩타이드의 하나 이상의 접합 부위 내로 접합될 수 있다. 하나 이상의 CAR-BP는 표적화 폴리펩타이드의 하나 이상의 말단에 융합될 수 있다. 이는 몇몇 접합/융합 부위가 CAR에 대한 CAR-BP의 최적의 결합을 제공하는 것으로 예측될 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 예를 들어, 제1 CAR-BP은 표적화 폴리펩타이드의 제1 도메인 내로 접합될 수 있고, 제2 CAR-BP는 표적화 폴리펩타이드의 제2 도메인 내로 접합될 수 있다. 제1 도메인과 제2 도메인은 동일할 수 있다. 제1 도메인과 제2 도메인은 상이할 수 있다. 비제한적 예로서, 제1 CAR-BP는 표적화 항체 또는 항체 단편의 경쇄 내로 접합될 수 있고, 제2 CAR-BP는 표적화 항체 또는 항체 단편의 중쇄 내로 접합될 수 있다. 제1 CAR-BP는 표적화 폴리펩타이드의 제1 말단에 융합될 수 있고, 제2 CAR-BP는 표적화 폴리펩타이드의 제2 말단에 융합될 수 있다. 비제한적 예로서, 제1 CAR-BP는 표적화 항체 또는 항체 단편의 경쇄의 C 말단에 융합될 수 있고, 제2 CAR-BP는 표적화 항체 또는 항체 단편의 중쇄의 N 말단에 융합될 수 있다. 제1 CAR-BP는 표적화 폴리펩타이드의 말단에 융합될 수 있고, 제2 CAR-BP는 표적화 폴리펩타이드의 도메인 내에서 접합될 수 있다. CAR-EC 스위치가 하나의 CAR을 발현시키는 CAR-EC 세포와 함께 사용될 수 있도록, 제1 CAR-BP와 제2 CAR-BP는 동일 또는 유사할 수 있다. AR-EC 스위치가 하나 이상의 CAR을 발현시키는 CAR-EC 또는 상이한 CAR을 발현시키는 다중 CAR-EC 세포와 함께 사용될 수 있도록 제1 CAR-BP와 제2 CAR-BP는 상이할 수 있다.
본 명세서에 개시된 펩타이드 스위치는 하나 이상의 CAR-BP를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 펩타이드 스위치는 2개 이상의 CAR-BP를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 펩타이드 스위치는 3개 이상의 CAR-BP를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 펩타이드 스위치는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 이상의 CAR-BP를 포함할 수 있다. 하나 이상의 CAR-BP는 하나 이상의 링커를 통해 표적화 폴리펩타이드에 융합 또는 접합될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 개시된 펩타이드 스위치는 하나 이상의 링커(예를 들어, L1, L2)를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 펩타이드 스위치는 2개 이상의 링커를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 펩타이드 스위치는 3개 이상의 링커를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 펩타이드 스위치는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 이상의 링커를 포함할 수 있다.
IB . 펩타이드 - 소분자 스위치
본 명세서에서 결합 영역 및 표적화 모이어티를 포함하는 CAR-EC 스위치가 추가로 개시되되, CAR 결합 영역은 CAR-결합 펩타이드 항원이고, 표적화 모이어티는 비-펩타이드 소분자이다. 비-펩타이드 소분자는 세포-표적화 분자, 화학적 리간드, 핵산, 비타민, 기질 또는 기질 유사체일 수 있다. 비-펩타이드 소분자는 2개의 아미노산을 포함하지 않을 수도 있되, 2개의 아미노산은 아마이드 결합에 의해 연결된다. CAR-EC 스위치는 링커를 추가로 포함할 수 있다. CAR-결합 펩타이드 항원(CAR-BP) 및 소분자는 부위-특이적으로 연결될 수 있다. CAR-결합 펩타이드 항원은 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. CAR-결합 펩타이드 항원 및 소분자는 비천연 아미노산에 의해 부위-특이적으로 연결될 수 있다. 소분자는 표적 세포 상에서 세포 표면 분자에 결합될 수 있다. 세포 표면 분자는 항원, 단백질, 펩타이드, 지질, 스테롤, 당지질 및 세포 표면 마커로부터 선택될 수 있다. CAR-결합 펩타이드 항원은 FLAG(등록상표) 태그, 효모 전사 인자 GCN4 및 친수성 표적 펩타이드(HTP)로부터 선택될 수 있다. 소분자는 2-[3-(1,3-다이카복시프로필)우레이도]펜탄다이온산일 수 있다. 소분자는 엽산일 수 있다. CAR-EC 스위치는 링커를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 표적화 모이어티에 CAR 결합 영역을 컨쥬케이팅하는 단계를 포함하는 CAR-EC 스위치의 생성방법이 개시되되, CAR-EC 스위치는 CAR 결합 영역 및 표적화 모이어티를 포함하고, CAR 결합 영역은 CAR-결합 펩타이드 항원이며, 표적화 모이어티는 소분자이다. 상기 방법은 링커에 소분자를 컨쥬게이팅하여 소분자-링커 중간체를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 소분자 또는 소분자-링커 중간체는 CAR-EC 스위치 내로 혼입되기 전에 CAR-BP 상에서 상보적 반응성 작용기와 반응할 수 있는 하나 이상의 반응 작용기를 포함할 수 있다. 링커 또는 소분자-링커 중간체는 2작용성일 수 있다. 링커 또는 소분자-링커 중간체는 헤테로2작용성일 수 있다.
소분자-링커 중간체 또는 CAR-EC 스위치는 생물직교(bioorthogonal) 반응의 생성물일 수 있으며, 이의 비제한적 예는 문헌[Kim et al., Curr Opin Chem Bio 17:412-419 (2013)]에서 검토된다. 소분자-링커 중간체, 링커 또는 CAR-EC 스위치는 옥심, 테트라졸, 딜스 알더 부가물, 헤테로 딜스 알더 부가물, 방향족 치환 반응 생성물, 친핵성 치환 반응 생성물, 에스터, 아마이드, 카밤산염, 에터, 티오에터, 또는 마이클 반응 생성물을 포함할 수 있다. 소분자-링커 중간체, 링커 또는 CAR-EC 스위치는 첨가 환화 생성물, 복분해 반응 생성물, 금속-매개 교차-결합 반응 생성물, 라디칼 중합 생성물, 산화적 결합 생성물, 아실-전달 반응 생성물, 또는 광 클릭 반응 생성물일 수 있다. 첨가 환화는 후이스겐(Huisgen)-첨가 환화일 수 있다. 첨가 환화는 무구리(copper-free) [3+2] 후이스겐-첨가 환화일 수 있다. 첨가 환화는 딜스-알더 반응일 수 있다. 첨가 환화는 헤테로 딜스-알더 반응일 수 있다. 상기 링커는 효소-매개 반응의 생성물일 수 있다. 상기 링커는 트랜스글루타미나제-매개 반응의 생성물일 수 있으며, 이의 비제한적 예는 문헌[Lin et al., J. Am. Chem. Soc. 128:4542-4543 (2006)] 및 제WO 2013/093809호에 기재되어 있다. 소분자-링커 중간체, 링커 또는 CAR-EC 스위치는 폴리테릭스(PolyTherics)에 의한 티오브릿지(ThioBridge)(상표명) 기법과 같이 두 시스테인 잔기를 연결하는 이황화 브릿지를 포함할 수 있다. 소분자-링커 중간체, 링커 또는 CAR-EC 스위치는 두 아미노산 잔기를 연결하는 말레이미드 브릿지를 포함할 수 있다. 소분자-링커 중간체, 링커 또는 CAR-EC 스위치는 두 시스테인 잔기를 연결하는 말레이미드 브릿지를 포함할 수 있다.
소분자-링커 중간체 또는 링커는 하나 이상의 말단에서 알콕시-아민(또는 아미노옥시)기, 아자이드기 및/또는 사이클로옥틴기를 포함할 수 있다. 소분자-링커 중간체 또는 링커는 하나의 말단에서 알콕시-아민 및 다른 말단에서 아자이드기를 포함할 수 있다. 소분자-링커 중간체 또는 링커는 하나의 말단에서 알콕시-아민 및 다른 말단에서 사이클로옥틴기를 포함할 수 있다. 알콕시-아민은 아미노산 상에서 케톤기와 안정한 옥심을 형성할 수 있다. 알콕시-아민은 비천연 아미노산 상에서 케톤기와 안정한 옥심을 형성할 수 있다. 케톤기는 p-아세틸 페닐알라닌(pAcF) 상에 있을 수 있다.
II. 키메라 항원 수용체(CAR)
본 명세서에서 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 세포의 활성을 조절하는 CAR-EC 스위치가 개시된다. 키메라 항원 수용체는 세포밖 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 세포밖 도메인은 CAR-EC 스위치의 펩타이드 항원(예를 들어, CAR-BP)에 결합될 수 있다. 세포밖 도메인은 CAR-EC 스위치(CAR-항체)의 CAR-BP에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. CAR-항체는 항체의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 항체는 전장 항체가 아니다. CAR-항체는 면역글로불린 또는 이의 단편의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 면역글로불린 또는 이의 단편은 scFv, 다이-scFv, 바이-scFv, Fab, Fc, F(ab')2, a pFc', 나노바디, 어피바디, DARPin, 다이어바디, 카멜리드, 공학 처리된 T 세포 수용체 및 모노바디로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 면역글로불린은 IgA1, IgA2, IgD, IgM, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. CAR-항체는 단일쇄 가변 단편(scFv)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. CAR-항체는 인간, 완전한 인간, 인간화된, 인간 공학 처리된, 비-인간 및/또는 키메라 항체일 수 있다.
CAR-항체는 CAR-BP에 대한 결합 친화도가 약 0.01pM, 약 0.02pM, 약 0.03pM, 약 0.04pM, 0.05pM, 약 0.06pM, 약 0.07pM, 약 0.08pM, 약 0.09pM, 약 0.1pM, 약 0.2pM, 0.3pM, 약 0.4pM, 약 0.5pM, 약 0.6pM, 약 0.7pM, 약 0.8pM, 약 0.9 pM 또는 약 1pM, 약 2pM, 약 3pM, 약 4pM, 약 5pM, 약 6pM, 약 7pM, 약 8pM, 약 9pM, 약 10pM, 약 0.01nM, 약 0.02nM, 약 0.03nM, 약 0.04nM, 약 0.05nM, 약 0.06nM, 약 0.07nM, 약 0.08nM, 약 0.09nM, 약 0.1nM, 약 0.2nM, 약 0.3nM, 약 0.4nM, 약 0.5nM, 약 0.6nM, 약 0.7nM, 약 0.8nM, 약 0.9nM, 약 1nM, 약 2nM, 약 2.5nM, 약 3nM, 약 4nM, 약 5nM, 약 6nM, 약 7nM, 약 8nM, 약 9nM, 약 10nM, 약 12nM, 약 14nM, 약 16nM, 약 18nM, 약 20nM, 약 22nM, 약 24nM, 약 26nM, 약 28 nM 또는 약 30 nM 미만일 수 있다.
CAR-항체는 합성(비-자연적으로-생기는) 펩타이드를 인식할 수 있다. CAR-항체는 FLAG(등록상표) 태그 또는 이들의 단편을 인식하는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. CAR-항체는 효모 전사 인자 GCN4 또는 이들의 단편을 인식하는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. CAR-항체는 항-HTP 항체 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다.
CAR의 막관통 도메인 및/또는 세포내 도메인은 세포질 신호전달 도메인의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 CD3제타, CD28 및 4-1BB를 포함하는 군으로부터 선택된 신호전달 분자의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. Fc 수용체 또는 이의 일부는 CD16 또는 이의 일부일 수 있다. 신호전달 분자는 CD3제타를 포함할 수 있다. 신호전달 분자는 CD28을 포함할 수 있다. 신호전달 분자는 4-1BB를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 CD3제타의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 CD28의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 4-1BB의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 OX-40의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 CD30의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 CD40의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 CD2의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 CD27의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 PD-1의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 ICOS의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 CD7의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 LIGHT의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인 NKG2C의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 B7-H3의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 하나 이상의 신호전달 분자로부터의 세포질 신호전달 도메인의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 2 이상의 세포질 신호전달 도메인의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 2 이상의 세포질 신호전달 도메인은 2 이상의 상이한 신호전달 분자의 적어도 일부로부터 유래될 수 있다. 세포내 도메인은 3 이상의 세포질 신호전달 도메인의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 4 이상의 세포질 신호전달 도메인의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 하나 이상의 신호전달 분자에 결합하는 리간드의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 CD83에 결합하는 리간드의 적어도 일부를 포함할 수 있다.
III. 키메라 항원 수용체 효과기 세포(CAR-EC)
본 명세서에 개시된 방법, 플랫폼 및 키트는 하나 이상의 키메라 항원 수용체 효과기 세포(CAR-EC) 또는 이의 용도를 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 키메라 항원 수용체 효과기 세포는 키메라 항원 수용체를 발현시킨다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 본 명세서에 개시된 임의의 CAR일 수 있다. 상기 방법, 플랫폼 또는 키트는 2 이상의 효과기 세포를 포함하되, 2 이상의 효과기 세포는 동일한 세포 유형을 가질 수 있다. 2 이상의 효과기 세포는 상이한 세포 유형을 가질 수 있다. 2 이상의 효과기 세포는 동일한 세포 계통을 가질 수 있다. 2 이상의 효과기 세포는 상이한 세포 계통을 가질 수 있다. 2 이상의 효과기 세포는 2 이상의 동일한 CAR을 포함할 수 있다. 2 이상의 효과기 세포는 2 이상의 상이한 CAR을 포함할 수 있다. 2 이상의 효과기 세포는 2 이상의 유사한 CAR을 포함할 수 있다.
효과기 세포는 T 세포일 수 있다. 효과기 세포는 T 세포 계통의 세포일 수 있다. 효과기 세포는 성숙 T 세포일 수 있다. 효과기 세포는 전구체 T 세포일 수 있다. 효과기 세포는 세포독성 T 세포일 수 있다. 효과기 세포는 나이브 T 세포일 수 있다. 효과기 세포는 기억 줄기 세포 T 세포(TMSC)일 수 있다. 효과기 세포는 중추 기억 T 세포(TCM)일 수 있다. 효과기 세포는 효과기 T 세포(TE)일 수 있다. 효과기 세포는 CD4+ T 세포일 수 있다. T 세포는 CD8+ T 세포일 수 있다. 효과기 세포는 CD4+ 및 CD8+ 세포일 수 있다. 효과기 세포는 알파-베타 T 세포일 수 있다. 효과기 세포는 감마-베타 T 세포일 수 있다. 효과기 세포는 자연 살해 T 세포일 수 있다. 효과기 세포는 헬퍼 T 세포일 수 있다.
본 개시내용의 바람직한 실시형태는 T 세포를 포함하는 방법, 키트 및 플랫폼을 기재하지만, 당업자는 또한 다른 세포 유형이 T 세포 대신 사용될 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 효과기 세포는 표적 또는 표적 세포에 근위로 운반될 때 표적 또는 표적 세포 상에서 효과를 갖는 효과기 세포일 수 있다. 효과기 세포는 표적 또는 표적 세포의 근위로 운반될 때 표적 또는 표적 세포 상에서 세포독성 효과를 갖는 세포일 수 있다. 효과기 세포는 면역 세포일 수 있다. 효과기 세포는 B 세포, 단핵구, 혈소판, 백혈구, 호중구, 호산구, 호염구, 또는 림프구로부터 선택될 수 있다. 효과기 세포는 림프구일 수 있다. 효과기 세포는 대식세포일 수 있다. 효과기 세포는 식세포일 수 있다. 효과기 세포는 효과기 B 세포일 수 있다. 효과기 세포는 자연 살해 세포일 수 있다. 효과기 세포는 질환 또는 병태로 고통받고 있는 대상체로부터 단리되거나 또는 유래될 수 있다. 효과기 세포는 본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치 또는 CAR-EC 플랫폼으로 치료 중인 대상체로부터 유래된 세포일 수 있다.
T 세포는 서열번호 1에 기반하거나 또는 유래된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 키메라 항원 수용체를 발현시킬 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1에 기반하거나 또는 유래된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1에 기반하거나 또는 유래된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 70% 동일할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드는 서열번호 1에 기반하거나 또는 유래될 수 있다. 폴리펩타이드는 서열번호 1에 기반하거나 또는 유래된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 구성적으로 발현될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 조건적으로 발현될 수 있다.
본 명세서에서 키메라 항원 수용체 또는 키메라 항원 수용체 복합체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 효과기 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 키메라 항원 수용체 효과기 세포(CAR-EC)의 생성 방법이 개시된다. 효과기 세포는 T 세포일 수 있다. 키메라 항원 수용체 또는 키메라 항원 수용체 복합체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 효과기 세포 내로 도입하는 단계는 효과기 세포를 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 형질감염시키는 단계를 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체 또는 키메라 항원 수용체 복합체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 효과기 세포 내로 도입하는 단계는 본 명세서에 개시된 키메라 항원 수용체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 바이러스를 이용하여 효과기 세포를 바이러스로 감염시키는 단계를 포함할 수 있다. 바이러스는 렌티바이러스일 수 있다. 바이러스는 아데노바이러스일 수 있다. 바이러스는 레트로바이러스일 수 있다. 바이러스는 아데노-연관 바이러스일 수 있다. 바이러스는 자기-상보적 아데노-연관 바이러스(scAAV)일 수 있다. 바이러스는 변형된 인간 면역결핍(HIV) 바이러스일 수 있다. 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV) 바이러스일 수 있다. CAR-EC를 생성하는 다른 방법은 키메라 항원 수용체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 전달하는 방법을 포함할 수 있되, 상기 방법은 전이인자, 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN 또는 CRISPR을 세포에 첨가하는 단계를 포함한다. 전이인자는 잠자는 미녀(sleeping beauty) 전이인자일 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1에 기반하거나 또는 유래될 수 있다.
IV. CAR-EC 플랫폼
본 명세서에서 효과기 세포를 포함하는 키메라 항원 수용체 효과기 세포(CAR-EC) 플랫폼이 개시되되, 효과기 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 키메라 항원 수용체 효과기 세포(CAR-EC) 스위치를 포함하되, CAR-EC 스위치는 CAR 결합 펩타이드 항원 및 표적화 폴리펩타이드를 포함하고, CAR-EC 스위치는 표적 세포 상에서 세포 표면 분자에 결합한다. CAR-EC 스위치는 본 명세서에 개시된 임의의 CAR-EC 스위치로부터 선택될 수 있다.
CAR-EC 플랫폼은 2 이상의 CAR-EC 스위치를 포함할 수 있다. CAR-EC 플랫폼은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 CAR-EC 스위치를 포함할 수 있다. CAR-EC 플랫폼은 20개 초과, 25개 초과, 30개 초과, 35개 초과, 40개 초과, 45개 초과 또는 50개 초과의 CAR-EC 스위치를 포함할 수 있다. 2 이상의 스위치는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 CAR-EC 스위치 또는 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에 개시된 CAR-EC 플랫폼은 제1 CAR-EC 스위치 및 제2 CAR-EC 스위치를 추가로 포함할 수 있되, 제1 CAR-EC 스위치는 제1 CAR-BP 및 제1 표적화 폴리펩타이드를 포함하고, 제2 CAR-EC 스위치는 제2 CAR-BP 및 제2 표적화 폴리펩타이드를 포함한다. 제1 CAR-BP와 제2 CAR-BP는 동일할 수 있다. 제1 CAR-BP와 제2 CAR-BP는 상이할 수 있다. 제1 CAR-BP 및 제2 CAR-BP는 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 92%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5% 또는 약 2% 상동성일 수 있다. 제1 표적화 폴리펩타이드 및 제2 표적화 폴리펩타이드는 동일할 수 있다. 제1 표적화 폴리펩타이드와 제2 표적화 폴리펩타이드는 상이할 수 있다. 제1 표적화 폴리펩타이드 및 제2 표적화 폴리펩타이드는 약 99%, 약 98%, 약 97%, 약 96%, 약 95%, 약 92%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5% 또는 약 2% 상동성일 수 있다.
V. 키트 , 벡터 및 폴리뉴클레오타이드
본 명세서에서 본 명세서에 개시된 하나 이상의 CAR-EC 스위치를 포함하는 키트가 개시된다. 키트는 2 이상의 CAR-EC 스위치를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 3개의 CAR-EC 스위치를 포함할 수 있다. 상기 키트는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 24, 30, 35, 48, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 120, 150, 200, 300, 384, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개의 CAR-EC 스위치를 포함할 수 있다. 키트는 생물학적 연구를 위해 사용될 수 있다. 키트는 질환 또는 병태를 진단하기 위해 사용될 수 있다. 키트는 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 키트의 CAR-EC 스위치는 본 명세서에 개시된 CAR-EC 세포 또는 임상적으로 사용되거나 또는 시험된 기존의 CAR T-세포를 이용하여 사용될 수 있다. 키트는 하나 이상의 효과기 세포를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 하나 이상의 CAR-EC 세포를 추가로 포함할 수 있다. CAR-EC 세포는 T 세포일 수 있다. T 세포는 하나 이상의 CAR을 발현시킬 수 있다. 키트는 하나 이상의 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 키트는 하나 이상의 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 추가로 포함할 수 있다. CAR은 본 명세서에 개시된 임의의 CAR로부터 선택될 수 있다. 키트는 본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부(예를 들어, 항체, 항체 단편, 펩타이드)를 포함할 수 있다.
추가로 본 명세서에서 CAR-EC 스위치를 암호화하는 벡터 및 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부가 개시되되, CAR-EC 스위치는 키메라 항원 수용체 결합 펩타이드 항원 및 표적화 폴리펩타이드를 포함하고, 표적화 펩타이드는 표적 세포 상에서 세포 표면 분자에 결합된다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 RNA일 수 있다. 달리 구체화되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "벡터"는 상호호환적으로 사용된다. 표적화 폴리펩타이드는 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 벡터는 항체 또는 항체 단편의 중쇄를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 항체 또는 항체 단편의 경쇄를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 항체 또는 항체 단편의 경쇄를 암호화하는 서열 및 항체 또는 항체 단편의 중쇄를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 경쇄 및 중쇄는 동일한 벡터로부터 발현될 수 있다. 경쇄 및 중쇄는 2개의 별도의 벡터로부터 발현될 수 있다.
본 명세서에서 키메라 항원 수용체를 암호화하는 벡터 및 폴리뉴클레오타이드가 개시되되, 키메라 항원 수용체는 키메라 항원 수용체 효과기 세포 스위치의 펩타이드에 결합하는 세포밖 도메인을 포함한다. 세포밖 도메인은 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 키메라 항원 수용체 효과기 세포 스위치의 펩타이드 항원에 결합할 수 있다. 펩타이드 항원은 효모 펩타이드일 수 있다. 효모 펩타이드는 GCN4일 수 있다. f a 또는 이의 일부는 서열번호 1에 기반하거나 또는 유래된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있다. CAR 또는 이의 일부는 서열번호 1에 기반하거나 또는 유래된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 CAR 또는 이의 일부는 서열번호 1에 기반하거나 또는 유래된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 약 70% 동일할 수 있다. 본 명세서에서 서열번호 1에 기반하거나 또는 유래된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 개시된다.
본 명세서에 개시된 키메라 항원 수용체 및/또는 키메라 항원 수용체 효과기 세포 스위치 및 이의 일부를 암호화하는 서열을 포함하는 벡터는 임의의 상업적으로 입수가능한 발현 벡터로부터 선택될 수 있다. 발현 벡터는 원핵생물 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 진핵생물 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 포유류 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 바이러스 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 CAR 및/또는 CAR-EC 스위치 암호화 서열의 구성적 발현을 위한 구성적 프로모터를 가질 수 있다. 발현 벡터는 CAR 및/또는 CAR-EC 스위치 암호화 서열의 조건적 발현을 위한 유도성 프로모터를 가질 수 있다.
VI. 치료적 용도
본 명세서에서 치료가 필요한 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법, 플랫폼 및 키트가 개시되며, 상기 방법은 키메라 항원 수용체 효과기 세포(CAR-EC) 스위치를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, CAR-EC 스위치는 CAR-결합 펩타이드 항원; 및 표적화 모이어티를 포함한다. 본 명세서에서 치료가 필요한 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치의 임의의 하나를 투여하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 CAR-EC 세포 및 하나 이상의 CAR-EC 스위치를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 24, 30, 35, 48, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 120, 150, 200, 300, 384, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 이상의 CAR-EC 스위치를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 2 이상의 CAR-EC 스위치를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 2 이상의 CAR-EC 스위치는 동일한 CAR-결합 펩타이드 항원을 포함할 수 있다. 2 이상의 CAR-EC 스위치는 동일한 세포 표적화 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 2 이상의 CAR-EC 스위치는 하나 이상의 상이한 CAR-결합 펩타이드 항원을 포함할 수 있다. 2 이상의 CAR-EC 스위치는 하나 이상의 상이한 세포 표적화 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 방법은 복수의 CAR-EC 세포 및 하나 이상의 CAR-EC 스위치를 포함할 수 있다.
키메라 항원 수용체 효과기 세포(CAR-EC)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 개시되되, 상기 CAR-EC 스위치는 표적 상에서 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체 결합 펩타이드 항원(CAR-BP); 및 표적화 모이어티를 포함한다. 비제한적 예로서 CAR-BP는 FLAG(등록상표) 태그, 효모 전사 인자 GCN4 및 친수성 표적 펩타이드(HTP)로부터 선택될 수 있다. 비제한적 예로서 표적화 모이어티는 항-CD19 항체, 항-CD20 항체, 항-CD22 항체, 항-EGFR 항체, 항-EGFRvIII 항체, 항-Her2 항체, 항-CS1 항체, 항-BCMA 항체, 항-CEA 항체, 항-CLL-1 항체 및 항-CD33 항체로부터 선택될 수 있다.
상기 방법은 하나 이상의 키메라 항원 수용체 효과기 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 하나 이상의 T 세포를 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 효과기 세포는 나이브 T 세포, 기억 줄기 세포 T 세포, 중추 기억 T 세포, 효과기 기억 T 세포, 헬퍼 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD8/CD4+ T 세포, αβ T 세포, γδ T 세포, 세포독성 T 세포, 자연 살해 T 세포, 자연 살해 세포, 대식세포로부터 선택된 T 세포로부터 선택될 수 있다.
CAR-EC 스위치는 표적 세포의 근위에 효과기 세포를 운반하는 것에 적어도 부분적으로 의존하는 치료적 효과를 가질 수 있다. CAR-EC 스위치의 의도된 적응증에 대한 치료적 효과는 표적 세포에 대해 효과기 세포를 동원하는 CAR-EC 스위치에 적어도 부분적으로 기인할 수 있다. CAR-EC 스위치의 의도된 적응증에 대한 치료적 효과는 표적 세포에 대해 효과기 세포를 동원하는 CAR-EC 스위치에 우세하게 기인할 수 있다. CAR-EC 스위치의 치료적 효과는 CAR-EC 세포에서 면역 반응을 자극하는 것에 적어도 부분적으로 의존할 수 있다.
CAR-EC 스위치를 투여하는 것은 효과기 세포를 추가로 투여하는 일 없이 임의의 치료적 효과를 갖지 않을 수도 있다. CAR-EC 스위치는 효과기 세포를 추가로 투여하는 일 없이 상당한, 바람직한 및/또는 의도된 치료적 효과를 갖지 않을 수도 있다. CAR-EC 스위치는 효과기 세포를 추가로 투여하는 일 없이 CAR-EC 플랫폼의 의도된 적응증에 대해 임의의 치료적 효과를 갖지 않을 수도 있다. CAR-EC 스위치(예를 들어, CAR-BP 또는 표적화 모이어티)의 일부 또는 구성성분은 CAR-EC 스위치의 제2 부분 또는 구성성분(예를 들어, CAR-BP 또는 표적화 모이어티)에 컨쥬게이팅되는 일 없이 CAR-EC 스위치의 의도된 적응증에 대해 치료적 효과를 갖지 않을 수도 있다. 치료적 효과를 제공하기 위해 CAR-EC 플랫폼의 부분으로서 투여될 때, CAR-EC 스위치(예를 들어, CAR-BP 또는 표적화 모이어티)의 일부 또는 구성성분의 용량은 CAR-EC 스위치의 일부 또는 구성성분이 해당 용량에서 단독으로 투여될 때의 치료적 효과를 갖지 않을 수도 있다. CAR-EC 스위치의 일부 또는 구성성분은 표적 세포에 T 세포를 동원하는 일 이외에 임의의 치료적 효과를 갖는 것으로 의도되지 않을 수도 있다. CAR-EC 스위치 단독의 일부 또는 구성성분을 투여하는 것은 표적 세포 상에서 치료적 효과를 가질 수 있되, 치료적 효과는 CAR-EC 스위치 및 CAR-EC 세포를 투여하는 것의 치료적 효과에 비해 무시할 만하다. CAR-EC 스위치의 일부 또는 구성성분을 투여하는 것은 표적 세포 상에서 치료적 효과를 가질 수 있되, 치료적 효과는 CAR-EC 스위치 및 CAR-EC 세포를 투여하는 것의 치료적 효과 미만이다.
본 명세서에서 치료가 필요한 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하기 위해 본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치의 용도가 개시된다. 본 명세서에서 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치의 용도가 추가로 개시된다.
본 명세서에서 치료가 필요한 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하기 위해 효과기 세포 상의 CAR(CAR-BP)에 결합하는 펩타이드 항원; 및 표적 상의 항원에 결합하는 표적화 폴리펩타이드를 포함하는 스위치의 용도가 개시된다. 본 명세서에서 효과기 세포 상에서 CAR에 결합하는 펩타이드 항원(CAR-BP), 여기서 CAR-BP 및 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 표적 상의 항원에 결합하는 표적화 폴리펩타이드를 포함하는 스위치의 용도가 추가로 개시된다.
본 명세서에서 다발성 골수종을 치료하기 위해 CAR-BP 및 CAR을 포함하는 효과기 세포를 포함하는 CAR-EC 스위치의 용도가 개시되되, CAR-BP는 친수성 표적 펩타이드(HTP) 또는 이의 유도체 및 표적화 폴리펩타이드를 포함하며, 표적화 폴리펩타이드는 항-CD19 항체 또는 이의 단편을 포함하고, CAR은 항-HTP 항체를 포함하며, 항-CD19 항체 또는 이의 단편은 B 세포 상에서 CD19와 결합된다.
본 명세서에서 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 또는 B-세포 림프종을 치료하기 위해 CAR-BP 및 CAR을 포함하는 효과기 세포를 포함하는 CAR-EC 스위치의 용도가 개시되되, CAR-BP는 효모 전사 인자 GCN4 또는 이의 유도체 및 표적화 폴리펩타이드를 포함하고, 표적화 폴리펩타이드는 항-CD19 항체 또는 이의 단편을 포함하며; CAR은 항-GCN4 항체를 포함하고, 항-CD19 항체 또는 이의 단편은 림프아구, 림프구 또는 B 세포 상에서 CD19에 결합한다.
질환 또는 병태는 세포 증식성 장애일 수 있다. 세포 증식성 장애는 고형 종양, 림프종, 백혈병 및 지방육종으로부터 선택될 수 있다. 세포 증식성 장애는 관해, I기, II기, III기, IV기, 소아 또는 성인에서 급성, 만성, 재발성, 난치성, 가속화될 수 있다. 세포 증식성 장애는 골수성 백혈병, 림프모구성 백혈병, 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 단핵구성 백혈병, 호중구성 백혈병, 골수형성이상 증후군, B-세포 림프종, 버킷 림프종, 거대 세포 림프종, 혼합 세포 림프종, 여포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 호지킨 림프종, 재발성 소림프구성 림프종, 모발세포 백혈병, 다발성 골수종, 호염구성 백혈병, 호산구성 백혈병, 거핵아구성 백혈병, 단모구 백혈병, 단구 백혈병, 적백혈병, 적혈구 백혈병 및 간세포 암종으로부터 선택될 수 있다. 세포 증식성 장애는 혈액학적 악성종양을 포함할 수 있다. 혈액학적 악성종양은 B 세포 악성종양을 포함할 수 있다. 세포 증식성 장애는 만성 림프성 백혈병을 포함할 수 있다. 세포 증식성 장애는 급성 림프구성 백혈병을 포함할 수 있다. 암은 CD19-양성 버킷 림프종을 포함할 수 있다.
질환 또는 병태는 암, 병원균 감염, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 유전자 장애일 수 있다.
일부 예에서, 하나 이상의 질환은 암을 포함할 수 있다. 암은 재발성 및/또는 난치성 암을 포함할 수 있다. 암의 예는 육종, 암종, 림프종 또는 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
암은 신경내분비 암을 포함할 수 있다. 암은 췌장암을 포함할 수 있다. 암은 외분비 췌장암을 포함할 수 있다. 암은 갑상선암을 포함할 수 있다. 갑상선암은 갑상선수질암을 포함할 수 있다. 암은 전립선암을 포함할 수 있다.
암은 상피암을 포함할 수 있다. 암은 유방암을 포함할 수 있다. 암은 자궁내막암을 포함할 수 있다. 암은 난소암을 포함할 수 있다. 난소암은 기질 난소암을 포함할 수 있다. 암은 자궁경부암을 포함할 수 있다.
암은 피부암을 포함할 수 있다. 피부암은 신생혈관형성 피부암을 포함할 수 있다. 피부암은 흑색종을 포함할 수 있다.
암은 신장암을 포함할 수 있다.
암은 폐암을 포함할 수 있다. 폐암은 소세포 폐암을 포함할 수 있다. 폐암은 비소세포 폐암을 포함할 수 있다.
암은 결장직장암을 포함할 수 있다. 암은 위암을 포함할 수 있다. 암은 결장암을 포함할 수 있다.
암은 뇌암을 포함할 수 있다. 뇌암은 뇌종양을 포함할 수 있다. 암은 교모세포종을 포함할 수 있다. 암은 성상세포종을 포함할 수 있다.
암은 혈액암을 포함할 수 있다. 혈액암은 백혈병을 포함할 수 있다. 백혈병은 골수성 백혈병을 포함할 수 있다. 암은 림프종을 포함할 수 있다. 림프종은 비호지킨 림프종을 포함할 수 있다.
암은 육종을 포함할 수 있다. 육종은 유잉 육종을 포함할 수 있다.
육종은 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈관 또는 다른 연결 또는 지지 조직의 암이다. 육종은 뼈암, 섬유육종, 연골육종, 유잉 육종, 악성 혈관내피종, 악성 신경초종, 양측성 전정 슈반종, 골육종, 연조직 육종(예를 들어 폐포성 연부육종, 혈관육종, 엽상낭상육종, 피부섬유육종, 데스모이드 종양, 상피모약 육종, 골격외 골육종, 섬유육종, 혈관주위세포종, 혈관육종, 카포씨 육종, 평활근육종, 지방육종, 림프혈관육종, 림프육종, 악성 섬유성 조직구종, 신경섬유육종, 횡문근육종, 및 활막육종)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
암종은 신체 표면을 뒤덮고, 호르몬을 생성하며, 샘을 구성하는 세포인 상피 세포에서 시작하는 암이다. 비제한적 예로서, 암종은 유방암, 췌장암, 폐암, 결장암, 직장결장암, 직장암, 신장암, 방광암, 위암, 전립선암, 간암, 난소암, 뇌암, 질암, 외음부암, 방광암, 구강암, 음경암, 고환암, 식도암, 피부암, 나팔관암, 두경부암, 위장관간질종양, 선암종, 피부 또는 안구내 흑색종, 항문부암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 요도암, 신우암, 자궁암, 자궁내막암, 자궁경부암, 뇌하수체암, 중추신경계의 신생물(CNS), 1차 CNS 림프종, 뇌 줄기 신경교종, 및 척수종양을 포함한다. 일부 예에서, 암은 피부암, 예컨대 기저세포 암종, 편평, 흑색종, 비흑색종 또는 화학선(태양광) 각화증이다.
일부 예에서, 암은 폐암이다. 폐암은 기관에서 갈라지는 기도에서 시작하여 폐(기관지) 또는 폐의 작은 공기 주머니(폐포)로 공급될 수 있다. 폐암은 비소세포 폐 암종(NSCLC), 소세포 폐 암종, 및 중피종을 포함한다. NSCLC의 예는 편평세포 암종, 선암종 및 거대 세포 암종을 포함한다. 중피종은 폐 및 흉강(늑막)의 내벽 또는 복부(복막)의 내벽의 암성 종양일 수 있다. 중피종은 석면 노출에 기인할 수 있다. 암은 뇌암, 예컨대 교모세포종일 수 있다.
대안적으로, 암은 중추신경계(CNS) 종양일 수 있다. CNS 종양은 신경교종 또는 비신경교종으로서 분류될 수 있다. 신경교종은 악성 신경교종, 고등급 신경교종, 미만성 내재 뇌교교종 신경교종일 수 있다. 신경교종의 예는 성상세포종, 희소돌기신경교종(또는 희소돌기신경교종 및 성상세포종 구성요소의 혼합물), 및 뇌실막세포종을 포함한다. 성상세포종은 저등급 성상세포종, 악성 성상세포종, 교모세포종 다형홍반, 모양세포성 성상세포종, 다형성 황색성상세포종, 및 뇌실막 및 거대 세포 성상세포종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 희소돌기신경교종은 저등급 희소돌기신경교종(또는 올리고성상세포종) 및 악성 희소돌기아교신경교종을 포함한다. 비신경교종은 수모세포종, 뇌하수체 종양, 원발성 CNS 림프종, 및 수아세포종을 포함한다. 일부 예에서, 암은 수막종이다.
백혈병은 급성 림프성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 또는 만성 골수성 백혈병일 수 있다. 백혈병은 추가적인 유형은 모발세포 백혈병, 만성 단핵구성 백혈병, 및 청소년 단핵구성 백혈병을 포함한다.
림프종은 림프구의 암이며, B 또는 T 림프구로부터 생길 수 있다. 림프종의 두 가지 주된 유형은 호지킨병으로서 이미 알려진 호지킨 림프종, 및 비-호지킨 림프종이다. 호지킨 림프종은 리드스텐버그 세포의 존재에 의해 표시된다. 비-호지킨 림프종은 호지킨 림프종이 아닌 모든 림프종이다. 비-호지킨 림프종은 나태한 림프종 및 공격적 림프종일 수 있다. 비-호지킨 림프종은 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 점막 연관 림프 조직 림프종(MALT), 소세포 림프구 림프종, 맨틀 세포 림프종, 버킷 림프종, 종격동 거대 B 세포 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 림프절 변연부 B 세포 림프종(NMZL), 비장 변연부 림프종(SMZL), 림프절밖 변연부 B 세포 림프종, 혈관내 거대 B 세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종, 및 육아종성림프종증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
암은 고형 종양을 포함할 수 있다. 암은 육종일 수 있다. 암은 방광암, 유방암, 결장암, 직장암, 자궁내막암, 신장암, 폐암, 흑색종, 골수종, 갑상선암, 췌장암, 신경교종, 뇌의 악성 신경교종, 교모세포종, 난소암 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 암은 비-균일 항원 발현을 가질 수 있다. 암은 조절된 항원 발현을 가질 수 있다. 항원은 표면 항원일 수 있다. 암은 골수종을 포함하지 않을 수 있다. 암은 흑색종을 포함하지 않을 수 있다. 암은 결장암을 포함하지 않을 수 있다. 암은 급성 림프구성 백혈병(ALL)일 수 있다. 암은 재발 ALL일 수 있다. 암은 난치 ALL일 수 있다. 암은 재발, 난치 ALL일 수 있다. 암은 만성 림프성 백혈병(CLL)일 수 있다. 암은 재발 CLL일 수 있다. 암은 난치 CLL일 수 있다. 암은 재발, 난치 CLL일 수 있다.
암은 유방암을 포함할 수 있다. 유방암은 삼중 양성유방암(에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 Her2 양성)일 수 있다. 유방암은 삼중 음성 유방암(에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 Her2 음성)일 수 있다. 유방암은 에스트로겐 수용체 양성일 수 있다. 유방암은 에스트로겐 수용체 음성일 수 있다. 유방암은 프로게스테론 수용체 양성일 수 있다. 유방암은 프로게스테론 수용체 음성일 수 있다. 유방암은 Her2 음성 유방암을 포함할 수 있다. 유방암은 저발현 Her2 유방암을 포함할 수 있다. 유방암은 Her2 양성 유방암을 포함할 수 있다. Her2를 발현시키는 세포주는 항원 밀도에 대해 잘 특성규명되었고, 0(<20,000 Her2 항원/세포), 1+(100,000 Her2 항원/세포), 2+(500,000 Her2 항원/세포) 및 3+(>2,000,000 Her2 항원/세포)로서 악성종양으로 분류되는 임상 면역조직화학 특징을 반영한다. 본 발명은 이들 분류의 유방암을 치료하는 방법을 제공한다. 유방암은 Her2 0으로서 분류되는 유방암을 포함할 수 있다. 유방암은 Her2 1+로서 분류되는 유방암을 포함할 수 있다. 유방암은 Her2 2+로서 분류되는 유방암을 포함할 수 있다. 유방암은 Her2 3+으로서 분류되는 유방암을 포함할 수 있다.
질환 또는 병태는 병원성 감염일 수 있다. 병원성 감염은 하나 이상의 병원균에 의해 야기될 수 있다. 일부 예에서, 병원균은 박테리아, 진균, 바이러스 또는 원생동물이다.
예시적인 병원균은 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아(Chlamydia), 클라미도필라(Chlamydophila), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테륨(Corynebacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 에스케리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 헤모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 레지오넬라(Legionella), 렙토스피라(Leptospira), 리스테리아(Listeria), 마이코박테륨(Mycobacterium), 마이코플라스마(Mycoplasma), 네이세리아(Neisseria), 슈도모나스(Pseudomonas), 리케챠(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 트레포네마(Treponema), 비브리오(Vibrio) 또는 예르시니아(Yersinia)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 경우에, 병원균에 의해 야기되는 질환 또는 병태는 결핵이고, 이종성 샘플은 박테리아 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)로부터 유래된 외래 분자 및 대상체로부터 유래된 분자를 포함한다. 일부 예에서, 질환 또는 병태는 박테리아에 의해 야기되며, 결핵, 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 슈도모나스(Pseudomonas)와 같은 박테리아에 의해 야기될 수 있는 폐렴, 쉬겔라(Shigella), 캄필로박터(Campylobacter) 및 살모넬라(Salmonella)와 같은 박테리아에 의해 야기될 수 있는 식품매개 질병, 및 파상풍, 장티푸스, 디프테리아, 매독 및 한센병과 같은 감염이다. 질환 또는 병태는 천연 유래 박테리아군의 불균형에 의해 야기되는 질의 질환인 박테리아성 질염일 수 있다. 대안적으로, 질환 또는 병태는 박테리아성 수막염, 수막의 박테리아성 염증(예를 들어, 뇌 및 척수를 뒤덮는 보호막)이다. 박테리아에 의해 야기되는 다른 질환 또는 병태는 박테리아성 폐렴, 요로 감염, 박테리아성 위장염, 및 박테리아성 피부 감염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 박테리아성 피부 감염의 예는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)에 의해 야기될 수 있는 농가진; 림프행성이 있는 깊은 표피의 스트렙토코커스 박테리아성 감염에 의해 야기될 수 있는 단독; 및 정상 피부 상재균에 의해 또는 외인성 박테리아에 의해 야기될 수 있는 봉와직염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
병원균은 진균, 예컨대 칸디다(Candida), 아스퍼질루스(Aspergillus), 크립토코커스(Cryptococcus), 히스토플라스마(Histoplasma), 뉴모시스티스(Pneumocystis) 및 스타키보트리스(Stachybotrys)일 수 있다. 진균에 의해 야기되는 질환 또는 병태의 예는 완선, 질염, 백선증 및 무좀을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
병원균은 바이러스일 수 있다. 바이러스의 예는 아데노바이러스, 콕사키바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 간염바이러스(예를 들어, A, B 및 C형 간염), 단순 포진 바이러스(1형 및 2형), 사이토메갈로바이러스, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 유두종 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 폴리오바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 풍진 바이러스 및 대상포진 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바이러스에 의해 야기되는 질환 또는 병태의 예는 감기, 독감, 간염, AIDS, 수두, 풍진, 볼거리, 홍역, 무사마귀 및 회백수염을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
병원균은 원생동물, 예컨대 아칸타모에바(Acanthamoeba)(예를 들어, 아칸타모에바 아스트로닉시스(A. astronyxis), 아칸타모에바 카스텔라니(A. castellanii), 아칸타모에바 쿨베르토소니(A. culbertsoni), 아칸타모에바 해치타이티(A. hatchetti), 아칸타모에바 폴리파가(A. polyphaga), 아칸타모에바 리소데스(A. rhysodes), 아칸타모에바 헤알라이(A. healyi), 아칸타모에바 디비오넨시스(A. divionensis)), 브라키올라(Brachiola)(예를 들어, 브라키올라 콘노리(B connori), 브라키올라 베시쿨라룸(B. vesicularum)), 크립토스포리디움(Cryptosporidium)(예를 들어, 크립토스포리디움 파붐(C. parvum)), 사이클로스포라(Cyclospora)(예를 들어, 사이클로스포라 사예타넨시스(C. cayetanensis)), 엔세팔리토준(Encephalitozoon)(예를 들어, 엔세팔리토준 쿠니쿨리(E. cuniculi), 엔세팔리토준 헬렘(E. hellem), 엔세팔리토준 인테스티날리스(E. intestinalis)), 엔타모에바(Entamoeba)(예를 들어, 엔타모에바 히스톨리티카(E. histolytica)), 엔테로사이토준(Enterocytozoon)(예를 들어, 엔테로사이토준 비에네우시(E. bieneusi)), 기아르디아(Giardia)(예를 들어, 기아르디아 람블리아(G. lamblia)), 이소스포라(Isospora)(예를 들어, 아이소스포라 벨리(I. belli)), 마이크로스포리디움(Microsporidium)(예를 들어, 마이크로스포리디움 아프리카눔(M. africanum), 마이크로스포리디움 세일로넨시스(M. ceylonensis)), 나에글레리아(Naegleria)(예를 들어, 나에글레리아 포우레리(N. fowleri)), 노세마(Nosema)(예를 들어, 노세마 알게라에(N. algerae), 노세마 오쿨라룸(N. ocularum)), 플레이스토포라(Pleistophora), 트라키플레이스토포라(Trachipleistophora)(예를 들어, 트라키플레이스토포라 안트로포프테라(T. anthropophthera), 트라키플레이스토포라 호미니스(T. hominis)) 및 비타포르마(Vittaforma)(예를 들어, 비타포르마 코르네아에(V. corneae))일 수 있다.
질환 또는 병태는 자가면역 질환 또는 자가면역 관련 질환일 수 있다. 자가면역 장애는 신체가 그 자신의 조직을 공격하게 하는 신체 면역계의 기능부전일 수 있다. 자가면역 질환 및 자가면역 관련 질환의 예는 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 항체 증후군(APS), 자가면역 재생불량성 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 심근염, 베체트병, 복강 증후군, 크론병, 피부근육염, 호산구성 근막염, 결정성 홍반, 거대세포 동맥염(측두동맥염), 굿파스처 증후군, 그레이브즈병, 하시모토병, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신장병, 청소년 관절염, 당뇨병, 청소년 당뇨병, 카와사키 증후군, 람베르트-이튼 증후군, 루푸스(SLE), 혼합 결합 조직병(MCTD), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 천포창, 결절 다발 동맥염, I, II, 및 III형 자가면역 다선성 증후군, 류마티스성 근통증, 다발성 근염, 건선, 건선성 관절염, 라이터증후군, 재발성 다발 연골염, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역, 강직인간 증후군, 타까야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염, 백반증 및 베게너 육아종증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
질환 또는 병태는 염증성 질환일 수 있다. 염증성 질환의 예는 치조염, 아밀로이드증, 혈관염, 강직성 척추염, 무혈관성 괴사, 바제도병, 벨마비, 윤활낭염, 수근관 증후군 증후군, 셀리악병, 담관염, 슬개골연골연화, 만성 활동성 간염, 만성 피로 증후군, 코간 증후군, 선천성 고관절 이형성증, 늑연골염, 크론병, 낭성 섬유증, 드꿰르뱅 건초염, 당뇨병 관련 관절염, 미만성 특발성 골과골화증 증후군, 원판상 루푸스, 엘러스-단로스 증후군, 가족성 지중해열, 근막염, 결합 조직염/섬유근육통, 오십견, 결절낭종, 거대세포 동맥염, 통풍, 그레이브스병, HIV-관련 류마티스성 질환 증후군, 부갑상선기능항진성 관련 관절염, 감염성 관절염, 염증성 장 증후군/자극성 장 증후군, 청소년 류마티스 관절염, 라임병, 마르판 증후군, 미쿨리츠병, 혼합 결합 조직병, 다발성 경화증, 근막동통 증후군, 골관절염, 골연화증, 골다공증 및 피질스테로이드-유발 골다공증, 파제트병, 재발성 류마티즘, 파킨슨병, 플러머병, 류마티스성 근통증, 다발성 근염, 가성통풍, 건선성 관절염, 레이노 현상/증후군, 라이터 증후군, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 좌골신경통(요부 신경근성병증), 피부경화증, 괴혈병, 겸상 적혈구 관절염, 쇼그렌 증후군, 척추관 협착증, 척추전방전위증, 스틸병, 전신 홍반성 낭창, 타카야수(무맥성) 질환, 건염, 테니스엘보/골프엘보, 갑상선 관련 관절염, 방아쇠 수지, 궤양성 대장염, 베게너 육아종증 및 휘플병을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 개시된 치료방법은 사이토카인 수준에 의해 측정한 바와 같은 표적을 벗어난 활성을 포함할 수 있다. 상기 방법은 다른 CAR-EC 요법과 비교할 때, 사이토카인 수준에 의해 측정한 바와 같은 표적을 벗어난 활성을 감소시킬 수 있다. 상기 방법은 인터페로노 감마 수준에 의해 측정한 바와 같은 표적을 벗어난 활성을 감소시킬 수 있다. 감소될 수 있는 다른 표적을 벗어난 활성은 독성 림프구감소증, 고형 종양 표적의 치명적 세포용해 및 혈액학적 표적에 대한 만성 저감마글로불린혈증을 포함한다. 본 명세서에 개시된 치료방법 및 조성물은 CD19-매개 B 세포 무형성증을 포함하는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법 및 조성물은 CD19-매개 B 세포 무형성증을 최소화할 수 있다. 상기 방법은 장기간 B-세포 무형성증을 회피할 수 있다.
본 명세서에 개시된 CAR-EC 플랫폼, 방법 및 조성물은 치료가 필요한 대상체에서 이종성 종양 또는 이종성 혈액 세포 악성종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. "pan-B 세포" 마커 CD20은 B 세포 신생물에 대해 가장 우세하게 표적화된 항원이며, FDA-승인 항체 리툭시맙은 다수의 백혈병 및 림프종의 치료에서 생명 유지에 필수적인 구성성분이다. 그러나, CD20 항원 발현의 조절과 관련된 내성 메커니즘은 상당한 다수의 환자에서 일어난다. CD19 또는 CD20 항원 중 하나 단독에 의한 표적화는 치유 요법제에 불충분하다는 것이 명백하다. 본 명세서에 개시된 방법은 상이한 특이성을 지니는 2 이상의 스위치(예를 들어, 항-CD19 항체 CAR-EC 스위치 및 항-CD20 항체 CAR-EC 스위치)의 구성 및 투여를 제공한다. 본 명세서에 개시된 방법은 상이한 특이성을 지니는 2 이상의 스위치(예를 들어, 항-CD19 항체 CAR-EC 스위치 및 항-CD22 항체 CAR-EC 스위치)의 구성 및 투여를 제공한다. 이 방법은 임상에서 재발에 대한 경향에 대해 상당한 이점을 제공할 수 있는 반면, B 세포의 지속적 손실을 회피한다. 이종성 종양 또는 이종성 혈액 세포 악성종양은 또한 항-CD19 항체 CAR-EC 스위치 및 항-CD22 항체 CAR-EC 스위치에 의해 치료될 수 있다. 하나 이상의 CAR-EC 스위치는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
CAR-EC 스위치는 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 투여될 수 있다. 하나 이상의 추가적인 치료제는 면역요법, 화학요법 및 스테로이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 추가적인 치료제는 화학요법 약물일 수 있다. 화학요법 약물은 알킬화제, 항대사산물, 화학요법 약물은 알킬화제, 항대사산물, 안트라사이클린, 토포아이소머라제 저해제, 유사분열 저해제, 피질스테로이드 또는 분화제일 수 있다. 화학요법 약물은 악티노마이신-D, 블레오마이신, 알트레타민, 보르테조밉, 부설판, 카보플라틴, 카페시타빈, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로파라빈, 사이클로포스파마이드, 시타라빈, 다카바진, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에토포사이트, 에스트라무스틴, 플록수리딘, 풀루다라빈, 플루오로유라실, 겜시타빈(겜자르(Gemzar)), 하이드록시유레아, 이다루비신, 이포스파마이드, 이리노테칸(캄토사르(Camptosar)), 익사베필론, L-아스파라기나제, 로무스틴, 메클로르에타민, 멜팔란, 6-머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미토마이신-C, 파클리탁셀(탁솔(Taxol)), 페메트렉세드, 펜토스타틴, 스트렙토조신, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸(하이캄틴(Hycamtin)), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 레티노이드, 트레티노인(ATRA 또는 아트랄린(Atralin)(등록상표)), 벡사로텐(타르그레틴(Targretin)(등록상표)) 및 삼산화비소(아르세녹스(Arsenox)(등록상표))로부터 선택될 수 있다. 화학요법은 연하를 위한 알약으로서, 근육 또는 지방 조직 내로의 주사로서, 정맥내, 국소 또는 체강 내로 직접 투여될 수 있다.
하나 이상의 추가적인 치료제는 혈관형성 저해제를 포함할 수 있다. 혈관형성 저해제는 베바시주맙, 이트라코나졸, 카복시아미도트라이아졸, TNP-470, CM101, IFN 알파, IL-12, 혈소판 인자 4, 수라민, SU5416, 트롬보스폰딘, VEGFR 길항제, 헤파린을 지니는 혈관생성억제 스테로이드, CAR-ECilage-유래 혈관형성 저해 인자, 기질 금속 단백질 분해효소 저해제, 앤지오스타틴, 엔도스타틴, 소라페닙, 수니티닙, 파조파닙, 에베롤리무스, 2-메톡시에스트라다이올, 테코갈란, 테트라티오몰리브데이트, 탈리도마이드, 프롤락틴, αvβ3 저해제, 리노마이드, 타스퀴니모드, 가용성 VEGFR-1, 가용성 NRP-1, 앤지오포이에틴 2, 바소스타틴, 칼레티쿨린, TIMP, CDAI, Meth-1, Meth-2, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, CXCL10, IL-4, IL-12, IL-18, 프로트롬빈, 항트롬빈 III 단편, 프롤락틴, VEGI, SPARC, 오스테오폰틴, 마스핀, 칸스타틴, 프롤리페린-관련 단백질 및 레스틴으로부터 선택될 수 있다.
하나 이상의 추가적인 치료제는 호르몬 요법을 포함할 수 있다. 호르몬 요법은 항-에스트로겐(예를 들어 풀베스트란트(파슬로덱스(Faslodex)(등록상표)), 타목시펜, 토레미펜(파레스톤(Fareston)(등록상표))); 아로마타제 저해제(예를 들어, 아나스트로졸(아리미덱스(Arimidex)(등록상표)), 엑세메스탄(아로마신(Aromasin)(등록상표)), 레트로졸(페마라(Femara)(등록상표))); 프로게스틴(예를 들어, 메게스트롤 아세테이트(메가세(Megace)(등록상표))); 에스트로겐; 항-안드로겐(예를 들어, 비칼루타마이드(카소덱스(Casodex)(등록상표)), 플루타마이드(유렉신(Eulexin)(등록상표)), 닐루타마이드(닐란드론(Nilandron)(등록상표))); 성선자극호르몬-방출 호르몬(GnRH) 또는 황체형성 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 효현제 또는 유사체(예를 들어, 레우프롤라이드(루프론(Lupron)(등록상표)), 고세렐린(졸라덱스(Zoladex)(등록상표)))로부터 선택될 수 있다.
하나 이상의 추가적인 치료제는 스테로이드를 포함할 수 있다. 스테로이드는 피질스테로이드일 수 있다. 스테로이드는 코티솔 또는 이들의 유도체일 수 있다. 스테로이드는 프레드니손, 메틸프레드니솔론(솔루메들론(Solumedrol)(등록상표)) 또는 데게사메타손으로부터 선택될 수 있다.
CAR-EC 스위치는 하나 이상의 추가적인 요법과 함께 투여될 수 있다. 하나 이상의 추가적인 요법은 레이저 요법을 포함할 수 있다. 하나 이상의 추가적인 요법은 방사선 요법을 포함할 수 있다. 하나 이상의 추가적인 요법은 수술을 포함할 수 있다.
본 명세서에 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하기 위한 플랫폼, 키트 및 방법이 개시된다. 대상체는 건강한 대상체일 수 있다. 대상체는 질환 또는 병태로 고통받을 수 있다. 대상체는 하나 이상의 질환 또는 병태로 고통받을 수 있다. 대상체는 만성 림프성 백혈병으로 고통받을 수 있다. 대상체는 급성 림프모구성 백혈병으로 고통받을 수 있다. 대상체는 동물일 수 있다. 대상체는 포유류일 수 있다. 포유류는 인간, 침팬지, 고릴라, 원숭이, 소, 말, 당나귀, 노새, 개, 고양이, 돼지, 토끼, 염소, 양, 래트, 햄스터, 기닉픽 또는 마우스일 수 있다. 대상체는 새 또는 닭일 수 있다. 대상체는 인간일 수 있다. 대상체는 소아일 수 있다. 소아는 급성 림프구성 백혈병으로 고통받고 있을 수 있다. 대상체는 6개월령 미만일 수 있다. 대상체는 약 1세, 약 2세, 약 3세, 약 4세, 약 5세, 약 6세, 약 7세, 약 8세, 약 9세, 약 10세, 약 11세, 약 12세, 약 13세, 약 14세, 약 15세, 약 18세, 약 20세, 약 25세, 약 30세, 약 35세, 약 40세, 약 45세, 약 50세, 약 55세, 약 60세, 약 65세, 약 70세, 약 75세, 약 80세, 약 85세, 약 90세, 약 95세, 약 100세 또는 약 105세일 수 있다.
VII. 효과기 세포의 클리어런스 방법
추가로 본 명세서에서 CAR-EC 오프 스위치를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 CAR-EC 세포를 클리어런스하는 방법이 개시된다. CAR-EC 오프 스위치는 효과기 세포 상에서 세포 표면 마커를 표적화하는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. CAR-EC 오프 스위치는 CAR-EC의 CAR에 의해 결합하는 펩타이드를 포함할 수 있다. CAR-EC 오프 스위치는 CAR-EC의 CAR에 의해 결합하는 CAR-BP를 포함할 수 있다.
CAR-EC 오프 스위치의 항체, 항체 단편 또는 펩타이드는 약물 또는 독소에 컨쥬게이팅될 수 있다. 약물 또는 독소는 메이타신(예를 들어 DM1, DM4), 모노메틸아우리스타틴 E, 모노메틸아우리스타틴 F, Ki-4.dgA, 돌라스타틴 10, 칼리키아마이신, SN-38, 듀오카르마이신, 이리노테칸, 리신, 사포린, 겔로닌, 자리공 항바이러스 단백질, 슈도모나스 아에루기노사 엑소톡신 A 또는 디프테리아 독소로부터 선택될 수 있다. 독소는 독, 박테리아성 독소(예를 들어, 파상풍, 디프테리아을 야기하는 박테리아성 독소), 식물 독소 또는 동물 독소를 포함할 수 있다. 독소는 뱀의 독일 수 있다. 독소는 빈블라스틴을 포함할 수 있다. 독소는 아우리스타틴을 포함할 수 있다. 독소는 리포좀막-코팅 소포에 함유될 수 있다. 여기서 독소는 리포좀-막 코팅 소포에 함유되며, 항체는 소포에 부착된다.
세포 표면 마커는 바이러스 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 효과기 세포는 세포 표면 마커가 아닌 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 발현시킨다. 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 발현시키는 효과기 세포는 약물에 의해 표적화될 수 있다. 여기서 효과기 세포는 바이러스 단백질 또는 이의 단편을 포함하며, 약물은 아바카비어, 아사이클로비어, 아데포비어, 아만타딘, 암프레나비어, 암플리겐, 아르비돌, 아타자나비어, 아트리플라, 발라비어, 보세프레비레테트, 시도포비어, 콤비비어, 다루나비어, 델라비르딘, 디다노신, 도코사놀, 에독수딘, 에파비렌즈, 엠트리시타빈, 엔푸비르타이드, 엔테카비어, 유입 저해제, 팜시클로비어, 고정된 용량 조합 항레트로바이러스 약물, 포미비르센, 포삼프레나비어, 포스카르넷, 포스포넷, 융합 저해제, 간시클로비어, 이바시타빈, 이뮤노비어, 이독수리딘, 이미퀴모드, 인디나비어, 이노신, 인테그라제 저해제, 인터페론 III형, 인터페론 II형, 인터페론 I형, 인터페론, 라미부딘, 로피나비어, 로비리데, 마라비록, 모록시딘, 메티사존, 넬피나비어, 네비어라핀, 넥사비어, 뉴클레오사이드, 유사체, 오셀타미비어, 페그인터페론알파-2a, 페시클로비어, 페라미비어, 플레코나릴, 포도필로독신, 프로테아제 인히비로, 랄테그라비어, 역 전사효소 저해제, 리바비린, 리만타딘, 리토나비어, 피라미딘, 사퀴나비어, 소포스부비어, 스타부딘, 상승적 증강제 레트로바이러스 약물, 티트리 오일, 텔라프레비어, 테노포비어, 테노포비어 디소프록실, 티프라나비어, 트리플루리딘, 트리지비어, 트로만타딘, 트루바다, 발락시클로비어, 비크리비록, 비다라빈, 비라미딘, 자시타빈, 자나미비어 또는 지도부딘을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 약물은 간시클로비어일 수 있다. 약물은 아사이클로비어일 수 있다.
VIII. 약제학적 조성물
본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물이 본 명세서에 개시된다. 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 염, 부형제 또는 비히클을 추가로 포함할 수 있다. 본 약제학적 조성물에서 사용하기 위한 약제학적으로 허용가능한 염, 부형제, 또는 비히클은 담체, 부형제, 희석제, 항산화제, 보존제, 착색제, 향미제 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충전제, 벌크화제, 완충제, 전달 비히클, 등장제, 공용매, 습윤제, 복합화제, 완충제, 항균제 및 계면활성제를 포함한다.
중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수는 예시적인 적절한 담체이다. 약제학적 조성물은 조성물은 항산화제, 예컨대 아스코브산; 저분자량 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 알기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 솔비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(Tween), 플루로닉스(pluronics) 또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)을 포함할 수 있다. 또한 예로서, 적합한 등장 증강제는 알칼리 금속 할로겐화물(바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨), 만니톨, 솔비톨 등을 포함한다. 적합한 보존제는 염화벤즈알코늄, 티메로살, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 솔브산 등을 포함한다. 과산화수소는 또한 보존제로서 사용될 수 있다. 적합한 공용매는 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 PEG를 포함한다. 적합한 복합화제는 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시-프로필-베타-사이클로덱스트린을 포함한다. 적합한 계면활성제 또는 습윤제는 솔비탄 에스터, 폴리솔베이트, 예컨대 폴리솔베이트 80, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔 등을 포함한다. 완충제는 전통적인 완충제, 예컹대 아세트산염, 붕산염, 시트르산염, 인산염, 중탄산염 또는 트리스-HCl일 수 있다. 아세트산염 완충제는 약 pH 4 내지 5.5일 수 있고, 트리스 완충제는 약 pH 7 내지 8.5일 수 있다. 추가적인 약제학적 작용제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990]에서 제시된다.
조성물은 액체 형태로 또는 동결건조 또는 냉동 건조된 형태일 수 있고, 하나 이상의 동결보호제, 부형제, 계면활성제, 고분자량 구조적 첨가제 및/또는 벌크화제를 포함할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,685,940호, 제6,566,329호 및 제6,372,716호 참조). 일 실시형태에서, 수크로스, 락토스 또는 트레할로스와 같은 비환원당인 동결보호제가 포함된다. 동결보호제의 양은 일반적으로 재구성 시, 얻어진 제형이 고장성 또는 약간 고장성 제형이 또한 적합할 수 있다고 해도, 등장성일 수 있도록 포함된다. 추가로, 동결보호제의 양은 동결건조 시 허용가능하지 않은 양의 단백질의 분해 및/또는 응집을 방지하기에 충분하여야 한다. 사전 동결건조된 제형에서 당(예를 들어, 수크로스, 락토스, 트레할로스)에 대한 예시적인 동결보호제는 약 10mM 내지 약 400mM이다. 다른 실시형태에서, 계면활성제는, 예를 들어, 비이온성 계면활성제 및 이온성 계면활성제, 예컨대 폴리솔베이트(예를 들어, 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 80); 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188); 폴리(에틸렌 글리콜) 페닐 에터(예를 들어, 트리톤); 도데실황산나트륨(SDS); 라우릴황산나트륨; 나트륨 옥틸 글리코사이드; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일, 미리스틸- 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스타미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 아이소스테아르아미도프로필-베타인(예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 아이소스테아르아미도프로필-다이메틸아민; 나트륨 메틸 코코일-, 또는 2나트륨 메틸 오페일-타우레이트; 및 모나쿠아트(MONAQUAT)(상표명)가 포함된다. 시리즈(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 및 에틸렌 및 프로필렌 글라이콜의 공중합체(예를 들어, 플루로닉스(Pluronics), PF68 등). 사전 동결건조된 제형에 존재할 수 있는 계면활성제의 예시적 양은 약 0.001 내지 0.5%이다. 고분자량 구조적 첨가제(예를 들어, 충전제, 결합제)는, 예를 들어, 아카시아, 알부민, 알긴산, 인산칼슘(2염기성), 셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 덱스트란, 덱스트린, 덱스트레이트, 수크로스, 타일로스, 전호화 전분, 황산칼슘, 아밀로스, 글리신, 벤토나이트, 말토스, 솔비톨, 에틸셀룰로스, 인산수소이나트륨, 인산나트륨, 파이로아황산나트륨, 폴리비닐 알코올, 젤라틴, 글루코스, 구아검, 액체 글루코스, 압축성 당, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 말토덱스트린, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리메트아크릴레이트, 포비돈, 알긴산나트륨, 트래거캔스 미정질 셀룰로스, 전분 및 제인을 포함할 수 있다. 고분자량 구조적 첨가제의 예시적 농도는 0.1중량% 내지 10중량%이다. 다른 실시형태에서, 벌크화제(예를 들어, 만니톨, 글리신)이 포함될 수 있다.
조성물은 비경구 투여에 적합할 수 있다. 예시적인 조성물은 당업자에게 이용가능한 임의의 경로, 예컨대 동맥내, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 대뇌내(뇌실내), 뇌혈관내, 근육내, 안구내, 동맥내 또는 병변내 경로에 의해 동물 내로 주사 또는 주입에 적합하다. 비경구 제형은 전형적으로 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 보존제를 함유하는 멸균, 무발열원, 등장성 수용액일 수 있다.
비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사용 유기 에스터, 예컨대 에틸 올레이트이다. 수성 담체는 물, 알코올/수용액, 식염수 및 완충 매질을 포함하는 에멀전 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 젖산 링거 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양분 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스에 기반한 것 등을 포함한다. 또한, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 비활성 기체 등과 같은 보존제 및 다른 첨가제가 존재할 수 있다. 일반적으로, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 16th Ed., Mack Eds., 1980]을 참조한다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 생성물의 국소 농도(예를 들어, 볼루스, 데포 효과) 및/또는 특정 국소 환경에서 증가된 안정성 또는 반감기를 제공하는 방식으로 제어 또는 지속된 전달을 위해 제형화될 수 있다. 조성물은 폴리락트산, 폴리글리콜산 등과 같은 중합체 화합물의 미립자 제제와 함께 본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치, 폴리펩타이드, 핵산 또는 벡터뿐만 아니라 활성제의 제어 또는 지속 방출을 제공하고, 이어서 데포 주사로서 전달될 수 있는 작용제, 예컨대 생분해성 기질, 주사용 마이크로스피어, 마이크로캡슐 입자, 마이크로캡슐, 생분해성 입자 비드, 리포좀 및 이식가능한 전달 장치의 제형을 포함할 수 있다. 이러한 지속- 또는 제어된-전달 수단을 제형화하기 위한 기법은 공지되어 있으며, 다양한 중합체가 약물의 지속적 방출 및 전달을 위해 개발되고 사용되었다. 이러한 중합체는 전형적으로는 생분해성 및 생체적합성이다. 온도 또는 pH 민감성 특성을 이용한 거울상체 중합체 또는 폴리펩타이드 세그먼트 및 하이드로겔의 복합체화에 의해 형성된 것을 포함하는 중합체 하이드로겔은 생활성 단백질 작용제(예를 들어, 상당히 긴 CDR3을 포함하는 항체)를 트래핑함 있어서 수반되는 약한 그리고 수성의 조건 때문에 약물 데포 효과를 제공하는데 바람직할 수 있다. 예를 들어, 제WO 93/15722호에서 약제학적 조성물의 전달을 위한 제어 방출 다공성 중합체 마이크로입자의 설명을 참고한다. 이 목적을 위한 적합한 물질은 폴리락타이드(예를 들어, 미국 특허 제3,773,919호 참조), 폴리-(a-하이드록시카복실산)의 중합체, 예컨대 폴리-D-(-)-3-하이드록시뷰티르산 (EP 133,988A), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), 폴리(2-하이드록시에틸-메트아크릴레이트)(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981), 및 Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), 에틸렌 비닐 아세테이트, 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시뷰티르산을 포함한다. 다른 생분해성 중합체는 폴리(락톤), 폴리(아세탈), 폴리(오쏘에스터) 및 폴리(오쏘카보네이트)를 포함한다. 지속 방출 조성물은 또한 당업계에 공지된 임의의 몇몇 방법에 의해 제조될 수 있는 리포좀을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-92 (1985)] 참조). 담체 그 자체 또는 그의 분해 생성물은 표적 조직에서 비독성이어야 하며, 상태를 추가로 악화시키지 않아야 한다. 이는 표적 장애의 동물 모델에서 일상적 선별에 의해, 또는 이러한 모델이 이용가능하지 않다면 정상 동물에서 결정될 수 있다. 지속 방출을 위한 재조합 단백질의 마이크로캡슐화는 인간 성장 호르몬(rhGH), 인터페론-(rhIFN-), 인터류킨-2 및 MN rgp120에 의해 성공적으로 수행될 수 있다. Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology. 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; 제WO 97/03692호, 제WO 96/40072호, WO 96/07399호; 미국 특허 제5,654,010호. 이들 단백질의 지속 방출 제형은 그의 생체적합성 및 넓은 범위의 생분해성 특성에 기인하여 폴리-락트-코글리콜산(PLGA) 중합체를 이용하여 개발되었다. PLGA, 락트산 및 글리콜산의 분해 생성물은 인간 신체 내에서 빠르게 클리어런스될 수 있다. 게다가, 이 중합체의 분해능력은 그의 분자량 및 조성에 따를 수 있다. 문헌[Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41]. 지속 방출 조성물의 추가적인 예는, 예를 들어, EP 58,481A호, 미국 특허 제3,887,699호, EP 158,277A호, 캐나다 특허 제1176565호, 문헌[U. Sidman et al., Biopolymers 22, 547 [1983], R. Langer et al., Chem. Tech. 12, 98 [1982], Sinha et al., J. Control. Release 90, 261 [2003], Zhu et al., Nat. Biotechnol. 18, 24 [2000], 및 Dai et al., Colloids Surf B Biointerfaces 41, 117 [2005]]을 포함한다.
생접착성 중합체는 또한 본 개시내용에서 또는 본 개시내용의 조성물과 함께 사용을 위해 고려된다. 생접착제는 장기간의 시간 기간 동안 생물학적 기질에 접착될 수 있는 합성 및 천연 유래 물질이다. 예를 들어, 카보폴 및 폴리카보필은 둘 다 폴리(아크릴산)의 합성 가교 유도체이다. 천연 유래 물질에 기반한 생접착성 전달 시스템은, 예를 들어 하이알루로난으로서도 알려진 하이알루론산을 포함한다. 하이알루론산은 D-글루쿠론산 및 N-아세틸-D-글루코사민의 잔기로 이루어진 천연 유래 뮤코다당류이다. 하이알루론산은 결합조직에서뿐만 아니라 활액 내 그리고 눈의 유리체 및 안방수 내를 포함하는, 척추동물의 세포밖 조직 기질에서 발견된다. 하이알루론산의 에스테르화된 유도체는 생체적합성 및 생분해성인 전달에서 사용을 위해 마이크로스피어를 생성하기 위해 사용되었다(예를 들어, 문헌[Cortivo et al., Biomaterials (1991) 12:727-730; 유럽 특허 제517,565호; 제WO 96/29998호; Illum et al., J. Controlled Rel. (1994) 29:133-141] 참조).
생분해성과 비-생분해성 중합체 기질은 둘 다 본 개시내용의 조성물을 전달하기 위해 사용될 수 있고, 이러한 중합체 기질은 천연 또는 합성 중합체를 포함할 수 있다. 생분해성 기질이 바람직하다. 방출이 일어나는 시간 기간은 중합체의 선택에 기반한다. 전형적으로, 몇 시간 내지 3 내지 12개월의 범위에 있는 기간에 따른 방출이 가장 바람직하다. 생분해성 전달 시스템을 형성하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 합성 중합체는 락트산 및 글리콜산의 중합체, 폴리아마이드, 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 에터, 폴리비닐 에스터, 폴리-비닐 할로겐화물, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜라이드, 폴리실록산, 폴리무수물, 폴리우레탄 및 이들의 공중합체, 폴리(부트산), 폴리(발레르산), 알킬 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스, 셀룰로스 에터, 셀룰로스 에스터, 나이트로 셀룰로스, 아크릴산 및 메트아크릴산 에스터의 중합체, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 하이드록시뷰틸 메틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세트산염, 셀룰로스 프로피온산염, 셀룰로스 아세테이트 뷰티레이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 카복실에틸 셀룰로스, 셀룰로스 트라이아세테이트, 셀룰로스 설페이트 나트륨염, 폴리(메틸 메트아크리레이트), 폴리(에틸 메트아크릴레이트), 폴리(뷰틸메트아크릴레이트), 폴리(아이소뷰틸 메트아크릴레이트), 폴리(헥실메트아크릴레이트), 폴리(아이소데실 메트아크릴레이트), 폴리(라우릴 메트아크릴레이트), 폴리(페닐 메트아크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(아이소프로필 아크릴레이트), 폴리(아이소뷰틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 알코올), 폴리비닐 아세테이트, 염화폴리 비닐, 폴리스타이렌 및 폴리비닐피롤리돈의 중합체를 포함한다. 예시적인 천연 중합체는 덱스트란 및 셀룰로스, 콜라겐, 화학물질, 이의 유도체(화학적 기의 치환, 첨가, 예를 들어, 알킬, 알킬렌, 하이드록실화, 산화 및 당업자에 의해 일상적으로 이루어지는 다른 변형), 알부민 및 다른 친수성 단백질, 제인 및 다른 프롤라민 및 소수성 단백질, 공중합체 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일반적으로, 이들 물질은 효소적 가수분해 또는 생체내에서 물에 대한 노출에 의해, 표면 또는 벌크 부식에 의해 분해된다. 중합체는 선택적으로 수 중에서 그의 중량의 약 90%까지를 흡수하고, 추가로 선택적으로 다가 이온 또는 다른 중합체와 가교되는 하이드로겔의 형태이다(예를 들어, 제WO 04/009664호, 제WO 05/087201호, Sawhney, et al., Macromolecules, 1993, 26, 581-587 참조).
전달은 또한 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스터 및 지방산 또는 중성 지방, 예컨대 모노-다이-및 트라이-글리세라이드; 하이드로겔 방출 시스템; 실라스틱 시스템; 펩타이드 기반 시스템; 왁스 코팅; 통상적인 결합제 및 부형제를 이용하는 압축 정제; 부분적으로 융합된 이식물 등과 같은 스테롤을 포함하는 지질인 비-중합체 시스템을 포함한다. 특이적 실시예는 (a) 생성물이 미국 특허 제4,452,775호, 제4,675,189호 및 제5,736,152호에 기재된 것과 같은 기질 내에서의 형태에 함유된 부식 시스템 및 (b) 생성물이 미국 특허 제3,854,480호, 제5,133,974호 및 제5,407,686호에 기재된 바와 같은 중합체로부터 제어된 속도로 침투하는 확산 시스템을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 생성물을 함유하는 리포좀은, 예를 들어(DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); 유럽 특허 제52,322호; 유럽 특허 제36,676호; 유럽 특허 제88,046호; 유럽 특허 제143,949호; 유럽 특허 제142,641호; 일본 특허 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 유럽 특허 제102,324호)와 같은 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 조성물은 본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치가 흡수 또는 캡슐화된 막, 스펀지 또는 다른 적절한 물질의 영향받은 면적 내로 이식을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용되는 경우, 장치는 임의의 적합한 조직 또는 기관 내로 이식될 수 있고, 본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치, 핵산 또는 벡터의 전달은 볼루스를 통한, 또는 연속적 투여를 통한 또는 연속적 주입을 이용하는 카테터를 통한 장치를 통해 직접적일 수 있다.
본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치를 포함하는 약제학적 조성물은 흡입, 예를 들어 건조 분말로서 제형화될 수 있다. 흡입 용액은 또한 에어로졸 전달을 위한 액화 추진제로 제형화될 수 있다. 또 다른 제형에서, 용액은 네뷸라이징될 수 있다. 폐 투여를 위한 추가적인 약제학적 조성물은, 예를 들어, 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 개시하는 제WO 94/20069호에 기재된 것을 포함한다. 폐 전달을 위해, 입자 크기는 원위의 폐에 대한 전달에 적합하여야 한다. 예를 들어, 입자 크기는 1㎛ 내지 5㎛일 수 있지만; 그러나, 예를 들어, 각각의 입자가 상당히 다공성이라면, 더 큰 입자가 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치를 함유하는 특정 제형은 경구로 투여될 수 있다. 본 방식으로 투여되는 제형은 정제 및 캡슐과 같은 고체 제형의 조제에서 관습적으로 사용되는 담체와 함께 또는 담체 없이 제형화될 수 있다. 예를 들어, 캡슐은 생체이용가능성이 최대화되고, 사전-전신성 분해가 최소화될 때 위장관 내 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 추가적인 작용제는 선택적 결합제의 흡수를 용이하게 하기 위해 포함될 수 있다. 희석제, 향미제, 저융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제 및 결합제가 또한 사용될 수 있다.
다른 제제는 정제의 제조에 적합한 비 독성 부형제와의 혼합물로 본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치의 효과적인 양을 수반할 수 있다. 멸균수 또는 다른 적절한 비히클 중에서 정제를 용해시킴으로써, 용액은 단위 용량 형태로 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 비활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 또는 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 탈크를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 및/또는 바람직한 약제학적 제형은 의도된 투여 경로, 전달 형식 및 목적으로 하는 투약량에 따라서 본 개시내용 및 제형화 기법의 일반적인 지식에 비추어 결정될 수 있다. 투여방식에도 불구하고, 효과적인 용량은 환자 체중, 표면적 또는 기관 크기에 따라서 계산될 수 있다. 본 명세서에 기재된 각각의 제형을 수반하는 치료를 위한 적절한 투약량을 결정하기 위한 계산의 추가적인 정제는 당업계에서 일상적으로 이루어지며, 당업계에서 일상적으로 수행되는 작업의 영역 내에 있다. 적절한 투약량은 적절한 용량-반응 데이터의 사용을 통해 확인될 수 있다.
IX. CAR-EC 스위치 생성 방법
본 명세서에서 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치 또는 이의 일부를 암호화하는 하나 이상의 서열을 갖는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터로부터 하나 이상의 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 CAR-EC 스위치의 생성 방법이 개시되되, 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 펩타이드 항원(CAR-BP) 및 표적화 폴리펩타이드를 포함한다. 표적화 모이어티는 표적화 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 표적화 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 CAR-BP를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 융합 또는 접합시키는 단계를 포함한다. 융합 또는 접합시키는 단계는 당업자에게 공지된 임의의 표준 클로닝 방법에 의해 수행될 수 있다. CAR-BP 및 표적화 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 융합 또는 접합시키는 단계는 폴리뉴클레오타이드의 효소적 소화, 폴리뉴클레오타이드의 결찰 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 증폭을 포함할 수 있다.
펩타이드 항원은 표적화 폴리펩타이드의 N 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 폴리펩타이드의 C 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 폴리펩타이드 내에 접합될 수 있다. 표적화 폴리펩타이드는 표적화 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 N 말단에 융합될 수 있다. 펩타이드 항원은 표적화 항체 또는 항체 단편의 C 말단에 융합될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "융합된"은 CAR-BP의 말단이 표적화 폴리펩타이드의 말단과 인접되는 것을 지칭할 수 있다. CAR-BP는 표적화 폴리펩타이드의 임의의 아미노산을 대체 또는 제거하는 일 없이 표적화 폴리펩타이드의 말단에 융합될 수 있다. 표적화 폴리펩타이드의 말단에 CAR-BP를 융합시키는 것은 표적화 폴리펩타이드의 말단에서 아미노산을 제거 또는 대체하는 것을 포함할 수 있다. 표적화 폴리펩타이드의 말단에서 아미노산을 제거 또는 대체하는 것은 표적화 폴리펩타이드의 말단에서 약 1 내지 약 20개의 아미노산을 제거 또는 대체하는 것을 포함할 수 있다. CAR-BP는 링커를 통해 표적화 폴리펩타이드의 말단에 융합될 수 있다. 링커는 CAR-BP-링커 중간체를 생성하기 위해 CAR-BP에 융합될 수 있다. 링커는 CAR-BP-링커 중간체를 생성하기 위해 CAR-BP N 말단에 융합될 수 있다. 링커는 CAR-BP-링커 중간체를 생성하기 위해 CAR-BP C 말단에 융합될 수 있다. CAR-BP-링커 중간체는 표적화 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. CAR-BP-링커 중간체는 표적화 폴리펩타이드의 N 말단에 융합될 수 있다. CAR-BP-링커 중간체는 표적화 폴리펩타이드의 C 말단에 융합될 수 있다. 제1 CAR-BP 링커 중간체는 표적화 폴리펩타이드의 N 말단에 융합될 수 있고, 제2 CAR-BP 링커 중간체는 표적화 폴리펩타이드는 C 말단에 융합될 수 있다. 제1 CAR-BP 링커 중간체의 CAR-BP는 제2 CAR-BP 링커 중간체의 CAR-BP와 동일 또는 유사할 수 있다. 제1 CAR-BP 링커 중간체의 CAR-BP는 제2 CAR-BP 링커 중간체의 CAR-BP와 상이할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "접합된"은 표적화 폴리펩타이드 내에(예를 들어, 표적화 폴리펩타이드의 두 아미노산 사이에) CAR-BP를 삽입하는 것을 지칭할 수 있다. CAR-BP는 표적화 폴리펩타이드의 임의의 아미노산을 대체 또는 제거하는 일 없이 표적화 폴리펩타이드 내에 접합될 수 있다. 표적화 폴리펩타이드 내에서 CAR-BP를 접합시키는 것은 표적화 폴리펩타이드 내에서 아미노산을 제거 또는 대체하는 것을 포함할 수 있다. 표적화 폴리펩타이드 내에서 아미노산을 제거 또는 대체하는 것은 표적화 폴리펩타이드 내에서 약 1 내지 20개의 아미노산을 제거 또는 대체하는 것을 포함할 수 있다. CAR-BP는 하나의 링커를 통해 표적화 폴리펩타이드 내에 접합될 수 있다. CAR-BP는 두 링커를 통해 표적화 폴리펩타이드 내에 접합될 수 있다. 링커는 CAR-BP-링커 중간체를 생성하기 위해 CAR-BP N 말단에 융합될 수 있다. 링커는 CAR-BP-링커 중간체를 생성하기 위해 CAR-BP C 말단에 융합될 수 있다. CAR-BP-링커 중간체를 생성하기 위해 제1 링커는 CAR-BP N 말단에 융합될 수 있고, 제2 링커는 CAR-BP C 말단에 융합될 수 있다. CAR-BP 링커 중간체는 표적화 폴리펩타이드 내에 접합될 수 있다. 제1 CAR-BP 링커 중간체는 표적화 폴리펩타이드 내에 접합될 수 있고, 제2 CAR-BP 링커 중간체는 표적화 폴리펩타이드 내에 접합될 수 있다. 제1 CAR-BP 링커 중간체는 표적화 폴리펩타이드의 제1 도메인 내에 접합될 수 있고, 제2 CAR-BP 링커 중간체는 표적화 폴리펩타이드의 제2 도메인 내에 접합될 수 있다. 표적화 폴리펩타이드의 제1 도메인은 표적화 폴리펩타이드의 제2 도메인과 동일할 수 있다. 표적화 폴리펩타이드의 제1 도메인은 표적화 폴리펩타이드의 제2 도메인과 상이할 수 있다. 제1 CAR-BP 링커 중간체의 CAR-BP는 제2 CAR-BP 링커 중간체의 CAR-BP와 동일 또는 상이할 수 있다. 제1 CAR-BP 링커 중간체의 CAR-BP는 제2 CAR-BP 링커 중간체의 CAR-BP와 상이할 수 있다. 달리 구체화되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "접합" 및 "삽입물"은 상호호환적으로 사용된다.
표적화 모이어티는 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 중쇄 및 경쇄 또는 이의 단편을 포함할 수 있다. 상기 방법은 중쇄를 발현시키는 단계를 포함할 수 있되, 펩타이드 항원은 중쇄의 말단에 융합된다. 상기 방법은 중쇄를 발현시키는 단계를 포함할 수 있되, 펩타이드 항원은 중쇄 내에 접합된다. 상기 방법은 경쇄를 발현시키는 단계를 포함할 수 있되, 펩타이드 항원은 경쇄의 말단에 융합된다. 상기 방법은 경쇄를 발현시키는 단계를 포함할 수 있되, 펩타이드 항원은 경쇄 내에 접합된다.
상기 방법은 표적화 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 항원을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 발현 벡터 내로 클로닝하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 표적화 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 항원을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 발현 벡터 내로의 결찰을 추가로 포함할 수 있다. 발현 벡터는 원핵생물 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 진핵생물 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 포유류 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 바이러스 발현 벡터일 수 있다. 상기 방법은 표적화 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 항원을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 발현 벡터 내로의 클로닝을 확인하는 단계, 벡터의 겔 전기영동을 실행하는 단계 및/또는 SDS 페이지 겔 상에서 표적화 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 항원을 관찰하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 표적화 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키는 단계 및 표적화 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 항원을 발현 벡터 내로 클로닝시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 표적화 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키는 단계는 유전자에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드에 어닐링하기 위해 유전자에 대해 충분히 상보적일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 링커 서열을 포함할 수 있다. 링커 서열은 서열번호 40 내지 44로부터 선택될 수 있다.
상기 방법은 세포를 발현 벡터로 형질감염 또는 감염시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 세포 내에서 표적화 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 항원을 발현시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 무세포 시스템 내 표적화 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 항원을 발현시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 발현 벡터를 포함하는 바이러스를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 바이러스를 증식시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 세포를 발현 벡터를 포함하는 바이러스로 감염시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 세포를 증식시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 CAR-EC 스위치를 생성하기 위해 항체 또는 항체 단편, 펩타이드 항원 또는 표적화 펩타이드를 접합시키는 방법이 개시된다. 상기 방법은 항체 또는 항체 단편에 CAR-BP를 접합시키는 방법을 포함할 수 있다. 상기 방법은 항체 또는 항체 단편의 N 말단, C 말단 또는 내부 부위에 CAR-BP를 접합시키는 단계를 포함할 수 있다. CAR-BP는 항체 또는 항체 단편의 CL 도메인에 접합될 수 있다. CAR-BP는 항체 또는 항체 단편의 CL 도메인의 루프에 접합될 수 있다. 상기 방법은 CAR-BP에 항체 또는 항체 단편을 접합시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 CAR-BP의 N 말단, C 말단 또는 내부 부위에 항체 또는 항체 단편을 접합시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 표적화 펩타이드에 CAR-BP를 접합시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 표적화 펩타이드의 N 말단, C 말단 또는 내부 부위에 CAR-BP를 접합시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 CAR-BP에 표적화 펩타이드를 접합시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 CAR-BP의 N 말단, C 말단 또는 내부 부위에 표적화 펩타이드를 접합시키는 단계를 포함할 수 있다.
CAR-BP, 표적화 펩타이드, 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 링커를 포함할 수 있되, 링커는 CAR-BP, 표적화 펩타이드, 항체 또는 항체 단편의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치된다. 상기 방법은 링커를 통해 항체 또는 항체 단편, CAR-BP 또는 표적화 펩타이드를 접합시키는 단계를 포함할 수 있다. 링커는 (GSSSS)n을 포함할 수 있다.
접합시키는 단계는 CAR-EC 스위치 생성 핵산을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. CAR-EC 스위치 암호화 핵산을 생성하는 단계는 하나 이상의 중합효소 연쇄 반응을 포함할 수 있다. CAR-EC 스위치 암호화 핵산을 생성하는 단계는 하나 이상의 핵산 효소 소화를 포함할 수 있다. 효소적 소화는 부위 특이적일 수 있다. CAR-EC 스위치 암호화 핵산을 생성하는 단계는 하나 이상의 결찰을 포함할 수 있다. CAR-EC 스위치를 생성하는 방법은 CAR-EC 스위치 암호화 핵산을 CAR-EC 스위치 벡터 내로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및/또는 조건적 프로모터를 포함할 수 있다. CAR-EC 스위치 암호화 핵산 또는 CAR-EC 스위치 벡터는 세포 내에서 발현될 수 있고, 얻어진 CAR-EC 스위치는 단리 및 정제된다. 세포는 원핵생물 세포일 수 있다. 세포는 이콜라이(E.coli)일 수 있다. 세포는 진핵생물 세포일 수 있다. 세포는 포유류 세포일 수 있다. CAR-EC 스위치 암호화 핵산 또는 CAR-EC 스위치 벡터는 무세포 시스템에서 발현될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로 CAR-EC 스위치는 유리 아미노산으로부터 합성될 수 있다.
CAR-EC 스위치 및 이의 일부의 정제
CAR-EC 스위치 생성 시스템(예를 들어, 세포의 파편, 유리 아미노산)의 구성성분으로부터 본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치를 분리시키는 단계를 포함하는 본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치를 정제하는 방법이 본 명세서에 개시된다. CAR-EC 스위치를 정제하는 단계는 하나 이상의 농축기 칼럼, 전기영동, 여과, 원심분리, 크로마토그래피 또는 이의 조합의 사용을 포함할 수 있다. 크로마토그래피는 크기-배제 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 추가적인 크로마토그래피 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 금속 결합, 면역친화도 크로마토그래피, 및 고성능 액체 크로마토그래피 또는 고압 액체 크로마토그래피를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 전기영동은 변성 전기영동 또는 비-변성 전기영동을 포함할 수 있다.
CAR-EC 스위치는 하나 이상의 펩타이드 태그를 포함할 수 있다. CAR-EC 스위치를 정제시키는 방법은 포획제에 CAR-EC 스위치의 하나 이상의 펩타이드를 결합시키는 단계를 포함할 수 있다. 포획제는 항체, 칼럼, 비드 및 이의 조합으로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 태그는 하나 이상의 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 태그의 예는 폴리히스티딘, FLAG(등록상표) 태그, HA, c-myc, V5, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP) 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 펩타이드 태그는 CAR-BP일 수 있다. 펩타이드 태그는 HTP일 수 있다. 펩타이드 태그는 효모 전사 인자 GCN4일 수 있다.
상기 방법은 CAR-BP, 표적화 폴리펩타이드 및/또는 CAR-EC 스위치의 동결건조 또는 초원심분리를 추가로 포함할 수 있다.
CAR-BP, 표적화 폴리펩타이드 및/또는 CAR-EC 스위치의 순도는 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상일 수 있다. CAR-BP, 표적화 폴리펩타이드 및/또는 CAR-EC 스위치의 순도는 85% 이상일 수 있다. CAR-BP, 표적화 폴리펩타이드 및/또는 CAR-EC 스위치의 순도는 90% 이상일 수 있다. CAR-BP, 표적화 폴리펩타이드 및/또는 CAR-EC 스위치의 순도는 95% 이상일 수 있다. CAR-BP, 표적화 폴리펩타이드 및/또는 CAR-EC 스위치의 순도는 97% 이상일 수 있다.
본 명세서에 개시된 CAR-EC 스위치를 생성하는 방법은 구조적으로 상동성인 CAR-EC 스위치를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드로부터 CAR-EC 스위치를 생성하는 방법은 동일 또는 유사한 형태, 특징, 결합 친화도(예를 들어, CAR 또는 표적에 대해), 기하학 및/또는 크기를 갖는 하나 이상의 CAR-EC 스위치를 초래할 수 있다. CAR-EC 스위치의 동질성은 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상일 수 있다. CAR-EC 스위치의 동질성은 85% 이상일 수 있다. CAR-EC 스위치의 동질성은 90% 이상일 수 있다. CAR-EC 스위치의 동질성은 95% 이상일 수 있다. CAR-EC 스위치의 동질성은 97% 이상일 수 있다. 동질성은 구조적 동질성일 수 있다. 동질성은 대상체에 세포를 투여하기 전의 구조적 동질성일 수 있다. 동질성은 세포 활성에 의한 CAR-EC 스위치에 대한 변형(메틸화, 아세틸화, 글리코실화 등) 전의 구조적 동질성일 수 있다. 동질성의 이들 높은 백분율은 CAR-EC 스위치의 더 예측가능한 효과를 제공할 수 있다. 동질성의 이들 높은 백분율은 대상체에서 병태를 치료하기 위해 CAR-EC와 조합될 때, CAR-EC 스위치의 더 적은 표적을 벗어난 효과를 제공할 수 있다.
실시예
다음의 예시적 실시예는 본 명세서에 기재된 소프트웨어 적용, 시스템 및 방법의 실시형태를 나타내며, 임의의 방법으로 제한하는 것을 의미하지 않는다.
실시예 1 - 전환가능한 CAR-T 플랫폼의 생성 및 평가
발생된 항체의 인간 프로테옴에서 교차 반응성 에피토프에 대한 용해도, 안정성 및 가능성을 CAR-EC 스위치 펩타이드 항원을 선택함에 있어서 고려하였다. 이들 기준에 기반하여, 효모 전사 인자 GCN4(7P14P)로부터의 선형 아미노산 에피토프를 선택하였다. 2.6nM 내지 5.2pM로 변하는 친화도를 지니는 단일쇄 항체는 결합 역학을 통해 CAR-EC의 최적화를 가능하게 한다. 추가적으로, 이들 항체는 선형 에피토프에 대해 가장 높은 친화도 항-펩타이드 단일쇄 항체 중에 있다. 서열 NYHLENEVARLKKL(서열번호 3)을 갖는 선택된 GCN4 에피토프(7P14P) 및 GCN4 결합 scFv(52SR4)에 대한 해리 상수(Kd)는 5.2pM이다.
통상적으로 사용되는 FLAG(등록상표) 태그에 기반한 작은 친수성 표적 펩타이드(HTP)를 개발하였다. FLAG(등록상표)는 낮은 항원성을 가지며, 고도로 가용성이고, 단백질 폴딩 또는 안정성에 대해 영향을 거의 갖지 않는 수많은 단백질에 융합되었다. HTP에 대해 FLAG를 변형시킴에 있어서, 단백질 분해 안정성을 증가시키기 위한 노력에서 말단의 라이신 다음에 프롤린 잔기를 혼입시켰다. 이 에피토프에 대한 항체를 전통적 마우스 면역화 및 후속적 인간화에 의해 또는 인간 라이브러리의 파지 패닝에 의해 발생시킨다. 진화된 scFv의 결합 역학을 완전히 특성규명하고, 펩타이드-CAR-EC를 생성하고 나서, 기재한 바와 같이 표적을 벗어난 특이성에 대해 시험한다.
이종이식 모델에서 전환가능한 CAR-T 플랫폼의 평가
효능을 평가하기 위해, 마우스 이종이식 모델을 사용하여 이들 전환가능한 플랫폼을 CAR-T 스위치 플랫폼에 의해 앞서 개발된 것과 비교한다. 이를 위하여, RS4;11, NALM-6, Raji 또는 다른 CD19 양성 세포주를 사용하여 비-비만 당뇨병-중증 조합 면역결핍(NOD-SCID-γ -/-, NSG) 마우스에서 종양 모델을 확인한다. CAR-T를 정맥내 투여에 의해 전달한다. 용량-범위 발견을 펩타이드 항-CD19 스위치에 대해 수행하고 나서, 야생형 CD19 Fab 대조군과 비교한다. 효능을 종양 부담 및 전반적인 생존 기준으로 판단한다. 마우스를 말초 혈액에서 CAR-EC의 증식을 모니터링하기 위해 매주 혈액을 회수하면서 모니터링한다. 효과기에 초점을 둔 CAR-EC의 면역표현형 특성규명을 상술하면, 기억, 노화(말단 분화됨) 또는 면역성 결핍화된 표현형을 다채널 유세포 분석기를 이용하여 표준 표현형 매개변수에 따라 정하였다.
Fab 및 IgG 기반 스위치의 효능을 관찰한 PK 데이터마다 적절한 투약량에서 전달하고, 비교한다. IgG는 생체내에서 그의 긴 체류시간 동안 이 모델에서 가장 효능이 있다. 이 생각에 대한 추가적인 설명을 동계이식 모델에서 수행한다.
1차 환자-유래 ALL 또는 CLL 샘플을 얻고, NSG 마우스에서 이종이식 모델을 생성한다. 1차 샘플을 유세포분석기에 의해 CD19 발현에 대해 특성규명한다. 요법의 투여 전 2 내지 3주 동안 마우스에서 백혈병을 확립한다. 말초 혈액에서 CD19+ ALL 아구 계수를 모니터링함으로써 CAR-T-19에 대한 효능을 판단한다. 백혈병이 제어 또는 제거되지 않는 경우에, 증식된 아구를 면역표현형화한다(구체적으로 추가 연구를 위해 CD19 항원 발현의 손실을 찾음). (후자는 RS4;11-기반 이종이식과 실질적으로 상이한 것으로 예상되지 않지만)CAR-EC의 지속을 또한 모니터링한다.
상승적 모델에서 전환가능한 CAR-T 플랫폼의 평가
면역결핍 마우스에서 이종이식 모델이 전환가능한 플랫폼의 효능을 측정하게 하지만, 이 모델은 CAR-T-19 요법과 연관된 장기간 림프구감소증을 완화시키는 방법을 평가하는데 최적이 아니다. 면역적격 B 세포 림프종 마우스 모델에서 B 세포 무형성증을 반전시키는 능력에 대해 전환가능한 CAR-EC를 시험한다. 뮤린 대용 CAR-T를 생성하기 위해, 공학 처리된 펩타이드-기반 키메라 수용체를 뮤린 비장세포 내로 형질도입을 위한 모로니(Moloney) 뮤린 백혈병-기반 레트로바이러스 벡터에 대해 클로닝시킨다. 뮤린-유래 신호전달 도메인 CD28 및 CD3z를 사용한다. 항-인간 CD19 항체는 마우스 CD19와 교차반응되지 않으며; 따라서, 래트 항-마우스 CD19 혼성세포 1D3를 (ATCC로부터) 얻고 가변 영역을 서열분석한다. 이 서열을 스위치를 생성하기 위한 펩타이드 융합을 위해 발현 벡터 내로 클로닝시키고 나서, CAR-T-19 마우스 대용물을 생성하기 위해 키메라 항원 수용체 내로 클로닝시킨다.
형질도입의 최적화 및 시험관내 효능의 평가 후에, 야생형 C57BL/6 마우스에서 B 세포 림프종을 확립하기 위해 Myc5-CD19 세포주를 사용한다. CAR-EC 및 스위치를 이종이식 연구 및 대용 시스템을 이용하는 시험관내 분석에 기반한 투약 스케줄로 투여한다. 이 모델의 특정 관심 대상은 Myc5-CD19 소멸 및 B 세포 소모 속도에 대해 Fab, 및 IgG 기반 스위치를 비교하는 것이다. 이종이식 연구로서, CAR-T 증식을 모니터링하고, 면역 표현형 특성규명을 생체밖에서 수행한다. 림프종 세포의 근절 후에, 스위치 투여를 중단하고 나서, 말초 혈액 내 B 세포의 재증식을 모니터링한다. 대용 CAR-T-19와 대용의 전환가능한 CAR-T는 둘 다 장기간 관해를 가능하게 하는 것으로 예상될 뿐만 아니라 전환가능한 플랫폼이 B 세포의 골수 증식을 가능하게 한다. 주요 기관에 대한 CAR-T 침입을 사전에 정한 코호트 조직학을 통해 모니터링하고, 치료 후 세포 분석을 수행한다. 자극이 없는 CAR-EC의 장기간 지속을 따른다.
이질적 암 모델에서 전환가능한 CAR-T 플랫폼의 평가
항-CD19 표적화 항체를 함유하는 제1 스위치 및 항-CD20 표적화 항체 리툭시맙을 함유하는 제2 스위치를 CAR-T-19 요법 동안 CD19 탈출 변이체에 기인하는 ALL 재발과 싸우기 위해 단일의 양자 전달된 CAR-T를 이용하여 동일 환자에서 상이한 항원을 순차적으로 또는 동시에 표적화하기 위해 사용한다.
항-CD20 스위치를 실시예 3에서 결정한 최적의 특징을 이용하여 항-CD19 스위치와 유사한 방식으로 생성한다. 리툭시맙에 기반한 CAR-T-20을 비교를 위해 구성한다. CD20-양성 IM-9 및 다우디 세포주에 대해 시험관내로 효능을 시험한다. 이종성 B-세포 림프아구를 생성하기 위해, 만성 골수성 백혈병-유래 K562 세포주를(CD20 및 CD19에 대해 음성임) 렌티바이러스 벡터를 이용하여 CD19 항원에 의해 안정하게 형질도입한다. 유동 분류를 통해 단일 세포 클론을 얻어서 상동성 CD19 발현을 지니는 집단을 얻는다. 이어서 이 세포주를 CD20에 의해 형질도입하고, 고(CD20고) 또는 저(CD20저) 수준의 항원 발현에 의해 분류한다. CD19+CD20- 및 CD19+CD20고 또는 CD19+CD20저의 혼합물에 대한 전환가능한 CAR-T의 활성화 및 세포독성을 CD19 및 CD20 스위치(동시 또는 순차적 투여)를 이용하여 시험관내 평가한다. 상기 방법은 리툭시맙 스위치를 이용하여 CAR-T를 자극하는데 필수적인 집단에서 CD20고 또는 CD20저 세포의 가장 낮은 백분율을 연구할 기회를 제공한다. 이는 균질한 집단보다 생리적으로 더 적절할 수 있다. 이어서, 이 시스템을 이종이식 마우스 모델에서 시험한다. CD19+CD20- 및 CD19+CD20+의 혼합물을 사용하여 이종이식을 확립한다. 대안적으로, 본 발명자들의 초기 이종이식 연구에서 CD19 또는 CD20 발현에 대해 이종성이 되는 것으로 발견된다면, 1차 환자 유래 ALL 샘플을 이 실험에 대해 사용한다. 항-CD20 스위치를 지니는 전환가능한 CAR-EC를 투여하여 CD19+CD20+ 집단을 제거하고 나서, CD19+CD20- 세포의 결과물을 허용한다. 동일한 CAR-T의 재표적화의 실현가능성을 입증하기 위해, 항-CD19 스위치를 후속적으로 투여하고, 남아있는 이종이식의 성장을 모니터링한다. 희생시킨 마우스의 코호트에서 또는 1차 아구에서 항원 발현에 대해 종양을 평가한다. 동시 표적화를 또한 평가한다. 치료를 CAR-T-19, CAR-T-20, 또는 동시에 둘 다와 비교한다.
실시예 2. CAR 구성
CAR을 다음과 같이 구성하였다:
LV-EF1a-GCN4-BBZ를 효모 전사 인자 GCN4(서열 RMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGER(서열번호 2), 여기서 밑줄친 아미노산은 PDB로부터의 1P4B 결정 구조 내 c11L32Ser scFv에 결합하는 것으로 나타났음)의 7P14P 에피토프를 표적화하도록 설계하였다. scFv를 문헌[Zahnd, C., Spinelli, S., Luginbuhl, B., Amstutz, P., Cambillau, C., and Pluckthun, A. (2004) Directed in vitro evolution and crystallographic analysis of a peptide-binding single chain antibody fragment (scFv) with low picomolar affinity, The Journal of Biological Chemistry 279, 18870-18877]으로부터의 52SR4(c11L32Ser에 대해 유사한 서열을 지니는 고친화도 돌연변이체) 항체 scFv로부터 구성하였다.
실시예 3. 항-CD19- Fab - GCN4 HC1 의 클로닝 , 발현 및 정제
클로닝: Fc 단편 없이 pFuse-hIgG1-Fc 백본 벡터(캘리포니아주에 소재한 인비보젠(InvivoGen))에 대한 증폭 CD19 Fab 중쇄(VH 및 CH1)의 결찰에 의해 CD19 Fab 중쇄의 포유류 발현 벡터를 생성하였다. 유전자 암호화 항체 CD19 경쇄를 증폭시키고 hIgG1 Fc 단편이 없는 pFuse 벡터 내로 클로닝시켰다. 유전자 암호화 GCN4(NYHLENEVARLKKL = 서열번호 3)를 올리고뉴클레오타이드로서 합성하였다. 후속적으로, CD19 Fab 중쇄의 S135 다음에 CD19 Fab의 성숙 중쇄 내로 GCN4를 접합함으로써 항-CD1-Fab-GCN4 HC1 융합 단백질을 생성하였다. 얻어진 포유류 발현 벡터를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
발현 및 정제: 제조업자의 프로토콜에 따라 CD19-Fab 경쇄 및 GCN4-CD19-HC1의 발현 벡터를 이용하는 프리스타일(FreeStyle) HEK 293 세포의 일시적 형질감염을 통해 항-CD19-Fab-GCN4 HC1을 발현시켰다. 간략하게, 3×107 세포를 함유하는 28㎖ 프리스타일 HEK 293 세포를 125㎖ 진탕 플라스크에서 파종시켰다. 1㎖ Opti-MEM에서 희석시킨 15㎍ 경쇄 플라스미드 및 15㎍ 중쇄 플라스미드를 60㎕ 293펙틴(293fectin)(인비트로젠 인코포레이티드(Invitrogen, Inc))을 함유하는 1㎖ Opti-MEM에 첨가하였다. 플라스미드를 293펙틴과 함께 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 리포플렉스 혼합물을 세포 현탁액에 첨가하였다. 이어서, 세포를 125rpm으로 37℃에서 5% CO2 환경에서 진탕시켰다. 분리된 단백질을 함유하는 배양 배지를 형질감염 후 48 및 96시간에 채취하였다. 항-CD1-Fab-GCN4 HC1을 단백질 G 크로마토그래피(일리노이주 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에 의해 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하였다. 도 5a 및 도 5b는 각각 비-환원 및 환원(50mM DTT를 이용) 조건에서 항-CD1-Fab-GCN4 HC1(레인 7)의 SDS 겔 이미지를 나타낸다.
실시예 4. 항-CD19- IgG - GCN4 HC1 의 클로닝 , 발현 및 정제
클로닝: CD19 IgG 중쇄의 포유류 발현 벡터를 pFuse-hIgG1-Fc 백본 벡터(캘리포니아주에 소재한 인비보젠)에 대한 증폭된 CD19 Fab 중쇄(VH 및 CH1)의 프레임내 결찰에 의해 생성하였다. 유전자 암호화 항체 CD19 경쇄를 증폭시키고, hIgG1 Fc 단편이 없는 pFuse 벡터 내로 클로닝시켰다. 유전자 암호화 GCN4(NYHLENEVARLKKL = 서열번호 3)를 올리고뉴클레오타이드로서 합성하였다. 후속적으로, 항-CD19-IgG-GCN4 HC1 융합 단백질을 CD19 IgG의 성숙 중쇄의 S135 다음에 GCN4를 삽입함으로써 생성하였다. 얻어진 포유류 발현 벡터를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
발현 및 정제: 제조업자의 프로토콜에 따라 CD19-IgG 경쇄 및 GCN4-CD19 중쇄의 발현 벡터를 이용하는 프리스타일 HEK 293 세포의 일시적 형질감염을 통해 항-CD19-IgG-GCN4 HC1을 발현시켰다. 간략하게, 3×107개 세포를 함유하는 28㎖ 프리스타일 HEK 293 세포를 125㎖ 진탕 플라스크에서 파종시켰다. 1㎖ Opti-MEM에서 희석시킨 15㎍ 경쇄 플라스미드 및 15㎍ 중쇄 플라스미드를 60㎕ 293펙틴(인비트로젠 인코포레이티드)을 함유하는 1㎖ Opti-MEM에 첨가하였다. 플라스미드를 293펙틴과 함께 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 리포플렉스 혼합물을 세포 현탁액에 첨가하였다. 이어서, 세포를 125rpm으로 37℃에서 5% CO2 환경에서 진탕시켰다. 분리된 단백질을 함유하는 배양 배지를 형질감염 후 48 및 96시간에 채취하였다. GCN4-CD19 중쇄를 단백질 G 크로마토그래피(일리노이주 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에 의해 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하였다. 도 5a 및 도 5b는 각각 비-환원 및 환원(50mM DTT를 이용) 조건에서 항-CD19-IgG-GCN4 HC1(레인 3)의 SDS 겔 이미지를 나타낸다.
실시예 5. 항-CD19- Fab - GCN4 C-말단 의 클로닝 , 발현 및 정제
클로닝: Fc 단편이 없는 pFuse-hIgG1-Fc 백본 벡터(캘리포니아주에 소재한 인비보젠)에 대한 증폭시킨 CD19 Fab 중쇄(VH 및 CH1)의 결찰에 의해 CD19 Fab 중쇄의 포유류 발현 벡터를 생성하였다. 유전자 암호화 항체 CD19 경쇄를 증폭시키고 hIgG1 Fc 단편이 없는 pFuse 벡터 내로 클로닝시켰다. GCN4의 N-말단에서 GGGGS (서열번호 40, 여기서 n=1) 링커를 지니는 GCN4(NYHLENEVARLKKL = 서열번호 3)를 암호화하는 유전자를 올리고뉴클레오타이드로서 합성하였다. 후속적으로, C223에서 Fab 중쇄의 C 말단에 링커-GCN4를 융합시킴으로써 항-CD19-Fab- GCN4 C-말단 융합 단백질을 생성하였다. 얻어진 포유류 발현 벡터를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
발현 및 정제: 제조업자의 프로토콜에 따라 CD19-Fab 경쇄 및 항-CD19-Fab- GCN4 C-말단의 발현 벡터를 이용하는 프리스타일 HEK 293 세포의 일시적 형질감염을 통해 항-CD19-Fab- GCN4 C-말단을 발현시켰다. 간략하게, 3×107개 세포를 함유하는 28㎖ 프리스타일 HEK 293 세포를 125㎖ 진탕 플라스크에서 파종시켰다. 1㎖ Opti-MEM에서 희석시킨 15㎍ 경쇄 플라스미드 및 15㎍ 중쇄 플라스미드를 60㎕ 293펙틴(인비트로젠 인코포레이티드)을 함유하는 1㎖ Opti-MEM에 첨가하였다. 플라스미드를 293펙틴과 함께 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 리포플렉스 혼합물을 세포 현탁액에 첨가하였다. 이어서, 세포를 125rpm으로 37℃에서 5% CO2 환경에서 진탕시켰다. 분리된 단백질을 함유하는 배양 배지를 형질감염 후 48 및 96시간에 채취하였다. 항-CD19-Fab-GCN4 C-말단을 단백질 G 크로마토그래피(일리노이주 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에 의해 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하였다. 도 5a 및 도 5b는 각각 비-환원 및 환원(50mM DTT를 이용) 조건에서 항-CD19-Fab-GCN4 C-말단(레인 9)의 SDS 겔 이미지를 나타낸다.
실시예 6. 항-CD19- IgG - GCN4 힌지 의 클로닝 , 발현 및 정제
클로닝: pFuse-hIgG1-Fc 백본 벡터(캘리포니아주에 소재한 인비보젠)에 대한 증폭시킨 CD19 Fab 중쇄(VH 및 CH1)의 프레임내 결찰에 의해 CD19 IgG 중쇄의 포유류 발현 벡터를 생성하였다. 유전자 암호화 항체 CD19 경쇄를 증폭시키고 hIgG1 Fc 단편이 없는 pFuse 벡터 내로 클로닝시켰다. GCN4("링커-GCN4-링커")의 C-말단에서 GCN4 및 GGS(서열번호 42, 여기서 n=1)의 N-말단에서 GGGGS(서열번호 40, 여기서 n=1) 링커를 지니는 유전자 암호화 GCN4(NYHLENEVARLKKL = 서열번호 3)를 올리고뉴클레오타이드로서 합성하였다. 후속적으로, 항-CD19-IgG -GCN4힌지 융합 단백질을 C223에서 Fab 중쇄의 C 말단과 힌지 영역 사이에 링커-GCN4-링커를 접합시킴으로써 생성하였다. 따라서, 링커-GCN4-링커는 IgG의 힌지 영역을 연장시켜, 신장된 힌지 영역을 지니는 IgG3 구조를 모방한다. 얻어진 포유류 발현 벡터를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
발현 및 정제: 제조업자의 프로토콜에 따라 CD19-IgG 경쇄 및 GCN4-CD19 힌지 중쇄의 발현 벡터를 이용하는 프리스타일 HEK 293 세포의 일시적 형질감염을 통해 항-CD19-IgG -GCN4힌지를 발현시켰다. 간략하게, 3×107개 세포를 함유하는 28㎖ 프리스타일 HEK 293 세포를 125㎖ 진탕 플라스크에서 파종시켰다. 1㎖ Opti-MEM에서 희석시킨 15㎍ 경쇄 플라스미드 및 15㎍ 중쇄 플라스미드를 60㎕ 293펙틴(인비트로젠 인코포레이티드)을 함유하는 1㎖ Opti-MEM에 첨가하였다. 플라스미드를 293펙틴과 함께 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 리포플렉스 혼합물을 세포 현탁액에 첨가하였다. 이어서, 세포를 125rpm으로 37℃에서 5% CO2 환경에서 진탕시켰다. 분리된 단백질을 함유하는 배양 배지를 형질감염 후 48 및 96시간에 채취하였다. GCN4-CD19 힌지 IgG를 단백질 G 크로마토그래피(일리노이주 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에 의해 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하였다. 도 5a 및 도 5b는 각각 비-환원 및 환원(50mM DTT를 이용) 조건에서 항-CD19-IgG-GCN4힌지(레인 5)의 SDS 겔 이미지를 나타낸다.
실시예 7. 항-CD19- IgG - GCN4 CL1 의 클로닝 , 발현 및 정제
클로닝: pFuse-hIgG1-Fc 백본 벡터(캘리포니아주에 소재한 인비보젠)에 대한 증폭시킨 CD19 Fab 중쇄(VH 및 CH1)의 프레임내 결찰에 의해 CD19 IgG 중쇄의 포유류 발현 벡터를 생성하였다. 유전자 암호화 항체 CD19 경쇄를 증폭시키고 hIgG1 Fc 단편이 없는 pFuse 벡터 내로 클로닝시켰다. 말단 둘 다에서 GGGGS(서열번호 40, 여기서 n=1) 링커를 지니는 유전자 암호화 GCN4(NYHLENEVARLKKL = 서열번호 3)를 올리고뉴클레오타이드로서 합성하였다. 후속적으로, CD19 경쇄의 CL 영역 내 K169를 말단 둘 다에서 링커 서열을 지니는 GCN4로 대체함으로써 항-CD19-IgG-GCN4CL1 융합 단백질을 생성하였다. 얻어진 포유류 발현 벡터를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
발현 및 정제: 제조업자의 프로토콜에 따라 CD19-IgG 중쇄 및 GCN4-CD19-CL1 경쇄의 발현 벡터를 이용하는 프리스타일 HEK 293 세포의 일시적 형질감염을 통해 항-CD19-IgG-GCN4CL1을 발현시켰다. 간략하게, 3×107개 세포를 함유하는 28㎖ 프리스타일 HEK 293 세포를 125㎖ 진탕 플라스크에서 파종시켰다. 1㎖ Opti-MEM에서 희석시킨 15㎍ 경쇄 플라스미드 및 15㎍ 중쇄 플라스미드를 60㎕ 293펙틴(인비트로젠 인코포레이티드)을 함유하는 1㎖ Opti-MEM에 첨가하였다. 플라스미드를 293펙틴과 함께 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 리포플렉스 혼합물을 세포 현탁액에 첨가하였다. 이어서, 세포를 125rpm으로 37℃에서 5% CO2 환경에서 진탕시켰다. 분리된 단백질을 함유하는 배양 배지를 형질감염 후 48 및 96시간에 채취하였다. 항-CD19-IgG-GCN4CL1을 단백질 G 크로마토그래피(일리노이주 써모 피셔 사이언티픽)에 의해 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하였다. 도 5a 및 도 5b는 각각 비-환원 및 환원(50mM DTT를 이용) 조건에서 항-CD19-IgG-GCN4CL1(레인 4)의 SDS 겔 이미지를 나타낸다.
실시예 8. 항-CD19- Fab - GCN4 CL1 의 클로닝 , 발현 및 정제
클로닝: Fc 단편이 없는 pFuse-hIgG1-Fc 백본 벡터(캘리포니아주에 소재한 인비보젠)에 대한 증폭시킨 CD19 Fab 중쇄(VH 및 CH1)의 결찰에 의해 CD19 Fab 중쇄의 포유류 발현 벡터를 생성하였다. 유전자 암호화 항체 CD19 경쇄를 증폭시키고 hIgG1 Fc 단편이 없는 pFuse 벡터 내로 클로닝시켰다. 말단 둘 다에서 GGGGS(서열번호 40, 여기서 n=1) 링커를 지니는 유전자 암호화 GCN4(NYHLENEVARLKKL = 서열번호 3)를 올리고뉴클레오타이드로서 합성하였다. 후속적으로, CD19 경쇄의 CL 영역 내 K169를 말단 둘 다에서 링커 서열을 지니는 GCN4로 대체함으로써 항-CD19-Fab-GCN4CL1 융합 단백질을 생성하였다. 얻어진 포유류 발현 벡터를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
발현 및 정제: 제조업자의 프로토콜에 따라 CD19-Fab 중쇄 및 GCN4-CD19-CL 경쇄의 발현 벡터를 이용하는 프리스타일 HEK 293 세포의 일시적 형질감염을 통해 항-CD19-Fab-GCN4CL1을 발현시켰다. 간략하게, 3×107개 세포를 함유하는 28㎖ 프리스타일 HEK 293 세포를 125㎖ 진탕 플라스크에서 파종시켰다. 1㎖ Opti-MEM에서 희석시킨 15㎍ 경쇄 플라스미드 및 15㎍ 중쇄 플라스미드를 60㎕ 293펙틴(인비트로젠 인코포레이티드)을 함유하는 1㎖ Opti-MEM에 첨가하였다. 플라스미드를 293펙틴과 함께 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 리포플렉스 혼합물을 세포 현탁액에 첨가하였다. 이어서, 세포를 125rpm으로 37℃에서 5% CO2 환경에서 진탕시켰다. 분리된 단백질을 함유하는 배양 배지를 형질감염 후 48 및 96시간에 채취하였다. 항-CD19-IgG-GCN4CL1을 단백질 G 크로마토그래피(일리노이주 써모 피셔 사이언티픽)에 의해 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하였다. 도 5a 및 도 5b는 각각 비-환원 및 환원(50mM DTT를 이용) 조건에서 항-CD19-Fab-GCN4CL1(레인 8)의 SDS 겔 이미지를 나타낸다.
실시예 9. 항-CD19- Fab - GCN4 LC1-N-말단 의 클로닝 , 발현 및 정제
클로닝: Fc 단편이 없는 pFuse-hIgG1-Fc 백본 벡터(캘리포니아주에 소재한 인비보젠)에 대한 증폭시킨 CD19 Fab 중쇄(VH 및 CH1)의 결찰에 의해 CD19 Fab 중쇄의 포유류 발현 벡터를 생성하였다. 유전자 암호화 항체 CD19 경쇄를 증폭시키고, hIgG1 Fc 단편이 없는 pFuse 벡터 내로 클로닝시켰다. GCN4의 C-말단에서 GGGGS(서열번호 40, 여기서 n=1) 링커를 지니는 유전자 암호화 GCN4(NYHLENEVARLKKL = 서열번호 3)를 올리고뉴클레오타이드로서 합성하였다. 후속적으로, Fab 경쇄의 N 말단에 링커-GCN4를 융합시킴으로써 항-CD19-Fab-GCN4 LC1-N-말단 융합 단백질을 생성하였다. 얻어진 포유류 발현 벡터를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
발현 및 정제: 제조업자의 프로토콜에 따라 CD19-Fab 경쇄 및 GCN4-CD19-C-말단의 발현 벡터를 이용하는 프리스타일 HEK 293 세포의 일시적 형질감염을 통해 항-CD19-Fab-GCN4 LC1-N-말단을 발현시켰다. 간략하게, 3×107개 세포를 함유하는 28㎖ 프리스타일 HEK 293 세포를 125㎖ 진탕 플라스크에서 파종시켰다. 1㎖ Opti-MEM에서 희석시킨 15㎍ 경쇄 플라스미드 및 15㎍ 중쇄 플라스미드를 60㎕ 293펙틴(인비트로젠 인코포레이티드)을 함유하는 1㎖ Opti-MEM에 첨가하였다. 플라스미드를 293펙틴과 함께 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 리포플렉스 혼합물을 세포 현탁액에 첨가하였다. 이어서, 세포를 125rpm으로 37℃에서 5% CO2 환경에서 진탕시켰다. 분리된 단백질을 함유하는 배양 배지를 형질감염 후 48 및 96시간에 채취하였다. 항-CD19-Fab-GCN4 LC1-N-말단을 단백질 G 크로마토그래피(일리노이주 써모 피셔 사이언티픽)에 의해 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE 겔에 의해 분석하였다. 도 5a 및 도 5b는 각각 비-환원 및 환원(50mM DTT를 이용) 조건에서 항-CD19-Fab-GCN4 LC1-N-말단(레인 10)의 SDS 겔 이미지를 나타낸다.
실시예 10. 항-CD19 Fab - GCN4 CL1 , 항-CD19 IgG Fc삭제 - GCN4 및 항-CD19 Fab -GCN4 C-말단 CAR-EC 스위치의 세포독성
GCN4 효모 전사 인자 펩타이드 서열 7P14P의 14개 아미노산을 융합시킴으로써 펩타이드 CAR-EC 스위치를 생성하였다(문헌[Zahnd et al. (2004) Directed in vitro evolution and crystallographic analysis of a peptide-binding single chain antibody fragmen (scFv) with low picomolar affinity, The Journal of Biological Chemistry 279, 18870-18877]에서 정의). scFv c11L32Ser을 지니는 GCN4 펩타이드는 7P14P의 결정 구조 1P4B에서 정의한 것에 기반하여 14개의 아미노산을 선택하였다. Fab 항체의 중쇄의 C-말단에 GCN4 펩타이드를 융합시킴으로써 또는 Fab 또는 IgG 항체의 경쇄의 CL 루프 내에 GCN4 펩타이드 서열을 융합시킴으로써 스위치를 구성하였다. 모든 발현을 CHO 또는 HEK 세포 내에서 수행하였다.
접합된 GCN4 펩타이드 기반 항-CD19 CAR-T 스위치(서열번호 30)를 생성하기 위해, 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드(7P14P) RMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGER(서열번호 2)로부터의 결정 구조(PDB: 1P4B)(도 2 참조)에 따라 최소 결합 에피토프가 되는 것으로 시사된 펩타이드 NYHLENEVARLKKL(서열번호 3)를 마우스 항-인간 CD19 Fab 클론 FMC63에 접합시켰다. 경쇄의 K63(성숙 단백질의 N 말단으로부터 카운팅할 때 K169인 불변 영역의 N 말단으로부터 카운팅)을 서열 GGGGSNYHLENEVARLKKLGGGGS(서열번호 4)- GGGGS 링커에 측접하는 GCN4 에피토프(서열번호 40, 여기서 n=1)로 대체함으로써 접합을 수행하였다. 항-CD19 FabCL1-GCN4의 질량 스펙트럼을 이하에 제공한다(도 3). 대안적으로, 펩타이드를 중쇄(서열번호 29)에 접합시킨다.
10:1의 E:T 비 및 24시간 인큐베이션에서 CAR-T-GCN4를 생성하기 위해 LV-EF1a-GCN4(52SR4)로 형질도입한 인간 PBMC를 이용하여 항-CD19 FabCL1-GCN4 스위치의 세포독성 활성을 평가하였다. 활성을 NALM-6(CD19+), RS4;11(CD19+) 또는 RPMI-8226(CD19-)(표 1)에 대해 평가하였다. IgG(Fc삭제) 스위치의 활성을RS4;11(CD19+) 또는 K562(CD19-)(표 2)에 대해 평가하였다. C-말단 스위치의 활성을 RS4;11(CD19+) 또는 K562(CD19-)(표 3)에 대해 평가하였다.
항-CD19 FabCL1-GCN4 스위치의 세포독성
세포독성%
농도(pM) NALM-6(CD19 양성) RS4;11(CD19 양성) RPMI-8226(CD19 음성)
10 86.74405 104.0488 15.20283
1 82.23607 90.00308 8.149928
0.1 77.28449 84.11992 3.819127
0.01 47.15363 45.37116 2.656606
0.001 -5.794394 -2.258805 -4.993927
0.0001 -7.191706 -8.02902 -7.662813
0.00001 -4.779683 -2.792706 -1.318068
항-CD19 IgGFc삭제 -GCN4 스위치의 세포독성
세포독성%
농도(pM) RS4;11(CD19 양성) K562(CD19 음성)
1 53.56274 6.218475
0.1 48.75237 1.844815
0.01 38.21278 -2.777584
0.001 12.10702 -2.964143
0.0001 0.1621473 -6.301391
0.00001 -0.9188344 -4.891867
항-CD19 FabC 말단 -GCN4 스위치의 세포독성
세포독성%
농도(nM) RS4;11 (CD19 양성) K562 (CD19 음성)
10 92.10811 1.44819
1 76.75676 -3.445695
0.1 66.59459 -2.197255
0.01 60.97298 -1.348315
0.001 8.216215 -2.147315
0.0001 -2.162161 -3.046195
0.00001 1.945946 -0.299624
실시예 11. 항-CD19 항체 또는 항체 단편의 상이한 영역에 접합/융합된 GCN4 를 지니는 다양한 항-CD19-GCN4 CAR-EC 스위치의 세포독성
항-CD19 FMC63 항체 또는 항체 단편의 상이한 영역에 접합/융합된 다양한 항-CD19-GCN4 CAR-EC 스위치의 세포독성 활성을 10:1 및 24 시간 인큐베이션의 E:T 비에서 CAR-T-GCN4를 생성하기 위해 LV-EF1a-GCN4(52SR4)와 함께 형질도입한 인간 PBMC를 이용하여 평가하였다. 시험한 스위치는 항-CD19 FabCL1-GCN4("CL1 Fab), 항-CD19-GCN4 FabC -말단("C-말단 Fab), 항-CD19 IgGHC1-GCN4("HC1 IgG"), 항-CD19 IgGCL1-GCN4("CL1 IgG"), 항-CD19 IgG힌지-GCN4("힌지 IgG"), 항-CD19 IgGWT-GCN4("Wt IgG"), 항-CD19 FabHC1-GCN4("HC1 Fab") 및 항-CD19 FabN -말단 LC1-GCN4("N-말단 LC1 Fab")이었다. RS4;11(CD19+)에 대한 활성을 평가하였다(도 4, 표 4). 도 6은 본 실시예에 기재한 스위치의 접합 위치를 도시한다. CL1 및 HC1 접합 위치를 Fab와 IgG 형식에 적용하였다. N-말단 접합은 경쇄에 접합된 것으로 나타나지만, N-말단의 접합은 경쇄 또는 Fab로 제한되지 않으며, 또한 중쇄뿐만 아니라 IgG 형식에 접합될 수 있다. Fab 상의 C-말단 위치는 힌지 IgG와 등량이다. 이와 관련하여 모든 Fab 작제물은 1가이며, 모든 IgG 작제물은 2가이지만, 이들은 일반적으로 CAR-EC 스위치에 대한 필수적인 필요조건이 아니다.
항-CD19-GCN4 스위치의 세포독성
스위치 농도 (nM) CL1 Fab C-말단 Fab HC1 IgG CL1 IgG 힌지 IgG WT IgG HC1 Fab N-말단 LC1 Fab
10 70.10483 63.81551 47.46331 54.02444 67.4252 1.785714 41.07143 59.97437
1 58.28092 59.53878 39.91614 59.58702 52.76022 2.040816 43.87755 62.53738
0.1 60.54507 55.26205 39.16142 58.3228 40.62368 3.061224 44.38776 62.28107
0.01 46.96017 33.37526 28.09225 56.80573 35.0611 2.55102 20.66327 49.46604
0.001 4.444445 -2.09644 1.174004 24.18879 2.697009 2.55102 -0.2551 21.52926
0.0001 2.180294 -4.61216 -2.09644 1.685631 -5.14117 2.040817 -0.5102 3.075609
0.00001 1.425577 -3.60587 -1.09015 0.927097 -6.65823 1.785714 -0.7653 5.07E-07
1E-07 0.922432 -1.34172 0.419288 0.674253 -1.60135 1.27551 -1.27551 1.281505
실시예 12. 이종이식 종양 마우스 모델에서 항-CD19- Fab - GCN4CL1 CAR-EC 스위치 및 항-GCN4 CAR T-세포(swiCAR T-세포)의 생체내 효능.
swiCAR-T 세포 생체내 활성을 평가하기 위해, 발광 NALM-6 세포에 기반한 정위(액체) 이종이식 종양 모델을 이용한 파일럿 연구를 수행하였다. 이 모델에서 swiCAR T-세포는 0.5㎎/㎏의 항-CD19(GCN4) CL1 Fab를 이용하는 1일 치료의 단지 5일 후에 퇴행이 입증되었다. swiCAR T-세포를 이용하는 야생형 항-CD19 Fab에 의한 치료는 종양 퇴행을 매개할 수 없었다(일원 ANOVA에 의해 유의하지 않음). 이 결과들은 생체내 swiCAR T-세포를 재지시하는 능력을 입증한다. 실험의 상세한 설명: 106개의 발광 NALM-6 세포를 비비만 당뇨병 중증 합병성 면역결핍(NOD-SCID-γ-/-, NSG) 마우스 내로 정맥내에 의해 주사하였다. 6일 후에, 30x106개 swiCAR T-세포 또는 CART-19 세포(50% 형질도입)를 정맥내로 주입하였다. αCD19-Fab-GCN4-CL1(정맥내)의 투약을 동일한 날에 1일 1회 0.5㎎/㎏으로 시작하였다. 투약 5일(제11일) 후에 마우스를 루시페린으로 주사하고 나서, 생체내 영상화 시스템(IVIS) n=3 또는 4에 대해 영상화하고, 마우스마다 측정한 평균 광휘(p/s/㎠/sr)를 플롯팅하고 나서, 평균 ± SEM, **p ≤ 0.05, 일원 ANOVA로 플롯팅하였다. 치료 없음과 swiCAR-T + WT Fab 사이의 차이는 통계적으로 유의하지 않다. 결과를 도 7A에 나타낸다.
실시예 13. 항- BCMA - IgG - GCN4 CL1 의 클로닝 , 발현 및 정제
클로닝: CD19 IgG 중쇄의 포유류 발현 벡터를 pFuse-hIgG1-Fc 백본 벡터(캘리포니아주에 소재한 인비보젠)에 대한 증폭시킨 항-BCMA IgG 중쇄(VH 및 CH1)의 프레임내 결찰에 의해 생성하였다. 유전자 암호화 항체 BCMA 경쇄를 증폭시키고 나서, hIgG1 Fc 단편이 없는 pFuse 벡터 내로 클로닝시켰다. 단부 둘 다에서 GGGGS(서열번호 40, 여기서 n=1) 링커를 지니는 유전자 암호화 GCN4(NYHLENEVARLKKL = 서열번호 3)를 올리고뉴클레오타이드로서 합성하였다. 후속적으로, 항-BCMA 경쇄의 CL 영역 내로 말단 둘 다에서 GCN4를 링커 서열과 접합시킴으로써 항-BCMA-IgG-GCN4CL1 융합 단백질을 생성하였다. 얻어진 포유류 발현 벡터를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
발현 및 정제: 제조업자의 프로토콜에 따라 BCMA-IgG 중쇄 및 GCN4-BCMA-CL1 경쇄의 발현 벡터를 이용하는 프리스타일 HEK 293 세포의 일시적 형질감염을 통해 항-BCMA-IgG-GCN4CL1을 발현시켰다. 간략하게, 3×107개 세포를 함유하는 28㎖ 프리스타일 HEK 293 세포를 125㎖ 진탕 플라스크에서 파종시켰다. 1㎖ Opti-MEM에서 희석시킨 15㎍ 경쇄 플라스미드 및 15㎍ 중쇄 플라스미드를 60㎕ 293펙틴(인비트로젠 인코포레이티드)을 함유하는 1㎖ Opti-MEM에 첨가하였다. 플라스미드를 293펙틴과 함께 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 리포플렉스 혼합물을 세포 현탁액에 첨가하였다. 이어서, 세포를 125rpm으로 37℃에서 5% CO2 환경에서 진탕시켰다. 분리된 단백질을 함유하는 배양 배지를 형질감염 후 48 및 96시간에 채취하였다. 항-BCMA-IgG-GCN4CL1을 단백질 G 크로마토그래피(일리노이주 써모 피셔 사이언티픽)에 의해 정제하였다.
실시예 14. 항- BCMA 항체 또는 항체 단편의 경쇄에 접합된 GCN4를 지니는 항-BCMA-IgG-GCN4 CL1 CAR-EC 스위치의 세포독성
항-BCMA-IgG-GCN4CL1 CAR-EC 스위치의 세포독성 활성을 10:1의 E:T 비 및 24 시간 인큐베이션에서 CAR-T-GCN4를 생성하기 위해 LV-EF1a-GCN4(52SR4)로 형질도입한 인간 PBMC를 이용하여 평가하였다. PBMC의 형질도입 효율은 대략 50%였다. 표적 세포의 세포용해에 기인하여 락트산염을 정량화함으로써 OPM2(BCMA+)에 대한 활성을 평가하였다(도 8, 표 5).
항-BCMA-IgG-GCN4CL1 CAR-EC 스위치 및 항-GCN4 CAR-T 세포의 세포독성
항-BCMA-IgG-GCN4CL1 스위치 농도[pM] 세포독성%
10000.000 35.52758
1000.000 35.06853
100.000 41.44725
10.000 31.59707
1.000 5.575391
0.100 1.13803
0.010 0.812881
본 발명의 바람직한 실시형태를 본 명세서에서 나타내고 기재하였지만, 이러한 실시형태가 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 수많은 변형, 변화 및 치환이 본 발명으로부터 벗어나는 일 없이 이제 당업자에게 떠오를 것이다. 본 명세서에 기재한 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안을 본 발명을 실행함에 있어서 사용할 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
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SEQUENCE LISTING <110> THE CALIFORNIA INSTITUTE FOR BIOMEDICAL RESEARCH <120> PEPTIDIC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T CELL SWITCHES AND USES THEREOF <130> IPA160248-US <140> PCT/US2014/060684 <141> 2014-10-15 <150> 62/030,514 <151> 2014-07-29 <150> 62/030,526 <151> 2014-07-29 <150> 62/009,054 <151> 2014-06-06 <150> 61/895,704 <151> 2013-10-25 <150> 61/891,347 <151> 2013-10-15 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8835 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 60 attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 120 aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 180 tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 240 agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 300 gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 360 cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 420 agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 480 taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 540 tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 600 taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 660 acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 720 ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 780 cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 840 agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 900 tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg 960 agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac 1020 tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 1080 ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 1140 tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1200 aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 1260 tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 1320 agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 1380 taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 1440 caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 1500 agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 1560 aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 1620 gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 1680 tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 1740 gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 1800 ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 1860 ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 1920 aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 1980 aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2040 atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca 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aatcctggcc tgttagaaac 2940 atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga 3000 agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga 3060 gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac 3120 caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt 3180 ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 3240 ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 3300 tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcctcaatg acgctgacgg 3360 tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 3420 ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 3480 gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 3540 ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 3600 tggaacagat tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac 3660 aagcttaata cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga 3720 attattggaa ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg 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ttaaggagcc ccttcgcctc 4620 gtgcttgagt tgaggcctgg cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc 4680 ttcgcgcctg tctcgctgct ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg 4740 ctgcgacgct ttttttctgg caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg 4800 gtatttcggt ttttggggcc gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt 4860 cggcgaggcg gggcctgcga gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg 4920 gccggcctgc tctggtgcct ggcctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa 4980 ggctggcccg gtcggcacca gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg 5040 cagggagctc aaaatggagg acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac 5100 aaaggaaaag ggcctttccg tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg 5160 cgccgtccag gcacctcgat tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg 5220 gggaggggtt ttatgcgatg gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc 5280 cagcttggca cttgatgtaa ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt 5340 tcattctcaa gcctcagaca gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag 5400 gaattcggta ccgcggccgc ccggggatcc atggccttac 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cgaattttaa caaaatatta 8820 acgtttacaa tttcc 8835 <210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Arg Met Lys Gln Leu Glu Pro Lys Val Glu Glu Leu Leu Pro Lys Asn 1 5 10 15 Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu 20 25 30 Arg <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu 1 5 10 15 Lys Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Pro 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 8 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 8 gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240 gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc ttgagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgtcgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 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gcgtacgctc aggtgcagct gcagcagccg ggcgcggaac tggtgaaacc gggcgcgagc 120 gtgaaaatga gctgcaaagc gagcggctat acctttacca gctataacat gcattgggtg 180 aaacagaccc cgggccgcgg cctggaatgg attggcgcga tttatccggg caacggcgat 240 accagctata accagaaatt taaaggcaaa gcgaccctga ccgcggataa aagcagcagc 300 accgcgtata tgcagctgag cagcctgacc agcgaagata gcgcggtgta ttattgcgcg 360 cgcagcacct attatggcgg cgattggtat tttaacgtgt ggggcgcggg caccaccgtg 420 accgtgagcg cggcgagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 480 agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540 gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 600 ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ctgtgccctc tagcagcttg 660 ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720 aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacaca 756 <210> 15 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 15 atgagggtcc ccgctcagct cctggggctc ctgctgctct 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cggcagcggc agcggcaccg attttaccct gaacattagc 240 agcctgcagc cggatgattt tgcgacctat tattgccagc agagcaaaga agtgccgtgg 300 acctttggcc agggcaccaa agtggaaatt aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt 654 <210> 20 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 20 caggtgcagc tggtgcagag cggcgcggaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtg 60 agctgcaaag cgagcggcta tacctttacc gattataaca tgcattgggt gcgccaggcg 120 ccgggccagg gcctggaatg gattggctat atttatccgt ataacggcgg caccggctat 180 aaccagaaat ttaaaagcaa agcgaccatt accgcggatg aaagcaccaa caccgcgtat 240 atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat accgcggtgt attattgcgc gcgcggccgc 300 ccggcgatgg attattgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgagcagcgc ctccaccaag 360 ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tcctagagca cctctggggg cacagcggcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtc gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtggt 660 ggcggtcacc atcaccatca tcaccaccac 690 <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 21 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val 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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 420 425 430 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 435 440 445 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 450 455 460 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 36 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Asn Tyr His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile 35 40 45 Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn 85 90 95 Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr 100 105 110 Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 115 120 125 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 130 135 140 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 165 170 175 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 180 185 190 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 195 200 205 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 210 215 220 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 37 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Asn Gln Gly Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Ser Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Tyr His 165 170 175 Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser 180 185 190 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 195 200 205 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 210 215 220 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 38 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30 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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 39 <211> 5574 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 39 aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60 tctcgctaac caaaccggta accctgatta tttgcacgga gtcacacttt gctatgccat 120 agcattttta tccataagat tagcggatcc tacctgacgc tttttatcgc aactctctac 180 tgtttctcca tacccgtttt tttgggctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga 240 atacatcaac tagtacgcaa gttcacgtaa aaagggtatc tagaggttga ggtgatttta 300 tgaaaaagaa tatcgcattt cttcttgcta gcatgttcgt tttttctatt gctacaaacg 360 catacgctga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct ctgggagaca 420 gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat tggtatcagc 480 agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta cactcaggag 540 tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc attagcaacc 600 tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt ccgtacacgt 660 tcggaggggg gaccaagctt gagatcaaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct 720 tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgtcgtgtgc ctgctgaata 780 acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta 840 actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca 900 ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc 960 atcagggcct gtcctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt taagctgggg 1020 atcctctaga ggttgaggtg attttatgaa aaagaatatc gcatttcttc ttgcatctat 1080 gttcgttttt tctattgcta caaacgcgta cgctgaggtg aaactgcagg agtcaggacc 1140 tggcctggtg gcgccctcac agagcctgtc cgtcacatgc actgtctcag gggtctcatt 1200 acccgactat ggtgtaagct ggattcgcca gcctccacga aagggtctgg agtggctggg 1260 agtaatatgg ggtagtgaaa ccacatacta taattcagct ctcaaatcca gactgaccat 1320 catcaaggac aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg aacagtctgc aaactgatga 1380 cacagccatt tactactgtg ccaaacatta ttactacggt ggtagctatg ctatggacta 1440 ctggggccaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcagcctcc accaagggcc catcggtctt 1500 ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt 1560 caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg 1620 cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt 1680 gactgtgccc tctagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc 1740 cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacata 1800 ataagtcgac cgatgccctt gagagccttc aacccagtca gctccttccg gtgggcgcgg 1860 ggcatgacta tcgtcgccgc acttatgact gtcttcttta tcatgcaact cgtaggacag 1920 gtgccaaacg gtctccagct tggctgtttt ggcggatgag agaagatttt cagcctgata 1980 cagattaaat cagaacgcag aagcggtctg ataaaacaga atttgcctgg cggcagtagc 2040 gcggtggtcc cacctgaccc catgccgaac tcagaagtga aacgccgtag cgccgatggt 2100 agtgtggggt ctccccatgc gagagtaggg aactgccagg catcaaataa aacgaaaggc 2160 tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag 2220 taggacaaat ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg 2280 ggcaggacgc ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga 2340 tggccttttt gcgtttctac aaactctttt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 2400 tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt 2460 atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 2520 gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 2580 cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 2640 gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 2700 cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 2760 gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 2820 tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 2880 ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 2940 gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 3000 cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 3060 tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 3120 tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 3180 cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 3240 acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 3300 tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat 3360 ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg 3420 accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc 3480 aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 3540 ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 3600 gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta 3660 ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 3720 ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 3780 ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 3840 gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 3900 cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 3960 cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 4020 cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 4080 aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 4140 ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct 4200 gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa 4260 gagcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg 4320 tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 4380 cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 4440 gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 4500 gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagcag atcaattcgc 4560 gcgcgaaggc gaagcggcat gcataatgtg cctgtcaaat ggacgaagca gggattctgc 4620 aaaccctatg ctactccgtc aagccgtcaa ttgtctgatt cgttaccaat tatgacaact 4680 tgacggctac atcattcact ttttcttcac aaccggcacg gaactcgctc gggctggccc 4740 cggtgcattt tttaaatacc cgcgagaaat agagttgatc gtcaaaacca acattgcgac 4800 cgacggtggc gataggcatc cgggtggtgc tcaaaagcag cttcgcctgg ctgatacgtt 4860 ggtcctcgcg ccagcttaag acgctaatcc ctaactgctg gcggaaaaga tgtgacagac 4920 gcgacggcga caagcaaaca tgctgtgcga cgctggcgat atcaaaattg ctgtctgcca 4980 ggtgatcgct gatgtactga caagcctcgc gtacccgatt atccatcggt ggatggagcg 5040 actcgttaat cgcttccatg cgccgcagta acaattgctc aagcagattt atcgccagca 5100 gctccgaata gcgcccttcc ccttgcccgg cgttaatgat ttgcccaaac aggtcgctga 5160 aatgcggctg gtgcgcttca tccgggcgaa agaaccccgt attggcaaat attgacggcc 5220 agttaagcca ttcatgccag taggcgcgcg gacgaaagta aacccactgg tgataccatt 5280 cgcgagcctc cggatgacga ccgtagtgat gaatctctcc tggcgggaac agcaaaatat 5340 cacccggtcg gcaaacaaat tctcgtccct gatttttcac caccccctga ccgcgaatgg 5400 tgagattgag aatataacct ttcattccca gcggtcggtc gataaaaaaa tcgagataac 5460 cgttggcctc aatcggcgtt aaacccgcca ccagatgggc attaaacgag tatcccggca 5520 gcaggggatc attttgcgct tcagccatac ttttcatact cccgccattc agag 5574 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 41 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 42 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Gly Gly Ser 1 <210> 43 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Gly Ser 1 <210> 44 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid <400> 44 Xaa Ser 1 <210> 45 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(25) <223> This sequence may encompass 1 to 5 "Gly Gly Gly Gly Ser" repeating units <400> 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(15) <223> This sequence may encompass 1 to 5 "Gly Gly Ser" repeating units <400> 46 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Gly Ser Ser Ser Ser 1 5 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 49 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Gly Ser 1

Claims (62)

  1. 피검체에서 암을 치료하기 위한 CAR-EC(chimeric antigen receptor-effector cell) 플랫폼으로서,
    a. i. 효과기 세포 상에서 키메라 항원 수용체에 결합하고, 또 이를 활성화시키는 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드를 포함하는 제1 펩타이드 항원이되, 상기 GCN4 펩타이드는 적어도 12개 아미노산인 서열번호 2의 일부를 포함하는, 제1 펩타이드 항원; 및
    ii. 표적 세포 상에서 세포 표면 분자와 결합하는 제1 표적화 모이어티이되, 여기서 상기 제1 표적화 모이어티는 항체, 또는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는, 제1 표적화 모이어티를 포함하는 제1 키메라 항원 수용체-효과기 세포(CAR-EC) 스위치로서,
    여기서 상기 제1 펩타이드 항원은 상기 제1 표적화 모이어티에 접합되거나, 또는 융합되는, 제1 CAR-EC 스위치, 및
    b. 상기 제1 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치의 제1 펩타이드 항원에 결합하는 항-GCN4 키메라 항원 수용체를 포함하는 제1 키메라 항원 수용체-효과기 세포를 포함하되,
    상기 효과기 세포는 T 세포인,
    피검체에서 암을 치료하기 위한 CAR-EC 플랫폼.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 CAR-EC 스위치는 2개의 펩타이드 항원을 포함하는, CAR-EC 플랫폼.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편은 면역글로불린, Fc 삭제 면역글로불린, Fab, 및 이들의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, CAR-EC 플랫폼.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 표적화 모이어티는 항-EGFR 항체, 항-Her2 항체, 항-EGFRvIII 항체, 항-CD33 항체, 항-CLL-1 항체, 항-CEA 항체, 항-CD19 항체, 항-CD22 항체, 항-BCMA 항체, 항-CS1 항체, 및 이들의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, CAR-EC 플랫폼.
  5. 제3항에 있어서, 상기 제1 표적화 모이어티는 항-CD19 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, CAR-EC 플랫폼.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 표적화 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편은 경쇄 및 중쇄 쌍을 포함하되, 여기서 상기 경쇄 및 중쇄는 서열번호 8 및 9; 서열번호 8 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 및 서열번호 19 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열 쌍을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는, CAR-EC 플랫폼.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제1 표적화 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편은 경쇄 및 중쇄 쌍을 포함하되, 여기서 상기 경쇄 및 중쇄는 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 27 및 29; 서열번호 30 및 29; 서열번호 36 및 29; 서열번호 31 및 28; 서열번호 27 및 32; 서열번호 27 및 33; 서열번호 27 및 34; 및 서열번호 27 및 35로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 쌍을 포함하는, CAR-EC 플랫폼.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제1 펩타이드 항원은 (i) 경쇄의 N 말단; (ii) 중쇄의 N 말단; (iii) IgG의 VL 도메인의 N 말단; (iv) IgG의 VH 도메인의 N 말단; (vi) Fab의 VL 도메인의 N 말단; 및 (vii) Fab의 VH 도메인의 N 말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 표적화 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편의 영역에 융합되는, CAR-EC 플랫폼.
  9. 제5항에 있어서, 상기 제1 펩타이드 항원은 (i) 경쇄의 N 말단; (ii) 중쇄의 N 말단; (iii) IgG의 VL 도메인의 N 말단; (iv) IgG의 VH 도메인의 N 말단; (v) Fab의 VL 도메인의 N 말단; 및 (vi) Fab의 VH 도메인의 N 말단으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 표적화 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편의 영역에 융합되는, CAR-EC 플랫폼.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제1 CAR-EC 스위치는 상기 제1 펩타이드 항원 및 상기 제1 표적화 모이어티를 연결하는 링커를 포함하는, CAR-EC 플랫폼.
  11. 제10항에 있어서, (i) 상기 링커가 1 내지 20개의 아미노산을 포함하거나; (ii) 상기 링커가 서열번호 40 내지 44로부터 선택된 서열을 포함하거나; 또는 (iii) 상기 링커가 1 내지 20개의 아미노산을 포함하고, 그리고 서열번호 40 내지 44로부터 선택된 서열을 포함하는, CAR-EC 플랫폼.
  12. 제1항에 있어서, 상기 암은 백혈병, 림프종, 유방암, 췌장암, 폐암, 신경교종, 및 교모세포종으로 구성된 군으로부터 선택되는, CAR-EC 플랫폼.
  13. 제1항에 있어서, 상기 세포 표면 분자는 종양 관련 항원; 분화 단백질 클러스터; 수용체; 내재성 막단백질; 및 당단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, CAR-EC 플랫폼.
  14. 피검체에서 암을 치료하기 위한 CAR-EC(chimeric antigen receptor-effector cell) 플랫폼으로서,
    a. i. 효과기 세포 상에서 키메라 항원 수용체에 결합하고, 또 이를 활성화시키며, (i) 서열번호 3을 포함하거나; 또는 (ii) 서열번호 2의 적어도 12개 아미노산을 포함하는, 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드를 포함하는 제1 펩타이드 항원; 및
    ii. 표적 세포 상에서 세포 표면 분자에 결합하는 제1 표적화 모이어티(여기서 상기 제1 표적화 모이어티는 항체, 또는 항체의 항원 결합 단편을 포함함)를 포함하는, 제1 키메라 항원 수용체-효과기 세포(CAR-EC) 스위치로서,
    여기서 상기 제1 펩타이드 항원은 상기 제1 표적화 모이어티에 접합되거나, 또는 융합되는, 제1 CAR-EC 스위치, 및
    b. 상기 제1 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치의 제1 펩타이드 항원에 결합하는 항-GCN4 키메라 항원 수용체를 포함하는 제1 키메라 항원 수용체-효과기 세포를 포함하되,
    상기 효과기 세포는 T 세포인, CAR-EC 플랫폼.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제1 표적화 모이어티는 항-EGFR 항체, 항-Her2 항체, 항-EGFRvIII 항체, 항-CD33 항체, 항-CLL-1 항체, 항-CEA 항체, 항-CD19 항체, 항-CD22 항체, 항-BCMA 항체, 항-CS1 항체, 및 이들의 항원 결합 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 표적화 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는, CAR-EC 플랫폼.
  16. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제2 CAR-EC 스위치를 추가로 포함하되,
    각각의 제2 CAR-EC 스위치는,
    a. 효과기 세포 상에서 키메라 항원 수용체와 결합하는 펩타이드 항원; 및
    b. 표적 세포 상에서 표적 항원 분자와 결합하는 제2 표적화 모이어티를 포함하고;
    여기서 상기 제2 표적화 모이어티는 항체, 또는 항체의 항원 결합 단편을 포함하며;
    각각의 제2 CAR-EC 스위치의 상기 제2 표적화 모이어티는 상기 제1 CAR-EC 스위치에 포함된 상기 제1 표적화 모이어티와 다르고;
    상기 제2 CAR-EC 스위치에 포함된 상기 펩타이드 항원은,
    (i) 상기 제1 CAR-EC 스위치에 포함된 상기 제1 펩타이드 항원과 동일하거나,
    (ii) 상기 제1 CAR-EC 스위치에 포함된 상기 제1 펩타이드 항원과 상이한 제2 펩타이드 항원이고;
    단, 상기 제2 CAR-EC 스위치가 제2 펩타이드 항원을 포함하면, 상기 플랫폼은, 상기 제2 CAR-EC 스위치의 상기 제2 펩타이드 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체를 포함하는 T 세포인, 제2 키메라 항원 수용체-효과기 세포를 추가로 포함하는, CAR-EC 플랫폼.
  17. 제16항에 있어서,
    (i) 상기 제1 표적화 모이어티는 항-CD20 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고, 그리고 상기 제2 표적화 모이어티는 항-CD19 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하거나; 또는
    (ii) 상기 제1 표적화 모이어티는 항-CD19 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고, 그리고 상기 제2 표적화 모이어티는 항-CD20 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, CAR-EC 플랫폼.
  18. 제16항에 있어서, 상기 제2 CAR-EC 스위치는 상기 제1 CAR-EC 스위치 다음에 상기 피검체에게 투여되는, CAR-EC 플랫폼.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제2 CAR-EC 스위치는, 피검체가 상기 제1 표적화 모이어티가 결합하는 상기 세포 표면 분자의 변형된 발현을 갖는 것으로 진단된 후, 상기 피검체에 투여되는, CAR-EC 플랫폼.
  20. 제19항에 있어서, (i) 상기 제1 표적화 모이어티는 항-CD20 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고, 그리고 상기 제2 표적화 모이어티는 항-CD19 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하거나;
    (ii) 상기 제1 표적화 모이어티는 항-CD19 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고, 그리고 상기 제2 표적화 모이어티는 항-CD20 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, CAR-EC 플랫폼.
  21. a. i. 효과기 세포 상에서 항-GCN4 키메라 항원 수용체에 결합하고, 또 이를 활성화시키는 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드를 포함하는 펩타이드 항원이되, 상기 GCN4 펩타이드는 적어도 12개 아미노산인 서열번호 2의 일부를 포함하는, 펩타이드 항원; 및
    ii. 표적 세포 상에서 세포 표면 분자와 결합하는 표적화 모이어티를 포함하는, 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치, 및
    b. 상기 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치의 상기 펩타이드 항원에 결합하는 항-GCN4 키메라 항원 수용체를 포함하는 키메라 항원 수용체-효과기 세포를 포함하는, 키트.
  22. 제21항에 있어서, 효과기 세포 상에서 상기 키메라 항원 수용체에 대한 상기 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치의 결합은 상기 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치에 결합된 상기 표적 세포에도 세포독성인 면역 반응을 유도하는, 키트.
  23. 제21항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 표적화 펩타이드를 포함하는, 키트.
  24. 제21항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 표적화 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는, 키트.
  25. 제24항에 있어서, 상기 표적화 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편은 면역글로불린, Fc 삭제 면역글로불린, Fab, 및 이들의 항원 결합 단편으로 이루어진 군에서 선택되는, 키트.
  26. 제24항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 항-EGFR 항체, 항-Her2 항체, 항-EGFRvIII 항체, 항-CD33 항체, 항-CLL-1 항체, 항-CEA 항체, 항-CD19 항체, 항-CD22 항체, 항-BCMA 항체, 항-CS1 항체, 및 이들의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
  27. 제24항에 있어서, 상기 표적화 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편은 경쇄 및 중쇄 쌍을 포함하되, 여기서 상기 경쇄 및 중쇄는 서열번호 8 및 9; 서열번호 8 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 및 서열번호 19 및 20으로 이루어진 군에서 선택된 핵산 서열 쌍을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는, 키트.
  28. 제24항에 있어서, 상기 표적화 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편은 경쇄 및 중쇄 쌍을 포함하되, 여기서 상기 경쇄 및 중쇄는 서열번호 21 및 22; 서열번호 23 및 24; 서열번호 25 및 26; 서열번호 27 및 28; 서열번호 27 및 29로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 키트.
  29. 제24항에 있어서, 상기 표적화 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편은 경쇄 및 중쇄 쌍을 포함하되, 여기서 상기 경쇄 및 중쇄는 서열번호 30 및 29; 서열번호 36 및 29; 서열번호 31 및 28; 서열번호 27 및 32; 서열번호 27 및 33; 서열번호 27 및 34; 및 서열번호 27 및 35로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 키트.
  30. 제24항에 있어서, 상기 펩타이드 항원은 상기 표적화 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편의 말단에 융합되는, 키트.
  31. 제24항에 있어서, 상기 펩타이드 항원은 경쇄의 N 말단, 경쇄의 C 말단, 중쇄의 N 말단, Fab 중쇄의 C 말단, 및 중쇄 불변 영역의 C 말단으로 이루어진 군으로부터 선택된, 상기 표적화 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편의 영역에 융합되는, 키트.
  32. 제21항에 있어서, 상기 펩타이드 항원 및 상기 표적화 모이어티를 연결하는 링커를 추가로 포함하는, 키트.
  33. 제32항에 있어서, 상기 링커가 1 내지 20개의 아미노산을 포함하는, 키트.
  34. 제32항에 있어서, 상기 링커가 서열번호 38 내지 42로부터 선택된 서열을 포함하는, 키트.
  35. 제21항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 항-Her2 항체, 항-BCMA 항체, 항-CD19 항체, 항-CEA 항체, 및 이들의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
  36. 제21항에 있어서, 상기 표적 세포가 암 세포인, 키트.
  37. 제21항에 있어서, 상기 세포 표면 분자가 종양 관련 항원인, 키트.
  38. 제21항에 있어서, 상기 세포 표면 분자가 분화 단백질의 클러스터, 수용체, 내재성 막단백질, 및 당단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
  39. 제24항에 있어서, 상기 표적화 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편은 경쇄 및 중쇄 쌍을 포함하되, 여기서 상기 경쇄 및 중쇄는 서열번호 8 및 9; 서열번호 8 및 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열 쌍을 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화되는, 키트.
  40. 제24항에 있어서, 상기 표적화 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편은 경쇄 및 중쇄 쌍을 포함하되, 여기서 상기 경쇄 및 중쇄는 서열번호 27 및 28; 및 서열번호 27 및 29로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 키트.
  41. 제21항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체-효과기 세포 스위치는 경쇄 및 중쇄 쌍을 포함하되, 여기서 상기 경쇄 및 중쇄는 서열번호 36 및 29의 아미노산 서열을 포함하는, 키트.
  42. 제21항에 있어서, 상기 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드는 서열번호 3과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는, 키트.
  43. 제21항에 있어서, 상기 효모 전사 인자 GCN4 펩타이드는 효과기 세포 상에서 상기 항-GCN4 키메라 항원 수용체에 결합하고, 또 이를 활성화시키며, 상기 GCN4 펩타이드는 (i) 적어도 12개의 아미노산이고, (ii) 서열번호 3과 적어도 85% 동일하며; 그리고 (iii) 이합체화하지 않은, 서열번호 2의 일부를 포함하는, 키트.
  44. 제43항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 표적화 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 포함하는, 키트.
  45. 제44항에 있어서, 상기 표적화 모이어티는 항-EGFR 항체, 항-Her2 항체, 항-EGFRvIII 항체, 항-CD33 항체, 항-CLL-1 항체, 항-CEA 항체, 항-CD19 항체, 항-CD22 항체, 항-BCMA 항체, 항-CS1 항체, 및 이들의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
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