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KR102223028B1 - 핵 수송 조절인자 및 이의 용도 - Google Patents

핵 수송 조절인자 및 이의 용도 Download PDF

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KR102223028B1
KR102223028B1 KR1020207028485A KR20207028485A KR102223028B1 KR 102223028 B1 KR102223028 B1 KR 102223028B1 KR 1020207028485 A KR1020207028485 A KR 1020207028485A KR 20207028485 A KR20207028485 A KR 20207028485A KR 102223028 B1 KR102223028 B1 KR 102223028B1
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compound
cancer
disease
group
trifluoromethyl
Prior art date
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KR1020207028485A
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Inventor
빈센트 피. 산다나야카
샤론 쉑터
샤론 샤참
딜라라 맥컬리
에르칸 바로그루
Original Assignee
바이오젠 엠에이 인코포레이티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 하기 화학식 (I)의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염, 화학식 (I)의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물, 및 상기 화합물, 염 및 조성물을 CRM1 활성과 관련된 다양한 질환의 치료에 이용하는 방법에 관한 것이다:
Figure 112020104886621-pat00091
.

Description

핵 수송 조절인자 및 이의 용도{NUCLEAR TRANSPORT MODULATORS AND USES THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2012년 5월 9일 출원된 미국 가특허출원 61/644,802호 및 2013년 3월 15일 출원된 미국 가특허출원 61/798,188호의 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 교시는 본원에 참조로서 포함된다.
대다수 인간 고형암 및 혈액 악성종양으로부터의 세포는 다양한 종양원성 단백질, 종양 억제인자 단백질, 및 세포 주기 억제제의 비정상적인 세포 국소화를 나타낸다 (Cronshaw et al. 2004, Falini et al 2006). 예를 들어, 특정한 p53 돌연변이는 핵보다는 세포질에서 국소화를 일으킨다. 그 결과 완전한 종양 억제인자 기능에도 불구하고, 정상 성장 조절의 손실이 발생한다. 그 밖의 종양에서, 야생형 p53은 세포질에 격리되거나 급속하게 분해되어, 역시 이의 억제 기능의 손실을 발생시킨다. 기능성 p53 단백질의 적절한 핵 국소화의 회복은 신생물 세포의 일부 성질을 정상화시킬 수 있고 (Cai et al. 2008; Hoshino et al. 2008; Lain et al. 1999a; Lain et al. 1999b; Smart et al. 1999), DNA 손상제에 대한 암세포의 민감성을 회복시킬 수 있고 (Cai et al. 2008), 확립된 종양의 회귀를 초래할 수 있다 (Sharpless & DePinho 2007, Xue et al. 2007). forkhead (Turner and Sullivan 2008) 및 c-Abl (Vignari and Wang 2001)과 같은 다른 종양 억제인자 단백질에 대해서 유사한 데이터가 수득되었다. 또한, 여러 종양 억제인자 및 성장 조절 단백질의 비정상적인 국소화는 자가면역 질병의 발병기전에 관여할 수 있다 (Davis 2007, Nakahara 2009). CRM1 억제는, 특수한 종양 억제인자 단백질 (TSP)이 결실되거나 기능장애이고 CRM1 억제제의 전신 (또는 국소) 투여에 의해 증가된 TSP 수준이 정상적인 종양 억제인자 기능을 회복하는데 도움이 될 수 있었던 가족성 암 증후군 (예컨대, 한 p53 대립유전자의 손실로 인한 리-프라우메니 증후군, BRCA1 또는 2 암 증후군)에서 특히 흥미로운 유용성을 제공할 수 있다.
특수한 단백질 및 RNA는 특수 수송 분자에 의해 핵 내로 그리고 핵 외로 운반되는데, 상기 특수 수송 분자는 분자를 핵 내로 수송하는 경우 임포틴(importin)으로 분류되고, 분자를 핵 외로 수송하는 경우 엑스포틴(exportin)으로 분류된다 (Terry et al. 2007; Sorokin et al. 2007). 핵 내로 또는 핵 외로 수송된 단백질은 이들이 관련 전달체와 상호작용할 수 있게 하는 핵 내수송/국소화 (NLS) 또는 외수송 (NES) 서열을 함유한다. 엑스포틴-1 또는 Xpo1로도 불리는 염색체 영역 유지부 1 (Crm1)가 주요 엑스포틴이다.
Crm1의 과발현은 인간 난소암 (Noske et al. 2008), 자궁경부암 (van der Watt et al. 2009), 췌장암 (Huang et al. 2009), 간세포 암종 (Pascale et al. 2005) 및 골육종 (Yao et al. 2009)을 포함하는 여러 종양에서 보고되었고, 독립적으로 이러한 종양 유형에서의 부족한 임상 결과와 관련이 있다.
Crm1의 억제는 유전자 발현, 세포 증식, 혈관신생 및 후생유전학과 연관된 핵으로부터 p53, c-Abl, p21, p27, pRB, BRCA1, IkB, ICp27, E2F4, KLF5, YAP1, ZAP, KLF5, HDAC4, HDAC5 또는 forkhead 단백질 (예컨대, FOXO3a)과 같은 종양 억제인자 단백질 및/또는 성장 조절제의 탈출을 차단한다. Crm1 억제제는 정상 (형질전환되지 않은) 세포를 사용치 않으며, 심지어 활성화 종양원성 또는 성장 자극 신호의 존재하에서도 암세포의 아폽토시스를 유도하는 것으로 나타났다. Crm1 억제에 대한 대부분의 연구는 자연 생성물 Crm1 억제제 렙토마이신 B (LMB)를 활용해 왔다. LMB 자체는 신생물 세포에 고도로 독성이지만, 현저한 위장 독성으로 인해 동물 (Roberts et al. 1986) 및 인간 (Newlands et al. 1996)에서 관용되기 어렵다. 약물-유사 특성을 향상시키기 위한 LMB의 유도체화는 항종양 활성을 보유하고 동물 종양 모델에 더 잘 관용되는 화합물을 생성한다 (Yang et al. 2007, Yang et al. 2008, Mutka et al. 2009). 따라서, 핵 외수송 억제제는 신생물 및 다른 증식적 질환에 유리한 효과를 지닐 수 있었다. 그러나, 지금까지, 시험관내 및 생체내 사용되는 소분자 약물-유사 Crm1 억제제는 흔하지 않다.
종양 억제인자 단백질에 추가하여, Crm1은 또한 다수의 염증 과정에 관여하는 여러 중요한 단백질을 외수송한다. 이는 IkB, NF-kB, Cox-2, RXRα, Commd1, HIF1, HMGB1, FOXO, FOXP 등을 포함한다. 면역글로불린 카파 유전자 발현을 구동시킨다는 발견에 기인하여 명명된, 전사 활성제의 핵 인자 카파 B (NF-kB/rel) 패밀리는 염증, 증식, 면역성 및 세포 생존에 관련된 다양한 유전자의 mRNA 발현을 조절한다. 기초 조건하에, IkB라 불리는 NF-kB의 단백질 억제제는 핵에서 NF-kB에 결합하고, IkB-NF-kB의 복합체는 NF-kB 전사 기능을 비활성시킨다. 염증 자극에 반응하여, IkB는 IkB-NF-kB 복합체로부터 분리되는데, 이는 NF-kB를 방출시키고 이의 잠재적인 전사 활성을 나타낸다. NF-kB를 활성화시키는 많은 신호는 단백질분해를 위해 IkB를 표적화함에 의해 그렇게 실행된다 (IkB의 인산화는 유비퀴틴화를 위해 이를 "드러낸(marked)" 후 단백질분해됨). 핵 IkBa-NF-kB 복합체는 이것이 분리되는 세포질로 Crm1에 의해 외수송될 수 있고, NF-kB는 재활성화될 수 있다. 유비퀴틴화된 IkB는 또한 NF-kB 전사 활성을 회복하면서, NF-kB 복합체로부터 분리될 수 있다. 인간 호중구 및 대식세포 유사 세포(U937)에서 LMB에 의한 Crm1 유도된 외수송의 억제는 전사적으로 비활성인 핵 IkBa-NF-kB 복합체를 발생시킬 뿐만 아니라 심지어 세포 자극시에도 NF-kB의 초기 활성화를 막는다 (Ghosh 2008, Huang 2000). 상이한 연구에서, LMB로의 치료는 폐 미세혈관 내피 세포에서 IL-1β 유도된 NF-kB DNA 결합 (NF-kB 전사 활성화에서의 제 1 단계), IL-8 발현 및 세포간 부착 분자 발현을 억제하였다 (Walsh 2008). COMMD1은 NF-kB 및 저산소-유도 인자 1 (HIF1) 전사 활성 둘 모두의 또 다른 핵 억제제이다. Crm1을 억제함에 의해 COMMD1의 핵 외수송을 차단하는 것은 NF-kB 및 HIF1 전사 활성의 증가된 억제를 발생시킨다 (Muller 2009).
Crm1은 또한 레티노이드 X 수용체 α (RXRα) 수송을 매개한다. RXRα는 간에서 고도로 발현되며, 담즙산, 콜레스테롤, 지방산, 스테로이드 및 생체이물 대사 및 항상성을 조절하는데 있어서 중추적인 역할을 담당한다. 간 염증 동안, 핵 RXRα 수준은, 주로 Crm1에 의한 RXRα의 염증-매개 핵 외수송으로 인해, 현저하게 감소된다. Lep B는 인간의 간 유래 세포에서 RXRα 수준의 IL-1β 유도된 세포질 증가를 억제할 수 있다 (Zimmerman 2006).
NF-kB, HIF-1 및 RXRα 신호전달에서 Crm1-매개된 핵 외수송의 역할은, 핵 외수송을 차단하는 것이 혈관 (혈관염, 동맥염, 류마티스성 다발성 근육통, 죽상경화증), 피부 (상기 참조), 류마티스 (류마토이드 및 관련 관절염, 건선성 관절염, 척추관절병증, 결정성 관절병증, 전신 홍반 루푸스, 혼합결합조직병, 근염 증후군, 피부근염, 봉입체 근염, 미분화 결합 조직 질환, 쇼그렌 증후군, 경피증 및 중복 증후군 등)를 포함하는 다수의 조직 및 기관에 걸친 많은 염증 과정에 있어서 잠재적으로 유리할 수 있음을 시사한다.
CRM1 억제는 ICp27, E2F4, KLF5, YAP1, ZAP와 같은 일련의 전사 인자를 억제/활성화시킴에 의해 유전자 발현에 영향을 준다.
Crm1 억제는 염증성 피부염 (아토피, 알레르기성 피부염, 화학적 피부염, 건선), 일광-손상 (자외선/UV 손상), 및 감염을 포함하는 다수의 피부과 증후군에 대해 잠재적인 치료 효과를 지닌다. LMB로 가장 잘 연구된 CRM1 억제는 정상 각질세포 상에서 최소의 효과를 나타내었고, UV, TNFα, 또는 다른 염증성 자극을 받은 각질세포 상에서 항-염증 활성을 발휘하였다 (Kobayashi & Shinkai 2005, Kannan & Jaiswal 2006). Crm1 억제는 또한 각질세포 (Schafer et al. 2010, Kannan & Jaiswal 2006) 및 다른 세포 유형 (Wang et al. 2009)을 산화 손상으로부터 보호하는 NRF2 (핵 인자 적혈구-관련 인자 2) 활성을 상향조절한다. LMB는 HPV16과 같은 종양원성 인간 유두종바이러스 (HPV) 균주로 감염된 각질세포에서 아폽토시스를 유발하나, 감염되지 않은 각질세포에서는 그렇지 않다 (Jolly et al. 2009).
Crm1은 또한 파킨슨병 (PD), 알츠하이머병, 및 근육위축가쪽경화증 (ALS)을 포함하는 신경변성 질환에 유용할 수 있는 중요한 신경보호 단백질의 수송을 매개한다. 예를 들어, (1) 뉴런 세포에 머물고 있는, NRF2 (Wang 2009), FOXA2 (Kittappa et al. 2007)와 같은 중요 신경보호 조절제의 핵 체류를 강제하고/하거나, (2) IκB를 신경아교 세포의 핵에 격리시킴에 의해 NFκB 전사 활성을 억제함으로써, Crm1 억제는 이러한 질환에서 발견되는 뉴런 세포 사멸을 늦추거나 막을 수 있었다. 또한 비정상적인 신경아교 세포 증식을 CRM1 수준 또는 CR1 기능에서의 비정상성에 결부시킨 증거가 존재한다 (Shen 2008).
주로 CRM1을 통해 매개되는 완전한 핵 외수송은 다수의 바이러스의 무손상 돌연변이에도 요구된다. 핵 외수송 및/또는 CRM1 자체가 그 라이프사이클에 관련된 바이러스는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 아데노바이러스, 유인원 레트로바이러스 타입 1, 보르나병 바이러스, 인플루엔자 (보통의 균주뿐 아니라 H1N1 및 조류 H5N1 균주), B형 (HBV) 및 C형 (HCV) 간염 바이러스, 인간 유두종바이러스 (HPV), 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 뎅기, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스, 황열병 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 단순포진 바이러스 (HSV), 거대세포바이러스 (CMV), 및 메르켈 세포 폴리오마바이러스 (MCV)를 포함한다 (Bhuvanakantham 2010, Cohen 2010, Whittaker 1998). 완전한 핵 외수송에 의존한 추가 바이러스 감염은 가까운 미래에 밝혀질 것으로 예상된다.
핵소체를 통해 왕래하고 핵과 세포질 사이를 왕복하는 HIV-1 Rev 단백질은 CRM1 외수송 경로에 의해 Rev 반응 요소 (RRE) RNA를 함유하는 스플라이싱되지 않은 HIV 전사체 및 단독으로 스플라이싱된 HIV 전사체의 외수송을 촉진한다. LepB 또는 PKF050-638과 같은 CRM1 억제제를 이용한 Rev-매개된 RNA 수송의 억제는 HIV-1 전사 과정을 억제하고, 새로운 HIV-1 비리온의 생성을 억제함으로써, HIV-1 수준을 감소시킬 수 있다 (Pollard 1998, Daelemans 2002).
뎅기 바이러스 (DENV)는 보통의 절지동물-매개 바이러스 질병, 뎅기열 (DF), 및 더욱 심하고 잠재적으로 치명적인 뎅기 출혈열 (DHF)의 원인 물질이다. DHF는 DENV에 대한 지나치게 무성한 염증 반응의 결과로 보인다. NS5는 DENV의 가장 크고 가장 보존된 단백질이다. CRM1은 핵에서 세포질로의 NS5의 수송을 조절하는데, 이 때 NS5 기능의 대부분이 매개된다. NS5의 CRM1-매개된 외수송의 억제는 바이러스 생산의 변경된 동역학을 발생시키고 염증 케모카인 인터류킨-8 (IL-8)의 유도를 감소시켜, DENV 및 C형 간염 바이러스를 포함하는 그 밖의 의학적으로 중요한 플라비바이러스에 의해 야기된 질환을 치료하기 위한 새로운 수단을 제시한다 (Rawlinson 2009).
핵에서 나가기 위해 CRM1을 이용하는 그 밖의 바이러스-엔코딩된 RNA-결합 단백질은 HSV 타입 1 외피 단백질 (VP13/14, 또는 hUL47), 인간 CMV 단백질 pp65, SARS 코로나바이러스 ORF 3b 단백질, 및 RSV 매트릭스 (M) 단백질을 포함한다 (Williams 2008, Sanchez 2007, Freundt 2009, Ghildyal 2009).
흥미롭게도, 이러한 바이러스 중 다수는 만성 HBV 또는 HCV 감염으로 인한 간세포 암종 (HCC), HPV로 인한 자궁경부암, 및 MCV와 관련된 메르켈 세포 암종을 포함하는 특수한 유형의 인간 암과 관련된다. 따라서, CRM1 억제제는 바이러스 감염 과정뿐 아니라 이러한 바이러스에 기인한 신생물 형질전환의 과정 둘 모두에 대해 유리한 효과를 지닐 수 있었다.
CRM1은 핵 국소화를 제어하므로, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT), 및 히스톤 메틸트랜스퍼라제 (HMT)를 포함하는 다수의 DNA 대사 효소의 활성을 제어한다. 비가역적 CRM1 억제제에 의한 심근 비대의 억제가 입증되었고, 이는 비대 유전자 프로그램을 억제하는 것으로 알려진 효소인 HDAC 5의 핵 체류 (및 활성화)와 관련된 것으로 여겨진다 (Monovich et al. 2009). 따라서, CRM1 억제는 울혈성 심부전 및 비대심근병의 특정 형태를 포함하는, 비대 증후군에 유리한 효과를 지닐 수 있다.
CRM1은 다른 질병과도 관련되었다. 망막 신경절 세포의 변성 및 시력 손실을 특징으로 하는 유전 질환인 레베르병은 CRM1 스위치의 활동저하와 관련이 있다 (Gupta N 2008). 신경변성 질환을 핵 수송에서의 비정상성과 결부시키는 증거도 존재한다.
상기에 비추어, 핵 수송을 조절하는 화합물의 발견이 요망된다.
발명의 개요
본 발명은 핵 수송 조절인자로서 유용한 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염, 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물, 및 다양한 질병의 치료에서 상기 조성물을 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 핵 수송 조절인자 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 및/또는 조성물은 마우스에서 AUC에 의해 측정되는 바와 같이 요망되는 생체내 노출을 제공하는 한편, 그 밖의 조절인자에 비해 보다 낮은 뇌 침투 수준을 나타내는 것이 발견되었다. 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 하기 화학식 (I)을 지니고, 여기서, 각 변수는 본원에 정의되고 기재된 바와 같다:
Figure 112020104886621-pat00001
본 발명의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 조성물은 부적당한 핵 수송에 의해 촉발된 이상 세포 반응과 연관된 다양한 질환, 질병 또는 병태를 치료하는데 유용하다. 이러한 질환, 질병 또는 병태는 본원에 기재된 것들을 포함한다.
본 발명에 의해 제공된 화합물은 또한 생물학적 및 병리학적 현상에서 핵 수송 조절의 연구: 그러한 키나제에 의해 매개된 세포내 신호 형질도입 경로의 연구; 및 새로운 핵 수송 조절인자의 비교 평가에 유용하다.
상기는 본 발명의 예시적인 구체예의 하기 더욱 특정한 기재로부터 자명해질 것이다.
도 1은 평균 종양 부피 대 시간의 그래프이고, 비히클, 80 mg/kg 사이클로포스파미드, 15 mg/kg 화합물 2 또는 7.5 mg/kg 화합물 2로 처리된 마우스에 대한 Z-138 이종이식편 종양의 그룹 평균 부피를 나타낸다 (오차 막대는 각 그룹에 대한 SEM을 나타낸다).
도 2는 평균 종양 부피 대 시간의 그래프이고, 비히클, 5 mg/kg 시스플라틴, 10 mg/kg 화합물 2 또는 5 mg/kg 화합물 2로 처리된 마우스에 대한 A549 이종이식편 종양의 그룹 평균 부피를 나타낸다 (오차 막대는 각 그룹에 대한 SEM을 나타낸다).
도 3a는 총 관절염 점수 대 시간의 그래프이고, 비히클, 덱사메타손, 4 mg/kg 화합물 2 또는 7.5 mg/kg 화합물 2로 처리된 항-콜라겐 항체 유도된 수컷 BALB/c 관절염 마우스에 대한 12일의 관찰 기간 동안의 임상 관절염 점수를 나타낸다 (￥ = 비히클-처리된 그룹과 현저하게 상이한 덱사메타손-처리된 그룹; # = 비히클-처리된 그룹과 현저하게 상이한 7.5 mg/kg 화합물 2-처리된 그룹; † = 비히클-처리된 그룹과 현저하게 상이한 4 mg/kg 화합물 2-처리된 그룹).
도 3b는 평균 뒷발 대 시간의 그래프이고, 비히클, 덱사메타손, 4 mg/kg 화합물 2 또는 7.5 mg/kg 화합물 2로 처리된 항-콜라겐 항체 유도된 수컷 BALB/c 관절염 마우스에 대한 12일의 관찰 기간 동안의 그룹 평균 뒷발 두께를 나타낸다 (￥ = 비히클-처리된 그룹과 현저하게 상이한 덱사메타손-처리된 그룹; # = 비히클-처리된 그룹과 현저하게 상이한 7.5 mg/kg 화합물 2-처리된 그룹; † = 비히클-처리된 그룹과 현저하게 상이한 4 mg/kg 화합물 2-처리된 그룹).
도 4a는 관절 종창 대 시간의 그래프이고, 나이브 래트 및 CIA 모델에 따라 처리되거나, 양성 대조군 또는 화합물 2를 이용하여 처리된 래트에서 0-4의 척도로 측정된 관절 종창을 나타낸다.
도 4b는 시간의 함수로서의 임상 점수의 그래프이고, 나이브 래트 및 CIA 모델에 따라 처리되거나, 양성 대조군 또는 화합물 2를 이용하여 처리된 래트의 임상 관절염 점수를 나타낸다.
도 5는 CIA 모델에서 각각의 처리 그룹으로부터의 대표적인 이미지이고, 나이브 래트 및 모델에 따라 처리되거나 양성 대조군 또는 화합물 2를 이용하여 처리된 래트의 뒷발의 조직병리학을 나타낸다.
도 6a는 귀 두께 대 시간의 그래프이고, 비히클, PMA 및 비히클, PMA 및 화합물 2 또는 PMA 및 베타메타손으로 처리된 암컷 BALB/c 마우스의 그룹 평균 좌측 귀 두께를 나타낸다.
도 6b는 귀 두께 대 시간의 그래프이고, 비히클, PMA 및 비히클, PMA 및 화합물 2 또는 PMA 및 베타메타손으로 처리된 암컷 BALB/c 마우스의 그룹 평균 우측 귀 두께를 나타낸다.
도 6c는 질병 활성 대 시간의 그래프이고, 비히클, PMA 및 비히클, PMA 및 화합물 2 또는 PMA 및 베타메타손으로 처리된 암컷 BALB/c 마우스의 그룹 평균 좌측 귀 질병 활성을 나타낸다.
도 6d는 질병 활성 대 시간의 그래프이고, 비히클, PMA 및 비히클, PMA 및 화합물 2 또는 PMA 및 베타메타손으로 처리된 암컷 BALB/c 마우스의 그룹 평균 우측 귀 질병 활성을 나타낸다.
도 7a는 질병 활성 지수 대 시간의 그래프이고, IMQ 투여 전에 비히클, IMQ 및 비히클, IMQ 및 1 μM 화합물 2, 또는 IMQ 및 10 mg/kg 사이클로포스파미드로 처리된 수컷 BALB/c 마우스의 질병 활성을 나타낸다.
도 7b는 질병 활성 지수 대 시간의 그래프이고, IMQ 투여 후에 비히클, IMQ 및 비히클, IMQ 및 1 μM 화합물 2, 또는 IMQ 및 10 mg/kg 사이클로포스파미드로 처리된 수컷 BALB/c 마우스의 질병 활성을 나타낸다.
도 8a는 누적 사료 섭취 대 시간의 그래프이고, 비히클 (VEH), 1.5 mg/kg 화합물 또는 3.0 mg/kg 화합물 2로 처리된 야윈 Zucker 래트 및 비만 Zucker 래트의 누적 사료 섭취를 나타낸다.
도 8b는 평균 사료 섭취 대 시간의 그래프이고, 비히클 (VEH), 1.5 mg/kg 화합물 또는 3.0 mg/kg 화합물 2로 처리된 야윈 Zucker 래트 및 비만 Zucker 래트의 평균 사료 섭취를 나타낸다.
도 9는 체중 변화 백분율 대 시간의 막대 그래프이고, 처리 기간 (연구 10일 및 17일) 및 실험의 워시아웃 기간 (연구 24일) 동안 비히클 (VEH), 1.5 mg/kg 화합물 또는 3.0 mg/kg 화합물 2로 처리된 야윈 Zucker 래트 및 비만 Zucker 래트의 체중 변화 백분율을 나타낸다.
도 10a는 누적 사료 섭취 대 시간의 그래프이고, 기준선, 처리 및 연구의 워시아웃 단계 동안 정상 고형사료를 공급한 래트 및 고지방 식이를 공급하고 비히클, 1.5 mg/kg 화합물 또는 3.0 mg/kg 화합물 2로 처리된 래트의 누적 사료 섭취를 나타낸다.
도 10b는 평균 체중 대 시간의 그래프이고, 기준선, 처리 및 연구의 워시아웃 단계 동안 정상 고형사료를 공급한 래트 및 고지방 식이를 공급하고 비히클, 1.5 mg/kg 화합물 또는 3.0 mg/kg 화합물 2로 처리된 래트의 평균 체중을 나타낸다.
도 11은 체중 변화 백분율 대 시간의 막대 그래프이고, 정상 고형사료를 공급한 래트 및 고지방 식이를 공급하고 비히클, 1.5 mg/kg 화합물 또는 3.0 mg/kg 화합물 2로 처리된 래트의 체중 변화 백분율을 나타낸다.
도 12a는 녹다운 조건을 포함하는, 다양한 조건하에 Nrf2 발현의 그래프이다.
도 12b는 녹다운 조건을 포함하는, 다양한 조건하에 NQO1 발현의 그래프이다.
도 12c는 녹다운 조건을 포함하는, 다양한 조건하에 EPHX1 발현의 그래프이다.
도 13a는 COX-2 mRNA 발현의 변화 배수의 막대 그래프이고, 화합물 1이 COX-2 전사에 영향을 주지 않음을 나타낸다. 미처리 HeLa 세포(대조군)의 qRT-PCR에 의한 COX-2 mRNA 발현 분석을 10 μM 화합물 1, 20 ng/ml TNFα, 또는 10 μM 화합물 1 + 20 ng/ml TNFα로 처리된 HeLa 세포와 비교하였다.
도 13b는 COX-2 단백질 발현의 세기의 그래프이고, 화합물 1이 TNFα-유도된 COX-2 단백질 발현을 억제함을 나타낸다.
도 14a는 DMSO, 20 ng/mL TNFα, 또는 화합물 1 + 20 ng/mL TNFα로 처리된 세포의 이미지이고, 다양한 염증-관련 CRM1 카고 단백질의 국소화를 나타낸다.
도 14b는 DMSO, 20 ng/mL TNFα, 또는 화합물 1 + 20 ng/mL TNFα로 처리된 세포의 이미지이고, IκB, NFκB, NRF2, PPARγ 및 RXRα의 국소화를 나타낸다.
도 15a는 시간의 함수로서 MWM 시험에서 플랫폼에 도달하는 대기시간의 그래프이고, MWM 시험의 습득 단계 동안 플랫폼에 도달하는 마우스의 대기시간에 대한 샴 처리, 대조군 처리, 프로게스테론 처리 및 다양한 용량의 화합물 1의 효과를 나타낸다 (데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다).
도 15b는 사이토카인 농도의 그래프이고, 래트 혈장에서 여러 사이토카인의 농도를 나타낸다.
도 15c는 샴 병변 (샴), CCI + 비히클 (대조군), 또는 CCI + 화합물 1 (6 mg/kg)을 수용한 동물의 전체 뇌의 사진이며, 바이브라톰 섹션화 이전에 전체 뇌의 정성적 외관 검사의 결과를 나타낸다. 상기 검사는 어떤 샴 동물도 등-내측 피질 조직에 대한 손상을 나타내지 않았음을 지시한다 (4마리 중 0). 전혀 대조적으로, CCI 대조군의 4마리 모두는 이러한 피질 영역에 제한된 심각한 양쪽 손상을 나타내었다. 화합물 1을 수용한 CCI 동물은 중간 내지 최소 범위의 손상을 나타내었다. 특히, 화합물 1 그룹에서 가장 심각한 손상을 보여주는 뇌가 CCI 대조 그룹의 모든 뇌보다 덜 심각하였다.
도 15d는 샴-처리되고 (샴), CCI + 비히클-처리되고 (대조군), 및 CCI + 화합물 1-처리된 (KPT) 동물의 등쪽 피질 영역 및 배쪽 피질 영역의 NeuN 표지화의 저-전력 마이크로그래프이다.
도 15e는 샴-처리되고 (샴), CCI + 비히클-처리되고 (대조군), 및 CCI + 화합물 1-처리된 (KPT) 동물에서 래트 IgG 및 TNFα의 면역형광 표지화의 현미경사진이다.
도 16a는 시간의 함수로서의 임상 점수의 그래프이고, 나이브 암컷 Lewis 래트, 대조군 암컷 관절염 Lewis 래트, 또는 화합물 2로 처리된 암컷 관절염 Lewis 래트의 임상 관절염 점수를 나타낸다.
도 16b는 시간의 함수로서의 관절 종창의 그래프이고, 나이브 암컷 Lewis 래트, 대조군 암컷 관절염 Lewis 래트, 또는 화합물 2로 처리된 암컷 관절염 Lewis 래트에서 0-4 척도로 측정된 관절 종창을 나타낸다.
도 17a는 나이브 암컷 Lewis 래트, 대조군 암컷 관절염 Lewis 래트, 및 화합물 2로 처리된 암컷 관절염 Lewis 래트의 족근 골의 골 광물질 밀도 (BMD)의 그래프이다.
도 17b는 나이브 암컷 Lewis 래트, 대조군 암컷 관절염 Lewis 래트, 및 화합물 2로 처리된 암컷 관절염 Lewis 래트의 뒷발의 3차원 마이크로 CT 이미징에 의한 시각화이다.
도 17c는 시간의 함수로서 윤활액 중 IL-1β의 농도의 그래프이고, CIA 2번 연구의 21일 및 27일에 그룹 A (나이브), 그룹 B (모델) 및 그룹 C (5 mg/kg의 화합물 2 QoD)에서 래트로부터 수집된 윤활액 중 IL-1β의 농도를 나타낸다.
도 17d는 시간의 함수로서 윤활액 중 IL-6의 농도의 그래프이고, CIA 2번 연구의 21일 및 27일에 그룹 A (나이브), 그룹 B (모델) 및 그룹 C (5 mg/kg의 화합물 2 QoD)에서 래트로부터 수집된 윤활액 중 IL-6의 농도를 나타낸다.
도 17e는 시간의 함수로서 윤활액 중 MCP-1의 농도의 그래프이고, CIA 2번 연구의 21일 및 27일에 그룹 A (나이브), 그룹 B (모델) 및 그룹 C (5 mg/kg의 화합물 2 QoD)에서 래트로부터 수집된 윤활액 중 MCP-1의 농도를 나타낸다.
도 17f는 시간의 함수로서 윤활액 중 CRP의 농도의 그래프이고, CIA 2번 연구의 21일 및 27일에 그룹 A (나이브), 그룹 B (모델) 및 그룹 C (5 mg/kg의 화합물 2 QoD)에서 래트로부터 수집된 윤활액 중 CRP의 농도를 나타낸다.
도 17g는 시간의 함수로서 혈청 중 IL-1β의 농도의 그래프이고, CIA 2번 연구의 15일, 21일 및 27일에 그룹 A (나이브), 그룹 B (모델) 및 그룹 C (5 mg/kg의 화합물 2 QoD)에서 래트로부터 수집된 래트 혈청 샘플 중 IL-1β의 농도를 나타낸다.
도 18a는 본원에 기재된 암컷 마우스에서 MOG-유도된 EAE 뮤린 모델의 도식이다.
도 18b는 연구 일수의 함수로서 임상 점수의 그래프이고, 본원에 기재된 MOG-유도된 EAE 뮤린 모델에서 암컷 마우스의 임상 점수에 대한 비히클 처리, 덱사메타손 처리 및 화합물 1 처리의 효과를 나타낸다.
도 19는 화합물 1 또는 이의 적절한 비히클로 국소적으로 또는 전신적으로 처리된 상처의 사진이며, 상처를 낸 지 5일 후에 수행된 상처 형태 평가의 결과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 화합물
제 1 구체예는 하기 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
Figure 112020104886621-pat00002
상기 식에서,
R1은 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되고;
R2는 O 및 S로부터 선택되고;
R3은 -N(R4)-(C3-C6 사이클로알킬), -C1-C6 알킬, -(C0-C4 알킬렌)-헤테로사이클릴, 및 -(C0-C4 알킬렌)-헤테로아릴로부터 선택되고, 여기서 R3의 임의의 알킬, 알킬렌, 헤테로사이클릴, 또는 헤테로아릴 부분은 임의로 그리고 독립적으로 치환되며;
R4는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택된다.
제 1 구체예의 첫 번째 양태에서, R1은 수소 및 메틸로부터 선택된다. 나머지 변수들의 값은 제 1 구체예에 기재된 바와 같다.
제 1 구체예의 두 번째 양태에서, R1은 수소이다. 나머지 변수들의 값은 제 1 구체예에 기재된 바와 같다.
제 1 구체예의 세 번째 양태에서, R2는 O이다. 나머지 변수들의 값은 제 1 구체예, 또는 이의 첫 번째 또는 두 번째 양태에 기재된 바와 같다.
제 1 구체예의 네 번째 양태에서, R2는 S이다. 나머지 변수들의 값은 제 1 구체예, 또는 이의 첫 번째 내지 세 번째 양태에 기재된 바와 같다.
제 1 구체예의 다섯 번째 양태에서, R4는 수소이다.
제 1 구체예의 여섯 번째 양태에서, R3은 -N(R4)-(C3-C6 사이클로알킬), -C3-C6 알킬, -(C0-C1 알킬렌)-헤테로사이클릴, 및 -(C0-C1 알킬렌)-헤테로아릴로부터 선택되고, 여기서 R3의 임의의 알킬 또는 알킬렌 부분은 임의로 -N(R5)2로 치환되고, 여기서 각각의 R5는 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되며; R3의 임의의 헤테로사이클릴, 및 헤테로아릴 부분은 고리에 하나 이상의 질소 원자를 포함하고; R3의 임의의 헤테로사이클릴, 및 헤테로아릴 부분은 임의로 C1-C4 알킬로 치환된다. 나머지 변수들의 값은 제 1 구체예, 또는 이의 첫 번째 내지 다섯 번째 양태에 기재된 바와 같다.
제 1 구체예의 일곱 번째 양태에서, R3는 -C(CH3)3, -CH(NH2)-CH(CH3)2, -NH 사이클로프로필, -(CH2)0-1-피라지닐, 피페리디닐, 하이드록시피페리디닐, N-메틸피페리디닐, -CH2-모르폴린-4-일, 및 메틸피라졸릴로부터 선택된다. 나머지 변수들의 값은 제 1 구체예, 또는 이의 첫 번째 내지 다섯 번째 양태에 기재된 바와 같다.
제 1 구체예의 여덟 번째 양태에서, R3는 -C(CH3)3, -CH(NH2)-CH(CH3)2, -NH-사이클로프로필, -(CH2)0-1-피라진-2-일, 피페리딘-3-일, -CH2-모르폴린-4-일, 및 5-메틸-1-H-피라졸-4-일로부터 선택된다. 나머지 변수들의 값은 제 1 구체예, 또는 이의 첫 번째 내지 다섯 번째 양태에 기재된 바와 같다.
제 1 구체예의 아홉 번째 양태에서, R3는 -C(CH3)3, -NH-사이클로프로필, -CH2-피라진-2-일, -피라진-2-일, -CH2-모르폴린-4-일, 및 5-메틸-1-H-피라졸-4-일로부터 선택된다. 나머지 변수들의 값은 제 1 구체예, 또는 이의 첫 번째 내지 다섯 번째 양태에 기재된 바와 같다.
제 2 구체예는 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이고, 여기서 R3는 -N(R4)-(C3-C6 사이클로알킬), -C3-C6 알킬, -(C0-C1 알킬렌)-헤테로사이클릴, 및 -(C0-C1 알킬렌)-헤테로아릴로부터 선택되고, 이 때:
R3의 임의의 알킬 또는 알킬렌 부분은 -N(R5)2로 치환되거나 치환되지 않고, 각각의 R5는 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되며;
R3의 임의의 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴 부분은 고리에 적어도 하나의 질소 원자를 포함하고,
R3의 임의의 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴 부분은 C1-C4 알킬로 치환되거나 치환되지 않는다.
제 2 구체예의 첫 번째 양태에서, R3는 -C(CH3)3, -CH(NH2)-CH(CH3)2, -NH-사이클로프로필, -(CH2)0-1-피라지닐, 피페리디닐, 하이드록시피페리디닐, N-메틸피페리디닐, -CH2-모르폴린-4-일, 및 메틸피라졸릴로부터 선택된다.
제 2 구체예의 두 번째 양태에서, R3는 -C(CH3)3, -CH(NH2)-CH(CH3)2, -NH-사이클로프로필, -(CH2)0-1-피라진-2-일, 피페리딘-3-일, -CH2-모르폴린-4-일, 및 5-메틸-1-H-피라졸-4-일로부터 선택된다.
제 2 구체예의 세 번째 양태에서, R3는 -C(CH3)3, -NH-사이클로프로필, -CH2-피라진-2-일, -피라진-2-일, -CH2-모르폴린-4-일, 및 5-메틸-1-H-피라졸-4-일로부터 선택된다.
제 3 구체예는 화학식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하고, 여기서 R3는 -N(R4)-(C3-C6 사이클로알킬), -C3-C6 알킬, -(C0-C1 알킬렌)-헤테로사이클릴, 및 -(C0-C1 알킬렌)-헤테로아릴로부터 선택되고, 이 때:
R3의 임의의 알킬 또는 알킬렌 부분은 옥소 및 -N(R5)2로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 임의로 그리고 독립적으로 치환되고, 각각의 R5는 독립적으로 수소 및 C1-C4 알킬로부터 선택되며;
R3의 임의의 헤테로사이클릴 부분은 고리에 적어도 하나의 질소 원자를 포함하고, C1-C4 알킬 및 옥소로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않으며,
R3의 임의의 헤테로아릴 부분은 고리에 적어도 하나의 질소 원자를 포함하고 하나 이상의 C1-C4 알킬로 치환되거나 치환되지 않는다. 나머지 변수들의 값은 제 1 구체예, 또는 이의 첫 번째 내지 다섯 번째 양태에 기재된 바와 같다.
제 3 구체예의 첫 번째 양태에서, R3은 -(C0-C1 알킬렌)-헤테로사이클릴이다. 나머지 변수들의 값은 제 1 구체예, 또는 이의 첫 번째 내지 다섯 번째 양태에 기재된 바와 같다.
제 3 구체예의 두 번째 양태에서, R3은 -(C0-C1 알킬렌)-헤테로사이클릴이고, 이 때 헤테로사이클릴은 피라지닐, 피페리디닐, 모르폴리닐, 및 피라졸릴로부터 선택된다. 나머지 변수들의 값은 제 1 구체예, 또는 이의 첫 번째 내지 다섯 번째 양태에 기재된 바와 같다.
제 3 구체예의 세 번째 양태에서, R3은 -(C0-C1 알킬렌)-헤테로사이클릴이고, 이 때 헤테로사이클릴은 모르폴리닐이다. 나머지 변수들의 값은 제 1 구체예, 또는 이의 첫 번째 내지 다섯 번째 양태에 기재된 바와 같다.
제 3 구체예의 네 번째 양태에서, R3은 -(C1 알킬렌)-헤테로사이클릴이다. 나머지 변수들의 값은 제 1 구체예, 또는 이의 첫 번째 내지 다섯 번째 양태에 기재된 바와 같다.
제 3 구체예의 다섯 번째 양태에서, R3은 -(C1 알킬렌)-모르폴리닐이다. 나머지 변수들의 값은 제 1 구체예, 또는 이의 첫 번째 내지 다섯 번째 양태에 기재된 바와 같다.
화학식 (I)의 예시적인 화합물이 표 1에 개시된다.
표 1. 화학식 (I)의 예시적인 화합물.
Figure 112020104886621-pat00003
Figure 112020104886621-pat00004
Figure 112020104886621-pat00005
일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 화합물 1 내지 11 중 어느 하나로부터 선택된다. 이러한 구체예의 한 양태에서, 화합물은 화합물 1, 2, 3, 4, 8 및 11 중 어느 하나로부터 선택된다.
약동학(PK)은 약물 발견 및 개발에서 역할이 증가하고 있다. 약동학은 약물 흡수, 분배, 대사 및/또는 배출의 시간 경과의 정량적 연구이다. 약물이 투여되는 경우, 이는 이의 투여 부위로부터 전신 혈액 순환으로 신속히 분배된다. 치료제의 분배 정도의 한 척도는 마지막 측정된 농도(AUCt)로 계산되고, 무한으로 외삽(AUCInf)된 혈장 농도-시간 곡선하 면적(AUC)이다. 따라서, AUC는 약물 노출을 정량하기 위한 유용한 측정규준이다.
일반적으로, 치료제의 노출이 높을수록, 작용제의 효과가 크다. 그러나, 치료제의 높은 노출은 특정 조직, 예를 들어, 뇌에 유해한 효과를 가질 수 있다. 내피 세포 사이의 치밀 이음부로 구성되는 보호 네트워크인 혈액뇌장벽(BBB)은 친수성 및/또는 큰 분자의 확산을 제한하나, 높은 AUC를 갖는 약물은 BBB 및/또는 뇌척수액을 여전히 투과할 수 있다. 이러한 투과는 종종 바람직하지 않으며 원치 않는 부작용을 야기시킬 수 있다. 현재의 약물 발견 노력은 부분적으로 뇌 침투를 최소화시키면서 약물 노출(예를 들어, AUC)을 최대화시키는 것 사이의 균형을 발생시키는 것을 목표로 한다.
뇌 대 혈장(B:P) 비는 순환에서 치료제의 분포에 대한 뇌 조직 내에서의 치료제의 상대 분포를 정량하는 한 방법이며, 이러한 비는 제공된 치료제의 뇌 침투의 한 지표를 제공한다. 높은 뇌 대 혈장 비는 목표로 하는 질병이 뇌 및 뇌척수액을 포함하는 중추신경계(CNS) 내에 국소화된 경우에 바람직하다. 그러나, 뇌 침투를 최소화시켜 잠재적 부작용을 회피하기 위해, 비-CNS 치료제에 대해서는 낮은 뇌 대 혈장 비가 일반적으로 바람직하다.
실시예 섹션에서 보다 상세하게 개시된 대로, 본 발명의 화합물은 2011년 3월 5일 출원되고 2011년 11월 10일 US 2009/0275607로서 공개된 공동-소유의 미국 특허 출원 13/041,377호에 기재된 것들과 같은 다른 핵 수송 억제제에 비해 높은 AUC 및/또는 낮은 B:P를 나타낸다. 일부 구체예에서, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물을 제공하며, 상기 화합물은 마우스에 10 mg/kg으로 po 투여시 <1μM (1μM 미만)의 핵 외수송 활성, 약 3500 초과의 AUCInf; 및 약 2.5 미만의 B:P를 지닌다.
본 발명의 신규한 특징은 본 발명의 하기 상세한 설명의 검토시에 당업자에게 자명해질 것이다. 그러나, 본 발명의 상세한 설명 및 제시된 특수한 실시예는, 본 발명의 특정 구체예를 나타내면서, 단지 예시를 목적으로 제공된 것임이 이해되어야 하는데, 그 이유는 본 발명의 정신 및 범위 내에서 다양한 변경 및 변형이 본 발명의 상세한 설명 및 이어지는 청구범위로부터 당업자에게 자명해질 것이기 때문이다.
화합물 및 정의
본 발명의 화합물은 상기에 일반적으로 기재된 것들을 포함하고, 본원에 기재된 부류, 하위부류 및 종에 의해 추가로 예시된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 하기 정의는 달리 지시되지 않는 한 이용될 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 원소는 원소의 주기율표 (CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.)에 따라 확인된다. 추가로, 유기 화학의 일반적인 원리는 문헌["Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, and "March's Advanced Organic Chemistry", 5th Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001]에 기재되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로서 포함된다.
본 명세서 내에서 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 명명법은 일반적으로 유기 화학의 명명법 (섹션 A, B, C, D, E, F, 및 H, Pergamon Press, Oxford, 1979)에 언급된 실례 및 규칙에 따르며, 상기 문헌은 화학 구조를 명명할 때 이의 예시적인 화학 구조 명칭 및 규칙에 대해 본원에 참조로서 포함된다. 임의로, 화합물의 명칭은 화학 명명 프로그램을 이용하여 생성될 수 있다: ACD/ChemSketch, Version 5.09/September 2001, Advanced Chemistry Development, Inc., Toronto, Canada.
본 발명의 화합물은 비대칭 중심, 카이랄 축 및 카이랄 면을 지닐 수 있고 (예컨대, 문헌[E. L. Eliel and S. H. Wilen, Stereo-chemistry of Carbon 화합물s, John Wiley & Sons, New York, 1994, pages 1119-1190]에 기재됨), 본 발명에 포함되는 광학 이성질체를 포함하여, 모든 가능한 이성질체 및 이의 혼합물과 함께 라세미체, 라세미 혼합물, 및 개개의 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체로서 발생할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "할로" 또는 "할로겐"은 할로겐을 의미하고, 예를 들어, 이로 한정되는 것은 아니지만, 방사성 및 비방사성 형태 둘 모두의 플루오로, 클로로, 브로모, 요오도 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "알킬"은, 달리 지시되지 않는 한, 직쇄 또는 분지된 포화된 일가 탄화수소 라디칼, 전형적으로 C1-C12, 바람직하게는 C1-C6을 의미한다. 이와 같이, "C1-C6 알킬"은 1 내지 6개(예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 탄소 원자를 지니는 직쇄 또는 분지된 포화된 일가 탄화수소 라디칼을 의미한다. 알킬 기의 예는 이로 한정되는 것은 아니지만 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 및 t-부틸을 포함한다.
본 발명의 화합물 상의 치환기 및 치환 패턴은 화학적으로 안정하고 당 분야에 알려진 기법에 의해 용이하게 합성될 수 있는 화합물, 뿐 아니라 하기 기재된 그러한 방법을 제공하기 위해 당업자에 의해 선택될 수 있는 것으로 이해된다. 일반적으로, 용어 "치환된"은, 용어 "임의로"가 선행되든 아니든 간에, 지정된 모이어티의 하나 이상의 수소가 적합한 치환기로 대체된 것을 의미한다. 달리 지시되지 않는 한, "치환되거나 치환되지 않은" 기는 기의 각각의 치환가능한 위치에 적합한 치환기를 지닐 수 있고, 어떠한 주어진 구조에서 하나를 초과하는 위치가 명시된 기로부터 선택된 하나를 초과하는 치환기로 치환될 수 있는 경우, 치환기는 위치마다 동일하거나 상이할 수 있다. 대안적으로, "치환되거나 치환되지 않은" 기는 비치환될 수 있다.
본 발명에 의해 구현된 치환기의 조합은 바람직하게는 안정하거나 화학적으로 실행할 수 있는 화합물의 형성을 발생시키는 것들이다. 치환기가 하나를 초과하는 기로 자체 치환되는 경우, 이러한 다수의 기는 안정한 구조를 발생시키는 한, 동일한 탄소 원자 또는 상이한 탄소 원자 상에 있을 수 있는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 용어 "안정한"은, 화합물의 생산, 검출, 및 특정의 구체예에서, 이들의 회수, 정제 및 본원에 기재된 목적 중 하나 이상을 위한 이용을 허용하는 조건하에 놓일 때, 실질적으로 변경되지 않는 화합물을 의미한다.
"치환되거나 치환되지 않은" 기의 치환가능한 탄소 원자 상의 적합한 일가 치환기는 독립적으로 할로겐; -(CH2)0-4R°; -(CH2)0-4OR-; -O(CH2)0-4R°; -O-(CH2)0-4C(O)OR°; -(CH2)0-4CH(OR°)2; -(CH2)0-4SR°; R°로 치환될 수 있는 -(CH2)0-4Ph; R°로 치환될 수 있는 -(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph; R°로 치환될 수 있는 -CH=CHPh; R°로 치환될 수 있는 -(CH2)0-4O(CH2)0-1-피리딜; -NO2; -CN; -N3; -(CH2)0-4N(R°)2; -(CH2)0-4N(R°)C(O)R°; -N(R°)C(S)R°; -(CH2)0-4N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)C(S)NR°2; -(CH2)0-4N(R°)C(O)OR°; -N(R°)N(R°)C(O)R°; -N(R°)N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)N(R°)C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)R°; -C(S)R°; -(CH2)0-4C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)SR°; -(CH2)0-4C(O)OSiR°3; -(CH2)0-4OC(O)R°; -OC(O)(CH2)0-4SR-, SC(S)SR°; -(CH2)0-4SC(O)R°; -(CH2)0-4C(O)NR°2; -C(S)NR°2; -C(S)SR°; -SC(S)SR°, -(CH2)0-4OC(O)NR°2; -C(O)N(OR°)R°; -C(O)C(O)R°; -C(O)CH2C(O)R°; -C(NOR°)R°; -(CH2)0-4SSR°; -(CH2)0-4S(O)2R°; -(CH2)0-4S(O)2OR°; -(CH2)0-4OS(O)2R°; -S(O)2NR°2; -(CH2)0-4S(O)R°; -N(R-)S(O)2NR°2; -N(R-)S(O)2R°; -N(OR°)R°; -C(NH)NR°2; -P(O)2R°; -P(O)R°2; -OP(O)R°2; -OP(O)(OR°)2; SiR°3; -(C1-4 직쇄 또는 분지된 알킬렌)O-N(R°)2; 또는 -(C1-4 직쇄 또는 분지된 알킬렌)C(O)O-N(R°)2이고, 각각의 R°은 하기 정의된 대로 치환될 수 있고 독립적으로 수소, C1-6 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, -CH2-(5 내지 6원 헤테로아릴 고리), 또는 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 지니는 5 내지 6원 포화된, 부분 불포화된, 또는 아릴 고리이거나, 상기 정의에도 불구하고, R°의 두 독립적인 발생은 그 사이에 있는 원자(들)와 함께 하여 하기 정의된 대로 치환될 수 있는 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 지니는 3-12원 포화된, 부분 불포화된, 또는 아릴 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 고리를 형성한다.
R° (또는 R°의 두 독립적인 발생이 그 사이에 있는 원자들과 함께 하여 형성된 고리) 상의 적합한 일가 치환기는 독립적으로 할로겐, -(CH2)0-2R
Figure 112020104886621-pat00006
, -(할로R
Figure 112020104886621-pat00007
), -(CH2)0-2OH, -(CH2)0-2OR
Figure 112020104886621-pat00008
, -(CH2)0-2CH(OR
Figure 112020104886621-pat00009
)2; -O(할로R
Figure 112020104886621-pat00010
), -CN, -N3, -(CH2)0-2C(O)R
Figure 112020104886621-pat00011
, -(CH2)0-2C(O)OH, -(CH2)0-2C(O)OR
Figure 112020104886621-pat00012
, -(CH2)0-2SR
Figure 112020104886621-pat00013
, -(CH2)0-2SH, -(CH2)0-2NH2, -(CH2)0-2NHR
Figure 112020104886621-pat00014
, -(CH2)0-2NR
Figure 112020104886621-pat00015
2, -NO2, -SiR
Figure 112020104886621-pat00016
3, -OSiR
Figure 112020104886621-pat00017
3, -C(O)SR
Figure 112020104886621-pat00018
, -(C1-4 직쇄 또는 분지된 알킬렌)C(O)OR
Figure 112020104886621-pat00019
, 또는 -SSR
Figure 112020104886621-pat00020
이고, 각각의 R
Figure 112020104886621-pat00021
은 비치환되거나 "할로"가 선행하는 경우, 단지 하나 이상의 할로겐으로만 치환되며, C1-4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 지니는 5 내지 6원 포화된, 부분 불포화된, 또는 아릴 고리로부터 독립적으로 선택된다. R°의 포화된 탄소 원자 상의 적합한 이가 치환기는 =O 및 =S를 포함한다.
"치환되거나 치환되지 않은" 기의 포화된 탄소 원자 상의 적합한 이가 치환기는 =O, =S, =NNR* 2, =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)2R*, =NR*, =NOR*, -O(C(R* 2))2-3O-, 및 -S(C(R* 2))2-3S-를 포함하고, R*의 각각의 독립적인 발생은 수소, 하기 정의된 대로 치환될 수 있는 C1-6 지방족, 또는 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 지니는 비치환된 5 내지 6원 포화된, 부분 불포화된, 또는 아릴 고리로부터 선택된다. "치환되거나 치환되지 않은" 기에 인접한 치환가능한 탄소에 결합된 적합한 이가 치환기는 -O(CR* 2)2-3O-를 포함한다 (이 때 R*의 각각의 독립적인 발생은 수소, 하기 정의된 바와 같이 치환될 수 있는 C1-6 지방족, 또는 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 지니는 비치환된 5 내지 6원 포화된, 부분 불포화된, 또는 아릴 고리로부터 선택된다).
R*의 지방족 기 상의 적합한 치환기는 할로겐, -R
Figure 112020104886621-pat00022
, -(할로R
Figure 112020104886621-pat00023
), -OH, -OR
Figure 112020104886621-pat00024
, -O(할로R
Figure 112020104886621-pat00025
), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR
Figure 112020104886621-pat00026
, -NH2, -NHR
Figure 112020104886621-pat00027
, -NR
Figure 112020104886621-pat00028
2, 및 -NO2를 포함하고, 각각의 R
Figure 112020104886621-pat00029
은 비치환되거나 "할로"가 선행하는 경우, 단지 하나 이상의 할로겐으로만 치환되며, 독립적으로 C1-4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 지니는 5 내지 6원 포화된, 부분 불포화된, 또는 아릴 고리이다.
"치환되거나 치환되지 않은" 기의 치환가능한 질소 상의 적합한 치환기는 -R†, -NR† 2, -C(O)R†, -C(O)OR†, -C(O)C(O)R†, -C(O)CH2C(O)R†, -S(O)2R†, -S(O)2NR† 2, -C(S)NR† 2, -C(NH)NR† 2, 및 -N(R†)S(O)2R†을 포함하고; 각각의 R†은 독립적으로 수소, 하기 정의된 대로 치환될 수 있는 C1-6 지방족, 비치환된 -OPh, 또는 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 지니는 비치환된 5 내지 6원 포화된, 부분 불포화된, 또는 아릴 고리이거나, 상기 정의에도 불구하고, R†의 두 독립적인 발생은 그 사이에 있는 원자(들)와 함께 하여 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 지니는 비치환된 3-12원 포화된, 부분 불포화된, 또는 아릴 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 고리를 형성한다.
R†의 지방족 기 상의 적합한 치환기는 독립적으로 할로겐, -R
Figure 112020104886621-pat00030
, -(할로R
Figure 112020104886621-pat00031
), -OH, -OR
Figure 112020104886621-pat00032
, -O(할로R
Figure 112020104886621-pat00033
), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR
Figure 112020104886621-pat00034
, -NH2, -NHR
Figure 112020104886621-pat00035
, -NR
Figure 112020104886621-pat00036
2, 또는 NO2이고, 각각의 R
Figure 112020104886621-pat00037
은 비치환되거나 "할로"가 선행하는 경우, 단지 하나 이상의 할로겐으로만 치환되며, 독립적으로 1-4 지방족, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, 또는 질소, 산소, 및 황으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 4개의 헤테로원자를 지니는 5 내지 6원 포화된, 부분 불포화된, 또는 아릴 고리이다.
헤테로아릴 상의 바람직한 치환기는 -OH, -SH, 니트로, 할로겐, 아미노, 시아노, C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕시, C1-C12 할로알킬, C1-C12 할로알콕시 및 C1-C12 알킬 설파닐로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 알킬, 알킬렌 및 헤테로사이클릴 상의 바람직한 치환기는 헤테로아릴 및 옥소 상의 바람직한 치환기를 포함한다. 한 구체예에서, 알킬, 알킬렌, 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴 상의 치환기는 화학식 -N(R5)2를 지니는 아미노 기이고, 여기서 각각의 R5는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
알킬, 알킬렌, 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴 상의 치환기는 -OH, -SH, 니트로, 할로겐, 아미노, 시아노, C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐 기, C1-C12 알콕시, C1-C12 할로알킬, C1-C12 할로알콕시 및 C1-C12 알킬 설파닐로부터 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 치환기는 화학식 -N(R5)2를 지니는 아미노 기이고, 여기서 각각의 R5는 수소 및 C1-C4 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
본원에서 사용되는 용어 "사이클로알킬"은 포화된 사이클릭 탄화수소, 즉 모든 고리 원자가 탄소인 화합물을 의미한다. 사이클로알킬의 예는 이로 한정되는 것은 아니지만 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 및 사이클로헵틸을 포함한다. 일부 구체예에서, 사이클로알킬은 -OH, -SH, 할로겐, 아미노, 니트로, 시아노, C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐 또는 C2-C12 알키닐 기, C1-C12 알콕시, C1-C12 할로알킬, 및 C1-C12 할로알콕시로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "헤테로아릴"은 하나 이상의 헤테로원자 (O, S, 또는 N)를 함유하는 방향족 기이다. 헤테로아릴 기는 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭, 예컨대 하나 이상의 카르보사이클릭 방향족 기 또는 그 밖의 모노사이클릭 헤테로아릴 기에 융합된 모노사이클릭 헤테로아릴 고리이다. 본 발명의 헤테로아릴 기는 또한 하나 이상의 옥소 모이어티로 치환된 고리 시스템을 포함할 수 있다. 헤테로아릴 기의 예는 이로 한정되는 것은 아니지만 피리디닐, 피리다지닐, 이미다졸릴, 피리미디닐, 피라졸릴, 트리아졸릴, 피라지닐, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 테트라졸릴, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 신놀리닐, 인다졸릴, 인돌리지닐, 프탈라지닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 이소인돌릴, 퓨리닐, 옥사디아졸릴, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 푸라자닐, 벤조푸라자닐, 벤조티오페닐, 벤조트리아졸릴, 벤조티아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 나프티리디닐, 디하이드로퀴놀릴, 테트라하이드로퀴놀릴, 디하이드로이소퀴놀릴, 테트라하이드로이소퀴놀릴, 벤조푸릴, 푸로피리디닐, 피롤로피리미디닐, 및 아자인돌릴을 포함한다.
상기 헤테로아릴 기는 C-부착되거나 N-부착될 수 있다 (그것이 가능한 경우). 예를 들어, 피롤에서 유래된 기는 피롤-1-일 (N-부착됨) 또는 피롤-3-일 (C-부착됨)일 수 있다.
"헤테로사이클릴"은 N, O 또는 S로부터 독립적으로 선택된 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 헤테로원자를 함유하는 포화되거나 불포화된 사이클릭 4-13원 지방족 고리를 의미한다. 하나의 헤테로원자가 S일 때, 이것은 임의로 모노- 또는 디-산소화될 수 있다(즉, -S(O)- 또는 -S(O)2-). 헤테로사이클릴은 모노사이클릭, 융합된 바이사이클릭, 브릿징된 바이사이클릭, 스피로 바이사이클릭 또는 폴리사이클릭일 수 있다.
"Oxo"는 =O를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "알케닐"은 2개 내지 12개의 탄소 원자를 지니고 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 지니는 포화된 직쇄 또는 분지된 비-사이클릭 탄화수소를 의미한다. 알케닐 기는 임의로 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "알키닐"은 2개 내지 12개의 탄소 원자를 지니고 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 지니는 포화된 직쇄 또는 분지된 비-사이클릭 탄화수소를 의미한다. 알키닐 기는 임의로 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "알킬렌"은 화합물의 나머지에 대해 2개의 부착점을 갖는 알킬을 지칭한다. 알킬렌 기의 비제한적인 예는 메틸렌 (-CH2-), 에틸렌 (-CH2CH2-), n-프로필렌 (-CH2CH2CH2-), 이소프로필렌 (-CH2CH(CH3)-) 등을 포함한다. 알킬렌 기는 임의로 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "할로알킬"은 하나 이상의 F, Cl, Br, 또는 I로 치환된 알킬을 포함하고, 여기서 알킬은 상기 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "알콕시"는 "알킬-O-" 기를 의미하고, 여기서 알킬은 상기 정의된다. 알콕시 기의 예는 메톡시 또는 에톡시 기를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 믿을 만한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 타당한 이익/위험 비로 균형잡힌 그러한 염을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 염은 당 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 본원에 참조로서 포함된 문헌[J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19]에서 약제학적으로 허용되는 염을 기재하고 있다. 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 적합한 무기 및 유기산 및 염기로부터 유래되는 것들을 포함한다.
약제학적으로 허용되는 무독성 산 부가염의 예는 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 트리플루오로아세트산 (2,2,2-트리플루오로아세트산), 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산으로 형성되거나 이온 교환과 같이 당 분야에서 이용되는 다른 방법에 의해 형성된 아미노 기의 염이다. 그 밖의 약제학적으로 허용되는 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토바이오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 트리플루오로아세테이트 (2,2,2-트리플루오로아세테이트), 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다.
적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속, 알칼리토금속, 암모늄 및 N+(C1-4알킬)4 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리토금속 염은 소듐, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가로, 약제학적으로 허용되는 염은 적절한 경우, 무독성 암모늄, 사차 암모늄, 및 할라이드, 하이드록사이드, 카르복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급 알킬 설포네이트 및 아릴 설포네이트와 같은 반대이온을 이용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에 묘사된 구조는 또한 구조의 모든 이성질체 (예컨대, 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 및 기하 (또는 형태)) 형태; 예를 들어, 각각의 비대칭 중심에 대한 R 및 S 배열, Z 및 E 이중 결합 이성질체, 및 Z 및 E 형태 이성질체를 포함하도록 의도된다. 따라서, 본 발명의 화합물의 단일한 입체화학적 이성질체뿐 아니라 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 및 기하 (또는 형태) 혼합물이 본 발명의 범위 내에 있다. 달리 언급되지 않는 한, 본 발명의 화합물의 모든 호변이성질체 형태가 본 발명의 범위 내에 있다. 추가로, 달리 언급되지 않는 한, 본원에 묘사된 구조는 또한 하나 이상의 동위원소적으로 풍부한 원자의 존재에서만 상이한 화합물을 포함하고자 한다. 예를 들어, 수소를 중수소 또는 삼중수소로 대체하거나, 탄소를 13C- 또는 14C-풍부화 탄소로 대체시킨 것을 포함하는 본 발명의 구조를 지닌 화합물이 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 화합물은, 예를 들어, 분석 툴로서, 생물학적 검정에서 프로브로서, 또는 본 발명에 따른 치료제로서 유용하다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 환자의 치료와 상용가능한 산 부가염 또는 염기 부가염을 의미한다.
일부 구체예에서, 적합한 염을 형성하는 예시적인 무기산은 이로 한정되는 것은 아니지만 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산 및 산금속염, 예컨대 소듐 모노하이드로겐 오르토포스페이트 및 포타슘 하이드로겐 설페이트를 포함한다. 염을 형성하는 예시적인 유기산은 모노-, 디- 및 트리카르복실산을 포함한다. 상기 산의 예는, 예를 들어, 아세트산, 트리플루오로아세트산 (2,2,2-트리플루오로아세트산), 글리콜산, 락트산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 하이드록시말레산, 벤조산, 하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 신남산, 살리실산, 2-페녹시벤조산, p-톨루엔설폰산 및 그 밖의 설폰산, 예컨대 메탄설폰산 및 2-하이드록시에탄설폰산이다. 1산 또는 2산염이 형성될 수 있고, 그러한 염은 수화되거나, 용매화되거나 실질적으로 무수 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 이러한 화합물의 산 부가염은 물과 다양한 친수성 유기 용매에서 보다 용해성이고, 일반적으로 이들의 유리 염기 형태에 비해 높은 용융점을 나타낸다. 그 밖의 약제학적으로 허용되지 않는 염, 예컨대, 옥살레이트가, 예를 들어 실험실 용으로, 또는 약제학적으로 허용되는 산 부가염으로의 후속 전환을 위한 화학식 (I)의 화합물의 분리에 이용될 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 염기 부가염"은 화학식(I)로 표시되는 산 화합물, 또는 이의 임의의 중간체의 어떠한 무독성 유기 또는 무기 염기 부가염이다. 적합한 염을 형성하는 예시적인 무기 염기는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 리튬, 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 또는 바륨 하이드록사이드를 포함한다. 적합한 염을 형성하는 예시적인 유기 염기는 지방족, 지방족고리 또는 방향족 유기 아민, 예컨대 메틸아민, 트리메틸 아민 및 피콜린 또는 암모니아를 포함한다. 적절한 염의 선택은, 만약 있다면 분자의 다른 곳에 있는 에스테르 작용기가 가수분해되지 않도록 하기 위해서 중요할 수 있다. 적절한 염에 대한 선택 기준은 당업자에게 알려져 있을 것이다.
화학식 (I)의 화합물의 산 부가염은 가장 적합하게는 약제학적으로 허용되는 산으로부터 형성되고, 예를 들어 무기산, 예컨대 염산, 황산 또는 인산 및 유기산, 예컨대 숙신산, 말레산, 아세트산, 트리플루오로아세트산 또는 푸마르산으로 형성된 것들을 포함한다. 그 밖의 약제학적으로 허용되지 않는 염, 예컨대, 옥살레이트가, 예를 들어 실험실 용으로, 또는 약제학적으로 허용되는 산 부가염으로의 후속 전환을 위한 화학식 (I)의 화합물의 분리에 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 화합물의 염기 부가염 (예컨대 소듐, 포타슘 및 암모늄 염), 용매화물 및 수화물이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 주어진 화합물 염의 요망되는 화합물 염으로의 전환은 당업자에게 널리 공지된 표준 기법을 이용하여 달성된다.
용어 "입체이성질체"는 공간에서의 이들의 원자의 배향만이 상이한 개개 분자의 모든 이성질체에 대한 일반적인 용어이다. 이는 거울 상 이성질체 (거울상이성질체), 기하 (시스/트랜스) 이성질체 및 서로 거울 상이 아닌 하나를 초과하는 카이랄 중심을 지닌 화합물의 이성질체 (부분입체이성질체)를 포함한다.
용어 "치료하다" 또는 "치료하는"은 징후를 완화시키거나, 일시적이거나 영구적으로 징후의 원인을 제거하거나, 명명된 질병 또는 질환의 징후의 출현을 예방하거나 느리게 하는 것을 의미한다.
용어 "치료적 유효량"은 질병 또는 질환의 하나 이상의 징후의 중증도를 감소시키거나 치료하기에 효과적인 화합물의 양을 의미한다.
본원에 기재된 요소들을 도입시킬 때, 단수 형태 및 "상기"는 하나 이상의 요소가 존재함을 의미하고자 한다. 용어 "포함하는" 및 "지니는"은 제약을 두지 않음을 의도하며, 나열된 요소 이외의 추가 요소가 존재할 수 있음을 의미한다.
용도, 제형 및 투여
약학적으로 허용되는 조성물
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트, 또는 비히클을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물 중 화합물의 양은 생물학적 샘플 또는 환자에서 CRM1을 측정할 수 있을 만큼 억제하기에 효과적인 양이다. 특정의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 조성물을 필요로 하는 환자로의 투여를 위해 제형화된다. 본원에서 사용되는 용어 "환자"는 동물을 의미한다. 일부 구체예에서, 동물은 포유동물이다. 특정의 구체예에서, 환자는 수의학적 환자이다 (즉, 인간이 아닌 포유동물 환자). 일부 구체예에서, 환자는 개이다. 다른 구체예에서, 환자는 인간이다.
용어 "약제학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트, 또는 비히클"은 이것과 함께 제형화되는 화합물의 약리학적 활성을 파괴하지 않는 무독성 담체, 애쥬번트, 또는 비히클을 의미한다. 본 발명의 조성물에 이용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트 또는 비히클은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 이온 교환기, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 완충 물질, 에컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 포타슘 소르베이트, 포화된 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대, 프로타민 설페이트, 디소듐 하이드로겐 포스페이트, 포타슘 하이드로겐 포스페이트, 소듐 클로라이드, 아연 염, 콜로이드 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지를 포함한다.
본 발명의 조성물은 경구로, 비경구로 (피하, 근내, 정맥내 및 피내 포함), 흡입 스프레이에 의해, 국소적으로, 직장으로, 비내로, 구강으로, 질내로 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 제공된 화합물 또는 조성물은 정맥내 및/또는 복강내로 투여가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근내, 안내, 유리체내, 관절내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 간장내, 복강내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기법을 포함한다. 바람직하게는, 조성물은 경구, 피하, 복강내 또는 정맥내 투여된다. 본 발명의 조성물의 주입가능한 멸균 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이러한 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 이용하여 당 분야에 공지된 기법을 이용하여 제형화될 수 있다. 주입가능한 멸균 형태는 또한, 예를 들어 1,3-부탄디올 중의 용액과 같이, 비경구적으로 허용되는 무독성 희석제 또는 용매 중의 주입가능한 멸균 용액 또는 현탁액일 수 있다. 이용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 소듐 클로라이드 용액이 있다. 또한, 멸균 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 이용된다.
본 발명의 약제학적으로 허용되는 조성물은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 캡슐, 정제, 수성 현탁액, 또는 용액을 포함하는 임의의 경구 허용되는 투여 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구 이용을 위한 정제의 경우에, 일반적으로 이용되는 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트가 또한 통상적으로 첨가된다. 캡슐 형태로의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토스 및 건조된 옥수수 전분을 포함한다. 경구 이용을 위해 수성 현탁액이 요구되는 경우, 활성 성분은 에멀젼화제 및 현탁제와 조합된다. 요망되는 경우, 특정 감미제, 풍미제 또는 착색제가 또한 첨가될 수 있다. 일부 구체예에서, 제공되는 경구 제형은 즉방출 또는 지속/지연된 방출을 위해 제형화된다. 일부 구체예에서, 정제, 로젠지 및 향정을 포함하는 조성물은 협측 또는 설하 투여에 적합하다. 마이크로-캡슐화된 형태의 화합물이 또한 제공될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 약제학적으로 허용되는 조성물은 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적으로 허용되는 조성물은 또한, 특히 치료의 표적이 국소 적용에 의해 용이하게 접근가능한 부위 또는 기관을 포함할 때, 국소적으로 투여될 수 있으며, 눈, 피부 또는 하부 장관의 질환을 포함한다. 적합한 국소 제형은 이들 부위 또는 기관의 각각을 위해서 용이하게 제조된다.
하부 장관용 국소 투여는 직장 좌제 제형 (상기 참조) 또는 적합한 관장 제형으로 수행될 수 있다. 국소-경피 패치도 이용될 수 있다.
안과 사용을 위해, 제공되는 약제학적으로 허용되는 조성물은 마이크론화된 현탁액으로서 또는 페트롤라툼과 같은 연고로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약제학적으로 허용되는 조성물은 또한 코 에어로졸 또는 흡입에 의해서 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 약제학적으로 허용되는 조성물은 복강내 투여용으로 제형화된다.
담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태의 조성물을 생성시킬 수 있는 본 발명의 화합물의 양은 치료하고자 하는 호스트(host), 특정의 투여 방식에 따라서 다양할 것이다. 한 구체예에서, 제공되는 조성물은 0.01 내지 100 mg/체중kg/일(day)의 억제제의 투여량이 이러한 조성물을 투여받는 환자에게 투여될 수 있도록 제형화되어야 한다. 또 다른 구체예에서, 투여량은 4 내지 120시간마다, 또는 특정 약물의 요건에 따라서, 약 0.5 내지 약 100 mg/체중kg, 또는 1 mg 내지 1000 mg/용량이다. 전형적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 매일 약 1 내지 약 6회 투여될 것이다.
어떠한 특정의 환자에 대한 특정의 투여량 및 치료 요법은 사용되는 특정의 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식사, 투여 시간, 배설률, 약물 조합, 및 치료하는 의사의 판단 및 치료되는 특정의 질환의 중증도를 포함한 다양한 인자에 좌우될 것이다. 조성물 중의 본 발명의 화합물의 양은 또한 조성물 중의 특정 화합물에 좌우될 것이다.
환자의 상태 개선시, 필요한 경우, 본 발명의 화합물, 조성물 또는 조합물의 유지량을 투여할 수 있다. 후속하여, 투여량 또는 투여 빈도, 또는 둘 모두는 징후가 요망되는 수준으로 경감되었을 때 개선된 상태가 유지되는 수준으로 징후의 함수로서 감소될 수 있다. 그러나, 환자는 질환 징후의 임의의 재발시에 장기간 기준으로 간헐적 치료를 요구할 수 있다.
화합물 및 약제학적으로 허용되는 조성물의 용도
본원에 기재된 화합물 및 조성물은 CRM1의 억제에 일반적으로 유용하므로, CRM1의 활성과 연관된 하나 이상의 질병의 치료에 유용하다. 따라서, 특정의 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CRM1-매개 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 또한 하기 본원에 기재된 것들을 포함하는 다양한 질병을 치료, 예방, 및/또는 진단하기 위해, 배양 중인 세포, 예컨대 시험관내 또는 생체외, 또는 피검체, 예컨대, 생체내에 투여될 수 있다.
본 발명에서 이용되는 화합물의 CRM1의 억제제로서의 활성은 시험관내, 생체내 또는 세포주에서 검정될 수 있다. CRM1의 억제제로서 본 발명에서 이용되는 화합물을 검정하기 위한 상세한 조건은 하기 실시예에 개시되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "CRM1-매개" 질병 또는 병태는 CRM1이 역할을 담당하는 것으로 공지된 임의의 질환 또는 그 밖의 유해한 병태를 의미한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예는 CRM1이 역할을 담당하는 것으로 공지된 하나 이상의 질환을 치료하거나 그 중증도를 감소시키는 것에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본원에 기재된 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 피검체에서 p53, p73, p21, pRB, p27, IκB, NFκB, c-Abl, FOXO 단백질, COX-2, 또는 HDAC (히스톤 데아세틸라제)의 발현 또는 활성과 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 증식성 질병 (예컨대, 암), 또는 염증성 질병, 자가면역 질병, 바이러스 감염, 안과 질환 또는 신경변성 질환으로부터 선택되는 질환 또는 병태를 치료하거나 그 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 방법은 본 발명에 따른 화합물 또는 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 보다 특수한 구체예에서, 본 발명은 암을 치료하거나 그 중증도를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 상기 질병의 특수한 예는 하기에 상세히 개시된다.
본 발명의 화합물에 의해 치료가능한 암은 이로 한정되는 것은 아니지만 혈액 악성종양 (백혈병, 림프종, 다발성 골수종을 포함하는 골수종, 골수이형성증 및 골수증식성 증후군) 및 고형 종양 (전립선, 유방, 폐, 결장, 췌장, 신장, 난소뿐만 아니라 연조직 및 골육종과 같은 암종, 및 기질 종양)을 포함한다. 유방암(BC)은 기저양 유방암(Basal-like breast cancer)(BLBC), 삼중음성유방암(TNBC) 및 BLBC와 TNBC 둘 모두인 유방암을 포함할 수 있다. 또한, 유방암은 침습적 또는 비침습적 관상 또는 소엽 암종, 유방의 관, 수질, 점액, 유두, 체모양 암종, 남성 유방암, 재발성 또는 전이성 유방암, 유방의 엽상 종양, 및 유두의 파제트병을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물에 의해 치료가능한 염증성 질병은 이로 한정되는 것은 아니지만 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절 질환, 전신 루푸스, 전신 경화증, 혈관염 증후군 (소, 중 및 대혈관), 죽상경화증, 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 크론병, 점액 대장염, 궤양 대장염, 위염, 패혈증, 건선 및 다른 피부과 염증 질병 (예컨대, 습진, 아토피 피부염, 접촉 피부염, 두드러기, 경피증, 및 급성 염증성 성분, 천포창, 유천포창, 알레르기 피부염을 동반한 피부병), 및 두드러기 증후군을 포함한다.
본 발명의 화합물에 의해 치료가능한 바이러스 질환은 이로 한정되는 것은 아니지만 급성 열성 인두염, 인두결막열(pharyngoconjunctival fever), 유행성 각막결막염(epidemic keratoconjunctivitis), 유아위장관염(infantile gastroenteritis), 콕사키 바이러스 감염(Coxsackie infections), 전염단핵구증(infectious mononucleosis), 버킷 림프종, 급성 간염, 만성 간염, 간경화증(hepatic cirrhosis), 간세포 암종, 원발성 HSV-1 감염증(예컨대, 소아에서의 헤르페스잇몸구내염(gingivostomatitis), 성인에서의 편도염(tonsillitis) 및 인두염(pharyngitis), 각막결막염(keratoconjunctivitis)), 잠재성 HSV-1 감염증(예컨대, 입술헤르페스(herpes labialis) 및 입술물집(cold sores)), 원발성 HSV-2 감염증, 잠재성 HSV-2 감염증, 무균수막염(aseptic meningitis), 전염단핵구증(infectious mononucleosis), 거대세포포함병(Cytomegalic inclusion disease), 카포시 육종, 다중심 캐슬만병(multicentric Castleman disease), 원발성 삼출 림프종, AIDS, 인플루엔자, 라이 증후군(Reye syndrome), 홍역(measles), 감염후 뇌척수염(postinfectious encephalomyelitis), 볼거리(Mumps), 과다형성 상피 병변(hyperplastic epithelial lesions)(예컨대, 보통 사마귀, 편평 사마귀, 발바닥 사마귀 및 항문 성기 사마귀, 후두 유두종(laryngeal papillomas), 사마귀표피형성이상(epidermodysplasia verruciformis)), 자궁경부 암종, 편평 세포 암종, 크룹(croup), 폐렴(pneumonia), 기관지염(bronchiolitis), 감기(common cold), 회색질척수염(Poliomyelitis), 광견병(Rabies), 인플루엔자-유사 증후군(influenza-like syndrome), 폐렴을 동반한 중증 기관지염(severe bronchiolitis with pneumonia), 풍진(German measles), 선천풍진(congenital rubella), 수두(Varicella), 및 대상 포진을 포함한다. 본 발명의 화합물에 의해 치료가능한 바이러스 질환은 또한 B형 간염 및 C형 간염을 포함하는 만성 바이러스 감염을 포함한다.
예시적인 안과 질병은 이로 한정되는 것은 아니지만 황반 부종(macular edema)(당뇨병성 및 비당뇨병성 황반부종), 삼출성 및 건조한 형태의 연령 관련된 황반 변성, 연령 관련된 디스크모양 황반변성(aged disciform macular degeneration), 낭포황반부종(cystoid macular edema), 눈꺼풀 부종(palpebral edema), 망막 부종(retina edema), 당뇨병성 망막병(diabetic retinopathy), 맥락망막병(chorioretinopathy), 신생혈관황반병(neovascular maculopathy), 신생혈관녹내장(neovascular glaucoma), 포도막염(uveitis), 홍채염(iritis), 망막혈관염(retinal vasculitis), 안구내염(endophthalmitis), 범안구염(panophthalmitis), 전이성 안염, 맥락막염 (choroiditis), 망막색소상피염(retinal pigment epithelitis), 결막염(conjunctivitis), 섬모체염(cyclitis), 공막염(scleritis), 공막바깥염(episcleritis), 시신경염(optic neuritis), 숨뇌뒤 시신경염(retrobulbar optic neuritis), 각막염(keratitis), 눈꺼풀염(blepharitis), 삼출성 망막 박리(exudative retinal detachment), 각막궤양(corneal ulcer), 결막 궤양(conjunctival ulcer), 만성 동전각막염, 저산소증 또는 허혈과 관련된 안과 질환, 미숙아망막병증(retinopathy of prematurity), 증식당뇨망막병(proliferative diabetic retinopathy), 결절맥락막혈관병증(polypoidal choroidal vasculopathy), 망막 혈관종성 증식(retinal angiomatous proliferation), 망막 동맥 폐쇄(retinal artery occlusion), 망막 정맥 폐쇄(retinal vein occlusion), 코우츠병(Coats' disease), 가족성삼출유리체망막병증(familial exudative vitreoretinopathy), 무맥박병(pulseless disease)(다카야스병(Takayasu's disease)), 일스병(Eales disease), 항인지질항체 증후군(antiphospholipid antibody syndrome), 백혈병망막병증(leukemic retinopathy), 혈액 과다점성 증후군(blood hyperviscosity syndrome), 고분자글로불린혈증(macroglobulinemia), 인터페론-관련된 망막병증(interferon-associated retinopathy), 고혈압 망막병증(hypertensive retinopathy), 방사선망막병증(radiation retinopathy), 각막 상피 줄기세포 결핍 및 백내장을 포함한다.
화학식 (I)의 화합물에 의해 치료가능한 신경변성 질환은 이로 한정되는 것은 아니지만 파킨슨병, 알츠하이머병 및 헌팅톤병 및 근육위축가쪽경화증 (ALS/루게릭병(Lou Gehrig's Disease))을 포함한다.
본원에 기재된 화합물 및 조성물은 또한 확장성 심근병증(dilative cardiomyopathy), 비대심장근육병증(hypertrophic cardiomyopathy), 제한심장근육병증(restrictive cardiomyopathy), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 간섬유증(hepatic fibrosis), 사구체신염(glomerulonephritis), 다낭성 신장 질환(polycystic kidney disorder, PKD) 및 그 밖의 신장 장애를 포함하는 비정상적인 조직 성장 및 섬유증의 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 화합물 및 조성물은 또한 비만(obesity) 및 과식증(hyperphagia)과 같은 섭식과 관련된 질병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 천식, 기관지염, 폐섬유증, 알레르기성 비염, 산소독성(oxygen toxicity), 폐공기증(emphysema), 만성 기관지염, 급성 호흡곤란증후군, 및 어떠한 만성 폐쇄폐병(COPD)을 포함하는 알레르기 및 호흡기 질병을 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, CRM1 활성과 관련된 질병 또는 병태는 근육 퇴행위축, 관절염, 예를 들어, 골관절염 및 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 패혈증, 류마티스 질환, 암 동맥경화증, 타입 1 당뇨병, 타입 2 당뇨병, 렙토스피라증(leptospiriosis) 신장 질환, 녹내장, 망막 질환, 노화, 두통, 통증, 복합 부위 통증 증후군, 심장 비대, 근위축(musclewasting), 이화 장애, 비만, 태아 성장 지연, 고콜레스테롤혈증, 심장병, 만성 심부전, 허혈/재관류, 뇌졸중, 뇌동맥류, 협심증, 폐 질환, 낭포성 섬유증, 산-유도 폐손상, 폐동맥 고혈압, 천식, 만성폐쇄폐질환, 쇼그렌 증후군, 유리질막병(hyaline membrane disease), 신장 질환, 사구체 질환, 알코올성 간 질환, 창자 질환, 복막 자궁내막증, 피부 질환, 코 부비동염, 중피종, 안하이드로틱 에코더멀(anhidrotic ecodermal) 이형성증-ID, 베체트병, 색소실조증, 결핵, 천식, 크론병, 대장염, 눈 알레르기, 맹장염, 파제트병, 췌장염, 치주염, 자궁내막증, 염증성 장 질환, 염증성 폐 질환, 실리카-유도된 질환, 수면 무호흡, AIDS, HIV-1, 자가면역 질환, 항인지질 증후군, 루푸스, 루푸스 신염, 가족성 지중해열, 유전성 주기적인 발열 증후군, 정신사회적 스트레스 질환, 신경병리학적 질환, 가족성 아밀로이드 다발신경병증, 염증성 신경병증, 파킨슨병, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 근육위축가쪽경화증, 헌팅톤병, 백내장 또는 청력 손실이다.
그 밖의 구체예에서, CRM1 활성과 관련된 질병 또는 병태는 머리 부상, 포도막염, 염증성 통증, 알레르겐 유도된 천식, 알레르겐 유도되지 않은 천식, 사구체신염, 궤양 대장염, 괴사성 장염, 재발성 발열을 갖는 고면역글로불린혈증 D, TNF 수용체 관련 주기성 증후군 (TRAPS), 크라이오피린-관련 주기성 증후군, 머클-웰스 증후군 (두드러기 난청 아밀로이드증), 가족성 한냉 두드러기, 신생아 발병 다발적 염증 질환(neonatal onset multisystem inflammatory disease)(NOMID), 주기적인 발열, 아프타 구내염, 인두염 및 선염 (PFAPA 증후군), Blau 증후군, 화농성 무균 관절염, 괴저고름피부증, 여드름 (PAPA), 인터루킨-1-수용체 길항체의 결핍 (DIRA), 지주막하 출혈, 다낭성 신장 질환, 이식, 장기 이식, 조직 이식, 골수형성이상 증후군, 자극제-유도된 염증, 식물 자극제-유도된 염증, 덩굴 옻나무/우루시올 오일-유도된 염증, 화학 자극제-유도된 염증, 벌침-유도된 염증, 곤충 자상-유도된 염증, 일광화상, 화상, 피부염, 내독소혈증, 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군, 알코올성 간염, 또는 기생충 감염에 의해 야기된 신장 손상이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 피검체에서 p53, p73, p21, pRB, p27, IκB, NFκB, c-Abl, FOXO 단백질, COX-2 또는 HDAC의 발현 또는 활성과 관련된 질환을 치료하는 약제의 제조에서의 화학식 (I)의 화합물의 용도를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 암 및/또는 신생물 질환, 혈관신생, 자가면역 질환, 염증성 질환 및/또는 질병, 후생유전학, 호르몬 장애 및/또는 질환, 바이러스성 질환, 신경변성 질환 및/또는 질병, 상처, 및 안과 질환 중 어느 것을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 화학식 (I)의 화합물의 용도를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 생물학적 샘플을 화학식 (I)의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염 또는 이의 약제학적으로 허용되는 조성물과 접촉시키거나, 이를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 CRM1을 억제하는 방법을 제공한다.
신생물 질환
본원에 기재된 화합물 또는 조성물은 신생물 질환을 치료하는데 이용될 수 있다. "신생물 질환"은 자율적 성장 또는 복제능을 지니는 세포를 특징으로 하는 질환 또는 질병, 예컨대, 증식성 세포 성장을 특징으로 하는 비정상 상태 또는 병태이다. 예시적인 신생물 질환은 암종, 육종, 전이성 질환, 예를 들어, 전립선, 뇌, 뼈, 결장, 폐, 유방, 난소 및 간 기원에서 발생한 종양, 조혈 신생물 질환, 예를 들어, 백혈병, 림프종, 골수종 및 그 밖의 악성 형질 세포 질환, 및 전이성 종양을 포함한다. 유행하는 암은 유방암, 전립선암, 결장암, 폐암, 간암 및 췌장암을 포함한다. 화합물을 이용한 치료는 신생물 질환의 적어도 하나의 징후를 개선시키기에 효과적인 양으로 될 수 있고, 상기 개선은 예컨대, 감소된 세포 증식, 감소된 종양 질량 등이다.
개시된 방법은, 예를 들어, 고형 종양, 연조직 종양 및 이들의 전이뿐만 아니라, 리-프라우메니 증후군(Li Fraumeni Syndrome), 가족성 유방-난소 암(Familial Breast-Ovarian Cancer)(BRCA1 또는 BRAC2 돌연변이) 증후군 및 그 밖의 증후군을 포함한 암의 예방 및 치료에 유용하다. 개시된 방법은 비-고형 암을 치료하는데 또한 유용한다. 예시적인 고형 종양은 다양한 기관계, 예컨대 폐, 유방, 림프, 위장(예, 결장), 및 비뇨생식(예, 신장, 요로상피, 고환 종양) 관, 인두(pharynx), 전립선, 및 난소의 악성 종양(예, 육종, 선암종 및 암종)을 포함한다. 예시적인 선암종은 결장직장 암, 신장-세포 암, 간암, 폐의 비소세포 암종 및 소장의 암을 포함한다.
내셔널 캔서 인스티튜트(National Cancer Institute)에 의해서 기재된 예시적인 암은 급성 림프모세포성 백혈병(급성 림프모구 백혈병), 성인; 급성 림프모세포성 백혈병, 어린이; 급성 골수성 백혈병, 성인; 부신피질암종(Adrenocortical carcinoma); 부신피질암종, 어린이; AIDS-관련 림프종; AIDS 관련 악성 종양; 항문 암; 소뇌 별아교세포종, 어린이; 대뇌 별아교세포종, 어린이; 간외 담도 암; 방광 암, 어린이; 뼈 암, 뼈육종/악성섬유조직구종; 뇌줄기신경아교종(Brain Stem Glioma), 이린이; 뇌 종양, 성인; 뇌 종양, 뇌줄기신경아교종 어린이; 뇌 종양, 소뇌 별아교세포종, 어린이; 뇌 종양, 대뇌 별아교세포종/악성 교종, 어린이; 뇌종양, 뇌실막세포종, 어린이; 뇌종양, 속질모세포종, 어린이; 뇌종양, 천막상부 원시신경외배엽 종양(Supratentorial Primitive Neuroectodermal Tumor), 어린이; 뇌종양, 시각 경로 및 시상하부 교종, 어린이; 뇌종양, 어린이(그외); 유방암; 유방암 및 임신; 유방암, 어린이; 유방암, 남성; 기관지 샘종/유암종, 어린이; 카르시노이드 종양, 어린이; 카르시노이드 종양, 위장; 암종, 부신피질; 암종, 섬세포; 미공지 원발성의 암종; 중추신경계 림프종, 원발성; 소뇌별아교세포종, 어린이; 대뇌 별아교세포종/악성 교종, 어린이; 소뇌 암; 어린이 암; 만성 림프구 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 만성 골수증식성질환; 건초의 투명 세포 육종; 결장암; 결장직장 암, 어린이; 피부 T-세포 림프종; 자궁내막암(Endometrial Cancer); 뇌실막세포종, 어린이; 상피 암, 난소; 식도 암; 식도 암, 어린이; 가족성 유잉종양(Ewing's Family of Tumor); 두개외 생식세포 종양, 어린이; 고환외 생식세포 종양; 간외 담관 암(Extrahepatic Bile Duct Cancer); 눈 암(Eye Cancer), 안구내 흑색종(Intraocular Melanoma); 눈 암, 망막모세포종(Retinoblastoma); 쓸개암(Gallbladder Cancer); 위(Stomach) 암; 위(Stomach) 암, 어린이; 위장 카르시노이드 종양; 배아세포 종양(Germ Cell Tumor), 두개외, 어린이; 배아세포 종양, 고환외; 배아세포 종양, 난소; 임신 영양막 종양; 교종, 어린이 뇌 배아; 교종, 어린이 시각 경로 및 시상하부; 털모양 세포 백혈병; 두경부암(Head and Neck Cancer); 간세포(간) 암, 성인 (원발성); 간세포(간) 암, 어린이 (원발성); 호지킨 림프종, 성인; 호지킨 림프종, 어린이; 호지킨 림프종 임신중; 하인두암(Hypopharyngeal Cancer); 시상하부 및 시각 경로 교종, 어린이; 안구내 흑색종; 섬세포 암종 (내분비성 췌장); 카포시 육종; 신장 암; 후두 암; 후두 암, 어린이; 백혈병, 급성 림프모구, 성인; 백혈병, 급성 림프모구, 어린이; 백혈병, 급성 골수성, 성인; 백혈병, 급성 골수성, 어린이; 백혈병, 만성 림프구; 백혈병, 만성 골수성; 백혈병, 털모양 세포; 입술 및 구강 암; 간암, 성인 (원발성); 간암, 어린이 (원발성); 폐 암, 비소세포; 폐 암, 소세포; 림프모구 백혈병, 성인 급성; 림프모구 백혈병, 어린이 급성; 림프구 백혈병, 만성; 림프종, AIDS-관련된; 림프종, 중추신경계 (원발성); 림프종, 피부 T-세포; 림프종, 호지킨, 성인; 림프종, 호지킨, 어린이; 림프종, 호지킨 임신중; 림프종, 비-호지킨, 성인; 림프종, 비-호지킨, 어린이; 림프종, 비-호지킨 임신중; 림프종, 원발성 중추신경계; 발덴스트롬마크로글로불린혈증(Macroglobulinemia, Waldenstrom's); 남성 유방암; 악성 중피종, 성인; 악성 중피종, 어린이; 악성 가슴샘종; 속질모세포종, 어린이; 흑색종; 흑색종, 안구내; 메르켈 세포(Merkel Cell) 암종; 중피종, 악성; 전이성 편평 경부 암, 잠재적 원발성; 다발성 내분비선종증(Multiple Endocrine Neoplasia Syndrome), 어린이; 다발성 골수종/혈장 세포 신생물(Multiple Myeloma/Plasma Cell Neoplasm); 균상식육종(Mycosis Fungoides); 골수 형성이상 증후군(Myelodysplastic Syndromes); 골수성 백혈병, 만성; 골수성 백혈병, 어린이 급성; 골수종, 다발성; 골수증식 질환, 만성; 비강 및 부비동 암; 코인두암; 코인두암, 어린이; 신경모세포종; 비호지킨 림프종, 성인; 비호지킨 림프종, 어린이; 비-호지킨 림프종 임신 종안; 비소세포 폐 암; 구강 암, 어린이; 구강 및 입술 암; 입인두 암(Oropharyngeal Cancer); 뼈의 골육종/악성 섬유조직구종; 난소암, 어린이; 난소 상피 암; 난소배세포 종양; 난소 저악성 잠재 종양; 췌장암; 췌장암, 어린이; 췌장암, 섬세포(Islet Cell); 부비동 및 비강 암; 부갑상선 암; 음경 암; 크롬친화세포종; 송과체 및 천막상부 원시신경외배엽 종양(Pineal and Supratentorial Primitive Neuroectodermal Tumor), 어린이; 하수체 종양(Pituitary Tumor); 형질세포 신생물/다발성 골수종; 융막폐장 모세포종(Pleuropulmonary Blastoma); 임신성 및 유방암; 임신성 및 호지킨 림프종; 임신성 및 비호지킨 림프종; 원발성 중추신경계 림프종; 원발성 간암, 성인; 원발성 간암, 어린이; 전립선 암; 직장암; 신장 세포(신장) 암; 신장 세포 암, 어린이; 신우 및 요관, 이행세포암; 망막모세포종; 횡문근육종, 어린이; 침샘 암; 침샘 암, 어린이; 육종, 가족성 유잉종양(Ewing's Family of Tumor); 육종, 카포시; 뼈의 육종(골육종)/악성 섬유조직구종; 육종, 횡문근육종, 어린이; 육종, 연조직, 성인; 육종, 연조직, 어린이; 세자리 증후군(Sezary Syndrome); 피부암; 피부암, 어린이; 피부암(흑색종); 피부 암종, 메르켈 세포(Merkel Cell); 소세포 폐 암; 소장 암; 연조직 육종, 성인; 연조직 육종, 어린이; 편평 경부암, 불가사의한 원발성, 전이성; 위 암; 위(Gastric) 암, 어린이; 천막상부 원시신경외배엽 종양, 어린이; T-세포 림프종, 피부; 고환 암; 가슴샘종, 어린이; 가슴샘종, 악성; 갑상선 암; 갑상선 암, 어린이; 신우 및 요관의 이행세포암(Transitional Cell Cancer); 영양막 종양, 임신; 미공지 원발성 부위, 어린이의 암; 어린이의 보통과는 다른 암(Unusual Cancer); 요관 및 신우, 이행세포 암; 요도암; 자궁 육종; 질 암(Vaginal Cancer); 시각 경로 및 시상하부 교종, 어린이; 외음부 암(Vulvar Cancer); 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's Macro globulinemia); 및 윌름즈 종양(Wilms' Tumor)를 포함한다.
추가의 예시적인 암은 미만성 큰 B-세포 림프종(DLBCL) 및 외투세포 림프종(MCL)을 포함한다.
상기 언급된 암의 전이가 또한 본원에 기재된 방법에 따라서 치료되고 예방될 수 있다.
조합 치료법
일부 구체예에서, 본원에 기재된 화합물은 추가의 "제 2" 치료제 또는 치료와 함께 투여된다. 제 2 치료제는 표시된 질환 또는 병태를 치료하기 위해 단일요법에 전형적으로 이용되는 임의의 작용제로부터 선택될 수 있다. 본원에서 이용되는 용어 "함께 투여된다" 및 관련 용어는 본 발명에 따른 치료제의 동시 또는 순차 적투여를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 별도의 단위 투여 형태로 또는 함께 단일의 단위 투여 형태로 동시에 또는 순차적으로 또 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물, 추가 치료제, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트, 또는 비히클을 포함하는 단일 단위 용량 형태를 제공한다.
제 2 치료제가 피검체에게 투여되는 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 화합물의 유효량은 제 2 치료제가 투여되지 않는 경우의 그 유효량보다 적다. 또 다른 구체예에서, 제 2 치료제의 유효량은 본 발명의 화합물이 투여되지 않는 경우의 그 유효량보다 적다. 이러한 식으로, 어느 작용제의 고용량과 관련된 요망되지 않는 부작용을 최소화시킬 수 있다. 다른 잠재적인 이점 (비제한적으로 개선된 투여 섭생 및/또는 감소된 약물 비용 포함)이 당업자에게 자명할 것이다. 추가 작용제는 여러 투여 섭생의 일부로서, 본 발명의 화합물과 별도로 투여될 수 있다. 대안적으로, 이러한 작용제는 본 발명의 화합물과 단일 조성물로 함께 혼합된, 단일 투여 형태의 일부일 수 있다.
암 조합 치료법
일부 구체예에서, 본원에 기재된 화합물은 추가의 암 치료와 함께 투여된다. 예시적인 추가의 암 치료는, 예를 들어, 화학요법, 표적 치료법, 예컨대, 항체 치료법, 키나제 억제제, 면역치료법 및 호르몬 치료법, 후생유전학 치료법, 프로테오솜 억제제, 및 항-혈관형성 치료법(anti-angiogenic therapies)을 포함한다. 이들 치료의 각각의 예가 이하 제공된다.
본원에서 사용된 용어 "조합", "조합된" 및 관련 용어는 본 발명에 따른 치료제의 동시 또는 순차적 투여를 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 별도의 단위 투여 형태로 또는 함께 단일의 단위 투여 형태로 동시에 또는 순차적으로 또 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 추가의 치료제, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 애쥬번트 또는 비히클을 포함하는 단일 단위 투여 형태를 제공한다.
담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성시킬 수 있는 본 발명의 화합물 및 추가의 치료제 둘 모두의 양(상기 기재된 바와 같은 추가의 치료제를 포함하는 조성물에서)은 치료되는 호스트 및 특정의 투여 방식에 따라서 다양할 것이다. 바람직하게는 본 발명의 조성물은 0.01 내지 100 mg/체중kg/일의 본 발명의 화합물의 투여량이 투여될 수 있도록 제형화되어야 한다.
화학요법
일부 구체예에서, 본원에 기재된 화합물은 화학요법과 함께 투여될 수 있다. 화학요법은 암세포를 파괴할 수 있는 약물에 의한 암의 치료이다. "화학요법"은 일반적으로는, 표적된 치료법과는 대조적으로, 세포의 분할에 일반적으로 신속하게 영향을 주는 세포독성 약물을 나타낸다. 화학요법 약물은 다양한 가능한 경로로, 예를 들어, DNA의 복제 또는 새롭게 형성된 염색체의 분리에 의한 세포 분할을 방해한다. 화학요법의 대부분의 형태는 모두 신속하게 세포 분할을 표적으로 하고, 암 세포에 특이적이지 않지만, 약간의 특이성이 많은 암 세포의 불능으로부터 발생하여, 정상세포가 일반적으로 할 수 있는 동안, DNA 손상을 복구할 수 있다.
암 치료에 사용되는 화학요법제의 예는, 예를 들어, 예를 들어, 항대사물질 (예컨대, 폴산, 푸린, 및 피리미딘 유도체) 및 알킬화제 (예컨대, 질소 머스터드, 니트로소우레아, 백금, 알킬 설포네이트, 하이드라진, 트리아젠. 아지리딘, 방추체 독, 세포독성제, 토포아이소머라제 억제제 및 기타)를 포함한다. 예시적인 작용제는 아클라루비신, 액티노마이신, 알트레타민, 아미노프테린, 아미노레불린산, 암루비신, 암사크린, 아나그렐리드, 삼산화비소, 아스파라기나제, 아트라센탄, 벨로테칸, 벡사로텐, 벤다무스틴, 블레오마이신, 보르테조미브, 부술판, 캄프토테신, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르보큐온, 카르모푸르, 카르무스틴, 셀레콕시브, 클로람부실, 클로르메틴, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로파라빈, 크리산타스파제, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데시타빈, 데메콜신, 도세탁셀, 독소루비신, 에파프록시랄, 엘레스클로몰, 엘사미트루신, 에노시타빈, 에피루비신, 에스트라무스틴, 에토글루시드, 에토포시드, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루오로우라실 (5FU), 포테무스틴, 겜시타빈, 글리아달 이식물, 하이드록시카르바미드, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 이로풀벤, 이사베필론, 라로탁셀, 류코보린, 리포솜 독소루비신, 리포솜 다우노루비신, 로니다민, 로무스틴, 루칸톤, 만노술판, 마소프로콜, 멜팔란, 메르캅토푸린, 메스나, 메토트렉세이트, 메틸 아미노레불리네이트, 미토브로니톨, 미토구아존, 미토탄, 미토마이신, 미톡산트론, 네다플라틴, 니무스틴, 오블리메르센, 오마세탁신, 오르타탁셀, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페가스파르가제, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 피라루비신, 픽산트론, 플리카마이신, 포르피머 소듐, 프레드니무스틴, 프로카르바진, 랄티트렉세드, 라니무스틴, 루비테칸, 사파시타빈, 세무스틴, 시티마겐, 세라데노벡, 스트라타플라틴, 스트렙토조신, 탈라포르핀, 테가푸르-우라실, 테모포르핀, 테모졸로미드, 네티포시드, 테세탁셀, 테스토락톤, 테트라니트레이트, 티오테파, 티아조퓨린, 티오구아닌, 티피파르니브, 토포테칸, 트라벡테딘, 트리아지큐온, 트리에틸렌멜라민, 트리플라틴, 트레티노인, 트레오술판, 트로포스파미드, 우라무스틴, 발루비신, 베르테포르핀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 빈플루닌, 빈노렐빈, 보리노스타트, 조루비신, 및 본원에 기재된 그 밖의 세포증식억제제 또는 세포독성제를 포함한다.
일부 약물은 단독으로보다는 함께 더 잘 작용하므로, 2개 이상의 약물이 종종 동시에 제공된다. 흔히, 2개 이상의 화학요법제를 조합 화학요법으로서 이용한다. 일부 구체예에서, 화학요법제 (조합 화학요법 포함)를 본원에 기재된 화합물과 함께 이용할 수 있다.
표적화 요법
표적화 요법은 암 세포의 탈조절 단백질에 특이적인 작용제의 이용을 포함한다. 소분자 표적화 요법 약물은 일반적으로 돌연변이되거나, 과발현되거나, 암 세포 내에서 달리 결정적인 단백질 상의 효소 도메인의 억제제이다. 두드러진 예는 액시티니브, 보수티니브, 세디라니브, 데사티니브, 에롤로티니브, 이마티니브, 게피티니브, 라파티니브, 레스타우르티니브, 닐로티니브, 세막사니브, 소라페니브, 수니티니브, 및 반데타니브와 같은 티로신 키나제 억제제, 및 또한 사이클린-의존성 키나제 억제제, 예컨대 알보시디브 및 셀리시클리브이다. 모노클로날 항체 요법은 치료제가 암세포의 표면 상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 또 다른 방법이다. 예는 유방암에 통상적으로 이용되는 항-HER2/neu 항체 트라스투주맙 (Herceptin®), 및 다양한 B-세포 악성종양에 통상적으로 이용되는 항-CD20 항체 리툭시맙 및 토시투모맙을 포함한다. 그 밖의 예시적인 항체는 세툭시맙, 파니투무맙, 트라스투주맙, 알렘투주맙, 베바시주맙, 에드레콜로맙, 및 겜투주맙을 포함한다. 예시적인 융합 단백질은 아플리베르셉트 및 데니류킨 디프티톡스를 포함한다. 일부 구체예에서, 글리벡 (Vignari and Wang 2001)과 같은 표적화 요법이 본원에 기재된 화합물과 함께 이용될 수 있다.
표적화 요법은 또한 세포 표면 수용체 또는 종양 주위의 침범된 세포외 매트릭스에 결합할 수 있는 "자동유도장치(homing device)"로서 소 펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 펩티드에 부착되는 방사성핵종(예컨대, RGD)은 핵종이 세포 부근에서 붕괴되는 경우 실제로 암세포를 사멸시킨다. 이러한 요법의 예는 BEXXAR®를 포함한다.
혈관형성
본원에서 기재된 화합물 및 방법은 혈관형성과 관련된 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위해서 사용될 수 있다. 혈관형성과 연관된 질환은 암, 심혈관 질환 및 황반변성을 포함한다.
혈관형성은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관의 성장을 포함한 생리 과정이다. 혈관형성은 성장 및 발달에서뿐만 아니라 상처 치유 및 육아 조직(granulation tissue)에서 정상 및 생명 과정이다. 그러나, 이는 또한 잠복 상태로부터 악성 상태로의 종양의 전이에서 기초적인 단계이다. 혈관형성은 불량한 혈관신생 또는 비정상적인 혈관구조가 특징인 질환을 퇴치하기 위한 표적일 수 있다.
신체내 새로운 혈관의 발생을 억제하거나 유도할 수 있는 특이적 화합물의 적용이 그러한 질환을 퇴치하는데 도움이 될 수 있다. 없어야 할 혈관의 존재는 조직의 기계적인 성질에 영향을 주어서 기능상실(failure)의 가능성을 증가시킬 수 있다. 복구 또는 달리 대사 활성 조직에서의 혈관의 부재는 복구 또는 다른 필수적인 기능을 억제할 수 있다. 몇 가지 질환, 예컨대, 허혈성 만성 상처는 기능상실 또는 불충분한 혈관 형성의 결과이고, 혈관의 국소 확장에 의해서 치료될 수 있으며, 그에 따라서, 그 부위에 새로운 영양물을 공급하고 복구를 촉진시킬 수 있다. 다른 질환, 예컨대, 노화-관련된 황반변성은 혈관의 국소 팽창에 의해서 발생될 수 있으며, 정상적인 생리 과정을 방해할 수 있다.
혈관내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor: VEGF)가 주어진 혈관망에서 모세혈관의 수를 증가시키는 혈관 형성에 대한 주요 기여인자인 것으로 입증되었다. VEGF의 상향 조절은 운동을 위한 생리적인 반응의 주요 구성요소이며, 혈관형성에서의 이의 역할은 혈관 손상에서의 가능한 치료인 것으로 여겨진다. 시험관내 연구에서, VEGF는 혈관형성의 잠재적 자극인자인데, 그 이유는 성장 인자의 존재하에 평판화된 내피 세포가 증식하고 이동하여, 결국 모세혈관과 유사한 튜브 구조를 형성할 것이기 때문임이 명확히 입증된다.
종양은 다양한 성장인자(예, VEGF)를 분비시킴으로써 혈관 성장(혈관형성)을 유도한다. 성장인자, 예컨대, bFGF 및 VEGF는 종양내로의 모세혈관 성장을 유도할 수 있으며, 일부 연구자들은 이를 종양 팽창을 가능하게 하는 필요한 영양물을 공급하는 것으로 의심한다.
혈관형성은 심혈관 질환의 치료를 위한 우수한 치료 표적을 나타낸다. 이러한 혈관형성은 우리의 신체가 생명 기관에 대한 혈액 공급의 감소에 반응하는 자연적인 방식의 근간을 이루는 잠재적 생리 과정, 즉, 허혈 손상을 극복하기 위한 새로운 이차적인 혈관의 생성이다.
VEGF의 과발현은, 혈관혈성을 자극하는 것에 추가로, 혈관에서의 투과성의 증가를 야기시킨다. 삼출성 황반변성에서, VEGF는 모세혈관의 망막내로의 증식을 유발시킨다. 혈관형성의 증가는 또한 부종을 유발시키기 때문에, 혈액 및 다른 망막 액이 망막내로 누출되어 시력 손실을 야기시킨다.
항-혈관신생 요법은 수니티니브, 소라페니브, 또는 베바시주맙, 또는 VEGF-Trap, 또는 탈리도미드 또는 이의 유사체 (레날리도미드, 포말리도미드), 또는 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 앤지오포이에틴, 또는 앤지오스타틴 또는 엔도스타틴과 같은 비-VEGF 혈관신생 표적을 표적화하는 작용제를 포함하는 VEGF 또는 VEGF 수용체에 대한 모노클로날 항체 또는 수용체 "디코이(decoys)"와 같은 혈과 내피 성장 인자(VEGF)를 표적화하는 키나제 억제제를 포함할 수 있다.
후생유전학
본원에 기재된 화합물 및 방법은 후생유전학과 연관된 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위해서 사용될 수 있다. 후생유전학은 기초가 되는 DNA 서열에서의 변화가 아닌 메커니즘에 의해서 유발된 표현형 또는 유전자 발현에서의 유전 가능한 변화에 대한 학문이다. 진핵 생물학에서의 후생유전적 변화의 한 예는 세포 분화 과정이다. 형태 형성 동안에, 줄기 세포는 배아의 다양한 세포주가 되고, 이는 이어서 완전히 분화된 세포가 된다. 달리 설명하면, 단일의 수정란 세포는, 계속 분할됨에 따라서, 뉴런, 근육 세포, 상피, 혈관 등을 포함한 많은 세포 유형으로 변한다. 이러한 과정은 다른 것을 억제하면서 일부 유전자를 활성화시킴으로써 그렇게 한다.
후생유전적 변화는 세포가 분할할 때에 보존된다. 대부분의 후생유전적 변화는 단지 하나의 개별적인 유기체 수명의 과정 내에서 발생하지만, DNA에서의 돌연변이가 수태를 생성시키는 정자 또는 난자에서 유발되면, 일부 후생유전적 변화가 한 세대에서 다음 세대로 유전된다. 특이적 후생유전 과정은 모의 돌연변이, 북마킹(bookmarking), 임프린팅(imprinting), 유전자 침묵(gene silencing), X 염색체 불활성화, 위치 효과(position effect), 리프로그래밍(reprogramming), 트랜스벡션(transvection), 기형의 모계 영향(maternal effect), 히스톤 변형 및 이질염색질의 조절, 및 처녀생식 및 클로닝에 영향을 주는 기술적 한계를 포함한다.
후생유전학과 관련된 예시적인 질환은 ATR-증후군, 취약 X-증후군, ICF 증후군, 안젤만 증후군(Angelman's syndrome), 프라더-빌스 증후군(Prader-Wills syndrome), BWS, 레트 증후군(Rett syndrome), α-지중해빈혈, 암, 백혈병, 루빈스타인 테이비 증후군(Rubinstein-Taybi syndrome) 및 코핀-로우리 증후군(Coffin-Lowry syndrome)을 포함한다.
후생유전학과 연관되는 첫 번째 인간 질환은 암이다. 연구자들은 결장직장 암을 앓고 있는 환자로부터의 질환 조직이 동일한 환자의 정상 조직보다 DNA 메틸화가 더 적었음을 발견하였다. 메틸화된 유전자는 전형적으로 턴 오프(turn off)되기 때문에, DNA 메틸화의 손실은 염색질의 배열을 변경시킴으로써 비정상적으로 높은 유전자 활성화를 유발시킬 수 있다. 다른 한편으로, 매우 많은 메틸화는 보호성 종양 억제 유전자의 작용을 원상태로 돌려놓는다.
DNA 메틸화는 CpG에서 발생하고, 대부분의 CpG 시토신이 포유동물에서 메틸화된다. 그러나, 정상 세포에서의 메틸화가 없는 CpG 부위(CpG 섬으로 공지됨)의 더 높은 농도를 지니는 프로모터 영역 근처에 DNA의 스트레치(stretch)가 존재한다. 이들 CpG 섬은 암 세포에서 과도하게 메틸화되어, 침묵하지 않아야 할 유전자가 턴 오프(turn off)되게 한다. 이러한 비정상은 종양에서 발생하고 암 발생의 초기에 일어나는 트레이드마크 후생유전적 변화이다. CpG 섬의 과메틸화는 종양-억제 유전자를 셧 오프(shut off)시킴으로써 종양을 유발시킬 수 있다. 사실, 이들 변화 유형이 인간 암에서 DNA 서열 돌연변이보다 더 일반적일 수 있다.
추가로, 비록 후생유전적 변화가 DNA 서열을 변경시키지 않지만, 이들은 돌연변이를 유발시킬 수 있다. 암의 가족성 또는 유전된 형태를 유발시키는 유전자의 거의 절반은 메틸화에 의해서 턴 오프된다. 대부분의 이들 유전자는 일반적으로는 종양 형성을 억제하고, O6-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스페라제(MGMT), MLH1 사이클린-의존성 키아나제 억제제 2B(CDKN2B), 및 RASSF1A를 포함한 DNA를 복구하는데 도움을 준다. 예를 들어, MGMT의 프로모터의 과메틸화는 G-투-A 돌연변이(G-to-A mutation)의 수가 증가되게 한다.
과메틸화는 또한 DNA의 반복된 서열인 미세부수체(microsatellite)의 불안정성을 유도할 수 있다. 이러한 미세부수체는 정상적인 개인에서는 일반적이며, 이들은 일반적으로는 디뉴클레오티드 CA의 반복체로 이루어진다. DNA 복구 유전자 MLH1의 프로모터의 매우 많은 메틸화는 미세부수체를 불안정하게 하고 이를 길게 하거나 짧게 할 수 있다. 미세부수체 불안정성은 결장직장, 자궁내막, 난소 및 위 암을 포함한 많은 암과 연관되어 있다.
취약 X 증후군은, 특히, 남성에서, 가장 빈번한 유전적 정신장애(mental disability)이다. 두 성별 모두가 이러한 병태에 영향을 받을 수 있지만, 남성은 단지 하나의 X 염색체를 지니기 때문에, 하나의 취약 X가 더욱 심각하게 그들에게 영향을 줄 것이다. 사실, 취약 X 증후군은 4,000 명의 남성 중 대체로 1명 그리고 8,000 명의 여성 중 대체로 1명에서 발생한다. 이러한 증후군을 앓고 있는 사람들은 심각한 지적 장애, 지연된 언어 발달, 및 "자폐-유사" 행동을 한다.
취약 X 증후군은 유전자 비정상을 함유하는 X 염색체의 일부가 현미경하에 보인다는 것으로 보아 그 명칭이 붙여졌으며; 이는 일반적으로는 이것이 실에 의해서 매달려 있으며 용이하게 파괴 가능한 것처럼 보인다. 이러한 증후군은 FMR1(취약 X 정신 지체 1) 유전자에서의 비정상에 의해서 유발된다. 취약 X 증후군을 앓고 있지 않은 사람들은 이들 FMR1 유전자내에 트리뉴클레오티드 CGG의 6 내지 50개 반복체를 지닌다. 그러나, 200 초과의 반복체를 지니는 개인은 완전한 돌연변이이며, 이들은 일반적으로는 증후군의 증상을 보인다. 너무 많은 CGG는 FMR1 유전자의 프로모터 영역에서의 CpG 섬이 메틸화되게 하고; 일반적으로는, 이들은 그렇지 않다. 이러한 메틸화는 유전자를 턴 오프시키고, FMR1 유전자가 취약 X 정신 지체 단백질이라고 일컬어지는 중요한 단백질을 생산하는 것을 중지시킨다. 이러한 특이적 단백질의 손실은 취약 X 증후군을 유발시킨다. 비록 취약 X의 원인으로서 CGG 팽창 돌연변이에 많은 주목이 집중되었지만, FMR1 메틸화와 관련된 후생유전적 변화가 실제적인 증후군의 원인이다.
취약 X 증후군이 후생유전적 변화를 포함하는 정신지체와 연관된 유일한 질병은 아니다. 다른 그러한 병태에는 루빈스타인-테이비 증후군, 코핀-로우리 증후군, 프라더-빌스 증후군, 안젤만 증후군, 벡위드-비더만 증후군(Beckwith-Wiedemann syndrome), ATR-X 증후군 및 레트 증후군이 포함된다.
후생유전학 요법은 후생유전학 변형을 제어하는 효소의 억제제, 특히 일부 악성종양뿐 아니라 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 siRNA에 대해 항-종양원성 효과를 보증하는 것으로 확인된 DNA 메틸트랜스퍼라제 및 히스톤 데아세틸라제를 포함한다.
면역요법
일부 구체예에서, 본 발명에 기재된 화합물은 면역요법과 함께 투여될 수 있다. 암 면역요법은 종양에 대항하는 환자 자신의 면역 시스템을 유도하도록 설계된 치료 방법의 다양한 세트를 의미한다. 종양에 대한 면역 반응을 발생시키는 동시대적 방법은 표재성 방광암에 대한 소포내 BCG 면역요법, 전립선암 백신 Provenge, 및 신장 세포 암종 및 흑색종 환자에서 면역 반응을 유도하기 위한 인터페론 및 그 밖의 사이토카인의 이용을 포함한다.
동종 조혈모세포 이식은, 공여체의 면역 세포가 종종 이식편대종양 효과로 종양을 공격할 것이므로, 면역요법의 형태로 간주될 수 있다. 일부 구체예에서, 면역요법제를 본원에 기재된 화합물과 함께 이용할 수 있다.
호르몬 요법
일부 구체예에서, 본 발명에 기재된 화합물은 호르몬 요법과 함께 투여될 수 있다. 일부 암의 성장은 특정의 호르몬을 제공하거나 차단함으로써 억제될 수 있다. 호르몬-민감성 종양의 일반적인 예는 특정의 레티노이드/레티노산에 반응하는 특정 유형의 유방암 및 전립선암뿐만 아니라, 특정 유형의 백혈병을 포함한다. 에스트로겐 또는 테스토스테론을 제거하거나 차단하는 것은 흔히 중요한 추가의 치료이다. 특정의 암에서, 호르몬 효능제, 예컨대, 프로게스토겐(progestogen)을 투여하는 것은 치료적으로 유익할 수 있다. 일부 구체예에서, 호르몬 요법제는 본원에 기재된 화합물과 조합하여 사용될 수 있다.
호르몬 요법제는 호르몬 효능제 또는 호르몬 길항제의 투여를 포함하고 레티노이드/레티노산, 에스트로겐 또는 테스토스테론을 억제하는 화합물, 뿐만 아니라 프로게스토겐의 투여를 포함한다.
염증 및 자가면역 질환
본원에 기재된 화합물 및 방법은 염증, 특히, 인간 및 다른 포유동물에서의 염증과 연관된 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위해서 사용될 수 있다. 본원에서 기재된 화합물은 염증의 발병 전에, 그의 개시시에, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 예방적으로 사용되는 경우에, 화합물은 바람직하게는 어떠한 염증 반응 또는 그 증상에 앞서서 제공된다. 화합물의 투여는 염증 반응 또는 증상을 예방하거나 완화시킬 수 있다. 예시적인 염증 병태는, 예를 들어, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 퇴행성 관절 질환, 척추관절병증(spondouloarthropathies), 다른 혈청음성 염증성 관절염, 류마티스성 다발성 근육통, 다양한 혈관염(various vasculidities)(예, 거대 세포 동맥염, ANCA + 혈관염), 통풍성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 소아 관절염(juvenile arthritis), 소아류마티스관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 골다공증(osteoporosis), 당뇨병(예, 인슐린의존당뇨병(insulin dependent diabetes mellitus) 또는 청소년 - 발병 당뇨병(juvenile onset diabetes)), 월경통(menstrual cramps), 낭성섬유증(cystic fibrosis), 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 크론병(Crohn's disease), 점액잘록창자염(mucous colitis), 궤양대장염(ulcerative colitis), 위염(gastritis), 식도염(esophagitis), 췌장염(pancreatitis), 복막염(peritonitis), 알츠하이머병, 쇼크, 강직척추염(ankylosing spondylitis), 위염, 결막염, 췌장염(급성 또는 만성), 다발성 기관 손상(multiple organ injury syndrome)(예, 패혈증 또는 외상에 대해 이차적), 심근경색, 뇌졸중(stroke), 재관류 손상(reperfusion injury)(예, 심폐우회술 또는 신장 투석에 기인한), 급성 사구체신염, 열적 손상(thermal injury)(즉, 일광화상), 괴사작은창자큰창자염(necrotizing enterocolitis), 과립세포 수혈 연관된 증후군(granulocyte transfusion associated syndrome), 및/또는 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome)을 포함한다. 피부의 예시적인 염증 병태는, 예를 들어, 습진, 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 두드러기, 경피증(schleroderma), 건선(psoriasis), 및 급성 염증성 성분에 의한 피부염을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본원에 기재된 화합물 또는 방법은 천식, 기관지염, 폐섬유증, 알레르기성 비염, 산소독성(oxygen toxicity), 폐공기증(emphysema), 만성 기관지염, 급성 호흡곤란증후군, 및 어떠한 만성 폐쇄폐병(COPD)을 포함한 알레르기 및 호흡기 병태를 치료 또는 예방하기 위해서 사용될 수 있다. 이러한 화합물은 B형 간염 및 C형 간염을 포함한 만성 간염 감염증을 치료하기 위해서 사용될 수 있다.
추가로, 본원에 기재된 화합물 또는 방법은 자가면역 질환 및/또는 자가면역 질환과 연관된 염증, 예컨대, 기관-조직 자가면역 질환(예, 레이노증후군(Raynaud's syndrome)), 공피증, 중증근육무력증(myasthenia gravis), 이식편 거부(transplant rejection), 내독소 쇼크, 패혈증, 건선, 습진, 피부염, 다발성 경화증, 자가면역성 갑상선염, 포도막염, 전신홍반루푸스, 애디슨병(Addison's disease), 자가면역성 다선성 질환(autoimmune polyglandular disease)(자가면역성 다선성 증후군으로도 알려짐), 및 그레이브스병(Grave's disease)을 치료하기 위해서 사용될 수 있다.
특정의 구체예에서, 본원에 기재된 화합물은 다발성 경화증을 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 특이적 양태에서, 다발성 경화증을 치료하기 위해서 사용되는 화합물은 화합물 1: (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-1-(3,3-디플루오로아제티딘-1-일)프로프-2-엔-1-온)이다.
조합 치료
특정의 구체예에서, 본원에서 기재된 화합물은 단독으로 또는 염증을 치료하거나 예방하기에 유용한 다른 화합물과 함께 투여될 수 있다. 예시적인 항-염증제는, 예를 들어, 스테로이드(예, 코르티솔, 코르티손, 플루드로코르티손(fludrocortisone), 프레드니손(prednisone), 6[알파]-메틸프레드니손, 트리아시놀론(triamcinolone), 베타메타손(betamethasone) 또는 덱사메타손(dexamethasone)), 비스테로이드성 항염증 약물(nonsteroidal antiinflammatory drugs: NSAIDS (예, 아스피린, 아세타미노펜, 톨메틴(tolmetin), 이부프로펜(ibuprofen), 메페남산(mefenamic acid), 피록시캄(piroxicam), 나부메톤(nabumetone), 로페콕십(rofecoxib), 셀레콕십(celecoxib), 에토돌락(etodolac) 또는 리메설라이드(nimesulide))를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 다른 치료제는 항생제(예, 반코마이신(vancomycin), 페니실린, 아목시실린(amoxicillin), 암피실린(ampicillin), 세파탁심(cefotaxime), 세프트리악손(ceftriaxone), 세픽심(cefixime), 리파핀메트로니다졸(rifampinmetronidazole), 독시사이클린(doxycycline) 또는 스트렙토마이신(streptomycin))이다. 또 다른 구체예에서, 다른 치료제는 PDE4 억제제(예, 로플러미라스트(roflumilast) 또는 롤리프람(rolipram))이다. 또 다른 구체예에서, 다른 치료제는 항히스타민(예, 사이클리진(cyclizine), 하이드록시진, 프로메타진 또는 디펜하이드라민)이다. 또 다른 구체예에서, 다른 치료제는 항-말라리아(예, 아르테미시닌(artemisinin), 아르테메테르(artemether), 아르트수네이트(artsunate), 클로로퀸 포스페이트, 메플로퀸(mefloquine) 하이드로클로라이드, 독시사이클린 하이클레이트(doxycycline hyclate), 프로구아닐(proguanil) 하이드로클로라이드, 아토바쿠온(atovaquone) 또는 할로판트린(halofantrine))이다. 한 구체예에서, 다른 화합물은 드로트레코긴 알파(drotrecogin alfa)이다.
항-염증제의 추가의 예는, 예를 들어, 아세클로페낙(aceclofenac), 아세메타신(acemetacin), e-아세타미도카프로산(e-acetamidocaproic acid), 아세타미노펜, 아세타미노살롤, 아세타닐라이드(acetanilide), 아세틸살리실산, S-아데노실메티오닌, 알클로페낙(alclofenac), 알클로메타손(alclometasone), 알펜타닐(alfentanil), 알게스톤(algestone), 알릴프로딘(allylprodine), 알미노프로펜(alminoprofen), 알록시프린(aloxiprin), 알파프로딘(alphaprodine), 알루미늄 비스(아세틸살리실레이트), 암시노나이드(amcinonide), 암페낙(amfenac), 아미노클로르테녹사진(aminochlorthenoxazin), 3-아미노-4-하이드록시부티르산, 2-아미노-4-피콜린, 아미노프로필론, 아미노피린, 아믹세트린(amixetrine), 암모늄 살리실레이트, 아미록시캄(ampiroxicam), 암톨메틴 구아실(amtolmetin guacil), 아닐레리딘(anileridine), 안티피린(antipyrine), 안트라페닌(antrafenine), 아파존(apazone), 베클로메타손(beclomethasone), 벤다작(bendazac), 베노릴레이트(benorylate), 베녹사프로펜(benoxaprofen), 벤즈피페릴론(benzpiperylon), 벤지다민(benzydamine), 벤질모르핀, 베르모프로펜(bermoprofen), 베타메타손(베타메타손), 베타메타손-17-발레레이트, 베지트라미드(bezitramide), [알파]-비사볼롤, 브롬페낙(bromfenac), p-브로모아세타닐라이드, 5-브로모살리실산 아세테이트, 브로모살리게닌(bromosaligenin), 부세틴(bucetin), 부클록산(bucloxic acid), 부콜롬(bucolome), 부데소니드(budesonide), 부펙사막(bufexamac), 부마디존(bumadizon), 부프레노르핀(buprenorphine), 부타세틴(butacetin), 부티부펜(butibufen), 부토르파놀(butorphanol), 카르바마제핀(carbamazepine), 카르비펜(carbiphene), 카이프로펜(caiprofen), 카르살람(carsalam), 클로로부타놀, 클로로프레드니손, 클로르테낙사진(chlorthenoxazin), 콜린 살리실레이트, 신초펜(cinchophen), 신메타신(cinmetacin), 시라마돌(ciramadol), 클리다낙(clidanac), 클로베타솔(clobetasol), 클로코르톨론(clocortolone), 클로메타신(clometacin), 클로니타젠(clonitazene), 클로닉신(clonixin), 클로피락(clopirac), 클로프레드놀(cloprednol), 클로브(clove), 코데인(codeine), 코데인 메틸 브로마이드, 코데인 포스페이트, 코데인 설페이트, 코르티손, 코르티바졸(cortivazol), 크로프로파미드(cropropamide), 크로테타미드(crotethamide), 사이클라조신(cyclazocine), 데플라자코르트(deflazacort), 데하이드로테스토스테론(dehydrotestosterone), 데소모르핀(desomorphine), 데소니드(desonide), 데속시메타손(desoximetasone), 덱사메타손(dexamethasone), 덱사메타손-21-이소니코티네이트, 덱속사드롤(dexoxadrol), 덱스트로모라미드(dextromoramide), 덱스트로프로폭시펜(dextropropoxyphene), 데옥시코르티코스테론(deoxycorticosterone), 데조신(dezocine), 디아모프로미드(diampromide), 디아모르폰(diamorphone), 디클로페낙(diclofenac), 디페나미졸(difenamizole), 디펜피라미드(difenpiramide), 디플로라손(diflorasone), 디플로코르톨론(diflucortolone), 디플루니살(diflunisal), 디플루프레드네이트(difluprednate), 디하이드로코데인, 디하이드로코데논 에놀 아세테이트, 디하이드로모르핀, 디하이드록시알루미늄 아세틸살리실레이트, 디메녹사돌(dimenoxadol), 디메프헵타놀, 디메틸티암부텐(dimethylthiambutene), 디옥사페틸 부티레이트(dioxaphetyl butyrate), 디피파논(dipipanone), 디프로세틸(diprocetyl), 디피론(dipyrone), 디타졸(ditazol), 드록시캄(droxicam), 에모르파존(emorfazone), 엔파남산(enfenamic acid), 에녹솔론(enoxolone), 에피리졸(epirizole), 엡타조신(eptazocine), 에테르살레이트(etersalate), 에탄자미드(ethenzamide), 에토헵타진(ethoheptazine), 에톡사젠(ethoxazene), 에틸메틸티암부텐, 에틸모르핀, 에토돌락(etodolac), 에토페나메이트(etofenamate), 에토니타젠(etonitazene), 에우게놀(eugenol), 펠비낙(felbinac), 펜부펜(fenbufen), 펜클로즈산(fenclozic acid), 펜도살(fendosal), 페노프로펜(fenoprofen), 펜타닐(fentanyl), 펜티아작(fentiazac), 페프라디놀(fepradinol), 페프라존(feprazone), 플록타페닌(floctafenine), 플루아자코르트(fluazacort), 플루크로로니드(flucloronide), 플루페남산(flufenamic acid), 플루메타손(flumethasone), 플루니솔라이드(flunisolide), 플루닉신(flunixin), 플루녹사프로펜(flunoxaprofen), 플루오시놀론 아세토니드(fluocinolone acetonide), 플루오시노니드(fluocinonide), 플루오시놀론 아세토니드(fluocinolone acetnide), 플루오코르틴 부틸(fluocortin butyl), 플루오코이톨론(fluocoitolone), 플루오레손(fluoresone), 플루오로메톨론, 플루페롤론(fluperolone), 플루피르틴(flupirtine), 플루프레드니덴(fluprednidene), 플루프레드니솔론(fluprednisolone), 플루프라쿠아존(fluproquazone), 플루란드레놀라이드(flurandrenolide), 플루르비프로펜(flurbiprofen), 플루티카손(fluticasone), 포르모코르탈(formocortal), 포스포살(fosfosal), 젠티스산(gentisic acid), 글라페닌(glafenine), 글루카메타신(glucametacin), 글리콜 살리실레이트, 구아이아줄렌(guaiazulene), 헬시노니드(halcinonide), 할로베타솔(halobetasol), 할로메타손(halometasone), 할로프레드논(haloprednone), 헤로인(heroin), 하이드로코돈(hydrocodone), 하이드로 코르타메이트(hydro cortamate), 하이드로코르티손, 하이드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손 석시네이트, 하이드로코르티손 헤미석시네이트, 하이드로코르티손 21-라이시네이트, 하이드로코르티손 사이피오네이트(cypionate), 하이드로모르폰(hydromorphone), 하이드록시페티딘, 이부페낙(ibufenac), 이부프로펜(ibuprofen), 이부프록삼(ibuproxam), 이미다졸 살리실레이트, 인도메타신(indomethacin), 인도프로펜(indoprofen), 이소페졸락(isofezolac), 이소플루프레돈(isoflupredone), 이소플루프레돈 아세테이트, 이솔라돌(isoladol), 이소메타돈(isomethadone), 이소닉신(isonixin), 이속세팍(isoxepac), 이속시캄(isoxicam), 케토베미돈(ketobemidone), 케토프로펜(ketoprofen), 케토롤락(ketorolac), p-락토페네타이드(p-lactophenetide), 레페타민(lefetamine), 레발로르판(levallorphan), 레보르파놀(levorphanol), 레보페나실-모르판(levophenacyl-morphan), 로페타닐(lofentanil), 로나졸락(lonazolac), 로르녹시캄(lornoxicam), 록소프로펜(loxoprofen), 라이신 아세틸살리실레이트, 마지프레돈(mazipredone), 메클로페남산(meclofenamic acid), 메드리손(medrysone), 메페남산(mefenamic acid), 멜록시캄(meloxicam), 메페리딘(meperidine), 메프레드니손(meprednisone), 메프타지놀(meptazinol), 메살아민(mesalamine), 메타조신(metazocine), 메타돈(methadone), 메토트리메프라진(methotrimeprazine), 메틸프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 메틸프레드니솔론 소듐 석시네이트, 메틸프레드니솔론 설렙트네이트(methylprednisolone suleptnate), 메티아진산(metiazinic acid), 메토폴린(metofoline), 메토폰(metopon), 모페부타존(mofebutazone), 메페졸락(mofezolac), 모메타존(mometasone), 모라존(morazone), 모르핀(morphine), 모르핀 하이드로클로라이드, 모르핀 설페이트, 모르폴린 살리실레이트(morpholine salicylate), 마이로핀(myrophine), 나부메톤(nabumetone), 날부핀(nalbuphine), 날로르핀(nalorphine), 1-나프틸 살리실레이트, 나프록센(naproxen), 나르세인(narceine), 네포팜(nefopam), 니코모르핀(nicomorphine), 니페나존(nifenazone), 니플룸산(niflumic acid), 니메설라이드(nimesulide), 5'-니트로-2'-프로폭시아세타닐라이드, 노르레보르파놀(norlevorphanol), 노르메타돈(normethadone), 노르모르핀(normorphine), 노르피파논(norpipanone), 올살라진(olsalazine), 오피움(opium), 옥사세프롤(oxaceprol), 옥사메타신(oxametacine), 옥사프로진(oxaprozin), 옥시코돈(oxycodone), 옥시모르폰(oxymorphone), 옥시펜부타존(oxyphenbutazone), 파파베레툼(papaveretum), 파라메타손(paramethasone), 파라닐린(paranyline), 파르살미드(parsalmide), 펜타조신(pentazocine), 페리속살(perisoxal), 페나세틴(phenacetin), 페나독손(phenadoxone), 페나조신(phenazocine), 페나조피리딘 하이드로클로라이드, 페노콜(phenocoll), 페노페리딘(phenoperidine), 페노피라존(phenopyrazone), 페노모르판(phenomorphan), 페닐 아세틸살리실레이트, 페닐부타존, 페닐 살리실레이트, 페니라미돌(phenyramidol), 피케토프로펜(piketoprofen), 피미노딘(piminodine), 피페부존(pipebuzone), 피페릴론(piperylone), 피라졸락(pirazolac), 피리트라미드(piritramide), 피록시캄(piroxicam), 피르프로펜(pirprofen), 피라노프로펜(pranoprofen), 프레드니카르베이트(prednicarbate), 프레드니솔론(prednisolone), 프레드니손(prednisone), 프레드니발(prednival), 프레드닐리덴(prednylidene), 프로글루메타신(proglumetacin), 프로헵타진(proheptazine), 프로메돌(promedol), 프로파세타몰(propacetamol), 프로페리딘(properidine), 프로피람(propiram), 프로폭시펜(propoxyphene), 프로피페나존(propyphenazone), 프로쿠아존(proquazone), 프로티진산(protizinic acid), 프록사졸, 라미페나존(ramifenazone), 레미펜타닐(remifentanil), 리마졸륨 메틸설페이트(rimazolium metilsulfate, 살아세타미드, 살리신(salicin), 살리실아미드(salicylamide), 살리실아미드 o-아세트산, 살리실산, 살리실황산(salicylsulfuric acid), 살살레이트(salsalate), 살베린(salverine), 시메트리드(simetride), 수펜타닐(sufentanil), 설파살라진(sulfasalazine), 설린닥(sulindac), 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), 수프로펜(suprofen), 숙시부존(suxibuzone), 탈니플루메이트(talniflumate), 테니답(tenidap), 테녹시캄(tenoxicam), 테로페나메이트(terofenamate), 테트란드린(tetrandrine), 티아졸리노부타존(thiazolinobutazone), 티아프로펜산(tiaprofenic acid), 티아라미드(tiaramide), 틸리딘(tilidine), 티노리딘(tinoridine), 틱소코르톨(tixocortol), 톨페남산(tolfenamic acid), 톨메틴(tolmetin), 트라마돌(tramadol), 트리암시놀론(triamcinolone), 트리암시놀론 아세토니드, 트로페신, 비미놀, 젠부신(xenbucin), 지모프로펜(ximoprofen), 잘토프로펜(zaltoprofen) 및 조메피락(zomepirac)을 포함한다.
한 구체예에서, 본원에 기재된 화합물은 염증을 치료 또는 예방하기 위해서 선택적 COX-2 억제제와 함께 투여될 수 있다. 예시적인 선택적 COX-2 억제제는, 예를 들어, 데라콕십(deracoxib), 파레콕십(parecoxib), 셀레콕십(celecoxib), 발데콕십(valdecoxib), 로페콕십(rofecoxib), 에토리콕십(etoricoxib), 및 루미라콕십(lumiracoxib)을 포함한다.
일부 구체예에서, 제공된 화합물은 안드라실린(anthracycline) 또는 Topo II 억제제와 함께 투여된다. 특정의 구체예에서, 제공된 화합물은 독소루비신(Doxorubicin: Dox)과 함께 투여된다. 특정의 구체예에서, 제공된 화합물은 보르테조밉(bortezomib)(및 더욱 광범위하게는 카르필조밉(carfilzomib)을 포함함)과 함께 투여된다. 놀랍게도, Dox 또는 보르테조밉과 조합된 제공된 화합물은 상승작용 효과(즉, 추가 효과를 초과함)를 생성시켰음이 밝혀졌다.
바이러스 감염증
본원에 기재된 화합물 및 방법은 바이러스 감염증, 특히, 인간 및 다른 포유동물에서의 바이러스 감염증과 관련된 질환 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위해서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 화합물은 바이러스 감염증의 발병 전에, 그의 개시시에, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 예방적으로 사용되는 경우에, 화합물은 바람직하게는 어떠한 바이러스 감염증 또는 그 증상에 앞서서 제공된다.
예시적인 바이러스 질환은 급성 열성 인두염, 인두결막염(pharyngoconjunctival fever), 유행성 각막결막염(epidemic keratoconjunctivitis), 유아위장관염(infantile gastroenteritis), 콕사키 바이러스 감염(Coxsackie infections), 전염단핵구증(infectious mononucleosis), 버키트 림프종, 급성 간염, 만성 간염, 간경화증(hepatic cirrhosis), 간세포 암종, 원발성 HSV-1 감염증(예, 어린이에서의 헤르페스잇몸구내염(gingivostomatitis), 성인에서의 편도염(tonsillitis) 및 인두염(pharyngitis), 각막결막염(keratoconjunctivitis)), 잠재성 HSV-1 감염증(예, 입술헤르페스(herpes labialis) 및 입술물집(cold sores), 원발성 HSV-2 감염증, 잠재성 HSV-2 감염증, 무균수막염(aseptic meningitis), 전염단핵구증(infectious mononucleosis), 거대세포포함병(Cytomegalic inclusion disease), 카포시 육종, 다중심 캐슬만병(multicentric Castleman disease), 원발성 삼출 림프종, AIDS, 인플루엔자, 라이 증후군(Reye syndrome), 홍역(measles), 감염후성 뇌척수염(postinfectious encephalomyelitis), 볼거리(Mumps), 과다형성 상피 병변(hyperplastic epithelial lesions)(예, 보통 사마귀, 편평 사마귀, 발바닥 사마귀 및 항문 성기 사마귀, 후두 유두종(laryngeal papillomas), 사마귀표피형성이상(epidermodysplasia verruciformis)), 자궁경부 암종, 편평 세포 암종, 크룹(croup), 폐렴(pneumonia), 기관지염(bronchiolitis), 감기(common cold), 회색질척수염(Poliomyelitis), 광견병(Rabies), 인플루엔자-유사 증후군(influenza-like syndrome), 폐렴을 동반한 중증 기관지염(severe bronchiolitis with pneumonia), 풍진(German measles), 선천풍진(congenital rubella), 수두(Varicella), 및 대상 포진을 포함한다.
예시적인 바이러스 병원균은 아데노바이러스(Adenovirus), 콕사키바이러스(Coxsackievirus), 뎅기 바이러스(Dengue virus), 뇌염 바이러스(Encephalitis Virus), 앱스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus), A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus), B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 단순포진 바이러스 타입 1(Herpes simplex virus type 1), 단순포진 바이러스 타입 2, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 인간 헤르페스바이러스 타입 8(Human herpesvirus type 8), 인간 면역결핍 바이러스(Human immunodeficiency virus), 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스(Mumps virus), 인간 파필로마바이러스(Human papillomavirus), 파라인플루엔자 바이러스(Parainfluenza virus), 폴리오바이러스(Poliovirus), 광견병 바이러스(Rabies virus), 호흡기 세포 융합 바이러스(Respiratory syncytial virus), 풍진 바이러스(Rubella virus), 수두 - 대상 포진 바이러스(Varicella-zoster virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 뎅기 및 황열 바이러스를 포함한다. 바이러스 병원균은 또한 내성 바이러스 감염증을 유발시키는 바이러스를 포함한다.
항바이러스 약물은 바이러스 감염증을 치료하기 위해서 특별히 사용되는 약물의 부류이다. 항바이러스 활성은 일반적으로 하기 세 가지 메커니즘 중 하나에 속한다: 표적 세포의 침윤하는 바이러스의 능력을 간섭함(예, 아만타딘(amantadine), 리만타딘(rimantadine) 및 플레코나릴(pleconaril)), 바이러스의 합성의 억제(예, 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어, 아시클로비어 및 지도부딘(AZT)), 및 바이러스의 방출의 억제(예, 자나미비어(zanamivir) 및 오셀타미비어oseltamivir))
안과
본원에 기재된 화합물 및 방법은 안과 질병을 치료 또는 예방하기 위해서 사용될 수 있다. 안과 질병은 황반 부종(macular edema)(당뇨병성 및 비당뇨병성 황반부종), 삼출성 및 건조한 형태의 연령 관련된 황반 변성, 연령 관련된 디스크모양 황반변성(aged disciform macular degeneration), 낭포황반부종(cystoid macular edema), 눈꺼풀 부종(palpebral edema), 망막 부종(retina edema), 당뇨병성 망막병(diabetic retinopathy), 맥락망막병(chorioretinopathy), 신생혈관황반병(neovascular maculopathy), 신생혈관녹내장(neovascular glaucoma), 포도막염(uveitis), 홍채염(iritis), 망막혈관염(retinal vasculitis), 안구내염(endophthalmitis), 범안구염(panophthalmitis), 전이성 안염, 맥락막염 (choroiditis), 망막색소상피염(retinal pigment epithelitis), 결막염(conjunctivitis), 섬모체염(cyclitis), 공막염(scleritis), 공막바깥염(episcleritis), 시신경염(optic neuritis), 숨뇌뒤 시신경염(retrobulbar optic neuritis), 각막염(keratitis), 눈꺼풀염(blepharitis), 삼출성 망막 박리(exudative retinal detachment), 각막궤양(corneal ulcer), 결막 궤양(conjunctival ulcer), 만성 동전각막염, 저산소증 또는 허혈과 관련된 안과 질환, 미숙아망막병증(retinopathy of prematurity), 증식당뇨망막병(proliferative diabetic retinopathy), 결절맥락막혈관병증(polypoidal choroidal vasculopathy), 망막 혈관종성 증식(retinal angiomatous proliferation), 망막 동맥 폐쇄(retinal artery occlusion), 망막 정맥 폐쇄(retinal vein occlusion), 코우츠병(Coats' disease), 가족성삼출유리체망막병증(familial exudative vitreoretinopathy), 무맥박병(pulseless disease)(다카야스병(Takayasu's disease)), 일스병(Eales disease), 항인지질항체 증후군(antiphospholipid antibody syndrome), 백혈병망막병증(leukemic retinopathy), 혈액 과다점성 증후군(blood hyperviscosity syndrome), 고분자글로불린혈증(macroglobulinemia), 인터페론-관련된 망막병증(interferon-associated retinopathy), 고혈압 망막병증(hypertensive retinopathy), 방사선망막병증(radiation retinopathy), 각막 상피 줄기세포 결핍 및 백내장을 포함한다.
본원에 기재된 화합물 및 방법을 이용하여 치료가능한 그 밖의 인과 질병은 증식성 유리체망막병증(proliferative vitreoretinopathy) 및 만성 망막 박리(chronic retinal detachment)를 포함한다.
염증성 안질환은 또한 본원에 기재된 화합물 및 방법을 이용하여 치료될 수 있다.
신경변성 질환
신경변성은 신경세포의 사망을 포함한 신경세포의 구조 또는 기능의 진행성 상실에 대한 포괄 용어이다. 파킨슨병, 알츠하이머병 및 헌팅톤병을 포함한 많은 신경변성 질환이 신경변성 과정의 결과로서 발생한다. 연구가 진행됨에 따라서, 서브-세포 수준에서 이들 질환을 서로 관련시키는 많은 유사성이 있는 듯하다. 이들 유사성을 발견하는 것은 많은 질환을 유사하게 경감시킬 수 있는 치료적 진전에 희망을 제공한다. 비정형 단백질 복합체(atypical protein assemblies)뿐만 아니라 유도된 세포 사망을 포함한 여러 신경변성 질병들 사이에는 많은 공통점이 있다.
알츠하이머병(Alzheimer's disease)은 대뇌 피질 및 특정의 피질하 부위에서의 신경세포 및 시냅스의 손실이 특징이다. 이들 손실은, 측두엽 및 두정엽, 및 전두 피질(frontal cortex) 및 대상회(cingulate gyrus)의 일부에서의 변성을 포함한, 영향을 받은 부위의 총체적 위축(gross atrophy)을 발생시킨다.
헌팅톤병(Huntington's disease)은 성상교세포증 및 중형 돌기 뉴런(medium spiny neuron)의 손실을 야기시킨다. 뇌의 영역은 이들의 구조 및 이들이 함유하는 뉴런의 유형에 따라서 영향을 받아서, 이들이 누적적으로 세포를 손실함에 따라서 크기가 작아진다. 영향을 받는 영역은 주로 선조체이지만, 또한 전두 및 측두 피질이 영향을 받는다. 선조체의 시상밑핵(subthalamic nuclei)은 조절신호를 창백핵(globus pallidus)에 보내고, 이는 운동을 시작 및 조절한다. 따라서, 시상밑핵으로부터의 약한 신호는 감소된 운동 시작 및 조절을 유발시켜서, 질병의 특성적 운동을 발생시킨다. 헌팅톤병의 예시적인 치료제는 테트라벤자진, 뉴로렙틱스(neuroleptics), 벤조디아제핀, 아만타딘, 레마세미드(remacemide), 발프로산(valproic acid), 선택적 세로토닌 재흡수 억제제(selective serotonin reuptake inhibitor: SSRI), 미르타자핀(mirtazapine) 및 항정신병약(antipsychotics)을 포함한다.
파킨슨병에서의 뇌 세포가 상실되는 메커니즘은 손상된 세포에서의 유비퀴틴(ubiquitin)에 결합된 단백질 알파-시뉴클레인(protein alpha-synuclein)의 비정상적 축적으로 이루어질 수 있다. 알파-시뉴클레인-유비퀴틴 복합체는 프로테오솜에 유도될 수 없다. 이러한 단백질 축적은 루이 소체(Lewy bodies)로 일컬어지는 단백질성 세포질 포함체를 형성시킨다. 질환의 병인에 대한 최근의 연구는 알파-시뉴클레인에 의한 도파민생성 뉴런의 사멸이 두 가지 주요 세포 기관들, 즉, 세포질 세망(endoplasmic reticulum: ER)과 골지기관(Golgi apparatus) 사이에서 단백질을 수송하는 장치의 결함에 기인함이 밝혀졌다. Rab1과 유사한 특정의 단백질은 동물 모델에서 알파-시뉴클레인에 의해서 유발된 이러한 결함을 역전시킬 수 있다. 예시적인 파킨슨병 치료제는 레보도파(levodopa), 도파민 효능제, 예컨대, 브로모크립틴(bromocriptine), 페르골리드(pergolide), 프라미펙솔(pramipexole), 로피니롤(ropinirole), 피리베딜(piribedil), 카베르골린(cabergoline), 아포모르핀(apomorphine) 및 리수리드(lisuride), 도파 데카르복실레이트 억제제(dopa decarboytlate inhibitors), MAO-B 억제제, 예컨대, 셀레길렌(selegilene) 및 라사길렌(rasagilene), 항콜린작용약물(anticholinergics) 및 아만타딘(amantadine)을 포함한다.
근육위축가쪽경화증(Amyotrophic lateral sclerosis)(ALS/루게릭병(Lou Gehrig’s Disease))은 운동 뉴런이 변성에 대해서 선택적으로 표적되는 질환이다. 예시적인 ALS 치료제는 릴루졸(riluzole), 바클로펜(baclofen), 디아제팜(diazepam), 트리헥시페니딜(trihexyphenidyl) 및 아미트립틸린(amitriptyline)을 포함한다.
다른 예시적인 신경변성 치료제는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 줄기 세포를 포함한다.
상처 치유
상처는 세포 또는 조직 손상을 특징으로 하는 질환의 유형이다. 상처 치유는 조직 완전성 및 기능의 최적의 복구에 이르게 하는 동적 경로이다. 상처 치유 과정은 세 가지 중첩 단계로 이루어진다. 첫 번째 단계는 염증기이며, 항상성, 혈소판 응집 및 탈과립을 특징으로 한다. 첫 번째 반응으로서 혈소판은 다수의 성장 인자를 방출시켜 면역 세포, 상피 세포, 및 내피 세포를 동원한다. 염증기는 전형적으로 0-5일 동안 발생한다. 상처 치유의 두 번째 단계는 대식세포와 과립구가 상처에 침입하는 증식기이다. 침윤성 섬유모세포가 콜라겐을 생성하기 시작한다. 이러한 단계의 주요 특징은 상피화, 혈관형성, 육아 조직 형성 및 콜라겐 생성이다. 증식기는 전형적으로 3-14일 동안 발생한다. 세 번째 단계는 기질 형성이 발생하는 리모델링기이다. 섬유모세포, 상피 세포, 및 내피 세포가 리모델링을 위해 계속하여 콜라겐 및 콜라게나제 뿐만 아니라 기질 금속단백분해효소(MMP)를 생성한다. 콜라겐 가교가 발생하고 상처는 수축을 겪는다. 리모델링기는 전형적으로 7일 내지 1년 동안 발생한다.
본원에 기재된 화합물 및 조성물은 상처 치유를 촉진하는데 이용될 수 있다 (예컨대, 상처 폐쇄 및/또는 상처 치유 촉진 또는 가속화, 상처 및/또는 상처 주위 조직의 흉터 섬유증 완화, 상처 주위 또는 상처에 가까운 세포의 아폽토시스 억제). 따라서, 특정 구체예에서, 본 발명은 화합물 (예컨대, CRM1 억제제), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 조성물을 피검체에게 투여하는 것을 포함하는, 피검체에서 상처 치유를 촉진하는 방법을 제공한다. 상기 방법이 상처의 완전한 치유 또는 폐쇄를 달성할 필요는 없다; 상기 방법은 어느 정도의 상처 폐쇄를 촉진하는 것으로 충분하다. 이와 관련하여, 상기 방법은 단독으로 또는 상처 조직을 치유하기 위한 다른 방법과 함께 이용될 수 있다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 염증(또는 초기) 단계 동안, 증식(또는 중기) 상처 치유 단계 동안, 및/또는 리모델링(또는 후기) 상처 치유 단계 동안 상처를 치료하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예에서, 상처 치유가 필요한 피검체는 인간 또는 동물, 예를 들어, 말, 돼지, 또는 설치류, 예컨대 마우스이다.
일부 구체예에서, 상처 치유에 유용한 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 국소적으로, 예를 들어, 상처 부위에 가깝게, 또는 전신적으로 투여된다.
보다 구체적으로, 본원에 기재된 화합물 또는 조성물은 상처를 코팅함에 의해 또는 본원에 기재된 화합물 또는 조성물로 코팅되거나 처리된 붕대, 충전재, 스티치 등을 이용하여 상처 부위에 투여될 수 있다 (임의로 다른 작용제와 함께). 이와 같이, 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 표면 상처를 치료하기 위해 국소 투여용으로 제형화될 수 있다. 국소 제형은 입(구강)을 통해 그리고 피부의 층 (즉, 표피, 진피, 및/또는 피하층)이 본원에 기재된 화합물 또는 조성물과 접촉하도록 피부로 전달되는 것들을 포함한다. 국소 전달 시스템을 이용하여 본원에 기재된 화합물 및 조성물의 국소 제형을 투여할 수 있다.
대안적으로, 본원에 기재된 화합물 및 조성물은, 예를 들어, 본원에 기재된 화합물 또는 조성물을 포함하는 용액의 주입, 서방성 제형의 주입, 또는 생체분해성 임플란의 도입에 의해 상처 부위에 또는 상처 부위에 가깝게 투여될 수 있다.
본원에 기재된 화합물 및 조성물은 급성 상처 또는 만성 상처를 치료하는데 이용될 수 있다. 만성 상처는 정상적인 재생 과정이 중단되었을 때 발생한다. 만성 상처는 인지되지 않은 지속적인 감염 또는 부적절한 일차 치료의 결과인 급성 손상으로부터 발생할 수 있다. 그러나 대부분의 경우에, 만성 병변은 정맥, 동맥, 또는 대사 혈관 질환, 욕창, 방사선 손상, 또는 종양으로 인한 진행성 조직 파괴의 마지막 단계이다.
만성 상처에서, 치유는 당뇨병성 궤양에서의 부적절한 순환, 화상에서와 같은 상당한 괴사, 및 감염을 포함하는 여러 가지 이유로 발생하지 않는다. 이러한 만성 상처에서, 생존력 또는 복구 단계는 종종 속도-제한 단계이다. 세포는 더 이상 생존가능하지 않으므로, 초기 회복 단계는 불리한 상처 층 환경에 의해 연장된다.
만성 상처는 하기로 한정되는 것은 아니지만 만성 허혈성 피부 병변(chronic ischemic skin lesions); 피부경화 궤양(scleroderma ulcers); 동맥 궤양(arterial ulcers); 당뇨족궤양(diabetic foot ulcers); 압박 궤양(pressure ulcers); 정맥 궤양(venous ulcers); 악성 하지 상처(non-healing lower extremity wounds); 염증성 질환으로 인한 궤양; 및/또는 오래된 상처(long-standing wounds)를 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 당뇨병성 상처 치유 또는 피검체에서 당뇨병 또는 허혈에 부차적인 다리 및 발 궤양의 치유를 촉진하는데 이용될 수 있다.
한 구체예에서, 상처는 표면 상처이다. 또 다른 구체예에서, 상처는 수술 상처이다 (예컨대, 복부 또는 위장의 수술 상처). 추가의 구체예에서, 상처는 화상이다. 또한 다른 구체예에서, 상처는 방사선 노출의 결과이다.
본원에 기재된 화합물 및 조성물은 또한 당뇨병성 상처 치유, 위장의 상처 치유, 또는, 예를 들어 수술로 인한 유착의 치유에 이용될 수 있다.
본원에 기재된 화합물 및 조성물은 또한 또 다른 질환에 부차적인 상처를 치유하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 건선 및 피부염과 같은 염증성 피부 질환에서, 상기 질환에 부차적이고, 피부의 깊은 균열 또는 피부의 긁힘에 의한 수많은 피부 병변 사건이 존재한다. 본원에 기재된 화합물 및 조성물을 이용하여, 이러한 질환, 예를 들어 염증성 피부 질환, 예컨대 건선 및 피부염에 부차적인 상처를 치유할 수 있다.
추가의 구체예에서, 상처는 내부 상처이다. 특수한 양태에서, 내부 상처는 만성 상처이다. 또 다른 특수한 구체예에서, 상처는 혈관 상처이다. 또한 다른 특수한 양태에서, 내부 상처는 궤양이다.
상처의 예는 이로 한정되는 것은 아니지만 찰과상, 찢김, 팽창성 상처(blowing wounds) (즉, 개방 기흉), 화상 상처, 타박상, 총상, 절개 상처, 개방 상처(open wounds), 관통 상처, 천공 상처, 찔린 상처, seton 상처, 자창, 수술 상처, 피하 상처, 당뇨병성 병변, 또는 비스듬 상처(tangential wounds)를 포함한다. 본원에 기재된 화합물 및 조성물에 의해 치료될 수 있는 상처의 추가 예는 급성 병태 또는 상처, 예컨대 열 화상, 화학 화상, 방사선 화상, 자외선 방사선에 과다 노출에 의한 화상 (예컨대, 일광 화상); 신체 조직, 예컨대 노동과 출산의 결과로서의 회음부에 대한 손상; 의료 과정 동안 지속 손상, 예컨대 외음부절개술; 절단, 절개, 긁은 상처를 포함한 외상-유도된 손상; 사고에서 입은 부상; 수술후 손상, 뿐만 아니라 만성 질환, 예컨대 압박 궤양(pressure sores), 욕창(bedsores), 당뇨병 및 원활하지 못한 순환과 관련된 질환, 및 모든 유형의 여드름을 포함한다. 또한, 상처는 피부염, 예컨대 농가진, 간찰진, 모낭염 및 습진, 치과 수술후 상처; 치주 질환; 외상후 상처; 및 종양-관련 상처를 포함할 수 있다. 또한 상처의 다른 예는 동물 물림, 동맥 질환, 곤충 독침 및 물림, 뼈 감염, 약화된 피부/근육 이식, 괴저, 피부 찢김 또는 열상, 피부 노화, 느리거나 비-치유 수술 상처를 포함하는 수술 절개, 뇌내출혈, 동맥류, 피부 무력증, 및 수술후 감염을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상처는 화상 상처, 절개 상처, 개방 상처, 수술 또는 수술후 상처, 당뇨병성 병변, 열 화상, 화학 화상, 방사선 화상, 압박 궤양(pressure sore), 욕창(bedsore), 및 당뇨병 및 원활하지 못한 순환과 관련된 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 피검체에서의 상처 치유 동안 흉터 형성을 감소시키는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 상처에서 및/또는 상처 주위에서 흉터 형성을 감소시키기에 효과적인 양으로 상처에 직접 또는 상처에 가까운 세포에 투여될 수 있다.
상처는 피검체의 신체의 어떠한 부분에 대한 손상을 포함할 수 있다. 구체예에 따르면, 화상 손상을 입은 피검체에서 흉터 형성을 개선, 감소, 또는 저하시키는 방법이 제공된다. 바람직한 구체예에 따르면, 급성 또는 만성 상처 또는 손상을 입은 피검체에서 비후 흉터를 치료하거나, 이의 출현을 감소시키거나, 발생 가능성을 감소시키는 방법이 제공된다.
다른 질병
본원에 기재된 화합물 및 조성물은 또한 확장성 심근병증(dilative cardiomyopathy), 비대심장근육병증(hypertrophic cardiomyopathy), 제한심장근육병증(restrictive cardiomyopathy), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 간섬유증(hepatic fibrosis), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 그 밖의 신장 장애를 포함한 비정상적인 조직 성장 및 섬유증의 질병을 치료하기 위해서 사용될 수 있다.
조합 방사선 요법
본원에 기재된 화합물 및 조성물은 방사선감작제로서 유용하다. 따라서, 본원에 기재된 화합물 및 조성물은 방사선 요법과 함께 투여될 수 있다. 방사선 요법은 종양을 수축시키고 악성 세포를 사멸시키며, 암 치료의 일부로서 일반적으로 이용되는 고-에너지 방사선(예컨대, x-선, 감마선, 하전된 입자)의 의료적 이용이다. 방사선 요법은 DNA를 손상시킴에 의해 악성 세포를 사멸시킨다.
방사선 요법은 여러 방식으로 환자에게 전달될 수 있다. 예를 들어, 방사선은 외부 빔 방사선 요법에서와 같이, 환자의 신체 외부의 기계와 같은, 외부 공급원으로부터 전달될 수 있다. 암의 치료를 위한 외부 빔 방사선 요법은 환자에 대해 외부에 있는 방사선 공급원, 전형적으로 방사성동위원소, 예컨대 60Co, 137Cs, 또는 고 에너지 x-선 공급원, 예컨대 선형 가속기를 이용한다. 외부 공급원은 환자의 종양 부위로 유도되는 평행 빔을 생성한다. 외부-공급원 방사선 요법은 내부-공급원 방사선 요법의 문제들 중 일부를 회피하나, 이는 바람직하지 않게 그리고 반드시 종양 조직과 함께 방사선 빔의 경로에 있는 비-종양성 또는 건강한 조직의 상당한 체적에 조사된다.
종양 부위에 수렴되는 빔을 이용하여 다양한 "gantry" 각도로 환자에게 외부 방사선 빔을 투영함으로써, 종양 조직에 주어진 방사선량을 유지하면서 건강한 조직에 조사되는 부작용을 감소시킬 수 있다. 방사선 빔의 경로를 따라, 건강한 조직의 특정 체적 엘리먼트를 변화시켜, 전체 치료 동안 건강한 조직의 각각의 그러한 엘리먼트에 대한 총 선량을 감소시킨다.
또한 방사선 빔의 축에 대해 수직으로 취해진 종양의 일반적인 단면에 방사선 빔을 밀집하여 시준함으로써 건강한 조직의 조사가 또한 감소될 수 있다. 이러한 원주 시준을 생성하기 위한 다수의 시스템이 존재하며, 이들 중 일부는 구분적으로, 임의의 윤곽의 방사선-비투과 마스크를 생성할 수 있는 다수의 슬라이딩 셔터를 이용한다.
외부 빔 방사선의 투여를 위해, 그 양은 치료 부피에 대해 하루걸러 1회 이상의 적어도 약 1 Gray (Gy) 분획일 수 있다. 특정 구체예에서, 방사선은 치료 부피에 대해 하루에 1회 이상의 적어도 약 2 Gray (Gy) 분획으로 투여된다. 또 다른 특정 구체예에서, 방사선은 1주일에 연속 5일 동안 치료 부피에 대해 하루에 1회 이상의 적어도 약 2 Gray (Gy) 분획으로 투여된다. 또 다른 특정 구체예에서, 방사선은 치료 부피에 대해 1주일에 하루걸러 3회의 10 Gy 분획으로 투여된다. 또 다른 특정 구체예에서, 적어도 약 총 20 Gy가 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구체예에서, 적어도 약 30 Gy가 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 또 다른 특정 구체예에서, 적어도 약 40 Gy가 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.
전형적으로, 환자는 1주일에 4회 또는 5회의 외부 빔 요법을 받는다. 치료의 전체 과정은 일반적으로 암의 유형과 치료의 목표에 따라 1 내지 7주간 지속된다. 예를 들어, 환자는 30일 동안 2 Gy/일의 선량을 수용할 수 있다.
내부 방사선 요법은 국소화된 방사선 요법이며, 이는 방사선 공급원이 종양 또는 영향받은 영역 부위에 배치됨을 의미한다. 내부 방사선 요법은 치료가 필요한 영역 내부 또는 영역 가까기에 방사선 공급원을 배치시킴에 의해 전달될 수 있다. 내부 방사선 요법은 근접치료라고도 불린다. 근접치료는 유강충간 치료 및 사이질 치료를 포함한다. 유강충간 치료에서, 방사성 공급원을 보유한 컨테이너를 종양에 또는 종양 가까이에 놓는다. 공급원을 체강에 놓는다. 사이질 치료에서, 방사성 공급원만을 종양에 놓는다. 이러한 방사성 공급원은 환자에 영구적으로 머무를 수 있다. 전형적으로, 방사성 공급원은 수 일 후에 환자에게서 제거된다. 방사성 공급원은 용기 중에 있다.
방사선약제를 투여하기 위한 다수의 방법이 존재한다. 예를 들어, 방사선약제는 표적화 방사성 컨쥬게이트, 예컨대 방사성표지된 항체, 방사성표지된 펩티드 및 리포솜 전달 시스템의 표적화 전달 또는 전신 전달에 의해 투여될 수 있다. 표적화 전달의 한 특정 구체예에서, 방사성표지된 약제는 방사성표지된 항체일 수 있다. 예를 들어, 그 내용이 본원에 참조로서 포함된 문헌[Ballangrud A. M., et al. Cancer Res., 2001; 61:2008-2014 and 금enber, D.M. J. Nucl. Med., 2002; 43(5):693-713]을 참조하라.
표적화 전달의 또 다른 특정 구체예에서, 방사선약제는 리포솜 전달 시스템의 형태, 예컨대 소형 단층 소포, 대형 단층 소포 및 다층 소포로 투여될 수 있다. 리포솜은 다양한 인지질, 예컨대 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린으로부터 형성될 수 있다. 예를 들어, 그 내용이 본원에 참조로서 포함된 문헌[Emfietzoglou D, Kostarelos K, Sgouros G. An analytical dosimetry study for the use of radionuclide-liposome conjugates in internal radiotherapy. J Nucl Med 2001; 42:499-504]을 참조하라.
또한 표적화 전달의 또 다른 특정 구체에에서, 방사성표지된 약제는 방사성표지된 펩티드일 수 있다. 예를 들어, 그 내용이 본원에 참조로서 포함된 문헌[Weiner RE, Thakur ML. Radiolabeled peptides in the diagnosis and therapy of oncological diseases. Appl Radiat Isot 2002 Nov;57(5):749-63]을 참조하라.
표적화 전달 외에, 근접치료를 이용하여 방사선약제를 표적 부위에 전달할 수 있다. 근접치료는 종양 부위에 가능한 한 가깝게 방사선 공급원을 놓는 기법이다. 종종 공급원은 종양에 직접 삽입된다. 방사성 공급원은 와이어, 시드 또는 로드의 형태일 수 있다. 일반적으로, 세슘, 이리듐 또는 아이오딘이 이용된다.
전신 방사선 요법은 방사선 요법의 또 다른 유형이고 혈액에서 방사성 물질의 이용을 수반한다. 전신 방사선 요법은 표적화 요법의 형태이다. 전신 방사선 요법에서, 환자는 전형적으로 방사성 아이오딘 또는 모노클로날 항체에 결합된 방사성 물질과 같은, 방사성 물질을 섭취하거나 이의 주입을 수용한다.
본원에 정의된 "방사선약제"는 하나 이상의 방사선-방출 방사성동위원소를 함유하는 약제를 지칭한다. 방사선약제는 다양한 질병의 진단 및/또는 치료를 위한 핵 의학에 일상적으로 이용된다. 방사성표지된 약제, 예를 들어 방사성표지된 항체는 방사선 공급원으로서 기능하는 방사성동위원소 (RI)를 함유한다. 본원에서 고려되는 용어 "방사성동위원소"는 금속 및 비-금속 방사성동위원소를 포함한다. 방사성동위원소는 방사성표지된 약제의 의학적 이용에 기반하여 선택된다. 방사성동위원소가 금속 방사성동위원소인 경우, 킬레이터는 통상적으로 금속 방사성동위원소를 분자의 나머지에 결합시키는데 이용된다. 방사성동위원소가 비-금속 방사성동위원소인 경우, 비-금속 방사성동위원소는 통상적으로 분자의 나머지에 직접 연결되거나, 링커를 통해 연결된다.
본원에서 사용되는 "금속 방사성동위원소"는 생체내 또는 시험관내 치료 또는 진단 절차에서 유용한 임의의 적합한 금속 방사성동위원소이다. 적합한 금속 방사성동위원소는 이로 한정되는 것은 아니지만 악티늄-225, 안티몬-124, 안티몬-125, 아세닉-74, 바륨-103, 바륨-140, 베릴륨-7, 비스무트-206, 비스무트-207, 비스무트212, 비스무트213, 카드뮴-109, 카드뮴-115m, 칼슘-45, 세륨-139, 세륨-141, 세륨-144, 세슘-137, 크롬-51, 코발트-55, 코발트-56, 코발트-57, 코발트-58, 코발트-60, 코발트-64, 구리-60, 구리-62, 구리-64, 구리-67, 에르븀-169, 유로퓸-152, 갈륨-64, 갈륨-67, 갈륨-68, 가돌리늄153, 가돌리늄-157 금-195, 금-199, 하프늄-175, 하프늄-175-181, 홀뮴-166, 인듐-110, 인듐-111, 이리듐-192, 철 55, 철-59, 크립톤85, 납-203, 납-210, 루테튬-177, 망간-54, 수은-197, 수은203, 몰리브덴-99, 네오디뮴-147, 넵투늄-237, 니켈-63, 니오븀95, 오스뮴-185+191, 팔라듐-103, 팔라듐-109, 백금-195m, 프라세오디뮴-143, 프로메튬-147, 프로메튬-149, 프로트악티늄-233, 라듐-226, 레늄-186, 레늄-188, 루비듐-86, 루테늄-97, 루테늄-103, 루테늄-105, 루테늄-106, 사마륨-153, 스칸듐-44, 스칸듐-46, 스칸듐-47, 셀레늄-75, 은-110m, 은-111, 소듐-22, 스트론튬-85, 스트론튬-89, 스트론튬-90, 황-35, 탄탈룸-182, 테크네튬-99m, 텔루륨-125, 텔루륨-132, 탈륨-204, 토륨-228, 토륨-232, 탈륨-170, 주석-113, 주석-114, 주석-117m, 티타늄-44, 텅스텐-185, 바나듐-48, 바나듐-49, 이테르븀-169, 이테르븀-86, 이테르븀-88, 이테르븀-90, 이테르븀-91, 아연-65, 지르코늄-89, 및 지르코늄-95를 포함한다.
본원에서 사용되는 "비-금속 방사성동위원소"는 생체내 또는 시험관내 치료 또는 진단 절차에서 유용한 임의의 적합한 비금속 방사성동위원소(비-금속 방사성동위원소)이다. 적합한 비-금속 방사성동위원소는 이로 한정되는 것은 아니지만 아이오딘-131, 아이오딘-125, 아이오딘-123, 인-32, 아스타틴-211, 플루오린-18, 탄소-11, 산소-15, 브롬-76, 및 질소-13을 포함한다.
방사선 요법에 가장 적절한 동위원소를 확인하는 것은 다양한 인자를 평가할 것을 요구한다. 여기에는 종양 흡수 및 유지, 혈중 청소, 방사선 전달 속도, 방사성동위원소의 반감기 및 특이적 활성, 및 경제적인 방식으로 방사성동위원소의 대규모 생성의 가능성이 포함된다. 치료용 방사선약제의 핵심은 제어 불가능한 부작용을 야기하지 않으며 종양 세포에 필요한 양의 방사선량을 전달하고 세포독성 또는 종양억제(tumoricidal) 효과를 달성하는 것이다.
치료용 방사성동위원소의 물리적 반감기는 종양 부위에서 방사선약제의 생물학적 반감기와 유사한 것이 바람직하다. 예를 들어, 방사성동위원소의 반감기가 지나치게 짧으면, 방사선약제가 최대 표적/배경 비에 도달하기 전에 큰 붕괴가 발생할 것이다. 반면에, 지나치게 긴 반감기는 정상 조직으로의 불필요한 방사선량을 야기시킬 수 있다. 이상적으로는, 방사성동위원소는 최소 선량률을 달성하고 대부분의 세포 주기의 방사선 민감성 단계 동안 모든 세포를 조사하기에 충분히 긴 반감기를 가져야 한다. 또한, 방사성동위원소의 반감기는 제조, 방출, 및 수송을 위한 적당한 시간을 허용하기에 충분히 길어야 한다.
종양 치료에서 주어진 용도에 대한 방사성동위원소를 선택하는 다른 실제적인 고려사항은 가용성과 품질이다. 순도는, 미량의 불순물이 방사성표지화 및 방사선약제의 방사화학적 순도에 영향을 미칠 수 있으므로, 충분하며 재현성이 있어야 한다.
종양에서의 표적 수용체 부위는 전형적으로 수에 있어서 제한적이다. 이와 같이, 방사성동위원소는 높은 특이적 활성을 지니는 것이 바람직하다. 특이적 활성은 생성 방법에 주로 의존적이다. 미량의 금속 오염물질은 종종 킬레이트에 대해 방사성동위원소와 경쟁하고 이들의 금속 착물은 방사성표지된 킬레이트제와 수용체 결합에 대해 경쟁하므로, 최소화되어야 한다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 방사선의 유형은 다양할 수 있다. 예를 들어, 방사선은 사실상 전자기이거나 미립자일 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 전자기 방사선은 이로 한정되는 것은 아니지만 x-선 및 감마 선을 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 미립자 방사선은 이로 한정되는 것은 아니지만 전자빔 (베타 입자), 양성자 빔, 중성자 빔, 알파 입자, 및 네거티브 파이 중간자를 포함한다. 방사선은 통상적인 방사선 치료 장치 및 방법을 이용하고, 수술중(intraoperative) 및 정위 방법에 의해 전달될 수 있다. 본 발명의 실시에 사용하기에 적합한 방사선 치료에 관한 추가의 논의는 문헌[Steven A. Leibel et al., Textbook of Radiation Oncology (1998) (publ. W. B. Saunders Company), and particularly in Chapters 13 and 14] 전반에서 찾아볼 수 있다. 방사선은 또한 표적화 전달, 예를 들어 방사성 "시드"에 의해서나, 표적화 방사성 컨쥬게이트의 전신 전달과 같은 그 밖의 방법에 의해 전달될 수 있다. 문헌[J. Padawer et al., Combined Treatment with Radioestradiol lucanthone in Mouse C3HBA Mammary Adenocarcinoma and with Estradiol lucanthone in an Estrogen Bioassay, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 7:347-357 (1981)]. 그 밖의 방사선 전달 방법을 본 발명의 실시에 이용할 수 있다.
종양 치료를 위해, α 및 β-입자 방출체 둘 모두가 조사되었다. 알파 입자는 특히 우수한 세포독성제인데, 그 이유는 이들이 하나 또는 2개의 세포 지름 내에 다량의 에너지를 소모하기 때문이다. β-입자 방출체는 에너지 수준에 따라 비교적 긴 침투 범위(조직에서 2-12 mm)를 지닌다. 장거리 침투는 이종성 혈류 및/또는 수용체 발현을 지니는 고형 종양에 특히 중요하다. β-입자 방출체는 표적 조직 내에 이질적으로 분배될 때조차도 더욱 균일한 용량 분포를 생산한다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 화합물 및 조성물의 치료적 유효량은 암 (예컨대, 폐암, 예컨대 비소세포폐암)을 치료하기 위해 치료적 유효량의 방사선 요법과 함께 투여된다. 필요한 방사선의 양은 특정 유형의 암에 대해 공지된 선량에 기반하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, [Cancer Medicine 5th ed., Edited by R.C. Bast et al., July 2000, BC Decker]을 참조하라.
상기 기재는 본 발명을 일반적으로 설명한 것이다. 하기 특수한 실시예를 참조로 하여 보다 완전한 이해가 얻어질 수 있다. 이러한 실시예는 단지 예시를 목적으로 기재된 것이며 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 상황에 따라서 또는 편의상 형태의 변경 및 등가물의 치환이 고려된다. 비록 특수한 용어가 본원에서 이용되었으나, 그러한 용어는 설명적인 의미로 의도된 것이며 제한하려는 목적이 아니다.
실시예
약어
aq. 수성
Boc 3차-부톡시카르보닐
CH2Cl2 디클로로메탄
DABCO 1,4-디아자바이사이클로[2.2.2]옥탄
DIPEA N,N-디이소프로필에틸아민
DMF N,N-디메틸포름아미드
DMSO 디메틸설폭사이드
eq. 당량(들)
EtOAc 에틸 아세테이트
EtOH 에탄올
h 시간(들)
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
LCMS 액체 크로마토그래피 질량 분광분석
LiOH 리튬 하이드록사이드
NMR 핵자기 공명
RT 실온 또는 체류 시간
T3P 프로필포스폰산 무수물
TFA 트리플루오로아세트산
THF 테트라하이드로푸란
상기 공정의 하기 설명을 통틀어, 적절한 경우, 유기 합성 분야의 당업자가 용이하게 이해할 방식으로 적합한 보호기가 첨가될 것이고, 후속하여, 다양한 반응물 및 중간체로부터 제거될 것임이 이해되어야 한다. 그러한 보호기를 이용하는 통상적인 절차뿐 아니라 적합한 보호기의 예는, 예를 들어, 문헌["Protective Groups in Organic Synthesis", T.W. Green, P.G.M. Wuts, Wiley-Interscience, New York, (1999)]에 기재되어 있다. 화학적 조작에 의한 기 또는 치환기의 또 다른 기 또는 치환기로의 변형은 최종 생성물을 향한 합성 경로 상에서 임의의 중간체 또는 최종 생성물에 대해 수행될 수 있고, 이 때 가능한 변형 타입은 그 단계에서 변형에 이용되는 조건 또는 시약에 대한 분자에 의해 운반된 다른 작용기 고유의 비양립성으로만 제한됨이 또한 이해되어야 한다. 이러한 고유의 비양립성, 및 적절한 변형 및 합성 단계를 적합한 순서로 수행함에 의해 이러한 비양립성을 회피하는 방식은 유기 합성 분야의 당업자에게 용이하게 이해될 것이다. 변형의 예는 하기에 제공되며, 요망되는 변형은 변형이 예시되어 있는 포괄적인 기 또는 치환기에만 제한되는 것이 아님이 이해되어야 한다. 다른 적합한 변형에 대한 참조 및 설명은 문헌["Comprehensive Organic Transformations - A Guide to Functional 그룹 Preparations" R. C. Larock, VHC Publishers, Inc. (1989)]에서 제공된다. 다른 적합한 반응의 참조 및 설명은 유기 화학의 텍스트북, 예를 들어 문헌["Advanced Organic Chemistry", March, 4th ed. McGraw Hill (1992) or, "Organic Synthesis", Smith, McGraw Hill, (1994)]에 기재되어 있다. 중간체 및 최종 생성물의 정제를 위한 기법은, 예를 들어, 컬럼 또는 회전판 상에서의 정상 및 역상 크로마토그래피, 재결정화, 증류 및 액체-액체 또는 고체-액체 추출을 포함하며, 이들은 당업자에 의해 용이하게 이해될 것이다. 치환기 및 기의 정의는, 상이하게 정의된 경우를 제외하고는, 화학식 (I)에서와 같다. 용어 "실온" 및 "주위 온도"는, 달리 명시되지 않는 한, 16 내지 25℃의 온도를 의미할 것이다. 용어 "환류"는, 달리 언급되지 않는 한, 이용된 용매에 관해, 명명된 용매의 비등점 온도 또는 비등점 초과의 온도를 의미할 것이다.
실시예 1. (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-피바로일아크릴로하이드라지드 (화합물 1)의 합성. 화합물 1은 하기 도식에 따라 합성되었다:
도식:
Figure 112020104886621-pat00038
3,5-비스(트리플루오로메틸)벤조티오아미드 (단계 1). 2L의 3-목 둥근바닥 플라스크를 DMF (1 L) 중의 3,5-비스(트리플루오로메틸)벤조니트릴 (200 g)의 용액으로 채웠다. 용액을 이후에 NaSH (123.7 g, 2.0 eq.) 및 MgCl2 (186.7 g, 1.0 eq.)로 처리하고, 반응 혼합물을 RT에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 빙수 슬러리 (10 L)에 붓고, 화합물을 EtOAc (3 x 1 L)로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 소듐 클로라이드 수용액(3 x 100 mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 205 g의 요망되는 미정제 3,5-비스(트리플루오로메틸)벤조티오아미드 (수율: 90 %)를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸 (단계 2). 5L의 3-목 둥근바닥 플라스크를 DMF (1.03 L) 중의 3,5-비스(트리플루오로메틸)벤조티오아미드 (205.65 g)의 용액으로 채웠다. 하이드라진 하이드레이트 (73.2 mL, 2.0 eq.)를 적가하고, 반응 혼합물을 RT에서 1시간 동안 교반하였다. HCOOH (1.03 L)를 적가하고 반응 혼합물을 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. RT로 냉각되게 한 후에, 반응 혼합물을 수성 중탄산나트륨 포화용액 (7 L)에 붓고 EtOAc(3 x 1 L)로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 소듐 클로라이드 수용액(3 x 500 mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압(35℃, 20 mmHg)하에 농축시켜 180 g의 미정제 생성물을 수득하였다. 이러한 미정제 물질을 석유 에테르(3 x 500 mL)와 함께 교반하고, 여과하고 건조시켜 160 g의 요망되는 3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸을 담황색 고형물 (수율: 75%)로서 수득하였다.
(Z)-이소프로필 3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴레이트 (단계 3). 2L의 3-목 둥근바닥 플라스크를 DMF (960 mL) 중의 3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸 (160 g)의 용액으로 채웠다. 용액을 DABCO (127.74 g, 2 eq.)로 처리하고, 30분 동안 교반한 후에 (Z)-이소프로필 3-아이오도아크릴레이트 (150.32 g, 1.1 eq.)를 적가하였다. 1시간 후에, 반응 혼합물을 빙수 슬러리 (5 L)에 붓고, EtOAc(3 x 1 L)로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 소듐 클로라이드 수용액(3 x 100 mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압(35℃, 20 mmHg)하에 농축시켜 250 g의 미정제 생성물을 수득하고, 이를 에틸 아세테이트/n-헥산 구배 (컬럼을 헥산으로 패킹하고 요망되는 화합물을 2% EtOAC/n-헥산로부터 용리시키기 시작하였음)를 사용하여 컬럼 크로마토그래피 (60/120 실리카겔)로 정제하였다. 요망되는 화합물을 함유하는 분획을 합하여 (Z)-이소프로필 3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴레이트 (138 g, 수율: 61%)를 수득하였다.
(Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (단계 4). 5L의 3-목 둥근바닥 플라스크에서, (Z)-이소프로필 3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴레이트 (130 g, 1.0 eq.)를 THF(1.3 L)에 용해시켰다. 물 (1.3 L) 중의 LiOH (69.3 g, 5.0 eq.)의 용액을 용액에 적가하고, 반응 혼합물을 RT에서 4시간 동안 교반한 후에, 400 mL 빙수 슬러리로 켄칭시키고, 묽은 수성 HCl로 산성 (pH = 2-3)으로 만들었다. 혼합물을 EtOAc(3 x 1 L)로 추출하고 합한 유기층을 포화 소듐 클로라이드 수용액으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 110 g의 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (수율:94%), (LCMS에 의한 시스 함량= 90.0%, 트랜스 함량= 8.2%)을 수득하였다.
(Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-피발로일아크릴로하이드라지드 (화합물 1). 50mL의 3-목 둥근바닥 플라스크에서, (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (0.2 g, 1.0 eq.)을 EtOAc (20 mL)에 용해시키고, -60℃로 냉각시켰으며, 이 때 피발로하이드라지드 (0.08 g, 1.2 eq.)가 적가 도입되었다. T3P (EtOAc 중 50%) (0.4 mL, 4 eq.)에 이어 DIPEA (0.4 mL, 4 eq.)를 적가시키고 반응 혼합물을 1 h 동안 -60℃에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (25℃, 20 mm Hg) 미정제 생성물을 수득하고, 이를 메탄올/디클로로메탄 구배 (컬럼을 디클로로메탄으로 패킹하고 요망되는 화합물을 3% 메탄올/디클로로메탄으로 용리시키기 시작하였음)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피 (60/120 실리카겔)에 의해 정제시켰다. 요망되는 화합물을 함유하는 분획을 합하여 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-피발로일아크릴로하이드라지드 (0.11 g, 수율: 43%)를 수득하였다;
실시예 2. (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-모르폴리노아세틸)아크릴로하이드라지드 (화합물 2)의 합성.
2-모르폴리노아세토하이드라지드. 25 mL의 3-목 둥근바닥 플라스크에서, 메틸 2-모르폴리노아세테이트 (0.25 g, 1.0 eq.)를 에탄올 (5 mL)에 RT에서 용해시켰다. 하이드라진 하이드레이트 (0.087 g, 1.1 eq.)를 RT에서 적가 도입시키고, 반응 혼합물을 95℃에서 20 h 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (40℃, 20 mm Hg) 미정제 2-모르폴리노아세토하이드라지드 (0.23 g)를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 이용하였다.
(Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-모르폴리노아세틸)아크릴로하이드라지드 (화합물 2). 50 mL의 3-목 둥근바닥 플라스크에서, (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (실시예 1, 단계 4; 0.5 g, 1.0 eq.)을 CH2Cl2: EtOAc (20 mL, 2:1)에 용해시키고, -60℃로 냉각시켰으며, 이 때 2-모르폴리노아세토하이드라지드 (0.23 g, 1.0 eq.)가 적가 도입되었다. T3P (EtOAc 중 50%) (1.27 mL, 1.5 eq.)에 이어 DIPEA (0.96 mL, 2 eq.)를 적가시키고 반응 혼합물을 1 h 동안 -60℃에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (25℃, 20 mm Hg) 미정제 생성물을 수득하고, 이를 메탄올/디클로로메탄 구배 (컬럼을 디클로로메탄으로 패킹하고 요망되는 화합물을 3% 메탄올/디클로로메탄으로 용리시키기 시작하였음)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피 (60/120 실리카겔)에 의해 정제시켰다. 요망되는 화합물을 함유하는 분획을 합하여 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-모르폴리노아세틸)아크릴로하이드라지드 (0.1 g, 수율: 14%)를 수득하였다.
실시예 3. (Z)-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)-5-메틸-1H-피라졸-4-카르보하이드라지드 (화합물 3)의 합성.
5-메틸-1H-피라졸-4-카르보하이드라지드. 25 mL의 밀봉된 튜브에서, 에틸 5-메틸-1H-피라졸-4-카르복실레이트 (0.25 g, 1.0 eq.)를 에탄올 (5 mL)에 RT에서 용해시켰다. 하이드라진 하이드레이트 (1 mL, 5 eq.)를 RT에서 적가 도입시키고, 반응 혼합물을 120℃에서 20 h 동안 가열시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (40℃, 20 mm Hg) 미정제 5-메틸-1H-피라졸-4-카르보하이드라지드 (0.24 g)를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 이용하였다.
(Z)-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)-5-메틸-1H-피라졸-4-카르보하이드라지드 (화합물 3). 50 mL의 3-목 둥근바닥 플라스크에서, (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (실시예 1, 단계 4; 0.5 g, 1.0 eq.)을 EtOAc:EtOH (15 mL, 2:1)에 용해시키고, -60℃로 냉각시켰으며, 이 때 5-메틸-1H-피라졸-4-카르보하이드라지드 (0.24 g, 1.0 eq.)가 적가 도입되었다. T3P (EtOAc 중 50%) (1.69 mL, 1.5 eq.)에 이어 DIPEA (2 mL, 8 eq.)를 적가시키고 반응 혼합물을 1 h 동안 -60℃에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (25℃, 20 mm Hg) 미정제 생성물을 수득하고, 이를 메탄올/디클로로메탄 구배 (컬럼을 디클로로메탄으로 패킹하고 요망되는 화합물을 3% 메탄올/디클로로메탄으로 용리시키기 시작하였음)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피 (60/120 실리카겔)에 의해 정제시켰다. 요망되는 화합물을 함유하는 분획을 합하여 (Z)-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)-5-메틸-1H-피라졸-4-카르보하이드라지드 (0.2 g, 수율: 42%)를 수득하였다.
실시예 4. (Z)-2-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)-N-사이클로프로필하이드라진카르보티오아미드 (화합물 4)의 합성
50mL의 3-목 둥근바닥 플라스크에서, (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (실시예 1, 단계 4; 0.5 g, 1.0 eq.)을 EtOAc:EtOH (15 mL, 2:1)에 용해시키고, -60℃로 냉각시켰으며, 이 때 N-사이클로프로필하이드라진카르보티오아미드 (0.22 g, 1.2 eq.)가 적가 도입되었다. T3P (EtOAc 중 50%) (1.69 mL, 2 eq.)에 이어 DIPEA (1 mL, 4 eq.)를 적가시키고 반응 혼합물을 1 h 동안 -60℃에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (25℃, 20 mm Hg) 미정제 생성물을 수득하고, 이를 메탄올/디클로로메탄 구배 (컬럼을 디클로로메탄으로 패킹하고 요망되는 화합물을 3% 메탄올/디클로로메탄으로 용리시키기 시작하였음)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피 (60/120 실리카겔)에 의해 정제시켰다. 요망되는 화합물을 함유하는 분획을 합하여 (Z)-2-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)-N-사이클로프로필하이드라진카르보티오아미드 (0.06 g, 수율: 9%)를 수득하였다.
실시예 5. (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-메틸-N'-(2-모르폴리노아세틸)아크릴로하이드라지드 (화합물 5)의 합성.
N-메틸-2-모르폴리노아세토하이드라지드. 25 mL의 밀봉된 튜브에서, 메틸 2-모르폴리노아세테이트 (0.5 g, 1.0 eq.)를 에탄올 (5 mL)에 RT에서 용해시켰다. 메틸하이드라진 (0.16 g, 1.1 eq.)을 RT에서 적가 도입시키고, 반응 혼합물을 95℃에서 48 h 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (40℃, 20 mm Hg) 미정제 N-메틸-2-모르폴리노아세토하이드라지드 (0.27 g)를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 이용하였다.
(Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-메틸-N'-(2-모르폴리노아세틸)아크릴로하이드라지드 (화합물 5). 50 mL의 3-목 둥근바닥 플라스크에서, (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (실시예 1, 단계 4; 0.3 g, 1.0 eq.)을 THF: EtOAc (15 mL, 2:1)에 용해시키고, -60℃로 냉각시켰으며, 이 때 N-메틸-2-모르폴리노아세토하이드라지드 (0.23 g, 1.5 eq.)가 적가 도입되었다. T3P (EtOAc 중 50%) (1.27 mL, 2.5 eq.)에 이어 DIPEA (0.45 mL, 3 eq.)를 적가하고 반응 혼합물을 1 h동안 -60℃에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (25℃, 20 mm Hg) 미정제 생성물을 수득하고, 이를 메탄올/디클로로메탄 구배 (컬럼을 디클로로메탄으로 패킹하고 요망되는 화합물을 3% 메탄올/디클로로메탄으로 용리시키기 시작하였음)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피 (60/120 실리카겔)에 의해 정제시켰다. 요망되는 화합물을 함유하는 분획을 합하여 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-메틸-N'-(2-모르폴리노아세틸)아크릴로하이드라지드 (0.052 g, 수율: 12%)를 수득하였다.
실시예 6. (Z)-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)피페리딘-3-카르보하이드라지드 (화합물 6)의 합성.
피페리딘-3-카르보하이드라지드. 30 mL의 밀봉된 튜브에서, 에틸 메틸 피페리딘-3-카르복실레이트 (1 g, 1.0 eq.)를 에탄올 (5 mL)에 RT에서 용해시켰다. 하이드라진 하이드레이트 (1.05 g, 3 eq.)를 RT에서 적가 도입시키고, 반응 혼합물을 120℃에서 20 h 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (40℃, 20 mm Hg) 미정제 피페리딘-3-카르보하이드라지드 (0.8 g)를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 이용하였다.
(Z)-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)피페리딘-3-카르보하이드라지드 (화합물 6). 50 mL의 3-목 둥근바닥 플라스크에서, (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (실시예 1, 단계 4; 0.25 g, 1.0 eq.)을 THF: EtOAc (15 mL, 2:1)에 용해시키고, -60℃로 냉각시켰으며, 이 때 피페리딘-3-카르보하이드라지드 (0.113 g, 1.1 eq.)가 적가 도입되었다. T3P (EtOAc 중 50%) (1.69 mL, 4 eq.)에 이어 DIPEA (0.25 mL, 2 eq.)를 적가시키고 반응 혼합물을 1 h 동안 -60℃에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (25℃, 20 mm Hg) 미정제 생성물을 수득하고, 이를 메탄올/디클로로메탄 구배 (컬럼을 디클로로메탄으로 패킹하고 요망되는 화합물을 3% 메탄올/디클로로메탄으로 용리시키기 시작하였음)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피 (60/120 실리카겔)에 의해 정제시켰다. 요망되는 화합물을 함유하는 분획을 합하여 (Z)-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)피페리딘-3-카르보하이드라지드 (0.01 g, 수율: 2.4%)를 수득하였다.
실시예 7. (S,Z)-2-아미노-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)-3-메틸부탄하이드라지드 2,2,2-트리플루오로아세테이트 (화합물 7)의 합성.
화합물 7을 하기 도식에 의해 합성하였다:
Figure 112020104886621-pat00039
(Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로하이드라지드 (단계 1). 50mL의 3-목 둥근바닥 플라스크에서, (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (실시예 1, 단계 4; 0.5 g, 1.0 eq.)을 THF (10 mL)에 용해시키고, -10℃로 냉각시켰으며, 이 때 NMP (0.3 g, 2.1 eq.)가 첨가되며, 반응 혼합물을 5분 동안 교반시켰다. 그 후 이소부틸 클로로포르메이트 (0.465 g, 2.4 eq.)을 첨가하고, 반응 혼합물을 1 h 동안 교반시켰다. 형성된 고형물을 여과에 의해 제거하였다. 여과액을 0℃로 냉각시키고, 3차-부톡시카르보닐 하이드라지드 (0.21 g, 1.1 eq.)를 도입시켰다. 반응 혼합물이 RT로 가온되게 하고, 여기서 이것을 1 h 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 얼음-수 슬러리에 붓고 EtOAc로 추출하였다 (3 X 50 mL). 합한 유기층을 포화 소듐 클로라이드 수용액(25 mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켜 (25℃, 20 mmHg) 0.5 g의 미정제 생성물을 수득하였다. 그 후 미정제 생성물을 THF (10 mL)에 용해시키고, TFA (2 mL)를 RT에서 적가하고, 반응 혼합물을 2 h 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고 (25℃, 20 mmHg) 형성된 고형물을 펜탄으로 분쇄시켜 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로하이드라지드 (0.25 g, 수율: 48.5%)를 수득하였다.
(S)-2-((3차-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄산. 25 mL의 3-목 둥근바닥 플라스크에서, (S)-2-아미노-3-메틸부탄산 (0.8 g, 1.0 eq.)을 물 (4 mL)에 용해시켰다. 중탄산나트륨 (0.63 g, 1.1 eq.)에 이어 디-3차-부틸 디카르보네이트 (2.97 g, 2.0 eq.)를 첨가하고, 반응 혼합물을 2 h 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc로 추출하였다 (3 X 10 mL). 합한 유기층을 포화 소듐 클로라이드 수용액(25 mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압(25℃, 20 mmHg)하에 농축시켜 1.2 g의 미정제 생성물을 수득하고, 이를 메탄올/디클로로메탄 구배 (컬럼을 디클로로메탄으로 패킹하고 요망되는 화합물을 3% 메탄올/디클로로메탄으로 용리시키기 시작하였음)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피 (60/120 실리카겔)에 의해 정제시켰다. 요망되는 화합물을 함유하는 분획을 합하여 (S)-2-((3차-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄산 (0.7 g, 수율: 47.3%)을 수득하였다.
(S,Z)-2-아미노-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)-3-메틸부탄하이드라지드 2,2,2-트리플루오로아세테이트 (화합물 7). 10 mL의 둥근바닥 플라스크에서, (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로하이드라지드 (0.25 g, 1.0 eq.)를 THF (5 mL)에 용해시키고, -60℃로 냉각시켰으며, 이 때 (S)-2-((3차-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄산 (0.19 g, 1.3 eq.)이 적가 도입되었다. T3P (EtOAc 중 50%) (0.81 mL, 2 eq.)에 이어 DIPEA (0.48 mL, 4 eq.)를 적가시키고 반응 혼합물을 1 h 동안 -60℃에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (25℃, 20 mm Hg) 미정제 생성물을 수득하고, 이를 메탄올/디클로로메탄 구배 (컬럼을 디클로로메탄으로 패킹하고 요망되는 화합물을 3% 메탄올/디클로로메탄으로 용리시키기 시작하였음)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피 (60/120 실리카겔)에 의해 정제시켰다. 요망되는 화합물을 함유하는 분획을 합하여 (S,Z)-3차-부틸 (1-(2-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)하이드라지닐)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트 (0.07 g, 수율: 18%)를 수득하였다. 이어서, 10 mL의 둥근바닥 플라스크에서, (S,Z)-3차-부틸 (1-(2-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)하이드라지닐)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트를 디클로로메탄 (2 mL)에 용해시켰다. TFA (0.05 mL)를 첨가하고, 반응 혼합물을 RT에서 5 h 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (25℃, 20 mm Hg) 미정제 생성물 (0.01 g)을 수득하고, 이를 석유 에테르로 분쇄하고, 감압 하에 건조시켜 (S,Z)-2-아미노-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)-3-메틸부탄하이드라지드 2,2,2-트리플루오로아세테이트 (0.006 g, 수율: 2 %)를 수득하였다.
실시예 8. (Z)-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)피라진-2-카르보하이드라지드 (화합물 8)의 합성.
25 mL의 3-목 둥근바닥 플라스크에서, (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (실시예 1, 단계 4; 0.5 g, 1.0 eq.)을 디클로로메탄 (5 mL)에 용해시키고, -60℃로 냉각시켰으며, 이 때 피라진-2-카르보하이드라지드 (0.216 g, 1.1 eq.)가 도입되었다. T3P (EtOAc 중 50%) (3.39 mL, 4 eq.)에 이어 DIPEA (0.5 mL, 2 eq.)를 적가시키고 반응 혼합물을 1 h 동안 -60℃에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (25℃, 20 mm Hg) 미정제 생성물을 수득하고, 이를 메탄올/디클로로메탄 구배 (컬럼을 디클로로메탄으로 패킹하고 요망되는 화합물을 3% 메탄올/디클로로메탄으로 용리시키기 시작하였음)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피 (60/120 실리카겔)에 의해 정제시켰다. 요망되는 화합물을 함유하는 분획을 합하여 (Z)-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)피라진-2-카르보하이드라지드 (0.13 g, 수율: 19.4%)를 수득하였다.
실시예 9. (Z)-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)-1-메틸피페리딘-4-카르보하이드라지드 (화합물 9)의 합성.
1-메틸피페리딘-4-카르보하이드라지드. 25 mL의 밀봉된 튜브에서, 메틸 1-메틸피페리딘-4-카르복실레이트 (0.2 g, 1.0 eq.)를 에탄올 (5 mL)에 RT에서 용해시켰다. 하이드라진 하이드레이트 (0.127 g, 2 eq.)를 RT에서 적가 도입시키고, 반응 혼합물을 120℃에서 20 h 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (40℃, 20 mm Hg) 미정제 1-메틸피페리딘-4-카르보하이드라지드 (0.145 g)를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 이용하였다.
(Z)-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)-1-메틸피페리딘-4-카르보하이드라지드 (화합물 9). 50mL의 3-목 둥근바닥 플라스크에서, (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (0.25 g, 1.0 eq.)을 EtOAc:THF (15 mL; 2:1)에 용해시키고, -60℃로 냉각시켰으며, 이 때 1-메틸피페리딘-4-카르보하이드라지드 (0.123 g, 1.1 eq.)가 도입되었다. T3P (EtOAc 중 50%) (0.85 mL, 2 eq.)에 이어 DIPEA (0.31 mL, 2.5 eq.)를 적가시키고 반응 혼합물을 1 h 동안 -60℃에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (35℃, 20 mm Hg) 미정제 생성물을 수득하고, 이를 메탄올/디클로로메탄 구배 (컬럼을 디클로로메탄으로 패킹하고 요망되는 화합물을 3% 메탄올/디클로로메탄으로 용리시키기 시작하였음)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피 (60/120 실리카겔)에 의해 정제시켰다. 요망되는 화합물을 함유하는 분획을 합하여 (Z)-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)-1-메틸피페리딘-4-카르보하이드라지드 (0.016 g, 수율: 4.5%)를 수득하였다.
실시예 10. (R,Z)-2-아미노-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)-3-메틸부탄하이드라지드 2,2,2-트리플루오로아세테이트 (화합물 10)의 합성.
(R)-2-((3차-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄산. 25 mL의 3-목 둥근바닥 플라스크에서, (R)-2-아미노-3-메틸부탄산 (0.8 g, 1.0 eq.)을 물 (4 mL)에 용해시켰다. 중탄산나트륨 (0.394 g, 1.1 eq.)에 이어 디-3차-부틸 디카르보네이트 (1.86 g, 2.0 eq.)를 첨가하고, 반응 혼합물을 2 h 동안 RT에서 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc로 추출하였다 (3 X 10 mL). 합한 유기층을 포화 소듐 클로라이드 수용액(25 mL)으로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압(25℃, 20 mmHg)하에 농축시켜 0.75 g의 미정제 생성물을 수득하고, 이를 메탄올/디클로로메탄 구배 (컬럼을 디클로로메탄으로 패킹하고 요망되는 화합물을 3% 메탄올/디클로로메탄으로 용리시키기 시작하였음)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피 (60/120 실리카겔)에 의해 정제시켰다. 요망되는 화합물을 함유하는 분획을 합하여 (R)-2-((3차-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄산 (0.44 g, 수율: 47.3%)을 수득하였다.
(R,Z)-2-아미노-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)-3-메틸부탄하이드라지드 2,2,2-트리플루오로아세테이트 (화합물 10). 10 mL 둥근바닥 플라스크에서, (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로하이드라지드 (0.05 g, 1.0 eq.)를 THF (5 mL)에 용해시키고, -60℃로 냉각시켰드며, 이 때 (R)-2-((3차-부톡시카르보닐)아미노)-3-메틸부탄산 (0.038 g, 1.3 eq.)이 적가 도입되었다. T3P (EtOAc 중 50%) (0.16 mL, 2 eq.)에 이어 DIPEA (0.095 mL, 4 eq.)를 적가시키고 반응 혼합물을 1 h 동안 -60℃에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (25℃, 20 mm Hg) 미정제 생성물을 수득하고, 이를 메탄올/디클로로메탄 구배 (컬럼을 디클로로메탄으로 패킹하고 요망되는 화합물을 3% 메탄올/디클로로메탄으로 용리시키기 시작하였음)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피 (60/120 실리카겔)에 의해 정제시켰다. 요망되는 화합물을 함유하는 분획을 합하여 (R,Z)-3차-부틸 (1-(2-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)하이드라지닐)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트 (0.017 g, 수율: 26%)를 수득하였다. 이어서, 10 mL의 둥근바닥 플라스크에서, (R,Z)-3차-부틸 (1-(2-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)하이드라지닐)-3-메틸-1-옥소부탄-2-일)카르바메이트를 디클로로메탄 (2 mL)에 용해시켰다. TFA (0.2 mL)를 첨가하고, 반응 혼합물을 RT에서 5 h 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (25℃, 20 mm Hg) 미정제 생성물 (0.02 g)을 수득하고, 이를 석유 에테르로 분쇄하고, 감압 하에 건조시켜 (R,Z)-2-아미노-N'-(3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴로일)-3-메틸부탄하이드라지드 2,2,2-트리플루오로아세테이트 (0.007 g, 수율: 35 %)를 수득하였다.
실시예 11. (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-(피라진-2-일)아세틸)아크릴로하이드라지드 (화합물 11)의 합성.
2-(피라진-2-일)아세토하이드라지드. 25 mL의 밀봉된 튜브에서, 메틸 2-(피라진-2-일)아세테이트 (0.25 g, 1.0 eq.)를 에탄올 (5 mL)에 RT에서 용해시켰다. 하이드라진 하이드레이트 (0.33 g, 4 eq.)를 RT에서 적가 도입시키고, 반응 혼합물을 120℃에서 20 h 동안 가열시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (40℃, 20 mm Hg) 미정제 2-(피라진-2-일)아세토하이드라지드 (0.2 g)를 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 이용하였다.
(Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-(피라진-2-일)아세틸)아크릴로하이드라지드 (화합물 11). 50mL의 3-목 둥근바닥 플라스크에서, (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (0.3 g, 1.0 eq.)을 EtOAc:THF (15 mL; 2:1)에 용해시키고, -60℃로 냉각시켰으며, 이 때 2-(피라진-2-일)아세토하이드라지드 (0.129 g, 1.1 eq.)가 도입되었다. T3P (EtOAc 중 50%) (1.01 mL, 2 eq.)에 이어 DIPEA (0.35 mL, 2.5 eq.)를 적가시키고 반응 혼합물을 1 h 동안 -60℃에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 (25℃, 20 mm Hg) 미정제 생성물을 수득하고, 이를 메탄올/디클로로메탄 구배 (컬럼을 디클로로메탄으로 패킹하고 요망되는 화합물을 3% 메탄올/디클로로메탄으로 용리시키기 시작하였음)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피 (60/120 실리카겔)에 의해 정제시켰다. 요망되는 화합물을 함유하는 분획을 합하여 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-(피라진-2-일)아세틸)아크릴로하이드라지드 (0.025 g, 수율: 5%)를 수득하였다.
실시예 12. (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-모르폴리노-2-옥소아세틸)아크릴로하이드라지드 (화합물 12)의 합성.
Figure 112020104886621-pat00040
에틸 2-모르폴리노-2-옥소아세테이트의 합성:
Figure 112020104886621-pat00041
디에틸 에테르 (5 mL) 중 에틸 2-클로로-2-옥소아세테이트 (1.25 g, 9.18 mmol)의 용액을 디에틸 에테르 (20 mL) 및 트리에틸아민 (1.16 g, 11.48 mmol) 중 모르폴린 (1.0 g, 11.48 mmol)의 용액에 0℃에서 적가하였다. 반응 혼합물이 실온까지 가온되게 하고 2 h 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여과액을 감압 하에 농축시켰다. 황색 오일을 25 mL의 얼음수에 옮기고 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3 x 20 mL). 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 1 g의 미정제 생성물을 수득하고, 이를 임의의 추가 정제 없이 이용하였다. 미정제 수율 47%.
Figure 112020104886621-pat00042
2-모르폴리노-2-옥소아세토하이드라지드의 합성:
Figure 112020104886621-pat00043
에틸 2-모르폴리노-2-옥소아세테이트 (1.0 g, 5.34 mmol)를 에탄올 (7 mL)에 용해시키고, 하이드라진 하이드레이트 (0.267g, 5.34 mmol)를 0℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 0.9g의 미정제 생성물을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 이용하였다. 미정제 수율 90%.
Figure 112020104886621-pat00044
(Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-모르폴리노-2-옥소아세틸)아크릴로하이드라지드의 합성:
Figure 112020104886621-pat00045
THF (3 mL) 중 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (0.2 g, 0.569 mmol) 및 2-모르폴리노-2-옥소아세토하이드라지드 (0.02 g, 0.175 mmol)의 용액을 -60℃로 냉각시켰다. T3P (0.098 g, 0.569 mmol) (0.50 mL)에 이어 DIPEA (0.11 g, 0.854 mmol)를 적가시키고 -60℃에서 1 h 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 25 mL의 얼음수로 옮기고 에틸 아세테이트로 추출하였다 (2 x 25 mL). 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 0.3 g의 미정제 생성물을 수득하고, 이를 크로마토그래피 (0-4% MeOH/CH2Cl2)에 의해 정제시켜 0.15 g의 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-모르폴리노-2-옥소아세틸) 아크릴로하이드라지드 (수율 50%)를 수득하였다.
Figure 112020104886621-pat00046
실시예 13. (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-(3,5-디메틸모르폴리노)아세틸)아크릴로하이드라지드 (화합물 13)의 합성.
Figure 112020104886621-pat00047
2,2'-아자 아잔디일디프로판-1-올의 합성:
Figure 112020104886621-pat00048
2-아미노프로판-1-올 (5 g, 66.57 mmol) 및 1-하이드록시프로판-2-온 (5.77g, 77.89 mmol)을 에탄올 (115 mL)에 용해시키고 50 mg의 PtO2를 첨가하였다. 반응 혼합물을 50 psi H2 압력으로 실온에서 24 h 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여과액을 감압 하에 농축시켜 미정제 생성물을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 이용하였다. 미정제 수율: 79%.
Figure 112020104886621-pat00049
3,5-디메틸모르폴린의 합성:
Figure 112020104886621-pat00050
2,2'-아잔디일디프로판-1-올 (7 g, 52 mmol)을 농축된 H2SO4 (5.3 mL, 99.8 mmol)에 실온에서 현탁시키고, 180℃에서 8 h 동안 가열시켰다. 반응 혼합물을 0℃에서 냉각시키고, 60 mL의 물 중 KOH (11.79 g, 21.02 mmol)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12 h 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과시키고, 여과액을 CHCl3:MeOH (85:15; 5X50 mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 황산 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 3.5 g의 미정제 생성물을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 이용하였다 (미정제 수율: 58%).
에틸 2-(3,5-디메틸모르폴리노)아세테이트의 합성:
Figure 112020104886621-pat00051
포타슘 카르보네이트 (0.311 g, 2.25 mmol) 및 에틸 브로모아세테이트 (0.319 g, 1.91 mmol)를 아세토니트릴 (4 mL) 중 3,5-디메틸모르폴린 (0.2 g, 1.73 mmol)의 용액에 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 12 h 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 얼음수로 옮기고 에틸 아세테이트로 추출하였다 (20 mL x 3). 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 미정제 생성물을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 이용하였다 (미정제 수율: 54%).
에틸 2-(3,5-디메틸모르폴리노)아세토하이드라지드의 합성:
Figure 112020104886621-pat00052
에틸-2-(3,5-디메틸모르폴리노)아세테이트 (0.19 g, 0.944 mmol)를 에탄올 (4 mL)에 용해시키고, 하이드라진 하이드레이트 (0.047 g, 0.944 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 20 h 동안 교반시키고, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켜 미정제 생성물을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 이용하였다. (미정제 수율: 97 %).
Figure 112020104886621-pat00053
(Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-(3,5-디메틸모르폴리노)아세틸)아크릴로하이드라지드의 합성:
Figure 112020104886621-pat00054
THF (10 mL) 중 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (0.2 g, 0.569 mmol) 및 2-(3,5-디메틸모르폴리노)아세토하이드라지드 (0.106 g, 0.569 mmol)의 용액에 -60℃에서 T3P (0.543 g, 0.854 mmol)에 이어 DIPEA (0.110 g, 0.854 mmol)를 첨가하고, 2 h 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 25 mL의 얼음수로 옮기고, 에틸 아세테이트로 추출하고 (2 x 25 mL), 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 미정제 생성물을 수득하고, 이를 크로마토그래피 (0-3% MeOH/CH2Cl2)에 의해 정제시켜 0.02 g의 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-(3,5-디메틸모르폴리노)아세틸)아크릴로하이드라지드 (수율: 7%)를 수득하였다.
Figure 112020104886621-pat00055
실시예 14. (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-(3-옥소모르폴리노)아세틸)아크릴로하이드라지드 (화합물 14)의 합성.
Figure 112020104886621-pat00056
에틸 2-(3-옥소모르폴리노) 아세테이트의 합성:
Figure 112020104886621-pat00057
모르폴린-3-온 (3 g, 29.67 mmol)을 DMF (15 mL, 29.67 mmol)에 용해시키고, NaH (1.78 g, 44.51 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반시키고, 에틸브로모 아세테이트 (3.76 mL, 32.64 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3 h 동안 추가로 교반시키고, 50 mL의 물로 옮기고, EtOAc로 추출하였다 (3 x 50 mL). 합한 유기층을 염수 용액으로 세척하고 (2 x 50 mL), 무수 황산 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 미정제 생성물을 수득하고, 이를 크로마토그래피 (0-100% 에틸 아세테이트/헥산)에 의해 정제시켜 600 mg의 에틸-2-(3-옥소모르폴리노)아세테이트 (수율: 10%)를 수득하였다. LCMS m/z 187 [M+H]+, tR 2.505 min.
2-(3-옥소모르폴리노)아세토하이드라지드의 합성:
Figure 112020104886621-pat00058
에틸-2-(3-옥소모르폴리노)아세테이트 (600 mg, 3.21 mmol)를 에탄올 (3 mL)에 용해시키고, 하이드라진 하이드레이트 (160.46 mg, 3.21 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 1 h 동안 가열시켰다. 반응 혼합물을 50 mL의 물로 옮기고, EtOAc로 추출하였다 (3 x 50 mL). 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 미정제 생성물을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 이용하였다 (미정제 수율: 54%). LCMS m/z 174.05 [M+H]+ tR 2.489 min.
(Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-(3-옥소모르폴리노)아세틸)아크릴로하이드라지드의 합성:
Figure 112020104886621-pat00059
(Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (0.400 g, 1.14 mmol)을 THF(4 mL)에 용해시키고, 2-(3-옥소모르폴리노)아세토하이드라지드 (0.295 g, 1.71 mmol)를 첨가하였다. T3P (1.09 g, 1.71 mmol)에 이어 DIPEA (220.80 mg, 1.71 mmol)를 -60℃에서 적가시키고, 반응 혼합물을 1 h 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 25 mL의 얼음수로 옮기고, EtOAc로 추출하였다 (2x25 mL). 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 미정제 생성물을 수득하고, 이를 크로마토그래피 (0-4% MeOH/CH2Cl2)에 의해 정제시켜 0.05 g의 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-(3-옥소모르폴리노)아세틸) 아크릴로하이드라지드 (수율: 8%)를 수득하였다.
Figure 112020104886621-pat00060
실시예 15. (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-(3,3-디메틸모르폴리노)아세틸)아크릴로하이드라지드 (화합물 15)의 합성.
Figure 112020104886621-pat00061
에틸 2-(3,3-디메틸모르폴리노)아세테이트의 합성:
Figure 112020104886621-pat00062
3,3-디메틸모르폴린 (1 g, 8.68 mmol)을 아세토니트릴 (5 mL)에 용해시키고, 포타슘 카르보네이트 (1.8 g, 13 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반시키고, 에틸브로모 아세테이트 (1.1 mL, 9.55 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 1 h 동안 가열시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 50 mL의 물로 옮기고, 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3x50 mL). 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 미정제 생성물을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 이용하였다 (미정제 수율: 91%). LCMS m/z 202.9 [M+H]+, tR 2.33 min.
2-(3,3-디메틸모르폴리노)아세토하이드라지드의 합성:
Figure 112020104886621-pat00063
에탄올 (3 mL) 중 에틸 2-(3-옥소모르폴리노)아세테이트 (600 mg, 2.98 mmol)의 용액에 하이드라진 하이드레이트 (0.20 mL, 2.98 mmol)를 실온에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 1 h 동안 가열시키고, 실온까지 냉각되게 하고, 50 mL의 물로 옮기고, 에틸 아세테이트로 추출하였다 (3x25 mL). 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 미정제 생성물을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 이용하였다 (미정제 수율: 28%). LCMS m/z 188 [M+H]+ tR: 188 min.
(Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-(3,3-디메틸모르폴리노)아세틸)아크릴로하이드라지드의 합성:
Figure 112020104886621-pat00064
THF (2.5 mL) 중 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산 (0.250 g, 0.7 mmol) 및 2-(3,3-디메틸모르폴리노)아세토하이드라지드 (0.160 g, 0.85 mmol)의 용액에 T3P (0.63 mL, 1.06 mmol)에 이어 DIPEA (0.18 mL, 1.06 mmol)를 -60℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 1 h 동안 교반시키고, 25 mL의 얼음수로 옮기고, 에틸 아세테이트로 추출하였다 (2x25mL). 합한 유기층을 염수로 세척하고, 무수 황산 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켜 미정제 생성물을 수득하고, 이를 크로마토그래피 (0-4% MeOH:CH2Cl2)에 의해 정제시켜 0.05 g의 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-(2-(3,3-디메틸모르폴리노)아세틸)아크릴로하이드라지드 (수율: 13%)를 수득하였다.
Figure 112020104886621-pat00065
실시예 16. 검정. 본 발명의 특정 화합물을 화합물 X-1, X-2 및 X-3 (하기 도시됨)과 함께 다양한 검정으로 시험하였다.
Figure 112020104886621-pat00066
핵 외수송의 억제
본 발명의 화합물에 의한 CRM1 매개된 핵 외수송의 억제를 평가하였다. 결과는 표 2에 제시된다. CRM1 단백질에 대한 화합물의 억제 활성은 RevGFP 검정으로 평가되었다. 본 발명의 화합물은 Rev-GFP 검정에서 IC50 < 10 μM로 활성이며 가장 바람직한 화합물은 1 μM의 IC50 값을 갖는 활성을 지닌다.
실험 프로토콜: Rev는 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1)으로부터의 단백질이고, 이는 이의 C-말단 도메인 내에 핵 외수송 신호(NES) 및 이의 N-말단 도메인 내에 핵 국소화 신호(NLS)를 함유한다. Rev 단백질의 핵 외수송은 전통적인 NES/CRM1 경로에 의존한다 (Neville et al, 1997, Kau et al, 2003). Rev의 핵 축적은 CRM1의 특정 억제제, 예컨대, LMB로 처리된 세포에서 관찰된다 (Kau et al. 2003). 이러한 검정에서, U2OS-RevGFP 세포를 실험 전날 투명-바닥의 흑색 384-웰 플레이트에 시딩하였다. 화합물을 별개의 384-웰 플레이트에서 40 μM로부터 시작하여 DMEM 중에서 1:2로 연속 희석시킨 후, 세포로 전달하였다. 세포를 약 1시간 동안 화합물과 함께 인큐베이션시키고, 3.7% 포름알데하이드로 고정시키고, Hoechst 33258로 핵 염색시켰다. 세포 핵 내의 GFP의 양을 측정하고, 화합물의 IC50들을 결정하였다(Kau et al. 2003).
MTT 세포 증식 검정
화합물의 세포독성 및 세포증식억제 특성을 연구하기 위해 MM1.S Jurkat 및 HCT-116 세포에서 CellTiter 96® AQueous One Solution 세포 증식 검정(Promega)을 사용하였다. 상기 검정은 전자-커플링 시약 PES(페나진 에토설페이트)의 존재하에서 테트라졸륨 염 MTS의 분해를 기초로 한다. MTS 테트라졸륨 화합물은 조직 배양 배지에서 가용성인 착색된 포르마잔 생성물로 세포에 의해 생체환원된다. 이러한 전환은 아마 대사적으로 활성인 세포에서 데하이드로게나제 효소에 의해 생성된 NADPH 또는 NADH에 의해 달성된다. 검정은 적은 양의 CellTiter 96® AQueous One solution 시약을 배양 웰에 직접 첨가하고, 1-4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 96-웰 플레이트 판독기를 이용하여 490nm에서의 흡광도를 기록함으로써 수행된다. 흡광도는 세포수와 이들의 대사 활성에 대한 직접적인 상관관계를 나타내었다.
세포는 100 ㎕의 새로운 배양 배지 중에서 96-웰 플레이트의 각각의 웰 내에 5x103 내지 1.5x104개의 세포 (세포 유형에 따라)로 시딩하였고, 유착 세포를 밤새 부착시켰다. 화합물의 스톡 용액을 세포 배양 배지 중에 희석시켜 1 nM 내지 30 μM 범위의 각각의 약물의 8개의 농도를 수득하였고, 1% v/v 미만의 DMSO를 음성 대조군으로 사용하였다. 처리 72시간 후, 20 ㎕의 CellTiter 96® AQueous 시약을 96-웰 검정 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 가습화된 5% CO2 대기에서 1-4시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 이후, 각각의 웰의 흡광도를 96-웰 플레이트 판독기를 이용하여 490 nm에서 기록하였다. 대부분의 경우, 검정을 삼중으로 수행하였고, 결과를 하기 개시된 최대 절반 억제 농도(IC50)로 제시하였다. 화합물 농도에 비한 광학 밀도를 플롯팅하였고, 비-선형 회귀 식(Excel fit)을 이용하여 분석하였고, 각각의 화합물에 대한 IC50을 계산하였다. 결과는 표 2에 제시된다.
약동학(PK) 및 뇌:혈장 비의 결정
혈액을 전체 10개의 시점(투여-전, 투여 후 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간 및 24시간)으로 제공된 마우스(N=3)로부터 수거하였다. 마우스를 회전을 기초로 하여 채혈하였고, 각각의 마우스를 혈액 수거를 위해 3개의 시점에 제공하였다. 지정된 시점에서, 동물을 이소플루란 하에서 마취시키고, 시점 당 약 110 ㎕의 혈액을 안구뒤(retro-orbital) 천자를 통해 미리 냉각된 K2EDTA(항응고제) 튜브로 수거하였다. 혈액 샘플을 습성 얼음 상에 두고, 원심분리(2000g, 4℃에서 5분)시켜 샘플 수거 30분 이내에 혈장을 수득하였다. 모든 샘플을 분석 때까지 약 -80℃에서 동결 저장하였다. 분석 전, 샘플을 아세토니트릴 중에서 내부 표준(덱사메타손)과 함께 혼합하고, 볼텍싱시키고, 원심분리시키고, 상층액을 분석을 위해 주입하였다. 혈장 중 화합물의 농도를 LC-MS-MS 기계(API 4000, 전기분무 이온화를 이용한 Triple Quadruple; Acuity Ultra Performance Liquild Chromatography 컬럼 C18, 유기 용매로서 MeOH 및 포름산을 이용함)를 이용하여 결정하였다. 비제한적으로 Tmax, Cmax, t1/2, AUClast, AUCinf를 포함하는 PK 변수를 WinNonlin Professional 6.2 소프트웨어 패키지, 비-구획 약동학 모델 NCA200을 이용하여 계산하였다.
뇌 대 혈장 비(B:P). 별개의 그룹의 마우스(N=3)에게 투여(달리 지시되지 않는 한 10 mg/kg의 PO)한 후, 최대 혈장 농도(투여 2시간 후의 추정 Tmax)의 시점에서 희생시켰고, 이 때 최종 혈장 및 뇌를 수거하였다. 수거 후, 뇌 조직을 저온 염수로 헹구고, 필터 종이 상에서 건조시키고, 칭량하고, 드라이아이스 상에 두어 급속-동결시켰다. 모든 샘플을 분석때까지 약 -80℃에서 동결 저장하였다. 분석 시점에서, 뇌 조직을 균질화(균질화 용액 PBS, pH 7.4)시키고, 아세토니트릴 중의 내부 표준(덱사메타손)과 혼합하고, 볼텍싱하고, 원심분리시키고, LC-MS-MS 방법(API 4000, 전기분무 이온화를 이용한 Triple Quadruple; Acuity Ultra Performance Liquild Chromatography 컬럼 C18, 유기 용매로서 MeOH 및 포름산을 이용함)을 이용하여 화합물의 농도의 분석을 위해 상층액을 주입하였다. 혈장 샘플을 동일 방법(균질화 단계 제외)으로 처리하고, 어느 한 매트릭스 내의 화합물의 농도를 발생된 표준 곡선을 기초로 하여 계산하였다. 결과는 표 2에 제시된다.
표 2. 화학식 (I)의 화합물 및 이에 대한 비교측정기에 대한 검정 결과.
Figure 112020104886621-pat00067
* 10 mg/kg po로 마우스에 투여됨.
** US 2009/0275607호로부터의 화합물 26.
*** US 2009/0275607호로부터의 화합물 44.
**** 5 mg/kg po로 마우스에 투여됨.
‡ 10 mg/kg po로 마우스에 투여된 화합물 X-1에 대한 AUCInf 값은 정량 한계 미만이었다. 데이터는 5 mg/kg iv에 대해 보고되었다.
† 10 mg/kg po로 래트에 투여됨.
NT = 시험되지 않음
N/A= 정량가능한 한계 미만
화합물 X-1에 대한 AUCInf는 10 mg/kg po로 마우스에 투여되는 경우 검출 한계 미만이었다. 5 mg/kg iv로 투여되는 경우, 화합물 X-1은 209 hr·ng/mL의 낮은 AUCInf에 의해 나타나는 바와 같이 최소 노출을 나타내었다. 화합물 X-1에 대한 뇌 대 혈장 비는 po 투여되는 경우 뇌에서 이의 무시할만한 수준 (정량 한계 미만)으로 인해 결정되지 않았다.
화합물 X-2에 대한 AUCInf는 10 mg/kg po로 래트에 투여되는 경우 68.3 hr·ng/mL인 것으로 계산되었다. 이러한 노출 수준은 본 발명의 화학식 (I)의 화합물 및 화합물 X-3과 비교하는 경우 매우 낮은 것이다. 그러나, 화합물 X-2는 중등의 뇌 대 혈장 비를 나타낸다. 무시 못할 뇌 대 혈장 비와 커플링된 낮은 AUCInf는 화합물 X-2가 낮은 노출 수준에도 불구하고 BBB를 가로지를 수 있는 것을 암시한다. 본 출원인은 화합물 X-2가 이의 AUCInf가 증가하는 경우 유의하게 더 높은 뇌 대 혈장 비를 가질 것으로 생각한다.
화합물 X-3에 대한 AUCInf는 10 mg/kg po로 래트에 투여되는 경우 12300 hr·ng/mL인 것으로 계산되었고, 이는 우수한 노출을 나타낸다. 그러나, X-3은 5.0의 높은 B:P 비를 나타내었다.
화학식 (I)의 화합물은 모두 높은 AUCInf (>3500 hr·ng/mL) 및 비교적 낮은 B:P (<2.5)를 나타낸다. 일반적으로, 치료제의 더 큰 노출 수준은 종종 뇌 침투의 가능성을 증가시킨다. 따라서, 화학식 (I)의 화합물이 높은 AUCInf 수준을 나타내는 반면 비교적 낮은 뇌 대 혈장 비를 나타내는 것은 놀랍고 예기치 못한 것이다.
실시예 17. 모델
SCID 마우스에서 이종이식편으로 성장한 Z-138 림프종 세포주에서 종양 성장에 대한 화합물 2의 효과 평가
Z-138 (ATCC # CRL-3001) 외투 세포 림프종 세포를 ATCC로부터 수득하였다. 이러한 세포를 10% 말 혈청, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신, 및 2mM L-글루타민이 보충된 IMEM 배지에서 성장시켰다. 세포를 1:5 내지 1:10 비의 희석에 의해 계대-배양하였다. 5 내지 6주령의 24마리의 암컷 CB-17 SCID 마우스 (Charles River Labs strain code 236)를 이용하였다. 마우스 당 4 x 107개 세포에 해당하는 0.2 mL의 부피의 Z-138 세포를 SCID 마우스의 좌측 옆구리에 접종하였다.
종양이 84.3 mm3의 평균 부피에 도달했을 때, 처리를 개시하였다. 마우스를 처리 개시 전에 종양 부피에 기반하여 8마리로 된 4개의 그룹에 할당하여, 각 그룹에서의 평균 종양 부피가 77 내지 92 mm3의 범위 내에 있게 하였다. 마우스를 표 3에 제시된 대로 비히클, 처리 약물의 표준/양성 대조 약물 (사이클로포스파미드) 또는 화합물 2로 처리하였다.
표 3. 초기 연구 그룹
Figure 112020104886621-pat00068
동물에게 Labdiet® 5001 설치류 고형사료를 공급하고, 멸균수를 임의로 제공하였다. 종양을 마이크로-캘리퍼스를 이용하여 격일에 1회로 측정하고, 종양 부피를 (길이 x 폭 x 폭)/2으로 계산하였다. 처리로부터 초래된 가능한 독성의 표시로서 처리 그룹 간의 동물 체중의 가능한 차이를 평가하기 위해 모든 동물을 매일 칭량하였다. 시작 체중의 20% 초과의 체중 손실을 나타내는 동물을 안락사시켰다. 시작 체중의 15% 초과의 체중 손실을 나타내는 마우스는 체중 손실이 이들의 시작 체중의 5% 미만으로 회복될 때까지 재처리하지 않았다. 1500 mm3를 초과하는 종양 부피를 갖는 임의의 동물을 안락사시켰다.
투여 용액은 각 투여일에 새로이 제조되었다. 화합물 2를 Pluronic F-68 및 PVP K29/32로 구성된 균형을 갖는 69.61%의 화합물 2를 함유하는 동결건조된 분말로 공급하였다. 이는 동결건조된 분말을 멸균수에 용해시킴에 의해 제조되었다. 사이클로포스파미드를 주입용 멸균수에 8 mg/mL으로 용해시켰다. 모든 시험 제품은 10 mL/체중 kg의 부피로 투여되었다.
처리 그룹 사이의 통계적 차이를 0.05의 임계값을 갖는 Mann-Whitney Rank Sum 또는 ANOVA 시험을 이용하여 결정하였다.
도 1은 모든 처리 그룹이 종양 부피 및 종양 부피 퍼센트 둘 모두에 대해 ANOVA 시험을 이용한 성장 곡선하 면적을 비교함에 의해 평가했을 때 종양 성장에 있어서 비히클에 비해 통계적으로 유의한 감소를 나타내었음을 제시한다. 이러한 처리 그룹은 p<0.0001의 현저한 종양 성장 감소를 나타내었다. 일부 체중 감소가 15 mg/kg의 화합물 2로 처리된 그룹에서 관찰되었으나, 통계적으로 유의하긴 해도, 비히클 대조군과 비교시에, 엄밀한 체중 감소는 소수의 동물에 제한적이었다.
경구 투여되는 화합물 2는 용량 의존적인 방식으로 7.5 mg/kg 및 15 mg/kg 용량 둘 모두에서 항종양 효과를 지녔다.
A549 소세포 폐 암종 모델에서 화합물 2의 항종양 활성
A549 세포주는 58세의 백인 남성으로부터의 폐포 암종 조직의 체외이식편 배양으로부터 유래되었다. 세포를 10% 우태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 지닌 Ham's F12-K 조직 배양 배지에서 성장시켰다. 세포를 일상적으로 트립신화하고 1:10 계대시켰다. 처리 전 평균 체중이 16.3 그램인 5 내지 6주령의 32마리의 암컷 CB-17 SCID 마우스 (Charles River Labs strain code 236)를 이용하였다. 마우스를 처리 개시 전에 종양 부피에 기반하여 8마리로 된 4개의 그룹으로 나누었다. 이식 당일에, 세포를 PBS에서 세척하고, 트립신화하고, 완전 배지에 2 x 107개 세포/mL의 밀도로 재현탁시킨 후, 같은 부피의 Matrigel과 혼합시켰다. 그 후 이러한 혼합물을 23G 바늘을 이용하여 0.1 mL의 부피로 마우스에 피하 접종하였다.
마우스를 표 4에 제시된 대로 비히클, 처리 약물의 표준/양성 대조 약물 (시스플라틴) 또는 화합물 2로 처리하였다. 동물 체중 및 상태를 매일 기록하였고, 종양을 월요일, 수요일 및 금요일에 마이크로-캘리퍼스로 측정하였으며, 종양 부피를 (길이 x 폭 x 폭)/2로 계산하였다.
표 4. 초기 연구 그룹
Figure 112020104886621-pat00069
시작 체중의 20% 초과의 체중 손실을 나타내는 동물을 안락사시켰다. 시작 체중의 15% 초과의 체중 손실을 나타내는 마우스는 체중 손실이 이들의 시작 체중의 5% 미만으로 회복될 때까지 재처리하지 않았다. 1500 mm3를 초과하는 종양 부피를 갖는 임의의 동물을 안락사시켰다.
투여 용액은 각 투여일에 새로이 제조되었다. 화합물 2를 Pluronic F-68 및 PVP K29/32로 구성된 균형을 갖는 69.61%의 화합물 2를 함유하는 동결건조된 분말로 공급하였다. 이는 동결건조된 분말을 멸균수에 용해시킴에 의해 제조되었다. 시스플라틴을 DMSO에 5 mg/mL로 용해시키고 주입용 멸균수에 1:10으로 희석시켰다. 모든 시험 제품은 0.1 mL/체중 10g의 부피로 투여되었다.
처리 그룹 사이의 통계적 차이를 0.05의 임계값을 갖는 Mann-Whitney Rank Sum 또는 ANOVA 시험을 이용하여 결정하였다.
연구 동안 종양 부피 변화에 대한 데이터가 도 2에 도시된다. 비히클 대조군의 경우 평균 종양 부피는 1일에 95 mm3에서 29일에 1669 mm3으로 증가하였다. 시스플틴으로 처리된 그룹은 1일에 104 mm3의 평균 종양 부피를 지녔고, 이는 29일에 1136 mm3으로 증가하였다. 10 mg/kg의 화합물 2로 PO 처리된 마우스 (그룹 3)는 1일에 101 mm3의 평균 종양 부피를 지녔고, 이는 29일에 686 mm3으로 증가하였다. 5 mg/kg의 화합물 2로 PO 처리된 마우스 (그룹 6)는 1일에 101 mm3의 평균 종양 부피를 지녔고, 이는 29일에 1231 mm3으로 증가하였다.
각 종양에 대한 평균 곡선하 면적(AUC)을 산출하고 일원 ANOVA 시험을 이용하여 그룹들을 비교함에 의해 종양 부피 데이터의 추가 분석을 수행하였다. 이러한 분석은, 비히클 대조군과 10 mg/kg의 화합물 2로 처리된 그룹 간에 통계적으로 유의한 차이가 존재하였음을 나타내었다 (p=0.0005). 양성 대조군 (시스플라틴)의 경우 종양 성장에 있어서 통계적으로 유의한 감소는 존재하지 않았음이 주목되어야 한다.
경구 투여되는 화합물 2는 용량 의존적인 방식으로 5 mg/kg 및 10 mg/kg 용량 둘 모두에서 항종양 효과를 지녔다. 그러나, 비히클 처리 그룹과 비교했을 때 10 mg/kg 그룹에서만 통계적으로 유의한 차이가 나타났다.
항-콜라겐 항체 유도된 류마티스 관절염의 마우스 모델 (CAIA)에서 화합물 2의 평가
6 내지 8주령된 24마리의 수컷 Balb/c 마우스를 이용하였다. 처리 개시 시점에 동물의 체중 변화는 평균 체중의 ±20%를 초과하지 않았다. 동물을 비히클, 덱사메타손 또는 화합물 2를 수용할 3개의 그룹으로 임의로 할당하였다. 연구 0일째에 (연구 개시), 모든 마우스에 2 mg의 ArthritoMAbTM 항체 칵테일 (MD Biosciences #S1203001)을 정맥내 주입시킨 후 연구 3일째에 LPS(100μg/마우스)를 복강내 주입시켰다. 연구 동물을 경구에 의해 7.5 mg/kg의 화합물 2 또는 4 mg/kg의 화합물 2; 복강내로 1 mg/kg의 덱사메타손; 또는 경구에 의해 비히클로 처리하였다. 치료제는 투약 휴가가 적용되는 경우를 제외하고는, 모든 그룹에 대해 4, 6, 8 및 10일에 하루에 1회 투여되었다. 동물의 체중이 0일 시작 체중의 87% 미만으로 떨어지면, 0일 체중의 90% 이상에 해당하는 체중에 도달할 때까지 동물에게 투여하지 않았다.
관절염 발생, 임상 징후 및 체중을 연구 0일, 3-8일, 10일 및 12일에 모든 마우스에서 모니터하였다. 관찰은 피부, 모피, 눈, 점막, 분비물과 배출물의 발생 (예를 들면, 설사) 및 자율 활동(예컨대, 눈물 흘림, 타액의 분비, 경직, 동공 크기, 비정상적인 호흡 패턴)에서의 변화를 포함하였다. 각 동물의 모든 발 (전면 좌우, 및 후면 좌우)을 관절염 유도 전의 관절유발성(arthritogenic) 반응의 징후 및 연구 0일 및 후속하여 연구 3-8일, 10일 및 12일 (연구 종료)에 시험 항목 또는 대조 항목 투여에 대해 조사하였다. 관절염 반응을 채점하고, 하기 표 5에 제시된 대로, 중증도 정도가 올라가는 대로 0-4 규모로 기록하였다. 발 두께를 또한 다이얼 캘리퍼스를 이용하여 측정하였다 (Kroeplin, Munich, Germany).
표 5. 관절염 임상 점수
Figure 112020104886621-pat00070
투여되는 용량은 동물이 평균 20g의 체중을 지닌다는 가정하에 계산되었다. 덱사메타손의 스톡 용액을 100% 에탄올에서 제조하고, 사용 전에 PBS에서 적절한 농도로 희석시켰다. 비히클 대조군용 비히클은 0.6g Pluronic 및 0.6g PVP를 100mL의 증류된 탈이온수에 용해시킴에 의해 제조되었다. MAb 스톡 용액 (10 mg/mL)은 MD Biosciences, Division of Morwell Diagnostics GmbH에 의해 공급받았다. LPS를 PBS로 희석시켜 적절한 농도를 달성하였다. 주입 직전에 충분한 볼텍싱이 요구되었다. 화합물 2를 Pluronic F-68 및 PVP K29/32로 구성된 균형을 갖는 70.71%의 화합물 2를 함유하는 동결건조된 약물 분말로 공급하였다. 각 마우스에게 200μL의 고정 용량을 투여하였다.
평가는 주로 관절염 점수 및 발 두께 측정에 대한 평균 값에 기반하였다. 적절한 경우, Tukey의 사후 분석 ANOVA에 의한 데이터의 분석을 적용시켜 치료 효과의 유의성을 결정하였다.
도 3a 및 3b는 CAIA 마우스 모델 실험의 결과를 나타낸다. LPS-투여와 관련된 임상 징후는 3일째 LPS 부스트 후 모든 그룹에서 발생하였다. 비히클 처리된 마우스에 비해, 7.5 mg/kg 또는 4 mg/kg의 화합물 2로 처리된 마우스는 각각 5-12일 및 6-12일에 총 관절염 점수가 현저하게 감소하였다. 덱사메타손 처리는 6-12일에 비히클 그룹에 비해 총 관절염 점수를 현저하게 감소시켰다. 비히클 처리된 마우스에 비해, 7.5 mg/kg 또는 4 mg/kg의 화합물 2로 처리된 마우스는 5-12일에 현저하게 감소된 뒷발 관절염 점수를 지녔다. 덱사메타손 처리는 비히클 그룹에 비해 5일 및 12일에 뒷발 관절염 점수를 현저하게 감소시켰다. 비히클-처리군과 시험 항목-처리군 간에 체중에서의 유의한 차이는 없었다.
본 연구에서의 발견에 비추어, 경구 전달되는 7.5 mg/kg 또는 4 mg/kg의 화합물 2는 평균 관절염 점수에서의 지속적인 감소 및 발 두께의 감소와 함께, 항-콜라겐 항체 유도된 류마티스 관절염 모델에서 현저한 항-관절염 활성을 나타내었다.
Lewis 래트에서 콜라겐-유도된 관절염(CIA)에서 화합물 2의 효능 연구
전-처리 체중 범위가 180 내지 200g인 6 내지 8주령된 40마리의 암컷 Lewis 래트 (BK)를 각각 10마리의 래트로 된 4개의 그룹 (그룹 A-D)으로 임의로 나누었다. 그룹 B 내지 D의 래트를 0일에 꼬리의 기저 근처에 있는 세 부위에 그리고 500 μL의 에멀젼으로 등 위에 IFA 중 소 CII로 피내 면역시켰다 (각 부위에 대해 200 μL, 200 μL, 100 μL). 7일에, 그룹 B-D의 래트에게 이전의 주입 부위 근처에 동일한 양의 에멀젼을 이용한 피내 부스터 주입을 제공하였다. 치료적 처리 모델에서 (그룹 C 및 D), 덱사메타손 또는 화합물 2가 표 6에 제시된 대로, 관절염의 개시 후에 CIA를 지닌 래트에 경구 투여되었다. 래트를 매일 칭량하고, 체중 손실이 13%를 초과할 경우 동물에 약물 휴일을 제공하였다.
표 6. 초기 연구 그룹
Figure 112020104886621-pat00071
CIA 발생은 거시적 점수와 발 종창의 측정을 통해 평가되었다. 이는 표 7에 제시된 각 발에 대한 임상 점수 시스템을 이용하여 감작화 (7일) 이후 처음 5일 동안 매일 평가되었고, 그 후 나머지 기간 동안 매주 2회 (월요일 및 목요일) 평가되었다.
표 7. 관절염 임상 점수
Figure 112020104886621-pat00072
발 부피를 연구 기간 내내 관절염 측정과 같은 날에 체적변동유량측정법으로 측정하였다. 각 뒷발의 체적 및 팽창률을 하기 방정식을 이용하여 측정하였다:
팽창률 = (CN-C0)/ C0×100%.
도 4a는 관절 종창 대 시간의 그래프이고, 나이브 래트와, 모델에 따라 처리되거나 양성 대조군 또는 화합물 2를 이용하여 처리된 래트에서 0-4 등급으로 측정된 관절 종창을 나타낸다.
4 mg/mL의 소 CII (10mM 아세트산 중)를 같은 부피의 IFA로 에멀젼화시켰다.
각 동물에 대한 임상 점수를 합하고, 각 그룹에 있는 모든 동물의 전체 평균을 평균 관절염 점수로서 표시하였다. 도 4b는 시간의 함수로서의 임상 점수의 그래프이고, 나이브 래트와, 모델에 따라 처리되거나 양성 대조군 또는 화합물 2를 이용하여 처리된 래트의 임상 관절염 점수를 나타낸다.
연구 28일 째에, 각 처리 그룹으로부터 3마리의 대표를 안락사시키고, 뒷발을 수거하여 4% 중성 완충된 포르말린에 저장하였다. 준비된 뒷발 섹션을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색하였다.
대조 동물의 조직병리학적 분석은 질병의 경과에 따른 연골 침식과 파누스 형성을 보여 주었다. 그러나, 화합물 2 처리된 래트에서, 상대적으로 무손상의 연골이 관절 표면에서 발견되었고, 파누스 형성은 최소였다. 조직학적 분석 결과는 도 5에 도시된다.
임상 점수, 관절 종창 및 조직학적 조사 데이터는 상관관계를 나타내었다. 상기 결과는 또한 임상 점수, 관절 종창 및 조직학적 조사에 대한 효과에 의해 제시되는 바와 같이, 4mg/kg의 화합물 2의 치료적 효능을 나타내었다 (MPK). Lewis 래트에서 CIA 모델의 결과는 도 4a 및 4b, 및 도 5에 묘사된다.
암컷 BALB/C 마우스에서 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트 (PMA)-유도된 건선에서 화합물 2의 항-건선 활성
체중이 22 내지 30g인 6 내지 8주령된 24마리의 암컷 BALB/c 마우스를 이용하였다. 마우스를 각각 8마리의 마우스로 된 4개의 그룹으로 무작위화하였다. 동물의 그룹은 다음과 같았다: 그룹 I (나이브; 에탄올), 그룹 II (PMA; 에탄올), 그룹 III (PMA; 화합물 2 10μM) 및 그룹 IV (PMA; 베타메타손). 20μL의 PMA (4μg/20μL의 아세톤)을 그룹 II 내지 그룹 IV의 모든 동물의 귀의 귓바퀴의 윗면에 국소적으로 적용시켰다. PMA를 1일부터 9일까지 왼쪽 귀에 매일 적용시키고 오른쪽 귀에 하루씩 걸러서 (M-W-F) 적용시켰다. PMA를 적용한 지 30분 후에, 비히클 또는 기준 화합물 (베타메타손) 또는 화합물 2를 상이한 그룹으로부터의 동물의 귀에 국소적으로 적용시켰다. 참고로, 비히클, 기준 화합물, 및 화합물 2는 1일부터 12일까지 상이한 동물의 양쪽 귀에 매일 적용되었다.
동물은 임의의 치료와 관련된 증상에 대해 12일의 기간 동안 매일 관찰되었다. 기저 귀 두께를 시간 T0(1일)에 디지털 스크류 게이지를 이용하여 모든 동물에서 기록하였다 (PMA의 적용 전). 전체 연구 기간 동안, 비히클, 기준 화합물 또는 화합물 2를 적용한 지 4시간 후에, 귀의 두께를 디지털 스크류 게이지를 이용하여 매일 측정하고, 홍반, 각화(scaling) 및 주름형성 점수를 기록하였다. 귀의 귓바퀴 손상의 중증도를 표 8에 도시된 채점 시스템에 의해 평가하였다.
표 8. 건선 점수
Figure 112020104886621-pat00073
동물에게 오토클레이브 처리된 영양적으로 균형 잡힌 펠렛화 사료 (Nutrivet Life Sciences, Pune (India))를 임의로 공급하고 실험 기간 내내 보통 식수를 제공하였다.
시판되는 100% DMSO (LR 등급) 및 에탄올 (LR 등급)을 이용하여 제형을 제조하였다. 10 mg의 PMA를 50.0mL의 아세톤에 용해시킴에 의해 PMA를 제조하였다. 화합물 2는 1.47 mg의 화합물 2를 300μL의 100% DMSO에 용해시킴에 의해 제조되었다.
실험 결과는 도 6a-6d에 평균 ± SEM로서 표시된다. 체중, 사료 및 물 소비에 있어서 모든 처리 그룹 간에 유의한 차이는 없었다. PMA 적용은, (i) 좌측 뿐만 아니라 우측 귀의 증가된 두께(그룹 II vs. 나이브) 및 (ii) 좌측 뿐만 아니라 우측 귀의 증가된 질병 활성 지수(DAI)(그룹 II vs. 나이브)를 나타내었다. 중요하게는, 화합물 2의 국소 적용은 (i) 좌측 및 우측 귀 두께, 및 (ii) 좌측 및 우측 귀 DAI에 있어서 PMA-유도된 증가에서의 두드러진 감소를 발생시켰다. 이러한 효과는 화합물 2로 처리된 더 많은 동물이 좌측/우측 귀 두께 (그룹 II로부터의 동물에 비해), 및 DAI (그룹 II로부터의 동물에 비해)를 감소시킨 연구 6-8일에 현저하였다. 참고로, 좌측/우측 귀 두께 및 DIA에 있어서 PMA-유도된 증가에서의 화합물 2-매개된 감소는 연구가 진행됨에 따라 감소하였다 (10일 및 그 이후).
마우스의 PMA 유도된 건선 모델에서, 화합물 2는 통계적으로 유의한 항-건선 활성을 나타내었다.
이미퀴모드 (IMQ)-유도된 피부 염증/건선 모델에서 화합물 2의 항-건선 활성 (연구 1)
전처리 체중이 22 내지 30g인 6 내지 8주령의 40마리의 수컷 BALB/c 마우스를 이용하였다. BALB/c 마우스를 그룹 당 10마리의 마우스로 된 4개의 그룹으로 무작위화하였다. 모든 동물의 등쪽 피부 상의 작은 면적 (약 2×2cm2)을 깔끔하게 면도시켰다. 그룹-I 동물은 나이브 동물로서 제공되었다. 1일부터 13일까지 동물의 등 위에 매일 31.25 mg의 IMQ 크림을 국소 도포함에 의해 그룹 II 내지 IV [그룹 II (IMQ; 비히클), 그룹 III (IMQ; 화합물 2 (1μM)) 및 그룹 IV (IMQ; 사이클로포스파미드 (10 mg/kg)]에서 건선을 유도하였다. IMQ를 도포한 지 4시간 후에, 비히클 또는 기준 화합물 (사이클로포스파미드) 또는 화합물 2를 적절한 그룹에 1일부터 13일까지 매일 투여하였다 (국소적으로-30μL; 경구적으로-체중에 따라). 비히클 또는 기준 화합물 또는 화합물 2를 투여한 지 2시간 후에, 홍반, 각화, 주름형성 및 피부의 비대를 기록하여 질병 활성 지수(DAI)를 결정하였다.
임의의 처리-관련 증상에 관해 동물을 13일의 기간 동안 매일 관찰하였다. 매일 관찰은 체중, 사료 섭취, 피부 비대, 각화, 주름형성, 홍반, 콧물, 움직임, 호흡, 털, 복부 팽창, 피부 상태, 모피, 점막, 분비물의 존재 또는 부재, 눈 상태, 꼬리 상승, 운동 활성, 자세 및 보행을 포함하였다. 피부의 등쪽 부분에 대한 손상의 중증도는 표 9의 규정에 따라, 피부의 외부 관찰에 기반한 홍반, 각화, 주름형성 및 피부 비대 점수를 할당함에 의해 평가되었다.
표 9. 건선 점수
Figure 112020104886621-pat00074
시판되는 100% DMSO (LR 등급), 에탄올 (LR 등급), 사이클로포스파미드 (CMC), PVP 및 Pluronic을 이용하여 제형을 제조하였다. 화합물 2는 1.47 mg의 화합물 2를 300 μL의 100% DMSO에 용해시킴에 의해 제조되었다. 사이클로포스파미드는 500 mg의 CMC를 100 mL의 증류수에 용해시킴에 의해 제조되었다.
도 7a 및 7b에 도시된 실험 결과는 평균 ± SEM로서 표시된다.
연구 기간 동안 대조군에 비해 처리 그룹에서 체중, 사료 소비 및 물 섭취에 있어서 유의한 차이는 없었다. 화합물 2는 IMQ-유도된 질병 징후를 감소시켰다.
화합물 2는 질병 활성 지수에서의 감소에 의해 입증된 바와 같이, 비히클 처리 그룹에 비해 항-건선 활성을 나타낸다. 추가로, 화합물 2는 체중, 사료 및 물 섭취에 불리한 영향을 주지 않으며 이러한 효과를 발생시켰다.
이미퀴모드 (IMQ)-유도된 피부 염증/건선 모델에서 화합물 2의 항-건선 활성 (연구 2)
40마리의 수컷 BALB/c 마우스 (Biological E Limited, Hyderabad (CPCSEA 등록 번호: 36/99/CPCSEA))를 각각 10마리의 마우스로 구성된 4개의 그룹으로 나누었다. 동물은 이들의 체중에 기반하여 무작위화되었다. 그룹을 그룹-I (나이브), 그룹-II (IMQ; 비히클 (PEG 400 및 HPBCD)), 그룹-III (IMQ; 화합물 2 (2.5 mg/kg)) 및 그룹-IX (IMQ; 사이클로포스파미드 (10 mg/kg))로 지정하였다.
각 마우스의 등 위의 작은 면적을 면도하여, 이러한 면적이 동일한 크기/면적을 지니도록 보장하였다. 1일부터 6일까지 동물의 등 위에 매일 50 mg의 IMQ 크림을 국소 도포함에 의해 그룹 II 내지 IV에서 건선을 유도하였다. 연구 1일 및 2일에, IMQ를 국소 도포한 지 4시간 후에, 화합물 2 또는 양성 대조군 (사이클로포스파미드) 또는 비히클을 해당 그룹의 동물에 투여하였다. 참고로, 그룹 II 및 그룹 III의 동물에는 피하 주입된 반면, 그룹 IV의 동물에는 경구 투여되었다. 화합물 2, 비히클 및 사이클로포스파미드 처리를 2일에 종료시켰다. 이러한 그룹의 동물은 6일까지 매일 IMQ 처리에 대해 유지되었다. 7일에, 건선-유도된 동물을 누적 질병 활성 지수 (CDAI)에 기반하여 각각 10마리의 동물로 구성된 3개의 그룹으로 재-무작위화하였다. 7일부터 9일까지, 동물은 비히클 또는 양성 대조군 또는 화합물 2를 수용하였다. 참고로, 이런 날에는 동물을 IMQ로 처리하지 않았다. 10일부터 14일까지, 동물은 택일적으로 IMQ (10일, 12일 및 14일), 또는 비히클, 양성 대조군 또는 화합물 2 (11일, 13일)로 처리되었다.
모든 동물은 16일의 기간 동안 육안 관찰, 체중 및 사료 및 물 섭취에 대해 매일 관찰되었다. 1일 및 2일에, 홍반, 각화, 주름형성 및 피부 비대 점수를 비히클/양성 대조군/시험 화합물을 투여한 지 2시간 후에 기록하고, 3일 내지 14일에는 IMQ를 적용하거나, 양성 대조군, 비히클 또는 화합물 2를 투여한 지 4시간 후에 점수를 기록하였다. 동물의 등에 대한 유도의 중증도는 표 10에 제시된 대로 평가되고 채점되었다.
비히클은 40 mg의 HPBCD를 70.0mL의 증류수에 용해시킴에 의해 제조되었다. 화합물 2는 3.59 mg의 화합물 2를 0.5% PVP 및 0.5% Pluronic에 용해시킴에 의해 제조되었다. 사이클로포스파미드는 500 mg의 CMC를 100 mL의 증류수에 용해시킴에 의해 제조되었다.
표 10에 도시된 실험 결과는 평균 ± SEM로서 표시된다. 데이터를 일원 ANOVA를 이용하여 평가하고, Dunnett's 시험을 이용한 사후 분석을 수행하였다.
표 10. 질병 활성 지수 (DAI)의 감소율
Figure 112020104886621-pat00075
화합물 2로 처리된 동물에서의 질병 활성 지수의 감소율은 비히클로 처리된 동물에서 관찰된 감소율보다 현저하게 큰 것으로 관찰되었다. 연구 기간 동안 처리 그룹에서의 체중, 사료 소비 및 물 섭취는 대조 그룹에 비해 유의가 차이가 없었다.
수득된 결과는 화합물 2로의 처리가 사료 또는 물의 소비에 큰 영향을 주지 않고, 이에 따라 처리 그룹의 동물의 체중에 임의의 효과를 나타내지 않으며 IMQ-유도된 질병 징후를 감소시켰음을 나타낸다.
Zucker 래트에서 화합물 2의 효과
7개월령의 21마리의 수컷 Zucker 래트를 동등한 체중 및 사료 섭취에 기반하여 N=7의 3개 그룹에 할당하였다. 연령이 일치하는 Zucker 야윈 대조군의 N=7의 추가 그룹을 대조군으로서 포함시켰다. 체중 및 사료 및 물 섭취를 대략 동일한 시간 (14:30-15:30h)에 매일 측정하였다. 처리 당일, 투약은 14:30-15:30h에 이루어졌다 (소등 약 2시간 전).
Zucker 비만 및 야윈 대조군을 비히클 (10mL/kg 용량 부피; 물 중 0.5% Pluronic F68 및 0.5% PVP K29/32)로 평일에 경구 처리하였다. 화합물 2 (1.5 mg/kg 및 3 mg/kg) 그룹 둘 모두를 평일에 경구 처리하였다 (10mL/kg 용량 부피; 물 중 0.5% Pluronic F68 및 0.5% PVP K29/32). 처리 단계에 앞서, 4일 기준선 데이터를 수집하였다. 처리 단계는 16일 동안이었고, 6일의 워시아웃(washout) 단계도 포함시켰다.
도 8a 및 8b 및 도 9는 Zucker 래트에 대한 화합물 2의 효과를 도시한다. 기준선에서, 3마리의 Zucker 비만 그룹 간에 체중 및 일일 사료 섭취에 있어서 현저한 차이는 없었다. 그러나, 모든 그룹은 Zucker 야윈 그룹과 현저하게 상이하였다.
화합물 2 (1.5-3 mg/kg 경구)는 16일의 처리 기간 동안 Zucker 대조 그룹에 비해 일일 사료 섭취 및 체중에서 용량-관련된 감소를 발생시켰다. 화합물 2 처리는 또한 동일한 기간 동안 측정된 물 섭취를 현저하게 증가시켰다. 3 mg/kg의 화합물 2 그룹 및 Zucker 비히클 그룹 간에 체중 증가에 있어서 현저한 차이가 있었다. 1.5 mg/kg의 화합물 2-처리된 그룹 및 Zucker 비히클 그룹 간에 체중 증가에 있어서 현저한 차이는 없었다.
화합물 2는 고용량 (3mg/kg) 이용시 일일 사료 효과에 있어서 용량 의존적인 감소를 나타내었고, 이는 1.5mg/kg 용량보다 효과적이었다. 추가로, 3 mg/kg의 화합물 2 그룹은 Zucker 대조 그룹에 비해 낮은 체중 증가를 나타내었다.
식이-유도된 비만 모델에서 화합물 2의 효과
2개월령의 수컷 Sprague-Dawley 래트를 3개월 동안 고지방 식이(Research Diets Inc., product code D12492, 60% kcal% 지방)에 배치하였다. 연령이 같은 래트의 그룹에게는 정상 lab 고형사료 (LabDiet 5001, ~13% kcal% 지방)를 공급하고, 이러한 동물을 DIO 그룹에 대한 대조군으로서 활용하였다.
고지방 식이에 배치되는 2개월, 및 4개월령에서, 모든 래트는 동등한 체중 및 사료 섭취에 기반하여 N=7의 3개의 그룹에 할당되었다. 체중 및 사료 및 물 섭취를 대략 동일한 시간에 매일 측정하였다. 처리 당일에, 투약은 소등하기 약 2시간 전에 이루어졌다.
DIO 대조 그룹을 평일에 비히클 (경구, 10mL/kg 용량 부피; 물 중 0.5% Pluronic F68 및 0.5% PVP K29/32)로 처리하였다. 화합물 2 1.5 mg/kg 그룹을 처리 단계 내내 평일에 경구 처리하였다 (용량 10mL/kg 용량 부피; 물 중 0.5% Pluronic F68 및 0.5% PVP K29/32). 화합물 2 3 mg/kg 그룹 (10mL/kg 용량 부피; 물 중 0.5% Pluronic F68 및 0.5% PVP K29/32)을 초기에는 1주일 동안 평일에 매일 1회 경구 처리하였고, 이후 2주 동안 매주 2회 (월요일, 수요일) 처리하였다. 3주 및 4주 처리 동안, 화합물 2 3 mg/kg 처리를 매주 2회 지속시켰는데, 투약이 월요일과 목요일에 이루어진 것이 달랐다.
처리 단계에 앞서, 3일 기준선 데이터를 수집하였다. 처리 단계는 4주 동안이었다. 10일의 워시아웃 단계도 포함시켰다.
화합물 2는 분말 형태로 공급되었다. 시험 화합물은 65.89%의 활성 백분율을 지녔다. 활성 백분율은 1.437의 BEW를 이용하여 조정되었고 이는 0.5% w/v Pluronic F-68 및 0.5% w/v PVP K-29-32 비히클 용액에 용해시킴에 의해 제조되었다. 비히클 용액은 매주 제조되는 반면 화합물 2는 2일마다 새로이 제조되어 +4℃에 저장되었다. 동물에게 10 mL/kg의 부피를 투여하였다. 개별적인 용량은 적당한 mg/kg/일 투여량을 제공하기 위해 가장 최근의 체중에 기반하여 계산되었다.
도 10a 및 10b 및 도 11은 식이-유도된 비만 모델에서 화합물 2의 효과를 나타낸다. 기준선에서, 3개의 DIO 그룹들 간에 체중 및 일일 사료 및 물 섭취에 있어서 현저한 차이는 없었다. 그러나, 모든 DIO 그룹들은 일반 식이 그룹과는 현저하게 상이하였다. 특히, 정규 식이를 공급받은 동물은 고지방 식이를 공급받은 래트에 비해 현저하게 낮은 체중을 지녔다. 반대로, 고지방 식이를 공급받은 래트는 정규 식이를 공급받은 래트에 비해 현저하게 적은 일일 사료 및 물을 소비하였다.
화합물 2 (1.5-3 mg/kg 경구)는 28일의 처리 기간 동안 DIO 대조 그룹에 비해 일일 사료 섭취 및 체중에서 용량-관련된 감소를 발생시켰다. 화합물 2 처리는 또한 동일한 기간 동안 측정되는 물 섭취를 현저하게 증가시켰다 (F3,27 = 11.2, P<0.01).
체중 증가에 대한 처리 효과에 관해, 이는 공식적으로 연구 3일로부터의 체중 변화의 백분율로서 측정되었다. 처리 7일 (연구 10일) 및 14일 (연구 17일)에 둘 모두의 화합물 2 그룹에서 DIO 대조군에 비해 체중 증가에서의 현저한 감소가 있었다.
체중, 사료/물 섭취를 워시아웃 단계 동안 매일 측정하였다. 화합물 2 그룹에서의 사료 섭취는 DIO 대조군과 유사하였다. 화합물 2 그룹에서의 체중은 DIO 대조군보다 낮게 유지되었다.
화합물 2는 용량 의존적인 방식으로 일일 사료 섭취를 감소시킨다. 화합물 2는 또한 1.5 및 3 mg/kg 용량 둘 모두에서 체중 증가에 영향을 준다.
Nrf2 항-염증 경로의 화합물 1 유도
THP-1 (인간 급성 단핵구 백혈병 세포) 세포를 이용하여 염증 환경에서 Nrf2 경로에 대한 화합물 1의 효과를 평가하였다. 핵 인자 (적혈구-유래 2)-유사 2 (Nrf2)는 항-염증성 전사 인자이다. 정상적인 환경하에, Nrf2는 유비퀴틴화에 의해 Nrf2를 분해시키는 Kelch 유사-ECH 관련 단백질 1 (KEAP1)에 의해 세포질에 유지된다. Nrf2는 또한 핵으로 이동하고 CRM1 카고(cargo)로서 세포질로 되돌아올 수 있다. 본 연구에서, Nrf2는 siRNA를 지닌 KEAP1을 녹다운시켜 분해로부터 보호되었다. 이어서, KEAP1-고갈된 세포를 TNFα로 처리하여 염증을 유도하고, Nrf2 경로의 상향-조절에 의해 염증을 역전시키는 화합물 1의 능력을 시험하였다. Nrf2 경로의 활성화를 입증하기 위해, 이의 다운스트림 유전자들 중 2개인 NAD(P)H 데하이드로게나제 [퀴논]1 (NQO1) 및 에폭사이드 하이드롤라제 1 (EPHX1)의 발현을 정량적 PCR에 의해 정량하였다.
THP-1 (급성 단핵구 백혈병) 세포를 10% 열-불활성화 우태아 혈청(Invitrogen) 및 2-메르캅토에탄올이 보충된 RPMI-1640 배지 (Lonza)를 지닌 2개의 10 cm 배양 디시 (6*106 세포/디시)에 0.05 mM의 최종 농도로 플레이팅하였다. 한 디시의 세포를 50 nM의 KEAP1 siRNA (Life Technologies, Silencer Select, siRNA ID# s18982)로 Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen)를 이용하여 트랜스펙션시키는 한편, 다른 디시의 세포를 50nM의 대조군 siRNA, Block-iT (Invitrogen)로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포를 72 h 동안 방치하고, KEAP1 녹다운 효능을 KEAP1에 대한 프로브를 이용하여 정량적 PCR로 산출하였다.
이어서, 디시 각각으로부터의 세포를 상이한 6-웰 플레이트들의 4개의 웰에 동등하게 나누었다. 각각의 플레이트의 웰들 중 하나를 1μM의 화합물 1로 1 h 동안, 이어서 20ng/mL의 TNFα로 24 h 동안 전-처리하였다. 다른 웰들을 1μM의 화합물 1 또는 20 ng/mL의 TNFα 또는 어느 것도 없이 24 h 동안 처리하였다. 처리 후, RNA를 세포로부터 RNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 추출하였다. 각 처리 그룹으로부터의 RNA 샘플을 역 전사시키고 실시간 PCR을 Nrf2 및 이의 다운스트림 유전자들 중 2개인 NQO1 및 EPHX1에 대한 프로브를 이용하여 상응하는 cDNA 서열에 대해 수행하였다. THP-1 세포를 KEAP1 siRNA로 트랜스펙션시켰다. 40% 녹다운 효율을 달성하였다. KEAP1 녹다운 세포를 1μM의 화합물 1 또는 20ng/mL의 TNFα 또는 둘 모두를 함께 이용하여 24 h 동안 처리하였다.
도 12a는 미처리 세포에 비해 TNFα 및 화합물 1의 조합물로 처리된 세포에서 Nrf2 발현에 있어서 2.5배 증가를 나타낸다. 그러나, Nrf2 mRNA 수준에서의 유사한 (최대 3배) 증가가 또한 KEAP1 녹다운되지 않고 화합물 1 및 TNFα로 처리된 세포에서 발견되었다. 화합물 1 또는 TNFα 단독은 KEAP1 녹다운되거나 녹다운되지 않은 경우에 Nrf2 발현에 대해 어떠한 현저한 효과도 지니지 않았다.
도 12b는 KEAP1 녹다운되거나 녹다운되지 않은 세포에서 NAD(P)H 데하이드로게나제 [퀴논]1 또는 NQO1의 발현을 나타낸다. 도 12b는 KEAP1 녹다운이 NQO1 발현에 효과를 지녔음을 나타낸다. 어떠한 처리도 안 된 샘플조차 KEAP1 녹다운시에 그 mRNA 수준에 있어서 2배 증가를 나타내었다. 화합물 1 및 TNFα의 조합물은 KEAP1 녹다운되지 않은 세포에서 동일한 조합물에 의해 보여진 2배 증가에 비해 KEAP1 녹다운 샘플의 경우에 NQO1 발현에 있어서 4배 증가를 발생시켰다.
도 12c는 화합물 1 및/또는 TNFα로의 처리 후에 KEAP1 녹다운되거나 녹다운되지 않은 세포에서 에폭사이드 하이드롤라제 1 또는 EPHX1의 mRNA 수준을 나타낸다. 도 12c는 화합물 1이 TNFα의 존재 또는 부재하에 EPHX1의 발현을 상향-조절시켰음을 나타낸다. 최대 2.5배의 유도가 화합물 1 및 KEAP1 녹다운을 지닌 샘플에서 관찰되었으므로, KEAP1 녹다운은 화합물 1의 효과에 부가되었다.
20 ng/mL의 TNFα의 존재하에 1 μM의 화합물 1로의 24시간 동안의 처리는 Nrf2 신호전달을 상향-조절하였다. KEAP1 녹다운은, KEAP1 녹다운되지 않았을 때의 이의 발현 수준에 비해 더 큰 배수의 NQO1 (4배 대 2배) 및 EPHX1 (2.5배 대 1.5배)의 유도에 의해 보여진 바와 같이, 이러한 효과를 증강시켰다. 상기 결과는 CRM1 억제가 염증 동안 Nrf2 경로를 활성화시킬 수 있음을 나타내고, KEAP1 억제제와 함께 화합물 1의 처리가 화합물 1 단독으로의 처리보다 더욱 효과적일 수 있었음을 시사한다.
NF-κB 전사 활성에 대한 화합물 1, 2, 및 12의 효과
TNFα는 NF-κB의 전사 활성을 유도할 수 있다. 이러한 전사 활성은 NFκB에 결합하여 이의 활성을 억제하는 IκB가 분해될 때 개시된다. 이어서, 클래스 I 패밀리의 멤버 p50과 헤테로이합체를 형성하는 NF-κB 단백질의 클래스 II 패밀리의 멤버인 RelA 또는 p65가 핵으로 이동한다. p65 서브유닛은 그 C 말단에 전사활성화 도메인을 지니고, 이는 염증 관련 유전자의 전사를 활성화시킨다. NF-κB와 같이, IκB가 또한 세포 핵으로 이동할 수 있다. 분해가 주로 세포질에서 발생하기 때문에, IκB의 핵 축적은 분해로부터 단백질을 보호한다. CRM1은 IκB의 핵 외수송을 책임진다. 따라서, 핵 IκB는 NF-κB에 결합하여 NF-κB가 DNA 서열에 결합하는 것을 막으므로 CRM1의 억제를 통해 IκB의 핵 외수송을 차단하는 것은 NF-κB 활성을 최소화한다.
화합물을 HeLa (샘암종) 세포에 대해 시험하여 NF-κB 전사 활성을 억제하는 이들의 능력을 정량하였다. NF-κB 활성은 TNFα에 의해 HeLa 세포에서 유도되었고, 이어서 화합물을 첨가하여 유도된 NF-κB 활성을 억제하였다. 여러 화합물, 즉 화합물 1, 화합물 2 및 화합물 12의 최대 절반 억제 농도 (IC50)를 용량 반응 연구에 의해 결정하였다.
HeLa 세포를 12-웰 플레이트에 플레이팅하고 (200,000개 세포/웰), 10% 열-불활성화 우태아 혈청 (Invitrogen) 및 50 μg/mL 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen)이 보충된 Lonza로부터의 Eagle's Minimal Essential 배지 (EMEM)에서 배양시키고, 밤새 부착되게 두었다. 세포를 연속 희석된 (30 μM에서 시작; 1:3 희석) 화합물로 1 h 동안 전-처리한 다음 혈청 비함유 배지에서 20 ng/mL의 TNFα (Peprotech)에 4 h 동안 노출시켰다. 처리 후, 세포를 PBS (Invitrogen)로 세척하고, RIPA 완충제 (Themo Scientific)로 용해시켰다. 세포에서 NF-κB의 전사 활성을 제조사의 지시에 따라 화학발광 전사 인자 검정 키트 (Thermo Scientific Catalog# 89859)에 의해 측정하였다. 간단히 말해, 각 처리로부터의 1.5 mg/mL의 RIPA 용해된 전체 세포 추출물을 NF-κB 바이오티닐화된-컨센서스 서열과 결합된 96-웰 플레이트에서 인큐베이션시켰다. 컨센서스 서열에 결합된 활성 NF-κB 전사 인자를 NF-κB p65 일차 항체와 인큐베이션시킨 다음, 이차 HRP-컨쥬게이션된 항체와 인큐베이션시켰다. 화학발광 기질을 웰에 첨가하고, 생성된 신호를 발광측정기를 이용하여 검출하였다. 3개의 분리된 실험이 IC50 곡선의 각 농도에 대해 분석되었다. XLFit 모델 205를 이용하여 IC50 곡선을 계산하였다.
NF-κB 전사 활성의 억제는 화합물 전-처리 1시간 후에, 이어서 20ng/mL TNFα 노출 4 h 후에 화합물 1, 화합물 2 및 화합물 12의 연속 희석액에 의해 측정되었다. 3개의 독립적인 실험을 각각의 농도에 대해 채점하고, 평균을 여기에 제시한다. 화합물 1은 1.59 μM의 IC50 값을 지녔고, 화합물 2는 1.22 μM의 IC50 값을 지녔고, 화합물 12는 1.46 μM의 IC50 값을 지녔다.
시험관내 성장한 HeLa 세포에서 전-염증 단백질 COX-2의 발현에 대한 화합물 1의 효과의 평가
HeLa 세포를 10% 열-불활성화 우태아 혈청 (Invitrogen)이 보충된 EMEM 배지 (Lonza)를 지닌 6-웰 배양 디시 (2.5x105개 세포/웰)에 플레이팅하였다. 플레이트의 웰들 중 2개를 10 μM의 화합물 1로 30분 동안 전-처리하고, 이 시점에 웰들 중 하나를 20ng/ml의 TNFα (Preprotech)에 1시간 동안 노출시켰다. 다른 웰을 20 ng/ml TNFα 또는 아무것도 없이 1시간 동안 처리하였다. 처리 후에, RNA를 세포로부터 RNA 추출 키트 (Qiagen)를 이용하여 추출하였다. 각 처리 그룹으로부터의 RNA 샘플을 역 전사시키고, 정량적 실시간 (qRT) PCR을 COX-2에 대한 프로브 (Life Technologies)를 이용하여 상응하는 cDNA 서열에 대해 수행하였다.
HeLa 세포를 10% 열-불활성화 우태아 혈청 (Invitrogen)이 보충된 EMEM 배지 (Lonza)를 지닌 6-웰 배양 디시 (5x105개 세포/웰)에 플레이팅하였다. 플레이트의 웰들 중 2개를 1 μM의 화합물 1로 30분 동안 전-처리하고, 이 시점에 웰들 중 하나를 20ng/ml의 TNFα (Preprotech)에 24시간 동안 노출시켰다. 다른 웰을 20 ng/ml TNFα 또는 아무것도 없이 24시간 동안 처리하였다. 처리 후에, 전체-세포 용해물을 프로테아제 및 포스파타제 억제제 (Roche)가 보충된 RIPA 완충제로의 용해에 의해 세포로부터 생성하였다. COX-2 단백질의 면역블롯 검출을 항-COX-2 항체 (Cayman)를 이용하여 수행하였다. COX-2 단백질에 대한 신호 세기를 각 샘플에 대해 베타-액틴(Santa Cruz)에 대해 표준화시키고, 그래프에 의해 임의의 세기 단위로서 플롯팅하였다.
qRT-PCR에 의한 mRNA 분석으로부터의 데이터를 도 13a에 도시한다. 1시간의 처리 후에, TNFα는 COX-2 mRNA의 발현에서 대조군에 비해 대략 8배 증가를 유도한 반면, 화합물 1 단독은 COX-2 발현의 수준에 아무런 영향을 나타내지 않았다. 화합물 1은 COX-2 mRNA 발현에서의 증가 원인이 아니었다.
면역블롯에 의한 단백질 분석으로부터의 데이터를 도 13b에 도시한다. HeLa 세포를 미처리인 채로 두거나, 20 ng/ml TNFα 또는 1 μM 화합물 1, 또는 20 ng/ml TNFα 및 1 μM 화합물 1로 24시간 동안 처리한 다음, 면역블롯 검출에 의해 존재하는 COX-2 단백질의 양을 평가하였다. COX-2 단백질은 미처리 대조군 및 화합물 1 처리된 세포에 비해 TNFα-자극된 세포에서 24시간까지 증가한 반면, 화합물 1은 TNFα의 존재하에 COX-2 단백질의 양을 감소시켰다. COX-2 단백질에 대한 면역블롯 신호의 세기는 각 샘플에서 β-액틴에 대해 표준화되었고 그래프로 표시되었다.
화합물 1은 COX-2의 TNFα 유도된 발현에 영향을 주지 않지만,COX-2 단백질의 TNFα 유도된 발현의 양을 감소시킨다.
화합물 1은 염증-관련 CRM1 카고를 핵에 국한시킨다
HeLa 및 THP-1 (인간 급성 단핵구 백혈병) 세포를 염증 유도 인자인 TNFα 단독으로 또는 1-10 μM의 화합물 1과 함께 4-24 h 동안 처리한 다음, 염증-관련 CRM1 카고 단백질: IĸB, Nrf2, HMGB1, FoxP3, FOXO1a, RxRα, PPARγ 및 NFκB (p65 서브유닛)의 핵 국소화에 대해 면역형광(IF)에 의해 분석하였다.
IkB, Nrf2, RxRα 및 PPARγ 국소화의 검출을 위해, 세포를 10 μM의 화합물 1과 30분 동안 미리-인큐베이션시킨 후에, 20 ng/mL의 TNFα와 4시간 동안 혈청 비함유 배지에서 인큐베이션시켰다. HMGB1, FoxP3 및 Foxo1A의 검출을 위해, 세포를 1 μM의 화합물 1과 2 h 동안 미리-인큐베이션시킨 후에, 20 ng/mL의 TNFα와 24시간 동안 인큐베이션시켰다. NFκB의 검출을 위해, 세포를 1 μM의 화합물 1과 2 h 동안 미리-인큐베이션시킨 후에, 20 ng/mL의 TNFα와 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 100% 빙냉 메탄올 (MeOH)에 고정시키고 0.1% Tween 20, 0.3 M 글리신, 및 PBS 중 1% BSA로 투과/차단시키거나, PFA (3% 파라포름알데히드 및 PBS 중 2% 수크로스)에 고정시키고 0.1% Triton-X100 및 PBS 중 1% BSA로 투과/차단시켰다. IĸB를 Abcam (ab32518)으로부터의 일차 토끼 모노클로날(E130) 항체로 검출하였고; Nrf2를 Santa Cruz (sc722)로부터의 일차 토끼 폴리클로날 항체로 검출하였고; RxR 알파를 Santa Cruz (sc553)로부터의 일차 토끼 폴리클로날 항체로 검출하였고; PPAR 감마를 Cell Signaling (#2443)으로부터의 일차 토끼 모노클로날 [E130] 항체로 검출하였고; Foxo1A를 Cell Signaling (#2880)으로부터의 일차 토끼 모노클로날 [C29H4] 항체로 검출하였고; HMGB1을 Abcam (ab18256)으로부터의 일차 토끼 폴리클로날 항체로부터 검출하였고; FoxP3을 Abcam (ab10563)으로부터의 일차 토끼 폴리클로날 항체로부터 검출하였고; NFκB-p65를 Cell Signaling (#4764)으로부터의 일차 토끼 모노클로날 [C22B4] 항체로 검출하였다. 토끼 이차 항체인 Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A11008)을 모든 염색에 이용하였다. 이미지를 20X 배율로 촬영하였다.
핵에서 염증-관련 CRM1 카고를 잠그는 것은 염증에 불리한 효과를 지니므로, IF 검정은 CRMI 억제제의 항-염증 효과에 대한 바이오마커로서 작용할 수 있다.
IĸB는 전-염증 경로의 발현을 유도하는 NFκB의 억제제이다. 대부분의 IĸB 분해는 세포질에서 일어나므로, 이의 핵 국소화는 IĸB가 분해되는 것을 방지하고 이로 하여금 핵 NFκB에 결합될 수 있게 하여, NFκB의 전-염증 활성을 차단한다. Nrf2는 핵에서 항-염증 활성의 발현을 유도하는 류신 지퍼 전사 인자이다. HMGB1는 높은-이동성-그룹 박스 1 인자이고, 보통 염색질에 단단히 결합된다. HMGB1은 손상된 세포로부터의 활성 분비 또는 수동 방출시에, 사이토카인으로서 기능하여 전-염증 반응을 유도한다. 핵에서 HMGB1을 잠그는 것은 이의 전-염증 효과를 억제한다. FoxP3, forkhead 박스 P3은 면역억제 활성을 지닌 조절 T 세포의 발생 및 기능에서 마스터 전사 인자로서 기능한다. FOXO1a는 앤지오포이에틴-2와 같은 항-염증 유전자를 유도할 수 있는 전사 인자이다. 따라서, 핵 국소화는 FOXO1a가 인산화, 핵 배제 및 후속하여 분해되는 것을 막는다. RxRα는 대식세포에서 Ccl6 및 Ccl9와 같은 케모카인의 발현을 조절하는 레티노이드 핵 수용체이다. RxRα는 염증 부위로 백혈구를 동원하는데 필수적이다. RxRα의 핵 포착은 NFκB와 같은 전-염증 전사 인자에 결합하도록 달리 기능하는 전사 공-활성제의 동원 및 고갈을 발생시킨다. PPARγ는 핵 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 리간드-활성화된 전사 인자이며, 항-염증 유전자의 발현을 조절한다.
도 14a 및 14b에 도시된 결과는 염증을 유도하는 것으로 공지된 TNFα의 존재하에서조차, 상기 카고의 핵 국소화를 입증한다. 결과는 염증을 극복하기 위해 항-염증 경로를 유도하는 화합물 1의 능력을 나타낸다.
래트에서 BCCI 손상 후 인지 결핍에 대한 화합물 1의 효과의 평가
수컷 Sprague Dawley 래트의 내측 전두 피질(MFC)에 대한 양쪽 제어된 피질 충격(BCCI) 손상을 피질 타박 장치에 의해 유도하였다. CCI 후 임의의 피질 표면 출혈을 제어하고, 근막과 두피를 봉합하였다. 샴(Sham)-수술된 래트를 안락사시키고, 입체정위 장치에 놓고, 개두술을 수행하였다.
프로게스테론 16 mg/mL을 22.5% 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린에 용해시키고, 초기 주입액 (16 mg/kg)을 손상 1 h 후에 i.p. 제공하였다. 잔여 주입액 (모두 16 mg/kg)을 손상 6 h 후에 피하 제공하고 손상 후 5일 동안 지속시켰다. 프로게스테론 주입액은 1 mL/kg의 농도로 제조되었다. 프로게스테론을 대조군으로서 이용하였다.
화합물 1 0.2, 0.4, 및 0.6 mg/mL를 비히클 (물 중 0.6% w/v Pluronic® F-68 및 0.6% w/v PVP K-29/32)에 현탁시키고, 손상 16 h 전과 손상 2 h 후에 10 mL/kg의 농도로 p.o 투여하고, 투여를 4일 동안 지속시켰다. 대조군 래트는 동일한 시점에 화합물 1 대신 비히클의 동등한 주입액을 수용하였다. 처리 그룹은 표 11에 요약된다.
표 11. 처리 그룹
Figure 112020104886621-pat00076
모리스 물 미로 (MWM) 시험은 시각 신호를 사용하여 설치류의 학습과 기억을 측정하는 공간 탐색 작업이다. 피검체는 숨겨진 플랫폼을 찾는 날들의 과정을 통해 학습한다. MWM 시험은 손상 후 2주 동안 수행되었다. 수컷 Sprague Dawley 래트가 탱크의 남서 사분면에 위치한 플랫폼에 도달할 때까지, 또는 90초가 경과할 때까지, 이들을 풀에서 헤엄치게 하였다. 거동은 풀 위에 매달린 비디오 카메라에 의해 추적되고 비디오 트랙 소프트웨어 (ANY-maze)를 이용하여 기록되고 분석되었다.
MWM 시험의 습득(acquisition)에 대한 화합물 1 및 프로게스테론의 효과가 도 15a에 도시된다. 양방향 반복 측정 ANOVA는 상당한 치료 효과를 발견하였다. 샴 손상 래트에 비해, BCCI-손상된 래트는 5일 습득 단계 동안 숨겨진 플랫폼을 찾기 위한 대기시간에서의 상당한 증가에 의해 표시된 바와 같이, 상당한 공간 학습 결핍을 보였다 (도 15a). 비히클-처리된 BCCI-손상된 래트에 비해, 화합물 1 (2, 4 및 6 mg/kg)은 숨겨진 플랫폼을 찾기 위한 대기시간에서 용량 의존적인 감소를 보였고, 현저한 효과는 6 mg/kg을 이용한 경우 손상시킨 지 17일 및 18일 후에 그리고 4 mg/kg을 이용한 경우 18일 후에 나타났다. 데이터는 화합물 1이 신경보호 효과를 지님을 시사한다.
도 15c는 샴 병변(샴), CCI + 비히클 (대조군), 또는 CCI + 화합물 1 (6 mg/kg)을 수용한 동물의 전체 뇌 사진이고, 바이브라톰 섹션화 이전에 전체 뇌의 정성적 외관 검사의 결과를 나타낸다. 상기 검사는 어떤 샴 동물도 등-내측 피질 조직에 대한 손상을 나타내지 않았음을 지시한다 (4마리 중 0). 전혀 대조적으로, CCI 대조군의 4마리 모두는 이러한 피질 영역에 제한된 심각한 양쪽 손상을 나타내었다. 화합물 1을 수용한 CCI 동물은 중간 내지 최소 범위의 손상을 나타내었다. 특히, 화합물 1 그룹에서 가장 심각한 손상을 보여주는 뇌가 CCI 대조 그룹의 모든 뇌보다 덜 심각하였다.
각 처리 그룹의 래트로부터 수거된 혈장에서 여러 사이토카인의 발현 수준을 측정하였다. 샘플을 냉동된 채로 받아서 -80℃에 보관하였다. 실험 당일에, 샘플을 해동시키고, 4배 희석시키고, Luminex 플랫폼 상에서 사이토카인 발현에 대해 분석하였다. 샘플을 Millipore에 의해 제조된 multipliex 키트를 이용하여 사이토카인 GRO/KC, IFNy, IL-1B, IL-6, IL-10, IL-12p70 및 TNFa에 대해 분석하였다. 도 15b에 도시된 대로, 샘플들 간에 발현 수준에 있어서 동일한 패턴이 관찰되었다. 가장 큰 변화는 IL-10에 있었다. 6 mg/kg의 화합물 1은 비히클-처리된 대조 그룹에 비해 IL-10을 감소시켰다.
많은 경우에, 외상성 손상은 부차적인 손상 반응을 유도한다. 대부분의 경우에, 결과는 염증일 것이다. 염증 반응은 사이토카인 및 케모카인에 의해 유래되며, 손상된 조직 유래된 생성물에 의해 부분적으로 전파된다 (손상 관련 분자 패턴).
제대로 이해되지 않은 장기 기능의 연속적이고 점진적인 손실의 증후군인 다발성 장기 부전 증후군(MODS)은 손상 후 만기 사망의 가장 빈번한 원인이며, 상당한 이환율 및 사망률을 차지한다. MODS는 염증 경로의 과도하거나 부적응 활성화에 부분적으로 기인하는 것으로 고려된다.
세포 밀도의 정량적 척도를 정수리 약 2-3mm의 전방에서 항-NeuN 면역표지된 하위섹션으로부터 수집하였다. 관심 영역 (ROI)은 CCI-처리된 동물의 손상 부위에 인접한 피질 영역 또는 샴 동물의 해당 영역 (등쪽 피질)에서 레이어 IV-VI 주위에 그려졌다 (실험 조건에 블라인드). 유사한 영역의 ROI가 또한 동일한 섹션의 배쪽 피질 영역에서 평가되었다. 세포 확인은 Keyence BZ-II 분석기 소프트웨어의 세포 계수 모델을 이용하여 수행되었다. 세포-대-회색질(CG) 면적 계수를 각 ROI에 대해 결정하였다. 샴 동물은 등쪽 및 배쪽 영역 둘 모두 내에서 균일한 밀도 표지화를 나타내었다. 예상한 바와 같이, CCI 대조 동물은 샴 동물에 비해 등쪽 (샴에 비해 -45%) 및 배쪽 (샴에 비해 -30%) 둘 모두의 피질 영역에서 감소된 CG 계수를 나타내었다 (도 15d). CG 계수에서의 CCI-유도된 감소는 배쪽 피질에서 화합물 1로의 처리에 의해 완화되었다 (샴에 비해 -3%; p = 0.09). 배쪽 피질에서 화합물 1 대 비히클 처리의 효과는 통계적으로 유의하지 않으나, 이러한 효과는 더 큰 연구에서 통계적 유의성을 깨뜨릴 것으로 예상된다. 손상 부위에 매우 인접한 등쪽 피질 영역에서 화합물 1의 효과는 검출되지 않았다 (샴에 비해 -32%). 배쪽 영역 대 등쪽 영역에 대해 관찰된 화합물 1의 효과에서의 차이는 손상 정도와 관련된 임계 효과일 수 있으며, 이는 손상 부위로부터의 거리와 반비례하였다. 따라서, 등쪽 피질 영역에 대한 손상은 지나치게 심각하여 이러한 조건 하에 화합물 (1)에 의해 복구될 수 없었다.
면역 반응의 여러 경로에 대한 TBI의 영향을 평가하고, 화합물 (1)이 그 경로들 중 하나 이상을 통해 이의 신경보호 효과를 매개할 수 있는지를 확인하기 위해, 면역형광법을 수행하였다. 부차적 손상 반응의 반-정량적 척도를 항-래트 IgG (혈액뇌장벽 (BBB) 투과성의 지표), 및 TNFα (신경 염증의 지표)에 대한 면역형광 표지화를 이용하여 조사하였다. 모든 마커는 NeuN 표지화 평가에 사용되는 것들에 대해 300 μm 내에서 인접한 하위섹션의 손상 부위를 둘러싼 피질의 영역에서 20배 배율로 촬영되었다. 각 표지의 경우, 표적 ROI는 손상 부위에 인접한 레이어 IV-VI (또는 샴 동물의 경우 등쪽 피질의 상당하는 영역) 내에 표시되며, 참조 ROI는 배쪽 피질의 동일한 판으로부터 수집되었다. 표준화된 형광 세기를 2개의 ROI의 각각에서 평가하였다. 모든 표지의 경우에, 배쪽 피질 참조 부위는 그룹들 간에 상이하지 않은 것으로 확인되었으므로(p>0.5); 참조 값에 대한 표준 퍼센트 (IF)를 결정하였다.
항-래트 IgG는 손상된 조직의 뉴런 (도 15e에서 화살촉으로 표시됨)에서 발현되었다. 도 15e는 항-래트 IgG가 피질 조직의 손상 영역의 뉴로필(neurophil) 내에 분포되었음을 나타낸다. 항-래트 IgG는 샴 조직에는 존재하지 않았다. TNFα 면역양성 세포 (도 15e에서 화살촉으로 표시됨)는 대조 동물에서 손상 부위를 둘러싼 손상된 조직에서 명확하게 볼 수 있었다. 이러한 엘리먼트는 화합물 1-처리된 동물 및 샴 동물에서는 대부분 존재하지 않았다. 도 15e는 화합물 1이 뇌 손상에 노출된 래트에서 부차적인 손상 반응을 감소시킴을 나타낸다.
콜라겐-유도된 관절염 (CIA) 2번 연구
염증 바이오마커에 대한 본원에 기재된 화합물의 효과를 추가로 조사하기 위해, 제 2 CIA 모델을 개시하였다. 이러한 모델에서, 그룹은 그룹 A (나이브), 그룹 B (모델; 비히클-처리됨), 그룹 C (5 mg/kg의 화합물 2 QoD)로 지정되었다. 그룹 B 및 C의 래트를 0일에 IFA 중 소 타입 II 콜라겐으로 피내 면역시키고, 7일에 부스터 주입을 제공하였다. 화합물 2는 관절염의 개시 후에 (11일) CIA를 지닌 래트에 경구 투여되었다. CIA 발생을 육안 점수와 발 종창의 측정을 통해 평가하였다. 이는 상기 표 7에 기재된 임상 점수 시스템을 이용하여 감작화 (7일) 이후 처음 5일 동안 매일 평가되었고, 그 후 28일까지 매주 2회 (월요일 및 목요일) 평가되었다. 또한, CD45, CRP, CCL2/MCP-1, TNF-α, IL1-β, IL-6, IL-17에 대한 ELISA, 및 카텝신 K 및 엘라스타제에 대한 측정을 모든 그룹 동물에 대해 화합물로 처리한 지 4일 후 (연구 15일) 및 10일 후 (연구 21일 - 질병 절정)에 그리고 연구의 맨 마지막(28일)에 수행하였다. 추가로, 연구 마지막 날 (28일)에, 각 그룹으로부터 몇 마리의 대표 동물을 종골의 3차원 마이크로-단층덴시토메트리로 처리하고, 발에서의 골 미란을 정량하였다.
도 16a 및 16b는 5 mg/kg의 화합물 2로 처리된 래트가 비히클-처리된 래트에 비해 관절 종창 (도 16b) 및 임상 점수 (도 16a)를 현저하게 감소시켰음을 나타낸다.
도 17a 및 17b는 5 mg/kg의 화합물 2로 처리된 래트가 비히클-처리된 래트에 비해 뒷발에서 현저하게 감소된 골 미란을 지녔음을 나타낸다. 화합물 2로 처리된 동물의 관절 상태는 나이브 동물과 유사하였다. 대조적으로, 비히클-처리된 동물은 이들의 뒷발에서 통계적으로 유의하게 증가된 골 미란을 나타내었다.
LUMINEX® 검정 및 ELISA를 이용하여 전-염증 사이토카인의 수준 및 염증 마커에 대한 화합물 2의 효과를 측정하였다. 윤활액을 첫 번째 면역화 이후 21일에 모델 그룹의 2마리 래트 및 화합물 2-처리된 그룹의 2마리 래트로부터 수집하고, 연구의 끝에 나이브 그룹의 2마리 래트, 모델 그룹의 3마리 래트 및 화합물 2-처리된 그룹의 3마리 래트로부터 수집하였다.
도 17c-17f는, 모델 그룹에 비해, 화합물 2가 윤활액 샘플에서 전-염증 사이토카인 및 염증 마커의 생성에 대해 억제 효과를 나타내었음을 보여준다. 감소된 사이토카인은 IL-1β, IL-6 및 MCP-1을 포함하고, 염증 마커는 C-반응성 단백질 (CRP)이다.
또한 LUMINEX® 검정을 이용하여 혈청 중 전-염증 사이토카인의 수준을 측정하였다. 혈청 샘플 (래트 당 1 mL의 혈액)을 화합물로 처리한 지 4일 후 (15일), 화합물로 처리한 지 10일 후 (보통 질병 절정 - 21일) 및 연구의 끝 (27일)에 수집하였다.
도 17g는, 모델 그룹에 비해, 화합물 2가 혈청 샘플에서 IL-1β 생성에 억제 효과를 나타내었음을 보여준다.
실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 모델
EAE 모델은 다발성 경화증과 같은 인간 CNS 탈수초 질환의 연구를 위해 허용된 모델이다. 암컷 C57B1/6J 마우스의 EAE 뮤린 모델에서 MOG-유도에 있어서 화합물 1의 효과를 조사하였다. 동물을 그룹 I (비히클 대조군), 그룹 II (덱사메타손-양성 대조군) 및 그룹 III (7.5 mg/kg의 화합물 1)으로 지정되는 3개의 그룹으로 나누었다. 염수, 덱사메타손 및 화합물 1을 도 18a에 도시된 스케쥴에 따라 투여하였다. 염수 및 덱사메타손을 0일에서 시작하여 매일 복강내 투여하였다. 7.5 mg/kg의 화합물 1을 11일 (질병 개시)에 시작하여 연속 3주 동안 월요일, 수요일 및 금요일에 경구 투여하였다. 질환은 연구 0일에 완전 프로인트 애쥬번트(CFA)에 에멀젼화된 MOG의 단일 피내 주입에 이어, 연구 0일에 수행되고, 48시간 후 연구 2일에 재수행되는 백일해 독소(PT)로의 복강내 보충적 면역자극에 의해 유도되었다.
도 18b에 도시된 대로, 질환의 첫 번째 징후는 MOG 면역화 7-9일 후에 인지되었고, 질환 절정은 연구 17일에 발생하였다. 0일부터 시작된 1 mg/kg IP 용량의 덱사메타손으로의 처리는 비히클 대조군 (그룹 I)에 비해 임상 점수를 연구 8-37일 (그룹 II)에 현저하게 감소시켰다. 11일부터 시작된 7.5 mg/kg 용량의 화합물 1로의 처리(그룹 III)는 질병 점수 및 중증도를 현저하게 감소시켰다. 이러한 결과는 도 18b에 도시된다.
이러한 연구 조건 하에 수득된 연구 결과에 비추어, 연구 11일부터 시작되는 7.5 mg/kg 용량의 화합물 1로의 p.o. 처리는 질병 점수 및 중증도에 있어서 감소를 발생시켰다.
실시예 18. 상처 치유 모델
물질
마우스 - Harlan Laboratories LTD에서 수득한 SPF 6-8주령 수컷 C57BL/6J 마우스. 마우스는, 사료와 물을 임의로 사용할 수 있고, 암 및 광 주기가 12h/12h이며, 온도가 19-21℃로 제어되고, 습도가 40-60%로 제어되며, 동물의 방 내부가 포지티브 공기압이고, 3개월마다 선택된 센티넬(sentinel)에 대해 건강 보고 제어가 수행되는 멸균 개별 환기 케이지 (IVC)에서 사육되었다.
돼지 - 수스 스크로파 도메스티카(sus scrofa domestica), 가축용 돼지 (주로 Landrace X large White), 암컷, 약 60 Kg, 4-5개월령, Lahav Institute of Animal Research(Kibbutz Lahav, Israel). 돼지는, 수의사의 감독하에 표준 성장 표의 권고에 따른 사료, 공개원으로부터 직접 임의의 수돗물, 깨끗한 비-SPF 환경에서 사육되었다.
흡입용 이소플루란 99.9%, 로트 6027962, Abbot Laboratories Ltd, England
물 - 주입용 물, 배치 11481012, B. Braun Melsungen AG, Germany
염수 - 주입용 0.9% 소듐 클로라이드, 배치 12224012, B. Braun Melsungen AG, Germany
DMSO - 디메틸 설폭사이드, D2650, Sigma-Aldrich Inc., U.S.
PLURONIC® F-68
PVP K-29/32
C57BL 마우스 피부 상처에 대한 화합물 1의 전신 투여 및 국소 도포의 효과의 평가
피부 상처 치유에 대한 화합물 1의 효과를 마우스 길이방향 전체 두께 피부 절개 상처 모델에서 연구하였다. 도착하면, 동물을 귀 태그에 의해 확인하고, 칭량하고, 실험을 개시하기 전에 며칠 동안 적응하게 두었다. 상처를 내는 날, 마우스를 칭량하고 체중 차이 분류 무작위화에 따라, 그룹 당 6마리의 동물로 된 6개의 실험 그룹으로 나누었다. 수술 절차 전에, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 동물의 등의 털을 깎았다. 20mm의 전체 두께 길이방향 절개를 동물의 등 위에 표준 스캘펄 블레이드를 이용하여 수행하였다 (등뼈에 평행). 상처를 낸 지 3시간 후에, 동물의 피부 탄성 및 활동으로 의해, 절개는 타원형이 되었다. 이 단계에서, 상처의 가장 넓은 면적을 측정하여 기준선 상처 폭을 확립하였다. 가장 넓은 상처 면적을 측정함에 의해 상처 치유 평가를 수행하였다. 처리 그룹은 구강 투여 또는 국소 그룹으로 구성되었다. 실험 동안, 상처를 사진-기록하고, 형태학적 분석을 수행하였다. 실험의 끝에, 상처를 낸 지 8일 후에, 마우스를 희생시키고, 상처 폭을 측정하고, 상처 영역의 생검을 수집하여 분석하였다.
표 12. 초기 연구 그룹
Figure 112020104886621-pat00077
투여 용액은 각 투여일에 새로이 제조되었다. 경구 투여용 화합물 1은 동결건조된 분말로서 공급되었고 이를 수성 0.6% w/v Pluronic® F-68 및 0.6% w/v PVP K-29/32 용액에서 재구성하여 0.75 mg/mL의 스톡 현탁액을 제조하였으며, 이어서 7.5 mg/kg 및 4 mg/kg의 워킹 용액을 제조하기 위해 이를 0.6% w/v Pluronic® F-68 및 0.6% w/v PVP K-29/32로 희석시켰다. 국소 도포용 화합물 1은 동결건조된 분말로서 공급되었고 이를 10 mM의 농도로 물에 현탁시키며, 이는 국소 도포용 최종 워킹 농도를 달성하기 위해 물에 추가로 희석되었다.
매일 형태학적 평가의 일부로서, 사진-기록을 디지털 카메라 FinePix S700을 이용하여 수행하였다. 도 19는 상처를 낸 지 5일 후에 각각의 실험 그룹으로부터의 대표적인 상처의 사진이다. 검은 스케일 바는 1cm를 나타낸다. 33마리의 마우스에 총 33개의 상처가 만들어졌다. 형태학적 평가는, 경구 또는 국소적으로, 화합물 1을 이용한 처리의 양성 효과를 입증하였다. 모든 처리는 대조군보다 양호한 상처 치유를 유도하였다. 처리된 상처는 크기가 더 작았고, 딱지는 가볍고, 얇고 균열 없이 균일하였는데, 이는 상처 치유의 후기 단계를 나타낸다. 처리 그룹과 같은 날에 평가시, 대조 그룹 상처는 더 큰 크기를 나타내었고, 상처의 가장자리와 중간 둘 모두에서 비-치유된 상처 영역 (붉은 분홍색 영역으로서 관찰됨)을 노출시킨 두꺼운 균열 있는 딱지로 덮여 있었다.
형태학적 분석은 동물에 대한 임상전 연구 및 인간 상처의 임상 치료에서 상처 치유 평가에 이용되는 주요 변수이다. 형태학적 분석에 기반하여, 화합물 1은 효능을 나타내었고, 상처 치유에 대한 양성 영향을 지녔다. 참고로, 화합물 1의 국소 도포 및 전신 투여 둘 모두는 상처 크기 축소 및 양호한 딱지화 특성에 의해 측정되는 바와 같이, 양호한 상처 치유를 발생시켰다.
돼지 피부 상처에 대한 시험 화합물의 국소 도포의 효과의 평가
피부 상처 치유에 대한 시험 화합물의 효과를 돼지 길이방향 전체 두께 피부 절개 상처 모델에서 연구할 수 있다. 도착하면, 동물을 귀 태그에 의해 확인하고, 칭량하고, 실험을 개시하기 전에 며칠 동안 적응하게 두었다. 수술하기 3일 전에, 돼지는 적응을 위해 입원 시설로 옮겨진다. 수술하기 12시간 전에, 사료를 중단한다. 수술 당일에, 케타민, 자일라진, 디아제팜 및 이소플루란을 사용하여 돼지를 마취시켰다. 배쪽 흉부와 복부 상의 털을 Oster® 클리퍼 기계 (블레이드 크기 30)를 이용하여 조심스럽게 깎고 각각 4 cm2의 20개의 개별적인 영역을 2개의 행으로 표시한다 (행 당 10개 영역). 등쪽 정중선의 양쪽으로부터 4cm에 #11 스캘펄 블레이드를 이용하여 10쌍의 2.5 cm의 전체 두께 길이방향 피부 절개를 내었다.
수술 절차 후에, 상처를 실험 그룹으로 나누고, 상처 영역과 상처 가장자리를 국소 도포에 의해 매일 처리하였다. 처리 영역은 상처 중심으로부터 2cm 거리까지의 피부의 표면으로 구성된다. 투여 용액은, 전체 처리 부피 (예를 들어, 1 mL의 염수 또는 시험 화합물)가 조직에 흡수될 때까지, 피펫을 이용하여 각각의 상처에 점차 도포된다.
상처를 낸 지 수 시간 후에, 동물의 피부 탄성 및 활동으로 의해, 절개는 타원형이 된다. 이 단계에서, 상처의 가장 넓은 면적을 측정하여 기준선 상처 폭을 확립한다. 가장 넓은 상처 면적을 측정함에 의해 상처 치유 평가를 수행한다. 실험 동안, 상처를 사진-기록하고, 형태학적 분석을 수행한다.
실험의 끝에 (예를 들어, 상처를 낸 지 12일 후), 마취제 및 KCl을 투여하여 돼지를 희생시켰다. 상처 형태를 평가하고, 상처 폭을 측정하고, 상처 영역의 생검을 회수하여 추가 분석을 위해 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정한다. 고정 후에, 상처 생검을 고해상도 디지털 카메라, 예를 들어 FinePix S700을 이용하여 사진-기록하고, 상처 영역의 생검을 조직병리학적 분석한다. 상처 치유의 평가는, 시험 화합물로 처리된 각 상처를 등쪽 정중선의 다른 쪽의 동일한 해부학적 위치에 있는 대조 상처와 직접 비교하는 페어링 방식으로 수행된다. 치유의 이러한 페어링 평가는, 돼지 등의 상이한 영역에서 피부의 혈관화 정도 및 혈액 순환과 관련된 가변성 때문에, 객관적인 평가 및 비-처리된 상처에 대한 처리된 상처의 객관적인 비교의 관점에서 중요하다. 목 근처의 앞 부분에 위치한 상처는 등 뒤에 위치한 상처보다 훨씬 더 나은 치유 특성을 나타낸다.
표 13. 초기 연구 그룹
Figure 112020104886621-pat00078
투여 용액은 각 투여일에 새로이 제조된다. 시험 화합물은 동결건조된 분말로서 공급되었고, 이를 주입가능한 0.9% 소듐 클로라이드에서 추가로 재구성하여 3 mg/mL 스톡 현탁액을 제조한다. 스톡 현탁액은 국소 도포를 위해 주입가능한 0.9% 소듐 클로라이드로 3 μM 및 1 μM의 최종 농도로 추가로 희석된다.
상처로부터 진물, 출혈 또는 분비물의 발생 없이 균질하고, 얇고 균일한 조직의 딱지 표면은 상처 치유를 나타낸다. 매우 이질적이고, 균열이 있으며 어두운 색 딱지는 상처 치유 과정의 경과 동안 삼출, 진물 및 출혈의 다수의 발생을 나타낸다.
돼지에서 조기 상처 치유 과정에 대한 시험 화합물의 국소 도포의 효과의 평가
조기 상처 치유에 대한 시험 화합물의 효과를 돼지에서 길이방향 전체 두께 피부 절개의 상처 모델에서 연구할 수 있다. 배쪽 정중선의 양쪽으로부터 4 cm에 #11 스캘펄 블레이드를 이용하여 마취된 돼지의 등의 정면 섹션에 5쌍의 2.5 cm의 길이방향 전체 두께 절개를 수행하였다. 수술 후 수 시간 내에, 길이방향 절개는 타원형 상처가 된다.
상처를 실험 그룹으로 나누고, 상처 영역 (가장자리 포함 및 상처에 가까운 피부 영역 상에)을 국소 도포에 의해 매일 처리하였다. 처리 단계는 상처를 낸 지 24시간 후에 시작된다. 투여 용액은, 전체 처리 부피 (예를 들어, 1 mL의 염수 또는 시험 화합물)가 조직에 흡수될 때까지, 피펫을 이용하여 각각의 상처에 점차 도포된다.
5일에, 상처 치유 상태 및 형태를 하기 변수에 따라 평가하였다: 출혈, 진물, 종창, 염증, 고름 분비 및 딱지 형성. 평가는, 시험 화합물로 처리된 각 상처를 등쪽 정중선의 다른 쪽의 동일한 해부학적 위치에 있는 대조 상처와 직접 비교하는 페어링 방식으로 수행된다.
표 14. 초기 연구 그룹
Figure 112020104886621-pat00079
투여 용액은 각 투여일에 새로이 제조된다. 시험 화합물은 동결건조된 분말로서 공급되었고, 이를 0.9% 소듐 클로라이드에서 재구성하여 3 mg/mL 스톡 현탁액을 제조한다. 이러한 스톡 현탁액은 최종 3 μM의 국소 용액의 제조를 위해 0.9% 소듐 클로라이드로 추가로 희석된다.
형태학적 상처 치유 평가는 처리 5일에 수행된다. 종창을 조사하고, 각 상처에서의 중증도에 따라 채점하고, 약함, 중간 또는 심함으로 기록한다. 중간 및 심한 종창을 나타내는 상처를 실험 그룹에 있는 모든 상처의 백분율로서 제시한다. 분비물을 조사하고, 이원 방식으로 채점한다: 최소 분비물을 나타낸 상처는 양성으로 고려되며, 어떠한 검출가능한 분비물도 없는 상처는 이러한 변수에 대해 음성으로 고려된다. 분비물을 나타낸 상처 (이러한 변수에 대해 양성)는 실험 그룹에 있는 모든 상처의 백분율로서 제시된다. 딱지는, 경질의 건조한 불그스레한 어두운 황색 또는 갈색으로 형성된 연속 층이 전체 상처 영역을 덮고 상처 층에 강하게 부착되며, 이에 따라 외부 환경과 상처 입은 조직 사이에 연속적인 강한 장벽을 제공할 때 완전히 형성된 것으로 고려된다. 딱지 형성을 조사하고 이원 방식으로 채점한다: 건조되고 강한 완전히 형성된 딱지를 나타내는 상처는 양성으로 고려되고 딱지가 없거나 초기 단계의 딱지를 지닌 상처는 이러한 변수에 대해 음성으로 고려된다. 완전히 형성된 딱지를 지닌 상처를 그룹 당 총 상처의 백분율로서 제시한다.
종창, 분비물 및 딱지 형성을 또한 평가한다. 종창 및 분비물은 조직 복구를 지연시킬 수 있고 흉한 상처를 유도하는 과도한 염증 반응의 일부이다.
돼지 피부에 대한 조기 상처 치유 및 손상되거나 상처 입은 피부와 관련된 자극과 긁힘에 대한 시험 화합물의 국소 도포의 효과 평가
피부 상처 치유에 대한 시험 화합물의 효과를 돼지에서 길이방향 전체 두께 피부 절개 상처 모델에서 연구할 수 있다. 수술하기 3일 전에, 돼지는 적응을 위해 입원 시설로 옮겨진다. 수술하기 12시간 전에, 사료를 중단한다. 수술 당일에, 케타민, 자일라진, 디아제팜 및 이소플루란을 사용하여 돼지를 마취시켰다. 배쪽 흉부와 복부 상의 털을 Oster® 클리퍼 기계 (블레이드 크기 30)를 이용하여 깎았다. 10쌍의 각각 4 cm2 섹션을 표시하고, 배쪽 정중선의 양쪽에서, #11 스캘펄 블레이드를 이용하여 2.5 cm의 전체 두께 길이방향 피부 절개를 내었다.
수술 절차 후에, 상처를 실험 그룹으로 나누고, 상처 영역 (가장자리 포함 및 모든 방향에서 상처로부터 2cm의 거리까지 상처에 가까운 피부 영역 상에)을 국소 도포에 의해 매일 처리하였다. 투여 용액은, 전체 처리 부피 (예를 들어, 1 mL의 비히클 또는 시험 화합물)가 조직에 흡수될 때까지, 피펫을 이용하여 각각의 상처에 점차 도포된다.
수술 후 수 시간 내에, 길이방향 절개는 동물의 피부 탄성 및 활동으로 인해 타원형 상처가 된다. 실험 동안, 상처를 사진-기록하고, 형태학적 분석을 수행한다. 상처 치유의 평가는, 시험 화합물로 처리된 각 상처를 등쪽 정중선의 다른 쪽의 동일한 해부학적 위치에 있는 대조 상처와 직접 비교하는 페어링 방식으로 수행된다. 상처를 낸 후 처음 5일 동안, 상처 형태 및 동물 거동을 기록한다.
표 15. 초기 연구 그룹
Figure 112020104886621-pat00080
투여 용액은 각 투여일에 새로이 제조된다. 시험 화합물은 동결건조된 분말로서 공급되고, 이를 100% DMSO에서 15 mM의 스톡 농도로 용해시킨다. 주입가능한 물에서 추가 희석을 수행하여 국소 도포를 위해 3 μM 및 1 μM의 최종 농도를 달성한다.
매일 형태학적 평가의 일부로서, 상처의 사진-기록을, 예를 들어 디지털 고해상도 카메라 FinePix S700을 이용하여 수행한다. 상처 상태 외에, 자극되고 긁힌 피부의 영역을 관찰한다. 일반적으로, 긁힘은 상처에 손상을 야기하지 않거나 상처 치유 과정을 방해하지 않는데, 그 이유는 상처가 등 위의 등쪽 정중선 근처에 가해져서, 동물이 상처에 도달하는 것이 어렵고 거의 불가능하기 때문이다.
마우스에서 피부 치유와 관련된 긁힘에 대한 PVP/Pluronic® F-68 중 화합물 1 및 물 중 화합물 1의 효과의 평가
본원에 기재된 마우스의 피부 상처 연구에서, 동물의 행동을 또한 관찰하였고, 흉터를 제거하려는 시도, 불편 징후, 및 상처 영역의 긁힘을 정량하였다. 마우스에서 수행된 모든 연구로부터 긁힘과 통증 흔적의 이상 거동 및 이상 표시를 분석하였다. 이러한 연구에서, PVP/Pluronic® F-68 중 화합물 1 및 물 중 화합물 1, 및 개개의 비히클 대조군을 이용하여 처리를 수행하였다.
마우스에서 모든 상처 치유 실험 동안, 상처 치유와 관련된 치유 변수, 피부 자극의 징후 및 상처에 가까운 영역 및 처리된 피부 영역에서의 그 밖의 피부 상태를 모니터하였다. 추가로, 모든 피부 치유 모델의 처리 단계 동안, 불편 및 통증 징후와 같은 동물의 거동; 및 상처와 피부의 긁힘 및 훼손 징후에 특별히 주의를 기울였다. 처리 화합물의 수딩(soothing) 및 진정 효과는 이들의 상처를 훼손하는 성향을 갖는 대조 동물에 비해 매우 분명하였다.
마우스에서, PVP/Pluronic® F-68 중 화합물 1 또는 물 중 화합물 1로의 처리는 비히클 처리된 마우스 (물 중 DMSO, 염수, PVP/pluronic 또는 물)에 비해 상처에 대한 훼손 발생을 감소시켰다.
마우스에서, 상처에 대한 훼손은 일반적으로 딱지의 제거와 출혈 또는 딱지에 강하게 부착된 상처 층 위에 새로이 형성된 조직에 대한 손상을 발생시켰다. 이러한 사건의 대부분은 비히클 처리된 그룹에서 일어났다 (모든 실험의 약 20-30%).
피부 상태 및 동물 거동의 개요에 따르면, PVP/Pluronic® F-68 중 화합물 1 또는 물 중 화합물 1로의 상처 처리는, 아마도, 상처 입고 자극된 피부에 대한 처리 화합물의 일부 수딩 및 진정 효과로 인해, 마우스에서 상처에 대한 훼손을 방지하였다고 결론내릴 수 있다.
마우스에서 피부 상처 치유에 대한 시험 화합물의 용량 반응
피부 상처 치유에 대한 시험 화합물의 효과를 마우스 길이방향 전체 두께 피부 절개 모델에서 연구할 수 있다. 도착하면, 동물을 귀 태그에 의해 확인하고, 칭량하고, 실험을 개시하기 전에 며칠 동안 적응하게 두었다. 상처를 내는 날, 마우스를 칭량하고 체중 차이 분류 무작위화에 따라 7개의 실험 그룹(N=6 또는 N=7)으로 나누었다. 비히클 그룹은 물 중 0.1% DMSO를 수용한 반면 양성 대조 그룹은 수성 0.6% w/v Pluronic® F-68 및 0.6% w/v PVP K-29/32로 처리된다. 수술 절차 전에, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 동물의 등 위의 털을 깎아 다듬었다. 20mm의 전체 두께 길이방향 절개를 동물의 등 위에 표준 스캘펄 블레이드를 이용하여 수행하였다 (등뼈에 평행). 상처를 낸 지 3시간 후에, 동물의 피부 탄성 및 활동으로 의해, 절개는 타원형이 된다. 이 단계에서, 상처의 가장 넓은 면적을 측정하여 기준선 상처 폭을 확립하였다. 가장 넓은 상처 면적을 측정함에 의해 상처 치유 평가를 수행하였다. 상처의 처리는 상처에 직접 투여 용액(예를 들어, 0.2 mL)을 국소 도포(매일)함에 의해 수행된다.
표 16. 초기 연구 그룹
Figure 112020104886621-pat00081
투여 용액은 각 투여일에 새로이 제조되었다. 시험 화합물은 동결건조된 분말로서 공급되며 이를 물 중 0.1% DMSO에서 3 mg/mL의 스톡 현탁액으로 재구성한다. 원액 현탁액을 물 중 0.1% DMSO로 추가 희석시켜 최종 국소 용액을 제조한다. 대조 그룹의 상처는 물 중 0.1% DMSO, 또는 수성 0.6% w/v Pluronic® F-68 및 0.6% w/v PVP K-29/32 용액으로 국소적으로 처리된다
실험의 끝에, 상처를 낸 지 8일 후에, 마우스를 CO2의 흡입에 의해 희생시키고, 상처 폭을 측정하고, 상처 영역의 생검을 수집하여 조직학적 분석하였다. 생검을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하였다. 전체 상처 영역의 고정 후에, 상처의 가장 넓은 영역의 5 mm 절제를 수행하고, 이러한 견본을 파라핀 매입시켰다. 조직의 그래쥬에이트(graduate) 탈수 및 파라핀 매입의 표준 절차를 이용하여 파라핀 블록을 제조하였다. 이후, 조직학적 섹션을 준비하고 조직을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색으로 염색하였다. H&E 염색된 슬라이드를 조사하고, 상처 치유 효능의 평가를 수행하였다.
에오신 염색된 건강한 진피 및 상처 갭에서 새로이 형성된 진피 가장자리의 조사에 의해 8일에 진보된 진피 폐쇄가 평가되었다. 현미경의 100x 배율 시야 (BX41 Olympus 또는 Axiovert 25, Zeiss)에서 관찰된 양 진피 가장자리를 갖는 상처는 진보된 진피 폐쇄 치유 변수에 대해 양성으로 고려된다. 진보된 상처 폐쇄를 지닌 상처의 수는 실험 그룹의 총 상처의 퍼센트로서 제시된다.
가장 넓은 영역의 상처에서 조직학적 섹션을 분석함에 의해 진보된 표피 폐쇄가 8일에 H&E 염색을 이용하여 평가되었다. 전체 상처 갭을 덮는 표피의 연속적인 층의 존재를 나타내는 상처 및 현미경 시야에서 400x 배율로 관찰된 표피 가장자리의 가장 진보된 이동을 지닌 상처는 진보된 표피 폐쇄 변수에 대해 양성으로 고려된다. 상기 결과를 실험 그룹 당 전체의 퍼센트로서 제시한다.
표피 이동은 양 상처 가장자리에서 응축된 헤마톡실린 염색된 새로이 형성된 표피를 분석함에 의해 8일에 H&E 염색을 이용하여 평가되었다. 표피 가장자리는 새로이 형성된 표피 가장자리가 상처 갭의 약 20-30%를 덮을 때 이동성인 것으로 고려된다. 그룹에서의 이동성 표피 가장자리를 계수하고 표피 가장자리의 총 수(그룹에서 상처 수의 두 배)의 퍼센트로서 제시한다. 양 표피 가장자리는 완전하거나 진보된 표피 폐쇄를 나타낸 상처에서 이동성인 것으로 고려된다. 62마리의 마우스에서 총 62개의 상처를 만들었다.
시험 화합물로의 상처 처리는 표피의 과다증식 및 유착과 같은 상처 치유 합병증을 예방한다
피부 상처 치유에 대한 시험 화합물의 효과를 마우스 길이방향 전체 두께 피부 절개 상처 모델에서 연구할 수 있다. 수술 절차 전에, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 동물의 등을 면도하였다. 20 mm의 전체 두께 길이방향 절개를 동물의 등 위에서 스캘펄 블레이드를 이용하여 수행하였다 (등뼈에 평행). 상처를 낸 지 3시간 후에, 동물의 피부 탄성 및 활동으로 의해, 절개는 타원형이 되었다. 상처의 가장 넓은 면적을 측정함에 의해 상처 치유 평가를 수행하였다. 상처의 처리는 상처에 직접, 예를 들어 0.2 mL의 시험 화합물을 매일 국소 도포함에 의해 수행되었다. 상처 치료 과정은 부분적으로 습한 환경에서 이루어지며 - 각각의 매일 치료 후, 상처는 한동안 습윤되어 있다. 실험의 끝에, 상처를 낸 지 8일 후에, 마우스를 희생시키고, 상처 폭을 측정하고, 상처 영역의 생검을 수집하여 조직학적 분석하였다.
표 17. 초기 연구 그룹
Figure 112020104886621-pat00082
투여 용액은 각 투여일에 새로이 제조되었다. 시험 화합물을 동결건조된 분말로서 공급하고 물 중 0.1% DMSO에서 3 mg/mL의 스톡 현탁액으로 재구성하였으며, 이어서 물 중 0.1% DMSO로 희석시켜 국소 도포용 워킹 농도를 달성하였다. 대조 그룹의 상처는 물 중 0.1% DMSO 또는 수성 0.6% w/v Pluronic® F-68 및 0.6% w/v PVP K-29/32으로 국소 처리되었다.
실험 단계의 끝에, 상처를 낸 지 8일 후에, 마우스를 CO2의 흡입에 의해 희생시키고, 상처 영역의 생검을 회수하였다. 상처 조직의 고정은 4% 파라포름알데히드를 이용하여 수행된다. 전체 상처 영역의 고정 후에, 상처의 가장 넓은 영역의 5 mm 절제를 수행하고, 이를 파라핀 매입시켰다. 그래쥬에이트 탈수의 표준 절차를 이용하여 파라핀 블록을 제조하였다. 이후, 조직학적 섹션을 준비하고 조직을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 상처 치유 변수를 평가하고 그래프로 표시하였다.
표피의 과다증식은 8일에 평가되었다. 그룹의 비-이동성 및 과다증식성 표피 가장자리를 계수하고, 표피 가장자리의 총 수(그룹에서 상처 수의 두 배)의 퍼센트로서 제시한다. 표피의 응축된 헤마톡실린 염색된 영역을 분석함에 의해 과다증식성 표피 가장자리를 H&E 염색을 이용하여 평가하였다. 표피 가장자리가 건강한 피부 영역의 정상 표피보다 두꺼워 보일 때 그리고 그러한 표피 가장자리가 상처 갭을 밀봉시키려는 이동을 나타내지 않을 때, 이는 과다증식성 및 비-이동성인 것으로 고려된다.
상처 갭의 유착은 8일에 평가되었다. 상처 갭에서 세포 및 조직 구조를 분석함에 의해 유착을 평가하였다. 상처 유착을 약함, 중간 또는 심함 규모로 채점하였다. 상처 갭에 응괴가 있거나 정상 육아 조직이 다른 조직, 예컨대 골격근 또는 광범위한 림프계 조직에 의해 대체되는 경우 음성 점수로 간주된다. 몇몇 유착 또는 이상 육아가 상처 갭 영역의 40%를 넘게 점유하면 심함으로 간주된다. 현저하지 않거나 정상 피부 조직 재생을 방해하지 않을 때 유착은 약함으로 간주된다. 중증 유착을 지닌 상처를 실험 그룹 당 총 상처의 퍼센트로서 계산하고 도시된 대로 그래프로 표시한다. 32마리의 마우스에서 총 32개의 상처 (64개 표피 가장자리)를 만들었다.
가장 중요한 상처 치유 합병증 중 하나는 표피의 과다증식이다. 상처와 관련된 스트레스 신호에 대한 반응으로서, 피부 손실을 보상하기 위해 표피의 기저층에서 세포 증식이 발생한다. 일반적으로, 특별하지 않은 상처 치유에서, 표피 세포는 증식 후 곧바로 상처 갭의 밀봉을 위해 이동을 개시한다. 예를 들어 당뇨병 상처에서 고혈당에 의해 야기된 피부 합병증에서, 이동이 발생하지 않거나 느려질 때, 표피 과다증식은 현저해지고, 이는 상처 치유에서 심지어 더 많은 합병증을 야기할 수 있다. 본 실험에 이용된 모델에서와 같은 급성 개방 상처에서, 또는 수술 후 상처와 같은 급성 봉합 상처에서, 표피 가장자리의 과다증식과 관련된 표피 치유의 감소는 오염 및 그 밖의 상처 치유 합병증, 예컨대 상처 벌어짐, 상처로부터 유체 배수, 또는 상처로부터 조직 돌출의 위험을 증가시킨다.
효과적인 상처 치유 과정에서, 일차 혈괴는 상처 갭에서 육아 조직을 형성하기 위해 점진적인 변화를 겪고, 이는 리모델링 이후, 결국 완전히 복구된 기능을 지닌 새로이 형성된 피부 조직이 된다. 비-피부 관련 조직의 유착이 상처 갭에서 발생하면, 육아 조직은 제대로 형성되지 못하고, 결과적으로, 최종 조직 리모델링이 제한된다. 이는 치유된 피부의 기능에 추가의 제한을 야기시킬 수 있다.
염수-기반 제형의 시험 화합물을 이용한 상처의 처리는 상처 치유를 개선시키고 심한 유착을 방지한다
피부 상처 치유에 대한 시험 화합물의 효과를 마우스 길이방향 전체 두께 피부 절개 상처 모델에서 연구하였다. 이소플루란으로 마취된 7-8주령 C57BL 수컷 마우스에서 수술 절차를 수행하였다. 수술 절차 전에, 마우스를 이소플루란으로 마취시키고, 털을 깎았다. 20 mm의 전체 두께 길이방향 절개를 표준 스캘펄 블레이드를 이용하여 수행하였다. 상처를 낸 지 3시간 후, 동물의 피부 탄성 및 활동으로 인해, 절개는 타원형이 되었다. 이 단계에서, 상처의 가장 넓은 면적을 측정하여 기준선 상처 폭을 확립하였다. 상처 치유 평가는 가장 넓은 상처 면적을 측정함에 의해 수행되었다. 상처의 처리는 상처에 직접 0.2 mL의 용액을 매일 국소 도포함에 의해 수행되었다. 각각의 매일 치료 후, 상처는 한동안 습윤되어 있으므로 (3-5시간), 상처 치료 과정은 부분적으로 습한 환경에서 수행된다. 실험의 끝에, 상처를 낸 지 8일 후에, 마우스를 희생시키고, 상처 폭을 측정하고, 상처 영역의 생검을 수집하여 조직학적 분석하였다.
표 18. 초기 연구 그룹
Figure 112020104886621-pat00083
투여 용액은 각 투여일에 새로이 제조되었다. 시험 화합물을 동결건조된 분말로서 공급하고 염수에서 3 mg/mL의 스톡 현탁액으로 재구성하였으며, 이어서 염수로 희석시켜 국소 도포를 위한 3 μM의 워킹 농도를 달성하였다. 대조 그룹의 상처는 국소적으로 염수로 처리되었다.
처리 단계의 끝에, 상처를 낸 지 8일 후에, 마우스를 CO2의 흡입에 의해 희생시키고, 상처 영역의 생검을 회수하였다. 상처 조직의 고정을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 수행하였다. 전체 상처 영역의 고정 후에, 상처의 가장 넓은 영역의 5 mm 절제를 수행하고, 절제된 영역을 파라핀 매입시켰다. 그래쥬에이트 탈수의 표준 절차를 이용하여 파라핀 블록을 제조하였다. 이후, 조직학적 섹션을 준비하고 조직을 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 상처 치유 변수를 평가하고 그래프로 나타내었다.
가장 넓은 영역의 상처에서 조직학적 섹션을 분석함에 의해 표피 폐쇄가 8일에 H&E 염색을 이용하여 평가되었다. 전체 상처 갭을 덮는 표피의 연속적인 층의 존재를 나타내는 상처 및 양 가장자리를 현미경 시야에서 400x 배율로 관찰할 때 표피 가장자리의 가장 진보된 이동을 지닌 상처는 진보된 표피 폐쇄 변수에 대해 양성으로 고려된다. 상기 결과를 실험 그룹 당 전체의 퍼센트로서 제시한다.
진피 치유는 에오신 염색된 건강한 진피 및 상처 갭에서 새로이 형성된 진피 가장자리의 조사에 의해 평가되었다. 현미경의 100x 배율 시야 (BX41 Olympus 또는 Axiovert 25, Zeiss)에서 관찰된 양 진피 가장자리를 갖는 상처는 진보된 진피 폐쇄 치유 변수에 대해 양성으로 고려된다. 진보된 진피 폐쇄를 지닌 상처의 수는 실험 그룹의 총 상처의 퍼센트로서 제시된다.
육아 조직은 H&E 염색을 이용하여 평가되었다. 주된 섬유소 응괴가 지방세포를 함유하는 섬유성 결합 조직, 림프 세포를 함유하는 새로운 모세혈관 및 침윤물, 대식세포, 및 형질 세포에 의해 대체되면, 육아 조직은 초기로 간주된다. 매우 풍부한 섬유모세포 및 콜라겐 섬유에 의해 대체된 초기 육아 조직은 진보된 것으로 간주된다. 전반적으로, 상처 갭에서 진보된 육아 조직의 면적은 총 상처 갭 면적의 퍼센트로서 기록된다. 상처 갭의 40%를 덮는 진보된 육아 조직 형성을 나타내는 상처 갭은 이러한 변수에 대해 양성으로 고려된다. 결과는 그룹 당 총 상처의 퍼센트로서 계산되었다.
상처 갭에서 세포 및 조직 구조를 분서함에 의해 유착을 평가하였다. 상처 유착을 약함, 중간 또는 심함 규모로 채점하였다. 상처 갭에 응괴가 있거나 정상 육아 조직이 다른 조직, 예컨대 골격근 또는 광범위한 림프계 조직에 의해 대체되는 경우 음성 점수로 간주된다. 몇몇 유착 또는 이상 육아가 상처 갭 영역의 40%를 넘게 점유하면 심함으로 간주된다. 현저하지 않거나 정상 피부 조직 재생을 방해하지 않을 때 유착은 약함으로 간주된다. 중증 유착을 지닌 상처를 실험 그룹 당 총 상처의 퍼센트로서 계산한다. 19마리의 마우스에서 총 19개의 상처 (38개 표피 가장자리)를 만들었다.
돼지 피부에 대한 상처 치유의 후기 단계에서 치유 과정 및 흉터형성에 대한 시험 화합물의 국소 도포의 효과의 평가
피부 상처 치유의 후기 단계에 대한 시험 화합물의 효과를 길이방향 전체 두께 절개의 돼지 상처 모델에서 연구하였다. 수술 당일에, 케타민, 자일라진, 디아제팜 및 이소플루란을 사용하여 돼지를 마취시켰다. 등쪽 흉부와 복부 상의 털을 깎고 등쪽 정중선의 양쪽으로부터 4 cm에 10쌍의 2.5 cm의 전체 두께 길이방향 피부 절개를 #11 스캘펄 블레이드를 이용하여 내었다. 수술 절차 후에, 상처를 실험 그룹으로 나누고, 모든 방향에서 상처로부터 2cm의 거리까지 상처 영역에 가까운 피부의 처리를 포함하여, 상처 영역과 상처 가장자리를 국소 도포에 의해 매일 처리하였다. 투여 용액은, 전체 처리 부피 (예를 들어, 1 mL의 비히클 또는 시험 화합물)가 조직에 흡수될 때까지, 피펫을 이용하여 각각의 상처에 점차 도포된다. 상처에 가까운 피부를 시험 화합물 또는 비히클 용액이 스며든 거즈로 처리하였다.
실험 동안, 상처를 사진-기록하고, 형태학적 분석을 수행하였다. 처리 단계의 끝에 (상처를 낸 지 19일 후), 마취제 및 KCl을 투여하여 돼지를 희생시켰다. 상처 형태를 조사하고, 상처를 사진-기록하고, 상처 영역의 생검을 고정 및 추가 형태학적 및 조직학적 분석을 위해 회수하였다.
표 19. 초기 연구 그룹
Figure 112020104886621-pat00084
투여 용액은 각 투여일에 새로이 제조되었다. 시험 화합물은 동결건조된 분말로서 공급되었고, 이를 100% DMSO에 용해시켜 15 mM의 스톡 용액을 제조하였다. 이어서 주입가능한 물에서 희석을 수행하여 국소 도포를 위한 3 μM 및 1 μM의 최종 농도를 달성하였다.
처리 단계의 끝에 (상처를 낸 지 19일 후), 상처 치유의 평가를 수행하였다. 완전히 치유된 상처를 그룹 당 총 상처의 퍼센트로서 보고하였다. 완전히 치유되고 전체 딱지가 완전히 탈착된 흉터의 평균 폭을 또한 보고하였다. 흉터를 측정하고 (mm) 흉터의 평균 폭 및 표준 편차를 계산하였다. 총 20개의 상처를 수행하였다.
처리 단계의 끝에 (상처를 낸 지 19일 후), 마취제 및 KCl의 과다복용에 의해 돼지를 희생시키고, 상처 영역의 생검을 회수하였다. 상처 생검의 고정을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 수행하였다. 고정 후에, 상처 생검을, 예를 들어 고해상도의 디지털 카메라 FinePix S700을 이용하여 사진-기록하였다.
참고문헌
Figure 112020104886621-pat00085
Figure 112020104886621-pat00086
Figure 112020104886621-pat00087
본원에 인용된 모든 특허, 공개된 출원 및 참고문헌의 교시내용은 이들의 전체내용이 참조로서 포함된다.
본 발명은 이의 예시적 구체예와 관련하여 특별히 제시되고 기재되었으나, 형태 및 세부사항에 있어서 다양한 변화가 첨부된 청구항에 의해 포함되는 본 발명의 범위로부터 벗어남이 없이 그 안에서 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.

Claims (31)

  1. (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산을 하기 화학식을 갖는 피발로하이드라지드와 반응시키는 단계를 포함하는 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)-N'-피발로일아크릴로하이드라지드를 합성하는 방법:
    Figure 112020105531607-pat00135
    .
  2. 제1항에 있어서, (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산이 (Z)-이소프로필 3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴레이트를 LiOH와 반응시킴으로써 형성되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, (Z)-이소프로필 3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴레이트가 3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸을 (Z)-이소프로필 3-아이오도아크릴레이트와 반응시킴으로써 형성되는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸이 3,5-비스(트리플루오로메틸)벤조티오아미드를 하이드라진 하이드레이트와 반응시킴으로써 형성되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 3,5-비스(트리플루오로메틸)벤조티오아미드가 3,5-비스(트리플루오로메틸)벤조니트릴을 소듐 설프하이드레이트(sodium sulfhydrate)와 반응시킴으로써 형성되는, 방법.
  6. (Z)-이소프로필 3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴레이트를 LiOH와 반응시키는 단계를 포함하는 (Z)-3-(3-(3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐)-1H-1,2,4-트리아졸-1-일)아크릴산을 합성하는 방법.
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