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KR102258460B1 - 온코스타틴 m 수용체 항원 결합 단백질 - Google Patents

온코스타틴 m 수용체 항원 결합 단백질 Download PDF

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KR102258460B1
KR102258460B1 KR1020187021007A KR20187021007A KR102258460B1 KR 102258460 B1 KR102258460 B1 KR 102258460B1 KR 1020187021007 A KR1020187021007 A KR 1020187021007A KR 20187021007 A KR20187021007 A KR 20187021007A KR 102258460 B1 KR102258460 B1 KR 102258460B1
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Abstract

본 발명은 항-온코스타틴 M 수용체- (OSMR) 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체 및 그것의 기능적 단편, 유도체, 뮤테인, 및 변이체를 제공한다. OSMR 항원 결합 단백질은 OSM 및/또는 IL-31의 OSMR에의 결합을 방해한다. 일부 구현예에서, 항-OSMR 항원 결합 단백질은 OSMR과 연관된 질환 및 장애를 연구하는데 유용한 도구이고 OSMR 및 OSM 및/또는 IL-31의 OSMR에의 결합과 연관된 질환 및 장애를 치료하는 방법에서 특히 유용하다.

Description

온코스타틴 M 수용체 항원 결합 단백질{ONCOSTATIN M RECEPTOR ANTIGEN BINDING PROTEINS}
관련 출원들에 대한 교차참조
본원은 2013년 5월 30일에 출원된 미국 가출원 제61/829,082호에 대해 우선권의 이익을 주장하며, 이 내용은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
온코스타틴 M (OSM) 및 인터루킨-31 (IL-31)은 IL-6 슈퍼패밀리의 멤버이며 수용체 서브유닛, 온코스타틴 M 수용체-β (OSMR)를 공유한다 (Dillon 등, Nat. Immunol. 5(7): 752-60, 2004). IL-31을 제외한 이 패밀리의 모든 멤버들은 이들의 다량체성 수용체 복합체 내에 당단백질 130 (gp130)의 공통의 사슬을 공유한다. OSM은 OSMR 및 gp130을 함유하는 이형이량체 수용체 복합체를 통해 신호를 전달하는 반면, IL-31은 OSMR과 조합하여, gp130-유사 수용체인 IL-31R을 이용한다 (Dillon 등, supra; Dreuw 등, J. Biol. Chem. 279(34): 36112-20, 2004). 일반적으로, OSMR 및 gp130은 조직 및 세포 유형 전체에 아주 흔하게 발현되며, 다양한 자극 조건하에 유도될 수 있다. IL-31R 발현은 상대적으로 더 제한적이며 강력히 조절되는 것으로 보인다. 인간 및 마우스 모두에서, IL-31R mRNA 발현은 기도, 골격근, 흉선 및 골수와 같은 조직에서 낮은 수준으로 검출될 수 있다 (Dillon 등, supra). 발현 수준은 완전히 다르긴 하지만, IL-31R 및 OSMR은 피부 및 장관 상피 세포를 포함하는 다수의 조직에서 공동-발현되며, 이는 상기 조직이 IL-31에 반응한다는 것을 제시한다 (Dillon 등, supra; Dambacher 등, Gut 56(9): 1257-65, 2007). OSMR은 폐에서 상피 세포 상에서 항시적으로 발현되는 반면, IL-31R 발현은 폐 조직에서 무시해도 될 정도로 낮은 수준이지만, 기도 도전(airway challenge)의 다양한 방법으로 상향조절된다 (Dillon 등, supra; Jawa 등, J. Interferon Cytokine Res. 28(4): 207-19, 2008).
T 림프구, 대식세포, 및 중성구에 의해 주로 분비되어, OSM 및 IL-31 둘 모두는 염증을 수반하는 다양한 질환 상태에서 상향조절된다. OSM은 골 형성, 연골 저하, 콜레스테롤 흡수, 통증 및 염증을 포함하는 다양한 생물학적 역할에 연루되어 왔다 (Cawston 등, Arthritis Rheum. 41(10):1760-71, 1998; Hasegawa 등, Rheumatology (Oxford) 38(7): 612-7, 1999; Levy 등, J. Hepatol. 32(2): 218-26, 2000; Manicourt 등, Arthritis. Rheum. 43(2): 281-8, 2000; de Hooge 등, Am J. Pathol. 160(5):1733-43, 2002; Luzina 등, Arthritis Rheum 48(8): 2262-74, 2003; Morikawa 등, J. Neurosci. 24(8): 1941-7, 2004; Kong 등, J. Lipid Res. 46(6): 1163-71, 2005). OSM은 다양한 문맥에서 세포외 매트릭스 (ECM)의 강력한 조절물질인 것으로 입증되어 왔으며, 이는 OSM이 섬유증 (ECM의 초과) 및 연골 저하 (ECM의 파손)를 포함하는, 외견상으로 반대의 병리적 결과를 매개할 수 있음을 제시한다. 조직 유형 및 환경에 따라, 이들 효과 모두는 OSM이 과발현되거나 각각 마우스의 폐 또는 관절 내로 외인성으로 투여될 때 관찰되었다 (Richards 등, Biochem. Soc. Trans. 30(2): 107-11, 2002; Hui 등, Arthritis Rheum. 48(12): 3404-18, 2003; Rowan 등, Am. J. Pathol. 162(6): 1975-84, 2003). 또한, OSM은 이전에 이들 유형의 결과들이 존재하는 인간 병리학에서 상향조절되는 것으로 나타났다 (Cawston 등, supra; Hasegawa 등, supra; Levy 등, supra; Manicourt 등, supra; Luzina 등, supra). 주로, 국소 작용성 사이토카인 OSM은 류마티스성 관절염 (RA)을 갖는 환자의 관절로부터 활막 유체에서 (Cawston 등, supra; Manicourt 등, supra), 경피증-연관된 간질성 폐질환, 특발성 폐 섬유증 (IPF)을 갖는 환자의 기관지세척 (BAL) 유체에서 (Luzina 등, supra), 및 경변증을 갖는 환자의 간에서 (Levy 등, supra) 상향조절된다. OSM이 ECM이 미치는 제안된 영향은 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 및 MMP의 조직 억제제 (TIMP) 사이에 균형을 바꾸는 OSM의 능력에 부분적으로 기인할 수 있다. TIMP는 고 친화도로 1:1 비율로 MMP에 결합하여 MMP 단백분해 활성의 손실을 야기한다. TIMP-1 및 TIMP-3은 이전에 OSM에 의해 차별적으로 조절되어, TIMP-1의 증가 및 TIMP-3의 감소를 야기하는 것으로 나타났다 (Gatsios 등, Eur. J. Biochem. 241(1): 56-63, 1996). 세포외 기질 성분의 소화를 조절하는 것 외에도, MMP는 또한 강력한 전-섬유증 사이토카인인 TGF-β를 포함하는 수많은 단백질의 절단 및 이후의 활성화에 연루되어 있다 (Leask 등, FASEB J. 18(7): 816-27, 2004). OSM은 또한 시험관내에서 I형 콜라겐의 전사를 직접 유도할 수 있는 것으로 보고되어 왔다 (Hasegawa 등, J. Rheumatol. 25(2): 308-13, 1998).
OSM 및 IL-31 모두의 발현은 건선 및 아토피 피부염을 갖는 환자의 피부에서 발견되어 왔고, OSMR 및 IL-31R에서의 돌연변이는 전신 피부 아밀로이드증과 연결되어 왔다. IL-31의 시스템-전역 (system-wide) 형질전환 과발현은 마우스의 피부에서 소양증 염증성 반응을 유도하였다. OSM 및 IL-31 모두는 이들이 통각성 및 소양증 반응을 촉진하는 것으로 제안된 뉴런 상에서 OSMR을 통해 신호를 전달한다.
총괄적으로, 이들은 인간 질환과 관련되며, 적어도 염증, 세포외 매트릭스 리모델링, 통증, 및 소양증을 포함하는 다양한 병리학을 촉진하는 OSM 및 IL-31의 능력은 OSMR의 봉쇄가 OSMR과 연관된 많은 질환 및 장애의 치료적 중재를 위한 유용한 표적임을 제시한다.
본 발명은 상업적 생산에 적합한 특성 및 인간에서의 치료 용도를 갖는 항-OSMR 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체 및 기능적 그것의 단편을 제공한다. 항-OSMR 항원 결합 단백질은 OSMR과 연관된 질환 및 장애, 및 특히, OSM 또는 IL-31의 OSMR에의 결합과 연관된 것들을 치료하는 방법에서 유용하다. 고친화성으로 OSMR에 결합하고 OSMR에 대한 OSM 및/또는 IL-31 결합을 효과적으로 차단하고, 그렇게 함으로써 세포에서 OSMR-매개된 신호전달을 감소시키는 OSMR-결합 항체가 제공된다.
제1 측면에서, OSMR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: a) 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 서열식별번호:27, 서열식별번호:28, 또는 서열식별번호:29에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 경쇄 가변 도메인; b) 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 서열식별번호:9, 서열식별번호:10, 또는 서열식별번호:11에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 중쇄 가변 도메인; 또는c) 상기 a)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 b)의 중쇄 가변 도메인.
제1 측면의 바람직한 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: 적어도 90%, 적어도 95%를 갖거나 서열식별번호:27에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 경쇄 가변 도메인 및 적어도 90%, 적어도 95%를 갖거나 서열식별번호:9에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 적어도 90%, 적어도 95%를 갖거나 서열식별번호:28에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 경쇄 가변 도메인 및 적어도 90%, 적어도 95%를 갖거나 서열식별번호:10에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 및 적어도 90%, 적어도 95%를 갖거나 서열식별번호:29에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 경쇄 가변 도메인 및 적어도 90%, 적어도 95%를 갖거나 서열식별번호:11에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들.
서열식별번호:9에 대한 상기-정의된 서열 관련성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 OSMR 항원 결합 단백질은 서열식별번호:9의 위치 73에 상응하는 위치 에서 아스파라긴 (예를 들면, 아스파르트산) 이외의 아미노산을 임의로 함유할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 임의로 서열식별번호:53에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
서열식별번호:10에 대한 상기-정의된 서열 관련성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 OSMR 항원 결합 단백질은 서열식별번호:10의 위치 73에 상응하는 위치 에서 아스파라긴 (예를 들면, 아스파르트산) 이외의 아미노산을 임의로 함유할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 임의로 서열식별번호:54에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
제2 측면에서, OSMR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: a) 서열식별번호:27, 서열식별번호:28, 또는 서열식별번호:29에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인; b) 서열식별번호:9, 서열식별번호:10, 또는 서열식별번호:11에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인; 또는c) 상기 a)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 b)의 중쇄 가변 도메인.
제2 측면의 바람직한 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: 서열식별번호:27에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호:9에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 서열식별번호:28에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호:10에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 및 서열식별번호:29에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호:11에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들.
서열식별번호:9에 대한 상기-정의된 서열 관련성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 OSMR 항원 결합 단백질은 서열식별번호:9의 위치 73에 상응하는 위치에서 아스파라긴 (예를 들면, 아스파르트산) 이외의 아미노산을 임의로 함유할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 임의로 서열식별번호:53에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
서열식별번호:10에 대한 상기-정의된 서열 관련성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 OSMR 항원 결합 단백질은 서열식별번호:10의 위치 73에 상응하는 위치에서 아스파라긴 (예를 들면, 아스파르트산) 이외의 아미노산을 임의로 함유할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 임의로 서열식별번호:54에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
제3 측면에서, OSMR 항원 결합 단백질은 하기를 함유한다: 하기를 포함하는 경쇄 가변 도메인: a) 서열식별번호:30에서 제시된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열식별번호:33에서 제시된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 및 서열식별번호:36에서 제시된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; b) 서열식별번호:31에서 제시된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열식별번호:34에서 제시된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 및 서열식별번호:37에서 제시된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; 또는c) 서열식별번호:32에서 제시된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열식별번호:35에서 제시된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 및 서열식별번호:38에서 제시된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; 및 하기를 포함하는 중쇄 가변 도메인: d) 서열식별번호:12에서 제시된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열식별번호:15에서 제시된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 및 서열식별번호:18에서 제시된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3; e) 서열식별번호:13에서 제시된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열식별번호:16에서 제시된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 및 서열식별번호:19에서 제시된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3; 또는f) 서열식별번호:14에서 제시된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열식별번호:17에서 제시된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 및 서열식별번호:20에서 제시된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3.
제3 측면의 바람직한 OSMR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: 상기 a)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 d)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 상기 b)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 e)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 및 상기 c)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 f)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들.
상기 a)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 d)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 OSMR 항원 결합 단백질은 서열식별번호:9의 위치 73에 상응하는 위치에서 아스파라긴 (예를 들면, 아스파르트산) 이외의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 임의로 함유할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 임의로 서열식별번호:53에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
상기 b)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 e)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 OSMR 항원 결합 단백질은 서열식별번호:10의 위치 73에 상응하는 위치에서 아스파라긴 (예를 들면, 아스파르트산) 이외의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 임의로 함유할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 임의로 서열식별번호:54에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 제4 측면에서, 제1, 제2, 또는 제3 측면의 OSMR 항원 결합 단백질은 1 x 10-10 M 이하의 친화성을 갖는 인간 OSMR에 결합한다.
본 발명의 제5 측면에서, 제1, 제2, 제3, 또는 제4 측면의 OSMR 항원 결합 단백질은 인간 OSM의 인간 OSMR에의 및/또는 인간 IL-31의 인간 OSMR에의 결합을 억제한다.
본 발명의 제6 측면에서, 제1, 제2, 제3, 제4, 또는 제 5 측면의 OSMR 항원 결합 단백질은 인간 OSMR-발현 세포에서 인간 OSM-매개된 및/또는 인간 IL-31-매개된 OSMR 신호전달을 감소시킨다.
본 발명의 제7 측면에서, 제6 측면의 OSMR 항원 결합 단백질은 사이노몰구스 원숭이 OSMR-발현 세포에서 사이노몰구스 원숭이 OSM-매개된 및/또는 IL-31-매개된 OSMR 신호전달을 감소시킨다.
본 발명의 제8 측면에서, 제1, 제2, 제3, 제4, 제 5, 제6 또는 제7 측면의 OSMR 항원 결합 단백질은 항체, 예컨대 인간 항체이다. 바람직한 항체는 서열식별번호:24에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호:6에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 서열식별번호:25에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호:7에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 것들; 및 서열식별번호:26에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호:8에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 것들을 포함한다.
추가의 항체는 서열식별번호:24에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호:50에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 항체; 서열식별번호:25에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호:51에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 것들; 및 서열식별번호:26에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열식별번호:52에서 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 것들을 포함한다.
제9 측면에서, 본 발명은 OSMR 항원 결합 단백질의 하나 이상의 폴리펩타이드 성분, 예를 들면, 항체 경쇄 또는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산 또는 단리된 핵산을 제공한다. 바람직한 구현예에서 핵산은 하기를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다:
a) 서열식별번호:27, 서열식별번호:28, 또는 서열식별번호:29에서 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인;
b) 서열식별번호:9, 서열식별번호:10, 또는 서열식별번호:11에서 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인;
c) 서열식별번호:27, 서열식별번호:28, 또는 서열식별번호:29에서 제시된 아미노산 서열로부터 5개 이하 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인;
d) 서열식별번호:9, 서열식별번호:10, 또는 서열식별번호:11에서 제시된 아미노산 서열로부터 5개 이하 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인;
e) 하기를 포함하는 경쇄 가변 도메인:
i) 서열식별번호:30에서 제시된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열식별번호:33에서 제시된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 및 서열식별번호:36에서 제시된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3;
ii) 서열식별번호:31에서 제시된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열식별번호:34에서 제시된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 및 서열식별번호:37에서 제시된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3;
iii) 서열식별번호:32에서 제시된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열식별번호:35에서 제시된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 및 서열식별번호:38에서 제시된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3;
f) 하기를 포함하는 중쇄 가변 도메인:
i) 서열식별번호:12에서 제시된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열식별번호:15에서 제시된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 및 서열식별번호:18에서 제시된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3;
ii) 서열식별번호:13에서 제시된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열식별번호:16에서 제시된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 및 서열식별번호:19에서 제시된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3; 또는
iii) 서열식별번호:14에서 제시된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열식별번호:17에서 제시된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 및 서열식별번호:20에서 제시된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3.
어떤 구현예에서, 핵산 또는 단리된 핵산은 서열식별번호:53 또는 서열식별번호:54에서 제시된 아미노산 서열 을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다.
어떤 구현예에서, 핵산 또는 단리된 핵산은 서열식별번호:50, 서열식별번호:51, 또는 서열식별번호:52에서 제시된 아미노산 서열 을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다.
제9 측면의 어떤 구현예에서, 핵산 또는 단리된 핵산은 항체 경쇄를 인코딩하고 서열식별번호:21, 서열식별번호:22, 또는 서열식별번호:23에서 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일하다. 제9 측면의 다른 구현예에서, 핵산 또는 단리된 핵산은 항체 중쇄를 인코딩하고 서열식별번호:3, 서열식별번호:4, 또는 서열식별번호:5에서 제시된 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일하다.
어떤 구현예에서, 중쇄는 서열식별번호:47, 서열식별번호:48, 또는 서열식별번호:49에서 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산에 의해 인코딩된다.
제10 측면에서, 본 발명은 제8 측면 의 하나 이상의 핵산 또는 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 어떤 구현예에서, 발현 벡터는 항체 경쇄, 항체 중쇄, 또는 항체 경쇄 및 중쇄 둘 모두를 인코딩한다.
제11 측면에서, 본 발명은 프로모터에 작동가능하게 연결된 제9 측면의 하나 이상의 핵산 또는 단리된 핵산을 포함하는 재조합 숙주세포를 제공하고, 상기 숙주세포는 본 발명의 제10 측면의 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주세포를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 재조합 숙주세포는 OSMR에 결합하는 항체를 분비한다. 바람직한 숙주세포는 CHO 세포주를 포함하는 포유동물 숙주세포이다.
제12 측면에서, 본 발명은 자가면역 장애, 염증성 장애, 또는 세포외 매트릭스 침착 또는 리모델링과 연관된 장애를 치료하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 치료적으로 효과적인 양의 제1, 제2, 제3, 제4, 제 5, 제6, 제6, 제7, 또는 제8 측면 중 임의의 하나의 OSMR 항원 결합 단백질을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 서열식별번호:27에서 제시된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열식별번호:9에서 제시된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (예를 들면, Ab1), 서열식별번호:28에서 제시된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열식별번호:10에서 제시된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (예를 들면, Ab2), 또는 서열식별번호:29에서 제시된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열식별번호:11에서 제시된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체 (예를 들면, Ab3)이다. 일부 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 서열식별번호:27에서 제시된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열식별번호:53에서 제시된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체, 또는 서열식별번호:28에서 제시된 바와 같은 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열 및 서열식별번호:54에서 제시된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 바람직한 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 OSM의 OSMR에의 또는 IL-31이 OSMR에의 결합을 억제한다. 특히 바람직한 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 또는 세포외 매트릭스 침착 또는 리모델링과 연관된 장애는 섬유증, 연골 분해, 관절염, 류마티스성 관절염, 경피증, 경피증-연관된 간질성 폐 질환, 특발성 폐 섬유증, 경변증, 건선, 아토피 피부염, 전신 피부 아밀로이드증, 일차 피부 아밀로이드증, 염증, 소양증 염증, 결정성 양진, 및 통증이다.
제13 측면에서, 본 발명은 제11 측면의 재조합 숙주세포를 배양하고 상기 OSMR 항원 결합 단백질을 상기 배양물으로부터 단리하여 제1, 제2, 제3, 제4, 제 5, 제6, 제6, 제7, 또는 제8 측면 중 임의의 하나의 OSMR 항원 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
제14 측면에서, 본 발명은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 항체와 교차-경쟁하는 제1, 제2, 제3, 제4, 제 5, 제6, 제6, 제7, 또는 제8 측면 중 임의의 하나의 OSMR 항원 결합 단백질을 제공한다:
a) 서열식별번호:24에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열식별번호:6에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
b) 서열식별번호:25에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열식별번호:7에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체; 및
c) 서열식별번호:26에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열식별번호:8에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체.
본원에 사용된 섹션 제목은 단지 구조적 목적을 위한 것이며 기재된 요지를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 명세서의 본문 내에 언급된 모든 참조문헌은 그 전체가 참고로 명확히 편입된다.
표준 기술이 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 조직 배양 및 형질전환, 단백질 정제, 등을 위해 사용될 수 있다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 설명서에 따라 또는 본 기술분야에서 통상적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 하기 절차 및 기술은 당해기술에서 잘 알려진 종래의 방법에 따라 그리고 명세서 전반에 언급되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 특정한 참조문헌에서 기재된 바와 같이 일반적으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 어떤 목적을 위해 본원에 참고로 편입된 문헌[Sambrook 등, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, N.Y.]을 참고한다. 특정 정의가 제공되지 않는 한, 본원에 기재된 분석 화학, 유기 화학, 및 의료 및 약제학적 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 이의 실험실 절차 및 기술은 본 기술분야에서 잘 알려지고 통상적으로 사용되는 것이다. 표준 기술은 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제제, 제형, 및 환자의 전달 및 치료를 위해 사용될 수 있다.
OSMR
본원에 기재된 항원 결합 단백질은 OSMR에 결합한다. OSM 및 IL-31은 OSMR을 통해 신호를 전달한다. OSMR은 I형 사이토카인 수용체 패밀리의 멤버이다. OSMR은 당단백질 130 (gp130, 인터루킨 6 신호 변환체 (IL6ST), IL6-베타, 또는 CD130으로도 공지됨)과 이형이량체화하여 II형 OSMR을 형성한다. OSMR은 또한 IL-31 수용체 A (IL31RA)와 이형이량체화하여 IL-31 수용체를 형성하며, 따라서, OSM- 및 IL-31-유도된 신호전달 사건을 형질도입한다. 예시적인 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 OSMR에 결합하고 OSMR을 발현하는 세포에서 OSM- 및/또는 IL-31-매개된 신호전달을 막는다.
인간 OSMR 서열은 당해기술에 공지되어 있다. 다양한 측면에서, 인간 OSMR 단백질 서열은 Genbank Accession 번호 AAI25210, AAI25211, NP_003990, 및 EAW55976에서 제공된다. 예시적인 인간 OSMR 아미노산 서열 (서열번호: 1)은 표 1에 제공되어 있다. 상기 단백질은 몇 개의 도메인으로 구성된다: 아미노산 1-27은 포유동물 세포에서 단백질의 가공 동안 절단될 수 있는 신호 서열에 해당하고; 아미노산 28-740은 세포외 도메인에 해당하며; 아미노산 741-761은 막통과 도메인에 해당한다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 OSMR의 세포외 도메인에 결합하고 OSM 및/또는 IL-31의 OSMR과의 상호작용을 방지한다.
인간 OSM 서열은 당해기술에 공지되어 있다. 다양한 측면에서, 인간 OSM 단백질 서열은 Genbank Accession 번호 CAG30420, CAG46504, NP_065391, P13725, AAC05173, EAW59864, 및 AAH11589에서 제공된다. 예시적인 인간 OSM 아미노산 서열 (서열번호: 39)은 표 1에 제공되어 있다. 아미노산 1-25는 신호 서열에 해당하고; 아미노산 26-220은 성숙한 단백질에 해당하며; 아미노산 221-252는 프로펩타이드 서열에 해당한다.
인간 IL-31 서열은 당해기술에 공지되어 있다. 다양한 측면에서, 인간 IL-31 단백질 서열은 Genbank Accession 번호 NP_001014358, AAS86448, AAI32999, AAI33001, Q6EBC2, 및 EAW98310에서 제공된다. 예시적인 인간 IL-31 아미노산 서열 (서열번호: 41)은 표 1에 제공되어 있다. 아미노산 1-23은 추정 신호 서열에 해당한다.
인간 IL31RA 서열은 당해기술에 공지되어 있다. 다양한 측면에서, 인간 IL31RA 단백질 서열은 Genbank Accession 번호 AAS86447, NP_001229567, 및 CBL94051에서 제공된다. 예시적인 인간 IL31RA (v4, 동형체 3) 아미노산 서열 (서열번호: 43)은 표 1에 제공되어 있다. 아미노산 1-32는 신호 서열에 해당하고; 아미노산 533-553은 막통과 서열에 해당한다.
인간 gp130 서열은 당해기술에 공지되어 있다. 다양한 측면에서, 인간 gp130 단백질 서열은 Genbank Accession 번호 AAI17403, AAI17405, EAW54936, NP_002175, ABK41905, 및 AAA59155에서 제공된다. 예시적인 인간 gp130 아미노산 서열 (서열번호: 45)은 표 1에 제공되어 있다. 상기 단백질은 몇 개의 도메인으로 구성된다: 아미노산 1-22는 신호 서열에 해당하고; 아미노산 23-619는 세포외 도메인에 해당하며; 아미노산 620-641은 막통과 도메인에 해당하고; 아미노산 642-918은 세포질 도메인에 해당한다.
표 1
Figure 112018071894158-pat00001
Figure 112018071894158-pat00002
본 발명의 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 고 친화도로 인간 및 사이노몰구스 원숭이 OSMR 모두에 결합하며, 고 친화도로 결합하고 사이노몰구스 원숭이 OSMR에 대한 사이노몰구스 원숭이 OSM 및/또는 IL-31의 상호작용을 차단하는 것을 포함한다. 이들 특성은 비-인간 영장류에서 유익한 독성학 연구를 허용한다.
히말라야 원숭이 (붉은털원숭이) OSMR 단백질 서열은 본 기술분야에 공지되어 있으며 Genbank Accession XP_001083745에서 제공된다. 예시적인 사이노몰구스 원숭이 (필리핀원숭이) OSMR 아미노산 서열 (서열번호:2)은 표 2에 제공된다. 상기 단백질은 몇 개의 도메인으로 구성된다: 아미노산 1-27은 포유동물 세포에서 단백질의 가공 동안 절단될 수 있는 신호 서열에 해당하고; 아미노산 28-737은 세포외 도메인에 해당하며; 아미노산 738-757은 막통과 도메인에 해당한다. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질은 OSMR의 세포외 도메인에 결합하고 OSM 및/또는 IL-31의 OSMR과의 상호작용을 방지한다.
히말라야 원숭이 (붉은털원숭이) OSM 단백질 서열은 본 기술분야에 공지되어 있으며 Genbank Accession NP_001181403에서 제공된다. 예시적인 사이노몰구스 원숭이 (필리핀원숭이) OSM 아미노산 서열 (서열번호:40)은 표 2에 제공된다. 아미노산 1-196은 성숙한 사이노몰구스 OSM에 해당한다.
히말라야 원숭이 (붉은털원숭이) IL-31 단백질 서열은 본 기술분야에 공지되어 있으며 Genbank Accession XP_001096743에서 제공된다. 예시적인 사이노몰구스 원숭이 (필리핀원숭이) IL-31 아미노산 서열 (서열번호:42)은 표 2에 제공된다. 이 서열은 성숙한 사이노몰구스 원숭이 IL-31에 해당한다.
예시적인 사이노몰구스 원숭이 (필리핀원숭이) IL31RA 아미노산 서열 (서열번호: 44)은 표 2에 제공된다. 아미노산 1-19는 신호 서열에 해당하고; 아미노산 520-540은 막통과 도메인에 해당한다.
히말라야 원숭이 (붉은털원숭이) gp130 단백질 서열은 본 기술분야에 공지되어 있으며 Genbank Accession NP_001252920에서 제공된다. 예시적인 사이노몰구스 원숭이 (필리핀원숭이) gp130 아미노산 서열 (서열번호: 46)은 표 2에 제공된다. 상기 단백질은 몇 개의 도메인으로 구성된다: 아미노산 1-22는 신호 서열에 해당하고; 아미노산 23-619는 세포외 도메인에 해당하고; 아미노산 620-641은 막통과 도메인에 해당하며; 아미노산 642-918은 세포질 도메인에 해당한다.
표 2
Figure 112018071894158-pat00003
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OSMR 항원 결합 단백질
본 발명은 OSMR에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 항원 결합 단백질의 구현예는 OSMR에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및/또는 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 하나 이상의 번역후 변형을 임의로 포함할 수 있다. 항원 결합 단백질의 구현예는 OSMR에 특이적으로 결합하는, 본원에 다양하게 정의된 항체 및 이의 단편을 포함한다. 이들은 인간 OSMR에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하며, 이는 OSM 및/또는 IL-31이 OSMR에 결합하고/거나 활성화시키는 것을 포함한다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 OSMR에 특이적으로 결합한다. 본원에서 사용된 바와 같이 "특이적으로 결합한다"는 것은 항원 결합 단백질이 다른 단백질보다 우선적으로 OSMR에 결합한다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서 "특이적으로 결합한다"는 것은 OSMR 항원 결합 단백질이 다른 단백질보다 OSMR에 대해 더 높은 친화도를 갖는다는 것을 의미한다. OSMR에 특이적으로 결합하는 OSMR 항원 결합 단백질은 1 x 10-7 M 이하, 2 x 10-7 M 이하, 3 x 10-7 M 이하, 4 x 10-7 M 이하, 5 x 10-7 M 이하, 6 x 10-7 M 이하, 7 x 10-7 M 이하, 8 x 10-7 M 이하, 9 x 10-7 M 이하, 1 x 10-8 M 이하, 2 x 10-8 M 이하, 3 x 10-8 M 이하, 4 x 10-8 M 이하, 5 x 10-8 M 이하, 6 x 10-8 M 이하, 7 x 10-8 M 이하, 8 x 10-8 M 이하, 9 x 10-8 M 이하, 1 x 10-9 M 이하, 2 x 10-9 M 이하, 3 x 10-9 M 이하, 4 x 10-9 M 이하, 5 x 10-9 M 이하, 6 x 10-9 M 이하, 7 x 10-9 M 이하, 8 x 10-9 M 이하, 9 x 10-9 M 이하, 1 x 10-10 M 이하, 2 x 10-10 M 이하, 3 x 10-10 M 이하, 4 x 10-10 M 이하, 5 x 10-10 M 이하, 6 x 10-10 M 이하, 7 x 10-10 M 이하, 8 x 10-10 M 이하, 9 x 10-10 M 이하, 1 x 10-11 M 이하, 2 x 10-11 M 이하, 3 x 10-11 M 이하, 4 x 10-11 M 이하, 5 x 10-11 M 이하, 6 x 10-11 M 이하, 7 x 10-11 M 이하, 8 x 10-11 M 이하, 9 x 10-11 M 이하, 1 x 10-12 M 이하, 2 x 10-12 M 이하, 3 x 10-12 M 이하, 4 x 10-12 M 이하, 5 x 10-12 M 이하, 6 x 10-12 M 이하, 7 x 10-12 M 이하, 8 x 10-12 M 이하, 또는 9 x 10-12 M 이하의 인간 OSMR에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다.
항원 결합 단백질의 결합 친화도를 측정하는 방법은 당해기술에 공지되어 있다. 친화도 결정을 위해 흔히 사용되는 방법은 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (Morton 및 Myszka "Kinetic analysis of macromolecular interactions using surface plasmon resonance biosensors" Methods in Enzymology (1998) 295, 268-294), 바이오-층 간섭법 (Abdiche 등 "Determining Kinetics and Affinities of Protein Interactions Using a Parallel Real-time Label-free Biosensor, the Octet" Analytical Biochemistry (2008) 377, 209-217), 동력학 배제 분석 (KinExA) (Darling 및 Brault "Kinetic exclusion assay technology: characterization of molecular interactions" Assay and Drug Dev Tech (2004) 2, 647-657), 등온 열량측정 (Pierce 등 "Isothermal Titration Calorimetry of Protein-Protein Interactions" Methods (1999) 19, 213-221) 및 분석적 초원심분리 (Lebowitz 등 "Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review" Protein Science (2002), 11:2067-2079)를 포함한다. 실시예 5는 친화도 결정의 예시적인 방법을 제공한다.
본원의 OSMR-결합 항체의 다양한 구현예를 참조할 때, 그것은 또한 이의 OSMR-결합 단편도 포함하는 것으로 이해된다. OSMR-결합 단편은 OSMR에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 본원에 기재된 항체 단편 또는 도메인 중 어느 것을 포함한다. 상기 OSMR-결합 단편은 본원에 기재된 스캐폴드 중 어느 것일 수 있다.
어떤 치료적 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 OSM 및/또는 IL-31의 OSMR에의 결합을 억제하고/거나 OSM 및/또는 IL-31의 OSMR에의 결합과 연관된 하나 이상의 생물학적 활성, 예를 들면, OSM- 및/또는 IL-31-매개된 신호전달을 억제한다. 그러한 항원 결합 단백질은 "중화하는" 것이라 한다. 어떤 구현예에서, 중화하는 OSMR 항원 결합 단백질은 OSMR에 특이적으로 결합하고 OSM 및/또는 IL-31의 OSMR에의 결합을 10% 내지 100%, 예컨대 적어도 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과하여 억제한다. 예를 들면, OSMR 항원 결합 단백질은 OSM 및/또는 IL-31의 OSMR에의 결합을 차단하는 항원 결합 단백질의 능력을 결정함으로써 중화 능력에 대해 시험될 수 있다. 예를 들면, 각각 실시예 2 및 3의 인간 OSMR 및 사이노몰구스 OSMR 차단 분석을 참고한다. 대안적으로, OSMR 항원 결합 단백질은 OSM- 및/또는 IL-31-매개된 생물학적 기능을 측정하는 분석에서 OSMR 항원 결합 단백질의 존재의 효과를 측정하는 분석에서 중화 능력에 대해 시험될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 반응, 예컨대 배양된 소 대동맥 내피 세포에서 플라스미노겐 활성제 활성의 자극, 인간 내피 세포에서 IL-6 발현의 조절, 및 LDL 흡수의 자극 및 HepG2 세포에서 세포 표면 LDL 수용체의 상향 조절을 유도하는 OSM의 능력. 대안적으로, 피부에서 염증을 유도하는 IL-31의 능력.
항원 결합 단백질의 구현예는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 갖는, 본원에서 다양하게 정의된 바와 같은, 스캐폴드 구조를 포함한다. 구현예는 하나 이상의 항체 가변 도메인, 중쇄 또는 경쇄를 갖는 스캐폴드 구조를 포함하는 항원 결합 단백질을 추가로 포함한다. 구현예는 Ab1 경쇄 가변 도메인 (LCv), Ab2 LCv, 및 Ab3 LCv (서열번호: 27-29, 각각)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 도메인 및/또는 Ab1 중쇄 가변 도메인 (HCv), Ab2 HCv, 및 Ab3 HCv (서열번호:9-11, 각각)로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 도메인, 및 이의 단편, 유도체, 뮤테인, 및 변이체를 포함하는 항체를 포함한다.
서열번호: 9의 예시적인 중쇄 가변 도메인 변이체는 서열번호: 9에서 위치 73에 상응하는 위치에서 아스파라긴 (예를 들면, 아스파르트산) 이외의 아미노산을 함유한다. 서열번호: 53에서 제시된 아미노산 서열은 서열번호: 9의 중쇄 가변 도메인 변이체의 예이다.
서열번호: 10의 예시적인 중쇄 가변 도메인 변이체는 서열번호: 10에서 위치 73에 상응하는 위치에서 아스파라긴 (예를 들면, 아스파르트산) 이외의 아미노산을 함유한다. 서열번호: 54에서 제시된 아미노산 서열은 서열번호: 10의 중쇄 가변 도메인 변이체의 예이다.
Ab1 LCv을 포함하는 예시적인 경쇄는 서열식별번호:24에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄이다.
Ab2 LCv을 포함하는 예시적인 경쇄는 서열식별번호:25에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄이다.
Ab3 LCv을 포함하는 예시적인 경쇄는 서열식별번호:26에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄이다.
Ab1 HCv을 포함하는 예시적인 경쇄는 서열식별번호:6에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄이다.
Ab1 HCv의 변이체를 포함하는 예시적인 중쇄는 서열식별번호:50에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄이다.
Ab2 HCv을 포함하는 예시적인 경쇄는 서열식별번호:7에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄이다.
Ab2 HCv의 변이체를 포함하는 예시적인 중쇄는 서열식별번호:51에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄이다.
Ab3 HCv을 포함하는 예시적인 경쇄는 서열식별번호:8에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄이다.
Ab3 HCv의 변이체를 포함하는 예시적인 중쇄는 서열식별번호:52에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄.
구상된 스캐폴드의 추가의 예는 하기를 비제한적으로 포함한다: 파이브로넥틴, 네오카르지노스타틴 CBM4-2, 리포칼린, T-세포 수용체, 단백질 -A 도메인 (단백질 Z), Im9, TPR 단백질, 아연 핑거 도메인, pVIII, 조류 췌장 폴리펩타이드, GCN4, WW 도메인 Src 상동성 도메인 3, PDZ 도메인, TEM-1 베타-락타마제, 티오레독신, 포도상구균 뉴클레아제, PHD-핑거 도메인, CL-2, BPTI, APPI, HPSTI, 에코틴, LACI-D1, LDTI, MTI-II, 전갈 독소, 곤충 데펜신-A 펩타이드, EETI-II, Min-23, CBD, PBP, 사이토크롬 b-562, Ldl 수용체 도메인, 감마-크리스탈린, 유비퀴틴, 트랜스페린, 및 또는 C-형 렉틴-유사 도메인. 비-항체 스캐폴드 및 치료제로서 그것의 용도는 하기에서 검토된다: Gebauer 및 Skerra, Curr. Opin. Chem. Biol., 13:245-255 (2009) 및 Binz 등, Nat. Biotech., 23(10):1257-68 (2005), 이것은 본원에 그 전체가 참고로 편입되어 있다.
본 발명의 측면은 하기의 가변 도메인을 포함하는 항체를 포함한다: Ab1 LCv/Ab1 HCv (서열식별번호:27/서열식별번호:9), Ab2 LCv/Ab2 HCv (서열식별번호:28/서열식별번호:10), Ab3 LCv/Ab3 HCv (서열식별번호:29/서열식별번호:11), 및 이들의 조합, 뿐만 아니라 단편, 그것의 유도체, 뮤테인 및 변이체.
하기 가변 도메인을 포함하는 항체가 또한 포함된다: 서열식별번호:27/서열식별번호:53; 및 서열식별번호:28/서열식별번호:54.
본 발명의 예시적인 항체는 하기를 포함한다: Ab1 (서열식별번호:24/서열식별번호:6), Ab2 (서열식별번호:25/서열식별번호:7), 및 Ab3 (서열식별번호:26/서열식별번호:8).
추가의 예시적인 항체는 하기를 포함한다: 서열식별번호:24/서열식별번호:50; 서열식별번호:25/서열식별번호:51; 및 서열식별번호:26/서열식별번호:52.
전형적으로, 항체 경쇄 또는 중쇄의 각 가변 도메인은 3 개의 CDR을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 중쇄 CDR1 (HCDR1), 중쇄 CDR2 (HCDR2), 및 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 경쇄 CDR1 (LCDR1), 경쇄 CDR2 (LCDR2), 및 경쇄 CDR3 (LCDR3)을 포함한다. 어떤 구현예에서, 항원 결합 단백질은 본원에 기재된 바람직한 가변 도메인 내에 함유된 하나 이상의 CDR을 포함한다.
그와 같은 CDR의 예는, 비제한적으로 하기를 포함한다:
Ab1 LCv의 CDR: LCDR1 (서열식별번호:30), LCDR2 (서열식별번호:33), 및 LCDR3 (서열식별번호:36);
Ab2 LCv의 CDR: LCDR1 (서열식별번호:31), LCDR2 (서열식별번호:34), 및 LCDR3 (서열식별번호:37);
Ab3 LCv의 CDR: LCDR1 (서열식별번호:32), LCDR2 (서열식별번호:35), 및 LCDR3 (서열식별번호:38);
Ab1 HCv의 CDR: HCDR1 (서열식별번호:12), HCDR2 (서열식별번호:15), 및 HCDR3 (서열식별번호:18);
Ab2 HCv의 CDR: HCDR1 (서열식별번호:13), HCDR2 (서열식별번호:16), 및 HCDR3 (서열식별번호:19); 및
Ab3 HCv의 CDR: HCDR1 (서열식별번호:14), HCDR2 (서열식별번호:17), 및 HCDR3 (서열식별번호:20).
일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: a) 폴리펩타이드, 예를 들면, 서열식별번호:30, 31, 및 32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR1; 서열식별번호:33, 34, 및 35로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및/또는 서열식별번호:36, 37, 및 38로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄; 및/또는b) 폴리펩타이드, 예를 들면, 서열식별번호:12, 13, 및 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR1; 서열식별번호:15, 16, 및 17로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR2; 및/또는 서열식별번호:18, 19, 및 20로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 중쇄.
추가 구현예에서, 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: a) Ab1 LCv, Ab2 LCv, 및 Ab3 LCv 중 어떤 것 의 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 아미노산 서열 및b) Ab1 HCv, Ab2 HCv, 및 Ab3 HCv 중 어떤 것 의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 아미노산 서열.
어떤 구현예에서, CDR은 본원에서 제시된 예시적인 CDR 로부터 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 또는 6개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 포함한다.
본 발명의 측면은 서열식별번호:27, 28, 및 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 포함한다. 본 발명의 측면은 서열식별번호:9, 10, 및 11로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 포함한다. 본 발명의 추가 측면은 하기를 포함하는 항체를 포함한다: a) 서열식별번호:27, 28, 및 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 가변 도메인, 및b) 서열식별번호:9, 10, 및 11로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인.
본 발명의 항체는 당해기술에서 공지된 임의의 불변 영역을 포함할 수 있다. 경쇄 불변 영역은, 예를 들면, 하기일 수 있다: 카파- 또는 람다-형 경쇄 불변 영역, 예를 들면, 인간 카파- 또는 람다-형 경쇄 불변 영역. 중쇄 불변 영역은, 예를 들면, 하기일 수 있다: 알파-, 델타-, 엡실론-, 감마-, 또는 뮤-형 중쇄 불변 영역, 예를 들면, 인간 알파-, 델타-, 엡실론-, 감마-, 또는 뮤-형 중쇄 불변 영역. 일 구현예에서 경쇄 또는 중쇄 불변 영역은 천연 발생 불변 영역의 단편, 유도체, 변이체, 또는 뮤테인이다.
본 발명의 측면은 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 또는 10개 이하 아미노산 부가, 결실, 또는 치환 을 갖는 서열식별번호:27, 28, 및 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 본 발명의 측면은 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 또는 10개 이하 아미노산 부가, 결실, 또는 치환 을 갖는 서열식별번호:9, 10, 및 11로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 본 발명의 추가 측면은 하기를 포함하는 항체를 포함한다: a) 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 또는 10개 이하 아미노산 부가, 결실, 또는 치환 을 갖는 서열식별번호:27, 28, 및 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 가변 영역, 및b) 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 또는 10개 이하 아미노산 부가, 결실, 또는 치환 을 갖는 서열식별번호:9, 10, 및 11로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 가변 영역.
일 변화에서, 항원 결합 단백질은 서열식별번호:27, 28, 및 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 하나의 변화에서, 항원 결합 단백질은 서열식별번호:9, 10, 및 11로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 추가의 구현예에서, 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: a) 서열식별번호:27, 28, 및 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열, 및b) 서열식별번호:9, 10, 및 11로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열.
서열식별번호:9에 대한 상기-정의된 서열 관련성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 OSMR 항원 결합 단백질은 서열식별번호:9의 위치 73에 상응하는 위치에서 아스파라긴 (예를 들면, 아스파르트산) 이외의 아미노산을 임의로 함유할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 임의로 서열식별번호:53에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
서열식별번호:10에 대한 상기-정의된 서열 관련성을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 OSMR 항원 결합 단백질은 서열식별번호:10의 위치 73에 상응하는 위치에서 아스파라긴 (예를 들면, 아스파르트산) 이외의 아미노산을 임의로 함유할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 임의로 서열식별번호:54에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
어떤 구현예에서, 항원 결합 단백질은 경쇄 및/또는 중쇄 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 서열식별번호:36, 37, 38, 18, 19, 및 20에서 제시된 서열의 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 구현예에서, 아미노산 서열은 서열식별번호:36, 37, 38, 18, 19, 및 20에서 제시된 예시적인 서열로부터 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 또는 6개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 따라서, 본 발명의 구현예는 서열식별번호:36, 37, 38, 18, 19, 및 20에서 제시된 서열의 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질을 포함한다.
어떤 구현예에서, 항원 결합 단백질은 경쇄 및/또는 중쇄 CDR2을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 서열식별번호:33, 34, 35, 15, 16, 및 17에서 제시된 서열의 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 구현예에서, 아미노산 서열은 서열식별번호:33, 34, 35, 15, 16, 및 17에서 제시된 예시적인 서열로부터 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 또는 6개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 따라서, 본 발명의 구현예는 서열식별번호:33, 34, 35, 15, 16, 및 17에서 제시된 서열의 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질을 포함한다.
어떤 구현예에서, 항원 결합 단백질은 경쇄 및/또는 중쇄 CDR1을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 단백질은 서열식별번호:30, 31, 32, 12, 13, 및 14에서 제시된 서열의 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 어떤 구현예에서, 아미노산 서열은 서열식별번호:30, 31, 32, 12, 13, 및 14에서 제시된 예시적인 서열 로부터 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 또는 6개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 따라서, 본 발명의 구현예는 서열식별번호:30, 31, 32, 12, 13, 및 14에서 제시된 서열의 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질을 포함한다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 인간 및 단클론성 항체, 이중특이적 항체, 디아바디, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (본원에서 때때로 "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라성 항체, 항체 융합 (본원에서 때때로 "항체 콘주게이트"로 지칭됨), 및 각각의 단편을 포함하는, 전통적 항체의 스캐폴드를 포함한다. CDR의 다양한 조합을 포함하여, 상기 기재된 CDR은 하기 스캐폴드 중 어느 것 내로 그라프팅될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 본원에 다양하게 기재된 바와 같이, 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 다양한 형태의 단량체 또는 다량체 단백질을 지칭한다. 어떤 구현예에서, 항체는 재조합 DNA 기법에 의해 생산된다. 추가 구현예에서, 항체는 천연 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산된다. 또 하나의 측면에서, 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: a) 인간 항체; b) 인간화된 항체; c) 키메라성 항체; d) 단클론성 항체; e) 다클론성 항체; f) 재조합 항체; g) 항원-결합 단편; h) 단일 사슬 항체;i) 디아바디; j) 트리아바디, k) 테트라바디, l) Fab 단편; m) F(ab')2 단편, n) IgA 항체, o) IgD 항체, p) IgE 항체, q) IgG1 항체, r) IgG2 항체, s) IgG3 항체, t) IgG4 항체, 및 u) IgM 항체.
가변 영역 또는 도메인은 프레임워크 영역 (지정된 프레임워크 영역 FR1, FR2, FR3, 및 FR4) 내에 삽입된 적어도 3개의 중쇄 또는 경쇄 CDR을 포함한다 (Kabat 등, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD). 전통적인 항체 구조 단위는 전형적으로 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 전형적으로 2개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 사슬로 구성되고, 각각의 쌍은 하나의 "경"쇄 및 하나의 "중"쇄를 갖는다. 각 사슬의 아미노-말단부는 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카복시-말단부는 효과기 기능을 주로 담당하는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄는 카파 또는 람다 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로서 분류되고, 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 항체의 아이소타입을 정의한다. IgG는, 비제한적으로 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는, 몇 가지 서브클래스를 갖는다. IgM은, 비제한적으로 IgM1 및 IgM2를 포함하는 서브클래스를 갖는다. 본 발명의 구현에는 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 단백질의 가변 도메인 또는 CDR을 포함하는 항체의 모든 그러한 클래스 및 서브클래스를 포함한다.
낙타와 라마에서 발견되는 것과 같은 일부 천연 발생 항체들은 2개의 중쇄로 이루어진 이합체이고 경쇄를 포함하지 않는다. 본 발명은 OSMR에 결합할 수 있는, 2개의 중쇄의 이합체 항체, 또는 그것의 단편을 포함한다.
중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 전형적으로 3개의 초가변 영역, 즉 상보성 결정 영역 또는 CDR에 의해 연결된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역 (FR)의 동일한 일반적인 구조를 나타낸다. CDR은 주로 항원 인식 및 결합을 담당한다. 각 쌍의 2개의 사슬 유래의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 정렬되며, 이는 특정 에피토프에의 결합을 가능하게 한다. N-말단부터 C-말단까지, 두 경쇄 및 중쇄는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 배정은 카바트(Kabat)의 정의에 따른다.
CDR은 항원 결합을 위한 주요 표면 접점을 구성한다. CDR3 또는 경쇄 및, 특히, 중쇄의 CDR3은 경쇄 및 중쇄 가변 영역 내에서 항원 결합에서 가장 중요한 결정인자를 구성할 수 있다. 일부 항체에서, 중쇄 CDR3은 항원 및 항체 사이의 주요 접촉면을 구성하는 것으로 보인다. CDR3만이 달라지는 시험관내 선택 도식이 항체의 결합 특성에 변화를 주거나 또는 어느 잔기가 항원의 결합에 기여하는지 결정하는데 사용될 수 있다.
천연 발생 항체는 전형적으로 신호 서열을 포함하고, 이는항체를 단백질 분비를 위한 세포성 경로로 보내고, 성숙한 항체에서는 존재하지 않는다. 본 발명의 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 아래에서 기재된 바와 같이 천연 발생 신호 서열 또는 이종성 신호 서열을 인코딩할 수 있다.
일 구현예에서, 항원 결합 단백질은 본원에 기재된 1 내지 6개의 예시적인 CDR을 포함하는 항체이다. 본 발명의 항체는 IgM, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4를 포함함), IgD, IgA, 또는 IgE 항체를 포함하는 임의의 유형일 수 있다. 특정한 구현예에서 항원 결합 단백질은 IgG 유형 항체, 예를 들면, IgG1 항체이다.
일부 구현예에서, 예를 들면 항원 결합 단백질이 완전한 중쇄 및 경쇄를 갖는 항체일 경우, CDR은 모두 동일한 종, 예를 들면, 인간으로부터 유래된다. 대안적으로, 예를 들면 항원 결합 단백질이 상기 개괄된 서열 유래의 6개 미만의 CDR을 함유하는 구현예에서, 추가의 CDR은 다른 종 유래일 수 있거나 또는 예시적인 서열 내에 묘사된 것과 상이한 인간 CDR일 수 있다. 예를 들면, 본원에서 확인된 적절한 서열 유래의 HCDR3 및 LCDR3 영역은 대안적인 종 또는 상이한 인간 항체 서열, 또는 이들의 조합으로부터 임의로 선택되는 HCDR1, HCDR2, LCDR1, 및 LCDR2와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 CDR은 상업적으로 관련된 키메라성 또는 인간화된 항체의 CDR 영역을 대체할 수 있다.
특정 구현예는 인간 성분인 항원 결합 단백질의 스캐폴드 성분을 이용한다. 그러나, 일부 구현예에서, 상기 스캐폴드 성분은 상이한 종 유래의 혼합물일 수 있다. 이와 같이, 만약 항원 결합 단백질이 항체이면, 그와 같은 항체는 키메라성 항체 및/또는 인간화된 항체일 수 있다. 일반적으로, "키메라성 항체" 및 인간화된 항체" 모두는 하나를 초과하는 종으로부터 유래된 영역들을 조합한 항체를 지칭한다. 예를 들면, "키메라성 항체"는 전통적으로 마우스 (또는 일부 경우 랫트)로부터 유래된 가변 영역(들) 및 인간으로부터 유래된 불변 영역(들)을 포함한다.
"인간화된 항체"는 일반적으로 인간 항체에서 발견된 서열과 교환된 가변 도메인 프레임워크 영역을 갖는 비-인간 항체를 지칭한다. 일반적으로, 인간화된 항체에서, 전체 항체는,하나 이상의 CDR을 제외하고, 인간 기원의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되거나 또는 하나 이상의 CDR 내를 제외하고 상기 항체에 동일하다. 비-인간 유기체에서 유래되는 핵산에 의해 인코딩된 CDR의 일부 또는 모두는 인간 항체 가변 영역의 베타-시트 프레임워크 내로 그라프팅되어 항체를 생성하며, 이의 특이성은 그라프팅된 CDR에 의해 결정된다. 그러한 항체의 생성은, 예를 들면, 문헌[WO 92/11018, Jones 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen 등, 1988, Science 239:1534-1536]에 기재되어 있다. 인간화된 항체는 또한 유전적으로 조작된 면역계를 갖는 마우스를 이용하여 생성될 수 있다 (Roque 등, 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654). 본원에 기재된 예시적인 구현예에서, 상기 확인된 CDR은 인간이며, 따라서 이 문맥에서 인간화된 항체 및 키메라성 항체 모두는 일부 비-인간 CDR을 포함하고; 예를 들면, HCDR3 및 LCDR3 영역을 포함하며 다른 CDR 영역 중 하나 이상이 상이한 종 기원인 인간화된 항체가 생성될 수 있다.
일 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 다중특이적 항체, 및 특히 때때로 "디아바디"로도 불리는 이중특이적 항체이다. 이들은 단일 항원 상의 2 이상 상이한 항원 또는 상이한 에피토프에 결합하는 항체이다. 어떤 구현예에서, 이중특이적 항체는 OSMR 및 인간 효과기 세포 (예를 들면, T 세포) 상의 항원에 결합한다. 그러한 항체는 OSMR 발현 세포, 예컨대 OSMR-발현 종양 세포에 대해 효과기 세포를 표적화하는데 유용하다. 바람직한 구현예에서, 인간 효과기 세포 항원은 CD3이다. 미국 특허 제7,235,641호. 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당해기술에 공지되어 있다. 그러한 한 가지 방법은 중쇄의 Fc 부위를 조작하여 세포에서 공동-발현될 때 중쇄의 이형이량체 형성을 촉진하는 "노브 (knob)" 및 "홀 (hole)"을 생성하는 것을 포함한다. 미국 특허 제7,695,963호. 또 하나의 방법은 또한 중쇄의 Fc 부위를 조작하는 것을 포함하지만 세포에서 공동-발현될 때 중쇄의 동형이량체 형성을 막으면서 이형이량체 형성을 격려하기 위해 정전기 스티어링 (steering)을 사용한다. WO 09/089,004 (그 전체가 본원에 참고로 편입되어 있음).
일 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 미니바디이다. 미니바디는 CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함하는 최소화된 항체-유사 단백질이다 (Hu 등, 1996, Cancer Res. 56:3055-3061).
일 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 도메인 항체이다; 예를 들면 미국 특허 제6,248,516호를 참고한다. 도메인 항체 (dAb)는 인간 항체의 중쇄 (VH) 또는 경쇄 (VL) 중 하나의 가변 영역에 대응하는, 항체의 기능적 결합 도메인이다. dAB는 대략 13 kDa의 분자량, 또는 완전 항체의 1/10 미만의 크기를 갖는다. dAB는 박테리아, 효모, 및 포유동물 세포 시스템을 포함하는 다양한 숙주에서 잘 발현된다. 또한, dAb는 매우 안정하며 가혹한 조건, 예컨대 냉동건조 또는 열 변성에 놓여진 후에도 활성을 유지한다. 예를 들면, US 특허 제6,291,158호; 제6,582,915호; 제6,593,081호; 제6,172,197호; US 시리즈 번호 제2004/0110941호; 유럽 특허 제0368684호; US 특허 제6,696,245호, 제WO04/058821호, 제WO04/003019호 및 제WO03/002609호를 참고한다.
일 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 항체 단편이며, 즉 OSMR에 대한 결합 특이성을 보유하는 본원에 개괄된 어느 항체의 단편이다. 다양한 구현예에서, 상기 항체 결합 단백질은, 비제한적으로, F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, 또는 단일 사슬 Fv 단편을 포함한다. 최소한도로, 본원에서 의미한 바와 같은, 항체는, 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 모두 또는 일부, 예컨대 하나 이상의 CDR을 포함하는 OSMR에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 포함한다.
OSMR-결합 항체 단편의 추가의 예는, 비제한적으로, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편, (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) 단일 가변으로 이루어진 dAb 단편 (Ward 등, 1989, Nature 341:544-546), (v) 분리된 CDR 영역, (vi) F(ab')2 단편, 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편 (vii) 단일 사슬 Fv 분자 (scFv), 여기서 VH 도메인 및 VL 도메인은 2개의 도메인이 해리되어 항원 결합 부위를 형성하게 하는 펩타이드 링커에 의해 연결됨 (Bird 등, 1988, Science 242:423-426, Huston 등, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883), (viii) 이중특이적 단일 사슬 Fv 이합체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) "디아바디" 또는 "트리아바디", 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다중특이적 단편 (Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger 등, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448). 항체 단편은 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디설파이드 브릿지의 혼입에 의해 안정화될 수 있다 (Reiter 등, 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245). 본 발명의 측면은 이들 단편의 비-CDR 성분이 인간 서열인 구현예를 포함한다.
일 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 완전 인간 항체이다. 이 구현예에서, 상기 개괄된 바와 같이, 특이적 구조는 CDR 영역을 포함하는 것으로 묘사된 완전한 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 추가의 구현예는 본 발명의 CDR 중 하나 이상을 이용하며, 다른 CDR, 프레임워크 영역, J 및 D 영역, 불변 영역, 등은 다른 인간 항체로부터 유래된다. 예를 들면, 본 발명의 CDR은 인간 항체, 특히 상업적으로 관련된 많은 항체의 CDR을 대체할 수 있다.
단일 사슬 항체는 아미노산 브릿지 (짧은 펩타이드 링커)를 통해 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 (Fv 영역) 단편을 연결하여, 단일 폴리펩타이드 사슬을 야기함으로써 형성될 수 있다. 그러한 단일-사슬 Fv (scFv)는 2개의 가변 도메인 폴리펩타이드 (VL 및 VH)를 인코딩하는 DNA 사이에 펩타이드 링커를 인코딩하는 DNA를 융합함으로써 제조되었다. 수득한 폴리펩타이드는 그들 자신에게 다시 접혀 항원-결합 모노머를 형성할 수 있거나, 또는 이들은 2개의 가변 도메인 사이의 가요성 링커의 길이에 따라 다량체 (예를 들면, 이량체, 삼량체, 또는 사량체)를 형성할 수 있다 (Kortt 등, 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt 등, 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). 상이한 VL 및 VH-포함 폴리펩타이드를 조합함으로써, 상이한 에피토프에 결합하는 다량체 scFv를 형성할 수 있다 (Kriangkum 등, 2001, Biomol. Eng. 18:31-40). 단일 사슬 항체의 생산을 위해 개발된 기술은 문헌[미국 특허 제4,946,778호; Bird, 1988, Science 242:423; Huston 등, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward 등, 1989, Nature 334:544, de Graaf 등, 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87]에 기재된 것을 포함한다. 본원에 제공된 항체로부터 유래된 단일 사슬 항체 (비제한적으로 Ab1 LCv/Ab1 HCv (서열번호: 27 / 서열번호: 9), Ab2 LCv/Ab2 HCv (서열번호: 28 / 서열번호: 10), 및 Ab3 LCv/Ab3 HCv (서열번호: 29 / 서열번호: 11)의 가변 도메인 조합을 포함하는 scFv를 포함함), 및 이들의 조합이 본 발명에 포함된다. 예시적인 단일 사슬 항체는 하기 가변 도메인 조합: 서열번호: 27 / 서열번호: 53; 및 서열번호: 28 / 서열번호: 54를 포함한다.
일 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 항체 융합 단백질 (때때로 본원에서 "항체 콘주게이트"로서 지칭됨)이다. 콘주게이트 파트너는 단백질성 또는 비-단백질성일 수 있고; 후자는 일반적으로 항원 결합 단백질 상의 그리고 콘주게이트 파트너 상의 작용성 그룹을 이용하여 생성된다. 어떤 구현예에서, 상기 항체는 비-단백질성 화합물 (약물)에 접합되어 항체 약물 콘주게이트를 형성한다.
일 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 때때로 "합성 항체"로 지칭되는 항체 유사체이다. 예를 들면, 다양한 작업은 그라프팅된 CDR을 갖는 대안적인 단백질 스캐폴드 또는 인공 스캐폴드 중 하나를 이용한다. 그러한 스캐폴드는, 비제한적으로, 결합 단백질 뿐만 아니라 예를 들면 생체적합성 폴리머로 구성된 완전한 합성 스캐폴드의 3차원 구조를 안정화시키기 위해 도입된 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, 문헌[Korndorfer 등, 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129. Roque 등, 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654]을 참조한다. 또한, 펩타이드 항체 모방체 ("PAM") 뿐만 아니라 스캐폴드로서 피브로넥틴 성분을 이용한 항체 모방체에 기반한 연구가 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단백질"은 적어도 2개의 공유결합된 아미노산을 의미하며, 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 2 이상의 공유결합된 아미노산은 펩타이드 결합에 의해 부착된다. 아래에 요약한 바와 같이, 예를 들면 단백질이 발현 시스템 및 숙주 세포를 이용하여 재조합으로 제조될 때, 상기 단백질은 천연 발생 아미노산 및 펩타이드 결합으로 구성될 수 있다. 대안적으로, 상기 단백질은 합성 아미노산 (예를 들면, 호모페닐알라닌, 시트룰린, 오르니틴, 및 노르류신), 또는 펩타이드모사체 구조, 즉, "펩타이드 또는 단백질 유사체", 예컨대 펩토이드를 포함할 수 있고 (본원에 참고로 편입된, Simon 등, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:9367, 참고), 이는 프로테아제 또는 다른 생리적 및/또는 보관 상태에 대해 내성일 수 있다. 그러한 합성 아미노산은 항원 결합 단백질이 당해기술에서 잘 알려진 종래의 방법에 의해 시험관내에서 합성될 때 특히 혼입될 수 있다. 또한, 펩타이드모사체, 합성 및 천연 발생 잔기/구조의 임의의 조합이 사용될 수 있다. "아미노산"은 또한 이미노 산 잔기, 예컨대 프롤린 및 하이드록시프롤린을 포함한다. 아미노산 "R 그룹" 또는 "측쇄"는 (L)- 또는 (S)- 배열 중 하나일 수 있다. 특정한 구현예에서, 상기 아미노산은 (L)- 또는 (S)-배열이다.
어떤 측면에서, 본 발명은 OSMR 및, 일부 구현예에서, 재조합 인간 OSMR 또는 이의 일부에 결합하는 재조합 항원 결합 단백질을 제공한다. 이 문맥에서, "재조합 단백질"은 즉, 본원에 기재된 바와 같은 재조합 핵산의 발현을 통해, 임의의 기술 및 당해분야에서 공지된 방법을 이용한 재조합 기술을 이용하여 제조된 단백질이다. 재조합 단백질의 생산을 위한 방법 및 기술은 당해기술에 공지되어 있다. 본 발명의 구현예는 야생형 OSMR 및 이의 변이체에 결합하는 재조합 항원 결합 단백질을 포함한다.
"본질적으로 이루어지는"은 아미노산 서열은 인용된 서열번호: 서열 대비 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15% 달라질 수 있고, 본원에 기재된 바와 같이, 생물학적 활성을 여전히 보유할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 분리된 단백질 또는 실질적으로 순수한 단백질이다. "분리된" 단백질은, 예를 들면, 주어진 샘플에서 총 단백질의 적어도 약 5 중량%, 또는 적어도 약 50 중량%를 구성하는, 그의 천연 상태에서 정상적으로 회합되는 물질의 적어도 일부를 동반하지 않는다. 분리된 단백질은 상황에 따라 총 단백질 함량의 5 내지 99.9 중량%를 구성할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들면, 단백질은 유도성 프로모터 또는 고 발현 프로모터의 사용을 통해 유의미하게 더 높은 농도로 제조될 수 있고, 이로써 단백질이 증가된 농도 수준으로 제조된다. 상기 정의는 당해기술에 공지되어 있는 다양한 유기체 및/또는 숙주 세포에서 항원 결합 단백질의 생산을 포함한다
아미노산 서열의 경우, 서열 동일성 및/또는 유사성은, 비제한적으로, Smith 및 Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482의 국소 서열 동일성 알고리즘, Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443의 서열 동일성 정렬 알고리즘, Pearson 및 Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444의 유사성 조사 방법, 이들 알고리즘 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)의 컴퓨터화된 실행, 바람직하게는 디폴트 셋팅을 이용하여, 또는 점검에 의해, Devereux 등, 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395에 의해 기재된 최상 적합 서열 프로그램을 포함하는, 본 기술분야에서 공지된 표준 기술을 이용하여 결정된다. 바람직하게는, 퍼센트 동일성은 하기 파라미터에 기초하여 FastDB에 의해 계산된다: 1의 미스매치 페널티; 1의 갭 페널티; 0.33의 갭 사이즈 페널티; 및 30의 조이닝 페널티, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.
유용한 알고리즘의 예는 PILEUP이다. PILEUP는 진행성, 쌍별 정렬을 이용하여 관련된 서열의 그룹으로부터 다중 서열 정렬을 생성한다. 또한 그것은 상기 정렬을 생성하는데 사용된 클러스터링 관계를 보여주는 트리를 플롯팅할 수 있다. PILEUP는 문헌[Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360]의 진행성 정렬 방법의 단순화를 이용하며; 상기 방법은 문헌[Higgins 및 Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153]에 기재된 것과 유사하다. 유용한 PILEUP 파라미터는 3.00의 디폴트 갭 중량, 0.10의 디폴트 갭 길이 중량, 및 칭량된 엔드 갭을 포함한다.
유용한 알고리즘의 또 하나의 예는 문헌[Altschul 등, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul 등, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; 및 Karin 등, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787]에 기재된 BLAST 알고리즘이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 문헌[Altschul 등, 1996, Methods in Enzymology 266:460-480]으로부터 수득된 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는 몇 개의 서치 파라미터를 이용하며, 이들 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 조정가능한 파라미터는 하기 값을 이용하여 설정된다: 오버랩 범위=1, 오버랩 분획=0.125, 워드 역치 (T)=II. HSP S 및 HSP S2 파라미터는 동적 값이며 특정 서열의 조성 및 관심 서열이 서치되는 특정한 데이터베이스의 구성에 따라 프로그램 자체에 의해 확립되지만, 상기 값은 민감성을 증가시키기 위해 조정될 수 있다.
추가의 유용한 알고리즘은 문헌[Altschul 등, 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402]에 의해 보고된 바와 같은 갭핑된 BLAST이다. 갭핑된 BLAST는 BLOSUM-62 치환 스코어; 9로 설정된 역치 T 파라미터; 갭핑되지 않은 확대를 촉발하는 2-히트 방법, k의 차지 갭 길이(charges gap length), 10+k의 코스트(cost); 16으로 설정된 Xu, 및 데이타베이스 서치 단계에 대해 40으로 설정되고 알고리즘의 출력 단계에 대해 67로 설정된 Xg를 이용한다. 갭핑된 정렬은 약 22 비트에 해당하는 스코어에 의해 촉발된다.
일반적으로, 개별적인 변이체 CDR 간의 아미노산 상동성, 유사성, 또는 동일성은 본원에 묘사된 서열에 적어도 80%, 보다 전형적으로 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 거의 100%의 바람직하게는 증가하는 상동성 또는 유사성이다. 유사한 방식으로, 본원에서 확인된 결합 단백질의 핵산 서열과 관련하여 "퍼센트 (%) 핵산 서열 동일성"은 항원 결합 단백질의 코딩 서열 내의 뉴클레오타이드 잔기와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오타이드 잔기의 백분율로서 정의된다. 특정한 방법은 각각 1 및 0.125로 설정된 오버랩 범위 및 오버랩 분획과 함께, 디폴트 파라미터로 설정된 WU-BLAST-2의 BLASTN 모듈을 이용한다.
일반적으로, 개별적인 변이체 CDR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 본원에 묘사된 뉴클레오타이드 서열 간의 핵산 서열 상동성, 유사성, 또는 동일성은 적어도 80%, 및 더욱 전형적으로 바람직하게는 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 거의 100%의 증가하는 상동석 또는 동일성이다.
따라서, "변이체 CDR"은 본 발명의 모 CDR에 대해 명시된 상동성, 유사성, 또는 동일성을 갖는 것이며, 이는 모 CDR의 특이성 및/또는 활성의 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함하나, 이에 제한되지 않는 생물학적 기능을 공유한다.
아미노산 서열 변화를 도입하기 위한 부위 또는 영역은 미리 결정되지만, 돌연변이 자체는 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들면, 주어진 부위에서 돌연변이의 실행을 최적화하기 위해, 랜덤 돌연변이유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행될 수 있고, 발현된 항원 결합 단백질 CDR 변이체가 원하는 활성의 최적 조합에 대해 스크리닝될 수 있다. 공지된 서열을 갖는 DNA 내의 미리 결정된 부위에서 치환 돌연변이를 만드는 방법, 예를 들면, M13 프라이머 돌연변이유발 및 PCR 돌연변이유발은 널리 알려져 있다. 돌연변이체의 스크리닝은 OSMR 결합과 같은 항원 결합 단백질의 분석을 이용하여 수행된다.
아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기 중에 있으며, 삽입은, 상당히 더 큰 삽입이 허용될 수 있음에도 불구하고, 용인될 수 있음에도 불구하고, 일반적으로 약 1 내지 약 20 아미노산 잔기일 것이다. 결실은, 일부 경우 결실이 더 클 수 있음에도 불구하고, 약 1 내지 약 20 아미노산 잔기 범위이다.
치환, 결실, 삽입 또는 임의의 이들의 조합이 최종 유도체 또는 변이체에 도달하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 이들 변화는 분자의 변화, 특히 항원 결합 단백질의 면역원성 및 특이성을 최소화하기 위해 몇 개의 아미노산에서 이뤄진다. 그러나, 어떤 상황에서는 더 큰 변화가 허용될 수 있다. 보존적 치환은 표 3과 같이 묘사된 하기 차트에 따라 이뤄진다.
표 3
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기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변화는 표 3에 나타난 것보다 덜 보존적인 치환을 선택함으로써 이뤄진다. 예를 들면, 변화 영역 내의 폴리펩타이드 골격의 구조, 예를 들면 알파-나선 또는 베타-시트 구조; 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성; 또는 측쇄의 부피에 더 유의하게 영향을 미치는 치환이 이뤄질 수 있다. 일반적으로 폴리펩타이드의 특성에 가장 큰 변화를 야기할 것으로 예상되는 치환은 (a) 친수성 잔기, 예를 들면, 세릴 또는 트레오닐이 소수성 잔기, 예를 들면, 류실, 이소류실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐을 치환하거나(또는 치환되거나); (b) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기를 치환하거나(또는 치환되거나); (c) 양전기 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들면, 라이실, 아르기닐, 또는 히스티딜이 음전기 잔기, 예를 들면, 글루타밀 또는 아스파틸을 치환하거나(또는 치환되거나); 또는 (d) 부피가 큰 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들면, 페닐알라닌이 측쇄를 갖지 않는 것, 예를 들면, 글리신을 치환하는(또는 치환되는) 것이다.
상기 변이체들은 또한 필요에 따라 항원 결합 단백질의 특성을 변형하기 위해 선택됨에도 불구하고, 전형적으로 천연 발생 유사체와 동일한 정성적 생물학적 활성을 나타내고 동일한 면역 반응을 유발할 것이다. 대안적으로, 상기 변이체는 항원 결합 단백질의 생물학적 활성이 변경되도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 당화 부위가 본원에서 논의된 바와 같이 변경되거나 제거될 수 있다.
본 발명의 범위 내의 OSMR 항체의 다른 유도체는 예컨대 OSMR 항체 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 융합 단백질의 발현에 의한, OSMR 항체, 또는 그것의 단편과 다른 단백질 또는 폴리펩타이드와의 공유 또는 집합적 콘주게이트를 포함한다. 예를 들면, 상기 접합된 펩타이드는 이종성 신호 (또는 리더) 폴리펩타이드, 예를 들면, 효모 알파-인자 리더, 또는 에피토프 태그와 같은 펩타이드일 수 있다. OSMR 항체-함유 융합 단백질은 OSMR 항체의 정제 또는 확인을 용이하게 하기 위해 부가되는 펩타이드 (예를 들면, 폴리-His)를 포함할 수 있다. OSMR 항체 폴리펩타이드는 또한 문헌[Hopp 등, Bio/Technology 6:1204, 1988, 및 U.S. 특허 5,011,912]에 기재된 바와 같은 FLAG 펩타이드에 연결될 수 있다. 상기 FLAG 펩타이드는 고항원성이고 특이적 단클론성 항체 (mAb)에 의해 가역적으로 결합된 에피토프를 제공하여, 발현된 재조합 단백질의 빠른 분석 및 손쉬운 정제를 가능하게 한다. FLAG 펩타이드가 특정한 폴리펩타이드에 융합된 융합 단백질을 제조하는데 유용한 시약들은 상업적으로 이용가능하다 (Sigma, St. Louis, MO).
일 구현예에서, 올리고머는 면역글로불린으로부터 유래된 폴리펩타이드를 이용하여 제조된다. 항체 유래 폴리펩타이드의 다양한 부분 (Fc 도메인 포함)에 융합된 어떤 이종성 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 제조는, 예를 들면, 문헌[Ashkenazi 등, 1991, PNAS USA 88:10535; Byrn 등, 1990, Nature 344:677; 및 Hollenbaugh 등, 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1 - 10.19.11]에 기재되었다.
본 발명의 하나의 구현예는 OSMR 항체의 OSMR 결합 단편을 항체의 Fc 영역에 융합함으로써 생성된 2개의 융합 단백질을 포함하는 이합체에 관한 것이다. 상기 이합체는, 예를 들면, 융합 단백질을 인코딩하는 유전자 융합을 적절한 발현 벡터 내로 삽입하고, 상기 유전자 융합을 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에서 발현시키고, 상기 발현된 융합 단백질이 매우 유사한 항체 분자로 조립되게 하고, 그 결과 Fc 모이어티 사이에서 사슬간 디설파이드 결합이 형성되어 이합체를 생성함으로써 제조될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "Fc 폴리펩타이드"는 항체의 Fc 영역으로부터 유래된 폴리펩타이드의 천연 형태 및 뮤테인 형태를 포함한다. 이합체화를 촉진하는 힌지 영역을 함유하는 상기 폴리펩타이드의 끝이 잘린 형태 역시 포함된다. Fc 모이어티를 포함하는 융합 단백질(및 이로부터 형성된 올리고머)는 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼에 비해 친화도 크로마토그래피에 의한 손쉬운 정제의 이점을 제공한다.
PCT 출원 제WO 93/10151호 (이로써 참고로 편입됨)에 기재된 한 가지 적합한 Fc 폴리펩타이드는 N-말단 힌지 영역으로부터 인간 IgG 항체의 Fc 영역의 원상태 C-말단으로 연장하는 단일 사슬 폴리펩타이드이다. 또 하나의 유용한 Fc 폴리펩타이드는 U.S. 특허 제5,457,035호 및 Baum 등, 1994, EMBO J. 13:3992-4001에 기재된 Fc 뮤테인이다. 이 뮤테인의 아미노산 서열은 아미노산 19가 Leu에서 Ala로 바뀌고, 아미노산 20이 Leu에서 Glu로 바뀌고, 아미노산 22가 Gly에서 Ala로 바뀐 것을 제외하면, WO 93/10151호에 제시된 원상태 Fc 서열의 아미노산 서열과 동일하다. 상기 뮤테인은 Fc 수용체에 대해 감소된 친화도를 나타낸다.
다른 구현예에서, OSMR 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 부위는 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 부위를 치환할 수 있다.
올리고머 OSMR 항체 유도체를 제조하는 또 하나의 방법은 류신 지퍼를 포함한다. 류신 지퍼 도메인은 이들이 발견된 단백질의 올리고머화를 촉진하는 펩타이드이다. 류신 지퍼는 본래 몇 개의 DNA-결합 단백질에서 확인되었고(Landschulz 등, Science 240:1759-64, 1988), 그 이후로 다양한 상이한 단백질에서 발견되었다. 공지된 류신 지퍼 중에는 이합체화하거나 삼합체화하는 천연 발생 펩타이드 및 그것의 유도체가 있다. 가용성 올리고머 단백질을 생산하는데 적합한 류신 지퍼 도메인의 예는 PCT 출원 WO 94/10308호에 기재되어 있고, 폐 계면활성제 단백질 D (SPD)로부터 유래된 류신 지퍼는 참고로 본원에 편입된 Hoppe 등, 1994, FEBS Letters 344:191에 기술되어 있다. 융합된 이종성 단백질을 안정적으로 삼합체화시키는 변형된 류신 지퍼의 사용은 문헌[Fanslow 등, 1994, Semin. Immunol. 6:267-78]에 기재되어 있다. 하나의 접근법에서, 류신 지퍼 펩타이드에 융합된 OSMR 항체 단편 또는 유도체를 포함하는 재조합 융합 단백질은 적합한 숙주 세포에서 발현되며, 형성하는 가용성 올리고머 OSMR 항체 단편 또는 유도체는 배양 상청액으로부터 회수된다.
항원 결합 단백질의 공유 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되며, 항상은 아니지만 일반적으로 번역후에 이뤄진다. 예를 들면, 항원 결합 단백질의 특정 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도화제와 반응시킴으로써 항원 결합 단백질의 몇 가지 유형의 공유 변형이 분자 내로 도입된다.
시스테이닐 잔기는 가장 흔하게 α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민), 예컨대 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 반응하여, 카복시메틸 또는 카복시아미도메틸 유도체를 생성한다. 시스테이닐 잔기 역시 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설파이드, 메틸 2-피리딜 디설파이드, p-클로로메르큐리벤조에이트, 2-클로로메르큐리-4-니트로페놀, 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과의 반응에 의해 유도체화된다.
히스티딜 잔기는 pH 5.5-7.0에서 디에틸파이로카보네이트와의 반응에 의해 유도체화되는데, 이 제제가 히스티딜 측쇄에 대해 상대적으로 특이적이기 때문이다. 파라-브로모펜아실 브로마이드 역시 유용하며; 상기 반응은 바람직하게는 pH　6.0에서 0.1M 나트륨 카코딜레이트 중에서 수행된다.
라이시닐 및 아미노 말단 잔기는 석시닉 또는 다른 카복실산 무수물과 반응한다. 이들 제제들을 이용한 유도체화는 라이시닐 잔기의 전하를 역전시키는 효과를 갖는다. 알파-아미노-함유 잔기를 유도체화하기 위한 다른 적합한 시약은 이미도에스테르, 예컨대 메틸 피콜린이미데이트; 피리독살 포스페이트; 피리독살; 클로로보로하이드라이드; 트리니트로벤젠설폰산; O-메틸이소우레아; 2,4-펜탄디온; 및 글리옥실레이트와의 아미노기전달효소-촉매 반응을 포함한다.
아르기닐 잔기는 하나 또는 몇 개의 종래의 시약, 그 중에서도, 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-사이클로헥산디온, 및 닌히드린과의 반응에 의해 변형된다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 구아니딘 작용성 그룹의 높은 pKa 때문에 알칼리성 조건에서 반응이 수행될 것을 요구한다. 더욱이, 이들 시약은 라이신 그룹 뿐만 아니라 아르기닌 엡실론-아미노 그룹과 반응할 수 있다.
방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄과의 반응에 의해 스펙트럼 표지를 티로실 잔기 내로 도입하는데 특히 관심을 가지고, 티로실 잔기의 특이적 변형이 이루어질 수 있다. 가장 흔하게, N-아세틸이미다졸 및 테트라니트로메탄이 각각 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 형성하는데 사용된다. 방사선면역분석에서 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조하기 위해, 티로실 잔기가 125I 또는 131I를 이용하여 요오드화되며, 상기 기재된 클로르아민 T 방법이 적합하다.
카복실 측면 그룹 (아스파틸 또는 글루타밀)은 카보디이미드 (R'―N=C=N--R')와의 반응에 의해 선택적으로 변형되며, 여기서 R 및 R'는 1-사이클로헥실-3-(2-모폴리닐-4-에틸) 카보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸) 카보디이미드와 같은, 임의로 상이한 알킬 그룹이다. 더욱이, 아스파틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파르기닐 및 글루타미닐 잔기로 변환된다.
이작용성 제제를 이용한 유도체화는 다양한 방법에서 사용하기 위해 항원 결합 단백질을 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 가교결합하는데 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교결합제는, 예를 들면, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데하이드, N-하이드록시석신이미드 에스테르, 예를 들면, 4-아지도살리실산을 갖는 에스테르, 3,3'-디티오비스(석신이미딜프로피오네이트)와 같은 디석신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이작용성 이미도에스테르, 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이작용성 말레이미드를 포함한다. 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 유도화제는 빛의 존재시 가교결합을 형성할 수 있는 광활성 중간체를 생성한다. 대안적으로, 시아노겐 브로마이드-활성화된 탄수화물과 같은 반응성 수불용성 매트릭스 및 미국 특허 제3,969,287호; 제3,691,016호; 제4,195,128호; 제4,247,642호; 제4,229,537호; 및 제4,330,440호에 기재된 반응성 기질이 단백질 고정화를 위해 이용된다.
글루타미닐 및 아스파르기닐 잔기는 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파틸 잔기로 자주 탈아미드화된다. 대안적으로, 이들 잔기는 중산성 조건하에 탈아미드화된다. 어느 하나의 형태의 이들 잔기들이 본 발명의 범위 내에 속한다.
다른 변형은 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 그룹의 인산화, 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 그룹의 메틸화 (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카복실 그룹의 아미드화를 포함한다.
본 발명의 범위 내에 포함되는 항원 결합 단백질의 공유 변형의 또 하나의 유형은 단백질의 당화 패턴을 변경하는 것을 포함한다. 당해기술에 공지된 바와 같이, 당화 패턴은 단백질의 서열(예를 들면, 하기 논의된 특정 당화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재), 또는 단백질이 생산된 숙주 세포 또는 유기체에 좌우될 수 있다. 특정한 발현 시스템이 하기에 논의된다.
폴리펩타이드의 당화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 지칭한다. 트리-펩타이드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착하기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드 내에 이들 트리-펩타이드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 당화 부위를 생성한다. 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록실리신이 또한 사용될 수 있음에도 불구하고, O-연결된 당화는 당류 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 또는 자일로스 중 하나가 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로 세린 또는 트레오닌에 부착되는 것을 지칭한다.
항원 결합 단백질에 당화 부위를 부가하는 것은 아미노산 서열이 상기 기재된 트리-펩타이드 서열 중 하나 이상 (N-연결된 당화 부위를 위한 서열)을 함유하도록 상기 아미노산 서열을 변경함으로써 간편하게 달성된다. 상기 변경은 또한 개시 서열 (O-연결된 당화 부위를 위한 서열)에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가하거나, 또는 치환함으로써 달성될 수 있다. 편의를 위해, 상기 항원 결합 단백질 아미노산 서열은 특히 미리 선택된 염기에서 표적 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA를 돌연변이시켜 원하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 함으로써, 바람직하게는 DNA 수준에서의 변화를 통해 변경된다.
항원 결합 단백질 상의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또 하나의 수단은 글리코사이드를 단백질에 화학적 또는 효소적으로 커플링시키는 것에 의한다. 이들 절차는 N- 및 O-연결된 당화를 위한 당화 능력을 갖는 숙주 세포에서 단백질을 생산하는 것을 요구하지 않는다는 점에서 유리하다. 사용된 커플링 방식에 따라, 상기 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카복실 그룹, (c) 유리 설프하이드릴 그룹, 예컨대 시스테인의 유리 설프하이드릴 그룹, (d) 유리 하이드록실 그룹, 예컨대 세린, 트레오닌, 또는 하이드록시프롤린의 유리 하이드록실 그룹, (e) 방향성 잔기, 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 방향성 잔기, 또는 (f) 글루타민의 아미드 그룹에 부착될 수 있다. 이들 방법은 1987년 9월 11일에 공개된 제WO 87/05330호, 및 Aplin 및 Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306에 기재되어 있다.
개시 항원 결합 단백질 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈당화는 단백질을 화합물 트리플루오로메탄설폰산, 또는 대등한 화합물에 노출시키는 것을 요구한다. 이 처리는 상기 폴리펩타이드는 온전하게 하면서, 연결하는 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당류를 절단한다. 화학적 탈당화는 문헌[Hakimuddin 등, 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge 등, 1981, Anal. Biochem. 118:131]에 기재되어 있다. 폴리펩타이드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌[Thotakura 등, 1987, Meth. Enzymol. 138:350]에 기재된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다아제를 사용함으로써 달성될 수 있다. 잠재적 당화 부위에서의 당화는 문헌[Duskin 등, 1982, J. Biol. Chem. 257:3105]에 기재된 바와 같이 화합물 투니카마이신의 사용에 의해 방지될 수 있다. 투니카마이신은 단백질-N-글리코사이드 연결의 형성을 차단한다.
항원 결합 단백질의 공유 변형의 또 하나의 유형은, 미국 특허 번호 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로, 상기 항원 결합 단백질을 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌과 같은 다양한 폴리올을 포함하는 다양한 비단백질성 폴리머에 연결하는 것을 포함한다. 또한, 당해기술에 공지된 바와 같이, 아미노산 치환은 PEG와 같은 폴리머의 부가를 용이하기 위해 상기 항원 결합 단백질 내의 다양한 위치에서 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질의 공유 변형은 하나 이상의 표지의 부가를 포함한다.
용어 "라벨링 그룹"은 임의의 검출가능한 표지를 의미한다. 적합한 라벨링 그룹의 예는, 비제한적으로, 방사선동위원소 또는 방사선핵종 (예를 들면, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광성 그룹 (예를 들면, FITC, 로다민, 란탄족 포스포르), 효소 그룹 (예를 들면, 홀스래디쉬 페록시다아제, β-갈락토시다아제, 루시퍼라아제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광 그룹, 바이오티닐 그룹, 또는 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩타이드 에피토프 (예를 들면, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 라벨링 그룹은 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 암을 통해 항원 결합 단백질에 커플링된다. 단백질을 라벨링하는 다양한 방법들이 당해기술에 공지되어 있으며 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다.
일반적으로, 라벨은 검출될 분석에 따라, 다양한 클래스로 나뉜다: a) 방사성 또는 중 동위원소일 수 있는, 동위원소 표지; b) 자기성 라벨 (예를 들면, 자기성 입자); c) 산화환원 활성 모이어티; d) 광학적 염료; 효소 그룹 (예를 들면 홀스래디쉬 페록시다아제, β-갈락토시다아제, 루시퍼라아제, 알칼리성 포스파타제); e) 바이오티닐화된 그룹; 및 f) 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩타이드 에피토프(예를 들면, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체를 위한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그, 등). 일부 구현예에서, 상기 라벨링 그룹은 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 암을 통해 항원 결합 단백질에 커플링된다. 단백질을 라벨링하기 위한 다양한 방법들이 당해기술에 공지되어 있으며 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다.
특이적 라벨은, 비제한적으로, 발색단, 포스포르 및 형광단을 포함하는 광학적 염료를 포함하며, 후자는 많은 경우 특이적이다. 형광단은 "소분자" 플루오르, 또는 단백질성 플루오르일 수 있다.
"형광 라벨"은 그의 고유한 형광 특성을 통해 검출될 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 적합한 형광 라벨은 비제한적으로, 플루오레신, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라사이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 황색, 캐스케이드 블루J, 텍사스 레드, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, 오레곤 그린, Alexa-Fluor 염료(Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), 캐스케이드 블루, 캐스케이드 황색 및 R-파이코에리트린 (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, 로다민, 및 텍사스 레드 (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA)을 포함한다. 형광단을 포함하는 적합한 광학적 염료는 참고로 본원에 명확히 편입된 문헌[Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland]에 기재되어 있다.
적합한 단백질성 형광 라벨은 또한, 비제한적으로, GFP의 레닐라, 프틸로사르쿠스, 또는 아에쿠오레아 종을 포함하는, 녹색 형광 단백질(Chalfie 등, 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank Accession Number U55762), 청색 형광 단백질 (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim 등, 1996, Curr. Biol. 6:178-182), 증대된 황색 형광성 단백질 (EYFP, Clontech Laboratories, Inc), 루시퍼라아제 (Ichiki 등, 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β 갈락토시다아제 (Nolan 등, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) 및 레닐라 (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, U.S. 특허 제5292658호, 제5418155호, 제5683888호, 제5741668호, 제5777079호, 제5804387호, 제5874304호, 제5876995호, 제5925558호)를 포함한다. 상기 언급된 참조문헌은 모두 본원에 참고로 명확히 편입된다.
본원에 기재된 예시적인 항원 결합 단백질은 항원 결합 단백질에 의해 결합된 OSMR 상의 뚜렷이 다른 에피토프에 기반한 특성을 갖는다. 용어 "에피토프"는, 항원 결합 단백질이 표적 분자에 결합될 때, 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체가 접촉하는 표적 분자의 아미노산을 의미한다, 에피토프는 인접하거나 또는 비-인접할 수 있다(예를 들면, (i) 단일-사슬 폴리펩타이드에서, 폴리펩타이드 서열 내에서 서로 인접하지는 않지만 표적 분자의 문맥에서 항원 결합 단백질에 의해 결합된 아미노산 잔기, 또는 (ii) 2 이상 개별 성분, 예를 들면, OSMR 및 gp130 또는 OSMR 및 IL-31 수용체 A를 포함하는 다량체 수용체에서, 아미노산 잔기는 하나 이상의 개별 성분 상에 존재하지만 항원 결합 단백질에 의해 여전히 결합됨. 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐 그룹과 같은 분자의 화학적으로 활성 표면 그룹을 포함할 수 있고, 특이적 3차원적 구조적 특성, 및/또는 특이적 전하 특성을 가질 수 있다. 일반적으로, 특정한 표적 분자에 특이적인 항원 결합 단백질은 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 내에서 표적 분자 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
항원 결합 단백질에 의해 결합된 에피토프를 규명하는 방법은 당해기술에서 잘 알려져 있으며, 비제한적으로, 비닝 (binning; 교차-경쟁) (Miller 등 "Epitope binning of murine monoclonal antibodies by a multiplexed pairing assay" J Immunol Methods (2011) 365, 118-25), 펩타이드 맵핑 (예를 들면, PEPSPOTTM) (Albert 등 "The B-cell Epitope of the Monoclonal Anti-Factor VIII Antibody ESH8 Characterized by Peptide Array Analysis" 2008 Thromb. Haemost. 99, 634-7), 돌연변이유발 방법, 예컨대 키메라(Song 등 "Epitope Mapping of Ibalizumab, a Humanized Anti-CD4 Monoclonal Antibody with Anti-HIV-1 Activity in Infected Patients" J. Virol. (2010) 84, 6935-6942), 알라닌 스캐닝(Cunningham 및 Wells "High-resolution epitope mapping of HGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis" Science (1989) 244, 1081-1085) , 아르기닌 스캐닝(Lim 등 "A diversity of antibody epitopes can induce signaling through the erythropoietin receptor" Biochemistry (2010) 49, 3797-3804), HD 교환 방법(Coates 등 "Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry" Rapid Commun. Mass Spectrom. (2009) 23 639- 647), NMR 교차 포화 방법(Morgan 등 "Precise epitope mapping of malaria parasite inhibitory antibodies by TROSY NMR cross-saturation" Biochemistry (2005) 44, 518-23), 및 결정학 (Gerhardt 등 "Structure of IL-17A in complex with a potent, fully human neutralizing antibody" J. Mol. Biol (2009) 394, 905-21)을 포함한다. 상기 방법들은 에피토프를 포함하는 아미노산과 관련하여 이들이 제공하는 세부 수준이 다르다. 실시예 4는 에피토프 비닝의 예시적인 방법을 제공한다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 본원에 기재된 예시적인 항원 결합 단백질, 예를 들면, Ab1, Ab2, 또는 Ab3과 중첩되는 에피토프를 갖는 것을 포함한다. 어떤 구현예에서, 상기 항원 결합 단백질은 예시적인 항원 결합 단백질과 동일한 에피토프를 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 항원 결합 단백질은 예시적인 항원 결합 단백질과 동일한 아미노산들의 하나의 서브셋에만 결합한다.
어떤 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 Ab1, Ab2, 또는 Ab3와 동일한 또는 중첩한 에피토프를 가지며, 그리고 하기를 포함한다: a) 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 서열식별번호:27, 서열식별번호:28, 또는 서열식별번호:29에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 경쇄 가변 도메인; b) 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성을 갖거나, 또는 서열식별번호:9, 서열식별번호:10, 또는 서열식별번호:11에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 중쇄 가변 도메인; 또는c) 상기 a)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 b)의 중쇄 가변 도메인.
어떤 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 Ab1, Ab2, 또는 Ab3와 동일한 또는 중첩한 에피토프를 가지며, 그리고 하기를 포함한다: 적어도 90%, 적어도 95%를 갖거나 서열식별번호:27에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 경쇄 가변 도메인 및 적어도 90%, 적어도 95%를 갖거나 서열식별번호:9에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 중쇄 가변 도메인; 적어도 90%, 적어도 95%를 갖거나 서열식별번호:28에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 경쇄 가변 도메인 및 적어도 90%, 적어도 95%를 갖거나 서열식별번호:10에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 및 적어도 90%, 적어도 95%를 갖거나 서열식별번호:29에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 경쇄 가변 도메인 및 적어도 90%, 적어도 95%를 갖거나 서열식별번호:11에서 제시된 아미노산 서열과 동일한 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들.
어떤 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 Ab1, Ab2, 또는 Ab3와 동일한 또는 중첩한 에피토프를 가지며, 그리고 하기를 포함한다: a) 서열식별번호:27, 서열식별번호:28, 또는 서열식별번호:29에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인; b) 서열식별번호:9, 서열식별번호:10, 또는 서열식별번호:11에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인; 또는c) 상기 a)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 b)의 중쇄 가변 도메인.
어떤 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 Ab1, Ab2, 또는 Ab3와 동일한 또는 중첩한 에피토프를 가지며, 그리고 하기를 포함한다: 서열식별번호:27에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호:9에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인; 서열식별번호:28에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호:10에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 및 서열식별번호:29에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호:11에서 제시된 아미노산 서열로부터 10개 이하 또는 5개 이하의 아미노산 부가, 결실 또는 치환을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들.
서열식별번호:9의 예시적인 중쇄 가변 도메인 변이체는 서열식별번호:9의 위치 73에 상응하는 위치 에서 아스파라긴 (예를 들면, 아스파르트산) 이외의 아미노산을 함유한다. 서열식별번호:53에서 제시된 아미노산 서열은 서열식별번호:9의 중쇄 가변 도메인 변이체의 예이다.
서열식별번호:10의 예시적인 중쇄 가변 도메인 변이체는 서열식별번호:10의 위치 73에 상응하는 위치 에서 아스파라긴 (예를 들면, 아스파르트산) 이외의 아미노산을 함유한다. 서열식별번호:54에서 제시된 아미노산 서열은 서열식별번호:10의 중쇄 가변 도메인 변이체의 예이다.
어떤 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 Ab1, Ab2, 또는 Ab3와 동일한 또는 중첩한 에피토프를 가지며, 그리고 하기를 포함한다: 하기를 포함하는 경쇄 가변 도메인: a) 서열식별번호:30에서 제시된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열식별번호:33에서 제시된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 및 서열식별번호:36에서 제시된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; b) 서열식별번호:31에서 제시된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열식별번호:34에서 제시된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 및 서열식별번호:37에서 제시된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; 또는c) 서열식별번호:32에서 제시된 LCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR1; 서열식별번호:35에서 제시된 LCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR2; 및 서열식별번호:38에서 제시된 LCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 LCDR3; 및 하기를 포함하는 중쇄 가변 도메인: d) 서열식별번호:12에서 제시된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열식별번호:15에서 제시된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 및 서열식별번호:18에서 제시된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3; e) 서열식별번호:13에서 제시된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열식별번호:16에서 제시된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 및 서열식별번호:19에서 제시된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3; 또는f) 서열식별번호:14에서 제시된 HCDR1 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR1; 서열식별번호:17에서 제시된 HCDR2 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR2; 및 서열식별번호:20에서 제시된 HCDR3 서열로부터 3개 이하의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 갖는 HCDR3.
바로 위에서 기재된 바람직한 OSMR 항원 결합 단백질은 하기를 포함한다: 상기 a)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 d)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 상기 b)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 e)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들; 및 상기 c)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 f)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것들.
상기 a)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 d)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 OSMR 항원 결합 단백질은 서열식별번호:9의 위치 73에 상응하는 위치에서 아스파라긴 (예를 들면, 아스파르트산) 이외의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 임의로 함유할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 임의로 서열식별번호:53에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
상기 b)의 경쇄 가변 도메인 및 상기 e)의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 OSMR 항원 결합 단백질은 서열식별번호:10의 위치 73에 상응하는 위치에서 아스파라긴 (예를 들면, 아스파르트산) 이외의 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 임의로 함유할 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 중쇄 가변 도메인은 임의로 서열식별번호:54에서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
동일한 에피토프 또는 중첩 에피토프를 갖는 항원 결합 단백질은 항원에 결합하기 위해 종종 교차-경쟁할 것이다. 따라서, 어떤 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 Ab1, Ab2, 또는 Ab3와 교차-경쟁한다. "교차-경쟁하다" 또는 "교차-경쟁"이란, 항원 결합 단백질이 표적 상의 동일한 에피토프 또는 결합 부위에 대해 경쟁한다는 것을 의미한다. 그와 같은 경쟁은, 참조 항원 결합 단백질 (예를 들면, 그것의 항체 또는 항원-결합부)가 시험 항원 결합 단백질의 특이적 결합을 예방 또는 억제하고 그리고 그 반대인 분석에 의해 결정될 수 있다. 수많은 유형의 경쟁적 결합 분석은, 시험 분자가 결합에 대해 참조 분자와 경쟁하는 지를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이용될 수 있는 분석의 예는 하기를 포함한다: 고체상 직접 또는 간접적 방사선면역분석 (RIA), 고체상 직접 또는 간접적 효소 면역분석 (EIA), 샌드위치 경쟁 분석 (참고, 예를 들면, Stahli 등 (1983) Methods in Enzymology 9:242-253), 고체상 직접적인 바이오틴-아비딘 EIA (참고, 예를 들면, Kirkland 등, (1986) J. Immunol. 137:3614-9), 고체상 직접적인 표지된 분석, 고체상 직접적인 표지된 샌드위치 분석, Luminex (Jia 등 "A novel method of Multiplexed Competitive Antibody Binning for the characterization of monoclonal antibodies" J. Immunological Methods (2004) 288, 91-98) 및 표면 플라즈몬 공명 (Song 등 "Epitope Mapping of Ibalizumab, a Humanized Anti-CD4 Monoclonal Antibody with Anti-HIV-1 Activity in Infected Patients" J. Virol. (2010) 84, 6935-42). 교차-경쟁을 측정하는 예시적인 방법은 실시예 5에 기재되어 있다. 보통, 경쟁하는 항원 결합 단백질이 과잉으로 존재할 때, 참조 항원 결합 단백질의 공통의 항원에의 결합을 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 또는 75%까지 억제할 것이다. 일부 예에서, 결합은 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 초과까지 억제된다.
OSMR 항원 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
본원에서 정의된 바와 같이 항체를 포함하는 OSMR 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산 또는 단리된 핵산이 본 발명 내에 포함된다. 바람직한 핵산은 본원에서 기재된 예시적인 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 것을 포함한다.
Ab1 LC을 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열식별번호:21에서 제시된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab2 LC을 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열식별번호:22에서 제시된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab3 LC을 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열식별번호:23에서 제시된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab1 HC을 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열식별번호:3에서 제시된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab2 HC을 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열식별번호:4에서 제시된 서열을 포함하는 핵산이다.
Ab3 HC을 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열식별번호:5에서 제시된 서열을 포함하는 핵산이다.
변이체 Ab1 HC을 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열식별번호:47에서 제시된 서열을 포함하는 핵산이다.
변이체 Ab2 HC을 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열식별번호:48에서 제시된 서열을 포함하는 핵산이다.
변이체 Ab3 HC을 인코딩하는 예시적인 핵산은 서열식별번호:49에서 제시된 서열을 포함하는 핵산이다.
본 발명의 측면은 본원에서 기재된 아미노산 서열을 인코딩하는 (예를 들면, 축퇴로 인한) 폴리뉴클레오타이드 변이체를 포함한다.
본 발명의 측면은 하기 예시적인 구현예를 비제한적으로 포함하는 다양한 구현예를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 핵산으로서, 여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩한다:
A. 1. 서열식별번호:27-29 에서 제시된 경쇄 가변 도메인과 적어도 90% 동일한 경쇄 가변 도메인 서열;
2. 서열식별번호:9-11에서 제시된 중쇄 가변 도메인과 적어도 90% 동일한 중쇄 가변 도메인 서열;
3. (1)의 경쇄 가변 도메인 및 (2)의 중쇄 가변 도메인; 및
B. 동일하거나 하기 서열로부터의 각 CDR에서 총 3개의 아미노산 부가, 치환, 및/또는 결실까지 상이한 CDR1, CDR2, CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및/또는 CDR1, CDR2, CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인:
1. Ab1의 경쇄 CDR1 (서열식별번호:30), CDR2 (서열식별번호:33), CDR3 (서열식별번호:36) 또는 중쇄 CDR1 (서열식별번호:12), CDR2 (서열식별번호:15), CDR3 (서열식별번호:18);
2. Ab2의 경쇄 CDR1 (서열식별번호:31), CDR2 (서열식별번호:34), CDR3 (서열식별번호:37) 또는 중쇄 CDR1 (서열식별번호:13), CDR2 (서열식별번호:16), CDR3 (서열식별번호:19); 및
3. Ab3의 경쇄 CDR1 (서열식별번호:32), CDR2 (서열식별번호:35), CDR3 (서열식별번호:38) 또는 중쇄 CDR1 (서열식별번호:14), CDR2 (서열식별번호:17), CDR3 (서열식별번호:20).
일부 구현예에서, 핵산은 서열식별번호:53 또는 서열식별번호:54에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다.
일부 구현예에서, 핵산은 서열식별번호:50, 서열식별번호:51, 또는 서열식별번호:52에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다.
바람직한 구현예에서, 상기 핵산 또는 분리된 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩타이드는 OSMR에 결합하는 항원 결합 단백질의 성분이다.
핵산의 분리를 위한 프로브 또는 프라이머로서 또는 데이타베이스 서치를 위한 쿼리 서열로서 사용될, 본원에 기재된 아미노산 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 아미노산 서열로부터 "역-번역 (back-translation)"에 의해 수득되거나, 또는 상기 코딩 DNA 서열이 확인된 폴리펩타이드와 동일한 아미노산 영역들을 확인함으로써 수득될 수 있다. OSMR 항원 결합 단백질 또는 OSMR 항원 결합 단백질 폴리펩타이드 단편들의 원하는 조합을 인코딩하는 DNA 서열을 분리하고 증폭하기 위해 널리 알려진 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 절차가 이용될 수 있다. DNA 단편들의 조합의 원하는 말단을 정의하는 올리고뉴클레오타이드가 5' 및 3' 프라이머로서 이용된다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 증폭된 DNA 단편들의 조합의 발현 벡터 내로의 삽입을 용이하게 하기 위해, 제한 엔도뉴클레아제를 위한 인식 부위를 추가로 함유할 수 있다. PCR 기술은 문헌[Saiki 등, Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu 등, eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp. 189-196; 및 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et. al., eds., Academic Press, Inc. (1990)]에 기재되어 있다.
본 발명의 핵산 분자는 단일-가닥 및 이중-가닥 형태의 DNA 및 RNA, 뿐만 아니라 상응하는 상보적 서열을 포함한다. DNA는, 예를 들면, cDNA, 게놈 DNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR에 의해 증폭된 DNA, 및 이들의 조합을 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 전장 유전자 또는 cDNA 분자 뿐만 아니라 이의 단편들의 조합을 포함한다. 본 발명의 핵산은 우선적으로 인간 공급원으로부터 유래되지만, 본 발명은 비-인간 종으로부터 유래된 것도 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산은 분리된 핵산이다. "분리된 핵산"은, 천연 발생 공급원으로부터 분리된 핵산의 경우, 핵산이 분리된 유기체의 게놈 내에 존재하는 인접한 유전적 서열로부터 분리된 핵산이다. 주형으로부터 효소적으로 합성되거나, 또는 예를 들면 PCR 생성물, cDNA 분자, 또는 올리고뉴클레오타이드와 같이 화학적으로 합성된 핵산의 경우, 상기 과정으로부터 비롯된 핵산이 분리된 핵산인 것으로 이해된다. 분리된 핵산 분자는 별개의 단편의 형태인 핵산 분자 또는 더 큰 핵산 컨스트럭트의 성분으로서 핵산 분자를 지칭한다. 하나의 바람직한 구현예에서, 상기 핵산은 오염시키는 내인성 물질이 실질적으로 없다. 상기 핵산 분자는 바람직하게는 표준 생화학적 방법 (예컨대 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)에 개괄된 것)에 의해 그의 성분 뉴클레오타이드 서열의 확인, 조작, 및 회수를 가능하게 하는 실질적으로 순수한 형태 및 양 또는 농도로 적어도 1번 분리된 DNA 또는 RNA로부터 유래되었다. 그러한 서열은 바람직하게는 진핵 유전자 내에 존재하는, 내부 비-번역된 서열, 또는 인트론에 의해 방해받지 않는 열린 해독틀의 형태로 제공되고/거나 구축된다. 비-번역된 DNA의 서열은 열린 해독틀로부터 5' 또는 3'에 존재할 수 있고, 상기 서열은 코딩 영역의 조작 또는 발현을 방해하지 않는다.
본 발명은 또한 중간 정도의 엄격한 조건, 및 더 바람직하게는 매우 엄격한 조건 하에 본원에 기재된 바와 같은 OSMR 항원 결합 단백질을 인코딩하는 핵산에 혼성화하는 핵산 또는 분리된 핵산을 포함한다. 혼성화 조건의 선택 및 적당한 조건을 고안하기 위한 안내에 영향을 미치는 기본적인 변수들은 문헌[Sambrook,, Fritsch, 및 Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 및 11; 및 Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel 등, eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 및 6.3-6.4)]에 제시되어 있으며, 이는, 예를 들면, DNA의 길이 및/또는 염기 조성에 기초하여 당해분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 중간 정도의 엄격한 조건을 달성하는 한 가지 방법은 5　x　SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)를 함유하는 전세정 용액, 약 50% 포름아미드, 6　x　SSC의 혼성화 버퍼, 및 약 55℃의 혼성화 온도 (또는 약 42℃의 혼성화 온도로, 예컨대 약 50% 포름아미드를 함유하는 것과 같은 다른 유사한 혼성화 용액), 및 0.5　x　SSC, 0.1% SDS에서 약 60℃의 세정 조건을 사용하는 것을 포함한다. 일반적으로, 매우 엄격한 조건은 대략 68℃, 0.2　x　SSC, 0.1% SDS에서 세정하는 것을 제외하고, 상기와 같은 혼성화 조건으로서 정의된다. SSPE (1xSSPE는 0.15M NaCl, 10 mM NaH.sub.2 PO.sub.4, 및 1.25 mM EDTA, pH 7.4임)는 혼성화 및 세정 버퍼에서 SSC (1xSSC는 0.15M NaCl 및 15 mM 나트륨 시트레이트임)를 대체할 수 있고; 세정은 혼성화가 완료된 후 15분 동안 수행된다. 세정 온도 및 세정 염 농도는 당해분야의 숙련가에게 공지되고 하기에 더 기재된 바와 같이, 혼성화 반응 및 듀플렉스 안정성을 지배하는 기본적인 원리를 적용함으로써 원하는 정도의 엄격성을 달성하기 위해 필요에 따라 조정될 수 있는 것으로 이해되어야 한다 (예를 들면, Sambrook 등, 1989 참고). 핵산을 미공지된 서열의 표적 핵산에 혼성화하는 경우, 혼성화물 길이는 혼성화하는 핵산의 길이인 것으로 추정된다. 공지된 서열의 핵산들이 혼성화되는 경우, 혼성화물 길이는 상기 핵산들의 서열을 정렬하고 최적의 서열 상보성의 영역 또는 영역들을 확인함으로써 결정될 수 있다. 50개 미만의 염기쌍 길이인 것으로 예상되는 혼성화물을 위한 혼성화 온도는 상기 혼성화물의 용융 온도 (Tm)보다 5 내지 10℃ 낮아야 하며, 여기서 Tm은 하기 방정식에 따라 결정된다. 18개 미만의 염기쌍 길이의 혼성화물의 경우, Tm(℃) = 2(A + T 염기의 개수) + 4(G + C 염기의 개수)이다. 18개 초과의 염기쌍 길이의 혼성화물의 경우, Tm(℃) = 81.5 + 16.6(log10 [Na+]) + 0.41(% G + C) - (600/N)이며, 여기서 N은 상기 혼성화물 내의 염기의 개수이고, [Na+]는 혼성화 버퍼 내의 나트륨 이온의 농도이다(1xSSC에 대한 [Na+] = 0.165M). 바람직하게는, 각각의 상기 혼성화 핵산은 적어도 15 뉴클레오타이드 (또는 더 바람직하게는 적어도 18 뉴클레오타이드, 또는 적어도 20 뉴클레오타이드, 또는 적어도 25 뉴클레오타이드, 또는 적어도 30 뉴클레오타이드, 또는 적어도 40 뉴클레오타이드, 또는 가장 바람직하게는 적어도 50 뉴클레오타이드), 또는 그것이 혼성화하는 본 발명의 핵산의 길이의 적어도 25% (더 바람직하게는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 및 가장 바람직하게는 적어도 80%)인 길이를 갖고, 그것이 혼성화하는 본 발명의 핵산과 적어도 60% 서열 동일성 (더 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 및 가장 바람직하게는 적어도 99.5%)을 가지며, 여기서 상기 서열 동일성은 상기에 더 상세히 기술된 서열 갭을 최소화하면서 오버랩 및 동일성을 최대화하기 위해 정렬될 때 상기 혼성화 핵산 서열들의 서열을 비교함으로써 결정된다.
본 발명에 따른 변이체는 일반적으로 카세트 또는 PCR 돌연변이유발 또는 당해기술에서 잘 알려진 다른 기술을 이용하여 항원 결합 단백질을 인코딩하는 DNA 내에 부위 특이적 돌연변이를 유발하여 변이체를 인코딩하는 DNA를 생산한 후, 본원에 개괄된 바와 같은 세포 배양에서 상기 재조합 DNA를 발현시킴으로써 제조된다. 그러나, 최대 약 100-150 잔기를 갖는 변이체 CDR을 포함하는 항원 결합 단백질 단편은 확립된 기술을 이용하여 시험관내 합성에 의해 제조될 수 있다. 하기에 더 충분히 서술될 변형된 특성을 갖는 변이체들이 선택될 수 있음에도 불구하고, 상기 변이체는 전형적으로, 예컨대 OSMR에 결합하는 천연 발생 유사체와 동일한 정성적 생물학적 활성을 나타낸다.
본 기술분야의 숙련가에 의해 인식될 바와 같이, 유전자 암호의 축퇴로 인해, 매우 많은 수의 핵산들이 만들어질 수 있으며, 이들 모두는 본 발명의 CDR (및 항원 결합 단백질의 중쇄 및 경쇄 또는 다른 성분)을 인코딩한다. 따라서, 특정한 아미노산 서열을 확인한 후, 당해분야의 숙련가는 인코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 방식으로 하나 이상의 코돈의 서열을 간단히 변형시킴으로써, 임의의 수의 상이한 핵산들을 만들 수 있을 것이다.
본 발명은 또한, 상기와 같은 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드, 발현 벡터, 전사 또는 발현 카세트 형태의 발현 시스템 및 컨스트럭트를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 발현 시스템 또는 컨스트럭트를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
전형적으로, 임의의 숙주 세포에서 사용되는 발현 벡터는 플라스미드 유지를 위한 서열 및 외인성 뉴클레오타이드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열을 함유할 것이다. 어떤 구현예에서 "플랭킹 서열"로 총칭되는 그러한 서열들은 전형적으로 하기 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상을 포함할 것이다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제 기점, 전사 종결 서열, 공여체 및 수용체 스플라이스 부위를 함유하는 완전한 인트론 서열, 폴리펩타이드 분비를 위한 선도 서열을 인코딩하는 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현될 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 폴리링커 영역, 및 선별 마커 요소. 이들 각각의 서열은 하기에서 논의된다.
임의로, 상기 벡터는 "태그"-인코딩 서열, 즉, OSMR 항원 결합 단백질 코딩 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치한 올리고뉴클레오타이드 분자를 함유할 수 있고; 상기 올리고뉴클레오타이드 서열은 polyHis (예컨대 hexaHis), 또는 또 하나의 "태그", 예컨대 FLAG, HA (헤마글루티닌 인플루엔자 바이러스), 또는 myc를 인코딩하며, 이를 위한 상업적으로 이용가능한 항체들이 존재한다. 이 태그는 전형적으로 상기 폴리펩타이드의 발현시 상기 폴리펩타이드에 융합되며, 숙주 세포로부터 OSMR 항원 결합 단백질의 친화도 정제 또는 검출을 위한 수단으로서의 역할을 할 수 있다. 친화도 정제는, 예를 들면, 친화도 매트릭스로서 상기 태그에 대한 항체를 이용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 달성될 수 있다. 임의로, 상기 태그는 차후에 절단을 위해 어떤 펩티다아제를 이용하는 것과 같은 다양한 수단에 의해 상기 정제된 OSMR 항원 결합 단백질로부터 제거될 수 있다.
플랭킹 서열은 상동성이거나 (즉, 숙주 세포와 동일한 종 및/또는 균주 유래), 이종성이거나 (즉, 상기 숙주 세포 종 또는 균주 이외의 종 유래), 하이브리드 (즉, 하나를 초과하는 공급원 유래의 플랭킹 서열들의 조합), 합성 또는 원상태일 수 있다. 이와 같이, 상기 플랭킹 서열이 숙주 세포 기구에서 기능하고, 숙주 세포 기구에 의해 활성화될 수 있는 한, 플랭킹 서열의 공급원은 임의의 원핵 또는 진핵 유기체, 임의의 척추 또는 무척추 유기체, 또는 임의의 식물일 수 있다.
본 발명의 벡터에서 유용한 플랭킹 서열은 당해기술에서 잘 알려진 임의의 몇 가지 방법에 의해 수득될 수 있다. 전형적으로, 본원에서 유용한 플랭킹 서열은 맵핑에 의해 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 앞서 확인되었을 것이고, 따라서 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 적절한 조직 공급원으로부터 분리될 수 있다. 일부 경우, 플랭킹 서열의 전체 뉴클레오타이드 서열은 알려질 수 있다. 여기에서, 플랭킹 서열은 핵산 합성 또는 클로닝을 위해 본원에 기재된 방법을 이용하여 합성될 수 있다.
플랭킹 서열의 전부 또는 단지 일부가 공지되어 있든지 간에, 그것은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 이용하여 및/또는 동일한 또는 또 다른 종 유래의 올리고뉴클레오타이드 및/또는 플랭킹 서열 단편과 같은 적합한 프로브를 이용하여 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 플랭킹 서열이 공지되지 않은 경우, 플랭킹 서열을 함유하는 DNA의 단편은, 예를 들면, 코딩 서열 또는 또 하나의 유전자 또는 유전자를 함유할 수 있는 DNA의 더 큰 조각으로부터 분리될 수 있다. 분리는 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 적절한 DNA 단편을 생산한 다음 아가로스 겔 정제, Qiagen® 칼럼 크로마토그래피 (Chatsworth, CA), 또는 숙련가에게 공지된 다른 방법을 이용하여 분리함으로써 달성될 수 있다. 이 목적을 달성하기 위는 적합한 효소의 선택은 당해분야의 숙련가에게 쉽게 분명할 것이다.
복제 기점은 전형적으로 상업적으로 구매된 상기 원핵 발현 벡터의 일부이며, 상기 기점은 숙주 세포에서 벡터의 증폭을 돕는다. 만약 선택된 벡터가 복제 기점 부위를 함유하지 않으면, 이는 공지된 서열에 기초하여 화학적으로 합성되고, 벡터 내로 결찰될 수 있다. 예를 들면, 플라스미드 pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) 유래의 복제 기점이 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하며, 다양한 바이러스 기점 (예를 들면, SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 소포성 구내염 바이러스 (VSV), 또는 파필로마바이러스, 예컨대 HPV 또는 BPV)이 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점 성분은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다(예를 들면, 단지 SV40 기점은 바이러스 초기 프로모터를 함유하기 때문에, 종종 사용된다).
전사 종결 서열은 폴리펩타이드 코딩 영역의 말단의 3'에 위치하며 전사를 종결하는 역할을 한다. 보통, 원핵 세포에서의 전사 종결 서열은 G-C 풍부 단편 뒤이어 폴리-T 서열이다. 상기 서열은 라이브러리로부터 쉽게 클로닝되ㄱ고j거나 벡터의 일부로서 상업적으로 구매되지만, 이는 또한 본 명세서에서 기재된 것과 같은 핵산 합성 방법을 이용하여 쉽게 합성될 수 있다.
선별 마커 유전자는 선택적 배양 배지에서 성장한 숙주 세포의 생존 및 성장에 필요한 단백질을 인코딩한다. 전형적인 선별 마커 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들면, 원핵 숙주 세포를 위한 암피실린, 테트라사이클린, 또는 카나마이신에 대해 내성을 부여하거나; (b) 세포의 영양요구성 결핍을 보충하거나; 또는 (c) 복합 또는 한정 배지로부터 이용할 수 없는 매우 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩한다. 특정 선별 마커는 카나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 및 테트라사이클린 내성 유전자이다. 유익하게는, 네오마이신 내성 유전자가 또한 원핵 및 진핵 숙주 세포 모두에서의 선별을 위해 사용될 수 있다.
다른 선별 유전자가 발현될 유전자를 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 증폭은 성장 또는 세포 생존에 중요한 단백질을 생산하는데 필요한 유전자가 염색체 내에서 재조합 세포의 연속적인 생산과 동시에 반복되는 공정이다. 포유동물 세포를 위한 적합한 선별 마커의 예는 디하이드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 및 프로모터가 없는 티미딘 키나아제 유전자를 포함한다. 포유동물 세포 형질전환체는 선별 압력하에 놓여지고, 상기 형질전환체만이 벡터 내에 존재하는 선별 유전자 덕택에 생존하도록 독특하게 적응된다. 선별 압력은 형질전환된 세포를 배지 내의 선별 제제의 농도가 연속하여 증가되는 조건하에서 배양하고, 이에 의해 선별 유전자 및 OSMR 폴리펩타이드에 결합하는 항원 결합 단백질 항체와 같은 또 하나의 유전자를 인코딩하는 DNA 모두의 증폭을 야기함으로써 부과된다. 그 결과, 증가된 양의 폴리펩타이드, 예컨대 OSMR 항원 결합 단백이 증폭된 DNA로부터 합성된다.
리보솜-결합 부위는 보통 mRNA의 번역 개시에 필요하며 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 서열 (원핵생물) 또는 코작 서열 (진핵생물)을 특징으로 한다. 상기 요소는 전형적으로 프로모터의 3' 및 발현될 폴리펩타이드의 코딩 서열의 5'에 위치한다. 어떤 구현예에서, 하나 이상의 코딩 영역들이 내부 리보솜 결합 부위 (IRES)에 작동가능하게 연결되어, 단일 RNA 전사체로부터 2개의 열린 해독틀을 번역시킨다.
일부 경우에, 예컨대 진핵 숙주 세포 발현 시스템에서 당화가 요구되는 경우에, 당화 또는 수율을 개선하기 위해 다양한 프리- 또는 프로서열을 조작할 수 있다. 예를 들면, 특정한 신호 펩타이드의 펩티다아제 절단 부위를 변경하거나, 또는 당화에 영향을 미치는 프로서열을 추가할 수 있다. 최종 단백질 생성물은 -1 위치(성숙한 단백질의 첫 번째 아미노산 대비)에, 발현에 부수적인 하나 이상의 추가의 아미노산을 가질 수 있으며, 이는 완전히 제거되지 않을 수 있다. 예를 들면, 최종 단백질 생성물은 아미노-말단에 부착된, 펩티다아제 절단 부위에서 발견되는 1 또는 2개의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 대안적으로, 일부 효소 절단 부위의 사용은, 만약 상기 효소가 성숙한 폴리펩타이드 내의 상기 영역에서 절단하는 경우, 약간 끝이 잘린 형태의 원하는 폴리펩타이드를 야기할 수 있다.
본 발명의 발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로 숙주 유기체에 의해 인식되고 OSMR 항원 결합 단백질을 인코딩하는 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유할 것이다. 프로모터는 구조 유전자 (일반적으로 약 100 내지 1000 bp 이내)의 시작 코돈의 업스트림 (즉, 5')에 위치한 비전사된 서열로서, 상기 구조 유전자의 전사를 제어한다. 프로모터는 종래에 2개의 클래스로 그룹화된다: 유도성 프로모터 및 항시적 프로모터. 유도성 프로모터는 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도 변화와 같은 배양 조건의 일부 변화에 대한 반응으로 이들의 제어하에 있는 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시한다. 반면, 항시적 프로모터는, 유전자 발현을 거의 또는 전혀 제어하지 않으면서, 이들이 작동가능하게 연결된 유전자를 한결같이 전사시킨다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 다수의 프로모터들은 잘 알려져 있다. 제한 효소 소화에 의해 공급원 DNA로부터 프로모터를 제거하고 원하는 프로모터 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 적합한 프로모터는 본 발명의 OSMR 항원 결합 단백질을 포함하는 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된다.
효모 숙주와 함께 사용하기 위한 적합한 프로모터들은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유익하게 사용된다. 포유동물 숙주 세포와 함께 사용하기 위한 적합한 프로모터들은 잘 알려져 있으며, 비제한적으로, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스 및 가장 바람직하게는 유인원 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 것을 포함한다. 다른 적합한 포유동물 프로모터는 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들면, 열-충격 프로모터 및 액틴 프로모터를 포함한다.
관심이 있을 수 있는 추가의 프로모터들은, 비제한적으로 하기를 포함한다: SV40 초기 프로모터 (Benoist 등, 1981, Nature 290:304-310); CMV 프로모터(Thornsen 등, 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663); 라우스 (Rous) 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복 내에 함유된 프로모터 (Yamamoto 등, 1980, Cell 22:787-797); 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터 (Wagner 등, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); 메탈로티오닌 유전자 유래의 프로모터 및 조절 서열 (Prinster 등, 1982, Nature 296:39-42); 및 베타-락타마제 프로모터와 같은 원핵 프로모터 (Villa-Kamaroff 등, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731); 또는 tac 프로모터 (DeBoer 등, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). 또한 조직 특이성을 나타내며 형질전환 동물에서 이용되어 온 하기 동물 전사 제어 영역이 관심 대상이다: 췌장 샘꽈리 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역 (Swift 등, 1984, Cell 38:639-646; Ornitz 등, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역 (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); 림프모양 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 영역 (Grosschedl 등, 1984, Cell 38:647-658; Adames 등, 1985, Nature 318:533-538; Alexander 등, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); 고환, 유방, 림프모양 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유선 종양 바이러스 대조군 영역 (Leder 등, 1986, Cell 45:485-495); 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역 (Pinkert 등, 1987, Genes and Devel. 1 :268-276); 간에서 활성인 알파-페토-단백질 유전자 제어 영역 (Krumlauf 등, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer 등, 1987, Science 253:53-58); 간에서 활성인 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역 (Kelsey 등, 1987, Genes and Devel. 1:161-171); 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역 (Mogram 등, 1985, Nature 315:338-340; Kollias 등, 1986, 세포 46:89-94); 뇌 내의 희소돌기교세포 세포에서 활성인 수초 염기성 단백질 유전자 제어 영역 (Readhead 등, 1987, Cell 48:703-712); 골격 근육에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역 (Sani, 1985, Nature 314:283-286); 및 시상하부에서 활성인 생식선자극성 방출 호르몬 유전자 제어 영역 (Mason 등, 1986, Science 234:1372-1378).
고등 진핵생물에 의한 본 발명의 OSMR 항원 결합 단백질을 포함하는 경쇄 또는 중쇄를 인코딩하는 DNA의 전사를 증가시키기 위해 인핸서 서열이 벡터 내로 삽입될 수 있다. 인핸서는 보통 약 10-300 bp 길이의 DNA의 시스-작용 요소로서, 프로모터에 작용하여 전사를 증가시킨다. 인핸서는 상대적으로 방향 및 위치 독립적이며, 전사 단위에 대하여 위치 5' 및 3' 모두에서 발견되었다. 포유동물 유전자로부터 이용가능한 몇 가지 인핸서 서열들이 공지되어 있다 (예를 들면, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토-단백질 및 인슐린). 그러나, 전형적으로 바이러스 유래의 인핸서가 사용된다. 본 기술분야에서 공지된 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 진핵 프로모터의 활성화를 위한 예시적인 인핸싱 요소이다. 인핸서는 벡터 내에서 코딩 서열의 5' 또는 3'에 위치할 수 있지만, 전형적으로 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다. 적절한 원상태 또는 이종성 신호 서열 (선도 서열 또는 신호 펩타이드)을 인코딩하는 서열이 발현 벡터 내로 편입되어, 항체의 세포외 분비를 촉진할 수 있다. 신호 펩타이드 또는 리더의 선택은 항체가 생산될 숙주 세포의 유형에 좌우되며, 이종성 신호 서열은 원상태 신호 서열을 대체할 수 있다. 포유동물 숙주 세포에서 기능하는 신호 펩타이드의 예는 하기를 포함한다: US 특허 제4,965,195호에 기재된 인터루킨-7(IL-7)에 대한 신호 서열; Cosman 등,1984, Nature 312:768에 기재된 인터루킨-2 수용체에 대한 신호 서열; EP 특허 제0367 566호에 기재된 인터루킨-4 수용체 신호 펩타이드; 미국 특허 제4,968,607호에 기재된 I형 인터루킨-1 수용체 신호 펩타이드; EP 특허 제0 460 846호에 기재된 II형 인터루킨-1 수용체 신호 펩타이드.
벡터는 벡터가 숙주 세포 게놈 내로 통합될 때 발현을 용이하게 하는 하나 이상의 요소를 함유할 수 있다. 예는 EASE 요소 (Aldrich 등 2003 Biotechnol Prog. 19:1433-38) 및 매트릭스 부착 영역(MAR)을 포함한다. MAR은 염색질의 구조적 체계성을 매개하고 "위치" 효과로부터 통합된 벡터를 보호할 수 있다. 따라서, MAR은 벡터가 안정한 감염체를 생성하는데 사용될 때 특히 유용하다. 많은 천연 및 합성 MAR-함유 핵산은 당해기술, 예를 들면, 미국 특허 제6,239,328호; 제7,326,567호; 제6,177,612호; 제6,388,066호; 제6,245,974호; 제7,259,010호; 제6,037,525호; 제7,422,874호; 제7,129,062호에 공지되어 있다.
본 발명의 발현 벡터는 상업적으로 이용가능한 벡터와 같은 개시 벡터로부터 구축될 수 있다. 그러한 벡터는 원하는 플랭킹 서열 모두를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 본원에 기재된 플랭킹 서열 중 하나 이상이 벡터 내에 사전에 존재하지 않는 경우, 이들은 개별적으로 수득되어 벡터 내로 결찰될 수 있다. 각각의 플랭킹 서열을 수득하는데 사용되는 방법은 당해분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다.
벡터가 구축되고 OSMR 항원 결합 서열을 포함하는 경쇄, 중쇄, 또는 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 핵산 분자가 벡터의 적절한 부위 내로 삽입된 후, 상기 완성된 벡터는 증폭 및/또는 폴리펩타이드 발현을 위한 적합한 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. OSMR 항원 결합 단백질을 위한 발현 벡터를 선택된 숙주 세포로 형질전환하는 것은 형질감염, 감염, 칼슘 포스페이트 공동침전, 전기천공, 미세주입, 리포펙션, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 또는 다른 공지된 기술을 포함하는 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 상기 선택된 방법은 부분적으로는 사용될 숙주 세포의 유형의 기능일 수 있다. 이들 방법 및 다른 적합한 방법은 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 전술한 문헌[Sambrook 등, 2001]에 제시되어 있다.
숙주 세포는, 적절한 조건하에서 배양될 때, OSMR 항원 결합 단백질을 합성하며, 이는 차후에 배양 배지로부터 수집되거나(숙주 세포가 이를 배지 내로 분비하는 경우) 또는 이를 생산하는 숙주 세포로부터 직접 수집될 수 있다(그것이 분비되는 경우). 적절한 숙주 세포의 선택은 다양한 인자, 예컨대 원하는 발현 수준, 활성에 바람직하거나 필요한 폴리펩타이드 변형(예컨대 당화 또는 인산화) 및 생물학적 활성 분자로의 폴딩의 편의성에 좌우될 것이다. 숙주 세포는 진핵 또는 원핵일 수 있다.
발현용 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 당해기술에서 잘 알려져 있으며, 비제한적으로, 미국 종균 협회(ATCC)로부터 이용가능한 불멸화된 세포주를 포함하고, 본 기술분야에서 공지된 발현 시스템에서 사용되는 임의의 세포주가 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 만드는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포는 원하는 항-OSMR 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터를 이용하여 형질전환된다. 이용될 수 있는 숙주 세포 중에는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵 세포가 있다. 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들면 E. 콜라이 또는 바실러스를 포함한다. 고등 진핵 세포는 곤충 세포 및 포유동물 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예는 원숭이 신장 세포의 COS-7 세포주(ATCC CRL 1651)(Gluzman 등, 1981, Cell 23:175), L 세포, 293 세포, C127 세포, 3T3 세포(ATCC CCL 163), 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 그것의 유도체, 예컨대 Veggie CHO 및 무혈청 배지에서 성장하는 관련된 세포주(Rasmussen 등, 1998, Cytotechnology 28: 31), HeLa 세포, BHK(ATCC CRL 10) 세포주, 및 McMahan 등, 1991, EMBO J. 10: 2821에 의해 기재된 바와 같은 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CVI으로부터 유래된 CVI/EBNA 세포주(ATCC CCL 70), 인간 배아 신장 세포, 예컨대 293, 293 EBNA 또는 MSR 293, 인간 표피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 다른 형질전환된 영장류 세포주, 정상적인 2배체 세포, 일차 조직의 시험관내 배양으로부터 유래된 세포주, 일차 외식편, HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포를 포함한다. 임의로, 다양한 신호 전달 또는 리포터 분석에서 상기 폴리펩타이드를 사용하는 것이 바람직한 경우, 예를 들면 HepG2/3B, KB, NIH 3T3 또는 S49와 같은 포유동물 세포주가 상기 폴리펩타이드의 발현을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 효모와 같은 하등 진핵생물 또는 박테리아와 같은 원핵생물에서 상기 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 적합한 효모는 사카로마이세스 세레비지애, 쉬조사카로마이세스 폼베, 클루이베로마이세스 균주, 칸디다, 또는 이종성 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 효모 균주를 포함한다. 적합한 박테리아 균주는 에스케리치아 콜리, 바실러스 서브틸리스, 살모넬라 타이피뮤리움, 또는 이종성 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 임의의 균주를 포함한다. 만약 상기 폴리펩타이드가 효모 또는 박테리아에서 만들어지는 경우, 기능적 폴리펩타이드를 수득하기 위해, 예를 들면 적절한 부위의 인산화 또는 당화에 의해 상기에서 생산된 폴리펩타이드를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 공유 부착은 공지된 화학적 또는 효소에 의한 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 또한 하나 이상의 곤충 발현 벡터에서 본 발명의 핵산 또는 분리된 핵산을 적합한 제어 서열에 작동가능하게 연결하고, 곤충 발현 시스템을 이용함으로써 생산될 수 있다. 배큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 위한 물질 및 방법은, 예를 들면, Invitrogen, San Diego, CA, U.S.A.(the MaxBac® kit)로부터의 키트 형태로 상업적으로 이용가능하며, 그러한 방법은 문헌[Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), 및 Luckow 및 Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)]에 기재된 바와 같이 당해기술에서 잘 알려져 있다. 본원에 개시된 핵산 컨스트럭트로부터 유래된 RNA를 이용하여 폴리펩타이드를 생산하기 위해 무세포 번역 시스템이 또한 이용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[Pouwels 등 (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)]에 기재되어 있다. 바람직하게는 적어도 하나의 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 본 발명의 핵산 또는 분리된 핵산을 포함하는 숙주 세포는 "재조합 숙주 세포"이다.
어떤 구현예에서, 세포주는 세포주가 높은 발현 수준을 가지며 OSMR 결합 특성을 갖는 항원 결합 단백질을 항시적으로 생산하는지 결정하는 것을 통해 선택될 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 자신의 항체를 만들지는 않지만 이종성 항체를 만들고 분비하는 능력을 갖는 B 세포 계통 유래의 세포주가 선택될 수 있다.
세포-고갈 OSMR 항원 결합 단백질
바람직한 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 OSMR에 결합하고 OSM 및/또는 IL-31 결합을 억제함으로써, OSMR-발현 세포에서 OSM- 및/또는 IL-31-매개된 신호전달을 감소시킨다. 그러나, 어떤 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 고갈을 위해 OSMR에 결합하고 OSMR-발현 세포를 표적화한다. 다양한 측면에서, 상기 OSMR 항원 결합 단백질은 고갈을 위해 OSM 및/또는 IL-31 결합을 억제하고 OSMR을 표적화한다.
세포-고갈 OSMR 항원 결합 단백질은 OSMR의 과발현과 연관된 질환 또는 장애, 예를 들면, 자가면역 질환, 염증성 질환, 세포외 매트릭스 침착 또는 리모델링과 연관된 질환 또는 장애, 또는 OSMR-발현 종양을 치료하는데 특히 유용하다. 항원 결합 단백질, 예를 들면 항체로 세포를 표적화하는 방법은 당해기술에 공지되어 있다. 예시적인 구현예가 하기에서 논의된다.
항체 약물 콘주게이트
본 발명의 구현예는 항체 약물 콘주게이트(ADC)를 포함한다. 일반적으로 ADC는 화학치료제, 예를 들면, 세포독성 약물, 세포증식억제제, 독소, 또는 방사선활성제에 접합된 항체를 포함한다. 링커 분자는 약물을 항체에 접합시키는데 사용될 수 있다. ADC 기술에서 유용한 다양한 링커 및 약물은 당해기술에 공지되어 있고 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있다(참고 US20090028856; US2009/0274713; US2007/0031402; WO2005/084390; WO2009/099728; US5208020; US5416064; US5475092; 5585499; 6436931; 6372738; 및 6340701, 모두 본원에 참고로 편입됨).
링커
어떤 구현예에서, ADC는 하나 이상의 링커 성분으로 구성된 링커를 포함한다. 예시적인 링커 성분은 6-말레이미도카프로일, 말레이미도프로파노일, 발린-시트룰린, 알라닌-페닐알라닌, p-아미노벤질옥시카보닐, 및, 비제한적으로, N-석신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트("SPP"), N-석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 카복실레이트("SMCC," "MCC"로도 본원에서 지칭됨), 및 N-석신이미딜 (4-아이오도-아세틸) 아미노벤조에이트("SIAB")를 포함하는 링커 시약과의 접합으로부터 비롯된 것을 포함한다.
링커는 "절단가능" 링커 또는 "비-절단가능" 링커일 수 있다(Ducry 및 Stump, Bioconjugate Chem. 2010, 21, 5-13; 그 전체가 참고로 본원에 편입됨). 절단가능 링커는 어떤 환경 인자에 놓여질 때, 예를 들면, 표적 세포 내로 내재화될 때, 약물을 방출하도록 설계된다. 절단가능 링커는 산 불안정성 링커, 프로테아제 민감성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-함유 링커를 포함한다. 비-절단가능 링커는 표적 세포 내에서 내재화 및 분해시 항체의 적어도 하나의 아미노산 및 약물과 공유적으로 회합된 상태를 유지하는 경향이 있다. 예시적인 비-절단가능 링커는 MCC이다.
약물
어떤 구현예에서, 항체는 화학치료제에 접합된다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로포스파마이드(CYTOXAN™); 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스파오르아미드 및 트리메틸롤로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸을 포함함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 바이젤레신 합성 유사체를 포함함); 크립토파이신(특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CBI-TMI를 포함함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로르암부실, 클로마파진, 콜로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라신 머스타드; 나이트로수레아 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 엔디인 항생제(예를 들면 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 .감마1 및 칼리키아마이신 쎄타 I, 예를 들면, Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994) 참고; 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 엔디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린; 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모폴리노-독소루비신, 시아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함함), 에피루비신, 에소루비신, 아이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신, 예컨대 아미노글루테티마이드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레벌린산; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK®; 라족산; 라이족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아진산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라바이노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파마이드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들면 파클리탁셀(탁솔™, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) 및 독세탁셀(탁소테르®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로르암부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오미틴 (DMFO); 레티노산; 카페시타빈; 및 상기 어느 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 이 정의에는 또한 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항 호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐 including 예를 들면 타목시펜, 랄록시펜, 방향화효소 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케녹시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(Fareston); 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타마이드, 바이칼루타마이드, 류프롤라이드, 및 고세렐린; siRNA 및 상기 어느 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 다른 화학치료제는 US 공보 제20080171040호 또는 US 공보 제20080305044호에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 편입된다.
항체는 2 이상의 상이한 화학치료제에 접합될 수 있거나 약제학적 조성물은 항체의 혼합물을 포함할 수 있음이 고려되며, 여기서 상기 항체 성분은 상이한 화학치료제에 접합되는 것을 제외하면 동일하다. 그러한 구현예는 표적 세포를 이용하여 다중 생물학적 경로를 표적화하는데 유용할 수 있다.
바람직한 구현예에서, ADC는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제인, 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 접합된 항체를 포함한다. 다양한 변형을 포함하는, 메이탄시노이드는 US 특허 제3896111호; 제4151042호; 제4137230호; 제4248870호; 제4256746호; 제4260608호; 제4265814호; 제4294757호; 제4307016호; 제4308268호; 제4309428호; 제4313946호; 제4315929호; 제4317821호; 제4322348호; 제4331598호; 제4361650호; 제4364866호; 제4424219호; 제4450254호; 제4362663호; 제4371533호; 및 제WO 2009/099728호에 기재되어 있다. 메이탄시노이드 약물 모이어티는 천연 공급원으로부터 분리되거나, 재조합 기술을 이용하여 생산되거나, 또는 합성으로 제조될 수 있다. 예시적인 메이탄시노이드는 C-19-데클로로(US 특허 제4256746호), C-20-하이드록시(또는 C-20-데메틸) +/- C-19-데클로로(US 특허 제4307016호 및 제4361650호), C-20-데메톡시(또는 C-20-아실옥시(-OCOR), +/- 데클로로(US 특허 제4294757호), C-9-SH(US 특허 제4,424,219호), C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(미국 특허 제4,331,598호), C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc)(미국 특허 제4,450,254호), C-15-하이드록시/아실옥시(미국 특허 제4,364,866호), C-15-메톡시(미국 특허 제4,313,946호 및 제4,315,929호), C-18-N-데메틸(미국 특허 제4,362,663호 및 제4,322,348호), 및 4,5-데옥시(미국 특허 제4,371,533호)를 포함한다.
원하는 링크의 유형에 따라, 메이탄시노이드 화합물 상의 다양한 위치가 연결 위치로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 에스테르 연결을 형성하기 위해, 하이드록실 그룹을 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록실 그룹으로 변형된 C-15 위치, 및 하이드록실 그룹을 갖는 C-20 위치가 모두 적합하다(US 특허 제5208020호, 제RE39151호, 및 제6913748호; US 특허 출원공개 제20060167245호 및 제20070037972호, 및 제WO 2009099728호).
바람직한 메이탄시노이드는 DM1, DM3, 및 DM4로서 본 기술분야에서 공지된 것을 포함한다(US 특허 출원공개 제2009030924호 및 제20050276812호, 본원에 참고로 편입됨).
메이탄시노이드를 함유하는 ADC, 상기 ADC를 제조하는 방법, 및 이의 치료 용도는 US 특허 제5208020호 및 제5416064호, US 특허 출원공개 제20050276812호 및 제WO 2009099728호(모두 참고로 본원에 편입됨)에 개시되어 있다. 메이탄시노이드 ADC를 제조하는데 유용한 링커는 본 기술분야에 공지되어 있다(US 특허 제5208020호 및 US 특허 출원공개 제2005016993호 및 제20090274713호; 모두 참고로 본원에 편입됨). SMCC 링커를 포함하는 메이탄시노이드 ADC는 US 특허 공개 제2005/0276812호에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다.
효과기 기능-증대된 항체
항체의 Fc 부위의 기능 중 하나는 항체가 그의 표적에 결합할 때 면역계와 소통하는 것이다. 이것은 "효과기 기능"으로 간주된다. 소통은 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포성 식균작용(ADCP), 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 야기한다. ADCC 및 ADCP는 면역계의 세포 표면 상에서 Fc가 Fc 수용체에 결합함으로써 매개된다. CDC는 보체 시스템의 단백질, 예를 들면, C1q과 Fc의 결합을 통해 매개된다.
IgG 서브클래스는 효과기 기능을 매개하는 그 능력 면에서 다양하다. 예를 들면, IgG1은 ADCC 및 CDC를 매개하는데 있어 IgG2 및 IgG4보다 더 우수하다. 따라서, 파괴를 위해 OSMR을 발현하는 세포가 표적화되는 구현예에서, 항-OSMR IgG1 항체가 바람직할 것이다.
항체의 효과기 기능은 하나 이상의 돌연변이를 Fc 내로 도입함으로써 증가되거나 감소될 수 있다. 본 발명의 구현예는 효과기 기능을 증가시키기 위해 조작된 Fc를 갖는 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 포함한다(U.S. 제7,317,091호 및 Strohl, Curr. Opin. Biotech., 20:685-691, 2009; 둘은 그 전체가 참고로 본원에 편입됨). 증가된 효과기 기능을 갖는 예시적인 IgG1 Fc 분자는 하기 치환을 갖는 것(카밧 넘버링 도식에 기반함)을 포함한다:
S239D/I332E
S239D/A330S/I332E
S239D/A330L/I332E
S298A/D333A/K334A
P247I/A339D
P247I/A339Q
D280H/K290S
D280H/K290S/S298D
D280H/K290S/S298V
F243L/R292P/Y300L
F243L/R292P/Y300L/P396L
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L
G236A/S239D/I332E
K326A/E333A
K326W/E333S
K290E/S298G/T299A
K290N/S298G/T299A
K290E/S298G/T299A/K326E
K290N/S298G/T299A/K326E
본 발명의 추가 구현예는 효과기 기능을 감소시키도록 조작된 Fc를 갖는 항원 결합 단백질, 예를 들면, 항체를 포함한다. 감소된 효과기 기능을 갖는 예시적인 Fc 분자는 하기 치환을 갖는 것(카밧 넘버링 도식에 기반함)을 포함한다:
N297A (IgG1)
L234A/L235A (IgG1)
V234A/G237A (IgG2)
L235A/G237A/E318A (IgG4)
H268Q/V309L/A330S/A331S (IgG2)
C220S/C226S/C229S/P238S (IgG1)
C226S/C229S/E233P/L234V/L235A (IgG1)
L234F/L235E/P331S (IgG1)
S267E/L328F (IgG1)
IgG Fc-함유 단백질의 효과기 기능을 증가시키는 또 하나의 방법은 Fc의 푸코실화를 감소시키는 것에 의한다. Fc에 부착된 바이안테너리 복합체-유형 올리고사카리이드로부터 코어 푸코스를 제거하는 것은 항원 결합 또는 CDC 효과기 기능을 변경하지 않고 ADCC 효과기 기능을 크게 증가시켰다. Fc-함유 분자, 예를 들면, 항체의 푸코실화를 감소시키거나 폐지하는 몇 가지 방법이 공지되어 있다. 이들은 FUT8 녹아웃 세포주, 변이 CHO 세포주 Lec13, 랫트 하이브리도마 세포주 YB2/0, 특이적으로 FUT8 유전자에 대한 작은 간섭 RNA를 포함하는 세포주, 및 β-1,4-N-아세틸글루코스아미닐전달효소 III 및 골지 α-만노시다제 II를 공동발현하는 세포주를 포함하는 어떤 포유동물 세포주에서의 재조합 발현을 포함한다. 대안적으로, Fc-함유 분자는 비-포유동물 세포, 예컨대 식물 세포, 효모, 또는 원핵 세포, 예를 들면, E. 콜라이에서 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명의 어떤 구현예에서, 조성물은 항체, 예를 들면 감소된 푸코실화를 갖거나 또는 전적으로 푸코실화가 부족한 Ab1, Ab2, 또는 Ab3을 포함한다.
약제학적 조성물
일부 구현예에서, 본 발명은, 약제학적으로 효과적인 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제, 및/또는 보조제와 함께, 하나 또는 복수의 본 발명의 항원 결합 단백질의 치료적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 어떤 구현예에서, 상기 항원 결합 단백질은 항체이다. 본 발명의 약제학적 조성물은, 비제한적으로, 액체, 냉동, 및 동결건조된 조성물을 포함한다.
바람직하게는, 제형 물질은 이용된 투여량 및 농도에서 수령체에 비독성이다. 특정한 구현예에서, 치료적 유효량의 OSMR 항원 결합 단백질, 예를 들면, OSMR-결합 항체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
어떤 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은, 예를 들면, pH, 오스몰농도, 점도, 투명성, 색상, 등장성, 냄새, 멸균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 조성물의 흡착 또는 침투를 변형하거나, 유지하거나 방지하기 위한 제형 물질을 함유할 수 있다. 그러한 구현예에서, 적합한 제형 물질은, 비제한적으로, 아미노산(예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 프롤린, 또는 라이신); 항미생물제; 항산화제(예컨대 아스코르브산, 나트륨 설파이트 또는 나트륨 수소-설파이트); 버퍼(예컨대 보레이트, 바이카보네이트, 트리스-HCl, 시트레이트, 포스페이트 또는 다른 유기산); 증량제(예컨대 만니톨 또는 글리신); 킬레이트제(예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화제(예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-사이클로덱스트린 또는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린); 충전제; 모노사카라이드; 디사카라이드; 및 다른 탄수화물(예컨대 글루코오스, 만노스 또는 덱스트린); 단백질(예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제, 풍미 및 희석제; 유화제; 친수성 폴리머(예컨대 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩타이드; 염 형성 반대이온(예컨대 나트륨); 보존제(예컨대 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로산, 펜에틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매(예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올(예컨대 만니톨 또는 소르비톨); 현탁화제; 계면활성제 또는 습윤제(예컨대 플루로닉스, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔); 안정성 향상제(예컨대 수크로오스 또는 소르비톨); 긴장성 향상제(예컨대 알칼리 금속 할라이드, 바람직하게는 나트륨 또는 칼륨 클로라이드, 만니톨 소르비톨); 전달 비히클; 희석제; 부형제 및/또는 약제학적 보조제를 포함한다. 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company]을 참고한다.
어떤 구현예에서, 최적의 약제학적 조성물은, 예를 들면, 의도된 투여 경로, 전달 방식 및 원하는 투여량에 따라 당해분야의 숙련가에 의해 결정될 것이다. 예를 들면, 상기 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES]을 참고한다. 어떤 구현예에서, 그와 같은 조성물은 본 발명의 항원 결합 단백질의 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 청소능 속도에 영향을 미칠 수 있다. 어떤 구현예에서, 약제학적 조성물 내의 주된 비히클 또는 담체는 천연적으로 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들면, 적합한 비히클 또는 담체는, 비경구 투여용 조성물에서 통상적인 다른 물질들이 아마도 보충된, 주사용수, 생리적 염수 용액 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성 완충된 염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수는 추가의 예시적인 비히클이다. 특정한 구현예에서, 약제학적 조성물은 약 pH 7.0-8.5의 트리스 버퍼, 또는 약 pH 4.0-5.5의 아세테이트 버퍼를 포함하고, 소르비톨 또는 적합한 대체물을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질 조성물은 동결건조된 케이크 또는 수용액의 형태로 원하는 정도의 순도를 갖는 선택된 조성물을 임의의 제형 제제(상기 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES)와 혼합함으로써 보관을 위해 제조될 수 있다. 게다가, 어떤 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질 생성물은 적절한 부형제, 예컨대 수크로오스를 이용하여 동결건조물로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 전달을 위해 선택될 수 있다. 대안적으로, 상기 조성물은 흡입을 위해 또는 소화관을 통한 전달을 위해, 예컨대 경구용으로 선택될 수 있다. 그러한 약제학적으로 허용가능한 조성물의 제조는 본 기술분야의 기술 내에 속한다. 상기 제형 성분은 바람직하게는 투여 부위에 허용가능한 농도로 존재한다. 어떤 구현예에서, 조성물을 생리적 pH에서 또는 약간 더 낮은 pH에서, 전형적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내에서 유지하기 위해 버퍼가 사용된다.
비경구 투여가 고려되는 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 치료적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 비히클 내에 원하는 OSMR 항원 결합 단백질을 포함하는 발열성 물질이 없는, 비경구로 허용가능한 수용액의 형태로 제공될 수 있다. 비경구 주사에 특히 적합한 비히클은 멸균된 증류수이며, 여기서 OSMR 항원 결합 단백질은 적절하게 보존된, 멸균된, 등장성 용액으로서 제형화된다. 어떤 구현예에서, 상기 제조는 주사가능 마이크로구형체, 생분해성 입자, 폴리머 화합물(예컨대 폴리락트산 또는 폴리글라이콜산), 비드 또는 리포좀과 같은 제제를 이용한 원하는 분자의 제형화를 포함할 수 있으며, 이는 데포 주사를 통해 전달될 수 있는 생성물의 조절되거나 지속된 방출을 제공할 수 있다. 어떤 구현예에서, 순환에서 지속된 지속시간을 촉진하는 효과를 갖는 하이알루론산이 또한 사용될 수 있다. 어떤 구현예에서, 이식가능 약물 전달 장치가 원하는 항원 결합 단백질을 도입하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 흡입용으로 제형화될 수 있다. 이들 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질은 유익하게는 건조한 흡입성 분말로서 제형화된다. 특정한 구현예에서, OSMR 항원 결합 단백질 흡입 용액은 또한 에어로졸 전달을 위해 추진제를 이용하여 제형화될 수 있다. 어떤 구현예에서, 용액은 분무될 수 있다. 따라서 폐 투여 및 제형화 방법은 참고로 편입된 국제 특허 출원 번호 PCT/US94/001875호에 더 기재되어 있으며, 이는 화학적으로 변형된 단백질의 폐 전달을 기술한다.
제형이 경구로 투여될 수 있다는 것이 또한 고려된다. 이 방식으로 투여되는 OSMR 항원 결합 단백질은 정제 및 캡슐과 같은 고형 투여 형태의 컴파운딩에서 관례상 사용되는 담체를 이용하여 또는 담체 없이 제형화될 수 있다. 어떤 구현예에서, 캡슐은 생체이용률이 최대화되고 전-전신 분해가 최소화될 때 위장관 내의 지점에서 제형의 활성 부위를 방출하도록 설계될 수 있다. OSMR 항원 결합 단백질의 흡수를 용이하게 하기 위해 추가 제제가 포함될 수 있다. 희석제, 풍미제, 저 용융점 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕해제, 및 결합제가 또한 이용될 수 있다.
추가의 약제학적 조성물은 당해분야의 숙련가에게 자명할 것이며, 이는 지속된- 또는 조절된-전달 제형에서 OSMR 항원 결합 단백질을 포함하는 제형을 포함한다. 다양한 다른 지속된- 또는 조절된-전달 수단, 예컨대 리포좀 담체, 생분해성 미세입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사를 제형화하는 기술이 당해분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들면, 참고로 편입되고 약제학적 조성물의 전달을 위해 다공성 폴리머성 미세입자의 제어 방출을 기술하는 국제 특허 출원 제PCT/US93/00829호를 참고한다. 지속 방출 제제는 성형 물품, 예를 들면, 필름, 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 폴리머 매트릭스를 포함할 수 있다. 지속 방출 매트릭스는 폴리에스테르, 하이드로겔, 폴리락타이드(각각 참고로 편입된, 미국 특허 제3,773,919호 및 유럽 특허 출원 공보 제EP 058481호에 개시된 바와 같음), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman 등, 1983, Biopolymers 2:547-556), 폴리 (2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)(Langer 등, 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 및 Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), 에틸렌 비닐 아세테이트(상기 Langer 등, 1981) 또는 폴리-D(-)-3-하이드록시부티르산(유럽 특허 출원 공보 제EP 133,988호)를 포함할 수 있다. 지속 방출 조성물은 또한 본 기술분야에서 공지된 몇 가지 방법 중 어느 것에 의해 제조될 수 있는 리포좀을 포함할 수 있다. 예를 들면, 참고로 편입된, Eppstein 등, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692; 유럽 특허 출원 공보 제EP 036,676호; 제EP 088,046호 및 제EP 143,949호를 참고한다.
생체내 투여를 위해 사용되는 약제학적 조성물은 전형적으로 멸균된 조제물로서 제공된다. 멸균은 멸균된 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 상기 조성물이 동결건조되는 경우, 이 방법을 이용하는 멸균이 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 수행될 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 동결건조된 형태로 보관되거나 또는 용액 내에 보관될 수 있다. 비경구 조성물은 일반적으로 멸균된 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들면, 피하 주사 바늘에 뚫릴 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 넣어진다.
본 발명의 측면은 자가-버퍼 OSMR 항원 결합 단백질 제형을 포함하며, 이는 그 전체가 참고로 본원에 편입된 국제 특허 출원 제WO 06138181A2호(PCT/US2006/022599)에 기재된 바와 같이, 약제학적 조성물로서 사용될 수 있다.
상기에서 논의된 바와 같이, 어떤 구이 섹션 및 본원의 다른 곳에 예시적으로 기재된 것과 같은 하나 이상의 부형제를 포함하는 구현예는 OSMR 항원 결합 단백질 단백질 조성물, 특히 OSMR 항원 결합 단백질 외에 이 섹션 및 본원의 다른 곳에 예시적으로 기재된 것과 같은 하나 이상의 부형제를 포함하는 약제학적 OSMR 항원 결합 단백질 조성물을 제공한다. 부형제는 유효성을 개선하고/거나 예를 들면, 제조, 운송, 보관, 사용전 준비, 투여 동안과 그 후에 발생하는 스트레스로 인한 분해 및 부패에 대해 상기 제형 및 공정을 안정화시키기 위해, 점도 및/또는 본 발명의 공종의 조절과 같은, 제형의 물리적, 화학적, 또는 생물학적 특성을 조절하는 것과 같은 다양한 목적을 위해 이와 관련하여 본 발명에서 사용될 수 있다.
특히 수의적 및/또는 인간 의료 용도를 위한 단백질 의약품 및 고정에 대해, 본 발명과 관련하여 자가-버퍼 단백질 제형을 위한 부형제 및 이의 공정에 특히 일부 적합한, 각각이 그 전체가 참고로 본원에 편입된 문헌[Arakawa 등, "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick 등, "Physical stabilization of proteins in aqueous solution," in: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter 및 Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), 및 Randolph 등, "Surfactant-protein interactions," Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002)]과 같이, 단백질 안정화 및 제형 물질 및 방법에 대하여 다양한 설명이 이용될 수 있다.
염은, 예를 들면, 제형의 이온성 강도 및/또는 등장성을 조절하고/거나 본 발명에 따른 조성물의 단백질 또는 다른 성분의 용해도 및/또는 물리적 안정성을 개선하기 위해, 본 발명의 어떤 구현예에 따라 사용될 수 있다.
잘 알려진 바와 같이, 이온은 단백질의 표면 상의 하전된 잔기에 결합함으로써 그리고 단백질 내의 하전되고 극성인 그룹을 차단하고 그것의 정전 상호작용, 친화 및 및 반발 상호작용의 강도를 감소시킴으로써 단백질의 원상태를 안정화시킬 수 있다. 이온은 또한 특히, 단백질의 변성된 펩타이드 연결(--CONH)에 결합함으로써 단백질의 변성된 상태를 안정화시킬 수 있다. 더욱이, 단백질 내의 하전되고 극성인 그룹과의 이온성 상호작용은 또한 분자간 정전 상호작용을 감소시켜 단백질 응집 및 불용성을 방지하거나 감소시킬 수 있다.
이온성 종은 단백질에 대한 이들의 효과가 현저히 상이하다. 이온의 수많은 카테고리적 랭킹 및 그것의 단백질에 대한 효과가 개발되었고, 이는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 제형화하는데 사용될 수 있다. 한 가지 예는 호프마이스터(Hofmeister) 시리즈로서, 이는 용액 내 단백질의 형태적 안정성에 대한 이들의 효과에 이온성 및 극성 비-이온성 용질의 순위를 매긴다. 안정화 용질은 "코스모트로픽"으로 불린다. 불안정화 용질은 "카오트로픽"으로 불린다. 코스모트로프는 통상적으로 용액으로부터 단백질을 침전하기 위해("염석(salting-in)") 고농도(예를 들면, >1 몰 암모늄 설페이트)로 사용된다. 카오트로프는 통상적으로 단백질을 변성화하고/거나 가용화하는데 사용된다("염용(salting-in)"). "염용" 및 "염석"에 대한 이온의 상대적 유효성은 호프마이스터 시리즈에서 이들의 위치를 정의한다.
유리 아미노산은 증량제, 안정제, 및 항산화제와 같은 본 발명의 다양한 구현예 뿐만 아니라 다른 표준 사용에 따라 OSMR 항원 결합 단백질 제형에서 사용될 수 있다. 라이신, 프롤린, 세린, 및 알라닌은 제형에서 단백질을 안정화시키기 위해 사용될 수 있다. 글리신은 정확한 케이크 구조 및 특성을 보장하기 위해 동결건조에서 유용하다. 아르기닌은 액체 및 동결건조된 제형 모두에서, 단백질 응집을 억제하는데 유용할 수 있다. 메티오닌은 항산화제로서 유용하다.
폴리올은 당류, 예를 들면, 만니톨, 수크로오스, 및 소르비톨 및 다가 알코올 예컨대, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜, 및 본원에서 논의의 목적을 위해, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 관련된 물질을 포함한다. 폴리올은 코스모트로픽이다. 이들은 물리적 및 화학적 분해 공정으로부터 단백질을 보호하기 위해 액체 및 동결건조된 제형 모두에서 유용한 안정제이다. 폴리올 역시 제형의 긴장성을 조절하는데 유용하다.
본 발명의 선택된 구현예에서 유용한 폴리올 중에는 동결건조된 제형에서 케이크의 구조적 안정성을 보장하는데 통상적으로 사용되는 만니톨이 있다. 그것은 케이크에 구조적 안정성을 보장한다. 그것은 일반적으로 동결건조보호제, 예를 들면, 수크로오스와 함께 사용된다. 긴장성을 조절하기 위한 그리고 운송 동안 냉동-해동 스트레스 또는 제조 공정 동안 벌크의 제조에 대해 보호하는 안정제로서 바람직한 제제 중에는 소르비톨 및 수크로오스가 있다. 환원 당(유리 알데하이드 또는 케톤 그룹을 함유함), 예컨대 글루코오스 및 락토오스는 표면 라이신 및 아르기닌 잔기를 당화시킬 수 있다. 따라서, 이들은 일반적으로 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 폴리올에 속하지 않는다. 또한, 산성 조건하에 프럭토스 및 글루코오스로 가수분해되고, 결국 당화를 야기하는, 수크로스와 같이, 그러한 반응성을 형성하는 당류가 또한 이와 관련하여 본 발명의 바람직한 폴리올에 속하지 않는다. PEG는 단백질을 안정화시키는데 그리고 동결보호제로서 유용하며 이와 관련하여 본 발명에서 사용될 수 있다.
OSMR 항원 결합 단백질 제형의 구현예는 계면활성제를 추가로 포함한다. 단백질 분자는 표면 상에 흡착되기 쉽고, 공기-액체, 고체-액체, 및 액체-액체 계면에서 변성되고 결과적으로 응집되기 쉽다. 이들 효과는 일반적으로 단백질 농도와 반대로 증가한다. 이러한 유해한 상호작용은 일반적으로 단백질 농도와 반대로 증가하며, 전형적으로 제품의 운송 및 처리 동안 발생하는 것과 같은 물리적 진탕에 의해 악화된다.
계면활성제는 일상적으로 표면 흡착을 막거나, 최소화하거나, 또는 감소시키기 위해 사용된다. 이와 관련하여 본 발명에서 유용한 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 소르비탄 폴리에톡실레이트의 다른 지방산 에스테르, 및 폴록사머 188을 포함한다.
계면활성제 역시 단백질 형태적 안정성을 제어하기 위해 통상적으로 사용된다. 임의의 제시된 계면활성제가 일부 단백질을 안정화시키고 다른 단백질은 불안정화시킬 것이므로, 이와 관련하여 계면활성제의 사용은 단백질-특이적이다.
폴리소르베이트는 산화적 분해에 민감하며, 공급된 폴리소르베이트는 종종 충분한 양의 퍼옥사이드를 함유하여 단백질 잔기 측쇄, 특히 메티오닌의 산화를 야기한다. 결과적으로, 폴리소르베이트는 주의 깊게 사용되어야 하며, 사용될 때, 가장 낮은 유효 농도에서 이용되어야 한다. 이와 관련하여, 폴리소르베이트는 부형제가 그것의 가장 낮은 유효 농도에서 사용되어야 한다는 일반적인 규칙을 예시한다.
OSMR 항원 결합 단백질 제형의 구현예는 하나 이상의 항산화제를 추가로 포함한다. 어느 정도, 단백질의 유해한 산화는 주위 산소 및 온도의 적절한 수준을 유지함으로써 그리고 빛에 대한 노출을 피함으로써 약제학적 제형에서 예방될 수 있다. 항산화제 부형제는 단백질의 산화적 분해를 막기 위해 또한 사용될 수 있다. 이와 관련된 유용한 항산화제 중에는 환원제, 산소/유리-라디칼 스캐빈져, 및 킬레이트제가 있다. 본 발명에 따른 치료적 단백질 제형에서 사용하기 위한 항산화제는 바람직하게는 수용성이고 생성물의 유통 기한 내내 그 활성을 유지한다. EDTA는 이와 관련된 본 발명에 따른 바람직한 항산화제이다.
항산화제는 단백질을 손상시킬 수 있다. 예를 들면, 글루타티온과 같은 환원제는 특히, 분자내 디설파이드 연결을 파괴할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용하기 위한 항산화제는, 무엇보다도 제형에서 단백질을 손상시키는 이들의 가능성을 제거하거나 또는 충분히 감소시키기 위해 선택된다.
본 발명에 따른 제형은 단백질 보조인자인 금속 이온 및 어떤 인슐린 현탁액을 형성하는데 필요한 아연과 같은, 단백질 배위 착물을 형성하는데 필요한 금속 이온을 포함할 수 있다. 금속 이온은 또한 단백질을 분해하는 일부 공정을 억제할 수 있다. 그러나, 금속 이온은 또한 단백질을 분해하는 물리적 및 화학 공정을 촉매한다.
마그네슘 이온(10-120 mM)은 아스파르트산의 이소아스파르트산으로의 이성질체화를 억제하기 위해 사용될 수 있다. Ca+2 이온(최대 100 mM)은 인간 데옥시리보뉴클레아제의 안정성을 증가시킬 수 있다. 그러나, Mg+2, Mn+2, 및 Zn+2는 rhDNase를 불안정화시킬 수 있다. 유사하게, Ca+2 및 Sr+2는 인자 VIII를 안정화시킬 수 있고, 그것은 Mg+2, Mn+2 및 Zn+2, Cu+2 및 Fe+2에 의해 불안정화될 수 있고 그것의 응집은 Al+3 이온에 의해 증가될 수 있다.
OSMR 항원 결합 단백질 제형의 구현예는 하나 이상의 보존제를 추가로 포함한다. 보존제는 동일한 용기로부터 하나 이상의 추출을 수반하는 다중-용량 비경구 제형을 개발할 때 필요하다. 이들의 주요 기능은 유통기한 또는 의약품의 사용 기간 내내 미생물 성장을 억제하고 생성물 멸균성을 보장하는 것이다. 통상적으로 사용되는 보존제는 벤질 알코올, 페놀 및 m-크레졸을 포함한다. 보존제가 소분자 비경구를 이용한 오랜 사용 이력을 가짐에도 불구하고, 보존제를 포함하는 단백질 제형의 개발은 도전적일 수 있다. 보존제는 거의 항상 단백질에 대해 탈안정화 효과(응집)를 가지며, 이는 다중-용량 단백질 제형에서 그것의 용도를 제한하는 주요 인자가 되어 왔다. 현재까지, 대부분의 단백질 약물은 단일-용도용으로만 제형화되어 왔다. 그러나, 다중-용량 제형이 가능한 경우, 이들은 환자 편의성, 및 시장성 증가를 가능하게 하는 부가된 이점을 갖는다. 좋은 예는 인간 성장 호르몬 (hGH)의 것이며, 여기서 보존된 제형의 개발은 더 편리한, 다용도 주사 펜 제시의 상업화를 야기하였다. hGH의 보존된 제형을 함유하는 적어도 4개의 상기 펜 기기가 현재 시장에서 이용가능하다. 노디트로핀(액체, Novo Nordisk), 뉴트로핀 AQ(액체, Genentech) & 제노트로핀(동결건조된--이중 챔버 카트리지, Pharmacia & Upjohn)은 페놀을 함유하는 반면 소마트로프(일라이 릴리)는 m-크레졸을 이용하여 제형화된다.
몇 가지 측면은 보존된 투여 형태의 제형 및 개발 동안 고려되어야 한다. 의약품에서 효과적인 보존제 농도는 최적화되어야 한다. 이는 단백질 안정성을 손상시키지 않으면서 항-미생물 유효성을 제공하는 농도 범위로 상기 투여 형태 내의 제시된 보존제를 시험하는 것을 필요로 한다.
예상되는 바와 같이, 보존제를 함유하는 액체 제형의 개발은 동결건조된 제형보다 더 도전적이다. 동결건조된 생성물은 보존제 없이 동결건조되어 사용 시점에 희석제를 함유하는 보존제를 이용하여 재구성될 수 있다. 이는 보존제가 단백질과 접촉되는 시간을 단축시켜, 관련된 안정성 위험을 현저히 최소화한다. 액체 제형을 이용하여, 보존제 유효성 및 안정성은 전체 생성물 유통기한(약 18 내지 24개월) 동안 유지되어야 한다. 유의할 중요한 점은 보존제 유효성이 활성 약물 및 모든 부형제 성분을 함유하는 최종 제형에서 입증되어야 한다는 것이다.
OSMR 항원 결합 단백질 제형은 일반적으로 무엇보다도 생체이용률 및 지속성의 범위로, 투여의 특정 경로 및 방법을 위해, 투여의 특정 투여 투여량 및 빈도를 위해, 특정 질환의 특정 치료를 위해 설계될 것이다. 따라서, 제형은 비제한적으로 경구로, 귀로, 안과적으로, 직장으로, 및 질을 포함하는 임의의 적합한 경로에 의한 전달을 위해, 그리고 정맥내 및 동맥내 주사, 근육내 주사, 및 피하 주사를 포함하는, 비경구 경로에 의한 전달을 위해 본 발명에 따라 설계될 수 있다.
상기 약제학적 조성물이 제형화되면, 이는 용액, 현탁액, 겔, 유화액, 고체, 결정, 또는 탈수되거나 동결건조된 분말로서 멸균된 바이알 내에 보관될 수 있다. 그러한 제형은 바로 사용가능한 형태로 또는 투여 전에 재구성되는 형태(예를 들면, 동결건조된)로 보관될 수 있다. 본 발명은 또한 단일-용량 투여 단위를 생산하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 건조된 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제형을 갖는 제2 용기 모두를 각각 함유할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 단일 및 다중-챔버의 미리-충전된 주사기(예를 들면, 액체 주사기 및 라이오주사기)를 함유하는 키트가 제공된다.
이용될 OSMR 항원 결합 단백질-함유 약제학적 조성물의 치료적 유효량은, 예를 들면, 치료적 문맥 및 목적에 좌우될 것이다. 당해분야의 숙련가는 치료를 위한 적절한 투여량 수준이, 부분적으로, 전달된 분자, OSMR 항원 결합 단백질이 사용되고 있는 적응증, 투여 경로, 및 환자의 크기(체중, 체표면 또는 장기 크기) 및/또는 상태(연령 및 일반적인 건강)에 따라 달라질 것임을 인식할 것이다. 어떤 구현예에서, 임상의는 최적의 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 변형할 수 있다. 전형적인 투여량은 상기 언급된 인자에 따라, 약 0.1 μg/kg부터 최대 약 30 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 특정한 구현예에서, 상기 투여량은 1.0 μg/kg부터 최대 약 20 mg/kg, 임의로 10 μg/kg부터 최대 약 10 mg/kg 또는 100 μg/kg부터 최대 약 5 mg/kg의 범위일 수 있다.
OSMR 항원 결합 단백질의 치료적 유효량은 바람직하게는 질환 증상의 중증도의 감소, 무증상 기간의 빈도 또는 지속시간의 감소, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 야기한다.
약제학적 조성물은 의료 기기를 이용하여 투여될 수 있다. 약제학적 조성물을 투여하기 위한 의료 기기의 예는 모두 본원에 참고로 편입된 U.S. 특허 제4,475,196호; 제4,439,196호; 제4,447,224호; 제4,447,233호; 제4,486,194호; 제4,487,603호; 제4,596,556호; 제4,790,824호; 제4,941,880호; 제5,064,413호; 제5,312,335호; 제5,312,335호; 제5,383,851호; 및 제5,399,163호에 기재되어 있다.
OSMR-연관된 질환 또는 장애를 진단하거나 치료하는 방법
본 발명의 OSMR 항원 결합 단백질은 생물학적 샘플에서 OSMR을 검출하는데 특히 유용하다. 어떤 구현예에서, 환자로부터 수득된 생물학적 샘플은 OSMR 항원 결합 단백질과 접촉된다. 이후, OSMR 항원 결합 단백질의 OSMR에의 결합이 검출되어 샘플 내의 OSMR의 존재 또는 상대적인 양을 결정한다. 상기 방법은 OSMR 항원 결합 단백질 치료를 잘 받아들이는 환자를 진단하거나 결정하는데 유용할 수 있다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 OSMR 항원 결합 단백질은 자가면역 장애, 염증성 장애, 또는 세포외 매트릭스 침착 또는 리모델링과 연관된 장애를 진단하거나, 검출하거나, 또는 치료하는데 사용된다.
이들 장애를 치료하는데 있어서, OSMR 항원 결합 단백질은 파괴를 위해 면역계의 OSMR-발현 세포를 표적화하고/거나 OSM 및/또는 IL-31과 OSMR의 상호작용을 차단할 수 있다.
OSMR-매개된 신호전달과 연관된 질환 또는 장애는 본원에 개시된 하나 이상의 OSMR 항원 결합 단백질을 이용한 치료를 특히 잘 받아들인다. 그러한 장애는, 비제한적으로, 염증, 통증, 소양증, 결절성 양진, 피부염, 천식, 자가면역 질환, 방종양성 자가면역 질환, 연골 염증, 섬유증(비제한적으로, 폐 섬유증 및 피부 섬유증을 포함함), 섬유성 질환, 만성적 폐쇄성 폐 질환(COPD), 간질성 폐렴, 비정상 콜라겐 침착, 전신 피부 아밀로이드증, 일차 피부 아밀로이드증, 베체트병, 코 용종증, 간경변증, 연골 저하, 골 저하, 관절염, 류마티스성 관절염, 소아 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 소수관절 소아 류마티스성 관절염, 다수관절 소아 류마티스성 관절염, 전신 개시 소아 류마티스성 관절염, 유년성 강직 척추염, 유년성 장병증성 관절염, 유년성 반응성 관절염, 유년성 라이터 증후군, SEA 증후군(혈청음성, 부착부위병증, 관절병증 증후군), 유년성 피부근염, 유년성 건선성 관절염, 유년성 경피증, 유년성 전신 홍반성 낭창, 유년성 혈관염, 소수관절 류마티스성 관절염, 다수관절 류마티스성 관절염, 전신 개시 류마티스성 관절염, 강직 척추염, 장병증성 관절염, 반응성 관절염, 라이터 증후군, SEA 증후군(혈청음성, 부착부위병증, 관절병증 증후군), 피부근염, 건선성 관절염, 경피증, 경피증-연관된 간질성 폐 질환, 혈관염, 근염, 다발성근염, 피부근염, 결정성 다발동맥염, 베게너 육아종증, 동맥염, 류마티스 다발근육통, 유육종증, 경피증, 경화증, 일차 담도성 경화증, 경화 담관염, 쇼그렌 증후군, 건선, 판상 건선, 적상 건선, 역형 건선, 농포성 건선, 홍피성 건선, 피부염, 아토피 피부염, 죽상경화증, 낭창, 스틸 질환, 전신 홍반성 낭창(SLE), 중증 근무력증, 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 궤양성 대장염, 소아지방변증, 다발성 경화증(MS), 천식, COPD, 비부비동염, 용종을 갖는 비부비동염, 호산구성 식도염, 호산구성 기관지염, 기관지염, 길랑-바레 질환, I형 진성 당뇨병, 갑상선염(예를 들면, 그레이브스병), 애디슨병, 레이노 현상, 자가면역 간염, GVHD, 이식 거부, 신장 손상, 심혈관 질환, 감염, 패혈증, HIV 감염, 외상, 신장 동종이식편 신병증, IgA 신병증, 당뇨병성 신병증, 당뇨 망막병증, 황반 변성, 담도성 폐쇄증, 울혈성 심장기능상실, 죽상경화증, 재협착증, 방사선-유도된 섬유증, 화학요법-유도된 섬유증, 화상, 수술 외상, 사구체경화증, 등을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 자가면역 장애, 염증성 장애, 또는 세포외 매트릭스 침착 또는 리모델링과 연관된 장애는 섬유증, 연골 저하, 관절염, 류마티스성 관절염, 경피증, 경피증-연관된 간질성 폐 질환, 특발성 폐 섬유증, 경변증, 건선, 아토피 피부염, 전신 피부 아밀로이드증, 일차 피부 아밀로이드증, 염증, 소양증 염증, 결절성 양진, 및 통증이다.
어떤 구현예에서, 본 발명의 OSMR 항원 결합 단백질은 암 또는 종양유발성 장애를 진단하거나, 검출하거나, 또는 치료하기 위해 사용된다. 암 또는 종양유발성 장애를 치료하는데 있어서, OSMR 항원 결합 단백질은 파괴를 위해 OSMR-발현 세포를 표적화하고/거나 OSM 및/또는 IL-31의 OSMR과의 상호작용을 차단함으로써 OSMR 매개된 신호전달을 감소시킨다. OSM- 및/또는 IL-31-매개된 신호전달을 차단하는 OSMR 항원 결합 단백질이 암 환자에서 개선된 생존을 촉진하는데 유용할 것임이 고려된다. OSMR 항원 결합 단백질을 이용하여 진단되거나, 검출되거나, 또는 치료될 수 있는 암 또는 종양유발성 장애는, 비제한적으로, 고형 종양, 일반적으로, 폐암, 난소암, 유방암, 전립선암, 자궁내막 암, 신장 암, 식도암, 췌장암, 편평상피 세포 암종, 포도막 흑색종, 자궁경부암, 결장직장 암, 방광, 뇌, 췌장, 머리, 목, 간, 백혈병, 림프종 및 호지킨 질환, 다발성 골수종, 흑색종, 위암, 성상세포 암, 위, 및 폐 선암종을 포함한다.
항원 결합 단백질은 종양 성장, 진행, 및/또는 전이를 억제하는데 사용될 수 있다. 그러한 억제는 다양한 방법을 이용하여 모니터링될 수 있다. 예를 들면, 억제는 감소된 종양 크기 및/또는 종양 내에서 대사 활성의 감소를 야기할 수 있다. 이들 변수 모두는 예를 들면 MRI 또는 PET 스캔에 의해 측정될 수 있다. 억제는 또한 종양 내에서 괴사의 수준, 종양 세포 사멸, 및 혈관질의 수준을 확인하기 위해 생검에 의해 모니터링될 수 있다. 전이 정도는 공지된 방법을 이용하여 모니터링될 수 있다.
본원에 제공된 임의의 그리고 모든 실시예, 또는 예시적인 언어(예를 들면, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명의 구현예를 더 잘 예시하기 위한 것이며 달리 청구된 않는 한 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 명세서 내의 언어는 어떤 청구되지 않은 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 가리키는 것으로서 해석되지 않아야 한다.
실시예
실제적이고 예언적인 실시예는 본 발명의 특정 구현예 또는 특징을 예시하기 위해 제공되며 그 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1: XENOMOUSE® 플랫폼을 이용한 항-OSMR 항체의 생산
인간 OSMR에 대한 완전 인간 항체를 XENO마우스® 기술을 이용하여 생성하였다(그 전체가 참고로 본원에 편입된 미국 특허 제6,114,598호; 제6,162,963호; 제6,833,268호; 제7,049,426호; 제7,064,244호; 및 Green 등, Nature Genetics 7:13-21, 1994; Mendez 등, Nature Genetics 15:146-56; 1997; Green 등, J. Ex. Med. 188:483-95, 1998; 및 Kellermann 등, Current Opinion in Biotechnology, 13:593-7, 2002에 기재된 바와 같음).
OSMR에 대한 항체를 생산하기 위해, XENOMOUSE® 동물, 즉, XMG2-KL 및 XMG4-KL 마우스의 2개의 상이한 균주를 인간 OSMR-Fc 가용성 단백질(Amgen, Seattle, WA에 의해 제조됨)로 면역화하였다. 적합한 양의 면역원(즉, 10 μg/마우스의 가용성 인간 OSMR-Fc 단백질)을, 그 개시내용이 참고로 본원에 편입된 1996년 12월 3일에 출원된 미국 특허 출원 제08/759,620호 및 1998년 6월 11일에 공개된 국제 특허 출원 제WO 98/24893호 및 2000년 12월 21일에 공개된 제WO 00/76310호에 개시된 방법에 따라 XENOMOUSE® 동물의 초기 면역화를 위해 사용하였다. 초기 면역화 후, 면역원(5 μg/마우스의 가용성 인간 OSMR-Fc 단백질)의 차후의 부스트 면역화를 스케줄에 따라 그리고 마우스에서 항-OSMR 항체의 적합한 역가를 유도하는데 필요한 지속시간 동안 투여하였다.
제1 주사 후 약 4주에 혈청을 수집하고 특이적 역가를 ELISA에 의해 결정하였다. XENOMOUSE® 동물을 하기와 같이 적정하는데 사용된 프로토콜은 하기와 같았다: Costar 3368 배지 결합 플레이트를 8μg/mL(50 μL/웰)의 뉴트라비딘으로 코팅하고 1XPBS/0.05% 아자이드 중에서 밤새 4℃에서 배양하였다. 플레이트를 RO 물로 TiterTek 3-사이클 세정을 이용하여 세정하였다. 플레이트를 250 μL의 1XPBS/1%milk를 이용하여 차단하고 적어도 30분간 실온에서 배양하였다. 블록을 RO 물로 TiterTek 3-사이클 세정을 이용하여 세정하였다. 그리고 나서 1XPBS/1%milk/10mM Ca2+(분석 희석제) 50 μl/웰 중에 2 μg/mL의 바이오티닐화된 huOSMR-FNFH(Amgen, Seattle, WA에 의해 제조됨)를 캡처하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 RO 물로 TiterTek 3-사이클 세정을 이용하여 세정하였다. 일차 항체의 경우, 혈청을 1:100으로부터 1:3 반복하여 적정하였다. 이는 분석 희석제 50 μL/웰에서 수행하였고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 RO 물로 TiterTek 3-사이클 세정을 이용하여 세정하였다. 2차 항체는 50 μL/웰의 분석 희석제 중에서 400 ng/mL의 염소 항 인간 IgG Fc HRP였다. 이를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, 이것을 RO 물로 TiterTek 3-사이클 세정을 이용하여 세정하고 종이 타올 상에서 두드려 건조하였다. 기질의 경우, 1-단계 TMB 용액(Neogen, Lexington, Kentucky)을 사용하였고(50 μL/웰), 상기 기질을 실온에서 30분 동안 현상하였다.
적합한 역가를 나타내는 동물들을 확인하였다. 5마리의 XMG2KL 동물을 OSMR에 대한 특이적 IgG 면역 반응으로 확인하였다. 비장 및 유출(draining) 림프절을 이들 동물로부터 수확하였고 하이브리도마 생성을 위해 함께 모았다. 특이적 면역 반응을 갖는 5마리의 XMG4KL 동물을 유사하게 수확하고 별개의 융합 스크리닝 캠페인으로서 진행시켰다. 면역 동물 유래의 농축된 B 세포를 비-분비성 골수종 P3 x 63Ag8.653 세포((미국 종균 협회 CRL-1580; Kearney et al, J. Immunol. 123: 1548-50, 1979)에 융합시켜 표준 기술을 이용하여 하이브리도마를 생성하였다(Kohler 등, Nature 256, 495-7, 1975).
그리고 나서, 하이브리도마를 96-웰 조직 배양판 상에 고밀도(웰당 다수의 상이한 하이브리도마 클론)로 플레이팅하고 4주간 성장시켰다. 하이브리도마 주 상청액을 형광 마이크로용적 분석 기술(FMAT)(Applied Biosystems, Foster City, CA)에 의해 일시적으로 형질감염된 293T 세포 상에 발현된 전장 인간 및 사이노몰구스 OSMR에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 요약하면, 384-웰 FMAT 플레이트에서, 3,000 OSMR 293T 형질감염된 세포 및 15,000 모(parental) 293T 세포의 40 μl 혼합물을 15 μL의 하이브리도마 상청액 및 10 μL의 항-인간 경쇄(hukappa/hulambda) Alexa647(Invitrogen, Carlsbad, CA) 표지된 2차 항체(1.0 μg /mL 최종 농도)와 조합하였다. 그리고 나서, 플레이트를 실온에서 3시간 동안 배양하고 형광을 FMAT 판독기를 이용하여 판독하였다. 이들 스크린은 인간 및 사이노몰구스 OSMR 모두에 결합하는 885 하이브리도마주를 확인하였다.
실시예 2: 인간 OSMR-차단 분석
인간 OSMR을 통한 신호전달을 차단하는 OSMR 항체의 능력을 리간드로서 인간 온코스타틴 M(OSM) 또는 인간 인터루킨 31(IL-31) 중 하나를 이용한 2개의 분석을 이용하여 결정하였다. 조합으로, 상기 분석들을 사용하여 항체가 OSM 및/또는 IL-31의 결합을 통해 촉발된 OSMR의 신호전달을 억제할 수 있는지 결정하였다.
제1 스크린에서, 항체를 대상으로 OSMR을 통해 OSM의 신호전달을 차단하는 이들의 능력을 평가하였다. OSM을 이용한 일차 정상 인간 폐 섬유아세포의 자극은 STAT3의 인산화 및 그의 차후의 핵으로의 전좌를 유도한다. 세포를 Costar 384-웰 플레이트에 3000 세포/웰로 시딩하고 밤새 부착시켰다. 세포를 항체 상청액으로 20분간 전처리한 다음, 80 pM 인간 OSM으로 30분 동안 자극시켰다. 그리고 나서, 세포를 PBS에서 3X 세정하고, 3.5% 포름알데하이드 용액으로 고정시키고, 세정하고(PBST에서 3X) 0.5% 트리톤 X-100 용액으로 투과시켰다. 그리고 나서, 세포를 항-포스포STAT3 항체로 1시간 동안 염색하고, 세정하고 AlexaFluor 접합된 항체(모두 Cellomics사의 HitKit 내에 함유됨)로 염색하였다. 플레이트를 덮고 Cellomics 전매 알고리즘을 이용하여 ArrayScan 기기상에서 판독하여 핵 세기 값 및 세포질 세기 값을 생성하였다. 결과를 이들 두 값 사이의 차이로서 보고하였고, 최대로 자극된 세포 및 배지-처리된 세포(POC)를 함유하는 대조군 데이터에 대해 추가로 정규화하였다.
제2 분석에서, 항체를 대상으로 인간 IL-31RA4 및 OSMR을 과발현한 안정한 세포주에서 OSM을 통해 IL-31의 증식성 신호를 억제하는 이들의 능력을 평가하였다. BaF3 세포를 2가지 플라스미드로 안정적으로 형질감염시켰다: pcDNA3.1 + huOSMRb (NeoR) 및 pcDNA3.1 + huIL31RA4 (ZeoR). 쥣과 Il-3의 부재시, 이 세포주는 단지 인간 IL-31에 대한 반응으로 증식할 수 있으며, 따라서, 항-OSMR 항체의 차단 능력을 특이적으로 평가하기 위해 사용될 수 있다. BaF3 세포를 20,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 항체 및 리간드(huIL-31, Peprotech)를 100 μL의 최종 부피로 웰에 부가하고, 플레이트를 5% CO2, 37C 가습 챔버에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 후, 20 μL의 알라마르 블루를 각 웰에 부가하고 플레이트를 배양기에 다시 넣었다. 플레이트를 알라마르 블루 부가 후 다양한 시점에 분자 기기 Vmax 플레이트 리더(570-600 nm) 상에서 판독하였다.
2가지 분석 결과가 하기 표 4에 제시되어 있다. 3000개가 넘는 하이브리도마 상청액을 이들 두 분석에서의 차단 능력에 대해 스크리닝하였고; 상위 200개의 차단제를 4-포인트 적정에서 추가 시험하였고, 14개를 재조합 단백질의 생산 및 추가 시험을 위해 선택하였다. 3개의 예시적인 항체(항체 1-3)에 대한 IC50이 두 분석에 대해 나타나 있다. 일부 항체는 이들이 IL-31-유도된 증식을 억제한 것보다 더 완전하게 OSM-유도된 STAT3 전좌를 억제하였고, 그 반대였다. 하지만, 3개의 모든 항체는 OSM- 및 IL-31 매개된 신호전달의 강력한 억제제였다.
표 4
Figure 112018071894158-pat00006
실시예 3: 사이노몰구스 OSMR 차단 분석
사이노몰구스 OSMR을 통해 신호전달을 차단하는 OSMR 항체의 능력을 리간드로서 인간 OSM 또는 인간 IL-31 중 하나를 이용한 2가지 분석을 이용하여 조사하였다.
제1 스크린에서, 항체를 대상으로 일차 신장 상피 세포주를 이용하여 사이노몰구스 OSMR을 통한 OSM의 신호전달을 차단하는 이들의 능력을 평가하였다. 사이노몰구스(cyno) OSM을 이용한 이들 세포의 자극은 STAT3의 인산화 및 그의 차후의 핵으로의 전좌를 유도한다. 세포를 Costar 384-웰 플레이트에 3000 세포/웰로 시딩하고 밤새 부착시켰다. 세포를 항체 상청액으로 20분간 전처리한 다음, 80 pM cyno OSM으로 30분 동안 자극시켰다. 그리고 나서, 세포를 PBS에서 3X 세정하고, 3.5% 포름알데하이드 용액으로 고정시키고, 세정하고(PBST에서 3X) 0.5% 트리톤 X-100 용액으로 투과시켰다. 그리고 나서, 세포를 항-포스포STAT3 항체로 1시간 동안 염색하고, 세정하고 AlexaFluor 접합된 항체(모두 Cellomics사의 HitKit 내에 포함됨)로 염색하였다. 플레이트를 덮고 Cellomics 전매 알고리즘을 이용하여 ArrayScan 기기상에서 판독하여 핵 세기 값 및 세포질 세기 값을 생성하였다. 결과를 이들 두 값 사이의 차이로서 보고하였고, 최대로 자극된 세포 및 배지-처리된 세포(POC)를 함유하는 대조군 데이터에 대해 추가로 정규화하였다.
제2 분석에서, 항체를 대상으로 cyno IL-31RA 및 OSMR을 과발현한 안정한 세포주에서 사이노몰구스 OSMR을 통해 IL-31의 증식성 신호를 억제하는 능력을 평가하였다. 실시예 2와 유사하게, BaF3 세포를 20,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 항체 및 리간드(사이노몰구스 IL-31, 인하우스, 즉, Amgen, Seattle, WA)를 100 μL의 최종 부피로 웰에 부가하고, 플레이트를 5% CO2, 37C 가습 챔버에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 후, 20 μL의 알라마르 블루를 각 웰에 부가하고, 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣었다. 플레이트를 알라마르 블루의 부가 후 다양한 시점에 분자 기기 Vmax 플레이트 리더(570-600 nm) 상에서 판독하였다.
두 분석의 결과가 하기 표 5에 나타나 있고, 각 항체에 대한 IC50이 두 분석에 대해 나타나 있다. 상기 결과는 각각의 항체 1, 2, 및 3이 OSM- 및 IL-31 매개된 신호전달의 강력한 억제제임을 확인한다.
표 5
Figure 112018071894158-pat00007
실시예 4: 항-OSMR 항체의 에피토프 비닝(Binning)
항-OSMR xenomouse 항체의 에피토프를 규명하기 위해 항체 경쟁 연구를 수행하였다. 서로 경쟁하는 항체는 표적 상의 동일한 부위에 결합하는 것으로 생각될 수 있다. 이들 실험에서, OSMR 또는 무관한 항체들이 캡처 항체(바이오티닐화된 1가 마우스 항-인간 IgG Fc 항체)에 미리 결합된 스트렙타비딘-코팅된 루미넥스 비드 상에 캡처되었다. OSMR 항원 또는 버퍼(항원 없음)를 웰에 부가하고, 프로브 항체를 각 웰에 부가하고 PE-표지된 1가 마우스 항-인간 IgG Fc 항체로 검출하였다. 각 웰의 평균 형광 세기를 측정하였다. 전체 참조를 위해, 문헌[Jia 등, J. Immunol. Methods 288: 91-8, 2004]을 참조한다. 주어진 웰에서의 형광의 검출은, 다른 OSMR 항체의 존재시에도, 상기 프로브가 OSMR에 결합할 수 있음을 보여주었고, 이는 이들이 별개의 에피토프에 결합한다는 것을 입증한다. 하기 표 6에 나타나 있는 바와 같이 3개의 빈(bin)의 최소값이 확인되었다.
표 6
Figure 112018071894158-pat00008
실시예 5: 항-OSMR 항체의 친화도 결정
항-OSMR 항체의 친화도를 결정하였다. 인간 OSMR에 대한 항체 1-3(Abs 1-3)의 상호작용을 조사하기 위해 동력학 속도 상수를 결정하였다.
바이오센서 분석을 CM5 센서 칩이 구비된 Biacore 3000 광학적 바이오센서를 이용하여 HBS-EP+ (1X) 완충 시스템(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.0 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20)에서 25℃에서 수행하였다. 모든 시약은 주사 전에 8℃에서 유지하였다. 염소 항-인간 IgG(Jackson ImmunoResearch, #109-005-098)를 유동 전지 1 및 2에의 표준 아민 커플링을 통해 센서 칩에 고정시킨 다음(~3000 RU), 에탄올아민으로 차단시켰다. hOSMR.FH를 150 nM의 작동 완충제에서 제조하고 0.617 nM로 3배 희석하였다. 항체 1-3을 작동 완충제에서 희석하였다(0.25 내지 0.5 μg/mL). 상기 항체를 10 μL/분의 유속으로 유동 전지 2 위에 주사하였다(15 μL). 약 50 RU의 항체가 캡처되었다. 상기 표면을 안정화시킨 다음(90초), 각각의 농도(150, 50.0, 16.7, 5.56, 1.85 및 0.617)의 hOSMR을 50 μL/분의 유속으로 유동 전지 1 및 2 위를 통과시켜 결합(5분) 및 해리(5분)를 관찰하였다. 샘플을 반복하여 그리고 무작위 순서로 진행시켰다.
버퍼 분석물 블랭크(0 nM hOSMR)를 샘플 주사 전, 사이 및 후에 주사하였다. 항체를 10 μL/분의 유속으로 유동 전지 2 위에 주사하였다(15 μL). 약 50 RU의 항체가 캡처되었다. 표면을 안정화시킨 다음(90초), 각각의 농도(150 nM)의 hOSMR을 50 μL/분의 유속으로 유동 전지 1 및 2 위를 통과시켜 결합(5분) 및 해리(1-2시간)를 관찰하였다. 상기 샘플을 3회 반복하여 진행시켰다.
버퍼 분석물 블랭크(0 nM hOSMR)를 샘플 주사 전과 후에 주사하였다. 표면을 10 mM 글리신(pH 1.5, 50 μL)의 2번 주사로 50 μL/분의 유속으로 재생시켰다. 이후, 버퍼 블랭크를 주사하였다(15초).
데이타를 하기와 같이 스크러버 2.0 소프트웨어로 분석하였다. 유동 전지 1(블랭크 참조)로부터의 데이터로부터 유동 전지 2로부터의 데이타를 차감하였다. 이후, 가장 가까운 0 nM 농도 데이터로부터 상기 참조 차감된 데이타(2-1)를 차감하였다(이중 참조됨). 상기 이중 참조된 긴 해리 데이타를 1:1 결합 모델에 핏팅하여 해리 속도 상수(kd)를 결정하였다. 결합 속도 상수(ka) 및 평형 해리 상수(Kd)를 결정하기 위하여, 이 해리 속도 상수를 고정된 파라미터로 사용하여 이중 참조된 짧은 해리 데이타를 1:1 결합 모델에 핏팅하였다.
상기 시약들은 실험 조건하에 잘 작동하였고, 데이타(하기 표 7 참고)는 1:1 결합 모델에 매우 잘 핏팅하였다.
표 7
Figure 112018071894158-pat00009
실시예 6: 항-OSMR 항체
인간 OSMR에 대한 완전 인간 항체를 실시예 1에 상기 기술된 XENOMOUSE® 기술을 이용하여 생성하였다. 각각의 항체 1, 2, 및 3은 OSM- 및/또는 IL-31-매개된 신호전달의 강력한 억제제인 것으로 입증되었다. 항체 1, 2, 및 3(즉, Ab1, Ab2, 및 Ab3)의 서열을 결정하였고, 이는 하기 표 8에 제시되어 있다.
표 8
Figure 112018071894158-pat00010
Figure 112018071894158-pat00011
Figure 112018071894158-pat00012
Figure 112018071894158-pat00013
Figure 112018071894158-pat00014
실시예 7: 변형된 항-OSMR 항체
Ab1, Ab2, 및 Ab3의 변형된 형태를 생성하였다. 항체의 모든 3개의 변형된 형태의 경우, 중쇄의 C 말단에 있는 라이신이 제거되었다. Ab1 및 Ab2의 경우, 위치 73에 있는 아스파리긴을 아스파르트산으로 치환함으로써 위치 73에 있는 당화 부위가 제거되었다. 이들 변이체는 Ab1-N73D 및 Ab2-N73D로 불린다. 상기 변형된 항체의 서열이 하기 표 9에 제시되어 있다(상기 변형된 뉴클레오타이드 및 아미노산은 밑줄되어 있음).
표 9
Figure 112018071894158-pat00015
Figure 112018071894158-pat00016
Figure 112018071894158-pat00017
상이한 Fc 영역을 갖는 Ab1 또는 Ab2의 가변 영역을 함유하는 항체(또는 Ab1 또는 Ab2의 N73D 변이체)를 이용한 다양한 포맷(결합능-없는 포맷을 위한 캡처 ELISA; 용액상 포맷을 위한 샌드위치 ELSIA; 및 고체 상태 결합능 포맷을 위한 직접적인 ELISA) 하에 ELISA 실험을 수행하였다.
Ab1 및 Ab2 각각은 인간 IgG2 기원의 CH1, CH2, CH3 도메인을 함유한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "Ab1" 및 "Ab1 IgG2 WT"는 동일한 항체를 지칭한다. 유사하게, 용어들 "Ab2" 및 "Ab2 IgG2 WT"는 동일한 항체를 지칭한다.
"IgG4P agly / IgG1"로서 확인된 항체들은 인간 IgG4로부터의 CH1 도메인에 융합된 Ab1 또는 Ab2의 가변 영역(또는 Ab1 또는 Ab2의 N73D 변이체), 셔플링을 감소시키는 Ser에서 Pro 돌연변이(위치 228에서)를 갖는 인간 IgG4로부터의 힌지, N-연결된 당화 부위를 제거하는 Asn에서 Gln 돌연변이(위치 297에서)를 갖는 인간 IgG4로부터의 CH2 도메인, 및 인간 IgG1으로부터의 CH3 도메인을 함유한다. "IgG4P agly / IgG1" 프레임워크는 US 공개된 특허 출원 US 제2012/0100140호에 기재되어 있다.
상기 ELISA 결과들은 N73D 치환을 통한 당화 부위의 제거가 상기 변형된 항체가 OSMR에 결합하는데 영향을 미치지 않았다는 것을 보여주었다. 표 10을 참조한다.
표 10
Figure 112018071894158-pat00018
결합 연구를 BIAcore 방법을 이용하여 수행하였다. 상이한 Fc 영역을 갖는 Ab1 또는 Ab2의 가변 영역을 함유하는 항체(또는 Ab1 또는 Ab2의 N73D 변이체)를 제조자의 프로토콜에 따라 CM4 칩(GE lifesciences) 상에 고정시켰다. 가용성 OSMR을 분석물로서 사용하였다. N73D 치환을 통해 Ab1 및 Ab2 상의 당화 부위를 제거하는 것은 결합 친화도를 개선하였다. Ab1의 경우, 상기 치환은 Kon 속도를 개선한 반면, Ab2의 경우 그것은 Koff 속도를 개선하였다. 표 11을 참조한다.
표 11
Figure 112018071894158-pat00019
Fab 단편의 안정성을 항체의 열적 언폴딩을 평가함으로써 결정하였다. Fab 단편의 높은 용융 온도는 안정성 증가와 직접 상호관련된다. 차별적인 스캐닝 형광측정법 실험에 의해 평가된 바와 같이, N73D 치환을 통한 Ab2 상의 당화 부위의 제거는 Fab 단편의 열적 안정성에 영향을 미치지 않았고 Ab1 상에 작은 효과를 나타내었다. 표 12를 참조한다.
표 12
Figure 112018071894158-pat00020
인간 OSMR을 통해 신호전달을 차단하는 변형된 항-OSMR 항체의 능력을 평가하였다. 상기 변형된 항체를 대상으로 IL31, OSM, 또는 IL31 및 OSM의 존재하에 BaF_hu-IL31R/OSMR/gp130 세포주의 증식을 억제하는 능력을 평가하였다. 상기 결과가 하기 표 13 및 14에 제시되어 있으며, 각 항체에 대한 IC50이 나타나 있다. 상기 결과들은 Ab1 및 Ab2의 변형된 형태가 OSM- 및 IL-31-매개된 신호전달의 강력한 억제제임을 확인한다.
표 13
Figure 112018071894158-pat00021
표 14
Figure 112018071894158-pat00022
상기 개시내용은 개시내용의 실시를 위한 특정 방식을 포함하는 것으로 나타나거나 제안된 특정 구현예 측면에서 기술되었다. 기재된 발명의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 당해분야의 숙련가에게 분명할 것이다. 본 발명은 특정 구현예와 관련하여 기재되었지만, 청구된 본 발명은 그러한 특정 구현예에 과도하게 제한되지 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 사실상, 관련 분야에서 숙련자에게 자명한 발명을 수행하기 위한 기술된 방식의 다양한 변형이 하기 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOGEN IDEC MA INC. <120> ONCOSTATIN M RECEPTOR ANTIGEN BINDING PROTEINS <130> 13751-0155WO1 <140> PCT/US2014/040360 <141> 2014-05-30 <150> 61/829,082 <151> 2013-05-30 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 979 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> source <223> /note="Human OSMR" <400> 1 Met Ala Leu Phe Ala Val Phe Gln Thr Thr Phe Phe Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Arg Thr Tyr Gln Ser Glu Val Leu Ala Glu Arg Leu Pro Leu 20 25 30 Thr Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Thr Asn Ser Thr Arg Gln Ser Leu 35 40 45 His Leu Gln Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gln Glu Leu Lys 50 55 60 Met Val Phe Gln Ile Gln Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser Asn Val Ile 65 70 75 80 Trp Val Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gln Val Leu His 85 90 95 Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr His Phe Val 100 105 110 Arg Ile Lys Ser Leu Val Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu Pro Asn Phe 115 120 125 Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gln Asp Ser Thr 130 135 140 Gly 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gatgggatgg atgaacccta acagtggtta cacaggctat 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cctccataag cacagcctac 240 atggaaatga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatata 300 gtggctgcga atacggatta ctacttctat tatggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acggtcaccg tctcctcagc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcgccctgc 420 tccaggagca cctccgagag cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gctctgacca gcggcgtgca caccttccca 540 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 600 aacttcggca cccagaccta cacctgcaac gtagatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660 gacaagacag ttgagcgcaa atgttgtgtc gagtgcccac cgtgcccagc accacctgtg 720 gcaggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780 acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccccga ggtccagttc 840 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccacg ggaggagcag 900 ttcaacagca cgttccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgttg tgcaccagga ctggctgaac 960 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaaggcctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020 atctccaaaa ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc 1140 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacacct 1200 cccatgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggt 1353 <210> 49 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 49 caggttcatc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctatggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg ctcagcactt acagtggtaa cacaaactat 180 gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagggaac 300 ttctactact acggtatgga cgtctggggc caggggacca cggtcaccgt ctcctcagct 360 agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccag ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca acttcggcac ccagacctac 600 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagacagt tgagcgcaaa 660 tgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagca ccacctgtgg caggaccgtc agtcttcctc 720 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg 780 gtggtggacg tgagccacga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggacggcgtg 840 gaggtgcata atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 900 gtcagcgtcc tcaccgttgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 960 gtctccaaca aaggcctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1020 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1080 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacacctc ccatgctgga ctccgacggc 1200 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320 ctgtctccgg gt 1332 <210> 50 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 50 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Ile Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Met Val Ala Ala Asn Thr Asp Tyr Tyr Phe Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr 130 135 140 Ser Glu Ser 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Claims (74)

  1. 온코스타틴 M 수용체(OSMR) 결합 항체를 포함하는 소양증 치료용 조성물로서, 상기 조성물은 소양증의 중증도를 감소시키는 치료적 유효량으로 인간 환자에게 주사되는 것을 특징으로 하며,
    상기 항체는 서열식별번호: 28의 경쇄 가변 도메인 및 서열식별번호: 54의 중쇄 가변 도메인으로 정의된 항-OSMR 항체와 교차-경쟁하며,
    상기 OSMR 결합 항체는 OSM 및 IL-31 신호전달 둘 다를 억제하는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 OSMR 결합 항체는 정맥내 주사되는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 OSMR 결합 항체는 피하 주사되는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 0.1 μg/kg 내지 30 mg/kg의 범위인 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 1 μg/kg 내지 20 mg/kg의 범위인 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 10 μg/kg 내지 10 mg/kg의 범위인 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 OSMR 결합 항체는 인간화된 항체인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 OSMR 결합 항체는 인간 항체인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 OSMR 결합 항체는 단클론성 항체인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 OSMR 결합 항체는 키메라성 항체인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 OSMR 결합 항체는 IgG1, IgG2, IgG4, 또는 이들의 하이브리드 항체인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 OSMR 결합 항체는 당화되지 않은 것인 조성물.
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