KR100960211B1

KR100960211B1 - 이온 교환 크로마토그래피에 의한 단백질 정제 방법

Info

Publication number: KR100960211B1
Application number: KR1020067009888A
Authority: KR
Inventors: 캐롤 디. 바시; 그레그 에스. 블랑크
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 1998-05-06
Filing date: 1999-05-03
Publication date: 2010-05-27
Also published as: JP2002513800A; EP1075488A1; CN1810292A; JP2018140994A; WO1999057134A1; CN1260249C; ES2198913T5; KR20060081422A; US7074404B2; BR9910332A; US20160376377A1; CN1299370A; AU760048B2; DK1075488T4; US6417335B1; US20060182739A1; CN101333244B; US20090220492A1; SI1308455T1; KR20100017967A

Abstract

본 발명의 이온 교환 크로마토그래피법에 의해 폴리펩티드를 정제하는 방법은 1종 이상의 오염 물질로부터 목적 폴리펩티드를 단리하기 위해 완충액의 전도도 및(또는) pH를 변화시키는 단계를 포함한다.

이온 교환 크로마토그래피법, 전도도, 로딩 완충액, 중간 완충액, 세정 완충액.

Description

이온 교환 크로마토그래피에 의한 단백질 정제 방법 {Protein Purification by Ion Exchange Chromatography}

도 1은 전도도를 (예를 들어 하기 실시예 1의 NaCl 농도로) 또는 pH를 (예를 들어 흐름도에 나타낸 pH 값으로) 변화시켜 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 방법을 보여주는 흐름도이다.

도 2는 전도도를 (예를 들어 도면에 나타낸 NaCl 농도로) 또는 pH를 (예를 들어 도 2에 나타낸 pH 값으로) 변화시켜 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 방법을 보여주는 흐름도이다.

도 3은 대규모 제조에서, 실시예 1의 양이온 교환 크로마토그래피 수행의 흡광도 기록이다. 컬럼이 본 명세서에 기재된 다른 완충액들로 세척된 지점은 화살표로 표시되어 있다.

도 4는 각 크로마토그래피 분획에서 회수된 재조합 인간화 항-HER2 모노클로날 항체(rhuMAb HER2)에 관한 설명이다(관련된 크로마토그래피의 모든 분획의 총합에 대한 백분율로 계산함). 통액 분획, 세척 단계 분획 및 예비 푸울 분획은 모두 로딩 시작부터 푸울링 개시까지 수집된 모든 유출 샘플이다. 푸울 분획은 선단 변곡점에서 용출을 시작한 5배 컬럼 용적의 유출 샘플이다. 재생 분획은 푸울링 말기부터 재생 말기까지 수집된 유출액을 포함한다.

도 5는 카르복시 술폰 양이온 교환 고압 액체 크로마토그래피(CSx HPIEX)법에 의해 평가된 각각의 양이온 교환 크로마토그래피 푸울 샘플의 rhuMAb HER2의 품질을 보여준다. 피크 a, b 및 1은 rhuMAb HER2의 탈아미노화된 형태에 대한 피크이다. 피크 3은 탈아미노화되지 않은 rhuMAb HER2의 피크이다. 피크 4는 rhuMAb HER2의 C-말단 라이신 함유 변형체 및 이소-아스파라긴산 변형체 배합물에 대한 피크이다.

도 6은 각 크로마토그래피에 대해 0.025 M MES/0.070 M NaCl(pH 5.6)로 세척한 흡광도(280 nm) 프로필을 보여준다. 양이온 교환 수지에 가해진 rhuMAb HER2의 크기는 정점에서 피크의 흡광도 수준 및 정점 도달에 요구되는 완충액의 양에 영향을 준다. 이 세척 단계에서 발생한 작은 피크(30 mg/mL 로딩에서 가장 잘 보임)로 인해, 정점은 0.5 흡광 단위(AU) 이상의 흡광도 수준으로 정의된다.

도 7a 및 도 7b는 각각 humMAb4D5-8 경쇄(SEQ ID NO:1) 및 humMAb4D5-8 중쇄(SEQ ID NO:2)의 아미노산 서열을 보여준다.

본 발명은 일반적으로 단백질 정제 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 이온 교환 크로마토그래피법을 이용하여 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염 물질을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드(예를 들어, 항체)를 정제하는 방법에 관한 것이다.

경제적인 대규모 단백질 정제는 생물공학 산업 분야에서 점점 중요한 문제가 되고 있다. 일반적으로, 단백질은 세포 배양에 의해, 목적 단백질의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 삽입시켜 목적 단백질을 생산하게끔 조작된 포유류 또는 박테리아 세포 라인을 사용하여 생산된다. 사용된 세포 라인이 생물체이기 때문에, 그들에게는 일반적으로 동물 혈청 제제로부터 공급되는 당류, 아미노산류 및 성장 인자를 함유하는 복합 배양 배지가 공급될 것이다. 이러한 세포에 공급된 화합물들의 혼합물 및 세포 자체의 부산물로부터 원하는 단백질을 인체 치료용으로 충분한 순도로 분리하는 것은 만만치 않은 일이다.

세포 파편으로부터 단백질을 정제하는 방법은 처음에는 그 단백질의 발현 부위에 따라 좌우된다. 어떤 단백질은 세포로부터 주위 증식 배지로 직접 분비될 수 있도록 할 수 있고, 어떤 단백질은 세포내에서 만들어진다. 후자 단백질의 경우, 정제 방법의 제1 단계는 기계적 전단, 삼투압 충격 또는 효소 처리를 비롯한 여러 방법에 의해 수행될 수 있는 세포의 용균 단계를 포함한다. 이러한 세포 파열로, 세포의 전체 내용물이 세포 현탁액으로 방출되고, 또한 크기가 작아 제거하기 어려운 세포내 단편들이 생성된다. 이 세포내 단편들은 일반적으로 분획 원심분리법 또는 여과법에 의해 제거된다. 정도는 덜 하지만, 이러한 문제는 세포의 자연사 및 단백질 생산 과정 중 세포내 숙주 세포 단백질의 방출로 인해 직접 분비된 단백질에 있어서도 마찬가지이다.

목적 단백질을 함유하는 정제된 용액이 수득되면, 세포에 의해 생산된 다른 단백질로부터 목적 단백질을 분리하는 것은 일반적으로 다른 크로마토그래피 기술 을 병용함으로써 수행된다. 이 기술은 단백질의 전하, 소수성 정도 또는 크기를 기준으로 단백질 혼합물을 분리한다. 이 기술 각각마다 몇가지 다른 크로마토그래피 수지가 있어서 관련된 특정 단백질에 대한 정제 방법을 정확히 맞출 수 있다. 이러한 각 분리 방법의 핵심은 단백질이 긴 컬럼의 아래 방향으로 다른 속도로 이동하여 그들이 컬럼 아래 방향으로 계속 내려감에 따라 점점 더 크게 물리적으로 분리되거나, 또는 단백질을 분리 배지에 선별적으로 부착시킨 다음, 다른 용매에 의해 차별적으로 용출시킬 수 있다는 것이다. 경우에 따라, 불순물은 컬럼에 특이적으로 부착되고 목적 단백질은 컬럼에 부착되지 않는, 즉 목적 단백질은 "통액(flow-through)" 중에 존재하게 되는 경우에 목적 단백질이 불순물로부터 분리된다.

이온 교환 크로마토그래피법은 통상적으로 단백질의 정제에 사용되는 크로마토그래피 기술이다. 이온 교환 크로마토그래피법에서 주변 완충액의 이온 농도가 낮다는 조건하에, 용질 표면의 하전된 부분이 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 반대 전하에 의해 끌려가게 된다. 용출은 일반적으로 완충액의 이온 농도(즉, 전도도)를 증가시켜 이온 교환 매트릭스의 하전된 부위에 대해 용질과 경합시킴으로써 달성된다. pH를 변화시켜 용질의 전하를 바꾸는 방법은 용질을 용출하는 또다른 방법이다. 전도도 또는 pH의 변화는 점진적(구배 용출)이거나 또는 단계적(단계적 용출)일 수 있다. 기존의 방법에서는, 전도도 또는 pH의 변화가 점진적이었는데, 즉 pH 또는 전도도는 한쪽 방향으로 증가 또는 감소하였다.

<발명의 개요>

본 발명은 목적 폴리펩티드를 초기 전도도 또는 pH에서 이온 교환 물질에 결합시킨 다음, 이온 교환 물질을 다른 전도도 또는 pH, 또는 이들 모두에서 중간 완충액으로 세척하는 이온 교환 크로마토그래피법을 제공한다. 중간 세척 후의 특정 시점에서 이온 교환 크로마토그래피 표준 수행 방법과 반대로, 이온 교환 물질을 세정 완충액으로 세척하는데, 여기서 중간 완충액으로부터 세정 완충액으로의 전도도, pH, 또는 이들 전도도와 pH 모두의 변화는 앞선 단계에서 달성되는 전도도, pH, 또는 전도도와 pH 모두의 변화에 대해 반대 방향이었다. 세정 완충액으로 세척한 후에는, 앞선 단계에서 사용된 완충액의 전도도, pH, 또는 전도도와 pH 모두와 전도도, pH, 또는 전도도와 pH 모두가 다른 용출 완충액을 사용하여 이온 교환 물질을 처리함으로써 목적 폴리펩티드 분자를 용출시키면 된다.

이온 교환 크로마토그래피법에 대한 본 발명의 새로운 연구는, 순수하며 고수율의 폴리펩티드 산물을 목적으로 하는 대규모 제조에서 밀접하게 관련된 오염 물질 분자로부터 생성물 분자를 분리해야하는 상황에 특히 유용하다.

따라서, 본 발명은 폴리펩티드 및 오염 물질을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 연속으로 수행되는

(a) 제1 전도도 및 pH의 로딩 완충액을 사용하여 폴리펩티드를 이온 교환 물질에 결합시키는 단계,

(b) 이온 교환 물질로부터 오염 물질을 용출시키기 위해, 제2 전도도 및(또는) pH의 중간 완충액으로 이온 교환 물질을 세척하는 단계,

(c) 제3 전도도 및(또는) pH의 세정 완충액으로 이온 교환 물질을 세척하는 단계(여기서, 중간 완충액으로부터 세정 완충액으로의 전도도 및(또는) pH의 변화는 로딩 완충액으로부터 중간 완충액으로의 전도도 및(또는) pH의 변화에 대해 반대 방향임), 및

(d) 이온 교환 물질로부터 폴리펩티드를 용출하기 위해, 제4 전도도 및(또는) pH의 용출 완충액으로 이온 교환 물질을 세척하는 단계를 포함한다. 제1 전도도 및(또는) pH는 제3 전도도 및(또는) pH와 동일할 수 있다.

이온 교환 물질이 양이온 교환 수지를 포함하는 경우, 중간 완충액의 전도도 및(또는) pH는 바람직하게는 로딩 완충액의 전도도 및(또는) pH보다 높고, 세정 완충액의 전도도 및(또는) pH는 바람직하게는 중간 완충액의 전도도 및(또는) pH보다 낮으며, 용출 완충액의 전도도 및(또는) pH는 바람직하게는 중간 완충액의 전도도 및(또는) pH보다 높다. 바람직하게는, 세정 완충액의 전도도 및(또는) pH는 로딩 완충액의 전도도 및(또는) pH와 대략 동일하다.

바람직하게는, 중간 완충액 및 용출 완충액의 전도도는 각각 변화시키되 이 완충액의 pH는 대략 동일하게 유지함으로써 오염 물질 및 폴리펩티드의 용출이 달성된다.

또한, 본 발명은 폴리펩티드 및 오염 물질을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 연속으로 수행되는

(a) 제1 전도도 및 pH의 로딩 완충액을 사용하여 폴리펩티드를 양이온 교환 물질에 결합시키는 단계,

(b) 양이온 교환 물질로부터 오염 물질을 용출하기 위해, 로딩 완충액의 전도도 및(또는) pH보다 높은 제2 전도도 및(또는) pH의 중간 완충액으로 양이온 교환 물질을 세척하는 단계,

(c) 중간 완충액의 전도도 및(또는) pH보다 낮은 제3 전도도 및(또는) pH의 세정 완충액으로 양이온 교환 물질을 세척하는 단계, 및

(d) 양이온 교환 물질로부터 폴리펩티드를 용출하기 위해, 중간 완충액의 전도도 및(또는) pH보다 높은 제4 전도도 및(또는) pH의 용출 완충액으로 양이온 교환 물질을 세척하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 항체 및 오염 물질을 포함하는 조성물로부터 항체를 정제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 양이온 교환 수지에 조성물을 로딩하는 단계(여기서, 양이온 교환 수지에 로딩된 항체의 양은 양이온 교환 수지 mL 당 항체 약 20 mg 내지 약 35 mg임) 및 경우에 따라, 양이온 교환 수지로부터 항체를 용출시키는 단계를 추가로 포함한다. 이 방법은 양이온 교환 수지로부터 1종 이상의 오염 물질을 용출시키는 중간 세척 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 중간 세척 단계는 일반적으로 항체 용출 단계의 선행 단계이다.

본 발명은 항-HER2 항체 및 1종 이상의 그의 산성 변형체의 혼합물을 포함하는 조성물을 추가로 제공하는데, 조성물 중 산성 변형체의 양은 약 25 % 미만, 바람직하게는 약 20 % 미만, 예를 들어 약 1 % 내지 약 18 % 범위이다. 경우에 따라, 이 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.

<바람직한 실시태양의 상세한 설명>

<정의>

본 명세서에서 정제된 "조성물"이라는 용어는 목적 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염 물질을 포함한다. 이 조성물은 "부분적으로 정제"하거나(즉, 1단계 이상의 정제 단계, 예를 들어 하기 실시예 1의 단백질 A 크로마토그래피(Protein A Chromatography)법으로 처리함) 또는 목적 폴리펩티드를 생산하는 숙주 세포 또는 유기체로부터 직접 수득할 수 있다(예를 들어, 이 조성물은 수획된 세포 배양액일 수 있음).

본 명세서에 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"라는 용어는 일반적으로 약 10개 이상의 아미노산을 갖는 펩티트 및 단백질을 의미한다. 바람직하게는, 이 폴리펩티드는 포유류 단백질이고, 그 예로는 레닌, 인간 성장 호르몬 및 우 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 지단백질, 알파-1-안티트립신, 인슐린 A-쇄, 인슐린 B-쇄, 프로인슐린, 여포 자극 호르몬, 칼시토닌, 황체형성 호르몬, 글루카곤, 응고 인자, 예를 들어 인자 VIII, 인자 IX, 조직 인자 및 빌레브란드스(Willebrands) 인자, 항-응고 인자, 예를 들어 단백질 C, 심방성 나트륨 이뇨 인자, 폐 표면활성 물질, 플라스미노겐 활성 물질, 예를 들어 유로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성 물질(t-PA), 봄베신, 트롬빈, 조혈 성장 인자, 종양 괴사 인자-알파 및 종양 괴사 인자-베타, 엔케팔리나제, RANTES(일반적으로, 활성 T-세포의 발현 및 분비를 조절함), 인간 마크로파지 염증 단백질(MIP-1-알파), 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈 청 알부민, 뮬러리안(Muellerian)-억제 물질, 렐락신 A-쇄, 렐락신 B-쇄, 프로렐락신, 마우스 성선자극 호르몬-관련 펩티드, 미생물 단백질, 예를 들어 베타-락타마제, DNase, IgE, 세포상해성 T-림프구 관련 항원(CTLA), 예를 들어 CTLA-4, 인히빈, 액티빈, 혈관 내피 증식인자(VEGF), 호르몬 또는 성장 인자의 수용체, 단백질 A 또는 D, 류마토이드 인자, 신경 종양 인자, 예를 들어 골-유래 신경 종양 인자(BDNF), 뉴트로핀-3, -4, -5 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β, 혈소판-유래 증식 인자(PDGF), 섬유아세포 증식 인자, 예를 들어 aFGF 및 bFGF, 표피 증식 인자(EGF), 트랜스포밍 증식 인자(TGF), 예를 들어 TGF-알파, 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 포함하는 TGF-β, 인슐린양 증식 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II), 데스(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린양 증식 인자 결합 단백질(IGFBP), CD 단백질, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20, 에리트로포이에틴, 골유도 인자, 면역 독소, 골유도 단백질(BMP), 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, -베타 및 -감마, 콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF, 인터루킨(IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10, 수퍼옥시드 디스뮤타제, T-세포 수용체, 막표면 단백질, 붕괴 촉진 인자, 바이러스 항원, 예를 들어 AIDS 엔벨로프의 일부, 운반 단백질, 호밍 수용체, 어드레신, 조절 단백질, 인테그린, 예를 들어 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM, 종양 관련 항원, 예를 들어 HER2, HER3 또는 HER4 수용체, 및 상기 기재된 임의 폴리펩티드의 단편 및(또는) 변형체가 포함된다. 인간 HER2와 결합하는 전장의 항원이 가장 바람직하다.

"오염 물질"은 원하는 폴리펩티드 산물과 상이한 물질이다. 오염 물질은 원하는 폴리펩티드의 변형체(예를 들어, 원하는 폴리펩티드의 탈아미노화된 변형체 또는 아미노-아스파라긴산 변형체) 또는 다른 폴리펩티드, 핵산, 내독소 등일 수 있다.

출발 폴리펩티드의 "변형체" 또는 "아미노산 서열 변형체"는 출발 폴리펩티드의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일반적으로, 변형체는 천연 폴리펩티드와의 서열 일치도가 80 % 이상, 바람직하게는 90 % 이상, 보다 바람직하게는 95 % 이상이고, 가장 바람직하게는 98 % 이상이다. 서열 일치도(%)는 예를 들어 최대 상동성을 제공하게끔 서열을 배열한 다음, 피치(Fitch) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1382-1386 (1983)]의 방법 및 니들만(Needleman) 등의 문헌[J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)]에 기재된 알고리즘에 의해 결정한다. 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형체는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 내에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나 또는 펩티드 합성에 의해 만들 수 있다. 이러한 변형체는 예를 들어 목적 폴리펩티드의 아미노산 서열내 잔기의 결실 및(또는) 서열내 잔기의 삽입 및(또는) 서열내 잔기의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환을 임의 조합하여 최종 구조물을 만들 수도 있는데 다만 최종 구조물이 원하는 특징을 지녀야 한다. 또한, 아미노산 변화는 폴리펩티드의 번역후 프로세스를 바꿀 수 있는데, 예를 들어 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다. 폴리펩티드의 아미노산 서열 변형체를 생성하는 방법은 예를 들어 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제5,534,615호에 기재되어 있다.

"산성 변형체"는 목적 폴리펩티드의 변형체이며, 예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 결정된 바로는 목적 폴리펩티드 보다 산성이다. 산성 변형체의 예로는 탈아미노화된 변형체가 있다.

폴리펩티드 분자의 "탈아미노화된" 변형체는 본래의 폴리펩티드의 1개 이상의 아스파라긴 잔기가 아스파라긴산으로 전환된, 즉 중성 아미드 측쇄가 전체적으로 산성 특징을 지닌 잔기로 전환된 폴리펩티드이다. 하기 실시예의 탈아미노화된 humMAb4D5 항체는 그의 V_L 영역들 중 하나 또는 양쪽의 CDR1에서 Asn30이 아스파라긴산으로 전환된다. 본 명세서에 사용된 "탈아미노화된 인간 DNase"라는 용어는 천연 성숙 인간 DNase(본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제 5,279,823호)의 아미노산 서열 74번 위치의 아스파라긴 잔기에서 탈아미노화된 인간 DNase를 의미한다.

항-HER2 항체를 포함하는 조성물에 관하여 본 명세서에 사용된 "혼합물"이라는 용어는 원하는 항-HER2 항체 및 1종 이상의 그의 산성 변형체 모두의 존재를 의미한다. 이 산성 변형체는 탈아미노화된 항-HER2 항체를 주로, 다른 산성 변형체를 미량으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 발현으로부터 얻어진 항-HER2 항체의 시료에 있어서, 항-HER2 항체의 약 25 %가 탈아미노화되는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 바람직한 실시태양에 있어서, 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이다. "재조합 폴리펩티드"는 재조합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산으로 형질전환 또는 형질감염되거나 또는 상동 재조합의 결과로 재조합 폴리펩티드를 생산하는 숙주 세포에서 생산된 폴리펩티드이다. "형질 전환" 및 "형질 감염"은 서로 바꾸어 쓸 수 있는 용어인데, 세포내에 핵산을 도입하는 방법을 의미한다. 형질전환 또는 형질감염 후에, 핵산은 숙주 세포 게놈내에 통합되거나 염색체외 요소로서 존재할 수 있다. "숙주 세포"에는 시험관내 세포 배양에서의 세포 및 숙주 동물내 세포가 포함된다. 폴리펩티드를 재조합 생산하는 방법은 예를 들어 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제5,534,615호에 기재되어 있다.

"항체"라는 용어는 광범위한 의미로 사용되며, 특히 그가 원하는 생물 활성을 나타낸다면 모노클로날 항체(전장의 모노클로날 항체를 포함함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함한다.

본 명세서의 항체는 목적 "항원"에 대항해 지시된다. 바람직하게는, 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이며, 질병 또는 질환으로 고통받는 포유류에게 항체를 투여하여 그 포유류에게 치료 이익을 줄 수 있다. 그러나, 비폴리펩티드 항원에 대항해 지시되는 항체(예를 들어, 종양 관련 당지질 항원, 미국 특허 제5,091,178호 참조)도 고려 대상이다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 그는 막관통 분자(예를 들어, 수용체) 또는 리간드, 예를 들어 성장 인자일 수 있다. 전형적인 항원에는 상기 논의된 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명에 포함되는 항체의 바람직한 분자 표적은 CD 폴리펩티드, 예를 들어 EGF 수용체, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 및 CD34, HER 수용체 군의 요소, 예를 들어 HER2, HER3 또는 HER4 수용체, 세포 접착 분자, 예를 들어 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 a 또는 b 서브유닛을 포함하는 av/b3 인테크린(예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항 체), 성장 인자, 예를 들어 VEGF, IgE, 혈액형 항원, flk3/flt3 수용체, 비만증(OB) 수용체, mpl 수용체, CTLA-4, 폴리펩티드 C 등이 있다. 경우에 따라 다른 분자에 연결되는 가용성 항원 및 그의 단편을 항체를 생성시키는 면역원으로 사용할 수 있다. 막관통 분자, 예를 들어 수용체의 경우, 그의 단편(예를 들어, 수용체의 세포외 도메인)을 면역원으로 사용할 수 있다. 또는, 막관통 분자를 발현시키는 세포를 면역원으로 사용할 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원(예를 들어, 암 세포 라인)에서 유래하거나 또는 막관통 분자를 발현시키는 재조합 기술에 의해 형질전환되는 세포일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 "모노클로날 항체"라는 용어는 사실상 동종의 항체 집단으로부터 얻어진 항체를 의미하는데, 즉 동종의 항체 집단을 이루는 각 항체는 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 또한, 통상적으로 여러가지 결정 요소(에피톱)에 대항해 지시되는 여러가지 항체를 포함하는 통상의(폴리클로날) 항체 시료와는 대조적으로, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 1개의 결정 요소에 대항해 지시된다. "모노클로날"이라는 수식어는 사실상 동종의 항체 집단으로부터 얻어진 항체의 특징을 나타내며, 임의 특정 방법에 의한 항체를 생산해야 하는 것으로 이해되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 쾰러(Kohler) 등의 문헌[Nature 256:495(1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법 또는 재조합 DNA 방법[예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조]에 의해 생산할 수 있다. 다른 실시태양으로, "모노클로날 항체"는 맥카페르티(McCafferty) 등의 문헌[Nature, 348:552-554 (1990)], 클랙슨 (Clackson) 등의 문헌[Nature, 352:624-628 (1991)] 및 마르크스(Marks) 등의 문헌[J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 생성된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리할 수 있는데, 이들 문헌에는 파지 라이브러리를 이용하여 쥐와 인간의 항체를 각각 단리하는 방법이 기재되어 있다. 이후의 간행물에는 쇄 재편성에 의한 고 친화성(nM 범위) 인간 항체의 생산 방법[마르크스(Marks) 등의 문헌[Bio/Technology, 10:779-783 (1992)]], 및 초대형 파아지 라이브러리를 구성하는 전략으로서, 복합 형질감염 방법 및 생체내 재조합 방법[워터하우스(Waterhouse) 등의 문헌[Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)]]이 설명되어 있다. 따라서, 상기 기술은 모노클로날 항체를 단리하기 위한 통상의 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실행가능한 대안일 수 있다. 또는, 본 발명에 이르러, 면역화함으로써 내부 면역글로불린 생산의 부재하에 완전한 형태의 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자 도입 동물(예를 들어, 마우스)을 산출할 수 있게 되었다. 예를 들어, 키메라 및 생식-라인 돌연변이 마우스의 항체 중쇄 연결 영역(J_H) 유전자의 동형 결실은 내부 항체 생산을 완전히 억제하는 것으로 설명되어 있다. 인간 생식-라인 면역글로불린 유전자 배열을 상기 생식-라인 돌연변이 마우스로 전달하면, 항원 투여 후에 인간 항체가 생산될 것이다[예를 들어, 야코보비츠(Jakobovits) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)], 야코보비츠(Jakobovits) 등의 문헌[Nature, 362:255-258 (1993)], 브루게르만(Bruggermann) 등의 문헌[Year in Immuno., 7:33 (1993)] 및 두코살(Duchosal) 등의 문헌[Nature 355:258 (1992)] 참조].

본 명세서의 모노클로날 항체는 특히 "키메라" 항체(면역글로불린)를 포함하는데, 그의 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부는 특정 종 유래 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일 또는 상동이지만, 쇄(들)의 나머지 부분은 또다른 종 유래 또는 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 일치 또는 상동이며, 원하는 생물 활성을 나타낸다면 이 항체의 단편도 마찬가지이다[미국 특허 제4,816,567호 및 모리슨(Morrison) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]].

본 명세서에 사용된 "초가변성 영역"이라는 용어는 항원과 결합하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 이 초가변성 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 유래의 아미노산 잔기[즉, 경쇄 가변성 도메인의 잔기 24 내지 34(L1), 50 내지 56(L2) 및 89 내지 97(L3), 및 중쇄 가변성 도메인의 잔기 31 내지 35(H1), 50 내지 65(H2) 및 95 내지 102(H3); 카바트(Kabat) 등의 문헌[Sequences of polypeptides of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]] 및(또는) "초가변성 루프" 유래의 아미노산 잔기[즉, 경쇄 가변성 도메인의 잔기 26 내지 32(L1), 50 내지 52(L2) 및 91 내지 96(L3), 및 중쇄 가변성 도메인의 잔기 26 내지 32(H1), 53 내지 55(H2) 및 96 내지 101(H3); 코티아(Chotia) 및 레스크(Lesk)의 문헌[J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]]를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본 명세서에 정의된 초가변성 영역 잔기 이외의 가변성 도메인 잔기이다. 하기 실시예의 rhuMAb HER2 항체의 CDR 및 FR 잔기는 카터(Carter) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]에 기재되어 있다.

인간외 동물(예를 들어, 쥐)의 "인간화" 형태의 항체는 인간외 동물의 면역글로불린 유래의 최소한의 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 인간 면역글로불린(수여자 항체)인데, 수여자 항체의 초가변성 영역의 잔기는 원하는 특이성, 친화성 및 수용성을 지닌, 인간외의 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 인간외 영장류 항체의 초가변성 영역 유래의 잔기에 의해 대체된다. 경우에 따라, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR)의 잔기는 인간외 동물의 항체의 상응하는 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형체는 추가로 정제하여 항체로 사용할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 사실상 1개 이상, 통상적으로 2개 이상의 가변성 도메인을 모두 포함하는데, 모든 또는 사실상 모든 초가변성 루프는 인간외 동물의 면역글로불린의 초가변성 루프에 상응하며 모든 또는 사실상 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 FR 영역에 해당한다. 또한, 경우에 따라 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 통상적으로 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다.

인간 항체 경쇄 및 중쇄의 가변성 도메인 모두를 선택하여 인간화 항체를 만드는 것은 항원성을 줄이기 위해 매우 중요하다. 이른바 "꼭 맞음(best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변성 도메인의 서열을 공지된 인간 항체의 가변성 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝할 수 있다. 그 후에, 설치류의 항체 서열에 가장 가까운 인간 항체의 서열은 인간화 항체에 있어 프레임워크(FR)로서 허용된다[심스(Sims) 등의 문헌[J. Immunol., 151:2296 (1993)] 및 코티아(Chothia) 등의 문헌[J. Mol. Biol., 196:901 (1987)]].

또다른 방법에서는 모든 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 컨센서스 서열 유래의 특정 프레임워크를 사용한다. 이와 동일한 프레임워크가 여러 다른 인간화 항체로 사용될 수 있다[카터(Carter) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)] 및 프레스타(Presta) 등의 문헌[J. Immnol., 151:2623 (1993)]].

또한, 항체는 항원에 대한 높은 친화성 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 갖게끔 인간화하는 것이 중요하다. 이를 달성하기 위한 바람직한 방법에 따르면, 모 항체 서열 및 인간화 항체 서열의 3차원 모델을 이용하여 모 항체 서열 및 여러가지 개념상의 인간화 생성물을 분석하는 방법에 의해 인간화 항체를 제조한다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용되는 것이며 당업자에게 공지되어 있다. 컴퓨터 프로그램을 사용하여 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 배치 구조를 설명 및 도시하였다. 이 그림을 조사하여, 후보 면역글로불린 서열의 기능에 대한 잔기의 가능한 역할, 즉 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기를 분석할 수 있었다. 이러한 방식으로, 수여자 및 수입 서열로부터 FR 잔기를 선택하고 모을 수 있기 때문에, 바람직한 항체 특성, 예를 들어 표적 항원에 대한 항체의 친화성이 증가하게 된다.

"항체 단편"은 전장의 항체의 일부, 일반적으로 전장의 항체의 항원 결합 영 역 또는 그의 가변성 영역을 포함한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다. 항체 단편을 생산하기 위한 각종 기술이 개발되어 왔다. 통상적으로, 이러한 단편은 원형 항체의 단백질 가수 분해를 통해 유도된다[예를 들어, 모리모또(Morimoto) 등의 문헌[Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 브레난(Brennan) 등의 문헌[Science, 229:81 (1985)] 참조]. 그러나, 본 발명에 이르러 재조합 숙주 세포에 의해 이러한 단편을 직접 생산할 수 있게 되었다. 예를 들어, 이러한 항체 단편은 상기 논의된 항체 파아지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 또는, Fab'-SH 단편은 대장균(E.coli)으로부터 직접 회수하여 화학적인 방법으로 연결함으로써 F(ab')₂ 단편을 제조할 수 있다[카터(Carter) 등의 문헌[Bio/Technology 10:163-167 (1992)]]. 또다른 실시태양으로, F(ab')₂ 분자의 조립을 촉진하는 루신 지퍼 GCN4를 사용하여 F(ab')₂를 형성한다. 또다른 연구에 따르면, 재조합 숙주 세포 배양물로부터 F(ab')₂ 단편을 직접 단리할 수 있다. 항체 단편을 생산하는 다른 기술은 당업자라면 알 수 있는 기술이다.

다른 실시태양으로, 선택된 항체는 단쇄 Fv 단편(scFv)이다[국제 특허 출원 공개 제93/16185호 참조]. "단쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하며, 여기서 도메인은 폴리펩티드 단쇄로 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 추가로 V_H 및 V_L 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 포함하는데, 이 링커는 sFv가 항원 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하게끔 한다[sFv의 조사를 위해서는 플룩툰(Pluckthun)의 문헌[The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 참조].

"디아바디"라는 용어는 2개의 항원-결합 부위를 지닌 작은 항체 단편을 의미하는데, 이 단편은 동일 폴리펩티드 쇄(V_H-V_L)내의 경쇄 가변성 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변성 도메인(V_H)을 포함한다. 너무 짧아서 동일 쇄의 이러한 2개의 도메인을 짝지을 수 없는 링커를 사용함으로써, 이들 도메인이 다른 쇄의 상보적인 도메인과 쌍을 이루어 2개의 항원-결합 부위를 생성하게끔 한다. 디아바디는 예를 들어 유럽 특허 제404,097호, 국제 특허 출원 공개 제93/11161호 및 홀링거(Hollinger) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.

본 출원 명세서에 사용된 "선형 항체"라는 표현은 자파타(Zapata) 등의 문헌[Polypeptide Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]에 기재되어 있다. 요컨대, 이 항체들은 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 세로로 나란한 한쌍의 Fd 단편(V_H-C_H1-V_H-C_H1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적이거나 단일특이적일 수 있다.

"다중특이적 항체"는 일반적으로 다른 항원 유래의 2개 이상의 상이한 에피톱에 대한 결합 특이성을 지닌다. 이 분자는 통상적으로 2개의 항원과 결합할 뿐 이지만(즉, 이중특이적 항체, BsAb), 추가의 특이성을 지닌 항체, 예를 들어 삼중특이적 항체도 본 명세서에 사용된 다중특이적 항체라는 표현에 포함된다. BsAb의 예에는 종양 세포 항원에 대항해 지시되는 한 팔과 세포상해성 유도 분자에 대항해 지시되는 다른 팔을 지닌 분자, 예를 들어 항-FcγRI/항-CD15, 항-p185^HER2/F_c _γRIII(CD16), 항-CD3/항-악성 B-세포(1D10), 항-CD3/항-p185^HER2, 항-CD3/항-p97, 항-CD3/항-신장 세포 종양, 항-CD3/항-OVCAR-3, 항-CD3/L-D1(항-결장 종양), 항-CD3/항-멜라닌 세포 자극 호르몬 유사체, 항-EGF 수용체/항-CD3, 항-CD3/항-CAMA1, 항-CD3/항-CD19, 항-CD3/MoV18, 항-신경 세포 부착 분자(NCAM)/항-CD3, 항-엽산 결합 단백질(FBP)/항-CD3, 항-전체 종양 관련 항원(AMOC-31)/항-CD3, 종양 항원과 특이적으로 결합하는 한 팔과 독소와 결합하는 한 팔을 갖는 BsAb, 예를 들어 항-사포린/항-Id-1, 항-CD22/항-사포린, 항-CD7/항-사포린, 항-CD38/항-사포린, 항-CEA/항-리신 A 쇄, 항-인터페론-α(IFN-α)/항-하이브리도마 유전자형, 항-CEA/항-빈카 알칼로이드, 효소 활성화 프로드러그를 전환시키는 BsAb, 예를 들어 항-CD30/항-알칼리 포스파타제(미토마이신 포스파타제 프로드러그의 미토마이신 알콜로의 전환을 촉진시킴), 섬유소 용해 물질로 사용될 수 있는 BsAb, 예를 들어 항-피브린/항-조직 플라스미노겐 활성자(tPA), 항-피브린/항-유로키나제-유형 플라스미노겐 활성자(uPA), 면역복합체를 세포 표면 수용체로 표적화하는 BsAb, 예를 들어 항-저밀도 지단백질(LDL)/항-Fc 수용체(예를 들어, FcγRI 또는 FcγRIII), 감염성 질환 치료용의 BsAb, 예를 들어 항-CD3/항-단순-헤르페스 바이러스(HSV), 항-T-세포 수용체, CD3 복합체/항-인플루엔자, 항-Fcγ/항-HIV, 시험관내 또는 생체내의 종양 검출용 BsAb, 예를 들어 항-CEA/항-EOTUBE, 항-CEA/항-DPTA, 항-p185^HER2/항-합텐, 백신 보조제로서의 BsAb, 및 진단 도구로서의 BsAb, 예를 들어 항-토끼 IgG/항-페리틴, 항-양고추냉이 페록시다제(HRP)/항-호르몬, 항-소마토스타틴/항-물질 P, 항-HRP/항-FITC, 항-CEA/항-β-갈락토시다제가 포함된다. 삼중특이적 항체의 예에는 항-CD3/항-CD4/항-CD37, 항-CD3/항-CD5/항CD-37 및 항-CD3/항-CD8/항-CD37이 포함된다. 이중특이적 항체는 전장의 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')₂)으로 만들 수 있다.

이중특이적 항체를 만드는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장의 이중특이적 항체를 생산하는 통상적인 방법은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현을 토대로 한다[밀스타인(Millstein) 등의 문헌[Nature, 305:537-539 (1983)]]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 임의 분류로 인해, 상기 하이브리도마(쿼드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산하며, 그 중 한가지 항체 분자가 정확한 이중특이적 구조를 가질뿐이다. 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 이중특이적 구조를 지닌 항체 분자의 정제는 다소 귀찮은 일이며, 생성물의 수율도 낮다. 이와 유사한 방법이 국제 특허 출원 공개 제93/08829호 및 트라우네커(Traunecker) 등의 문헌[EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.

다른 연구에 의하면, 원하는 결합 특이성을 지닌 항체의 가변성 도메인은 면 역글로불린 불변 도메인 서열과 융합한다. 이 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합인 것이 바람직하다. 융합체 중 적어도 하나 이상에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 원한다면 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별도의 발현 벡터내에 삽입하여 적합한 숙주 유기체를 공동 형질감염시킨다. 그 결과, 이 구조물에 사용된 다른 비율의 3가지 폴리펩티드 쇄가 최적의 수율을 제공하는 실시태양에 있어서 이 3가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동비율인 2가지 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현이 높은 수율로 나타나거나 또는 이 비율이 특별한 의미가 없는 경우, 발현 벡터에 2가지 또는 3가지 폴리펩티드 쇄의 코딩 서열을 삽입할 수 있다.

상기 연구의 바람직한 한 실시태양으로, 이중특이적 항체는 한 팔에 제1 결합 특이성을 지닌 하이브리드 면역글로불린 중쇄 및 다른 팔에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)으로 이루어진다. 이 비대칭적 구조로 원치 않는 면역글로불린 쇄의 배합물로부터 원하는 이중특이적 화합물을 쉽게 분리할 수 있는 것으로 밝혀졌는데, 마찬가지로 면역글로불린 경쇄가 이중특이적 분자의 절반에만 존재하여도 원하는 이중특이적 화합물을 쉽게 분리할 수 있었다. 이 연구는 국제 특허 출원 공개 제94/04690호에 개시되어 있다. 이중 특이적 항체를 생산하는 보다 상세한 방법으로는, 수레쉬(Suresh) 등의 문헌[Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.

국제 특허 출원 공개 제96/27011호에 개시된 또다른 연구에 의하면, 한쌍의 항체 분자 사이의 인터페이스를 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로이량체의 백분율을 최대화할 수 있다. 이 인터페이스는 항체 불변 도메인 중 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 첫번째 항체 분자의 인터페이스로부터 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체한다. 큰 아미노산 측쇄를 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써, 큰 측쇄와 동일한 크기이거나 또는 작은 크기의 보충적인 "강"을 두번째 항체 분자의 인터페이스에 생성한다. 그 결과, 호모이량체와 같은 원치 않는 최종 산물을 사용하여 헤테로이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.

이중특이적 항체는 가교 항체 또는 "헤테로복합체" 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로복합체 항체 중 하나는 아비딘에 연결하고 다른 하나는 비오틴에 연결할 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 원치 않는 세포에 대해 면역계 세포를 표적화하고[미국 특허 제4,676,980호] HIV 감염을 치료하는데[국제 특허 출원 공개 제91/00360호, 국제 특허 출원 공개 제92/200373호 및 유럽 특허 제03089호] 제공된다. 임의 편리한 가교화 방법을 이용하여 헤테로복합체 항체를 만들 수 있다. 적합한 가교 물질은 당업계에 잘 알려져 있으며 많은 가교 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 문헌에 기재되어 있 다. 예를 들어, 화학적 가교 방법을 이용하여 이중특이적 항체를 만들 수 있다. 브레난(Brennan) 등의 문헌[Science, 229:81 (1985)]에는 원형 항체를 단백질 가수분해로 잘라내어 F(ab')₂ 단편을 생성하는 방법이 기재되어 있다. 이 단편을 디티올 복합 물질인 소듐 아르세니트의 존재하에 환원시켜 비시날 디티올을 안정화시키고 분자내 디술피드 형성을 막는다. 그 후에, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환시킨다. 그 후에, 머캅토에틸아민으로 환원함으로써 Fab'-TNB 유도체의 하나를 Fab'-티올로 재전환시키고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다. 생성된 이중특이적 항체는 효소를 선별적으로 고정화하는 물질로 사용할 수 있다.

최근의 연구는 화학적으로 연결되어 이중특이적 항체를 형성할 수 있는 대장균 유래의 Fab'-SH 단편의 직접적인 발견을 촉진하였다. 샬라비(Shalaby) 등의 문헌[J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)]에는 완전한 인간화 이중특이적 항체 F(ab')2 분자를 생산하는 방법이 기재되어 있다. 각각의 Fab' 단편은 대장균으로부터 각각 분비되며 시험관내에서 직접 화학적으로 연결되어 이중특이적 항체를 형성한다.

재조합 세포 배양물로부터 직접 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하는 여러 가지 기술도 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 루신 지퍼를 사용함으로써 이중특이적 항체를 생산하였다[코스텔니(Kostelny)의 문헌[J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]]. 유전자 융합에 의해 Fos 및 Jun 단백질 유래의 루신 지퍼 펩티드를 2종의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결하였다. 이 항체 호모이량체의 힌지 영역을 환원시켜 단량체를 형성한 다음, 재산화하여 항체 헤테로이량체를 형성하였다. 이 방법은 항체 호모이량체를 생산하는데에도 이용할 수 있다. 홀링거(Hollinger) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아비디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 만드는 다른 메카니즘을 제공한다. 이 단편은 링커에 의해 경쇄 가변성 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변성 도메인(V_H)을 포함하는데, 이 링커는 너무 짧아서 두 도메인을 동일 쇄로 짝지을 수 없다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인은 다른 단편의 상보적인 V_L 및 V_H 도메인과 쌍을 이루게 되며, 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단쇄 Fv(sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 만드는 또다른 전략이 보고되었다[그루버(Gruber) 등의 문헌[J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조].

2가 이상의 결합가를 갖는 항체도 고려 대상이다. 예를 들어, 삼중특이적 항체를 만들 수 있다[투트(Tutt) 등의 문헌[J. Immunol. 147:60 (1991)]].

"이온 교환 물질"이라는 용어는 음으로 하전된 고체상(즉, 양이온 교환 수지) 또는 양으로 하전된 고체상(즉, 임이온 수지)을 의미한다. 1종 이상의 하전된 리간드를 고체상에 부착함으로써, 즉 공유 연결에 의해 전하를 제공할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 전하는 고체상의 고유의 특성일 수 있다(예를 들어, 실리카의 경우, 고체상은 전체적으로 음전하를 띤다).

"고체상"이라는 용어는 1종 이상의 하전된 리간드가 부착할 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 고체상은 정제 컬럼, 불균일 상의 이산된 입자, 막 또는 필터 등일 수 있다. 고체상을 형성하는 물질의 예에는 폴리사카라이드(예를 들어, 아가로스 및 셀룰로스), 및 기계적으로 안정한 그 밖의 매트릭스, 예를 들어 실리카(예를 들어, 조절형 공극 글래스), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 세라믹 입자 및 상기 임의 물질의 유도체가 포함된다.

"양이온 교환 수지"라는 용어는 음으로 하전된 고체상을 의미하며, 고체상을 지나치거나 통과하는 수용액 중의 양이온과 교환되는 유리 양이온을 갖는다. 양이온 교환 수지를 형성하는 고체상에 부착된 음으로 하전된 리간드는 예를 들어 카르복실레이트 또는 술포네이트일 수 있다. 시판되는 양이온 교환 수지에는 카르복시-메틸-셀룰로스, BAKERBOND ABX(등록상표), 아가로스에 고정된 술포프로필(SP)[예를 들어, 파마시아(Pharmacia)사의 SP-SEPHAROSE FAST FLOW(등록상표) 또는 SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE(등록상표)] 및 아가로스에 고정된 술포닐[예를 들어, 파마시아사의 S-SEPHAROSE FAST FLOW(등록상표)]이 포함된다.

본 명세서에 사용된 "음이온 교환 수지"라는 용어는 예를 들어 고체상에 부착된 1종 이상의 양으로 하전된 리간드, 예를 들어 4가의 아미노기를 갖는 양으로 하전된 고체상을 의미한다. 시판되는 음이온 교환 수지에는 DEAE 셀룰로스, OAE SEPHADEX(등록상표) 및 FAST Q SEPHAROSE(등록상표)(파마시아사)가 포함된다.

"완충액"은 산-염기 복합 성분의 작용에 의해 pH의 변화에 저항하는 용액이다. 예를 들어, 완충액의 원하는 pH에 따라 사용할 수 있는 여러 가지 완충액이 문헌[Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological System, Gueffroy, D., Ed. Calbiochem Corporation (1975)]에 기재되어 있다. 한 실시태양으로는, 완충액의 pH 범위는 약 5 내지 7이다(예를 들어, 하기 실시예 1에 나타냄). 이 범위에서 pH를 조절하는 완충액의 예에는 MES, MOPS, MOPSO, 인산, 아세트산, 시트르산, 숙신산 및 암모늄 완충액, 및 이 완충액의 조합이 포함된다.

"로딩 완충액"이란 목적 폴리펩티드 분자 및 1종 이상의 오염 물질을 포함하는 조성물을 이온 교환 수지에 로딩하는데 사용되는 완충액이다. 로딩 완충액은 목적 폴리펩티드 분자(및 일반적으로 1종 이상의 오염 물질)가 이온 교환 수지에 결합하는 전도도 및(또는) pH를 갖는다.

"중간 완충액"은 목적 폴리펩티드 분자를 용출하기에 앞서 이온 교환 수지로부터 1종 이상의 오염 물질을 용출하는데 사용된다. 중간 완충액의 전도도 및(또는) pH는, 오염 물질은 이온 교환 수지로부터 용출되나 많은 양의 목적 폴리펩티드는 용출되지 않는 전도도 및(또는) pH이다.

본 명세서에 사용된 "세정 완충액"이라는 용어는 목적 폴리펩티드 분자를 용출하기에 앞서 이온 교환 수지를 세척 또는 재평형화하는데 사용되는 완충액을 의미한다. 이롭게는, 세정 완충액 및 로딩 완충액은 동일할 수도 있으나 반드시 그렇지는 않다.

"용출 완충액"은 고체상으로부터 목적 폴리펩티드를 용출하는데 사용된다. 용출 완충액의 전도도 및(또는) pH는 목적 폴리펩티드가 이온 교환 수지로부터 용출되는 전도도 및(또는) pH이다. "재생 완충액"을 사용하여 이온 교환 수지를 재생함으로써 이 수지를 재사용할 수 있다. 재생 완충액은 이온 교환 수지로부터 사 실상 모든 오염 물질 및 목적 폴리펩티드를 제거하는데 필요한 전도도 및(또는) pH를 갖는다.

"전도도"라는 용어는 두 전극 사이의 전류 흐름을 통하게 하는 수용액의 능력을 의미한다. 용액에서는, 이온 운반에 의해 전류가 흐른다. 따라서, 수용액 중 존재하는 이온량을 증가시키면, 용액은 더 높은 전도도를 갖게 될 것이다. 전도도의 측정 단위는 mmhos(mS/cm)이며, 시판되는 전도도 측정기, 예를 들어 오리온(Orion)을 사용하여 측정할 수 있다. 용액의 이온 농도를 변화시킴으로써 용액의 전도도를 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 원하는 전도도를 얻기 위해 용액 중 완충 물질의 농도 및(또는) 염(예를 들어, NaCl 또는 KCl)의 농도를 변화시킬 수 있다. 바람직하게는, 하기 실시예와 같이 각종 완충액의 염 농도를 변경하여 원하는 전도도를 얻을 수 있다.

폴리펩티드 및 1종 이상의 오염 물질을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 "정제한다"는 것은 이 조성물로부터 1종 이상의 오염 물질을 완전히 또는 부분적으로 제거함으로써 조성물 중 폴리펩티드의 순도를 증가시키는 것을 의미한다. "정제 단계"는 "균일한" 조성물을 생성하는 전체 정제 과정의 일부일 수 있으며, 본 명세서에 사용된 "균일한" 조성물이라는 용어는 조성물의 총량을 기준으로 목적 폴리펩티드를 약 70 중량% 이상, 바람직하게는 약 80 중량% 이상 포함하는 조성물을 의미한다.

다른 지시가 없다면, 본 명세서에 사용된 "HER2"라는 용어는 인간 HER2 단백질을 의미하며, "HER2"라는 용어는 인간 HER2 유전자를 의미한다. 인간 HER2 유전 자 및 HER2 단백질은 예를 들어 셈바(Semba) 등의 문헌[PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985)] 및 야마모또(Yamamoto) 등의 문헌[Nature 319:230-234 (1986)]에 기재되어 있다(젠뱅크(Genebank) 기탁 번호 제X03363호).

본 명세서에 사용된 "humMAbD5-8"이라는 용어는 SEQ ID NO:1의 경쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:2의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항-HER2 항체를 의미하거나 또는 HER2와 결합하여 HER2를 과다발현하는 종양 세포의 증식을 억제하는 능력을 지닌 인간화 항-HER2 항체의 아미노산 서열 변형체를 의미한다[본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제5,677,171호 참조].

폴리펩티드의 "pI" 또는 "등전점"은 폴리펩티드의 양전하가 그의 음전하와 균형을 이루는 pH를 의미한다. pI는 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 순 전하로부터 계산하거나 또는 등전점 전기영동법(예를 들어, 하기 실시예의 CSx 크로마토그래피법을 이용하여)에 의해 결정할 수 있다.

이온 교환 물질에 분자를 "결합시키는 것"은 적절한 조건(pH/전도도)하에 이온 교환 물질에 분자를 노출시킴으로써 분자와 이온 교환 물질의 하전된 기 또는 기들 사이의 이온 상호작용에 의해 분자가 이온 교환 물질 내 또는 이온 교환 물질 상에 가역적으로 고정되는 것을 의미한다.

이온 교환 물질을 "세척하는 것"은 적당한 완충액이 이온 교환 물질을 통과하거나 지나치게 하는 것을 의미한다.

이온 교환 물질로부터 분자(예를 들어, 폴리펩티드 또는 오염 물질)를 "용출시키는 것"은 이온 교환 물질을 둘러싸는 완충액의 이온 농도를 변화시켜 이온 교 환 물질의 하전된 부위에 대해 완충액이 분자와 경합함으로써 이온 교환 물질로부터 분자를 제거하는 것을 의미한다.

"처리"는 치료 처리 및 예방 또는 방어 조치를 모두 의미한다. 처리해야 하는 대상에는 이미 질환에 걸린 대상 및 질환을 예방해야 하는 대상이 포함된다. "질환"은 본 명세서에 기재된 바와 같이 정제된 폴리펩티드로 처리하면 이로울 수 있는 어떤 증상을 의미한다. 이 질환에는 포유류가 해당 질환에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 증상을 비롯한 급만성 질환 또는 질병이 포함된다.

본 명세서에 사용된 "표지"라는 용어는 폴리펩티드에 직접 또는 간접적으로 연결되는 검출용 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체로 검출할 수 있거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지) 또는 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉진할 수 있다.

본 명세서에 사용된 "세포상해성 물질"이라는 용어는 세포의 기능을 억제 또는 저해하고(하거나) 세포의 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 이 용어는 방사성 동위원소(예를 들어, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ 및 Re¹⁸⁶), 화학치료제, 및 독소, 예를 들어 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편을 포함하는 의미이다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학 화합물이다. 화학요법제의 예에는 아드리아마이신, 독소루비신, 에피루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁소이드(예를 들어, 파 클리탁셀(TAXOL(등록상표), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)), 및 독세탁셀, 톡소테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포시드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라마이신[미국 특허 제4,675,187호 참조], 멜팔란 및 다른 관련 니트로젠 머스타드가 포함된다. 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 호르몬제, 예를 들어 타목시펜 및 오나프리스톤도 상기 정의에 포함된다.

<본 발명의 실시 방법>

본 발명은 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염 물질을 포함하는 조성물(예를 들어, 수용액)로부터 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다. 이 조성물은 일반적으로 폴리펩티드의 재조합 생산물로부터 생성된 것이지만 펩티드 합성법(또는 다른 합성 방법)에 의한 폴리펩티드 생산으로부터 생성된 것일 수도 있고, 또는 이 펩티드는 폴리펩티드의 천연 공급원으로부터 정제될 수도 있다. 바람직하게는, 이 폴리펩티드는 항체, 예를 들어 HER2 항원과 결합하는 항체이다.

폴리펩티드를 재조합 생산하는 경우, 그를 코딩하는 핵산을 단리하여 또다른 클로닝(그 DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제 벡터내에 삽입한다. 이 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 통상의 방법을 이용하여 쉽게 단리 및 서열 분석된다(예를 들어, 여기서 폴리펩티드는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 항체임). 많은 벡터를 이용할 수 있다. 이 벡터 성분에는 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 1종 이상의 표식 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열[예를 들어, 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 미국 특허 제5,534,615호에 개시됨]의 1종 이상이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서의 벡터내 DNA를 클로닝 또는 발현하는데 적합한 숙주 세포로는 원핵 생물, 효모 또는 상기 기재된 고등 진핵생물 세포가 있다. 이 목적에 적합한 원핵 생물에는 진정세균, 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 장내세균과(Enterobacteriaceae), 예를 들어 이세리키아(Escherichia), 예를 들어 대장균(E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르비니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Samonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Samonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella)뿐 아니라 바실리(Bacilli), 예를 들어 비. 서브틸리스(B. Subtilis) 및 비. 리치에니포르미스(B. licheniformis)(예를 들어, 1989년 4월 12일에 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리치에니포르미스(B. licheniformis) 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 피. 애루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Strepomyces)가 포함된다. 바람직한 한 대장균 클로닝 숙주로는 대장균 294(ATCC 31,446)이 있지만, 다른 균주, 예를 들어 대장균 B, 대장균 X1776(ATCC 31,537) 및 대장균 W3110(ATCC 27,325)도 적합하다. 이 예는 설명을 위한 것일 뿐이며 한정하려는 것은 아니다.

원핵 생물 이외에, 진핵 미생물, 예를 들어 사상 진균 또는 효모도 폴리펩티드 코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 및 발현 숙주이다. 하등 진핵 숙주 미생물 중 에서는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 제빵 효모가 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다른 많은 속, 종 및 균주도 통상적으로 이용되고 유용하며, 그 예로는 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 비커라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178) 케이. 발티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36,960), 케이. 테모토레란스(K. thermotolerans) 및 케이. 마르키아누스(K. marxianus), 야로비아(yarrowia)(EP 402,226), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070), 칸디다(Candida), 트리코데마 레시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 쉬바니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스(Schiwanniomyces occidentalis), 및 사상 진균, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)가 있다.

글리코실화 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체 유래의 세포이다. 무척추 동물 세포의 예에는 식물 세포 및 곤충 세포가 포함된다. 많은 바쿨로바이러스 균주 및 변형체, 및 숙주, 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(카터필라), 애데스 애집티(Aedes aegypti)(모기), 애데스 알보피크투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(초파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) 유래의 상응하는 임의의 곤충 숙주 세포가 동정되었다. 많은 형질감염용 바이러스 균주는 공개적으로 이용할 수 있으며, 예를 들어 오토그라파 캘리포니아(Autographa california) NPV의 L-1 변형체 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주, 및 상기 바이러스가 본 발명에 따른 바이러스로 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염에 사용할 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 콩, 페투니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물도 숙주로 이용할 수 있다.

그러나, 가장 흥미로운 숙주는 척추동물 세포이며, 배양물(조직 배양) 중 척추동물 세포의 증식법이 일반적인 방법으로 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포 라인의 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인(COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 세포 라인[293 세포 또는 현탁 배양물에서 증식을 위해 서브클로닝된 293 세포, 그라함(Graham) 등의 문헌[J. Gen Virol. 36:59 (1977)]], 어린 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10), 중국산 햄스터 난소 세포/-DHFR[CHO, 우르라우브(Urlaub) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]], 마우스 세르톨리 세포[TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)], 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70), 아프리카 초록 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 경부 종양 세포(HELA, ATCC CCL 2), 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065), 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL 51), TRI 세포[마터(Mather) 등의 문헌[Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]], MRC 5 세포, FS4 세포 및 인간 간암 세포 라인(Hep G2)이 있다.

숙주 세포는 폴리펩티드 생산을 위해 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되며, 프로모터를 유도하고 형질전환체를 선별하고 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭하는데 적합하게끔 변형된 통상의 영양 배지에서 배양된다.

본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 사용되는 숙주 세포는 여러가지 배지에서 배양할 수 있다. 시판되는 배지, 예를 들어 Ham's F10(시그마사(Sigma)), 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium(MEM), (시그마사)), RPMI-1640(시그마사) 및 둘베코스 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM, 시그마사))가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 함(Ham) 등의 문헌[Meth. Enz. 58:44 (1979)], 반스(Barns) 등의 문헌[Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호, 제4,657,866호, 제4,927,762호, 제4,560,655호 또는 제5,122,469호, 국제 특허 출원 공개 제90/03430호, 제87/00195호 또는 미국 특허 제30,985호에 기재된 임의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용할 수 있다. 필요에 따라, 상기 임의 배지에 호르몬 및(또는) 다른 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 증식 인자), 염(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액(예를 들어, HEPES), 뉴클레오티드(예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들어, 겐타마이신(GENTAMYCIN, 등록상표) 약물), 미량 원소(일반적으로, 최종 농도에서 마이크로몰 범위로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지원을 보충할 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물을 당업자에게 공지된 적합한 농도로 포함시킬 수도 있다. 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대한 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 기존에 사용되던 조건이며 당업자에게는 자명한 것이다.

재조합 기술을 사용하는 경우, 폴리펩티드는 세포내, 막간 공간에서 생성되거나 또는 배지내로 직접 분비될 수 있다. 폴리펩티드가 세포내에서 생산되는 경우, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용균 세포의 파쇄 미립자(예를 들어, 균질화하여 생성됨)가 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 폴리펩티드가 배지내로 분비되는 경우, 이 발현 계의 상등액은 일반적으로 시판 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 이용하여 먼저 농축된다.

그 후에, 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 이온 교환 크로마토그래피 방법을 포함하는 한단계 이상의 정제 단계에 의해 처리된다. 이온 교환 크로마토그래피 방법에 앞서서, 그 동안 또는 이후에 수행될 수 있는 추가의 정제 방법의 예에는 소수성 상호작용 크로마토그래피 상(예를 들어, 페닐 세파로스 상) 분류법, 에탄올 침전법, 등전점 전기영동법, 역상 HPLC법, 실리카 상 크로마토그래피법, HEPARIN SEPHAROSE(등록상표) 상 크로마토그래피법, 다른 음이온 교환 크로마토그래피법 및(또는) 다른 양이온 교환 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, SDS-PAGE, 황산암모늄 침전법, 히드록실라파티트 크로마토그래피법, 겔 전기영동법, 투석법 및 친화성 크로마토그래피법(예를 들어, 포획 시약(capture reagent)으로 단백질 A, 단백질 G, 항체, 특이적 기질, 리간드 또는 항체를 사용함)이 포함된다.

이온 교환 크로마토그래피는 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행된다. 먼저 결정할 것은 음이온 교환 수지 또는 양이온 교환 수지 중 어느 것을 사용할 것인지이다. 일반적으로, 양이온 교환 수지는 pI가 약 7을 초과하는 폴리펩티드에 사용할 수 있고, 음이온 교환 수지는 pI가 약 7 미만인 폴리펩티드에 사용할 수 있다.

음이온 교환 수지 또는 양이온 교환 수지는 공지된 방법에 따라 제조한다. 일반적으로, 폴리펩티드 및 1종 이상의 오염 물질을 포함하는 조성물을 수지에 로딩하기에 앞서, 이온 교환 수지에 평형 완충액을 통과시킨다. 이롭게는, 평형 완충액은 로딩 완충액과 동일한 완충액이나 반드시 그렇지는 않다.

크로마토그래피에 사용되는 각종 완충액은 예를 들어 양이온 교환 수지를 사용할 것인지 또는 음이온 교환 수지를 사용할 것인지에 따라 달라진다. 이는 도 1 및 도 2의 흐름도에 보다 분명하게 나타나 있다.

특히, 도 1에는 양이온 교환 수지가 사용되는 경우에 수행되는 전형적인 단계가 나타나 있는데, 전도도 및(또는) pH가 선행 단계의 중간 완충액의 전도도 및(또는) pH 보다 낮은 세정 완충액을 제외하고는 각 완충액의 pH 및(또는) 전도도는 선행 단계의 완충액에 비해 증가한다. 폴리펩티드 및 오염 물질이 양이온 교환 수지에 결합하는 pH 및(또는) 전도도의 로딩 완충액을 사용하여 목적 폴리펩티드 및 오염 물질을 포함하는 수용액을 양이온 교환 수지에 로딩하였다. 하기 실시예에 나타난 바와 같이, 1단계의 로딩 완충액의 전도도는 가장 낮을 수 있다(예를 들어, 약 5.2 내지 약 6.6 mmhos). 로딩 완충액의 전형적인 pH는 약 5.0일 수 있다(도 1 참조). (예를 들어, 전장의 항체의) 폴리펩티드 약 20 mg/mL 내지 약 35 mg/mL를 예를 들어 이온 교환 수지에 로딩할 수 있다.

그 후에, 양이온 교환 수지를 본질적으로는 오염 물질을 용출시키지만 상당한 양의 목적 폴리펩티드는 용출시키지 않는 제2 전도도 및(또는) pH의 중간 완충액으로 세척하였다. 이는 중간 완충액의 전도도 또는 pH, 또는 이들 모두를 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 로딩 완충액으로부터 중간 완충액으로의 pH 변화는 목적에 따라 단계적 또는 점진적일 수 있다. 본 명세서의 실시예에서, 중간 완충액은 로딩 완충액보다 더 높은 전도도를 갖는다(즉, 중간 완충액의 전도도는 약 7.3 내지 약 8.4 mmhos의 범위임). 또는, 도 1에 나타낸 바와 같이, 양이온 교환 수지가 사용되는 본 발명의 실시태양에서 중간 완충액의 pH는 로딩 완충액의 pH를 초과할 수 있다. 예를 들어, 중간 완충액의 pH는 약 5.4일 수 있다.

중간 완충액으로의 세척 단계 이후에, 중간 완충액 보다 낮은 전도도 또는 pH, 또는 이들 모두를 갖는 세정 완충액으로 양이온 교환 수지를 세척 또는 재평형화하였다(즉, 문헌의 이온 교환 크로마토그래피 단계와는 다르게, 전도도 또는 pH, 또는 이들 모두는 반대로, 즉 선행 단계에 대해 역방향으로 변화시킴). 하기 실시예에서, 세정 완충액은 로딩 완충액과 대략 동일한 전도도(즉, 약 5.2 내지 약 6.6 mmhos 범위)를 가지며, 따라서 그의 전도도는 중간 완충액의 전도도 미만이다. 또다른 실시태양으로, 세정 완충액의 전도도가 중간 완충액의 전도도 미만이라면, 세정 완충액의 전도도를 로딩 완충액의 전도도 미만 또는 초과의 전도도로 낮출 수 있다. 또다른 실시태양으로, 세정 완충액의 pH는 중간 완충액의 pH 미만일 수 있다(예를 들어, 세정 완충액의 pH는 약 5.0일 수 있음). 중간 완충액과 비교되는 세정 완충액의 전도도 및(또는) pH의 변화는 이 파라메타들을 각각 또는 모두 단계 적 또는 점진적으로 변화시켜 달성할 수 있다.

앞 단락에서 세척 단계 이후에, 양이온 교환 수지로부터 목적 폴리펩티드 분자를 용출하기 위한 준비를 하였다. 원하는 폴리펩티드가 더 이상 양이온 교환 수지에 결합하지 않으며, 따라서 그로부터 용출되는 pH 및(또는) 전도도를 갖는 용출 완충액을 사용하여 목적 폴리펩티드를 용출하였다. 용출 완충액의 pH 및(또는) 전도도는 일반적으로 선행 단계에서 사용된 로딩 완충액, 중간 완충액 및 세정 완충액의 pH 및(또는) 전도도를 초과한다. 하기 실시예에서, 용출 완충액의 전도도는 약 10.0 내지 약 11.0 mmhos 범위이었다. 별법으로 또는 추가로, 용출 완충액의 pH는 세정 완충액 및 중간 완충액에 상대적으로 증가시킬 수 있다(예를 들어, 용출 완충액의 pH는 약 6.0일 수 있음). 전도도 및(또는) pH 변화는 목적에 따라 단계적 또는 점진적일 수 있다. 따라서, 원하는 폴리펩티드는 상기 방법 중 이 단계에서 양이온 교환 수지로부터 회수된다.

다른 실시태양으로, 이온 교환 물질은 음이온 교환 수지를 포함한다. 본 발명의 이 실시태양은 본 명세서의 도 2에 나타나 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 전도도의 변화는 일반적으로 양이온 교환 수지에 대해 상기에 기재된 바와 같다. 그러나, pH 변화 방향은 음이온 교환 수지와는 다르다. 예를 들어, pH를 변화시켜 오염 물질 및 폴리펩티드를 용출시킨다면, 로딩 완충액의 pH는 가장 낮으며, 오염 물질 또는 오염 물질들을 용출시키기 위해 중간 완충액의 pH는 이보다 낮아지게 된다. 세번째 단계에서, 컬럼은 세정 완충액으로 세척 및 재평형화되며 전도도 또는 pH, 또는 이들 모두의 변화는 선행 단계의 전도도 또는 pH, 또는 이들 모두의 변화 에 대해 반대 방향이다. 따라서, pH는 중간 완충액에 비해 세정 완충액에서 증가할 수 있다. 이 단계 후에, 제4 전도도 및(또는) pH의 용출 완충액을 사용함으로써 음이온 교환 수지로부터 목적 폴리펩티드를 용출시킨다. pH가 변화한다면, pH는 일반적으로 로딩 완충액, 중간 완충액 및 세정 완충액의 pH 미만일 것이다. 상기 설명된 바와 같이, 이들 완충액에서 pH 및(또는) 전도도의 변화는 단계적 또는 점진적일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양으로, 1개의 파라메타(즉, 전도도 또는 pH)를 변화시켜 원하는 폴리펩티드 및 오염 물질 모두를 용출시킬 수 있지만, 다른 파라메타(즉, pH 또는 전도도, 각각)는 대략 일정하게 유지된다. 예를 들어, 여러가지 완충액(로딩 완충액, 중간 완충액, 세정 완충액 및(또는) 용출 완충액)의 전도도는 다를 수 있지만, 그의 pH는 본질적으로 동일할 수 있다.

본 발명의 임의 실시태양에서, 목적 폴리펩티드의 용출 후에, 재생 완충액을 사용하여 이온 교환 수지를 재생하고, 컬럼을 재사용할 수 있다. 일반적으로, 재생 완충액의 전도도 및(또는) pH는 사실상 모든 오염 물질 및 목적 폴리펩티드가 이온 교환 수지로부터 용출되는 정도의 것이다. 일반적으로, 이온 교환 수지로부터 오염 물질 및 폴리펩티드를 용출하기 위해, 재생 완충액은 매우 높은 전도도를 갖는다.

본 발명의 방법은 1종 이상의 오염 물질로부터 목적 폴리펩티드 분자를 단리하는데 특히 유용한데, 여기서 오염 물질 및 목적 폴리펩티드 분자의 이온 전하는 약간만 다를 뿐이다. 예를 들어, 목적 폴리펩티드 및 오염 물질의 pI는 단지 "약 간 다를" 수 있는데, 예를 들어 약 0.05 내지 약 0.2 pI 단위만이 다를 뿐이다. 하기 실시예에서, 본 발명의 방법을 이용하여 8.79의 pI를 갖는 항-HER2 항체의 1-탈아미노화된 변형체로부터 8.87의 pI를 갖는 항-HER2 항체를 단리할 수 있었다. 또는, 이 방법을 이용하여 예를 들어 탈아미노화되지 않은 DNase로부터 탈아미노화된 DNase를 단리할 수 있었다. 또다른 실시태양으로, 본 발명의 방법을 이용하여 폴리펩티드의 글리코실화 변형체로부터 폴리펩티드를, 예를 들어 변형되지 않은 폴리펩티드와 비교하여 다른 분포의 시알산을 갖는 폴리펩티드의 변형체를 단리할 수 있었다.

본 발명의 이온 교환 크로마토그래피 방법에 따라 얻어진 폴리펩티드 시료는 필요하다면 추가의 정제 단계를 거칠 수 있다. 전형적인 추가의 정제 단계는 상기에 논의되어 있다.

경우에 따라, 폴리펩티드는 원하는 1종 이상의 이종 분자에 연결된다. 이종 분자는 예를 들어 폴리펩티드(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, PEG)의 혈청 반감기를 증가시키는 분자이거나 또는 표지(예를 들어, 효소, 형광 표지 및(또는) 방사성 핵종) 또는 세포상해성 분자(예를 들어, 독소, 화학요법 약물 또는 방사성 동위원소 등)일 수 있다.

원하는 순도를 지닌 폴리펩티드를 임의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 함께 동결건조 제형 또는 수용액 형태로 혼합함으로써 폴리펩티드, 경우에 따라 이종 분자에 연결된 폴리펩티드를 포함하는 치료 배합물을 제조할 수 있다[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]. "제 약상 허용되는" 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 투여량 및 농도에서 수여자에 대해 비독성이며, 완충액, 예를 들어 인산, 시트르산 및 다른 유기산 완충액, 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제, 보존제(예를 들어, 염화 옥타데실디메틸벤질 암모늄, 염화 헥사메토늄, 염화 벤즈알코늄, 염화 벤즈에토늄, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸), 저분자량(잔기 약 10개 미만) 폴리펩티드, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린, 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신, 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물, 킬레이트제, 예를 들어 EDTA, 슈가, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨, 염-형성 쌍이온, 예를 들어 나트륨, 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체), 및(또는) 비이온성 표면활성제, 예를 들어 TWEEN(등록상표), PLURONICS(등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 본 발명의 특정 목적 humMAb4D5-8 항체는 예를 들어 본 명세서에 참고 문헌으로 인용되는 국제 특허 출원 공개 제97/04801호에 개시된 동결건조 제형으로 제조할 수 있다.

본 발명의 배합물은 치료할 특정 증상에 필요한 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물을 포함할 수도 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도하는 목적에 효과적인 양으로 배합된다. 예를 들어 항-HER2 항체의 경우, 예를 들어 탁소이드 또는 타목시펜과 같은 화학요법 제를 배합물에 첨가할 수 있다.

활성 성분은 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캅셀, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캅셀 및 폴리-(메틸메타크릴레이트)마이크로캅셀 각각, 콜로이드 약물 전달계(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캅셀) 또는 매크로에멀젼에 포함시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.

생체내 투여에 사용되는 제형은 무균적이어야 한다. 이는 무균 여과막을 통해 여과함으로써 쉽게 달성된다.

서방형 제제를 제조할 수도 있다. 서방형 제제의 적합한 예에는 폴리펩티드 변형체를 포함하는 고상 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캅셀 형태이다. 서방형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT(등록상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주사용 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.

본 명세서에 개시된 바와 같이 정제된 폴리펩티드, 또는 이 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물은 각종 진단, 치료 또는 상기 폴리펩티드 및 조성물에 대해 알려진 다른 용도로 사용된다. 예를 들어, 포유류에게 상기 폴리펩티드를 치료 유효량 투여함으로써 포유류의 질환을 치료하는데 이 폴리펩티드를 사용할 수 있다.

하기 실시예는 설명을 위해 제공된 것이며 본 발명을 한정하려는 것은 아니다. 본 명세서에 인용된 모든 기재 사항은 본 명세서에 참고 문헌에 포함되어 있다.

<실시예 1>

전장의 인간 IgG rhuMAb HER2(SEQ ID NO:1의 경쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:2의 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 humAb4D5-8, 카터(Carter) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. 89:4285-4289 (1992)])를 CHO 세포에서 재조합적으로 생산하였다. 단백질 생산 및 세포 배양 배지로의 분비 후에, 접선 흐름 여과법(tangential flow filtration, PROSTACK(등록상표))에 의해 세포 배양 배지로부터 CHO 세포를 분리하였다. 그 후에, CHO 세포로부터 수획된 세포 배양액(Harvested Cell Culture Fluid, HCCF)을 평형화된 PROSEPA(등록상표) 컬럼(Bioprosessing, Ltd)에 직접 가함으로써 단백질 A 크로마토그래피를 수행하였다.

단백질 A 크로마토그래피 후에, 술포프로필 (SP)-SEPHAROSE FAST FLOW(등록상표)(SPSFF) 컬럼(파마시아사)을 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하고 원하는 항-HER2 항체 분자를 추가로 분리하였다. 크로마토그래피 조작은 결합 및 용출 방식으로 수행하였다.

로딩할 SPSFF 컬럼은 재생 완충액(0.025 M MES/1.0 M NaCl, pH 5.6)을 사용 하여 세척한 다음, 평형 완충액(0.025 M MES/50 mM NaCl, pH 5.6)으로 연속 세척하여 준비하였다. 그 후에, 컬럼에 pH 5.60±0.05 및 전도도 5.8±0.2 mmhos로 조정된 단백질 A 푸울을 로딩하였다. 용출에 앞서, 컬럼을 (1) 최소 1 배 컬럼 용적의 로딩 완충액(0.025 M MES/50 mM NaCl, pH 5.6)으로 세척하는 단계, (2) 280 nm 피크의 정점에 도달할 때까지 중간 완충액(0.025 M MES/70 mM NaCl, pH 5.6)으로 세척하는 단계, (3) 최소 1.2 배 컬럼 용적의 세정 완충액(0.025 M MES/50 mM NaCl, pH 5.6)으로 세척하는 단계의 3 단계로 세척하였다.. 280 nm 용출 프로필은 선단 높이를 갖는다(도 3). 이 높이의 변곡점에서, 푸울링은 시작되고 추가의 5 배 컬럼 용적 동안 계속된다. 그 후에, 재생 완충액(0.025 M MES/ 1.0 M NaCl, pH 5.6)을 사용하여 컬럼을 재생하였다.

<재료 및 방법>

컬럼 및 로딩 준비: 축소-규모의 SPSFF 컬럼을 충전하였다. 치수는 용적이 27.0 mL, 직경이 1.0 cm이고 층 높이가 34.5 cm이었다. 1.5 M Tris 염기를 사용하여 단백질 A 푸울의 분획을 pH를 2.6으로 적정하였다. 이 푸울의 전도도는 주사용 무균수(SWFI)를 동등한 용적으로 첨가하여 낮추었다.

크로마토그래피: 이 연구에 있어 크로마토그래피 처리는 파마시아사의 UNICORN(등록상표) FPLC 시스템으로 수행하였다. 평형, 로딩 및 초기 세척 단계는 200 cm/h의 선형 흐름 속도(linear flow rate)로 수행하였다. 모든 크로마토그래피 단계는 100 cm/h의 선형 흐름 속도로 수행하였다. 크로마토그래피 단계에서의 순서는 표 1에 정의되어 있다. SPSFF 수지 mL 당 로딩 밀도 15, 20, 25, 30, 35 및 40 mg의 rhuMAb HER2를 사용하여 총 6회의 크로마토그래피를 수행하였다.

크로마토그래피 단계¹
크로마토그래피 단계	완충액	대략적 종말점
평형: 부분 1	0.025 M MES/1.0 M NaCl, pH 5.6	2 CV²
평형: 부분 2	0.025 M MES/0.05 M NaCl, pH 5.6	pH 5.6±0.1 전도도: 5.8±0.2 mmhos
로딩	조정된 단백질 A 푸울	필요에 따라
세척 1	0.025 M MES/0.05 M NaCl, pH 5.6	1.5 CV
세척 2	0.025 M MES/0.07 M NaCl, pH 5.6	피크의 정점
세척 3	0.025 M MES/0.05 M NaCl, pH 5.6	2 CV
용출: 예비 푸울	0.025 M MES/0.095 M NaCl, pH 5.6	선단 높이의 변곡점(~1.2 CV)으로
용출: 푸울	0.025 M MES/0.095 M NaCl, pH 5.6	5 CV
재생	0.025 M MES/1.0 M NaCl, pH 5.6	2 CV
1. 수지의 평형은 수동식으로 수행되며, 나머지 단계는 파마시아사 Unicorn Program으로부터 수행됨.
2. CV는 컬럼 용적임.

총 단백질: 각 샘플에 대한 분광광도 스캐닝에 의해 각 크로마토그래피 분획(통과 흐름, 세척 단계, 용출 예비 푸울, 용출 푸울 및 재생 분획)의 단백질 농도를 결정하였다. 이 결과를 이용하여 단백질 회수 수율을 계산하였다. rhuMAb HER2에 대한 흡광 계수는 1.45이었다. 이 결과를 유도하는데 사용된 계산식은 하기와 같다.

단백질 농도(mg/mL) = (280 nm/1.45)×희석 계수(Dilution Factor)

각 분획의 단백질 질량(mg) = 단백질 농도(mg/mL)×분획 용적(mL)

수율(%) = (분획 질량(mg)/총 질량)×100

rhuMAb HER2 항체 변형체의 결정(CSx HPIEX): rhuMAb HER2 SPSFF 크로마토그래피 컬럼은 항체 변형체를 단리하였다. CSx HPIEX 크로마토그래피법에 의해 각 크로마토그래피 분획의 변형체 항체의 상대적인 양을 시험하였다. BAKERBOND WIDEPORE(등록상표) CSx HPIEX 컬럼(4.6×250 mm)을 55 ℃에서 1 mL/분으로 수행하였다. 이동상은 3차 구배로부터 형성되었다(표 2).

구배 구성
시간(분)	%A	%B	%C
0 - 초기 상태	49	1	50
10.0	40	10	50
50.0	33	17	50
50.0	49	1	50
70.0	49	1	50
컬럼은 55 ℃에서 1mL/분으로 수행됨

A 완충액은 0.025 M MES(pH 5.9)이고, B 완충액은 1 M 아세트산 암모늄(pH 7.0)이고, C 용액은 주사용 무균수이었다. 컬럼을 초기 구배 상태(49 % A, 1 % B 및 50 % C)로 평형화하고, SWFI로 희석되고 단백질을 300 ㎍미만으로 포함하는 샘플 200 ㎕를 주입하였다. 생성된 각 크로마토그램을 합하여 각 분획에 대한 각 피크 면적(%)을 결정하였다(표 3 및 도 5).

rhuMAb HER2에 대한 CSx HPIEX 분석
CSx 피크	rhuMAb HER2 변형체
a & b	경쇄: Asn→Asp³⁰ 탈아미노화 -및- 트립신 지도에 의해 확인되지 않은 다른 변형체
1	경쇄: Asn→Asp³⁰ 탈아미노화
3	완전히 프로세싱된 항체
4	중쇄: Asp→Iso-Asp¹⁰² -및(또는)- 중쇄: 추가의 Lys⁴⁵⁰
기타	중쇄: Asp→숙신이미드¹⁰² -및(또는)- 피크 1 및 4에 나타난 다중 치환

크로마토그램 비교: 각 크로마토그래피 파일의 흡광 데이타(AU 280 nm)는 Unicorn으로부터 ASCII 포맷으로 얻어진 것이다. 0.025 M MES/0.07 M NaCl(pH 5.6) 세척으로 얻어진 데이타를 엑셀(Excel) 포맷으로 번역하여 KALEIDAGRAPH(등록상표)로 카피하였다. KALEIDAGRAPH(등록상표)를 사용하여 세척 프로필을 겹쳐 놓고 서로 비교하였다(도 6).

<결과 및 토의>

재조합 DNA 기술에 의해 항체를 제조하는 경우, rhuMAb HER2의 탈아미노화 변형체 및 다른 산성 변형체가 생성되었다(예를 들어, 도 5의 CSx 피크 a, b 및 1 참조). 탈아미노화 변형체 및 다른 산성 변형체는 초기 단백질 A 크로마토그래피 단계로부터 얻어진 조성물의 약 25 %(CSx 크로마토그래피에 의해 얻어진 전체 곡선 또는 프로필에서 면적으로 계산함)를 구성하였다. 본 명세서에 기재된 이온 교환 방법을 이용하여 항-HER2 조성물 중 탈아미노화된 변형체 및 다른 산성 변형체의 양을 사실상 약 13 % 미만(즉, 본 명세서에 기재된 양이온 교환 크로마토그래피 처리된 제제 중 산성 변형체의 양은 약 50 %까지 또는 그 이상 감소함)으로 감소시킬 수 있었다.

상기 기재된 바와 같이 수행된 양이온 교환 컬럼으로부터의 흡광 기록은 도 3에 나타나 있다. 이 방법으로 탈아미노화되지 않은 항-HER2 항체와 약간만 다를뿐인 항-HER2 항체의 탈아미노화된 변형체가 단리된다. 초기 상태로부터 중간 세척 단계로 전도도를 증가시키자 탈아미노화된 항-HER 항체가 용출되었다. 그러나, 이 전도도로 계속 세척하면 탈아미노화되지 않은 항-HER2 항체도 용출되어 생성물의 손실을 초래하는 것으로 나타났다. 중간 완충액으로부터 용출 완충액으로 직접 처리하면 푸울링이 빨리 시작되는 경우 생성물로부터 탈아미노화된 항-HER2 항체가 허용되지 않을 정도로 조금 제거되거나 또는 탈아미노화된 항-HER2 항체가 감소될 때까지 푸울링이 지연되는 경우 항-HER2 항체 생성물이 허용되지 않을 정도로 조금 산출되었다. 초기에 사용된 낮은 전도도로 전환시킴으로써, 상당한 양의 항-HER2 항체 생성물이 용출되지 않으면서 탈아미노화된 항-HER2 항체의 용출이 계속되었다.

(a) 완충액 요건, (b) 푸울에서의 생성물 회수 및 (c) 푸울에서 생성물 질에 대한 rhuMAb HER2 로딩의 영향을 평가하였다.

15 mg/mL 내지 35 mg/mL의 로딩 밀도에서, 용출 푸울 중 생성물 수율은 대략 75 %이었다. 40 mg/mL의 로딩 밀도에서는, 푸울 중 생성물 수율은 65 % 까지 감소하였다(도 4). 이와 같은 푸울 중 회수의 감소는 주로 2회 세척 단계(70 mM NaCl 및 50 mM NaCl, 각각)에서의 항체의 증가 때문이다.

모든 용출 푸울에서의 rhuMAb HER2의 질은 중간 세척 단계를 통해 향상된다. 수지에 결합된 rhuMAb HER2의 질량이 증가함에 따라, 280 nm 피크 정점에 도달하는데 필요한 중간 완충액 용적 소모량은 감소하였다. 40 mg/mL 로딩 밀도에 필요한 완충액 용적은 대략 2.5 배 컬럼 용적이었다. 15 mg/mL 로딩 밀도에 필요한 완충액 용적은 대략 15 배 부피 용적이었다. 완충액 요구량의 증가는 이 두가지 극값 사이의 5 mg/mL 씩의 증가 변화와 정확히 일치하지는 않는다. 최대 증가는 20 mg/mL 및 15 mg/mL의 로딩 밀도 사이에서 관찰된다. 여기서, 완충액 요구량은 완충액 7.5 배 컬럼 용적으로부터 상기 언급된 15 배 컬럼 용적으로 배가된다. 그러나, 70 mM NaCl 세척 피크의 정점에 이르면, 생성물의 질은 조사된 임의 로딩 밀도에 대응하게 된다.

상기 연구로 SPSFF 수지상에 얼마나 많은 rhuMAb HER2를 로딩할 수 있는지 결정되었다. 수지 mL 당 항체 15 내지 40 mg 범위에서는, 용출 푸울에서 회수된 rhuMAb HER2의 질에서의 차이는 없었다. 그러나, 수지에 35 mg/mL를 초과하는 항체를 로딩하는 경우, 회수된 rhuMAb HER2의 양은 대략 10 % 까지 감소하였다. 일정한 수율을 얻기 위해서는, rhuMAb HER2의 제조시 최대 로딩 밀도를 35 mg/mL로 설정할 것을 추천한다. 또한, 70 mM NaCl의 세척 용적 요구량은 20 내지 15 mg/mL 사이에서 상당하기 때문에, rhuMAb HER2의 제조시 최소 로딩 밀도를 20 mg/mL으로 설정할 것을 추천한다.

본 발명은 목적 폴리펩티드를 초기 전도도 또는 pH에서 이온 교환 물질에 결합시킨 다음, 이온 교환 물질을 다른 전도도 또는 pH, 또는 이들 모두에서 중간 완충액으로 세척하는 이온 교환 크로마토그래피법을 제공한다. 중간 세척 후의 특정 시점에서 이온 교환 크로마토그래피 표준 수행 방법과 반대로, 이온 교환 물질을 세정 완충액으로 세척하는데, 여기서 중간 완충액으로부터 세정 완충액으로의 전도도, pH, 또는 이들 전도도와 pH 모두의 변화는 앞선 단계에서 달성되는 전도도, pH, 또는 전도도와 pH 모두의 변화에 대해 반대 방향이었다. 세정 완충액으로 세척한 후에는, 앞선 단계에서 사용된 완충액의 전도도, pH, 또는 전도도와 pH 모두 와 전도도, pH, 또는 전도도와 pH 모두가 다른 용출 완충액을 사용하여 이온 교환 물질을 처리함으로써 목적 폴리펩티드 분자를 용출시키면 된다.

Claims

(a) 제1 전도도 및 pH의 로딩 완충액을 사용하여 폴리펩티드를 이온 교환 물질에 결합시키는 단계,

(b) 이온 교환 물질로부터 오염 물질을 용출하기 위해 제2 전도도 또는 pH, 또는 모두의 중간 완충액으로 이온 교환 물질을 세척하는 단계,

(c) 중간 완충액으로부터 세정 완충액으로의 전도도 또는 pH, 또는 모두의 변화가 로딩 완충액으로부터 중간 완충액으로의 전도도 또는 pH, 또는 모두의 변화와 반대 방향인, 제3 전도도 또는 pH, 또는 모두의 세정 완충액으로 이온 교환 물질을 세척하는 단계, 및

(d) 이온 교환 물질로부터 폴리펩티드를 용출하기 위해 제4 전도도 또는 pH, 또는 모두의 용출 완충액으로 이온 교환 물질을 세척하는 단계를 연속으로 수행하는 것을 포함하는, 폴리펩티드 및 오염 물질을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하는 방법.
제1항에 있어서, 이온 교환 물질이 양이온 교환 수지를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 이온 교환 물질이 음이온 교환 수지를 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 중간 완충액의 전도도 또는 pH, 또는 모두가 로딩 완충액의 전도도 또는 pH, 또는 모두보다 높고, 세정 완충액의 전도도 또는 pH, 또는 모두가 중간 완충액의 전도도 또는 pH, 또는 모두보다 낮은 것인 방법.
제1항에 있어서, 세정 완충액의 전도도 또는 pH, 또는 모두가 로딩 완충액의 전도도 또는 pH, 또는 모두와 동일한 것인 방법.
제2항에 있어서, 용출 완충액의 전도도 또는 pH, 또는 모두가 중간 완충액의 전도도 또는 pH, 또는 모두보다 높은 것인 방법.
제1항에 있어서, 중간 완충액 및 용출 완충액의 전도도를 각각 변화시킴으로써 오염 물질 및 폴리펩티드를 용출시키는 방법.
제7항에 있어서, 각 단계 (a) 내지 (d)의 pH가 일정한 것인 방법.
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제1항에 있어서, 오염 물질이 폴리펩티드의 탈아미노화된 변형체인 방법.
제7항에 있어서, 중간 완충액 및 용출 완충액의 전도도가 그의 염 농도를 변화시킴으로써 변경되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 중간 완충액 및 용출 완충액의 전도도가 그의 NaCl 농도를 변화시킴으로써 변경되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (d) 이후에 이온 교환 물질을 재생 완충액으로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 양이온 교환 수지가 아가로스 상에 고정된 술포프로필을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 폴리펩티드가 항체인 방법.
제15항에 있어서, 항체가 HER2와 결합하는 것인 방법.
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제1항에 있어서, 균일한 폴리펩티드 시료를 수득하기 위해 이온 교환 크로마토그래피법 이전에, 그 동안 또는 이후에 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 1회 이상의 추가의 정제 단계로 처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제18항에 있어서, 정제된 폴리펩티드를 이종 분자에 연결하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제19항에 있어서, 이종 분자가 폴리에틸렌 글리콜, 표지 물질 또는 세포상해성 물질인 방법.
제18항에 있어서, 균일한 폴리펩티드 시료를 제약상 허용되는 담체와 배합함으로써 제약 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
삭제
(a) 제1 전도도 및 pH의 로딩 완충액을 사용하여 폴리펩티드를 양이온 교환 물질에 결합시키는 단계,

(b) 양이온 교환 물질로부터 오염 물질을 용출시키기 위해 로딩 완충액의 전도도 또는 pH, 또는 모두보다 높은 제2 전도도 또는 pH, 또는 모두의 중간 완충액으로 양이온 교환 물질을 세척하는 단계,

(c) 중간 완충액의 전도도 또는 pH, 또는 모두보다 낮은 제3 전도도 또는 pH, 또는 모두의 세정 완충액으로 양이온 교환 물질을 세척하는 단계, 및

(d) 양이온 교환 물질로부터 폴리펩티드를 용출하기 위해 중간 완충액의 전도도 또는 pH, 또는 모두보다 높은 제4 전도도 또는 pH, 또는 모두의 용출 완충액으로 양이온 교환 물질을 세척하는 단계를 연속으로 수행하는 것을 포함하는, 폴리펩티드 및 오염 물질을 포함하는 조성물로부터 폴리펩티드를 정제하는 방법.
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