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KR102055396B1 - 신규한 항-pd-1 항체 - Google Patents

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KR102055396B1
KR102055396B1 KR1020177036687A KR20177036687A KR102055396B1 KR 102055396 B1 KR102055396 B1 KR 102055396B1 KR 1020177036687 A KR1020177036687 A KR 1020177036687A KR 20177036687 A KR20177036687 A KR 20177036687A KR 102055396 B1 KR102055396 B1 KR 102055396B1
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용 젱
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지솅 첸
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우시 바이올로직스 (케이만) 인코포레이티드
오픈 모노클로날 테크놀로지, 인코포레이티드
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Abstract

본 개시내용은 프로그래밍된 세포 사멸 1 (PD-1) 리간드가 PD-1에 결합하는 것을 차단하여, PD-1 발현 T 세포 상에서 PD-1 리간드의 억제 기능을 차단할 수 있는, 단백질 PD-1에 대한 모노클로날 항체를 제공한다. 본 개시내용의 항체는 인간 면역 기능의 조절을 통해 여러 암을 치료하기 위한 매우 강력한 작용제를 제공한다.

Description

신규한 항-PD-1 항체
본 개시내용은 전반적으로 신규한 항-PD-1 항체에 관한 것이다.
임상전 및 임상 결과로부터의 증가하는 증거들은 면역 체크포인트의 표적화가 암 환자를 치료하는 가장 유망한 접근법이 되고 있음을 제시한 바 있다. 면역-체크포인트 단백질 중 하나인 프로그래밍된 세포 사멸 1은, 종양 세포가 면역 감시로부터 벗어나게 하는 주요 면역 내성 메카니즘을 제공하는 T 세포의 활성을 제한하는데 있어서 주요한 역할을 한다. 활성화된 T 세포 상에서 발현된 PD-1과 종양 세포 상에서 발현된 PD-L1의 상호작용은 면역 반응을 부정적으로 조절하고, 항-종양 면역력을 약화시킨다. 종양에서 PD-L1의 발현은 식도암, 췌장암 및 다른 유형의 암에서 감소된 생존과 상호 관련이 있으며, 이는 종양 면역요법을 위한 새로운 유망한 표적으로서 상기 경로를 강조한다. PD-1 경로를 표적으로 하는 여러 작용제가 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb, BMS), 머크(Merck), 로쉐(Roche) 및 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline, GSK)과 같은 제약 회사에 의해 개발된 바 있다. 임상 실험으로부터의 데이터는 다양한 종양 유형을 가진 환자에서 항구성 임상 활성의 초기 증거 및 유망한 안전성 프로파일을 입증하였다. BMS에 의해 개발된 PD-1 약물인 니볼루맙은 차세대 분야에서 각광을 받고 있다. 이제, 6가지 후기 연구에서, 상기 치료는 연구된 5개의 암 그룹 중 3개에서, 예컨대 72명의 폐암 환자 중 18%, 98명의 흑색종 환자 중 대략 1/3 및 33명의 신장암 환자 중 27%에서 종양 위축을 자극하였다. 머크에 의해 개발된 람브롤리주맙은 PD-1에 대해 작용하는 완전 인간 모노클로날 IgG4 항체이며, 피부암에 대해 인상적인 IB 데이터가 나온 이후 FDA의 신규한 획기적인 지정을 받았다. IB 단계 연구로부터의 결과는 85명의 암 환자 중 51%에서 객관적인 항-종양 반응 및 환자의 9%에서 완전한 반응을 제시한 바 있다. 로쉐의 실험용 MPDL3280A는 다양한 종양 크기를 가진 진행암 환자 140명 중 29명 (21%)에서 종양을 위축시키는 능력을 입증하였다.
그러나, 기존 요법들이 모두 만족스럽지 않을 수 있으며, 따라서 신규한 항-PD-1 항체가 여전히 요구된다.
본 개시내용은 신규한 모노클로날 항-PD-1 항체 (특히 완전 인간 항체), 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 그의 사용 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 플라즈몬 공명 결합 검정에 의해 측정 시 10-8 M 이하 (예를 들어, ≤9x10-9 M, ≤8x10-9 M, ≤7x10-9 M, ≤6x10-9 M, ≤5x10-9 M, ≤4x10-9 M, ≤3x10-9 M, ≤2x10-9 M, 또는 ≤10-9 M 이하)의 Kd 값으로 인간 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
특정 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 100 nM 이하 또는 10nM 이하 (예를 들어, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM 또는 1nM 이하)의 EC50으로 원숭이 PD-1에 결합한다. 특정 실시양태에서, 상기 항체 및 그의 항원-결합 단편은 마우스 PD-1에는 결합하지 않지만, 인간 PD-1과 유사한 결합 친화도로 원숭이 PD-1에 결합한다. 특정 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 100 nM 이하 (예를 들어, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, 10 nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM, 1 nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM 또는 0.1nM 이하)의 IC50으로 인간 또는 원숭이 PD-1이 그의 리간드 (예를 들어, PD-L1 또는 PD-L2)에 결합하는 것을 강력하게 억제한다. 특정 실시양태에서, EC50 또는 IC50은 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 분석에 의해 측정된다.
특정 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 실질적으로 감소된 이펙터 기능을 갖는다. 특정 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 ADCC 또는 CDC 또는 이들 둘 다를 매개하지 않는다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1, 3, 5, 13, 15, 21, 23, 25, 33, 35 및 37로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 7, 9, 11, 17, 19, 27, 29, 31, 39, 41, 43 및 65로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된; 또는 서열식별번호: 13, 15, 5, 7, 17 및 11로 이루어진 군으로부터 선택된; 또는 서열식별번호: 1, 15, 5, 7, 17 및 19로 이루어진 군으로부터 선택된; 또는 서열식별번호: 1, 15, 5, 7, 17 및 65로 이루어진 군으로부터 선택된; 또는 서열식별번호: 21, 23, 25, 27, 29 및 31로 이루어진 군으로부터 선택된; 또는 서열식별번호: 33, 35, 37, 39, 41 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 포함한다:
a) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역;
b) 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 15 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역;
c) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 15 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역;
d) 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 23 및/또는 서열식별번호: 25를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
e) 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 35 및/또는 서열식별번호: 37을 포함하는 중쇄 가변 영역.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함한다:
a) 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9 및/또는 서열식별번호: 11을 포함하는 경쇄 가변 영역;
b) 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 17 및/또는 서열식별번호: 11을 포함하는 경쇄 가변 영역;
c) 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 17 및/또는 서열식별번호: 19를 포함하는 경쇄 가변 영역;
d) 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 29 및/또는 서열식별번호: 31을 포함하는 경쇄 가변 영역;
e) 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 41 및/또는 서열식별번호: 43을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
f) 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 17 및/또는 서열식별번호: 65를 포함하는 경쇄 가변 영역.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
a) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9 및/또는 서열식별번호: 11을 포함하는 경쇄 가변 영역;
b) 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 15 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 17 및/또는 서열식별번호: 11을 포함하는 경쇄 가변 영역;
c) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 15 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 17 및/또는 서열식별번호: 19를 포함하는 경쇄 가변 영역;
d) 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 23 및/또는 서열식별번호: 25를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 29 및/또는 서열식별번호: 31을 포함하는 경쇄 가변 영역;
e) 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 35 및/또는 서열식별번호: 37을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 41 및/또는 서열식별번호: 43을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
f) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 15 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 17 및/또는 서열식별번호: 65를 포함하는 경쇄 가변 영역.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 61로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 63 및 서열식별번호: 67로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기를 포함한다:
a) 서열식별번호: 45를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 47을 포함하는 경쇄 가변 영역;
b) 서열식별번호: 49를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 51을 포함하는 경쇄 가변 영역;
c) 서열식별번호: 53을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 55를 포함하는 경쇄 가변 영역;
d) 서열식별번호: 57을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 59를 포함하는 경쇄 가변 영역;
e) 서열식별번호: 61을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 63을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
f) 서열식별번호: 53을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 67을 포함하는 경쇄 가변 영역.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체에는 예를 들어, 1.7.3 hAb, 1.49.9 hAb, 1.103.11 hAb, 1.103.11-v2 hAb, 1.139.15 hAb, 및 1.153.7 hAb가 포함된다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 동일한 에피토프에 대해 항체 1.7.3 hAb, 1.49.9 hAb, 1.103.11 hAb, 1.103.11-v2 hAb, 1.139.15 hAb, 또는 1.153.7 hAb와 경쟁한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 아미노산 잔기 PD-1: V64, P83, D85, L128, A129, P130, K131, A132 및 Q133 중 적어도 하나를 포함하는 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 PD-1이 그의 리간드에 결합하는 것을 차단하여 하기 활성 중 적어도 하나를 제공할 수 있다:
a) CD4+T 세포에서 IL-2 생성의 유도;
b) CD4+T 세포에서 IFNγ 생성의 유도;
c) CD4+T 세포 증식의 유도; 및
d) T reg의 저해 기능의 역전.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 모노클로날 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 이중특이적 항체, 표지된 항체, 2가 항체, 또는 항-유전자형 항체이다. 특정 실시양태에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 임의적으로 트랜스제닉 래트, 예를 들어 래트 이뮤노글로불린 유전자의 불활성화된 내인성 발현을 갖고, J-locu 결실 및 C-kappa 돌연변이를 가진 재조합 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 보유한 트랜스제닉 래트에 의해 생성되는, 완전 인간 모노클로날 항체이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 그의 항원-결합 단편은 낙타화 단일 도메인 항체, 디아바디, scFv, scFv 이합체, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv 단편, Fab, Fab', F(ab')2, ds 디아바디, 나노바디, 도메인 항체, 또는 2가 도메인 항체이다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 이뮤노글로불린 불변 영역을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 접합체를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 접합체는 검출가능한 표지, 약동학적 개질 모이어티, 또는 정제 모이어티일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 특정한 다른 실시양태에서, 이들 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공되고, 특정한 다른 실시양태에서, 이들 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 항체 또는 항원-결합 단편이 벡터로부터 발현되는 조건 하에 이들 숙주 세포를 배양시킴으로써, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편 중 하나 이상을 발현시키는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드는 벡터에서 SV40 프로모터와 같은 프로모터와 작동가능하게 회합한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 벡터를 포함하는 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포 또는 293F 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 PD-1 항체, 예컨대 1.7.3 hAb, 1.49.9 hAb, 1.103.11 hAb, 1.103.11-v2 hAb, 1.139.15 hAb, 및 1.153.7 hAb는 동물에서 양호한 내성 및 높은 생체내 항-종양 활성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 PD-1 항체가 투여된 종양 세포를 가진 동물은 유사한 기준선 종양 부피를 갖지만 비히클만 투여한 대조군 동물에 비해 종양 부피가 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 감소된다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 PD-1과 연관된 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 개체는 PD-1 길항제에 반응할 가능성이 있는 장애 또는 상태를 가진 것으로 확인된 바 있다. 특정 실시양태에서, 상기 개체는 개체로부터의 생물학적 시험 샘플에서 PD-L1의 존재 또는 상향조절된 수준에 대해 양성인 것으로 확인된 바 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 1종 이상의 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이들 특정한 실시양태에서, 제약 담체는 예를 들어 희석제, 항산화제, 아주반트, 부형제, 또는 무독성 보조 물질일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응의 상향조절로부터 이익을 얻을 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 대상체는 PD-L1의 상향조절된 발현을 갖거나, 또는 PD-L1의 발현에 대해 양성인 것으로 확인된 바 있다.
면역 반응의 상향조절로부터 이익을 얻을 상태를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 본원에 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도가 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 상태는 암 또는 만성 바이러스 감염이다.
도 1은 FACS 분석에 의해 측정 시 완전 인간 항-PD-1 항체가 PD-1 발현 CHO 세포에 결합하는 것을 도시한다.
도 2는 FACS 분석에 의해 측정 시 약 2nM의 EC50으로 완전 인간 PD-1 항체가 PD-1 발현 CHO 세포에 결합하는 것을 도시한다.
도 3은 FACS 분석에 의해 측정 시 완전 인간 항-PD-1 항체가 활성화된 CD4+T 세포 상에서 발현된 PD-1에 결합하는 것이다.
도 4는 FACS 분석에 의해 측정 시 약 3-8 nM의 IC50으로 완전 인간 항-PD-1 항체가 PD-L1의 PD-1 형질감염된 CHO 세포에 결합하는 것을 차단하였음을 제시한다.
도 5는 FACS 분석에 의해 측정 시 완전 인간 항-PD-1 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하지만 패밀리 구성원 CD28 및 CTLA4에는 결합하지 않음을 제시한다.
도 6은 PD-1에 대한 완전 인간 항-PD-1 항체가 시노몰구스 원숭이 PD-1에 결합하지만 뮤린 PD-1에는 결합하지 않음을 제시한다.
도 7은 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정 시 3.76E-9 내지 1.76E-10 mol/L 범위에서 인간 PD-1에 대한 PD-1 항체의 결합 친화도의 완전 역학이다.
도 8은 혼합 림프구 반응 (MLR)에서 IL-2 생성에 대한 완전 인간 항-PD-1 항체의 효과를 예시한다.
도 9는 MLR에서 IFNγ 생성에 대한 완전 인간 항-PD-1 항체의 효과를 예시한다.
도 10은 MLR에서 완전 인간 항-PD-1 항체가 T 세포 증식을 촉진시켰음을 제시한다.
도 11은 특이적 T 세포 반응에서 완전 인간 PD-1 항체가 T 세포 증식을 촉진시켰음을 제시한다.
도 12는 항-PD-1 항체가 Treg의 저해 기능을 역전시켰음을 제시한다.
도 13은 항-PD-1 항체가 활성화된 T 세포 상에서 ADCC를 결여시켰음을 제시한다.
도 14는 항-PD-1 항체가 활성화된 T 세포 상에서 CDC를 결여시켰음을 제시한다.
도 15는 상이한 완충제 중의 1.103.11-v2 hAb가 ELISA에 의해 측정 시 유사한 친화도로 인간 PD-1 세포외 도메인에 결합하는 것을 제시한다. "완충제 중의 1.103.11-v2 hAb"는 제제 완충제 중의 항체를 지칭하고, "PBS 중의 1.103.11-v2 hAb"는 1xPBS, pH 7.4 중의 항체를 지칭한다.
도 16은 상이한 완충제 중의 1.103.11-v2 hAb가 FACS에 의해 측정 시 유사한 친화도로 PD-1 발현 CHO 세포에 결합하는 것을 제시한다. "완충제 중의 1.103.11-v2 hAb"는 제제 완충제 중의 항체를 지칭하고, "PBS 중의 1.103.11-v2 hAb"는 1xPBS, pH 7.4 중의 항체를 지칭한다.
도 17은 항체가 결합하는 인간 PD-L1의 결정 구조체 상의 핫-스팟 잔기 (음영 영역)를 제시한다. A는 일반적인 핫-스팟 잔기를 제시하고, B 내지 D는 각각 1.103.11 hAb, 키트루다(Keytruda) 및 11.148.10 hAb에 대한 핫-스팟 잔기를 제시한다.
본 개시내용의 하기 설명은 단지 본 개시내용의 다양한 실시양태를 예시하기 위해 의도된다. 따라서, 논의된 구체적인 변형이 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 파악되어서는 안된다. 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 다양한 등가물, 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이고, 이러한 등가 실시양태가 본원에 포함되어야 하는 것으로 이해된다. 공보, 특허 및 특허 출원을 비롯하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
정의
본원에 사용된 용어 "항체"에는 특이적인 항원에 결합하는 임의의 이뮤노글로불린, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체, 또는 이중특이적 (2가) 항체를 지칭한다. 본래의 온전한 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 가변 영역 및 제1, 제2 및 제3 불변 영역으로 구성되는 반면에, 각각의 경쇄는 가변 영역 및 불변 영역으로 구성된다. 포유류 중쇄는 α, δ, ε, γ 및 μ로 분류되고, 포유류 경쇄는 λ 또는 κ로 분류된다. 항체는 "Y" 형태를 가지며, Y의 줄기는 디술파이드 결합을 통해 함께 결합된 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역으로 구성된다. Y의 각각의 아암은 단일 경쇄의 가변 및 불변 영역에 결합된 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 담당한다. 양쪽 쇄의 가변 영역은 일반적으로 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 3개의 고도 가변 루프를 함유한다 (경쇄 (L) CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 중쇄 (H) CDR은 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함함). 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편에 대한 CDR 경계는 카바트(Kabat), 코티아(Chothia) 또는 알-라지카니(Al-Lazikani)의 협약 (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, C. et al., J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C. and Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989); Kabat E.A. et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))에 의해 정의되거나 확인될 수 있다. 3개의 CDR은, CDR보다 더욱 고도로 보존되고 초가변 루프를 지지하기 위한 스캐폴드를 형성하는 프레임워크 영역 (FR)으로 공지된 플랭킹 스트레치들 사이에 끼여있다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원 결합과는 관련이 없지만, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 항체는 그들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열을 기준으로 하는 부류로 배정된다. 항체의 5가지 주요 부류 또는 이소형은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이고, 이들은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 중쇄를 특징으로 한다. 주요 항체 부류 중 몇몇은 하위 부류, 예컨대 IgG1 (γ1 중쇄), IgG2 (γ2 중쇄), IgG3 (γ3 중쇄), IgG4 (γ4 중쇄), IgA1 (α1 중쇄), 또는 IgA2 (α2 중쇄)로 나뉘어 진다.
본원에 사용된 용어 "항원-결합 단편"은 1개 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부로부터 형성된 항체 단편, 또는 항원에 결합하지만 온전한 본래의 천연 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편의 예에는 비제한적으로 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디술파이드 안정화된 Fv 단편 (dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv (dsFv-dsFv'), 디술파이드 안정화된 디아바디 (ds 디아바디), 단일쇄 항체 분자 (scFv), scFv 이합체 (2가 디아바디), 다중특이적 항체, 낙타화 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 및 2가 도메인 항체가 포함된다. 항원-결합 단편은 모 항체가 결합하는 것과 동일한 항원에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원-결합 단편은 1종 이상의 상이한 인간 항체로부터의 프레임워크 영역에 그래프팅된 특정한 인간 항체로부터의 1개 이상의 CDR을 포함할 수 있다.
항체와 관련하여 "Fab"는 디술파이드 결합에 의해 단일 중쇄의 가변 영역 및 제1 불변 영역에 결합된 단일 경쇄 (가변 및 불변 영역 둘 다)로 구성되는 항체의 일부분을 지칭한다.
"Fab'"는 힌지 영역의 일부분을 포함하는 Fab 단편을 지칭한다.
"F(ab')2"는 Fab'의 이합체를 지칭한다.
항체와 관련하여 "Fc"는 디술파이드 결합을 통해 제2 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역에 결합된 제1 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역으로 구성되는 항체의 일부분을 지칭한다. 항체의 Fc 부분은 다양한 이펙터 기능, 예컨대 ADCC 및 CDC를 담당하지만, 항원 결합에 대한 기능은 갖지 않는다.
항체와 관련하여 "Fv"는 완전한 항원 결합 부위를 보유하는 항체의 가장 작은 단편을 지칭한다. Fv 단편은 단일 중쇄의 가변 영역에 결합된 단일 경쇄의 가변 영역으로 구성된다.
"단일쇄 Fv 항체" 또는 "scFv"는 직접적으로 또는 펩티드 링커 서열을 통해 서로 연결된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역으로 구성되는 조작된 항체를 지칭한다 (Huston JS et al. Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879(1988)).
"단일쇄 Fv-Fc 항체" 또는 "scFv-Fc"는 항체의 Fc 영역에 연결된 scFv로 구성되는 조작된 항체를 지칭한다.
"낙타화 단일 도메인 항체", "중쇄 항체" 또는 "HCAb"는 2개의 VH 도메인을 함유하고 경쇄는 함유하지 않는 항체를 지칭한다 (Riechmann L. and Muyldermans S., J Immunol Methods. Dec 10;231(1-2):25-38 (1999); Muyldermans S., J Biotechnol. Jun;74(4):277-302 (2001); WO94/04678; WO94/25591; 미국 특허 번호 6,005,079). 중쇄 항체는 원래 낙타과로부터 유래되었다 (낙타, 단봉낙타, 및 라마). 비록 경쇄가 없지만, 낙타화 항체는 진본의 항원-결합 레퍼토리를 갖는다 (Hamers-Casterman C. et al., Nature. Jun 3;363(6428):446-8 (1993); Nguyen VK. et al. "Heavy-chain antibodies in Camelidae; a case of evolutionary innovation", Immunogenetics. Apr;54(1):39-47 (2002); Nguyen VK. et al.Immunology. May;109(1):93-101 (2003)). 중쇄 항체의 가변 도메인 (VHH 도메인)은 적응 면역 반응에 의해 생성되는 가장 작은 공지된 항원-결합 단위를 나타낸다 (Koch-Nolte F. et al., FASEB J. Nov;21(13):3490-8. Epub 2007 Jun 15 (2007)).
"나노바디"는 중쇄 항체로부터의 VHH 도메인 및 2개의 불변 도메인 CH2 및 CH3으로 구성되는 항체 단편을 지칭한다.
"디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 포함하고, 상기 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄에서 VL 도메인에 연결된 VH 도메인 (VH-VL 또는 VL-VH)을 포함한다 (예를 들어, Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. Jul 15;90(14):6444-8 (1993); EP404097; WO93/11161 참고). 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 두 도메인 사이에서는 쌍형성을 허용하지 않는 링커를 사용함으로써, 도메인이 또 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 형성하도록 하여, 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 항원-결합 부위는 상이한 항원의 동일한 부위 (또는 에피토프)를 표적으로 할 수 있다.
"도메인 항체"는 중쇄의 가변 영역만을 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 항체 단편을 지칭한다. 특정한 예에서, 2개 이상의 VH 도메인이 펩티드 링커에 의해 공유 연결되어, 2가 또는 다가 도메인 항체를 생성한다. 2가 도메인 항체의 2개의 VH 도메인은 동일하거나 상이한 항원을 표적으로 할 수 있다.
특정 실시양태에서, "(dsFv)2"는 3개의 펩티드 쇄: 펩티드 링커에 의해 연결되고 디술파이드 브릿지에 의해 2개의 VL 모이어티에 결합된 2개의 VH 모이어티를 포함한다.
특정 실시양태에서, "이중특이적 ds 디아바디"는 VH1과 VL1 사이의 디술파이드 브릿지를 통해 VL1-VH2 (펩티드 링커에 의해 연결됨)에 결합된 VH1-VL2 (펩티드 링커에 의해 연결됨)를 포함한다.
특정 실시양태에서, "이중특이적 dsFv" 또는 "dsFv-dsFv'"는 3개의 펩티드 쇄: 중쇄가 펩티드 링커 (예를 들어, 긴 가요성 링커)에 의해 연결되고, 디술파이드 브릿지를 통해 각각 VL1 및 VL2 모이어티에 결합된 VH1-VH2 모이어티를 포함하고, 여기서 각각의 디술파이드에 의해 쌍형성된 중쇄 및 경쇄는 상이한 항원 특이성을 갖는다.
특정 실시양태에서, "scFv 이합체"는, 한 모이어티의 VH가 다른 모이어티의 VL과 배위 결합하여 동일한 항원 (또는 에피토프) 또는 상이한 항원 (또는 에피토프)을 표적으로 할 수 있도록, 또 다른 VH-VL 모이어티에 이합체화된 VH-VL (펩티드 링커에 의해 연결됨)을 포함하는 2가 디아바디 또는 2가 ScFv (BsFv)이다. 다른 실시양태에서, "scFv 이합체"는, VH1과 VL1이 배위 결합하고 VH2와 VL2가 배위 결합하여 각각의 배위 결합된 쌍이 상이한 항원 특이성을 갖도록, VL1-VH2 (펩티드 링커에 의해 연결됨)와 회합된 VH1-VL2 (펩티드 링커에 의해 연결됨)을 포함하는 이중특이적 디아바디이다.
항체 또는 항원-결합 단편과 관련하여 본원에 사용된 용어 "완전 인간"은, 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 또는 인간 면역 세포에 의해 생성된 항체, 또는 비-인간 공급원, 예컨대 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하는 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 유래된 항체에 상응하는 아미노산 서열(들)을 갖거나 그로 구성된 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 완전 인간 항체는 비-인간 항체로부터 유래된 아미노산 잔기 (특히 항원-결합 잔기)를 포함하지 않는다.
항체 또는 항원-결합 단편과 관련하여 본원에 사용된 용어 "인간화"는, 항체 또는 항원-결합 단편이 비-인간 동물로부터 유래된 CDR, 인간으로부터 유래된 FR 영역, 및 적용가능한 경우 인간으로부터 유래된 불변 영역을 포함하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항원-결합 단편은 인간에서 감소된 면역원성을 갖기 때문에 인간의 치료에 유용하다. 일부 실시양태에서, 비-인간 동물은 포유류, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 기니 피그 또는 햄스터이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체 또는 항원-결합 단편은 비-인간인 CDR 서열을 제외하고는 실질적으로 모든 인간 서열로 구성된다. 일부 실시양태에서, 인간으로부터 유래된 FR 영역은 그가 유래된 인간 항체와 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 일부 아미노산 변화, 예를 들어 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산에서의 이러한 변화는 중쇄 FR 영역에서만, 경쇄 FR 영역에서만, 또는 양쪽 쇄에 존재할 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 인간화 항체는 인간 FR1-3 및 인간 JH 및 Jκ를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "키메라"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 한 종으로부터 유래되고 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 것인 항체 또는 항원-결합 단편을 의미한다. 예시적인 예에서, 키메라 항체는 인간으로부터 유래된 불변 영역 및 비-인간 종, 예컨대 마우스로부터 유래된 가변 영역을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "PD-1"은 이뮤노글로불린의 상과에 속하고 면역계를 부정적으로 조절하기 위한 공동억제 수용체로서 기능하는 프로그래밍된 세포 사멸 단백질을 지칭한다. PD-1은 CD28/CTLA-4 패밀리의 구성원이고, 2개의 공지된 리간드, 예컨대 PD-L1 및 PD-L2를 갖는다. 인간 PD-1의 대표적인 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호: NP_005009.2로 개시되어 있고, 인간 PD-1을 코딩하는 대표적인 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호: NM_005018.2로 제시되어 있다.
본원에 사용된 "PD-L1"은 프로그래밍된 세포 사멸 리간드 1 (PD-L1, 예를 들어, Freeman et al. (2000) J. Exp . Med . 192:1027 참고)를 지칭한다. 인간 PD-L1의 대표적인 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호: NP_054862.1로 개시되어 있고, 인간 PD-L1을 코딩하는 대표적인 핵산 서열은 NCBI 수탁 번호: NM_014143.3으로 제시되어 있다. PD-L1은 태반, 비장, 림프절, 흉선, 심장, 태아 간에서 발현되고, 많은 종양 또는 암 세포에서도 확인된다. PD-L1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 골수 세포 상에서 발현되는 그의 수용체 PD-1 또는 B7-1에 결합한다. PD-L1과 그의 수용체의 결합은 신호 변환을 유도하여, 시토카인 생성 및 T 세포 증식의 TCR-매개된 활성화를 저해한다. 따라서, PD-L1은 임신, 자가면역 질환, 조직 동종이식과 같은 특별한 사건 동안에 면역계를 저해하는데 있어서 주요 역할을 하고, 종양 또는 암 세포가 면역학적 체크포인트를 피하여 면역 반응을 피하게 하는 것으로 믿어진다.
본원에 사용된 "항-PD-1 항체"는 진단 및/또는 치료적 용도로 제공하기에 충분한 친화도로 PD-1 (예를 들어, 인간 또는 원숭이 PD-1)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합한다"는 두 분자 사이의, 예를 들어 항체와 항원 사이의 비-무작위 결합 반응을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은 ≤10-6 M (예를 들어, ≤5x10-7 M, ≤2x10-7 M, ≤10-7 M, ≤5x10-8 M, ≤2x10-8 M, ≤10-8 M, ≤5x10-9 M, ≤2x10-9 M, ≤10-9 M, 10-10 M)의 결합 친화도 (KD)로 인간 및/또는 원숭이 PD-1에 특이적으로 결합한다. 본원에 사용된 KD는 해리율 대 회합률의 비 (koff/kon)를 지칭하고, 이는 표면 플라즈몬 공명 방법을 이용하여, 예를 들어 비아코어(Biacore)와 같은 장비를 이용하여 측정할 수 있다.
본원에 사용된 "결합을 차단하는" 또는 "동일한 에피토프에 대해 경쟁하는" 능력은 항체 또는 항원-결합 단편이 두 분자 (예를 들어, 인간 PD-1 및 항-PD-1 항체) 사이의 결합 상호작용을 임의의 검출가능한 정도로 억제하는 능력을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 두 분자 사이의 결합을 차단하는 항체 또는 항원-결합 단편은 두 분자 사이의 결합 상호작용을 적어도 50% 억제한다. 특정 실시양태에서, 이 억제는 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과 또는 90% 초과일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체가 결합하는 항원 상의 원자 또는 아미노산의 특이적인 기를 지칭한다. 두 항체가 항원에 대해 경쟁적인 결합을 나타내는 경우, 이들은 항원 내의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편이 예시적인 항체, 예컨대 1.7.3 hAb, 1.49.9 hAb, 1.103.11 hAb, 1.103.11-v2 hAb, 1.139.15 hAb, 및 1.153.7 hAb의 인간 PD-1에 대한 결합을 차단하는 경우, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 이들 예시적인 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 고려될 수 있다.
에피토프 내의 특정한 아미노산 잔기는 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 의해 돌연변이될 수 있고, 단백질 결합을 감소시키거나 방지하는 돌연변이가 확인된다. "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"은 에피토프와 그에 결합하는 또 다른 화합물 또는 단백질의 상화작용에 영향을 미치는 단백질의 특정한 잔기 또는 영역을 확인하기 위해 수행할 수 있는 방법이다. 단백질 내의 표적 잔기들의 잔기 또는 기를 중성의 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌, 또는 보존적 아미노산 치환)으로 교체한다. 단백질의 결합을 역가보다 많이 감소시키거나 단백질의 결합을 다른 돌연변이에 비해 최대로 감소시키는 아미노산 잔기 또는 그를 코딩하는 코돈의 임의의 돌연변이는 단백질에 의해 결합된 에피토프 내에 있을 가능성이 있다. 본 개시내용의 특정 실시양태에서, PD-1 항체에 대해 결정적인 에피토프는 V64, P83, D85, L128, A129, P130, K131, A132 및 Q133의 아미노산 잔기 중 적어도 하나를 포함한다.
본원에 사용된 "1.7.3 hAb"는 서열식별번호: 45의 중쇄 가변 영역, 서열식별번호: 47의 경쇄 가변 영역, 및 IgG4 이소형의 인간 불변 영역을 갖는 완전 인간 모노클로날 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 "1.49.9 hAb"는 서열식별번호: 49의 중쇄 가변 영역, 서열식별번호: 51의 경쇄 가변 영역, 및 IgG4 이소형의 인간 불변 영역을 갖는 완전 인간 모노클로날 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 "1.103.11 hAb"는 서열식별번호: 53의 중쇄 가변 영역, 서열식별번호: 55의 경쇄 가변 영역, 및 IgG4 이소형의 인간 불변 영역을 갖는 완전 인간 모노클로날 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 "1.103.11-v2 hAb"는 서열식별번호: 53의 중쇄 가변 영역, 서열식별번호: 67의 경쇄 가변 영역, 및 IgG4 이소형의 인간 불변 영역을 갖는 완전 인간 모노클로날 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 "1.139.15 hAb"는 서열식별번호: 57의 중쇄 가변 영역, 서열식별번호: 59의 경쇄 가변 영역, 및 IgG4 이소형의 인간 불변 영역을 갖는 완전 인간 모노클로날 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 "1.153.7 hAb"는 서열식별번호: 61의 중쇄 가변 영역, 서열식별번호: 63의 경쇄 가변 영역, 및 IgG4 이소형의 인간 불변 영역을 갖는 완전 인간 모노클로날 항체를 지칭한다.
아미노산 서열과 관련하여 "보존적 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 생리화학적 성질을 가진 측쇄를 갖는 상이한 아미노산 잔기로 교체하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환은 소수성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 (예를 들어 Met, Ala, Val, Leu, 및 Ile) 중에서, 중성 친수성 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어 Cys, Ser, Thr, Asn 및 Gln) 중에서, 산성 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어 Asp, Glu) 중에서, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어 His, Lys, 및 Arg) 중에서, 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어 Trp, Tyr, 및 Phe) 중에서 이루어질 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 보존적 치환은 보통 단백질 배좌 구조에서 유의한 변화를 초래하지 않고, 따라서 단백질의 생물학적 활성을 보유할 수 있다.
아미노산 서열 (또는 핵산 서열)과 관련하여 "퍼센트 (%) 서열 동일성"은, 동일한 아미노산 (또는 핵산 잔기)의 최대 갯수를 달성하도록 서열을 정렬하고, 필요에 따라 갭을 도입한 후에, 기준 서열에서의 아미노산 (또는 핵산) 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 (또는 핵산)의 백분율로서 정의된다. 아미노산 잔기의 보존적 치환은 동일한 잔기로서 고려될 수 있거나 고려되지 않을 수 있다. 퍼센트 아미노산 (또는 핵산) 서열 동일성의 측정을 위한 정렬은 예를 들어 공개적으로 입수가능한 도구, 예컨대 BLASTN, BLASTp (미국 국립 생물공학 정보 센터 (U.S. National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 웹사이트에서 입수가능함, Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Stephen F. et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997) 또한 참고), ClustalW2 (유럽 생물정보 연구소(European Bioinformatics Institute)의 웹사이트에서 입수가능함, Higgins D.G. et al., Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A. et al., Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007) 또한 참고), 및 ALIGN 또는 메갈라인 (Megalign, DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 도구에 의해 제공되는 디폴트 변수를 이용할 수 있거나, 또는 예를 들어 적합한 알고리즘을 선택함으로써 정렬에 최적인 변수를 맞춤화할 수 있다.
본원에 사용된 "T 세포"에는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, T 헬퍼 1 유형 T 세포, T 헬퍼 2 유형 T 세포, T 헬퍼 17 유형 T 세포 및 억제성 T 세포가 포함된다.
본원에 사용된 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역이 그의 이펙터, 예컨대 C1 복합체 및 Fc 수용체에 결합하는데 기여할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 예시적인 이펙터 기능에는 항체와 C1 복합체 상의 C1q 사이의 상호작용에 의해 유도되는 보체 의존성 세포독성 (CDC); 항체의 Fc 영역이 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에 결합함으로써 유도되는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 및 식세포작용이 포함된다.
본원에 사용된 "암" 또는 "암 상태"는 신생물성 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이에 의해 매개되는 임의의 의학적 상태를 지칭하고, 고형 암 및 비-고형 암, 예컨대 백혈병 둘 다를 포함한다. 본원에 사용된 "종양"은 신생물성 및/또는 악성 세포의 고형 종괴를 지칭한다.
본원에 사용된 상태를 "치료하는" 또는 "치료"는 상태를 예방 또는 완화시키는 것, 상태의 발병 또는 진행 속도를 늦추는 것, 상태의 진행 위험을 감소시키는 것, 상태와 연관된 증상의 진행을 예방하거나 지연시키는 것, 상태와 연관된 증상을 감소 또는 종료시키는 것, 상태의 완전한 또는 부분적인 퇴행을 발생시키는 것, 상태를 치유하는 것, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다. 암과 관련하여, "치료하는" 또는 "치료"는 신생물성 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이를 억제하거나 늦추는 것, 신생물성 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이의 발생을 예방하거나 지연시키는 것, 또는 이들의 일부 조합을 지칭할 수 있다. 종양과 관련하여, "치료하는" 또는 "치료"는 종양의 전부 또는 일부를 근절시키는 것, 종양 성장 및 전이를 억제하거나 늦추는 것, 종양의 발생을 예방하거나 지연시키는 것, 또는 이들의 일부 조합을 포함한다.
"단리된" 물질은 사람의 손에 의해 천연 상태로부터 변경된 바 있다. "단리된" 조성물 또는 물질이 천연에서 발생하는 경우, 이는 그의 원래 환경으로부터 변화된 바 있거나 또는 제거된 바 있거나 또는 이들 둘 다이다. 예를 들어, 살아있는 동물에 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 실질적으로 순수한 상태로 존재하도록 그의 천연 상태의 공존 물질로부터 충분히 분리된 경우 이는 "단리된" 것이다. 특정 실시양태에서, 전기영동 방법 (예컨대, SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 방법 (예컨대, 이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 HPLC)에 의해 측정 시 항체 및 항원-결합 단편은 적어도 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 순도를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 단백질을 발현시키도록 작동가능하게 삽입될 수 있는 것인 비히클을 지칭한다. 벡터는 숙주 세포 내에 보유된 유전적 요소를 발현시키도록 숙주 세포를 형질전환, 형질도입 또는 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 벡터의 예에는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체 (YAC), 박테리아 인공 염색체 (BAC), 또는 P1-유래된 인공 염색체 (PAC), 박테리오파지, 예컨대 람다 파지 또는 M13 파지, 및 동물 바이러스가 포함된다. 벡터로서 사용되는 동물 바이러스의 카테고리에는 레트로바이러스 (예컨대, 렌티바이러스), 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스 (예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스), 폭스파이러스, 바쿨로바이러스, 유두종 바이러스, 및 파포바바이러스 (예를 들어, SV40)가 포함된다. 벡터는 발현을 조절하는 다양한 요소, 예컨대 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택가능한 요소, 및 리포터 유전자를 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 기점을 함유할 수 있다. 벡터는 또한 세포로의 진입을 보조하는 물질, 예컨대 이로 제한되는 것은 아니지만 바이러스 입자, 리포좀 또는 단백질 코팅을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 문구 "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터가 도입된 것인 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 "PD-1과 연관된 또는 관련된 질환"은 PD-1 (예를 들어, 인간 PD-1)의 증가된 또는 감소된 발현 또는 활성에 의해 초래되거나, 악화되거나 또는 달리 관련이 있는 임의의 상태를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "치료 유효량" 또는 "유효 용량"은 인간 PD-1과 연관된 질환 또는 상태를 치료하는데 효과적인 약물의 용량 또는 농도를 지칭한다. 예를 들어, 암 치료에서의 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편의 사용과 관련하여, 치료 유효량은 종양의 전부 또는 일부를 근절시킬 수 있는, 종양 성장을 억제하거나 늦출 수 있는, 암 상태를 매개하는 세포의 성장 또는 증식을 억제할 수 있는, 종양 세포 전이를 억제할 수 있는, 종양 또는 암 상태와 연관된 임의의 증상 또는 마커를 완화시킬 수 있는, 종양 또는 암 상태의 진행을 예방하거나 지연시킬 수 있는, 또는 이들의 일부 조합일 수 있는 항체 또는 항원-결합 단편의 용량 또는 농도이다.
용어 "제약상 허용가능한"은, 지정된 담체, 비히클, 희석제, 부형제(들) 및/또는 염이 일반적으로 제제를 구성하는 다른 성분들과 화학적 및/또는 물리적으로 상용성이고, 그의 수용자와 생리학적으로 상용성인 것을 나타낸다.
항-PD-1 항체
한 측면에서, 본 개시내용은 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. CD279로도 불리는 PD-1은 면역억제를 매개하는 활성화된 T 세포에 의해 발현되는 주요 면역-체크포인트 수용체로서 공지되어 있다. PD-1 리간드 1 (PD-L1)은 다양한 종양 세포, 간질 세포 또는 이들 둘 다에서 발현되는 40 kDa 막횡단 단백질이고, PD-1에 결합한다. PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용의 억제는 T-세포 반응을 강화시켜, 항암 활성을 매개할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 CDR 서열이 하기 표 1에 제시된 바와 같고, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 서열 또한 하기 제시된 바와 같은 것인 예시적인 완전 인간 모노클로날 항체 1.7.3 hAb, 1.49.9 hAb, 1.103.11 hAb, 1.103.11-v2 hAb, 1.139.15 hAb, 및 1.153.7 hAb를 제공한다.
표 1
Figure 112017126963818-pct00001
Figure 112017126963818-pct00002
Figure 112017126963818-pct00003
Figure 112017126963818-pct00004
1.7.3 hAb - VH (23466- VH ): (아미노산의 경우 서열식별번호:45 및 핵산의 경우 서열식별번호:46) 중쇄 CDR 1-3을 가짐: 각각 서열식별번호: 1, 3, 5는 아미노산 서열이고, 서열식별번호:2, 4, 6은 핵산 서열임:
V 세그먼트: IGHV4-39*01
D 세그먼트: IGHD1-26*01
J 세그먼트: IGHJ4*02
Figure 112017126963818-pct00005
Figure 112017126963818-pct00006
1.7.3 hAb - VL (23195- VL ): (아미노산의 경우 서열식별번호:47 및 핵산의 경우 서열식별번호:48) 경쇄 CDR 1-3을 가짐: 각각 서열식별번호: 7, 9, 11은 아미노산 서열이고, 서열식별번호:8, 10, 12는 핵산 서열임:
V 세그먼트: IGLV2-14*01
J 세그먼트: IGLJ3*02
Figure 112017126963818-pct00007
Figure 112017126963818-pct00008
1.49.9 hAb - VH (20951- VH ): (아미노산의 경우 서열식별번호:49 및 핵산의 경우 서열식별번호:50) 중쇄 CDR 1-3을 가짐: 각각 서열식별번호: 13, 15, 5는 아미노산 서열이고, 서열식별번호:14, 16, 6은 핵산 서열임:
V 세그먼트: IGHV4-39*01
D 세그먼트: IGHD1-26*01
J 세그먼트: IGHJ4*02
Figure 112017126963818-pct00009
Figure 112017126963818-pct00010
1.49.9 hAb - VL (21526- VL ): (아미노산의 경우 서열식별번호:51 및 핵산의 경우 서열식별번호:52) 경쇄 CDR 1-3을 가짐: 각각 서열식별번호: 7, 17, 11은 아미노산 서열이고, 서열식별번호:8, 18, 12는 핵산 서열임:
V 세그먼트: IGLV2-14*01
J 세그먼트: IGLJ3*02
Figure 112017126963818-pct00011
Figure 112017126963818-pct00012
1.103.11 hAb - VH (20975- VH ): (아미노산의 경우 서열식별번호:53 및 핵산의 경우 서열식별번호:54) 중쇄 CDR 1-3을 가짐: 각각 서열식별번호: 1, 15, 5는 아미노산 서열이고, 서열식별번호:2, 16, 6은 핵산 서열임:
V 세그먼트: IGHV4-39*01
D 세그먼트: IGHD1-26*01
J 세그먼트: IGHJ4*02
Figure 112017126963818-pct00013
Figure 112017126963818-pct00014
1.103.11 hAb - VL (21038- VL ): (아미노산의 경우 서열식별번호:55 및 핵산의 경우 서열식별번호:56) 경쇄 CDR 1-3을 가짐: 각각 서열식별번호: 7, 17, 19는 아미노산 서열이고, 서열식별번호:8, 18, 20은 핵산 서열임:
V 세그먼트: IGLV2-14*01
J 세그먼트: IGLJ3*02
Figure 112017126963818-pct00015
Figure 112017126963818-pct00016
1.139.15 hAb - VH (23521- VH ) (아미노산의 경우 서열식별번호:57 및 핵산의 경우 서열식별번호:58) 중쇄 CDR 1-3을 가짐: 각각 서열식별번호: 21, 23, 25는 아미노산 서열이고, 서열식별번호:22, 24, 26은 핵산 서열임:
V 세그먼트: IGHV4-39*01
D 세그먼트: IGHD6-13*01
J 세그먼트: IGHJ4*02
Figure 112017126963818-pct00017
Figure 112017126963818-pct00018
1.139.15 hAb - VL (22895- VL ) (아미노산의 경우 서열식별번호:59 및 핵산의 경우 서열식별번호:60) 경쇄 CDR 1-3을 가짐: 각각 서열식별번호: 27, 29, 31은 아미노산 서열이고, 서열식별번호: 28, 30, 32는 핵산 서열임:
V 세그먼트: IGLV2-18*02
J 세그먼트: IGLJ3*02
Figure 112017126963818-pct00019
Figure 112017126963818-pct00020
1.153.7 hAb - VH (20942- VH ): (아미노산의 경우 서열식별번호:61 및 핵산의 경우 서열식별번호:62) 중쇄 CDR 1-3을 가짐: 각각 서열식별번호: 33, 35, 37은 아미노산 서열이고, 서열식별번호: 34, 36, 38은 핵산 서열임:
V 세그먼트: IGHV3-23*01
D 세그먼트: IGHD7-27*01
J 세그먼트: IGHJ4*02
Figure 112017126963818-pct00021
Figure 112017126963818-pct00022
1.153.7 hAb - VL (21110- VL ) (아미노산의 경우 서열식별번호:63 및 핵산의 경우 서열식별번호:64) 경쇄 CDR 1-3을 가짐: 각각 서열식별번호: 39, 41, 43은 아미노산 서열이고, 서열식별번호: 40, 42, 44는 핵산 서열임:
V 세그먼트: IGLV3-9*01
J 세그먼트: IGLJ3*02
Figure 112017126963818-pct00023
Figure 112017126963818-pct00024
1.103.11-v2 hAb - VH (20975- VH ): (아미노산의 경우 서열식별번호:53 및 핵산의 경우 서열식별번호:54) 중쇄 CDR 1-3을 가짐: 각각 서열식별번호: 1, 15, 5는 아미노산 서열이고, 서열식별번호:2, 16, 6은 핵산 서열임:
V 세그먼트: IGHV4-39*01
D 세그먼트: IGHD1-26*01
J 세그먼트: IGHJ4*02
Figure 112017126963818-pct00025
Figure 112017126963818-pct00026
1.103.11-v2 hAb - VL (21038-2- VL ): (아미노산의 경우 서열식별번호:67 및 핵산의 경우 서열식별번호:68) 경쇄 CDR 1-3을 가짐: 각각 서열식별번호: 7, 17, 65는 아미노산 서열이고, 서열식별번호:8, 18, 66은 핵산 서열임:
V 세그먼트: IGLV2-14*01
J 세그먼트: IGLJ3*02
Figure 112017126963818-pct00027
Figure 112017126963818-pct00028
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1, 3, 5, 13, 15, 21, 23, 25, 33, 35 및 37로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 7, 9, 11, 17, 19, 27, 29, 31, 39, 41, 43 및 65로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 생성된 항체가 1종 이상의 특성에 있어서 모 항체에 비해 개선되도록 (예컨대, 개선된 항원-결합, 개선된 글리코실화 패턴, CDR 잔기 상에서 글리코실화 위험의 감소, CDR 잔기 상에서 탈아미노화의 감소, 증가된 약동학적 반감기, pH 민감성, 및 접합에 대한 상용성), 달리 모 항체 (즉, 상기 언급한 변형 또는 변화를 제외하고는 달리 동일한 세트의 CDR 서열을 갖는 항체)에 필적하도록, 또는 모 항체의 항원-결합 성질을 적어도 실질적으로 보유하도록, 본원에 제공된 1개 이상의 CDR 서열을 변형 또는 변화시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 15 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 15 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 23 및/또는 서열식별번호: 25를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 35 및/또는 서열식별번호: 37을 포함하는 중쇄 가변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9 및/또는 서열식별번호: 11을 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 17 및/또는 서열식별번호: 11을 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 17 및/또는 서열식별번호: 19를 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 29 및/또는 서열식별번호: 31을 포함하는 경쇄 가변 영역; 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 41 및/또는 서열식별번호: 43을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 17 및/또는 서열식별번호: 65를 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 a) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 9 및/또는 서열식별번호: 11을 포함하는 경쇄 가변 영역; b) 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 15 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 17 및/또는 서열식별번호: 11을 포함하는 경쇄 가변 영역; c) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 15 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 17 및/또는 서열식별번호: 19를 포함하는 경쇄 가변 영역; d) 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 23 및/또는 서열식별번호: 25를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 29 및/또는 서열식별번호: 31을 포함하는 경쇄 가변 영역; e) 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 35 및/또는 서열식별번호: 37을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 41 및/또는 서열식별번호: 43을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 f) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 15 및/또는 서열식별번호: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 17 및/또는 서열식별번호: 65를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는, 개선된 생물학적 활성, 예컨대 인간 PD-1에 대한 개선된 결합 친화도를 제공하도록 표 1에 제공된 CDR 서열을 1개 이상의 아미노산 치환을 함유하도록 변형시킬 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 항체 변이체 (예컨대, Fab 또는 scFv 변이체)의 라이브러리를 생성하고, 파지 디스플레이 기술에 의해 발현시킨 다음, 인간 PD-1에 대한 결합 친화도에 대해 스크리닝할 수 있다. 또 다른 예로, 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여, 인간 PD-1에 대한 항체의 결합을 실제로 시뮬레이션하고, 결합 영역을 형성하는 항체 상의 아미노산 잔기를 확인할 수 있다. 이러한 잔기는 결합 친화도의 감소를 방지하도록 치환 시에 피할 수 있거나 또는 더 강력한 결합을 제공하기 위해 치환의 표적으로 할 수 있다. 특정 실시양태에서, CDR 서열에서 적어도 1개의 (또는 모든) 치환(들)이 보존적 치환이다.
특정 실시양태에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 표 1에 열거된 것 (또는 것들)과 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 1개 이상의 CDR 서열을 포함하고, 동시에 상응하는 CDR 서열이 표 1에 열거된 것 (또는 것들)과 100% 서열 동일성을 갖는 것을 제외하고는 실질적으로 동일한 서열을 갖는 그의 모 항체와 유사하거나 그보다 훨씬 더 높은 수준으로 인간 PD-1에 대한 결합 친화도를 보유한다.
특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 완전 인간이다. 완전 인간 항체는 인간화 항체에서 종종 관찰되는 인간에서의 면역원성 및/또는 감소된 결합 친화도의 문제를 갖지 않는다.
일부 실시양태에서, 완전 인간 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 49, 서열식별번호: 53, 서열식별번호: 57, 서열식별번호: 61, 및 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 그의 상동성 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 51, 서열식별번호: 55, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 63, 서열식별번호: 67, 및 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 그의 상동성 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이들 완전 인간 항체는 바람직하게는 예시적인 항체: 1.7.3 hAb, 1.49.9 hAb, 1.103.11 hAb, 1.103.11-v2 hAb, 1.139.15 hAb, 및 1.153.7 hAb 중 하나와 유사한 수준으로 인간 PD-1에 대한 결합 친화도를 보유한다.
일부 실시양태에서, 완전 인간 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 a) 서열식별번호: 45를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 47을 포함하는 경쇄 가변 영역; b) 서열식별번호: 49를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 51을 포함하는 경쇄 가변 영역; c) 서열식별번호: 53을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 55를 포함하는 경쇄 가변 영역; d) 서열식별번호: 57을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 59를 포함하는 경쇄 가변 영역; e) 서열식별번호: 61을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 63을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는 f) 서열식별번호: 53을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 67을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본원에는 본원에 제공된 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편과 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항체 및 항원-결합 단편 또한 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 항체는 1.7.3 hAb, 1.49.9 hAb, 1.103.11 hAb, 1.103.11-v2 hAb, 1.139.15 hAb, 또는 1.153.7 hAb가 인간 또는 원숭이 PD-1에 결합하는 것을 예를 들어 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-7.5 M 미만, 10-8 M 미만, 10-8.5 M 미만, 10-9 M 미만, 또는 10-10 M 미만의 IC50 값 (즉, 50% 억제 농도)으로 차단한다. IC50 값은 경쟁 검정, 예컨대 ELISA 검정, 방사성 리간드 경쟁 결합 검정, 및 FACS 분석을 기준으로 측정한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 플라즈몬 공명 결합 검정에 의해 측정 시 ≤10-6 M (예를 들어, ≤5x10-7 M, ≤2x10-7 M, ≤10-7 M, ≤5x10-8 M, ≤2x10-8 M, ≤10-8 M, ≤5x10-9 M, ≤2x10-9 M, ≤10-9 M, 10-10 M)의 결합 친화도 (Kd)로 인간 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있다. 결합 친화도는 KD 값으로 표현될 수 있고, 이는 항원과 항원-결합 분자 사이의 결합이 평형에 도달하였을 때 해리율 대 회합률의 비 (koff/kon)로서 계산된다. 항원-결합 친화도 (예를 들어 KD)는 관련 기술분야에 공지된 적합한 방법, 예를 들어 비아코어와 같은 장비를 사용하는 플라즈몬 공명 결합 검정을 이용하여 적절히 측정할 수 있다 (예를 들어, Murphy, M. et al., Current protocols in protein science, Chapter 19, unit 19.14, 2006 참고).
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 단편은 0.1nM-100nM (예를 들어 0.1nM-50nM, 0.1nM-30nM, 0.1nM-20nM, 0.1nM-10nM, 또는 0.1nM-1nM)의 EC50 (즉, 50% 결합 농도)으로 인간 PD-1에 결합한다. 항체와 인간 PD-1의 결합은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 샌드위치 검정, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯, FACS 또는 다른 결합 검정에 의해 측정할 수 있다. 예시적인 예에서, 시험 항체 (즉, 일차 항체)를 고정된 인간 PD-1 또는 인간 PD-1 발현 세포에 결합하도록 허용하고, 미결합 항체를 세척한 후에, 시험 항체에 결합할 수 있는 표지된 이차 항체를 도입하여, 결합된 일차 항체의 검출을 허용한다. 고정된 PD-1을 사용하는 경우에는 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 또는 인간 PD-1 발현 세포를 사용하는 경우에는 FACS 분석을 이용하여 상기 검출을 수행할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 단편은 FACS 분석에 의해 측정 시 1nM 내지 10nM, 또는 1nM 내지 5nM의 EC50 (즉, 50% 유효 농도)으로 인간 PD-1에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 단편은 경쟁 검정에 의해 측정 시 0.2nM-100nM (예를 들어, 0.2nM-50nM, 0.2nM-30nM, 0.2nM-20nM, 0.2nM-10nM, 또는 1nM-10nM)의 IC50으로 인간 PD-1이 그의 리간드에 결합하는 것을 억제한다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 그의 단편은 인간 PD-1이 그의 리간드에 결합하는 것을 차단하여, 생물학적 활성, 예를 들어 활성화된 T 세포 (예컨대, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포)로부터 시토카인 생성의 유도, 활성화된 T 세포 (예컨대, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포) 증식의 유도, 및 T reg의 저해 기능의 역전을 제공한다. 예시적인 시토카인에는 IL-2 및 IFNγ가 포함된다. 용어 "IL-2"는 백색 혈액 세포 (예를 들어, 백혈구)의 활성을 조절하는 면역계에서의 시토카인 신호전달 분자의 유형인 인터류킨 2를 지칭한다. 용어 "인터페론 감마 (IFNγ)"는 자연 살해 (NK), NK T 세포, CD4+ 및 CD8+T 세포에 의해 생성되는 시토카인이며, 이는 대식세포의 결정적인 활성인자 및 주요 조직적합 복합체 (MHC) 분자 발현의 유도인자이다. 시토카인 생성은 관련 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어 ELISA에 의해 측정할 수 있다. [3H] 티미딘 도입 검정을 비롯하여 T 세포의 증식을 검출하는 방법 또한 이용할 수 있다.
항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 PD-1에 대해 특이적이다. 특정 실시양태에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 CD28 및/또는 CTLA-4에 결합하지 않는다. 예를 들어, CD28 및/또는 CTLA-4에 대한 결합 친화도는 PD-1에 비해 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만이다.
특정 실시양태에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 ELISA에 의해 측정 시 100nM 이하, 예를 들어 약 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9nM, 0.8nM, 0.7nM, 0.6nM, 0.5nM, 0.4nM, 0.3nM, 0.2nM, 0.1nM, 0.09nM, 0.08nM, 0.07nM, 0.06nM, 0.05nM, 0.04nM, 0.03nM, 0.02nM 또는 0.01nM 또는 그 이하의 EC50으로 원숭이 PD-1에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 약 1 nM -10nM의 EC50으로 원숭이 PD-1에 결합한다.
특정 실시양태에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 마우스 PD-1에는 결합하지 않지만, 인간 PD-1에 대한 것과 유사한 결합 친화도로 원숭이 PD-1에 결합한다. 예를 들어, 예시적인 항체 1.7.3 hAb, 1.49.9 hAb, 1.103.11 hAb, 1.103.11-v2 hAb, 1.139.15 hAb, 및 1.153.7 hAb와 마우스 PD-1의 결합은 통상적인 결합 검정, 예컨대 ELISA, 또는 FACS 분석에서 검출가능하지 않는 반면에, 이들 항체와 원숭이 PD-1의 결합은 ELISA 또는 FACS에 의해 측정 시 인간 PD-1에 대한 것과 유사한 친화도 또는 EC50 값을 갖는다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 감소된 또는 결핍된 이펙터 기능을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 감소된 또는 결핍된 이펙터 기능을 갖는 IgG4 이소형의 불변 영역을 갖는다. 이펙터 기능, 예컨대 ADCC 및 CDC는 PD-1 발현 세포에 대한 세포독성을 유도한다. 여러 세포, 예컨대 T 세포는 PD-1을 정상적으로 발현시킨다. 이들 정상 세포에 대한 잠재적인 원치않는 독성을 피하기 위해, 본원에 제공된 항체 및 항원-결합 단편의 특정한 실시양태는 감소된 또는 심지어 결핍된 이펙터 기능을 가질 수 있다. ADCC 또는 CDC 활성을 평가하기 위한 다양한 검정, 예를 들어 Fc 수용체 결합 검정, C1q 결합 검정, 및 세포 용해 검정이 공지되어 있으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 이론에 구애되기를 바라지는 않지만, 감소된 또는 결핍된 이펙터 기능, 예컨대 ADCC 또는 CDC를 갖는 항체는 PD-1-발현 세포, 예를 들어 이들 T 세포에 대해 최소의 세포독성을 나타내거나 세포독성을 나타내지 않을 것이며, 따라서 원치않는 부작용을 피하게 하는 반면에, PD-1의 차단은 암 또는 만성 감염과 같은 상태의 치료를 위해 면역계를 증강시킬 것으로 믿어진다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 감소된 부작용을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 항체 및 그의 항원-결합 단편은 완전 인간 IgG 서열을 가질 수 있으며, 따라서 인간화 항체 대응체에 비해 감소된 면역원성을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 본원에 제공된 항체 및 그의 항원-결합 단편은 IgG4 형태를 가져서 ADCC 및 CDC를 제거할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 이들이 면역원성 작용제, 예컨대 종양 세포, 정제된 종양 항원, 및 면역 자극 시토카인을 코딩하는 유전자로 형질감염된 세포, 종양 백신과 조합되어 사용될 수 있다는 점에서 유리하다. 또한, 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 조합 요법, 예컨대 표준 화학요법 및 방사선요법, 표적 기재 소분자 요법, 다른 신흥 면역 체크포인트 조절인자 요법에 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 항체-약물 접합체, 이중특이적 또는 다가 항체의 기재로서 사용될 수 있다.
본원에 제공된 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 이중특이적 항체, 표지된 항체, 2가 항체, 또는 항-유전자형 항체일 수 있다. 재조합 항체는 재조합 방법을 이용하여 동물에서가 아니라 시험관내에서 제조된 항체이다. 이중특이적 또는 2가 항체는 2가지 상이한 모노클로날 항체의 단편을 갖는 인공 항체이고, 2가지 상이한 항원과 결합할 수 있다. "2가"인 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 2개의 항원-결합 부위를 포함한다. 2개의 항원 결합 부위는 동일한 항원에 결합할 수 있거나, 또는 이들은 상이한 항원에 각각 결합할 수 있으며, 이 경우 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 "이중특이적"인 것을 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 완전 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 완전 인간 항체는 재조합 방법을 이용하여 제조된다. 예를 들어, 트랜스제닉 동물, 예컨대 마우스는 인간 이뮤노글로불린 유전자의 트랜스진 또는 트랜스염색체를 보유하도록 제조될 수 있으며, 따라서 적절한 항원, 예컨대 인간 PD-1로 면역화시킨 후에 완전 인간 항체를 생성할 수 있다. 완전 인간 항체는 이러한 트랜스제닉 동물로부터 단리할 수 있거나, 또는 대안적으로 트랜스제닉 동물의 비장 세포를 불멸 세포주와 융합하여, 완전 인간 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 생성함으로써 하이브리도마 기술에 의해 제조될 수 있다. 예시적인 트랜스제닉 동물에는 비제한적으로 옴니래트(OmniRat, 래트 이뮤노글로불린 유전자의 내인성 발현이 불활성화되고, 그와 동시에 기능적 재조합 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 함유하도록 조작됨); 옴니마우스(OmniMouse, 마우스 이뮤노글로불린 유전자의 내인성 발현이 불활성화되고, 그와 동시에 J-locus 결실 및 C-kappa 돌연변이를 갖는 재조합 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 함유하도록 조작됨); 옴니플릭(OmniFlic, 래트 이뮤노글로불린 유전자의 내인성 발현이 불활성화되고, 그와 동시에 단일의 공통된, 재배열된 VkJk 경쇄 및 기능적 중쇄를 갖는 재조합 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 함유하도록 조작된 트랜스제닉 래트)이 포함된다. 상세한 정보는 Osborn M. et al., Journal of Immunology, 2013, 190: 1481-90; Ma B. et al., Journal of Immunological Methods 400-401 (2013) 78-86; Geurts A. et al., Science, 2009, 325:433; 미국 특허 8,907,157; EP 특허 2152880B1; EP 특허 2336329B1에서 추가로 확인할 수 있으며, 이들 모두는 전문이 본원에 참고로 포함된다. 다른 적합한 트랜스제닉 동물, 예를 들어 휴맵(HuMab) 마우스 (상세한 정보는 Lonberg, N. et al. Nature 368(6474): 856 859 (1994) 참고), 제노-마우스(Xeno-Mouse) (Mendez et al. Nat Genet., 1997, 15:146-156), 트랜스크로모(TransChromo) 마우스 (Ishida et al. Cloning Stem Cells, 2002, 4:91-102) 및 벨로크이뮨(VelocImmune) 마우스 (Murphy et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111:5153-5158), 키마우스(Kymouse) (Lee et al. Nat Biotechnol, 2014, 32:356-363), 및 트랜스제닉 래빗 (Flisikowska et al. PLoS One, 2011, 6:e21045) 또한 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 낙타화 단일 도메인 항체, 디아바디, scFv, scFv 이합체, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv 단편, Fab, Fab', F(ab')2, ds 디아바디, 나노바디, 도메인 항체, 또는 2가 도메인 항체이다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 이뮤노글로불린 불변 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이뮤노글로불린 불변 영역은 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH1-CH2, 또는 CH1-CH3 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 불변 영역은 바람직한 성질을 부여하는 하나 이상의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 불변 영역은 하나 이상의 이펙터 기능을 감소 또는 결핍시키거나, FcRn 수용체 결합을 개선시키거나, 또는 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입시키도록 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편은 접합체를 추가로 포함한다. 다양한 접합체가 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편에 연결될 수 있는 것으로 고려된다 (예를 들어, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York, (1989) 참고). 이들 접합체는 다른 방법들 중에서 공유 결합, 친화성 결합, 층간 삽입, 배위 결합, 복합체화, 회합, 블렌딩 또는 첨가에 의해 항체 또는 항원-결합 단편에 연결될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 하나 이상의 접합체에 결합하기 위해 사용될 수 있는, 에피토프 결합 부분의 외부에 특정한 부위를 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 이러한 부위는 1개 이상의 반응성 아미노산 잔기, 예컨대 시스테인 또는 히스티딘 잔기를 포함하여, 접합체와의 공유 연결을 용이하게 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 접합체에 간접적으로 연결되거나, 또는 또 다른 접합체를 통해 연결될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편은 비오틴에 접합된 다음, 아비딘에 접합된 제2 접합체에 간접적으로 접합될 수 있다. 접합체는 검출가능한 표지, 약동학적 개질 모이어티, 정제 모이어티, 또는 세포독성 모이어티일 수 있다. 검출가능한 표지의 예에는 형광 표지 (예를 들어, 플루오레세인, 로다민, 단실, 피코에리트린, 또는 텍사스 레드), 효소-기질 표지 (예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 루세리페라제, 글루코아밀라제, 리소자임, 당류 옥시다제 또는 β-D-갈락토시다제), 방사성 동위원소 (예를 들어 123I, 124I, 125I, 131I, 35S, 3H, 111In, 112In, 14C, 64Cu, 67Cu, 86Y, 88Y, 90Y, 177Lu, 211At, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 및 32P, 다른 란탄 계열 원소, 발광 표지), 발색단 모이어티, 디곡시게닌, 비오틴/아비딘, DNA 분자 또는 검출용 금이 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합체는 약동학적 개질 모이어티, 예컨대 항체의 반감기를 증가시키는데 도움이 되는 PEG일 수 있다. 다른 적합한 중합체에는 예컨대 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체 등이 포함된다. 특정 실시양태에서, 접합체는 정제 모이어티, 예컨대 자성 비드일 수 있다. "세포독성 모이어티"는 세포에 해로운 또는 세포를 손상 또는 사멸시킬 수 있는 임의의 작용제일 수 있다. 세포독성 모이어티의 예에는 비제한적으로 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 푸로마이신 및 그의 유사체, 항대사물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예를 들어, 다우노루비신 (이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항세포분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함된다.
폴리뉴클레오티드 및 재조합 방법
본 개시내용은 항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 표 1에 제공된 CDR 서열을 코딩하는, 표 1에 제시된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 중쇄 가변 영역을 코딩하고, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 50, 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 62, 및 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 그의 상동성 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 경쇄 가변 영역을 코딩하고, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 56, 서열식별번호: 60, 서열식별번호: 64, 서열식별번호: 68, 및 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 서열 동일성을 갖는 그의 상동성 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 백분율 동일성은 유전자 코드 축퇴성 때문이며, 코딩된 단백질 서열은 변하지 않고 유지된다.
항-PD-1 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 표 1의 서열)을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 추가의 클로닝 (DNA 증폭) 또는 발현을 위해 관련 기술분야에 공지된 재조합 기술을 이용하여 벡터에 삽입될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체를 관련 기술분야에 공지된 상동성 재조합에 의해 생성할 수 있다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA를 통상적인 절차를 이용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리 및 시퀀싱한다. 여러 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 (예를 들어, SV40, CMV, EF-1α), 및 전사 종결 서열 중 하나 이상이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 벡터 시스템에는 포유류, 박테리아, 효모 시스템 등이 포함되며, 플라스미드, 예컨대 이로 제한되지 않지만 pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2.2 등 및 다른 실험실용 및 상업적으로 입수가능한 벡터를 포함한다. 적합한 벡터는 플라스미드, 또는 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함할 수 있다.
항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 클로닝 또는 유전자 발현을 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본원의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현시키기에 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모, 또는 상기 기재된 보다 고등한 진핵세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵세포에는 유박테리아, 예컨대 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 예컨대 에스케리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르비니아(Erwinia), 클레브시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실리(Bacilli), 예컨대 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리체니포르미스(B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 피. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 포함된다.
원핵세포 이외에도, 진핵세포 미생물, 예컨대 사상균 또는 효모가 항-PD-1 항체-코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 저등 진핵세포 숙주 미생물 중에서 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반적인 제빵 효모가 가장 흔히 사용된다. 그러나, 수많은 다른 속, 종 및 균주, 예컨대 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예컨대 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis, ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus, ATCC 16,045), 케이. 위케라미이(K. wickeramii, ATCC 24,178), 케이. 왈티이(K. waltii, ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum, ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마르크시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia, EP 402,226); 피치아 파스토리스(Pichia pastoris, EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia, EP 244,234); 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa); 슈반니오마이세스(Schwanniomyces), 예컨대 슈반니오마이세스 오씨덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상균, 예컨대 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스퍼길루스(Aspergillus) 숙주, 예컨대 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니게르(A. niger)가 흔히 입수가능하며 본원에서 유용하다.
본원에 제공된 글리코실화 항체 또는 항원-단편의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 수많은 바쿨로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda, 유충), 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti, 모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus, 모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster, 초파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 확인된 바 있다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 대중적으로 이용가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로서 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물 또한 숙주로서 사용될 수 있다.
그러나, 척추동물 세포가 가장 큰 관심을 받아 왔으며, 및 배양물 (조직 배양물) 중에서 척추동물 세포의 전파가 일반적인 절차가 되기 시작하였다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁액 배양물 중에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개과 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주 (Hep G2)이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 293F 세포이다.
숙주 세포는 항-PD-1 항체 생산을 위해 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터의 유도, 형질전환체의 선별, 또는 원하는 서열을 코딩하는 유전자의 증폭에 적절하도록 개질된 통상적인 영양 배지에서 배양된다.
본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하기 위해 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 배지, 예컨대 햄(Ham) F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM), (시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코(Dulbecco) 개질된 이글(Eagle) 배지 (DMEM), 시그마)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), 미국 특허 번호 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 기재된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 이들 임의의 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예컨대, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예컨대, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제 (예컨대, HEPES), 뉴클레오티드 (예컨대, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예컨대, 젠타마이신(GENTAMYCIN)™ 약물), 미량 원소 (보통 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되었을 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대해 이전에 기재된 바와 같고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
재조합 기술을 이용하는 경우, 항체는 세포내에서 생성되거나, 원형질막주위 공간에서 생성되거나, 또는 배지에 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생성되는 경우, 첫번째 단계로서 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 잔해를 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)는 이. 콜라이의 원형질막주위 공간으로 분비된 항체를 단리하는 절차를 기재한다. 간략히, 세포 페이스트를 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동시킨다. 세포 잔해를 원심분리에 의해 제거할 수 있다. 항체를 배지에 분비한 경우에는, 일반적으로 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 먼저 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 여과기, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 이용하여 농축시킨다. 단백질 가수분해를 억제하기 위해 상기 단계 중 임의의 단계에 프로테아제 억제제, 예컨대 PMSF를 포함시킬 수있고, 우발성 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제를 포함시킬 수 있다.
상기 세포로부터 제조된 항체를 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, DEAE-셀룰로스 이온 교환 크로마토그래피, 황산암모늄 침전, 염석, 및 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있으며, 친화도 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화도 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소형에 따라 좌우된다. 단백질 A를 이용하여 인간 .감마.1, .감마.2, 또는 .감마.4 중쇄를 기재로 하는 항체를 정제할 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소형에 대해 및 인간 .감마.3에 대해 권고된다 (Guss et al., EMBO J. 5:1567 1575 (1986)). 친화도 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 조절 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스에 의해 달성될 수 있는 것보다 빠른 유속 및 짧은 가공 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX.TM. 수지 (제이. 티. 베이커(J. T. Baker), 뉴저지주 필스버그)가 정제에 유용하다. 회수되는 항체에 따라 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예컨대 이온-교환 칼럼 상에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예컨대, 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 세파로즈(SEPHAROSE)™ 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전 또한 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 이후, 관심 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물을 약 2.5-4.5 pH의 용리 완충제를 이용하여, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25M 염)에서 수행되는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용할 수 있다.
키트
본 개시내용은 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 생물학적 샘플에서 PD-1의 존재 또는 수준을 검출하는데 유용하다. 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 검출가능한 표지와 접합된 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정한 다른 실시양태에서, 키트는 비표지된 항-PD-1 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하고, 비표지된 항-PD-1 항체에 결합할 수 있는 표지된 이차 항체를 추가로 포함한다. 키트는 사용 설명서, 및 키트에서 각각의 성분들을 분리시키는 포장을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 샌드위치 검정, 예컨대 ELISA에서 또는 이뮤노그래픽 검정에서 유용한 기질 또는 기기와 회합된다. 유용한 기질 또는 기기는 예를 들어 미세역가 플레이트 및 시험 스트립일 수 있다.
제약 조성물 및 치료 방법
본 개시내용은 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 1종 이상의 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 추가로 포함한다.
본원에 개시된 제약 조성물에서 사용하기 위한 제약상 허용가능한 담체에는 예를 들어 제약상 허용가능한 액체, 겔 또는 고체 담체, 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장화제, 완충제, 항산화제, 마취제, 현탁화제/분산화제, 격리제 또는 킬레이팅제, 희석제, 아주반트, 부형제, 또는 무독성 보조 물질, 관련 기술분야에 공지된 다른 성분, 또는 이들의 다양한 조합물이 포함될 수 있다.
적합한 성분에는 예를 들어 항산화제, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 보존제, 윤활제, 향미제, 증점제, 착색제, 유화제 또는 안정화제, 예컨대 당 및 시클로덱스트린이 포함될 수 있다. 적합한 항산화제에는 예를 들어 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 티오황산나트륨, 백금, 카탈라제, 시트르산, 시스테인, 티오글리세롤, 티오글리콜산, 티오소르비톨, 부틸화 히드록사니솔, 부틸화 히드록시톨루엔 및/또는 프로필 갈레이트가 포함될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편 및 접합체를 포함하는 조성물 중에 하나 이상의 항산화제, 예컨대 메티오닌을 포함시키면, 항체 또는 항원-결합 단편의 산화를 감소시킬 수 있다. 이러한 산화의 감소는 결합 친화도의 손실을 방지하거나 감소시켜, 항체 안정성을 개선시키고 반감기를 최대화시킨다. 따라서, 특정 실시양태에서 본원에 개시된 하나 이상의 항체 또는 항원-결합 단편, 및 하나 이상의 항산화제, 예컨대 메티오닌을 포함하는 조성물이 제공된다. 추가로, 항체 또는 항원-결합 단편을 하나 이상의 항산화제, 예컨대 메티오닌과 혼합함으로써, 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편의 산화를 방지하고, 반감기를 연장시키고/거나 효능을 개선시키는 방법이 제공된다.
추가로 예시하기 위해, 제약상 허용가능한 담체에는 예를 들어 수성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사액, 링거(Ringer) 주사액, 등장성 덱스트로즈 주사액, 멸균수 주사액, 또는 덱스트로즈 및 락테이트화 링거 주사액, 비수성 비히클, 예컨대 식물성 기원의 고정유, 면실유, 옥수수유, 참깨유 또는 낙화생유, 살박테리아성 또는 살진균성 농도의 항미생물제, 등장화제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로즈, 완충제, 예컨대 포스페이트 또는 시트레이트 완충제, 항산화제, 예컨대 중황산나트륨, 국소 마취제, 예컨대 프로카인 히드로클로라이드, 현탁화제 및 분산화제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 또는 폴리비닐피롤리돈, 유화제, 예컨대 폴리소르베이트 80 (TWEEN-80), 격리제 또는 킬레이팅제, 예컨대 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 EGTA (에틸렌 글리콜 테트라아세트산), 에틸 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산이 포함될 수 있다. 담체로서 사용되는 항미생물제는 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤즈에토늄 클로라이드를 포함하는 다중-용량 용기 중의 제약 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 부형제에는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤 또는 에탄올이 포함될 수 있다. 적합한 무독성 보조 물질에는 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충화제, 안정화제, 가용성 강화제, 또는 아세트산나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 또는 시클로덱스트린과 같은 작용제가 포함될 수 있다.
제약 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 환제, 캡슐, 정제, 서방형 제제, 또는 분말일 수 있다. 경구 제제는 표준 담체, 예컨대 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다.
실시양태에서, 제약 조성물을 주사가능한 조성물로 제제화할 수 있다. 주사가능한 제약 조성물은 임의의 통상적인 형태, 예컨대 액체 용액, 현탁액 또는 에멀젼을 생성하는데 적합한 액체 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 고체 형태로 제조될 수 있다. 주사용 제제에는 즉시 주사용 멸균성 및/또는 비발열성 용액, 멸균성의 건조한 가용성 생성물, 예컨대 사용 직전에 용매와 즉시 조합되는 동결건조된 분말, 예컨대 피하용 정제, 즉시 주사용 멸균성 현탁액, 사용하기 직전에 비히클과 즉시 조합되는 멸균성의 건조한 불용성 생성물, 및 멸균성 및/또는 비발열성 에멀젼이 포함될 수 있다. 용액은 수성 또는 비수성일 수 있다.
특정 실시양태에서, 단위-용량 비경구 제제는 앰풀, 바이알, 또는 니들을 갖는 시린지로 포장된다. 비경구 투여를 위한 모든 제제는 관련 기술분야에 공지되고 실시되는 바와 같이 멸균성이고 비발열성이어야 한다.
특정 실시양태에서, 멸균성의 동결건조된 분말은 적합한 용매 중에 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편을 용해시킴으로써 제조된다. 용매는 분말, 또는 분말로부터 제조된 재구성된 용액의 안정성 또는 다른 약리학적 요소를 개선시키는 부형제를 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제에는 물, 덱스트로즈, 소르비탈, 프럭토스, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코스, 수크로스 또는 다른 적합한 작용제가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서 용매는 약 중성 pH에서 완충제, 예컨대 시트레이트, 인산나트륨 또는 인산칼륨, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 이러한 다른 완충제를 함유할 수 있다. 용액을 후속적으로 멸균 여과한 후, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 조건 하에 동결건조시키면 원하는 제제가 제공된다. 한 실시양태에서, 생성된 용액을 동결건조를 위한 바이알에 배분할 것이다. 각각의 바이알은 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 단일 용량 또는 다중 용량, 또는 그의 조성물을 함유할 수 있다. 정확한 샘플 채취 및 정확한 투약을 용이하게 하기 위해, 용량 또는 용량 세트에 필요한 것보다 조금 더 많게 (예를 들어, 약 10%) 바이알을 과충전하는 것이 가능하다. 동결건조된 분말을 적절한 조건 하에, 예컨대 약 4℃ 내지 실온에서 보관할 수 있다.
동결건조된 분말을 주사용수로 재구성하여 비경구 투여에 사용되는 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 멸균성 및/또는 비발열성 물 또는 다른 액체로 재구성하기 위해, 적합한 담체를 동결건조된 분말에 첨가한다. 정확한 양은 주어지는 선택된 요법에 따라 좌우되고, 경험에 의해 결정될 수 있다.
PD-1과 연관된 또는 관련된 상태 또는 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편의 치료 유효량을 투여하여, PD-1과 연관된 상태 또는 장애를 치료 또는 예방하는 치료 방법 또한 제공된다. 또 다른 측면에서, 면역 반응의 상향조절로부터 이익을 얻을 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응의 상향조절로부터 이익을 얻을 상태를 치료하는 방법이 제공된다.
본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편의 치료 유효량은 관련 기술분야에 공지된 다양한 인자, 예를 들어 대상체의 체중, 연령, 과거 병력, 현재 투약, 건강 상태, 및 교차-반응, 알러지, 과민증 및 불리한 부작용의 가능성, 뿐만 아니라 투여 경로 및 종양 진행 단계에 따라 좌우될 것이다. 이들 및 다른 상황 또는 요건에 의해 지시되는 바와 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자 (예를 들어, 의사 또는 수의사)에 의해 용량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편은 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg (예를 들어, 약 0.01 mg/kg, 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 15 mg/kg, 약 20 mg/kg, 약 25 mg/kg, 약 30 mg/kg, 약 35 mg/kg, 약 40 mg/kg, 약 45 mg/kg, 약 50 mg/kg, 약 55 mg/kg, 약 60 mg/kg, 약 65 mg/kg, 약 70 mg/kg, 약 75 mg/kg, 약 80 mg/kg, 약 85 mg/kg, 약 90 mg/kg, 약 95 mg/kg, 또는 약 100 mg/kg)의 치료 유효 용량으로 투여될 수 있다. 이들 특정한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편을 약 50 mg/kg 이하의 용량으로 투여하고, 이들 특정한 실시양태에서 용량은 10 mg/kg 이하, 5 mg/kg 이하, 1 mg/kg 이하, 0.5 mg/kg 이하, 또는 0.1 mg/kg 이하이다. 특정 실시양태에서, 투여 용량을 치료 과정에서 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 초기 투여 용량이 후속 투여 용량보다 많을 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여 용량을 대상체의 반응에 따라 치료 과정에서 변화시킬 수 있다.
투여 섭생법은 원하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 용량을 투여할 수 있거나, 또는 몇몇 분할된 용량을 시간에 걸쳐 투여할 수 있다.
본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 관련 기술분야에 공지된 임의의 경로, 예를 들어 비경구 경로 (예를 들어, 피하, 복막내, 정맥내, 예컨대 정맥내 주입, 근육내, 또는 피내 주사) 또는 비경구가 아닌 경로 (예를 들어, 경구, 비내, 안구내, 설하, 직장 또는 국소)로 투여될 수 있다.
PD-1과 연관된 상태 및 장애는 면역 관련 질환 또는 장애일 수 있다. 특정 실시양태에서, PD-1 연관 상태 및 장애에는 종양 및 암, 예를 들어 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 신세포 암, 결장직장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암종, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선 암종, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상 식육종, 메르켈 세포 암, 및 다른 혈액암, 예컨대 고전적 호지킨 림프종 (CHL), 원발성 종격 거대 B-세포 림프종, T-세포/조직구-풍부 B-세포 림프종, EBV-양성 및 -음성 PTLD, 및 EBV-연관 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 형질모세포 림프종, 외부 NK/T-세포 림프종, 비인두 암종, 및 HHV8-연관 원발성 삼출 림프종, 호지킨 림프종, 중추 신경계 (CNS)의 신생물, 예컨대 원발성 CNS 림프종, 척추 종양, 뇌간 신경교종이 포함된다. 특정 실시양태에서, 종양 및 암은 전이성, 특히 PD-L1을 발현시키는 전이성 종양이다. 특정 실시양태에서, PD-1 연관 상태 및 장애에는 자가면역 질환, 예컨대 전신 홍반성 루프스 (SLE), 건선, 전신 피부경화증, 자가면역 당뇨병 등이 포함된다. 특정 실시양태에서, PD-1 연관 상태 및 장애에는 감염성 질환, 예컨대 만성 바이러스 감염, 예를 들어 B형 간염, C형 간염의 바이러스 감염, 헤르페스 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, HIV, 시토메갈로바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 유형 I, 단순 헤르페스 바이러스 유형 2, 인간 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 전염과 연관된 카포시 웨스트 육종, 얇은 고리 바이러스 (토르퀘테노바이러스), JC 바이러스 또는 BK 바이러스 감염이 포함된다.
사용 방법
본 개시내용은 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 PD-1과 연관된 상태 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 개체는 PD-1 길항제에 반응할 가능성이 있는 장애 또는 상태를 가진 것으로 확인된 바 있다.
생물학적 관심 샘플에서 PD-L1의 존재 또는 수준은, 상기 생물학적 샘플이 유래된 개체가 PD-1 길항제에 반응할 가능성이 있는지 여부에 대한 지표일 수 있다. 개체로부터의 생물학적 시험 샘플에서 PD-L1의 존재 또는 수준을 결정하는 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 시험 샘플을 발현된 PD-L1 단백질에 결합하여 그를 검출하는 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 노출시킬 수 있다. 대안적으로, PD-L1은 또한 qPCR, 역전사효소 PCR, 마이크로어레이, SAGE, FISH 등과 같은 방법을 이용하여 핵산 발현 수준에서 검출될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험 샘플은 암 세포 또는 조직, 또는 종양 침윤 면역 세포로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 생물학적 시험 샘플에서 PD-L1의 존재 또는 상향조절된 수준은 반응할 가능성이 있음을 나타낸다. 본원에 사용된 용어 "상향조절된"은, 동일항 항체를 이용하여 검출된 기준 샘플에서 PD-L1 단백질 수준에 비해, 본원에 제공된 항체 또는 항원-결합 단편을 이용하여 검출시, 시험 샘플에서 PD-L1의 단백질 수준이 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 이상 또는 그보다 많이 전체 증가한 것을 지칭한다. 기준 샘플은 건강한 또는 질환이 없는 개체로부터 수득한 대조군 샘플, 또는 시험 샘플을 수득한 동일한 개체로부터 수득된 건강한 또는 질환이 없는 샘플일 수 있다. 예를 들어, 기준 샘플은 시험 샘플 (예를 들어, 종양)에 인접하거나 근처에 있는 질환이 없는 샘플일 수 있다.
본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편을 단독으로, 또는 1종 이상의 추가의 치료 수단 또는 치료제와 조합하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편을 화학요법, 방사선요법, 암 치료를 위한 수술 (예를 들어, 종양절제), 1종 이상의 제토제, 또는 화학요법으로 인한 합병증에 대한 다른 치료, 또는 암 또는 PD-1에 의해 매개된 임의의 의학적 장애의 치료에 사용하기 위한 다른 치료제와 조합하여 투여할 수 있다. 이들 특정한 실시양태에서, 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 투여되는 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편은 1종 이상의 추가의 치료제와 동시에 투여될 수 있고, 이들 특정한 실시양태에서 항체 또는 항원-결합 단편 및 추가의 치료제(들)은 동일한 제약 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 그러나, 또 다른 치료제와 "조합하여" 투여되는 항체 또는 항원-결합 단편이 상기 치료제와 동시에 투여되거나 또는 동일한 조성물 중에서 투여될 필요는 없다. 또 다른 작용제 이전에 또는 이후에 투여되는 항체 또는 항원-결합 단편은, 심지어 상기 항체 또는 항원-결합 단편 및 제2 작용제를 상이한 경로로 투여하더라도, 상기 문구가 본원에서 사용되는 바와 같이 상기 작용제와 "조합하여" 투여되는 것으로 고려된다. 가능한 경우, 본원에 개시된 항체 또는 항원-결합 단편과 조합하여 투여되는 추가의 치료제는 추가의 치료제의 제품 정보 시트에 열거된 스케쥴에 따라, 또는 Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57th Ed; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002)) 또는 관련 기술분야에 공지된 프로토콜에 따라 투여된다.
특정 실시양태에서, 치료제는 암에 대한 면역 반응을 유도하거나 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 종양 백신을 이용하여 특정한 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한, 시토카인 요법을 이용하여 면역계에 대해 종양 항원 제시를 강화시킬 수 있다. 시토카인 요법의 예에는 비제한적으로 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β 및 -γ, 콜로니 자극 인자, 예컨대 대식세포-CSF, 과립구 대식세포 CSF, 및 과립구-CSF, 인터류킨, 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 및 IL-12, 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-α 및 TNF-β가 포함된다. 면역억제 표적을 불활성화시키는 작용제, 예를 들어 TGF-베타 억제제, IL-10 억제제, 및 Fas 리간드 억제제 또한 사용될 수 있다. 작용제의 또 다른 군에는 종양 또는 암 세포에 대한 면역 반응성을 활성화시키는 작용제, 예를 들어 T 세포 활성화를 강화시키는 작용제 (예를 들어, T 세포 동시자극 분자, 예컨대 CTLA-4, ICOS 및 OX-40의 효능제), 및 수지상 세포 기능 및 항원 제시를 강화시키는 작용제가 포함된다.
청구된 발명을 더 잘 예시하기 위해 하기 실시예가 제공되고, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 하기 기재된 모든 특정한 조성물, 물질 및 방법은 전체적으로 또는 부분적으로 본 발명의 범위 내에 속한다. 이들 구체적인 조성물, 물질 및 방법은 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 단지 본 발명의 범위 내에 속하는 구체적인 실시양태를 예시하기 위한 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 발명적 능력을 행사하지 않고 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 등가의 조성물, 물질 및 방법을 개발할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 유지되는한 본원에 기재된 절차에서 여러 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명자들의 의도는 이러한 변형이 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다.
실시예 1: 항체 하이브리도마 생성
1.1 면역원 생성: PD-1 및 PD-L1 ECD 또는 전장을 코딩하는 DNA를 합성하고, 발현 벡터 pcDNA3.3에 삽입하였다. 플라스미드 DNA를 맥스-프렙하고, 삽입된 DNA 서열을 시퀀싱에 의해 확인하였다. 인간 PD-1 ECD 유전자를 CHO-S 또는 HEK293 세포에 형질감염시킴으로써 인간 Fc, 마우스 Fc 및 His 태그를 비롯하여 다양한 태그를 함유하는 융합 단백질 PD-1 ECD 및 PD-L1 ECD를 수득하였다. 5일 후, 일시적으로 형질감염된 세포의 배양물로부터 수확한 상청액을 단백질 정제를 위해 사용하였다. 융합 단백질을 면역화 및 스크리닝에 사용하기 위해 정제하고 정량화하였다.
1.2 안정한 세포주 수립. 항체 스크리닝 및 확인을 위한 도구를 수득하기 위해, PD-1 및 PD-L1 형질감염체 세포주를 생성하였다. 간략히, CHO-K1, 293F 또는 Ba/F3 세포를 리포펙타민 2000 형질감염 키트를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 전장 PD-1 또는 PD-L1을 함유하는 pCND3.3 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 48-72시간 후, 형질감염된 세포를 선별을 위해 블라스티시딘 또는 G418을 함유하는 배지에서 배양하였다. 시간이 경과함에 따라 그들의 게놈 DNA에 안정하게 도입된 PD-1 또는 PD-L1 유전자를 갖는 세포를 선별할 것이다. 그 동안에, 관심 유전자 PD-1 및 PD-L1 발현에 대해 세포를 체크하였다. 상기 발현이 확인되면, 단일 관심 클론을 한계 희석에 의해 취하고, 큰 부피로 규모를 증가시켰다. 이어서, 수립된 모노클로날 세포주를 저용량의 항생제 블라스티시딘 또는 G418을 함유하는 배지에서 유지시켰다.
1.3 항체 하이브리도마 생성.
1.3.1 면역화 및 세포 융합: 8-10주령의 OMT-래트 (오픈 모노클로날 테크놀로지, 인크.(Open Monoclonal Technology, Inc., 미국 팔로알토)로부터 입수함)의 발바닥에 타이터맥스(TiterMax) 중 10μg의 인간 PD-1 ECD 단백질을 처음 접종하여 면역화시키고, 3일마다 알루미늄 중 PD-1 ECD 단백질로 면역화를 반복하였다. 혈청 수집을 위해 2주마다 래트를 채혈하고, 항체 역가를 ELISA 또는 FACS 검정에 의해 측정하였다. 항체 역가가 충분히 높이 도달하였을 때, 래트에게 아주반트 없이 (대신에 100μl 1XPBS를 첨가함) 최종 접종하였고, 세포 융합을 다음과 같이 수행하였다: 면역화된 OMT-래트의 림프절로부터 단리된 B 림프구를 골수종 세포와 합하였다 (1:1 비). 세포 혼합물을 세척하고, 5-10ml ECF 용액으로 현탁시켰다. ECF 용액을 첨가하여 농도를 2x106개 세포/ml로 조정하였다. 전자 세포 융합 이후, 즉시 융합 챔버로부터의 세포 현탁액을 더 많은 부피의 배지를 함유하는 멸균 튜브로 옮겼다. 37℃에서 24시간 넘게 인큐베이션한 후, 세포 현탁액을 혼합하고, 96-웰 플레이트에 피펫팅하였다 (0.5x106개 세포/플레이트). 세포를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 클론이 매우 풍부해졌을 때, 항체 스크리닝을 위해 96-웰 플레이트로부터의 100μl 상청액을 검정으로 옮겼다.
1.3.2 하이브리도마 상청액의 제1 및 확인 스크리닝: 하이브리도마 상청액이 PD-1 단백질에 결합하는 것을 시험하기 위해 ELISA 검정을 제1 스크린 방법으로 이용하였다. 간략히, 플레이트 (눈크(Nunc))를 인간 PD-1 세포외 도메인의 가용성 단백질 1 μg/ml로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 차단 및 세척 이후, 하이브리도마 상청액을 코팅된 플레이트로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고, 후속적으로 이차 항체 염소 항 래트 IgG1 HRP (베틸(Bethyl)) 및 염소 항 래트 IgG2b HRP (베틸)와 함께 45분 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, TMB 기질을 첨가하고, 2M HCl에 의해 상호작용을 중단시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이스(Molecular Device))를 이용하여 판독하였다. 세포막에서 발현된 배좌 PD-1 분자에 대한 PD-1 항체의 본래의 결합을 확인하기 위해, FACS 분석을 PD-1 형질감염된 CHO-S 세포주에 대해 수행하였다. 인간 PD-1을 발현시키는 CHO-S 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트 (BD)에 1x106개 세포/ml의 밀도로 옮겼다. 이어서, 하이브리도마 상청액을 상기 플레이트로 옮기고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1XPBS/1%BSA로 세척한 후, 이차 항체 염소 항 래트 FITC (잭슨 이뮤노리서치 랩(Jackson Immunoresearch Lab))를 적용하고, 세포와 함께 4℃에서 1시간 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 1XPBS/1%BSA 중에 재현탁시키거나 또는 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 유세포 분석 (BD)에 의해 분석하였다. 모 CHO-S 세포주로의 항체 결합을 동일한 방법을 이용하여 수행하였다. 도 1은 항-인간 PD-1 항체와 PD-1 발현 CHO 세포의 결합을 제시한다. 전장 인간 PD-1로 형질감염된 CHO 세포를 래트 하이브리도마로부터의 인간 PD-1에 대한 항체로 염색한 후, 이차 항체를 FITC 접합된 염소 항-래트-lgG Fc로 염색하고, FACS에 의해 분석하였다. 데이터는 항체가 CHO 세포 상에서 발현된 PD-1에 특이적으로 결합함을 제시한다.
인간 CD4+T 세포 상에서 발현된 본래의 PD-1에 대한 항체의 결합 친화도를 시험하기 위해, 인간 CD4+T 세포를 IL-2 및 OKT3 중에서 3일 동안 배양된 PBMC로부터 생성하고, 인간 PD-1에 대한 항체로 염색하였다. T 세포 상의 PD-1에 대한 항체의 결합을 FACS에 의해 분석하였다. 도 3에 제시된 바와 같이, FACS 분석은 항체가 CD4+T 세포 상에서 발현된 본래의 PD-1에 특이적으로 결합함을 제시하였다.
잠재적인 항체 히트를 선별하기 위한 확인 스크린으로써 항체의 차단 활성의 시험을 이용하였다. 선별된 항체를 FACS 분석에 의해 PD-1 형질감염된 CHO-S 세포에 대한 리간드 PD-L1의 결합을 차단하는 능력에 대해 시험하였다. 인간 PD-1 발현 CHO-S 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트 (BD)에 1x106개 세포/ml의 밀도로 옮겼다. 항체를 세척 완충제 (1XPBS/1%BSA) 중에서 계열 희석하고, 세포와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, 인간 Fc 융합-인간 PD-L1 단백질을 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이차 항체 염소 항 인간 IgG Fc FITC 항체 (래트 IgG Fc와의 교차-반응성 없음, 잭슨 이뮤노리서치 랩)를 세포와 함께 4℃에서 1시간 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세척하고, 1XPBS/1%BSA 중에 재현탁시키거나 또는 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 유세포 분석 (BD)에 의해 분석하였다.
1.3.3 하이브리도마 서브클로닝: 제1 및 확인 스크린을 통해 특이적인 결합 및 차단이 확인되면, 양성 하이브리도마 세포주를 서브클로닝을 위해 사용하였다. 간략히, 각각의 하이브리도마 세포주에 대해, 세포를 카운트하고 희석하여, 클로닝 배지 중 5개 세포/웰, 1개 세포/웰 및 0.5개 세포/웰을 제공하였다. 200μl/웰을 96-웰 플레이트에 플레이팅하였고, 1개의 플레이트에는 5개 세포/웰, 1개의 플레이트에는 1개 세포/웰 및 4개의 플레이트에는 0.5개 세포/웰로 플레이팅하였다. 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 모든 플레이트를 넣었다. 모든 세포주가 ELISA 검정에 의해 체크될 때까지 인큐베이션하였다.
실시예 2: 항체 하이브리도마 세포 서열 및 완전 인간 항체 특징분석
2.1 항체 하이브리도마 세포 서열: RNA를 모노클로날 하이브리도마 세포로부터 트리졸(Trizol) 시약에 의해 단리하였다. PD-1 항체의 VH 및 VL을 하기 프로토콜에 따라 증폭시켰다: 간략히, RNA를 먼저 하기 기재된 반응계 (20μl)의 역전사효소를 이용하여 cDNA에 역전사시켰다:
10xRT 완충제 2.0μl
25xdNTP Mix (100 mM) 0.8μl
10xRT 랜덤 프라이머/올리고T/특이적 프라이머 2.0μl
멀티스크라이브(MultiScribe)™ 역전사효소 1.0μl
RNase 억제제 1.0μl
RNA 2μg
뉴클레아제-무함유 H2O 20.0μl까지
반응 조건
Figure 112017126963818-pct00029
생성된 cDNA는 관심 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 이용하는 후속적인 PCR 증폭을 위해 사용되었다. PCR 반응은 하기 절차에 따라 수행하였다;
Figure 112017126963818-pct00030
10μl의 PCR 반응물을 취하여 pMD18-T 벡터로 라이게이션하였다. 상위 10의 적격 세포를 10μl 라이게이션 생성물로 형질전환시키고, 표준 프로토콜에 따라 상기 혼합물을 예열된 2-YT+Cab 플레이트로 옮기고, 밤새 인큐베이션하였다. 양성 클론을 M13-48 및 M13-47 프라이머를 이용하는 PCR에 의해 체크한 후, 시퀀싱하였다.
2.2 완전 인간 항체 분자 제조: PD-1 항체의 VH 및 VL을 상기 기재된 바와 같이 증폭시켰다. PCR 반응물을 PCR 클린-업 키트로 정제하고, VL 및 pCI 벡터를 제한 효소 Pme I 및 BssH II에 의해 37℃에서 2시간 동안 소화시켰다. 1% 아가로스 중에서 반응을 진행하고, 제조자의 지침에 따라 키트를 이용하여 겔 추출하였다. 소화된 VL 및 pCI 벡터를 하기 절차에 따라 라이게이션하였다:
Figure 112017126963818-pct00031
상기 혼합물을 16℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 10μl의 반응물을 형질전환 및 클론 성장을 위해 사용하였다. 확인된 클론은 플라스미드 pCI-VL DNA의 추출을 위해 사용하였다. 이어서, pCI-VL 벡터 및 VH 단편을 Xbal 및 Sal I로 소화시키고, 정제되고 소화된 VH 및 벡터를 T4 DNA 리가제로 16℃에서 30분 동안 라이게이션시켰다. 관심 VL 및 VH의 서열이 시퀀싱에 의해 확인되면, 완전 인간 PD-1 항체의 전체 IgG를 함유하는 발현 벡터를 일시적인 형질감염 및 안정한 세포주 발달을 위해 사용하였다.
실시예 3: 완전 인간 항체 특징분석
3.1 유세포 분석 (FACS)에 의해 시험한 세포 표면 PD-1 분자에 대한 PD-1 항체의 결합 친화도: 세포 표면 PD-1에 대한 항체 결합 친화도를 FACS 분석에 의해 수행하였다. 인간 PD-1 발현 CHO-S 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트 (BD)에 5x105개 세포/ml의 밀도로 옮겼다. 시험한 항체를 세척 완충제 (1XPBS/1%BSA) 중에서 1:2 계열 희석하고, 세포와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이차 항체 염소 항-인간 IgG Fc FITC (3.0몰 FITC/몰 IgG, (잭슨 이뮤노리서치 랩))를 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 어두운 곳에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 1회 세척하고, 1XPBS/1%BSA 중에 재현탁시키고, 유세포 분석 (BD)에 의해 분석하였다. 정량적 비드 콴텀(QuantumTM) MESF 키트 (뱅스 래버러토리즈, 인크.(Bangs Laboratories, Inc.))를 기준으로 하여 형광 강도를 결합된 분자/세포로 전환시켰다. 그래프패드 프리즘5(Graphpad Prism5)를 이용하여 KD를 계산하였다. 도 2는 PD-1 발현 CHO 세포에 대한 완전 인간 PD-1 항체 (즉, 1.7.3 hAb, 1.49.9 hAb, 1.103.11 hAb, 1.139.15 hAb, 및 1.153.7 hAb)의 결합을 제시한다. 인간 PD-1에 대한 완전 인간 항체를 이용하여 PD-1 형질감염된 CHO 세포를 염색하였고, FACS 분석에 의해 완전 인간 PD-1 항체가 약 2nmol/L의 EC50으로 PD-1에 특이적으로 결합하는 것으로 제시되었다다.
CDR 잔기 상에서 글리코실화 위험을 감소시키기 위해 원래의 항체 1.103.11 hAb -VH(20975-VL) 상의 단일 아미노산 Asn93 (카바트 넘버링(Kabat Numbering))을 세린 잔기로 돌연변이시킴으로써 1.103.11-v2 hAb를 생성하였다. Asn93이 경쇄 CDR3에 위치하지만, 컴퓨터 도킹으로부터 생성된 항체-항원 복합체 모델은 Asn93이 인간 PD-1의 항원 상의 어느 잔기와도 직접적으로 접촉하지 않음을 제시하였다. 경쇄 CDR3의 대부분의 결합 기능이 PD-1 FG 루프 상의 일부 잔기와 상호작용하는 이웃 잔기 Tyr91에 기인하는 것으로 여겨졌다. 1.103.11-v2 hAb의 세포-기재 기능 검정에 의해, 상기 돌연변이가 임의의 결합 능력에 영향을 미치지 않았음이 확인되었다 (하기 실험 결과 및 도 15 및 16 참고).
인간 PD-1에 대한 1.103.11-v2 hAb의 결합 친화도를 FACS 및 ELISA 검정에 의해 측정하였다. 도 16은 PD-1 발현 CHO 세포에 대한 상이한 완충제 중의 1.103.11-v2 hAb의 결합을 제시하며, 항체가 제제 완충제 또는 1xPBS (pH 7.4) 중에 있고, 인간 PD-1 발현 CHO-S 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트 (BD)에 2x105개 세포/ml의 밀도로 옮긴 것을 제외하고는, 상기 기재된 FACS 검정과 동일한 조건 하에 상기 결합을 시험하였다. 결과는 1.103.11 hAb와 필적하였다. "완충제 중의 1.103.11-v2 hAb"는 제제 완충제 중의 항체를 지칭하고, "PBS 중의 1.103.11-v2 hAb"는 1xPBS, pH 7.4 중의 항체를 지칭한다. 상기 양쪽 용액 중의 항체를 CHO 세포의 세포 표면 PD-1에 결합시켰고, 두 조건 사이에서 인간 PD-1에 대한 친화도에는 유의한 차이가 없었다 (1xPBS의 경우 EC50이 약 2.52nmol/L이고, 제제 완충제의 경우 약 3.12nmol/L임).
도 15는 ELISA에 의해 측정되는, 상이한 용액 중의 PD-1 단백질에 대한 항체 1.103.11-v2 hAb의 결합을 제시한다. 상기 기재된 것과 동일한 ELISA 프로토콜에 따라, 1.103.11-v2 hAb에 대한 인큐베이션 시간은 2시간이었고, 이차 항체 염소 항-인간 IgG FcHRP (1:5000, 압캠(Abcam))에 대한 인큐베이션 시간은 1시간이었다. "완충제 중의 1.103.11-v2 hAb"는 제제 완충제 중의 항체를 지칭하고, "PBS 중의 1.103.11-v2 hAb"는 1xPBS (pH 7.4) 중의 항체를 지칭한다. 인간 PD-1에 대한 결합 친화도가 양쪽 조건 하에 입증되었다.
인간 PD-1 발현 CHO 세포를 PD-1에 대한 상이한 농도의 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 마우스 Fc-태그 부착된 인간 PD-L1을 세포에 첨가하였다. PD-1 발현 세포에 대한 인간 PD-L1의 결합을 FITC-접합된 염소 항-마우스 IgG를 이용한 후, FACS 분석에 의해 검출하였다. 도 4에 제시된 바와 같이, PD-1에 대한 항체는 PD-1 형질감염된 CHO 세포에 대한 PD-L1의 결합을 차단하였다. 1.103.11-v2 hAb를 또한 PD-1 형질감염된 CHO 세포에 대한 PD-L1 결합의 차단에 대해 시험하였고, 결과는 1.103.11 hAb와 필적하였다.
3.2 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 시험한 전체 역학 결합 친화도: 프로테온(ProteOn) XPR36 (바이오-라드(Bio-Rad))을 이용하여 SPR 검정에 의해 PD-1에 대한 친화도 및 결합 역학에 대해 항체를 특징분석하였다. 단백질 A 단백질 (시그마)을 아민 커플링을 통해 GLM 센서 클립 (바이오-라드)에 고정하였다. 정제된 항체를 센서 클립 상으로 유동시키고, 단백질 A에 의해 포획하였다. 클립을 90° 회전시키고, 기준선이 안정해질 때까지 흐르는 완충제 (1XPBS/0.01% Tween20, 바이오-라드)로 세척하였다. 5가지 농도의 인간 PD-1 및 흐르는 완충제를 240초 회합 단계에 이은 600초 해리 동안에 항체 유동 세포에 대해 100 μL/분의 유속으로 유동시켰다. 각각의 흐름 이후에 클립을 pH 1.7 H3PO4로 재생시켰다. 회합 및 해리 곡선을 프로테온 소프트웨어를 이용하여 1:1 랭뮤어 결합 모델에 대입하였다.
도 7에 제시된 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명을 이용하여, 재조합 인간 PD-1의 경우 PD-1에 대한 항체의 친화도는 3.76E-9 내지 1.76E-10 mol/L이었다. 1.103.11-v2 hAb의 친화도는 1.103.11 hAb와 필적할 것으로 예상되었다.
3.3 이종상동성 유전자 (종간 교차) 및 상동성 유전자 (패밀리간 교차) 스크린:
3.3.1 시노몰구스 PD-1 및 뮤린 PD-1에 대한 교차-반응성: 교차-반응성을 ELISA에 의해 측정하였다. 플레이트 (눈크)를 시노몰구스 PD-1 (시노 바이올로지칼(Sino biological)) 및 뮤린 PD-1 (시노 바이올로지칼)로 4℃에서 밤새 1 μg/ml로 코팅하였다. 차단 및 세척 이후, 1 μg/ml 항체를 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고, 후속적으로 이차 항체 염소 항 래트 IgG1 HRP (베틸) 및 염소 항 래트 IgG2b HRP (베틸)와 함께 45분 동안 인큐베이션하였다. 세척한 후, TMB 기질을 첨가하고, 2M HCl에 의해 상호작용을 중단시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이스)를 이용하여 판독하였다.
종간 교차 실험의 결과는 PD-1에 대한 항체가 시노몰구스 원숭이 PD-1에 결합하지만, 뮤린 PD-1에는 결합하지 않음을 입증하였다 (도 6). 동일한 실험에서 1.103.11-v2 hAb는 1.103.11 hAb와 필적할 결과를 갖는 것으로 예상되었다.
3.3.2 PD-1 패밀리 구성원인 CD28, CTLA4 및 ICOS에 대한 교차-반응성: 완전 인간 항체의 패밀리간 교차 결합 활성을 실험하기 위해, PD-1, CD28, CTLA4 또는 ICOS를 발현시키는 세포주를 상기 항체로 염색한 다음, 이차 항체를 FITC 접합된 염소 항-인간 IgG Fc로 염색하였다. PD-1 발현 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 상응하는 모 세포주를 음성 대조군으로 사용하였다. 염색한 세포를 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences) FACS칸토(FACSCanto) II 및 플루오조 버젼(FlowJo Version) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
도 5는 PD-1, CD28로 형질감염된 CHO 세포, 및 CTLA4로 형질감염된 293F를 PD-1에 대한 항체로 염색하고, FACS에 의해 분석하였음을 제시한다. 결과는 PD-1 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하지만, PD-1 패밀리인 CD28 및 CTLA4에는 결합하지 않음을 입증하였다. 동일한 실험에서 1.103.11-v2 hAb는 1.103.11 hAb와 필적할 결과를 갖는 것으로 예상되었다.
3.4 에피토프 비닝 시험:
3.4.1 PD-1 항체의 결합 에피토프를 프로테온 XPR36 (바이오-라드)을 이용하여 SPR 검정에 의해 벤치마크 항체 A 및 B에 대해 비닝하였다. 벤치마크 항체 A 및 B를 아민 커플링을 통해 GLC 센서 클립 (바이오-라드) 상에 고정하였다. 인간 PD-1 용액을 항체 고정된 채널 상으로 유동시키고, 벤치마크 항체에 의해 포획하였다. 이어서, 클립을 90° 회전시키고, 기준선이 안정해질 때까지 흐르는 완충제로 세척하였다. 선별된 항체를 센서 클립 상으로 유동시켰다.
3.4.2 PD-1 항체의 결합 에피토프를 FACS에 의해 벤치마크 항체 A 및 B에 대해 비닝하였다. 세포 표면에서 인간 PD-1을 발현시키는 CHO 세포를 벤치마크 항체 A 또는 B와 함께 10μg/ml의 농도로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 본 개시내용의 PD-1 항체를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이차 항체 항-래트 IgG-FITC를 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 1회 세척하고, 1XPBS/1%BSA 중에 재현탁시키고, 유세포 분석 (BD)에 의해 분석하였다.
비닝 시험에 대한 SPR 검정 및 FACS의 결과는, 완전 인간 PD-1 항체 (즉, 1.7.3 hAb, 1.49.9 hAb, 1.103.11 hAb, 1.139.15 hAb, 및 1.153.7 hAb)에 결합된 인간 PD-1 상의 에피토프가 기존의 PD-1 항체 (즉, 벤치마크 항체 A 및 B)와 상이하였음을 제시하였다. 동일한 실험에서 1.103.11-v2 hAb는 1.103.11 hAb와 필적할 결과를 갖는 것으로 예상되었다.
3.5 세포-기재 검정에 의해 시험한 PD-1 항체의 시험관내 기능:
3.5.1 T 세포 증식에 대한 인간 PD-1 항체의 효과. 동종이계 반응을 이용하여 T 림프구 증식에 대한 PD-1 항체의 효과를 시험하였다. 1차 수지상 세포 (DC)-자극된 MLR을 10% FCS 및 항생제를 함유하는 200 μl의 RPMI 1640 중에서 96-웰 U-바닥 조직 배양 플레이트에서 수행하였다. DC를 1X105 동종이계의 전체 CD4+T 세포와 1:10 내지 1:100 DC:T 세포의 비로 혼합하였다. 또한, 중화 mAb: 인간 PD-1 항체 및 벤치마크 항체 A 및 B의 존재 또는 부재 하에 10 μg /ml로 사용하여 배양을 수행하였다. 검정을 5일 동안 인큐베이션하고, 마지막 16시간 동안 [3H]티미딘을 1 uCi/웰로 첨가하였다. [3H]티미딘 도입을 섬광 카운팅에 의해 측정하였고, 증식성 반응을 삼벌식 웰의 평균 [3H]티미딘 도입 (카운트/분)으로 나타내었다. DC 단독으로 인한 카운트는 대략 <1000 cpm이었다. 제시된 결과는 수행한 최소 5회의 실험을 대표하는 예이다.
상기 allo-MLR에서 사용된 인간 수지상 세포 (DC) 및 CD4+T, CD8+T 및 전체 세포를 하기 절차에 따라 PBMC로부터 생성하였다: 제조자 (스템셀 메일란(StemCell Meylan))의 지침에 따라 인간 단핵구 풍부 칵테일 키트를 사용하는 음성 선별에 의해 인간 단핵구를 PBMC로부터 정제하였다. 간략히, 피콜-파크(Ficoll-Paque) 구배를 이용하여 건강한 공여자의 혈액으로부터 PBMC를 단리하였다. 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 단리 완충제 중에서 1X108개 세포/ml로 재현탁시키고, 단핵구 풍부 Ab 혼합물과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 후속적으로 자성 콜로이드와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 비표지된 단핵구를 MACS 칼럼에 통과시키고 수집하였다. iDC를 생성하기 위해, 단핵구를 10% FCS 및 항생제를 함유하는 RPMI 1640 배지 중에서 GM-CSF (페프로테크(PeproTech), 뉴저지주 록키 힐; 800 U/ml) 및 IL-4 (페프로테크; 500 U/ml)와 함께 2X106개 세포/ml의 농도로 배양하였다. 배지의 절반을 격일로 GM-CSF- 및 IL-4-함유 배지로 교체하였다. 5일째에 iDC를 LPS (026: B6; 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스; 1 μg/ml)로 추가 24시간 동안 자극하여 성숙한 DC를 생성하였다. 제조자 (스템셉(Stemsep))의 지침에 따라 PBMC를 인간 CD4+T, CD8+T 및 전체 T 세포 풍부 혼합물 및 자성 콜로이드와 함께 인큐베이션함으로써 음성 선별에 의해 CD4+T, CD8+T 및 전체 T 세포를 정제하였다.
인간 CD4+ T 세포를 PD-1 항체 1.7.3 hAb, 1.49.9 hAb, 1.103.11 hAb, 1.139.15 hAb, 및 1.153.7 hAb의 존재 또는 부재 하에 동종이계 DC로 자극하였다. CD4+ T 세포의 증식을 [3H] 티미딘 도입에 의해 평가하였다. 도 10은 1.7.3 hAb, 1.49.9 hAb, 1.103.11 hAb, 1.139.15 hAb, 및 1.153.7 hAb가 농도 의존적인 T 세포 증식을 강화시켰음을 제시하였다. 동일한 실험에서 1.103.11-v2 hAb는 1.103.11 hAb와 필적할 결과를 갖는 것으로 예상되었다.
3.5.2 시험관내 시토카인 IFNγ 분비에 대한 인간 PD-1 항체의 효과: 시토카인 IFNγ 생성에 대한 인간 PD-1 항체 차단의 효과를 직접적으로 평가하기 위해, allo-MLR에서 IFNγ 생성에 대한 실험을 수행하였다. 간략히, 제조자의 지침에 따라 CD4+T 세포 풍부 칵테일 키트를 이용하는 음성 선별에 의해 인간 CD4+T 세포를 PBMC로부터 정제하였다. 미성숙 DC를 GM-CSF 및 IL-4 중에서 5일 동안 배양하여 단핵구로부터 생성하였고, 성숙 DC를 LPS로 1μg/ml에서 밤새 자극하여 분화시켰다. CD4+T 세포를 iDC/mDc와 10:1 내지 100:1 T:DC의 비로 혼합하였다. 인간 PD-1 항체 및 벤치마크 항체의 존재 또는 부재 하에 배양을 수행하였다. 5일 후에, 각각의 배양으로부터의 상청액을 시토카인 IFNγ 측정을 위해 수확하였다. 상청액 중 IFNγ의 수준을 ELISA 검정에 의해 측정하였다. 간략히, 맥시소르프(Maxisorp) 플레이트를 코팅 완충제로 희석된 항-인간 IFN-감마 mAb (0.75μg/ml; 즉 1/1360 희석)로 50μl/웰 (즉, 전체 96-웰 플레이트의 경우 3.7μl의 항체를 5 ml의 코팅 완충제에 첨가)에서 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 200μl/웰의 차단 완충제를 2시간 동안 첨가하여 남은 단백질 결합 능력을 차단하였다. 완전 배지 중에서 8000pg/ml로부터 125pg/ml로 2배 희석된, 표준으로 작용하는 재조합 IFN-감마의 희석액, 플러스 완전 배지 단독으로 희석하여 제조하였다. 플레이트를 세척하고, 표준 및 시험 상청액을 첨가하고 (100μl/웰), 2-4 시간 동안 인큐베이션하였다. 차단 완충제 중 비오틴화 항-IFN-감마 mAb (1/1333)를 첨가한 후, 엑스트라-아비딘 퍼옥시다제(Extra-avidin Peroxidase)를 첨가하였다. TMB 기질을 첨가하여 반응을 진행하고, 2M HCl에 의해 중단시켰다. 450nm에서의 흡광도를 측정하였다.
도 9는 인간 CD4+ T 세포가 항체 1.7.3 hAb, 1.49.9 hAb, 1.103.11 hAb, 1.139.15 hAb, 및 1.153.7 hAb의 존재 또는 부재 하에 동종이계 DC에 의해 자극되었음을 제시한다. IFNγ의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 결과는 완전 인간 PD-1 항체가 용량 방식으로 IFNγ 분비를 증가시켰음을 제시하였다. 동일한 실험에서 1.103.11-v2 hAb는 1.103.11 hAb와 필적할 결과를 갖는 것으로 예상되었다.
3.5.3 시험관내 인터류킨 2(IL-2) 생성에 대한 인간 PD-1 항체의 효과: CD4+T 세포를 iDC/mDc와 10:1 내지 100:1 T:DC의 비로 혼합하였다. 인간 PD-1 항체 및 벤치마크 항체의 존재 또는 부재 하에 배양을 수행하였다. 5일 후에, 각각의 배양으로부터의 상청액을 시토카인 측정을 위해 수확하였다. 상청액 중 IL-2의 수준을 ELISA 검정에 의해 측정하였다.
도 8은 인간 CD4+ T 세포를 리드 항체 또는 대조군 Ab의 존재 또는 부재 하에 동종이계 DC로 자극하였음을 제시한다. IL-2의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 결과는 PD-1에 대한 항체가 용량-의존적인 방식으로 IL-2 분비를 증가시켰음을 제시하였다. 동일한 실험에서 1.103.11-v2 hAb는 1.103.11 hAb와 필적할 결과를 갖는 것으로 예상되었다.
3.5.4 자가 항원 특이적 면역 반응에 의해 세포 증식 및 시토카인 생성에 대한 인간 PD-1 항체의 효과: 이 검정에서, T 세포 및 DC는 동일한 공여자로부터의 것이었다. 간략히, CD4+T 세포를 PBMC로부터 정제하고, CMV pp65 펩티드 및 저용량의 IL2 (20U/ml)의 존재 하에 배양하였고, 동시에 GM-CSF 및 IL-4 중에서 동일한 공여자의 PBMC로부터의 단핵구를 배양함으로써 DC를 생성하였다. 5일 후에, CMV pp65 펩티드로 처리된 CD4+T 세포를 인간 PD-1 항체 및 벤치마크 항체 (대조군으로서)의 부재 또는 존재 하에 pp65 펩티드로 펄싱된 DC와 함께 공동 배양하였다. 5일째에, 시토카인 IFNγ 및 IL-2 측정을 위해 각각의 배양으로부터 100μl의 상청액을 취하였다. IFNγ 및 IL-2 생성의 수준을 ELISA 검정에 의해 검출하였다. CMVpp65 펩티드-펄싱된 DC에 대한 특이적 T 세포의 증식을 [3H]티미딘 도입에 의해 평가하였다.
도 11에 제시된 바와 같이, PD-1 항체는 CMV pp65 펩티드-로딩된 자가 DC로 자극된 농도 의존적인 CMV+- CD4+ T 세포 증식을 강화시켰다. 동일한 실험에서 1.103.11-v2 hAb는 1.103.11 hAb와 필적할 결과를 갖는 것으로 예상되었다.
3.5.5 조절 T 세포 (Treg) 저해 기능에 대한 인간 PD-1 항체의 효과: T 세포의 아집단인 Treg는 주요 면역 조절인자이며, 자가 내성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. Treg 개수의 증가가 여러 암을 가진 환자에서 발견되었고 적절한 예후와 연관되기 때문에, CD4+CD25+ 조절 T 세포는 종양과 연관된다. 면역 억제 반응에 대한 인간 PD-1 항체의 효과를 직접적으로 평가하기 위해, Treg에 대한 실험을 수행하였다. CD4+CD25+ 및 CD4+CD25-T 세포를 각각 특이적인 항-CD25 마이크로비드 (밀테뉘 바이오텍(Miltenyi Biotec), 캘리포니아주 오번) 및 양성 또는 음성 선별을 이용하여 분리하였다. 처음에는, 제조자 (스템셉)의 지침에 따라 PBMC를 인간 CD4+ T 세포 풍부 혼합물 및 자성 콜로이드와 함께 인큐베이션함으로써 음성 선별에 의해 CD4+ T 세포를 정제하였다. 이어서, CD4+T 세포를 MACS 완충제 중에 재현탁시키고, 얼음 상에서 30분 동안 CD25+ 마이크로비드와 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 칼럼에 로딩하였다. 칼럼에 결합하지 않은 CD4+CD25- T 세포를 통과액으로부터 수집하고, 사용하기 전에 세척하였다. 후속적으로, CD4+CD25+T 세포를 칼럼으로부터 회수하고, 사용하기 전에 세척하였다. Treg를 인간 PD-1 항체의 존재 또는 부재 하에 CD4+CD25-T 세포 및 DC (Treg:Teff 1:1 비)와 함께 10μg/ml의 농도에서 배양하였다. 음성 대조군으로서 항체를 사용하지 않거나 이소형 항체를 사용하였다. 5일째에 ELISA에 의한 시토카인 검출을 위해 배양으로부터 상청액을 취하였고, [3H]티미딘을 1uCi/웰의 농도로 첨가함으로써 세포 증식을 측정하고, 추가 18시간 동안 인큐베이션하였다. [3H]티미딘 도입을 섬광 카운팅에 의해 측정하였다. 도 12에 제시된 바와 같이, PD-1 항체는 Treg의 저해 기능을 방해하고, 반응하는 T 세포 증식 및 IFNγ 분비를 복구하였다. 동일한 실험에서 1.103.11-v2 hAb는 1.103.11 hAb와 필적할 결과를 갖는 것으로 예상되었다.
3.6 ADCC/CDC 검정: 건강한 PD-1+ 세포에 대한 원치않는 독성을 최소화하기 위해, 선별된 항-PD-1 완전 인간 항체에는 ADCC 및 CDC 기능이 없는 것으로 확인되었다.
3.6.1 ADCC: 높은 수준의 세포 표면 PD-1을 발현시키는 활성화된 T 세포를 표적 세포로서 사용하였고, 96-웰 플레이트에서 다양한 농도의 완전 인간 항체와 함께 30분 동안 예비-인큐베이션한 다음, IL-2-활성화된 PBMC (자연 살해 (NK) 세포, 즉 이펙터 세포로서 사용됨)를 50:1의 이펙터/표적 비로 첨가하였다. 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 표적 세포 용해를 세포독성 검출 키트 (로쉐)에 의해 측정하였다. 광학 밀도를 몰레큘라 디바이시즈 스펙트라맥스(SpectraMax) M5e 플레이트 판독기에 의해 측정하였다. 결과는 PD-1에 대한 시험한 완전 인간 항체가 ADCC를 매개하지 않았음을 제시하였다 (도 13). 동일한 실험에서 1.103.11-v2 hAb는 1.103.11 hAb와 필적할 결과를 갖는 것으로 예상되었다.
3.6.2 CDC: 표적 세포 (활성화된 T 세포), 희석된 인간 혈청 보체 (퀴델(Quidel)-A112) 및 다양한 농도의 완전 인간 PD-1 항체를 96-웰 플레이트에서 혼합하였다. 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 표적 세포 용해를 셀타이터 글로(CellTiter glo, 프로메가(Promega)-G7573)에 의해 측정하였다. 리툭산 (로쉐) 및 인간 B 림프종 세포주 Raji (CD20 양성)를 양성 대조군으로 사용하였다. 데이터는 PD-1 항체가 CDC를 매개하지 않았음을 제시하였다 (도 14). 동일한 실험에서 1.103.11-v2 hAb는 1.103.11 hAb와 필적할 결과를 갖는 것으로 예상되었다.
실시예 4: 완전 인간 항체의 에피토프 맵핑
본원에 제공된 본 발명의 항체 1.103.11 hAb와 공지된 hPD-1 항체인 키트루다 사이의 에피토프 차이를 측정하기 위해, hPD-1에 대한 알라닌 스캐닝 실험 및 항체 결합에 대한 효과 평가를 1.103.11 hAb, 키트루다 및 11.148.10 (1.103.11 hAb 또는 키트루다와 중복되지 않는 에피토프에 결합하는 대조군 hPD-1 항체)을 이용하여 수행하였다.
hPD-1에 대한 알라닌 잔기를 글리신 코돈으로 돌연변이시키고, 모든 다른 잔기를 알라닌 코돈으로 돌연변이시켰다. hPD-1 세포외 도메인 (ECD)의 각각의 잔기에 대해, 2개의 순차적 PCR 단계를 이용하여 점 아미노산 치환을 생성하였다. 인간 PD-1의 ECD 및 C-말단 His-태그를 코딩하는 pcDNA3.3-hPD-1_ECD.His 플라스미드를 주형으로 사용하였고, 퀵체인지 라이트닝(QuikChange lightning) 다중-부위-지정 돌연변이유발 키트 (애질런트 테크놀로지즈(Agilent technologies), 캘리포니아주 팔로 알토)를 이용하는 첫번째 단계 PCR을 위해 돌연변이유발 프라이머의 집단을 사용하였다. 돌연변이체 가닥 합성 반응 이후에 Dpn I 엔도뉴클레아제를 사용하여 모 주형을 소화시켰다. 두번째 단계 PCR에서, CMV 프로모터, PD-1의 세포외 도메인 (ECD), His-태그 및 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 (TK) 폴리아데닐화로 구성된 선형 DNA 발현 카세트를 증폭시키고, HEK293F 세포 (라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 매릴랜드주 게이터스버그)에서 일시적으로 발현시켰다.
모노클로날 항체 1.103.11 hAb, 키트루다 및 11.148.10 hAb를 ELISA 결합 검정을 위한 플레이트에 코팅하였다. 정량화된 PD-1 돌연변이체를 함유하는 상청액과 상호작용시킨 후, HRP 접합된 항-His 항체 (로크랜드(Rockland), Cat#200-303-382)를 검출 항체로서 첨가하였다. 흡광도를 대조군 돌연변이체의 평균에 따라 정규화하였다. 결합 배수 변화 (<0.55)에 대한 추가의 컷오프를 설정한 후, 최종 결정된 에피토프 잔기를 확인하였다.
항체 결합을 유의하게 감소시킨 상위 30의 점-치환된 hPD-1 돌연변이체를 표 2에 제시하였다. hPD-1 결정 구조체 (PDB 코드 3RRQ 및 4ZQK) 상의 이들 모든 잔기의 위치를 체크한 결과, 일부 아미노산 (예를 들어, Val144, Leu142, Val110, Met108, Cys123 등)이 단백질에 완전히 매립되어 있었고, 어느 항체와도 직접적으로 접촉할 가능성이 낮은 것으로 드러났다. 관찰된 결합 감소는 아마도 알라닌 치환 이후 hPD-1 구조체의 불안정성 또는 심지어 붕괴의 결과일 수 있다. 이들 데이터를 에피토프 핫 스팟으로 잘못 해석하는 것을 피하기 위해, 항원 상에서 전혀 상이한 위치에 결합하지만, hPD-1 구조체의 붕괴가 실제로 일어나는 경우 그에 반응할 것으로 예상되는 대조군 항체 11.148.10 hAb를 이용하였다. 양쪽 항체에 영향을 미치는 돌연변이체를 잘못된 핫 스팟으로 처리하였고, 리스트로부터 제거하였다. 결합 배수 변화 (<0.55)에 대한 추가의 컷오프를 설정한 후, 최종 결정된 에피토프 잔기를 표 3에 열거하였다. 1.103.11 hAb에서는 9개 위치, 및 키트루다에서는 5개 위치, 및 대조군 항체 11.148.10 hAb에서는 10개 잔기가 있었다.
표 2. 항체 결합에 대한 PD-1 점 돌연변이의 효과
Figure 112017126963818-pct00032
표 3. 잠재적인 에피토프의 확인
Figure 112017126963818-pct00033
표 3에서 1.103.11 hAb 및 키트루다의 에피토프 잔기의 비교는 단지 2개의 중복되는 핫 스팟 잔기를 나타내었다. 나머지는 매우 다양한 것으로 보였으며, 이는 두 항체가 hPD-1 결합 및 hPD-L1 차단의 측면에서 매우 상이한 메카니즘을 채택할 수 있음을 나타내었다. 표 3에서 잔기 ID를 읽음으로써 메카니즘을 해석하는 것이 쉽지는 않다. 따라서, 보다 용이한 가시화 및 비교를 위해 표 3의 모든 데이터 뿐만 아니라 hPD-L1 결합 위치를 hPD-1의 결정 구조체 상에 맵핑하였다 (도 17).
도 17에 제시된 바와 같이, hPD-L1 결합을 담당하는 핫-스팟 잔기는 모두 C, F 및 G 가닥의 중간에 모여있다 (도 17A). 조사된 2가지 항체 1.103.11 hAb 및 키트루다는 비록 둘 다 hPD-1에 결합하고 hPD-L1을 차단하는 기능을 갖지만, 명백히 상이한 에피토프를 갖는다 (1.103.11 hAb의 경우 도 17B, 키트루다의 경우 17C). 키트루다의 에피토프는 PD-L1 결합 부위와는 전혀 교차하지 않는 C'D 루프 상의 잔기 (mPD-1 상의 C" 잔기에 상응함)로부터 주로 기인하였다. 이는 키트루다의 hPD-L1 차단 기능이 항체의 크기에 의해 제공된 그의 입체 장애 효과에 더욱 의존하였음을 시사하였다. 대조적으로, 본 발명자들의 리드 항체 1.103.11 hAb의 에피토프는 다중 위치에 걸쳐 분포된 핫 스팟으로 구성되었고, hPD-L1 결합 위치와 직접적으로 중복하였다 (도 17A, 17B). 본 발명의 1.103.11 hAb는 그들의 공통된 결합 위치와 반응하는데 있어서 hPD-L1에 비해 더욱 경쟁적이기 때문에 hPD-L1을 차단하였다. 따라서, 1.103.11 hAb는 하류 발달에서 더욱 기능적일 것으로 예상되었다.
그러나, 항체 11.148.10 hAb는 2가지 기능적 항체와는 완전히 상이한 위치 (도 17D)에 결합하며, 이는 그 자체로 알라닌 치환을 수행하는데 있어서 hPD-1의 기능을 모니터링하기 위한 양호한 대조군 항체임을 확고히 하였다.
본 개시내용이 구체적인 실시양태 (이중 일부는 바람직한 실시양태임)를 기준으로 특정하게 제시되고 기재되었지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자라면 본원에 개시된 본 개시내용의 개념 및 범위를 벗어나지 않고 형태 및 세부사항에 있어서 다양한 변화가 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> WuXi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Open Monoclonal Technology, Inc <120> NOVEL ANTI-PD-1 ANTIBODIES <130> 053674-8008WO03 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Thr Thr Tyr Tyr Trp Val 1 5 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agtactactt actactgggt c 21 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 agtatctctt atagtgggaa cacctactac aatccgtccc tcaagagt 48 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 His Leu Gly Tyr Asn Gly Arg Tyr Leu Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 catctagggt ataatgggag gtacctcccc tttgactac 39 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Phe Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 actggaacca gcagtgacgt tggtttttat aactatgtct cc 42 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo 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35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Val Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Ala Ala Thr Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg His Leu Gly Tyr Asn Gly Arg Tyr Leu Pro Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 54 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgaccctc 60 acctgcactg tctctgctga ctccatcagc agtactactt actactgggt ctggatccgc 120 cagcccccag ggaagggact ggagtggatt gggagtatct cttatagtgg gagcacctac 180 tacaatccgt ccctcaagag tcgagtcacc gtatccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgaactctgt ggccgccaca gacacggctc tatattactg tgcgagacat 300 ctagggtata atgggaggta cctccccttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctcctcc 369 <210> 55 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Phe Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Asn Ile 85 90 95 Ser Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 56 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ttttataact atgtctcctg gtaccaacag 120 cacccaggca aagcccccga actcatgatt tatgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180 tctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caaacatcag cacttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 57 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Thr 20 25 30 Thr Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Pro Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ile 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ser Leu Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg His Leu Gly Tyr Asn Ser Asn Trp Tyr Pro Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 58 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cctcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtactactt actactgggg ctggatccgc 120 cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct cttatagtgg gaccacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atccccgtag acacgtccaa gaaccagatc 240 tccctgaaac tgagctctgt gaccgccgca gacacgtctt tgtattattg tgcgagacat 300 ctcgggtata acagcaactg gtaccctttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 360 gtctcctca 369 <210> 59 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr 20 25 30 Asn Arg Val Ser Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Thr Ala Pro Glu Val 35 40 45 Ile Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 60 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 cagtcggccc tgactcagcc tccctccgtg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt agttataacc gtgtctcctg gtaccagcag 120 cccccaggca cagcccccga agtcattatt tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtc 180 cctgatcgct tctctgggtc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cacttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 61 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Arg Ala Gly Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 62 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactg 60 tcctgcgcag cctctggatt cacctttagc agccatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaact attactggtg gtggtggtag catatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attattgtgc gaaaaaccgc 300 gctggggagg gttactttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 63 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asp Asn Ile Gly Asn Lys Asp Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Arg Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Gly Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Ala Gln Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ile Trp Val Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 64 <211> 315 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 tcctatgagc tgactcagcc actctcagtg tcagtggccc tgggacagac ggccaggatt 60 acctgtgggg gagacaacat tggaaataaa gatgtgcact ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcat ctatagggat agcaaccggc cctctgggat ccctgaggga 180 ttctctggct ccaactcggg gaacacggcc accctgacca tcagcagagc ccaagccggg 240 gatgaggctg actattactg tcaggtgtgg gacagcattt gggtgttcgg cggagggacc 300 aagctgaccg tccta 315 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesis <400> 65 Ser Ser Tyr Thr Ser Ile Ser Thr Trp Val 1 5 10 <210> 66 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesis <400> 66 agctcatata caagcatcag cacttgggtg 30 <210> 67 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesis <400> 67 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Phe Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ile 85 90 95 Ser Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 68 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesis <400> 68 cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60 tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ttttataact atgtctcctg gtaccaacag 120 cacccaggca aagcccccga actcatgatt tatgatgtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180 tctgatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240 caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcatcag cacttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330

Claims (34)

  1. 하기를 포함하는 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    a) 서열식별번호: 1의 CDR1, 서열식별번호: 3의 CDR2 및 서열식별번호: 5의 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7의 CDR1, 서열식별번호: 9의 CDR2 및 서열식별번호: 11의 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    b) 서열식별번호: 13의 CDR1, 서열식별번호: 15의 CDR2 및 서열식별번호: 5의 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7의 CDR1, 서열식별번호: 17의 CDR2 및 서열식별번호: 11의 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    c) 서열식별번호: 1의 CDR1, 서열식별번호: 15의 CDR2 및 서열식별번호: 5의 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7의 CDR1, 서열식별번호: 17의 CDR2 및 서열식별번호: 19의 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    d) 서열식별번호: 21의 CDR1, 서열식별번호: 23의 CDR2 및 서열식별번호: 25의 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 27의 CDR1, 서열식별번호: 29의 CDR2 및 서열식별번호: 31의 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    e) 서열식별번호: 33의 CDR1, 서열식별번호: 35의 CDR2 및 서열식별번호: 37의 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 39의 CDR1, 서열식별번호: 41의 CDR2 및 서열식별번호: 43의 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    f) 서열식별번호: 1의 CDR1, 서열식별번호: 15의 CDR2 및 서열식별번호: 5의 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 7의 CDR1, 서열식별번호: 17의 CDR2 및 서열식별번호: 65의 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  2. 제1항에 있어서, 하기를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    a) 서열식별번호: 45를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 47을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    b) 서열식별번호: 49를 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 51을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    c) 서열식별번호: 53을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 55를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    d) 서열식별번호: 57을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 59를 포함하는 경쇄 가변 영역;
    e) 서열식별번호: 61을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 63을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    f) 서열식별번호: 53을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 67을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 완전 인간 모노클로날 항체인 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 낙타화 단일 도메인 항체, 디아바디, scFv, scFv 이합체, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv 단편, Fab, Fab', F(ab')2, ds 디아바디, 나노바디, 도메인 항체, 또는 2가 도메인 항체인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이뮤노글로불린 불변 영역을 추가로 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 접합체를 추가로 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  10. 제9항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  11. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건 하에, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현시키는 방법.
  12. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는, 개체에서 종양, 암, 전이성 종양, 전이성 암, 자가면역 질환 및 감염성 질환으로부터 선택되는 PD-1과 연관된 상태를 치료하기 위한 키트.
  13. 제12항에 있어서, PD-1과 연관된 상태가 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 신세포 암, 결장직장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암종, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선 암종, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상 식육종, 메르켈 세포 암, 및 고전적 호지킨 림프종 (CHL), 원발성 종격 거대 B-세포 림프종, T-세포/조직구-풍부 B-세포 림프종, 엡스타인-바르 바이러스(EBV)-양성 및 -음성 이식후 림프증식성 질환 (PTLD), 및 EBV-연관 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 형질모세포 림프종, 외부 NK/T-세포 림프종, 비인두 암종, 및 인간 헤르페스 바이러스 8 (HHV8)-연관 원발성 삼출 림프종, 호지킨 림프종을 포함하는 다른 혈액암, 원발성 중추 신경계 (CNS) 림프종, 척추 종양, 뇌간 신경교종을 포함하는 중추 신경계의 신생물; 전신 홍반성 루프스 (SLE), 건선, 전신 피부경화증, 자가면역 당뇨병; 및 B형 간염, C형 간염의 바이러스 감염, 헤르페스 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, HIV, 시토메갈로바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 유형 I, 단순 헤르페스 바이러스 유형 2, 인간 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 전염과 연관된 카포시 웨스트 육종, 얇은 고리 바이러스 (토르퀘테노바이러스), JC 바이러스 또는 BK 바이러스 감염을 포함하는 만성 바이러스 감염으로부터 선택되는 것인 키트.
  14. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 1종 이상의 제약상 허용가능한 담체를 포함하는, 개체에서 종양, 암, 전이성 종양, 전이성 암, 자가면역 질환 및 감염성 질환으로부터 선택되는 PD-1과 연관된 상태를 치료하기 위한 제약 조성물.
  15. 제14항에 있어서, PD-1과 연관된 상태가 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 신세포 암, 결장직장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암종, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선 암종, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상 식육종, 메르켈 세포 암, 및 고전적 호지킨 림프종 (CHL), 원발성 종격 거대 B-세포 림프종, T-세포/조직구-풍부 B-세포 림프종, 엡스타인-바르 바이러스(EBV)-양성 및 -음성 이식후 림프증식성 질환 (PTLD), 및 EBV-연관 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 형질모세포 림프종, 외부 NK/T-세포 림프종, 비인두 암종, 및 인간 헤르페스 바이러스 8 (HHV8)-연관 원발성 삼출 림프종, 호지킨 림프종을 포함하는 다른 혈액암, 원발성 중추 신경계 (CNS) 림프종, 척추 종양, 뇌간 신경교종을 포함하는 중추 신경계의 신생물; 전신 홍반성 루프스 (SLE), 건선, 전신 피부경화증, 자가면역 당뇨병; 및 B형 간염, C형 간염의 바이러스 감염, 헤르페스 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, HIV, 시토메갈로바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 유형 I, 단순 헤르페스 바이러스 유형 2, 인간 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 전염과 연관된 카포시 웨스트 육종, 얇은 고리 바이러스 (토르퀘테노바이러스), JC 바이러스 또는 BK 바이러스 감염을 포함하는 만성 바이러스 감염으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
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