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KR20080090412A - 생체내 세포 표면 엔지니어링 - Google Patents

생체내 세포 표면 엔지니어링 Download PDF

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KR20080090412A
KR20080090412A KR1020087016531A KR20087016531A KR20080090412A KR 20080090412 A KR20080090412 A KR 20080090412A KR 1020087016531 A KR1020087016531 A KR 1020087016531A KR 20087016531 A KR20087016531 A KR 20087016531A KR 20080090412 A KR20080090412 A KR 20080090412A
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KR
South Korea
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immune
binding pair
cells
stimulatory
tumor
Prior art date
Application number
KR1020087016531A
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Inventor
하발 셔반
쿠트루 지. 엘펙
에스마 에스. 욜쿠
Original Assignee
유니버시티 오브 루이빌 리서치 파운데이션, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 루이빌 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 filed Critical 유니버시티 오브 루이빌 리서치 파운데이션, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 종양 세포 표면과 같은 세포 표면을 하나 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드로 생체내에서 엔지니어링하는 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 방법, 조성물 및 엔지니어링된 세포는 예를 들면 세포에 대한 면역 반응을 자극하는데 유용하다. 엔지니어링된 세포 표면이 종양 세포 표면인 경우, 상기 방법, 조성물 및 엔지니어링된 세포는 암에 대한 환자의 면역 반응을 증대시키고 종양 크기를 줄이고 종양 성장을 억제하는데 유용하다.
종양, 세포 표면 엔지니어링, 면역 보조자극성 폴리펩티드

Description

생체내 세포 표면 엔지니어링 {IN VIVO CELL SURFACE ENGINEERING}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 다음 미국 가출원의 출원일의 이점을 청구한다: 60/748,177 (2005년 12월 8일자 출원); 60/771,179 (2006년 2월 6일자 출원); 60/799,643 (2006년 5월 12일자 출원); 및 60/863,173 (2006년 10월 27일자 출원). 상기 출원은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 일반적으로 세포에 대한 면역 반응을 자극하기 위해 세포 표면 상에 하나 이상의 외인성 면역자극 분자를 디스플레이함으로써 세포 표면을 생체내에서 엔지니어링하는 방법에 관한 것이다. 엔지니어링을 달성하기 위한 조성물 또한 제공된다.
면역 결핍을 특징으로 하거나 또는 보다 공격적인 면역 반응에 의해 치유가능한 질환 및 증상을 처치하기 위해 숙주의 면역 반응을 촉진하는 것에 관한 접근법이 광범위하게 개시되었다. 이러한 질환 또는 증상의 예로는 암이 있다. 종양은 암유발 바이러스로부터 유래된 단백질, 또는 돌연변이되었거나 또는 과발현/비정상 발현된 자가단백질인 종양 관련 항원을 발현시키기 때문에 면역계에 의해 표 적화된다. 암의 발병은 T 세포에 의해 매개되는 획득성 면역의 면역 감시 역할의 결핍으로부터 초래되는 것으로 생각된다.
수술, 화학요법 및 방사선요법을 이용하여 접근하는 암 치료법이 일반적으로 사용되나, 이러한 접근법은 종양 특이성이 부족하여 그에 반하는 부작용 및 만족스러운 수준보다 낮은 임상 반응을 초래하는 것으로 평가된다. 따라서, 정상적인 세포에 대해서는 유의한 유해 효과 없이 표적 암성 세포에 대한 반응을 특이적으로 지시함으로써 암에 대한 면역 반응을 촉진하는 방법이 전통적인 암 요법에 비해 우수한 이점을 제공할 것이다.
암으로부터의 항원을 포함하는 암 백신은 암의 재발을 예방할 수 있는 면역계의 장기 기억, 특이성, 안전성, 및 효능의 유망함 때문에 특히 관심을 끌었다. 그러나, 이러한 접근법은 암 세포가 특정한 항원을 더 이상 발현하지 않고/않거나 종양이 면역 반응을 억제하거나 관용될 수 있다면 약화될 수 있다.
해당 면역학적 분자를 발현하도록 자가 종양 세포를 유전자 조작하는 것을 기반으로 하는 백신은, 종양 세포가 임의의 종양 관련 항원을 잠재적으로 발현할 수 있고, 따라서 효과적인 요법을 위한 광범위한 면역 반응을 활성화할 수 있기 때문에 암을 위한 효과적인 치료 양식을 나타낸다. 예를 들면, CD80을 발현하는 유전자 변형된 종양 세포는 효과적인 치료 효능을 나타내는 활발한 항종양 면역 반응을 유도하는 것으로 보고되었다 (문헌 [Ramarathinam et al., 1994, J. Exp. Med., 179:1205-14]; 문헌 [Townsend ＆ Allison, Science, 259:368-70]; 및 문헌 [Lane, 1997, Ann. N.Y. Acad. Sci., 815:392-400]; 및 문헌 [Van Gool et al., 1996, Immunol. Rev., 153:47-83] 참조). 유전자 백신은 다양한 면역회피 메카니즘, 예컨대 항원의 대변이(shift)의 가능성이 낮고 종양 발달의 과정 중에 발생할 수 있는 면역우성 에피토프에 대한 관용성을 갖는 것으로 생각된다. 지금까지 제안된 자가 종양 세포-기반 백신은 일반적으로 종양의 외과적 절제, 해당 면역학적 분자를 발현하도록 하기 위한 종양의 생체외 유전자 조작, 및 조작된 세포의 백신접종에 의한 환자에게로의 재도입을 요한다. 백신을 제작하기 위해 상당한 종양 덩어리가 필요한 것, 일차(primary) 종양 세포의 유전자 조작과 관련된 어려움, 및 유전자 요법을 기반으로 하는 접근법을 위한 백신 제작에 매우 장기간의 시간 (수주일 내지 수개월)이 필요한 것과 같은 수많은 장애물이 이러한 접근법과 관련있다.
발명의 요약
본 발명은 일반적으로 종양 세포 표면과 같은 세포 표면의 생체내 엔지니어링 방법, 생체내 엔지니어링의 달성을 위한 조성물 및 엔지니어링된 세포 표면에 관한 것이다.
한 실시양태에 따라서, 본 발명은 면역 보조자극성 폴리펩티드를 디스플레이하기 위한 세포 표면의 엔지니어링 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포 표면을 (a) 결합쌍의 제1 구성원 및 세포의 표면에 결합하는 분자를 포함하는 이기능성 분자 및 (b) 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제1 면역 보조자극성 잔기와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법에 따라서, 면역 보조자극성 폴리펩티드가 결합쌍의 제1 구성원과 제2 구성원 사이의 결합을 통해 세포 표면 상에 디스플레이된다. 한 실시양태에 따라서, 상기 방법은 시험관내에서 달성된다. 또다른 실시양태에 따라서, 상기 방법은 생체내에서 달성된다.
한 실시양태에서, 세포 표면은 종양 세포 표면이다. 또다른 실시양태에서, 면역 보조자극성 폴리펩티드는 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, 및 APRIL로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, 결합쌍의 제1 구성원은 비오틴을 포함하고 결합쌍의 제2 구성원은 아비딘 또는 스트렙타비딘, 예컨대 코어 스트렙타비딘을 포함한다. 한 실시양태에서, 이기능성 분자는 술포-NHS-LC-비오틴을 포함한다.
또다른 실시양태에 따라서, 본 발명은 면역 보조자극기 및 결합쌍의 구성원, 예컨대 아비딘 또는 스트렙타비딘 (예를 들면 코어 스트렙타비딘)을 포함하는 키메라 단백질을 제공한다. 한 실시양태에서, 면역 보조자극성 폴리펩티드는 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, 및 APRIL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명은 또한 키메라 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또다른 실시양태에 따라서, 본 발명은 하나 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드를 디스플레이하기 위한 세포 표면의 엔지니어링 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 결합쌍의 제1 구성원 및 세포의 표면에 결합하는 분자를 포함하는 이기능성 분자; (b) 제1 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제1 면역 보조자극성 잔기; 및 임의로는 (c) 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결 합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제2 면역 보조자극성 잔기를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법에 따라서, 제1 및 임의적인 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드가 결합쌍의 제1 구성원과 제2 구성원 사이의 결합을 통해 세포 표면 상에 디스플레이된다.
한 실시양태에서, 세포 표면은 종양 세포 표면이다. 또다른 실시양태에서, 면역 보조자극성 폴리펩티드 중 하나 이상은 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, 및 APRIL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서, 제1 및 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드는 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, 결합쌍의 제1 구성원은 비오틴을 포함하고 결합쌍의 제2 구성원은 아비딘 또는 스트렙타비딘, 예컨대 코어 스트렙타비딘을 포함한다. 한 실시양태에서, 이기능성 분자는 술포-NHS-LC-비오틴을 포함한다.
한 실시양태에서, 결합쌍의 제1 구성원은 종양내 주입을 통해 투여된다. 또다른 실시양태에서, 제1 및 제2 면역 보조자극성 잔기 중 하나 이상은 종양내 주입을 통해, 또는 결합쌍의 제1 구성원과 동일한 또는 상이한 경로에 의해 투여된다.
또다른 실시양태에서 투여된 제1 또는 제2 면역 보조자극성 잔기에 대해 초기에 양성인 세포의 약 5％ 이상은 주입한지 약 2일 후에도 양성으로 존재한다.
본 발명의 또다른 측면은 제1 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 구성원을 포함하는 제1 융합 단백질, 및 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 동일한 구성원을 포함하는 제2 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 면역 보조자극성 폴리펩티드 중 하나 이상은 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4- 1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, 및 APRIL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서, 제1 및 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드는 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또다른 측면은 제1 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 구성원을 포함하는 제1 융합 단백질을 포함하는 제1 조성물, 및 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 동일한 구성원을 포함하는 제2 융합 단백질을 포함하는 제2 조성물을 포함하는 조합물을 제공한다. 한 실시양태에서, 면역 보조자극성 폴리펩티드 중 하나 이상은 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, 및 APRIL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서, 제1 및 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드는 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에 따라서, 본 발명은 (a) 결합쌍의 제1 구성원 및 종양의 종양 세포의 표면에 결합하는 분자를 포함하는 이기능성 분자; (b) 제1 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제1 면역 보조자극성 잔기; 및 임의로는 (c) 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제2 면역 보조자극성 잔기를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양의 크기를 줄이거나 또는 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 실시양태에 따라서, 제1 및 임의적인 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드가 결합쌍의 제1 구성원과 제2 구성원 사이의 결합을 통해 종양 세포 표면 상에 디스플레이된다.
한 실시양태에서, 면역 보조자극성 폴리펩티드 중 하나 이상은 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, 및 APRIL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서, 제1 및 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드는 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에 따라서, 결합쌍의 제1 구성원은 비오틴을 포함하고 결합쌍의 제2 구성원은 아비딘 또는 스트렙타비딘, 예컨대 코어 스트렙타비딘을 포함한다. 한 실시양태에서, 이기능성 분자는 술포-NHS-LC-비오틴을 포함한다.
도 1A 및 1B는 코어 스트렙타비딘 및 뮤린 LIGHT 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질의 핵산 서열 (서열 1) 및 코딩된 아미노산 서열 (서열 2)을 나타낸다. 코어 스트렙타비딘 서열은 밑줄로 표시하였다.
도 2A 및 2B는 인간 CD80의 세포외 도메인 및 코어 스트렙타비딘을 포함하는 융합 단백질의 핵산 서열 (서열 3) 및 코딩된 아미노산 서열 (서열 4)을 나타낸다. 코어 스트렙타비딘 서열은 밑줄로 표시하였다.
도 3A 및 3B는 뮤린 4-1BBL의 세포외 도메인 및 코어 스트렙타비딘을 포함하는 융합 단백질의 핵산 서열 (서열 5) 및 코딩된 아미노산 서열 (서열 6)을 나타낸다. 코어 스트렙타비딘 서열은 밑줄로 표시하였다.
도 4는 코어 스트렙타비딘 및 인간 4-1BBL의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질의 아미노산 서열 (서열 7)을 나타낸다. 코어 스트렙타비딘 서열은 밑줄로 표시하였다.
도 5A 및 5B는 코어 스트렙타비딘 및 인간 B7.2의 세포외 도메인을 포함하는 융합 단백질의 핵산 서열 (서열 8) 및 코딩된 아미노산 서열 (서열 9)을 나타낸다.
도 6은 유세포 측정법으로 측정한, 생체내 세포-표면 비오틴의 동역학을 나타낸다.
도 7A-7C는 유세포 측정법으로 측정한, 시험관내 배양된 비장림프구 (도 7A-7B) 및 내피 세포 (도 7C) 상의 세포-표면 비오틴의 지속성을 나타낸다.
도 8은 엔지니어링된 세포에 의해 디스플레이된 2개의 면역 보조자극성 폴리펩티드 (4-1BBL ＆ CD80) 각각의 수준을 보여주는 엔지니어링된 LLC 세포의 유세포 측정 분석을 나타낸다.
도 9는 엔지니어링된 세포의 정맥내 투여 후의, 면역 보조자극성 폴리펩티드 (CD80)를 디스플레이하도록 엔지니어링된 림프절 세포 및 비장 세포의 유세포 측정 분석을 나타낸다.
도 10은 엔지니어링된 A20 B 림프종 세포의 표면 상에 디스플레이된 면역 보조자극성 폴리펩티드 (CD80)의 유세포 측정법에 의한 정량화를 나타낸다.
도 11은 CD80을 디스플레이하도록 엔지니어링된 종양 세포에 의해 유도된 증식 반응을 나타낸다.
도 12는 면역 보조자극성 폴리펩티드의 디스플레이를 측정하는 종양 세포의 유세포 측정법을 나타낸다. 종양 세포는 EZ-링크(Link) 술포-NHS-LC-비오틴이 종양에 직접 투여된 후에 CD80-CSA가 종양내 투여된 동물로부터 채취하였다.
도 13은 서로 다른 농도의 EZ-링크 술포-NHS-LC-비오틴으로 비오틴화하고 1, 3, 5 및 7일 후의 종양 세포 상의 비오틴의 디스플레이를 나타낸다.
도 14는 엔지니어링된 A20 B 림프종 세포의 표면 상의 4-1BBL 및 CD80의 공동-디스플레이의 유세포 측정법에 의한 정량화를 나타낸다.
도 15는 4-1BBL이 부착된 A20 세포에 대한 T 세포 증식의 유세포 측정법을 나타낸다.
도 16은 CD80-CSA가 비오틴화 후 상이한 시점에 종양내 투여될 경우 면역 보조자극성 폴리펩티드의 디스플레이를 측정하는 종양 세포의 유세포 측정법을 나타낸다.
본 발명은 종양 세포 표면과 같은 세포 표면을 하나 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드로 생체내에서 엔지니어링하는 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 방법, 조성물 및 엔지니어링된 세포는 예를 들어 세포에 대한 면역 반응을 자극하는데 유용하다. 엔지니어링된 세포 표면이 종양 세포 표면일 경우, 상기 방법, 조성물 및 엔지니어링된 세포는 암에 대한 환자의 면역 반응을 자극하여 치료학적 이점을 제공하는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 종양 크기를 줄이는 방법 및 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 비롯한 암 면역요법을 위한 방법을 제공한다.
이론에 구애됨이 없이, 본원에 기재된 바와 같이 생체내에서 엔지니어링된 종양 세포는 증대된 APC 기능을 획득하는 것으로 생각된다. 이러한 접근법에 의해, 하나 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드를 디스플레이하도록 엔지니어링된 종양 세포에 의한 항원을 T 세포에 직접 제시함으로써 종양 미세환경 내에서의 T 세포 활성화, 분화 및 이펙터 기능의 획득을 유도할 것이고, 다른 접근법이 직면한 여러 한계점, 예컨대 클래스 I 경로를 통한 외인성 항원의 비효과적인 제시 및 항원 활성화된 T 세포의 종양 부위로의 트래피킹(trafficking)을 극복할 것이다.
2개 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드를 디스플레이하는 생체내 변형된 종양 세포의 사용은, 종양 관련 항원의 전체 어레이를 나이브(naive) 및 기억 T 세포에 제시하여 효과적인 요법을 위한 다양한 면역 반응을 활성화하는 (단일 종양 항원 백신과 비교하여) 추가의 이점을 갖는다. 이러한 다양한 활성화는 그러한 종양 백신이 면역우성 에피토프를 제시하는 단일 종양 항원 백신으로부터 초래될 수 있는 아네르기 또는 클론 결손에 의한 관용성을 극복하도록 한다.
하나 이상의, 또는 2개 이상이 조합된 면역 보조자극성 폴리펩티드, 예컨대 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, 및 APRIL 중 하나 이상, 또는 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L 중 2개 이상을 디스플레이하기 위한 생체내에서의 종양의 엔지니어링은 종양 세포 및 T 세포의 표면 상의 수용체-리간드 상호작용을 증대시킨다. 이러한 상호작용은 무한하게 지속될 필요는 없다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같이 달성된 종양 세포 표면 상의 면역 보조자극성 폴리펩티드의 일시적인 디스플레이가 종양 세포에 대한 환자의 면역 반응을 증대시키고 효과적인 면역요법을 제공할 것이라고 기대된다.
본 출원의 목적상, 하기 용어들은 하기 정의를 갖는다.
본원에서 사용되는 "하나" 또는 "한"은 하나만을 의미한다고 명확하게 언급하지 않는 한, 하나 이상을 의미한다.
본원에서 사용되는 "투여"는 물질을 환자에게 제공하는 모든 적합한 수단을 포함한다. 통상의 경로는 경구, 설하, 경점막, 경피, 직장, 질, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 경막내 경로, 카테터를 통한 경로, 이식물을 통한 경로 등을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 조성물은 종양 근처에서 또는 종양에 직접적으로, 예를 들면 종양으로의 직접 주입에 의해 또는, 예컨대 종양이 혈액 종양일 경우는, 혈액으로의 주입에 의해 투여된다.
본원에서 "항원"은 본원에서 제한 없이 사용된다. 항원은 단백질, 지질, 당, 핵산, 화학 잔기 및 면역 반응을 유도하는 다른 잔기를 포함한다. 항원은 예컨대 글리코실화 또는 메틸화에 의해 변형될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있는 단백질, 예를 들면 고리화되거나 또는 지질에 결합된 단백질을 포함한다. 감염성 제제 또는 질환과 관련된 항원은 감염성 제제의 일부인 항원, 예컨대 외피 단백질, 캡시드 단백질, 표면 단백질, 독소, 세포벽, 항원 지질 등을 포함한다. 다른 항원은 숙주의 존재하에서만 발현될 수 있다. 몇몇 실시양태에서 다른 적합한 항원은 감염 또는 질환의 표지로서 유도되었거나 변형되었거나 또는 과발현된 것들을 비롯한 숙주의 항원을 포함한다. 감염성 제제, 감염, 증상 또는 질환으로부터 유래되었거나 또는 이들과 관련된 모든 이러한 항원이 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 전장 단백질의 항원 부분을 포함하는 펩티드, 예컨대 면역원성 에피토프와 같이 면역 반응을 유도하는 단백질의 부분을 포함하는 펩티드 또한 본 발명에 따라 "항원"으로서 사용하기에 적합하다. 예를 들면, 적합한 항원은 면역 반응을 유도하는 합성 펩티드를 포함할 수 있다.
"결합쌍"은 그 쌍이 서로와 특이적으로 결합하는 성질을 갖도록, 예를 들어 이온 결합, 공유 결합, 소수 결합, 반데르발스(van der Waals) 결합 및 수소 결합을 비롯한 다양한 분자력을 통해 서로와 상호작용하는 2개의 분자를 지칭한다. 특이적 결합은 결합쌍 구성원이 또다른 분자와 결합하지 않는 조건하에서 서로와의 결합을 나타냄을 의미한다. 결합쌍의 예로는 비오틴-아비딘, 호르몬-수용체, 수용체-리간드, 효소-기질, IgG-단백질 A, 항원-항체 등이 있다.
"세포 표면"은 당업계에서의 통상적인 의미에 따라 사용되며, 따라서 단백질 및 다른 분자와 결합하기 쉬운 세포의 외면을 포함한다.
"엔지니어링된 세포 표면"은 면역 보조자극성 폴리펩티드와 같은 외인성 분자가 세포 표면에 결합함으로써 변형된 세포 표면을 지칭한다. 외인성 분자와 세포 표면의 결합은 공유 결합, 수소 결합, 수용체-리간드 상호작용 및 항체-항원 상호작용과 같은 당업계에 공지된 임의의 수단을 통해 달성될 수 있다.
"변형된 세포 표면"은 외인성 분자가 결합된 세포 표면을 의미한다.
본원에서 사용되는 "환자"는 말, 양, 염소, 소, 돼지, 새, 개, 고양이 및 영장류 종을 비롯한 임의의 척추 동물을 포함한다. 한 실시양태에서, 환자는 인간이다. 당업자라면, 한 종과 관련하여 논의된 특정한 면역 보조자극성 분자, 시그널링 분자, 세포 표지, 세포 유형, 감염성 제제 등이 다른 종에서 상응하는 유사체를 가질 수 있고, 이러한 유사체, 및 상응하는 종 및 관련 종에서의 그의 사용이 본 발명에 포함됨을 알 것이다.
본원에서 사용되는 "종양"은 고형 종양 및 비-고형 종양 (예컨대 백혈병); 및 전암성 병변 및 양성 종양으로부터 암성, 악성 및 전이성 종양으로의 종양 발달의 상이한 단계를 포함한다.
일반적으로 세포 표면은, (a) 결합쌍의 제1 구성원 및 이기능성 분자를 세포에 연결하는 잔기를 포함하는 이기능성 분자; (b) 제1 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제1 면역 보조자극성 잔기; 및 임의로는 (c) 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제2 면역 보조자극성 잔기와 세포 표면을 접촉시키거나, 또는 이들을 상기 세포를 함유하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 의해 하나 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드를 디스플레이하도록 시험관내 또는 생체내에서 엔지니어링된다. 제1 및 임의적인 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드는 결합쌍의 제1 구성원과 제2 구성원 사이의 결합을 통해 세포 표면 상에 디스플레이된다. 본 발명의 한 특정 측면에서, 세포 표면은 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, 및 APRIL 중 하나 이상, 또는 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L 중 2개 이상을 디스플레이하도록 엔지니어링된다.
본 발명에 따라서, 세포 표면은 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 각각 포함하는 복수의 면역 보조자극성 잔기를 투여함으로써 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드의 조합으로 엔지니어링될 수 있다. 세포를 2개 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드의 조합으로 엔지니어링함으로써, 본 발명은 단일 면역 보조자극성 폴리펩티드가 디스플레이되는 것보다 우수한 치료학적 이점을 달성한다. 또한, 세포 표면은 세포 기능을 방해하지 않으면서 복수의 면역 보조자극성 폴리펩티드로 엔지니어링될 수 있는 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 세포가 하나의 면역 보조자극성 폴리펩티드, 예컨대 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, 및 APRIL로 엔지니어링되는 실시양태를 포함한다.
면역 보조자극성 폴리펩티드
세포 표면은 당업계에 공지된 다양한 면역 보조자극성 폴리펩티드 또는 그의 보조자극성 단편으로 생체내에서 엔지니어링될 수 있다. "면역 보조자극성 폴리펩티드"란 병원체 또는 종양에 대한 개체의 면역 반응을 증가시키는 폴리펩티드를 의미한다. 면역 보조자극성 폴리펩티드의 예는 LIGHT, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), B7-H2 ICOS, CD94 (KP43), CD40L (CD154), ICAM-1 (CD54), ICAM-2, ICAM-3, SLAM (CD150), HAS (CD24), 4-1BB (CDw137), 4-1BBL (CDw137L), OX40L, CD28, CD40 (BP50), CD25 (IL-2Rα), 림포톡신 (LTα 또는 LTβ), TNF, Fas-L, GITR (활성화-유도성 TNRF), GITR 리간드, CD11a (αL 인테그린), CD11b (αM 인테그린), L-셀렉틴 (CD62L), CD69 (매우 이른 활성화 항원), 및 CD70 (CD27L)을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다 (예를 들면, 문헌 [Watts ＆ DeBenedette, 1999, Curr. Opin. Immunol., 11:286-93] 참조). 본원에서 "전장"이라고 명시하지 않는다면, 본원에서 면역 보조자극성 폴리펩티드를 언급하는 것은 전장 폴리펩티드, 및 하기에 구체적으로 언급한 단편 및 부분들을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는 면역 보조자극성 기능을 나타내는 그의 단편 또는 일부를 포함한다. 따라서 예를 들어, 4-1BBL 폴리펩티드를 언급하는 것은 4-1BBL의 세포외 도메인과 같은 면역 보조자극성 기능을 나타내는 전장 4-1BBL의 단편 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드 또는 전장 4-1BBL 단백질을 내포한다.
대표적인 핵산 서열 및 코딩된 면역 보조자극성 폴리펩티드의 예는 진뱅크(GenBank) 수탁번호 AB029155 (뮤린 LIGHT); NM_172014 (인간 TNFSF14 mRNA 전사체 변이체 2); NM_003807 (인간 TNFSF14 mRNA 전사체 변이체 1); NM_005191 (인간 CD80 mRNA); NM_009855 (마우스 CD80 mRNA); NM_214087 미니돼지 (Sus scrofa) CD80 mRNA); NM_009404 (뮤린 Tnfsf9 mRNA); NM_003811 (인간 TNFSF9 mRNA); NM_181384 (집쥐 (Rattus norvegicus) Tnfsf9 mRNA); BAA88559 (뮤린 LIGHT 단백질); Q9QYH9 (뮤린 TNFSF14 막 결합 단백질 및 가용성 단백질); AAH18058 (인간 TNFSF14 단백질); NP_005182 (인간 CD80 단백질); NP_033985 (뮤린 CD80 단백질); NP_037058 (집쥐 CD80 단백질); NP_003802 (인간 TNFSF9 단백질); NP_033430 (마우스 TNFSF9 단백질); NP_852049 (집쥐 TNFSF9 단백질); NM_012967 (집쥐 ICAM-1 mRNA); X69711 (인간 ICAM-1 mRNA); X52264 (뮤린 ICAM-1 mRNA); X69819 (인간 ICAM-3 mRNA); AF296283 (뮤린 ICAM-4 mRNA); NM_021181 (인간 SLAMF7 mRNA); NM_033438 (인간 SLAMF9 mRNA); NM_029612 (뮤린 SLAMF9 mRNA); NM_144539 (뮤린 SLAMF7 mRNA); L13944 (뮤린 CD18 유전자); X53586 (인간 인테그린 α6 mRNA); X68742 (인간 인테그린 α mRNA); J04145 (인간 호중구 부착 수용체 알파-M 서브유닛 mRNA); AJ246000 (인간 백혈구 부착 수용체, L-셀렉틴 mRNA); AY367061 (인간 L-셀렉틴 mRNA, 부분 cds); Y13636 (뮤린 CD70 mRNA); NM_001252 (인간 TNFSF7 mRNA); BC000725 (인간 TNFSF7 mRNA (cDNA 클론 MGC:1597 IMAGE:3506629), 전체 cds); X69397 (인간 CD24 유전자 및 전체 CDS); NM_013230 (인간 CD24 mRNA); NM_012752 (집쥐 CD24 mRNA); Y00137 (뮤린 종양 괴사 인자-베타 (림포톡신) 유전자); X02911 (인간 종양 괴사 인자-베타 (림포톡신) 유전자); D00102 (인간 림포톡신 mRNA, 전체 CDS); X01393 (인간 림포톡신 mRNA); 및 A06316 (인간 림포톡신 mRNA)으로 표시된 것들을 포함한다. 동일한 또는 다른 면역 보조자극성 폴리펩티드를 코딩하는 다른 핵산 서열 및/또는 보조자극성 폴리펩티드의 아미노산 서열은, 예를 들면 공개적으로 이용가능한 진뱅크 데이터베이스 (예를 들면, 월드와이드웹 상의 ncbi.nlm.nih.gov에서 이용가능함)를 검색함으로써 찾을 수 있다.
보조자극성 폴리펩티드는 나이브 T 세포와 항원 제시 세포 간의 자연적인 상호작용에 관여하며, 이는 그들 상호간의 활성화를 초래하고 다양한 세포 표면 리간드 및 수용체, 및 면역 반응의 개시, 유지 및 장기 기억에 기여하는 가용성 단백질의 발현을 자극한다. 나이브 T 세포의 초기 활성화를 위해서는 3개 이상의 시그널이 필요하다. 시그널 1은 T 세포 수용체 (TCR)와, 수지상 세포 (DC)와 같은 전문적인 APC의 표면 상의 주 조직적합 복합체 (MHC) 분자에 의해 제시된 명목상의 펩티드 간의 상호작용에 의해 발생된다. 시그널 2는 다수의 상이한 분자에 의해 매개될 수 있고 지속적인 면역 반응에 있어 중요하다. 시그널 3은 활성화된 T 세포 및 APC에 의해 조종된 시토카인을 통해 변환되며 이펙터 면역 반응의 유지에 있어 중요하다.
종양은 면역 매개되는 파괴를 피하기 위한 다양한 대항-메카니즘(counter-mechanism)을 발달시킨다. 이러한 대항-메카니즘은 (i) 종양 세포 상의 MHC/종양 항원 2분자 복합체의 비효과적인 디스플레이, 시그널 1의 변환 결함 및/또는 NKG2 억제성 수용체를 발현하는 NK 세포를 억제하는 주 조직적합 복합체 유사체 (MIC)의 발현으로부터 기인할 수 있는 시그널 1의 부족; (ii) 종양 세포 상의 보조자극성 분자의 부족 또는 보조-억제성 분자의 종양 발현으로부터 기인할 수 있는 시그널 2의 부재; (iii) 예를 들어 항염증성 분자의 분비, 종양-반응성 T 세포의 아네르기 유도, 아폽토시스(apoptosis)를 통한 이펙터 T 세포의 물리적인 제거 또는 Treg의 유도를 통한 면역 반응의 종양-매개 억제; 및 (iv) 종양 기질(stroma)에 의한 면역의 조절을 포함한다. 수많은 이러한 대항-메카니즘이, 특히 큰 종양 부하량을 갖는 환자에서 동시에 작동한다.
CD80 (B7.1, CD28LG, LAB7이라고도 알려짐) 및 CD86 (B7.2, CD28LG2, LAB72라고도 알려짐)이 예시적인 보조자극성 폴리펩티드이며, 이들은 둘다 T 세포에 의해 발현되는 CD28/CTLA4 공동-수용체와 결합한다. CD80은 288개의 아미노산을 함유한다 (33048 Da) (문헌 [Freeman et al. J. Immunol. 143 (8), 2714-2722 (1989)] 참조). 인간 B7.1의 전체 아미노산 서열은 스위스-프롯(Swiss-Prot) 데이터베이스에서 수탁번호 P33681로 찾을 수 있다. B7.1은 분비 시그널을 형성하는 1-34 잔기, 잠재적인 세포외 도메인을 형성하는 35-242 잔기, 잠재적인 막관통 도메인을 형성하는 243-263 잔기, 및 잠재적인 세포질내 도메인을 형성하는 264-288 잔기를 갖는 제I형 당단백질이다. 따라서, 그의 분비 시그널 서열이 없는 성숙 B7.1 분자는 35-288 아미노산을 나타낸다. B7.1을 코딩하는 인간 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 수탁번호 NM_005191로 찾을 수 있다.
그의 동족 수용체 CD28과 결합할 수 있는 B7.1의 35-242 잔기 또는 그의 단편은 본 발명에 따라 사용되는 결합쌍 구성원과 연결되거나 또는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 예를 들면, 도 2A 및 2B는 인간 B7.1 (CD 80)의 세포외 도메인 및 코어 스트렙타비딘을 포함하는 키메라 단백질의 뉴클레오티드 (서열 3) 및 아미노산 서열 (서열 4)을 나타낸다.
B7.2는 329개의 아미노산을 함유한다 (37696 Da) (문헌 [Freeman et al. Science 262 (5135), 909-911 (1993)] 참조). 인간 B7.2의 전체 아미노산 서열은 스위스-프롯 데이터베이스에서 수탁번호 P42081로 찾을 수 있다. B7.2는 분비 시그널을 형성하는 1-23 잔기, 잠재적인 세포외 도메인을 형성하는 24-247 잔기, 잠재적인 막관통 도메인을 형성하는 248-268 잔기, 및 잠재적인 세포질내 도메인을 형성하는 269-329 잔기를 갖는 제I형 당단백질이다. 따라서, 그의 분비 시그널 서열이 없는 성숙 B7.2 분자는 24-329 아미노산을 나타낸다. B7.2를 코딩하는 인간 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 수탁번호 NM_175862로 찾을 수 있다.
그의 동족 수용체 CD28과 결합할 수 있는 B7.2의 24-247 잔기 또는 그의 단편은 본 발명에 따라 사용되는 결합쌍 구성원과 연결되거나 또는 융합체로서 발현될 수 있다. 예를 들면, 도 5A 및 5B는 인간 B7.2 (CD86)의 세포외 도메인 및 코어 스트렙타비딘을 포함하는 키메라 단백질의 뉴클레오티드 (서열 8) 및 아미노산 (서열 9) 서열을 나타낸다.
B7.2는 통상 휴면 B 세포 상에서는 발현되지 않고 말초 혈액 단핵백혈구 (PBC) 및 DC 상에서는 낮은 수준으로 발현된다. 그러나 그의 발현은 활성화 후에 B 세포 및 다른 APC, 예컨대 대식세포 및 DC 상에서 상향조절된다. 이와 반대로, CD86은 PBC 및 DC 상에서 구조적으로 발현되고 B 세포 상에서 보다 신속히 상향조절된다. APC 상의 MHC/펩티드 복합체와의 T 세포 수용체 (TCR) 상호작용은 T 세포 상에서 CD80/86과 CD28의 동시 체결을 가능하게 하고, 이는 지질 키나제 포스포티딜이노시톨 3-키나제의 티로신 인산화를 유도하고, 이어서 IL-2 유전자 발현, 세포 증식 및 이펙터 기능으로의 분화의 유도를 초래하는 일련의 세포내 사건을 개시한다. 시그널 2는 항아폽토시스 유전자, 예컨대 Bcl-xL의 조절을 통해 세포 사멸을 방지함으로써 생산적 면역 반응을 추가로 증가시킬 수 있다. 본원에서 기재된 바와 같이 CD80 및/또는 CD86을 디스플레이하도록 생체내에서 엔지니어링된 종양 세포는 효과적인 치료 효능을 갖는 활발한 항종양 면역 반응을 유도하는 능력을 갖는다.
4-1BB의 리간드 (4-1BB-L) 및 LIGHT는 본원에 기재된 바와 같은 생체내 세포 표면 엔지니어링에 유용한 바람직한 면역 보조자극성 폴리펩티드의 추가 예이다. 면역 활성화의 초기 단계 후에, "2차" 수용체/리간드 쌍, 예컨대 4-1BBL/4-1BB 및 LIGHT/HVEM은 T 세포 및 APC의 표면 상에서 상향조절된다. 이들 수용체/리간드 쌍은 초기 활성화 후속 사건의 유지, 면역 항상성 및 면역학적 기억의 발달에 관여한다.
4-1BBL (4-BB-L, 4-BB 리간드, TNFSF9, ILA 리간드라고도 알려짐)은 254개의 아미노산을 함유한다 (26624 Da) (문헌 [Alderson et al. Eur J Immunol. 1994 Sep;24(9):2219-27] 참조). 인간 4-1BBL의 전체 아미노산 서열은 스위스-프롯 데이터베이스에서 수탁번호 P41273으로 찾을 수 있다. 4-1BBL은 잠재적인 세포질내 도메인을 형성하는 1-28 잔기, 단일 예상 막관통 도메인을 형성하는 29-49 잔기, 잠재적인 세포외 도메인을 형성하는 50-254 잔기, 및 poly-Leu 스트레치를 나타내는 35-41 잔기를 갖는 제II형 당단백질이다. 4-1BBL을 코딩하는 인간 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 수탁번호 NM_003811로 찾을 수 있다.
4-1BBL은 활성화된 B 세포, 대식세포, 및 DC를 비롯한 활성화된 항원 제시 세포에 의해 활성화 2-3일 후에 발현된다. 4-1BBL은 종양에 대한 보다 강력한 면역 반응을 위해 CD8+ T 세포를 비롯한 T 세포 및 DC를 활성화할 수 있다. 4-1BBL에 대한 수용체인 4-1BB (CD137이라고도 알려짐)는 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 표면 상에서, 자연 살해 세포, 단핵백혈구, 및 휴면 DC 상에서 발현된다. 그의 동족 수용체 4-1BB와 결합할 수 있는 4-1BBL의 50-254 잔기 또는 그의 단편은 본 발명에 따라 사용되는 결합쌍 구성원과 연결되거나 또는 융합체로서 발현될 수 있다. 예를 들면, 도 3A 및 B는 CSA-뮤린 4-1BBL 융합 단백질의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (서열 5 및 6)을 나타낸다. 도 4는 인간 4-1BBL의 세포외 도메인 및 코어 스트렙타비딘을 포함하는 키메라 단백질의 아미노산 서열 (서열 7)을 나타낸다.
본 발명의 방법의 한 장점은 4-1BBL을 디스플레이하도록 생체내에서 엔지니어링된 종양 세포와 같은 세포가 T 세포 상에서 4-1BB의 동족 수용체를 활성화하여, 몇몇 중요한 면역-자극 효과를 초래할 수 있다는 것이다. 한 효과는 CD28과 독립적인 방식으로 시그널 2를 CD8+ T 세포로 변환시키는 것이고, 이는 T 세포가 시토카인을 생산하고, 증대되고, 이펙터 기능을 획득하도록 자극한다. 4-1BB/4-1BBL 상호작용의 또다른 효과는 단핵백혈구 및 DC의 활성화이며, 이는 시토카인의 합성 및 방출을 초래한다. 4-1BB 시그널링의 또다른 효과는 T 세포 생존의 촉진 및 활성화-유도된 세포 사멸 (AICD)의 저해에 의한 장기 면역학적 기억의 확립이다. 4-1BB/4-1BBL 상호작용의 또다른 효과는 종양 근절에 중요한 제1형 이펙터 T 세포에 대하여 작용하는, T 세포, DC 및 대식세포로부터의 IL-2, IFN-γ, 및 TNF-α와 같은 제1형 시토카인의 선택적 생산이다. 이러한 T 세포는 4-1BB 수용체를 구조적으로 발현하는 CD4+CD25+T 조절 (Treg) 세포를 포함한다. 본 발명의 방법의 또다른 장점은 4-1BBL을 디스플레이하도록 엔지니어링된 종양 세포와 같은 세포가 예를 들어 종양에 대한 보다 강력한 면역 반응을 위해 T 세포, 특히 CD8+T 세포 및 DC를 활성화할 수 있다는 것이다.
LIGHT 폴리펩티드 (TNFS14, HVEM-L, LTg, TR2라고도 알려짐)는 림포톡신과 동족인 TNF 상위패밀리 일원이다 (문헌 [Mauri et al. Immunity 8 (1), 21-30 (1998)] 참조). 인간 LIGHT의 전체 아미노산 서열은 스위스-프롯 데이터베이스에서 수탁번호 O43557로 찾을 수 있다. LIGHT는 240개의 아미노산을 함유하고 (26351 Da), 잠재적인 세포질내 도메인을 형성하는 1-37 잔기, 단일 예상 막관통 도메인을 형성하는 38-58 잔기, 및 잠재적인 세포외 도메인을 형성하는 59-240 잔기를 갖는 제II형 당단백질이다. 절단 부위는 82-83 잔기를 포함한다. LIGHT를 코딩하는 인간 뉴클레오티드 서열은 진뱅크 수탁번호 NM_172014로 찾을 수 있다.
그의 동족 수용체 HVEM, LTβR 또는 TR6과 결합할 수 있는 LIGHT의 59-240 잔기 또는 그의 단편은 본 발명에 따라 사용되는 결합쌍 구성원과 연결되거나 또는 융합체로서 발현될 수 있다. 예를 들면, 도 1A 및 1B는 코어 스트렙타비딘 및 뮤린 LIGHT의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 단백질의 뉴클레오티드 (서열 1) 및 아미노산 서열 (서열 2)을 나타낸다.
LIGHT는 활성화된 T 세포, NK 세포, 및 미성숙 수지상 세포 상에서 주로 발현되고, 면역 반응의 여러 측면을 조절하는 기능을 한다. LIGHT는 막-결합 단백질로서 합성되나, 그의 세포-표면 발현은 다수의 번역후 메카니즘에 의해 조절된다. LIGHT는 그의 발현 후 즉시 기질 메탈로프로테이나제에 의해 세포 표면으로부터 절단되고 가용성 분자 (이소형 1; 대체로 83-240 잔기에 해당함; 스위스-프롯 O43557-1)로서 축적된다. 세포 표면 세포질내 절편은 이소형 2 (스위스-프롯 O43557-2)를 나타낸다. 추가로, 다양한 세포 유형이 소낭에 LIGHT를 저장하고 다양한 생리학적 자극에 의한 활성화시 이들을 방출한다. LIGHT의 가용성 형태의 역할이 잘 특징화되지 않았지만, LIGHT는 HVEM 및 LTβR에 대해 경쟁함으로써 막-결합된 형태의 기능을 억제하는 음성 피드백 루프로서 기능할 수 있다.
LIGHT는 3종의 상이한 수용체와 상호작용한다: (1) T 세포 상의 헤르페스바이러스 세포내 침투 매개체 (HVEM), (2) 상피 및 기질 세포 상에서 주로 발현되는 LTβR, 및 (3) 다양한 세포 상의 가용성 유인 수용체 3. 이러한 상호작용은 LIGHT에 서로 다른 기능을 부여한다. 기질 세포 상의 LTβR과의 상호작용은 다양한 시토카인/케모카인의 생산, 림프절 (LN) 기관발생, 및 2차 림프구양 구조의 복구와 관련있다. 한편, 림프구 상의 LIGHT와 HVEM 수용체의 상호작용은 IFN-γ 및 GM-CSF가 우세한 시토카인의 활성화 및 생산을 초래한다. 이러한 정황상, LIGHT/HVEM 축은 종양 근절에서 중요한 역할을 하는 Th1형 반응의 활성화와 관련된 보조자극성 시그널을 전달하는 것으로 보인다.
LIGHT는 림프 기관발생 및 Th1형 반응의 발달에서 소정의 역할을 한다 (예를 들면, 문헌 [Yang et al., 2002, J. Biol. Regul. Homeost. Agents, 16:206-10]; 문헌 [Schneider et al., 2004, Immunol. Rev., 202:49-66] 참조).
LIGHT의 효과는 시험관내 및 생체내 모두 상이한 종양 모델에서 나타났다. LIGHT를 발현하는 헤르페스 심플렉스 바이러스 증폭산물에 의해 형질도입된 만성 림프구성 백혈병 세포는 혼합된 림프구 반응으로 T 세포 증식을 증대시키는 것으로 보고되었다. MDA-MB-231 인간 유방암 세포 상의 LIGHT의 과발현은 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다. LIGHT의 상이한 암 세포주로의 형질감염은 이들 세포에서 ICAM-1 발현을 자극한다. ICAM-1의 존재는 ICAM-1이 종양 세포에서 항종양 활성을 나타내는 효과적인 시그널링을 가능하게 하기 때문에 이로운 것으로 생각된다. T 세포 활성화 외에도, LIGHT의 또다른 중요한 기능은 기질 세포에서의 부착 분자 및 케모카인 발현의 유도를 통해 매개되는 2차 림프구양 구조의 발달에서 중요한 역할을 하는 LTβR을 통한 시그널의 변환 능력이다. 기질 세포 상의 LIGHT와 LTβR의 상호작용은 나이브 T 세포의 림프 조직으로의 귀소를 조절하는, CCL21의 발현을 조절한다.
종양 세포가 LIGHT를 디스플레이하도록 엔지니어링된 본 발명의 실시양태의 한 장점은 LIGHT가 림프 기관발생을 자극하고 Th1형 반응의 발달을 지지하는 능력이다. 또다른 장점은 LIGHT가 종양에 대한 면역 반응을 자극하고 이러한 반응을 더욱 증대시키기 위해 종양 기질을 활성화하는 능력이다.
기질은 종양 부위로의 림프구 침윤을 방지하기 위한 물리적 장벽으로서 기능한다. 기질은 또한 종양 미세환경 내에서의 림프구 활성화를 억제한다. 이는 T 세포 활성화를 위해 필요한 보조자극성 시그널의 부족 및/또는 기질 섬유아세포 및 종양 세포 둘다에 의해 합성 및 분비되는 TGF-β 및 IL-10과 같은 다양한 면역억제성 가용성 매개인자의 존재 때문일 수 있다. 기질은 종양 세포를 종양 부위로 한정시켜 이들의 국소 림프절로의 트래피킹을 저해함으로써 면역학적 무시를 촉진한다.
종양 기질 세포는 또한 본 발명에 따라 항종양 면역의 증대를 위해 이용될 수 있는 LTβR과 같은 다양한 면역학적 수용체를 발현한다.
OX40L은 수지상 세포 및 다른 APC에 의해 발현되고, 활성화된 T 세포 상에 존재하는 OX40과 결합한다. OX40L은 183개의 아미노산을 함유한다 (21950 Da) (문헌 [Miura et al. Mol. Cell. Biol. 11:1313-1325 (1991)] 참조). OX40L의 전체 아미노산 서열은 스위스-프롯 데이터베이스에서 수탁번호 P23510으로 찾을 수 있다. OX40L은 1-23 잔기에서 세포질내 도메인, 24-50 잔기에서 막관통 도메인, 및 51-183 잔기에서 세포외 도메인을 갖는 제II형 당단백질이다. OX40L의 뉴클레오티드 서열은 3510개의 bp를 갖고, 코딩 서열은 157-708 (진뱅크 수탁번호 NM_003326.2 참조)이다. 그의 동족 수용체 OX40과 결합할 수 있는 OX40L의 51-183 잔기 또는 그의 단편은 본 발명에 따라 사용되는 결합쌍 구성원과 연결되거나 또는 C-말단 융합체로서 발현될 수 있다.
CD40L은 활성화된 T 세포에 의해 발현되고, 또한 단백질분해 과정에 의해 막 형태로부터 유래되는 세포외 가용성 형태로서 존재한다. CD40L (TNFSF5라고도 알려짐)은 261개의 아미노산을 함유한다 (29350 Da) (문헌 [Villinger et al. Immunogenetics 53:315-328 (2001)] 참조). CD40L의 전체 아미노산 서열은 수탁번호 Q9BDN3으로 찾을 수 있다. CD40L은 1-22 잔기에서 세포질내 도메인, 23-43 잔기에서 막관통 도메인, 및 44-261 잔기에서 세포외 도메인을 갖는 제II형 당단백질이다. CD40L의 뉴클레오티드 서열은 1834개의 bp를 갖고, 코딩 서열은 73-858 (진뱅크 수탁번호 NM_000074 참조)이다. 그의 동족 수용체 CD40과 결합할 수 있는 CD40L의 44-261 잔기 또는 그의 단편은 본 발명에 따라 사용되는 결합쌍 구성원과 연결되거나 또는 N-말단 융합체로서 발현될 수 있다.
PD-L1은 활성화된 T 및 B 세포, 수지상 세포, 케라티노사이트 및 단핵백혈구 상에서 발현된다. PD-L1 (B7-H; B7H1; PDL1; PDCD1L1이라고도 알려짐)은 290개의 아미노산을 함유한다 (33275 Da) (문헌 [Dong et al. Nat. Med. 5: 1365-1369 (1999)] 참조). PD-L1의 전체 아미노산 서열은 스위스-프롯 데이터베이스에서 수탁번호 Q9NZQ7로 찾을 수 있다. PD-L1은 290개의 아미노산을 함유하고, 그 중 N 말단에서 18개의 아미노산이 시그널 서열을 나타낸다. 세포외 도메인은 19-238 아미노산에 위치하고, 막관통 도메인은 239-259 잔기에서 위치하고, 세포질내 도메인은 260-290 잔기에서 위치한다. PD-L1의 뉴클레오티드 서열 (1553 bp)은 공개 데이터베이스에서 이용가능하다 (진뱅크 수탁번호 NM_014143 참조) (코딩 서열은 53-925임). PD-L1의 이소형은 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 존재한다. 그의 동족 수용체 PDCD1과 결합할 수 있는 PD-L1의 세포외 도메인 또는 그의 단편은 본 발명에 따라 사용되는 결합쌍 구성원과 연결되거나 또는 N-말단 융합체로서 발현될 수 있다.
GL50 이소형 1은 광범위하게 발현되고 (뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 췌장, 태반, 골격근, 골수, 결장, 난소, 전립선, 고환, 림프절, 백혈구, 비장, 흉선 및 편도); GL50 이소형 2 (스위스프롯 O75144)는 림프절, 백혈구 및 비장, 및 활성화된 단핵백혈구 및 수지상 세포 상에서 발현된다. GL50 (B7-H2; B7H2; B7RP-1; B7RP1; ICOS-L; ICOSLG; KIAA0653; 및 LICOS라고도 알려짐)은 290개의 아미노산을 함유한다 (33275 Da) (문헌 [Wang et al. Blood 96:2808-2813 (2000)] 참조). GL50의 전체 아미노산 서열은 스위스-프롯 데이터베이스에서 수탁번호 O75144로 찾을 수 있다. GL50은 302개의 아미노산을 함유하고, 그 중 N 말단에서 18개의 아미노산이 시그널 서열을 나타낸다. 세포외 도메인은 19-256 아미노산에서 위치하고, 막관통 도메인은 257-277 잔기에서 위치하고, 세포질내 도메인은 278-302 잔기에서 위치한다. GL50의 뉴클레오티드 서열 (3239 bp)은 공개 데이터베이스에서 이용가능하다 (진뱅크 수탁번호 NM_015259 참조) (코딩 영역은 135-1043을 나타냄). GL50의 이소형은 선택적 스플라이싱에 의해 존재한다. 그의 동족 수용체 ICOS와 결합할 수 있는 GL50의 세포외 도메인 또는 그의 단편은 본 발명에 따라 사용되는 결합쌍 구성원과 연결되거나 또는 N-말단 융합체로서 발현될 수 있다.
다른 면역 보조자극성 폴리펩티드가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들면 US 2003/0219419 (그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 본 발명에서 유용한 IL-2-CSA 융합 단백질 및 CSA-CD40L 융합 단백질이 개시되어 있다.
표 1에 다양한 보조자극성 분자 및 그의 수용체가 요약되어 있다.
구조물 명칭 및 오리엔테이션 수용체 수용체 발현
CD80-CSA CD28 거의 모든 인간 CD4 T 세포 및 CD8 T 세포의 대략 50％ 상에서 구조성
GL50-CSA ICOS 휴면 T 세포 상에서 검출가능함, 활성화된 CD4+T 및 CD8+T 세포 및 NK 세포 상에서 상향조절됨
PD-L1-CSA PD-1 CD4+ 및 CD8+T 세포, B 세포 및 단핵백혈구 상에서 유도성, NK-T 세포 상에서 낮은 수준
CSA-CD40L CD40 B 세포, 단핵백혈구, DC, 내피 및 상피 세포 상에서 구조성
CSA-4-1BBL CD137 활성화된 T 세포 (피크 48시간, 감소 96시간) 및 시토카인-처리된 NK 세포 상에서 유도성, DC (낮은 수준), 인간 단핵백혈구, 소낭 DC, CD4+ CD25+ 조절 T 세포의 부분집합군 상에서 구조성
CSA-OX40L OX40 활성화된 CD4 (선택적임) 및 CD8 (강력한 항원 반응) T 세포 (피크 48시간, 감소 96시간) 상에서 유도성
CSA-LIGHT HVEM 휴면 T 세포, 단핵백혈구 및 미성숙 DC 상에서 구조성, T 세포 활성화 및 DC 성숙시 하향조절됨
요약하면, 본 발명에 따라 유용한 면역 보조자극성 폴리펩티드의 예는 하기를 포함한다.
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Figure 112008048951616-PCT00002
Figure 112008048951616-PCT00003
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Figure 112008048951616-PCT00005
Figure 112008048951616-PCT00006
면역 보조자극성 폴리펩티드의 디스플레이
하나 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드가 본원에 기재된 바와 같이 시험관내에서 또는 생체내에서 엔지니어링된 세포, 예컨대 종양 세포 상에 디스플레이될 수 있다. 폴리펩티드의 조합이 사용되는 경우에, 이용되는 특정한 조합은 상이한 면역 메카니즘이 작동하도록 선택될 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 특정한 조합의 예는 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L 중 2개 이상을 포함하는 조합을 포함한다.
본 발명의 한 특정 측면에서, 상기 조합은 4-1BBL 또는 LIGHT 중 하나 이상, 예컨대 4-1BBL과 LIGHT, 또한 4-1BBL, LIGHT 및 CD80을 포함한다. 이론에 구애됨이 없이, 보조자극성 분자의 이러한 특정한 조합을 디스플레이하게 되는 세포, 예컨대 종양 세포는 다음 효과 중 하나 이상을 가질 것이라고 생각된다: (i) 종양 세포 상에 디스플레이된 LIGHT는 종양에서의 기질 세포 상에서 LTβR과 체결되어 기질 세포의 활성화 및 다양한 림프구-특이적 케모카인의 분비를 초래할 것이다; (ii) 방출된 림포카인은 나이브 T 세포 및 DC를 종양 부위로 보충할 것이다; (iii) 보충된 T 세포 및 DC는, 엔지니어링된 종양 세포 상의 LIGHT, CD80 및 4-1BBL과 T 세포 및 DC (4-1BB) 상에서 발현된 그들 각각의 수용체, HVEM (제2 LIGHT 수용체), CD28 및 4-1BB의 체결에 의해 종양 미세환경 내에서 활성화될 것이다. 이러한 효과 및 그 외의 다른 효과가 치료학적 의미가 있는 강력한 전신성 항종양 면역을 초래할 것이다.
한 특정 실시양태에 따라서, 종양 세포와 같은 세포는 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L 중 하나 이상으로, 예컨대 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L 중 2개 이상의 조합으로 엔지니어링된다. 한 특정한 실시양태에서, 종양 세포와 같은 세포는 LIGHT, CD80, 및 4-1BBL 각각으로 엔지니어링된다. 이러한 실시양태는 상기 논의된 모든 장점을 제공하며 면역 활성화를 표적으로 할 뿐만 아니라, 또한 면역 반응을 감작화하도록 종양 기질을 조절하는 우수한 접근법을 제공한다. 따라서, CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L 중 2개 이상의 조합으로 생체내에서 엔지니어링된 세포, 예컨대 종양 세포는 예를 들어 종양을, 존재하는 종양을 근절시키고 또한 재발에 대해 방어할 수 있는 효과적인 종양내 및 전신성 항종양 면역 반응의 발달을 위한 모의(pseudo) 2차 림프구양 구조로 전환시킬 가능성을 제공하는 것으로 생각된다.
결합쌍
결합쌍의 예로는 비오틴과 스트렙타비딘 (SA) 또는 아비딘이 있다. 비오틴에 대하여 실질적인 결합 활성, 예컨대 천연 SA 또는 아비딘 각각의 결합 친화력의 적어도 50％를 보유하는 SA 또는 아비딘 단편 또한 사용가능하다. 이러한 단편은 스트렙타비딘 잔기 13-138, 14-138, 13-139 및 14-139를 포함할 수 있는 전장 스트렙타비딘 폴리펩티드의 말단절단형(truncated)인 "코어 스트렙타비딘" ("CSA")을 포함한다 (예를 들면, 문헌 [Pahler et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:13933-37] 참조). 비오틴에 대하여 강력한 결합력을 보유하는 스트렙타비딘 및 아비딘의 다른 말단절단형 또한 사용가능하다 (예를 들면, 문헌 [Sano et al., J Biol Chem. 1995 Nov 24;270(47):28204-9] (코어 스트렙타비딘 변이체 16-133 및 14-138를 개시함) (미국 특허 제6,022,951호) 참조). 실질적인 비오틴 결합 활성 또는 증가된 비오틴 결합 활성을 보유하는 스트렙타비딘의 돌연변이체 및 스트렙타비딘의 코어 형태 또한 사용가능하다 (문헌 [Chilcoti et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Feb 28;92(5): 1754-8]; 문헌 [Reznik et al., Nat Biotechnol. 1996 Aug;14(8):1007-11] 참조). 예를 들어, 잠재적인 T 세포 에피토프 또는 림프구 에피토프를 제거하기 위한 부위-지정 돌연변이유발에 의해 돌연변이된 돌연변이체와 같이 감소된 면역원성을 갖는 돌연변이체가 사용될 수 있다 (문헌 [Meyer et al., Protein Sci. 2001 10:491-503] 참조). 마찬가지로, 실질적인 비오틴 결합 활성 또는 증가된 비오틴 결합 활성을 보유하는 아비딘의 돌연변이체 및 아비딘의 코어 형태 또한 사용가능하다 (문헌 [Hiller et al., J. Biochem. (1991) 278:573-85]; 문헌 [Livnah et al. Proc Natl Acad Sci USA (0: 5076-80 (1993)] 참조). 편의상, 본 명세서에서, 본원에서 사용되는 용어 "아비딘" 및 "스트렙타비딘"은 이러한 결합쌍 구성원의 비오틴-결합 단편, 돌연변이체 및 코어 형태를 포함하고자 한다. 아비딘 및 스트렙타비딘은 시판 공급원으로부터 입수가능하다. 또한, 스트렙타비딘 및 아비딘을 코딩하는 핵산 서열, 및 스트렙타비딘 및 아비딘 아미노산 서열은 예를 들면 진뱅크 수탁번호 X65082; X03591; NM_205320; X05343; Z21611; 및 Z21554로 찾을 수 있다.
본원에서 사용되는 "비오틴"은 세포 표면 (종양 세포 표면을 포함함)과 같은 표면과 결합할 수 있는 비오틴-함유 잔기, 예컨대 NHS-비오틴 및 EZ-링크(상표명) 술포-NHS-LC-비오틴 (피어스(Pierce)사)을 포함한다. 비오틴의 이러한 단백질 반응성 형태는 시판되고 있다.
비오틴과 그의 결합 파트너 (아비딘 또는 스트렙타비딘) 사이의 상호작용은 본 발명의 정황상 수많은 장점을 제공한다. 예를 들면, 비오틴은 스트렙타비딘 (1013 M-1)과 아비딘 (1015 M-1) 둘 모두에 대하여 매우 높은 친화력을 갖는다. 이러한 실시양태는 또한, 스트렙타비딘 또는 아비딘을 포함하는 면역 보조자극성 잔기가 비오틴화된 세포, 조직 또는 기관의 표면에 선택적으로 국소화될 수 있기 때문에 유리하다. 목적하는 수준에서의 표적화는 면역 보조자극성 폴리펩티드 또는 표적화된 세포의 관련 기능의 손상 없이 신속하고 (약 2시간 미만), 효과적이며 (표적화된 세포의 약 100％), 지속적인 (t1 /2 = 수일 내지 수주일) 방식으로 달성될 수 있다. 추가로, 스트렙타비딘과 아비딘은 둘다 각각 4개의 비오틴 분자와 결합하는 4량체 폴리펩티드이다. 따라서 스트렙타비딘 또는 아비딘을 포함하는 면역 보조자극성 잔기는 4량체 이상의 구조체를 형성하는 경향이 있다. 그 결과, 이들은 보다 효과적인 시그널 변환을 위해, 예를 들어 수용체의 집합을 통해 그의 상응하는 면역 세포 수용체와 가교될 수 있다. 또한, 세포 표면은 세포 기능을 방해하지 않으면서 복수의 면역 보조자극성 폴리펩티드로 엔지니어링될 수 있다.
당업자라면 다른 메카니즘 (예를 들어 다른 연결 잔기 또는 화학적 또는 유전학적 가교를 사용하는 다른 접합 방법)이, 그 또한 유리한 성질을 나타낼 면역 보조자극성 분자의 2량체, 3량체, 4량체 및 고차원 다량체를 포함하는 접합체와 같은 면역 보조자극성 분자의 고차원 구조체를 제공하는데 사용될 수 있음을 알 것이다. 이러한 접합체는 본 발명의 범주 내에 포함된다.
면역 보조자극성 잔기
면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 면역 보조자극성 잔기는 당업계에 널리 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드와 제2 구성원은 직접적으로 또는 연결기(linker)를 통해 서로와 접합되거나 또는 서로와 공유 결합될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에 따라서, 면역 보조자극성 잔기는 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 융합 단백질이다. 융합 단백질은 당업계에 공지된 수많은 상이한 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질의 구성요소 폴리펩티드 중 하나 이상이 화학적으로 합성되거나 또는 널리 공지된 재조합 핵산 기술을 사용하여 생산될 수 있다. (본원에서 사용되는 "핵산"은 RNA 또는 DNA를 지칭한다.) 본 발명에서 유용한 핵산 서열은 예를 들면 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 수득할 수 있다. 다양한 PCR 방법이 예를 들어 문헌 [PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach 7 Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995]에 개시되어 있다.
한 실시양태에 따라서, 면역 보조자극성 폴리펩티드는 그의 C-말단을 통해 결합쌍의 제2 구성원의 N-말단에 결합한다. 예를 들면, 본 발명은 CD80-CSA 융합 단백질을 포함하며, 여기서 CD80 잔기는 그의 C 말단을 통해 CSA의 N-말단에 결합한다. 또다른 실시양태에 따라서, 면역 보조자극성 폴리펩티드는 그의 N-말단을 통해 결합쌍의 제2 구성원의 C-말단에 결합한다. 예를 들면, 본 발명은 CSA-4-1BBL, CSA-LIGHT, CSA-CD40L, 및 CSA-OX40L 융합 단백질을 포함하며, 여기서 CSA 잔기는 그의 C-말단을 통해 면역 보조자극성 잔기의 N-말단에 결합한다. 면역 보조자극성 폴리펩티드는 결합쌍의 제2 구성원에 직접 결합하거나 또는 하나 이상의 연결 잔기, 예컨대 하나 이상의 연결 폴리펩티드를 통해 결합할 수 있다.
면역 보조자극성 폴리펩티드의 단편 및/또는 결합쌍 구성원의 단편을 포함하는 핵산 및 폴리펩티드는, 상기 단편이 그의 전장 폴리펩티드의 활성을 보유하는 한 본 발명에서 유용하다. 따라서, 면역 보조자극성 단편은 그의 면역 보조자극 활성을 보유 (예를 들면, 그의 수용체 또는 리간드와의 결합 능력을 보유)하여야 하고, 결합 구성원 단편은 그의 결합 파트너와 결합하는 능력을 보유하여야 한다. 단편은 하기 실시예에 예시된 것들을 포함하는 당업계에서 일상적인 방법에 의해 보유 활성에 따라 스크리닝될 수 있다. 면역 보조자극성 폴리펩티드의 단편의 예가 상기에 나타나 있다.
면역 보조자극성 잔기는 연결기, 예컨대 제2 결합쌍 구성원과 면역 보조자극성 폴리펩티드 사이의 펩티드 연결기를 포함할 수 있다. 연결기 길이 및 조성은 잔기의 기능성 말단의 활성을 증대시키도록 선택될 수 있다. 연결기는 일반적으로 약 3 내지 약 15개의 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 약 5개 내지 약 10개의 아미노산 길이이지만, 보다 길거나 또는 짧은 연결기가 사용될 수 있거나 또는 연결기가 전혀 없을 수도 있다. 단쇄 항체의 중쇄 및 경쇄를 연결하는데 사용되는 것과 같은 유연한 연결기 (예를 들면, (Gly4Ser)3)가 이러한 측면에서 사용될 수 있다 (문헌 [Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883]; 미국 특허 제5,091,513호, 미국 특허 제5,132,405호, 미국 특허 제4,956,778호; 미국 특허 제5,258,498호, 및 미국 특허 제5,482,858호 참조). 다른 연결기는 FENDAQ APKS 또는 LQNDAQAPKS이다. 면역글로불린 Fc 영역의 하나 이상의 도메인 및 면역 글로불린 Fc 영역 (예를 들면 CH1, CH2 및/또는 CH3) 또한 연결기로서 사용가능하다.
변형, 변이 또는 돌연변이된 핵산 및 폴리펩티드 또한, 이들이 그의 관련 핵산 또는 폴리펩티드의 활성을 보유하는 한 본 발명에서 유용하다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기에 적합한 핵산 및 폴리펩티드 서열은 그의 관련 핵산 또는 폴리펩티드, 즉 공지된 면역 보조자극성 폴리펩티드 또는 결합쌍 구성원을 코딩하는 핵산에 대하여 약 80％ 이상의 서열 동일성 (80％ 이상의 서열 동일성을 포함함)을 가질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 핵산 서열 또는 폴리펩티드는 그의 관련 핵산 또는 폴리펩티드에 대하여 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 약 99％ 이상의 서열 동일성을 갖는다.
본 발명은, 동일한 아미노산을 코딩한다는 점에서 "침묵"인 염기 변화가 일어난 핵산 (즉, 다의성 핵산 서열)을 포함한다. 본 발명은 또한 보존적 아미노산 치환이 일어난 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 그러한 폴리펩티드를 포함한다. 보존적 아미노산 치환 (예를 들면, 한 소수성 잔기가 상이한 소수성 잔기로 치환된 것)은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들면 점 돌연변이 등에 의해 달성될 수 있다. 주어진 변형된 서열, 변이체 또는 돌연변이체의 적합성은 당업계에 공지된 수용체 결합 및/또는 생물학적 스크리닝 방법, 예컨대 단편과 관련하여 상기 논의된 방법을 사용하여 확인할 수 있다.
본원에서 사용되는 "서열 동일성 (％)"은 정렬된 핵산 또는 폴리펩티드 서열에서 일치하는 위치의 개수를 측정하여, 일치하는 위치의 개수를 각각 정렬된 뉴클레오티드 또는 아미노산의 총 개수로 나눈 다음 100을 곱하여 계산한다. 일치하는 위치는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 정렬된 서열 내 동일한 위치에서 나타나는 위치를 지칭한다. 정렬된 뉴클레오티드 또는 아미노산의 총 개수는 제2 서열을 정렬하는데 필요한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 최소 개수를 지칭하며, 해당 서열의 N-말단 또는 C-말단에서 융합될 수 있는 것들과 같은 유사하지 않은 서열 (즉, 면역 보조자극성 폴리펩티드 또는 결합쌍 구성원을 코딩하는 서열)을 갖는 정렬 (예를 들면 강제 정렬)은 포함하지 않는다. 정렬된 뉴클레오티드 또는 아미노산의 총 개수는 전체 코딩 서열에 대응하거나 또는 본원에서 정의한 전장 서열의 단편에 대응할 수 있다.
서열은 월드와이드웹 상의 ncbi.nlm.nih.gov에서 이용가능한 BLAST (basic local alignment search tool) 프로그램에 입력하여 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402]에 개시된 알고리즘을 사용하여 정렬할 수 있다. BLAST 검색 또는 정렬을 수행하여, Altschul 알고리즘을 사용하여 핵산 분자 ("질의 서열(query sequence)")와 임의의 다른 서열 또는 그의 일부 사이의 서열 동일성 (％)을 측정할 수 있다. BLASTN을 사용하여 핵산 서열을 정렬하고 그들 사이의 동일성을 비교할 수 있으며, 한편 BLASTP를 사용하여 아미노산 서열을 정렬하고 그들 사이의 동일성을 비교할 수 있다. 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열과 또다른 서열 사이의 동일성 (％)을 계산하기 위해 BLAST 프로그램을 이용할 때, 갭 감점(gap penalty)에 대한 디폴트를 포함하는 각각의 프로그램의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산은 서던 또는 노던 블롯 분석법 (즉, 혼성화), PCR, 또는 동소(in situ) 혼성화 분석법과 같은 방법으로 검출가능하다. 폴리펩티드는 통상적으로 형질감염된 세포주에서의 면역세포화학법에 의해 또는 나트륨 도데실 술페이트(SDS)-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후에 쿠마시 블루(Coomassie blue)-염색 또는 특정 폴리펩티드에 대하여 특이적 결합 친화력을 갖는 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날)를 사용하는 웨스턴 블롯 분석법에 의해 검출된다. 이들 방법의 대다수가 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]에 상세히 개시되어 있다.
면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 코딩하는 핵산 서열은 통상의 분자생물학 기술을 사용하여 구조물에서 서로와 작동가능하게 연결될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 2001, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press)] 또는 문헌 [Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 2002, 5th Ed., Current Protocols)] 참조). 이러한 방법에 사용하기에 적합한 구조물은 시판되고 있으며 당업계에서 일상적으로 사용되고 있다. 구조물은 발현을 위해 필요한 요소, 예컨대 프로모터 서열, 조절 요소, 예컨대 인핸서 서열, 및 핵산 서열의 발현을 조절하는 반응 요소 및/또는 유도성 요소를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "작동가능하게 연결된"이란 (i) 핵산 서열에 대한 프로모터 및/또는 다른 조절 요소(들)를 핵산의 발현을 지시하거나 또는 조절하도록 하는 방식으로 위치시키는 것; 및/또는 (ii) 면역 보조자극성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 결합쌍의 제2 구성원을 코딩하는 핵산을 코딩 서열이 "인 프레임(in frame)"에 있도록, 즉 구조물이 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 융합 단백질을 코딩하도록 위치시키는 것을 지칭한다.
구조물은 증식 또는 발현되어 당업계에 공지된 방법으로 숙주 세포에서 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "숙주" 또는 "숙주 세포"는 대장균(E. coli)과 같은 원핵생물 뿐만 아니라, 효모, 곤충, 식물 및 동물 세포와 같은 진핵생물을 포함하고자 한다. 동물 세포는 예를 들면 COS 세포 및 HeLa 세포를 포함한다. 숙주 세포는 당업자에게 통상적으로 공지된 기술, 예컨대 인산칼슘 또는 아세트산리튬 침강법, 전기천공법, 리포펙션(lipofection) 및 입자주입법(particle bombardment)을 사용하여 DNA 분자 (예를 들면, 구조물)로 형질전환 또는 형질감염될 수 있다. 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포는 상기 기재된 바와 같이 벡터를 증식시키거나, 핵산 (예를 들면, DNA 또는 RNA)을 생산하거나, 면역 보조자극성 폴리펩티드 또는 그의 단편을 발현시키거나, 융합 단백질을 발현시키는 것과 같은 목적을 위해 사용될 수 있다.
도 1A ＆ 1B, 2A ＆ 2B, 3A ＆ 3B, 및 5A ＆ 5B는 코어 스트렙타비딘 및 면역 보조자극성 폴리펩티드를 포함하는 면역 보조자극성 잔기를 코딩하는 대표 핵산 서열 (서열 1, 3, 5 및 8), 및 대응하는 코딩된 아미노산 서열 (서열 2, 4, 6 및 9)을 나타낸다.
생체내 세포 표면 엔지니어링
본 발명에 따라서, 세포는 면역 보조자극성 폴리펩티드를 디스플레이하도록 생체내에서 변형된다. 논의된 바와 같이, 이는 결합쌍의 제1 구성원 및 종양 세포와 같은 세포의 표면에 결합할 수 있는 분자를 포함하는 이기능성 분자, 및 하나 이상의 보조자극성 잔기 (각각 결합쌍의 제2 구성원 및 하나 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드를 포함함)를 개체에게 투여함으로써 달성될 수 있다. 이기능성 분자는, 이기능성 분자가 이기능성 분자의 세포 표면 결합 부분을 통해 세포 표면에 결합된 후에 결합쌍의 제1 구성원이 결합쌍의 제2 구성원에 대한 그의 친화력을 실질적으로 보유하도록 고안된다. 한 특정 실시양태에서, 이기능성 분자는 생체내에서 세포 표면 상의 단백질과 접합될 수 있는 비오틴 형태, 예컨대 NHS-비오틴이다. 제1 구성원을 포함하는 이기능성 분자가 세포 표면에 결합할 수 있는 분자로서 비오틴을 포함하는 경우, 이는 하기 예시된 방법 또는 WO 02/02751에 개시된 방법과 같은 그 외의 다른 방법으로 세포 표면에 국소화될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 결합쌍의 제1 구성원과 세포 표면과의 결합에 기여하는 이기능성 분자의 부분 사이에 위치하는 연결기 또는 다른 그러한 스페이서(spacer)가 있을 수 있다. 이러한 연결기의 길이 및 조성은 당업계에 널리 공지된 바와 같이 이기능성 분자의 양쪽 말단의 활성을 최대화하도록 선택될 수 있다.
이기능성 분자 (제1 결합쌍 구성원을 포함함)와 하나 이상의 보조자극성 잔기는 실질적으로 동시에 또는 상이한 시점에 투여될 수 있다. 제1 결합쌍 구성원은 통상적으로 하나 이상의 면역 보조자극성 잔기 전에 투여될 것이다. 예를 들면, 이러한 시간 간격은 1시간 내지 수시간, 1일 내지 수일, 1주일 이상으로 다를 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 면역 보조자극성 잔기는 이기능성 분자보다 적어도 16시간 후에, 예컨대 약 16시간 후에, 약 24시간 후에, 약 32시간 후에, 약 36시간 후에, 또는 약 48시간 후에 투여된다. 또다른 실시양태에서, 면역 보조자극성 잔기는 이기능성 분자보다 적어도 약 2시간 후에, 예를 들면 약 2시간 후에, 약 4시간 후에, 또는 약 8시간 후에 투여된다. 그러나, 실질적으로 동시에 상기 2개가 투여될 수 있거나 또는 제1 결합쌍 구성원이 하나 이상의 보조자극성 잔기가 투여된 후에 투여될 수 있다. 별법으로, 제1 결합쌍 구성원 및 면역 보조자극성 잔기는 단일 조성물로서 투여될 수 있다. 복수의 면역 보조자극성 잔기로 엔지니어링되는 경우, 이들 잔기는 단일 조성물로서 배합되거나 또는 실질적으로 동시에 또는 순차적으로 (상이한 시점에) 주어지는 별개의 조성물로서 투여될 수 있다.
결합쌍의 제1 구성원 및/또는 보조자극성 잔기는 환자에게 전신 투여에 의해 또는 국소 투여에 의해, 예컨대 정맥내, 복막, 또는 피하 주입에 의해 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물(들) 중 하나 이상은 종양 부위로의 직접 주입을 통해, 예컨대 종양내 주입에 의해 국소 투여된다. 또다른 실시양태에서, 조성물 중 하나 이상은 상이한 경로에 의해 투여된다. 예를 들면, 하나 이상의 조성물은 국소 투여될 수 있고 하나 이상의 조성물은 전신 투여될 수 있다.
임의의 세포 표면이 본 발명에 따라 엔지니어링될 수 있다. 한 실시양태에서, 세포 표면은 종양 세포 표면이다. 본 발명이 유용한 대표적인 종양 세포는 폐, 간, 유방, 피부, 방광, 위, 결장, 췌장 등을 비롯한 여러 신체 기관으로부터 유래될 수 있는 암종을 포함하나, 이로 제한되지는 않는다. 암종은 기관 또는 선에서 발달하는 선암, 및 편평 상피에서 유래되는 편평 세포 암종을 포함할 수 있다. 치료가능한 다른 암은 골육종 또는 골원성 육종 (뼈), 연골육종 (연골), 평활근육종 (평활근), 횡문근육종 (골격근), 중피성 육종 또는 중피종 (체강의 내막(membranous lining)), 섬유육종 (섬유상 조직), 맥관육종 또는 혈관내피종 (혈관), 지방육종 (지방 조직), 신경교종 또는 성상세포종 (뇌에서 발견되는 신경성 결합 조직), 점액육종 (원시 배아 결합 조직), 간엽성 또는 혼합 중배엽성 종양 (혼합 결합 조직 유형)과 같은 육종을 포함한다. 또한 골수종, 백혈병 및 림프종도 치료될 수 있다.
여러 실시양태에서, 면역 반응은 특정한 종양 관련 항원 (TAA)에 대하여 도출된다. 특정한 종양 유형과 관련된 수많은 TAA가 확인되었다. 여기에는 인간 텔로머라제 역전사효소 (hTERT), 서바이빈(survivin), MAGE-1, MAGE-3, 인간 융모막성 생식선자극호르몬, 암배아 항원, 알파 태아단백질, 췌장암 태아 항원, MUC-1, CA 125, CA 15-3, CA 19-9, CA 549, CA 195, 전립선-특이 항원; 전립선-특이 막 항원, Her2/neu, gp-100, 돌연변이형 K-ras 단백질, 돌연변이형 p53, 말단절단형 표피 성장 인자 수용체, 키메라 단백질 p210BCR-ABL; 인간 유두종 바이러스의 E7 단백질, 및 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스의 EBNA3 단백질이 포함된다. 임의의 이들 항원, 그의 항원성 단편, 및 항원 및/또는 단편의 혼합물이 환자의 항종양 면역 반응을 일으키거나 증대시키기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 표 5에 TAA의 몇몇 예 및 그러한 TAA와 관련된 질환이 나열되어 있다.
항원 질환
cTAGE-1 및 변이체 피부 T 세포 림프종
BLA 또는 글로보트리아오실세라마이드 (Pk 항원) 버킷(Burkitt) 림프종
인간 T-세포 백혈병 바이러스-관련 세포막 항원 (HTLV-MA) 성인 T-세포 백혈병 림프종(ATL)
흉선세포 표면 항원 JL1 대부분의 급성 백혈병
성인 T 세포 백혈병 관련, 인간 레트로바이러스 관련 항원 (ATLA) 성인 T 세포 백혈병
엡스타인-바 바이러스 (EPV) 항원 버킷 림프종, 호지킨병(Hodgkin's disease)
역형성 림프종 키나제 (ALK), 융합 단백질 (NPM/ALK 및 변이체) CD30+ 역형성 대세포 림프종 (ALCL)
일반적인 급성 림프모구성 백혈병 항원 (CALLA) 대부분의 급성 림프모구성 백혈병
면역글로불린 Id; 제II형 당단백질 (예를 들면, HM1.24; KW-2, KW-4, KW-5, KW-12); 종양태아 항원 미성숙 라미닌 수용체 단백질 (OFA-iLRP); EBV 단백질 (예를 들면, LMP2A) 림프증식성 질환
T-세포에 의해 인식되는 추가의 인간 TAA는 예를 들면 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Novellino et al., "A listing of human tumor antigens recognized by T cells: March 2004 update" Cancer Immunology and Immunotherapy, 54: 187-207 (2005)]에서 찾아볼 수 있다. 동물계의 이들 질환, 및 다른 동물 질환에 대응하는 수많은 동물 TAA가 당업계에 공지되어 있으며 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
생체외에서 변형되어 환자에게 (예를 들어 국소 주입에 의해) 다시 복귀된 세포 표면 또한 본원의 방법에 따라 생체내에서 엔지니어링될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 종양 세포 표면을 엔지니어링하기 위해 조성물을 투여한 개체에게 또한 이미 개시된 바와 같이 생체외에서 엔지니어링된 종양 세포를 투여할 수 있다 (WO 02/02751 참조).
하기 실시예에 나타난 바와 같이, 종양 세포 표면과 같은 세포 표면은 1주일 이상 동안 비오틴화된 상태로 있을 수 있다. 따라서, 세포 표면은 초기 비오틴화 이후 및/또는 초기 엔지니어링 이후 1주일 이상까지 면역 보조자극성 폴리펩티드로 엔지니어링될 수 있다. 예를 들면, 비오틴화 후에, 하나 이상의 면역 보조자극기-스트렙타비딘 융합 단백질을 투여하여 비오틴-변형된 종양 세포 표면 상에 면역 보조자극성 폴리펩티드를 디스플레이할 수 있다. 이어서, 일정 시간 후에, 예를 들면 수시간 내지 수일, 수주일까지 하나 이상의 면역 보조자극기-스트렙타비딘 융합 단백질 (이전에 투여된 것(들)과 동일하거나 또는 상이한 것)을 투여하여 비오틴-변형된 종양 세포 표면 상에 하나 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드를 디스플레이함으로써 추가의 엔지니어링이 달성될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 두번째 비오틴화 단계가 수행된 후에 하나 이상의 면역 보조자극기-스트렙타비딘 융합 단백질을 투여할 수 있다.
동일한 또는 상이한 면역 보조자극성 폴리펩티드로의 순차적 엔지니어링은 향상된 치료 효능을 제공할 수 있다. 예를 들면, 종양 세포 표면과 같은 세포 표면은 면역 반응에서 초기에 소정의 역할을 하는 면역 보조자극성 폴리펩티드(들)로 엔지니어링된 후에 면역 반응에서 후기에 소정의 역할을 하는 면역 보조자극성 폴리펩티드(들)로 엔지니어링될 수 있다. 순차적 투여 사이의 시간 간격은 실질적으로 없거나, 1시간 내지 수시간, 1일 내지 수일, 1주일 이상까지 다를 수 있다.
한 실시양태에서, 종양 세포 표면과 같은 세포 표면은 우선 구조성 수용체, 예컨대 CD80, LIGHT 및 CD40L과 결합하는 면역 보조자극성 분자로 엔지니어링된 후에, 이어서 유도성 수용체, 예컨대 4-1BBL 및 OX40L과 결합하는 면역 보조자극성 분자로 엔지니어링된다. 예를 들면, 종양 세포 표면은 CD80 및/또는 LIGHT로 엔지니어링된 후에, 이어서 예를 들면 2-3일 이후 또는 그보다 긴 시간 이후에 4-1BBL로 엔지니어링될 수 있다.
표 6은 구조성 및 유도성인 보조자극성 분자의 목록을 제공한다.
구조성 유도성
CD80-CSA CSA-4-1BBL
CSA-CD40L CSA-OX40L
CSA-LIGHT PD-L1-CSA
GL50-CSA
본 발명에 따라 엔지니어링된 세포 표면은 일시적인, 또한 일시적이지 않은 시간 동안 하나 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드를 보유한다. 예를 들면, 생체내에서 엔지니어링된 세포 표면은 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 60시간, 적어도 72시간, 적어도 4일, 적어도 5일 또는 그 이상 동안 하나 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드를 보유할 수 있다.
한 실시양태에서, 면역 보조자극성 폴리펩티드에 대하여 초기에 양성인 세포의 약 5％ 이상이 투여한지 약 24시간 후에 양성으로 존재한다. 또다른 실시양태에서, 세포의 약 10％ 이상, 약 15％ 이상, 약 20％ 이상 또는 약 25％ 이상이 투여한지 약 24시간 후에 투여된 면역 보조자극성 폴리펩티드에 대하여 양성으로 존재한다. 또다른 실시양태에서, 세포의 약 5％ 이상, 약 10％ 이상, 약 15％ 이상, 약 20％ 이상 또는 약 25％ 이상이 투여한지 약 36시간 후에 투여된 면역 보조자극성 폴리펩티드에 대하여 양성으로 존재한다. 또다른 실시양태에서, 세포의 약 5％ 이상, 약 10％ 이상, 약 15％ 이상, 약 20％ 이상 또는 약 25％ 이상이 투여한지 약 48시간 후에 투여된 면역 보조자극성 폴리펩티드에 대하여 양성으로 존재한다. 또다른 실시양태에서, 세포의 약 5％ 이상, 약 10％ 이상, 약 15％ 이상, 약 20％ 이상 또는 약 25％ 이상이 투여한지 약 60시간 후에 투여된 면역 보조자극성 폴리펩티드에 대하여 양성으로 존재한다. 또다른 실시양태에서, 세포의 약 5％ 이상, 약 10％ 이상, 약 15％ 이상, 약 20％ 이상 또는 약 25％ 이상이 투여한지 약 72시간 후에 투여된 면역 보조자극성 폴리펩티드에 대하여 양성으로 존재한다. 또다른 실시양태에서, 세포의 약 5％ 이상, 약 10％ 이상, 약 15％ 이상, 약 20％ 이상 또는 약 25％ 이상이 투여한지 약 4일 후에 투여된 면역 보조자극성 폴리펩티드에 대하여 양성으로 존재한다.
한 실시양태에서, 세포의 약 5％ 이상이 투여한지 약 5일 후에 투여된 면역 보조자극성 폴리펩티드에 대하여 양성으로 존재한다. 또다른 실시양태에서, 세포의 약 10％ 이상, 약 15％ 이상, 약 20％ 이상 또는 약 25％ 이상이 투여한지 약 5일 후에 투여된 면역 보조자극성 폴리펩티드에 대하여 양성으로 존재한다. 예를 들면, 주입하고 5일 후에, 세포의 5％ 이상, 10％ 이상, 15％ 이상, 20％ 이상 또는 25％ 이상이 투여된 면역 보조자극성 폴리펩티드에 대하여 양성으로 존재한다. 또다른 실시양태에서, 세포의 약 5％ 이상, 약 10％ 이상, 약 15％ 이상, 약 20％ 이상 또는 약 25％ 이상이 투여한지 약 7일 후에, 또는 투여한지 약 10일 후에 투여된 면역 보조자극성 폴리펩티드에 대하여 양성으로 존재한다. 예를 들면, 주입하고 7일 또는 10일 후에, 세포의 5％ 이상, 10％ 이상, 15％ 이상, 20％ 이상 또는 25％ 이상이 투여된 면역 보조자극성 폴리펩티드에 대하여 양성으로 존재한다.
암 면역요법
본 발명은 또한 종양 크기를 줄이는 방법 및 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 비롯한 암 면역요법을 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법에 따라서, 종양 세포 표면은 상기 기재된 바와 같이 하나 이상의 면역 보조자극성 분자로 엔지니어링된다.
면역요법의 효능은, 종양 세포 증식 및/또는 종양 크기에 있어서의 감소를 측정함으로써 평가할 수 있다. 종양 세포의 개수는 고정적이지 않으며 세포 분열을 진행하는 세포의 개수와 (예를 들면, 아폽토시스에 의해) 사멸하고 있는 세포의 개수를 둘다 반영한다. 종양 세포에 대한 개체의 면역 반응의 증가로 세포의 증식을 억제할 수 있다. 본원에서 사용되는 종양 세포의 증식은 주어진 시간 (예를 들면, 수시간, 수일, 수주일 또는 수개월) 동안 종양 세포의 개수의 증가 (시험관내 또는 생체내)를 지칭한다. 종양 세포의 증식의 억제는 종양 세포 개수의 증가 속도의 감소, 종양 세포의 완전한 소실 또는 그 사이의 증식의 어느 정도의 감소로 측정할 수 있다. 고형 종양의 크기의 감소는 종양 세포 증식의 억제의 지표이다.
엔지니어링된 세포에 의한 면역 자극의 부족은, T 세포와 종양 세포 상에 발현된 MHC 분자의 상호작용을 물리적으로 차단하는 면역 보조자극성 융합 단백질 때문이거나, 또는 세포 표면 상에 적정 수준 이하의 개수로 보조자극성 폴리펩티드가 존재하기 때문일 수 있다. 당업자라면 면역자극 활성을 최적화하기 위해 변형된 세포 표면에 대해 표적화된 면역 보조자극성 폴리펩티드의 양을 다르게 할 수 있다.
조성물 및 그의 조합물
본 발명은 또한 본원에 기재된 생체내 엔지니어링 방법에 사용하기 위한 조성물 및 조성물의 조합물을 제공한다.
예를 들면, 본 발명은 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍 구성원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 면역 보조자극성 잔기를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 제1 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제1 가용성 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 한 특정 실시양태에서, 면역 보조자극성 폴리펩티드는 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, 또는 APRIL을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 면역 보조자극성 폴리펩티드는 CD80 또는 CD40L을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 제1 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제1 가용성 융합 단백질, 및 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제2 가용성 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 제1 또는 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드 중 하나 이상은 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 또는 CD40L일 수 있고, 결합쌍의 제2 구성원은 스트렙타비딘일 수 있다. 한 실시양태에서, 조성물은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 7 및 서열 9로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 하나 이상의 가용성 융합 단백질을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 LIGHT 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 가용성 융합 단백질, CD80 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 가용성 융합 단백질, 및 4-1BBL 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 가용성 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물에는 또한 세포 표면을 생체내에서 엔지니어링하기 위해 투여하는 것에 관한 지침서가 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물은 제약상 허용되는 담체를 임의로 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 담체는, 물질이 투여 환경에서 활성제(들)과 상용성이고, 비활성이거나 또는 의학적으로 허용되기 때문에 조성물을 위한 비히클로서 사용될 수 있는 물질이다. 제약상 허용되는 담체는 희석제 및 보존제와 같은 통상의 제약 첨가제를 함유할 수 있다.
본 발명은 또한 제1 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제1 가용성 융합 단백질을 포함하는 제1 조성물, 및 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제2 가용성 융합 단백질을 포함하는 제2 조성물을 포함하는 조합물을 제공한다. 한 실시양태에서, 결합쌍의 제2 구성원은 스트렙타비딘이다. 한 실시양태에서, 적어도 제1 또는 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드는 CD86, ICOSL (B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 및 LICOS를 포함함), PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또다른 실시양태에서, 적어도 제1 또는 제2 가용성 융합 단백질은 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 7 및 서열 9로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 조합물은 LIGHT 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 가용성 융합 단백질을 포함하는 조성물, CD80 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 가용성 융합 단백질을 포함하는 조성물, 및 4-1BBL 및 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 가용성 융합 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다. 조합물의 각각의 조성물은 별개의 용기에 제공될 수 있다. 조합물에는 또한 세포 표면을 생체내에서 엔지니어링하기 위해 조성물을 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것에 관한 지침서가 제공될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하며, 본 발명의 범주를 임의의 측면으로 제한하지 않는다.
실험 방법
사용되는 종양 모델은 A20 종양 모델을 포함하며 루이스(Lewis) 폐암종 (LLC) 세포주가 이식가능한 뮤린 폐 고형 종양 모델로서 사용된다. LLC의 선택은 부분적으로 폐암이 미국에서 남성 및 여성들 사이에서 암 사망의 주요 원인이라는 사실 때문이다. LLC 고형 종양은 마우스에서 정착될 수 있고, 예를 들면 비오틴 잔기, 이어서 동시에 또는 순차적으로 2개 이상의 면역 보조자극기-스트렙타비딘 융합 단백질의 조합을 종양내 주입함으로써 면역 보조자극성 폴리펩티드의 디스플레이를 위해 생체내에서 엔지니어링될 수 있다. 종양은 외과적으로 절제될 수 있 고, 종양 세포 표면이 면역 보조자극성 폴리펩티드의 조합으로 생체내에서 엔지니어링되어 암에 대한 환자의 면역 반응을 증대시킬 수 있는지를 입증하기 위해 세포 표면 비오틴 및 면역 보조자극성 폴리펩티드의 존재에 대하여 분석될 수 있다.
동물. 성체 근교계 C57BL/6 및 BALB/c 마우스를 잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories)사 (미국 메인주 바하버 소재)에서 구입하여 루이빌 대학 동물 수용소에서 사육한다.
RNA 제조. 해당 세포 또는 조직을 채취하여 즉시 트리졸(Trizol; 인비트로겐(InVitrogen)사; 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 중에서 균질화한다. 전체 RNA를 제조업자의 프로토콜에 따라 단리한다. 순수한 RNA를 디에틸피로카르보네이트-처리된 물 중에 용해시키고, RN아제 억제제를 보충하고, 적은 분취량으로 분배한 다음 사용하기 전까지 -70℃에서 보관한다. 각각의 RNA 분취물을 한 번만 해동하고 미사용 부분을 버려 빈번한 냉동 및 해동의 결과로서의 RNA 불안정성과 관련된 변수를 제거한다.
융합 단백질의 클로닝 및 발현. 인간 CD80 및 마우스 4-1BBL을 클로닝하여 곤충 발현 시스템에서 발현시킨다 (문헌 [Singh et al., 2003, Cancer Res., 63:4067-73]). LIGHT의 클로닝 경우, 마우스 비장림프구를 PMA 10 ng/mL 및 0.5 μM 이오노마이신(ionomycin)으로 3시간 동안 활성화하고 전체 RNA 추출을 위해 가공한다. Id. 전체 RNA 중 2 mg을 제1 가닥 cDNA로 전환시킨 후에 문헌 [Yu et al., 2004, Nat. Immunol., 5:141-9]에 기재된 바와 같이 PCR에서 메탈로프로테이나제 절단이 부족한 LIGHT의 세포외 부분에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 증 폭시킨다. 서열 확인 후에, 유전자를 표준 분자적 방법을 사용하여 초파리 pMT/BiP/V5-His 발현 벡터 (인비트로겐사; 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)에서 코어 스트렙타비딘 (SA)으로 서브클로닝한다 (C-말단).
형질감염. 문헌 [Yolcu et al., 2002, Immunity, 17:795-808]에서 이미 개시된 바와 같이 인산칼슘 형질감염 키트를 사용하여 플라스미드 DNA 20 ㎍으로의 초파리 S2 세포의 일시적 형질감염을 수행한다. S2 세포에서의 발현은 형질감염하고 1 내지 4일 후에 500 μM의 최종 농도로 배지에 황산구리를 첨가함으로써 유도된다. 안정한 형질감염체를 일시적 형질감염에 대해 기재된 것과 유사한 실험 조건하에서 20:1 (벡터:대상) 비율로의 pCoHYGRO 벡터와의 동시형질감염을 사용하여 정착시킨다. 3일 후에, 형질감염체를 300 ㎍/ml의 하이그로마이신 존재하에 3 내지 5일마다 배양 배지를 교체하면서 유지한다. 이어서 안정한 형질감염체를 다량 발현자의 확인을 위해 96-타이터 플레이트에서 웰 1개당 0.3개 세포로 클로닝한다. 이들 유전자의 발현은 ELISA, 면역침강 및 웨스턴 블롯법으로 6xHis-태그 (퀴아겐(QIAGEN)사; 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)에 대해 특이적인 항체를 사용하여 측정한다.
재조합 단백질의 정제. 재조합 융합 단백질을 니켈-니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA) 고정화 금속 친화 크로마토그래피 (퀴아겐사)를 사용하는 대량 정제에 이용되는 6-His-태그가 부착된 상태로 발현시킨다. 간략하게 말하면, 안정한 형질감염체를 무혈청 배지에서 생장시키고 24시간 동안 황산구리로 유도한다. 배양 배지를 2X 천연 결합 완충액과 1:1의 비율로 혼합하여 Ni-NTA 아가로스 비드를 함유하 는 컬럼 상으로 로딩한다. 컬럼을 세척 완충액 (50 mM NaH2PO4 pH 8.0; 300 mM NaCl; 250 mM 이미다졸)으로 철저하게 세척한 후에, 융합 단백질을 용리 완충액 (50 mM NaH2PO4 pH 8.0; 300 mM NaCl; 250 mM 이미다졸)으로 용리한다. 단리된 단백질의 순도를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정한다. 단백질 농도는 제조업자 (바이오라드(BioRad)사; 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재)의 지시에 따라 브래드포드(Bradford) 분석법을 사용하여 측정한다.
ELISA. A20 또는 LLC 종양 기질 세포에 의한 CCL21 발현을 ELISA에 의해 측정한다. 간략하게 말하면, 종양을 잘라내어 단일 세포 현탁액으로 기계적으로 가공한다. 이들 세포를 다양한 농도의 CSA-LIGHT (1-5000 ng/ml)와 함께 다양한 시간 (2-5일) 동안 인큐베이션한다. 배양액 상등액을 채취하여 시판되는 항-마우스 CCL21 Ab (R＆D 시스템즈 인크.(R＆D Systems Inc.)사; 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재)를 사용하여 CCL21의 존재에 대하여 시험한다 (문헌 [Yang et al., 2004, Clin. Cancer Res., 10:2891-901]). CSA-LIGHT가 없거나 또는 CSA 대조 단백질을 함유하는 배양액, 및 플레이트-결합된 LIGHT와 함께 인큐베이션된 배양액이 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용된다.
세포 표면의 엔지니어링. LLC 또는 A20 종양 세포를 얼음-냉각된 PBS로 세척하고 5-15 μM EZ-링크(상표명) 술포-NHS-LC-비오틴 (피어스사)을 함유하는 pH 8.0의 PBS 중에서 1 ml당 2 x 107개 세포로 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 세포를 철저하게 세척하고 1 ml당 1 x 106개 세포로 100 ng/정제된 면역 보조자극기-스트렙타비딘 융합 단백질과 함께 45분 동안 4℃에서 인큐베이션한다. PBS로 철저하게 세척한 후에, 세포를 면역 보조자극성 융합 단백질로 엔지니어링된 세포를 평가하기 위한 유세포 측정 분석법을 위해 가공한다. 이러한 세포는 또한 시험관내 기능 연구를 위해서도 사용된다. 세포는 시험관내 연구에서 사용되기 전에 100 Gy에서 방사선 조사된다.
혼합형 림프구 종양 반응 ( MLTR ). 림프절 (LN) 세포를 해당 동물로부터 수집하여, 단일 세포 현탁액으로 가공하고, 완전 혼합형 림프구 반응 (MLR) 배지 (10 mM HEPES, 100 U/ml의 페니실린 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신, 274 μM L-아르기닌, 및 5％ 풀링 마우스 혈청이 보충된 RPMI-1640)에 재현탁시킨 다음 항원 부동성을 갖는 다양한 유전자 집단으로부터의 방사선 조사된 (100 Gy) 종양 세포에 대한 반응자로서 사용한다. 인큐베이션 3-5일 후에, 배양액에 배양 기간의 마지막 18시간 동안 1 μCi/웰의 [3H]티미딘 (NEN 라이프 사이언시즈 프로덕츠(NEN Life Sciences Products)사; 미국 매사추세츠주 보스턴 소재)을 적용하고(pulsed), 세포 증식의 평가를 위해 채취한다. 변형되지 않은 세포 및 대조 CSA 단백질이 부착된 세포가 대조군으로서 사용된다.
세포독성 T 림프구 ( CTL ) 분석법. 해당 동물의 LN으로부터의 이펙터 세포 (5 x 106)를 배양액에서 5일 동안 60 IU/ml의 IL-2로 보충된 완전 MLTR 배지에서 부착되지 않은 동일한 개수의 방사선 조사된 (100 cGy) 종양 세포로 생산한다. 이펙 터 세포를 림포라이트(Lympholyte; 등록상표)-M (애큐리트 케미컬 앤드 사이언티픽 코포레이션(Accurate Chemical and Scientific Corporation)사; 미국 뉴욕주 웨스트베리 소재)을 사용하여 채취하고 JAM 분석법에서 상이한 이펙터:표적 (E:T) 비율로 표적 세포에 대하여 사용한다 (문헌 [Matzinger, 1991, J. Immunol. Methods, 145:185-92] 참조).
생체내 종양 엔지니어링 및 면역요법. B6 또는 BALB/c 마우스에 각각 치사량 (예를 들면, 1 x 105 - 1 x 106)의 생존 LLC 또는 A20 종양 세포를 옆구리에서 피하로 공격접종한다. 종양 크기가 직경 6-8 mm에 도달하면, 종양에 비오틴 300 ㎕, 이어서 면역 보조자극기-스트렙타비딘 융합 단백질을 주입한다. 대조군은 변형되지 않은 종양 및 CSA 단백질로 변형된 종양을 포함한다. 종양의 직경은 캘리퍼(caliper) 측정에 의해 측정하고 1주일에 3번 측정한 최장 직경의 평균 및 수직 직경 ± 표준 오차로 표시한다. 종양 크기가 대략 20 mm의 직경에 도달하면 동물을 안락사시킨다.
시토카인 발현을 위한 경쟁적 RT- PCR . 전체 RNA를 해당 샘플로부터 준비하여 전체 RNA 중 2 ㎍을 올리고(dT)18을 사용하는 제1 가닥 cDNA 합성을 위한 20-㎕ 반응 혼합물 중에 사용한다 [문헌 [Mhoyan et al., 1997, Transplantation, 64:1665-70]; 문헌 [Shirwan et al., 1998, Transplantation, 66: 1802-9]). 이 반응 혼합물 2 ㎕를 IL-12, IL-10, 및 IFN-γ, TGF-β, 및 CCL21-특이적 5' 및 3' 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 45초 동안의 변성, 60℃에서 60초 동안의 어닐링, 및 72℃에서 90초 동안의 신장 과정을 25-38 사이클 반복. 각각의 반응 혼합물은 또한 각각의 시토카인을 위한 프라이머 쌍에 대한 서열을 갖는 삽입물을 함유하는, 기지 양의 플라스미드 벡터를 포함한다. 이는 주어진 샘플에서 각각의 시토카인에 대한 전사체의 카피수를 추정하기 위한 경쟁적 주형으로서 사용된다. PCR 산물을 1％ 아가로스 중에서 분별하고, EtBr 염색에 의해 시각화한 후에, 바이오라드 GelDoc 시스템을 사용하여 분석한다. 경쟁자 및 시험 대상체에 해당하는 밴드 세기를 농도계 스캐닝으로 평가하여 시토카인-특이적 전사체의 총 개수/전체 RNA ㎍을 추정하는데 사용한다. 마우스 HPRT의 발현이 RNA의 양을 측정하는데, 또한 다양한 시토카인 분석을 위해 사용되는 cDNA의 양을 표준화하는데 사용된다. cDNA를 함유하지 않는 완전 PCR 혼합물이 음성 대조군으로서 사용된다.
유세포 측정법. 면역 보조자극성 융합 단백질과 그의 수용체의 결합에 대하여, 마우스 비장림프구를 림포라이트(등록상표)-M (애큐리트 케미컬 앤드 사이언티픽 코포레이션사; 미국 뉴욕주 웨스트베리 소재)을 사용하여 단리하고 다양한 농도 (10-1000 ng/ml)의 융합 단백질과 함께 인큐베이션한 후, 유세포 측정법에서 CD4, CD8 및 CD11c에 대한 항체와 배합하여 각각의 분자에 대한 플루오레세인-표지 항체로 염색한다. 재조합 코어 SA와 함께 인큐베이션한 세포가 음성 대조군으로서 사용된다. 일반적으로, 1차 및 2차 해당 항체를 우선 적정한 후에 표준 절차를 사용하는 유세포 측정법에서 최적 농도를 사용함으로써 멀티컬러 유세포 측정 분석법을 수행한다 (문헌 [Mhoyan et al., 1997, Transplantation, 64:1665-70] 참조). 동 종형(isotype)-매칭된 항체가 음성 대조군으로서 사용된다. 샘플을 FACS 칼리버(Calibur) 또는 밴지티 소터(Vantage Sorter) (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)사) 상에 전개한다. 분석은 FlowJo 또는 CellQuest 소프트웨어를 사용하여 수행한다.
통계학. 종양 생존에 대한 실험적 처리의 효과를 카프란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선을 사용하여 평가한다. 상이한 집단 사이의 생존에 있어서의 차이점을 로그-순위 검정법 (일반화된 사비지/만텔 콕스(Savage/Mantel Cox))을 사용하여 평가한다. 개개 동물들의 집단으로부터의 실험 데이터의 비교를 포함하는 절차는 F 검정법 (두 집단) 또는 레벤 검정법 (복수 집단)을 사용하여 검정된 분산의 동일성을 갖는다. 분산이 동일하지 않다면, 로그 변환을 수행한다. 정규 분포의 샘플 평균을 비교할 경우에는, 스튜던트의 t 검정법 (두 집단) 또는 뉴만-퀼즈(Newman-Keuls) 검정법 (복수 집단)이 사용된다. 데이터가 정규 분포가 아닐 경우에는, 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정법 (두 집단) 또는 크루스칼-월리스(Kruskal-Wallis) 검정법 (복수 집단)이 사용된다. 통계적 유의성은 P<0.05로서 정의된다.
실시예 1
본원의 결과는 (1) 종양 및 일차 세포는 생리학적 조건하에서 효과적으로 비오틴화될 수 있고 비오틴은 세포 표면 상에서 수주일 동안 지속된다는 것; (2) 비오틴화된 세포는, 후에 장시간 동안 (수일 내지 수주일) 생체내 세포 표면 상에서 지속되는 다수의 융합 단백질로 엔지니어링될 수 있다는 것; (3) 생존가능한 LLC 또는 A20 종양 세포의 피하 주입은 유전적 동계 마우스에서 고형 종양을 유발한다 는 것을 입증하였다. 데이터는 종양이 CD80의 디스플레이를 위해 생체내에서 엔지니어링될 수 있음을 보여준다.
A. 세포 표면 변형
피어스 바이오테크놀러지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.)사 (미국 일리노이주 록포드 소재)로부터의 EZ-링크(상표명) 술포-NHS-LC-비오틴 유도체를 사용하여 일련의 연구를 수행하여 세포의 생존력 및 기능을 손상시키지 않는 비오틴화 조건을 확립하였다. 5-50 μM 범위에서의 비오틴화가 이러한 기준을 만족시키고 외인성 단백질의 최적의 디스플레이를 위한 효과적인 플랫폼을 제공하였다 (문헌 [Yolcu et al., 2002, Immunity, 17:795-808]).
생체내에서 세포 표면 상의 비오틴 지속성의 동역학을 평가하기 위해, 래트 비장림프구를 시험관내에서 비오틴화하고 (5-15 μM), 세포내 염료 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)로 표지하고, 유전적 동계 동물에 정맥내 주입하였다. 비장림프구를 주입 후 다양한 시점에 채취하여 CFSE 양성 세포를 스트렙타비딘-알로피코시아닌 (스트렙타비딘-APC)을 사용하여 세포 표면 상의 비오틴의 존재에 대하여 유세포 측정법으로 분석하였다. 생체내에서 세포 표면 상의 비오틴의 t1 /2는 15일보다 긴 것으로 밝혀졌다 (도 6; 문헌 [Singh et al., 2003, Cancer Res., 63:4067-73] 참조).
세포막 상의 비오틴의 지속성을, 15 μM 비오틴으로 표지하고 ConA의 부재하에 또는 그의 존재하에 다양한 기간 동안 배양한 비장림프구에 대하여 평가하였다. 세포를 채취하여 유세포 측정법을 사용하여 스트렙타비딘 반응성 비오틴에 대해 분석하였다. 비오틴은 휴면 (도 7A) 및 증식 (도 7B) 비장림프구에 대하여 각각 20일 및 18일보다 긴 t1 /2를 가져 장시간 동안 세포 표면 상에 존재하였다. 20일 째에는, 미분열 세포의 53％가 비오틴에 대해 양성인 반면, 분열 세포의 36％만이 비오틴에 대하여 양성으로 평가되었다.
유사한 정도의 비오틴 지속성이 또한 래트 대동맥 내피 세포를 사용하여 관찰되었다. 내피 세포의 경우 비오틴 세포 표면 안정성의 동역학은 초기 평가된 t1/2이 7일이고, 이후 20일보다 긴 t1 /2를 갖는 이상성이었다 (도 7C). 내피 세포 상에서 비오틴의 초기의 보다 신속한 유실은 아마도 부분적인 희석에 의한 것일 것이고, 이상성 시간 경과는 세포 성장의 동역학 및 배양액이 전면생장 상태가 될수록 증식이 느려지는 것을 반영한다. 생체내 연구는 수주일 동안의 세포 표면 상의 비오틴의 지속성을 보여주었다.
비오틴 지속성은 또한 A20 세포를 사용하여서도 입증되었다. 백만개의 A20 세포를 나이브 Balb/c 마우스의 오른쪽 옆구리로 피하 주입하였다. 종양 성장을 모니터링하고 종양 크기가 직경 6-8 mm에 도달하였을 때, 상이한 용량의 비오틴 용액 (PBS 300 ㎕ 중 0.5 mM, 1 mM 및 5 mM)을 종양내 주입하였다. 집단마다 3마리의 동물을 비오틴을 주입한지 1일, 3일, 5일 및 7일 후에 안락사시켰다. 종양을 외과적으로 절제하고 단일 세포 현탁액으로 기계적으로 가공하였다. 백만개의 세포를 스트렙타비딘-APC로 염색하고 비오틴화되지 않은 종양 세포를 음성 대조군으 로서 사용하였다. 세포를 유세포 측정법 및 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. PBS 300 ㎕마다 EZ-링크 술포-NHS-LC-비오틴 (분자량 556.59, 피어스사) 0.83 mg을 용해시킴으로써, 비오틴 용액을 0일에 신선하게 5 mM 스톡으로서 제조하였다. 보다 낮은 농도를 위해서는 비오틴 스톡을 PBS로 희석하였다 (1:5 및 1:10).
그 결과가 도 13에 나타나 있으며, 도 13은 5 mM 비오틴으로 처리한 세포의 약 66％가 5일 후에 비오틴화된 상태로 존재함을 보여준다. 3일 후에는 94％가 비오틴화된 상태로 존재하고, 7일 후에는 7％가 비오틴화된 상태로 존재하였다. 0.5 mM 비오틴으로 처리한 세포의 경우에는, 1일 후에 86％가 비오틴화된 상태로 존재하고, 3일 후에는 44％가 비오틴화된 상태로 존재하였다. 1 mM 비오틴으로 처리한 세포의 경우에는, 1일 후에 95％가 비오틴화된 상태로 존재하고, 3일 후에는 67％가 비오틴화된 상태로 존재하고, 5일 후에는 27％가 비오틴화된 상태로 존재하고, 7일 후에는 3％가 비오틴화된 상태로 존재하였다.
상기 데이터는 제1 결합쌍 구성원으로서 비오틴을 포함하는 이기능성 분자가 생체내에서 수주일 동안 또는 수개월 동안 세포 표면 상에서 지속될 수 있어, 장시간 동안 면역 보조자극성 폴리펩티드에 연결된 스트렙타비딘 또는 그의 기능성 단편을 포함하는 융합 단백질과 복합체를 형성하고, 따라서 세포 표면 상에서 이를 디스플레이할 수 있다는 것을 입증한다.
B. 생체외 세포 표면 엔지니어링
면역 보조자극성 융합 단백질은 생체외에서 비오틴으로 표지된 종양 세포의 표면 상에 공동-디스플레이될 수 있다.
백만개의 LLC 세포를 PBS 중의 피어스 바이오테크놀러지, 인크사 (미국 일리노이주 록포드 소재)로부터의 15 μM EZ-링크(상표명) 술포-NHS-LC-비오틴 유도체를 사용하여 실온에서 20-30분 동안 비오틴화하였다. 이어서 비오틴을 원심분리에 의해 제거하고, 세포를 1회 세척하고, 깨끗한 제2 튜브에 옮겨, 1-2회 더 세척한 후에, PBS 중의 100 ng/단백질/106개 세포의 CD80-CSA 및 4-1BBL-CSA 융합 단백질과 30-45분 동안 얼음 상에서 접촉시켰다. 이어서 세포를 철저하게 세척하고, 30-45분 동안 얼음 상에서 인큐베이션함으로써 PBS 중의 포화 농도의, CD80 및 4-1BBL에 대한 다양한 형광색소-접합된 항체로 염색하는데 사용하였다. 이어서 세포를 FACS 배지로 철저하게 세척하여 유세포 측정 분석법을 위해 사용하였다. 두 융합 단백질 모두 유사한 수준에서 종양 세포의 표면 상에 공동-디스플레이되었다 (도 8). 디스플레이된 융합 단백질은 특이적 항체에 의한 내생성 세포막 단백질의 검출을 유의하게 변경시키지 않았다.
A20 세포를 비오틴화 (5 μM)한 후에 상기 상술한 것과 유사한 절차에 따라서 100 ng/단백질/106개 세포의 CD80-CSA 및 4-1BBL-CSA 융합 단백질과 접촉시켰다. 두 융합 단백질 모두 유사한 수준에서 종양 세포의 표면 상에 공동-디스플레이되었다 (도 14).
C. 생체외 엔지니어링된 종양 상의 단백질 디스플레이의 생체내 동역학
세포 표면 상의 외인성 단백질의 지속성의 동역학을 생체내에서 측정하였다. 비장림프구를 비오틴 (15 μM)으로 변형시키고, CD80-CSA 융합 단백질 (100 ng/1 x 106개의 세포)로 엔지니어링하고, CFSE로 표지한 후에, 유전적 동계 동물에 정맥내 주입하였다. 비장림프구 및 LN 세포를 주입 후 다양한 경과일에 채취하여 CFSE 양성 세포 상의 융합 단백질의 존재에 대해 분석하였다. CD80-CSA는 10일보다 긴 t1 /2로 비장림프구의 표면 상에 지속되었다 (도 9).
상기 데이터는 면역 보조자극성 융합 단백질로 엔지니어링된 종양 세포가 엔지니어링된 세포 또는 숙주 환자 (또는 시험 동물)에게 검출될 정도의 독성을 부여하지 않으면서 수주일 동안 생체내에서 세포 표면 상에 그러한 단백질을 보유할 수 있다는 것을 입증한다.
D. 생체외 엔지니어링에 의해 달성된 높은 디스플레이 수준
다양한 단백질 농도의 함수로서 세포 상에 디스플레이된 CD80-CSA 분자의 개수를 평가하기 위해, A20 B 림프종 세포를 5 μM 비오틴으로 비오틴화하고, 식염수 100 ㎕ 중의 CD80 (100 ng/106개의 세포)으로 이중으로 4℃에서 30분 동안 엔지니어링하였다. 세포를 피코에리트린 (PE) 접합된 항-인간 CD80 항체로 염색하였다. 뱅즈 래보러토리즈(Bangs Laboratories)사로부터의 퀀텀(Quantum)-27 MESF 키트를 사용하여 세포 1개당 CD80-CSA 분자의 개수를 평가하였다. 샘플의 MESF(Molecules of equivalent soluble fluorochrome)를 셀 퀘스트 분석 프로그램 (벡톤 디킨슨 바이오사이언시즈(Becton Dickinson Biosciences)사)을 사용하여 다양한 MESF 값 (0, 727, 2737, 10110, 41738)을 갖는 5개의 MESF 비드로 만든 보정 곡선에 따라 계산 하였다. 각각의 샘플의 데이터를 MESF 값으로 전환하였다 (도 10).
세포 표면 상의 CD80-CSA 분자의 개수와 100 ng 이하로 사용된 단백질의 양 사이에는 직접적인 상관관계가 있었다. 예비-임상 연구 (하기 참조)에서 암 백신을 위해 사용된 이 단백질 농도에서, 세포 1개당 평균 118,000개의 분자가 있었으며, 이는 생리학적 조건하에서 활성화된 B 세포 또는 DC 1개당 6,000-12,000개의 CD80 분자와 대조된다 (문헌 [Bergwelt-Baildon et al., 2002, Blood, 99:3319-25] 참조).
E. CD80 -SA 엔지니어링된 세포에 의해 유도된 자가/동종반응성 반응
CD80-CSA가 기능성이고 T 세포 면역 반응을 발달시키는지를 시험하기 위해, CD80-SA를 디스플레이하는 일차 종양 세포 및 정착된 종양 세포주를 사용하여 MLTR 분석법을 수행하였다. CD80-CSA로 엔지니어링된 인간 종양 세포주 (HEC-1-A, 자궁내막암)는 건강한 지원자로부터의 말초 혈액 림프구에서 강력한 증식성 반응을 발달시켰다. 증식성 반응은 CD80-CSA 특이적인데, 그 이유는 엔지니어링되지 않은 종양 세포 또는 S2 배양액 상등액으로 처리한 비오틴화된 세포는 최소의 증식성 반응을 도출하였기 때문이다. 관찰된 증식성 반응은 CD4+ T 세포보다 CD8+ T 세포와 더욱 관련있다 (도 11). 상기 데이터는 CD80-CSA로 엔지니어링된 종양 세포가 T-세포 증식을 유도하는 효과적인 보조자극성 시그널을 발생시킨다는 것을 나타낸다.
F. 4-1 BBL 엔지니어링에 의한 면역조절
CD4+ 및 CD8+ T 세포를 나이브 C57B/6 (H2-Kb) 마우스의 비장 및 림프절로부 터 FACS-분류하여 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜에스테르 (CFSE)로 염색하였다. 간략하게 말하면, 세포를 PBS로 세척하고, 4 ml의 2.5 μM CFSE/1 x 106개 세포 중에서 7분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 1분 동안 2 부피의 FBS 중에서 인큐베이션하고, PBS로 2회 세척하였다. A20 B 림프종 세포 (H2-Kd)를 PBS에서 세척하고 신선하게 제조된 PBS 중의 EZ-링크 술포-NHS-LC-비오틴 (50 x 106개 세포마다 1 ml 용액)을 사용하여 30분 동안 실온에서 비오틴화하였다. PBS로 세척한 후에, 세포를 10000 cGy에서 방사선 조사하였다. 비오틴화되고 방사선 조사한 A20 세포를 5 ml 용량의 튜브에서 CSA-4-1BBL (100 ng/1 x 106개 세포) 또는 대조 단백질 CSA (38 ng/1 x 106개 세포)와 함께 30분 동안 냉장실에서 인큐베이션하였다. 세포를 철저하게 세척한 후에, 세포 중 일부를 4-1BBL 및 스트렙타비딘에 대한 형광색소-접합 항체로 염색하여 부착을 검출하거나, 또는 형광색소-접합 스트렙타비딘으로 염색하여 비오틴화를 검출하였다. CFSE 표지 분류된 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 (1 x 105/웰)를 96-웰 플레이트에서 방사선 조사한 A20 세포, 방사선 조사/비오틴화된 A20 세포 또는 방사선 조사/비오틴화/부착된 A20 세포와 함께 4:1 비율로 4일 동안 공동-배양하였다.
세포를 형광색소-접합된 항-CD4 또는 항-CD8 항체로 염색한 후에 T 세포의 증식을 유세포 측정법을 사용하여 측정하였다. CSA가 부착된 대조군 (8.6％)과 비 교하여 4-1BBL이 부착된 A20 세포 (52.6％)에 대하여 활발한 증식 반응이 있었다 (도 15).
상기 데이터는, 세포를 4-1BBL로 엔지니어링하는 것이 Teff 기능을 증대시키기 때문에 본 발명에 따른 4-1BBL의 사용이 효과적인 면역조절을 달성한다는 것을 입증한다.
G. 고형 종양의 생체내 엔지니어링
백만개의 생존 A20 B 림프종 세포를 유전적 동계의 나이브 Balb/c 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 주입하였다. 종양 크기가 직경 7-9 mm에 도달하였을 때, 300 ㎕의 PBS 중의 1 mM EZ-링크 술포-NHS-LC-비오틴을 종양에 주입하고, 이어서 24시간 후에 PBS 150 ㎕ 중의 CD80-CSA 융합 단백질 40 ㎍을 종양내 주입하였다. 종양 세포를 채취하여 단백질을 주입한지 24시간 후에 분석하였다. 비오틴 수준을 스트렙타비딘-APC에 의해 검출하고 융합 단백질 수준을 CD80에 대한 항체에 의해 검출하였다. 미처리 종양 및 비오틴화된 종양으로부터의 세포를 각각 비오틴 및 CD80에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다.
종양 세포의 98％가 비오틴을 주입한지 48시간 후에 비오틴에 대해 양성이었고 81％가 CD80 융합 단백질을 주입한지 24시간 후에 CD80에 대해 양성이었다 (도 12). 상기 데이터는 세포 표면 상의 또다른 비오틴 자리가 SA와의 결합을 위해 이용가능함을 보여준다. 따라서, 세포 표면은 비오틴을 포함하는 추가의 이기능성 분자로 세포를 처리할 필요 없이 동일한 또는 상이한 면역 보조자극성 폴리펩티드 를 포함하는 또다른 면역 보조자극기-스트렙타비딘 융합 단백질로 순차적으로 엔지니어링될 수 있다.
이러한 결과는 종양이, 생체내에서 종양 세포의 표면 상에 장시간 동안 지속될 면역 보조자극성 폴리펩티드로 생체내에서 엔지니어링될 수 있음을 나타낸다.
유사한 프로토콜에 따라서 비오틴화 이후의 CD80-CSA 투여 시기의 영향을 평가하였다. 1 x 106개의 A20 세포를 나이브 BALB/c 마우스의 오른쪽 등쪽 옆구리에 피하 주입하였다. 종양 성장을 모니터링하고 1주일에 3회 캘리퍼를 사용하여 측정하였다. 종양 크기가 평균 직경 7-9 mm에 도달하였을 때, 300 ㎕의 5 mM 비오틴 용액 (PBS 중 EZ-링크 술포-NHS-LC-비오틴)을 종양에 주입하였다. 비오틴을 주입한지 2, 4, 8 또는 16시간 후에, 비오틴화를 상기 기재된 바와 같이 평가하고 50 ㎍의 CD80-SA를 종양내 주입에 의해 투여하였다. (몇몇 동물은 음성 대조군으로서 처치하지 않은 상태로 두었다.) 동물을 CD80-SA를 주입한지 16시간 후에 안락사시켰다. 종양을 단일 세포 현탁액으로 가공하고, 융합 단백질 수준을 유세포 측정법을 사용하여 CD80에 대한 항체에 의해 검출하였다. 결과 (도 16)는, 비오틴을 투여한지 16시간 후에 융합 단백질이 투여되었을 때, 보다 많은 비율의 비오틴화된 세포가 부착됨을 보여주며, 여기서 비오틴을 투여한지 8, 4 및 2 시간 후의 각각 49％, 31％ 및 10％와 비교하여 비오틴화된 세포의 62％가 부착되었다.
실시예 2
본 실시예는 2개 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드, 예컨대 LIGHT, CD80, 4-1BBL, CD40L, OX40L, PD-L1 및 GL50 폴리펩티드 중 2개 이상의 조합의 효과적이고 지속적인 디스플레이를 위한 종양 표면의 생체내 엔지니어링을 기재하고 있다.
A. 비오틴화
생체내에서 종양 세포의 비오틴화를 위한 효과적인 비오틴 용량 및 이러한 종양 세포의 표면 상의 비오틴 지속성의 동역학이 측정될 수 있다. 생체내에서 비오틴 접합의 효과적인 수준은 (i) 종양 세포의 50％를 초과한 종양 세포의 비오틴화; (ii) 비오틴화한지 5일 후에 비오틴에 대해 초기에 양성이었던 종양 세포의 50％ 이상의 표면 상의 비오틴 지속성 (여기서, 비오틴 양성 세포의 평균 형광 강도는 70을 초과함); 및 (iii) 종양 또는 환자에 대하여 검출될 정도의 독성이 없는 것으로서 정의될 수 있다.
상기 기준을 만족시키는 비오틴의 용량은 비오틴화 직후에 종양 세포마다 100,000개 초과의 면역 보조자극성 융합 단백질 분자의 디스플레이를 허용하고 비오틴화한지 5일 후에 세포마다 12,000개를 초과한 분자의 디스플레이를 허용해야 한다. 뒤쪽의 개수는 활성화된 APC의 표면 상의 CD80의 생리학적 발현을 토대로 한다 (문헌 [Bergwelt-Baildon et al., 2002, Blood, 99:3319-25] 참조).
T 세포 반응 (항종양 면역 반응을 포함함)이 초기 항원 공격의 24-72시간 후에 발달되고 효과적인 항종양 반응을 발달시키기 위해 모든 종양 세포가 보조자극성 분자를 발현시킬 필요가 없기 때문에, 상기 기재한 비오틴화 기준은 본 발명에 따라 사용되었을 때 강력한 항종양 면역 반응을 달성할 것으로 기대된다. 예를 들면, 5일 및 50％의 잔존하는 비오틴-양성 종양 세포 파라미터는 엔지니어링된 종양 세포 표면이 5일 이상 면역 보조자극성 폴리펩티드를 디스플레이하고, 또한 필요할 경우 상기 기재된 바와 같이, 추가의 비오틴화 없이 추가의 면역 보조자극성 폴리펩티드로 재-엔지니어링될 수 있음을 보장할 것으로 기대된다.
비오틴화 정도는, 예를 들어 100-200 ㎕의 다양한 농도 (예를 들면, 0, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 50.0 mM)의 EZ-링크(상표명) 술포-NHS-LC-비오틴을 종양내 주입한 후에 종양에서 측정할 수 있다. (종양 크기에 따라 보다 다량의 용액이 사용될 수 있다.) 이어서 종양을 주입 후 다양한 시점에 채취하여, 단일 세포 현탁액으로 제조하고, 종양 세포, 종양 침윤 숙주 세포, 예컨대 T 세포 (CD3), B 세포 (CD19) 및 DC (CD11c) 상의 비오틴의 존재에 대하여 유세포 측정법에 의해 (예를 들면 SA-APC를 사용하여) 분석하였다.
말초 혈액 세포 및 종양 유출 LN 또한, 존재한다면 비오틴 누출 및 말초 세포의 부착 및/또는 종양으로부터의 비오틴화된 세포의 말초로의 이동 때문일 수 있는 비오틴 양성 세포의 존재에 대하여 분석할 수 있다. 환자를 각각 생존 및 종양 성장에 대하여 모니터링하여, 시험 비오틴 용량이 검출될 정도의 독성과 관련있는지를 결정한다.
비오틴 용량의 증가는 종양 세포 (및 종양 내 존재하는 숙주 세포)의 표면 상에 디스플레이된 비오틴 수준을 증가시킬 것이다. 이와 마찬가지로, 보다 다용량의 투여된 비오틴은 표적 세포 상에서 비오틴 지속성의 보다 장기 동역학을 초래한다. 비오틴의 세포 표면 동역학이 비오틴이 접합된 세포 표면 분자의 통상의 턴오버(turnover) 및 세포 분열의 함수로서 비오틴의 희석에 의해 거의 조절됨을 가 정하면, 비오틴 턴오버의 보다 느린 동역학이 침묵인 세포, 예컨대 DC에 대해 관찰될 것이다.
B. 면역 보조자극기- CSA 융합 폴리펩티드의 특징화
면역 보조자극성 폴리펩티드 및 스트렙타비딘을 포함하는 융합 폴리펩티드를 하기에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 생산하고, 기능적 및 구조적으로 시험관내에서 특징화하고, 다량으로 정제하였다.
면역 보조자극성 폴리펩티드 및 CSA를 포함하는 다수의 융합 폴리펩티드를 클로닝하고 발현시켰다. 상기 및 그 외의 다른 예시적 융합 폴리펩티드의 서열 및 그의 뉴클레오티드 서열이 도 1 내지 5에 나타나 있다. 당업자라면 상기 기재되었고 하기 논의된 것들을 포함하는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 이러한 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
LIGHT는 활성화된 (PMA 및 이오노마이신) 마우스 비장림프구로부터 클로닝되고 DES 발현 벡터에서 코어 스트렙타비딘에 대하여 C-말단에 위치한다 (문헌 [Yolcu et al., 2002, Immunity, 17:795-808]; 문헌 [Askenasy et al., 2003, Circulation, 107:41-7]; 문헌 [Singh et al., 2003, Cancer Res., 63:4067-73] 참조). 초파리 S2 세포를 제조업자 (인비트로겐사; 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재)의 지시에 따라 인산칼슘 형질감염 키트를 사용하여 플라스미드 DNA 20 ㎍으로 형질감염시켜 안정한 형질감염체를 정착시켰다. 융합 단백질의 발현은 0.5 mM 황산구리로 유도되었다. 융합 단백질을 Ni-NTA 컬럼 및 6xHis-태그를 사용하여 다량으로 정제하였다.
정제된 융합 단백질을 상기 실시예 1에서 논의된 바와 같이 마우스 4-1BBL 및 LIGHT 분자에 대한 항체 및 유세포 측정법을 사용하여 T 세포 상의 그들의 각각의 수용체와의 결합에 대해 시험하였다. T 세포 상에서 4-1BB의 발현은 유도성이고 HVEM은 구조적으로 발현되기 때문에 (문헌 [Granger ＆ Rickert, 2003, Cytokine Growth Factor Rev., 14:289-96]), 불활성화 상태로 존재하거나 또는 3일 동안 ConA로 활성화된 비장림프구가 사용된다. 활성화 및 불활성화 비장림프구를 림포라이트(등록상표)-M (애큐리트 케미컬 앤드 사이언티픽 코포레이션사; 미국 뉴욕주 웨스트베리 소재)을 사용하여 단리하고 다양한 농도 (10-1000 ng/ml)의 융합 단백질과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 유세포 측정 분석법을 위해 세포를 각각의 융합 단백질에 대한 플루오레세인-표지 항체로, 또한 다양한 세포 표면 분자, 예컨대 CD4 및 CD8에 대한 항체의 조합으로 염색하였다. 세포를 음성 대조군으로서 사용되는 재조합 코어 SA와 함께 인큐베이션하였다.
시험관내에서 종양 섬유아세포를 활성화하는 LIGHT의 능력을 하기와 같이 동물 모델에서 시험할 수 있다. 간략하게 말하면, B6 마우스에 1 x 105개의 생존가능한 유전적 동계 LLC 종양 세포를 피하 접종하고, 종양을 직경이 15 mm에 도달한 이후에 외과적으로 잘라내었다. 종양을 단일 세포 현탁액으로 기계적으로 가공하고 다양한 시간 (2-5일) 동안 다양한 양의 LIGHT 단백질 (1-5000 ng/ml)의 존재하에 배양하였다. 배양액 상등액을 채취하여 실시예 1에서 논의된 바와 같이 ELISA에 의해 CCL21 케모카인의 존재에 대해 검사하였다. LIGHT가 없거나 또는 CSA 대조 단백질을 함유한 배양액, 및 플레이트-결합된 LIGHT와 함께 인큐베이션된 배양액이 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용되었다.
LLC 세포의 표면 상에 디스플레이된 면역 보조자극성 융합 폴리펩티드를 면역 활성화를 위한 보조자극성 분자로서 기능하는 능력에 대해 검사할 수 있다. 동물 모델에서, LLC 세포는 MHC 클래스 I 분자를 최소로 발현하고 검출가능한 수준의 클래스 II 항원 또는 보조자극성 분자 (예를 들면, LIGHT, CD80, 또는 4-1BBL)를 발현하지 않는다. 따라서, LLC 세포는 동종이형 T 세포를 자극할 수 없다. 혼합형 림프구 반응 (MLR) 분석법을 사용하여 융합 단백질이 종양 세포를 생산적 T 세포 반응의 발생을 위한 전문적인 APC로 전환시킬 수 있는지를 검사하였다. 간략하게 말하면, 종양 세포 (1 x 106)를 PBS 1 ml 중의 EZ-링크(상표명) 술포-NHS-LC-비오틴 (5 μM)으로 30분 동안 실온에서 비오틴화하였다. PBS로 수차례 세척한 후에, 비오틴화된 세포를 면역 보조자극기-CSA 융합 폴리펩티드 (50-100 ng/단백질/106개 세포)와 함께 개별적으로 또는 다양하게 조합하여 45분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. PBS로 수차례 세척한 후에, 세포 표면 상의 키메라 분자의 존재를 적절한 플루오레세인-접합된 모노클로날 항체를 사용하여 유세포 측정법에 의해 측정하였다. 이들 세포를 100 Gy에서 방사선 조사하여 나이브 유전적 동계 (B6) 또는 동종이형 (BALB/c) 동물로부터 채취한 림프구와 함께 1:1의 비율로 자극인자로서 사용하였다. 배양액에 18시간 동안 3[H] 티미딘을 적용한 후에, 채취하여 DNA-도입된 방사성에 의해 평가한 세포 증식을 측정하였다. 세포를 배양 후 3, 4, 및 5일 째에 채취하여 증식의 동역학을 측정하였다. 대조군은 반응자 단독, 자극인자 단독, 및 대조 SA가 부착된 종양 세포와 함께 공동-인큐베이션된 반응자를 포함하였다.
LIGHT 분자를 함유하는 융합 폴리펩티드는 CCL21의 분비를 위해 종양 기질 세포를 자극할 수 있고, 종양 세포의 표면 상에 디스플레이되었을 때, 시험관내에서 효과적인 T 세포 증식성 반응을 발달시킬 수 있다.
C. 보조자극성 폴리펩티드의 조합물로의 엔지니어링
면역 보조자극성 폴리펩티드, 예컨대 LIGHT, CD80, 4-1BBL, CD40L, OX40L, PD-L1 및 GL50은 상승적 방식으로 부가적으로 또한 잠재적으로 함께 기능할 수 있다. 이는 단 1개의 면역 보조자극성 폴리펩티드가 세포 표면 상에 디스플레이되었을 때보다 종양 세포가 2개 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드의 조합으로 엔지니어링되었을 때 관찰된 증식 효과가 더 크다는 것을 의미한다.
D. 조합물 생체내 엔지니어링의 평가
다음이 생체내에서 엔지니어링된 종양 세포의 표면 상의 키메라 LIGHT, CD80, 4-1BBL, CD40L, OX40L, PD-L1 또는 GL50 단백질의 수준 및 지속성을 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 연구는 또한 단백질이 조합되어 및/또는 순차적으로 종양 세포의 표면 상에 디스플레이될 수 있는지를 시험하고, 그의 세표 표면 턴오버 동역학을 측정하는데 사용될 수 있다.
종양 세포의 95％를 초과한 종양 세포를 변형시키고 5일 동안 종양 세포의 50％ 이상에서 비오틴이 지속되는 것을 가능하게 하는 비오틴 농도가 생체내 종양 엔지니어링에 사용되었다. 종양 미세환경 내의 유리 비오틴이 융합 단백질과의 결합에 대하여 세포 표면 비오틴과 경쟁할 수 있기 때문에 비오틴 주입 후 다양한 시점에서 면역 보조자극성 융합 단백질로의 엔지니어링을 평가하였다. 1 mM 비오틴으로 비오틴화하고, 이어서 24시간 후에 CD80 40 ㎍을 주입하는 것은 비오틴 양성 세포의 >80％에서 단백질을 디스플레이하는데 있어서 효과적임이 관찰되었다. 예를 들면, 두가지 용량의 면역 보조자극성 폴리펩티드 융합 단백질 (20 및 200 ㎍/종양)을 시험하여, 종양 세포 상에서의 그의 디스플레이 효과에 대한 주요 영향 없이 단백질이 종양으로 투여될 수 있는 비오틴화 후의 최단 지속시간을 측정하였다. 이 시점이 나머지 연구 동안 비오틴화 후의 융합 단백질의 종양내 주입을 위해 사용되었다.
비오틴화된 종양에 다양한 농도의 면역 보조자극성 융합 폴리펩티드를 단독으로, 조합하여, 또는 순차적으로 주입하였다. 종양을 단백질 주입 후 다양한 경과일에 채취하여, 단일 세포 현탁액으로 제조하고, 각각의 단백질에 대한 형광물질-접합 항체를 사용하여 멀티컬러 유세포 측정법으로 분석하였다. 집단마다 7마리의 동물을 사용하였다. 동물을 생존 및 종양 성장에 대하여 면밀히 모니터링하였다.
보다 고용량의 융합 단백질이 비오틴화된 종양 세포 표면 상의 보다 높은 수준의 단백질 디스플레이를 초래할 것이고, 비오틴이 포화되지 않는 한 단백질 지속성의 동역학을 연장할 것으로 기대된다. 비오틴 자리가 포화되면, 상기 두 파라미터는 안정 수준이 될 것이다. 비오틴의 세포 표면 동역학이 비오틴이 접합된 세포 표면 분자의 정상적인 턴오버 및 세포 분열의 함수로서 비오틴의 희석에 의해 거의 조절된다면, 융합 단백질 수준은 다양할 것으로 기대된다. 또한, 세포 표면 턴오버의 동역학은 본 발명자의 선행 공개 연구를 토대로 부분적으로 단백질-의존성일 것으로 기대된다.
종양 수축이 단백질 턴오버 동역학의 정확한 평가 및 장기 연구를 복잡하게 할 수 있는 면역 보조자극성 단백질에 의해 도출된 항종양 면역의 결과로서 관찰될 수 있음을 기억해야 한다. 이러한 효과는 모든 3종의 단백질이 동시에 또는 순차적으로 공동-디스플레이될 때 증폭될 수 있다.
E. 생체내 엔지니어링된 종양 세포의 치료 효능
2개 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드, 예컨대 LIGHT, CD80, 4-1BBL, CD40L, OX40L, PD-L1 및 GL50의 조합물로 생체내에서 엔지니어링된 종양 세포의 치료 효능을 하기와 같이 평가하였다.
상술한 바와 같이, 종양 내 LIGHT, CD80, 4-1BBL, CD40L, OX40L, PD-L1 및/또는 GL50의 공동-디스플레이는 종양 기질을 자극하여 림프구의 종양 부위로의 보충을 위해 필요한 다양한 케모카인을 분비하도록 할 뿐만 아니라, 종양 세포를 보조자극성 시그널을 제공함으로써 종양 침윤 T 세포를 직접적으로 활성화할 수 있는 반응 능력이 있는 APC로 전환시킬 것이다. 이는 그의 공격적인 성장, 전이성 거동, 및 최적 수준의 보조자극성 분자의 부족으로 인해 선택된 LLC 고형 폐 종양 모델을 사용하여 입증될 수 있다.
동물을 여러 면역학적 파라미터에 대해 모니터링하며, 특히 CD8+ T 세포, 케모카인, 및 Th1 시토카인 반응에 중점을 둔다. 이들 반응은 면역요법의 효능과 상관관계가 있다.
암 세포는 흔히 종양 회피를 위한 보조자극성 시그널이 부족하거나 이를 조종한다. 또한, 종양 기질은 물리적 및 면역학적 장벽으로서 기능함으로써 종양 발달에 기여한다. 그러나, 종양 기질은 다양한 면역학적 수용체, 예컨대 LTβR을 발현한다. 종양 기질 세포 상의 LTβR과 LIGHT의 체결은 종양 기질 내의 섬유아세포를 자극함으로써 다양한 케모카인, 예컨대 CCL21, Mig, 및 IP10을 합성하여 이들을 분비한다. 따라서, 종양 내의 LIGHT, CD80, 4-1BBL, CD40L, OX40L, PD-L1 및/또는 GL50의 공동-디스플레이는 종양 기질을 자극하여 림프구가 종양 부위로 보충되도록 하기 위해 필요한 다양한 케모카인을 분비하도록 하고, 또한 종양 세포를 보조자극성 시그널을 제공함으로써 종양 침윤 T 세포를 직접적으로 활성화할 수 있는 반응 능력이 있는 APC로 전환시킨다. 종양 세포를 엔지니어링하는데 사용되는 하나 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드의 조합물은 종양 기질을 조절하고 그의 면역억제 기능을 면역자극 기능으로 전환할 수 있다.
기계학적 연구를 수행하여 효과적인 요법과 관련된 면역 파라미터를 확인한다. 기계학적 연구는 (1) CD4, CD8, 및 CD25 마커를 사용하는 종양에 침윤하는 T 세포의 표현형검사; 및 (2) Th1 반응을 위한 시그네이쳐(signature) 시토카인으로서의 종양내 IFN-γ 및 IL-12, 면역 억제 시토카인으로서의 IL-10 및 TGF-β, 및 CCL21 케모카인의 분석을 포함한다.
CCL21 케모카인은 종양 기질 세포 상의 LTβR과 LIGHT의 체결의 결과로서 합성된다. 간략하게 말하면, 면역 보조자극성 융합 단백질로의 생체내 엔지니어링 이후 다양한 시간에 (3, 6, 9일), 단백질 디스플레이 방법이 효과적인 면역요법을 초래한 동물로부터 종양을 잘라내어 단일 세포 현탁액으로 기계적으로 가공하였다. 세포의 일부를 전체 RNA 추출을 위해 사용하고, 한편 나머지 세포를 CD4, CD8, 및 CD25에 대한 상이한 형광물질-접합 항체로 염색하고 멀티컬러 유세포 측정법으로 분석하였다.
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 RT-PCR에서 시토카인-특이적 프라이머를 사용하여 시토카인 분석을 수행하였다. 또한, 종양 세포에 대한 CD8+ T 세포 세포독성 반응을 검사하였다. 간략하게 말하면, 종양 유출 LN 세포를 면역요법이 성공적인, 또한 비성공적인 동물로부터 개별적으로 채취하여, IL-2의 존재하에 5일 동안 방사선 조사한 LLC 세포와 함께 공동-인큐베이션하였다. 이펙터 세포를 Ficoll 구배를 사용하여 채취하여, 표준 세포독성 분석법에서 다양한 이펙터 대 표적 비율로 생존 LLC 세포에 대해 시험하였다 (문헌 [Singh et al., 2003, Cancer Res., 63:4067-73]). 면역요법이 실패한 동물로부터의 종양으로 유사한 분석을 하였다. BALB/c로부터의 A20 B 세포 림프종 세포를 제3 표적으로서 사용하여 사멸 반응의 항원 특이성을 측정하였다.
종양 세포 표면을 단독의 LIGHT로 엔지니어링함으로써 나이브 T 세포 및 DC 의 종양 부위로의 보충을 촉진할 수 있고 이펙터 기능을 획득하도록 이들 세포의 활성화 및 분화를 유도할 수 있다. 그러나, LIGHT, CD80 및 4-1BBL의 공동-디스플레이는 Th1 반응을 발생시키는데 있어서의 이들 분자의 상승적 효과 및 Th1형 시토카인의 합성 및 이용을 위해 DC를 활성화하는 4-1BBL의 능력 때문에 보다 효과적인 종양 면역요법을 제공할 것으로 기대된다. 추가로, 4-1BBL은 또한 장기 지속되는 방어를 위한 CD8+ T 세포의 장기 기억 및 이펙터 기능에 기여할 수 있다.
종양의 완전한 근절은 면역 보조자극성 폴리펩티드의 종양으로의 반복된 도입을 요할 수 있다. 이는 종양의 재-비오틴화 없이 비오틴화한 첫주 이내에 달성될 수 있다. 그 이후의 시간에, 종양을 재-비오틴화한 다음 다시 융합 단백질을 부착할 수 있다.
종양 근절의 실패는 융합 단백질에 대한 항체, 특히 융합 단백질의 SA 부분에 대한 항체의 유도 때문일 수 있다. 면역 보조자극기-SA 융합 단백질의 종양으로의 직접적인 주입은 전신성 주입과 비교하여 항체-차단에 대해 보다 작은 감수성을 가질 가능성이 있다. 이는 B 림프종 모델을 이용한 선행 공개된 결과와 일치한다 (CD80 분자를 디스플레이하도록 생체외에서 조작된 종양 세포가 효과적인 종양 백신으로서 사용될 수 있음을 입증하는 문헌 [Singh et al., 2003, Cancer Res., 63:4067-73] 참조).
별법으로, 면역 보조자극성 융합 단백질은 스트렙타비딘 대신 아비딘을 이용하여 생산될 수 있다. 아비딘은 단백질 수준에서 스트렙타비딘과 완전한 상동성을 공유하지 않는다. 따라서, 스트렙타비딘 또는 아비딘을 함유하는 융합 단백질은 항체 무력화를 최소화하는데 상호교환하여 사용될 수 있다. 추가적으로 또는 별법으로, 상기 기재된 바와 같이, 감소된 면역원성을 갖는 아비딘 및 스트렙타비딘의 변형 형태, 예컨대 림프구 에피토프의 제거에 의해 변형된 형태가 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
활성화된 표현형 (CD25+)을 갖는 다수의 종양내 CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 높은 수준의 IFN-γ, IL-12, 및 CCL21 전사체가 면역요법이 효과적인 동물에서 관찰된다. 이와 전혀 다르게, 요법이 실패한 동물은 종양 내에 최소의 림프구 침윤이 나타나고 높은 수준의 IL-10 및 TGF-β를 발현하는 것으로 예상된다. 이와 유사하게, 효과적인 요법은 종양에 대하여 효과적인 CD8+ T 세포 사멸 반응을 발달시키는 것으로 예상된다.
본 발명이 본 발명을 달성하고 사용할 당업자를 위해 충분히 상세하게 설명되었고 예시되었지만, 다양한 변경, 변형 및 개선이 본 발명의 취지 및 범주로부터 이탈함이 없이 자명해야 한다. 본원에 제공된 실시예는 바람직한 실시양태를 대표하는 것이며, 예시적이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 실시예에서의 변형 및 다른 용법이 당업자에게 있을 것이다. 이러한 변형이 본 발명의 취지 내에 포함되고 청구항의 범주에 의해 한정된다.
본 발명의 범주 및 취지로부터 이탈함이 없이 본원에 기재된 발명에 대한 다양한 대체 및 변형이 만들어질 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공개문헌은 본 발명이 관련된 업계의 숙련인의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공개문헌은 각각의 공개문헌이 구체적으로, 또한 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 언급되는 것과 동일한 정도로 참고로 본원에 포함된다.
본원에 예시적으로 설명된 본 발명은 적합하게 본원에 구체적으로 기재되지 않은 임의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들 없이 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원의 각각의 경우에 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"은 나머지 두 용어로 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한하는 것이 아니라 설명하는 측면에서 사용되며, 이러한 용어 및 표현을 사용할 때 나타나 있고 기재된 특징 또는 그의 일부의 임의의 등가물을 제외하는 의도는 없으며, 다양한 변형이 청구된 본 발명의 범주 내에서 가능할 것임이 인지된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 실시양태 및 선택적 특징에 의해 구체적으로 기재되었지만, 기재된 본원의 개념의 변형 및 변화가 당업자에 의해 좌우될 수 있으며, 이러한 변형 및 변화가 첨부된 청구항에 의해 한정된 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주됨이 이해되어야 한다.
다른 실시양태가 하기 청구항에 설명되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> UNIVERSITY OF LOUISVILLE RESEARCH FOUNDATION, INC. <120> IN VIVO CELL SURFACE ENGINEERING <130> 060592-0137 <140> PCT/US2006/046663 <141> 2006-12-07 <150> 60/748,177 <151> 2005-12-08 <150> 60/771,179 <151> 2006-02-06 <150> 60/799,643 <151> 2006-05-12 <150> 60/863,173 <151> 2006-10-27 <160> 13 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 1213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic nucleotide construct <400> 1 acccgtgtgt aaagccgcgt ttccaaaatg tataaaaccg agagcatctg gccaatgtgc 60 atcagttgtg gtcagcagca aaatcaagtg aatcatctca gtgcaactaa aggggggatc 120 cgatctcaat atgaagttat gcatattact ggccgtcgtg gcctttgttg gcctctcgct 180 cgggagatct catcatcacc atcaccatat caccggcacc tggtacaacc agctcggctc 240 gaccttcatc gtgaccgcgg gcgccgatgg cgccctgacc ggaacctacg agtcggccgt 300 cggcaacgcc gagagccgct acgtcctgac cggtcgttac gacagcgccc cggccaccga 360 cggcagcggc accgccctcg gttggacggt ggcctggaag aataactacc gcaacgccca 420 ctccgcgacc acgtggagcg 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Artificial Sequence: Synthetic fusion protein <400> 2 Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Val Gly Leu Ser 1 5 10 15 Leu Gly Arg Ser His His His His His His Ile Thr Gly Thr Trp Tyr 20 25 30 Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala 35 40 45 Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr 50 55 60 Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly 65 70 75 80 Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala 85 90 95 His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala 100 105 110 Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Ala Thr Glu Ala Asn 115 120 125 Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys 130 135 140 Pro Ser Ala Ala Ser Ser Glu Phe Gln Arg Ser His Gln Ala Asn Pro 145 150 155 160 Ala Ala His Leu Thr Gly Ala Asn Ala Ser Leu Ile Gly Ile Gly Gly 165 170 175 Pro Leu Leu Trp Glu Thr Arg Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu 180 185 190 Thr Tyr His Asp Gly Ala Leu Val Thr Met Glu 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ccacattcct agatctcatc 780 atcaccatca ccatatcacc ggcacctggt acaaccagct cggctcgacc ttcatcgtga 840 ccgcgggcgc cgacggcgcc ctgaccggaa cctacgagtc ggccgtcggc aacgccgaga 900 gccgctacgt cctgaccggt cgttacgaca gcgccccggc caccgacggc agcggcaccg 960 ccctcggttg gacggtggcc tggaagaata actaccgcaa cgcccactcc gcgaccacgt 1020 ggagcggcca gtacgtcggc ggcgccgagg cgaggatcaa cacccagtgg ctgttgacct 1080 ccggcgccac cgaggccaac gcctggaagt ccacgctggt cggccacgac accttcacca 1140 aggtgaagcc gtccgccgcc tcaagccgaa ttctgcagat atccagcaca gtggcggccg 1200 ctcgagtcta gagggccctt cgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtctcgat 1260 tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cattgagttt aaacccgctg atcagcctcg 1320 actgtgcttt ctaa 1334 <210> 9 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic fusion protein <400> 9 Met Lys Leu Cys Ile Leu Leu Ala Val Val Ala Phe Val Gly Leu Ser 1 5 10 15 Leu Gly Arg Ser Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr 20 25 30 Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn 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Ile Thr Gly Thr 245 250 255 Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp 260 265 270 Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser 275 280 285 Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly 290 295 300 Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg 305 310 315 320 Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala 325 330 335 Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Ala Thr Glu 340 345 350 Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys 355 360 365 Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ser 370 375 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 11 Phe Glu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 12 Leu Gln Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ser 1 5 10 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 13 His His His His His His 1 5

Claims (36)

  1. 하나 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드를 디스플레이하기 위한 세포를 함유하는 개체에게
    a) 결합쌍의 제1 구성원 및 세포의 표면에 결합하는 분자를 포함하는 이기능성 분자;
    b) 제1 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 상기 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제1 면역 보조자극성 잔기; 및 임의로는
    c) 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 상기 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제2 면역 보조자극성 잔기
    를 투여하는 것을 포함하며,
    여기서, 상기 제1 및 임의적인 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드는 상기 결합쌍의 상기 제1 구성원과 상기 결합쌍의 상기 제2 구성원 사이의 결합을 통해 상기 세포 표면 상에 디스플레이되고,
    상기 제1 및 임의적인 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드 중 하나 이상은 CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF 및 APRIL로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,
    하나 이상의 면역 보조자극성 폴리펩티드를 디스플레이하기 위한 세포 표면의 엔지니어링 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 표면이 종양 세포 표면인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 결합쌍의 제1 구성원을 포함하는 상기 이기능성 분자를 종양내 주입을 통해 투여하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 제1 및 임의적인 제2 면역 보조자극성 잔기 중 하나 이상을 종양내 주입을 통해 투여하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 임의적인 제2 면역 보조자극성 잔기를 투여하고, 상기 제1 및 제2 면역 보조자극성 잔기를 실질적으로 동시에 투여하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 임의적인 제2 면역 보조자극성 잔기를 투여하고, 상기 제1 및 제2 면역 보조자극성 잔기를 서로 다른 날에 순차적으로 투여하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 면역 보조자극성 잔기를 초기에 디스플레이하는 세포의 약 5％ 이상이 주입한지 약 2일 후에 계속해서 상기 제1 또는 제2 면역 보조자극성 잔기를 디스플레이하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 결합쌍의 상기 제1 구성원이 비오틴을 포함하고 상기 결합쌍의 상기 제2 구성원이 코어 스트렙타비딘을 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 임의적인 제2 면역 보조자극성 잔기를 투여하고, 상기 제1 및 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드가 CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 제3 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 상기 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제3 면역 보조자극성 잔기를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 면역 보조자극성 폴리펩티드 중 2개 이상이 CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 면역 보조자극성 폴리펩티드가 LIGHT, CD80 및 4-1BBL인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 면역 보조자극성 잔기 중 하나 이상을 상기 제1, 제2 및 제3 면역 보조자극성 잔기 중의 나머지 하나 이상과 상이한 경로로 투여하는 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 면역 보조자극성 잔기를 각각 동일한 경로로 투여하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 면역 보조자극성 잔기를 단일 조성물의 구성요소로서 투여하는 방법.
  16. 제1 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 구성원을 포함하는 제1 융합 단백질 및
    제2 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 동일한 구성원을 포함하는 제2 융합 단백질
    을 포함하며, 여기서 상기 면역 보조자극성 폴리펩티드 중 하나 이상은 CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF 및 APRIL로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제1 및 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드가 CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 결합쌍의 상기 구성원이 코어 스트렙타비딘을 포함하는 것 인 조성물.
  19. 제16항에 있어서, 상기 융합 단백질 중 하나 이상이 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 7 및 서열 9로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 조성물.
  20. 제16항에 있어서, LIGHT 및 결합쌍의 상기 구성원을 포함하는 가용성 융합 단백질, CD80 및 결합쌍의 상기 구성원을 포함하는 가용성 융합 단백질, 및 4-1BBL 및 결합쌍의 상기 구성원을 포함하는 가용성 융합 단백질을 포함하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 결합쌍의 상기 구성원이 코어 스트렙타비딘을 포함하는 것인 조성물.
  22. 제1 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 구성원을 포함하는 제1 융합 단백질을 포함하는 제1 조성물 및
    제2 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 동일한 구성원을 포함하는 제2 융합 단백질을 포함하는 제2 조성물
    을 포함하며, 여기서 상기 면역 보조자극성 폴리펩티드 중 하나 이상은 CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF 및 APRIL로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조합물.
  23. 제19항에 있어서, 상기 제1 및 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드가 CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF, APRIL, CD80 및 CD40L로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조합물.
  24. 제22항에 있어서, 결합쌍의 상기 구성원이 스트렙타비딘을 포함하는 것인 조합물.
  25. 제22항에 있어서, 상기 융합 단백질 중 하나 이상이 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 7 및 서열 9로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 조합물.
  26. 제22항에 있어서, LIGHT 및 결합쌍의 상기 구성원을 포함하는 가용성 융합 단백질을 포함하는 조성물, CD80 및 결합쌍의 상기 구성원을 포함하는 가용성 융합 단백질을 포함하는 조성물, 및 4-1BBL 및 결합쌍의 상기 구성원을 포함하는 가용성 융합 단백질을 포함하는 조성물을 포함하는 조합물.
  27. 종양을 함유하는 개체에게
    a) 결합쌍의 제1 구성원 및 종양의 종양 세포의 표면에 결합하는 분자를 포함하는 이기능성 분자;
    b) 제1 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 상기 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제1 면역 보조자극성 잔기; 및 임의로는
    c) 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 상기 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 제2 면역 보조자극성 잔기
    를 투여하는 것을 포함하며,
    여기서, 상기 제1 및 임의적인 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드는 상기 결합쌍의 상기 제1 구성원과 상기 결합쌍의 상기 제2 구성원 사이의 결합을 통해 상기 종양 세포 표면 상에 디스플레이되고,
    상기 제1 및 임의적인 제2 면역 보조자극성 폴리펩티드 중 하나 이상은 CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF 및 APRIL로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,
    상기 종양의 크기를 줄이거나 또는 종양 성장을 억제하는 방법.
  28. 세포 표면을
    a) 결합쌍의 제1 구성원 및 상기 세포의 표면에 결합하는 분자를 포함하는 이기능성 분자; 및
    b) 면역 보조자극성 분자 및 상기 결합쌍의 제2 구성원을 포함하는 면역 보조자극성 잔기
    와 접촉시키는 것을 포함하며,
    여기서, 상기 면역 보조자극성 폴리펩티드는 CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF 및 APRIL로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    상기 면역 보조자극성 폴리펩티드는 상기 결합쌍의 상기 제1 구성원과 상기 결합쌍의 상기 제2 구성원 사이의 결합을 통해 상기 세포 표면 상에 디스플레이되는 것인,
    면역 보조자극성 폴리펩티드를 디스플레이하기 위한 세포 표면의 엔지니어링 방법.
  29. 제28항에 있어서, 시험관내에서 달성되는 방법.
  30. 제28항에 있어서, 생체내에서 달성되는 방법.
  31. 제28항에 있어서, 결합쌍의 상기 제1 구성원이 비오틴을 포함하고 결합쌍의 상기 제2 구성원이 아비딘 및 스트렙타비딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 스트렙타비딘이 코어 스트렙타비딘인 방법.
  33. CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF 및 APRIL로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 구성원을 포함하는 키메라 단백질.
  34. 제33항에 있어서, 결합쌍의 상기 구성원이 아비딘 및 스트렙타비딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키메라 단백질.
  35. 제34항에 있어서, 상기 스트렙타비딘이 코어 스트렙타비딘인 키메라 단백질.
  36. CD86, ICOSL, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF 및 APRIL로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 보조자극성 폴리펩티드 및 결합쌍의 구성원을 포함하는 키메라 단백질, 및
    제약상 허용되는 담체
    를 포함하는 제약 조성물.
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