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CN118271441A - 制瘤素m受体抗原结合蛋白 - Google Patents

制瘤素m受体抗原结合蛋白 Download PDF

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CN118271441A
CN118271441A CN202410270260.4A CN202410270260A CN118271441A CN 118271441 A CN118271441 A CN 118271441A CN 202410270260 A CN202410270260 A CN 202410270260A CN 118271441 A CN118271441 A CN 118271441A
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S·S·埃斯科巴
C·T·金
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S·纳拉亚南
P·H·温雷布
N·E·佩德森
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Kiniksa Phamaceuticals Ltd
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Abstract

本发明提供抗制瘤素M受体‑β(OSMR)抗原结合蛋白，例如抗体和其功能片段、衍生物、突变蛋白和变体。OSMR抗原结合蛋白干扰OSM和/或IL‑31与OSMR结合。在一些实施方案中，抗OSMR抗原结合蛋白在研究与OSMR相关的疾病和病症中是有用的工具且在治疗与OSMR及OSM和/或IL‑31与OSMR的结合相关的疾病和病症的方法中尤其有用。

Description

制瘤素M受体抗原结合蛋白
本申请是基于申请日为2014年5月30日，优先权日为2013年5月30日，申请号为201910733125.8，发明名称为：“制瘤素M受体抗原结合蛋白”的专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年5月30日提交的美国临时申请No.61/829,082的优先权的利益，其内容通过引用整体并入本文。
发明背景
制瘤素M(OSM)和白细胞介素-31(IL-31)是IL-6超家族中的成员且共享受体亚基制瘤素M受体-β(OSMR)(Dillon等，Nat.Immunol.5(7)：752-60，2004)。除了IL-31外，这家族所有成员在它们的多聚受体复合物中共享糖蛋白130(gp130)的共有链。OSM通过含有OSMR和gp130的异二聚体受体复合物传导信号，而IL-31利用gp130样受体IL-31R与OSMR的组合(Dillon等，同上；Dreuw等，J.Biol.Chem.279(34)：36112-20，2004)。通常，OSMR和gp130在多种类型组织和细胞上非常广泛地表达，并可在多种刺激条件下被诱导。IL-31R表达似乎相对更加受限且被严格调控。在人和类似的鼠中，IL-31R mRNA表达在诸如气管、骨骼肌、胸腺和骨髓的组织中可以低水平检测到(Dillon等，同上)。尽管表达水平明显不同，但是IL-31R和OSMR在包括皮肤和肠上皮细胞的许多组织上共表达，表明那些组织应响应于IL-31(Dillon等，同上；Dambacher等，Gut 56(9)：1257-65，2007)。虽然OSMR在肺上皮细胞中组成型表达，IL-31R表达在肺组织中为可忽略不计的低水平，但是在各种气道激发的方法中上调(Dillon等，同上；Jawa等，J.Interferon Cytokine Res.28(4)：207-19，2008)。
主要由T淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞分泌的OSM和IL-31在涉及炎症的多种疾病状态中均上调。OSM已参与多种生物作用，包括骨形成、软骨退化、胆固醇摄取、疼痛和炎症(Cawston等，Arthritis Rheum.41(10)：1760-71，1998；Hasegawa等，Rheumatology(Oxford)38(7)：612-7，1999；Levy等，J.Hepatol 32(2)：218-26，2000；Manicourt等，Arthritis，Rheum.43(2)：281-8，2000；de Hooge等，Am J.Pathol.160(5)：1733-43，2002；Luzina等，Arthritis Rheum48(8)：2262-74，2003；Morikawa等，J.Neurosci.24(8)：1941-7，2004；Kong等，J.Lipid Res.46(6)：1163-71，2005)。OSM已被证明在多种情况下是胞外基质(ECM)的有效调节剂，这表明OSM能够介导看似相反的病理性结果，包括纤维化(过量ECM)和软骨退化(ECM分解)。取决于组织类型和周围环境，当OSM过度表达或分别外源性施用于小鼠的肺或关节中时均观察到这些效果(Richards等，Biochem.Soc.Trans.30(2)：107-11，2002；Hui等，Arthritis Rheum.48(12)：3404-18，2003；Rowan等，Am.J.Pathol.162(6)：1975-84，2003)。另外，先前已显示OSM在存在这类结果的人病理中是上调的(Cawston等，同上；Hasegawa等，同上；Levy等，同上；Manicourt等，同上；Luzina等，同上)。大部分情况下，局部作用的细胞因子OSM在患有风湿性关节炎(RA)患者的关节滑液中(Cawston等，同上；Manicourt等，同上)、在患有硬皮病相关的间质性肺病(Luzina等，同上)、特发性肺纤维化(IPF)的患者的支气管肺泡灌洗(BAL)液中，和在患有肝硬化的患者的肝中(Levy等，同上)为上调的。所提出的OSM对ECM的影响可部分地归因于OSM改变基质金属蛋白酶(MMP)与MMP的组织抑制剂(TIMP)之间平衡的能力。TIMP以1：1的比例高亲和力结合至MMP，导致MMP蛋白水解活性的丧失。TIMP-1和TIMP-3先前已显示受到OSM差异调节，导致TIMP-1增加且TIMP-3降低(Gatsios等，Eur.J.Biochem.241(1)：56-63，1996)。除了调节胞外基质组分的消化外，MMP也参与包括TGF-β(一种有效的促纤维化细胞因子)的许多蛋白的裂解和随后活化(Leask等，FASEB J.18(7)816-27，2004)。也已报道OSM能够在体外直接诱导I型胶原蛋白转录(Hasegawa等，J.Rheumatol.25(2)：308-13，1998)。
已在患有牛皮癣和特应性皮炎的患者的皮肤中发现OSM和IL-31的表达，并且OSMR和IL-31R的突变已与全身性皮肤淀粉样变相关。IL-31的整个体系内的转基因过表达诱导小鼠皮肤的瘙痒炎性反应。OSM和IL-31通过神经元上OSMR传导信号，其中已表明它们促发痛感和瘙痒反应。
总的来所，与人疾病以及OSM和IL-31促发一系列病理(包括至少炎症、胞外基质重塑、疼痛和瘙痒症)的能力的这些联系表明阻断OSMR在与OSMR相关的许多疾病和病症中为治疗性干预的有用目标。
发明概要
本发明提供抗OSMR抗原结合蛋白，例如抗体和其功能片段，其具有适合于商业生产和人治疗用途的特性。抗OSMR抗原结合蛋白用于治疗与OSMR相关的疾病和病症，特别是与OSM或IL-31与OSMR结合相关的那些的方法。本文提供了以高亲和力结合OSMR且有效阻断OSM和/或IL-31与OSMR结合，从而降低在细胞中OSMR介导的信号传导的OSMR结合抗体。
在第一方面，OSMR抗原结合蛋白包含a)与SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ IDNO：29中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变结构域；b)与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变结构域；或c)a)的轻链可变结构域和b)的重链可变结构域。
第一方面的优选抗原结合蛋白包括包含与SEQ SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性、或相同的重链可变结构域的那些；包含与SEQ ID NO：28中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变结构域的那些；以及包含与SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变结构域的那些。
包含具有上面定义的与SEQ ID NO：9相关的序列的重链可变结构域的OSMR抗原结合蛋白可在对应于SEQ ID NO：9中的位置73的位置任选地含有除了天冬酰胺的氨基酸(例如天冬氨酸)。在此类实施方案中，重链可变结构域任选地包含SEQ ID NO：53中所示的氨基酸序列。
包含具有上面定义的与SEQ ID NO：10相关的序列的重链可变结构域的OSMR抗原结合蛋白可在对应于SEQ ID NO：10中的位置73的位置任选地含有除了天冬酰胺的氨基酸(例如天冬氨酸)。在此类实施方案中，重链可变结构域任选地包含SEQ ID NO：54中所示的氨基酸序列。
在第二方面，OSMR抗原结合蛋白包含a)具有SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQID NO：29中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变结构域；b)具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的重链可变结构域；或c)a)的轻链可变结构域和b)的重链可变结构域。
第二方面的优选的抗原结合蛋白包括包含具有SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变结构域和具有SEQ IDNO：9中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的重链可变结构域的那些；包含具有SEQ ID NO：28中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变结构域和具有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的重链可变结构域的那些；以及包含具有SEQID NO：29中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变结构域和具有SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的重链可变结构域的那些。
包含具有上面定义的与SEQ ID NO：9相关的序列的重链可变结构域的OSMR抗原结合蛋白可在对应于SEQ ID NO：9中的位置73的位置任选地含有除了天冬酰胺的氨基酸(例如天冬氨酸)。在此类实施方案中，重链可变结构域任选地包含SEQ ID NO：53中所示的氨基酸序列。
包含具有上面定义的与SEQ ID NO：10相关的序列的重链可变结构域的OSMR抗原结合蛋白质可在对应于SEQ ID NO：10中的位置73的位置任选地含有除了天冬酰胺的氨基酸(例如天冬氨酸)。在此类实施方案中，重链可变结构域任选地包含SEQ ID NO：54中所示的氨基酸序列。
在第三方面，OSMR抗原结合蛋白含有轻链可变结构域和重链可变结构域，所述轻链可变结构域包含a)具有SEQ ID NO：30中所示的LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：33中所示的LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：36中所示的LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；b)具有SEQ ID NO：31中所示的LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：34中所示的LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：37中所示的LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或c)具有SEQ ID NO：32中所示的LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：35中所示的LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：38中所示的LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；所述重链可变结构域包含d)具有SEQ ID NO：12中所示的HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：15中所示的HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：18中所示的HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；e)具有SEQ ID NO：13中所述的HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：16中所示的HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：19中所示的HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或f)具有SEQ ID NO：14中所示的HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：17中所示的HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：20中所示的HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3。
第三方面的优选的OSMR抗原结合蛋白包括包含a)的轻链可变结构域和d)的重链可变结构域的那些；包含b)的轻链可变结构域和e)的重链可变结构域的那些；以及包含c)的轻链可变结构域和f)的重链可变结构域的那些。
包含a)的轻链可变结构域和d)的重链可变结构域的OSMR抗原结合蛋白可任选地含有重链可变结构域，所述重链可变结构域在对应于SEQ ID NO：9中的位置73的位置包含除了天冬酰胺的氨基酸(例如天冬氨酸)。在此类实施方案中，重链可变结构域任选地包含SEQ ID NO：53中所示的氨基酸序列。
包含b)的轻链可变结构域和e)的重链可变结构域的OSMR抗原结合蛋白可任选地含有重链可变结构域，所述重链可变结构域在对应于SEQ ID NO：10中的位置73的位置包含除了天冬酰胺的氨基酸(例如天冬氨酸)。在此类实施方案中，重链可变结构域任选地包含SEQ ID NO：54中所示的氨基酸序列。
在本发明的第四方面，第一、第二或第三方面的OSMR抗原结合蛋白以小于或等于1×10-10M的亲和力结合至人OSMR。
在本发明的第五方面，第一、第二、第三或第四方面的OSMR抗原结合蛋白抑制人OSM与人OSMR和/或人IL-31与人OSMR的结合。
在本发明的第六方面，第一、第二、第三、第四或第五方面的OSMR抗原结合蛋白在人OSMR表达细胞中降低人OSM介导的和/或人IL-31介导的OSMR信号传导。
在本发明的第七方面，第六方面的OSMR抗原结合蛋白在食蟹猴OSMR表达细胞中降低食蟹猴OSM介导的和/或IL-31介导的OSMR信号传导。
在本发明的第八方面，第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七方面的OSMR抗原结合蛋白是抗体，诸如人抗体。优选的抗体包括包含具有SEQ ID NO：24中所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：6中所述的氨基酸序列的重链的那些抗体；包含具有SEQID：25中所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：7中所述的氨基酸序列的重链的那些；以及包含具有SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的重链的那些。
其它抗体包括包含具有SEQ ID NO：24中所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ IDNO：50中所示的氨基酸序列的重链的那些抗体；包含具有SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：51中所示的氨基酸序列的重链的那些；以及包含具有SEQ IDNO：26中所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列的重链的那些。
在第九方面，本发明提供编码OSMR抗原结合蛋白的一种或多种多肽组分(例如抗体轻链或抗体重链)的核酸或分离的核酸。在优选的实施方案中，核酸编码包含以下的多肽：
a)与SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的轻链可变结构域；
b)与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的重链可变结构域；
c)具有SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列的不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变结构域；
d)具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的重链可变结构域；
e)轻链可变结构域，其包含：
i)具有SEQ ID NO：30中所示的LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：33中所示的LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：36中所示的LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
ii)具有SEQ ID NO：31中所示的LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：34中所示的LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：37中所示的LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或
iii)具有SEQ ID NO：32中所示的LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：35中所示的LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：38中所示的LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或
f)重链可变结构域，其包含：
i)具有SEQ ID NO：12中所示的HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：15中所示的HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：18中所示的HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
ii)具有SEQ ID NO：13中所示的HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：16中所示的HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：19中所示的HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或
iii)具有SEQ ID NO：14中所示的HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：17中所示的HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：20中所示的HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3。
在某些实施方案中，核酸或分离的核酸编码包含SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：54中所示的氨基酸序列的多肽。
在某些实施方案中，核酸或分离的核酸编码包含SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列的多肽。
在第九方面的某些实施方案中，核酸或分离的核酸编码抗体轻链且与SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23中所示的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性。在第九方面的其它实施方案中，核酸或分离的核酸编码抗体重链且与SEQID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％或100％同一性。
在某些实施方案中，重链由包含SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49中所示的核苷酸序列的核酸编码。
在第十方面，本发明提供包含一种或多种第八方面的核酸或分离的核酸的表达载体。在某些实施方案中，所述表达载体编码抗体轻链、抗体重链、或抗体轻链和重链。
在第十一方面，本发明提供包含一种或多种第九方面的核酸或分离的核酸的可操作地连接至启动子的重组宿主细胞，包括包含一种或多种本发明第十方面的表达载体的重组宿主细胞。在优选的实施方案中，重组宿主细胞分泌结合OSMR的抗体。优选的宿主细胞是脯乳动物宿主细胞，包括CHO细胞系。
在第十二方面，本发明提供治疗自身免疫性病症、炎性病症或与胞外基质沉积或重塑相关的病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第六、第七或第八方面中任一方面的OSMR抗原结合蛋白。在优选的实施方案中，OSMR抗原结合蛋白是包含如SEQ ID NO：27中所示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：9中所示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如Ab1)、包含如SEQ IDNO：28中所示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：10中所示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如Ab2)，或包含如SEQ ID NO：29中所示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：11中所示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如Ab3)。在一些实施方案中，OSMR抗原结合蛋白是包含如SEQ ID NO：27中所示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：53中所示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体，或包含如SEQ ID NO：28中所示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：54中所示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体。在优选的实施方案中，OSMR抗原结合蛋白抑制OSM与OSMR或IL-31与OSMR的结合。在特别优选的实施方案中，自身免疫性病症、炎性病症或与胞外基质沉积或重塑相关的病症是纤维化、软骨退化、关节炎、风湿性关节炎、硬皮病、硬皮病相关的间质性肺病、特发性肺纤维化、肝硬化、牛皮癣、特应性皮炎、全身性皮肤淀粉样变、原发性皮肤淀粉样变、炎症、瘙痒炎症、结节性痒疹，和疼痛。
在第十三方面，本发明提供一种通过培养第十一方面的重组宿主细胞且从所述培养物中分离OSMR抗原结合蛋白制备第一、第二、第三、第四、第五、第六、第六、第七或第八方面中任一方面的OSMR抗原结合蛋白的方法。
在第十四方面，本发明提供与选自由以下组成的组的抗体交叉竞争的第一、第二、第三、第四、第五、第六、第六、第七或第八方面中任一方面的OSMR抗原结合蛋白：
a)包含含有SEQ ID NO：24中所示的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列的重链的抗体；
b)包含含有SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列的重链的抗体；以及
c)包含含有SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的重链的抗体。
本发明包括以下内容：
项1.一种制瘤素M受体(OSMR)抗原结合蛋白，其包含：
a)与SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的轻链可变结构域；
b)与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变结构域；或
c)a)的轻链可变结构域和b)的重链可变结构域。
项2.根据项1所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述轻链可变结构域与SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29中所示的所述氨基酸序列具有至少95％同一性。
项3.根据项1或2所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述重链可变结构域与SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的所述氨基酸序列具有至少95％同一性。
项4.一种制瘤素M受体(OSMR)抗原结合蛋白，其包含：
a)具有SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29中所示的所述氨基酸序列的不超过十种氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变结构域；
b)具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的所述氨基酸序列的不超过十种氨基酸添加、缺失或取代的重链可变结构域；或
c)a)的所述轻链可变结构域和b)的所述重链可变结构域。
项5.根据项4所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述轻链可变结构域具有SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29中所示的所述氨基酸序列的不超过五种氨基酸添加、缺失或取代。
项6.根据项4或5所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述重链可变结构域具有SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的所述氨基酸序列的不超过五种氨基酸添加、缺失或取代。
项7.根据项1-6所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述轻链可变结构域包含SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29中所示的所述氨基酸序列。
项8.根据项1-7所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述重链可变结构域包含SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的所述氨基酸序列。
项9.一种制瘤素M受体(OSMR)抗原结合蛋白，其包含：
轻链可变结构域，其包含：
a)具有SEQ ID NO：30中所示的所述LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：33中所示的所述LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：36中所示的所述LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
b)具有SEQ ID NO：31中所示的所述LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：34中所示的所述LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：37中所示的所述LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或
c)具有SEQ ID NO：32中所示的所述LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：35中所示的所述LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：38中所示的所述LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；以及
重链可变结构域，其包含：
d)具有SEQ ID NO：12中所示的所述HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：15中所示的所述HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：18中所示的所述HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
e)具有SEQ ID NO：13中所示的所述HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：16中所示的所述HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：19中所示的所述HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或
f)具有SEQ ID NO：14中所示的所述HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：17中所示的所述HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：20中所示的所述HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3。
项10.根据项9所述的OSMR抗原结合蛋白，其包含a)的所述轻链可变结构域和d)的所述重链可变结构域。
项11.根据项10所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述轻链可变结构域包含如SEQID NO：30中所示的LCDR1；如SEQ ID NO：33中所示的LCDR2序列；以及如SEQ ID NO：36中所示的LCDR3序列；并且所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：12中所示的HCDR1；如SEQ IDNO：15中所示的HCDR2序列；以及如SEQ ID NO：18中所示的HCDR3序列。
项12.根据项9所述的OSMR抗原结合蛋白，其包含b)的所述轻链可变结构域和e)的所述重链可变结构域。
项13.根据项12所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述轻链可变结构域包含如SEQID NO：31中所示的LCDR1；如SEQ ID NO：34中所示的LCDR2序列；以及如SEQ ID NO：37中所示的LCDR3序列；并且所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：13中所示的HCDR1；如SEQ IDNO：16中所示的HCDR2序列；以及如SEQ ID NO：19中所示的HCDR3序列。
项14.根据项9所述的OSMR抗原结合蛋白，其包含c)的所述轻链可变结构域和f)的所述重链可变结构域。
项15.根据项14所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述轻链可变结构域包含如SEQID NO：32中所示的LCDR1；如SEQ ID NO：35中所示的LCDR2序列；以及如SEQ ID NO：38中所示的LCDR3序列；并且所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO：14中所示的HCDR1；如SEQ IDNO：17中所示的HCDR2序列；以及如SEQ ID NO：20中所示的HCDR3序列。
项16.根据项1-7或9-11中任一项的所述OSMR抗原结合蛋白，其中所述重链可变结构域在对应于SEQ ID NO：9中的位置73的位置包含除了天冬酰胺的氨基酸。
项17.根据项16所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述重链可变结构域在对应于SEQID NO：9中的位置73的位置包含天冬氨酸。
项18.根据项1-7或9-11中任一项所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述重链可变结构域包含SEQ ID NO：53中所示的所述氨基酸序列。
项19.根据项1-7、9、12或13中任一项所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述重链可变结构域在对应于SEQ ID NO：10中的位置73的位置包含除了天冬酰胺的氨基酸。
项20.根据项19所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述重链可变结构域在对应于SEQID NO：10中的位置73的位置包含天冬氨酸。
项21.根据项1-7、9、12或13中任一项所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述重链可变结构域包含SEQ ID NO：54中所示的所述氨基酸序列。
项22.根据项1-21中任一项所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以小于或等于1×10-10M的亲和力特异性结合人OSMR。
项23.根据项1-22中任一项所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白抑制人OSM或人IL-31与人OSMR的结合。
项24.根据项1-23中任一项所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白在人OSMR表达细胞中降低人OSM介导的或人IL-31介导的OSMR信号传导。
项25.根据项1-24中任一项所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是抗体。
项26.根据项25所述的OSMR抗原结合蛋白，其中所述抗体是人抗体。
项27.根据项26所述的OSMR抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID NO：24中所示的所述氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO：6中所示的所述氨基酸序列。
项28.根据项26所述的OSMR抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID NO：25中所示的所述氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO：7中所示的所述氨基酸序列。
项29.根据项26所述的OSMR抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID NO：26中所示的所述氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO：8中所示的所述氨基酸序列。
项30.根据项25所述的OSMR抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID NO：24中所示的所述氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO：50中所示的所述氨基酸序列。
项31.根据项25所述的OSMR抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID NO：25中所示的所述氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO：51中所示的所述氨基酸序列。
项32.根据项25所述的OSMR抗原结合蛋白，其包含轻链和重链，其中所述轻链包含SEQ ID NO：26中所示的所述氨基酸序列且所述重链包含SEQ ID NO：52中所示的所述氨基酸序列。
项33.一种编码多肽的分离的核酸，所述多肽包含：
a)与SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29中所示的所述氨基酸序列具有至少95％同一性的轻链可变结构域；
b)与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的所述氨基酸序列具有至少95％同一性的重链可变结构域；
c)具有SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29中所示的所述氨基酸序列的不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变结构域；
d)具有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的所述氨基酸序列的不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的重链可变结构域；
e)一种轻链可变结构域，其包含：
i)具有SEQ ID NO：30中所示的所述LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：33中所示的所述LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：36中所示的所述LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
ii)具有SEQ ID NO：31中所示的所述LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：34中所示的所述LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：37中所示的所述LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或
iii)具有SEQ ID NO：32中所示的所述LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：35中所示的所述LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：38中所示的所述LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；
f)一种重链可变结构域，其包含：
i)具有SEQ ID NO：12中所示的所述HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：15中所示的所述HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：18中所示的所述HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
ii)具有SEQ ID NO：13中所示的所述HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：16中所示的所述HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：19中所示的所述HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或
iii)具有SEQ ID NO：14中所示的所述HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：17中所示的所述HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：20中所示的所述HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；
项34.根据项33所述的分离的核酸，其中所述多肽包含抗体轻链。
项35.根据项34所述的分离的核酸，其中所述轻链由包含与SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22或SEQ ID NO：23中所示的所述核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列的核酸编码。
项36.根据项35所述的分离的核酸，其中所述轻链由包含与SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22或SEQ ID NO：23中所示的所述核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列的核酸编码。
项37.根据项36所述的分离的核酸，其中所述轻链由包含与SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22或SEQ ID NO：23中所示的所述核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的核酸编码。
项38.根据项37所述的分离的核酸，其中所述轻链由包含SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22或SEQ ID NO：23中所示的核苷酸序列的核酸编码。
项39.根据项33所述的分离的核酸，其中所述多肽包含抗体重链。
项40.根据项39所述的分离的核酸，其中所述多肽包含SEQ ID NO：53或SEQ IDNO：54中所示的所述氨基酸序列。
项41.根据项39所述的分离的核酸，其中所述多肽包含SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52中所示的所述氨基酸序列。
项42.根据项39所述的分离的核酸，其中所述重链由包含与SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17中所示的所述核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列的核酸编码。
项43.根据项42所述的分离的核酸，其中所述重链由包含与SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：5中所示的所述核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列的核酸编码。
项44.根据项43所述的分离的核酸，其中所述重链由包含与SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：5中所示的所述核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的核酸编码。
项45.根据项44所述的分离的核酸，其中所述重链由包含SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列的核酸编码。
项46.根据项44所述的分离的核酸，其中所述重链由包含SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：48或SEQ ID NO：49中所示的核苷酸序列的核酸编码。
项47.一种表达载体，其包含根据项33-46中任一项所述的分离的核酸。
项48.根据项47所述的表达载体，其中所述分离的核酸编码抗体轻链。
项49.根据项47所述的表达载体，其中所述分离的核酸编码抗体重链。
项50.根据项48所述的表达载体，其进一步包含编码抗体重链的分离的核酸。
项51.一种重组宿主细胞，其包含可操作地连接至启动子的根据项33-46中任一项所述的分离的核酸。
项52.一种重组宿主细胞，其包含根据项47-50中任一项所述的表达载体。
项53.根据项52所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含根据项48和49所述的表达载体。
项54.根据项53所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞分泌结合OSMR的抗体。
项55.根据项51-54中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞来源于哺乳动物。
项56.根据项55所述的重组宿主细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
项57.一种治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据项1-32中任一项所述的OSMR抗原结合蛋白。
项58.根据项57所述的方法，其中所述OSMR抗原结合蛋白是抗体。
项59.根据项58所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO：27中所示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：9中所示的重链可变结构域氨基酸序列。
项60.根据项59所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO：24中所述的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO：6中所示的重链氨基酸序列。
项61.根据项58所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO：27中所示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：53中所示的重链可变结构域氨基酸序列。
项62.根据项61所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO：24中所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO：50中所示的重链氨基酸序列。
项63.根据项58所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO：28中所示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：10中所示的重链可变结构域氨基酸序列。
项64.根据项63所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO：25中所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO：7中所示的重链氨基酸序列。
项65.根据项58所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO：28中所示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：54中所示的重链可变结构域氨基酸序列。
项66.根据项65所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO：25中所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO：51中所示的重链氨基酸序列。
项67.根据项58所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO：29中所示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：11中所示的重链可变结构域氨基酸序列。
项68.根据项67所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO：26中所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO：8中所示的重链氨基酸序列。
项69.根据项67所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO：26中所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO：52中所示的重链氨基酸序列。
项70.根据项57-69中任一项所述的方法，其中所述抗原结合蛋白抑制OSM和/或IL-31与OSMR的结合。
项71.根据项70所述的方法，其中所述疾病或病症是自身免疫性病症、炎性病症或与胞外基质沉积或重塑相关的病症。
项72.根据项71所述的方法，其中所述自身免疫性病症、所述炎性病症或与胞外基质沉积或重塑相关的所述病症是纤维化、软骨退化、关节炎、风湿性关节炎、硬皮病、硬皮病相关的间质性肺病、特发性肺纤维化、肝硬化、牛皮癣、特应性皮炎、全身性皮肤淀粉样变、原发性皮肤淀粉样变、炎症、瘙痒炎症、结节性痒疹和疼痛。
项73.一种制备制瘤素M受体(OSMR)抗原结合蛋白的方法，所述方法包括：
a)培养根据项51-56中任一项所述的重组宿主细胞；以及
b)从所述培养物中分离所述OSMR抗原结合蛋白。
项74.根据项1-32中任一项所述的制瘤素M受体(OSMR)抗原结合蛋白，其中所述OSMR抗原结合蛋白与选自由以下组成的组的抗体交叉竞争：
a)包含含有SEQ ID NO：24中所示的所述氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO：6中所示的所述氨基酸序列的重链的抗体；
b)包含含有SEQ ID NO：25中所示的所述氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO：7中所示的所述氨基酸序列的重链的抗体；
c)包含含有SEQ ID NO：26中所示的所述氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO：8中所示的所述氨基酸序列的重链的抗体。
具体实施方式
本文使用的章节标题只是为了使结构清晰，而不是限制所描述的主题。说明书中所引用的所有参考文献通过引用特别地整体并入本文。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化、蛋白纯化等。可根据生产商的说明书或如本领域常规或如本文描述实施酶促反应和纯化技术。以下过程和技术通常可根据本领域熟知的传统方法和如本说明书中引用和讨论的各种概述和更具体的参考文献所述而进行。参见，例如Sambroo等，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manuel，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，cold Spring Harbor，N.Y.，其通过引用并入本文用于任意目的。除非提供具体的定义，否则本文描述的与分析化学、有机化学、和医学和制药化学相关使用的术语、以及它们的实验室程序和技术是在本领域熟知并常用的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送，和患者的治疗。
OSMR
本文描述的抗原结合蛋白结合至OSMR。OSM和IL-31通过OSMR传导信号。OSMR是I型细胞因子受体家族中的成员。OSMR与糖蛋白130(也称为gp130，白细胞介素6信号转导体(IL6ST)、IL6-β或CD 130)异二聚化以形成II型OSMR。OSMR也与IL-31受体A(IL31RA)异二聚化以形成IL-31受体且因此转导OSM-和IL-31-诱导的信号传导事件。在示例性实施方案中，OSMR抗原结合蛋白在表达OSMR的细胞中结合OSMR且阻止OSM-和/或IL-31-介导的信号传导。
人OSMR序列在本领域内是已知的。在各个方面，人OSMR蛋白序列以GenBank登录号AAI25210、AAI25211、NP_003990、和EAW55976提供。在表1中提供了示例性人OSMR氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。该蛋白由多个域组成：氨基酸1-27对应于哺乳动物细胞中蛋白加工期间可裂解的信号序列；氨基酸28-740对应于胞外域；以及氨基酸741-761对应于跨膜域。在优选的实施方案中，本文描述的抗原结合蛋白结合至OSMR的胞外域且阻止OSM和/或IL-31与OSMR的相互作用。
人OSM序列在本领域是已知的。在各个方面，人OSM蛋白序列以GenBank登录号CAG30420、CAG46504、NP_065391、P13725、AAC05173、EAW59864和AAH11589提供。在表1中提供了示例性人OSM氨基酸序列(SEQ ID NO：39)。氨基酸1-25对应于信号序列；氨基酸26-220对应于成熟蛋白；以及氨基酸221-252对应于前肽序列。
人IL-31序列在本领域是已知的。在各个方面，人IL-31蛋白序列以GenBank登录号NP_001014358、AAS86448、AAI32999、AAI33001、Q6EBC2和EAW98310提供。在表1中提供了示例性人IL-31氨基酸序列(SEQ ID NO：41)。氨基酸1-23对应于假定的信号序列。
人IL31RA序列在本领域是已知的。在各个方面，人IL31RA蛋白序列以GenBank登录号AAS86447、NP_001229567和CBL94051提供。在表1中提供了示例性人IL31RA(v4，同种型3)氨基酸序列(SEQ ID NO：43)。氨基酸1-32对应于信号序列；以及氨基酸533-553对应于跨膜序列。
人gp1 30序列在本领域是已知的。在各个方面，人gp130蛋白序列以GenBank登录号AAI17403、AAI17405、EAW54936、NP_002175、ABK41905和AAA59155提供。在表1中提供了示例性人gp130氨基酸序列(SEQ ID NO：45)。该蛋白由多个域组成：氨基酸1-22对应于信号序列；氨基酸23-619对应于胞外域；620-641对应于跨膜域；以及642-918对应于胞质域。
表1
在本发明的特定实施方案中，本文描述的抗原结合蛋白以高亲和力结合人和食蟹猴OSMR，包括以高亲和力结合且阻断食蟹猴OSM和/或IL-31与食蟹猴OSMR相互作用的那些。这些特征允许在非人灵长类动物中进行有益的毒性研究。
恒河猴(Macaca mulatta)OSMR蛋白序列在本领域是已知的且以GenBank登录号XP_001083745提供。在表2中提供了示例性食蟹猴(Macaca fascicularis)OSMR氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。蛋白由多个域组成：氨基酸1-27对应于哺乳动物细胞中蛋白加工期间可裂解的信号序列；氨基酸28-737对应于胞外域；以及氨基酸738-757对应于跨膜域。在优选的实施方案中，本文描述的抗原结合蛋白结合至OSMR的胞外域且阻止OSM和/或IL-31与OSMR的相互作用。
恒河猴(Macaca mulatta)OSM蛋白序列在本领域是已知的且以GenBank登录号NP_001181403提供。在表2中提供了示例性食蟹猴(Macaca fascicularis)OSM氨基酸序列(SEQID NO：40)。氨基酸1-196对应于成熟的食蟹猴OSM。
恒河猴(Macaca mulatta)IL-31蛋白序列在本领域是已知的且以GenBank登录号XP_001096743提供。在表2中提供了食蟹猴(Macaca fascicularis)IL-31氨基酸序列(SEQID NO：42)。该序列表示成熟的食蟹猴IL-31。
在表2中提供了示例性食蟹猴(Macaca fascicularis)IL31RA氨基酸序列(SEQ IDNO：44)。氨基酸1-19对应于信号序列；以及氨基酸520-540对应于跨膜域。
恒河猴(Macaca mulatta)gp130蛋白序列在本领域是已知的且以GenBank登录号NP_001252920提供。在表2中提供了示例性食蟹猴(Macaca fascicularis)gp130氨基酸序列(SEQ ID NO：46)。该蛋白由多个域组成：氨基酸1-22对应于信号序列；氨基酸23-619对应于胞外域；氨基酸620-641对应于跨膜域；以及氨基酸642-918对应于胞质域。
表2
OSMR抗原结合蛋白
本发明提供特异性结合OSMR的抗原结合蛋白。抗原结合蛋白的实施方案包括特异性结合OSMR的肽和/或多肽。所述肽或多肽可任选地包括一种或多种翻译后修饰。抗原结合蛋白的实施方案包括如本文以各种方式定义的特异性结合OSMR的抗体和其片段。这些包括特异性结合人OSMR的抗体，包括抑制OSM和/或IL-31结合和/或激活OSMR的那些。
本发明的抗原结合蛋白特异性结合OSMR。本文使用的“特异性结合”意指抗原结合蛋白优先于其它蛋白而结合OSMR。在一些实施方案中，“特异性结合”意指OSMR抗原结合蛋白对OSMR具有比其它蛋白更高的亲和力。特异性结合OSMR的OSMR抗原结合蛋白对人OSMR可具有小于或等于1×10-7M、小于或等于2×10-7M、小于或等于3×10-7M、小于或等于4×10-7M、小于或等于5×10-7M、小于或等于6×10-7M、小于或等于7×10-7M、小于或等于8×10-7M、小于或等于9×10-7M、小于或等于1×10-8M、小于或等于2×10-8M、小于或等于3×10-8M、小于或等于4×10-8M、小于或等于5×10-8M、小于或等于6×10-8M、小于或等于7×10-8M、小于或等于8×10-8M、小于或等于9×10-8M、小于或等于1×10-9M、小于或等于2×10-9M、小于或等于3×10-9M、小于或等于4×10-9M、小于或等于5×10-9M、小于或等于6×10-9M、小于或等于7×10- 9M、小于或等于8×10-9M、小于或等于9×10-9M、小于或等于1×10-10M、小于或等于2x10-10M、小于或等于3x 10-10M、小于或等于4×10-10M、小于或等于5×10-10M、小于或等于6×10-10M、小于或等于7×10-10M、小于或等于8×10-10M、小于或等于9×10-10M、小于或等于1×10-11M、小于或等于2×10-11M、小于或等于3×10-11M、小于或等于4×10-11M、小于或等于5×10-11M、小于或等于6×10-11M、小于或等于7×10-11M、小于或等于8×10-11M、小于或等于9×10-11M、小于或等于1×10-12M、小于或等于2×10-12M、小于或等于3×10-12M、小于或等于4×10-12M、小于或等于5×10-12M、小于或等于6×10-12M、小于或等于7×10-12M、小于或等于8×10-12M或小于或等于9×10-12M的结合亲和力。
测量抗原结合蛋白的结合亲和力的方法在本领域是熟知的。常用于亲和力确定的方法包括表面等离子共振(SPR)(Morton和Myszka“Kinetic analysis of macromolecularinteractions using surface plasmon resonance biosensors”Methods in Enzymology(1998)295，268-294)、生物层干涉测量法(Abdiche等“Determining Kinetics andAffinities of Protein Interactions Using a Parallel Real-time Label-freeBiosensor，the Octet”Analytical Biochemistry(2008)377，209-217)、动力学排除测定(KinExA)(Darling和Brault“Kinetic exclusion assay technology：characterizationof molecular interactions”Assay and Drug Dev Tech(2004)2，647-657)、等温量热法(Pierce等“Isothermal Titration“Isothermal Titration Calorimetry of Protein-Protein Interactions”Methods(1999)19，213-221)和分析超速离心(Lebowitz等“Modernanalytical ultracentrifugation in protein science：Atutorial review”ProteinScience(2002)，11：2067-2079)。实施例5提供了亲和力确定的示例性方法。
应理解当在本文提到OSMR结合抗体的各种实施方案时，其也涵盖其OSMR结合片段。OSMR结合片段包含本文描述的保留特异性结合OSMR的能力的任何抗体片段或域。OSMR结合片断也可在本文描述的任何支架中。
在某些治疗性实施方案中，OSMR抗原结合蛋白抑制OSM和/或IL-31与OSMR的结合和/或抑制一种或多种与OSM和/或IL-31与OSMR的结合相关的生物活性，例如OSM和/或IL-31介导的信号传导。此类抗原结合蛋白被称为“中和”。在某些实施方案中，中和OSMR抗原结合蛋白特异性结合OSMR且以10％与100％之间任一值抑制OSM和/或IL-31与OSMR的结合，诸如至少约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更多。例如，可通过确定抗原结合蛋白阻断OSM和/或IL-31与OSMR结合的能力测试OSMR抗原结合蛋白的中和能力，分别参见，例如实施例2和3中的人OSMR和食蟹猴OSMR阻断测定。或者，可在测量OSMR抗原结合蛋白在测量OSM和/或IL-31介导的生物功能的测定中存在的影响的测定中测试OSMR抗原结合蛋白的中和能力。例如，OSM诱导生物反应的能力，诸如在培养的牛主动脉内皮细胞中纤维溶酶原激活物活性的刺激、在人内皮细胞中IL-6表达的调节，和在HepG2细胞中细胞表面LDL受体的LDL摄取和上调的刺激。或者，IL-31诱导皮肤炎症的能力。
抗原结合蛋白的实施方案包含本文以各种方式定义的具有一种或多种互补决定区(CDR)的支架结构。实施方案进一步包括包含具有一种或多种抗体可变结构域(重或轻)的支架结构的抗原结合蛋白。实施方案包括包含选自由Ab 1轻链可变结构域(LCv)、Ab2LCv和Ab3 LCv(分别为SEQ ID NO：27-29)组成的组的轻链可变结构域和/或选自由Ab1重链可变结构域(HCv)、Ab2 HCv和Ab3 HCv(分别为SEQ ID NO：9-11)组成的组的重链可变结构域的抗体，以及其片段、衍生物、突变蛋白和变体。
SEQ ID NO：9的示例性重链可变结构域变体在对应于SEQ ID NO：9中的位置73的位置含有除了天冬酰胺的氨基酸(例如，天冬氨酸)。SEQ ID NO：53中所示的氨基酸序列是SEQ ID NO：9的重链可变结构域变体的实例。
SEQ ID NO：10的示例性重链可变结构域变体在对应于SEQ ID NO：10中的位置73的位置含有除了天冬酰胺的氨基酸(例如天冬氨酸)。SEQ ID NO：54中所示的氨基酸序列是SEQ ID NO：10的重链可变结构域变体的实例。
包含Ab1 LCv的示例性轻链是包含SEQ ID NO：24中所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab2 LCv的示例性轻链是包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab3 LCv的示例性轻链是包含SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab1 HCv的示例性重链是包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab1 HCv变体的示例性重链是包含SEQ ID NO：50中所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab2 HCv的示例性重链是包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab2 HCv变体的示例性重链是包含SEQ ID NO：51中所示的氨基酸序列的重链。
包含Ab3 HCv的示例性重链是包含SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列的重链。
包含Ab3 HCv变体的示例性重链是包含SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列的重链。
预想的支架的其它实例包括但不限于：纤维粘连蛋白、新制癌菌素CBM4-2、脂运载蛋白、T-细胞受体、蛋白-A域(蛋白Z)、Im9、TPR蛋白、锌指结构域、pVIII、鸟胰多肽、GCN4、WW域Src同源性域3、PDZ域、TEM-1β-内酰胺酶、硫氧还蛋白、葡萄球菌核酸酶、PHD-指域、CL-2、BPTI、APPI、HPSTI、大肠杆菌素、LACI-D1、LDTI、MTI-II、蝎毒素、昆虫防御素-A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、细胞色素b-562、Ldl受体域、γ-晶状体蛋白、泛素、运铁蛋白，和或C型凝集素样结构域。非抗体支架和它们的治疗性用途参阅Gebauer和Skerra，Curr.Opin.Chem.Biol.，13：245-255(2009)和Binz等，Nat.Biotech.，23(10)；1257-68(2005)，其通过引用整体并入本文。
本发明的多个方面包括包含以下可变结构域的抗体：Ab1LCv/Ab1 HCv(SEQ IDNO：27/SEQ ID NO：9)、Ab2 LCv/Ab2 HCv(SEQ ID NO：28/SEQ ID NO：10)、Ab3 LCv/Ab3 HCv(SEQ ID NO：29/SEQ ID NO：11)和其组合，以及其片段、衍生物、突变蛋白和变体。
也包括包含以下可变结构域的抗体：SEQ ID NO：27/SEQ ID NO：53；以及SEQ IDNO：28/SEQ ID NO：54。
本发明的示例性抗体包括Ab1(SEQ ID NO：24/SEQ ID NO：6)、Ab2(SEQ ID NO：25/SEQ ID NO：7，和Ab3(SEQ ID NO：26/SEQ ID NO：8)。
其它示例性抗体包括：SEQ ID NO：24/SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：25/SEQ ID NO：51，以及SEQ ID NO：26/SEQ ID NO：52。
通常，抗体轻链或重链的每个可变结构域包含三种CDR。重链可变结构域包含重链CDRl(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)和重链CDR3(HCDR3)。轻链可变结构域包含轻链CDRl(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含在本文描述的优选的可变结构域中的一种或多种CDR。
所述CDR的实例包括但不限于：
Ab1 LCv：LCDR1(SEQ ID NO：30)、LCDR2(SEQ ID NO：33)和LCDR3(SEQ ID NO：36)的CDR；
Ab2 LCv：LCDR1(SEQ ID NO：3l)、LCDR2(SEQ ID NO：34)和LCDR3(SEQ ID NO：37)的CDR；
Ab3 LCv：LCDR1(SEQ ID NO：32)、LCDR2(SEQ ID NO：35)和LCDR3(SEQ ID NO：38)的CDR；
Ab1 HCv：HCDR1(SEQ ID NO：12)、HCDR2(SEQ ID NO：15)和HCDR3(SEQ ID NO：18)的CDR；
Ab2 HCv：HCDR1(SEQ ID NO：13)、HCDR2(SEQ ID NO：16)和HCDR3(SEQ ID NO：19)的CDR；以及
Ab3 HCv：HCDR1(SEQ ID NO：14)、HCDR2(SEQ ID NO：17)和HCDR3(SEQ ID NO：20)的CDR。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含：A)多肽，例如轻链，其包含具有选自由SEQID NO：30、31和32组成的组的氨基酸序列的LCDR1；具有选自由SEQ ID NO：33、34和35组成的组的氨基酸序列的LCDR2；和/或具有选自由SEQ ID NO：36、37和38组成的组的氨基酸序列的LCDR3；和/或B)多肽，例如重链，其包含具有选自由SEQ ID NO：12、13和14组成的组的氨基酸序列的HCDR1；具有选自由SEQ ID NO：15、16和17组成的组的氨基酸序列的HCDR2；和/或具有选自由SEQ ID NO：18、19和20组成的组的氨基酸序列的HCDR3。
在其它实施方案中，抗原结合蛋白包含A)轻链氨基酸序列，其包含Ab1 LCv、Ab2LCv和Ab3LCv中任一种的LCDR1、LCDR2和LCDR3和B)重链氨基酸序列，其包含Ab1 HCv、Ab2HCv和Ab3HCv中任一种的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些实施方案中，CDR包括本文所示的示例性CDR的不超过一种、不超过两种、不超过三种、不超过四种、不超过五种，或不超过六种氨基酸添加、缺失或取代。
本发明的多个方面包括包含选自由SEQ ID NO：27、28和29组成的组的轻链可变结构域的抗体。本发明的多个方面包括包含选自由SEQ ID NO：9、10和11组成的组的重链可变结构域的抗体。本发明的其它方面包括抗体，其包含A)选自由SEQ ID NO：27、28和29组成的组的轻链可变结构域，和B)选自由SEQ ID NO：9、10和11组成的组的重链可变结构域。
本发明的抗体可包含本领域已知的任一恒定区。轻链恒定区可为例如κ或λ型轻链恒定区，例如人κ或λ型轻链恒定区。重链恒定区可为例如α、δ、ε、γ、或μ型重链恒定区，例如人α、δ、ε、γ、或μ型重链恒定区。在一个实施方案中，轻链或重链恒定区是天然存在的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白。
本发明的多个方面包括包含选自由SEQ ID NO：27、28和29组成的组的具有不超过一种、不超过两种、不超过三种、不超过四种、不超过五种、不超过六种、不超过七种、不超过八种、不超过九种，或不超过十种氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变结构域的抗体。本发明的多个方面包括包含选自由SEQ ID NO：9、10和11组成的组的具有不超过一种、不超过两种、不超过三种、不超过四种、不超过五种、不超过六种、不超过七种、不超过八种、不超过九种，或不超过十种氨基酸添加、缺失或取代的重链可变结构域的抗体。本发明的其它方面包括抗体，所述抗体包含A)包含选自由SEQ ID NO：27、28和29组成的组的具有不超过一种、不超过两种、不超过三种、不超过四种、不超过五种、不超过六种、不超过七种、不超过八种、不超过九种，或不超过十种氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变结构域，和B)选自由SEQ IDNO：9、10和11组成的组的具有不超过一种、不超过两种、不超过三种、不超过四种、不超过五种、不超过六种、不超过七种、不超过八种、不超过九种，或不超过十种氨基酸添加、缺失或取代的重链可变结构域。
在一个变型中，抗原结合蛋白包含与选自由SEQ ID NO：27、28和29组成的组的轻链可变结构域氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在另一变型中，抗原结合蛋白包含与选自由SEQ ID NO：9、10和11组成的组的重链可变结构域氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含A)与选自由SEQ ID NO：27、28和29组成的组的轻链可变结构域氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，和B)与选自由SEQID NO：9、10和11组成的组的重链可变结构域氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
包含具有上文定义的与SEQ ID NO：9相关的序列的重链可变结构域的OSMR抗原结合蛋白在对应于SEQ ID NO：9中的位置73的位置可任选地含有除了天冬酰胺的氨基酸(例如天冬氨酸)。在此类实施方案中，重链可变结构域任选地包含SEQ ID NO：53中所示的氨基酸序列。
包含具有上文定义的与SEQ ID NO：10相关的序列的重链可变结构域的OSMR抗原结合蛋白在对应于SEQ ID NO：10中的位置73的位置可任选地含有除了天冬酰胺的氨基酸(例如天冬氨酸)。在此类实施方案中，重链可变结构域任选地包含SEQ ID NO：54中所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗原结合蛋包含轻链和/或重链CDR3。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO：36、37、38、18、19和20中所示的序列的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列包括SEQ ID NO：36、37、38、18、19和20中所示的示例性序列的不超过一种、不超过两种、不超过三种、不超过四种、不超过五种，或不超过六种氨基酸添加、缺失或取代。因此，本发明的实施方案包括包含与选自由SEQ ID NO：36、37、38、18、19和20中所示的序列组成的组的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的抗原结合蛋白。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含轻链和/或重链CDR2。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO：33、34、35、15、16和17中所示的序列的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列包括SEQ ID NO：33、34、35、15、16和17中所示的示例性序列的不超过一种、不超过两种、不超过三种、不超过四种、不超过五种、或不超过六种氨基酸添加、缺失或取代。因此，本发明的实施方案包括包含与选自SEQ ID NO：33、34、35、15、16和17中所示的序列的组的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的抗原结合蛋白。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含轻链和/或重链CDR1。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO：30、31、32、12、13和14中所示的序列的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列包括SEQ ID NO：30、31、32、12、13和14中所示的示例性序列的不超过一种、不超过两种、不超过三种、不超过四种、不超过五种、或不超过六种氨基酸添加、缺失或取代。因此，本发明的实施方案包括包含与选自SEQ ID NO：30、31、32、12、13和14中所示的序列的组的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列的抗原结合蛋白。
本发明的抗原结合蛋白包含传统抗体的支架，所述传统抗体包括人和单克隆抗体、双特异性抗体、双抗体、微抗体、域抗体、合成抗体(有时本文称作“抗体模拟物”)、嵌合抗体、抗体融合物(有时称作“抗体缀合物”)和分别各自片段。可将上文描述的CDR，包括CDR的各种组合移植到以下任一支架中。
如本文所用，术语“抗体”指各种形式的单体或多聚体蛋白，其包含一种或多种特异性结合至抗原的单体或多聚体蛋白，如本文以各种方式描述的。在某些实施方案中，通过重组DNA技术产生抗体。在其它实施方案中，通过天然存在的抗体的酶促或化学裂解产生抗体。在另一方面，抗体选自由以下组成的组：a)人抗体、b)人源化抗体、c)嵌合抗体、d)单克隆抗体、e)多克隆抗体、f)重组抗体、g)抗原结合片段、h)单链抗体、i)双抗体、j)三抗体、k)四抗体、l)Fab片段、m)F(ab’)2片段、n)IgA抗体、o)IgD抗体、p)IgE抗体、q)IgG1抗体、r)IgG2抗体、s)IgG3抗体、t)IgG4抗体，以及u)IgM抗体。
可变区或可变结构域包含嵌入构架区(命名的构架区FR1、FR2、FR3和FR4)的至少三种重链或轻链CDR。Kabat等，1991，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Public Health Service N.I.H.，Bethesda，MD。传统的抗体结构单位通常包含四聚体。每个四聚体通常由两对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻”链和一个“重”链。每个链的氨基端部分包含主要负责抗原识别的具有约100至110或更多个氨基酸的可变区。每个链的羧基端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。人轻链被分类为κ或λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α或ε，且将抗体的同种型分别限定为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几种子类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有子类，包括但不限于IgM1和IgM2。本发明的实施方案包括并入抗原结合蛋白的可变结构域或CDR的抗体的所有这些类和子类，如本文所述的。
一些天然存在的抗体，诸如在骆驼和美洲驼中发现的那些抗体是由两个重链组成的二聚体且不包含轻链。本发明涵盖可结合至OSMR的两个重链或其片段的二聚抗体。
重链和轻链的可变区通常展现由三个高变区(即互补决定区或CDR)连接的相对保守的构架区(FR)的相同通用结构。CDR主要负责抗原识别和结合。来自每对的两个链的CDR由构架区对准，能够结合至特异性表位。从N端至C端，轻链和重链均包含域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。依据κ的定义将氨基酸分配至每个域。
CDR构成用于抗原结合的主表面接触点。轻链的CDR3且特别是重链的CDR3可在轻和重链可变区的抗原结合中构成最重要的决定簇。在一些抗体中，重链CDR3似乎构成抗原与抗体之间主要的接触面。在体外筛选方案中，其中只改变CDR3可用于改变抗体的结合性质或确定哪个残基导致抗原的结合。
天然存在的抗体通常包括信号序列，所述信号序列将抗体引入细胞通路中用于蛋白分泌且其通常不存在于成熟抗体中。编码本发明抗体的多核苷酸可编码天然存在的信号序列或以下描述的异源信号序列。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白是包含一种至六种本文描述的示例性CDR的抗体。本发明抗体可为包括IgM、IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgD、IgA或IgE抗体的任何类型。在一个特定实施方案中，抗原结合蛋白是IgG型抗体，例如IgG1抗体。
在一些实施方案中，例如当抗原结合蛋白是具有完整重链和轻链的抗体时，CDR全部来自相同物种，例如人。或者，例如在抗原结合蛋白含有来自上文所列的序列的少于六种CDR的实施方案中，另外的CDR可来自其它物种或可为与示例性序列中所描绘的那些不同的人CDR。例如，来自本文所鉴定的适当的序列的HCDR3和LCDR3区可与任选地选自其它物种或不同的人抗体序列的HCDR1、HCDR2、LCDR1和LCDR2或其组合一起使用。例如，本发明的CDR可取代商业上相关的嵌合或人源化抗体的CDR区。
特定实施方案利用其为人组分的抗原结合蛋白的支架组分。然而，在一些实施方案中，支架组分可为不同物种的混合物。因而，如果抗原结合蛋白是抗体，则此类抗体可为嵌合抗体和/或人源化抗体。一般来讲，“嵌合抗体”和“人源化抗体”指组合来自一种以上物种的区的抗体。例如，“嵌合抗体”通常包含来自小鼠(或大鼠，在一些情况下)的可变区和来自人的恒定区。
“人源化抗体”一般指已具有交换了人抗体中所发现的序列的可变结构域构架区的非人抗体。一般来讲，在人源化抗体中，除了一种或多种CDR外，整个抗体由人源的多核苷酸编码或与除了在一种或多种CDR中的此类抗体相同。将其一些或全部由源自非人生物体的核酸编码的CDR移植到人抗体可变区的β折叠构架中以产生抗体，其特异性由移植的CDR确定。此类抗体的产生在例如WO 92/11018，Jones 1986，Nature 321：522-525，Verhoeyen等，1988，Science239：1534-1536中有所描述。也可使具有基因工程化免疫系统的小鼠产生人源化抗体(Roque等，2004，Biotechnol.Prog.20：639-654)。在本文描述的示例性实施方案中，所鉴定的CDR是人，且因此在此上下文中的人源化和嵌合抗体包括一些非人CDR；例如，可产生人源化抗体，其包含HCDR3和LCDR3区，以及不同物种来源的一种或多种其它CDR区。
在一个实施方案中，OSMR抗原结合蛋白是多特异性抗体，且显著的是双特异性抗体，有时也称作“双抗体”。这些是结合至两种或多种不同抗原或单抗原的不同表位的抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体结合人效应细胞(例如T细胞)的OSMR和抗原。此类抗体用于靶向针对OSMR表达细胞(例如OSMR表达肿瘤细胞)的效应细胞反应。在优选的实施方案中，人效应细胞抗原是CD3。美国专利No.7,235,641。产生双特异性抗体的方法在本领域是已知的。一种此类方法涉及建造重链的Fc部分诸如以产生“突起”和“孔洞”，当在细胞中共表达时，所述“突起”和“孔洞”有利于重链的异二聚体形成。美国7,695,963。另一种方法也涉及建造重链的Fc部分，但是当在细胞中共表达时，使用静电导向以促进异二聚体形成，同时阻碍重链的同型二聚体形成。WO 09/089,004，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，OSMR抗原结合蛋白是微抗体。微抗体是包含连接至CH3域的scFv的最小化抗体样蛋白(Hu等，1996，Cancer Res.56：3055-3061)。
在一个实施方案中，OSMR抗原结合蛋白是域抗体；参见，例如美国专利No.6,248,516。域抗体(dAb)是抗体的功能结合域，对应于人抗体的重(VH)链或轻(VL)链的可变区。dAB具有约13kDa的分子量，或小于整个抗体的十分之一大小。dAB在包括细菌、酵母和哺乳动物细胞系统的多种宿主中良好表达。另外，dAb甚至在经历诸如冷冻干燥或热变性的严苛条件后也高度稳定并保持活性。参见，例如，美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；美国序列No.2004/0110941；欧洲专利0368684；美国专利6,696,245、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609。
在一个实施方案中，OSMR抗原结合蛋白是抗体片段，所述片段是本文所列出的保持对OSMR结合特异性的任一抗体的片段。在各种实施方案中，抗体结合蛋白包含但不限于F(ab)、F(ab')、F(ab')2、Fv或单链Fv片段。至少，本文所指的抗体包含可特异性结合至OSMR的多肽，所述OSMR包含所有或部分轻或重链可变区，诸如一种或多种CDR。
OSMR结合抗体片段的其它实例包括但不限于(i)由VL、VH、CL和CH1域组成的Fab片段，(ii)由VH和CH1域组成的Fd片段，(iii)由单抗体的VL和VH域组成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward等，1989，Nature 341：544-546)，其由单变量组成，(v)分离的CDR区，(vi)F(ab')2片段，包含两种连接的Fab片段的二价片段(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH域和VL域由允许两种域相关联以形成抗原结合位的肽连接体连接(Bird等，1988，Science 242：423-426，Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883)，(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)和(ix)“双抗体”或“三抗体”、通过基因融合构建的多价或多特异性片段(Tomlinson等，2000，Methods Enzymol.326：461-479；WO94/13804；Holliger等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448)。可修饰抗体片段。例如，可通过并入连接VH和VL域的二硫健而稳定分子(Reiter等，1996，Nature Biotech.14：1239-1245)。本发明的多个方面包括其中这些片段的非CDR组分是人序列的实施方案。
在一个实施方案中，OSMR抗原结合蛋白是完全的人抗体。在这个实施方案中，如上文所列，特定的结构包含所描绘的包含CDR区的完整重链和轻链。另外的实施方案利用本发明的CDR、来自其它人抗体的其它CDR、构架区、J和D区、恒定区等中的一种或多种。例如，本发明的CDR可取代任一数量的人抗体，特别是商业上的相关抗体的CDR。
可通过经由氨基酸键(短肽连接子)连接重链和轻链可变结构域(Fv区)导致单多肽链而形成单链抗体。此单链Fv(scFv)已通过融合编码DNA之间的肽连接子的DNA而制备，所述DNA编码两种可变结构域多肽(VL和VH)。取决于两个可变结构域之间柔性连接子的长度，所得的多肽可向后折叠到自身上以形成抗原结合单体，或它们可形成多聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体)(Kortt等，1997，Prot.Eng.10：423；Kortt等，2001，Biomol.Eng.18：95-108)。通过组合不同的包含多肽的VL和VH，可形成结合至不同表位的多聚scFv(Kriangkum等，2001，Biomol.Eng.18：31-40)。用于产生单链抗体而开发的技术包括美国专利No.4,946,778；Bird，1988，Science 242：423；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879；Ward等，1989，Nature 334：544，de Graaf等，2002，Methods Mol Biol.178：379-87中描述的那些。衍生自本文提供的抗体的单链抗体(包括但不限于包含Ab1 LCv/Ab1 HCv(SEQ ID NO：27/SEQ ID NO：9)、Ab2 LCv/Ab2 HCv(SEQ ID NO：28/SEQ ID NO：10)、和Ab3LCv/Ab3 HCv(SEQ ID NO：29/SEQ ID NO：11)的可变结构域组合，和其组合的scFv)涵盖在本发明中。示例性单链抗体包含以下可变结构域组合：SEQ ID NO：27/SEQ ID NO：53；以及SEQ ID NO：28/SEQ ID NO：54。
在一个实施方案中，OSMR抗原结合蛋白是抗体融合蛋白(本文有时称为“抗体缀合物”)。缀合物配体可为蛋白类或非蛋白类；后者一般使用抗原结合蛋白和缀合物配体上的官能团产生。在某些实施方案中，将抗体缀合至非蛋白类化学物(药物)以形成抗体药物缀合物。
在一个实施方案中，OSMR抗原结合蛋白是抗体类似物，有时称为“合成抗体”。例如，多种作业利用具有移植CDR的取代蛋白支架或人造支架。此类支架包括但不限于为了稳定结合蛋白以及整个由例如生物相容性聚合物组成的合成支架的三维结构而引入的突变。参见，例如Korndorfer等，2003，Proteins：Structure，Function，and Bioinformatics，第53卷，1：121-129册。Roque等，2004，Biotechnol.Prog.20：639-654。另外，可使用肽抗体模拟物(“PAM”)，以及基于抗体模拟物的作业利用纤连蛋白组分作为支架。
如本文使用，“蛋白”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白、多肽、寡肽和肽。在一些实施方案中，两个或多个共价连接的氨基酸由肽键连接。蛋白可由天然存在的氨基酸和肽键组成，例如当使用表达系统和宿主细胞重组产生蛋白时，如以下所列。或者，蛋白可包括合成氨基酸(例如高苯丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸，和正亮氨酸)或肽模拟物结构，即“肽或蛋白类似物”，诸如类肽(参见Simon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：9367，其通过引用并入本文)，其可耐受蛋白酶或其它生理和/或保存条件。可并入此类合成氨基酸，特别是当抗原结合蛋白在体外通过本领域熟知的传统方法合成时。另外，可使用肽模拟物、合成和天然存在的残基/结构的任意组合。“氨基酸”也包括氨基酸残基，诸如脯氨酸和羟脯氨酸。氨基酸“R基”或“侧链”可为(L)-或(S)-构型。在一个特定实施方案中，氨基酸为(L)-或(S)-构型。
在某些方面，本发明提供结合OSMR的重组抗原结合蛋白和在一些实施方案中，重组人OSMR或其部分。在此上下文中，“重组蛋白”为通过使用本领域已知的任意技术和方法的重组技术产生的蛋白，即通过本文描述的重组核酸的表达。用于产生重组蛋白的方法和技术在本领域是熟知的。本发明的实施方案包括结合野生型OSMR和其变体的重组抗原结合蛋白。
“基本上由…组成”意指氨基酸序列可相对于所示的SEQ ID NO：序列变化约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15％且仍然保持生物活性，如本文描述。
在一些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白是分离蛋白或实质上纯蛋白。“分离”蛋白不掺杂至少某些在天然状态通常与其关的物质，例如在给定样品中占总蛋白的至少约5重量％或至少约50重量％。应理解分离蛋白可视情况占总蛋白含量的5重量％至99.9重量％。例如，可通过使用诱导型启动子或高表达启动子，使蛋白在增加的浓度水平下产生，使得以显著更高浓度产生蛋白。限定包括抗原结合蛋白在本领域已知的多种生物和/或宿主细胞中产生。
对于氨基酸序列，通过使用本领域已知的标准技术确定序列同一性和/或相似性，包括但不限于Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482的局部序列同一性算法、Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443的序列同一性比对算法、Pearson和Lipman，1988，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85：2444的相似性搜索法、这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575ScienceDrive，Madison，Wis.中GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)、由Devereux等，1984，Nucl.AcidRes.12：387-395描述的最佳配合序列程序，优选地使用默认设置，或通过检查。优选地，基于以下参数通过FastDB计算同一性百分比：1的错配罚分；1的缺口罚分；0.33的缺口尺寸罚分；以及30的连接罚分，“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis，”Macromolecule Sequencing and Synthesis，Selected Methods and Applications，第127-149页(1988)，Alan R.Liss，Inc。
有用算法的一个实例是PILEUP。PPILEUP使用渐进的、成对的比对从一组相关序列中创建多序列比对。也可绘制显示用于创建比对的聚类关系的树图。PILEUP使用Feng&Doolittle，1987，J.Mol.Evol.35：351-360的简化渐进比对法；所述方法与Higgins和Sharp，1989，CABIOS 5：151-153描述的方法相似。有用的PILEUP参数包括3.00的默认缺口权重、0.10的默认缺口长度权重，和加权末端缺口。
有用算法的另一个实例是BLAST算法，在以下中描述：Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-410；Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402；以及Karin等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5787。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其获自Altschul等，1996，Methods in Enzymology 266：460-480。WU-BLAST-2使用多种搜索参数，其中大部分被设置为默认值。利用以下值设置可调节的参数：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(T)＝II。HSP S和HSP S2参数是动态值且取决于特定序列的组成和搜索受关注序列的特定数据库的组成由自身程序设立；但可调节值以增加敏感度。
另外有用的算法是由Altschul等，1993，Nucl.Acids Res.25：3389-3402报道的缺口BLAST。缺口BLAST使用BLOSUM-62取代分数；阈值T参数设置为9；触发非缺口拓展的双击方法，k的缺口长度记为10+k；Xu设置为16，且Xg在数据库搜索阶段设置为40且在算法输出阶段设置为67。通过对应于约22位的分数触发缺口比对。
一般来讲，单独变体CDR之间的氨基酸同源性、相似性或同一性为本文所描绘的序列的至少80％，且更典型地，优选地至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％的增加的同源性或同一性。以类似的方式，相对于本文鉴定的结合蛋白的核酸序列的“核酸序列同一性的百分比(％)”定义为在候选序列中与抗原结合蛋白的编码序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。特定方法利用WU-BLAST-2设置为默认值，重叠跨度和重叠分数分别设置为1和0.125的BLASTN模块。
一般来讲，编码单独变体CDR的核苷酸序列和本文所描绘的核苷酸序列之间的核酸序列同源性、相似性或同一性为至少80％，更典型地，优选地至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以及几乎100％的增加的同源性或同一性。
因此，“变体CDR”是与本发明的母本CDR具有特定同源性、相似性或同一性，且共享生物学功能的CDR，包括但不限于母本CDR的特异性和/或活性的至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
虽然预先确定引入氨基酸序列变化的位点或区，但不需要预先确定突变本身。例如，为了优化进行给定位点的突变，可在靶密码子或区进行随机诱变并针对所需活性的优化组合筛选表达的抗原结合蛋白CDR变体。用于在具有已知序列的DNA的预先确定的位点进行取代突变的技术是熟知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。使用抗原结合蛋白活性的测定进行突变体的筛选，诸如OSMR结合。
氨基酸取代一般为单个残基；虽然可耐受相当大的插入，但是插入通常为约一(1)至约二十(20)个数量级氨基酸残基。虽然在一些情况下缺失可更大，但是缺失范围为从约一(1)至约二十(20)个氨基酸残基。
取代、删除、插入或其任意组合可用于得到最终的衍生物或变体。一般来讲，对少量氨基酸进行这些改变以最小化分子的变动，特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。然而，在某些情况下，可耐受更大的改变。一般依据以下表3所列的图表进行保守取代。
表3
功能或免疫一致性的实质改变可通过选择比表3中所显示的那些保守性更低的取代进行。例如，可进行更显著地影响以下的取代：更改区域多肽主链的结构，例如α-螺旋或β-折叠结构；靶位点处分子的电荷和疏水性；或侧链的体积。一般期望使多肽性质产生最大改变的取代是那些取代，其中(a)亲水性残基(例如丝氨酰和苏氨酰)被取代为疏水性残基(例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰)或被其取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸被取代为任意其它残基或被其取代；(c)具有正电性侧链的残基(例如赖氨酰、精氨酰或组氨酰)被取代为负电性残基(例如谷氨酰或天冬氨酰)或被其取代；或(d)具有大体积侧链的残基(例如苯丙氨酸)被取代为不具有侧链的残基(例如甘氨酸)或被其取代。
虽然也可按需要选择变体以修饰抗原结合蛋白的特征，但是变体通常展示与天然存在的类似物相同的定性生物活性且激发相同的免疫反应。或者，可设计变体以改变抗原结合蛋白的生物活性。例如，如本文讨论，可更改或移除糖基化位点。
本发明范围内的其它OSMR抗体衍生物包括具有其它蛋白或多肽的OSMR抗体或其片段的共价或聚集缀合物，诸如通过包含融合至OSMR抗体多肽N端或C端的异源多肽的重组融合蛋白的表达。例如，缀合肽可为异源信号(或前导)多肽，例如酵母α因子前导，或肽诸如表位标记。含有OSMR抗体的融合蛋白可包含添加的以便于OSMR抗体(例如聚His)的纯化或鉴定的肽。OSMR抗体多肽也可连接至FLAG肽，如Hopp等，Bio/Technology 6：1204，1988和美国专利5,011,912中所描述。FLAG肽是高抗原的且通过特定的单克隆抗体(mAb)提供可逆性结合表位，使得表达的重组蛋白迅速测定且便于纯化。用于制备其中FLAG肽融合至给定的多肽的融合蛋白的试剂是市售的(Sigma，St.Louis，MO)。
在一个实施方案中，使用衍生自免疫球蛋白的多肽制备低聚体。已描述包含融合至抗体衍生的多肽(包括Fc域)的各个部分的某些异源多肽的融合蛋白的制备，例如Ashkenazi等，1991，PNAS USA 88：10535；Byrn等，1990，Nature 344：677；以及Hollenbaugh等，1992“Construction ofImmunoglobulin Fusion Proteins”，Current Protocols inImmunology，增刊4，第10.19.1-10.19.11页。
本发明的一个实施方案是针对于包含两种通过融合OSMR抗体的OSMR结合片段至抗体Fc区创建的融合蛋白的二聚体。该二聚体可通过例如将编码融合蛋白的基因融合插入适当的表达载体中，在利用重组表达载体转化的宿主细胞中表达基因融合，且允许表达的融合蛋白装配成抗体分子一样，由此在Fc部分之间形成链间二硫键以得到二聚体。
本文使用的术语“Fc多肽”包括衍生自抗体Fc区的多肽的天然和突变形式。也可包括含有促发二聚的铰链区的此类多肽的截短形式。包含Fc部分(和由此形成的低聚体)的融合蛋白提供便于蛋白A或蛋白G柱上的亲和层析纯化的优点。
如PCT申请WO 93/10151(通过引用并入本文)中所描述，一种合适的Fc多肽是从人IgG抗体铰链区的N端延伸至Fc区天然C端的单链多肽。另一种有用的Fc多肽是美国专利5,457,035和Baum等，1994，EMBO J.13：3992-4001中描述的Fc突变蛋白。除了氨基酸19从Leu改变为Ala、氨基酸20从Leu改变为Glu以及氨基酸22从Gly改变为Ala以外，这个突变蛋白的氨基酸序列与WO 93/10151中所示的天然Fc序列相同。突变蛋白展示对Fc受体的亲和力减小。
在其它实施方案中，OSMR抗体的重链和/或轻链的可变部分可取代为抗体重链和/或轻链的可变部分。
另一种用于制备低聚OSMR抗体衍生物的方法涉及亮氨酸拉链的使用。亮氨酸拉链域是促发蛋白低聚的肽，在所述蛋白中发现亮氨酸拉链域。亮氨酸拉链最初在多种DNA结合蛋白中被鉴定(Landschulz等，Science 240：1759-64，1988)，且迄今已在多种不同蛋白中发现。已知的亮氨酸拉链是天然存在的肽和其二聚或三聚衍生物。适用于产生可溶低聚蛋白的亮氨酸拉链域的实例在PCT申请WO 94/10308中有所描述，且衍生自肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链在Hoppe等，1994，FEBS Letters 344：191中有所描述，在此其通过引用并入本文。允许此处融合的异源蛋白的稳定的三聚的修饰的亮氨酸拉链的使用在Fanslow等，1994，Semin.Immunol.6：267-78中有所描述。在一种方法中，包含融合于亮氨酸拉链肽的OSMR抗体片段或衍生物的重组融合蛋白在适宜的宿主细胞中表达，且所形成的可溶性低聚OSMR抗体片段或衍生物从培养物上清液中回收。
包括在本发明范围内的抗原结合蛋白的共价修饰一般但不是经常是在翻译后进行的。例如，通过使抗原结合蛋白的特定氨基酸残基与能够与选择的侧链或N或C端残基反应的有机衍生试剂反应将抗原结合蛋白的共价修饰的多种类型引入分子中。
半胱氨酰残基最常与α卤代乙酸酯(和相应的胺)诸如氯乙酸或氯乙酰胺反应以产生羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨酰残基也可通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、对氯汞基苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧-1，3-二唑反应衍生。
组氨酰残基通过在pH5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应衍生，因为此试剂对组氨酰侧链具有相对特异性。对溴苯酰甲基溴也有用；该反应优选地在pH 6.0下在0.1M二甲胂酸钠中进行。
赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸或其它羧酸酐反应。利用这些试剂衍生具有使赖氨酰残基的电荷逆转的作用。用于衍生含有α氨基的残基的其它合适的试剂包括亚氨酸酯诸如甲基吡啶亚氨酸甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯代氢硼化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2，4-戊二酮；以及氨基转移酶催化的与乙醛酸的反应。
精氨酰残基通过与一种或几种传统试剂反应而修饰，其中苯甲酰甲醛、2，3-丁酮、1，2-环己二酮，和茚三酮。精氨酰残基的衍生需要反应在碱性条件下进行，因为胍功能基具有高pKa。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸的ε-氨基反应。
可进行酪氨酰残基的特定修饰，特别感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入酪氨酰残基中。最常见的是，N-乙酰咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰物种和3-硝基衍生物。酪氨酰残基使用125I或131I碘化以制备用于放射性免疫测定的标记蛋白，上文描述的氯胺T法是合适的。
通过与碳二亚胺类(R'—N＝C＝N--R')(其中R和R'任选地是不同的烷基)，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮翁-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺反应而选择性地修饰羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)。此外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应而转变为天冬酰胺和谷氨酰胺残基。
双官能试剂衍生法用于将抗原结合蛋白交联至在多种方法中使用的水溶性支撑基质或表面。常用的交联剂包括例如1，1-双(叠氮乙酰)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮水杨酸形成的酯、同双官能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺酯，诸如3，3′-二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)、和双官能马来酰亚胺，诸如双-N-马来酰亚胺基-1，8-辛烷。衍生剂诸如甲基-3-[(p-叠氮苯基)二硫代]丙酰亚胺产生在光存在下能够形成交联的光可活化的中间产物。或者，将美国专利No.3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；以及4,330,440中所描述的反应性水不溶性基质诸如溴化氰活化的糖类和反应性底物用于蛋白固定化。
谷氨酰胺和天冬酰胺残基通常脱酰胺成对应的谷氨酰和天冬酰残基。或者，这些残基在温和的酸性条件下脱酰氨基。这些残基的任一形式都在本发明的范围内。
其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structureand Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，1983，第79-86页)、N-端胺的乙酰化和任意C端羧基的酰胺化。
包括在本发明范围内的抗原结合蛋白的另一种共价修饰包括改变蛋白糖基化模式。如本领域所知，糖基化模式可取决于蛋白的序列(例如下文讨论的特殊糖基化氨基酸残基的存在或不存在)或其中产生蛋白的宿主细胞或有机体。具体的表达系统在下文讨论。
多肽的糖基化通常是N连接或O连接。N连接是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链相连。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸之外的任一氨基酸)是碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中这些三肽序列中任一种的存在创建了潜在的糖基化位点。O连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸)相连，但是也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
通过更改氨基酸序列使得它含有一种或多种上文描述的的三肽序列(对于N连接的糖基化位点)来将糖基化位点方便地加入抗原结合蛋白中。也可通过起始序列的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的添加或取代(对于O连接的糖基化位点)进行更改。为了方便起见，优选地通过在DNA水平下的改变，特别是通过在预先选好的碱基处突变编码靶多肽的DNA使得产生翻译成所需氨基酸的密码子来改变抗原结合蛋白氨基酸序列。
增加抗原结合蛋白上的碳水化合物部分的数量的另一种方法是将糖苷化学地或酶促地偶联到蛋白上。这些过程的优点是在具有N和O连接的糖基化的糖基化能力的宿主细胞中它们不需要产生蛋白。取决于所使用的偶联模式，糖可连接到(a)精氨酸和组氨酸、(b)游离羧基、(c)游离巯基，诸如半胱氨酸的那些、(d)游离羟基，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些、(e)芳香残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法在1987年9月11日出版的WO 87/05330、以及Aplin和Wriston，1981，CRCCrit.Rev.Biochem.，第259-306页中有所描述。
可以化学方式或酶促方式去除存在于起始抗原结合蛋白上的碳水化合物部分。化学去糖基化要求将蛋白暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。这种处理导致除了连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大多数或所有的糖裂解，同时使多肽完整。化学去糖基化在Hakimuddin等，1987，Arch.Biochem.Biophys.259：52和Edge等，1981，Anal.Biochem.118：131中有所描述。如Thotakura等，1987，Meth.Enzymol.138：350描述，多肽上的碳水化合物部分的酶裂解可通过使用多种内切或外切糖苷酶实现。如Duskin等，1982，J.Biol.Chem.257：3105描述，可通过使用衣霉素化合物阻止潜在的糖基化位点的糖基化。衣霉素阻止蛋白-N-糖苷键形成。
抗原结合蛋白的共价修饰的另一类型包括将抗原结合蛋白连接至各种非蛋白质聚合物，包括但不限于各种多元醇，诸如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯(以美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式)。另外，如本领域所知，可在抗原结合蛋白内的各个位置进行氨基酸取代以便于聚合物(诸如PEG)的添加。
在一些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白的共价修饰包含一种或多种标记的添加。
术语“标记基团”意指任一可检测的标记。合适的标记基团的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系磷光体)、酶基团(例如辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团或可被二次报道分子(例如亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位、金属结合域、表位标记)识别的预先确定的多肽表位。在一些实施方案中，标记基团经由各种长度的间隔臂偶联至抗原结合蛋白以降低潜在的空间位阻。用于标记蛋白的各种方法在本领域是已知的并可用于实施本发明。
一般来讲，取决于其待检测的测定，将标记分成多类：a)同位素标记，其可为放射性同位素或重同位素；b)磁标记(例如磁粒子)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料；酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素基团；以及f)可被二次报道分子(例如亮氨酸拉链对序列、二次抗体的结合位、金属结合域、表位标记等)识别的预先确定的多肽表位。在一些实施方案中，标记基团经由各种长度的间隔臂偶联至抗原结合蛋白以降低潜在的空间位阻。用于标记蛋白的各种方法在本领域是已知的并可用于实施本发明。
特定标记包括光学染料，包括但不限于发色团、荧光体和磷光体，在许多情况下后者为特定的。荧光体可为“小分子”荧光或蛋白质荧光。
“荧光标记”意指可通过其固有荧光特性而被检测到的任一分子。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、若丹明、四甲基若丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基-香豆素、芘、Malacite绿、二苯乙烯、荧光黄、Cascade BlueJ、德克萨斯红、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、奥勒冈绿、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、Cascade Blue、CascadeYellow和藻红蛋白(PE)(分子探针、Eugene、OR)、FITC、罗丹明和德克萨斯红(Pierce、Rockford、IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science，Pittsburgh，PA)。包括荧光体的合适光学染料在Molecular Probes Handbook，Richard P.Haugland中有所描述，再次其通过引用明确地并入本文。
合适的蛋白质荧光标记也包括但不限于绿荧光蛋白、包括GFP的Genilla、Ptilosarcus或多管水母属物种(Chalfie等，1994，Science263：802-805)、EGFP(ClontechLaboratories，Inc.，Genbank登录号U55762)、蓝荧光蛋白(BFP，QuantumBiotechnologies，Inc.1801de Maisonneuve Blvd.West，8th Floor，Montreal，Quebec，Canada H3H 1J9；Stauber，1998，Biotechniques 24：462-471；Heim等，1996，Curr.Biol.6：178-182)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP，Clontech Laboratories，Inc.)、荧光素酶(Ichiki等，1993，J.Immunol.150：5408-5417)、β半乳糖苷酶、(Nolan等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)和Renilla(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美国专利No.5292658、5418155、5683888、5741668、5777079、5804387、5874304、5876995、5925558)。上文引述的所有参考文献通过引用明确地并入本文。
本文描述的示例性抗原结合蛋白具有基于被抗原结合蛋白结合的OSMR上的不同表位的特性。术语“表位”意指当抗原结合蛋白结合至靶分子时，被抗原结合蛋白(例如抗体)接触的靶分子的氨基酸。表位可为相邻的或非相邻的(例如，(i)在单链多肽中，在多肽序列中彼此不相邻但在靶分子环境中的氨基酸残基被抗原结合蛋白结合，或(ii)在包含两种或多种个体组分(例如OSMR和gp130或OSMR和IL-31受体A)的多聚受体中，氨基酸残基存在在一种或多种个体组分上但仍然被抗原结合蛋白结合。表位决定簇可包括诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰氯基团的分子的化学活性表面基团，且可具有特定三维结构特征和/或特定的电荷特征。一般来讲，对于具体的靶分子特定的抗原结合蛋白在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优选地识别靶分子上的表位。
表征被抗原结合蛋白结合的表位的方法在本领域是熟知的，包括但不限于分箱(交叉竞争)(Miller等“Epitope binning of murine monoclonal antibodies by amultiplexed pairing assay”J Immunol Methods(2011)365，118-25)、肽作图(例如PEPSPOTTM)(Albert等“The B-cell Epitope of the Monoclonal Anti-Factor VIIIAntibody ESH8Characterized by Peptide Array Analysis”2008Thromb.Haemost.99，634-7)、诱变方法，诸如嵌合体(Song等“Epitope Mapping of Ibalizumab，a HumanizedAnti-CD4 Monoclonal Antibody with Anti-HIV-1Activity in Infected Patients”J.Virol.(2010)84，6935-6942)、丙氨酸扫描(Cunningham和Wells“High-resolutionepitope mapping of HGH-receptor interactions by alanine-scanning mutagenesis”Science(1989)244，1081-1085)、精氨酸扫描(Lim等“Adiversity of antibody epitopescan induce signaling through the erythropoietin receptor”Biochemistry(2010)49，3797-3804)、HD交换法(Coates等“Epitope mapping by amide hydrogen/deuteriumexchange coupled with immobilization of antibody，on-line proteolysis，liquidchromatography and mass spectrometry”Rapid Commun.Mass Spectrom.(2009)23 639-647)、NMR交叉饱和度法(Morgan等“Precise epitope mapping of malaria parasiteinhibitory antibodies by TROSY NMR cross-saturation”Biochemistry(2005)44，518-23)、和结晶学(Gerhardt等“Structure of IL-17Ain complex with a potent，fullyhuman neutralizing antibody”J.Mol.Biol(2009)394，905-21)。该方法在它们提供关于包含表位的氨基酸细节水平上变化。实施例4提供表位框并的示例性方法。
本发明的抗原结合蛋白包括具有本文描述的示例性抗原结合蛋白(例如Ab1、Ab2或Ab3)的重叠表位的那些。在某些实施方案中，抗原结合蛋白与示例性抗原结合蛋白具有相同的表位。在其它实施方案中，抗原结合蛋白仅结合与示例性抗原结合蛋白相同的氨基酸的子集。
在某些实施方案中，OSMR抗原结合蛋白具有与Ab1、Ab2或Ab3相同或重叠的表位，且包含a)与SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变结构域；b)与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变结构域；或c)a)的轻链可变结构域和b)的重链可变结构域。
在某些实施方案中，OSMR抗原结合蛋白具有与Ab1、Ab2或Ab3相同或重叠的表位，且包含与SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变结构域；包含与SEQ ID NO：28中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变结构域的那些；以及包含与SEQID NO：29中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或相同的重链可变结构域的那些。
在某些实施方案中，OSMR抗原结合蛋白具有与Ab1、Ab2或Ab3相同或重叠的表位，且包含a)具有SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变结构域；b)具有SEQ ID NO：9、SEQID NO：10或SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的重链可变结构域；或c)a)的轻链可变结构域和b)的重链可变结构域。
在某些实施方案中，OSMR抗原结合蛋白具有与Ab1、Ab2或Ab3相同或重叠的表位，且包含具有SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变结构域和具有SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的重链可变结构域的那些；包含具有SEQ ID NO：28中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变结构域和具有SEQ ID NO：10中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的重链可变结构域的那些；以及包含具有SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的轻链可变结构域和具有SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列的不超过十种或不超过五种氨基酸添加、缺失或取代的重链可变结构域的那些。
SEQ ID NO：9的示例性重链可变结构域变体在对应于SEQ ID NO：9中的位置73的位置含有除了天冬酰胺的氨基酸(例如天冬氨酸)。SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列是SEQID NO：9的重链可变结构域变体的实例。
SEQ ID NO：10的示例性重链可变结构域变体在对应于SEQ ID NO：10中的位置73的位置含有除了天冬酰胺的氨基酸(例如天冬氨酸)。SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列是SEQ ID NO：10的重链可变结构域变体的实例。
在某些实施方案中，OSMR抗原结合蛋白具有与Ab1、Ab2或Ab3相同或重叠的表位，且包含轻链可变结构域和重链可变结构域，所述轻链可变结构域包含a)具有SEQ ID NO：30中所示的LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：33中所示的LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：36中所示的LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；b)具有SEQ ID NO：31中所示的LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：34中所示的LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：37中所示的LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；或c)具有SEQ ID NO：32中所示的LCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR1；具有SEQ ID NO：35中所示的LCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR2；以及具有SEQ ID NO：38中所示的LCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的LCDR3；所述重链可变结构域包含d)具有SEQ ID NO：12中所示的HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：15中所示的HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：18中所示的HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；e)具有SEQ ID NO：13中所示的HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：16中所示的HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：19中所示的HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3；或f)具有SEQ ID NO：14中所示的HCDR1序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR1；具有SEQ ID NO：17中所示的HCDR2序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR2；以及具有SEQ ID NO：20中所示的HCDR3序列的不超过三种氨基酸添加、缺失或取代的HCDR3。
刚刚在上文描述的优选OSMR抗原结合蛋白包括包含a)的轻链可变结构域和d)的重链可变结构域的那些；包含b)的轻链可变结构域和e)的重链可变结构域的那些；以及包含c)的轻链可变结构域和f)的重链可变结构域的那些。
包含a)的轻链可变结构域和d)的重链可变结构域的OSMR抗原结合蛋白可任选地含有重链可变结构域，所述重链可变结构域在对应于SEQ ID NO：9中的位置73的位置包含除了天冬酰胺的氨基酸(例如天冬氨酸)。在此类实施方案中，重链可变结构域任选地包含SEQ ID NO：53中所示的氨基酸序列。
包含b)的轻链可变结构域和e)的重链可变结构域的OSMR抗原结合蛋白可任选地含有重链可变结构域，所述重链可变结构域在对应于SEQ ID NO：10中的位置73的位置包含除了天冬酰胺的氨基酸(例如天冬氨酸)。在此类实施方案中，重链可变结构域任选地包含SEQ ID NO：54中所示的氨基酸序列。
具有相同表位或重叠表位的抗原结合蛋白将通常交叉竞争以结合至抗原。因此，在某些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白与Ab1、Ab2或Ab3交叉竞争。“交叉竞争(“cross-compete”或“cross-competition”)”意指抗原结合蛋白竞争靶上的相同表位或结合位点。此类竞争可通过参考抗原结合蛋白(例如抗体或其抗原结合部分)防止或抑制测试抗原结合蛋白的特异性结合的测定而确定，且反之亦然。众多类型的竞争结合测定可用于确定测试是否分子与参考分子竞争以结合。采用的测定实例包括固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等(1983)Methods in Enzymology 9：242-253)、固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(参见例如Kirkland等，(1986)J.Immunol.137：3614-9)、固相直接标记测定、固相直接标定夹心测定、Luminex(Jia等“A novel method of Multiplexed Competitive Antibody Binning forthe characterization of monoclonal antibodies”J.Immunological Methods(2004)288，91-98)和表面等离子体共振(Song等“Epitope Mapping of Ibalizumab，a HumanizedAnti-CD4 Monoclonal Antibody with Anti-HIV-1 Activity in Infected Patients”J.Virol.(2010)84，6935-42)。确定交叉竞争的示例性方法在实施例5中有所描述。通常，当竞争抗原结合蛋白过量存在时，它将以至少50％、55％、60％、65％、70％或75％抑制参考抗原结合蛋白与普通抗原的结合。在一些情况下，以至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多抑制结合。
编码OSMR抗原结合蛋白的多核苷酸
本发明涵盖编码OSMR抗原结合蛋白的核酸或分离的核酸，包括抗体，如本文定义。优选的核酸包括编码本文描述的示例性轻链和重链的那些。
编码Ab1 LC的示例性核酸是包含SEQ ID NO：21中所示的序列的核酸。
编码Ab2 LC的示例性核酸是包含SEQ ID NO：22中所示的序列的核酸。
编码Ab3 LC的示例性核酸是包含SEQ ID NO：23中所示的序列的核酸。
编码Ab1 HC的示例性核酸是包含SEQ ID NO：3中所示的序列的核酸。
编码Ab2 HC的示例性核酸是包含SEQ ID NO：4中所示的序列的核酸。
编码Ab3 HC的示例性核酸是包含SEQ ID NO：5中所示的序列的核酸。
编码变体Ab1 HC的示例性核酸是包含SEQ ID NO：47中所示的序列的核酸。
编码变体Ab2 HC的示例性核酸是包含SEQ ID NO：48中所示的序列的核酸。
编码变体Ab3 HC的示例性核酸是包含SEQ ID NO：49中所示的序列的核酸。
本发明的多个方面包括编码本文所描述的氨基酸序列的多核苷酸变体(例如，由于简并)。
本发明的多个方面包括多种包括但不限于以下示例性实施方案的实施方案。
包含多核苷酸的分离的核酸，其中所述多核苷酸编码一种或多种包含选自由以下组成的组的氨基酸序列的多肽：
A.1.与SEQ ID NOS：27-29所示的轻链可变结构域序列具有至少90％同一性的轻链可变结构域序列；
2.与SEQ ID NOS：9-11所示的重链可变结构域序列具有至少90％同一性的重链可变结构域序列；
3.(1)的轻链可变结构域和(2)的重链可变结构域；以及
B.包含CDR1、CDR2、CDR3的轻链可变结构域和/或包含CDR1、CDR2、CDR3的重链可变结构域，其在来自以下序列的每个CDR中是相同或相异总共不超过三种氨基酸添加、取代和/或缺失：
1.Ab1的轻链CDR1(SEQ ID NO：30)、CDR2(SEQ ID NO：33)、CDR3(SEQ ID NO：36)或重链CDR1(SEQ ID NO：12)、CDR2(SEQ ID NO：15)、CDR3(SEQ ID NO：18)；
2.Ab2的轻链CDR1(SEQ ID NO：31)、CDR2(SEQ ID NO：34)、CDR3(SEQ ID NO：37)或重链CDR1(SEQ ID NO：13)、CDR2(SEQ ID NO：16)、CDR3(SEQ ID NO：19)；以及
3.Ab3的轻链CDR1(SEQ ID NO：32)、CDR2(SEQ ID NO：35)、CDR3(SEQ ID NO：38)或重链CDR1(SEQ ID NO：14)、CDR2(SEQ ID NO：17)、CDR3(SEQ ID NO：20)。
在一些实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：54中所示的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列的多肽。
在优选的实施方案中，由核酸或分离的核酸编码的多肽是结合OSMR的抗原结合蛋白的组分。
对应于本文描述的氨基酸序列的核苷酸序列被用作核酸分离的探针或引物或用作数据库搜索的查询序列，该核苷酸序列可通过从氨基酸序列“回翻译”得到，或通过与鉴定了编码DNA序列的多肽相同的氨基酸域的鉴定得到。熟知的聚合酶链式反应(PCR)过程可用于分离和扩增DNA序列，所述DNA序列编码OSMR抗原结合蛋白或OSMR抗原结合蛋白多肽片段的所需组合。限定DNA片段组合的所需末端的寡核苷酸被作为5'和3'引物。寡核苷酸可另含有限制性内切酶的识别位点以便于将扩增的DNA片段组合插入表达载体中。PCR技术在Saiki等，Science 239：487(1988)；Recombinant DNA Methodology，Wu等，编，AcademicPress，Inc.，San Diego(1989)，第189-196页；以及PCRProtocols：A Guide to Methodsand Applications，Innis等，编，Academic Press，Inc.(1990)中有所描述。
本发明的核酸分子包括以单链和双链形式的DNA和RNA，以及相应的互补序列。DNA包括例如cDNA、基因组DNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA和其组合。本发明的核酸分子包括全长基因或cDNA分子，以及其片段的组合。本发明的核酸优选地衍生自人源，但是本发明也包括衍生自非人物种的那些。
在一些实施方案中，本发明的核酸是分离的核酸。在核酸从天然存在的来源中分离的情况下，“分离的核酸”是从存在于核酸已被分离的生物体基因组中的相邻基因序列中分离的核酸。在由模板以酶促方式或以化学方式合成核酸的情况下，诸如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸，例如，应理解由此过程所得的核酸是分离的核酸。分离的核酸分子是指以单独片段形式或作为较大核酸构建体的组分的核酸分子。在一个优选的实施方案中，核酸基本上不含内源性污染物质。核酸分子优选地衍生自以基本上纯的形式和一定量或浓度分离至少一次的DNA或RNA，该量或浓度能够通过标准生化方法鉴定、操作和回收其组分核苷酸序列(诸如在Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中所列的那些)。此类序列优选地以未被内部未翻译序列间断的开放阅读框形式或内含子(通常存在于真核基因中)形式提供和/或构建。未翻译DNA序列可存在于开放阅读框的5′或3′，其中其不干扰编码区的操作或表达。
本发明也包括在中等严格条件下，更优选地高严格条件下与本文描述的编码OSMR抗原结合蛋白的核酸杂交的核酸或分离的核酸。影响杂交条件的选择和用于设计合适条件的指导的基本参数在Sambrook，，Fritsch，和Maniatis(1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第9和11章；以及Current Protocols in Molecular Biology，1995，Ausubel等，编，John Wiley&Sons，Inc.，第2.10和6.3-6.4节)中有所陈述，且可由本领域的技术人员根据例如DNA的长度和/或碱基组成轻易地确定。实现中等严格条件的一种方法涉及使用含有5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)、约50％甲酰胺的杂交缓冲液、6×SSC的预洗溶液，和约55℃的杂交温度(或其它相似杂交溶液，诸如含约50％甲酰胺的溶液，杂交条件约42℃)，和约60℃，0.5×SSC，0.1％SDS的洗涤条件。一般来讲，高严格条件被限定为以上杂交条件，但是在约68℃，0.2×SSC，0.1％ SDS下洗涤。SSPE(1×SSPE为0.15MNaCl、10mMNaH.sub.2PO.sub.4和1.25mM EDTA，pH 7.4)可取代杂交和洗涤缓冲液中的SSC(1×SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；杂交完成后洗涤15分钟。应理解洗涤温度和洗涤盐溶度可按需要调节以通过应用管理杂交反应和双螺旋稳定性的基本原则实现所需严格度，如本领域技术人员所知和下文进一步描述(参见例如Sambrook等，1989)。当核酸与具有未知序列的靶核酸杂交时，杂交体长度假定为杂交核酸的长度。当杂交具有已知序列的核酸时，则可通过比对核酸的序列并鉴定具有最佳序列互补性的一个或多个区来确定杂交体长度。对于预计长度小于50个碱基对的杂交体，杂交温度应比杂交体熔解温度(Tm)低5至10℃，其中Tm依据以下公式确定。对于长度小于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+T碱基的#)+4(#G+C碱基的#)。对于长度大于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N为杂交体的碱基数，且[Na+]为杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于1xSSC，[Na+]＝0.165M)。优选地，每个此类杂交核酸具有至少15个核苷酸(或更优选地至少18个核苷酸、或至少20个核苷酸、或至少25个核苷酸、或至少30个核苷酸、或至少40个核苷酸、或最优选地至少50个核苷酸)，或与其杂交的本发明的核酸长度的至少25％(更优选地至少50％、或至少60％、或至少70％，和最优选地至少80％)的长度，且具有与其杂交的本发明的核酸的至少60％序列同一性(更优选地至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，且最优选地至少99.5％)，其中通过当比对时比较杂交核酸的序列以最大化重叠和同一性，同时最小化序列缺口(如上文更详细描述)，来确定序列同一性。
根据本发明的变体通常通过编码抗原结合蛋白的DNA中核苷酸的位点特异性诱变制备，使用本领域熟知的盒式或PCR诱变或其它技术，以产生编码变体的DNA，且然后在如本文所列的细胞培养物中表达重组DNA。然而，包含具有高达约100-150个残基的变体CDR的抗原结合蛋白片段可通过体外合成使用公认的技术制备。尽管也可选择具有下文将充分列出的修饰特征的变体，但是变体通常展示与天然存在的类似物相同的定性生物活性，例如结合至OSMR。
本领域的技术人员将会认识到，由于遗传密码的简并性，可产生非常大量的核酸，所有核酸编码本发明的CDR(和抗原结合蛋白的重和轻链或其它组分)。因此，鉴定一种特定氨基酸序列后，本领域的技术人员可通过以不改变编码的蛋白氨基酸序列的方式简单地修饰一种或多种密码子的序列产生任意数量的不同核酸。
本发明也提供包含至少一个如上的多核苷酸的质粒、表达载体、转录或表达盒形式的表达系统和构建体。另外，本发明提供包含此类表达系统或构建体的宿主细胞。
通常，用于任一宿主细胞中的表达载体将含有用于质粒维持和用于克隆和表达外源核苷酸序列的序列。在某些实施方案中，此类序列被统称为“侧翼序列”，这些序列通常含有以下核苷酸序列中的一个或多个：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有给体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、多腺苷酸化序列、用于插入编码待表达多肽的核酸的多接头区，和选择性标记元素。在下文讨论这些序列中的每一个。
任选地，载体可含有“标记”编码序列，即位于OSMR抗原结合蛋白编码序列的5'或3'末端的寡核苷酸分子；该寡核苷酸序列编码聚His(诸如六聚His)，或另一“标记”，诸如FLAG、HA(流感病毒血凝素)、或myc，对此存在市售抗体。此标记在多肽表达时通常被融合到多肽中，且可作为亲和纯化或检测宿主细胞中OSMR抗原结合蛋白的方法。例如可通过柱层析实现亲和纯化，柱层析使用针对标记的抗体作为亲和基质。任选地，随后通过各种方法，诸如使用用于裂解的某些肽酶将标记从纯化OSMR抗原结合蛋白中除去。
侧翼序列可为同源的(即来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源的(即来自与宿主细胞物种或菌株不同的物种)、杂合的(即来自一种以上来源的侧翼序列的组合)、合成的或天然的。因此，侧翼序列的来源可为任意原核或真核生物体、任意脊椎动物或无脊椎动物生物体，或任意植物，条件是该侧翼序列能够在宿主细胞机制中起作用，并可被其激活。
用于本发明载体的侧翼序列可通过本领域熟知的多种方法中的任一种得到。通常，用于本文的侧翼序列事先通过作图和/或通过限制性内切酶消化鉴定且因此可使用适宜的限制性内切酶从合适的组织来源分离。在一些情况下，侧翼序列的全核苷酸序列是已知的。此时，可使用本文描述的用于核酸合成和克隆的方法合成侧翼序列。
不管是否已知侧翼序列的所有或仅一部分，可使用聚合酶链式反应(PCR)和/或通过使用适宜的探针诸如寡核苷酸和/或来自相同或另一物种的侧翼序列片段筛选基因组文库得到。侧翼序列未知时，含有侧翼序列的DNA片段可从较大片段的DNA中分离出来，其中所述较大片段的DNA可含有例如编码序列或甚至另一基因或多个基因。可通过限制性内切酶消化以产生适当的DNA片段，随后使用琼脂糖凝胶纯化、柱层析(Chatsworth，CA)，或者技术人员已知的其它方法分离来实现分离。为实现该目的合适酶的选择将对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。
复制起点通常是市售原核表达载体的一部分，且起点协助宿主细胞中载体的扩增。如果选择的载体不含有复制起点，则可基于已知的序列化学合成起点，且连接到载体中。例如，质粒pBR322(New England Biolabs，Beverly，MA)的复制起点适于大多数革兰氏阴性细菌，且各种病毒起点(例如，SV40、多瘤病毒、腺病毒、疱疹性口腔炎病毒(VSV)或乳头瘤病毒诸如HPV或BPV)用于克隆哺乳动物细胞中载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制组分起点(例如，经常使用SV40起点，只因为它也含有病毒早期启动子)。
转录终止序列通常位于多肽编码区末端的3'且用于终止转录。通常，原核细胞中的转录终止序列是富含G-C的片段，接着是聚-T序列。虽然可从文库容易地克隆该序列或甚至作为载体的一部分购买，但是也可使用核酸合成的方法(如本文中所描述的那些)轻易地合成。
可选择的标记基因编码选择性培养基中生长的宿主细胞的存活和生长所必需的蛋白。典型的选择标记基因编码蛋白，所述蛋白(a)赋予原核宿主细胞对抗生素或其它毒素(例如氨苄西林、四环素、或卡那霉素宿主细胞)的抗性；(b)互补细胞的营养缺陷；或(c)供应从复合或限定的培养基中不能得到的关键营养物。特定的选择标记物是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有利地，也可将新霉素抗性基因用于原核和真核宿主细胞的选择。
其它可选择基因可用于扩增将要表达的基因。扩增是一种过程，其中用于产生对生长或细胞存活关键的蛋白所需的基因在重组细胞的连续数代的染色体中串联重复。哺乳动物细胞的合适的选择性标记物的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子的胸苷激酶基因。将哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，其中转化体只有通过载体中存在的可选择基因才能生存。通过将转化的细胞培养在培养基中选择剂浓度不断增加的条件下来施加选择压力，从而导致选择性基因和编码另一种基因的DNA，诸如结合至OSMR多肽的抗原结合蛋白均扩增。结果，由扩增的DNA合成增加量的多肽诸如OSMR抗原结合蛋白。
核糖体结合位点通常为mRNA翻译起始所需，且表征为Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。该元素通常位于启动子的3'和待表达的多肽的编码序列的5'。在某些实施方案中，一个或多个编码区可以操作地连接至内部核糖体结合位点(IRES)，允许从单RNA转录体翻译两个开放阅读框。
在一些情况中，诸如当在真核宿主细胞的表达系统中需要糖基化时，可对多种原或前序列操作以促进糖基化或提高产量。例如，可改变特定信号肽的肽酶切割位点，或增加前序列，这也可影响糖基化。最终蛋白产物可在-1位置(相对于成熟蛋白的第一个氨基酸)具有一个或多个易于表达的另外氨基酸，这些氨基酸可能未被完全去除。例如，最终蛋白产物可具有在肽酶切割位点发现的一个或两个与氨基末端连接的氨基酸残基。或者，如果酶在成熟多肽的此类区域剪切，则使用一些酶裂解位点可导致所需多肽的稍微截短的形式。
本发明的表达和克隆载体通常含有可由宿主生物体识别且可操作地连接至编码OSMR抗原结合蛋白的分子的启动子。启动子是位于结构基因(一般约100至1000bp内)的起始密码子上游(即5'端)的非转录序列，该序列控制结构基因的转录。传统上将启动子分为两类：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子响应于培养条件的一些改变(诸如营养物的存在或不存在或温度改变)在其控制下开始DNA转录水平增加。另一方面，组成型启动子均匀地转录可操作地连接的基因，也就是说，对基因表达几乎没有或没有控制。熟知由多种潜在的宿主细胞识别的多种启动子。通过限制酶消化从源DNA除去启动子且将所需启动子序列插入载体，将合适的启动子可操作地连接至编码含有本发明的OSMR抗原结合蛋白的重链或轻链的DNA。
用于酵母宿主的合适的启动子在本领域也是熟知的。酵母增强子宜与酵母启动子一起使用。用于哺乳动物宿主细胞的合适的启动子是熟知的且包括但不限于，从病毒诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选地猿病毒40(SV40)的基因组得到的那些。其它合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。
受关注的其它启动子包括但不限于：SV40早期启动子(Benoist等，1981，Nature290：304-310)；CMV启动子(Thornsen等，1984，Proc.Natl.Acad.U.S.A.81：659-663)；包含在劳氏肉瘤病毒的3'长末端重复的启动子(Yamamoto等，1980，Cell 22：787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-1445)；金属硫蛋白基因的启动子和调节序列(Prinster等，1982，Nature 296：39-42)；以及原核启动子诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)。还关注的是以下的动物转录控制区，其展示出组织特异性且已经被用于转基因动物：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，1984，Cell38：639-646；Ornitz等，1986，ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature 315：115-122)；在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，1984，Cell 38：647-658；Adames等，1985，Nature 318：533-538；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)；在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等，1986，Cell45：485-495)；在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，Genes andDevel.1：268-276)；在肝脏中有活性的α-feto-蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等，1987，Science 253：53-58)；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，1987，Genes and Devel.1：161-171)；在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区(Mogram等，1985，Nature 315：338-340；Kollias等，1986，Cell 46：89-94)；在脑中的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等，1987，Cell 48：703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani，1985，Nature314：283-286)；以及在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等，1986，Science 234：1372-1378)。
可将增强子序列插入载体中以通过高等真核生物增加编码包含本发明的OSMR抗原结合蛋白的轻链或重链的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，其长度通常为约10-300bp，它可作用于启动子以增强转录。增强子相对不太依赖方向和位置，在转录单位的位置5'和3'均有发现。已知可从哺乳动物基因获得的多种增强子序列(例如珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-feto-蛋白和胰岛素)。然而，通常使用来自病毒的增强子。本领域已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤增强子和腺病毒增强子用于激活真核细胞启动子的示例性增强元件。虽然增强子可在编码序列的5′或3′的载体中，但是其通常位于启动子的位点5′。可将编码适当的天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列并入表达载体中，以促进抗体的胞外分泌。信号肽或前导的选择取决于其中产生抗体的宿主细胞的类型，且异源信号序列可取代天然信号序列。在哺乳动物宿主细胞中发挥功能的信号肽的实例包括以下：美国专利No.4,965,195中所描述的用于白细胞介素-7(IL-7)的信号序列；Cosman等，1984，Nature 312：768中所描述的用于白细胞介素-2受体的信号序列；欧洲专利No.0367 566中所描述的白细胞介素-4受体信号肽；美国专利No.4,968,607中所描述的I型白细胞介素-1受体信号肽；欧洲专利0 460 846中所描述的II型白细胞介素-1受体信号肽。
当将载体整合到宿主细胞基因组中时，载体可含有一种或多种有利于表达的元素。实例包括EASE元素(Aldrich等，2003，Biotechnol Prog.19：1433-38)和基质附着区(MAR)。MAR调节染色质的结构组织且可将整合载体与“位置”效应隔离。因此，当载体用于创建稳定转染子时，MAR特别有用。大量的含有天然和合成MAR的核酸在本领域是已知的，例如美国专利No.6,239,328；7,326,567；6,177,612；6,388,066；6,245,974；7,259,010；6,037,525；7,422,874；7,129,062。
本发明的表达载体可由诸如市售载体的起始载体建构。此类载体可或可不含有所需的所有侧翼序列。当本文描述的一个或多个侧翼序列未存在于载体中时，它们可单独获得且连接到载体中。获得每种侧翼序列的方法对于本领域的技术人员是熟知的。
载体构建且将编码轻链、重链或轻链和包含OSMR抗原结合序列的重链的核酸分子插入载体的适当位点后，可将完整载体插入合适的宿主细胞中用于扩增和/或多肽表达。可通过熟知的方法将OSMR抗原结合蛋白的表达载体转化到所选的宿主细胞中，所述方法包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、微注射、脂转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或其它已知技术。所选择的方法部分地与所用宿主细胞的类型有关。这些方法和其它合适的方法为技术人员熟知且例如在Sambrook等，2001，同上所述。
宿主细胞当在适当的条件下培养时，合成OSMR抗原结合蛋白，其随后从培养基(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)收集或者直接从产生其的宿主细胞(如果不分泌)收集。适当的宿主细胞的选择取决于各种因素，诸如所需表达水平、活性所需或所必要的多肽修饰(诸如糖基化或磷酸化)和折叠成生物活性分子的难易程度。宿主细胞可为真核细胞或原核细胞。
作为表达宿主的哺乳动物细胞系在本技术中是熟知的且包括但不限于，从美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到的无限增殖细胞系且用于本领域已知的表达系统中的任意细胞系可用于产生本发明的重组多肽。一般来讲，利用包含编码所需抗OSMR抗体多肽的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。可采用的宿主细胞是原核细胞、酵母或高等真核细胞。原核细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌(E.coli)或杆菌。高等真核细胞包括昆虫细胞和确立的哺乳动物源细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC CRL 1651)(Gluzman等，1981，Cell 23：175)、L细胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCC CCL 163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或它们的衍生物诸如蔬菜CHO和在无血清培养基中生长的相关细胞系(Rasmussen等，1998，Cytotechnology 28：31)、HeLa细胞、BHK(ATCC CRL 10)细胞系和衍生自非洲绿猴肾细胞系CVI的CVI/EBNA细胞系(ATCC CCL70)，如McMahan等，1991，EMBO J.10：2821中所描述、人胚肾细胞诸如293、293EBNA或MSR293、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其它转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、衍生自灵长类组织的体外培养物的细胞菌株、原始外植体、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。任选地，当期望将多肽用于多种信号转导或受体测定时，诸如HepG2/3B、KB、NIH 3T3或S49的哺乳动物细胞系例如可用于表达多肽。或者，可在低级真核细胞诸如酵母或原核细胞诸如细菌中产生多肽。合适的酵母包括酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、克鲁维氏酵母属、假丝酵母属或能够表达异源多肽的任意酵母菌株。合适的细菌菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌或能够表达异源多肽的任意细菌菌株。如果多肽在酵母或细菌中产生，需要修饰其中产生的多肽，例如通过适当位点的磷酸化或糖基化，以获得功能性多肽。可使用已知的化学或酶方法实现此类共价连接。还可通过可操作地将本发明的核酸或分离的核酸与一种或多种昆虫表达载体中的合适控制序列连接，且采用昆虫表达系统来产生多肽。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法以试剂盒形式可购自，例如Invitrogen，San Diego，CA，U.S.A.(试剂盒)且所述方法在本领域是已知的，如Summers和Smith，TexasAgricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)以及Luckow和Summers，Bio/Technology 6：47(1988)中所描述。无细胞翻译系统也可用于利用衍生自本文公开的核酸构建体的RNA产生多肽。用于细菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞宿主的适当克隆和表达载体在Pouwels等(Cloning Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier，New York，1985)中有所描述。包含本发明的核酸或分离的核酸的宿主细胞(优选地可操作地连接至至少一个表达控制序列)是“重组宿主细胞”。
在某些实施方案中，可通过确定哪种细胞系具有高表达水平且组成性地产生具有OSMR结合特性的抗原结合蛋白来选择细胞系。在另一个实施方案中，可从不产生自身抗体但能够产生并分泌异源抗体的B细胞谱系选择细胞系。
细胞消耗性OSMR抗原结合蛋白
在优选的实施方案中，OSMR抗原结合蛋白结合OSMR且抑制OSM和/或IL-31的结合，从而在OSMR表达细胞中减少OSM和/或IL-31介导的信号传导。然而，在某些实施方案中，OSMR抗原结合蛋白结合OSMR和靶向用于消耗的OSMR表达细胞。在各个方面，OSMR抗原结合蛋白抑制OSM和/或IL-31的结合和靶向用于消耗的OSMR细胞。
细胞消耗性OSMR抗原结合蛋白特别地用于治疗与OSMR的过表达相关的疾病和病症(例如自身免疫性病症、炎性病症或与胞外基质沉积或重塑相关的病症)或OSMR表达肿瘤。利用抗原结合蛋白(例如抗体)靶向细胞的方法在本领域是已知的。示例性实施方案在下文讨论。
抗体药物缀合物
本发明的实施方案包括抗体药物缀合物(ADC)。一般来讲，ADC包含缀合至化疗剂(例如细胞毒性剂、细胞抑制剂、毒素或放射性试剂)的抗体。连接子分子可用于将药物缀合至抗体。用于ADC技术的多种连接子和药物在本领域是已知的且可用于本发明的实施方案。(参见US20090028856；US2009/0274713；US2007/0031402；WO2005/084390；WO2009/099728；US5208020；US5416064；US5475092；5585499；6436931；6372738；以及6340701，其全部通过引用并入本文)。
连接子
在某些实施方案中，ADC包含由一个或多个连接子组分组成的连接子。示例性连接子组分包括6-马来酰亚氨基己酰基、马来酰亚氨基丙酰基、缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-苯丙氨酸、对氨基苄氧羰基，和与连接子试剂的缀合得到的那些，包括但不限于N-琥珀酰亚氨基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(“SMCC”，本文也称作“MCC”)，和N-琥珀酰亚氨基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SIAB”)。
连接子可为“裂解”连接子或“非裂解”连接子(Ducry和Stump，BioconjugateChem.2010，21，5-13；其通过引用整体并入本文)。当经受某些环境因素例如当内化到靶细胞中时，裂解连接子被设计成释放药物。裂解连接子包括酸不稳定连接子、蛋白酶敏感性连接子、光不稳定性连接子、二甲基连接子或含二硫化物连接子。在靶细胞内化并在其中降解时，非裂解连接子倾向于保持与抗体的至少一个氨基酸和药物共价结合。一个示例性非裂解连接子是MCC。
药物
在某些实施方案中，抗体缀合至化疗剂。化疗剂的实例包括烷化剂，诸如硫替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；氮杂环丙烷类和甲基蜜胺类包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；聚乙酸(尤其布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康)；苔藓抑素；海绵多烯酮类化合物(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和折来新合成类似物)；隐藻素(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司它汀；多卡霉素(包括合成的类似物、KW-2189和CBI-TMI)；艾榴素；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、甲二氯二乙胺、氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如亚硝基脲氮芥、氯脲霉素、福莫司汀、环己亚硝脲、嘧啶亚硝脲、雷莫司汀；抗生素，诸如抗肿瘤抗生素(例如加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1加利车霉素δI，参见，例如Angew Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994)；达内霉素，包括达内霉素A；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、去甲柔红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素；色霉素(chromomycins)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉基-阿霉素和去氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、nitomycins、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链佐霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、红比腙；抗代谢物，诸如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、氨甲喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫脒嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他宾、氟尿苷、5-FU；雄激素，诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸盐、环硫雄醇、孕甾酮、睾内脂；抗肾上腺，诸如氨鲁米特、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充物，诸如如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺催产素；氨基乙酰丙酸；安丫啶；贝塔布辛(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；脱羧秋水仙碱；亚丝醌；依氟鸟氨酸(elfomithine)；依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；埃杜香菇；氯尼达明；美登素类，诸如美登素和安丝菌素；丙脒腙；米托蒽酯；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；苯来美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；足叶草酸(podophyllinic acid)；2-乙基肼；丙卡巴肼；丙亚胺(razoxane)；根霉素；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺；菌酮酸；三亚胺醌；2，2'，2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；氮基甲酸乙酯(urethan)；长春地辛；氮烯米胺；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫衫烷类，例如紫杉酚(TAXOLTM，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他赛(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春瑞滨；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽酯；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；米托蒽醌；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；卡培他滨(xeloda)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；希罗达；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这个定义也包括调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；以及抗雄激素，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林；siRNA以及上述任一种的药学可接受的盐、酸或衍生物。可用于本发明的其它化疗剂在美国公开号20080171040或美国公开号20080305044中公开，其每一个都通过引用整体并入本文。
预期抗体可缀合至两种或多种不同的化疗剂或药物组合物可包含其中抗体组分除了缀合至不同化疗剂以外是相同的抗体混合物。此类实施方案可用于利用靶细胞靶向多个生物路径。
在优选的实施方案中，ADC包含缀合至一个或多个美登木素生物碱分子的抗体，美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合起作用的有丝分裂抑制剂。包括多种修饰的美登木素生物碱在美国专利No.3896111；4151042；4137230；4248870；4256746；4260608；4265814；4294757；4307016；4308268；4309428；4313946；4315929；4317821；4322348；4331598；4361650；4364866；4424219；4450254；4362663；4371533；以及WO 2009/099728中有所描述。美登木素生物碱药物部分可从天然来源分离，使用重组技术产生，或合成制备。示例性美登木素生物碱包括C-19-脱氯(美国专利No.4256746)、C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No.4307016和4361650)、C-20-脱甲氧基(或C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-脱氯(美国专利No.4294757)、C-9-SH(美国专利No.4,424,219)、C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(美国专利No.4,331,598)、C-14-羟甲基或酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利No.4,450,254)、C-15-羟基/酰氧基(美国专利No.4,364,866)、C-15-甲氧基(美国专利No.4,313,946和4,315,929)、C-18-N-脱甲基(美国专利No.4,362,663和4,322,348)，以及4，5-脱氧(美国专利No.4,371,533)。
取决于所需的连接类型，美登木素生物碱化合物上的多个位置可用作键联位置。例如，为了形成酯键，具有羟基的位置C-3、利用羟甲基修饰的位置C-14、利用羟基修饰的位置C-15，和具有羟基的位置C-20都是合适的(美国专利No.5208020、RE39151和6913748；美国专利申请公开号20060167245和20070037972、和WO 2009099728)。
优选的美登木素生物碱包括本领域已知的那些，如DM1、DM3，和DM4(美国专利申请公开号2009030924和20050276812，其通过引用并入本文)。
含有美登木素生物碱的ADC，产生此类ADC的方法和它们的治疗性用途在美国专利No.5208020和5416064、美国专利申请公开号20050276812和WO 2009099728(其通过引用全部并入本文)中公开。用于产生美登木素生物碱ADC的连接子在本领域是已知的(美国专利No.5208020和美国专利申请公开No.2005016993和20090274713；其全部通过引用并入本文)。包含SMCC连接子的美登木素生物碱ADC可如美国专利公开号2005/0276812所公开而制备。
效应子功能增强抗体
抗体的Fc部分的功能之一是当抗体结合其靶标时与免疫系统连通。这被认为是“效应子功能”。连通导致抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。ADCC和ADCP通过Fc结合至免疫系统的细胞表面上的Fc受体介导。CDC通过Fc与补体系统的蛋白例如C1q结合介导。
IgG子类的介导效应子功能的能力不同。例如，介导ADCC和CDC时，IgG1比IgG2和IgG4更优异。因此，在其中细胞表达OSMR被靶向破坏的实施方案中，优选抗OSMR IgG1抗体。
可通过将一个或多个突变导入Fc中增强或减弱抗体的效应子功能。本发明的实施方案包括具有工程化以增强效应子功能的Fc的抗原结合蛋白(例如抗体)(美国7，317，091和Strohl，Curr.Opin.Biotech.，20：685-691，2009；两者均通过引用整体并入本文)。具有增强的效应子功能的示例性IgG1 Fc分子包括(基于Kabat编号方案)具有以下取代的那些：
S239D/I332E
S239D/A330S/I332E
S239D/A330L/I332E
S298A/D333A/K334A
P247I/A339D
P247I/A339Q
D280H/K290S
D280H/K290S/S298D
D280H/K290S/S298V
F243L/R292P/Y300L
F243L/R292P/Y300L/P396L
F243LR292P/Y300L/V305I/P396L
G236A/S239D/I332E
K326A/E333A
K326W/E333S
K290E/S298G/T299A
K290N/S298G/T299A
K290E/S298G/T299A/K326E
K290N/S298G/T299A/K326E
本发明的其它实施方案包括具有工程化以减弱效应子功能的Fc的抗原结合蛋白(例如抗体)。具有减弱的效应子功能的示例性Fc分子包括(基于Kabat编号方案)具有以下取代的那些：
N297A(IgG1)
L234A/L235A(IgG1)
V234A/G237A(IgG2)
L235A/G237A/E318A(IgG4)
H268Q/V309L/A330S/A331S(IgG2)
C220S/C226S/C229S/P238S(IgG1)
C226S/C229S/E233P/L234V/L235A(IgGI)
L234F/L235E/P331S(IgG1)
S267E/L328F(IgG1)
增强含有IgG Fc的蛋白的效应子功能的另一方法是通过降低Fc的岩藻糖基化进行。从连接到Fc的双触角复合型寡多糖中除去核岩藻糖大大增强了ADCC效应子功能，而未改变抗原的结合或CDC效应子功能。已知用于降低或消除含有Fc的分子(例如抗体)的岩藻糖基化的多种方式。这些包括在某些哺乳动物细胞系中重组表达，哺乳动物细胞系包括FUT8敲除细胞系、变体CHO系Lec13、大鼠杂交瘤细胞系YB2/0、包含特异性针对FUT8基因的小干扰性RNA的细胞系，和共表达β-1，4-N-乙酰葡糖胺基转移酶III和高尔基α-甘露糖苷酶II的细胞系。或者，含有Fc的分子可在诸如植物细胞、酵母或原核生物细胞(例如大肠杆菌)的非哺乳动物细胞中表达。因此，在本发明的某些实施方案中，组合物包含具有降低的岩藻糖基化或缺乏岩藻糖基化的抗体，例如Ab1、Ab2或Ab3。
药物组合物
在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含治疗有效量的一种或多种本发明的抗原结合蛋白以及药学上有效的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。在某些实施方案中，抗原结合蛋白是抗体。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
优选地，配制材料在采用的剂量和浓度下对接受者没有毒性。在特定实施方案中，提供包含治疗有效量的OSMR抗原结合蛋白(例如OSMR结合抗体)的药物组合物。
在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改变、保持或保护例如，组合物的pH、摩尔渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的配制材料。在此类实施方案中，合适的配制材料包括但不限于氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、脯氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；填充剂(诸如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；以及其它碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(诸如钠)；防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(诸如普朗尼克、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(诸如聚山梨醇酯20)、聚山梨醇酯、曲拉通、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapol))；稳定增强剂(诸如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(诸如碱金属卤化物，优选氯化钠或钾、甘露糖醇、山梨糖醇)；传递媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物辅剂。参见REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版本(A.R.Genrmo编)，1990，Mack Publishing Company。
在某些实施方案中，最佳药物组合物将由本领域的技术人员根据例如预期施用途径、递送方式和所需剂量确定。参见，例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上。在某些实施方案中，此类组合物可影响本发明的抗原结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施方案中，药用组合物中的主要媒介或载剂的性质可为水性或非水性。例如，合适的媒介物或载剂可为注射用水、生理盐水或人造脑脊液，可补加胃肠外施用组合物中常用的其它物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其它示例性媒介物。在特定实施方案中，药物组合物包含pH约7.0-8.5的Tris缓冲液、pH约4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，且可进一步包括山梨糖醇或其合适的取代物。在本发明的某些实施方案中，通过将所选的具有所需纯度的组合物与任选的配制剂(REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES，同上)以冻干饼或水性溶液的形式混合可制备用于保存的OSMR抗原结合蛋白组合物。此外，在某些实施方案中，可利用适当的赋形剂诸如蔗糖将OSMR抗原结合蛋白产品配制成冻干物。
可选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送。或者，可选择组合物用于吸入或通过消化道递送诸如口服。此类药学上可接受组合物的制备属于本领域技术范围内。配制组分存在的浓度优选为施用位点可接受的浓度。在某些实施方案中，缓冲液用以保持组合物在生理pH或稍低的pH下，典型地约5至约8的pH范围内。
当预期肠胃外施用时，用于本发明的治疗性组合物可以在药学上可接受的媒介物中的无热源的肠胃外可接受的包含所需OSMR抗原结合蛋白的水溶液的形式提供。用于肠胃外注射的尤其合适的媒介物是无菌蒸馏水，其中OSMR抗原结合蛋白被配制成无菌、等渗溶液，适当保存。在某些实施方案中，制备可涉及利用试剂配制所需分子，诸如可注射微球体、可生物溶蚀的微粒、聚合化合物(诸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠子或脂质体，该试剂可控制或持续释放产品，该产品经由库注射递送。在某些实施方案中，也可使用透明质酸，其具有在循环中促进持续时间的效果。在某些实施方案中，可植入的药物递送设备可用于导入所需抗原结合蛋白。
可将本发明的药物组合物配制用于吸入。在这些实施方案中，OSMR抗原结合蛋白利于配制成可吸入干粉。在特定的实施方案中，OSMR抗原结合蛋白吸入溶液也可与推进剂一起配制以用于气溶胶递送。在某些实施方案中，可雾化溶液。因此，在国际专利申请No.PCT/US94/001875中进一步描述了肺部施用和配制方法，其通过引用并入且其描述了化学修饰蛋白的肺部递送。
还预期制剂可口服施用。以此类方式施用的OSMR抗原结合蛋白可与一般用于组合固体剂型例如片剂和胶囊的载剂一起或不一起配制。在某些实施方案中，胶囊可被设计成当生物利用度最大化且系统前降解最小化时，在胃肠道的某一点释放制剂的活性部分。可包括另外的试剂以便于OSMR抗原结合蛋白的吸收。还可采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、药片崩解剂和粘合剂。
另外的药物组合物将对于本领域内的技术人员是显而易见的，包括涉及以持续或控制递送制剂的OSMR抗原结合蛋白的制剂。用于配制多种其它持续或控制递送方式(诸如脂质体载剂、可生物蚀解微粒或多孔珠和长效注射剂)的技术也是本领域技术人员已知的。参见例如国际专利申请No.PCT/US93/00829，其通过引用并入且描述用于递送药物组合物的多孔聚合微粒的控制释放。持续释放制剂可包括以成型制品(例如薄膜)或微胶囊形式的半渗透聚合物基质。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚交酯(如美国专利No.3,773,919和欧洲专利申请公开号EP 058481中所公开，其每个通过引用并入)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚体(Sidman等，1983，Biopolymers2：547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277和Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)、乙烯醋酸乙烯酯(Langer等，1981，以上所述)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开No.EP 133,988)。持续释放的组合物也可包括可通过本领域已知的多种方法中任一种制备的脂质体。参见，例如Eppstein等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.美国82：3688-3692；欧洲专利申请公开No.EP 036,676；EP 088,046和EP 143,949，其通过引用并入。
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂提供。可通过无菌滤膜过滤实现无菌。当组合物冻干时，可在冻干和复水前或后利用这个方法除菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中保存。一般将肠胃外组合物置于具有无菌入口的容器中，例如静脉内溶液包或具有塞子的小瓶，该塞子通过皮下注射针穿透。
本发明的多个方面包括自身缓冲的OSMR抗原结合蛋白制剂，其可用作药物组合物，如国际专利申请WO 06138181A2(PCT/US2006/022599)中所描述，其通过引用整体并入本文。
如上文讨论，某些实施方案提供OSMR抗原结合蛋白组合物，特别是包含除了OSMR抗原结合蛋白以外的一种或多种赋形剂(诸如在这个章节和本文的其它地方描述的那些)的药物OSMR抗原结合蛋白组合物。赋形剂可在此方面因多种目的用于本发明(诸如调节制剂的物理、化学或生物特性，诸如粘度的调节)，和或本发明的工艺以改善有效性和或稳定此类制剂和工艺，防止因例如制造、运输、保存、使用前制备、施用，以及之后所产生的应力而导致的降解和损坏。
蛋白稳定以及用于此方面的配制材料和方法可利用多种赋形剂，诸如Arakawa等，“Solvent interactions in pharmaceutical formulations，”Pharm Res.8(3)：285-91(1991)；Kendrick等，“Physical stabilization of proteins in aqueous solution，”RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS：THEORY AND PRACTICE，Carpenter和Manning编Pharmaceutical Biotechnology.13：61-84(2002)，和Randolph等，“Surfactant-protein interactions，”Pharm Biotechnol.13：159-75(2002)，其每个通过引用整体并入本文，特别是与赋形剂和其用于依据本发明的自身缓冲蛋白制剂的工艺相关的部分，尤其是对于蛋白药物产品和用于兽医和/或人医疗用途的工艺。
盐可根据本发明的某些实施方案使用以例如调节制剂的离子强度和/或等渗性和/或改善根据本发明的组合物的蛋白或其它成分的溶解性和/或物理稳定性。
如熟知，离子可通过结合至蛋白表面的带电残基和通过屏蔽蛋白的带电和极性基团并降低它们静电相互作用、吸引和排斥相互作用的强度而稳定蛋白的天然状态。离子也可通过结合至特别是蛋白的变性肽键(--CONH)而稳定蛋白的变性状态。另外，与蛋白中带电和极性基团的离子相互作用也可降低分子间的静电相互作用且因此防止或降低蛋白聚积和不溶。
离子物种对蛋白的作用明显不同。大量的离子分类排列和它们对蛋白的作用已被开发，可根据本发明用于配制药物组合物。一个实例是霍夫梅斯特系列(Hofmeisterseries)，其通过它们在溶液中对蛋白构象稳定性的影响排列离子和极性非离子溶质。稳定性溶质被称为“补偿溶质(kosmotropic)”。去稳定化溶质被称为“离液剂”。补偿溶质常以浓度(例如>1摩尔硫化铵)使用以从溶液中沉淀出蛋白(“盐析”)。离液剂常用于变性和/或溶解蛋白(“盐溶”)。离子“盐溶”和“盐析”的相对作用限定它们在霍夫梅斯特系列中的位置。
游离氨基酸可在根据本发明的各个实施案例的OSMR抗原结合蛋白制剂中用作填充剂、稳定剂和抗氧化剂，以及其它标准用途。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于稳定制剂中的蛋白。甘氨酸在冻干中用以确保正确的饼结构和特性。精氨酸可用于在液体和冻干制剂中阻止蛋白聚积。将甲硫氨酸用作抗氧化剂。
多元醇包括糖(例如甘露醇、蔗糖，和山梨糖醇)和多羟基醇(诸如比如甘油和丙二醇和用于本文讨论的目的的聚乙二醇(PEG)和相关物质。多元醇是补偿溶质。它们在液体和冻干制剂中是有用的稳定剂以防止蛋白发生物理和化学降解过程。多元醇也用于调节制剂的张力。
用于本发明的选择实施方案中的多元醇是甘露醇，其常用于在冻干制剂中确保饼的结构稳定性。其确保饼的结构稳定性。其一般与冻干保护剂(例如蔗糖)一起使用。山梨糖醇和蔗糖是用于调节张力和作为稳定剂以在运输或生产过程的成批制备期间防止冻融应力的优选试剂。还原糖(其含有游离醛或酮基)(诸如葡萄糖和乳糖)可使表面赖氨酸和精氨酸残基糖化。所以，其一般不是根据本发明使用的优选的多元醇。另外，形成此类活性物种的糖(诸如蔗糖，其在酸性条件下水解为果糖和葡萄糖，且最终引起致糖化)在此方面也不是本发明的优选的多元醇。PEG用于稳定蛋白且作为低温防护剂并可在此方面用于本发明。
OSMR抗原结合蛋白制剂的实施方案进一步包含表面活性剂。蛋白分子易吸附表面和变性，最终在汽-液、固-液和液-液界面聚积。这些效应一般与蛋白浓度成反比。这些有害的相互作用一般与蛋白浓度成反比且通常因物理搅拌(诸如在产品运输和操作时产生的搅拌)加剧。
表面活性剂常用以防止、最小化或降低表面吸附。在本发明的这个方面有用的表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80、脱水山梨糖醇聚乙氧基化物的其它脂肪酸酯，和泊洛沙姆188。
表面活性剂常用以控制蛋白的构象稳定性。因为在这个方面使用的表面活性剂具有蛋白特异性，所以任意给定的表面活性剂通常将稳定一些蛋白且使其它去稳定化。
聚山梨酸酯易氧化降解且供应时经常含有足量的过氧化物以引起蛋白残基侧链(尤其是甲硫氨酸)的氧化。因此，应小心使用聚山梨酸酯，且当使用时，应采用它们最低有效浓度。在这个方面，以聚山梨酸酯举例来说，一般规则是赋形剂应以它们最低有效浓度使用。
OSMR抗原结合蛋白制剂的实施方案进一步包含一种或多种抗氧化剂。在一定程度上，可通过保持合适水平的环境氧和温度和通过避免暴露在光下而防止药物制剂中蛋白的有害氧化。抗氧化剂赋形剂也可用于防止蛋白氧化降解。在这个方面有用的抗氧化剂是还原剂、氧/自由基清除剂，和螯合剂。根据本发明，用于治疗性蛋白制剂的抗氧化剂优选地是水溶性和在产品的整个有效期内维持它们的活性。根据本发明，在这个方面，EDTA是优选的抗氧化剂。
抗氧化剂可破坏蛋白。比如，还原剂(诸如，具体来说谷胱甘肽)可扰乱分子内二硫键。因此，选择用于本发明的抗氧化剂尤其为了消除或充分降低它们破坏制剂中蛋白的可能性。
根据本发明的制剂可包括金属离子，其为蛋白辅因子和为形成蛋白配位复合物所必要，诸如形成某种胰岛素悬浮液所必要的锌。金属离子也可抑制降解蛋白的一些过程。然而，金属离子也催化降解蛋白的物理和化学过程。
镁离子(10-120mM)可用于抑制天冬氨酸异构化为异天冬氨酸。Ca+2离子(达100mM)可增强人脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而，Mg+2、Mn+2和Zn+2可对rhDNase去稳定化。相似地，Ca+2和Sr+2可稳定因子VIII，它可通过Mg+2、Mn+2和Zn+2、Cu+2和Fe+2去稳定化，且其聚积可通过Al+3离子增加。
OSMR抗原结合蛋白制剂的实施方案进一步包括一种或多种防腐剂。当开发涉及多于一种来自相同容器的提取物的多剂量肠胃外制剂时，防腐剂是必要的。它们的主要功能是抑制微生物生长且确保在药品的整个有效期或使用期产品无菌。常使用的防腐剂包括苯甲醇、苯酚和间甲酚。尽管防腐剂具有使用小分子肠胃外给药的悠久历史，但是可挑战包括防腐剂的蛋白制剂的开发。防腐剂几乎经常对蛋白有去稳定性效应(聚积)，且这在限制它们用于多剂量蛋白制剂中已变成主要的因素。迄今为止，大多数蛋白药物仅为单次使用配制。然而，当多剂量制剂可能时，它们增加了使患者方便，且增加适销性的优点。很好的实例是人生长激素(hGH)，其中防腐制剂的开发导致更方便、多用途注射笔商业化。至少四种含有hGH防腐制剂的笔设备可购得。Norditropin(液体，Novo Nordisk)，Nutropin AQ(液体，Genentech)&Genotropin(冻干-双室筒，Pharmacia&Upjohn)含有酚而Somatrope(EliLilly)利用间甲酚配制。
防腐剂型的配制和开发期间需要去考虑多个方面。必须优化产品中有效的防腐剂浓度。这需要在具有给予抗微生物有效性而不损及蛋白稳定性的浓度范围的剂型中测试给定的防腐剂。
如期望，含有防腐剂的液体制剂的开发比冻干制剂更具挑战性。在防腐剂不存在下可将冷冻-干燥产品冻干且在使用时利用含有防腐剂的稀释液复水。这缩短了防腐剂接触蛋白的时间，明显最大程度降低相关的稳定性风险。对于液体制剂，防腐剂有效性和稳定性应维持整个产品有效期(约18至24月)。应注意的重要一点是防腐剂有效性应在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终制剂中证实。
OSMR抗原结合蛋白制剂一般将被设计用于特定的施用途径和方法、特定的施用剂量和施用频率、特定疾病的特定治疗，尤其具有大范围的生物利用度和持久性。因此制剂可根据本发明设计以通过任意合适途径递送(包括但不限于经口、经耳、经眼、经直肠和经阴道)和通过肠胃外途径递送(包括静脉内和动脉内注射、肌内注射和皮下注射)。
一旦配制了药物组合物，可在无菌瓶中以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或作为脱水或冻干粉末贮存。此类制剂可以即用形式或以施用前复水的形式(例如冻干)贮存。本发明还提供了用于产生单剂量施用单位的试剂盒。本发明的试剂盒可都含有具有干燥蛋白的第一容器和具有水性制剂的第二容器。在本发明的某些实施方案中，提供了含有单腔和多腔的预装注射器(例如液体注射器或药粉注射器(lyosyringe))的试剂盒。
含有OSMR抗原结合蛋白的药物组合物的有效量取决于例如治疗环境和目的。本领域的技术人员将明白用于治疗的适当剂量水平将部分地取决于递送分子、用于OSMR抗原结合蛋白的指示、施用途径、和患者大小(体重、体表面积或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康情况)。在某些实施方案中，临床医生可确定剂量且修改施用途径以获得最佳治疗效果。取决于上述因素，典型的剂量可为约0.1μg/kg至多达约30mg/kg或更多。在特定实施方案中，剂量可为1.0μg/kg至多达约20mg/kg，任选地10μg/kg至多达约10mg/kg或100μg/kg至多达约5mg/kg。
OSMR抗原结合蛋白的治疗有效量优选地导致疾病症状的严重程度的降低、无疾病症状期的频率或持续时间的增加，或因罹患疾病引起的损伤或缺陷的预防。
可使用医疗设备施用药物组合物。用于施用药物组合物的医疗设备的实例在美国专利No.4,475,196；4,439,196；4,447,224；4,447,233；4,486,194；4,487,603；4,596,556；4,790,824；4,941,880；5,064,413；5,312,335；5,312,335；5,383,851；以及5,399,163中有所描述，其全部通过引用并入本文。
诊断或治疗OSMR相关疾病或病症的方法
本发明的OSMR抗原结合蛋白特别地用于检测生物样品中的OSMR。在某些实施方案中，使从患者中获得的生物样品与OSMR抗原结合蛋白接触。然后，检测OSMR抗原结合蛋白与OSMR的结合以确定OSMR在样品中的存在或相对量。此类方法可用于诊断或确定适于利用OSMR抗原结合蛋白治疗的患者。
在某些实施方案中，本发明的OSMR抗原结合蛋白用于诊断、检测或治疗自身免疫性病症、炎性病症或与胞外基质沉积或重塑相关的病症。
在这些病症的治疗中，OSMR抗原结合蛋白可靶向免疫系统的OSMR表达细胞用于破坏和/或可阻断OSMR与OSM和/或IL-31的相互作用。
与OSMR介导的信号传导相关的疾病或病症特别适于利用一种或多种本文公开的OSMR抗原结合蛋白治疗。这些病症包括但不限于炎症、疼痛、瘙痒症、结节性痒疹、皮炎、哮喘、自体免疫性疾病、肿瘤伴随自身免疫性疾病、软骨炎症、纤维变性(包括但不限于肺纤维化和皮肤纤维化)、纤维变性疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、间质性肺炎、非正常的胶原沉积、全身性皮肤淀粉样变、原发性皮肤淀粉样变性、贝切特氏病(Behcet’s disease)、鼻息肉病、肝硬化、软骨退化、骨降解、关节炎、风湿性关节炎、青年关节炎、青年类风湿关节炎、少关节的青年类风湿关节炎、多数关节青年类风湿关节炎、系统性发病的青年类风湿关节炎、青年强直性脊柱炎、青年肠病性关节炎、青年反应性关节炎、青年莱特尔氏综合征(Reter's Syndrome)、SEA综合征(血清阴性、末端病、关节病综合征)、青年皮肤肌炎、青年牛皮癣关节炎、青年硬皮病、青年系统性红斑狼疮、青年血管炎、少关节的风湿性关节炎、多数关节风湿性关节炎、系统性发病的风湿性关节炎、强直性脊柱炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、特尔氏综合征、SEA综合征(血清阴性、末端病、关节病综合征)、皮肤肌炎、牛皮癣关节炎、硬皮病、硬皮病相关的间质性肺病、血管炎、脊髓炎、多发性肌炎、皮肌炎、结节性多动脉炎、韦格内氏肉牙肿病(Wegener'sgranulomatosis)、动脉炎、风湿性多肌同、结节病、硬皮病、硬化、原发性胆汁性硬化、硬化胆管炎、斯耶格伦氏综合征(Sjogren'ssyndrome)、牛皮癣、斑块牛皮癣、滴状牛皮癣、褶性银屑病、脓疱性牛皮癣、红皮性牛皮癣、皮炎、特应性皮炎、动脉粥样硬化、狼疮、斯提耳氏病(Still’s disease)、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、发炎性肠道疾病(IBD)、克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎、脂泻病、多发性硬化(MS)、哮喘、COPD、鼻窦炎、鼻息肉伴鼻窦炎、嗜酸性食管炎、嗜酸性支气管炎、支气管炎、格林-巴利综合征(Guillain-Barre disease)、I型糖尿病、甲状腺炎(例如格雷夫斯氏病(Graves’disease))、阿狄森病(Addison's disease)、雷诺现象(Reynaud’sphenomenon)、自身免疫性肝炎、GVHD、移植排斥、肾损害、心血管疾病、感染、败血症、HIV感染、创伤、肾异体移植肾病、IgA肾病、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、胆管闭锁、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化、再狭窄、辐射诱导的纤维变性、化学诱导的纤维变性、烧伤、外科创伤、肾小球硬化症、诸如此类。
在优选的实施方案中，自身免疫性病症、炎性病症或与胞外基质沉积或重塑相关的病症是纤维化、软骨退化、关节炎、风湿性关节炎、硬皮病、硬皮病相关的间质性肺病、特发性肺纤维化、肝硬化、牛皮癣、特应性皮炎、全身性皮肤淀粉样变、原发性皮肤淀粉样变、炎症、瘙痒炎症、结节性痒疹，和疼痛。
在某些实施方案中，本发明的OSMR抗原结合蛋白用于诊断、检测或治疗癌症或致瘤性病症。在治疗癌症或致瘤性病症中，OSMR抗原结合蛋白可靶向OSMR表达细胞用于破坏和/或可阻断OSM和/或IL-31与OSMR的相互作用，从而降低OSMR介导的信号传导。预想阻断OSM和/或IL-31介导的信号传导的OSMR抗原结合蛋白将用于促进改善癌症患者的存活。可利用OSMR抗原结合蛋白诊断、检测或治疗的癌症或致瘤性病症包括但不限于一般的实体肿瘤、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、肾癌、食道癌、胰腺癌、鳞状细胞癌、眼色素黑素瘤、子宫颈癌、结直肠癌、膀胱癌、脑癌、胰腺癌、头癌、颈癌、肝癌、白血病、淋巴瘤和何杰金氏病(Hodgkin’sdisease)、多发性骨髓瘤、黑素瘤、胃癌、星形细胞癌症、胃腺癌和肺腺癌。
抗原结合蛋白可用于抑制肿瘤生长、恶化和/或转移。可利用各种方法监测此类抑制。比如，抑制可使肿瘤尺寸减小和/或肿瘤中代谢活动减弱。例如，这些参数都可通过MRI或PET扫描测量。也可通过活体组织监测抑制以确定坏死水平、肿瘤细胞死亡和肿瘤内血管分布的水平。可使用已知的方法监测转移程度。
本文提供的任一和全部实施例或示例性语言(例如“诸如”)的使用只在于更好地阐述本发明的实施方案且不对本发明的范围构成限制，除非另外声明。说明书中任何语言均不应解释为将任何未要求权利保护的要素作为实施本文所述发明的必要要素。
实施例
提供以下实施例(实际实施例和预示实施例)用于阐述本发明的特定实施方案或特征，并无意限定本发明的范围。
实施例1：使用 平台产生抗OSMR抗体
使用技术(如美国专利No.6,114,598；6,162,963；6,833,268；7,049,426；7,064,244中所描述，其通过引用整体并入本文；以及Green等，NatureGenetics 7：13-21，1994；Mendez等，Nature Genetics 15：146-56；1997；Green等，J.Ex.Med.188：483-95，1998；以及Kellermann等，Current Opinion in Biotechnology，13：593-7，2002中所描述)产生针对人OSMR的完全人抗体。
为了产生OSMR的抗体，利用人OSMR-Fc可溶蛋白(由Amgen，Seattle，WA制备)免疫动物的两种不同菌株，即XMG2-KL和XMG4-KL小鼠。依据1996年12月3日提交的美国专利申请序列No.08/759,620和1998年6月11日公开的国际专利申请No.WO 98/24893和2000年12月21日公开的WO 00/76310(其公开内容通过引用并入本文)中所公开的方法，将适量的免疫原(即10μg/小鼠的可溶性人OSMR-Fc蛋白)用于动物的初始免疫。初始免疫后，随后的免疫原加强免疫(5μg/小鼠的可溶性人OSMR-Fc蛋白)按计划施用且持续在小鼠中诱导抗OSMR抗体合适滴度所必要的时间段。
第一次注射后约四周时收集血清且通过ELISA确定特定滴度。用以滴定动物的方案如下：利用neutravadin@8μg/mL(50μL/孔)涂覆Costar3368培养基结合板且在4℃下在1XPBS/0.05％叠氮化物中孵育过夜。使用用RO水的TiterTek 3-循环洗涤对板进行洗涤。使用250μL 1XPBS/1％牛奶阻断板且在RT下孵育至少30分钟。使用用RO水的TiterTek 3-循环洗涤冲掉阻断物。然后，在2μg/mL下在1XPBS/1％牛奶/10mM Ca2+(测定稀释液)(50μl/孔)中捕获生物素化的huOSMR-FNFH(由Amgen，Seattle，WA制备)且在RT下孵育1小时。然后使用RO水的TiterTek 3-循环洗涤进行洗涤。对于一抗，一式两份从1∶100以1∶3滴定血清。这在测定稀释液(50μL/孔)中进行且在RT下孵育1小时。然后使用用RO水的TiterTek 3-循环洗涤进行洗涤。二抗是在测定稀释液(50μL/孔)的山羊抗人IgG Fc HRP@400ng/mL。这在RT下孵育1小时。这然后使用用RO水的TiterTek 3-循环洗涤进行洗涤且用纸巾轻拍干。对于底物，使用一步TMB溶液(Neogen，Lexington，Kentucky)(50μL/孔)且使底物在RT下显色30分钟。
鉴定展示合适滴度的动物。利用对OSMR的特异性IgG免疫反应鉴定五只XMG2KL动物。从这些动物中收集脾和引流淋巴结且汇集用于杂交瘤产生。相似地收集具有特异性免疫反应的五只XMG4KL动物且作为单独的融合筛选活动进行。使用标准技术(Kohler等，Nature 256，495-7，1975)，将来自免疫动物的富集B细胞融合至非分泌的骨髓瘤P3 x63Ag8.653细胞((美国典型培养物保藏中心CRL-1580；Kearney等，J.Immunol.123：1548-50，1979)以产生杂交瘤。
然后以高密度(每孔多个不同杂交瘤克隆)将杂交瘤涂铺到96-孔组织培养板上且生长4周。通过荧光微量测定技术(FMAT)(Applied Biosystems，Foster City，CA)筛选杂交瘤系上清液结合至在瞬时转染的293T细胞上表达的全长人和食蟹猴OSMR。简而言之，在384-孔FMAT板中，将3,000个OSMR 293T转染细胞和15,000个亲代293T细胞的40μl混合物与15μL杂交瘤上清液和10μL抗人轻链(hukappa/hulambda)Alexa647(Invitrogen，Carlsbad，CA)标记的二抗(1.0μg/mL最终浓度)合并。然后将板在室温下孵育三小时且使用FMAT读取器读取荧光。这些筛选鉴定结合至人和食蟹猴OSMR的885种杂交瘤系。
实施例2：人OSMR阻断测定
使用人制瘤素M(OSM)或人白细胞介素31(IL-31)作为配体的两种测定确定OSMR抗体阻断通过人OSMR信号传导的能力。总之，测定用以确定抗体是否可抑制通过OSM和/或IL-31的结合触发的OSMR的信号传导。
在第一次筛选中，评价抗体阻断OSM通过OSMR信号传导的能力。利用OSM刺激原发正常人肺成纤维细胞诱导STAT3的磷酸化且其随后转位至核。将细胞在Costar 384-孔板中以每孔3000个细胞接种且使其粘附过夜。利用抗体上清液预处理细胞二十分钟，且然后利用80pM人OSM刺激30分钟。然后细胞在PBS中进行3次洗涤，利用3.5％甲醛溶液固定，洗涤(3X，于PBST中)并利用0.5％曲拉通X-100溶液透化。然后利用抗磷酸STAT3抗体染色细胞一小时，洗涤并利用AlexaFluor缀合抗体(全部包含在Cellomics的HitKit中)染色。覆盖板且在ArrayScan仪器上使用Cellomics专有算法读取以产生核强度值和胞浆强度值。结果以这两个值之间的差异报告，且进一步标准化以控制含有最大限度刺激的细胞和培养基处理的细胞(POC)的数据。
在第二次测定中，评估抗体在过表达人IL-31RA4和OSMR的稳定细胞系中抑制IL-31通过OSMR的增殖信号的能力。利用两种质粒pcDNA3.1+huOSMRb(NeoR)和pcDNA3.1+huIL31RA4(ZeoR)稳定地转染BaF3细胞。在鼠Il-3不存在下，这个细胞系仅能在响应人IL-31时增殖且因此可用于特定地评价抗OSMR抗体的阻断能力。将BaF3细胞以每孔20,000个细胞的密度涂铺在96-孔板上。将抗体和配体(huIL-31，Peprotech)加入孔中至100μL的最终体积，且将板在5％CO2、37℃潮湿室中孵育72小时。孵育后，将20μL Alamar Blue加入每个孔中且将板返回至孵育器中。在Alamar Blue加入后的各个时间点，在Molecular DevicesVmax板读取器(570-600nm)上读取板。
两次测定的结果展示在下表4中。在这两次测定中筛选超过3000种杂交瘤上清液的阻断能力；在4-点滴定中进一步测试前200种阻断剂，选择14种用于重组蛋白的产生和进一步测试。显示三种示例性抗体(抗体1-3)的IC50用于测定。一些抗体抑制OSM诱导的STAT3转位比它们抑制IL-31诱导的增殖更完全，且反之亦然。然而，所有三种抗体是OSM-和IL-31介导的信号传导的有效抑制剂。
表4
IC50 Ab1 Ab2 Ab3
OSM 157pM 252pM 1.35nM
IL-31 35.2pM 27.6pM 780pM
实施例3：食蟹猴OSMR阻断测定
利用使用人OSM或人IL-31作为配体的两种测定探明OSMR抗体阻断通过食蟹猴OSMR信号传导的能力。
在第一次筛选中，通过使用原始肾上皮细胞系，评价抗体阻断OSM通过食蟹猴OSMR信号传导的能力。利用食蟹猴(cyno)OSM刺激这些细胞诱导STAT3的磷酸化及其随后转位至核。将细胞在Costar384-孔板中以每孔3000个细胞接种且使其粘附过夜。利用抗体上清液预处理细胞二十分钟，且然后利用80pM cyno OSM刺激30分钟。然后，细胞于PBS中进行3次洗涤，利用3.5％甲醛溶液固定，洗涤(3X，于PBST中)并利用0.5％曲拉通X-100溶液透化。然后利用抗磷酸STAT3抗体染色细胞一小时，洗涤并利用AlexaFluor缀合抗体(全部包含在Cellomics的HitKit中)染色。覆盖板且在ArrayScan仪器上使用Cellomics专有算法读取以产生核强度值和胞浆强度值。结果以这两个值之间的差异报告，且进一步标准化以控制含有最大限度刺激的细胞和培养基处理的细胞(POC)的数据。
在第二次测定中，评估抗体在过表达cyno IL-31RA和OSMR的稳定细胞系中抑制IL-31通过OSMR的增殖信号的能力。与实施例2相似，将BaF3细胞在96-孔板上以每孔20,000个细胞的密度涂铺。将抗体和配体(食蟹猴IL-31，自用，即Amgen，Seattle，WA)加入孔中至100μL的最终体积，且将板在5％CO2、37C潮湿室中孵育72小时。孵育后，将20μL AlamarBlue加入每孔中且将板返回至孵育器中。在Alamar Blue加入后的各个时间点，在Molecular Devices Vmax板读取器(570-600nm)上读取板。
两次测定的结果呈现在下表5中，显示两次测定中每种抗体的IC50。结果证实抗体1、2和3中每一个都是OSM-和IL-31介导的信号传导的有效抑制剂。
表5
IC50 Ab1 Ab2 Ab3
OSM 1.26nM 518pM 1.24nM
IL-31 225pM 29.3pM 6.87nM
实施例4：抗OSMR抗体的表位框并
进行抗体竞争研究以表征抗OSMR异种小鼠抗体的表位。彼此竞争的抗体可被视为结合靶上相同位点。在这些实验中，OSMR或不相关抗体被捕获到与捕获抗体(生物素化单价小鼠抗人IgG Fc抗体)预先结合的链霉亲和素涂覆的Luminex珠上。将OSMR抗原或缓冲液(无抗原)加入孔中，且将探针抗体加入每个孔中且利用PE标记的单价小鼠抗人IgG Fc抗体检测。测量每个孔的平均荧光强度。为了完全参考，参见Jia等，J.Immunol.Methods 288：91-8，2004。给定孔中荧光的检测表明探针抗体能够结合至OSMR，甚至在其它OSMR抗体存在下，这表明它们结合至不同表位。如下表6所示，发现最少三个框。
表6
实施例5：抗OSMR抗体的亲和性确定
确定抗OSMR抗体的亲和性。进行动力学速率常数确定以研究抗体1-3(Ab1-3)与人OSMR的相互作用。
在25℃下，在HBS-EP+(1X)缓冲液系统(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3.0mMEDTA，0.05％表面活性剂P20)中使用装备了CM5传感器芯片的Biacore 3000光生物传感器进行生物传感器分析。注射前，使所有试剂保持在8℃。经由耦合至流池1和2的标准胺，将山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch，#109-005-098)固定(～3000RU)至传感器芯片且然后利用乙醇胺阻断。在流动缓冲液中以150nM制备hOSMR.FH且3倍稀释至0.617nM。在流动缓冲液中稀释(0.25至0.5μg/mL)抗体1-3。将抗体以10μL/min的流速注射(15μL)到流池2。捕获约50RU抗体。使表面稳定(90s)且然后使每个浓度(150、50.0、16.7、5.56、1.85和0.617)的hOSMR以50μL/min的流速流过流池1和2以观察缔合(5分钟)和解离(5分钟)。以一式两份和随机顺序跑样。
在样品注射前、期间和后，注射缓冲分析物空白(0nM hOSMR)。将抗体以10μL/min的流速注射(15μL)到流池2。捕获约50RU抗体。使表面稳定(90s)且然后每个浓度(150nM)的hOSMR以50μL/min的流速流过流池1和2以观察缔合(5分钟)和解离(1-2小时)。以一式三份跑样。
在样品注射前和后注射缓冲分析物空白(0nM hOSMR)。利用两次10mM甘氨酸(pH1.5，50μL)注射在50μL/min的流速下再生表面。然后注射缓冲液空白(15秒)。
如下利用Scrubber 2.0软件分析数据。从来自流池1的数据(空白参考)中减去来自流池2的数据。然后从最接近0nM浓度的数据中减去(双引用)减去的参考数据(2-1)。使双引用的长解离数据与1∶1结合模式拟合以确定解离速率常数(kd)。将此解离速率常数用作固定参数以使双引用短解离数据与1∶1结合模式拟合以确定缔合速率常数(ka)和平衡解离常数(Kd)。
试剂在实验条件下表现良好且数据(参见下表7)与1∶1结合模式完美拟合。
表7
抗体 抗原 ka(1/Ms) kd(1/s) Kd(pM)
Ab1 huOSMR 4.47x105 9.95x10-5 22.1
Ab2 huOSMR 5.50x105 1.81x10-5 32.7
Ab3 hoOSMR 9.47x104 1.02x10-4 1080
实施例6：抗OSMR抗体
使用实施例1中以上描述的技术产生针对人OSMR的完全人抗体。抗体1、2和3中的每一个被证实是OSM和/或IL-31介导的信号传导的有效抑制剂。确定抗体1、2和3(即Ab1、Ab2和Ab3)的序列且示于下表8中。
表8
实施例7：修饰的抗OSMR抗体
产生Ab1、Ab2和Ab3的修饰型。对于抗体的所有三种修饰形式，去除重链C端的赖氨酸。对于Ab1和Ab2，通过用天冬氨酸取代位置73的天冬酰胺而去除位置73的糖基化位点。将这些变体称为Ab1-N73D和Ab2-N73D。修饰抗体的序列在下表9中(将修饰的核苷酸和氨基酸加下划线)示出。
表9
在各种形式(捕获ELISA用于低亲合力形式；夹层ELISA用于溶液相形式；以及直接ELISA用于固态亲合力形式)下，使用含有具有不同Fc区的Ab1或Ab2(或Ab1或Ab2的N73D变体)可变区的抗体进行ELISA实验。
Ab1和Ab2各自含有人IgG2源的CH1、CH2、CH3结构域。如本文使用，术语“Ab1”和“Ab1 IgG2 WT”是指相同的抗体。相似地，术语“Ab2”和“Ab2 IgG2 WT”是指相同的抗体。
鉴定为“IgG4P agly/IgG1”的抗体含有Ab1或Ab2(或Ab1或Ab2的N73D变体)的可变区，所述可变区融合至来自人IgG4的CH1结构域、来自具有Ser至Pro突变(在位置228处)以降低改组的人IgG4的铰链、来自具有Asn至Gln突变(在位置297处)以消除N-连接的糖基化位点的人IgG4的CH2结构域，和来自人IgG1的CH3结构域。“IgG4P agly/IgG1”构架在美国公开的专利申请No.US 2012/0100140中有所描述。
ELISA结果表明经由N73D取代去除糖基化位点不影响修饰的抗体与OSMR的结合。参见表10。
表10
使用BIAcore方法进行结合研究。根据生产商的方案，将含有具有不同Fc区的Ab1或Ab2(或Ab1或Ab2的N73D变体)可变区的抗体固定在CM4芯片(GE lifesciences)上。可溶性OSMR作为分析物。经由N73D取代去除Ab1和Ab2的糖基化位点改善了结合亲和力。对于Ab1，取代改善了K开速率，而对于Ab2，其改善了K关速率。参见表11。
表11
通过评价抗体的热展开确定Fab片段的稳定性。Fab片段的高熔解温度与增加的稳定性直接相关。如差示扫描荧光测定术实验评价，经由N73D取代去除Ab2上的糖基化位点不影响Fab片段的热稳定性且显示对Ab1影响甚微。参见表12。
表12
评价修饰的抗OSMR抗体阻断通过人OSMR信号传导的能力。评价修饰的抗体在IL31、OSM或IL31和OSM存在下抑制BaF_hu-IL31R/OSMR/gp130细胞系增殖的能力。结果呈现在下表13和14中，显示每个抗体的IC50。结果证实Ab1和Ab2的修饰型是OSM和IL-31介导的信号传导的有效抑制剂。
表13
表14
本公开已对发现或提出以包括用于实践本公开的特定模式的具体实施方案方面进行了描述。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明描述的各种修改和变型对本领域的技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合特定的实施方案描述了本发明，但应当理解的是，要求保护的本发明不应过分地限于此类特定实施方案。实际上，对相关领域内的技术人员显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的各种修改意在包含在下述的权利要求书的范围之内。
提供了以下技术方案。
1.治疗有效量的抗制瘤素M受体(OSMR)抗体在制备用于在人类患者中治疗瘙痒症的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物配制为对所述患者注射，且其中所述抗OSMR抗体与由SEQ ID NO：28的轻链可变结构域和SEQ ID NO：54的重链可变结构域定义的抗OSMR抗体竞争。
2.项1的用途，其中所述抗OSMR抗体抑制OSM和IL-31信号传导两者。
3.项1的用途，其中所述抗OSMR抗体静脉内注射。
4.项1的用途，其中所述抗OSMR抗体皮下注射。
5.项1的用途，其中所述治疗有效量范围从0.1μg/kg至30mg/kg。
6.项1的用途，其中所述治疗有效量范围从1μg/kg至20mg/kg。
7.项1的用途，其中所述治疗有效量范围从10μg/kg至10mg/kg。
8.项1的用途，其中所述抗OSMR抗体是单克隆抗体。
9.项1的用途，其中所述抗OSMR抗体是人源化抗体。
10.项1的用途，其中所述抗OSMR抗体是人抗体。
11.项1的用途，其中所述抗OSMR抗体是嵌合抗体。
12.项1的用途，其中所述抗OSMR抗体是IgG1、IgG2、IgG4，或其杂合抗体。
13.项1的用途，其中所述抗OSMR抗体是无糖基化的。
14.一种抗OSMR抗体，其包含：
a)如SEQ ID NO：27中所示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：9中所示的重链可变结构域氨基酸序列；
b)如SEQ ID NO：28中所示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：10中所示的重链可变结构域氨基酸序列；或
c)如SEQ ID NO：29中所示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：11中所示的重链可变结构域氨基酸序列。
15.一种抗OSMR抗体，其包含：
a)具有SEQ ID NO：24中所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列的重链；
b)具有SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列的重链；或
c)具有SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列的重链。

Claims (14)

1.抗OSMR抗体，其包含：
a)如SEQ ID NO:27所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:9所示的重链可变域氨基酸序列；
b)如SEQ ID NO:28所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:10所示的重链可变域氨基酸序列；或
c)如SEQ ID NO:29所示的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:11所示的重链可变域氨基酸序列。
2.权利要求1的抗OSMR抗体，其中所述抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的重链；
b)具有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的重链；或
c)具有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的重链。
3.权利要求1的抗OSMR抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:28限定的轻链可变域氨基酸序列和如SEQ ID NO:10所示的重链可变域氨基酸序列。
4.权利要求2的抗OSMR抗体，其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:25限定的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:7限定的氨基酸序列的重链。
5.权利要求1-4中任一项的抗OSMR抗体，其中所述抗OSMR抗体抑制OSM和IL-31信号传导两者。
6.抗OSMR抗体在制备用于治疗有此需要的瘙痒症的药物中的用途，其中所述抗OSMR抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的重链，或
b)具有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的重链。
7.抗OSMR抗体在制备用于治疗有此需要的瘙痒症的药物中的用途，其中所述抗OSMR抗体包含：
a)具有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链，或
b)具有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的重链。
8.权利要求6或7的用途，其中所述抗OSMR抗体配制用于静脉内注射。
9.权利要求6或7的用途，其中所述抗OSMR抗体配制用于皮下注射。
10.权利要求6-9中任一项的用途，其中所述抗OSMR抗体配制为以0.1μg/kg至30mg/kg的剂量施用。
11.权利要求10的用途，其中所述抗OSMR抗体配制为以1μg/kg至20mg/kg的剂量施用。
12.权利要求10的用途，其中所述抗OSMR抗体配制为以10μg/kg至10mg/kg的剂量施用。
13.一种制瘤素M受体(OSMR)抗原结合蛋白，其包含：
a)与SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的轻链可变结构域；
b)与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变结构域；或
c)a)的轻链可变结构域和b)的重链可变结构域。
14.治疗有效量的抗制瘤素M受体(OSMR)抗体在制备用于在人类患者中治疗瘙痒症的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物配制为对所述患者注射，且其中所述抗OSMR抗体与由SEQ ID NO:28的轻链可变结构域和SEQ ID NO:54的重链可变结构域定义的抗OSMR抗体竞争。
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