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JP2020037585A - 核内輸送調節因子およびその使用 - Google Patents

核内輸送調節因子およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】核輸送を調節する化合物を提供すること。【解決手段】所定の式Iの化合物またはその薬学的に許容可能な塩。【選択図】なし

Description

本発明は、核内輸送調節因子およびその使用に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、2012年5月9日に出願された米国仮特許出願第61/644,802号明細書、および2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/798,188号明細書の優先権を主張する。上記出願の教示全体は、参照によって本明細書に援用される。
ほとんどの主要なヒト固形および血液悪性腫瘍からの細胞は、多様な発がん性タンパク質、腫瘍サプレッサータンパク質、および細胞周期制御因子の異常な細胞局在を示す(Cronshaw et al.2004、Falini et al.2006)。例えば特定のp53変異は、核内でなく細胞質中への局在化をもたらす。これは腫瘍サプレッサー機能が無傷であるにもかかわらず、正常な増殖制御の喪失をもたらす。その他の腫瘍では、野生型p53は細胞質中に隔離され、または迅速に分解されて、この場合もまた、そのサプレッサー機能の喪失につながる。機能性p53タンパク質の適切な核局在化の復元は、新生物細胞のいくつかの特性を正常化し得て(Cai et al.2008;Hoshino et al.2008;Lain et al.1999a;Lain et al.1999b;Smart et al.1999)、DNA損傷剤に対するがん細胞の感受性を復元し得て(Cai et al.2008)、確立した腫瘍(Sharpless & DePinho 2007、Xue et al.2007)の退縮をもたらし得る。フォークヘッド(Turnerand Sullivan 2008)およびc−Abl(Vignari and Wang 2001)などのその他の腫瘍サプレッサータンパク質についても、同様のデータが得られている。これに加えて、いくつかの腫瘍サプレッサーおよび増殖制御タンパク質の異常な局在化が、自己免疫疾患の発病に関与することもある(Davis 2007、Nakahara 2009)。CRM1の阻害は、特異的腫瘍サプレッサータンパク質(TSP)が欠失し、または機能不全である、家族性がん症候群(例えば1つのp53対立遺伝子の欠損に起因するリー・フラウメニ症候群、BRCA1またはBRCA2がん症候群)において特に興味深い効用を提供してもよく、CRM1阻害剤の全身性(または局所性)投与によるTSPレベルの増大は、正常な腫瘍サプレッサー機能の復元を助け得る。
特定のタンパク質およびRNAは、それらが分子を核内に搬入する場合はインポーチンに分類され、分子を核外に搬出する場合はエクスポーチンに分類される、特化された輸送分子によって核に搬入され、それから搬出される(Terry et al.2007;Sorokin et al.2007)。核に搬入されそれから搬出されるタンパク質は、妥当な輸送体との相互作用する可能にする、核内搬入/局在化(NLS)または搬出(NES)配列を含有する。エクスポーチン−1またはXpo1とも称されるChromosomal Region Maintenance 1(Crm1)は、主要なエクスポーチンである。
Crm1の過剰発現は、ヒト卵巣がん(Noske et al.2008)、子宮頸がん(van der Watt et al.2009)、膵臓がん(Huang et al.2009)、肝細胞がん(Pascale et al.2005)、および骨肉腫(Yao et al.2009)をはじめとするいくつかの腫瘍において報告されており、独立してこれらの腫瘍型の芳しくない臨床転帰と関連付けられている。
Crm1の阻害は、遺伝子発現、細胞増殖、血管新生、およびエピジェネティックスと関連付けられている、p53、c−Abl、p21、p27、pRB、BRCA1、IkB、ICp27、E2F4、KLF5、YAP1、ZAP、KLF5、HDAC4、HDAC5またはフォークヘッドタンパク質(例えばFOXO3a)などの腫瘍サプレッサータンパク質および/または増殖制御物質の核からの大量流出をブロックする。Crm1阻害剤は、正常な(非形質転)細胞を残しながら、発がん性活性化または増殖促進シグナル存在下であってさえも、がん細胞にアポトーシスを誘導することが示されている。Crm1の阻害の大多数の研究は、天然Crm1阻害剤レプトマイシンB(LMB)を利用している。LMBそれ自体は、新生物細胞に対して高度に毒性であるが、耐容性に劣り、動物(Roberts et al.1986)およびヒト(Newlands et al.1996)において著しい胃腸毒性がある。薬剤様特性を改善するためのLMBの誘導体化は、動物腫瘍モデルにおいて、抗腫瘍活性を維持して耐容性がより良い化合物をもたらす(Yang et al.2007、Yang et al.2008、Mutka et al.2009)。したがって核外搬出阻害剤は、新生物およびその他の増殖性疾患において、有益な効果を有し得る。しかし今まで、生体外および生体内で使用するための、小分子薬剤様Crm1阻害剤は、稀であった。
腫瘍サプレッサータンパク質に加えて、Crm1はまた、炎症過程に関与するいくつかの重要なタンパク質も搬出する。これらとしては、IkB、NF−kB、Cox−2、RXRα、Commd1、HIF1、HMGB1、FOXO、FOXP、その他が挙げられる。それが免疫グロブリンκ遺伝子発現を駆動するという発見に名前が由来する、転写活性化因子の核因子κB(NF−kB/rel)ファミリーは、炎症、増殖、免疫、および細胞生存に関与する、多様な遺伝子のmRNA発現を調節する。基本条件下では、IkBと称されるNF−kBのタンパク質阻害剤は、核内でNF−kBに結合して、複合体IkB−NF−kBは、NF−kB転写機能を不活性化する。炎症性刺激に応えて、IkBはIkB−NF−kB複合体から解離し、それはNF−kBを遊離させて、その強力な転写活性を曝露させる。NF−kBを活性化する多数のシグナルは、IkBをタンパク質分解の標的にすることでNF−kBを活性化する(IkBのリン酸化は、それをユビキチン化、次にタンパク質分解のために「標識する」)。核IkBa−NF−kB複合体は、Crm1によって細胞質に搬入され得て、そこで解離してNF−kBが再活性化され得る。ユビキチン化IkBもまたNF−kB複合体から解離して、NF−kB転写活性が復元されてもよい。ヒト好中球およびマクロファージ様細胞(U937)へのCrm1誘導性搬入のLMBによる阻害は、転写的に不活性の核IkBa−NF−kB複合体の蓄積をもたらすだけでなく、細胞刺激時であってもさえもNF−kBの初期活性化もまた妨げる(Ghosh 2008、Huang 2000)。別の研究では、LMBによる処理は、肺微小血管内皮細胞中で、IL−1β誘導性NF−kBDNA結合(NF−kB転写活性化の最初のステップ)、IL−8発現、および細胞間接着分子発現を阻害した(Walsh 2008)。COMMD1は、NF−kBおよび低酸素誘導因子1(HIF1)転写活性の双方に対する、別の核阻害剤である。Crm1阻害によってCOMMD1の核外搬出をブロックすることは、NF−kBおよびHIF1転写活性阻害の増大をもたらす(Muller 2009)。
Crm1はまた、レチノイドX受容体α(RXRα)輸送も媒介する。RXRαは肝臓中で高度に発現されて、胆汁酸、コレステロール、脂肪酸、ステロイド、および異物代謝、および恒常性の調節において、中心的役割を果たす。肝臓炎症中には、主にCrm1によるRXRαの炎症媒介核外搬出のために、核RXRαレベルは顕著に低下する。Lep Bは、ヒト肝臓由来細胞において、IL−1β誘導性の細胞質におけるRXRαレベル増大を妨げることができる(Zimmerman 2006)。
NF−kB、HIF−1、およびRXRαシグナル伝達におけるCrm1媒介の核外搬出の役割は、核外搬出をブロックすることが、血管系(血管炎、動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、アテローム性動脈硬化)、皮膚科学的(上記参照)、リウマチ学的(リウマチ性および関連関節炎、乾癬性関節炎、脊椎関節症、結晶性関節症、全身性エリテマトーデス、混合性結合組織疾患、筋炎症候群、皮膚筋炎、封入体筋炎、未分化結合組織病、シェーグレン症候群、強皮症、および重複症候群など)をはじめとする、複数の組織および臓器にわたる多数の炎症過程において、潜在的に有益であり得ることを示唆する。
CRM1の阻害は、ICp27、E2F4、KLF5、YAP1、ZAPのような一連の転写因子を阻害/活性化することで、遺伝子発現に影響を及ぼす。
Crm1の阻害は、炎症性皮膚疾患(アトピー、アレルギー性皮膚炎、化学性皮膚炎、乾癬)、日焼けによる損傷(紫外線/UV損傷)、および感染症をはじめとする、多数の皮膚科学的症候群に対する潜在的な治療効果を有する。LMBを用いて最も良く研究されたCRM1の阻害は、正常なケラチノサイトに対する最小の影響を示し、UV、TNFa、またはその他の炎症性刺激に曝露したケラチノサイトに対する抗炎症活性を発揮した(Kobayashi & Shinkai 2005、Kannan & Jaiswal 2006)。Crm1の阻害はまた、ケラチノサイト(Schafer et al.2010、Kannan & Jaiswal 2006)およびその他の細胞型(Wang et al.2009)を酸化損傷から保護する、NRF2(核因子赤血球系関連因子2)活性を上方制御する。LMBは、HPV16などの発がん性ヒトパピローマウイルス(HPV)株に感染したケラチノサイトにアポトーシスを誘導するが、未感染ケラチノサイトでは誘導しない(Jolly et al.2009)。
Crm1はまた、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病、および筋萎縮性側索硬化をはじめとする、神経変性疾患に有用であってもよい、重要な神経保護タンパク質の輸送も媒介する。例えば、(1)NRF2(Wang 2009)、FOXA2(Kittappa et al.2007)などの重要な神経防護作用制御因子の核内保持を強制して神経細胞内に留め、および/または(2)グリア細胞の核内へのIκB隔離によりNFκB転写活性を阻害することで、Crm1の阻害は、これらの障害で見られる神経細胞死を遅延または予防し得る。異常なグリア細胞増殖を、CRM1レベルまたはCR1機能の異常と結びつける証拠もある(Shen 2008)。
主にCRM1を通じて媒介される、損なわれていない核外搬出はまた、多数のウイルスの損なわれていない成熟にも必要である。それらの生活環に、核外搬出、および/またはCRM1それ自体が関係があるとされるウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、アデノウイルス、サルレトロウイルス1型、ボルナ病ウイルス、インフルエンザ(通常株ならびにH1N1および鳥類H5N1株)、B(HBV)およびC(HCV)型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス(HPV)、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、デング(Dungee)、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、サイトメガロウイルス(CMV)、およびメルケル細胞ポリオーマウイルス(MCV)が挙げられる。(Bhuvanakantham 2010、Cohen 2010、Whittaker 1998)。損なわれていない核外搬出に依存する、追加的なウイルス感染症が近い将来発見されるものと思われる。
核小体を通り抜けて、核と細胞質の間を往復するHIV−1 Revタンパク質は、Rev応答要素(RRE)RNAを含有する、スプライシングされていない、そして個々にスプライスされている、HIV転写物のCRM1搬出経路による搬出を容易にする。LepBまたはPKF050−638などのCRM1阻害剤を使用するRev媒介RNA輸送の阻害は、HIV−1転写過程を停止させ、新しいHIV−1ビリオン生成を阻害して、それによってHIV−1レベルを低下させ得る(Pollard 1998、Daelemans 2002)。
デングウイルス(DENV)は、一般的な節足動物媒介ウイルス疾患であるデング熱(DF)と、そのより重篤で潜在的に致死性のデング出血熱(DHF)の病原体である。DHFは、DENVに対する過剰な炎症応答の結果のようである。NS5は、DENVの最大かつ最も良く保存されたタンパク質である。CRM1は、核から、NS5の機能の大部分がそこで媒介される細胞質への、NS5輸送を調節する。CRM1が媒介するNS5の搬出阻害は、ウイルス生成動態の変化をもたらし、炎症性ケモカインインターロイキン−8(IL−8)の誘導を低下させ、DENV、そしてC型肝炎ウイルスをはじめとする、その他の医学的に重要なフラビウイルスによって引き起こされる疾患の治療に、新しい手段を提示する(Rawlinson 2009)。
核外に出るためにCRM1を使用する、ウイルスにコードされたその他のRNA結合タンパク質としては、HSV1型テグメントタンパク質(VP13/14、またはhUL47)、ヒトCMVタンパク質pp65、SARSコロナウイルスORF 3bタンパク質、およびRSVマトリックス(M)タンパク質が挙げられる(Williams 2008、Sanchez 2007、Freundt 2009、Ghildyal 2009)。
興味深いことに、これらのウイルスの多くは、慢性HBVまたはHCV感染症に起因する肝細胞がん(HCC)、HPVに起因する子宮頸がん、およびMCVと関連付けられているメルケル細胞がんをはじめとする、特定タイプのヒトのがんと関連付けられている。したがってCRM1阻害剤は、ウイルス伝染過程、ならびにこれらのウイルスに起因する悪性形質転換過程の双方に対して、有益な効果を有し得る。
CRM1は核局在化を制御し、ひいてはヒストンデアセチラーゼ(HDAC)、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)、およびヒストンメチルトランスフェラーゼ(HMT)をはじめとする酵素を代謝する、複数のDNAの活性を制御する。不可逆的CRM1阻害剤による心筋細胞肥大の抑制が実証されており、肥大性遺伝的プログラムを抑制することが知られている酵素である、HDAC5の核内保持(および活性化)と関連があると考えられる(Monovich et al.2009)。したがってCRM1阻害は、特定形態のうっ血性心不全および肥大性心筋症をはじめとする肥大性症候群において、有益な効果を有してもよい。
CRM1はまた、その他の障害とも関連付けられている。網膜神経節細胞の変性および視力喪失によって特徴付けられる遺伝性疾患であるレーバー病は、CRM1スイッチの不活動と関連付けられている(Gupta N 2008)。神経変性障害を核輸送異常と結びつける証拠もある。
Mutka S,Yang W,Dong S,et al.2009.Identification of nuclear export inhibitors with potent anticancer activity in vivo.Cancer Res.69:510−7.
上記を鑑みて、核輸送を調節する化合物の発見が望ましい。
本発明は、核輸送調節因子として有用な化合物およびその薬学的に許容可能な塩と、本発明の化合物を含んでなる薬学的に許容可能な組成物と、前記組成物を様々な障害の治療において使用する方法とに関する。今や、本発明の核輸送調節因子およびその薬学的に許容可能な塩および/または組成物が、マウス中でAUCによって判定される望ましい生体内曝露を提供する一方で、その他の調節因子と比較してより低い脳透過性レベルを示すことが分かった。本発明の化合物は、一般式I:
またはその薬学的に許容可能な塩を有し、式中、各変数は、本明細書に定義され記載されるとおりである。
本発明の化合物およびその薬学的に許容可能な組成物は、不適当な核輸送によって引き起こされる、異常な細胞応答にと関連づけられている、多様な疾患、障害または病状の治療に有用である。このような疾患、障害、または病状としては、本明細書で記載されるものが挙げられる。
本発明によって提供される化合物はまた、生物学的および病理学的現象における核輸送調節の研究;このようなキナーゼによって媒介される細胞内情報伝達経路の研究;および新しい核輸送調節因子の比較評価のためにも有用である。
前述の事項は、以下の本発明の例証的実施形態のより具体的な説明から、明らかになるであろう。
即ち、本発明の要旨は、
〔1〕式I:
の化合物
(式中、
は、水素およびC〜Cアルキルから選択され;
は、OおよびSから選択され;
は、−N(R)−(C〜Cシクロアルキル)、−C〜Cアルキル、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリル、および−(C〜Cアルキレン)−ヘテロアリールから選択され(式中、Rのあらゆるアルキル、アルキレン、ヘテロシクリル、およびヘテロアリール部分は、任意選択的に独立して置換される);
は、水素およびC〜Cアルキルから選択される)、
またはその薬学的に許容可能な塩、
〔2〕Rが、水素およびメチルから選択される、〔1〕に記載の化合物、
〔3〕Rが、水素である、〔2〕に記載の化合物、
〔4〕RがOである、〔1〕〜〔3〕のいずれか一に記載の化合物、
〔5〕Rが水素である、〔1〕〜〔4〕のいずれか一に記載の化合物、
〔6〕Rが、−N(R)−(C〜Cシクロアルキル)、−C〜Cアルキル、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリル、および−(C〜Cアルキレン)−ヘテロアリールから選択され:
のあらゆるアルキルまたはアルキレン部分が、任意選択的に、独立して、オキソおよび−N(Rからなる群から選択される、1つまたは複数の置換基で置換され、式中、各Rは水素およびC〜Cアルキル、から独立して選択され;
のあらゆるヘテロシクリル部分が、環内に少なくとも1つの窒素原子を含んでなり、任意選択的に、C〜Cアルキルおよびオキソからなる群から選択される1つまたは複数の置換基で置換され;
のあらゆるヘテロアリール部分が、環内に少なくとも1つの窒素原子を含んでなり、任意選択的に、1つまたは複数のC〜Cアルキルで置換される、
〔1〕〜〔5〕のいずれか一に記載の化合物、
〔7〕Rが、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリルである、〔6〕に記載の化合物、
〔8〕Rが、−(Cアルキレン)−ヘテロシクリルである、〔7〕に記載の化合物、
〔9〕前記ヘテロシクリルが、ピラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、およびピラゾリルから選択される、〔7〕または〔8〕に記載の化合物、
〔10〕前記ヘテロシクリルが、−C(CH、−NH−シクロプロピル、−CH−ピラジン−2−イル、−ピラジン−2−イル、−CH−モルホリン−4−イル、および5−メチル−1−H−ピラゾール−4−イルから選択されるモルホリニルRである、〔9〕に記載の化合物、
〔11〕Rのあらゆるアルキル、アルキレン、ヘテロシクリル、およびヘテロアリール部分が、任意選択的に、独立して、−OH、−SH、ニトロ、ハロゲン、アミノ、シアノ、C〜C12アルキル、C〜C12アルケニルまたはC〜C12アルキニル基、C〜C12アルコキシ、C〜C12ハロアルキル、C〜C12ハロアルコキシ、およびC〜C12アルキルスルファニルからなる群から選択される、1つまたは複数の置換基で置換される、
〔1〕〜〔5〕のいずれか一に記載の化合物、
〔12〕Rのあらゆるアルキル、アルキレン、ヘテロシクリル、およびヘテロアリール部分が、任意選択的に、独立して、式−N(R(式中、各Rは、水素およびC〜Cアルキルから独立して選択される)を有するアミノ基で置換される、
〔1〕〜〔5〕のいずれか一に記載の化合物、
〔13〕Rのあらゆるヘテロアリール部分が、任意選択的に、独立して、−OH、−SH、ニトロ、ハロゲン、アミノ、シアノ、C〜C12アルキル、C〜C12アルケニル、C〜C12アルキニル、C〜C12アルコキシ、C〜C12ハロアルキル、C〜C12ハロアルコキシ、およびC〜C12アルキルスルファニルからなる群から選択される、1つまたは複数の置換基で置換され;
のあらゆるアルキル、アルキレンまたはヘテロシクリル部分が、任意選択的に、独立して、オキソ、−OH、−SH、ニトロ、ハロゲン、アミノ、シアノ、C〜C12アルキル、C〜C12アルケニル、C〜C12アルキニル、C〜C12アルコキシ、C〜C12ハロアルキル、C〜C12ハロアルコキシ、およびC〜C12アルキルスルファニルからなる群から選択される、1つまたは複数の置換基で置換される、
〔1〕〜〔5〕のいずれか一に記載の化合物、
〔14〕Rが、−N(R)−(C〜Cシクロアルキル)、−C〜Cアルキル、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリル、および−(C〜Cアルキレン)−ヘテロアリールから選択され;
のあらゆるアルキルまたはアルキレン部分が、任意選択的に−N(R(式中、各Rは、水素およびC〜Cアルキルから独立して選択される)で置換され;
のあらゆるヘテロシクリル、およびヘテロアリール部分が、環内に少なくとも1つの窒素原子を含んでなり;
のあらゆるヘテロシクリル、およびヘテロアリール部分が、任意選択的にC〜Cアルキルで置換される、
〔1〕〜〔5〕のいずれか一に記載の化合物、
〔15〕Rが、−C(CH、−CH(NH)−CH(CH、−NH−シクロプロピル、−(CH0〜1−ピラジニル、ピペリジニル、ヒドロキシピペリジニル、N−メチルピペリジニル、−CH−モルホリン−4−イル、およびメチルピラゾリルから選択される、〔14〕に記載の化合物、
〔16〕Rが、−C(CH、−CH(NH)−CH(CH、−NH−シクロプロピル、−(CH0〜1−ピラジン−2−イル、ピペリジン−3−イル、−CH−モルホリン−4−イル、および5−メチル−1−H−ピラゾール−4−イルから選択される、〔15〕に記載の化合物、
〔17〕Rが、−C(CH、−NH−シクロプロピル、−CH−ピラジン−2−イル、−ピラジン−2−イル、−CH−モルホリン−4−イル、および5−メチル−1−H−ピラゾール−4−イルから選択される、〔16〕に記載の化合物、
〔18〕構造式、
のいずれか1つによって表される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、
〔19〕化合物1、2、3、4、8、11、12、および13のいずれか1つから選択される、〔18〕に記載の化合物、
〔20〕〔1〕〜〔19〕のいずれか一に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容できる担体とを含んでなる医薬組成物、
〔21〕〔20〕に記載の医薬組成物の治療有効量をそれを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、CRM1活性関連障害を治療する方法、
〔22〕前記障害が、増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫障害、ウイルス感染症、眼科疾患、神経変性疾患、異常な組織成長障害、食物摂取量関連障害、アレルギー、および呼吸器疾患から選択される、〔21〕に記載の方法、
〔23〕前記疾患が、がんである、〔22〕に記載の方法、
〔24〕前記がんが、リンパ腫である、〔23〕に記載の方法、
〔25〕前記組成物が、がんを治療するのに有用な第2の治療薬と共に投与される、〔23〕または〔24〕に記載の方法、
〔26〕前記疾患が、関節炎である、〔21〕に記載の方法、
〔27〕前記疾患が、乾癬である、〔21〕に記載の方法、
〔28〕前記疾患が、肥満である、〔21〕に記載の方法、
〔29〕〔20〕に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含んでなる、それを必要とする対象において創傷治癒を促進する方法、
〔30〕前記創傷が、外傷、外科的創傷、内傷、慢性創傷、潰瘍、火傷であり、または放射線被曝の結果である、〔29〕に記載の方法、
〔31〕前記創傷が、火傷、切創、開放創、手術創または手術後創、糖尿病性病変、熱傷、化学火傷、放射線火傷、褥瘡、床擦れ、および糖尿病または芳しくない循環に関連した病状からなる群から選択される、〔29〕に記載の方法
に関する。
本発明により、核輸送を調節する化合物が提供され得る。
ビヒクル、80mg/kgシクロホスファミド、15mg/kgの化合物2または7.5mg/kgの化合物2で処置されたマウスにおける、Z−138異種移植腫瘍の群平均体積を示す、経時的平均腫瘍体積のグラフである(誤差棒は各群のSEMを表す)。 ビヒクル、5mg/kgシスプラチン、10mg/kgの化合物2または5mg/kgの化合物2で処置されたマウスにおける、A549異種移植腫瘍の群平均体積を示す、経時的平均腫瘍体積のグラフである(誤差棒は各群のSEMを表す)。 12日間の観察期間にわたる、ビヒクル、デキサメタゾン、4mg/kgの化合物2または7.5mg/kgの化合物2で処置された、抗コラーゲン抗体誘発性オスBALB/c関節炎マウスの臨床関節炎スコアを示す、経時的総合関節炎スコアのグラフである(¥=ビヒクル処置群と有意差があるデキサメタゾン処置群;#=ビヒクル処置群と有意差がある7.5mg/kgの化合物2処置群;†=ビヒクル処置群と有意差がある4mg/kgの化合物2処置群)。 12日間の観察期間にわたる、ビヒクル、デキサメタゾン、4mg/kgの化合物2または7.5mg/kgの化合物2で処置された、抗コラーゲン抗体誘発性オスBALB/c関節炎マウスの群平均後肢厚さを示す、経時的平均後肢グラフである(¥=ビヒクル処置群と有意差があるデキサメタゾン処置群;#=ビヒクル処置群と有意差がある7.5mg/kgの化合物2処置群;†=ビヒクル処置群と有意差がある4mg/kgの化合物2処置群)。 陽性対照または化合物2によってCIAモデルに従って処置された、未感作ラットおよびラットにおける、0〜4の尺度で測定された関節腫脹を示す、経時的関節腫脹のグラフである。 陽性対照または化合物2によってCIAモデルに従って処置された、未感作ラットおよびラット臨関節炎スコアを示す、時間の関数としての臨床スコアのグラフである。 陽性対照または化合物2によってモデルに従って処置された、未感作ラットおよびラットの後足の組織病理学を示す、CIAモデルにおける各処置群からの代表的画像である。 ビヒクル、PMAとビヒクル、PMAと化合物2、またはPMAとベタメタゾンで処置されたメスBALB/cマウス左耳介厚の群平均を示す、経時的耳介厚のグラフである。 ビヒクル、PMAとビヒクル、PMAと化合物2、またはPMAとベタメタゾンで処置されたメスBALB/cマウス右耳介厚の群平均を示す、経時的耳介厚のグラフである。 ビヒクル、PMAとビヒクル、PMAと化合物2、またはPMAとベタメタゾンで処置されたメスBALB/cマウス左耳介疾患活動性の群平均を示す、疾患活動性グラフである。 ビヒクル、PMAとビヒクル、PMAと化合物2、またはPMAとベタメタゾンで処置されたメスBALB/cマウス右耳介疾患活動性の群平均を示す、疾患活動性グラフである。 IMQ投与前に、ビヒクル、IMQとビヒクル、IMQと1μMの化合物2、またはIMQと10mg/kgのシクロホスファミドで処置された、オスBALB/cマウスの疾患活動性を示す、経時的疾患活動指数のグラフである。 IMQ投与後に、ビヒクル、IMQとビヒクル、IMQと1μMの化合物2、またはIMQと10mg/kgのシクロホスファミドで処置された、オスBALB/cマウスの疾患活動性を示す、経時的疾患活動指数のグラフである。 ビヒクル(VEH)、1.5mg/kgの化合物または3.0mg/kgの化合物2で処置された、痩せ型Zuckerラットおよび肥満型Zuckerラットの累積食物摂取量を示す、経時的累積食物摂取量のグラフである。 ビヒクル(VEH)、1.5mg/kgの化合物または3.0mg/kgの化合物2で処置された、痩せ型Zuckerラットおよび肥満型Zuckerラットの平均食物摂取量を示す、経時的平均食物摂取量のグラフである。 実験の処置期間(試験10〜17日目)および休薬期間(試験24日目)における、ビヒクル(VEH)、1.5mg/kgの化合物または3.0mg/kgの化合物2で処置された、痩せ型Zuckerラットおよび肥満型Zuckerラットの百分率体重変化を示す、経時的体重変化百分率の棒グラフである。 研究のベースライン、処置、および洗い出し段階における、ビヒクル、1.5mg/kgの化合物または3.0mg/kg化合物2で処置された、標準固形飼料を与えたラットおよび高脂肪食を与えたラットの累積食物摂取量を示す、経時的累積食物摂取量のグラフである。 研究のベースライン、処置、および洗い出し段階における、ビヒクル、1.5mg/kgの化合物または3.0mg/kg化合物2で処置された、標準固形飼料を与えたラットおよび高脂肪食を与えたラットの平均体重を示す、経時的平均体重のグラフである。 ビヒクル、1.5mg/kgの化合物または3.0mg/kgの化合物2で処置された、標準固形飼料を与えたラットおよび高脂肪食を与えたラットの百分率体重変化を示す、経時的体重変化百分率の棒グラフである。 12A。ノックダウン条件をはじめとする多様な条件下における、Nrf2発現のグラフである。12B。ノックダウン条件をはじめとする多様な条件下における、NQO1発現のグラフである。 ノックダウン条件をはじめとする多様な条件下における、EPHX1発現のグラフである。 13A。化合物1が、COX−2転写に影響を及ぼさないことを示す、COX−2 mRNA発現の倍数変化の棒グラフである。未処理HeLa細胞(対照)のqRT−PCRによるCOX−2 mRNA発現解析は、10μMの化合物1、20ng/mlのTNFα、または10μMの化合物1+20ng/mlのTNFαで処理されたHeLa細胞と比較された。13B。化合物1が、TNFα−誘導性COX−2タンパク質発現を阻害することを示す、COX−2タンパク質発現強度のグラフである。 多様な炎症関連CRM1カーゴタンパク質の局在化を示す、DMSO、20ng/mLのTNFα、または化合物1+20ng/mLのTNFαで処理された細胞の画像である。 IκB、NFκB、NRF2、PPARγ、およびRXRαの局在化を示す、DMSO、20ng/mLのTNFα、または化合物1+20ng/mLのTNFαで処理された細胞の画像である。 MWM試験の習得段階中のプラットフォームに到達するまでのマウスの遅延時間に対する、偽処置、対照処置、プロゲステロン処置、および様々な用量の化合物1の効果を示す、MWM試験における、時間の関数としてのプラットフォームに到達するまでの遅延時間のグラフである(データは、平均値±SEMを表す)。 ラット血漿中のいくつかのサイトカインの濃度を示す、サイトカイン濃度のグラフである。 ビブラトーム切出し前の脳全体の定性的外観検査結果を示す、偽処置(Sham)、CCI+ビヒクル(対照)、またはCCI+化合物1(6mg/kg)を投与された動物の脳全体の写真である。検査は、いずれのSham動物も(4匹中0匹)、背側−内側皮質組織の損傷を示さなかったことを示唆した。全く対照的に、4匹のCCI対照は全て、皮質のこの領域に限定される、重度の両側性傷害を示した。化合物1を投与されたCCI動物は、中等度から最小にわたる損傷を示した。特に、化合物1群中で最も重度の傷害を示す脳でも、CCI対照群の全ての脳に比べて、それほど極端でなかった。 偽処置(Sham)、CCI+ビヒクル処置(対照)、およびCCI+化合物1処置(KPT)動物における、背側皮質領域および腹側皮質領域のNeuN標識の低倍率顕微鏡写真である。 偽処置(Sham)、CCI+ビヒクル処置(対照)、およびCCI+化合物1処置(KPT)動物における、ラットIgGおよびTNFαの免疫蛍光標識顕微鏡写真である。 未感作メスLewisラット、対照関節炎メスLewisラット、または化合物2で処置された関節炎メスLewisラットの臨関節炎スコアを示す、時間の関数としての臨床スコアのグラフである。 未感作メスLewisラット、対照関節炎メスLewisラット、または化合物2で処置された関節炎メスLewisラットにおける、0〜4の尺度で評価された関節腫脹を示す、時間の関数としての関節腫脹のグラフである。 未感作メスLewisラット、対照関節炎メスLewisラット、または化合物2で処置された関節炎メスLewisラットにおける、足根骨の骨塩密度(BMD)のグラフである。 未感作メスLewisラット、対照関節炎メスLewisラット、または化合物2で処置された関節炎メスLewisラットの後足の三次元マイクロCT画像診断による視覚化である。 17C。CIA試験No.2の21日目および27日目における、A群(未感作)、B群(モデル)、およびC群(毎日5mg/kgの化合物2)ラットから採取された滑液中のIL−1β濃度を示す、時間の関数として滑液中IL−1β濃度のグラフである。17D。CIA試験No.2の21日目および27日目における、A群(未感作)、B群(モデル)、およびC群(毎日5mg/kgの化合物2)ラットから採取された滑液中のIL−6濃度を示す、時間の関数としての滑液中IL−6濃度のグラフである。17E。CIA試験No.2の21日目および27日目における、A群(未感作)、B群(モデル)、およびC群(毎日5mg/kgの化合物2)ラットから採取された滑液中のMCP−1濃度を示す、時間の関数としての滑液中MCP−1濃度のグラフである。17F。CIA試験No.2の21日目および27日目における、A群(未感作)、B群(モデル)、およびC群(毎日5mg/kgの化合物2)ラットから採取された滑液中のCRP濃度を示す、時間の関数としての滑液中CRP濃度のグラフである。 CIA試験No.2の15日目および27日目における、A群(未感作)、B群(モデル)、およびC群(毎日5mg/kgの化合物2)ラットから採取されたラット血清サンプル中のIL−1β濃度を示す、時間の関数としての血清中IL−1β濃度のグラフである。 本明細書に記載されるメスマウスにおける、MOG誘発性EAEマウスモデルの概略図である。 本明細書に記載されるMOG誘発性EAEマウスモデルにおける、メスマウスの臨床スコアに対する、ビヒクル処置、デキサメタゾン処置、および化合物1処置の効果を示す、試験日の関数としての臨床スコアのグラフである。 創傷形成5日後に実施された創傷形態学評価結果を示す、化合物1またはその適切なビヒクルによって局所的または全身的に処置された創傷の写真である。
発明の化合物
第1の実施形態は、式I:
の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を提供し、
式中、
は、水素およびC〜Cアルキルから選択され;
は、OおよびSから選択され;
は、−N(R)−(C〜Cシクロアルキル)、−C〜Cアルキル、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリル、および−(C〜Cアルキレン)−ヘテロアリールから選択され、(式中、Rのあらゆるアルキル、アルキレン、ヘテロシクリル、またはヘテロアリール部分は、任意選択的に独立して置換される);
は、水素およびC〜Cアルキルから選択される。
第1の実施形態の第1の態様では、Rは水素およびメチルから選択される。残りの変数の値は、第1の実施形態に記載される。
第1の実施形態の第2の態様では、Rは水素である。残りの変数の値は、第1の実施形態に記載される。
第1の実施形態の第3の態様では、RはOである。残りの変数の値は、第1の実施形態、またはその第1または第2の態様に記載される。
第1の実施形態の第4の態様では、RはSである。残りの変数の値は、第1の実施形態、またはその第1〜第3の態様に記載される。
第1の実施形態の第5の態様では、Rは水素である。
第1の実施形態の第6の態様では、Rは、−N(R)−(C〜Cシクロアルキル)、−C〜Cアルキル、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリル、および−(C〜Cアルキレン)−ヘテロアリールから選択され、Rのあらゆるアルキルまたはアルキレン部分は、任意選択的に−N(R(式中、各Rは、水素およびC〜Cアルキルから独立して選択される)で置換され、;Rのあらゆるヘテロシクリル、およびヘテロアリール部分は、環内に少なくとも1つの窒素原子を含んでなり;Rのあらゆるヘテロシクリル、およびヘテロアリール部分は、任意選択的にC〜Cアルキルで置換される。残りの変数の値は、第1の実施形態、またはその第1〜第5の態様に記載される。
第1の実施形態の第7の態様では、Rは、−C(CH、−CH(NH)−CH(CH、−NH−シクロプロピル、−(CH0〜1−ピラジニル、ピペリジニル、ヒドロキシピペリジニル、N−メチルピペリジニル、−CH−モルホリン−4−イル、およびメチルピラゾリルから選択される。残りの変数の値は、第1の実施形態、またはその第1〜第5の態様に記載される。
第1の実施形態の第8の態様では、Rは、−C(CH、−CH(NH)−CH(CH、−NH−シクロプロピル、−(CH0〜1−ピラジン−2−イル、ピペリジン−3−イル、−CH−モルホリン−4−イル、および5−メチル−1−H−ピラゾール−4−イルから選択される。残りの変数の値は、第1の実施形態、またはその第1〜第5の態様に記載される。
第1の実施形態の第9の態様では、Rは、−C(CH、−NH−シクロプロピル、−CH−ピラジン−2−イル、−ピラジン−2−イル、−CH−モルホリン−4−イル、および5−メチル−1−H−ピラゾール−4−イルから選択される。残りの変数の値は、第1の実施形態、またはその第1〜第5の態様に記載される。
第2の実施形態は、式の化合物(I)、またはその薬学的に許容可能な塩であり、式中、
は、−N(R)−(C〜Cシクロアルキル)、−C〜Cアルキル、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリル、および−(C〜Cアルキレン)−ヘテロアリールから選択され、
式中、
のあらゆるアルキルまたはアルキレン部分は、任意選択的に、−N(R(式中、各Rは、水素およびC〜Cアルキルから独立して選択される)で置換され、;
のあらゆるヘテロシクリル、およびヘテロアリール部分は、環内に少なくとも1つの窒素原子を含んでなり;
のあらゆるヘテロシクリル、およびヘテロアリール部分は、任意選択的に、C〜Cアルキルで置換される。
第2の実施形態の第1の態様では、Rは、−C(CH、−CH(NH)−CH(CH、−NH−シクロプロピル、−(CH0〜1−ピラジニル、ピペリジニル、ヒドロキシピペリジニル、N−メチルピペリジニル、−CH−モルホリン−4−イル、およびメチルピラゾリルから選択される。
第2の実施形態の第2の態様では、Rは、−C(CH、−CH(NH)−CH(CH、−NH−シクロプロピル、−(CH0〜1−ピラジン−2−イル、ピペリジン−3−イル、−CH−モルホリン−4−イル、および5−メチル−1−H−ピラゾール−4−イルから選択される。
第2の実施形態の第3の態様では、Rは、−C(CH、−NH−シクロプロピル、−CH−ピラジン−2−イル、−ピラジン−2−イル、−CH−モルホリン−4−イル、および5−メチル−1−H−ピラゾール−4−イルから選択される。
第3の実施形態は、式Iの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を提供し、
式中、
は、−N(R)−(C〜Cシクロアルキル)、−C〜Cアルキル、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリル、および−(C〜Cアルキレン)−ヘテロアリールから選択され、式中、
あらゆるRのあらゆるアルキルまたはアルキレン部分は、任意選択的に、独立して、オキソおよび−N(Rからなる群から選択される、1つまたは複数の置換基で置換され、式中、各Rは水素およびC〜Cアルキルから独立して選択され;
のあらゆるヘテロシクリル部分は、環内に少なくとも1つの窒素原子を含んでなり、任意選択的に、C〜Cアルキルおよびオキソからなる群から選択される1つまたは複数の置換基で置換され;
のあらゆるヘテロアリール部分は、環内に少なくとも1つの窒素原子を含んでなり、任意選択的に、1つまたは複数のC〜Cアルキルで置換される。残りの変数の値は、第1の実施形態、またはその第1〜第5の態様に記載される。
第3の実施形態の第1の態様では、Rは、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリルである。残りの変数の値は、第1の実施形態、またはその第1〜第5の態様に記載される。
第3の実施形態の第2の態様では、Rは、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリルであり、式中、ヘテロシクリルは、ピラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、およびピラゾリルから選択される。残りの変数の値は、第1の実施形態、またはその第1〜第5の態様に記載される。
第3の実施形態の第3の態様では、Rは、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリルであり、ヘテロシクリルは、モルホリニルである。残りの変数の値は、第1の実施形態、またはその第1〜第5の態様に記載される。
第3の実施形態の第4の態様では、Rは、−(Cアルキレン)−ヘテロシクリルである。残りの変数の値は、第1の実施形態、またはその第1〜第5の態様に記載される。
第3の実施形態の第5の態様では、Rは、−(Cアルキレン)−モルホリニルである。残りの変数の値は、第1の実施形態、またはその第1〜第5の態様に記載される。
式Iの例示的な化合物は、表1に記載される。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、化合物1〜11のいずれか1つから選択される。これらの実施形態の一態様では、化合物は、化合物1、2、3、4、8、および11のいずれか1つから選択される。
薬物動態(PK)は、創薬研究開発においてますます重要な役割を果たしている。薬物動態は、薬物の吸収、分布、代謝および/または排出の経時変化の定量的研究である。薬物が投与されると、それは投与部位から、全身の血液循環へ急速に分布する。治療薬の分布程度の1つの基準は、最終測定濃度(AUC)まで計算されて、無限時間(AUCInf)に外挿される、血漿濃度−時間曲線下面積(AUC)である。したがってAUCは、薬剤曝露を定量化するのに頻繁に使用される。
一般に、治療薬曝露が高いほど、作用物質の効果は大きい。しかし高い治療薬曝露は、脳などの特定組織に有害な影響を及ぼすこともある。内皮細胞間の密着結合からなる保護ネットワークである血液脳関門(BBB)が、親水性および/または大型分子の拡散を制限する一方で、AUCの高い薬剤は、なおもBBBおよび/または脳脊髄液に透過できる。このような透過は、往々にして望ましくなく、望まれない副作用をもたらし得る。現行の創薬努力は、一つには、薬物曝露(すなわちAUC)の最大化と、脳透過性の最小化を上手く両立させることを目指している。
脳対血漿(B:P)比は、循環している脳組織内の治療薬の相対的分布を定量する、このような1つの(once)方法である。このような比率は、所与の治療薬の脳透過性の1つの指標を提供する。脳および脳脊髄液をはじめとする中枢神経系(CNS)に局在する疾患を標的とする場合は、高い脳:血漿比が好ましい。しかし脳透過性を最小化して可能な副作用を回避するために、非CNS治療薬では、より低い脳対血漿比が一般に好ましい。したがって脳およびCNS組織内における望まれない治療薬の蓄積を回避するために、低い脳対血漿比が好ましい。
実施例セクションでより詳細に記載されるように、本発明の化合物は、2011年3月5日に出願されて、2011年11月10日に米国特許出願公開第2009/0275607号明細書として公開された、所有者共通の米国特許出願第13/041,377号明細書で開示されるものなどの、その他の核輸送阻害剤と比較して、より高いAUCおよび/またはより低いB:Pを示す。いくつかの実施形態では、本発明は、式Iの化合物を提供し、化合物は、10mg/kgでマウスに経口投与されると、<1μM(1μM未満)の核外搬出活性、約3500を超えるAUCInf;および約2.5未満のB:Pを有する。
本発明の新規特性は、以下の発明の詳細な説明を分析すれば、当業者には明白になるであろう。しかし発明の詳細な説明とそれに続く特許請求の範囲から、本発明の精神と範囲内の様々な変更と修正は当業者には明白になるので、報告される発明の詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の実施形態を示す一方で、例証のみを目的として提供されるものと理解すべきである。
化合物および定義
本発明の化合物は、上で概説され、本明細書で開示されるクラス、サブクラス、およびクラスによってさらに例証されるものを含む。本明細書の用法では、特に断りのない限り、以下の定義が適用されるものとする。本発明の目的では、化学元素はPeriodic Table of the Elements,CAS version,Handbook of Chemistry and Physics,第75版に従って同定される。さらに有機化学の一般的原理は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、“Organic Chemistry”,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999、および“March’s Advanced Organic Chemistry”,第5版,Ed.:Smith,M.B.and March,J.,John Wiley & Sons,New York:2001に記載される。
本明細書で特に断りのない限り、本明細書で使用される命名法は、その例示的な化学構造名および化学構造命名法について、参照によって本明細書に援用する、Nomenclature of Organic Chemistry,Sections A,B,C,D,E,F,and H,Pergamon Press,Oxford,1979に述べられる例と規則に一般に従う。任意選択的に、化合物名は、化学物質命名プログラムACD/ChemSketch,バージョン5.09/September 2001,Advanced Chemistry Development,Inc.,Toronto,Canadaを使用して、生成してもよい。
本発明の化合物は、(例えばE.L.Eliel and S.H.Wilen,Stereo−chemistry of Carbon Compounds,John Wiley & Sons,New York,1994,pages 1119−1190に記載されるように)不斉中心、キラル軸、およびキラル面を有して、ラセミ体、ラセミ混合物として、および個々のジアステレオマーまたは鏡像異性体として存在してもよく、光学異性体をはじめとする全ての可能な異性体およびそれらの混合物は、本発明に包含される。
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、明細書の用法では、ハロゲンを意味し、例えば非限定的に、放射性および非放射性形態の双方のフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードなどが挙げられる。
「アルキル」という用語は、本明細書の用法では、特に断りのない限り、典型的にC〜C12、好ましくはC〜Cである、直鎖または分枝飽和一価炭化水素遊離基を意味する。したがって「C〜Cアルキル」は、1〜6個(例えば1、2、3、4、5または6個)の炭素原子を有する、直鎖または分枝飽和一価炭化水素遊離基を意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、およびt−ブチルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の化合物上の置換基および置換パターンは、化学的に安定しており、当該技術分野で公知の技術、ならびに下記の方法によって容易に合成され得る化合物を与えるように、当業者によって選択され得るものと理解される。一般に「置換される」という用語は、「任意選択的に」という用語がそれに先行するかどうかに関わりなく、指定された部分の1つまたは複数の水素が、適切な置換基で置換されることを意味する。特に断りのない限り、「任意選択的に置換される基」は、基の置換可能な各位置で適切な置換基を有し得て、あらゆる所与の構造内の2つ以上の位置が、特定の群から選択される2つ以上の置換基で置換されてもよい場合、置換基は各位置で同一であるか、または異なり得る。代案としては、「任意選択的に置換される基」は非置換であり得る。
本発明によって想定される置換基の組み合わせは、安定したまたは化学的に実現可能な化合物の形成をもたらすものであることが好ましい。置換基それ自体が、2つ以上の基によって置換される場合、安定した構造が得られさえすれば、これらの複数の基は、同一炭素原子または異なる炭素原子上にあり得るものと理解される。「安定した」という用語は、本明細書の用法では、それらの生成、検出、および特定の実施形態では、それらの回収、精製、および本明細書で開示される目的の1つまたは複数のための使用を可能にする条件に置かれた際に、実質的に変性しない化合物を指す。
「任意選択的に置換される基」の置換可能な炭素原子上の適切な一価の置換基は、独立して、ハロゲン;−(CH0〜4R°;−(CH0〜4OR°;−O(CH0〜4R°、−O−(CH0〜4C(O)OR°;−(CH0〜4CH(OR°);−(CH0〜4SR°;R°で置換されてもよい−(CH0〜4Ph;R°で置換されてもよい−(CH0〜4O(CH0〜1Ph;R°で置換されてもよい−CH=CHPh;R°で置換されてもよい−(CH0〜4O(CH0〜1−ピリジル;−NO;−CN;−N;−(CH0〜4N(R°);−(CH0〜4N(R°)C(O)R°;−N(R°)C(S)R°;−(CH0〜4N(R°)C(O)NR°;−N(R°)C(S)NR°;−(CH0〜4N(R°)C(O)OR°;−N(R°)N(R°)C(O)R°;−N(R°)N(R°)C(O)NR°;−N(R°)N(R°)C(O)OR°;−(CH0〜4C(O)R°;−C(S)R°;−(CH0〜4C(O)OR°;−(CH0〜4C(O)SR°;−(CH0〜4C(O)OSiR°;−(CH0〜4OC(O)R°;−OC(O)(CH0〜4SR−,SC(S)SR°;−(CH0〜4SC(O)R°;−(CH0〜4C(O)NR°;−C(S)NR°;−C(S)SR°;−SC(S)SR°、−(CH0〜4OC(O)NR°;−C(O)N(OR°)R°;−C(O)C(O)R°;−C(O)CHC(O)R°;−C(NOR°)R°;−(CH0〜4SSR°;−(CH0〜4S(O)R°;−(CH0〜4S(O)OR°;−(CH0〜4OS(O)R°;−S(O)NR°;−(CH0〜4S(O)R°;−N(R°)S(O)NR°;−N(R°)S(O)R°;−N(OR°)R°;−C(NH)NR°;−P(O)R°;−P(O)R°;−OP(O)R°;−OP(O)(OR°);SiR°;−(C1〜4直鎖または分枝アルキレン)O−N(R°);または−(C1〜4直鎖または分枝アルキレン)C(O)O−N(R°)であり、式中、各R°は、以下に定義するように置換されてもよく、独立して、水素、C1〜6脂肪族、−CHPh、−O(CH0〜1Ph、−CH−(5〜6員ヘテロアリール環)、または窒素、酸素、およびイオウから独立して選択される0〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員の飽和、部分不飽和、またはアリール環であり、または上の定義に妨げられることなく、2つの独立したR°の存在は、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、およびイオウから独立して選択される0〜4個のヘテロ原子を有する3〜12員の飽和、部分不飽和、またはアリール単環または二環を形成し、それは以下に定義するように置換されてもよい。
R°(またはそれらの介在原子と共に2つの独立したR°の存在を一緒することで形成される環)上の適切な一価の置換基は、独立して、ハロゲン、−(CH0〜2、−(haloR)、−(CH0〜2OH、−(CH0〜2OR、−(CH0〜2CH(OR;−O(ハロR)、−CN、−N、−(CH0〜2C(O)R、−(CH0〜2C(O)OH、−(CH0〜2C(O)OR、−(CH0〜2SR、−(CH0〜2SH、−(CH0〜2NH、−(CH0〜2NHR、−(CH0〜2NR 、−NO、−SiR 、−OSiR 、−C(O)SR、−(C1〜4直鎖または分枝アルキレン)C(O)OR、または−SSRであり、式中、各Rは非置換であり、または「ハロ」が先行する場合は1つまたは複数のハロゲンのみで置換され、C1〜4脂肪族、−CHPh、−O(CH0〜1Ph、または窒素、酸素、およびイオウから独立して選択される0〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員の飽和、部分不飽和、またはアリール環から独立して選択される。R°の飽和炭素原子上の適切な二価の置換基としては、=Oおよび=Sが挙げられる。
「任意選択的に置換される基」の飽和炭素原子上の適切な二価の置換基としては、=O、=S、=NNR 、=NNHC(O)R、=NNHC(O)OR、=NNHS(O)、=NR、=NOR、−O(C(R ))2〜3O−、および−S(C(R ))2〜3S−が挙げられ、式中、各独立したRの存在は、水素、以下に定義するように置換されてもよいC1〜6脂肪族、または窒素、酸素、およびイオウから独立して選択される0〜4個のヘテロ原子を有する非置換の5〜6員の飽和、部分不飽和またはアリール環から選択される。「任意選択的に置換される」基の隣接する置換可能な炭素に結合する適切な二価の置換基としては、−O(CR 2〜3O−が挙げられ、式中、各独立したRの存在は、水素、以下に定義するように置換されてもよいC1〜6脂肪族、または窒素、酸素、およびイオウから独立して選択される0〜4個のヘテロ原子を有する非置換の5〜6員の飽和、部分不飽和またはアリール環から選択される。
の脂肪族基上の適切な置換基としては、ハロゲン、−R、−(haloR)、−OH、−OR、−O(haloR)、−CN、−C(O)OH、−C(O)OR、−NH、−NHR、−NR 、および−NOが挙げられ、式中、各Rは、非置換であり、または「ハロ」が先行する場合は、1つまたは複数のハロゲンのみで置換されて、独立して、C1〜4脂肪族、−CHPh、−O(CH0〜1Ph、または窒素、酸素、およびイオウから独立して選択される0〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員の飽和、部分不飽和、またはアリール環である。
「任意選択的に置換される基」の置換可能な窒素上の適切な置換基としては、−R、−NR 、−C(O)R、−C(O)OR、−C(O)C(O)R、−C(O)CHC(O)R、−S(O)、−S(O)NR 、−C(S)NR 、−C(NH)NR 、および−N(R)S(O)が挙げられ、;式中、各Rは、独立して、水素、以下に定義するように置換されてもよいC1〜6脂肪族、非置換−OPh、または窒素、酸素、およびイオウから独立して選択される0〜4個のヘテロ原子を有する非置換の5〜6員の飽和、部分不飽和またはアリール環から選択され、または上の定義に妨げられることなく、2つの独立したRの存在は、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、およびイオウから独立して選択される0〜4個のヘテロ原子を有する非置換の3〜12員の飽和、部分不飽和、またはアリール単環または二環を形成する。
の脂肪族基上の適切な置換基は、独立して、ハロゲン、−R、−(haloR)、−OH、−OR、−O(haloR)、−CN、−C(O)OH、−C(O)OR、−NH、−NHR、−NR 、または−NOであり、式中、各Rは、非置換であり、または「ハロ」が先行する場合は、1つまたは複数のハロゲンのみで置換されて、独立して、C1〜4脂肪族、−CHPh、−O(CH0〜1Ph、または窒素、酸素、およびイオウから独立して選択される0〜4個のヘテロ原子を有する5〜6員の飽和、部分不飽和、またはアリール環である。
ヘテロアリール上の好ましい置換基は、−OH、−SH、ニトロ、ハロゲン、アミノ、シアノ、C〜C12アルキル、C〜C12アルケニル、C〜C12アルキニル、C〜C12アルコキシ、C〜C12ハロアルキル、C〜C12ハロアルコキシ、およびC〜C12アルキルスルファニルからなる群から選択され得る。アルキル、アルキレン、およびヘテロシクリル上の好ましい置換基としては、ヘテロアリールおよびオキソ上の好ましい置換基が挙げられる。一実施形態では、アルキル、アルキレン、ヘテロシクリルまたはヘテロアリール上の置換基は、式−N(Rを有するアミノ基であり、各Rは、水素およびC〜Cアルキルから独立して選択される。
アルキル、アルキレン(aklylene)、ヘテロシクリル、およびヘテロアリール上の置換基は、−OH、−SH、ニトロ、ハロゲン、アミノ、シアノ、C〜C12アルキル、C〜C12アルケニル、C〜C12アルキニル基、C〜C12アルコキシ、C〜C12ハロアルキル、C〜C12ハロアルコキシ、およびC〜C12アルキルスルファニルから選択され得る。一実施形態では、置換基は、式、−N(Rを有するアミノ基であり、式中、各Rは、水素およびC〜Cアルキルから独立して選択される。
「シクロアルキル」という用語は、本明細書の用法では、飽和環状炭化水素、すなわち全ての環原子が炭素である化合物を意味する。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチルが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、シクロアルキルは、任意選択的に、−OH、−SH、ハロゲン、アミノ、ニトロ、シアノ、C〜C12アルキル、C〜C12アルケニルまたはC〜C12アルキニル基、C〜C12アルコキシ、C〜C12ハロアルキル、およびC〜C12ハロアルコキシから選択される、1つまたは複数の置換基で置換され得る。
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書の用法では、1つまたは複数のヘテロ原子(O、S、またはN)を含有する芳香族基を指す。ヘテロアリール基は、例えば1つまたは複数の炭素環芳香族基またはその他の単環ヘテロアリール基に融合した単環ヘテロアリール環などの単環または多環であり得る。本発明のヘテロアリール基はまた、1つまたは複数のオキソ部分で置換される環系も含み得る。ヘテロアリール基の例としては、ピリジニル、ピリダジニル、イミダゾリル、ピリミジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、ピラジニル、キノリル、イソキノリル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、ピロリル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、シンノリニル、インダゾリル、インドリジニル、フタラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、イソインドリル、プリニル、オキサジアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、フラザニル、ベンゾフラザニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、ジヒドロキノリル、テトラヒドロキノリル、ジヒドロイソキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ベンゾフリル、フロピリジニル、ピロロピリミジニル、およびアザインドリルが挙げられるが、これに限定されるものではない。
前述のヘテロアリール基は、(可能な場合)C付着性またはN付着性であってもよい。例えばピロールから誘導される基は、ピロール−1−イル(N付着性)またはピロール−3−イル(C付着性)であってもよい。
「ヘテロシクリル」は、N、OまたはSから独立して選択される、1、2、3、4または5個のヘテロ原子を含有する、4〜13員の飽和または不飽和脂肪族環を意味する。1つのヘテロ原子がSである場合、それは任意選択的に、一または二酸素化され得る(すなわち−S(O)−または−S(O)−)。ヘテロシクリルは、単環、融合二環、架橋二環、スピロ二環または多環であり得る。
「オキソ」は、=Oを意味する。
本明細書の用法では、「アルケニル」という用語は、2〜12個の炭素原子を有して、少なくとも1つの炭素−炭素二重結合を有する、飽和直鎖または分枝非環状炭化水素を意味する。アルケニル基は、任意選択的に、1つまたは複数の置換基で置換されてもよい。
本明細書の用法では、「アルキニル」という用語は、2〜12個の炭素原子を有して、少なくとも1つの炭素−炭素三重結合を有する、飽和直鎖または分枝非環状炭化水素を意味する。アルキニル基は、任意選択的に、1つまたは複数の置換基で置換されてもよい。
本明細書の用法では、「アルキレン」という用語は、化合物の残部に対して2つの付着点を有するアルキル基を指す。アルキレン基の非限定的例としては、メチレン(−CH2−)、エチレン(−CH2CH2−)、n−プロピレン(−CH2CH2CH2−)、イソプロピレン(−CH2CH(CH3)−)などが挙げられる。アルキレン基は、任意選択的に、1つまたは複数の置換基で置換されてもよい。
「ハロアルキル」という用語は、本明細書の用法では、1つまたは複数のF、Cl、Br、またはIで置換されるアルキルを含み、アルキルは上で定義される。
「アルコキシ」という用語は、本明細書の用法では、「アルキル−O−」基を意味し、アルキルは上で定義される。アルコキシ基の例としては、メトキシまたはエトキシ基が挙げられる。
本明細書の用法では、「薬学的に許容可能な塩」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー性応答などなしで、ヒトおよび下等動物組織と接触させる使用に適し、利点/リスクの比率が妥当に釣り合った塩を指す。薬学的に許容可能な塩は、当該技術分野で周知である。例えばS.M.Berge et al.は、J.Pharmaceutical Sciences,1977,66,1−19で、薬学的に許容可能な塩について詳細に記載する。本発明の化合物の薬学的に許容可能な塩としては、適切な無機および有機酸および塩基から誘導される塩が挙げられる。薬学的に許容可能な無毒の酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などの無機酸によって、または酢酸、トリフルオロ酢酸(2,2,2−トリフルオロ酢酸)、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸またはマロン酸などの有機酸によって、またはイオン交換などの当該技術分野で使用されるその他の方法を使用して、形成されるアミノ基の塩である。その他の薬学的に許容可能な塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、硫酸ラウリル塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸(2,2,2−トリフルオロ酢酸)、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。
適切な塩基から誘導される塩としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、およびN(C1〜4アルキル)塩が挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。薬学的に許容可能なさらなる塩としては、適切な場合、無毒のアンモニウムと、四級アンモニウムと、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸、硝酸塩、低級アルキルスルホネート、およびアリールスルホネートなどの対イオンを使用して形成されるアミンカチオンとが挙げられる。
特に断りのない限り、本明細書で描写される構造は、例えば各不斉中心のRおよびS立体配置、ZおよびE二重結合異性体、そしてZおよびE立体構造異性体などの構造の全ての異性体(例えば鏡像異性、ジアステレオマー、および幾何学的(または立体構造的))形態もまた含むことが意図される。したがって本化合物の単一立体化学異性体、ならびに鏡像異性、ジアステレオマー、および幾何学的(または立体構造)混合物は、本発明の範囲内である。特に断りのない限り、本発明の化合物の全ての互変異性形態は、本発明の範囲内である。それに加えて特に断りのない限り、本明細書で描写される構造は、1つまたは複数の同位体濃縮原子の存在のみが異なる、化合物を含むことが意図される。例えば、重水素またはトリチウムによる水素の置換、または13C富化または14C富化炭素による炭素の置換を含む本構造を有する化合物は、本発明の範囲内である。このような化合物は、例えば、分析ツールとして、生物学的アッセイのプローブとして、または本発明に従った治療薬として、有用である。
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、患者の治療に適合する酸付加塩または塩基付加塩のいずれかを意味する。
いくつかの実施形態では、適切な塩を形成する例示的な無機酸としては、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、およびリン酸と、オルトリン酸一水素ナトリウム、および硫酸水素カリウムなどの酸金属塩とが挙げられるがこれに限定されるものではない。適切な塩を形成する例証的な有機酸としては、モノ−、ジ−、およびトリカルボン酸が挙げられる。このような酸の例は、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸(2,2,2−トリフルオロ酢酸)、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸、2−フェノキシ安息香酸、p−トルエンスルホン酸とメタンスルホン酸や2−ヒドロキシエタンスルホン酸などのその他のスルホン酸である。一酸塩または二酸塩のいずれかが形成され得て、このよう塩は、水和、溶媒和または実質的に無水の形態のいずれかで存在し得る。一般に、これらの化合物の酸付加塩は、それらの遊離塩基形態と比較して、水や種々の親水性有機溶媒中でのより溶解性であり、一般により高い融点を示す。実験室での使用のために、または引き続く薬学的に許容可能な酸付加塩への変換のために、例えば式Iの化合物の単離において、例えばシュウ酸塩などのその他の薬学的に許容可能でない塩を使用してもよい。
「薬学的に許容可能な塩基性付加塩」は、式Iによって表される酸化合物のあらゆる無毒の有機または無機塩基付加塩、またはその中間体のいずれかである。適切な塩を形成する例証的な無機塩基としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムまたはバリウムの水酸化物が挙げられるが、これに限定されるものではない。適切な塩を形成する例証的な有機塩基としては、メチルアミン、トリメチルアミン、およびピコリンなどの脂肪族、脂環式または芳香族有機アミン、またはアンモニアが挙げられる。分子中の他の箇所にエステル官能基がもしあれば、加水分解されないように、適切な塩の選択が重要なこともある。適切な塩の選択基準は、当業者に知られている。
式Iの化合物の酸付加塩は、最も適切には、薬学的に許容可能な酸から生成され、例えば塩化水素、硫酸またはリン酸などの無機酸、そして例えばコハク酸、マレイン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸またはフマル酸などの有機酸によって形成されるものが挙げられる。実験室での使用のために、または引き続く薬学的に許容可能な酸付加塩への変換のために、例えば式Iの化合物の単離において、例えばシュウ酸塩などのその他の薬学的に許容可能でない塩を使用してもよい。本発明の化合物の塩基付加塩(ナトリウム、カリウム、およびアンモニウム塩などの)、溶媒和化合物、および水和物もまた、本発明の範囲内に含まれる。所与の化合物塩を所望の化合物塩に変換することは、当業者に良く知られている標準的な技術を適用して、達成される。
「立体異性体」という用語は、空間内のそれらの原子の配向のみが異なる、個々の分子の全ての異性体を指す一般用語である。これには、鏡像異性体(鏡像異性体)、幾何学的(シス/トランス)異性体、および互いに鏡像(ジアステレオマー)でない2つ以上のキラル中心がある化合物の異性体が含まれる。
「治療する」または「治療」という用語は、一時的または恒久的ベースのいずれかで、症状を緩和し、症状の原因を排除すること、前記の障害または病状のまたは症状出現を予防し、または遅延させることを意味する。
「治療有効量」という用語は、疾患または病状の1つまたは複数の症状を治療し、または重症度を低下させるのに効果的な化合物の量を意味する。
本明細書で開示される要素に言及する場合、冠詞「a」、「an」、「the」、および「前記(said)」は、1つまたは複数の要素があることを意味することが意図される。「含んでなる」、「有する」、「はじめとする」という用語には、制約がないことが意図され、列挙する要素の他に追加的な要素があってもよいことを意味する。
使用、配合、および投与
薬学的に許容可能な組成物
別の実施形態によると、本発明は、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な誘導体と、薬学的に許容できる担体、アジュバント、またはビヒクルとを含んでなる組成物を提供する。本発明の組成物中の化合物の量は、生物学的サンプル中または患者において、CRM1を測定可能な程度に阻害するのに効果的な量である。特定の実施形態では、本発明の組成物は、このような組成物を必要とする患者への投与のために調合される。「患者」という用語は、本明細書の用法では動物を意味する。いくつかの実施形態では、動物は哺乳類である。特定の実施形態では、患者は獣医学の患者(すなわち非ヒト哺乳類患者)である。いくつかの実施形態では、患者はイヌである。別の実施形態では、患者はヒトである。
「薬学的に許容できる担体、アジュバント、またはビヒクル」という用語は、それが一緒に調合される化合物の薬理学的活性を破壊しない、無毒の担体、アジュバント、またはビヒクルを指す。本発明の組成物中で使用されてもよい薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたはビヒクルとしては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミンやリン酸水素二ナトリウムやリン酸水素カリウムや塩化ナトリウムや亜鉛塩などの塩または電解質、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の組成物は、吸入噴霧、局所、直腸内、鼻腔内、口腔内、膣内、または埋め込み式リザバーを通じて、経口投与、非経口投与(皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む)されてもよい。いくつかの実施形態では、提供される化合物または組成物は、静脈内および/または腹腔内投与可能である。
「非経口」という用語は、本明細書の用法では、皮下、静脈内、筋肉内、眼内、硝子体内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、クモ膜下腔内、肝臓内、腹腔内病巣内、および頭蓋内注射または点滴技法を含む。好ましくは、組成物は、経口、皮下、腹腔内または静脈内投与される。本発明の組成物の無菌注射用形態は、水性または油性懸濁液であってもよい。これらの懸濁液は、適切な分散または湿潤剤と、懸濁剤とを使用して、当該技術分野で公知の技術によって調合されてもよい。無菌注射用製剤はまた、例えば1,3−ブタンジオール溶液などの無毒の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。用いてもよい許容可能なビヒクルおよび溶剤は、特に水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液である。これに加えて、無菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒として従来法で用いられる。
本発明の薬学的に許容可能な組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液、または溶液をはじめとするが、これに限定されるものではない、あらゆる経口的に許容可能な剤形で、経口的に投与してもよい。経口使用される錠剤の場合、通常、使用される担体としては、乳糖およびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの平滑剤もまた、典型的に添加される。カプセル形態での経口投与のための有用な希釈剤としては、乳糖および乾燥コーンスターチが挙げられる。経口使用のために水性懸濁液が必要な場合、活性成分は、乳化および懸濁剤と組み合わされる。所望ならば、特定の甘味剤、着香料または着色剤もまた、添加してもよい。いくつかの実施形態では、提供される経口製剤は、即時放出または持続/遅延放出のために調合される。いくつかの実施形態では、組成物は、錠剤、ロゼンジ、および香錠をはじめとする、バッカルまたは舌下投与に適する。提供される化合物はまた、マイクロカプセル化形態であり得る。
代案としては、本発明の薬学的に許容可能な組成物は、直腸投与のための坐薬の形態で投与してもよい。本発明の薬学的に許容可能な組成物はまた、特に治療の標的が、眼、皮膚、または下部腸管の疾患をはじめとする、局所塗布によって容易にアクセスできる領域または臓器を含む場合に、局所的に投与してもよい。適切な局所製剤は、これらの各領域または臓器のために、容易に調製される。
下部腸管のための局所施用は、直腸坐薬製剤(上記を参照されたい)で、または適切な浣腸製剤でもたらし得る。局所的経皮パッチもまた、使用してもよい。
眼科用途では、提供される薬学的に許容可能な組成物は、微粉化懸濁液として、またはペトロラタムなどの軟膏中で、調合してもよい。
本発明の薬学的に許容可能な組成物はまた、経鼻煙霧剤または吸入によって投与してもよい。
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的に許容可能な組成物は、腹腔内投与のために調合される。
単回投与形態の組成物を製造するために、担体材料と組み合わせてもよい本発明の化合物の量は、治療される宿主、特定の投与様式に応じて変動する。一実施形態では、提供される組成物は、これらの組成物を与えられる患者に、0.01〜100mg/kg体重/日の用量の阻害剤が投与され得るように調合すべきである。別の実施形態では、投与量は、約0.5〜約100mg/kg体重、または4〜120時間毎に1mg〜1000mg/投与であり、または特定の薬剤の要件に従う。典型的に本発明の医薬組成物は、1日あたり約1〜約6回投与される。
任意の特定患者のための特定の用量および治療計画が、用いられる特定化合物の活性、年齢、体重、総体的な健康、性別、食餌、投与時間、排出速度、薬剤併用、主治医の判断、および治療される特定疾患の重症度をはじめとする多様な要素に左右されることもまた理解される。組成物中の本発明の化合物の量はまた、組成物中の特定化合物にも左右される。
必要ならば、患者の病状改善に際して、本発明の化合物、組成物または組み合わせの維持用量を投与し得る。引き続いて、症状が所望のレベルまで緩和された際の改善された病状が保持されるレベルまで、投与の用量または頻度、またはその双方を症状に応じて低下させ得る。しかし患者は、あらゆる疾患症状の再発に際して、長期的に断続的治療を必要とすることもある。
化合物および薬学的に許容可能な組成物の使用
本明細書に記載される化合物および組成物は、一般にCRM1を阻害するのに有用であり、したがってCRM1活性と関連付けられている、1つまたは複数の障害を治療にするのに有用である。したがって特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者に、本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な組成物を投与するステップを含んでなる、CRM1媒介疾患を治療する方法を提供する。本明細書に記載される化合物および組成物はまた、例えば試験管内でまたは生体外で培養中の細胞に、または例えば生体内などで対象に投与して、本明細書で以下の実施例をはじめとする、多様な障害を治療、予防、および/または診断し得る。
本発明でCRM1阻害剤として利用される化合物の活性は、生体外、生体内または細胞系中でアッセイしてもよい。本発明でCRM1阻害剤として利用される化合物をアッセイする詳細な条件は、実施例に記載される。
本明細書の用法では、「CRM1媒介性」障害または病状という用語は、本明細書の用法では、その中でCRM1が役割を果たすことが知られている、あらゆる疾患またはその他の有害な病状を意味する。したがって本発明の別の実施形態は、CRM1が役割を果たしていることが知られている、1つまたは複数の疾患を治療し、または重症度を低下させることに関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される化合物の治療有効量を患者に投与するステップを含んでなる、対象中で、p53、p73、p21、pRB、p27、IκB、NFκB、c−Abl、FOXOタンパク質、COX−2、またはHDAC(ヒストンデアセチラーゼ)の発現または活性と関連付けられている疾患を治療する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、増殖性疾患(例えばがん)、炎症性疾患、自己免疫障害、ウイルス感染症、眼科疾患または神経変性疾患から選択される、疾患または病状を治療し、または重症度を低下させる方法に関し、前記方法は、本発明による化合物または組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含んでなる。より具体的な実施形態では、本発明は、がんを治療し、または重症度を低下させる方法に関する。上記障害の特定の例は、下で詳細に記載される。
本発明の化合物によって治療可能ながんとしては、血液悪性腫瘍(白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫と骨髄異形成と骨髄増殖性症候群とをはじめとする骨髄腫)および固形腫瘍(前立腺、乳房、肺、結腸、膵臓、腎臓の、卵巣ならびに軟部組織などのがん腫、骨肉腫、および間質腫瘍)が挙げられるが、これに限定されるものではない。乳がん(BC)としては、基底細胞様乳がん(BLBC)、トリプルネガティブ乳がん(TNBC)、およびBLBCとTNBCの双方である乳がんが挙げられる。さらに乳がんとしては、侵襲性または非侵襲性乳管または小葉がん、乳房の管状、髄様、粘液性、乳頭、篩状がん、男性乳がん、再発性または転移性乳がん、乳房の葉状腫瘍、および乳首のパジェット病が挙げられる。
本発明の化合物によって治療可能な炎症性疾患としては、多発性硬化症、関節リウマチ、変性関節疾患、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血管炎症候群(小、中、および大血管)、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、クローン病、粘液性大腸炎、潰瘍性大腸炎、胃炎、敗血症、乾癬およびその他の外皮炎症性疾患(湿疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、蕁麻疹、強皮症、および急性炎症性要素を伴う皮膚病、天疱瘡、類天疱瘡、アレルギー性皮膚炎など)、および蕁麻疹症候群が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の化合物によって治療可能なウイルス性疾患としては、急性熱性咽頭炎、咽頭結膜熱、流行性角結膜炎、乳児胃腸炎、コクサッキー感染症、伝染性単核症、バーキットリンパ腫、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞がん、原発性HSV−1感染症(例えば小児歯肉口内炎、成人扁桃炎および咽頭炎、角結膜炎)、不顕性HSV−1感染症(例えば口唇ヘルペスおよび単純疱疹)、原発性HSV−2感染症、不顕性HSV−2感染症、無菌性髄膜炎、伝染性単核症、巨細胞封入体病、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病、原発性滲出液リンパ腫、AIDS、インフルエンザ、ライ症候群、はしか、後感染性脳脊髄炎、おたふく風邪、過形成上皮病変(例えば尋常性、扁平、足底、および肛門性器疣贅、喉頭乳頭腫、疣贅状表皮発育異常症)、子宮頸がん、扁平上皮がん、クループ、肺炎、細気管支炎、感冒、灰白髄炎、狂犬病、インフルエンザ様症候群、肺炎を伴う重症細気管支炎、風疹、先天性風疹、水痘、および帯状疱疹が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の化合物によって治療可能なウイルス性疾患としてはまた、B型肝炎およびC型肝炎をはじめとする、長期ウイルス感染症が挙げられる。
例示的な眼科疾患としては、黄斑浮腫(糖尿病性および非糖尿病性黄斑浮腫)、湿潤および乾燥形態の加齢性(aged related)黄斑変性、加齢円板状黄斑変性症、嚢胞状黄斑浮腫、眼瞼浮腫、網膜浮腫、糖尿病性網膜症、網脈絡膜症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、ブドウ膜炎、虹彩炎、網膜血管炎、眼内炎、全眼球炎、転移性眼炎、脈絡膜炎、網膜色素上皮炎(retinal pigment epitheliitis)、結膜炎、毛様体炎、強膜炎、上強膜炎、視神経炎、球後視神経炎、角膜炎、眼瞼炎、滲出性網膜離脱、角膜潰瘍、結膜潰瘍、慢性貨幣状角膜炎、低酸素症または虚血に伴う眼疾患、未熟児網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、ポリープ状脈絡膜血管症、網膜血管腫状増殖、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞、コーツ病、家族性滲出性硝子体網膜症、脈なし病(高安病)、イールズ病、抗リン脂質抗体症候群、白血病性網膜症、過粘稠度症候群、マクログロブリン血症、インターフェロン網膜症、高血圧性網膜症、放射線網膜症、角膜上皮幹細胞不全症または白内障が挙げられるが、これに限定されるものではない。
式Iの化合物によって治療可能な神経変性疾患としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化(ALS/ルー・ゲーリック病)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書に記載される化合物および組成物はまた、拡張型心筋症、肥大性心筋症、拘束性心筋症、肺線維症、肝線維症、糸球体腎炎、多嚢胞性腎障害(PKD)、およびその他の腎障害をはじめとする、異常な組織増殖および線維症障害を治療するのにも使用してもよい。
本明細書に記載される化合物および組成物はまた、肥満症および過食症などの、食物摂取量に関連した障害を治療するのに使用してもよい。
別の実施形態では、本明細書に記載される化合物または組成物を使用して、喘息、気管支炎、肺線維症、アレルギー性鼻炎、酸素毒性、肺気腫、慢性気管支炎、急性呼吸窮迫症候群、およびあらゆる慢性閉塞性肺疾患(COPD)をはじめとする、アレルギーおよび呼吸器疾患を治療または予防してもよい。
いくつかの実施形態では、CRM1活性関連疾患または病状は、次のとおりである。筋ジストロフィー、例えば骨関節炎および関節リウマチなどの関節炎、強直性脊椎炎(ankylosing spondilitis)、外傷性脳損傷、脊髄損傷、敗血症、リウマチ性疾患、がんアテローム性動脈硬化、I型糖尿病、II型糖尿病、レプトスピラ症(leptospiriosis)腎疾患、緑内障、網膜疾患、加齢、頭痛、疼痛、複合性局所疼痛症候群、心臓肥大、筋消耗、異化作用障害、肥満症、胎児の成長遅延、高コレステロール血症、心疾患、慢性心不全、虚血/再灌流、脳卒中、脳動脈瘤、狭心症、肺疾患、嚢胞性線維症、酸誘導肺傷害、肺高血圧症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、シェーグレン症候群、肺硝子膜症、腎臓病、糸球体疾患、アルコール性肝疾患、腸疾患、腹膜子宮内膜症、皮膚病、副鼻腔炎、中皮腫、免疫不全を伴う無汗性外胚葉形成不全症、ベーチェット病、色素失調症、結核、喘息、クローン病、大腸炎、眼アレルギー、虫垂炎、パジェット病、膵臓炎、歯周炎(periodonitis)、子宮内膜症、炎症性腸疾患、炎症性肺疾患、シリカ誘発性疾患、睡眠時無呼吸、AIDS、HIV−1、自己免疫疾患、抗リン脂質抗体症候群、狼瘡、狼瘡性腎炎、家族性地中海熱、遺伝性周期熱症候群、心理社会的ストレス病、神経病理学的疾患、家族性アミロイドポリニューロパチー、炎症性神経障害、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(amyotropic lateral sclerosis)、ハンチントン病、白内障、または難聴。
別の実施形態では、CRM1活性関連疾患または病状は、次のとおりである。頭部外傷、ブドウ膜炎、炎症性疼痛、アレルゲン誘発性喘息、非アレルゲン誘発性喘息、糸球体腎炎、潰瘍性大腸炎、壊死性腸炎、周期熱を伴う高グロブリンD血症(HIDS)、TNF受容体関連周期性症候群(TRAPS)、クリオピリン関連周期性症候群、マックル・ウェルズ症候群(蕁麻疹−難聴−アミロイドーシス)、家族性寒冷蕁麻疹、新生児期発症多臓器性炎症性疾患周期熱(NOMID)、周期熱−アフタ性口内炎−咽頭炎−扁桃腺炎(PFAPA症候群)、ブラウ症候群、化膿性無菌性関節炎、壊疽性膿皮症、座瘡(PAPA)、インターロイキン1受容体拮抗欠乏症(DIRA)、クモ膜下出血、多発性嚢胞腎、移植、臓器移植、組織移植、骨髄異形成症候群、刺激物質誘発性炎症、植物刺激物誘発性炎症、ツタウルシ/ウルシオール油誘発性炎症、化学的刺激物誘発性炎症、蜂刺傷誘発性炎症、咬虫症誘発性炎症、日光皮膚炎、火傷、皮膚炎、内毒血症、肺傷害、急性呼吸窮迫症候群、アルコール性肝炎、または寄生虫感染症によって引き起こされる腎臓損傷。
さらなる態様では、本発明は、対象中で、p53、p73、p21、pRB、p27、IκB、NFκB、c−Abl、FOXOタンパク質、COX−2またはHDACの発現または活性と関連付けられている疾患を治療する薬剤を製造するための、式Iの化合物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、がんおよび/または新生物障害、血管新生、自己免疫障害、炎症性疾患および/または疾患、エピジェネティックス、ホルモン障害および/または疾患、ウイルス性疾患、神経変性障害および/または疾患、創傷、および眼科的障害のいずれかを治療するための薬剤の製造における、式Iの化合物の使用を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、式Iの化合物の薬学的に許容可能な塩、またはその薬学的に許容可能な組成物を生物学的サンプルに接触させ、または患者に投与するステップを含んでなる、生物学的サンプル中でCRM1を阻害する方法を提供する。
新生物障害
本明細書に記載される化合物または組成物は、新生物疾患を治療するのに使用し得る。「新生物障害」は、例えば増殖性細胞成長によって特徴付けられる異常な状態または病状などの、自律的増殖または複製能力を有する細胞によって特徴付けられる、疾病または障害である。例示的な新生物障害としては、例えば、前立腺、脳、骨、結腸、肺、乳、卵巣、および肝臓起源の腫瘍などのがん腫、肉腫、転移性障害、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫およびその他の悪性形質細胞などの障害造血性新生物障害、および転移性腫瘍が挙げられる。蔓延しているがんとしては、乳、前立腺、結腸、肺、肝臓、および膵臓がんが挙げられる。化合物による治療は、例えば細胞増殖低下、腫瘤量低下など、新生物障害の少なくとも1つの症状を改善するのに効果的な量で実施し得る。
開示される方法は、例えば、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、およびそれらの転位をはじめとするがんを予防および治療するのに、ならびにリー・フラウメニ症候群、家族性乳−卵巣がん(BRCA1またはBRAC2変異)症候群などの家族性がん症候群において、有用である。開示される方法はまた、非固形がんを治療するのに有用である。例示的な固形腫瘍としては、肺、乳、リンパ系、消化器(例えば結腸)などの様々な臓器系、および泌尿生殖器(例えば腎臓、尿路上皮、または精巣腫瘍)経路、咽頭、前立腺、および卵巣の悪性腫瘍(例えば肉腫、腺がん、およびがん腫)が挙げられる。例示的な腺がんとしては、結腸直腸がん、腎臓細胞がん腫、肝臓がん、非小細胞肺がん、および小腸がんが挙げられる。
米国国立がん研究所によって記載される例示的ながんとしては、以下が挙げられる。急性リンパ芽球性白血病、成人;急性リンパ芽球性白血病、小児期;急性骨髄性白血病、成人;副腎皮質がん;副腎皮質がん、小児期;AIDS関連リンパ腫;AIDS関連悪性腫瘍;肛門がん;星細胞腫、小児期小脳;星細胞腫、小児期脳;胆管がん、肝臓外;膀胱がん;膀胱がん、小児期;骨がん、骨肉腫/悪性線維性組織球腫;脳幹神経膠腫、小児期;脳腫瘍、成人;脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児期;脳腫瘍、小脳星細胞腫、小児期;脳腫瘍、脳星細胞腫/悪性神経膠腫、小児期;脳腫瘍、上衣細胞腫、小児期;脳腫瘍、髄芽細胞腫、小児期;脳腫瘍、小脳テント上腫瘍原始神経外胚葉性腫瘍、小児期;脳腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、小児期;脳腫瘍、小児期(その他の);乳がん;乳がんおよび妊娠;乳がん、小児期;乳がん、男性;気管支腺腫/カルチノイド、小児期;カルチノイド腫瘍、小児期;カルチノイド腫瘍、胃腸;がん腫、副腎皮質;がん腫、膵島細胞;路の原発性がん腫;中枢神経系リンパ腫、原発性;小脳星細胞腫、小児期;脳星細胞腫/悪性神経膠腫、小児期;子宮頸がん;小児期がん;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性髄増殖性疾患;腱鞘の明細胞肉腫;大腸がん;結腸直腸がん、小児期;皮膚のT細胞(CeIl)リンパ腫;子宮内膜がん;上衣細胞腫、小児期;上皮がん、卵巣;食道がん;食道がん、小児期;ユーイングファミリー腫瘍;頭蓋外胚細胞腫瘍、小児期;性腺外胚細胞腫瘍;肝外胆管がん;眼がん、眼球内黒色腫;眼がん、網膜芽細胞腫;胆嚢がん;胃がん;胃がん、小児期;消化管カルチノイド腫瘍;胚芽細胞腫瘍、頭蓋外、小児期;胚芽細胞腫瘍、性腺外;胚芽細胞腫瘍、卵巣;妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫、小児期脳幹;神経膠腫、小児期視覚路および視床下部;有毛細胞白血病;頭頸部がん;肝細胞(肝臓)がん、成人(原発性);肝細胞(肝臓)がん、小児期(原発性);ホジキンリンパ腫、成人;ホジキンリンパ腫、小児期;妊娠中ホジキンリンパ腫;下咽頭がん;視床下部および視覚路神経膠腫、小児期;眼球内黒色腫;膵島細胞がん腫(内分泌膵);カポジ肉腫;腎臓がん;喉頭がん;喉頭がん、小児期;白血病、急性リンパ芽球性、成人;白血病、急性リンパ芽球性、小児期;白血病、急性骨髄性、成人;白血病、急性骨髄性、小児期;白血病、慢性リンパ球性;白血病、慢性骨髄性;白血病、有毛細胞;口唇および口腔がん;肝臓がん、成人(原発性);肝臓がん、小児期(原発性);肺がん、非小細胞;肺がん、小細胞;リンパ芽球性白血病、成人急性;リンパ芽球性白血病、小児期急性;リンパ球性白血病、慢性;リンパ腫、AIDS関連;リンパ腫、中枢神経系(原発性);リンパ腫、皮膚T細胞(CeIl);ホジキンリンパ腫、成人;ホジキンリンパ腫、小児期;ホジキンリンパ腫、妊娠中;非ホジキンリンパ腫、成人;非ホジキンリンパ腫、小児期;非ホジキンリンパ腫、妊娠中;リンパ腫、原発性中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンシュトレーム;男性乳がん;悪性中皮腫、成人;悪性中皮腫、小児期;悪性胸腺腫;髄芽細胞腫、小児期;黒色腫;黒色腫、眼球内;メルケル細胞がん;中皮腫、悪性;原発不明の転移性扁平上皮頸部がん;多発性内分泌腺腫症候群、小児期;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄性白血病、慢性;骨髄性白血病、小児期急性;骨髄腫、多発性;骨髄増殖性疾患、慢性;鼻腔および副鼻腔がん;鼻咽頭がん;鼻咽頭がん、小児期;神経芽細胞腫;非ホジキンリンパ腫、成人;非ホジキンリンパ腫、小児期;妊娠中の非ホジキンリンパ腫;非小細胞肺がん;口腔がん、小児期;口腔および口唇がん;中咽頭がん;骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫;卵巣がん、小児期;卵巣上皮がん;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性潜在的腫瘍;膵臓がん;膵臓がん、小児期;膵臓がん、膵島細胞;副鼻腔および鼻腔がん;副甲状腺がん;陰茎がん;褐色細胞腫;松果体および小脳テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児期;脳下垂体腫瘍;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;妊娠および乳がん;妊娠およびホジキンリンパ腫;妊および非ホジキンリンパ腫;原発性中枢神経系リンパ腫;原発性肝臓がん、成人;原発性肝臓がん、小児期;前立腺がん;直腸がん;腎細胞(腎臓)がん;腎細胞がん、小児期;腎盂および尿管、移行上皮がん;網膜芽細胞腫;横紋筋肉腫、小児期;唾液腺がん;唾液腺がん、小児期;ユーイング肉腫ファミリー腫瘍;肉腫、カポジ;肉腫(骨肉腫)/骨の悪性線維性組織球腫;肉腫、横紋筋肉腫、小児期;肉腫、軟部組織、成人;肉腫、軟部組織、小児期;セザリー症候群;皮膚がん;皮膚がん、小児期;皮膚がん(黒色腫);皮膚がん、メルケル細胞;小細胞肺がん;小腸がん;軟部組織肉腫、成人;軟部組織肉腫、小児期;原発不明扁平上皮頸部がん、転移性;胃がん;胃がん、小児期;小脳テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児期;T細胞(CeIl)リンパ腫、皮膚;精巣がん;胸腺腫、小児期;胸腺腫、悪性;甲状腺がん;甲状腺がん、小児期;腎盂および尿管の移行上皮がん;絨毛性腫瘍、妊娠性;未知原発部位、がん、小児期;小児期の稀ながん;尿管および腎盂、移行上皮がん;尿道がん;子宮肉腫;膣がん;視覚路および視床下部神経膠腫、小児期;外陰がん;ワルデンシュトレームのマクログロブリン血症;およびウィルムス腫瘍。
さらなる例示的ながんとしては、びまん性大細胞リンパ腫(DLBCL)およびマントル細胞リンパ腫(MCL)が挙げられる。
前述のがんの転移もまた、本明細書に記載される方法に従って、処置または予防し得る。
併用療法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物は、追加的な「第2の」治療薬または治療と共に投与される。第2の治療薬は、指示される疾患または病状を治療する単剤療法で典型的に使用される、あらゆる作用物質から選択されてもよい。本明細書の用法では、「共に投与される」という用語および関連用語は、本発明による治療薬の同時または逐次の投与を指す。例えば本発明の化合物は、別個の単一剤形で同時または順次に、または単一剤形中で合わせて、別の治療薬と共に投与してもよい。したがって本発明は、式Iの化合物、追加的な治療薬、および薬学的に許容できる担体、アジュバント、またはビヒクルを含んでなる、単一剤形を提供する。
第2の治療薬が対象に投与される本発明の一実施形態では、本発明の化合物の有効量は、第2の治療薬が投与されない場合のその有効量を下回る。別の実施形態では、第2の治療薬の有効量は、本発明の化合物が投与されない場合のその有効量を下回る。このようにして、作用物質のいずれかの高用量に付随する、望まれない副作用が最小化されてもよい。(制限なしに、投薬計画改善および/または薬剤コスト低下をはじめとする)その他の可能な利点は、当業者には明白であろう。追加的な作用物質は、複数回投与レジメンの一部として、本発明の化合物とは別に投与してもよい。代案としては、これらの薬剤は、本発明の化合物と合わせて単一組成物に混合された、単回投与剤形の一部であってもよい。
がん併用療法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物は、追加的ながん治療薬と共に投与される。例示的な、さらなるがん治療法としては、例えば、化学療法、抗体療法などの標的療法、キナーゼ阻害剤、免疫療法、およびホルモン療法、エピジェネティック療法、プロテオソーム療法、および抗血管新生療法が挙げられる。これらの各治療の例は、下で提供される。本明細書の用法では、「組み合わせ」、「組み合わせた」という用語および関連用語は、本発明による治療薬の同時または逐次の投与を指す。例えば本発明の化合物は、別個の単一剤形で同時または順次に、または単一剤形中で併せて、別の治療薬と共に投与し得る。したがって本発明は、本発明の化合物、追加的な治療薬、および薬学的に許容できる担体、アジュバント、またはビヒクルを含んでなる、単一剤形を提供する。
(上述したような追加的治療薬を含んでなる組成物中で)単回投与剤形を製造するために、担体材料と組み合わせ得る本発明の化合物および追加的な治療薬の双方の量は、治療される宿主および特定の投与様式に応じて変動する。好ましくは、本発明の組成物は、0.01〜100mg/kg体重/日の用量の本発明の化合物が投与され得るように、調合されるべきである。
化学療法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物は、化学療法と共に投与される。化学療法は、がん細胞を破壊する薬剤によるがんの治療法である。「化学療法」は、通常は標的療法とは対照的に、一般に急速に分裂する細胞に影響を及ぼす細胞毒性薬を指す。化学療法薬は、例えばDNAの複製または新たに形成された染色体の分離などの細胞分裂を、様々な可能な様式で妨げる。化学療法のほとんどの形態は、急速に分裂する全ての細胞を標的とし、がん細胞に特異的ではないが、DNA損傷を多くのがん細胞が修復できないのに対して、正常細胞は一般に修復できることから、ある程度の特異性が得られることもある。
がん療法で使用される化学療法薬の例としては、例えば、代謝拮抗剤(例えば葉酸、プリン、およびピリミジン誘導体)、およびアルキル化剤(例えばナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金、アルキルスルホネート、ヒドラジン、トリアゼン、アジリジン、紡錘体阻害剤、細胞毒性薬、トポイソメラーゼ阻害剤など)が挙げられる。例示的な作用薬としては、アクラルビシン、アクチノマイシン、アリトレチノイン、アルトレタミン、アミノプテリン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アトラセンタン、ベロテカン、ベキサロテン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルボコン、カルモフール、カルムスチン、セレコキシブ、クロランブシル、クロルメチン、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンパスターゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、デメコルチン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エファプロキシラル、エレスクロモール、エルサミトルシン、エノシタビン、エピルビシン、エストラムスチン、エトグルシド、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル(5FU)、フォテムスチン、ゲムシタビン、グリアデルインプラント、ヒドロキシカルバミド、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、イロフルベン、イクサベピロン、ラロタキセル、ロイコボリン、リポソーム性ドキソルビシン、リポソーム性ダウノルビシン、ロニダミン、ロムスチン、ルカントン、マンノスルファン、マソプロコール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、アミノレブリン酸メチル、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトタン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ネダプラチン、ニムスチン、オブリメルセン、オマセタキシン、オルタタキセル、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペグアスパラガーゼ、ペメトレキセド、ペントスタチン、ピラルビシン、ピクサントロン、プリカマイシン、ポルフィマーナトリウム、プレドニムスチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ラニムスチン、ルビテカン、サパシタビン、セムスチン、シチマジーンセラデノベック、ストラタプラチン、ストレプトゾシン、タラポルフィン、テガフール−ウラシル、テモポルフィン、テモゾロマイド、テニポシド、テセタキセル、テストラクトン、四硝酸塩、チオテパ、チアゾフリン、チオグアニン、ティピファニブ、トポテカン、トラベクテジン、トリアジコン、トリエチレンメラミン、トリプラチン、トレチノイン、トレオスルファン、トロホスファミド、ウラムスチン、バルルビシン、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、ボリノスタット、ゾルビシン、および本明細書に記載されるその他の細胞分裂阻害剤または細胞毒性薬が挙げられる。
いくつかの薬剤は、単独よりも合わせたときにより良く機能するので、2種以上の薬剤が同時に投与されることが多い。頻繁に、2種以上の化学療法剤が、併用化学療法として使用される。いくつかの実施形態では、(併用化学療法をはじめとする)化学療法剤を、本明細書に記載される化合物と組み合わせて使用し得る。
標的療法
標的療法は、がん細胞の無秩序なタンパク質に対して特異的な、作用薬の使用からなる。小分子標的療法剤は、一般にがん細胞内の変異した、過剰発現した、またはさもなければ重要な、タンパク質の酵素ドメインの阻害剤である。顕著な例は、アキシチニブ、ボスチニブ、セジラニブ、ダサチニブ(desatinib)、エルロチニブ(erolotinib)、イマチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、レスタウルチニブ、ニロチニブ、セマキサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、およびバンデタニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤であり、アルボシジブおよびセリシクリブなどのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤もまた挙げられる。モノクローナル抗体療法は、治療薬が、がん細胞表面タンパク質に特異的に結合する抗体である、別のストラテジーである。例としては、典型的に乳がんで使用される、抗HER2/neu抗体トラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標))と、典型的に多様なB細胞悪性腫瘍で使用される、抗CD20抗体リツキシマブおよびトシツモマブとが挙げられる。その他の例示的な抗体としては、セツキシマブ、パニツマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、エドレコロマブ、およびゲムツズマブが挙げられる。例示的な融合タンパク質としては、アフリベルセプトおよびデニロイキンジフチトクスが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物と組み合わせて、標的療法を使用し得る。例えば、Gleevec(Vignariand Wang 2001)。
標的療法はまた、腫瘍周囲の細胞表面受容体に、または罹患した細胞外基質に結合し得る「自動誘導装置」としての小型ペプチドを含み得る。これらのペプチドに付着する放射性核種(例えばRGD)は、核種が細胞近傍で崩壊すれば、最終的にがん細胞を殺滅する。このような治療法の一例としては、BEXXAR(登録商標)が挙げられる。
血管新生
本明細書に記載される化合物および方法は、血管新生関連疾患または障害を治療または予防するのに使用してもよい。血管新生と関連付けられている疾患としては、がん、心血管疾患、および黄斑変性が挙げられる。
血管新生は、既存の血管からの新血管の増殖を伴う、生理学的過程である。血管新生は、成長および発達、ならびに創傷治癒および肉芽組織における、正常かつ不可欠な過程である。しかしそれはまた、休眠状態から悪性状態への腫瘍の移行における必須段階でもある。血管新生は、芳しくない血管新生または異常な血管系のいずれかによって特徴付けられる疾患に取り組むための、標的であってもよい。
体内で新血管生成を阻害または誘導することもある特定化合物の施用は、このような疾患に対する戦いの一助になることもある。存在すべきでない部位における血管の存在は、組織の機械的特性に影響を及ぼすこともあり、破損の可能性を増大させる。修復中またはさもなければ代謝的に活動性の組織における血管の不在は、修復またはその他の本質的機能を阻害することもある。虚血性慢性創傷などのいくつかの疾患は、破損または不十分な血管形成の結果であり、血管の局所的増殖によって、したがってその部位に新しい栄養素を供給して、修復を促進することで治療してもよい。加齢黄斑変性などのその他の疾患は、正常な生理学的過程と干渉する、血管の局所的増殖によって生じることもある。
血管内皮増殖因子(VEGF)は、血管新生の主要原因であり、所与のネットワーク中の毛細管数を増大させることが、実証されている。VEGFの上方制御は、運動に対する生理学的応答の主要構成要素であり、血管新生におけるその役割は、血管損傷における可能な治療法であると考えられている。生体外実験は、この増殖因子存在下において、播種された内皮細胞が増殖して移動し、最終的には毛細血管と似た管構造を形成することから、VEGFが血管新生の強力な刺激物質であることを明確に実証する。
腫瘍は、様々な増殖因子(例えばVEGF)を分泌することにより、血管増殖(血管新生)を誘導する。bFGFおよびVEGFなどの増殖因子は、腫瘍中の毛細血管増殖を誘導し得て、幾人かの研究者は、これが必要な栄養素を供給して、腫瘍の増殖を可能にすると考えている。
血管新生は、心血管疾患治療法のための優れた治療標的に相当する。これは、我々の身体が、重要臓器への血液供給の減少に応答する自然な様式、すなわち虚血傷害を克服するための新しい側副血管血管の生成の基礎となる、強力な生理学的過程である。
VEGFの過剰発現は、血管新生の刺激に加えて、血管透過性の増大を引き起こす。湿潤黄斑変性においては、VEGFは、網膜中の毛細血管の増殖を引き起こす。血管新生の増大は、浮腫もまた引き起こすため、血液およびその他の網膜液が網膜中に漏れて、視力喪失を引き起こす。
抗血管新生療法としては、スニチニブやソラフェニブなどの血管内皮増殖因子(VEGF)を標的とするキナーゼ阻害剤;またはベバシズマブまたはVEGF−Trap、をはじめとする、VEGFまたはVEGF受容体に対するモノクローナル抗体または受容体「デコイ」;またはサリドマイドまたはその類似体(レナリドミド、ポマリドミド);または線維芽細胞増殖因子(FGF)、アンギオポエチン、またはアンギオスタチンまたはエンドスタチンなどの非VEGF血管新生標的を標的とする作用薬が挙げられる。
エピジェネティックス
本明細書に記載される化合物および方法は、エピジェネティックス関連疾患または障害を治療または予防するのに使用してもよい。エピジェネティックスは、根本的なDNA配列の変化以外の機構によって引き起こされる、表現型または遺伝子発現における遺伝性変化の研究である。真核生物学におけるエピジェネティックなの変化の一例は、細胞分化過程である。形態形成中に、幹細胞は様々な胚細胞系になり、それは次に完全に分化した細胞になる。換言すれば、単一受精卵細胞は、分裂を続ける間に、ニューロン、筋肉細胞、上皮、血管などをはじめとする、多数の細胞型に変化する。これは、その他の遺伝子を抑制する一方で、いくつかの遺伝子を活性化することで、そうなる。
エピジェネティックな変化は、細胞が分裂する際に保存される。ほとんどのエピジェネティックな変化は、1つの個体の生涯においてのみ生じるが、受精をもたらした精子または卵細胞中で、DNA中の変異が引き起こされたのであれば、いくつかのエピジェネティックな変化は、1つの世代から次世代に遺伝する。特定のエピジェネティックな過程としては、パラミューテーション、ブックマーキング、刷り込み、遺伝子サイレンシング、X染色体不活性化、位置効果、再プログラミング、トランスベクション、母性効果、発がんの進行、催奇形因子の多数の影響、ヒストン修飾およびヘテロクロマチンの調節、および単為発生とクローニングに影響を及ぼす技術的限界が挙げられる。
エピジェネティックスと関連付けられている例示的な疾患としては、ATR症候群、脆弱X症候群、ICF症候群、アンジェルマン症候群、プラダー・ウィリー(Prader−Wills)症候群、BWS、レット症候群、αサラセミア、がん、白血病、ルビンシュタイン・テイビ症候群、およびコフィン・ローリー症候群が挙げられる。
エピジェネティックスと結びつけられた最初のヒト疾患は、がんである。研究者らは、結腸直腸がん患者からの患部組織が、同一患者の正常組織よりも、より少ないDNAメチル化を有することを見出した。メチル化遺伝子は、典型的にスイッチオフされるので、DNAメチル化の喪失は、クロマチン配置を変化させることにより、異常に高い遺伝子活性化を引き起こし得る。他方では、過剰なメチル化は、保護的腫瘍サプレッサー遺伝子の作用を取り消し得る。
DNAメチル化はCpG部位で生じ、哺乳類においてはCpGシトシンの大部分はメチル化されている。しかしプロモーター領域の近くには、正常細胞ではメチル化を含まないCpG部位を、より高濃度で有する一続きのDNAがある(CpGアイランドとして知られている)。がん細胞中では、これらのCpGアイランドが過剰にメチル化され、それによって発現停止されるべきではない遺伝子がスイッチオフされる。この異常は、腫瘍中で生じるエピジェネティックな変化を象徴する特徴であり、がん発生初期に起きる。CpGアイランドの過剰メチル化は、腫瘍抑制遺伝子をスイッチオフすることで、腫瘍を引き起こし得る。事実上、これらのタイプの変化は、ヒトのがんにおいて、DNA配列の変異よりもより一般的なこともある。
さらにエピジェネティックな変化は、DNA配列を変化させないが、それらは変異を引き起こし得る。家族性または遺伝性形態のがんを引き起こす遺伝子の約半分は、メチル化によりスイッチオフされる。これらのほとんどの遺伝子は、常態では、腫瘍形成を抑制して、O6−メチルグアニン−DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)、MLH1サイクリン依存性キナーゼ阻害剤2B(CDKN2B)、およびRASSF1Aをはじめとする、DNA修復を助ける。例えばMGMTプロモーターの過剰メチル化は、G−to−A変異の数を増大させる。
過剰メチル化はまた、反復DNA配列であるマイクロサテライトの不安定性をもたらし得る。マイクロサテライトは、正常な個体において一般的であり、それらは通常、ジヌクレオチドCAの反復からなる。DNA修復遺伝子MLH1のプロモーターの過剰なメチル化は、マイクロサテライトを不安定化し、それを延長または短縮し得る。マイクロサテライトの不安定性は、結腸直腸、子宮内膜、卵巣、および胃がんをはじめとする、多数のがんと結びつけられている。
脆弱X症候群は、特に男性において、最も頻繁に遺伝する精神障害である。男女ともこの病状を発症し得るが、男性は、X染色体を1つだけ有するので、1つの脆弱Xは男性に対してより重大な影響を及ぼす。実際に、脆弱X症候群は、4,000人の男性あたり約1人、8,000人の女性あたり1人に発生する。この症候群がある人々は、重篤な知的障害、言語発達遅延、「自閉症様」挙動を有する。
脆弱X症候群は、顕微鏡下における、遺伝子異常を含有するX染色体部分の見え方から、その名称を得た。それは、通常、糸でぶら下がっているように見えて、容易に破損する。症候群は、FMR1(脆弱X精神遅滞1)遺伝子中の異常によって引き起こされる。脆弱X症候群のない人々は、FMR1遺伝子中に、6〜50の三塩基CGGの反復を有する。しかし200を超える反復がある個人は、完全な変異を有して、通常、症候群の症状を示す。多すぎるCGGによって、CpGアイランドは、FMR1遺伝子のプロモーター領域でメチル化されるようになり;常態では、それらはメチル化されない。このメチル化は遺伝子をスイッチオフして、FMR1遺伝子が、脆弱X精神遅滞タンパク質と称される重要なタンパク質を生成するのを停止させる。この特定のタンパク質の低下が、脆弱X症候群を引き起こす。脆弱Xの原因として、CGG増幅変異が注目を集めているが、FMR1メチル化に付随するエピジェネティックな変化が、症候群の真犯人である。
エピジェネティックな変化を伴う精神遅滞に関連する障害は、脆弱X症候群だけではない。その他のこのような病状としては、ルビンシュタイン・テイビ(Rubenstein−Taybi)、コフィン・ローリー、プラダー・ウィリー、アンジェルマン、ベックウィズ・ヴィーデマン、ATR−X、およびレット症候群が挙げられる。
エピジェネティック治療法としては、エピジェネティックな修飾を制御する酵素の阻害剤、具体的にはいくつかの悪性腫瘍に対し有望な抗腫瘍形成性効果を示したDNAメチルトランスフェラーゼとヒストンデアセチラーゼ、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびsiRNAが挙げられる。
免疫療法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物は、免疫療法と共に投与される。がん免疫療法は、患者自身の免疫系が腫瘍と闘うよう誘導するようにデザインされた、治療ストラテジーの多様なセットを指す。腫瘍に対する免疫応答を生じさせる現代的な方法としては、表在性膀胱がんのための膀胱内BCG免疫療法、前立腺がんワクチンであるプロベンジ、および腎細胞がんおよび黒色腫患者において、免疫応答を誘導するためのインターフェロンおよびその他のサイトカインの使用が挙げられる。
同種異系造血幹細胞移植は、供与者の免疫細胞が、移植片対腫瘍効果で腫瘍を攻撃することが多いので、免疫療法の一形態と見なし得る。いくつかの実施形態では、免疫療法剤を本明細書に記載される化合物と組み合わせて使用し得る。
ホルモン療法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物は、ホルモン療法と共に投与される。ある種のがんの増殖は、特定のホルモンを提供するか、または遮断することによって抑制し得る。ホルモン感受性腫瘍の一般例としては、特定タイプの乳がんおよび前立腺がん、ならびに特定のレチノイド/レチノイン酸に応答する特定タイプの白血病が挙げられる。エストロゲンまたはテストステロンを除去またはブロックすることは、往々にして重要な追加治療である。特定のがんでは、プロゲストーゲンなどのホルモン作動薬の投与が、治療的に有益なこともある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物と組み合わせて、ホルモン療法剤を使用し得る。
ホルモン療法剤としては、ホルモン作動薬またはホルモン拮抗薬の投与が挙げられ、レチノイド/レチノイン酸、エストロゲンまたはテストステロンを阻害する化合物、ならびにプロゲストーゲン投与が挙げられる。
炎症および自己免疫疾患
本明細書に記載される化合物および方法は、特にヒトおよびその他の哺乳類において、炎症関連疾患または障害を治療または予防するのに使用してもよい。本明細書に記載される化合物は、炎症の発生前、発生時、または発生後に投与してもよい。予防的に使用される場合、化合物は、好ましくは、あらゆる炎症応答または症状に先立って提供される。化合物の投与は、炎症性応答または症状を予防または軽減し得る。例示的な炎症状態としては、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、変性関節疾患、脊椎関節症(spondouloarthropathies)、その他の血清反応陰性炎症性関節炎、リウマチ性多発性筋痛、様々な血管炎(例えば巨細胞性動脈炎、ANCA+血管炎)、痛風性関節炎、全身性エリテマトーデス、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、骨関節炎、骨粗鬆症、糖尿病(例えばインスリン依存性糖尿病または若年発症糖尿病)、月経痙攣、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、クローン病、粘液性大腸炎、潰瘍性大腸炎、胃炎、食道炎、膵臓炎、腹膜炎、アルツハイマー病、ショック、強直性脊椎炎、胃炎、結膜炎、膵臓炎(pancreatis)(急性または慢性)、多臓器損傷症候群(例えば敗血症または外傷に続発する)、心筋梗塞、アテローム性動脈硬化、脳卒中、再灌流傷害(例えば心肺のバイパスまたは腎臓透析に起因する)、急性糸球体腎炎、熱的傷害(すなわち日光皮膚炎)、壊死性腸炎、顆粒球輸血関連症候群、および/またはシェーグレン症候群が挙げられる。例示的な皮膚の炎症状態としては、例えば、湿疹、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、蕁麻疹、強皮症(schleroderma)、乾癬、および急性炎症性要素を伴う皮膚病が挙げられる。
別の実施形態では、本明細書に記載される化合物および方法は、喘息、気管支炎、肺線維症、アレルギー性鼻炎、酸素毒性、肺気腫、慢性気管支炎、急性呼吸困難症候群、およびいずれかの慢性閉塞性肺疾患(COPD)をはじめとする、アレルギーおよび呼吸の病状を治療または予防するのに使用してもよい。化合物は、B型肝炎およびC型肝炎をはじめとする、慢性肝炎感染を治療するのに使用しもよい。
さらに、本明細書に記載される化合物または方法は、自己免疫疾患および/または炎症を治療するのに使用してもよい。臓器組織自己免疫疾患(例えばレイノー症候群)、強皮症、重症筋無力症、移植拒絶反応、内毒素ショック、敗血症、乾癬、湿疹、皮膚炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、アジソン病、多腺性自己免疫疾患(多腺性自己免疫症候群としてもまた知られている)、およびグレーブス病などの自己免疫疾患と関連付けられている。
特定の実施形態では、本明細書に記載される化合物は、多発性硬化症を治療するのに使用し得る。特定の態様では、多発性硬化症を治療するのに使用される化合物は、化合物1、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−1−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)プロプ−2−エン−1−オン)である。
併用療法
特定の実施形態では、本明細書に記載される化合物は、単独で、または炎症を治療または予防するのに有用なその他の化合物と組み合わせて、投与してもよい。例示的な抗炎症剤としては、例えば、ステロイド(例えばコルチゾール、コルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、6[α]−メチルプレドニゾロン(methylprednisone)、トリアムシノロン、ベタメタゾンまたはデキサメタゾン)、非ステロイド系抗炎症薬(NSAIDS(例えばアスピリン、アセトアミノフェン、トルメチン、イブプロフェン、メフェナム酸、ピロキシカム、ナブメトン、ロフェコキシブ、セレコキシブ、エトドラクまたはニメスリド)が挙げられる。別の実施形態では、もう一方の治療薬は抗生物質である(例えばバンコマイシン、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフィキシム、リファンピンメトロニダゾール、ドキシサイクリンまたはストレプトマイシン)。別の実施形態では、もう一方の治療薬はPDE4阻害剤である(例えばロフルミラストまたはロリプラム)。別の実施形態では、もう一方の治療薬は抗ヒスタミン剤である(例えばシクリジン、ヒドロキシジン、プロメタジンまたはジフェンヒドラミン)。別の実施形態では、もう一方の治療薬は抗マラリア剤である(例えばアルテミシニン、アルテメーター、アルテスナート(artsunate)、リン酸クロロキン、塩酸メフロキン、ドキシサイクリン塩酸塩、塩酸プログアニル、アトバクオンまたはハロファントリン)。一実施形態では、もう一方の化合物はドロトレコギンアルファである。
抗炎症剤のさらなる例としては、例えば、アセクロフェナク、アセメタシン、e−アセトアミドカプロン酸、アセトアミノフェン、アセトアミノサロール、アセトアニリド、アセチルサリチル酸、S−アデノシルメチオニン、アルクロフェナック、アルクロメタゾン、アルフェンタニル、アルゲストン、アリルプロジン、アルミノプロフェン、アロキシプリン、アルファプロジン、ビス(アセチルサリチル酸塩)アルミニウム、アムシノニド、アンフェナク、アミノクロルテノキサジン、3−アミノ−4−ヒドロキシ酪酸、2−アミノ−4−ピコリン、アミノプロピロン、アミノピリン、アミキセトリン、サリチル酸アンモニウム、アンピロキシカム、アムトルメチングアシル、アニレリジン、アンチピリン、アントラフェニン、アパゾン、ベクロメタゾン、ベンダザック、ベノリレート、ベノキサプロフェン、ベンズピペリロン、ベンジダミン、ベンジルモルヒネ、ベルモプロフェン、ベタメタゾン、17−吉草酸ベタメタゾン、ベジトラミド、[α]−ビサボロール、ブロムフェナク、p−ブロモアセトアニリド、5−ブロモサリチル酸酢酸塩、ブロモサリゲニン、ブセチン、ブクロキシ酸、ブコローム、ブデソニド、ブフェキサマック、ブマジゾン、ブプレノルフィン、ブトアセチン、ブチブフェン、ブトルファノール、カルバマゼピン、カルビフェン、カルプロフェン、カルサラム、クロロブタノール、クロロプレドニゾン、クロルテノキサジン、サリチル酸コリン、シンコフェン、シンメタシン、シラマドール、クリダナク、クロベタゾール、クロコルトロン、クロメタシン、クロニタゼン、クロニキシン、クロピラク、クロプレドノール、クローブ、コデイン、臭化メチルコデイン、リン酸コデイン、硫酸コデイン、コルチゾン、コルチバゾール、クロプロプアミド、クロテトアミド、シクラゾシン、デフラザコート、デヒドロテストステロン、デソモルヒネ、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、デキサメタゾン−21−イソニコチン酸、デキソキサドロール、デキストロモラミド、デキストロプロポキシフェン、デオキシコルチコステロン、デゾシン、ジアンプロマイド、ジアモルホンジアモルホン、ジクロフェナク、ジフェナミゾール、ジフェンピラミド、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルニサール、ジフルプレドナート、ジヒドロコデイノンエノールアセタート、ジヒドロモルヒネ、アセチルサリチル酸ジヒドロキシアルミニウム、ジメノキサドール、ジメヘプタノール、ジメチルチアンブテン、酪酸ジオキサフェチル、ジピパノン、ジプロセチル、ジピロン、ジタゾール、ドロキシカム、エモルファゾン、エンフェナム酸、エノキソロン、エピリゾール、エプタゾシン、エテルサレート、エテンザミド、エトヘプタジン、エトキサゼン、エチルメチルチアンブテン、エチルモルヒネ、エトドラク、エトフェナメート、エトニタゼン、オイゲノール、フェルビナク、フェンブフェン、フェンクロジン酸、フェンドサール、フェノプロフェン、フェンタニル、フェンチアザック、フェプラジノール、フェプラゾン、フロクタフェニン、フルアザコート、フルクロロニド、フルフェナム酸、フルメタゾン、フルニソリド、フルニキシン、フルノキサプロフェン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン(fluocoitolone)、フルオレソン、フルオロメトロン、フルペロロン、フルピルチン、フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルプロクアゾン、フルランドレノリド、フルルビプロフェン、フルチカソン、ホルモコータル、ホスホサール、ゲンチジン酸、グラフェニン、グルカメタシン、サリチル酸グリコール、グアイアズレン、ハルシノニド、ハロベタソール、ハロメタゾン、ハロプレドノン、ヘロイン、ヒドロコドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン、ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン‐21‐リジネート、ヒドロコルチゾンシピオネート、ヒドロモルホン、ヒドロキシペチジン、イブフェナック、イブプロフェン、イブプロキサム、サリチル酸イミダゾール、インドメタシン、インドプロフェン、イソフェゾラク、イソフルプレドン、酢酸イソフルプレドン、イソラドール、イソメタドン、イソニキシン、イソキセパック、イソキシカム、ケトベミドン、ケトプロフェン、ケトロラック、p−ラクトフェネチド、レフェタミン、レバロルファン、レボルファノール、レボフェナシル−モルファン、ロフェンタニル、ロナゾラク、ロルノキシカム、ロキソプロフェン、アセチルサリチル酸リジン、マジプレドン、メクロフェナム酸、メドリゾン、メフェナム酸、メロキシカム、メペリジン、メプレドニゾン、メプタジノール、メサラミン、メタゾシン、メサドン、メトトリメプラジン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、メチルプレドニゾロンスレプトナート、メチアジン酸、メトホリン、メトポン、モフェブタゾン、モフェゾラク、モメタゾン、モラゾン、モルヒネ、塩酸モルヒネ、硫酸モルヒネ、サリチル酸モルホリン、ミロフィン、ナブメトン、ナルブフィン、ナロルフィン、サリチル酸1−ナフチル、ナプロキセン、ナルセイン、ネホパム、ニコモルフィン、ニフェナゾン、ニフルム酸、ニメスリド、5’−ニトロ−2’−プロポキシアセトアニリド、ノルレボルファノール、ノルメタドン、ノルモルヒネ、ノルピパノン、オルサラジン、アヘン、オキサセプロール、オキサメタシン、オキサプロジン、オキシコドン、オキシモルホン、オキシフェンブタゾン、パパベレタム、パラメタゾン、パラニリン、パルサルミド、ペンタゾシン、ペリソキサール、フェナセチン、フェナドキソン、フェナゾシン、塩酸フェナゾピリジン、フェノコール、フェノペリジン、フェノピラゾン、フェノモルファン、アセチルサリチル酸フェニル、フェニルブタゾン、サリチル酸フェニル、フェニラミドール、ピケトプロフェン、ピミノジン、ピペブゾン、ピペリロン、ピラゾラク、ピリトラミド、ピロキシカム、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニバール、プレドニリデン、プログルメタシン、プロヘプタジン、プロメドール、プロパセタモール、プロペリジン、プロピラム、プロポキシフェン、プロピフェナゾン、プロカゾン、プロチジン酸、プロキサゾール、ラミフェナゾン、レミフェンタニル、メチル硫酸リマゾリウム、サラセタミド、サリシン、サリチルアミド、サリチルアミドo−酢酸、サリチル酸、サリチル硫酸、サルサレート、サルベリン、シメトリド、スフェンタニル、スルファサラジン、スリンダク、超酸化物ジスムターゼ、スプロフェン、スキシブゾン、タルニフルメート、テニダップ、テノキシカム、テロフェナメート、テトランドリン、チアゾリノブタゾン、チアプロフェン酸、チアラミド、チリジン、チノリジン、チキソコルトール、トルフェナム酸、トルメチン、トラマドール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トロペシン、ビミノール、キセンブシン、キシモプロフェン、ザルトプロフェン、およびゾメピラックが挙げられる。
一実施形態では、本明細書に記載される化合物は、炎症を治療または予防するために、選択的COX−2阻害剤と共に投与されてもよい。例示的な選択的COX−2阻害剤としては、例えば、デラコキシブ、パレコキシブ、セレコキシブ、バルデコキシブ、ロフェコキシブ、エトリコキシブ、およびルミラコキシブが挙げられる。
いくつかの実施形態では、提供される化合物は、アントラサイクリンまたはTopo II阻害剤と組み合わせて投与される。特定の実施形態では、提供される化合物は、ドキソルビシン(Dox)と組み合わせて投与される。特定の実施形態では、提供される化合物は、ボルテゾミブ(より広義にはカーフィルゾミブを含む)と組み合わせて投与される。Doxまたはボルテゾミブと組み合わせた化合物の提供は、相乗(synergystic)効果(すなわち相加効果を上回る)をもたらすことが、驚くことに分かった。
ウイルス感染症
本明細書に記載される化合物および方法は、特にヒトおよびその他の哺乳類において、ウイルス感染症関連疾患または障害を治療または予防するのに使用してもよい。本明細書に記載される化合物は、ウイルス感染症の発生前、発生時、または発生後に投与してもよい。予防的に使用される場合、化合物は、好ましくは、あらゆるウイルス感染症またはその症状に先立って提供される。
例示的なウイルス性疾患としては、急性熱性咽頭炎、咽頭結膜熱、流行性角結膜炎、乳児胃腸炎、コクサッキー感染症、伝染性単核症、バーキットリンパ腫、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞がん、原発性HSV−1感染症(例えば小児における歯肉口内炎、成人における扁桃炎および咽頭炎、角結膜炎)、潜在性HSV−1感染症(例えば口唇ヘルペス(herpes labialis)および単純ヘルペス(cold sores)、原発性HSV−2感染症、潜在性HSV−2感染症、無菌性髄膜炎、伝染性単核症、巨細胞封入体病、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病、原発性滲出液リンパ腫、AIDS、インフルエンザ、ライ症候群、はしか、後感染性脳脊髄炎、おたふく風邪、過形成上皮病変(例えば尋常性、扁平、足底、および肛門性器疣贅、喉頭乳頭腫、疣贅状表皮発育異常症)、子宮頸がん、扁平上皮がん、クループ、肺炎、細気管支炎、感冒、灰白髄炎、狂犬病、インフルエンザ様症候群、肺炎を伴う重症細気管支炎、風疹、先天性風疹、水痘、および帯状疱疹が挙げられる。
例示的な病原性ウイルスとしては、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、デングウイルス、脳炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、肝炎Aウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス1型、単純ヘルペスウイルス2型、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス8型、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふく風邪ウイルス、ヒトパピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、西ナイルウイルス、デング(Dungee)、および黄熱病ウイルスが挙げられる。病原性ウイルスとしては、耐性ウイルス感染症を引き起こすウイルスもまた挙げられる。
抗ウイルス薬剤は、ウイルス感染症を治療するのに特異的に使用される、薬剤クラスである。抗ウイルス作用は、一般に3つの機構の内1つに分類される。ウイルスが標的細胞に侵入する能力への干渉(例えばアマンタジン、リマンタジン、およびプレコナリル)、ウイルス合成の抑制(例えばアシクロビルやジドブジン(AZT)のようなヌクレオシド類似体など)、およびウイルス放出の抑制(例えばザナミビルおよびオセルタミビル)。
眼科
本明細書に記載される化合物および方法は、眼科(ophthamology)疾患を治療しまたは予防するのに使用してもよい。例示的な眼科(ophthamology)障害としては、黄斑浮腫(糖尿病性および非糖尿病性黄斑浮腫)、加齢性湿潤および乾燥型黄斑変性、加齢性円板状黄斑変性(aged disciform macular degeneration)、嚢胞状黄斑浮腫、眼瞼浮腫、網膜浮腫、糖尿病性網膜症、脈絡網膜症、血管新生黄斑症、血管新生緑内障、ブドウ膜炎、虹彩炎、網膜血管炎、眼内炎、全眼球炎、転移性眼炎、脈絡膜炎、網膜色素上皮炎、結膜炎、毛様体炎、強膜炎、上強膜炎、視神経炎、球後視神経炎、角膜炎、眼瞼炎、滲出性網膜離脱、角膜潰瘍、結膜潰瘍、慢性貨幣状角膜炎、低酸素症または虚血に付随する眼疾患、未熟児網膜症、増殖性糖尿病性網膜症、ポリープ状脈絡膜血管症、網膜血管腫状増殖、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、コーツ病、家族性滲出性硝子体網膜症、脈なし病(高安病)、イールズ病、抗リン脂質抗体症候群、白血病性網膜症、血液過粘稠度症候群、マクログロブリン血症、インターフェロン網膜症、高血圧性網膜症、放射線網膜症、角膜上皮幹細胞不全症、および白内障が挙げられる。
本明細書に記載される化合物および方法を使用して治療可能なその他の眼科疾患としては、増殖性硝子体網膜症および慢性網膜離脱が挙げられる。
炎症性眼疾患もまた、本明細書に記載される化合物および方法を使用して治療可能である。
神経変性疾患
神経変性は、神経細胞の死をはじめとする、神経細胞の構造または機能の進行性喪失を示す、包括的用語である。パーキンソン病、アルツハイマー病、およびハンチントン病をはじめとする多数の神経変性疾患は、神経変性過程の結果として発生する。研究が進むにつれて、細胞内レベルでこれらの疾患を互いに関連付ける、多数の類似性が現れた。これらの類似性の発見は、多数の疾患を同時に改善し得る治療法の進歩に対する希望を提供する。異なる神経変性障害の間には、非定型タンパク質アセンブリーならびに誘導細胞死をはじめとする、多数の類似点がある。
アルツハイマー病は、大脳皮質および特定の皮質下の領域内における、ニューロンおよびシナプスの喪失によって特徴付けられる。この喪失は、側頭葉と頭頂葉、および前頭皮質と帯状回の一部における変性をはじめとする、罹患領域の肉眼的萎縮をもたらす。
ハンチントン病は、アストログリオーシスと、中型有棘ニューロンの喪失を引き起こす。脳の領域は、それらの構造と、それらが含有するニューロン型次第で影響を被り、累積的に細胞を喪失するに連れて、サイズが低下する。影響を受ける領域は、主に線条体中にあるが、前頭皮質および側頭皮質中にもある。線条体の視床下核は、運動を開始して調節する淡蒼球に、制御シグナルを送る。したがって視床下核からのシグナル低下は、動作の開始と調節に低下を引き起こして、疾患に特徴的な動作をもたらす。ハンチントン病の例示的な治療薬としては、テトラベナンジン、神経弛緩薬、ベンゾジアゼピン、アマンタジン、レマセミド、バルプロ酸、選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)、ミルタザピン、および抗精神病薬が挙げられる。
パーキンソン病における脳細胞が失われる機序は、損傷を受けた細胞中における、ユビキチンに結合したタンパク質α−シヌクレインの異常な蓄積からなることもある。α−シヌクレイン−ユビキチン複合体は、プロテアソーム(proteosome)に誘導され得ない。このタンパク質蓄積は、レビー小体と称されるタンパク質性細胞質封入体を形成する。疾患の病因に関する最新の研究は、α−シヌクレインによるドーパミン作動性ニューロンの死が、2つの主要な細胞内小器官である小胞体(ER)とゴルジ体の間でタンパク質を輸送する機構の欠陥に起因することを示している。Rab1のような特定のタンパク質は、動物モデルにおいて、α−シヌクレインによって引き起こされるこの欠陥を逆転させることもある。例示的なパーキンソン病療法としては、レボドパと、ブロモクリプチン、ペルゴリド、プラミペキソール、ロピニロール、ピリベジル、カベルゴリン、アポモルフィン、およびリスリドなどをはじめとするドーパミン作動薬と、ドーパ脱炭酸酵素阻害薬(dopa decarboxylate inhibitors)と、セレギリン(selegilene)およびラサギリン(rasagilene)などのMAO−B阻害剤と、抗コリン薬と、アマンタジンとが挙げられる。
筋萎縮性側索硬化(ALS/ルー・ゲーリック病)は、運動ニューロンが選択的に変性対象になる疾患である。例示的なALS療法としては、リルゾール、バクロフェン、ジアゼパム、トリヘキシフェニジル、およびアミトリプチリンが挙げられる。
その他の例示的な神経変性治療薬としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび幹細胞が挙げられる
創傷治癒
創傷は、細胞または組織損傷によって特徴付けられる病状の一種である。創傷治癒は、至適には、組織の完全性と機能の修復をもたらす動的過程である。創傷治癒過程は、3つの重複する段階からなる。第1段階は、恒常性維持、血小板凝集、および脱顆粒によって特徴付けられる炎症期である。最初の応答としての血小板は、複数の成長因子を放出して、免疫細胞、上皮細胞、および内皮細胞を動員する。炎症期は、典型的に0〜5日間にわたって起きる。創傷治癒の第2段階は、その間にマクロファージおよび顆粒球が創傷に侵入する、増殖期である。浸潤性線維芽細胞は、コラーゲンを産生し始める。この時期の原則的特徴は、上皮化、血管新生、肉芽組織形成、およびコラーゲン産生である。増殖期は、典型的に3〜14日間にわたって起きる。第3段階は、マトリックス形成が起きる再構築期である。線維芽細胞、上皮細胞、および内皮細胞は、再構築のために、コラーゲンおよびコラゲナーゼ、ならびにマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)を産生し続ける。コラーゲン架橋が生じて、創傷を収縮させる。再構築期は、典型的に7日目〜1年間にわたって起きる。
本明細書に記載される化合物および組成物は、創傷治癒を促進させる(例えば創傷閉鎖および/または創傷治癒を促進または加速させ、創傷組織および/またはその周辺の瘢痕線維症を軽減し、創傷周囲または近接細胞のアポトーシスを阻害する)ために使用し得る。したがって、特定の実施形態では、本発明は、化合物(例えばCRM1阻害剤)、またはその薬学的に許容可能な塩または組成物を対象に投与するステップを含んでなる、対象中で創傷治癒を促進する方法を提供する。方法は、創傷の完全な治癒または閉鎖を達成する必要はなく;方法は、あらゆる程度の創傷閉鎖を促進するれば十分である。この点において、方法は、負傷組織治癒のために、単独でまたはその他の方法の補助剤として用い得る。
本明細書に記載される化合物および組成物を使用して、炎症期(または初期)、創傷治癒増殖期(または中期)、および/または創傷治癒再構築期(または後期)において、創傷を治療し得る。
いくつかの実施形態では、創傷治癒を必要とする対象は、ヒトまたは、例えば、ウマ、ブタ、またはマウスのような齧歯類などの動物である。
いくつかの実施形態では、創傷治癒に有用な本明細書に記載される化合物および組成物は、例えば創傷部位に近接して局所投与され、または全身投与される。
より具体的には、本明細書に記載される化合物または組成物は、創傷を被覆することで、または、本明細書に記載される化合物または組成物で被覆または処理された、絆創膏、充填材料、縫合などを施用することで、(任意選択的にその他の薬剤と組み合わせて)創傷部位に投与し得る。したがって本明細書に記載される化合物および組成物は、表面創傷を治療する局所投与のために調合し得る。局所製剤としては、口を介した(バッカル)送達製剤、本明細書に記載される化合物または組成物を皮膚層(すなわち表皮、真皮、および/または皮下層)に接触させる皮膚送達製剤が挙げられる。局所送達系を使用して、本明細書に記載される化合物および組成物の局所製剤を投与してもよい。
代案としては、本明細書に記載される化合物および組成物は、例えば本明細書に記載される化合物または組成物を含んでなる、溶液の注射、持続放出調合物の注射、または生分解性移植片の導入によって、創傷部位またはその近くに投与し得る。
本明細書に記載される化合物および組成物を使用して、急性創傷または慢性創傷を治療し得る。慢性創傷は、正常な修復過程が中断されると生じる。慢性創傷は、無認識の持続性感染または不十分な一次処置の結果として、急性損傷から生じ得る。しかしほとんどの場合、慢性損傷は、静脈、動脈、または代謝血管疾患、褥瘡、放射線障害、または腫瘍に起因する、進行性組織破壊の終末期である。
慢性創傷では、糖尿病性潰瘍における不適当な循環、火傷や感染症などにおける顕著な壊死をはじめとする、多様な理由から治癒が起きない。これらの慢性創傷では、生存または回復期が律速段階であることが多い。細胞はもはや生存できず、したがって最初の回復期は、好ましくない創傷床環境によって延長される。
慢性創傷としては、慢性虚血性皮膚病変;強皮症潰瘍;動脈潰瘍;糖尿病性足部潰瘍;褥瘡;静脈潰瘍;非治癒性下肢創傷;炎症状態に起因する潰瘍;および/または長期にわたる創傷が挙げられるが、これに限定されるものではない。
特定の実施形態では、対象における、糖尿病性創傷治癒のために、または糖尿病または虚血に続発する下肢および足部潰瘍治癒を加速するために、本明細書に記載される化合物および組成物を使用し得る。
一実施形態では、創傷は外傷である。別の実施形態では、創傷は手術創(例えば腹部または胃腸手術創)である。さらなる実施形態では、創傷は火傷である。さらに別の実施形態では、創傷は放射線被曝の結果である。
本明細書に記載される化合物および組成物はまた、糖尿病性創傷の治癒、胃腸創傷の治癒、または例えば手術に起因する癒着の治癒のために使用し得る。
本明細書に記載される化合物および組成物を使用して、別の疾患に続発する創傷もまた回復させ得る。例えば乾癬および皮膚炎などの炎症性皮膚疾患においては、疾患に続発して、皮膚の深い亀裂によって、または皮膚を掻くことで引き起こされる、多数の皮膚病変事象がある。本明細書に記載される化合物および組成物を使用して、これらの疾患に続発する、例えば乾癬や皮膚炎のような炎症性皮膚疾患などの創傷を回復させ得る。
さらなる実施形態では、創傷は内傷である。特定の態様では、内傷は慢性創傷である。別の特定の態様では、創傷は血管創傷である。さらに別の特定の態様では、内傷は潰瘍である。
創傷の例としては、擦過傷、裂離、開放性気胸症(すなわち開放気胸)、火傷創傷、挫傷、銃創、切創、解放創、貫通創、穿孔創、穿刺創、串線創、刺創、手術創、皮下創傷、糖尿病性病変、または接線創が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書に記載される化合物および組成物によって治療し得る創傷の追加的な例としては、熱傷、化学火傷、急性病状または創傷、化学的火傷、照射火傷、過剰な紫外線照射への曝露によって引き起こされる火傷(例えば日光皮膚炎);陣痛および出産の結果としての会陰などの身体組織への損傷;会陰切開術などの医学的手技中に受けた損傷;切断、切開、表皮剥離をはじめとする、外傷誘発性損傷;事故から受けた損傷;術後の損傷、ならびに褥瘡、床擦れ、糖尿病および芳しくない循環関連の病状、および全てのタイプの座瘡などの慢性病状が挙げられる。さらに創傷としては、膿痂疹や間擦疹や毛嚢炎や湿疹などの皮膚炎、歯科手術に続く創傷;歯周病;外傷に続く創傷;および腫瘍関連創傷が挙げられる。創傷のなおもその他の例としては、動物咬創、動脈疾患、昆虫刺症と咬創、骨感染症、損傷皮膚/筋移植、壊疽、皮膚裂傷または裂創、皮膚老化、回復が遅いまたは非治癒性の手術創をはじめとする外科的切開、脳内出血、動脈瘤、皮膚無力症、および術後感染症が挙げられる。
好ましい実施形態では、創傷は、火傷、切創、開放創、手術創または手術後創、糖尿病性病変、熱傷、化学火傷、放射線火傷、褥瘡、床擦れ、および糖尿病または芳しくない循環に関連した病状からなる群から選択される。
本開示はまた、対象において創傷治癒中に瘢痕形成を軽減させる方法および組成物にも関する。本明細書に記載される化合物および組成物は、創傷および/またはその周辺で、瘢痕形成を軽減させるのに有効な量で、直接創傷に、または創傷に近接する細胞に投与し得る。
創傷としては、対象の身体のあらゆる部分に対する、あらゆる傷害が挙げられる。実施形態に従って、熱傷に罹患している対象中で、瘢痕形成を改善し、軽減させ、または低下させる方法が提供される。好ましい実施形態に従って、急性または慢性創傷または傷害に罹患している対象中で、肥大性瘢痕を治療し、出現を低減し、または発症確率を低下させる方法が提供される。
その他の障害
本明細書に記載される化合物および組成物はまた、拡張型心筋症、肥大性心筋症、拘束性心筋症、肺線維症、肝線維症、糸球体腎炎、およびその他の腎障害をはじめとする、異常な組織増殖および線維症障害を治療するのにも使用してもよい。
併用放射線療法
本明細書に記載される化合物および組成物は、放射線増感剤として有用である。したがって本明細書に記載される化合物および組成物は、放射線療法と組み合わせて投与し得る。放射線療法は、腫瘍を縮小させて、悪性細胞を殺滅するための、高エネルギー照射(例えばX線、ガンマ線、荷電粒子)の医学的使用であり、一般にがん治療法の一部として使用される。放射線療法は、それらのDNAを損傷することで悪性細胞を殺滅する。
放射線療法は、いくつかの方法で患者に送達し得る。例えば照射は、外部ビーム放射線療法におけるように、患者の身体の外部の装置などの外部線源から送達し得る。がん治療のための外部ビーム放射線療法は、典型的に、60Co、137Csなどの放射性同位体、または線形加速器などの高エネルギーX線源のいずれかである、患者の外部にある放射線源を使用する。外部線源は、患者の腫瘍部位に向けて平行ビームを生じる。外部線源放射線療法は、内部線源放射線療法の問題のいくつかを回避するが、それは腫瘍性組織と共に、放射線ビーム経路中で、望ましくなくかつ必然的に大量の非腫瘍性または健康な組織を照射する。
健康な組織を照射することの有害な影響は、ビームで腫瘍部位をカバーしながら、外部放射線ビームを多様な「ガントリー」角度で患者に投射することにより、腫瘍性組織中の所与の放射線量を保ちながら低下させ得る。放射線ビームの経路に沿った健康な組織の特定の体積要素は変化して、治療全体における健康な組織のこのような各要素に対する総線量が低下する。
健康な組織の照射はまた、放射線ビーム軸に垂直な腫瘍断面全体に対して、放射線ビームを厳密に視準することによっても低下させ得る。このような外周視準を生じる多数のシステムが存在し、そのいくつかは、任意の輪郭の放射線不透過性マスクを区分的に生じ得る複数のスライド式シャッターを利用する。
外部ビーム照射の投与のために、線量は、治療容積に対して、少なくとも隔日1回、少なくとも約1グレイ(Gy)画分であり得る。特定の実施形態では、照射は、少なくとも1日1回、少なくとも約2グレイ(Gy)画分で、治療容積に投与される。別の特定の実施形態では、照射は、週あたり連続して5日間にわたり、少なくとも1日1回、少なくとも約2グレイ(Gy)画分で治療容積に投与される。別の特定の実施形態では、照射は、隔日、週に3回、10Gy画分で治療容積に投与される。別の特定の実施形態では、少なくとも合計約20Gyが、それを必要とする患者に投与される。別の特定の実施形態では、少なくとも合計約30Gyが、それを必要とする患者に投与される。別の特定の実施形態では、少なくとも約40Gyが、それを必要とする患者に投与される。
典型的に患者は、外部ビーム治療法を週に4または5回受ける。全治療過程は、がんのタイプと治療目的に応じて、通常は、1〜7週間にわたる。例えば2Gy/日の用量を、患者に30日間にわたり投与し得る。
内部放射線療法は局在性放射線療法であり、放射線源は腫瘍部位または患部に配置される。内部放射線療法は、放射線源を、治療を要する領域の内部または隣に配置させることで送達し得る。内部放射線療法は、近接照射療法とも称される。近接照射療法としては、腔内(intercavitary)療法および間質内療法が挙げられる。腔内療法では、放射線源を収容する容器が、腫瘍に入れられまたはその近くに置かれる。放射線源は、体腔に入れられる。間質内療法では、放射線源のみが腫瘍に入れられる。これらの放射線源は、患者の中に恒久的に留まり得る。典型的に放射線源は、数日後に患者から取り出される。放射線源は、容器内にある。
放射性医薬品を投与する、いくつかの方法がある。例えば放射性医薬品は、放射性標識抗体、放射性標識ペプチド、およびリポソーム送達系などの標的化放射性複合体の標的化送達または全身性送達によって投与し得る。標的化送達の特定の一実施形態では、放射標識医薬品は放射標識抗体であり得る。例えばその内容を参照によって本明細書に援用する、Cancer Res.,2001;61:2008−2014 and Goldenber,D.M.J.Nucl.Med.,2002;43(5):693−713を参照されたい。
標的化送達の別の特定の実施形態では、放射性医薬品は、小型単層小胞、大型単層小胞、および多重膜小胞などのリポソーム送達系の形態で投与し得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどの多様なリン脂質から生成され得る。例えばその内容を参照によって本明細書に援用する、Emfietzoglou D,Kostarelos K,Sgouros G.An analytical dosimetry study for the use of radionuclide−liposome conjugates in internal radiotherapy.J Nucl Med 2001;42:499−504を参照されたい。
標的化送達のさらに別の特定の実施形態では、放射性標識医薬品は、放射性標識ペプチドであり得る。例えばその内容を参照によって本明細書に援用する、Weiner RE,Thakur ML.Radiolabeled peptides in the diagnosis and therapy of oncological diseases.Appl Radiat Isot 2002 Nov;57(5):749−63を参照されたい。
標的化送達に加えて、近接照射療法(bracytherapy)を使用して、放射性医薬品を標的部位に送達し得る。近接照射療法は、腫瘍部位の可能な限り近くに、放射線源を置く技術である。往々にして線源は、腫瘍に直接挿入される。放射線源は、ワイヤ、シードまたはロッドの形態であり得る。一般に、セシウム、イリジウムまたはヨウ素が使用される。
全身放射線療法は、別のタイプの放射線療法であり、血中の放射性物質の使用を伴う。全身放射線療法は、標的療法の一形態である。全身放射線療法では、患者は、典型的に、放射性ヨウ素などの放射性物質、またはモノクローナル抗体に結合した放射性物質を摂取し、または注射される。
本明細書で定義される「放射性医薬品」は、少なくとも1つの放射線放出性放射性同位体を含有する医薬品を指す。放射性医薬品は、慣例的に、様々な疾患の診断および/または治療ために核医学で使用される。例えば放射標識抗体などの放射標識医薬品は、放射線源の役割を果たす放射性同位体(RI)を含有する。本明細書における意図では、「放射性同位体」という用語は、金属および非金属放射性同位体を含む。放射性同位体は、放射性標識医薬品の医療用途に基づいて選択される。放射性同位体が、金属放射性同位体である場合、キレート化剤が典型的に用いられて、金属放射性同位体を分子残部に結合する。放射性同位体が非金属放射性同位体である場合、非金属放射性同位体は、典型的に、分子残部直接結合し、またはリンカーによって結合する。
本明細書の用法では,「金属放射性同位体」は、生体内または試験管内治療または診断手順で有用なあらゆる適切な金属放射性同位体である。適切な金属放射性同位体としては、アクチニウム−225、アンチモン−124、アンチモン−125、ヒ素−74、バリウム−103、バリウム−140、ベリリウム−7、ビスマス−206、ビスマス−207、ビスマス−212、ビスマス−213、カドミウム−109、カドミウム−115m、カルシウム−45、セリウム−139、セリウム−141、セリウム−144、セシウム−137、クロム−51、コバルト−55、コバルト−56、コバルト−57、コバルト−58、コバルト−60、コバルト−64、銅−60、銅−62、銅−64、銅−67、エルビウム−169、ユウロピウム−152、ガリウム−64、ガリウム−67、ガリウム−68、ガドリニウム−153、ガドリニウム−157金−195、金−199、ハフニウム−175、ハフニウム−175−181、ホルミウム−166、インジウム−110、インジウム−111、イリジウム−192、鉄55、鉄−59、クリプトン−85、鉛−203、鉛−210、ルテチウム−177、マンガン−54、水銀−197、水銀−203、モリブデン−99、ネオジム−147、ネプツニウム−237、ニッケル−63、ニオブ−95、オスミウム−185+191、パラジウム−103、パラジウム−109、白金−195m、プラセオジム−143、プロメチウム−147、プロメチウム−149、プロトアクチニウム−233、ラジウム−226、レニウム−186、レニウム−188、ルビジウム−86、ルテニウム−97、ルテニウム−103、ルテニウム−105、ルテニウム−106、サマリウム−153、スカンジウム−44、スカンジウム−46、スカンジウム−47、セレン−75、銀−110m、銀−111、ナトリウム−22、ストロンチウム−85、ストロンチウム−89、ストロンチウム−90、イオウ−35、タンタル−182、テクネチウム−99m、テルル−125、テルル−132、タリウム−204、トリウム−228、トリウム−232、タリウム−170、スズ−113、スズ−114、スズ−117m、チタン−44、タングステン−185、バナジウム−48、バナジウム−49、イッテルビウム−169、イットリウム−86、イットリウム−88、イットリウム−90、イットリウム−91、亜鉛−65、ジルコニウム−89、およびジルコニウム−95が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書の用法では,「非金属放射性同位体」は、生体内または試験管内治療または診断手順で有用なあらゆる適切な非金属放射性同位体(非金属放射性同位体)である。適切な非金属放射性同位体としては、ヨウ素−131、ヨウ素−125、ヨウ素−123、リン−32、アスタチン−211、フッ素−18、炭素−11、酸素−15、臭素−76、および窒素−13が挙げられるが、これに限定されるものではない。
放射線療法のために最も適切な同位体を同定するには、多様な要因の検討が必要である。これらとしては、腫瘍取り込みおよび保持、血液クリアランス、照射送達速度、放射性同位体半減期および比活性、および経済的な放射性同位体の大規模生産の実現可能性が挙げられる。治療用放射性医薬品の要点は、管理し難い副作用を引き起こさずに、必要な照射用量を腫瘍細胞に送達して、細胞毒性または殺腫瘍効果を達成することである。
治療用放射性同位体の物理半減期は、腫瘍部位における放射性医薬品の生物学的半減期と同様であることが好ましい。例えば放射性同位体の半減期が短かすぎる場合、崩壊の大半は、放射性医薬品が最大標的/背景比に達する前に起きる。他方、長すぎる半減期は、正常組織に対して不要な放射線量を引き起こし得る。理想的には、放射性同位体は、十分長い半減期を有して、最小線量率を達成し、細胞周期中の最も照射感受性の高い段階で、全ての細胞を照射すべきである。これに加えて放射性同位体の半減期は、製造、リリース、および輸送に十分な時間を与えるのに、十分長くなくてはならない。
腫瘍治療法において、特定用途のために放射性同位体を選択する上での、別の実用的考察は、入手可能性および品質である。放射性医薬品の放射性標識および放射化学純度には、痕跡量の不純物が影響を及ぼし得るため、純度は十分高く再現可能でなくてはならない。
腫瘍中の標的受容体部位は、典型的に数が限られている。したがって放射性同位体は、高い比活性を有することが好ましい。比活性は、主に製造法に左右される。微量金属汚染物質は、キレート化剤について、放射性同位体と往々にして競合し、またそれらの金属複合体は、受容体結合について、放射性標識キレート剤と競合するために、最小化されなくてはならない。
本発明の方法で使用するのに適した照射タイプは、変動し得る。例えば照射は、本質的に電磁または微粒子であり得る。本発明の実施において有用な電磁放射としては、X線およびガンマ線が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の実施で有用な微粒子照射としては、電子ビーム(ベータ粒子)、プロトンビーム(protons beams)、中性子ビーム、アルファ粒子、および負のパイ中間子が挙げられるが、これに限定されるものではない。照射は、従来の放射線学的治療装置および方法を使用して、および術中および定位固定法によって送達し得る。本発明の実施で使用するのに適した放射線治療に関する追加的な考察はSteven A.Leibel et al.,Textbook of Radiation Oncology(1998)(W.B.Saunders Companyによる出版)の全体を通じて記載され、特に第13章および14章に記載される。照射はまた、例えば放射性「シード」による、または標的化放射性複合体の全身性送達による、標的化送達などのその他の方法によって送達し得る。J.Padawer et al.,Combined Treatment with Radioestradiol lucanthone in Mouse C3HBA Mammary Adenocarcinoma and with Estradiol lucanthone in an Estrogen Bioassay,Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.7:347−357(1981)。その他の照射送達法も、本発明実施で使用し得る。
腫瘍療法のために、αおよびβ粒子放出体の双方が調査されている。アルファ粒子は、1または2細胞直径内に大量のエネルギーを散逸するので、特に優れた細胞毒性薬である。β粒子放出体は、エネルギーレベル次第で、比較的長い透過範囲(組織中で2〜12mm)を有する。長い透過範囲は、不均一の血流および/または受容体発現を有する固形腫瘍で、特に重要である。β粒子放出体は、それらが標的組織内で不均一に分布している場合でさえも、より均質な線量分布をもたらす。
特定の実施形態では、本明細書に記載される化合物および組成物の治療有効量を放射線療法の治療有効量と組み合わせて投与して、がん(例えば非小細胞肺がんなどの肺がん)を治療する。必要な照射量は、特定のタイプのがんのための既知の用量に基づいて、当業者によって判定され得る。例えばCancer Medicine 5th ed.,Edited by R.C.Bast et al.,July 2000,BC Deckerを参照されたい。
上の開示は、本発明について概説する。以下の特定の実施例を参照して、より完全な理解が得られ得る。これらの実施例は、例証のみを目的として記載され、本発明の範囲を制限することは意図されない。状況に応じて、または好都合であれば、形態の変更および同等物の置換が検討される。本明細書では、特定の用語が用いられているが、このような用語は記述的観念であることが意図され、制限目的ではない。
略語
aq.水性
Boc tert−ブトキシカルボニル
CHCl ジクロロメタン
DABCO 1,4−ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン
DIPEA N,N−ジイソプロピルエチルアミン
DMF N,N−ジメチルホルムアミド
DMSO ジメチルスルホキシド
eq.当量
EtOAc 酢酸エチル
EtOH エタノール
h 時間
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
LCMS 液体クロマトグラフィー質量分析
LiOH 水酸化リチウム
NMR 核磁気共鳴
RT 室温または滞留時間
T3P プロピルホスホン酸無水物
TFA トリフルオロ酢酸
THF テトラヒドロフラン
このような方法の以下の説明全体を通じて、適切な場合は、有機合成の当業者に容易に理解される様式で、様々な反応物質および中間体に、適切な保護基が付加され、引き続いてそれから除去されるものと理解される。このような保護基を使用する従来の手順、ならびに適切な保護基の例は、例えば“Protective Groups in Organic Synthesis”,T.W.Green,P.G.M.Wuts,Wiley−Interscience,New York,(1999)に記載される。化学処理による、基または置換基から別の基または置換基への変換が、最終生成物に向かう合成経路上のあらゆる中間体または最終生成物に対して実施され得ることもまた理解され、その中では、可能なタイプの変換は、変換に用いられる条件または試薬に対する、その段階で分子が有するその他の官能基の固有の不適合性によってのみ制限される。このような固有の不適合性と、それらを適切な変換および合成段階を適切な順番で実施することによって回避する方法は、有機合成の当業者には容易に理解されるであろう。変換の例は下述され、記載される変換は、それについて変換が例示される、一般的な基または置換基のみに限定されないものと理解される。その他の適切な変換に関する参考文献および説明は、“Comprehensive Organic Transformations−A Guide to Functional Group Preparations”R.C.Larock,VHC Publishers,Inc.(1989)にある。その他の適切な反応に関する参考文献および説明は、例えば、“Advanced Organic Chemistry”,March,第4版McGraw Hill(1992)、または“Organic Synthesis”,Smith,McGraw Hill,(1994)などの有機化学教科書に記載される。中間体および最終製品を精製する技術としては、例えば、カラムまたは回転板上の順相および逆相クロマトグラフィー、再結晶、蒸留、および液体−液体または固体−液体抽出が挙げられ、これらは当業者には容易に理解されるであろう。置換基および基の定義は、異なって定義される場合を除き、式Iのとおりである。「室温」および「周囲温度」という用語は、特に断りのない限り、16〜25℃の温度を意味するものとする。「還流」という用語は、特に断りのない限り、用いられた溶媒に関して、指名された溶媒の沸点以上の温度を意味するものとする。
実施例1.(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−ピバロイルアクリロヒドラジド(化合物1)の合成
化合物1は、以下のスキームに従って合成された。
3,5−ビス(トリフルオロメチル)ベンゾチオアミド(ステップ1)
2Lの3つ口丸底フラスコに、DMF(1L)中の3,5−ビス(トリフルオロメチル)ベンゾニトリル(200g)の溶液を装填した。次に溶液をNaSH(123.7g、2.0eq.)およびMgCl(186.7g、1.0eq.)で処理して、反応混合物を室温で3時間撹拌した。混合物を氷水スラリー(10L)中に注ぎ入れて、化合物をEtOAc(3×1L)で抽出した。合わせた有機層を水性飽和塩化ナトリウム溶液(3×100mL)で洗浄し、無水NaSO上で乾燥して、濾過し、減圧下で濃縮して、205gの所望の粗製3,5−ビス(トリフルオロメチル)ベンゾチオアミド(収率:90%)を得て、それをさらに精製せずに次のステップで使用した。
3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール(ステップ2)
5Lの3つ口丸底フラスコに、DMF(1.03L)中の3,5−ビス(トリフルオロメチル)ベンゾチオアミド(205.65g)の溶液を装填した。ヒドラジン水和物(73.2mL、2.0eq.)を滴下して添加し、反応混合物を室温で1時間撹拌した。HCOOH(1.03L)を滴下して添加し、反応混合物を90℃で3時間還流させた。室温に放冷後、反応混合物を飽和水性炭酸水素ナトリウム溶液(7L)中に注ぎ入れて、EtOAc(3×1L)で抽出した。合わせた有機層を水性飽和塩化ナトリウム溶液(3×500mL)で洗浄し、無水NaSO上で乾燥し、濾過して、減圧下(35℃、20mmHg)で濃縮し、180gの粗生成物をもたらした。粗製物を石油エーテル(3×500mL)と共に撹拌し、濾過して、乾燥し、淡黄色固体として得られる、160gの所望される3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾールを得た(収率:75%)。
(Z)−イソプロピル3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリレート(ステップ3)
2Lの3つ口丸底フラスコに、DMF(960mL)中の3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール(160g)の溶液を装填した。溶液をDABCO(127.74g、2eq.)で処理して、30分間撹拌した後、(Z)−3−ヨードアクリル酸イソプロピル(150.32g、1.1eq.)を滴下して添加した。1時間後、反応混合物を氷水スラリー(5L)中に注ぎ入れて、EtOAc(3×1L)で抽出した。合わせた有機層を水性飽和塩化ナトリウム溶液(3×100mL)で洗浄し、無水NaSO上で乾燥して、濾過し、減圧下(35℃、20mmHg)で濃縮して、250gの粗生成物を得て、それを酢酸エチル/n−ヘキサン勾配を使用して、カラムクロマトグラフィー(60/120シリカゲル)によって精製した(カラムはヘキサン中で充填し、所望の化合物は2%EtOAc/n−ヘキサンから溶出し始めた)。所望の化合物を含有する画分を合わせて、(Z)−イソプロピル3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリレート(138g、収率:61%)を得た。
(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(ステップ4)
5Lの3つ口丸底フラスコ内で、(Z)−イソプロピル3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリレート(130g、1.0eq.)をTHF(1.3L)中に溶解した。溶液に、水(1.3L)中のLiOH(69.3g、5.0eq.)の溶液を滴下して添加し、反応混合物を室温で4時間撹拌した後、400mLの氷水スラリーでクエンチして、希釈水性HClで酸性(pH=2〜3)にした。混合物をEtOAc(3×1L)で抽出して、合わせた有機層を水性飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、無水NaSO上で乾燥して減圧下で濃縮し、110gの(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(収率:94%)、(LCMSによるシス含量=90.0%、トランス含量=8.2%)を得た。
(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−ピバロイルアクリロヒドラジド(化合物1)
50mLの3つ口丸底フラスコ内で、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(0.2g、1.0eq.)をEtOAc(20mL)に溶解して、−60℃に冷却し、ピバロヒドラジド(0.08g、1.2eq.)を滴下して添加した。T3P(EtOAc中の50%)(0.4mL、4eq.)を滴下して添加し、DIPEA(0.4mL、4eq.)がそれに続き、反応混合物を−60℃で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下(25℃、20mmHg)で濃縮し、粗生成物を得て、それをメタノール/ジクロロメタン勾配を使用して、カラムクロマトグラフィー(60/120シリカゲル)によって精製した(カラムはジクロロメタン中で充填し、所望の化合物は3%メタノール/ジクロロメタンから溶出し始めた)。所望の化合物を含有する画分を合わせて、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−ピバロイルアクリロヒドラジド(0.11g、収率:43%)を得た。
実施例2.(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−モルホリノアセチル)アクリロヒドラジド(化合物2)の合成
2−モルホリノアセトヒドラジド
25mLの3つ口丸底フラスコ内で、メチル2−モルホリノ酢酸(0.25g、1.0eq.)を室温でエタノール(5mL)に溶解した。ヒドラジン水和物(0.087g、1.1eq.)を室温で滴下して添加して、反応混合物を95℃で20時間還流させた。反応混合物を減圧下で濃縮し(40℃、20mmHg)、粗製2−モルホリノアセトヒドラジド(0.23g)を得て、それをさらに精製せずに次のステップで使用した。
(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−モルホリノアセチル)アクリロヒドラジド(化合物2)
50mLの3つ口丸底フラスコ内で、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(実施例1、ステップ4;0.5g、1.0eq.)をCHCl:EtOAc(20mL、2:1)に溶解して、−60℃に冷却し、2−モルホリノアセトヒドラジド(0.23g、1.0eq.)を滴下して添加した。T3P(EtOAc中の50%)(1.27mL、1.5eq.)を滴下して添加し、DIPEA(0.96mL、2eq.)がそれに続き、反応混合物を−60℃で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下(25℃、20mmHg)で濃縮し、粗生成物を得て、それをメタノール/ジクロロメタン勾配を使用して、カラムクロマトグラフィー(60/120シリカゲル)によって精製した(カラムはジクロロメタン中で充填し、所望の化合物は3%メタノール/ジクロロメタンから溶出し始めた)。所望の化合物を含有する画分を合わせて、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−モルホリノアセチル)アクリロヒドラジド(0.1g、収率:14%)を得た。
実施例3.(Z)−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)−5−メチル−1H−ピラゾール−4−カルボヒドラジド(化合物3)の合成
5−メチル−1H−ピラゾール−4−カルボヒドラジド
25mLの封管内で、エチル5−メチル−1H−ピラゾール−4−カルボキシレート(0.25g、1.0eq.)を室温でエタノール(5mL)に溶解した。ヒドラジン水和物(1mL、5eq.)を室温で滴下して添加し、反応混合物を120℃で20時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し(40℃、20mmHg)、粗製5−メチル−1H−ピラゾール−4−カルボヒドラジド(0.24g)を得て、それをさらに精製せずに次のステップで使用した。
(Z)−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)−5−メチル−1H−ピラゾール−4−カルボヒドラジド(化合物3)
50mLの3つ口丸底フラスコ内で、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(実施例1、ステップ4;0.5g、1.0eq.)をEtOAc:EtOH(15mL、2:1)に溶解し、−60℃に冷却して、5−メチル−1H−ピラゾール−4−カルボヒドラジド(0.24g、1.0eq.)を滴下して添加した。T3P(EtOAc中の50%)(1.69mL、1.5eq.)を滴下して添加し、DIPEA(2mL、8eq.)がそれに続き、反応混合物を−60℃で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下(25℃、20mmHg)で濃縮し、粗生成物を得て、それをメタノール/ジクロロメタン勾配を使用して、カラムクロマトグラフィー(60/120シリカゲル)によって精製した(カラムはジクロロメタン中で充填し、所望の化合物は3%メタノール/ジクロロメタンから溶出し始めた)。所望の化合物を含有する画分を合わせて、(Z)−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)−5−メチル−1H−ピラゾール−4−カルボヒドラジド(0.2g、収率:42%)を得た。
実施例4.(Z)−2−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)−N−シクロプロピルヒドラジンカルボチオアミド(化合物4)の合成
50mLの3つ口丸底フラスコ内で、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(実施例1、ステップ4;0.5g、1.0eq.)をEtOAc:EtOH(15mL、2:1)に溶解し、−60℃に冷却して、N−シクロプロピルヒドラジンカルボチオアミド(0.22g、1.2eq.)を滴下して添加した。T3P(EtOAc中の50%)(1.69mL、2eq.)を滴下して添加し、DIPEA(1mL、4eq.)がそれに続き、反応混合物を−60℃で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下(25℃、20mmHg)で濃縮し、粗生成物を得て、それをメタノール/ジクロロメタン勾配を使用して、カラムクロマトグラフィー(60/120シリカゲル)によって精製した(カラムはジクロロメタン中で充填し、所望の化合物は3%メタノール/ジクロロメタンから溶出し始めた)。所望の化合物を含有する画分を合わせて、(Z)−2−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)−N−シクロプロピルヒドラジンカルボチオアミド(0.06g、収率:9%)を得た。
実施例5.(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−メチル−N’−(2−モルホリノアセチル)アクリロヒドラジド(化合物5)の合成
N−メチル−2−モルホリノアセトヒドラジド
25mLの封管内で、メチル2−モルホリノ酢酸(0.5g、1.0eq.)を室温でエタノール(5mL)に溶解した。メチルヒドラジン(0.16g、1.1eq.)を室温で滴下して添加して、反応混合物を95℃で48時間還流させた。反応混合物を減圧下で濃縮し(40℃、20mmHg)、粗製N−メチル−2−モルホリノアセトヒドラジド(0.27g)を得て、それをさらに精製せずに次のステップで使用した。
(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−メチル−N’−(2−モルホリノアセチル)アクリロヒドラジド(化合物5)
50mLの3つ口丸底フラスコ内で、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(実施例1、ステップ4;0.3g、1.0eq.)をTTHF:EtOAc(15mL、2:1)に溶解し、−60℃に冷却して、N−メチル−2−モルホリノアセトヒドラジド(0.23g、1.5eq.)を滴下して添加した。T3P(EtOAc中の50%)(1.27mL、2.5eq.)を滴下して添加し、DIPEA(0.45mL、3eq.)がそれに続き、反応混合物を−60℃で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下(25℃、20mmHg)で濃縮し、粗生成物を得て、それをメタノール/ジクロロメタン勾配を使用して、カラムクロマトグラフィー(60/120シリカゲル)によって精製した(カラムはジクロロメタン中で充填し、所望の化合物は3%メタノール/ジクロロメタンから溶出し始めた)。所望の化合物を含有する画分を合わせて、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−メチル−N’−(2−モルホリノアセチル)アクリロヒドラジド(0.052g、収率:12%)を得た。
実施例6.(Z)−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)ピペリジン−3−カルボヒドラジド(化合物6)の合成
ピペリジン−3−カルボヒドラジド
30mLの封管内で、エチルメチルピペリジン−3−カルボキシレート(1g、1.0eq.)を室温でエタノール(5mL)に溶解した。ヒドラジン水和物(1.05g、3eq.)を室温で滴下して添加し、反応混合物を120℃で20時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し(40℃、20mmHg)、粗製ピペリジン−3−カルボヒドラジド(0.8g)を得て、それをさらに精製せずに次のステップで使用した。
(Z)−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)ピペリジン−3−カルボヒドラジド(化合物6)
50mLの3つ口丸底フラスコ内で、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(実施例1、ステップ4;0.25g、1.0eq.)をTHF:EtOH(15mL、2:1)に溶解し、−60℃に冷却して、ピペリジン−3−カルボヒドラジド(0.113g、1.1eq.)を滴下して添加した。T3P(EtOAc中の50%)(1.69mL、4eq.)を滴下して添加し、DIPEA(0.25mL、2eq.)がそれに続き、反応混合物を−60℃で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下(25℃、20mmHg)で濃縮し、粗生成物を得て、それをメタノール/ジクロロメタン勾配を使用して、カラムクロマトグラフィー(60/120シリカゲル)によって精製した(カラムはジクロロメタン中で充填し、所望の化合物は3%メタノール/ジクロロメタンから溶出し始めた)。所望の化合物を含有する画分を合わせて、(Z)−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)ピペリジン−3−カルボヒドラジド(0.01g、収率:2.4%)を得た。
実施例7.(S,Z)−2−アミノ−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)−3−メチルブタンヒドラジド2,2,2−トリフルオロ酢酸(化合物7)の合成
化合物7は、以下のスキームによって合成された。
(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロヒドラジド(ステップ1)
50mLの3つ口丸底フラスコ内で、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(実施例1、ステップ4;0.5g、1.0eq.)をTHF(10mL)に溶解し、−10℃に冷却して、NMP(0.3g、2.1eq.)を添加して、反応混合物を5分間撹拌した。次にクロロギ酸イソブチル(0.465g、2.4eq.)を添加して、反応混合物を1時間撹拌した。形成した固形物を濾過して除去した。濾液を0℃に冷却し、tert−ブトキシカルボニルヒドラジド(0.21g、1.1eq.)を添加した。反応混合物が室温に暖まるまで放置して、1時間撹拌した。反応混合物を氷水スラリーに注ぎ入れ、EtOAc(3×50mL)で抽出した。合わせた有機層を水性飽和塩化ナトリウム溶液(25mL)で洗浄し、無水NaSO上で乾燥し、濾過して、減圧下(25℃、20mmHg)で濃縮し、0.5gの粗生成物をもたらした。次に粗生成物をTHF(10mL)に溶解して、TFA(2mL)を室温で滴下して添加し、反応混合物を2時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し(25℃、20mmHg)、形成された固形物をペンタンと共に摩砕して、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロヒドラジド(0.25g、収率:48.5%)を得た。
(S)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−メチルブタン酸
25mLの3つ口丸底フラスコ内で、(S)−2−アミノ−3−メチルブタン酸(0.8g、1.0eq.)を水(4mL)に溶解した。炭酸水素ナトリウム(0.63g、1.1eq.)とそれに続く二炭酸ジ−tert−ブチル(2.97g、2.0eq.)を添加して、応混合物を室温で2時間撹拌した。反応混合物をEtOAc(3×10mL)で抽出した。合わせた有機層を水性飽和塩化ナトリウム溶液(25mL)で洗浄し、無水NaSO上で乾燥して、濾過し、減圧下(25℃、20mmHg)で濃縮して、1.2gの粗生成物を得て、それをメタノール/ジクロロメタン勾配を使用して、カラムクロマトグラフィー(60/120シリカゲル)によって精製した(カラムはジクロロメタン中で充填し、所望の化合物は3%メタノール/ジクロロメタンから溶出し始めた)。所望の化合物を含有する画分を合わせて、(S)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−メチルブタン酸を得た(0.7g、収率:47.3%)。
(S,Z)−2−アミノ−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)−3−メチルブタンヒドラジド2,2,2−トリフルオロ酢酸(化合物7)
10mL丸底フラスコ内で、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロヒドラジド(0.25g、1.0eq.)をTHF(5mL)に溶解して、−60℃に冷却し、(S)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−メチルブタン酸(0.19g、1.3eq.)を滴下して添加した。T3P(EtOAc中の50%)(0.81mL、2eq.)を滴下して添加し、DIPEA(0.48mL、4eq.)がそれに続き、反応混合物を−60℃で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下(25℃、20mmHg)で濃縮し、粗生成物を得て、それをメタノール/ジクロロメタン勾配を使用して、カラムクロマトグラフィー(60/120シリカゲル)によって精製した(カラムはジクロロメタン中で充填し、所望の化合物は3%メタノール/ジクロロメタンから溶出し始めた)。所望の化合物を含有する画分を合わせて、(S,Z)−tert−ブチル(1−(2−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)ヒドラジニル)−3−メチル−1−オキソブタン−2−イル)カルバメートを得た(0.07g、収率:18%)。次に、10mL丸底フラスコ内で、(S,Z)−tert−ブチル(1−(2−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)ヒドラジニル)−3−メチル−1−オキソブタン−2−イル)カルバメートをジクロロメタン(2mL)に溶解した。TFA(0.05mL)を添加して、反応混合物を室温で5時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し(25℃、20mmHg)、粗生成物(0.01g)を得て、それを石油エーテルと共に摩砕して減圧下で乾燥させ、(S,Z)−2−アミノ−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)−3−メチルブタンヒドラジド2,2,2−トリフルオロ酢酸(0.006g、収率:2%)を得た。
実施例8.(Z)−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)ピラジン−2−カルボヒドラジド(化合物8)の合成
25mLの3つ口丸底フラスコ内で、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(実施例1、ステップ4;0.5g、1.0eq.)をジクロロメタン(5mL)に溶解し、−60℃に冷却して、ピラジン−2−カルボヒドラジド(0.216g、1.1eq.)を添加した。T3P(EtOAc中の50%)(3.39mL、4eq.)を滴下して添加し、DIPEA(0.5mL、2eq.)がそれに続き、反応混合物を−60℃で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下(25℃、20mmHg)で濃縮し、粗生成物を得て、それをメタノール/ジクロロメタン勾配を使用して、カラムクロマトグラフィー(60/120シリカゲル)によって精製した(カラムはジクロロメタン中で充填し、所望の化合物は3%メタノール/ジクロロメタンから溶出し始めた)。所望の化合物を含有する画分を合わせて、(Z)−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)ピラジン−2−カルボヒドラジド(0.13g、収率:19.4%)を得た。
実施例9.(Z)−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)−1−メチルピペリジン−4−カルボヒドラジド(化合物9)の合成
1−メチルピペリジン−4−カルボヒドラジド。25mLの封管内で、メチル1−メチルピペリジン−4−カルボキシレート(0.2g、1.0eq.)を室温でエタノール(5mL)に溶解した。ヒドラジン水和物(0.127g、2eq.)を室温で滴下して添加し、反応混合物を120℃で20時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し(40℃、20mmHg)、粗製1−メチルピペリジン−4−カルボヒドラジド(0.145g)を得て、それをさらに精製せずに次のステップで使用した。
(Z)−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)−1−メチルピペリジン−4−カルボヒドラジド(化合物9)
50mLの3つ口丸底フラスコ内で、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(0.25g、1.0eq.)をEtOAc:THF(15mL;2:1)に溶解して、−60℃に冷却し、1−メチルピペリジン−4−カルボヒドラジド(0.123g、1.1eq.)を滴下して添加した。T3P(EtOAc中の50%)(0.85mL、2eq.)を滴下して添加し、DIPEA(0.31mL、2.5eq.)がそれに続き、反応混合物を−60℃で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下(35℃、20mmHg)で濃縮し、粗生成物を得て、それをメタノール/ジクロロメタン勾配を使用して、カラムクロマトグラフィー(60/120シリカゲル)によって精製した(カラムはジクロロメタン中で充填し、所望の化合物は3%メタノール/ジクロロメタンから溶出し始めた)。所望の化合物を含有する画分を合わせて、(Z)−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)−1−メチルピペリジン−4−カルボヒドラジド(0.016g、収率:4.5%)を得た。
実施例10.(S,Z)−2−アミノ−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)−3−メチルブタンヒドラジド2,2,2−トリフルオロ酢酸(化合物10)の合成
(R)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−メチルブタン酸。25mLの3つ口丸底フラスコ内で、(R)−2−アミノ−3−メチルブタン酸(0.8g、1.0eq.)を水(4mL)に溶解した。炭酸水素ナトリウム(0.394g、1.1eq.)、とそれに続く二炭酸ジ−tert−ブチル(1.86g、2.0eq.)を添加して、反応混合物を2室温で時間撹拌した。反応混合物をEtOAc(3×10mL)で抽出した。合わせた有機層を水性飽和塩化ナトリウム溶液(25mL)で洗浄し、無水NaSO上で乾燥して濾過し、減圧下(25℃、20mmHg)で濃縮して、0.75gの粗生成物を得て、それをメタノール/ジクロロメタン勾配を使用して、カラムクロマトグラフィー(60/120シリカゲル)によって精製した(カラムはジクロロメタン中で充填し、所望の化合物は3%メタノール/ジクロロメタンから溶出し始めた)。所望の化合物を含有する画分を合わせて、(R)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−メチルブタン酸を得た(0.44g、収率:47.3%)。
(R,Z)−2−アミノ−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)−3−メチルブタンヒドラジド2,2,2−トリフルオロ酢酸(化合物10)
10mL丸底フラスコ内で、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロヒドラジド(0.05g、1.0eq.)をTHF(5mL)に溶解して、−60℃に冷却し、(R)−2−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−3−メチルブタン酸(0.038g、1.3eq.)を滴下して添加した。T3P(EtOAc中の50%)(0.16mL、2eq.)を滴下して添加し、DIPEA(0.095mL、4eq.)がそれに続き、反応混合物を−60℃で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下(25℃、20mmHg)で濃縮し、粗生成物を得て、それをメタノール/ジクロロメタン勾配を使用して、カラムクロマトグラフィー(60/120シリカゲル)によって精製した(カラムはジクロロメタン中で充填し、所望の化合物は3%メタノール/ジクロロメタンから溶出し始めた)。所望の化合物を含有する画分を合わせて、(R,Z)−tert−ブチル(1−(2−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)ヒドラジニル)−3−メチル−1−オキソブタン−2−イル)カルバメートを得た(0.017g、収率:26%)。次に、10mL丸底フラスコ内で、(R,Z)−tert−ブチル(1−(2−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)ヒドラジニル)−3−メチル−1−オキソブタン−2−イル)カルバメートをジクロロメタン(2mL)に溶解した。TFA(0.2mL)を添加して、反応混合物を室温で5時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し(25℃、20mmHg)、粗生成物(0.02g)を得て、それを石油エーテルと共に摩砕して減圧下で乾燥させ、(R,Z)−2−アミノ−N’−(3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリロイル)−3−メチルブタンヒドラジド2,2,2−トリフルオロ酢酸(0.007g、収率:35%)を得た。
実施例11.(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−(ピラジン−2−イル)アセチル)アクリロヒドラジド(化合物11)の合成
2−(ピラジン−2−イル)アセトヒドラジド
25mLの封管内で、メチル2−(ピラジン−2−イル)酢酸エステル(0.25g、1.0eq.)を室温でエタノール(5mL)に溶解した。ヒドラジン水和物(0.33g、4eq.)を室温で滴下して添加し、反応混合物を120℃で20時間加熱した。反応混合物を減圧下で濃縮し(40℃、20mmHg)、粗製2−(ピラジン−2−イル)アセトヒドラジド(0.2g)を得て、それをさらに精製せずに次のステップで使用した。
(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−(ピラジン−2−イル)アセチル)アクリロヒドラジド(化合物11)
50mLの3つ口丸底フラスコ内で、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(0.3g、1.0eq.)をEtOAc:THF(15mL;2:1)に溶解して、−60℃に冷却し、2−(ピラジン−2−イル)アセトヒドラジド(0.129g、1.1eq.)を滴下して添加した。T3P(EtOAc中の50%)(1.01mL、2eq.)を滴下して添加し、DIPEA(0.35mL、2.5eq.)がそれに続き、反応混合物を−60℃で1時間撹拌した。反応混合物を減圧下(25℃、20mmHg)で濃縮し、粗生成物を得て、それをメタノール/ジクロロメタン勾配を使用して、カラムクロマトグラフィー(60/120シリカゲル)によって精製した(カラムはジクロロメタン中で充填し、所望の化合物は3%メタノール/ジクロロメタンから溶出し始めた)。所望の化合物を含有する画分を合わせて、(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−(ピラジン−2−イル)アセチル)アクリロヒドラジド(0.025g、収率:5%)を得た。
実施例12.(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−モルホリノ−2−オキソアセチル)アクリロヒドラジド(化合物12)の合成
エチル2−モルホリノ−2−オキソ酢酸の合成:
ジエチルエーテル(5mL)中のエチル2−クロロ−2−オキソ酢酸(1.25g、9.18mmol)溶液をジエチルエーテル(20mL)中のモルホリン(1.0g、11.48mmol)溶液、およびトリエチルアミン(1.16g、11.48mmol)に0℃で滴下して添加した。反応混合物が室温になるまで放置して、2時間撹拌した。反応混合物を濾過して、濾液を減圧下で濃縮した。黄色油を25mLの氷水に移し入れて、酢酸エチル(3×20mL)で抽出した。合わせた有機層を鹹水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して1gの粗生成物を得て、それをいかなる精製もなくさらに使用した。粗収率47%。H NMR(400 MHz,CDCl)δ 4.33−4.38(q,2H),3.72−3.76(m,4H),3.65−3.68(m,2H),3.47−3.50(m,2H),1.37−1.40(t,3H).LCMS m/z 187.93[M+H],t=0.525 min.
2−モルホリノ−2−オキソアセトヒドラジドの合成:
エチル2−モルホリノ−2−オキソ酢酸(1.0g、5.34mmol)をエタノール(7mL)に溶解し、ヒドラジン水和物(0.267g、5.34mmol)を0℃で滴下して添加した。反応混合物を室温で1.5時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、0.9gの粗生成物を得て、それをさらに精製せずに次のステップで使用した。粗収率90%。H NMR(400 MHz,CDCl)δ 9.79(s,1H),4.43−4.48(m,2H),3.56−3.61(m,4H),3.40−3.48(m,4H).LCMS m/z 174.16[M+H],t=2.031 min.
(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−モルホリノ−2−オキソアセチル)アクリロヒドラジドの合成:
THF(3mL)中の(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(0.2g、0.569mmol)および2−モルホリノ−2−オキソアセトヒドラジド(0.02g、0.175mmol)の溶液を−60°Cに冷却した。TP(0.098g、0.569mmol)(0.50mL)を滴下して添加し、DIPEA(0.11g、0.854mmol)がそれに続き、−60℃で1時間撹拌した。反応混合物を25mLの氷水に移し入れ、酢酸エチル(2×25mL)で抽出した。合わせた有機層を鹹水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥して、減圧下で濃縮して0.3gの粗生成物を得て、それをクロマトグラフィー(0〜4%MeOH/CHCl)によって精製し、0.15gの(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−モルホリノ−2−オキソアセチル)アクリロヒドラジド(収率50%)を得た。H NMR(400 MHz,DMSO−d)δ 10.70−10.88(m,2H),9.56(s,1H),8.57(s,2H),8.29(s,1H),7.52−7.55(d,J=10.4 Hz,1H),6.0−6.03(d,J=10.4 Hz,1H),3.51−3.64(m,8H).LCMS m/z 507.25[M+H],t=2.012 min.
実施例13.(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−(3,5−ジメチルモルホリノ)アセチル)アクリロヒドラジド(化合物13)の合成
2,2’−アザンジイルジプロパン−1−オールの合成:
2−アミノプロパン−1−オール(5g、66.57mmol)および1−ヒドロキシプロパン−2−オン(5.77g、77.89mmol)をエタノール(115mL)に溶解し、50mgのPtOを添加した。反応混合物は、室温50psi Hの圧力で24時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して粗生成物を得て、それをさらに精製せずに次のステップで使用した。粗収率79%。H NMR(400 MHz,CDCl)δ 4.45(bs,2H),3.42−3.43(m,1H),3.16−3.22(m,4H),2.65−2.69(m,2H)0.87−0.91(m,6H):LCMS m/z 133.99[M+H],t:4.077 min.
3,5−ジメチルモルホリンの合成:
2,2’−アザンジイルジプロパン−1−オール(7g、52mmol)を濃HSO(5.3mL、99.8mmol)に室温で懸濁し、180℃で8時間加熱した。反応混合物を0℃に冷却し、60mLの水中のKOH(11.79g、21.02mmol)の溶液を滴下して添加した。反応混合物を室温で12時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液をCHCl:MeOH(85:15;5×50mL)で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥して減圧下で濃縮し、3.5gの粗生成物を得て、それをさらに精製せずに次のステップで使用した(粗収率:58%)。
エチル2−(3,5−ジメチルモルホリノ)酢酸の合成:
炭酸カリウム(0.311g、2.25mmol)とブロモ酢酸エチル(0.319g、1.91mmol)をアセトニトリル(4mL)中の3,5−ジメチルモルホリン(0.2g、1.73mmol)溶液に室温で添加した。反応混合物を60℃で12時間撹拌した。反応混合物を氷水に移し入れ、酢酸エチル(20mL×3)で抽出した。合わせた有機層を鹹水で洗浄し、無水NaSO上で乾燥して減圧下で濃縮し、粗生成物を得て、それをさらに精製せずに次のステップで使用した(粗収率:54%)。
エチル2−(3,5−ジメチルモルホリノ)アセトヒドラジドの合成:
エチル−2−(3,5−ジメチルモルホリノ)酢酸(0.19g、0.944mmol)をエタノール(4mL)に溶解し、dヒドラジン水和物(0.047g、0.944mmol)を滴下して添加した。反応混合物を80℃で20時間撹拌し、反応混合物を減圧下で濃縮して粗生成物を得て、それをさらに精製せずに引き続くステップで使用した。粗収率97%。H NMR(400 MHz,DMSO−d)δ 8.95(s,2H),8.84(s,1H),3.60−3.63(m,2H),3.25−3.29(m,2H),3.14(s,2H),3.05(s,2H),0.86−0.88(m,6H):LCMS m/z 188.12[M+H],t 4.716 min.
(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−(3,5−ジメチルモルホリノ)アセチル)アクリロヒドラジドの合成:
THF(10mL)中の(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(0.2g、0.569mmol)および2−(3,5−ジメチルモルホリノ)アセトヒドラジド(0.106g、0.569mmol)の溶液に、T3P(0.543g、0.854mmol)と、それに続いてDIPEA(0.110g、0.854mmol)とを−60℃で添加して、2時間撹拌した。反応混合物を25mLの氷水に移し入れて、酢酸エチル(2×25mL)で抽出し、合わせた有機層を鹹水で洗浄して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して粗生成物を得て、それをクロマトグラフィー(0〜3%MeOH/CHCl)によって精製して、0.02gの(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−(3,5−ジメチルモルホリノ)アセチル)アクリロヒドラジド(収率:7%)を得た。H NMR(400 MHz,DMSO−d)δ 10.58(s,1H),9.83(s,1H),9.56(s,1H),8.54−8.56(m,2H),8.25−8.30(m,1H),7.49−7.51(d,J=10.4 Hz,1H)),6.01−6.04(d,J=10.4 Hz,1H),3.44−3.57(m,2H),3.28−3.34(m,2H),3.21(s,1H),3.15(s,1H),2.84−2.88(m,2H),0.93−1.04(m,6H):LCMS m/z 521.18[M+H],t1.898 min.
実施例14.(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−(3−オキソモルホリノ)アセチル)アクリロヒドラジド(化合物14)の合成
エチル2−(3−オキソモルホリノ)酢酸の合成:
モルホリン−3−オン(3g、29.67mmol)をDMF(15mL、29.67mmol)に溶解して、NaH(1.78g、44.51mmol)を0℃で添加した。反応混合物を室温で30分間撹拌し、ブロモ酢酸エチル(3.76mL、32.64mmol)を滴下して添加した。反応混合物を室温で3時間さらに撹拌し、50mLの水に移し入れて、EtOAc(3×50mL)で抽出した。合わせた有機層を鹹水で洗浄し(2×50mL)、無水硫酸ナトリウム上で乾燥して、減圧下で濃縮し粗生成物を得て、それをクロマトグラフィー(0〜100%酢酸エチル/ヘキサン)によって精製し、600mgのエチル−2−(3−オキソモルホリノ)酢酸(収率:10%)を得た。LCMS m/z 187[M+H],t 2.505 min.
2−(3−オキソモルホリノ)アセトヒドラジドの合成:
エチル−2−(3−オキソモルホリノ)酢酸(600mg、3.21mmol)をエタノール(3mL)に溶解し、ヒドラジン水和物(160.46mg、3.21mmol)を室温で添加した。反応混合物を80℃で1時間加熱した。反応混合物を50mLの水に移し入れ、EtOAc(3×50mL)で抽出した。合わせた有機層を鹹水で洗浄して無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して、粗生成物を得て、それをさらに精製せずに引き続くステップで使用した(粗収率:54%)。LCMS m/z 174.05 [M+H] 2.489 min.
(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−(3−オキソモルホリノ)アセチル)アクリロヒドラジドの合成:
(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(0.400g、1.14mmol)をTHF(4mL)に溶解して、2−(3−オキソモルホリノ)アセトヒドラジド(0.295g、1.71mmol)を添加した。TP(1.09g、1.71mmol)と、それに続くDIPEA(220.80mg、1.71mmol)とを60℃で滴下して添加し、反応混合物を1時間撹拌した。反応混合物を25mLの氷水に移し入れ、EtOAc(2×25mL)で抽出した。合わせた有機層を鹹水で洗浄して無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して粗生成物を得て、クロマトグラフィー(0−4%MeOH/CHCl)によって精製し、0.05gの(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−(3−オキソモルホリノ)アセチル)アクリロヒドラジド(収率:8%)を得た。H NMR(400 MHz,DMSO−d)δ 10.33(bs,2H),9.63(s,1H),8.57(s,2H),8.30(s,1H),7.50−7.52(d,J=8 Hz,1H)),6.01−6.03(d,J=8 Hz,1H),4.08−4.12(m,4H),3.85−3.87(m,2H),3.41−3.44(m,2H).LCMS m/z 507.13[M+H],t 1.950 min.
実施例15.(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−(3,3−ジメチルモルホリノ)アセチル)アクリロヒドラジド(化合物15)の合成
エチル2−(3,3−ジメチルモルホリノ)酢酸の合成:
3,3−ジメチルモルホリン(1g、8.68mmol)をアセトニトリル(5mL)に溶解して、炭酸カリウム(1.8g、13mmol)を添加した。反応混合物を室温で30分間撹拌し、ブロモ酢酸エチル(1.1mL、9.55mmol)を添加した。反応混合物を60℃で1時間加熱した。次に反応混合物を50mLの水に移し入れ、酢酸エチル(3×50mL)で抽出した。合わせた有機層を鹹水で洗浄して無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して、粗生成物を得て、それをさらに精製せずに次のステップで使用した(粗収率:91%)。LCMS m/z 202.9[M+H],t 2.33 min.
2−(3,3−ジメチルモルホリノ)アセトヒドラジドの合成:
タノール(3mL)中のエチル2−(3−オキソモルホリノ)酢酸(600mg、2.98mmol)の溶液に、エヒドラジン水和物(0.20mL、2.98mmol)を室温で添加した。反応混合物を80℃で1時間加熱し、室温に放冷して50mLの水に移し入れ、酢酸エチル(3×25mL)で抽出した。合わせた有機層を鹹水で洗浄して無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して、粗生成物を得て、それをさらに精製せずに引き続くステップで使用した(粗収率:28%)。LCMS m/z 188[M+H]:188 min.
(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−(3,3−ジメチルモルホリノ)アセチル)アクリロヒドラジドの合成:
THF(2.5mL)中の(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)アクリル酸(0.250g、0.7mmol)および2−(3,3−ジメチルモルホリノ)アセトヒドラジド(0.160g、0.85mmol)の溶液に、TP(0.63mL、1.06mmol)と、それに続くDIPEA(0.18mL、1.06mmol)とを−60℃で滴下して添加した。反応混合物を1時間撹拌し、25mLの氷水に移し入れ、酢酸エチル(2×25mL)で抽出した。合わせた有機層を鹹水で洗浄して無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で濃縮して粗生成物を得て、クロマトグラフィー(0〜4%MeOH/CHCl)によって精製し、0.05gの(Z)−3−(3−(3,5−ビス(トリフルオロメチル)フェニル)−1H−1,2,4−トリアゾール−1−イル)−N’−(2−(3,3−ジメチルモルホリノ)アセチル)アクリロヒドラジド(収率:13%)を得た。H NMR(400 MHz,DMSO−d6)δ 10.55(s,1H),9.81(s,1H),9.62(s,1H),8.56(s,2H),8.29(s,1H),7.49−7.51(d,J=10.4 Hz,1H)),6.01−6.03(d,J=10.4 Hz,1H),3.65−3.67(m,2H),3.30−3.34(m,2H),3.08(bs,2H),2.55−2.58(m,2H),0.96(s,6H).LCMS m/z 521.18 [M+H],tR 1.937 min.
実施例16.アッセイ
(下に示される)化合物X−1、X−2、およびX−3と共に、特定の発明の化合物を様々なアッセイで試験した。
核外搬出の阻害
発明の化合物によるCRM1媒介性核外搬出の阻害を判定した。結果は、表2に示される。CRM1タンパク質に対する化合物の阻害活性は、RevGFPアッセイで判定した。発明の化合物は、Rev−GFPアッセイにおいて<10μMのIC50で活性であり、最も好ましい化合物は、1μMのIC50値の活性を有する。
実験プロトコル:Revは、ヒト免疫不全ウイルス型1(HIV−1)からのタンパク質であり、そのC末端ドメインに核外搬出シグナル(NES)、そのN末端領域に核局在化シグナル(NLS)を含有する。Revタンパク質の核外搬出は、古典的NES/CRM1経路に依存する(Neville et al.1997、Kau et al.2003)。Revの核蓄積は、LMBなどのCRM1の特異的阻害剤で処理した細胞中で観察される(Kau et al.2003)。このアッセイでは、実験の前日に、U2OS−RevGFP細胞を384ウェル黒クリアボトムプレート上に接種する。別個の384ウェルプレート中の40μMから開始して、DMEMで化合物を1:2に連続希釈し、次に細胞上に移す。細胞を化合物と共に約1時間インキュベートした後、3.7%ホルムアルデヒドで固定して、Hoechst 33258で核染色する。細胞核中のGFP量を測定して、化合物のIC50を判定した(Kau et al.2003)。
MTT細胞増殖アッセイ
CellTiter 96(登録商標)AQueous One Solution細胞増殖アッセイ(Promega)をMM.1S、JurkatおよびHCT−116細胞で使用して、化合物の細胞毒性および細胞分裂阻害特性を試験した。アッセイは、電子結合試薬PES(フェナジンエトスルファート)の存在下における、テトラゾリウム塩、MTSの切断に基づく。MTSテトラゾリウム化合物は、細胞によって生体還元されて着色ホルマザン生成物になり、それは組織培養液に可溶性である。この変換は、恐らくは、代謝的に活性な細胞中のデヒドロゲナーゼ酵素によって生成されるNADPHまたはNADHによって、達成される。アッセイは、少量のCellTiter 96(登録商標)AQueous One溶液試薬を直接培養ウェルに添加して、1〜4時間インキュベートし、次に96ウェルプレートリーダーを用いて490nmで吸光度を読み取って実施される。吸光度は、細胞数とそれらの代謝活性が、直接相関することを明らかにした。細胞は、96ウェルプレートの各ウェル内の100μLの新鮮な培養液中に、(細胞型に応じて)5×10〜1.5×10個の細胞で接種して、付着細胞を一晩付着させた。化合物の原液を細胞培養液で希釈して、1nM〜30μMの範囲にわたる8つの濃度の各薬剤を得て、1%v/v未満のDMSOを陰性対照として使用した。72時間の処理後、96ウェルアッセイプレートの各ウェルに、20μlのCellTiter 96(登録商標)AQueous試薬を添加して、プレートを加湿5%CO雰囲気内、37℃で1〜4時間培養した。次に96ウェルプレートリーダーを使用して、各ウェルの吸光度を490nmで記録した。ほとんどの場合、アッセイは三連で実施し、結果は下に記載される最大半量阻害濃度(IC50)として提示した。化合物濃度と対比して光学濃度をプロットし、非直線回帰方程式(ExcelFit)を使用して分析し、各化合物のIC50を計算した。結果は、表2に示される。
薬物動態(PK)および脳:血漿比の判定
マウス(N=3)から採血して、全部で10時点(投与前、投与後5分間、15分間、30分間、1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、および24時間)を提供した。マウスは交代制で採血され、各マウスは3つの時点における採血を提供した。指定された時点で、動物をイソフルラン下で麻酔し、眼窩後方穿刺によって、1時点あたり約110μLの血液を採取して、予冷したKEDTA(抗凝固剤)管内に入れた。血液サンプルを湿潤氷上にのせて、試料採取の30分以内に、遠心分離(2000g、4℃で5分間)して血漿を得た。全てのサンプルは、分析まで約−80℃で冷凍保存した。分析に先だって、サンプルをアセトニトリル中の内標準(デキサメタゾン)と混合してボルテックスし、遠心分離して上清を分析のために注入した。血漿中の化合物濃度は、LC−MS−MS計測手段を使用して測定した(API 4000、エレクトロスプレーイオン化によるトリプル四重極;Acuity Ultra Performance Liquid ChromatographyカラムC18、有機溶媒としてMeOHおよびギ酸)。WinNonlin Professional 6.2ソフトウェアパッケージ、ノンコンパートメント法薬物動態モデルNCA200を使用して、Tmax、Cmax、t1/2、AUClast、AUCinfをはじめとするが、これに限定されるものではないPKパラメータを計算した。
脳対血漿比(B:P)
別個のマウス群(N=3)に投薬し(特に断りのない限り10mg/kgの経口)、次に最大血漿濃度の時点(投与後2時間における推定Tmax)で殺処分し、最終血漿および脳を採取した。採取に続いて、脳組織を冷生理食塩水で洗浄して、濾紙上で乾燥して秤量し、ドライアイスにのせて、急速凍結した。全てのサンプルは、分析まで約−80℃で冷凍保存した。分析時には、脳組織を均質化して(均質化溶液PBS、pH7.4)、アセトニトリル中の内標準(デキサメタゾン)と混合してボルテックスし、遠心分離して、LC−MS−MS手順を使用する化合物濃度の分析のために上清を注入した(API 4000、エレクトロスプレーイオン化によるトリプル四重極;Acuity Ultra Performance Liquid ChromatographyカラムC18、有機溶媒としてMeOHおよびギ酸)。血漿サンプルを(均質化段階を除いて)同一方法で処理し、作成された標準曲線に基づいて、どちらかのマトリックス中の化合物濃度を計算した。結果は、表2に示される。
化合物X−1のAUCInfは、マウスに10mg/kg経口で投与した場合、検出限界未満であった。5mg/kg静注で投与した場合、化合物X−1は、209hr・ng/mLの低いAUCInfによって示されるように、最小の曝露を示した。化合物X−1の脳対血漿比は、経口投与時におけるその無視できる脳内レベル(定量限界未満)のために、判定しなかった。
化合物X−2のAUCInfは、ラットに10mg/kg経口投与した場合、68.3hr・ng/mLと計算された。このような曝露レベルは、化合物X−3および本発明の式Iの化合物と比較して、極めて低い。しかし化合物X−2は、中程度の脳:血漿比を呈示する。低いAUCInfは、無視できない脳:血漿比と相まって、化合物X−2が、低曝露レベルにもかかわらず、BBBを通過し得ることを示唆する。出願人らは、そのAUCInfが増大すれば、化合物X−2が、顕著により高い脳:血漿比を有したであろうと考える。
化合物X−3のAUCInfは、ラットに10mg/kg経口投与した場合、12300hr・ng/mLと計算され、良好な曝露を示す。しかしX−3は、5.0という高いB:P比を実証した。
式Iの化合物は全て、高いAUCInf(>3500hr・ng/mL)と、比較的低いB:P(<2.5)とを示す。一般に、治療薬のより大きな曝露レベルは、脳透過の可能性を増大させることが多い。したがって式Iの化合物が、高いAUCInfレベルを示しながら、比較的低い脳:血漿比を示すことは、驚くべきであり意外である。
実施例17.モデル
SCIDマウス中で異種移植として増殖させたZ−138リンパ腫細胞系の腫瘍成長に対する化合物2の効果の評価
Z−138(ATCC#CRL−3001)マントル細胞リンパ腫細胞は、ATCCから得た。10%ウマ血清、1%ペニシリンおよびストレプトマイシン、および2mMのL−グルタミンを添加したIMEM培地中で、これらの細胞を培養した。細胞を1:5〜1:10の比率で希釈して、二次培養した。24匹の5〜6週齢メスCB−17 SCIDマウス(Charles River Labs系統コード236)を使用した。マウスあたり4×10個の細胞に相当する、体積0.2mLのZ−138細胞をSCIDマウスの左側腹部に接種した。
腫瘍が84.3mmの平均体積に達したら、処置を開始した。処置開始に先だって、各群の平均腫瘍体積が、77〜92mmの範囲に収まるように、腫瘍体積に基づいてマウスを8匹ずつ4群に割り当てた。表3に示されるように、ビヒクル、標準的治療薬剤/陽性対照薬剤(シクロホスファミド)または化合物2で、マウスを処置した。
動物には、Labdiet(登録商標)5001齧歯類固形飼料および滅菌水を自由摂取させた。腫瘍は、マイクロキャリパーで、2日毎に1回測定し、腫瘍体積は(長さ×幅×幅)/2として計算した。処置に起因する可能な毒性の指標として、処置群中の体重の可能な違いを評価するために、全ての動物を毎日計量した。それらの開始体重の20%を上回る体重減少がある動物は、安楽死させた。それらの開始体重の15%を上回る体重減少があるマウスは、体重減少がそれらの開始体重の5%未満に回復するまで、再処置しなかった。腫瘍体積が1500mmを超えるあらゆる動物は、安楽死させた。
投与液は、毎投薬日に、新鮮に調製した。化合物2は、69.61%の化合物2を含有して、残りはPluronic F−68およびPVP K29/32で構成される、凍結乾燥粉末として提供された。これは凍結乾燥粉末を滅菌水に溶解して調製した。シクロホスファミドは、8mg/mLで無菌注射用水に溶解した。全ての被験物質は、10mL/kg体重の容積で投与した。
処置群間の統計学的差は、棄却限界値0.05で、マン−ホイットニー順位和またはANOVA検定を使用して判定した。
図1は、腫瘍体積および腫瘍体積百分率の双方に対し、ANOVA検定を使用して成長曲線下面積を比較することで評価した際に、ビヒクルと比較して腫瘍成長に統計学的に有意な低下を示した、全ての処置群を示す。これらの処置群は、p<0.0001で有意な腫瘍成長低下を示した。15mg/kgの化合物2で処置された群でいくらかの体重減少が観察され、統計学的に有意ではあるが、ビヒクル対照と比較して、重度の体重減少は少数の動物に限定された。
経口投与された化合物2は、7.5mg/kgおよび15mg/kg投与の双方で、用量依存的な抗腫瘍効果があった。
A549小細胞肺がんモデルにおける化合物2の抗腫瘍活性
A549細胞系は、58才の白人男性の肺胞がん腫組織外植片培養に由来した。細胞は、10%ウシ胎仔血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンとを添加した、ハムF12−K組織培地中で培養した。細胞を慣例的にトリプシン処理して、1:10で継代した。処置前平均体重16.3グラムの32匹の5〜6週齢のメスCB−17SCIDマウス(Charles River Labs系統コード236)を使用した。処置開始に先だって、腫瘍体積に基づいて、マウスを8匹ずつ4群に分けた。移植当日、細胞をPBSで洗浄し、トリプシン処理して、2×10細胞/mLの密度で完全培地に再懸濁してから、等容積のマトリゲルと混合した。次に23G針を使用して、この混合物を0.1mLの容積で、マウスに皮下接種した。
表4に示されるように、ビヒクル、標準的治療薬剤/陽性対照薬剤(シスプラチン)または化合物2で、マウスを処置した。動物の体重および状態を毎日記録し、月曜日、水曜日、金曜日にマイクロキャリパーで腫瘍を測定し、腫瘍体積を(長さ×幅×幅)/2として計算した。
それらの開始体重の20%を上回る体重減少がある動物は、安楽死させた。それらの開始体重の15%を上回る体重減少があるマウスは、体重減少がそれらの開始体重の5%未満に回復するまで、再処置しなかった。腫瘍体積が1500mmを超えるあらゆる動物は、安楽死させた。
投与液は、毎投薬日に、新鮮に調製した。化合物2は、69.61%の化合物2を含有して、残りはPluronic F−68およびPVP K29/32で構成される、凍結乾燥粉末として提供された。これは凍結乾燥粉末を滅菌水に溶解して調製した。シスプラチンは、5mg/mLでDMSO中に溶解し、無菌注射用水中で1:10に希釈した。全ての被験物質は、0.1mL/g体重の容積で投与した。
処置群間の統計学的差は、棄却限界値0.05で、マン−ホイットニー順位和またはANOVA検定を使用して判定した。
試験中の腫瘍体積変化のデータは、図2に示される。ビヒクル対照群の平均腫瘍体積は、1日目の95mmから29日目の1669mmに増大した。シスプラチン処置群は、1日目に104mmの平均腫瘍体積を有し、29日目に1136mmに増大した。10mg/kg経口の化合物2で処置されたマウス(第3群)は、1日目に101mmの平均腫瘍体積を有し、それは29日目までに686mmに増大した。5mg/kg経口の化合物2で処置されたマウス(第6群)は、1日目に101mmの平均腫瘍体積を有し、それは29日目までに1231mmに増大した。
各腫瘍の平均曲線下面積(AUC)計算し、一元配置ANOVA検定を使用して群を比較することで、腫瘍体積データの追加的な分析を実施した。この分析は、ビヒクル対照群と、10mg/kgの化合物2で処置された群の間に、統計学的有意差(p=0.0005)があったことを示唆した。陽性対照群(シスプラチン)の腫瘍成長には、統計学的に有意な低下がなかったことに留意すべきである。
経口投与された化合物2は、5mg/kgおよび10mg/kg投与の双方で、用量依存的な抗腫瘍効果があった。しかしビヒクル処置群と比較して、統計的有意差を示したのは10mg/kg群のみであった。
抗コラーゲン抗体誘発性関節リウマチ(rheumatorid arthritis)(CAIA)マウスモデルにおける化合物2の評価
6〜8週齢の24匹のオスBalb/cマウスを使用した。処置開始時点における動物の重量偏差は、平均体重の±20%を超えなかった。動物は、ビヒクル、デキサメタゾンまたは化合物2が投与される3群に無作為に割り当てた。試験の0日目(試験開始日)、全てのマウスにArthritoMAbTM抗体カクテル(MD Biosciences#S1203001)の2mg静脈内注射を実施して、試験3日目のLPS(100μg/マウス)の腹腔内注射がそれに続いた。試験動物は、経口的7.5mg/kgの化合物2または4mg/kgの化合物2で;腹腔内1mg/kgデキサメタゾンで;または経口的ビヒクルで処置した。治療薬は、休薬期間が適用される場合を除いて、全ての群で、4、6、8、および10日間にわたり毎日1回投与される。動物の体重が87%未満に低下した場合、0日目体重の90%以上に体重が増えるまで動物に投薬しなかった。
試験の0、3〜8、10および12日目に、全てのマウスで関節炎発症、臨床徴候、および体重をモニターした。観察は、皮膚、毛皮、目、粘膜の変化;分泌物および排泄物(例えば下痢)の出現;および自律神経活動(例えば流涙、流涎、立毛、瞳孔サイズ、異常な呼吸パターン)を含んだ。試験0日目の関節炎誘導と試験物または対照物投与前、引き続いて試験の3〜8、10、および12日目(研究終了日)に、各動物の全ての足(左右前足、および左右後足)を関節炎誘発応答徴候について検査した。下の表5に示されるように、重症度の昇順で0〜4の尺度に従って、関節炎(A rthritis)反応を採点し記録した。ダイアルキャリパー(Kroeplin,Munich,Germany)を使用して、足の厚さもまた評価した。
動物の体重が平均して20gであるという仮説に基づいて、投与量を計算した。デキサメタゾンの原液は、100%エタノール中で調製し、使用前にPBSで適切な濃度に希釈した。ビヒクル対照群のためのビヒクルは、0.6gのプルロニックおよび0.6gのPVPを100mLの蒸留脱イオン水に溶解して調製した。MAb原液(10mg/mL)は、MD Biosciences,Division of Morwell Diagnostics GmbHから供給された。LPSをPBSで希釈して、適切な濃度にした。その注射の直前に、徹底的なボルテックスが必要であった。化合物2は、70.71%の化合物2を含有して、残りはPluronic F−68およびPVP K29/32で構成される、凍結乾燥薬剤粉末として提供された。200μLの固定容積を各マウスに投与した。
評価は、主に、関節炎採点および足の厚さ測定値の平均値に基づいた。適切な場合は、チューキー事後検定を伴うANOVAによるデータ分析を適用して、治療効果の有意性を判定した。
図3Aおよび3Bは、CAIAマウスモデル実験の結果を示す。3日目のLPS追加免疫に続いて、全ての群で、LPS−投与に伴う臨床徴候が発症した。ビヒクル処置マウスと比較して、7.5mg/kgまたは4mg/kgの化合物2で処置されたマウスは、5〜12および6〜12日目の総関節炎スコアが、それぞれ有意に低下した。デキサメタゾン処置は、ビヒクル群と比較して、6〜12日目に総関節炎スコアを有意に低下させた。ビヒクル処置マウスと比較して、7.5mg/kgまたは4mg/kgの化合物2で処置されたマウスは、5〜12日目に後肢関節炎スコアが有意に低下した。デキサメタゾン処置は、ビヒクル群と比較して、5および12日目に後足関節炎スコアを有意に低下させた。ビヒクル処置群と試験物処置群の間で、体重に有意差はなかった。
本試験の所見を考慮すると、経口的に送達された7.5mg/kgまたは4mg/kgの化合物2は、関節リウマチの抗コラーゲン抗体誘発性モデルにおいて、平均関節炎スコアの持続性の低下および足厚の低下をもって、有意な抗関節炎活性を示した。
Lewisラットにおけるコラーゲン誘発性関節炎(CIA)に対する化合物2の有効性試験
処置前体重が180〜200gの範囲である、6〜8週齢の40匹のメスLewisラット(BK)を各10匹ずつの4群(A〜D群)に無作為に分けた。B〜D群のラットは、尾の付け根近くの背中の3箇所で、0日目に500μLの乳剤(各部位毎に200μL、200μL、100μL)で、IFA中のウシCIIで皮内免疫化した。7日目にB〜D群のラットに、先の注射部位近くの皮内に、同一量の乳剤で追加免疫注射を行った。治療処置モデル(CおよびD群)では、関節炎発症後に、表6に示されるように、CIAがあるラットに、デキサメタゾンまたは化合物2を経口投与した。ラットは、毎日計量し、13%を上回る体重減少があれば、動物に休薬日を与えた。
CIA発症は、巨視的採点および足腫脹測定値によって評価した。これは、感作(7日目)後最初の5日間は毎日、そして残りの期間は週2回(月曜日と木曜日)、表7に示される各足のための臨床採点システムによって評価した。
足容積は、研究期間全体を通じて、関節炎測定と同日の体積測定法によって測定した。各後足の容積および腫脹比を測定し、以下の式を使用した。
腫脹比=(C−C)/C×100%
図4Aは経時的関節腫脹のグラフであり、陽性対照または化合物2によってモデルに従って処置された、未感作ラットおよびラットにおける、0〜4の尺度で測定された関節腫脹を示す。
4mg/mLのウシCII(10mMの酢酸中)を等容積のFAと共に乳化した。
臨床スコアを各動物毎に合計し、各群中の全動物の全平均を平均関節炎スコアとして表した。図4Bは、時間の関数としての臨床スコアのグラフであり、陽性対照または化合物2によってモデルに従って処置された、未感作ラットおよびラット臨関節炎スコアを示す。
試験の28日目には、各処置群を代表する3匹を安楽死させ、後足を採取して、4%中性緩衝ホルマリン中に貯蔵した。調製した後足の切片に、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色を施した。
対照動物の組織病理学分析は、疾患経過と一致して、軟骨糜爛およびパンヌス形成を示した。しかし化合物2で処置されたラットでは、関節表面に比較的無傷の軟骨が見られ、パンヌス形成は最小限であった。組織学的分析の結果は、図5に示される。
臨床スコア、関節腫脹、および組織学的検査データは、相関を示した。結果はまた、臨床スコア、関節腫脹、および組織学的検査に対するその効果によって示されるように、4mg/kg(MPK)の化合物2の治療有効性を示した。LewisラットにおけるCIAモデルの結果は、図4Aと4B、および図5に描写される。
メスBALB/Cマウスにおけるホルボール−12−ミリステート−13−酢酸(PMA)誘発性乾癬に対する化合物2の抗乾癬活性
体重22〜30gの6〜8週齢の24匹のメスBALB/cマウスを使用した。マウスは、各8匹ずつの4群に無作為化した。動物のグループ分けは、以下のようであった:I群(未感作;エタノール)、II群(PMA;エタノール)、III群(PMA;10μMの化合物2)、およびIV群(PMA;ベタメタゾン)。20μLのPMA(4μg/20μLのアセトン)をII群〜IV群の全ての動物の耳介上面に局所的に塗布した。PMAを左の耳に毎日塗布し、1〜9日目には右の耳に隔日(月水金)に塗布した。PMA塗布の30分後、ビヒクルまたは標準化合物(ベタメタゾン)または化合物2を異なる群の動物の耳に局所的に塗布した。1〜12日目には、異なる動物の双方の耳に、ビヒクル、標準化合物、および化合物2が毎日塗布されたことに留意されたい。
動物は、あらゆる処置関連症状について、12日間にわたり毎日観察した。基礎耳介厚は、T0時間(1日目)にデジタル式スクリューゲージを使用して、(PMA塗布前に)全ての動物で記録した。試験の持続期間全体にわたり、ビヒクル、標準化合物、または化合物2の塗布の4時間後に、デジタル式スクリューゲージを使用して耳の厚さを毎日測定し、紅斑、鱗屑、および皺のコアを記録した。耳介損傷の重症度は、表8で示される採点システムによって評価した。
動物には、実験期間全体を通じて、栄養的にバランスのとれた高圧蒸気滅菌ペレット飼料(Nutrivet Life Sciences,Pune(India))を自由摂取させ、普通の飲料水にアクセスさせた。
市販の100%DMSO(LR等級)およびエタノール(LR等級)を使用して、製剤を調製した。10mgのPMAを50.0mLのアセトンに溶解して、PMAを調製した。1.47mgの化合物2を300μLの100%DMSOに溶解して、化合物2を調製した。
実験結果は、平均±SEMとして図6A〜6Dに表される。体重、食品、および水消費量に関して、全ての処置群間に有意差はなかった。PMA塗布は、(i)左ならびに右の耳の厚さ増大(II群対未感作)、および(ii)左ならびに右の耳の疾患活動指数(DAI)の増大(II群対未感作)を示した。重要なことには、化合物2の局所塗布は、(i)左右耳介厚、および(ii)左右耳のDAIのPMA誘発性増大に顕著な低下をもたらした。この効果は、試験の6〜8日目に顕著であり、化合物2で処置されたより多くの動物が、低下した左/右耳介厚(II群の動物と比較して)とDAI(II群の動物と比較して)を有した。化合物2が媒介する、左/右耳介厚およびDAIのPMA誘発性増大の低下は、試験の進行につれて(10日目以降)減少したことに留意されたい。
マウスにおけるPMA誘導乾癬モデルでは、化合物2は、統計学的に有意な抗乾癬活性を示した。
イミキモド(IMQ)誘発性皮膚炎症/乾癬モデルにおける化合物2の抗乾癬活性(試験1)
前処置体重22〜30gの6〜8週齢の40匹のオスBALB/cマウスを使用した。BALB/cマウスは、群あたり10匹ずつの4)群に無作為化した。全動物の背側皮膚の小領域(約2×2cm)をきれいに剃毛した。I群動物は、未感作動物の役割を果たした。1〜13日目にかけて、動物の背側に31.25mgのIMQクリームを毎日局所塗布して、II〜IV群[II群(IMQ;ビヒクル)、III群(IMQ;化合物2(1μM))、およびIV群(IMQ;シクロホスファミド(10mg/kg)]で乾癬を誘発した。1〜13日目にかけて毎日、IMQ塗布の4時間後、ビヒクルまたは標準化合物(シクロホスファミド)または化合物2を適切な群に(局所的に30μL;経口的に体重に準じて)投与した。ビヒクルまたは標準化合物または化合物2の投与の2時間後、皮膚の紅斑、鱗屑、皺、および肥厚を記録して、疾患活動指数(DAI)を判定した。
動物は、あらゆる処置関連症状について、13日間にわたり毎日観察した。毎日の観察は体重、飼料摂取量、皮膚肥厚、鱗屑、皺、紅斑、鼻汁、動作、呼吸、被毛、膨隆腹、皮膚状態、毛皮、粘膜、分泌物の存在または不在、目の状態、尾の挙上、運動能、姿勢、および歩行を含んだ。表9の皮膚の項目に従って、外観観察に基づいて紅斑、鱗屑、皺、および皮膚肥厚スコアを割り当てることで、皮膚背側部の損傷重症度を評価した。
市販の100%DMSO(LR等級)、エタノール(LR等級)、シクロホスファミド(CMC)、PVP、およびプルロニックを使用して、製剤を調製した。1.47mgの化合物2を300μLの100%DMSOに溶解して、化合物2を調製した。シクロホスファミドは、500mgのCMCを100mLの蒸留水に溶解して調製した。
図7Aおよび7Bで示される実験結果は、平均±SEMとして表される。
試験持続期間中に、対照群と比較して、処置群の体重、摂食量、および水摂取量に有意差はなかった。化合物2は、IMQ誘発性疾患の症状発現を低下させた。
化合物2は、ビヒクル処置群と比較した、疾患活動指数の低下によって証明されたように、抗乾癬活性を示す。さらに化合物2は、体重、食物および水摂取量に悪影響を及ぼすことなく、この効果を引き起こした。
イミキモド(IMQ)誘発性皮膚炎症/乾癬モデルにおける化合物2の抗乾癬活性(試験2)
40匹のオスBALB/cマウス(Biological E Limited,Hyderabad(CPCSEA登録番号:36/99/CPCSEA))を各10匹からなる4群に分けた。動物をそれらの体重に基づいて無作為化した。群は、I群(未感作)、II群(IMQ;ビヒクル(PEG400およびHPBCD))、III群(IMQ;化合物2(2.5mg/kg))、およびIX群(IMQ;シクロホスファミド(10mg/kg))と命名された。
各マウスの背側の小領域を剃毛して、これらの領域が確実に同等のサイズ/面積になるようにした。1日目〜6日目にかけて、動物の背側に毎日50mgのIMQクリームを局所塗布して、II〜IV群で乾癬を誘発した。試験の1日目および2日目に、IMQの局所塗布の4時間後に、化合物2または陽性対照(シクロホスファミド)またはビヒクルを妥当な群の動物に投与した。II群およびIII群動物は、皮下注射されたのに対し、IV群動物は、経口投与されたことに留意されたい。化合物2、ビヒクル、およびシクロホスファミド処置は、2日目に終了した。これらの動物群では、毎日のIMQ処置を6日目まで継続した。7日目に、累積疾患活動指数(CDAI)に基づいて、乾癬誘発動物を各10匹からなる3群に再度無作為化した。7日目〜9日目にかけて、動物にビヒクルまたは陽性対照または化合物2を投与した。この間、動物は、IMQで処置されなかったことに留意されたい。10日目〜14日目にかけて、動物は、二者択一に、IMQ(10、12、および14日目)、またはビヒクル、陽性対照または化合物2(11、13日目)で処置された。
全ての動物は、肉眼的観察、体重および飼料および水摂取量について、16日間にわたり毎日観察した。1および2日目には、ビヒクル/陽性対照/試験化合物投与の2時間後に、紅斑、鱗屑、皺、および皮膚肥厚の採点を記録し、3〜14日目には、IMQ塗布の、または陽性対照、ビヒクルまたは化合物2投与の、4時間後に採点を記録した。動物背側に対する誘導の重症度を評価して、表10に示されるように採点した。
ビヒクルは、40mgのHPBCDを70.0mLの蒸留水に溶解して調製した。化合物2は、3.59mgを0.5%PVPおよび0.5%プルロニックに溶解して調製した。シクロホスファミドは、500mgのCMCを100mLの蒸留水に溶解して調製した。
表10で示される実験結果は、平均±SEMとして表される。データは、一元配置ANOVAを使用して評価し、事後検定はダネット検定を使用して実施した。
化合物2で処置された動物における疾患活動指数の低下率は、ビヒクル処置動物で観察されたものよりも、有意により大きいことが観察された。試験持続期間中に、対照群と比較して、処置群の体重、摂食量、および水摂取量に有意差はなかった。
得られた結果は、化合物2による処置が、食物または水摂取量に大幅に影響することなく、したがって処置群の動物体重に対するいかなる影響も示すことなく、IMQ誘発性疾患の症状発現を低下させたことを示す。
Zuckerラットにおける化合物2の効果
7ヶ月齢の21匹のオスZuckerラットを同等の体重および食品摂取量に基づいて、N=7の3群に割り当てた。対照として、同年齢のZucker痩せ型対照の追加的なN=7の群を含めた。体重および食品および水摂取量は、毎日ほぼ同じ時間(14:30〜15:30h)に評価した。処置日には、14:30〜15:30hに投薬した(消灯の約2時間前)。
Zucker肥満および痩せ型対照は、平日中毎日、経口的に、ビヒクル(10mL/kg投与容積;水中の0.5%プルロニックF68および0.5%PVP K29/32)で処置した。化合物2(1.5mg/kgおよび3mg/kg)の双方の群は、平日中毎日、経口的に処置した(10mL/kg投与容積;水中の0.5%プルロニックF68および0.5%PVP K29/32)。処置段階に先だって、4日間の基線データを収集した。処置段階は16日間にわたり、洗い出し段階の6日間もまた含まれた。
図8Aおよび8Bおよび図9は、Zuckerラットに対する化合物2の効果を示す。ベースラインでは、3つのZucker肥満群の間で、体重および毎日の食物摂取量に有意差はなかった。しかし全ての群は、Zucker痩せ型群と著しく異なった。
化合物2(1.5〜3mg/kg経口)は、Zucker対照群と比較して、16日間の処置期間にわたり、毎日の食物摂取量および体重に用量依存性の低下を生じた。化合物2処置はまた、同期間中に測定された水摂取量を有意に増大させた。3mg/kgの化合物2群とZuckerビヒクル群との間では、体重増加に有意差があった。1.5mg/kgの化合物2処置群とZuckerビヒクル群との間では、体重増加に有意差がなかった。
化合物2は、毎日の食物の用量依存性低下効果を示し、より高用量(3mg/kg)は、1.5mg/kgの用量よりも効果的であった。さらに3mg/kgの化合物2群は、とZucker対照群比較して、より低い体重増加を示した。
食餌誘発性肥満症モデルにおける化合物2の効果
2ヶ月齢のオススプラーグドーリー系ラットに高脂肪食(Research Diets Inc.、製品コードD12492、60%kcal%脂肪)を3ヶ月間与えた。一群の年齢をマッチさせたラットに、標準lab固形飼料(LabDiet 5001、約13%kcal%脂肪)を与え、これらの動物は、DIO群の対照の役割を果たした。
4ヶ月齢において、2ヶ月間の高脂肪食後に、全てのラットを同等の体重および食品摂取量に基づいて、N=7の3群に割り当てた。体重および食物および水摂取量は、毎日ほぼ同じ時間に測定した。処置日には、消灯の約2時間前に投薬した。
DIO対照群は、平日中毎日、ビヒクル(経口、10mL/kg投与容積;水中の0.5%プルロニックF68および0.5%PVP K29/32)で処置した。1.5mg/kgの化合物2群は、処置段階を通じて、平日中毎日、経口的に処置した(用量10mL/kg投与容積;水中の0.5%プルロニックF68および0.5%PVP K29/32)。3mg/kgの化合物2群(10mL/kg投与容積;水中の0.5%プルロニックF68および0.5%PVP K29/32)は、最初の1週間は毎日1回、次に2週間にわたり週2回(月曜日、水曜日)、経口的に処置した。処置の3および4週目には、3mg/kgの化合物2による週2回の処置を継続したが、投薬は月曜日と木曜日であった。
処置段階に先だって、3日間の基線データを収集した。処置段階は4週間にわたった。10日間の洗い出し段階もまた含まれた。
化合物2は、粉末形態で供給された。試験化合物は、65.89%の活性百分率を有した。活性百分率は1.437のBEWを使用して調節し、0.5%w/vのプルロニックF−68および0.5%w/vのPVP K−29−32ビヒクル溶液に溶解することで調製した。ビヒクル溶液は毎週調製した一方で、化合物2は2日毎に新鮮に調製して、+4℃で保存した。動物には、10mL/kgの容積を投与した。個々の用量は最新の体重に基づいて計算し、適切なmg/kg/日の投与量を提供した。
図10Aおよび10Bおよび図11は、食餌誘発性肥満症モデルにおける化合物2の効果を示す。ベースラインでは、3つのDIO群間で体重および毎日の食物および水摂取量に有意差はなかった。しかし全てのDIO群は、普通食群と有意差があった。特に、普通食を与えた動物は、高脂肪食を与えたラットと比較して、体重が有意により低かった。反対に、高脂肪食を与えたラットは、普通食を与えたラットと比較して、毎日有意により少ない食物および水を摂取した。
化合物2(1.5〜3mg/kg経口)は、DIO対照群と比較して、28日間の処置期間にわたり、毎日の食物摂取量および体重に用量依存性の低下を生じた。化合物2処置はまた、同期間中に測定された水摂取量を有意に増大させた。(F3,27=11.2、P<0.01)。
体重増加に対する処置の効果に関して、これは形式上、試験3日目からの体重変化百分率として評価された。処置7日目(試験10日目)および14日目(試験17日目)には、DIO対照と比較して、双方の化合物2群で体重増加に有意な低下があった。
体重、食品/水摂取量は、洗い出し段階中、毎日の測定した。化合物2群における食物摂取量は、DIO対照と同様であった。化合物2群の体重は、DIO対照よりも低いままであった。
化合物2は、毎日の食物摂取量を用量依存的に低下させる。化合物2はまた、1.5および3mg/kg用量の双方で、体重増加に影響を及ぼす。
化合物1のNrf2抗炎症性経路誘導
THP−1(ヒト急性単球性白血病細胞)細胞を使用して、炎症環境におけるNrf2経路に対する化合物1の効果を評価した。核因子(赤血球系由来2)様2(Nrf2)は、抗炎症性転写因子である。通常の状態では、Nrf2は、ユビキチン化によってNrf2を分解する、Kelch様ECH結合タンパク質1(KEAP1)によって、細胞質内に保たれる。Nrf2はまた、CRM1カーゴとして核内に移動し、細胞質に戻り得る。本試験では、Nrf2は、siRNAによるKEAP1のノックダウンによって、分解から保護される。次にKEAP1枯渇細胞をTNFαで処置して、炎症を誘導し、Nrf2経路の上方制御によって炎症を逆転させる化合物1の能力を試験した。Nrf2経路の活性化を実証するために、その2つの下流遺伝子であるNAD(P)Hデヒドロゲナーゼ[キノン]1(NQO1)およびエポキシドヒドロラーゼ1(EPHX1)の発現を、定量PCRによって定量化した。
2つの10cm培養皿(6*10細胞/皿)に、10%熱不活性化ウシ胎仔血清(Invitrogen)および2−メルカプトエタノールを添加したRPMI−1640培地(Lonza)と共に、THP−1(急性単球性白血病)細胞を0.05mMの最終濃度に播種した。リポフェクタミンRNAiMax(Invitrogen)を使用して、1つの培養皿の細胞に50nMのKEAP1 siRNA(Life Technologies、Silencer Select、siRNA ID#s18982)を形質移入する一方で、別の培養皿の細胞には、50nMの対照siRNA、Block−iT(Invitrogen)を形質移入した。形質移入細胞は、72時間置いてから、KEAP1に対するプローブを使用して、定量PCRによってKEAP1ノックダウン効率を計算した。
次に各培養皿からの細胞を、別の6ウェルプレート内の4ウェルに等分した。各プレートからのウェルの1つを1μMの化合物1で1時間、それに続いて20ng/mLのTNFαで24時間、前処理した。その他のウェルは、1μMの化合物1または20ng/mLのTNFαのいずれかで24時間処理し、またはどちらによっても処理しなかった。処置に続いて、RNA抽出キット(Qiagen)を使用して、RNAを細胞から抽出した。各処置群からのRNAサンプルを逆転写して、Nrf2およびその2つの下流遺伝子NQO1およびEPHX1に対するプローブを使用して、対応するcDNA配列にリアルタイムPCRを実施した。THP−1細胞は、KEAP1 siRNAで形質移入した。40%のノックダウン効率が達成された。KEAP1ノックダウン細胞は、1μMの化合物1または20ng/mLのTNFαのいずれかで、またはその双方で、24時間処理した。
図12Aは、未処理細胞と比較した、TNFαおよび化合物1の組み合わせで処理された細胞中における、Nrf2発現の2.5倍の増大を示す。しかしNrf2 mRNAレベルの同様の(最大で3倍)増大はまた、KEAP1ノックダウンなしに化合物1およびTNFαで処理された細胞にも見られる。KEAP1ノックダウンの有無にかかわらず、化合物1またはTNFα単独では、Nrf2発現に対するいかなる有意な効果も有さなかった。
図12Bは、KEAP1ノックダウンありまたはなしでの細胞中における、NAD(P)Hデヒドロゲナーゼ[キノン]1またはNQO1の発現を示す。図12Bは、KEAP1ノックダウンが、NQO1発現に対する効果を有したことを示す。さらにいかなる処理もしなかったサンプルは、KEAP1ノックダウン時に、そのmRNAレベルに2倍の増大を示した。化合物1とTNFαの組み合わせは、KEAP1ノックダウンのない細胞中の同じ組み合わせで見られた2倍の増大と比較して、KEAP1ノックダウンサンプルのNQO1発現に4倍の増大をもたらした。
図12Cは、化合物1および/またはTNFαによるKEAP1ノックダウン後処理ありまたはなしの細胞中における、エポキシドヒドロラーゼ1またはEPHX1のmRNAレベルを示す。図12Cは、化合物1が、TNFαの存在または不在下で、EPHX1の発現を上方制御したことを示す。化合物1およびKEAP1ノックダウンがあるサンプル中では、最大で2.5倍の誘導が観察されたことから、KEAP1ノックダウンは化合物1の効果を高める。
20ng/mLのTNFαの存在下における1μM化合物1で24時間の処理は、Nrf2シグナル伝達を上方制御した。KEAP1ノックダウンなしのそれらの発現レベルと比較して、より大きなNQO1の誘導倍数(2倍対4倍)およびEPHX1(1.5倍対2.5倍)に見られるように、KEAP1ノックダウンは、この効果を増強した。結果は、CRM1阻害が、炎症中にNrf2経路を活性化し得ることを示し、KEAP1阻害剤と組み合わされた化合物1での処理が、化合物1のみの処理よりも効果的であり得ることを示唆する。
NF−κB転写活性に対する化合物1、2、および12の効果
TNFαは、NF−κBの転写活性を誘導し得る。この転写活性は、NFκBに結合してその活性を阻害するIκBが分解されると、開始される。次に、クラスIファミリーのメンバーp50とヘテロ二量体を構成する、NF−κBタンパク質のクラスIIファミリーのメンバーRelAまたはp65が、核内に移動する。p65サブユニットは、そのC末端にトランス活性化ドメインを有し、それは炎症関連遺伝子の転写を活性化する。NF−κBと同様に、IκBもまた、細胞核内に移動し得る。分解は主に細胞質内で起きるので、IκBの核内蓄積は、タンパク質を分解から保護する。CRM1は、IκBの核外搬出に関与する。核IκBはNF−κBに結合して、NF−κBがDNA配列に結合するのを妨げるので、CRM1の阻害を通じてIκBの核外搬出を遮断することは、NF−κB活性を最小化する。
化合物をHeLa(腺がん)細胞上で試験して、NF−κB転写活性を阻害するそれらの能力を定量化した。TNFαによってHeLa細胞中でNF−κB活性を誘発し、次に化合物を添加して、誘導性NF−κB活性を阻害した。いくつかの化合物、すなわち化合物1、化合物2、および化合物12の最大半量阻害濃度(IC50)は、用量応答試験によって測定した。
HeLa細胞を12ウェルプレート内に播種して(200,000細胞/ウェル)、10%熱不活性化ウシ胎仔血清(Invitrogen)および50μg/mLペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)を添加した、Lonzaからのイーグル最小必須培地(EMEM)中で培養して、一晩放置して付着させた。細胞は、連続希釈(30μMで開始;1:3希釈)化合物で1時間前処理し、次に無血清培地中で20ng/mLのTNFα(Peprotech)に4時間曝露した。処理後、細胞をPBS(Invitrogen)で洗浄し、RIPA緩衝液(Themo Scientific)に溶解した。製造会社の説明書に従って、化学発光転写因子アッセイキット(Thermo Scientific;カタログ番号89859)によって、細胞中のNF−κBの転写活性を測定した。簡単に述べると、NF−κBビオチン化共通配列結合96ウェルプレート内で、各処理からの1.5mg/mLのRIPA溶解ホールセル抽出物を培養した。共通配列に結合した活性NF−κB転写因子は、NF−κB p65一次抗体と共に、次に二次HRP共役抗体と共に培養した。化学発光基質をウェルに添加して得られたシグナルを照度計を使用して検出した。IC50曲線の各濃度について、3回の別個の実験を分析した。XLFitモデル205を使用して、IC50曲線を計算した。
1時間の化合物の前処理と、それに続く4時間の20ng/mLのTNFα曝露後に、化合物1、化合物2および化合物12の連続希釈によって、NF−κB転写活性阻害を測定した。各濃度について3回の独立した実験を採点し、平均をここに提示する。化合物1は1.59μMのIC50値、化合物2は1.22μMのIC50値、そして化合物12は1.46μMのIC50値を有した。
試験管内培養HeLa細胞中における炎症促進性タンパク質COX−2の発現に対する化合物1の効果の評価
HeLa細胞は、10%熱不活性化ウシ胎仔血清(Invitrogen)添加EMEM培地(Lonza)と共に、6ウェル培養皿(2.5×10細胞/ウェル)に播種した。プレートのウェルの2つを10μMの化合物1で30分間前処理し、その時点で、ウェルの1つを20ng/mlTNFα(Preprotech)に1時間曝露した。その他のウェルは、20ng/mlのTNFαで1時間処理し、または何の処理もしなかった。処理に続いて、RNA抽出キット(Qiagen)を使用して、RNAを細胞から抽出した。各処理群からのRNAサンプルを逆転写して、COX−2に対するプローブ(Life Technologies)を使用して、対応するcDNA配列上で定量的リアルタイム(qRT)PCRを実施した。
HeLa細胞は、10%熱不活性化ウシ胎仔血清(Invitrogen)添加EMEM培地(Lonza)と共に、6ウェル培養皿(5×10細胞/ウェル)に播種した。プレートのウェルの2つを1μMの化合物1で30分間前処理し、その時点で、ウェルの1つを20ng/mlのTNFα(Preprotech)に24時間曝露した。その他のウェルは、20ng/mlのTNFαで24時間処理し、または何の処理もしなかった。処理に続いて、プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤(Roche)とを添加したRIPA緩衝液で溶解し、細胞からホールセル溶解産物を作成した。抗COX−2抗体(Cayman)を使用して、COX−2タンパク質の免疫ブロット検出を実施した。各サンプルについて、COX−2タンパク質のシグナル強度をβアクチン(Santa Cruz)について正規化し、任意の強度単位としてグラフをプロットした。
qRT−PCRによるmRNA分析からのデータは、図13Aに示される。処理の1時間後、TNFαは、対照と比較して、COX−2 mRNAの発現に約8倍の増大を誘導した一方で、化合物1のみでは、COX−2発現のレベルに影響を及ぼさなかった。化合物1は、COX−2 mRNA発現の増大を引き起こさなかった。
免疫ブロットによるタンパク質分析からのデータは、図13Bに示される。HeLa細胞は、未処理のままにし、または20ng/mlのTNFαまたは1μMの化合物1のいずれかで処理し、または20ng/mlのTNFαおよび1μMの化合物1で24時間で処理し、次に免疫ブロット検出によって、存在するCOX−2タンパク質の量を評価した。COX−2タンパク質は、未処理対照および化合物1処理細胞と比較して、TNFα刺激細胞中で24時間目までに増大した一方で、化合物1は、TNFαの存在下でCOX−2タンパク質の量を低下させた。COX−2タンパク質の免疫ブロットシグナル強度は、各サンプルのβ−アクチンについて正規化し、グラフで表した。
化合物1は、TNFα誘発性のCOX−2発現に影響を及ぼさないが、TNFα誘発性のCOX−2タンパク質発現の量を低下させる。
化合物1は核に向かう炎症関連CRM1カーゴに局在化する
炎症誘導因子TNFα単独で、または1〜10μMの化合物1との組み合わせで、HeLaおよびTHP−1(ヒト急性単球性白血病)細胞を4〜24時間処理し、次に免疫蛍光(IF)によって、炎症関連CRM1カーゴタンパク質IκB、Nrf2、HMGB1、FoxP3、FOXO1a、RxRα、PPARγ、およびNFκB(p65サブユニット)の核局在化について分析した。
IkB、Nrf2、RxRα、およびPPARγ局在化を検出するために、細胞を10μM化合物1と共に30分間前培養し、無血清培地中での20ng/mLのTNFαとの4時間の培養がそれに続いた。HMGB1、FoxP3、およびFoxo1Aを検出するために、細胞を1μMの化合物1と共に2時間前培養し、20ng/mLのTNFαとの24時間の培養がそれに続いた。NFκBを検出するために、細胞を1μMの化合物1と共に2時間前培養し、20ng/mLのTNFαとの24時間の培養がそれに続いた。細胞は、100%氷冷メタノール(MeOH)で固定して、0.1%ツイーン20、0.3Mグリシン、およびPBS中1%BSAで透過処理/ブロックし、あるいはPFA(PBS中の3%パラホルムアルデヒドおよび2%スクロースin)で固定して、0.1%Triton−X100およびPBS中1%BSAで透過処理/ブロックした。IκBは、Abcamからの一次ウサギモノクローナル(E130)抗体(ab32518)によって検出され;Nrf2は、Santa Cruzからの一次ウサギポリクローナル抗体(sc722)によって検出され;RxRアルファは、Santa Cruzからの一次ウサギポリクローナル抗体(sc553)によって検出され;PPARガンマは、Cell Signalingからの一次ウサギモノクローナル[E130]抗体(#2443)によって検出され;Foxo1Aは、Cell Signalingからの一次ウサギモノクローナル[C29H4]抗体(#2880)によって検出され;HMGB1は、Abcamからの一次ウサギポリクローナル(polyoclonal)抗体(ab18256)によって検出され;FoxP3は、Abcamからの一次ウサギポリクローナル抗体(ab10563)によって検出され;NFκB−p65は、Cell Signalingからの一次ウサギモノクローナル[C22B4]抗体(#4764)によって検出された。全ての染色で、ウサギ二次抗体Alexa Fluor 488(Invitrogen、A11008)を使用した。画像は、20倍の倍率で撮影した。
核内への炎症関連CRM1カーゴの閉じ込めは、炎症に対して悪影響を有し、したがってIFアッセイは、CRMI阻害剤の抗炎症効果の生物マーカーの役割を果たし得る。
IκBは、炎症促進性経路.の発現を誘導するNFκBの阻害剤である。大部分のIκB分解は細胞質中で起きるので、その核局在化は、IκBを分解から保護してそれが核NFκBに結合できるようにし、NFκBの炎症促進活性を遮断する。Nrf2は、核内で抗炎症活性の発現を誘導する、ロイシンジッパー転写因子である。HMGB1は高移動度群ボックス1因子であり、通常はクロマチンと密接に結合する。損傷を受けた細胞からの能動的分泌または受動的放出た放出に際して、HMGB1は、サイトカインとして機能し、炎症促進性応答を誘導する。核内へのHMGB1の閉じ込めは、その炎症促進効果を妨げる。FoxP3(フォークヘッドボックスP3)は、免疫抑制活性を有する調節T細胞の発達と機能において、マスター転写因子として機能する。FOXO1aは、アンギオポエチン−2などの抗炎症性遺伝子を誘導する能力のある転写因子である。したがって核局在化は、FOXO1aをリン酸化、核排除、そして引き続く分解から保護する。RxRαは、マクロファージ内でCcl6およびCcl9などのケモカインの発現を調節する、レチノイド核内受容体である。RxRαは、炎症部位への白血球動員に必須である。RxRαの核封入は、さもなければNFκBなどの炎症促進性転写因子の結合に役立つ、転写活性化補助因子の動員および枯渇をもたらす。PPARγは、核内受容体スーパーファミリーに属するリガンド活性化転写因子であり、抗炎症遺伝子の発現を調節する。
図14Aおよび14Bに示される結果は、炎症を誘導することが知られているTNFαの存在下であってさえも、上記カーゴの核局在化を実証する。結果は、化合物1が抗炎症経路を誘導して、炎症を克服する能力を示す。
ラットにおけるBCCI傷害後の認知障害に対する化合物1の効果の評価
オスSprague Dawleyラットの前頭皮質中央(MFC)に対する、両側性制御式皮質衝撃(BCCI)傷害を、皮質挫傷装置により誘導した。CCI後、あらゆる皮質表面出血は制御され、筋膜および頭皮は縫合された。偽手術されたラットは、麻酔し、定位固定装置に載せて、開頭手術を実施した。
16mg/mLのプロゲステロンを22.5%2−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンに溶解して、傷害の1時間後に、最初の注射剤を腹腔内投与(16mg/kg)した。傷害の6時間後に残りの注射剤(全て16mg/kg)を皮下投与して、傷害後5日間継続した。プロゲステロン注射は、1mL/kgの濃度で作成した。プロゲステロンは、対照として使用した。
0.2、0.4、および0.6mg/mLの化合物1をビヒクル(水中の0.6%w/vプルロニック(登録商標)F−68および0.6%w/vPVPK−29/32)に懸濁して、傷害の16時間前および傷害の2時間後に10mL/kgの濃度で経口投与し、投与を4日間継続した。同時点で、対照ラットには、化合物1のビヒクル同等物の注射剤を投与した。処置群は、表11に要約される。
モリス水迷路(MWM)試験は、視覚的手がかりを使用する。齧歯類における学習および記憶を測定する、空間進路決定課題である。対象は、数日間にわたって、隠されたプラットフォームの発見を学習する。MWM試験は、傷害の2週間後に実施される。オスSprague Dawleyラットが、タンクの南西四分円に位置するプラットフォームに到達するまで、または90秒間が経過するまで、プール内で泳がせた。プール上部に吊したビデオカメラによって、行動を追跡し、ビデオ追跡ソフトウェア(ANY−maze)を使用して、記録し分析した。
MWM検査の習得に対する、化合物1およびプロゲステロンの効果は、図15Aに示される。二元配置反復測定ANOVAは、有意な治療効果を見出した。偽傷害ラットと比較して、BCCI傷害ラットは、5日間の習得期(図15A)における、隠されたプラットフォーム発見の待ち時間の有意な増大によって示される、顕著な空間的学習障害を示した。ビヒクル処置BCCI傷害ラットと比較して、化合物1(2、4、および6mg/kg)は、隠されたプラットフォーム発見の待ち時間に用量依存性の短縮を示し、有意な効果は、傷害の17および18日後の6mg/kg、および18日後の4mg/kgで見られた。データは、化合物1が神経保護効果を有することを示唆する。
図15Cは、ビブラトーム切出し前の脳全体の定性的外観検査結果を示す、偽処置(Sham)、CCI+ビヒクル(対照)、またはCCI+化合物1(6mg/kg)を受けた、動物の脳全体の写真である。検査は、いずれのSham動物も(4匹中0匹)、内側足背皮組織の損傷を示さなかったことを示唆した。全く対照的に、4匹のCCI対照は全て、皮質のこの領域に限定される、重度の両側性傷害を示した。化合物1を投与されたCCI動物は、中等度から最小にわたる損傷を示した。特に、化合物1群中で最も重度の傷害を示す脳でも、CCI対照群の全ての脳に比べて、それほど極端でなかった。
各処置群のラットから採取された血漿中で、いくつかのサイトカインの発現レベルを測定した。サンプルは凍結して−80℃で保存した。実験当日、サンプルを解凍して4倍に希釈し、ルミネックスプラットフォーム上で、サイトカイン発現について分析した。サンプルは、Milliporeによって製造されたmultipliexキットを使用して、サイトカインGRO/KC、IFNy、IL−1B、IL−6、IL−10、IL−12p70、およびTNFaについて分析した。図15Bに示されるように、サンプル間で発現レベルに同一パターンが観察された。最大の変化は、IL−10にあった。6mg/kgの化合物1は、ビヒクル処置対照群と比較してIL−10を低下させた。
多くの場合、外傷性傷害は、二次傷害応答を引き起こす。ほとんどの場合、結果は炎症である。炎症応答は、サイトカインおよびケモカインによって駆動され、損傷組織由来生成物(損傷関連分子パターン)によって部分的に伝播する。
臓器機能が逐次漸進的に失われる、ほとんど解明されていない症候群である多臓器不全症候群(MODS)は、最も頻繁に、傷害後の遅発性死亡を引き起こし、罹患率および死亡率のかなりの割合を占める。MODSは、ある程度、炎症経路の過剰なまたは不適応な活性化に起因すると見なされる。
細胞密度の定量的測定は、ブレグマの約2〜3mm前方の抗NeuN免疫標識された小区分から収集された。CCI処置動物中の傷害部位に、または偽処置動物中の同等の領域(背側皮質)に、隣接する皮質領域内の層IV−VI周辺から対象領域(ROI)を取り出した(実験条件について盲検)。同一切片中の腹側皮質領域内で、同様の領域のROIもまた評価した。Keyence BZ−II分析器ソフトウェアの細胞計数モジュールを使用して、細胞同定を実施した。各ROIについて、細胞対灰白質(CG)面積係数を判定した。偽処置動物は、背側および腹側領域内の双方で、一様な高密度標識を示した。予測されたように、CCI対照動物は、偽処置動物と対比して、背側(偽処置との比較で−45%)および腹側(偽処置との比較で−30%)皮質領域の双方で、CG係数低下を示した(図15D)。CG係数のCCI誘発性低下は、化合物1での処置によって腹側皮質で軽減された(偽処置との比較で−3%;p=0.09)。腹側皮質中の化合物1の効果は、ビヒクル処置と対比して統計学的に有意でなかったが、この効果は、より大規模な研究では、統計的有意性を破ることが予期される。傷害部位に隣接する背側皮質領域では、化合物1の効果は検出されなかった(偽処置との比較で−32%)。化合物1で観察された、背側領域への効果と腹側領域への効果の違いは、傷害部位からの距離と逆相関する傷害程度に関連する閾値効果かもしれない。したがって背側皮質領域に対する損傷は、これらの条件下で化合物1によってレスキューするには、重症すぎた可能性がある。
免疫蛍光を実施して、いくつかの免疫応答経路に対するTBIの影響を評価し、化合物1が、これらの経路の1つまたは複数によって、その神経保護効果を仲介するかどうかを判定した。抗ラットIgGに対する免疫蛍光標識(血液脳関門(BBB)透過性の指標)、およびTNFα(神経炎症の指標)を使用して、二次傷害応答の半定量的測定を調べた。全てのマーカーは、NeuN標識アセスメントで使用された領域の300μm以内の隣接小区分の傷害部位を取り囲む皮質領域で、20倍の倍率で造影した。各標識で、標的ROIは、損傷部位(または偽処置動物の背側皮質に相当する領域)のIV−VI隣接層内で輪郭を描き、基準ROIは腹側皮質中の同一皮質層から収集した。2つのROIのそれぞれで、正規化された蛍光強度を評価した。全ての標識について、腹側皮質基準部位は群間で異ならない(p>0.5)と判定され;したがって基準値(IF)に対する標的百分率を判定した。
傷害組織のニューロン(図15Eで矢印によって表示される)中で、抗ラットIgGを発現させた。図15Eは、抗ラットIgGが、皮質組織の損傷領域のニューロフィル(neurophil)内に分布していることを示す。抗ラットIgGは、偽処置組織中には存在しない。TNFα免疫陽性細胞(図15Eで矢印によって表示される)は、対照動物において、傷害部位を取り囲む損傷組織中で明確に視認できる。これらの要素は、化合物1処置動物および偽処置動物にはほとんど存在しない。図15Eは、化合物1が、脳損傷に曝露したラットで、二次傷害応答を低下させることを示す。
コラーゲン誘発性関節炎(CIA)試験No.2
炎症生物マーカー対にする本明細書に記載される化合物の効果をさらに調査するために、第2のCIAモデルを創始した。このモデルでは、群は、A群(未感作)、B群(モデル;ビヒクル処置)、C群(毎日5mg/kgの化合物2)と命名された。BおよびC群のラットは、0日目にIFA中のウシII型コラーゲンで皮内免疫化し、7日目に追加免疫注射を実施した。化合物2は、関節炎発症(11日目)後に、CIAがあるラットに経口投与した。CIA発症は、巨視的採点および足腫脹測定値によって評価した。これは、上の表7に記載される臨床採点システムを使用して、感作(7日目)後最初の5日間にわたり毎日評価し、次に28日目まで週2回(月曜日および木曜日)評価した。さらに全ての動物群で、化合物処置の4日後(試験の15日目)、および10日後(試験の21日目−疾患のピーク)、および試験最終日(試験の28日目)に、CD45、CRP、CCL2/MCP−1、TNF−α、IL1−β、IL−6、IL−17のELISA、そしてカテプシンKおよびエラスターゼの測定を実施した。さらに試験最終日(試験の28日目)に、各群からの少数の代表的な動物に対して、踵骨の三次元マイクロ断層デンシトメトリーを実施して、足の骨侵食を定量化した。
図16Aおよび16Bは、5mg/kgの化合物2で処置されたラットが、ビヒクル処置ラットと比較して、有意に低下した関節腫脹(図16B)および臨床スコア(図16A)を有したことを示す。
図17Aおよび17Bは、5mg/kgの化合物2で処置されたラットが、ビヒクル処置ラットと比較して、有意に低下した後足の骨侵食を有したことを示す。化合物2で処置された動物の関節の状態は、未感作動物と同等であった。対照的に、ビヒクル処置動物は、後足の骨侵食に、統計学的に有意な増大を示した。
ルミネックス(登録商標)アッセイおよびELISAを使用して、炎症促進性サイトカインおよび炎症マーカーのレベルに対する、化合物2の効果を測定した。最初の免疫化の21日後に、モデル群の2匹のラットおよび化合物2処置群の2匹のラットから、試験の終わりに未感作群の2匹のラット、モデル群の3匹のラット、および化合物2処置群の3匹のラットから滑液を採取した。
図17C〜17Fは、モデル群と比較して、化合物2が、滑液サンプル中の炎症促進性サイトカインおよび炎症マーカーの生成抑制効果を示したこと示す。低下したサイトカインには、IL−1β、IL−6、およびMCP−1が含まれ、炎症マーカーはC反応性タンパク質(CRP)である。
ルミネックス(登録商標)アッセイはまた、血清中の炎症促進性サイトカインレベルを測定するのにも(meaure)使用した。血清サンプル(各ラットにつき1mLの血液)を化合物処置の4日後(15日目)、化合物処置の10日後(通常は疾患ピーク−21日目)、および試験終了日(27日目)に採取した。
図17Gは、モデル群と比較して、化合物2が血清サンプル中のIL−1β産生に対して、阻害効果を示したことを示す。
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデル
EAEモデルは、多発性硬化症などのヒトCNS脱髄性疾患研究のための認められたモデルである。メスC57B1/6JマウスのEAEマウスモデル中のMOG誘発性における、化合物1の効果を調べた。動物は、I群(ビヒクル対照)、II群(デキサメタゾン陽性対照)、およびIII群(7.5mg/kgの化合物1)と命名された、3群に分けた。図18Aに示されるスケジュールに従って、生理食塩水、デキサメタゾン、および化合物1を投与した。0日目から開始して、生理食塩水およびデキサメタゾンを毎日腹腔内(intraperitonally)投与した。11日目(疾患発症)から開始して連続3週間、月曜日、水曜日、金曜日に、7.5mg/kgの化合物1を経口投与した。疾患は、完全フロイントアジュバント(CFA)中に乳化したMOGの試験0日目の単回皮内注射と、それに続く試験0日目のそして再度試験2日目(48時間後)の百日咳毒素(PT)による腹腔内追加免疫賦活によって誘導した。
図18Bに示されるように、疾患最初の徴候は、MOG免疫化に続いて7〜9日目に気付かれ、疾患ピークの発生は、試験17日目であった。0日目から1mg/kg IPの用量で開始するデキサメタゾン処置(II群)は、ビヒクル対照(I群)と比較して、試験の8〜37日目に臨床スコアを有意に低下させた。7.5mg/kgの用量で、11日目に開始する化合物1による処置(III群)は、疾患スコアおよび重症度を有意に低下させた。これらの結果は、図18Bに示される。
この試験条件下で得られた所見を考慮すると、試験11日目に開始する、7.5mg/kg経口の用量の化合物1による処置は、疾患スコアおよび重症度を有意に低下させた。
実施例18.創傷治癒モデル
材料
マウス−C57BL/6Jマウス、オス、6〜8週齢、SPFは、Harlan Laboratories LTDから入手した。マウスは、無菌個別換気ケージ(IVC)内で飼育し、食物および水は自由摂取させた。12h/12hの明暗周期、19〜21℃の温度管理、40〜60%の湿度管理、動物室内陽圧、選択された歩哨動物で3ヶ月毎の健康報告管理が実施された。
ブタ−ブタ(suss crofa domestica)、家畜ブタ(主にランドレースX大型白色)、メス、約60Kg、4〜5ヶ月齢、Lahav Institute of Animal Research,Kibbutz Lahav,Israel。ブタは清浄な非SPF環境で飼育して、公共水道水を直接自由摂取させ、食物は、獣医の監督下で標準的な成長表の推奨に従った。
吸入用イソフルラン99.9%、ロット6027962、Abbot Laboratories Ltd,England
水−注射用水、バッチ11481012、B.Braun Melsungen AG,Germany
生理食塩水−注射用0.9%塩化ナトリウム、バッチ12224012、B.Braun Melsungen AG,Germany
DMSO−ジメチルスルホキシド、D2650、Sigma−Aldrich Inc.,U.S.
プルロニック(登録商標)F−68
PVP K−29/32
C57BLマウス皮膚創傷に対する化合物1の全身投与および局所塗布の効果の評価
マウス縦方向全層皮膚切開創傷モデルにおける、皮膚創傷治癒に対する化合物1の効果を試験した。動物は到着時に、耳標で識別し、秤量して、実験開始前に数日間、環境に順応させた。創傷形成当日にマウスを秤量し、体重差層別無作為化に従って、6匹ずつ6実験群に分けた。外科手術に先だって、マウスをイソフルランで麻酔し、動物の背中の毛を刈った。標準外科用メスの刃を使用して、動物の背中に(背骨に平行に)20mmの全層縦方向切開を実施した。創傷形成3時間後、皮膚の弾性と動物の活動のために、切開は楕円形状になった。この段階で、創傷の最も広い領域を測定して、ベースライン創傷幅を確立した。創傷治癒評価は、創傷の最も広い領域の測定によって行った。処置群は、強制経口投与または局所投与群からなった。実験中、創傷を写真記録して、形態学的分析を実施した。創傷形成8日後の実験終了時、マウスを殺処分して、創傷幅を評価し、創傷領域の生検を採取して、分析に供した。
投与液は、毎投薬日に、新鮮に調製した。強制経口投与用の化合物1は、凍結乾燥粉末として提供され、水性0.6%w/vプルロニック(登録商標)F−68および0.6%w/v PVPK−29/32溶液で戻して、0.75mg/mL貯蔵懸濁液を作成し、7.5mg/kgおよび4mg/kgの使用液を調製するために、それを引き続いて水性0.6%w/vプルロニック(登録商標)F−68および0.6%w/v PVPK−29/32で希釈した。局所塗布用の化合物1は、凍結乾燥粉末として提供され、水に10mM濃度に懸濁し、それを水でさらに希釈して、局所塗布用の最終使用濃度にした。
毎日の形態学的評価の一部として、デジタルカメラFinePix S700を使用して写真記録を実施した。図19は、創傷形成後5日目の各実験群からの典型的な創傷の写真である。黒い棒目盛は、1cmを表す。33匹のマウスで、合計33の創傷を作った。形態学的評価は、経口的または局所的投与の双方で、化合物1による処置の好ましい効果を実証した。全ての処置は、対照よりも優れた創傷治癒を誘導した。処置された創傷はサイズがより小さく、痂皮は、亀裂なしに、より軽量でより薄く均質で、創傷治癒の後期を示唆した。処置群と同日に評価された対照群創傷は、サイズがより大きいようであり、創傷の縁と中央の双方で、未治癒創傷領域(赤みを帯びたピンク色の領域として観察される)を曝露する、厚くひび割れた挽き割り痂皮で覆われていた。
形態学的分析は、前臨床動物試験の創傷治癒評価で、およびヒト創傷の臨床治療で利用される、主要なパラメータである。形態学的分析に基づいて、化合物1は有効性を示し、創傷治癒に好ましい影響を及ぼした。創傷サイズの低下とより良い痂皮形成特性による判定で、化合物1の局所塗布および全身投与の双方が、より良い創傷治癒をもたらしたことに留意されたい。
ブタ皮膚創傷への試験化合物の局所塗布の効果の評価
皮膚創傷治癒に対する試験化合物の効果は、ブタ縦方向全層皮膚切開創傷モデルで試験し得る。動物は到着時に、耳標で識別し、秤量して、実験開始前に数日間、環境に順応させる。外科手術の3日前に、順応させるためにブタを入院設備に移す。処置の12時間前に、給餌を停止する。外科手術当日、ケタミン、キシラジン、ジアゼパム、およびイソフルランを使用して、ブタを麻酔する。Oster(登録商標)毛刈り機(ブレードサイズ30)を使用して、背側胸郭(dorsum thorax)および腹部の被毛を注意深く刈り、20個の4cmの個別領域のそれぞれを2列で標識する(列あたり10個の領域)。#11外科用メスの刃を使用して、背側正中線の両側から4cmで、10対の2.5cmの全層縦方向皮膚切開を作成する。
外科手術に続いて、創傷を実験群に分けて、創傷領域および創傷縁への局所塗布によって毎日処置する。処置領域は、創傷中心から2cmの距離までの皮膚の表面からなる。投与液は、全治療容積(例えば1mLの生理食塩水または試験化合物)が組織に吸収されるまで、ピペットを使用して、各創傷に少しずつ塗布する。
創傷形成の数時間後、皮膚の弾性と動物の活動のために、切開は楕円形状になる。この段階で、創傷の最も広い領域を測定して、ベースライン創傷幅を確立する。創傷治癒評価は、創傷の最も広い領域の測定によって行う。実験中、創傷を写真記録して、形態学的分析を実施する。
実験終了時(例えば創傷形成の12日後)、麻酔薬およびKClを投与して、ブタを殺処分する。創傷形態学を評価して、創傷幅を測定し、創傷領域の生検を採取して、さらなる分析のために4%パラホルムアルデヒドを使用して固定する。固定化に続いて、例えばFinePix S700などの高解像度デジタルカメラを使用して創傷生検を写真記録し、創傷領域の生検を組織病理学分析に供する。創傷治癒の評価は、試験化合物で処置された各創傷が、背側正中線の反対側の同一解剖学的位置の対照創傷と直接比較される、対合様式で実施される。ブタの背中の異なる領域における皮膚の血管新生および血液循環の程度に伴う変動性のために、この治癒の対合評価は、処置創傷と非処置創傷の客観的評価および客観的比較の観点から、重要である。頚部近くの前面に位置する創傷は、後方背面に位置する創傷よりもはるかに良い治癒特性を示す。
投与液は、毎投薬日に、新鮮に調製する。試験化合物は凍結乾燥粉末として提供され、注射用0.9%塩化ナトリウムでさらに戻して、3mg/mLの貯蔵懸濁液を作成する。貯蔵懸濁液を注射用0.9%塩化ナトリウムでさらに希釈して、局所塗布のための3μMおよび1μMの最終濃度にする。
創傷からの漏出、出血または分泌事象がない、均質で薄く、一様に組織化した痂皮表面は、創傷治癒を示唆する。非常に不均一でひび割れた暗色の痂皮は、創傷治癒過程における、多数の滲出、漏出、および出血事象を示唆する。
ブタにおける初期創傷治癒過程に対する試験化合物の局所塗布の効果の評価
初期創傷治癒に対する試験化合物の効果は、ブタにおいて縦方向全層皮膚切開の創傷モデルで試験し得る。麻酔したブタの背中の正面部分で、#11外科用メスの刃を使用して、背側正中線の両側から4センチメートルで、5対の2.5cmの縦方向全層切開を実施する。処置後数時間以内に、縦方向切開は、楕円形創傷になる。
創傷を実験群に分けて、創傷領域(縁および創傷の近くの皮膚領域を含む)への局所塗布によって、毎日処置する。処置段階は、創傷形成に続いて24時間後に開始する。投与液は、ピペットを使用して、治療容積全体(例えば1mLの生理食塩水または試験化合物)が組織に吸収されるまで、各創傷に少しずつ塗布する。
5日目に、以下のパラメータに従って、創傷治癒の状態および形態学を評価する:出血、漏出、腫脹、炎症、膿分泌、および痂皮形成。評価は、試験化合物で処置された各創傷が、背側正中線の反対側の同一解剖学的位置の対照創傷と直接比較される、対合様式で実施される。
投与液は、毎投薬日に、新鮮に調製する。試験化合物は凍結乾燥粉末として提供され、0.9%塩化ナトリウムで戻して、3mg/mLの貯蔵懸濁液にする。最終3μM局所溶液を調製するために、この貯蔵懸濁液を0.9%塩化ナトリウムでさらに希釈する。
形態学的創傷治癒評価は、処置の5日目に実施される。腫脹を検査して、各創傷の重症度に従って採点し、軽度、中等度または重度として記録する。中等度および重度の腫脹を示す創傷は、実験群の全創傷の百分率として提示される。分泌はバイナリモードで検査され採点される:最小の分泌を示す創傷はこのパラメータについて陽性と見なされ、いかなる検出可能な分泌もない創傷は、陰性と見なされる。分泌物を示す創傷(このパラメータについて陽性)は、実験群の全創傷の百分率として提示される。痂皮は、硬く乾燥して赤味を帯びた暗黄色または褐色の構造の連続層が、創傷領域全体を被覆し、創傷床に強く付着して、したがって外部環境と損傷組織との間に連続した強力な障壁を提供する場合に、完全に形成したと見なされる。痂皮形成は、バイナリモードで検査され採点される:乾燥して強力な完全に形成された痂皮を示す創傷は、このパラメータに関して陽性と見なされ、痂皮のないまたは初期段階の痂皮がある創傷は、陰性と見なされる。完全に形成された痂皮のある創傷は、実験群あたりの全創傷の百分率として提示される。
腫脹、分泌、および痂皮形成もまた評価される。腫脹および分泌は、組織修復を遅延させ、非審美的瘢痕を誘発するかもしれない、過剰な炎症応答の一部である。
ブタ皮膚の初期創傷治癒に対する、および損傷皮膚または負傷皮膚に伴う過敏症およびひっかき行動に対する、試験化合物の局所塗布の効果の評価
皮膚創傷治癒に対する試験化合物の効果は、ブタにおける縦方向全層皮膚切開創傷モデルで試験し得る。外科手術の3日前に、順応させるためにブタを入院設備に移す。外科処置の12時間前に、給餌を停止する。外科手術当日、ケタミン、キシラジン、ジアゼパム、およびイソフルランを使用して、ブタを麻酔する。Oster(登録商標)毛刈り機(ブレードサイズ30)を使用して、背側胸郭(dorsum thorax)および腹部の被毛を刈った。10対の各4cmのセクションを標識し、#11外科用メスの刃を使用して、2.5cmの全層縦皮膚切開を背正中線の両側に作る。
外科手術に続いて、創傷を実験群に分けて、創傷領域(端、および創傷からあらゆる方向に2cmの距離までの近くの皮膚領域を含む)への局所塗布によって、毎日処置する。投与液は、ピペットを使用して、治療容積全体(例えば1mLのビヒクルまたは試験化合物)が組織に吸収されるまで、各創傷に少しずつ塗布する。
処置後数時間以内に、縦方向切開は、皮膚弾性および動物活動のために楕円形創傷になる。実験中、創傷を写真記録して、形態学的分析を実施する。創傷治癒の評価は、試験化合物で処置された各創傷が、背側正中線の反対側の同一解剖学的位置の対照創傷と直接比較される、対合様式で実施される。創傷形成に続く最初の5日間、創傷形態学および動物行動を記録する。
投与液は、毎投薬日に、新鮮に調製する。試験化合物は、凍結乾燥粉末として提供され、100%DMSOで15mMの原液濃度に溶解する。注射用水でさらなる希釈を実施して、局所塗布のための3μMおよび1μMの最終濃度にする。
毎日の形態学的評価の一部として、例えばデジタル高解像度カメラFinePix S700などを使用して、創傷の写真記録を実施する。創傷状態に加えて、炎症を起こして掻き傷がある皮膚領域を観察する。動物が創傷に到達するのが困難でほぼ不可能であるように、創傷は背側正中線近くの背面に作成されるので、通常は、ひっかき行動は、創傷に損傷を引き起こさず、または創傷治癒過程に干渉しない。
マウスにおける皮膚治癒に伴うにひっかき行動に対するPVP/プルロニック(登録商標)F−68中の化合物1および水中の化合物1の効果の評価
本明細書に記載されるマウスにおける皮膚創傷試験では、動物の行動もまた観察し、瘢痕除去の試み、不快感の徴候、および創傷領域のひっかき行動を定量化した。マウスで実施した全試験からの異常な行動、および異常なひっかき行動の提示、および疼痛の徴候を分析した。これらの試験では、PVP/プルロニック(登録商標)F−68中の化合物1、および水中の化合物1、および各ビヒクル対照を使用して、処置を実施した。
マウスにおける全ての創傷治癒実験中に、創傷近くの領域と、処置された皮膚領域で、創傷治癒に伴う治癒パラメータ、皮膚過敏症徴候、およびその他の皮膚状態のモニタリングを実施する。さらに全ての皮膚治癒モデルの処置段階において、不快感と疼痛の徴候;および創傷と皮膚のひっかきといじりすぎの徴候などの動物行動に、特別な注意を払った。処置化合物の緩和および沈静効果は、それらの創傷をいじりがちな対照動物と比較して、非常に明白であった。
マウスでは、PVP/プルロニック(登録商標)F−68中の化合物1または水中の化合物1による治療は、ビヒクル処置マウス(水中のDMSO、生理食塩水、PVP/プルロニックまたは水)と比較して、創傷のいじりすぎを低下させた。
マウスでは、創傷のいじりすぎは、通常は痂皮除去と出血、または痂皮に強く付着する創傷床に新たに形成された組織の損傷をもたらした。このような事象の大部分は、ビヒクル処置群で起きた(全実験の約20〜30%)。
皮膚状態および動物行動の概要によると、PVP/プルロニック(登録商標)F−68中の化合物1または水中の化合物1による創傷処置は、恐らく、損傷し炎症を起こした皮膚に対する、処置化合物のいくらかの緩和および沈静効果のために、マウスにおける創傷のいじりすぎを予防すると結論付け得る。
マウスにおける皮膚創傷治癒に対する試験化合物用量応答
皮膚創傷治癒に対する試験化合物の効果は、マウス縦方向全層皮膚切開創傷モデルで試験し得る。動物は到着時に、耳標で識別し、秤量して、実験開始前に数日間、環境に順応させる。創傷形成当日にマウスを秤量し、体重差層別無作為化に従って7実験群(N=6またはN=7)に分ける。ビヒクル群に水中の0.1%DMSOを投与する一方で、陽性対照群は、水性0.6%w/vプルロニック(登録商標)F−68および0.6%w/v PVPK−29/32で処置する。外科手術に先だって、マウスをイソフルランで麻酔し、動物の背中の被毛を刈る。標準外科用メスの刃を使用して、動物の背中に(背骨に平行に)20mmの全層縦方向切開を実施する。創傷形成の3時間後、皮膚の弾性と動物の活動のために、切開は楕円形状になる。この段階で、創傷の最も広い領域を測定して、ベースライン創傷幅を確立する。創傷治癒評価は、創傷の最も広い領域の測定によって行う。創傷処置は、投与液(例えば0.2mL)を創傷に直接(毎日)局所塗布することで実施する。
投与液は、毎投薬日に、新鮮に調製する。試験化合物は凍結乾燥粉末として提供され、水中の0.1%DMSOで3mg/mLの貯蔵懸濁液に戻される。貯蔵懸濁液を水中の0.1%DMSOでさらに希釈して、最終局所溶液を調製する。対照群の創傷は、水中の0.1%DMSO、または水性0.6%w/vプルロニック(登録商標)F−68および0.6%w/v PVPK−29/32溶液で局所的に処置される。
創傷形成8日後の実験終了時に、CO吸入によってマウスを殺処分し、創傷の幅を測定し、創傷領域の生検を採取して、組織学的分析に供する。4%パラホルムアルデヒドを使用して、生検を固定する。創傷領域全体の固定化に続いて、創傷の最も幅広い領域の5mmの切開を実施して、これらの標本をパラフィン包埋する。パラフィンブロックは、組織の段階的脱水およびパラフィン包埋の標準手順を使用して調製する。その後、組織学的切片を調製して、組織をヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色で染色する。H&E染色スライドを検査して、創傷治癒有効性の評価を実施する。
進行した皮膚閉鎖は、エオジン染色された健康な真皮と、創傷間隙に新たに形成された真皮縁の検査によって、8日目に評価する。顕微鏡(BX41 OlympusまたはAxiovert 25、Zeiss)の100倍の視野で、双方の真皮縁が観察された創傷は、進行した皮膚閉鎖治癒パラメータについて陽性と見なされる。進行した皮膚閉鎖がある創傷数を実験群中の全創傷の百分率として提示する。
進行した表皮閉鎖は、創傷の最も幅広い領域の組織切片を分析することで、H&E染色を使用して8日目に評価される。顕微鏡の400倍の視野で観察された、創傷間隙全体を覆う表皮連続層の存在を示す創傷、および最も進行した表皮縁の移動がある創傷は、進行した皮膚閉鎖パラメータについて陽性と見なされる。結果は、実験群あたりの総百分率として提示される。
表皮移動は、H&E染色を使用して、双方の創傷縁で濃縮ヘマトキシリン染色された新たに形成された表皮を分析することで、8日目に評価される。表皮縁は、新たに形成された表皮縁が、創傷間隙の20〜30%を被覆する場合に、移動性と見なされる。群中の移動性表皮縁を数え、表皮縁の総数(群中の創傷数の2倍)の百分率として提示する。双方の表皮縁は、完全なまたは進行した表皮閉鎖を示す創傷中で、移動性と見なされる。62匹のマウスで、合計62の創傷を作る。
試験化合物による創傷処置は、表皮過形成や癒着などの創傷治癒合併症を予防する
皮膚創傷治癒に対する試験化合物の効果は、マウス縦方向全層皮膚切開創傷モデルで試験し得る。外科手術に先だって、マウスをイソフルランで麻酔し、動物の背中の毛を刈る。外科用メスの刃を使用して、動物の背中に(背骨に平行に)20mmの全層縦方向切開を実施する。創傷形成の3時間後、皮膚の弾性と動物の活動のために、切開は楕円形状になる。創傷治癒評価は、創傷の最も広い領域の測定によって行う。例えば0.2mLの試験化合物を毎日直接創傷に局所塗布して、創傷処置を実施する。創傷ケア過程は部分的に湿潤環境であり、毎日の処置後、創傷はしばらく湿潤である。創傷形成8日後の実験終了時、マウスを殺処分して、創傷幅を評価し、創傷領域の生検を採取して、分析に供する。
投与液は、毎投薬日に、新鮮に調製する。試験化合物は凍結乾燥粉末として提供され、水中の0.1%DMSOで3mg/mLの貯蔵懸濁液に戻され、引き続いて水中の0.1%DMSOで希釈して、局所塗布の使用濃度にする。対照群の創傷は、水中の0.1%DMSO、または水性0.6%w/vプルロニック(登録商標)F−68および0.6%w/v PVPK−29/32で局所的に処置される。
創傷形成8日後の処置段階終了時、CO吸入によってマウスを殺処分し、創傷領域の生検を採取する。4%パラホルムアルデヒドを使用して、創傷組織の固定化を実施する。創傷領域全体の固定化に続いて、創傷の最も幅広い領域の5mmの切開を実施して、パラフィン包埋する。段階的脱水の標準手順を使用して、パラフィンブロックを調製する。その後、組織学的切片を調製して、組織をヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)で染色する。創傷治癒パラメータを評価してグラフ表示する。
表皮の過形成は、8日目に評価する。群中の非移動性および過形成表皮縁を数え、表皮縁の総数(群中の創傷数の2倍)の百分率として提示する。過形成表皮縁は、表皮の濃縮ヘマトキシリン染色領域を分析することで、H&E染色を使用して評価する。表皮縁が、健康な皮膚領域の正常な表皮よりも厚いように見えて、このような表皮縁が創傷間隙封鎖に向けた移動を示さない場合、それは過形成で非移動性であると見なされる。
創傷間隙の癒着は、8日目に評価される。癒着は、創傷間隙における細胞および組織構造の分析によって評価される。創傷癒着は、軽度、中等度または重度の尺度で採点される。創傷間隙に血餅がある場合、または正常肉芽組織が骨格筋または広範なリンパ組織などのその他の組織によって置き換えられている場合、負のスコアと見なされる。創傷間隙領域の40%以上を占めるいくつかの癒着または異常な顆粒化は、重症と見なされる。接着は、それが顕著でなく、正常皮膚組織再生に干渉しなければ、軽度と見なされる。重度の癒着がある創傷は、実験群あたりの全創傷の百分率として計算し、示されるようにグラフ表示される。32匹のマウスにおいて、合計32の創傷(64の表皮縁)が生成される。
最重要な創傷治癒合併症の1つは、表皮の過形成である。創傷形成に伴うストレスシグナルに対する応答として、表皮基底層中の細胞増殖が起きて皮膚喪失を代償する。常態では、平穏無事な創傷治癒では、表皮細胞は、増殖後すぐに、創傷間隙の封鎖に向けて移動を開始する。例えば糖尿病性創傷における血糖症によって引き起こされる皮膚合併症などのように、移動が起きない場合、または遅延した場合、表皮性過形成が顕著になり、創傷治癒においてさらなる合併症を引き起こすこともある。この実験で用いられるモデルのような急性解放創では、または術後の創傷などの急性縫合創傷では、表皮縁過形成に伴う表皮治癒の低下が、汚染のリスク、そして創傷裂開、創傷からの流体排出、または創傷からの組織突出などのその他の創傷治癒合併症のリスクを増大させる。
効果的な創傷治癒過程では、創傷間隙に肉芽組織を生成するために、一次血餅が漸進的変化を受け、それは再構築に続いて、最終的に、機能が完全に回復した新たに形成された皮膚組織になる。創傷間隙で非皮膚関連組織の接着が起きると、肉芽組織が適切に形成せず、その結果、最後の組織再構築が制限される。これは、治癒皮膚の機能にさらなる制限を引き起こすこともある。
生理食塩水ベースの調合物中の試験化合物による創傷処置は、創傷治癒を改善し、重度の癒着を防止する
皮膚創傷治癒に対する試験化合物の効果は、マウス縦方向全層皮膚切開創傷モデルで試験された。イソフルランで麻酔した7〜8週齢のC57BLオスマウスで、外科手術を実施する。外科手術に先だって、マウスをイソフルランで麻酔して毛を刈る。標準外科用メスの刃を使用して、20mmの全層縦方向切開を実施する。創傷形成の3時間後、皮膚の弾性と動物の活動のために、切開は楕円形状になる。この段階で、創傷の最も広い領域を測定して、ベースライン創傷幅を確立する。創傷治癒評価は、創傷の最も広い領域の測定によって行う。創傷処置は、0.2mLの溶液を毎日直接創傷に局所塗布して、実施する。毎日の処置後、創傷はしばらく(3〜5時間)湿潤であるので、創傷ケア過程は部分的に湿潤環境で実施される。創傷形成8日後の実験終了時、マウスを殺処分して、創傷幅を評価し、創傷領域の生検を採取して、分析に供する。
投与液は、毎投薬日に、新鮮に調製する。試験化合物は凍結乾燥粉末として提供され、生理食塩水で戻して3mg/mLの貯蔵懸濁液を作成し、引き続いて生理食塩水で希釈して、局所塗布用の3μMの使用濃度にする。対照群の創傷は、局所的に生理食塩水で処置する。
創傷形成8日後の処置段階終了時、CO吸入によってマウスを殺処分し、創傷領域の生検を採取する。4%パラホルムアルデヒドを使用して、創傷組織の固定化を実施する。創傷領域全体の固定化に続いて、創傷の最も幅広い領域の5mmの切開を実施して、切開領域をパラフィン包埋する。段階的脱水の標準手順を使用して、パラフィンブロックを調製する。その後、組織学的切片を調製して、組織をヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)で染色する。創傷治癒パラメータを評価してグラフ表示する。
表皮閉鎖は、H&E染色を使用して、創傷の最も幅広い領域で組織切片を分析して評価する。顕微鏡の400倍の視野で観察された、創傷間隙全体を覆う表皮連続層の存在を示す創傷、および最も進行した表皮端の移動がある創傷は、進行した皮膚閉鎖パラメータについて陽性と見なされる。結果は、実験群あたりの総百分率として提示される。
皮膚治癒は、エオジン染色された健康な真皮と、創傷間隙に新たに形成された真皮縁の検査によって評価される。顕微鏡(BX41 OlympusまたはAxiovert 25、Zeiss)の100倍の視野で、双方の真皮縁が観察された創傷は、進行した皮膚閉鎖治癒パラメータについて陽性と見なされる。進行した皮膚閉鎖がある創傷数を実験群中の全創傷の百分率として提示する。
肉芽組織はH&E染色を使用して評価する。一次フィブリン血栓が、脂肪細胞を含有する線維性結合組織、新しい毛細血管、そしてリンパ系細胞とマクロファージと血漿細胞とを含有する浸潤物で置き換えられると、肉芽組織は初期と見なされる。多数の線維芽細胞とコラーゲン繊維がある組織で置き換えられた初期肉芽組織は、後期と見なされる。全体的には、創傷間隙の後期肉芽組織領域は、全創傷間隙領域の百分率として記録される。創傷間隙の40%を覆う後期肉芽組織形成を提示する創傷間隙は、このパラメータについて陽性と見なされる。結果は、群あたりの全創傷の百分率として計算される。
癒着は、創傷間隙における細胞および組織構造の分析によって評価される。創傷癒着は、軽度、中等度または重度の尺度で採点される。創傷間隙に血餅がある場合、または正常肉芽組織が骨格筋または広範なリンパ組織などのその他の組織によって置き換えられている場合、負のスコアと見なされる。創傷間隙領域の40%以上を占めるいくつかの癒着または異常な顆粒化は、重症と見なされる。接着は、それが顕著でなく、正常皮膚組織再生に干渉しなければ、軽度と見なされる。重度の癒着がある創傷は、実験群あたりの全創傷の百分率として計算される。19匹のマウスにおいて、19の創傷(38の表皮縁)を作成する。
ブタ皮膚上の創傷治癒後期の治癒過程および瘢痕に対する、試験化合物の局所塗布の効果の評価
縦方向全層切開のブタ創傷モデルで、皮膚創傷治癒後期に対する試験化合物の効果を調べる。外科手術当日、ケタミン、キシラジン、ジアゼパム、およびイソフルランを使用して、ブタを麻酔する。背側胸郭(dorsum thorax)および腹部の被毛を刈って、#11外科用メスの刃を使用して、背側正中線の両側から4センチメートルで、10対の2.5cm全層縦方向皮膚切開を実施する。外科手術に続いて、創傷を実験群に分けて、創傷中心からあらゆる方向に最大で2cmの距離までの創傷領域近くの皮膚の処置を含めて、創傷領域と創傷縁への局所塗布によって毎日処置する。投与液は、全治療容積(例えば1mLのビヒクルまたは試験化合物)が組織に吸収されるまで、ピペットを使用して、各創傷に少しずつ塗布する。創傷近くの皮膚は、試験化合物またはビヒクル溶液に浸漬したガーゼで処置する。
実験中、創傷を写真記録して、形態学的分析を実施する。処置段階終了時(創傷形成後19日目)、麻酔薬およびKClの投薬によってブタを殺処分する。創傷の形態学を検査し、創傷を写真記録して、固定化とさらなる形態学的および組織学的分析のために創傷領域の生検を採取する。
投与液は、毎投薬日に、新鮮に調製する。試験化合物は、凍結乾燥粉末として提供され、100%DMSOで溶解して、15mMの原液濃度に調製される。引き続いて、注射用水でさらなる希釈を実施して、局所塗布のための3μMおよび1μMの最終濃度にする。
処置段階終了時(創傷形成後19日目)に、創傷治癒の評価を実施する。完全に治癒した創傷は、群あたりの全創傷の百分率として報告される。完全に治癒して、完全な痂皮剥離を示す創傷中の瘢痕の平均幅もまた報告される。瘢痕を測定し(mm)、瘢痕の平均幅と標準偏差を計算した。合計20の創傷を実施した。
処置段階終了時(創傷形成後19日目)に、麻酔薬およびKClの過量供給によってブタを殺処分し、創傷領域の生検を採取する。4%パラホルムアルデヒドを使用して、創傷生検の固定化を実施する。固定化に続いて、例えばデジタルカメラFinePix S700を使用して、最大解像度で創傷生検を写真記録する。
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本明細書に引用された、全ての特許、公開出願、および参考文献の教示は、その内容全体を参照によって援用する。
その実施形態例に言及して、本発明を具体的に示して説明した一方で、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、形態および詳細に様々な変更を加えてもよいことが、当業者には理解されるであろう。

Claims (31)

  1. 式I:
    の化合物
    (式中、
    は、水素およびC〜Cアルキルから選択され;
    は、OおよびSから選択され;
    は、−N(R)−(C〜Cシクロアルキル)、−C〜Cアルキル、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリル、および−(C〜Cアルキレン)−ヘテロアリールから選択され(式中、Rのあらゆるアルキル、アルキレン、ヘテロシクリル、およびヘテロアリール部分は、任意選択的に独立して置換される);
    は、水素およびC〜Cアルキルから選択される)、
    またはその薬学的に許容可能な塩。
  2. が、水素およびメチルから選択される、請求項1に記載の化合物。
  3. が、水素である、請求項2に記載の化合物。
  4. がOである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の化合物。
  5. が水素である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物。
  6. が、−N(R)−(C〜Cシクロアルキル)、−C〜Cアルキル、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリル、および−(C〜Cアルキレン)−ヘテロアリールから選択され:
    のあらゆるアルキルまたはアルキレン部分が、任意選択的に、独立して、オキソおよび−N(Rからなる群から選択される、1つまたは複数の置換基で置換され、式中、各Rは水素およびC〜Cアルキル、から独立して選択され;
    のあらゆるヘテロシクリル部分が、環内に少なくとも1つの窒素原子を含んでなり、任意選択的に、C〜Cアルキルおよびオキソからなる群から選択される1つまたは複数の置換基で置換され;
    のあらゆるヘテロアリール部分が、環内に少なくとも1つの窒素原子を含んでなり、任意選択的に、1つまたは複数のC〜Cアルキルで置換される、
    請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物。
  7. が、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリルである、請求項6に記載の化合物。
  8. が、−(Cアルキレン)−ヘテロシクリルである、請求項7に記載の化合物。
  9. 前記ヘテロシクリルが、ピラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、およびピラゾリルから選択される、請求項7または請求項8に記載の化合物。
  10. 前記ヘテロシクリルが、−C(CH、−NH−シクロプロピル、−CH−ピラジン−2−イル、−ピラジン−2−イル、−CH−モルホリン−4−イル、および5−メチル−1−H−ピラゾール−4−イルから選択されるモルホリニルRである、請求項9に記載の化合物。
  11. のあらゆるアルキル、アルキレン、ヘテロシクリル、およびヘテロアリール部分が、任意選択的に、独立して、−OH、−SH、ニトロ、ハロゲン、アミノ、シアノ、C〜C12アルキル、C〜C12アルケニルまたはC〜C12アルキニル基、C〜C12アルコキシ、C〜C12ハロアルキル、C〜C12ハロアルコキシ、およびC〜C12アルキルスルファニルからなる群から選択される、1つまたは複数の置換基で置換される、
    請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物。
  12. のあらゆるアルキル、アルキレン、ヘテロシクリル、およびヘテロアリール部分が、任意選択的に、独立して、式−N(R(式中、各Rは、水素およびC〜Cアルキルから独立して選択される)を有するアミノ基で置換される、
    請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物。
  13. のあらゆるヘテロアリール部分が、任意選択的に、独立して、−OH、−SH、ニトロ、ハロゲン、アミノ、シアノ、C〜C12アルキル、C〜C12アルケニル、C〜C12アルキニル、C〜C12アルコキシ、C〜C12ハロアルキル、C〜C12ハロアルコキシ、およびC〜C12アルキルスルファニルからなる群から選択される、1つまたは複数の置換基で置換され;
    のあらゆるアルキル、アルキレンまたはヘテロシクリル部分が、任意選択的に、独立して、オキソ、−OH、−SH、ニトロ、ハロゲン、アミノ、シアノ、C〜C12アルキル、C〜C12アルケニル、C〜C12アルキニル、C〜C12アルコキシ、C〜C12ハロアルキル、C〜C12ハロアルコキシ、およびC〜C12アルキルスルファニルからなる群から選択される、1つまたは複数の置換基で置換される、
    請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物。
  14. が、−N(R)−(C〜Cシクロアルキル)、−C〜Cアルキル、−(C〜Cアルキレン)−ヘテロシクリル、および−(C〜Cアルキレン)−ヘテロアリールから選択され;
    のあらゆるアルキルまたはアルキレン部分が、任意選択的に−N(R(式中、各Rは、水素およびC〜Cアルキルから独立して選択される)で置換され;
    のあらゆるヘテロシクリル、およびヘテロアリール部分が、環内に少なくとも1つの窒素原子を含んでなり;
    のあらゆるヘテロシクリル、およびヘテロアリール部分が、任意選択的にC〜Cアルキルで置換される、
    請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物。
  15. が、−C(CH、−CH(NH)−CH(CH、−NH−シクロプロピル、−(CH0〜1−ピラジニル、ピペリジニル、ヒドロキシピペリジニル、N−メチルピペリジニル、−CH−モルホリン−4−イル、およびメチルピラゾリルから選択される、請求項14に記載の化合物。
  16. が、−C(CH、−CH(NH)−CH(CH、−NH−シクロプロピル、−(CH0〜1−ピラジン−2−イル、ピペリジン−3−イル、−CH−モルホリン−4−イル、および5−メチル−1−H−ピラゾール−4−イルから選択される、請求項15に記載の化合物。
  17. が、−C(CH、−NH−シクロプロピル、−CH−ピラジン−2−イル、−ピラジン−2−イル、−CH−モルホリン−4−イル、および5−メチル−1−H−ピラゾール−4−イルから選択される、請求項16に記載の化合物。
  18. 構造式、
    のいずれか1つによって表される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
  19. 化合物1、2、3、4、8、11、12、および13のいずれか1つから選択される、請求項18に記載の化合物。
  20. 請求項1〜19のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩と、薬学的に許容できる担体とを含んでなる医薬組成物。
  21. 請求項20に記載の医薬組成物の治療有効量をそれを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、CRM1活性関連障害を治療する方法。
  22. 前記障害が、増殖性疾患、炎症性疾患、自己免疫障害、ウイルス感染症、眼科疾患、神経変性疾患、異常な組織成長障害、食物摂取量関連障害、アレルギー、および呼吸器疾患から選択される、請求項21に記載の方法。
  23. 前記疾患が、がんである、請求項22に記載の方法。
  24. 前記がんが、リンパ腫である、請求項23に記載の方法。
  25. 前記組成物が、がんを治療するのに有用な第2の治療薬と共に投与される、請求項23または24に記載の方法。
  26. 前記疾患が、関節炎である、請求項21に記載の方法。
  27. 前記疾患が、乾癬である、請求項21に記載の方法。
  28. 前記疾患が、肥満である、請求項21に記載の方法。
  29. 請求項20に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与するステップを含んでなる、それを必要とする対象において創傷治癒を促進する方法。
  30. 前記創傷が、外傷、外科的創傷、内傷、慢性創傷、潰瘍、火傷であり、または放射線被曝の結果である、請求項29に記載の方法。
  31. 前記創傷が、火傷、切創、開放創、手術創または手術後創、糖尿病性病変、熱傷、化学火傷、放射線火傷、褥瘡、床擦れ、および糖尿病または芳しくない循環に関連した病状からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
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