ES2261589T3 - Composicion de anticuerpos anti-her2. - Google Patents

Abstract

Composición que comprende una mezcla de anticuerpo anti-HER2 y una o más variantes acídicas del mismo, en el que la cantidad de variante(s) acídica(s) es menor del 25% aproximadamente, y en el que la(s) variante(s) acídica(s) son predominantemente variantes desamidadas en las que uno u más residuos de asparagina del anticuerpo anti-HER2 se han desamidado, y en el que el anticuerpo anti-HER2 es humMAb4D5- 8, y en el que las variantes desamidadas tienen Asn30 en CDR1 de una o las dos regiones VL de humMAb4D5-8 convertido en aspartato.

Description

Composición de anticuerpos anti-HER2.

La presente invención se refiere, de manera general, a la purificación de proteínas.

Antecedentes del estado de la técnica

La purificación a gran escala económica de proteínas se está convirtiendo en un problema importante en la industria biotecnológica. En general, las proteínas son producidas en cultivos celulares, utilizando líneas celulares de mamíferos o bacterias manipuladas genéticamente para producir la proteína de interés, mediante la inserción de un plásmido recombinante que contiene el gen para esa proteína. Puesto que las líneas celulares utilizadas son organismos vivos, estos deben ser alimentados con un medio de crecimiento complejo que contenga azúcares, aminoácidos y factores de crecimiento, frecuentemente procedente de preparaciones de suero animal. Es un gran reto la separación de la proteína deseada de la mezcla de compuestos de alimento para las células y de los subproductos de las células con una pureza suficiente para ser utilizada como terapéutico humano.

Los procedimientos de purificación de proteínas procedentes de debris celulares dependen inicialmente del lugar de expresión de la proteína. Se pueden estimular algunas proteínas para que se secreten, de manera directa, de la célula al medio de crecimiento que la rodea; otras están producidas de manera intracelular. Para estas últimas proteínas, la primera etapa de un procedimiento de purificación implica la lisis de la célula, lo cual se puede realizar mediante una serie de procedimientos, incluyendo la agitación mecánica, el choque osmótico o tratamientos enzimáticos. Dicho rompimiento libera los contenidos enteros de la célula en el homogenado y, además, produce fragmentos subcelulares que son difíciles de extraer debido a su pequeño tamaño. Estos se eliminan, generalmente, mediante centrifugación diferencial o filtración. El mismo problema se plantea, aunque a menor escala, con las proteínas que se secretan directamente, debido a la muerte natural de las células y a la liberación de las proteínas intracelulares de la célula hospedadora en el curso de la producción de la proteína.

Una vez se ha obtenido una solución clarificada que contenga la proteína de interés, se consigue su separación de las otras proteínas producidas por la célula utilizando, en general, una combinación de diferentes técnicas cromatográficas. Estas técnicas separan mezclas de proteínas basándose en su carga, grado de hidrofobicidad o tamaño. Son asequibles varias resinas de cromatografía diferentes para cada una de estas técnicas, permitiendo una adaptación precisa del esquema de purificación para una determinada proteína implicada. La esencia de cada uno de estos procedimientos de separación es que se puede provocar que las proteínas eluyan a diferentes velocidades a lo largo de la columna, consiguiendo una separación física que aumenta a medida que pasan por la columna, o una adhesión, de manera selectiva, al medio de separación, siendo, a continuación, eluída, de manera diferencial, mediante diferentes disolventes. En algunos casos, se separa la proteína deseada de las impurezas cuando las impurezas se adhieren de manera específica a la columna y la proteína de interés no, esto es, la proteína de interés está presente en el "flujo continuo".

La cromatografía de intercambio iónico es una técnica cromatográfica que se utiliza frecuentemente para la purificación de proteínas. En la cromatografía de intercambio iónico, los parches cargados en la superficie del soluto son atraídos por cargas contrarias de la matriz de cromatografía, con la condición de que la fuerza iónica del tampón circundante sea bajo. La elución se consigue, en general, incrementando la fuerza iónica del tampón (p.e. conductividad) para que compita con el soluto por los sitios cargados en la matriz de intercambio iónico. Otra manera de conseguir la elución del soluto es cambiando el pH y, por consiguiente, alterando la carga del soluto. El cambio en la conductividad o pH puede ser gradual (elución por gradiente) o escalonada (elución por etapas). En el pasado, estos cambios habían sido progresivos; es decir, el pH o la conductividad aumentaba o disminuía en una única direc-
ción.

El documento WO 92/22653 (Genentech) describe métodos para hacer anticuerpos humanizados, que incluyen anticuerpos anti-HER2.

El documento WO 96/33208 (Genentech) describe métodos de purificación de anticuerpos (por ejemplo a partir de contaminantes vinculados incorrectamente con disulfato) mediante cromatografía de interacción hidrofóbica de
bajo pH.

Tsai et al. (1993) Pharmaceutical Research Vol 10, 11: 1580-1586 se refiere a la heterogeneidad isoeléctrica de un anticuerpo monoclonal CD18 anti-humano ("h1B4"). La heterogeneidad de carga se especuló como que surge a partir de una desamidación secuencial de la cadena pesada de immunoglobulina.

Adachi et al. (1997) J Chromatography A 763, 1-2: 57-63 se refiere a fases estacionarias de sulfopropil en HPLC de intercambio de iones. El documento discute el uso de estas fases para separar especies variantes de citocromo C, y la hormona de crecimiento humano a partir de sus isoformas desamidadas.

Moorhouse et al. (1997) J Pharmaceutical and Biomedical Analysis 16: 593-603 describe el uso de HPLC para el análisis de una heterogeneidad de carga de un anticuerpo monoclonal CD20 anti-humano ("IDEC-C2B8"). El documento describe variantes que surgen a partir de la ciclización de la glutamina a piroglutamato en término amino de las cadenas ligera y pesada y que surge a partir del procesamiento de residuos de lisina con terminales carboxi de las cadenas pesadas.

Descripción de la invención

Aquí se describe un procedimiento cromatográfico de intercambio iónico en donde un polipéptido de interés se une al material de intercambio iónico a una conductividad o pH inicial y, a continuación, se lava el material de intercambio iónico con un tampón intermedio a una conductividad o pH diferente, o ambas. En un momento determinado, después del lavado intermedio, y contrariamente a la práctica estándar en cromatografía de intercambio iónico, el material de intercambio iónico se lava con un tampón de lavado donde el cambio de conductividad o pH, o ambas, del tampón intermedio al tampón de lavado es en una dirección opuesta al cambio de conductividad o pH, o ambas, conseguido con las etapas anteriores. Solo después del lavado con el tampón de lavado el material de intercambio iónico está preparado para que la molécula polipeptídica de interés eluya mediante la aplicación del tampón de elución que tiene una conductividad o pH, o ambas, que difiere de la conductividad o pH, o ambas, de los tampones utilizados en las etapas anteriores.

Esta nueva aproximación a la cromatografía de intercambio iónico es particularmente útil en situaciones en las que una molécula de producto debe ser separada de una molécula contaminante relacionada muy cercana a escala completa de fabricación, donde se desea tanto pureza como una elevada recuperación del producto.

De acuerdo con esto, la invención proporciona una composición que comprende una mezcla de anticuerpo anti-HER2 tal como se define en la reivindicación 1. Esto se puede proporcionar mediante un procedimiento para purificar un polipéptido que es un anticuerpo anti-HER2 a partir de una composición que comprende el polipéptido y un contaminante, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas llevadas a cabo de manera secuencial:

a) unión del polipéptido a un material de intercambio iónico utilizando un tampón de carga, en donde el tampón de carga está a una primera conductividad y pH;

b) lavado del material de intercambio iónico con un tampón intermedio a una segunda conductividad y/o pH para que eluya el contaminante del material de intercambio iónico;

c) lavado del material de intercambio iónico con un tampón de lavado que está a una tercera conductividad y/o pH, en donde el cambio de conductividad y/o pH del tampón intermedio al tampón de lavado está en dirección opuesta al cambio en la conductividad y/o pH del tampón de carga al tampón intermedio;

d) lavado del material de intercambio iónico con un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o pH para que eluya el polipéptido del material de intercambio iónico. La primera conductividad y/o pH puede(n) ser igual(es) a la tercera conductividad y/o pH.

Cuando el material de intercambio iónico comprende una resina de intercambio catiónico, la conductividad y/o pH del tampón intermedio es/son preferiblemente mayor(es) que la conductividad y/o pH del tampón de carga; la conductividad y/o pH del tampón de lavado es/son preferiblemente menor(es) que la conductividad y/o pH del tampón intermedio; y la conductividad y/o pH del tampón de elución es/son preferiblemente mayor(es) que la conductividad y/o pH del tampón intermedio. Preferiblemente, la conductividad y/o pH del tampón de lavado es/son aproximadamente igual(es) a la conductividad y/o pH del tampón de carga.

Preferiblemente, la elución del contaminante y del polipéptido se consigue mediante modificación de la conductividad del tampón intermedio y del tampón de elución, respectivamente, mientras se mantiene el pH de estos tampones aproximadamente iguales.

También se describe aquí un procedimiento para la purificación de un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y un contaminante, comprendiendo dicho procedimiento las siguientes etapas llevadas a cabo de manera secuencial:

a) unión del polipéptido a un material de intercambio catiónico utilizando un tampón de carga, en donde el tampón de carga está a una primera conductividad y pH;

b) lavado del material de intercambio catiónico con un tampón intermedio a una segunda conductividad y/o pH que es mayor que la(s) del tampón de carga para que eluya el contaminante del material de intercambio iónico;

c) lavado del material de intercambio catiónico con un tampón de lavado que está a una tercera conductividad y/o pH que es(son) menor(es) que la(s) del tampón intermedio;

d) lavado del material de intercambio catiónico con un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o pH que es mayor que la(s) del tampón intermedio para que eluya el polipéptido del material de intercambio iónico.

Además, se describe aquí un procedimiento para la purificación de un anticuerpo de una composición que comprende el anticuerpo y un contaminante, comprendiendo dicho procedimiento cargar la composición en una resina de intercambio catiónico, en donde la cantidad de anticuerpo cargado en la resina de intercambio iónico está entre aproximadamente 20 mg y 35 mg de anticuerpo por mL de resina de intercambio catiónico y, opcionalmente, comprende, además, eluir el anticuerpo de la resina de intercambio catiónico. Preferiblemente, el procedimiento comprende, además, una etapa de lavado intermedia para eluir uno o más contaminantes de la resina de intercambio iónico. Esta etapa de lavado intermedia normalmente precede la etapa de elución del anticuerpo.

En las composiciones de la invención tal como se definen en la reivindicación 1, la cantidad de la(s) variante(s) acídica(s) en la composición es inferior a aproximadamente un 25% y, preferiblemente, inferior a aproximadamente un 20%, p.e. en el rango de entre aproximadamente un 1% a un 18%. Opcionalmente, la composición comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama de flujo que muestra cómo se puede llevar a cabo una cromatografía de intercambio catiónico alterando la conductividad (p.e. a las concentraciones de NaCl del Ejemplo 1 de más abajo) o alterando el pH (p.e. a los valores de pH que se muestran en el diagrama de flujo).

La Figura 2 es un diagrama de flujo que muestra cómo se puede llevar a cabo una cromatografía de intercambio aniónico alterando la conductividad (p.e. a las concentraciones de NaCl que se describen en la figura) o alterando el pH (p.e. a los valores de pH que se muestran).

La Figura 3 es una señal de absorbancia de una cromatografía de intercambio catiónico del Ejemplo 1 a escala de fabricación completa. Están marcados con flechas los puntos en los que se lava la columna con los diferentes tampones descritos en el presente documento.

La Figura 4 describe un anticuerpo monoclonal recombinante humanizado anti-HER2 (rhuMAbHER2) recuperado en cada fracción de la cromatografía (calculada como el porcentaje del total de la suma de todas las fracciones de la cromatografía pertinente). Las fracciones de flujo continuo, etapas de lavado y previas a la recolección "prepool" son todas las muestras eluyentes recogidas desde el comienzo de la carga al inicio de la recolección (en inglés "pooling"). La fracción de recolección "pool" es la muestra de eluyente con un volumen de cinco el de la columna en el inicio de la elución en el punto de inflexión del saliente. La fracción de regeneración contiene el efluyente capturado desde el final del "pooling" hasta el final de la regeneración.

La Figura 5 muestra la cualidad de rhuMAbHER2 en cada muestra pool de la cromatografía de intercambio catiónico cuando se evalúa por Cromatografía líquida de alta presión de intercambio catiónico carboxi sulfona (CSx HPIEX). Los picos a, b y 1 son formas desamidadas de rhuMAb HER2. El pico 3 es rhuMAb HER2 no desamidada. El pico 4 es una combinación del C-terminal que contiene lisina y las variantes iso-aspartato de rhuMAb HER2.

La Figura 6 muestra los perfiles de absorbancia (280 nm) de 0,025 M MES/0,070 M NaCl, pH 5,6 lavada para cada cromatografía. La masa de rhuMAb HER2 aplicada a la resina de intercambio catiónico afecta al nivel de absorbancia del pico al ápice así como la cantidad de tampón requerida hasta alcanzar el ápice. Debido a los pocos picos que aparecen (como mejor se ve en la carga de 30 mg/mL) en este lavado, el ápice se define como los niveles de absorbancia de por lo menos 0,5 unidades de absorbancia (AU).

La Figura 7A y 7B muestran las secuencias aminoacídicas de la cadena ligera humMAb4D5-8 (SEC. ID Nº: 1) y de la cadena pesada humMAb4D5-8 (SEC ID. Nº:2), respectivamente.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas Definiciones

La "composición" a ser purificada, en el presente documento, comprende el polipéptido de interés y uno o más contaminantes. La composición puede estar "parcialmente purificada" (es decir, que haya sido sometida a una o más etapas de purificación, tales como la cromatografía de la proteína A en el Ejemplo 1 de más abajo) o se puede obtener directamente de una célula u organismo hospedador que produzca el polipéptido (p.e. la composición puede comprender un fluido recogido de un cultivo celular).

Tal y como se utiliza en el presente documento, "polipéptido" se refiere a un anticuerpo anti-HER2. Preferiblemente, es un anticuerpo de longitud completa que se une al HER2 humano.

Un "contaminante" es un material que difiere del producto polipeptídico deseado. El contaminante puede ser una variante del polipéptido deseado (p.e. una variante desamidada o una variante amino-aspartato del polipéptido deseado) u otro polipéptido, ácido nucleico, endotoxina, etc.

Una "variante" o "variante de secuencia aminoacídica" de un polipéptido de partida es un polipéptido que comprende una secuencia aminoacídica diferente de la del polipéptido de partida. En general, la variante poseerá por lo menos un 80% de identidad de secuencia, preferiblemente por lo menos un 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente por lo menos un 95% de identidad de secuencia y, más preferiblemente por lo menos un 98% de identidad de secuencia con el polipéptido nativo. El porcentaje de identidad de secuencia se determina, por ejemplo, mediante Fitch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1382-1386 (1983), versión del algoritmo descrito por Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970), después del alineamiento de las secuencias para dar la máxima homología. Las variantes de secuencia aminoacídica de un polipéptido se pueden preparar introduciendo los cambios de nucleótidos apropiados en el DNA codificante del polipéptido o por síntesis peptídica. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos en la secuencia aminoacídica del polipéptido de interés. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se realiza para llegar a la construcción final, con tal de que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios aminoacídicos también pueden alterar los procesos post-traduccionales del polipéptido, tal como cambiar el número o posición de sitios de glicosilación. Procedimientos para generar variantes de secuencias aminoacídicas de polipéptidos, se describen en la patente US Nº 5.534.615, que se incluye aquí por referencia, por ejemplo.

Una "variante acídica" es una variante de un polipéptido de interés que es más acídico (p.e. cuando se determina mediante cromatografía de intercambio catiónico) que el polipéptido de interés. Un ejemplo de variante acídica es una variante desamidada.

Una variante "desamidada" de una molécula polipeptídica es un polipéptido en donde uno o más residuo(s) de asparagina del polipéptido original seb ha(n) convertido en aspartato, es decir, la cadena lateral amida neutra se ha convertido en un residuo con un carácter completamente acídico. El anticuerpo humMAb4D5 desamidado del Ejemplo de más abajo tiene Asn30 en CDR1, en cualquiera o ambas regiones V_{L} de la misma, convertida en aspartato. El término "DNasa humana desamidada" tal y como se utiliza en el presente documento significa Dnasa humana que está desamidada en el residuo de asparagina que se encuentra en la posición 74 de la secuencia aminoacídica de la DNasa humana nativa madura (patente US 5.279.823; incorporada expresamente aquí por referencia).

El término "mezcla" tal y como se utiliza en el presente documento, en referencia a una composición que comprende un anticuerpo anti-HER2, significa la presencia de tanto el anticuerpo anti-HER2 deseado como de una o más variantes acídicas del mismo. Las variantes acídicas pueden comprender predominantemente un anticuerpo anti-HER2 desamidado, con cantidades mínimas de otra(s) variante(s) acídica(s). Se ha encontrado, por ejemplo, que en las preparaciones de anticuerpo anti-HER2, obtenidas de la expresión recombinante, se desamidada tanto como aproximadamente un 25% del anticuerpo anti-HER2.

En realizaciones preferidas de la invención, el polipéptido es un polipéptido recombinante. Un "polipéptido recombinante" es uno que ha sido producido en una célula hospedadora que ha sido transformada o transfectada con el ácido nucleico codificante del polipéptido, o produce el polipéptido como resultado de la recombinación homóloga. "Transformación" y "transfección" se utilizan de manera intercambiable para referirse al procedimiento de introducción del ácido nucleico en una célula. Después de la transformación o transfección, el ácido nucleico puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora o puede existir como un elemento extracromosomal. La "célula hospedadora" incluye una célula en un cultivo celular in vitro así como una célula en un animal hospedador. En la patente US 5.534.615, incorporada expresamente aquí por referencia, se describen, por ejemplo, procedimientos para la producción recombinante de polipéptidos.

El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo los anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (p.e. anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos tan largos como para que exhiban la actividad biológica deseada.

El anticuerpo aquí descrito se dirige contra un "antígeno" de interés. Preferiblemente, el antígeno es un polipéptido biológicamente importante y la administración del anticuerpo a un mamífero que sufra de una enfermedad o alteración puede resultar en un beneficio terapéutico al mamífero. Sin embargo, también se contemplan los anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipeptídicos (tales como antígenos glicolípidos asociados a tumor; véase patente US 5.091.178). Cuando el anticuerpo es un polipéptido, este puede ser una molécula transmembrana (p.e. un receptor) o un ligando tal como un factor de crecimiento. Antígenos ejemplificantes incluyen los polipéptidos discutidos más arriba. Objetivos moleculares preferidos para los anticuerpos comprendidos en la presente invención incluyen los polipéptidos CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 y CD34; miembros de la familia de receptores de HER tales como el receptor de EGF, HER2, HER3 o HER4; moléculas de adhesión celular tales como LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM y la integrina av/b3, incluyendo las subunidades a o b del mismo (p.e. anticuerpos anti-CD 11a, anti-CD 18 o anti-CD 11b); factores de crecimiento tal como VEGF; IgE; antígenos de grupos sanguíneos; receptor flk2/flt3; receptor de la obesidad (OB); receptor mpl; CTLA-4; polipéptido C, etc. Se pueden utilizar antígenos o fragmentos de los mismos solubles como inmunógenos, opcionalmente conjugados a otras moléculas para generar anticuerpos. Para las moléculas transmembrana, dichos receptores, fragmentos de estos (p.e. el dominio extracelular de un receptor). Alternativamente, las células que expresan la molécula transmembrana se pueden utilizar como inmunógeno. Dichas células pueden derivar de una fuente natural (p.e. líneas celulares cancerígenas) o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas recombinantes para expresar la molécula transmembrana.

El término "anticuerpo monoclonal" tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto en las mutaciones que se pueden dar de manera natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, por ser obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y que no es para ser construido cuando se requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento determinado. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser utilizados de acuerdo con la presente invención se pueden preparar mediante el primer procedimiento de hibridoma descrito primero por Kohler et al., Nature 256:495(1975), o se pueden preparar mediante procedimientos de DNA recombinantes (véase, p.e. patente US 4.816.567). En otra realización, se pueden aislar los "anticuerpos monoclonales" de librerías de fagos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Claxon et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el asilamiento de anticuerpos de murina y humanos, respectivamente, utilizando librerías de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de elevada afinidad (rango de nM) mediante "chain shuffling" (Marks et al., Biol. Technology, 10:779-783 (1992)), así como la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para la construcción de librerías de fagos muy amplias (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. De manera alternativa, ahora es posible producir animales transgénicos (p.e. ratones) que son capaces, en la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigoto del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (J_{H}) en ratones quiméricos y mutantes en la línea germinal resulta en una inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia del gen de la inmunoglobulina de la línea germinal humana se basa en que dichos ratones mutantes en la línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos en el reto del antígeno. Véase, p.e., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y Duchosal et al., Nature 355: 258 (1992).

Los anticuerpos monoclonales aquí especificados incluyen, de manera específica, anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una región de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos procedentes de un especie determinada o perteneciente a una clase o subclase de anticuerpos determinados, mientras que la(s) cadena(s) restante(s) es(son) idéntica(s) a, o homóloga(s) a, las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, de manera que exhiban la actividad biológica deseada (patente US 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

El término "región hipervariable" cuando se utiliza en el presente documento, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (p.e. residuos 24-34 (L1), 50.56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 5th Edition Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (p.e. residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los residuos de sostén (en inglés "framework") o "FR" son aquellos residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable, tal y como se han definido en el presente documento. Los residuos CDR y FR del anticuerpo rhuMAb HER2 del ejemplo de más abajo (humAb4D5-8) se identifican en Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)).

Formas "no humanizadas" de anticuerpos no humanos (p.e. murina) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima procedente de una inmunoglobulina no humana. En la mayoría de casos, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpos receptores) en los que los residuos de las regiones hipervariables del receptor se han sustituido por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata, conejo o un primate no humano que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de sostén (FR) de la región (F_{V}) de inmunoglobulina humana se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar más la función del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de por lo menos uno, y generalmente dos, dominios variables, en los que todos o prácticamente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá, opcionalmente, por lo menos una parte de una región constante de la inmunoglobulina (Fc), en general de una inmunoglobulina
humana.

La elección de dominios variables humanos, tanto de cadena ligera como pesada, para ser utilizados en la preparación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el denominado procedimiento de "best-fit", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba en la librería completa de secuencias de dominios variables humanas conocidas. La secuencia humana que está más cercana a la del roedor es, a continuación, aceptada como la sostén humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)).

Otro procedimiento utiliza un framework determinado procedente de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un determinado subgrupo de cadenas ligeras o pesadas. El mismo framework se puede utilizar para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

Es además importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de una elevada afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para conseguir este objetivo, de acuerdo con un procedimiento preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un procedimiento de análisis de secuencias parenterales y varios productos humanizados conceptuales, utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parenterales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales son comúnmente asequibles y familiares para aquellos expertos en la materia. Los programas de ordenador son asequibles, ilustran y exhiben estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspección de estas exhibiciones permiten el análisis del papel similar de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata a unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR se pueden seleccionar y combinar del receptor e importar las secuencias de tal manera que se consiga la característica deseada del anticuerpo, tal como un incremento de la afinidad para
el(los) antígeno(s) objetivo. En general, los residuos CDR están implicados de manera directa y muy sustancialmente en influenciar la unión a antígeno.

Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una parte de un anticuerpo de longitud completa, generalmente la región de unión a antígeno o variable, del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')_{2} y F_{v}; homodímeros bivalentes (en inglés "diabodies"); anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados por fragmentos de anticuerpos. Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos proceden de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (véase p.e. Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos se pueden producir ahora, de manera directa, mediante células hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de las librerías de fagos de anticuerpos discutidas más arriba. De manera alternativa, los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar, directamente, de E. coli y unirse, químicamente, para formar fragmentos F(ab')_{2} (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra realización, el F(ab')_{2} se forma utilizando la cremallera de leucinas GCN4 para promover el ensamblaje de la molécula F(ab')_{2}. De acuerdo con otra aproximación, se pueden aislar directamente los fragmentos de F(ab')_{2} del cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para los practicantes expertos.

En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento F_{v} de cadena sencilla (scFv). Véase WO 93/16185. El "Fv de cadena sencilla" o los "fragmentos de anticuerpos" "scFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica sencilla. En general, el polipéptido F_{v} comprende, además, un engarce polipeptídico entre los dominios V_{H} y V_{L} que permite que sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pág. 269-315 (1994).

El término "homodímeros bivalentes" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo estos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica (V_{H}-V_{L}). Utilizando un engarce que sea demasiado corto para dejar que se emparejen los dos dominios en la misma cadena, se fuerzan los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno. Los homodímeros bivalentes se describen, con más detalle en, por ejemplo, EP 404.097, WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993).

La expresión "anticuerpos lineales" cuando se utiliza en esta solicitud, se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Polypeptide Eng. 8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos tándem Fd (V_{H}-C_{H}1-V_{H}-C_{H}1) que forman un par de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

Los "anticuerpos multiespecíficos" tienen especificidades de unión para, por lo menos, dos epítopos diferentes, en donde los epítopos son, normalmente, de antígenos diferentes. Mientras que tales moléculas normalmente se unirán solo a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos, BsAbs), anticuerpos con especificidades adicionales tales como los anticuerpos triespecíficos, se engloban dentro de la expresión cuando es utilizada en el presente documento. Ejemplos de BsAbs incluyen aquellos con un brazo dirigido contra un antígeno de célula tumoral y el otro brazo dirigido contra una molécula citotóxica inductora tal como anti-Fc\gammaRI/anti-CD15, anti-p185^{HER2}/Fc\gammaRIII (CD16), anti-CD3/anti-célula B maligna (1D10), anti-CD3/anti-p185^{HER2}, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti-célula renal de carcinoma, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D1 (anti-carcinoma de colon); anti-CD3/ análogo de la hormona anti-melanocitoestimuladora, receptor anti-EGF/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMA1, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV 18, anti-molécula de adhesión de una célula neuronal (NCAM)/anti-CD3; proteína de unión anti-folato (FBP)/anti-CD3; antígeno asociado a carcinoma anti-pan (AMOC-31)/ANTI-CD3, BsAbs con un brazo que se une específicamente a un antígeno tumoral y un brazo que se une a una toxina tal como anti-saporina/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/cadena A de anti-ricina, anti-interferón \alpha (IFN-\alpha)/idiotipo anti-hibridoma, anti-CEA/alcaloide anti-vinca; BsAbs para la conversión de profármacos activados por enzima tales como anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina, (que cataliza la conversión del fármaco fosfato de mitomicina en el alcohol mitomicina); BsAbs que se pueden utilizar como agentes fibrinolíticos tales como anti-fibrina/anti-activador tisular de plasminógeno (tPA), anti-fibrina/anti-activador de plasminógeno del tipo uroquinasa (uPA); BsAbs para la designación de complejos inmunes a receptores de superficie celular tales como anti-lipoproteínas de baja densidad (LDL)/anti-receptor Fc (p.e. Fc\gammaRI o Fc\gammaIII); BsAbs para utilizar en la terapia de enfermedades infecciosas tales como anti-CD3/anti-virus del herpes simple (HSV), anti-receptor de célula T; complejo CD3/anti-gripe, anti-Fc\gammaR/anti-HIV; BsAbs para la detección de tumores in vitro o in vivo tales como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-p185^{HER2}/anti-hapteno; BsAbs como adyuvantes de vacunas; y BsAbs como herramientas de diagnóstico, tales como anti-IgG de conejo/anti-ferritina, anti-peroxidasa de rábano (HRP)/anti-hormona, anti-somatostatina/anti-sustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-\beta-galactosidasa. Ejemplos de anticuerpos triespecíficos incluyen anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Los anticuerpos biespecíficosse pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (p.e. anticuerpos biespecíficos F(ab')2).

En el estado de la técnica se conocen procedimientos para la preparación de anticuerpos biespecíficos. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulinas, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas de inmunoglobulinas pesadas y ligeras, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se realiza frecuentemente por etapas de cromatografía de afinidad, es bastante engorrosa y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)).

De acuerdo con una aproximación diferente, los dominios variables de los anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con las secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. Preferiblemente, la fusión tiene lugar con un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, comprendiendo, por lo menos, parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferido tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1) conteniendo el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. Los DNAs codificantes de las fusiones de cadenas pesadas de inmunoglobulinas y, si se desea, de cadenas ligeras de inmunoglobulinas se insertan en vectores de expresión separados y son co-transfectados en un organismo hospedador adecuado. Esto da lugar a una gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en realizaciones donde las proporciones no igualadas de las tres cadenas polipeptídicas utilizadas en la construcción, proporciona los rendimientos óptimos. Es posible, sin embargo, insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas polipeptídicas en relaciones iguales resulta en unos rendimientos mayores o cuando las relaciones no son especialmente significativas.

En una realización preferida de esta aproximación, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena ligera-cadena ligera de una inmunoglobulina híbrida (proporcionando una segunda especificidad) en el otro brazo. Se encontró que la estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulinas no deseadas, así como la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera sencilla de separación. Esta aproximación se describe en WO94/04690. Para más detalles de la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo con otra aproximación descrita en WO96/27011, se puede manipular genéticamente la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende por lo menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de un anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas de tamaño mayor (p.e. tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena(s) lateral(es) grande(s) en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo mediante sustitución de cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (p.e. alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero respecto otros productos finales no deseados tales como homodímeros.

Anticuerpos biespecíficos incluyen los anticuerpos reticulados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Dichos anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para designar células del sistema inmune hacia células no deseadas (patente US Nº 4.676.980) y para el tratamiento de la infección por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar utilizando cualquiera de los procedimientos de reticulación adecuados. Son bien conocidos en el estado de la técnica agentes de reticulación adecuados y se describen en la patente US Nº 4.676.980 junto con una serie de técnicas de reticulación.

También se han descrito en la literatura técnicas para la generación de anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar los anticuerpos biespecíficos utilizando engarces químicos. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se cortan proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complejante ditiol arsenito sódico para estabilizar los ditioles vicinales y prevenir la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten, a continuación, en derivados del tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte, a continuación, en el Fab'-tiol mediante reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Un progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH procedentes de E. coli, los cuales se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo F(ab')_{2} biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab' se secreta separadamente de E. coli y se somete al acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar directamente fragmentos de anticuerpos biespecíficos de un cultivo celular recombinante. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de la cremallera de leucina procedentes de proteínas Fos y Jun se unen a regiones de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos se reducen a la región bisagra para formar monómeros y, a continuación, se vuelven a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este procedimiento se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología del homodímero bivalente descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para la preparación de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (V_{L}) mediante un engarce que es demasiado corto para dejar que se emparejen los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con esto, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento se fuerzan para que se emparejen con los dominios complementarios V_{L} y V_{H} del otro fragmento, formando, de este modo, dos sitios de unión a antígeno. También ha sido publicada otra estrategia para la preparación de fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros de cadena sencilla Fv (sFV). Véase Gruber et al., J. Immnuol., 152:5368 (1994).

Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

La frase "material de intercambio iónico" se refiere a una fase sólida que está cargada negativamente (es decir, resina de intercambio catiónico) o cargada positivamente (es decir, una resina de intercambio aniónico). La carga se puede proporcionar mediante la unión de uno o más ligandos cargados a la fase sólida, p.e., mediante unión covalente. De manera alternativa, o además, la carga puede ser una propiedad inherente de la fase sólida (p.e. es el caso de la sílice que tiene una carga neta negativa).

Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la que se pueden adherir uno o más ligandos cargados. La fase sólida puede ser una columna de purificación, una fase discontínua de partículas discretas, una membrana, un filtro, etc. Ejemplos de materiales para formar la fase sólida incluyen polisacáridos (tales como agarosa y celulosa); y otras matrices estables mecánicamente tales como ela sílice (p.e. cristal de poro controlado), poli(estirendivinil)benceno, poliacrilamida, partículas de cerámica y derivados de cualquiera de lo anterior.

Una "resina de intercambio catiónico" se refiere a una fase sólida que está cargada negativamente y que, además, tiene cationes libres para el intercambio con cationes en una solución acuosa pasada por o través de una fase sólida. Un ligando cargado negativamente unido a la fase sólida para formar la resina de intercambio catiónico, puede ser p.e. un carboxilato o sulfonato. Resinas de intercambio catiónico comercialmente disponibles incluyen carboximetilcelulosa, BAKERBOND ABX^{TM}, sulfopropil(SP) inmovilizado en agarosa (p.e. SP-SEPHAROSE FAST FLOW^{TM} o SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE^{TM}, de Pharmacia) y sulfonil inmovilizada en agarosa (p.e. S-SEPHAROSE FAST FLOW^{TM} de Pharmacia).

El término "resina de intercambio aniónico" se utiliza aquí para referirse a una fase sólida que está cargada positivamente, p.e. teniendo uno o más ligandos cargados positivamente, tales como grupos amonio cuaternarios, unidos a los mismos. Resinas de intercambio aniónico disponibles comercialmente incluyen DEAE celulosa, QAE SEPHADEX^{TM} y FAST Q SEPHAROSE^{TM} (Pharmacia).

Un "tampón" se una solución que resiste cambios de pH por la acción de componentes conjugados ácido-base. Se pueden utilizar diferentes tampones que dependiendo de, por ejemplo, el pH deseado del tampón, se describen en Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ED. Calbiochem Corporation (1975). En una realización, el tampón tiene un pH en el rango de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 (p.e. como en el Ejemplo 1 de más abajo). Ejemplos de tampones que controlarán el pH en este rango incluyen los tampones MES, MOPS, MOPSO, fosfato, acetato, citrato, succinato y amonio, así como combinaciones de estos.

El "tampón de carga" es aquel que se utiliza para cargar la composición que comprende la molécula polipeptídica de interés y uno o más contaminantes en la resina de intercambio iónico. El tampón de carga tiene una conductividad y/o pH tal que la molécula polipeptídica de interés (y generalmente uno o más contaminantes) se une(n) a la resina de intercambio iónico.

\newpage

El "tampón intermedio" se utiliza para eluir uno o más contaminantes de la resina de intercambio iónico, antes de la elución de la molécula polipeptídica de interés. La conductividad y/o pH del tampón intermedio es/son tal(es) que el contaminante eluye de la resina de intercambio iónico pero no en cantidades significativas del polipéptido de interés.

El "tampón de lavado" cuando se utiliza en el presente documento se refiere a un tampón utilizado para lavar o volver a equilibrar la resina de intercambio iónico, antes de la elución de la molécula polipeptídica de interés. Convenientemente, el tampón de lavado y de carga pueden ser el mismo, pero esto no es un requisito.

El "tampón de elución" se utiliza para eluir el polipéptido de interés de la fase sólida. La conductividad y/o pH del tampón de elución es/son tal(es) que el polipéptido de interés eluye de la resina de intercambio iónico. Un "tampón de regeneración" se puede utilizar para regenerar la resina de intercambio iónico de tal manera que puede volverse a utilizar. El tampón de regeneración tiene una conductividad y/o pH requerido para eliminar sustancialmente todos los contaminantes y el polipéptido de interés de la resina de intercambio iónico.

El término "conductividad" se refiere a la capacidad de una solución acuosa a conducir una corriente eléctrica entre dos electrodos. En solución, la corriente fluye mediante un transporte iónico. De esta manera, con un incremento de la cantidad de iones presentes en la solución acuosa, la solución tendrá una mayor conductividad. La unidad de medición de la conductividad es mmhos (mS/cm) y se puede medir utilizando un medidor de conductividad vendido, p.e., por Orion. La conductividad de una solución se puede alterar cambiando la concentración de iones en la misma. Por ejemplo, la concentración de un agente tamponante y/o concentración de una sal (p.e. NaCl o KCl) en la solución se pueden alterar con el fin de conseguir la conductividad deseada. Preferiblemente, la concentración de sal de los diversos tampones se modifica para conseguir la conductividad deseada como en el Ejemplo de más abajo.

Por "purificar" un polipéptido de una composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes se entiende incrementar el grado de pureza del polipéptido en la composición mediante eliminación (completa o parcial) de por lo menos un contaminante de la composición. Una "etapa de purificación" puede ser parte de todo el proceso de purificación que resulte en una composición "homogénea", que se utiliza en el presente documento para referirse a una composición que comprende por lo menos un 70% en peso del polipéptido de interés, basado en el peso total de la composición, preferiblemente por lo menos aproximadamente un 80% en peso.

A no ser que se indique lo contrario, cuando se utiliza en el presente documento el término "HER2", se refiere a la proteína HER2 humana (el factor receptor 2 de crecimiento epidérmico humano) y "HER2" se refiere al gen HER2 humano. El gen HER2 y la proteína HER2 humanas se describen en Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) y Yamamoto et al., Nature 319:230-234 (1986) (Número de Acceso en Genebank X03363), por ejemplo.

El término "humMAb4D5-8" (anticuerpo monoclonal humanizado 4D5-8) cuando se utiliza en el presente documento se refiere a un anticuerpo anti-HER2 humanizado que comprende la secuencia aminoacídica de la cadena ligera de la SEC ID Nº:1 y la secuencia aminoacídica de la cadena pesada de SEC ID Nº:2 o variantes de secuencia aminoacídica de las mismas que retienen la capacidad de unir HER2 e inhibir el crecimiento de células tumorales que sobreexpresen HER2 (véase la patente US Nº 5.677.171).

El "pI" o "punto isoeléctrico" de un polipéptido se refiere al pH al cual la carga positiva del polipéptido se equilibra con su carga negativa. El pI se puede calcular a partir de la carga neta de los residuos de aminoácidos del polipéptido o se puede determinar mediante enfoque isoeléctrico (p.e. utilizando la cromatografía CSx como en el Ejemplo de más abajo).

Por "unión" de una molécula a un material de intercambio iónico se entiende exponer la molécula al material de intercambio iónico en condiciones apropiadas (pH/conductividad) de tal manera que la molécula se inmoviliza de manera reversible en o dentro del material de intercambio iónico en virtud de las interacciones iónicas entre la molécula y un grupo cargado o grupos cargados del material de intercambio iónico.

Por "lavado" del material de intercambio iónico se entiende hacer pasar un tampón adecuado a través o por encima del material de intercambio iónico.

Para "eluir" una molécula (p.e. un polipéptido o contaminante) de un material de intercambio iónico se entiende extraer la molécula de ahí, alterando la fuerza iónica del tampón que circunda el material de intercambio iónico de manera que el tampón compite con la molécula por los sitios cargados en el material de intercambio iónico.

"Tratamiento" se refiere a tanto el tratamiento terapéutico como el profiláctico o medidas preventivas. Aquellas necesarias de tratamiento incluyen las ya asociadas con alteraciones así como en aquellas en las que se previene la alteración. Una "alteración" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con el polipéptido purificado tal y como se describe en el presente documento. Esto incluye alteraciones o desórdenes crónicos y agudos que incluyen aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero a la alteración en cuestión.

La palabra "marcador" cuando se utiliza en el presente documento se refiere a un compuesto o composición detectable que está conjugado de manera directa o indirecta al polipéptido. El marcador puede ser por sí mismo detectable (p.e. marcadores radioisótopos o marcajes fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar una alteración química de un compuesto o composición sustrato que sea detectable.

El término "agente citotóxico" cuando se utiliza en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causas de destrucción celular. El término intenta incluir isótopos radiactivos (p.e. I^{131}, I^{125}, Y^{90} y Re^{186}), agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como las toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de los mismos.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen la adriamicina, doxorubicina, epirubicina, 5-fluoruracil, citosinarabinósido ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfán, citoxina, taxoides, p.e. paclitaxel (TAXOLTM, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) y doxetaxel, toxoteto, metotrexato, cisplatín, melfalán, vinblastina, bleomicina, etoposida, ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, vincristina, vinorelbina, carboplatin, teniposida, daunomicina, carminomicina, aminopterina, dactinomicina, mitomicinas, esperamicinas (véase patente US Nº 4.675.187), melfalán y otros mostazas de nitrógeno relacionados. También están incluidos en esta definición los agentes hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal en tumores, tales como tamoxifen y onapristona.

Maneras de llevar a cabo la invención

La invención del presente documento proporciona un procedimiento para la purificación de un polipéptido de una composición (p.e. una solución acuosa) que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes. La composición es una que resulta, generalmente, de la producción recombinante del polipéptido, pero puede ser que resulte de la producción del polipéptido mediante síntesis peptídica (u otros medios sintéticos) o se puede purificar el polipéptido de una fuente nativa del polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido es un anticuerpo, p.e., uno que se una al antígeno HER2.

Para la producción recombinante del polipéptido, se aísla el ácido nucleico codificante y se inserta en un vector replicable para la posterior clonación (amplificación del DNA) o expresión. El DNA codificante del polipéptido se aísla y se secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (p.e. cuando el polipéptido sea un anticuerpo mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos que sean capaces de unirse a específicamente a genes codificantes de cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo). Muchos vectores son asequibles. Los componentes del vector incluyen, generalmente, pero no se limitan a, uno o más de lo siguiente: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más marcadores genéticos, un elemento intensificador, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción (p.e. según se describe en la patente US 5.534.615, incorporada aquí específicamente como referencia).

Células hospedadoras adecuadas para la clonación o expresión del DNA en los vectores del presente documento son las células procariotas, levaduras o células eucariotas superiores descritas más arriba. Procariotas adecuados para este fin incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae como Escherichia, p.e. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g. Salmonella typhimurium, Serratia, p.e., Serratia marcescans y Shigella, así como Bacilli, tales como B. subtilis y B. licheniformis (p.e. B. licheniformis 41P descrito en DD 266.710 publicado el 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces. Un hospedador de E. coli preferido para la clonación es E. coli 294 (ATCC 31.446) aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitativos.

Otros microbios procariotas y eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras son hospedadores apropiados para la clonación o expresión de vectores codificantes de polipéptidos. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura de pan común, es la más comúnmente utilizada entre los microorganismos hospedadores inferiores. Sin embargo, son asequibles y útiles, en el presente documento, una serie de otros géneros, especies y cepas, tales como los hospedadores Schizosaccharomycespombe; Kluyveromyces, tales como, p.e., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pasloris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, p.e., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y hospedadores Aspergillus tales como A. nidulans y A. níger.

Células hospedadoras adecuadas para la expresión de polipéptidos glicosilados proceden de organismos multicelulares. Ejemplos de células invertebradas incluyen las células de plantas e insectos. Han sido identificadas numerosas cepas de baculovirus y variantes y las células hospedadoras de insectos permisivas correspondientes procedentes de hospedadores tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Brombyx mori. Están disponibles públicamente una variedad de cepas virales para la transfección, p.e. la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, y dichos virus se pueden utilizar aquí como el virus de acuerdo con la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda. También se pueden utilizar como hospedadores cultivos celulares vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco.

Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) se ha vuelto un procedimiento rutinario. Ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embriónica humana (293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en un cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sartoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL2); células de riñón caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata bufalo (BRL 3A, ATCC CRL 2); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humana (Hep G2).

Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión o clonación más arriba descritos para la producción del polipéptido y se cultivan en medios de nutrientes convencionales modificados de manera apropiada para inducir a los promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes codificantes de las secuencias deseadas.

Las células hospedadoras utilizadas para producir el polipéptido de esta invención se puede cultivar en una variedad de medios. Medios comercialmente disponibles tales como Ham's 10 (Sigma), Medio Esencial Mínimo (MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Medio Eagle Modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células hospedadoras. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Patentes US Nº 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; o patente US Re. 30.985 se pueden utilizar como medios de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios se puede suplementar cuando sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tal como el HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN^{TM}), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente en concentraciones finales en el rango de micromolar) y glucosa o una fuente equivalente de energía. Se puede incluir cualquier otro suplemento necesario en las concentraciones adecuadas que sean conocidas para los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares son las utilizadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión y serán evidentes para un técnico especialista ordinario.

Cuando se utilizan técnicas recombinantes, el polipéptido se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretado directamente al medio. Si el polipéptido se produce intracelularmente, como primera etapa, el debris particulado, ya sea de células hospedadoras o células lisadas (p.e. resultantes de la homogeneización) se extrae, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Cuando el polipéptido se secreta al medio, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión se concentran, generalmente, primero utilizando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración de Amicon o Millipore Pellicon.

El polipéptido se somete, a continuación, a una o más etapas de purificación, incluyendo el procedimiento de cromatografía de intercambio iónico según se reivindica en el presente documento. Ejemplos de procedimientos de purificación adicionales que se pueden ejecutar antes de, durante o después del procedimiento de intercambio iónico incluye el fraccionamiento en una cromatografía de interacción hidrofóbica (p.e. en fenil sefarosa), precipitación con etanol, enfoque isoeléctrico, HPLC de fase reversa, cromatografía en sílice, cromatografía en HEPARIN SEPHAROSETM, además de la cromatografía de intercambio aniónico y/o adicionales cromatografías de intercambio catiónico, cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía con hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad (p.e. utilizando proteína A, proteína G, un anticuerpo, un sustrato específico, ligando o antígeno como reactivo de captura).

La cromatografía de intercambio iónico se lleva a cabo según se reivindica aquí. Se toma una primera decisión sobre si se utiliza una resina de intercambio catiónico o aniónico. En general, se puede utilizar una resina de intercambio catiónico para polipéptidos con pI superior a aproximadamente 7 y se puede utilizar una resina de intercambio aniónico para polipéptidos con pI inferior a aproximadamente 7.

La resina de intercambio aniónico o catiónico se prepara de acuerdo con procedimientos conocidos. Frecuentemente, se pasa un tampón de equilibrio a través de la resina de intercambio iónico antes de cargar la composición que comprende el polipéptido y uno o más contaminantes en la resina. De manera conveniente, el tampón de equilibrio es el mismo que el tampón de carga, pero no es un requisito.

Los diversos tampones utilizados para la cromatografía dependen de, por ejemplo, si se utiliza una resina de intercambio aniónico o catiónico. Esto se muestra más claramente en el diagrama de flujo de las Figuras 1 y 2.

Con especial referencia a la Figura 1, que muestra las etapas ejemplificadas para llevar a cabo cuando se utiliza una resina de intercambio catiónico, el pH y/o la conductividad de cada tampón se incrementa(n) respecto al tampón anterior, excepto para el tampón de lavado donde la conductividad y/ pH es/son inferior(es) a la conductividad y/o
pH del tampón intermedio anterior. La solución acuosa que comprende el polipéptido de interés y contaminante(s) cargado(s) en la resina de intercambio catiónico utilizando el tampón de carga que está a un pH y/o conductividad de manera que el polipéptido y el contaminante se unen a la resina de intercambio catiónico. Como en el ejemplo de más abajo, el tampón de carga puede estar a una primera conductividad baja (p.e. de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,6 mmhos). Un pH ejemplificante para el tampón de carga puede ser aproximadamente 5,0 (véase Figura 1). De aproximadamente 20 mg/mL a aproximadamente 35 mg/mL del polipéptido (p.e. un anticuerpo de longitud completa) se puede cargar, por ejemplo, en la resina de intercambio iónico.

La resina de intercambio catiónico se lava, a continuación, con un tampón intermedio que está a una segunda conductividad y/o pH con el fin de eluir esencialmente el contaminante y no una cantidad sustancial del polipéptido de interés. Esto se puede conseguir incrementando la conductividad o pH, o ambas, del tampón intermedio. El cambio del tampón de carga al tampón intermedio puede ser escalonado o gradual, según se desee. En el Ejemplo del presente documento, el tampón intermedio tenía una conductividad mayor que la del tampón de carga (es decir, la conductividad del tampón intermedio estaba en el rango de aproximadamente 7,3 a aproximadamente 8,4 mmhos). Alternativamente, como se muestra en la Figura 1, el pH del tampón intermedio puede exceder el del tampón de carga en esta realización de la invención, donde se utiliza una resina de intercambio catiónico. Por ejemplo, el tampón intermedio puede tener un pH de aproximadamente 5,4.

Después del lavado con el tampón intermedio, la resina de intercambio catiónico se lava o se vuelve a equilibrar con el tampón de lavado que tiene una conductividad o pH, o ambas, que es/son inferior(es) a la del tampón intermedio (es decir, la conductividad, o pH, o ambas, se cambia(n) en dirección opuesta, es decir, inversa, a la etapa anterior, a diferencia de las etapas de cromatografía de intercambio iónico de la literatura). En el Ejemplo de más abajo, el tampón de lavado tenía aproximadamente la misma conductividad que la del tampón de carga (es decir, en el rango de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,6 mmhos) y su conductividad era, por tanto, inferior a la del tampón intermedio. En otra realización, uno puede reducir la conductividad del tampón de lavado a una conductividad que sea inferior a, o mayor a, la del tampón de carga, con la condición de que la conductividad del tampón de lavado sea inferior a la del tampón intermedio. En otra realización, el pH del tampón de lavado puede ser inferior al pH del tampón intermedio (p.e. el pH del tampón de lavado puede ser aproximadamente 5,0). El cambio en la conductividad y/o pH del tampón de lavado comparado con el del tampón intermedio se puede conseguir mediante cambio gradual o escalonado de cualquiera o todos estos parámetros.

Después de la etapa de lavado del párrafo anterior, la resina de intercambio catiónico se prepara para la elución de la molécula polipeptídica deseada. Esto se consigue utilizando un tampón de elución que tenga un pH y/o conductividad tal que el polipéptido deseado no se una más a la resina de intercambio catiónico y, de esta manera, eluya. El pH y/o conductividad del tampón de elución excede, generalmente, el pH y/o conductividad del tampón de carga, el tampón intermedio y el tampón de lavado utilizados en las etapas previas. En el Ejemplo de más abajo, la conductividad del tampón de elución estaba en el rango de aproximadamente 10,0 a aproximadamente 11,0 mmhos. Alternativamente, o además, el pH del tampón de elución se puede incrementar respecto al tampón de lavado y al tampón intermedio (por ejemplo, el pH del tampón de elución puede ser aproximadamente 6,0). El cambio de conductividad y/o pH puede ser escalonado o gradual, según se desee. De esta manera, se recupera el polipéptido deseado de la resina de intercambio catiónico en esta etapa del procedimiento.

En una realización alternativa, el material de intercambio iónico comprende una resina de intercambio aniónico. Esta realización de la realización se describe en la Figura 2. Como se ilustra en esta figura, los cambios en la conductividad son, en general, como los descritos más arriba respecto a una resina de intercambio catiónico. Sin embargo, la dirección del cambio del pH es diferente para una resina de intercambio aniónico. Por ejemplo, si se consigue la elución del contaminante(s) y el polipéptido alterando el pH, el tampón de carga tiene un primer pH y en el tampón intermedio se disminuye el pH con el fin de eluir el contaminante o los contaminantes. En la tercera etapa, la columna se lava/vuelve a equilibrar con el tampón de lavado y el cambio en la conductividad o pH, o ambas, es en la dirección contraria a la de la etapa anterior. De esta manera, el pH se puede incrementar con el tampón de lavado, comparado con el tampón intermedio. Después de esta etapa, el polipéptido de interés se eluye de la resina de intercambio aniónico utilizando un tampón de elución a una cuarta conductividad y/o pH. Si se altera el pH, este será, normalmente, menor al pH del tampón de carga, el tampón intermedio y el tampón de lavado. El cambio en el pH y/o conductividad en los tampones sucesivos puede ser, como se ha explicado anteriormente, escalonado o gradual.

En un procedimiento preferido se cambia un solo parámetro (es decir, conductividad o pH) para conseguir la elución de tanto el polipéptido como el contaminante, mientras que el otro parámetro (es decir, el pH o conductividad, respectivamente) permanece casi constante. Por ejemplo, mientras que la conductividad de los diferentes tampones (tampón de carga, tampón intermedio, tampón de lavado y/o tampón de elución) pueden diferir, los pH de los mismos pueden ser esencialmente iguales.

En una realización opcional del procedimiento, la resina de intercambio iónico se regenera con un tampón de regeneración después de la elución del polipéptido, de manera que la columna pueda ser reutilizada. Generalmente, la conductividad y/o pH del tampón de regeneración es/son de tal manera que prácticamente todos los contaminantes y el polipéptido de interés eluyen de la resina de intercambio iónico. Generalmente, el tampón de regeneración tiene una muy elevada conductividad para eluir los contaminantes y el polipéptido de la resina de intercambio
iónico.

El procedimiento del presente documento es particularmente útil para resolver una molécula polipeptídica de interés de por lo menos un contaminante, donde el contaminante y la molécula polipeptídica de interés difieran sólo ligeramente en la carga iónica. Por ejemplo, los pI del polipéptido y contaminante pueden ser solo "ligeramente diferentes", por ejemplo, pueden diferir en aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2 unidades de pI. En el Ejemplo de más abajo, este procedimiento se podría utilizar para resolver un anticuerpo anti-HER2 que tenga un pI de 8,87, de, únicamente, una variante desamidada de la misma que tenga un pI de 8,79.

\newpage

La preparación del polipéptido obtenida de acuerdo con el procedimiento de cromatografía de intercambio iónico del presente documento, se puede someter a etapas de purificación adicionales, si es necesario. Etapas de purificación adicionales ejemplificativas se han discutido más arriba.

Opcionalmente, el polipéptido se conjuga a una o más moléculas heterólogas cuando se desee. La molécula heteróloga puede ser una que, por ejemplo, incremente el tiempo de vida media del polipéptido en suero (p.e. polietilenglicol, PEG) o puede ser un marcador (p.e. un enzima, un marcador fluorescente y/o radionuclido) o una molécula citotóxica (p.e. una toxina, fármaco quimioterapéutico o isótopo radiactivo, etc).

Se puede preparar una formulación terapéutica que comprenda el polipéptido, opcionalmente conjugado con una molécula heteróloga, mezclando el polipéptido que tiene el grado de pureza deseado con vehículos farmacéuticamente aceptables opcionales, excipientes o estabilizantes (Remington's Pharnmaceutical Sciences 16th Edition, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Vehículos "farmacéuticamente aceptables", excipientes o estabilizantes no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (tales como el cloruro de octadecildimetil bencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol; alcohol butílico o fenílico; alquil parabenos como el metil o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptido de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas tales como la albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; sales formadoras de contraiones como el sodio; complejos metálicos (p.e. complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos como TWEEN^{TM}, PLURONICS^{TM} o polietilenglicol (PEG). El anticuerpo humMAb4D5-8, de particular interés en el presente documento, se puede preparar como
una formulación liofilizada, p.e. según se describe en WO 97/04801; incorporada expresamente aquí por referencia.

La formulación del presente documento puede también contener más de un compuesto activo, si es necesario, para la indicación a ser tratada, preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre ellas. Tales moléculas se presentan adecuadamente en combinación, en cantidades que son efectivas para un determinado propósito. Por ejemplo, para un anticuerpo anti-HER2, se puede añadir a la formulación un agente quimioterapéutico, tal como taxoide o tamoxifén.

Los ingredientes activos se pueden también entrampar en una microcápsula preparada, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, una microcápsula de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en microemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, Osol, A. Ed. (1980).

La formulación a ser utilizada en la administración in vivo debe ser estéril. Esto se cumple fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenidas. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenidas incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrofóbicos que contienen la variante polipeptídica, estando estas matrices en forma de artículos moldeados, p.e. películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente US Nº 3.773.919) copolímeros de ácido L-glutámico y \gamma-etil-L-glutamato, etilenvinil acetato no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico como el LUPRON DEPOT^{TM} (microesferas inyectables compuestas de copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico y acetato leuprólido) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

El polipéptido purificado tal y como se ha descrito aquí o la composición que comprende el polipéptido y un vehículo farmacéuticamente aceptable se utilizan, a continuación, para diversos usos de diagnóstico, terapéutico u otros conocidos para dichos polipéptidos y composiciones. Por ejemplo, el polipéptido se puede utilizar para tratar un trastorno en un animal mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido a un mamífero.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo ilustrativo y no a modo limitativo. Las descripciones de todas las citas de la descripción se incorporan expresamente aquí por referencia.

Ejemplo 1

La IgG rhuMAb HER2 humana de longitud completa (humAb4D5-8 en Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 4285.

4289 (1992) que comprende la secuencia aminoacídica de la cadena ligera de la SEC ID Nº: 1 y la secuencia aminoacídica de la cadena pesada de la SEC ID Nº: 2) se produjo de manera recombinante en células CHO. Después de la producción de la proteína y la secreción al medio de cultivo celular, se separaron las células COS del medio de cultivo celular mediante filtración de flujo tangencial (PROSTACK^{TM}). A continuación, se llevó a cabo una cromatografía de Proteína A aplicando directamente el fluido del cultivo celular recogido (HCCF) de las células CHO a una columna PROSEP A^{TM} equilibrada (Bioprocessing, Ltd).

Después de la cromatografía de Proteína A, se llevó a cabo la cromatografía de intercambio catiónico utilizando una columna de sulfopropil (SP)-SEPHAROSE FAST FLOW^{TM} (SPSFF) (Pharmacia) para separar, además, la molécula de anticuerpo anti-HER2 deseado. La operación de cromatografía se llevó a cabo en el modo de unión y elución.

La columna SPSFF se preparó para cargar, mediante lavados secuenciales con tampón de regeneración (0,025 M MES/1,0 M NaCl, pH 5,6) seguido del tampón de equilibrio (0,025 M MES/50 mM NaCl, pH 5,6). La columna se cargó, a continuación, con el pool de Proteína A ajustado a un pH de 5,60 \pm 0,05 y una conductividad de 5,8 \pm 0,2 mmhos. Antes de la elución, la columna se lavó en tres etapas: (1) tampón de carga (0,025 M MES/50mM, pH 5,6) por un un volumen mínimo de una columna; (2) tampón intermedio (0,025 M MES/70 mM NaCl, pH 5,6) hasta que se alcanza un ápice de un pico de 280 nm y; (3) tampón de lavado (0,025 M MES/50 mM NaCl, pH 5,6) para un mínimo de 1,2 volúmenes de columna. A continuación, se eluye de la columna rhuMAb HER2 con un tampón de elución (0,025 M MES/95 mM NaCl pH 5,6). El perfil de elución a 280 nm tiene un saliente en el borde frontal (Figura 3). En el punto de inflexión de este saliente, empieza la agrupación y continúa durante 5 volúmenes más de columna. La columna, a continuación, se regeneró con un tampón de regeneración (0,0025 M MES/1,0 M NaCl, pH 5,6).

Materiales y Métodos

Columna y preparación de carga: se empaquetó una columna SPSFF a escala reducida. Las dimensiones eran: volumen de 27,0 mL, diámetro de 1,0 cm altura del lecho de 34,5 cm. Se tituló el pH de una alícuota del pool de Proteína A a 5,6 con base Tris 1,5 M. La conductividad del pool se redujo mediante la adición de un volumen igual de agua estéril para la inyección (SWFI).

Cromatografía: la cromatografía para este estudio se llevó a cabo con el sistema FPLC de UNICORN^{TM}. Las etapas de equilibrio, carga y lavado inicial se llevaron a cabo a una velocidad de flujo lineal de 200 cm/h. Todas las etapas de cromatografía se llevaron a cabo a una velocidad de flujo lineal de 100 cm/h. La secuencia de etapas de cromatografía se definen en la Tabla 1. Se llevaron un total de seis cromatografías con densidades de carga de 15, 20, 25, 30, 35 y 40 mg de rhuMAb HER2 por mL de resina SPSFF.

TABLA 1

Etapas^{1} de la Cromatografía
Etapa de Cromatografía	Tampón	Punto final aproximado
Equilibrio: Parte 1	0,025 M MES/1,0 M NaCl, pH 5,6	2 CV^{2}
Equilibrio: Parte 2	0,025 M MES/0,05 M NaCl, pH 5,6	PH: 5,6 \pm 0,1
		Cond.: 5,8\pm0,2 mmhos
Carga	Ajustar Pool de Proteína A	Según se requiera
Lavado 1	0,025 M MES/0,05 M NaCl, pH 5,6	1,5 CV
Lavado 2	0,02 5 M MES/0,07 M NaCl, pH 5,6	Ápice del pico
Lavado 3	0,025 M MES/0,05 M NaCl, pH 5,6	2 CV
Elución: "Prepool"	0,025 M MES/0,095 M NaCl, pH 5,6	Hasta el saliente en el borde frontal (-1,2 CV)
Elución: pool	0,025 M MES/0,095 M NaCl, pH 5,6	5 CV
Regeneración	0,025 M MES/1,0 M NaCl, pH 5,6	2 CV
1. \begin{minipage}[t]{155mm}El equilibrio de la resina se llevó a cabo de manera manual; las etapas restantes se ejecutaron a partir de un Programa Pharmacia Unicorn.\end{minipage}
2. CV= Volumen(es) de columna.

Proteína total: La concentración de proteína de cada fracción cromatográfica (flujo continuo, etapas de lavado, elución, de "prepool", "pool" de elución y regeneración) se determinó por escaneados espectrofotométricos de cada muestra. Los resultados se utilizaron para calcular los rendimientos de recuperación de producto. El coeficiente de extinción para rhuMAb HER2 es 1,45. Los cálculos utilizados para derivar los resultados (Figura 4) son:

Concentración \ de \ Prote\text{í}na \ (mg/mL)= \frac{280 \ nm}{1,45} \ x \ factor \ de \ dilución

Masa \ de \ Prote\text{í}na \ (mg) \ en \ cada \ fracción = \ Concentración \ de \ Prote\text{í}na \ (mg/mL) \ x \ Volumen \ de \ Fracción \ (mL)

Rendimiento \ (%) = \frac{Masa \ de \ Fracción \ (mg)}{Masa \ Total \ (mg)} \ x \ 100

\vskip1.000000\baselineskip

Determinación de las variantes del anticuerpo rhuMAb HER2 (CSxHPIEX): la columna de cromatografía de SPSFF de rhuMAb HER2 resuelve las variantes del anticuerpo. Se analizaron las fracciones de cada una de las cromatografías en estudio se ensayó por la cantidad relativa de anticuerpo variante por cromatografía CSxHPIEX. Se hizo correr una columna BAKERBOND WIDE-PORE^{TM} CSx HPIEX (4,6 x 250 mm) a 1 mL/min a 55ºC. La fase móvil se formó a partir de un gradiente terciario (Tabla 2).

TABLA 2

Esquema de Gradiente
Tiempo (min)	% A	% B	% C
0 - Condiciones iniciales	49	1	50
10,0	40	10	50
50,0	33	17	50
50,2	49	1	50
70,0	49	1	50

La columna se hace correr a 1 mL/min a 55ºC.

El tampón A era MES 0,025 M, pH 5,9; el tampón B era acetato de amonio 1 M, pH 7,0; y al disolución C era agua estéril para la inyección. La columna se equilibró con las condiciones iniciales de gradiente (49% A; 1% B; y 50% C) y se inyectaron 200 \mul de muestra, diluidos con SWFI y que contenía <300 \mug de proteína. Cada cromatograma resultante se integró para determinar el porcentaje de área de cada pico para cada fracción (Tabla 3 y Figura 5).

TABLA 3

Análisis CSxHPIEX de rhuMAb HER2
CSx Pico	Variante rhuMAb HER2
A \amp{1} b	Cadena Ligera: Asn-Asp^{30} desamidación
	-y-
1	Otra variación no identificable en el mapa tríptico
	Cadena Ligera: Asn-Asp^{30} desamidación
3	Anticuerpo procesado completamente
4	Cadena Pesada: Asp-Iso-Asp^{102}
	-y/o-
	Cadena Pesada: una Lys^{450} adicional
	Cadena Pesada: Asp- Succinimida^{102}
Otros	-y/o-
	Permutaciones múltiples encontrados en los picos 1 y 4

Cromatogramas comparados: los valores de absorbancia (AU 280 nm) para cada archivo de cromatografía se exportó a Unicorn en el formato ASCII. Los valores del lavado con 0,025 M MES/ 0,07 M NaCl, pH 5,6 se tradujo al formato Excel y se copió en KALEIDAGRAPH^{TM}. Utilizando KALEIDAGRAPHTM, los perfiles de lavado se cubren (Figura 6) y se compararon entre sí.

Resultados y discusión

Las variantes desamidadas y otras acídicas de rhuMAb HER2 se produjeron cuando el anticuerpo se preparó mediante tecnología recombinante de DNA (véase, por ejemplo, CSx picos a, b y 1 en la Figura 5). Las variantes desamidadas y otras acídicas constituían aproximadamente un 25% (calculado como el área bajo la curva integrada o el perfil obtenido por cromatografía CSx) de la composición obtenida de la etapa de cromatografía inicial de Proteína A. Se descubrió que el procedimiento de intercambio iónico descrito en el presente documento se podría utilizar para reducir, de manera sustancial, la cantidad de variantes desamidadas y otras variantes acídicas en la composición anti-HER2, es decir, hasta aproximadamente un 13% o menos (es decir, la cantidad de variantes acídicas en la preparación sometida a la cromatografía de intercambio catiónico según se ha descrito aquí disminuyó en por lo menos aproximadamente un 50% o más).

El trazado de absorbancia de la columna de intercambio catiónico ejecutada según se ha descrito más arriba se muestra en la Figura 3. Este procedimiento resolvía una variante desamidada del anticuerpo anti-HER2 que solo difería ligeramente del anticuerpo anti-HER2 no desamidado. El incremento en la conductividad de las condiciones iniciales hasta el lavado intermedio empezó a eluir el anticuerpo anti-HER2 desamidado. Sin embargo, el lavado continuado a esta conductividad hizo eluir el anticuerpo anti-HER2 no desamidado, resultando en una pérdida de producto. Procediendo directamente del tampón intermedio al tampón de elución se observó que resultaba en una extracción inaceptablemente baja del anticuerpo anti-HER2 desamidado del producto si la recolección "pooling" empezaba pronto o rendimientos inaceptablemente bajos del producto anticuerpo anti-HER2 si la recolección "pooling" decaía hasta que se reducía el anticuerpo anti-HER2 desamidado. Se descubrió que volviendo a una conductividad más baja como la utilizada inicialmente, la elución del anticuerpo anti-HER2 desamidado continuó, sin la elución significativa del producto anticuerpo anti-HER2.

Se evaluó el efecto de cargar rhuMAb HER2 en (a) requisitos del tampón, (b) recuperación del producto en el pool y (c) la cualidad del producto en el pool.

A densidades de carga de 15 mg/mL hasta 35 mg/mL, el rendimiento de producto en el pool de elución es aproximadamente del 75%. Para la densidad de carga de 40 mg/mL, el rendimiento de producto en el pool disminuyó hasta un 65% (Figura 4). La recuperación reducida en el pool se atribuye ampliamente a un incremento del anticuerpo en las dos etapas de lavado (a 70 mM NaCl y 50 mM NaCl, respectivamente).

La cualidad de rhuMAb HER2 en todos los pools de elución es equivalente cuando se determina mediante análisis de CSx HPIEX (Figura 5). Comparado al material de carga: existe un enriquecimiento del anticuerpo no desamidado (pico 3), no existe un cambio en la cantidad de anticuerpo con Iso-Asp^{102} o Lys^{450} (pico 4) y una reducción de la cantidad del anticuerpo desamidado en Asp^{30} (picos a, b y 1 y otros).

La cualidad en estos pools catiónicos de rhuMAb HER2 se mejora mediante la etapa intermedia de lavado. Según se incremente la masa de rhuMAb HER2 unido a la resina, se reduce el consumo en volumen de tampón intermedio necesario para alcanzar el ápice en el pico a 280 nm. El volumen de tampón requerido para una densidad de carga de 40 mg/mL es aproximadamente de 2,5 volúmenes de columna. El volumen de tampón requerido para una densidad de carga de 15 mg/mL es aproximadamente 15 volúmenes de columna. El incremento exacto del tampón requerido no es lineal con los cambios incrementados de 5 mg/mL entre estos dos extremos. El incremento mayor se observa entre las densidades de carga de 20 mg/mL y 15 mg/mL. Aquí el requerimiento dobla los 7,5 volúmenes de columna a los previamente mencionados 15 volúmenes de columna de tampón. Si se alcanza el ápice del pico de lavado con 70 mM de NaCl, sin embargo, la cualidad del producto es equivalente para cualquiera de las densidades de carga examinadas.

Este estudio determinó cuánto rhuMAb se puede cargar en la resina SPSFF. Entre los rangos de 15 a 40 mg de anticuerpo por mL de resina, no existe diferencia en la cualidad del rhuMAb HER2 recuperado en el pool de elución. La cantidad de rhuMAb HER2 recuperada, sin embargo, se reduce en aproximadamente un 10% cuando se carga la resina con más de 35 mg/mL. Para rendimientos consistentes se recomienda que 35 mg/mL sea la carga máxima para la fabricación de rhuMAb HER2. Además, debido al incremento sustancial en el requerimiento de volumen de lavado a 70 mM NaCl entre 20 y 15 mg/mL, se recomienda que 20 mg/mL sea la carga mínima para la fabricación de rhuMAb HER2.

Claims (6)

1. Composición que comprende una mezcla de anticuerpo anti-HER2 y una o más variantes acídicas del mismo,

en el que la cantidad de variante(s) acídica(s) es menor del 25% aproximadamente,

y en el que la(s) variante(s) acídica(s) son predominantemente variantes desamidadas en las que uno u más residuos de asparagina del anticuerpo anti-HER2 se han desamidado,

y en el que el anticuerpo anti-HER2 es humMAb4D5-8,

y en el que las variantes desamidadas tienen Asn30 en CDR1 de una o las dos regiones V_{L} de humMAb4D5-8 convertido en aspartato.

2. Composición según la reivindicación 1, en el que la cantidad de variante(s) acídica(s) es menor del 20% aproximadamente.

3. Composición según la reivindicación 2, en el que la cantidad de variante(s) acídica(s) es menor del 13% aproximadamente.

4. Composición según la reivindicación 2, en el que la cantidad de variante(s) acídica(s) está comprendida entre el 1% y el 18% aproximadamente.

5. Composición según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-HER2 comprende la secuencia de amino ácido de cadena ligera de SEQ ID NO. 1 y la secuencia de amino ácido de cadena pesada de SEQ ID NO. 2.

6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que también comprende un portador farmacéuticamente aceptable.