BR112020010514A2

BR112020010514A2 - método para tratar ou prevenir lesão por isquemia-reperfusão

Info

Publication number: BR112020010514A2
Application number: BR112020010514-7A
Authority: BR
Inventors: Ingela Vikstrom; Adriana Baz Morelli; Martin Pearse
Original assignee: Csl Limited
Priority date: 2017-11-29
Filing date: 2018-11-29
Publication date: 2020-11-24
Also published as: DK3717011T3; AU2018377856A1; EP3717011B1; CA3081770A1; WO2019104385A1; KR20200093562A; JP2021504382A; ES2939461T3; EP3717011A1; US20210179721A1; PL3717011T3; JP7465210B2; US20230279129A1; EP3717011A4; KR102684627B1; DK3717011T5; CN111417406A

Abstract

A presente invenção se refere a um método para prevenir ou tratar lesão por isquemia-reperfusão em um indivíduo, sendo que o método compreende administrar um composto que inibe sinalização de fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF). Em alguns exemplos, a lesão por isquemia-reperfusão é devido ou associada à transplantação de tecido ou órgão. Em alguns exemplos, o composto é um anticorpo.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para “MÉTODO PARA TRATAR OU PREVENIR LESÃO POR ISQUEMIA-REPERFUSÃO” Dados do pedido relacionado

[001] O presente pedido reivindica prioridade do Pedido de Patente Australiano nº 2017904822 depositado em 29 de novembro de 2017 e intitulado “Method of treating or preventing ischemia-reperfusion injury”. O conteúdo desse pedido é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

Listagem de sequências O presente pedido é depositado junto de uma Listagem de Sequências em forma eletrônica. O conteúdo da Listagem de Sequências é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.

Campo

[002] A presente revelação se refere a métodos para tratar ou prevenir lesão por isquemia-reperfusão em um indivíduo antagonizando-se sinalização de fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF) e usos do mesmo, por exemplo, em transplantação de órgão.

Antecedentes

[003] A lesão por isquemia-reperfusão (IRI) é uma afecção patológica causada por isquemia, isto é, uma restrição ou redução do fornecimento de sangue a um tecido ou órgão, por exemplo, um órgão de doador falecido para transplantação, seguido por reperfusão subsequente e reoxigenação. A isquemia causa privação de oxigênio e nutrientes às células e remoção inadequada de desperdício metabólico e pode causar rapidamente necrose e inflamação. A reperfusão de um tecido ou órgão após um período de isquemia causa o retorno do fornecimento de sangue e oxigênio, no entanto, a própria reperfusão pode acentuar a oxidação e inflamação causadas pela isquemia inicial e causar mais lesões. A reoxigenação pode causar danos oxidativos a proteínas celulares, ao DNA e à membrana plasmática. Tais danos oxidativos podem, por sua vez, causar a liberação de radicais livres que resultam em mais danos celulares. A lesão por reperfusão é caracterizada, entre outras coisas, pela geração de espécies de oxigênio reativo, ativação de complemento, inflamação celular e danos celular endoteliais.

[004] Na transplantação de órgão, a lesão por isquemia- reperfusão pode ser definida como IRI “quente” ou IRI “fria”. A IRI quente ocorre in situ durante a cirurgia de transplantação de órgão ou durante várias formas de choque ou trauma. A IRI fria ocorre durante a preservação ex vivo e normalmente está vinculada à IRI quente durante cirurgia de transplantação de órgão.

[005] Tanto o sistema imunológico inato quanto o sistema imunológico adaptativo têm uma função central na patogênese da lesão por isquemia-reperfusão. Em termos de imunidade inata, sinais de perigo liberados por células que morrem ativam os receptores do tipo Toll que levam à ativação e/ou produção de fatores celulares e solúveis que regulam o recrutamento celular inflamatório e a produção de mediadores inflamatórios, por exemplo, quimiocinas, citocinas e radicais livres. Os neutrófilos estão entre os respondedores celulares inflamatórias primários seguindo a isquemia e reperfusão. No ambiente inflamatório, as células dendríticas absorvem e processam os antígenos das células que morrem, migram para os nódulos linfáticos e ativam células antígeno-específicas do sistema imunológico adaptativo. Desse modo, a patogênese da lesão por isquemia-reperfusão é complexa, e os danos ao tecido ocorrem através de diversos mecanismos, tais como morte celular, disfunção macrovascular, reprogramação transcricional, ativação do complemento e dos sistemas imunológicos inatos e adaptativos.

[006] A lesão por isquemia-reperfusão é um evento frequente na transplantação, incluindo transplantação de rim, e é um fator relevante na determinação do resultado do enxerto tanto a curto prazo quanto a longo prazo. Na transplantação de rim, a IRI afeta as células endoteliais e células epiteliais tubulares e pode causar lesão renal aguda e função atrasada do enxerto (DGF), o que pode prejudicar a sobrevivência do enxerto. A DGF é uma das complicações precoces mais frequentes depois de transplantação de rim de um doador falecido ou de um doador com critérios expandidos e é acusada principalmente por necrose celular epitelial tubular causada por IRI (Schróppel B, et al., rim Int. 2014).

[007] Os compostos que atualmente são testados em testes clínicos para tratar a lesão por isquemia-reperfusão incluem eculizumab, que é um anticorpo monoclonal humanizado contra o componente C5 da cascata de complemento (Rother R, et al. Nat Biotechnol. 2007). o fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF) também foi investigado como um agente terapêutico para o tratamento de lesão por reperífusão, consultar Nogueira et al., Cell Phys Biochem (2006) e Li et al., Nephrology (2008). Esses estudos mostraram que o tratamento com G-CSF tem efeitos de proteção em isquemia renal.

[008] No entanto, terapias eficazes para impedir ou tratar lesão por isquemia-reperfusão foram ilusórias. Portanto, ficará evidente para a pessoa versada na técnica a partir do supracitado que há uma necessidade de estratégias e métodos para prevenir ou tratar os danos causados pela lesão por isquemia-reperíusão. Sumário

[009] Na elaboração da presente invenção, os inventores procederam contra ensinamentos anteriores em que G-CSF pode ter uma função protetora na lesão por isquemia-reperíusão e, em vez disso, estudaram os efeitos de inibir a sinalização de G-CSF na lesão por isquemia-reperfusão. Os inventores constataram que administrando-se um composto que inibe sinalização de G-CSF, os efeitos da lesão por isquemia- reperfusão foram reduzidos. Adicionalmente, os inventores constataram que inibindo-se a sinalização de G-CSF é possível prevenir ou tratar lesão por isquemia-reperfusão em um grau semelhante à ativação de complemento de inibição no nível de c5. As constatações fornecem a base para os métodos para prevenir ou tratar a lesão por isquemia-reperíusão inibindo- se a sinalização de G-CSF.

[010] Consequentemente, a presente invenção fornece um método para prevenir ou tratar lesão por isquemia-reperfusão em um indivíduo, sendo que o método compreende administrar um composto que inibe sinalização de fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF).

[011] A presente revelação também fornece um composto que inibe sinalização de G-CSF para uso na prevenção Ou no tratamento da lesão por isquemia-reperfífusão.

[012] A presente revelação também fornece uso de um composto que inibe sinalização de G-CSF na fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento da lesão por isquemia-reperfusão.

[013] Em alguns exemplos, a lesão por isquemia e/ou reperfusão é devido ou está associada à transplantação de órgão, armazenamento de órgão a frio, morte encefálica, aterosclerose, trombose, tromboembolismo, embolia lipídica, trauma, sangramento, estente, cirurgia, angioplastia, cirurgia de ponte (bypass), isquemia total, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, doença vascular periférica, sepse, um tumor ou combinações dos mesmos.

[014] Em alguns exemplos, a lesão por isquemia-reperfusão é lesão por isquemia-reperfusão quente. Em alguns exemplos, a lesão por isquemia-reperfusão é lesão por isquemia-reperfusão fria.

[015] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao indivíduo.

[016] Em um exemplo, a lesão por isquemia-reperfusão é devida ou está associada a um ou mais dentre o seguinte:

[017] (i) transplantação de órgão;

[018] (ii) cirurgia;

[019] (iii) trauma;

[020] (iv) sepse;

[021] (v) um tumor; e

[022] (vi) acidente vascular cerebral.

[023] Em um exemplo, a lesão por isquemia-reperfusão é devido ou está associada à cirurgia. Em um exemplo, a lesão por isquemia-reperfusão é devido ou está associada a ponte aorto-coronária cirurgia, por exemplo, uma ponte (bypass dupla (na qual duas artérias coronárias são desviadas (por exemplo, uma artéria descendente anterior esquerda (LAD) e uma artéria coronária direita (RCA)); uma ponte tripla (na qual três vasos são desviadas, por exemplo, a LAD, a RCA e a artéria circunflexa esquerda (LCX)); uma ponte quádrupla (na qual quatro vasos são desviados (por exemplo, a LAD, a RCA, a LCX e a primeira artéria diagonal da LAD)); ou um ponte quíntupla (em que cinco artérias são desviadas).

[024] Em um exemplo, a lesão por isquemia-reperfusão é devido ou está associada a transplantação de órgão, por exemplo, uma transplantação de órgão sólido. Em um exemplo, a transplantação de órgão é uma transplantação de rim. Em um exemplo, a transplantação de órgão é uma transplantação de fígado. Em um exemplo, a transplantação de órgão é uma transplantação de coração. Em um exemplo, a transplantação de órgão é uma transplantação de pâncreas. Em um exemplo, a transplantação de órgão é uma transplantação de pulmão. Em um exemplo, a transplantação de órgão é uma transplantação de estômago. Em um exemplo, a transplantação de órgão é uma transplantação de intestino. Em um exemplo, a transplantação de órgão é uma transplantação de testículo.

[025] Ainda em um exemplo adicional, a transplantação de órgão é uma transplantação de pele, por exemplo, uma transplantação de pele de total espessura.

[026] Em um exemplo, a lesão por isquemia-reperífusão é devido ou está associada a uma transplantação de tecido. Em um exemplo, a transplantação de tecido é uma transplantação de vaso sanguíneo. Em um exemplo, a transplantação de tecido é uma transplantação de pele, por exemplo, pele vascularizada. Em um exemplo, a transplantação de tecido [é uma transplantação de ilhotas pancreáticas. Em um exemplo, a transplantação de tecido é uma transplantação de córnea. Em um exemplo, a transplantação de tecido é uma transplantação musculoesquelética.

[027] Quando a lesão por isquemia-reperfusão é devido ou está associada à transplantação (por exemplo, transplantação de órgão), o composto que inibe sinalização de G-CSF pode administrado antes, durante e/ou após a transplantação. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao indivíduo, em que o indivíduo é um receptor da transplantação de tecido ou de órgão. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a um doador de transplantação de tecido ou de órgão.

[028] Em alguns exemplos, o doador de transplantação de tecido ou de órgão é um doador vivo. Em alguns exemplos, o doador de transplantação de tecido ou de órgão é um doador falecido. Em alguns exemplos, o doador de transplantação de tecido ou de órgão é um doador para doação após morte encefálica (DBD) . Em alguns exemplos, o doador de transplantação de tecido ou de órgão é um doador para doação após morte circulatória (DCD). Em alguns exemplos, o doador de transplantação de tecido ou de órgão é um doador com critérios expandidos (ECD). Em alguns exemplos, o doador de transplantação de tecido ou de órgão é um doador com critérios padrão (SCD).

[029] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a um órgão obtido ex vivo, antes da transplantação de órgão. Por exemplo, o órgão obtido pode ser perfurado ou infundido com uma solução que compreende o composto que inibe sinalização de G-CSF antes da transplantação.

[030] A presente revelação também fornece um método de transplantação de tecido ou de órgão ou para aprimorar resultado de uma transplantação de tecido ou de órgão ou para aprimorar a função de um tecido ou órgão transplantado ou para prevenir função atrasada do enxerto, sendo que o método compreende administrar um composto que inibe sinalização de G-CSF a um tecido ou órgão obtido ex vivo e transplantar o tecido ou órgão obtido para um receptor de transplante de tecido ou órgão.

[031] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao doador de transplantação de órgão e/ou ao recipiente da transplantação de órgão e/ou o órgão obtido. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao doador de transplantação de órgão e ao recipiente da transplantação de órgão. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao doador de transplantação de órgão e ao órgão obtido. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao receptor da transplantação de órgão e ao órgão obtido.

[032] Em um exemplo da revelação, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado antes da reperfusão, por exemplo, no caso de um transplante (por exemplo, transplante de órgão), sendo que o composto que inibe sinalização de G- CSF é administrado a um receptor de transplante de órgão antes da reperfusão do órgão transplantado (por exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado antes da transplantação ou durante a transplantação, porém antes da reperfusão, por exemplo, antes de os grampos que limitam o fluxo de sangue serem liberados).

[033] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado antes da isquemia. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre O dia (por exemplo, imediatamente antes ou da isquemia ou da reperfusão) a 7 dias antes da isquemia ou reperfusão. Por exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre O dia e 6 dias ou 5 dias ou 4 dias antes da reperfusão ou isquemia. Por exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre O e 72 horas antes da reperfusão ou isquemia. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre 6 e 48 horas antes da reperfusão ou isquemia. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre 12 e 36 horas antes da reperfusão ou isquemia. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado cerca de 24 horas antes da reperfusão ou isquemia.

[034] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado pelo menos 1 hora antes da reperfusão ou isquemia (e até 7 dias antes da reperfusão ou isquemia). Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado pelo menos 2 ou pelo menos 4 ou pelo menos 6 ou pelo menos 8 ou pelo menos 10 ou pelo menos 12 horas ou pelo menos 14 horas ou pelo menos 16 horas ou pelo menos 18 horas ou pelo menos 20 horas ou pelo menos 22 horas ou pelo menos 24 horas antes da reperífusão ou isquemia. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado pelo menos 24 horas antes da reperfusão ou isquemia.

[035] Em se tratando do tempo de administração de um composto no presente documento, a discussão deve se referir a múltiplas administrações do composto. Por exemplo, quando é declarado que um composto é administrado entre O dia e 7 dias antes da isquemia ou reperfusão, a presente revelação abrange múltiplas administrações do composto (por exemplo, 2 ou 3 ou 4 ou 5 etc.) entre O dia e 7 dias antes da isquemia ou reperfusão.

[036] Adicionalmente, no caso de um transplante, o composto pode ser administrado múltiplas vezes após a transplantação.

[037] Em se tratando do tempo de administração de um composto no presente documento, a revelação também abrange uma única administração do composto.

[038] Ficará evidente para a pessoa versada na técnica a partir do supracitado que a presente revelação fornece um método de transplantação (por exemplo, transplantação de órgão) ou para aprimorar o resultado da transplantação (por exemplo, transplantação de órgão) ou aprimorar a função de um transplante (por exemplo, um órgão transplantado) ou para prevenir função atrasada do enxerto, sendo que o método compreende administrar um composto que inibe sinalização de G-CSF a um doador de transplante antes da coleta de um tecido ou de um órgão; coletar o transplante (por exemplo, tecido/órgão) e transplantar o tecido ou órgão para um receptor de transplante de órgão.

[039] A presente revelação também fornece um método para preparar um tecido ou órgão para transplante de um doador de tecido ou de órgão para aprimorar função de tecido ou de órgão em um receptor de transplante de tecido ou órgão, sendo que o método compreende administrar ao doador de tecido ou de órgão um composto que inibe sinalização de G-CSF antes da coleta do tecido ou órgão.

[040] A presente revelação fornece adicionalmente um método para prevenir a rejeição tecido ou de órgão transplantado, sendo que o método compreende administrar a um doador de tecido ou de órgão um composto que inibe sinalização de G-CSF antes da coleta do tecido ou órgão, coletar o tecido ou órgão e transplantar o tecido ou órgão em um receptor de transplante de tecido ou órgão.

[041] Em alguns exemplos, o método compreende adicionalmente administrar o composto que inibe sinalização de G-CSF ao receptor do transplante. Por exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao receptor do transplante antes do transplante ou no momento, ou próximo, de transplantar o tecido ou órgão. Em outro exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao receptor do transplante durante transplantação de tecido ou de órgão cirurgia.

[042] A presente revelação também fornece um método de transplantação de órgão ou para aprimorar resultado de uma transplantação de tecido ou de órgão ou aprimorar a função de um tecido ou órgão transplantado ou para prevenir função atrasada do enxerto, sendo que o método compreende administrar um composto que inibe sinalização de G-CSF a um receptor do transplante antes de transplantar o tecido ou órgão e, em seguida, transplantar o órgão para o receptor do transplante.

[043] Em um exemplo, o doador de transplante de órgão com morte encefálica. Por exemplo, o doador de órgão está vivo e sobre suporte vital, porém sofreu morte encefálica. os doadores adicionais são descritos no presente documento e são aplicados a esse exemplo da revelação.

[044] No caso da administração a um doador de órgão, o composto que inibe sinalização de G-CSF pode ser administrado antes de o órgão ser coletado, por exemplo, entre 0 e 72 horas antes da coleta do órgão. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre 6 e 48 horas antes da coleta do órgão. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre 12 e 36 horas antes da coleta do órgão. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado cerca de 24 horas antes da coleta do órgão.

[045] No caso de administração a um doador com morte encefálica, o composto que inibe sinalização de G-CSF pode ser administrado em um período entre a morte encefálica e coleta do órgão. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF pode ser administrado dentro de 48 horas a partir da declaração da morte, por exemplo, dentro de 24 horas ou 12 horas ou 6 horas da declaração de morte encefálica.

[046] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado como uma dose única.

[047] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em várias doses. Por exemplo, o composto é administrado a um receptor do transplante antes da transplantação ou durante a transplantação e, em seguida, uma ou mais doses são administradas ao receptor após a transplantação. Em outro exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a um doador de transplante ou a um tecido ou órgão doado e, em seguida, uma ou mais doses adicionais são administradas a um receptor do transplante após a transplantação.

[048] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose entre cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, tal como entre cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, por exemplo, entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, por exemplo, entre cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 1 mg/kg. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose entre cerca de 0,4 mg/kg a cerca de 0,5 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,1 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,2 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,3 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,4 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,5 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,6 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,7 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,8 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 1 mg/kg. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose entre cerca de 2mg/kg a cerca de 8mg/kg. Em um exemplo, oO composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose entre cerca de 4 mg/kg a cerca de 6 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 5 mg/kg.

[049] Em alguns exemplos, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade que causa neutropenia. Por exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade que causa neutropenia transitória, por exemplo, por m período inferior a uma semana ou inferior a 5 dias ou inferior a 3 dias ou inferior a 1 dia.

[050] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade que não causa neutropenia.

[051] Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir inflamação. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir danos oxidativos.

[052] Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para ter um ou mais dentre os seguintes efeitos:

[053] (i) reduzir ou prevenir infiltração de neutrófilos, por exemplo, em um órgão transplantado no caso de uma transplantação de órgão; e

[054] (ii) reduzir ou prevenir infiltração de macrófagos, por exemplo, em um órgão transplantado no caso de uma transplantação de órgão.

[055] Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir infiltração de neutrófilos. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir infiltração de macrófagos. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou inibir expressão do receptor de interleucina 8 beta (IL-8RB). Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou inibir expressão da proteína de quimioatração de monócitos 1 (MCP-1).

[056] Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para ter um ou mais dentre os seguintes efeitos:

[057] (1) reduzir ou prevenir um aumento em níveis de creatinina sérica ou plasmática; e

[058] (ii) reduzir ou prevenir um aumento em níveis de ureia sérica ou plasmática.

[059] Os níveis de creatinina sérica ou plasmática e níveis de ureia sérica ou plasmática são medidas da função renal e são úteis na avaliação da função atrasada do enxerto, por exemplo, no caso de uma transplantação de rim, conforme descrito no presente documento.

[060] Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir um aumento nos níveis de creatinina sérica ou plasmática. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir um aumento nos níveis de creatinina sérica ou plasmática.

[061] Os níveis aumentados de albumina e/ou sangue na urina também podem indicar função renal prejudicada ou danos ao rim. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G- CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir um aumento nos níveis de albumina de urina. Em um exemplo, a composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir Ou prevenir um aumento nos níveis de sangue na urina do indivíduo.

[062] Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou inibir expressão de um ou mais dentre os seguinte, por exemplo, por células do órgão transplantado no caso de uma transplantação de órgão:

[063] (i) molécula de lesão ao rim 1 (KIM-1);

[064] (ii) lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL);

[065] (iii) interleucina 1 beta (IL-16);

[066] (iv) interleucina 6 (IL-6);

[067] (v) fator de necrose tumoral alfa (TNFao);

[068] (vi) receptor do componente 5a do complemento 1 (C5AR1L);

[069] (vii) proteína inflamatória de macrófagos 2-alfa (MIP2-alfa);

[070] (viii) Molécula de Adesão Intercelular 1 (ICAM-1);

[071] (ix) E-selectina;

[072] (x) ligante 1 de quimiocina com motivo C-X-C (CXCL1);

[073] (xi) receptor de interleucina 8 beta (IL-S8R$B); e

[074] (xii) proteína de quimioatração de monócitos 1 (MCP-1).

[075] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir ativação de C5 de complemento.

[076] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir deposição de C5b-9, por exemplo, na superfície de células do órgão transplantado no caso de uma transplantação de órgão.

[077] Os métodos para avaliar cada um dentre os supracitados são conhecidos na técnica e/ou descritos no presente documento. Além disso, uma pessoa versada na técnica observará que o termo “reduzir” é usado no presente documento para se referir a uma quantidade inferior de qualquer um dos itens listados acima, em relação ou à quantidade no indivíduo antes da administração do composto que inibe sinalização de G-CSF ou em relação à quantidade em um indivíduo de controle correspondente.

[078] Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em combinação com outro composto. Em alguns exemplos, o outro composto é sulfeto de hidrogênio. Em alguns exemplos, o outro composto é um composto anti- inflamatório e/ou inibe ou reduz especificamente a expressão ou atividade de uma ou mais dentre os moléculas listadas em (i) a (x) acima. Em alguns exemplos, o outro composto é um imunossupressor, por exemplo, ciclosporina. os imunossupressores adequados serão conhecidos na técnica e incluem aqueles descritos em James & Mannon, Curr Transplant

Rep (2015), que é incorporado no presente documento a título de referência. Alternativa ou adicionalmente, o outo composto é um corticosteroide, tal como prednisona e/ou prednisolona. Alternativa ou adicionalmente, o outro composto é metotrexato. Alternativa ou adicionalmente, o outro composto é ciclofosfamida. Alternativa ou adicionalmente, o outro composto é micofenolato de mofetila. Em alguns exemplos, o outro composto é TRO40303, conforme descrito em Le Lamer et al., JIJ Transl Med (2014). Em alguns exemplos, o outro composto é superóxido dismutase. Em alguns exemplos, o outro composto é metformina. Em alguns exemplos, o outro composto é um canabinoide ou um análogo sintético do mesmo. Em alguns exemplos, o outro composto é um que é usado normalmente em cirurgia de transplantação.

[079] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em combinação com uma célula. Em alguns exemplos, a célula é uma célula-tronco, tal como uma célula-tronco mesenquimal.

[080] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em combinação com uma terapia de genes.

[081] Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado simultaneamente com o outro composto. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado antes do outro composto. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado após o outro composto.

[082] Em um exemplo, tanto o composto que inibe sinalização de G-CSF quanto o outro composto são administrados a um receptor de transplante de órgão. Outros compostos adequados são descritos acima.

[083] Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a um doador de transplante de órgão antes da coleta de um órgão para transplante e o outro composto é administrado ao receptor de transplante de órgão, opcionalmente em combinação com o composto que inibe sinalização de G-CSF. Outros compostos adequados são descritos acima.

[084] Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF se liga ao receptor de G-CSF ou G-CSF (G-CSFR). Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF se liga ao G-CSF. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF se liga ao receptor de G-CSF (G-CSFR).

[085] Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é uma proteína.

[086] Em um exemplo o composto que inibe sinalização de G-CSF é uma proteína que compreende uma região variável de anticorpo que se lia ou se liga especificamente ao G-CSFR e neutraliza a sinalização de G-CSF. No presente documento, a referência a uma proteína ou anticorpo que “se liga a” G-CSFR fornece apoio literal para uma proteína ou anticorpo que “se liga especificamente a” G-CSFR.

[087] Em um exemplo o composto que inibe sinalização de G-CSF é uma proteína que compreende uma região variável de anticorpo que se lia ou se liga especificamente ao G-CSF e neutraliza a sinalização de G-CSF. No presente documento, a referência a uma proteína ou anticorpo que “se liga a” G-CSF fornece apoio literal para uma proteína ou anticorpo que “se liga especificamente a” G-CSF.

[088] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é uma proteína que compreende um Fv. Em alguns exemplos, a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em:

[089] (i) um fragmento Fv de cadeia única (scFv);

[090] (ii) um scFv dimérico (di-scFv); ou

[091] (iv) um dia-anticorpo;

[092] (v) um tria-anticorpo;

[093] (vi) um tetra-anticorpo;

[094] (vii) um Fab;

[095] (viii) um F(ab')>2;

[096] (ix) um Ev;

[097] (x) um dentre (i) a (ix) ligado a uma região constante de um anticorpo, Fc ou um domínio constante de cadeia pesada (Cx) 2 e/ou Cr3;

[098] (xi) um dentre (i) a (ix) ligado à albumina, fragmentos funcionais ou variantes dos mesmos ou uma proteína (por exemplo, anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo) que se liga à albumina; ou

[099] (xii) um anticorpo.

[100] Em um exemplo, a proteína é um anticorpo. Em um exemplo, o anticorpo é um anticorpo nu. Os anticorpos exemplificativos são descritos no documento nº WO2012171057, que é incorporado no presente documento a título de referência.

[101] Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que se liga ao hG-CSFR expresso na superfície de uma célula com uma afinidade de pelo menos cerca de 5 nM. Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que se liga ao hG-CSFR expresso na superfície de uma célula com uma afinidade de pelo menos cerca de 4 nM. Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que se liga ao hG-CSFR expresso na superfície de uma célula com uma afinidade de pelo menos cerca de 3 nM. Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que se liga ao hG-CSFR expresso na superfície de uma célula com uma afinidade de pelo menos cerca de 2 nM. Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que se liga ao hG-CSFR expresso na superfície de uma célula com uma afinidade de pelo menos cerca de 1 nM.

[102] Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que inibe a proliferação induzida por G-CSF de uma célula BaF3 que expressa o hG-CSFR com uma IC50 de pelo menos cerca de 5 nM. Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que inibe a proliferação induzida por G-CSF de uma célula BaF3 que expressa o hG-CSFR com uma IC50 de pelo menos cerca de 4 nM. Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que inibe a proliferação induzida por G-CSF de uma célula BaF3 que expressa o hG-CSFR com uma IC50 de pelo menos cerca de 3 nM. Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que inibe a proliferação induzida por G-CSF de uma célula BaF3 que expressa o hG-CSFR com uma IC50 de pelo menos cerca de 2 nM. Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que inibe a proliferação induzida por G-CSF de uma célula BaF3 que expressa o hG-CSFR com uma IC50 de pelo menos cerca de 1 nM. Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que inibe a proliferação induzida por G-CSF de uma célula BaF3 que expressa o hG-CSFR com uma IC50 de pelo menos cerca de 0,5 nM.

[103] Em um exemplo, a proteína é quimérica desimunizada, humanizada, humana ou primatizada. Em um exemplo, a proteína ou anticorpo é humana.

[104] Em um exemplo, a proteína compreende uma região variável de anticorpo que inibe competitivamente a ligação do anticorpo Cl1.2G que compreende uma região variável de cadeia pesada (Vn) que compreende uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve (V1L) que compreende uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 5 a G- CSFR.

[105] Em um exemplo, a proteína que se liga a um epítopo que compreende resíduos dentro de uma ou duas ou três ou quatro regiões selecionadas a partir de 111 a 115, 170 a 176, 218 a 234 e/ou 286-300 da SEQ ID NO: 1.

[106] Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos apresenta na SEQ ID NO: 5.

[107] Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que compreende uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3.

[108] Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que compreende uma VH que compreende três CDRs de uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 e uma VL que compreende três CDRs de uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5.

[109] Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que compreende uma VH que compreende três CDRs de uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e uma VL que compreende três CDRs de uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3.

[110] Em um exemplo, a proteína é um anticorpo que compreende:

[111] (i) uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14 ou 18 e uma cadeia leve que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15; ou

[112] (ii) uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 14 e uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 18 e duas cadeias leves que compreendem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15. Legenda da listagem de sequências

[113] SEQ ID NO: 1 - aminoácidos 25 a 335 de G-CSFR de Homo sapiens (hG-CSFR) com uma tag de poli-histidina C- terminal

[114] SEQ ID NO: 2 - Vx de C1.2

[115] SEQ ID NO: 3 - V1 de Cl1.2

[116] SEQ ID NO: 4 - Vx de C1.2G

[117] SEQ ID NO: 5 - V1 de C1.2G

[118] SEQ ID NO: 6 - HCDR1 de C1.2

[119] SEQ ID NO: 7 - HCDR2 de Cl.2

[120] SEQ ID NO: 8 - HCDR3 de Cl.2

[121] SEQ ID NO: 9 - LCDR1 de Cl.2

[122] SEQ ID NO: 10 - LCDR2 de C1.2

[123] SEQ ID NO: 11 - LCDR3 de C1.2

[124] SEQ ID NO: 12 - sequência consenso de HCDR3 de C1l.2

[125] SEQ ID NO: 13 - sequência consenso de LCDR3 de Cl.2

[126] SEQ ID NO: 14 - Cadeia pesada de Cl.2G com região constante de IgG4 estabilizada

[127] SEQ ID NO: 15 - Cadeia leve de Cl.2G com região constante de kappa

[128] SEQ ID NO: 16 - sequência de h-G-CSFR exemplificativo

[129] SEQ ID NO: 17 - polipeptídeo que compreende domínios de Ig e CRH de Macaca fascicularis G-CSFR (cinoG- CSFR) com uma tag de poli-histidina C-terminal

[130] SEQ ID NO: 18 - Cadeia pesada de Cl.2G com região constante de IgG4 estabilizada e que carece de lisina C- terminal. Breve descrição dos desenhos

[131] A Figura l é uma representação gráfica de concentrações de creatinina sérica 24 horas após a reperfusão no modelo de lesão por isquemia-reperfífusão renal quente. O tratamento de camundongos com 100 ug do anticorpo anti-G-CSFR VR81 reduziu significativamente as concentrações de creatinina sérica em comparação ao tratamento de camundongos com 100 pg de um anticorpo de controle de isótipo. ANOVA unidirecional (com correção de Bonferroni), *p<0,05, ***p<0,005 (n = 8 camundongos por grupo). Os resultados representam dois experimentos independentes - consultar, também, a Figura 7.

[132] A Figura 2 é uma representação gráfica de concentrações de ureia plasmática 24 horas após reperfusão no modelo de lesão por isquemia-reperfusão renal quente. O tratamento de camundongos com 100 ug do anticorpo anti-G-CSFR VR81 reduziu significativamente as concentrações de ureia plasmática em comparação ao tratamento de camundongos com 100 vg de um anticorpo de controle de isótipo. Teste T não pareado *p<0,05 (n = 8 camundongos por grupo). Os resultados representam dois experimentos independentes - consultar, também, a Figura 8.

[133] A Figura 3 é uma representação gráfica da contagem de neutrófilos a cada campo de grande aumento (HPF) no tecido renal. O tratamento de camundongos com 100 ug do anticorpo anti-G-CSFR VR81 reduziu significativamente a infiltração de neutrófilos renais no modelo de IRI renal quente em comparação à infiltração de neutrófilos vista em camundongos tratados com 100 ug de um anticorpo de controle de isótipo, conforme avaliado 24 horas após a reperfusão. ANOVA unidirecional (com correção de Bonferroni), p<0,05, **p<0,01, ***p<0,005 (n=5a6 camundongos por grupo).

[134] A Figura 4 é uma representação gráfica da contagem de macrófagos a cada campo de grande aumento (HPF) no tecido renal. O tratamento de camundongos com 100 upg do anticorpo anti-G-CSFR VR81 reduziu significativamente a infiltração de macrófagos renais no modelo de IRI renal quente em comparação à infiltração de macrófagos vista em camundongos tratados com 100 ug de um anticorpo de controle de isótipo, conforme avaliado 24 horas após a reperfusão. ANOVA unidirecional (com correção de Bonferroni), *p<0,05, **p<0,01l (n = 5 a 6 camundongos por grupo).

[135] A Figura 5 é uma representação gráfica de contagem de (A) neutrófilos e de (B) macrófagos a cada campo de grande aumento (HPF) no tecido renal. . O tratamento de camundongos com 500 no do anticorpo anti-G-CSFR VR81 reduziu significativamente neutrófilo e macrófago renal infiltração no modelo de IRI renal quente em comparação à infiltração de neutrófilos observada nos camundongos tratados com 500 ug de um anticorpo de controle de isótipo, conforme avaliado 24 horas após a reperfusão. ANOVA unidirecional (com correção de Bonferroni), ****p<0,0001 (n = 5 a 6 camundongos por grupo).

[136] A Figura 6 é uma representação gráfica de lesão tubular renal no modelo de IRI quente, conforme determinado pelo grau de necrose tubular observado no córtex renal dos camundongos tratados (sham; 100 ug do anticorpo anti-G-CSFR VR81; 100 ug de um anticorpo de controle de isótipo). A necrose foi avaliada por uma método semiquantitativo (Lu B et al. Nephrology 2008) com o uso de microscopia de fluorescência. O grau de necrose tubular foi classificado e um sistema de pontuação modificado foi usado (consultar a Tabela 3). O teste de Kruskal-Wallis e ANOVA unidirecional, teste de comparações múltiplas de Dunn, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,005 (n = 8 camundongos por grupo diferentes de sham em que n=3).

[137] A Figura 7 é uma representação gráfica da expressão KIM-1, NGAL, IL-6, IL-8REB/CXCR2, MCP-1/CCL2, CXCLl1, MIP- 2/CXCL2, ICAM-1 e C5aR mRNA em tecido renal no modelo de IRI renal quente conforme avaliado por qaRT-PCR. O tratamento com VR81 a uma dosagem de 500 ug/camundongo reduziu significativamente a expressão de (A) KIM-1, NGAL, IL-6, IL- 8RB/CXCR2, MCP-1/CCL2, CXCLl, e (B) MIP-2/CXCL2, ICAM-l e C5aR em comparação ao tratamento com o anticorpo de controle de isótipo. Teste de Kruskal-Wallis e ANOVA unidirecional, teste de Comparações Múltiplas de Dunn para VR81 vs. controle de Ab (* p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,005).

[138] A Figura 8 é uma representação gráfica da porcentagem de frequência dos neutrófilos (CDllb*Grl*!) no modelo de IRI renal quente conforme avaliado por citometria de fluxo em (A) rim e (B) sangue periférico dos camundongos tratados com 100 ug do anticorpo anti-G-CSFR VR81 ou 100 ug de um anticorpo anti-C5 (BB5.1) em comparação aos camundongos tratados com 100 ug de um anticorpo de controle de isótipo e camundongos sham. Os níveis significativamente inferiores de neutrófilos (CDl1b*Grl1*) foram observados nos rins dos camundongos sham e camundongos tratados com VR81 ou BB5.1 em comparação aos níveis observados nos camundongos tratados com um anticorpo de controle de isótipo. As populações de neutrófilos no sangue foram semelhantes em todos os grupos não afetados pelos tratamentos. Teste de Kruskal-Wallis e ANOVA unidirecional, teste de comparações múltiplas de Dunn, *p<0,05, *p<0,05, **p<0,01 (n = 7 a 8 camundongos por grupo diferentes de sham em que n=4).

[139] A Figura 9 é uma representação gráfica de concentrações de creatinina sérica no modelo de IRI renal quente. O tratamento dom 100 ug do anticorpo anti-G-CSFR VR81 ou 100 ng do anticorpo anti-C5 BB5.1 reduziu significativamente as concentrações de creatinina em comparação ao tratamento dos camundongos com 100 ug de um anticorpo de controle de isótipo. As reduções observadas com o VR81 e com BB5.1 não foram significativamente diferentes. Teste de Kruskal-Wallis e ANOVA unidirecional, Teste de Comparações Múltiplas de Dunn, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,005 (n = 7 a 8 camundongos por grupo).

[140] A Figura 10 é uma representação gráfica das concentrações de ureia plasmática no modelo de IRI renal quente. O tratamento dom 100 ug do anticorpo anti-G-CSFR VR81 ou 100 ng do anticorpo anti-C5 BB5.1 reduziu significativamente as concentrações de ureia plasmática em comparação ao tratamento dos camundongos com 100 pg de um anticorpo de controle de isótipo. As reduções observadas com o VR81 e com BB5.1 não foram significativamente diferentes. Teste de Kruskal-Wallis e ANOVA unidirecional, Teste de Comparações Múltiplas de Dunn, *p<0,05, **p<0,01 (n = 7 aB8 camundongos por grupo).

[141] A Figura 11 é uma representação gráfica das concentrações de ureia sérica no modelo de IRI renal quente. O tratamento de camundongos com 500 pg do anticorpo anti-G- CSFR VR81 reduziu significativamente as concentrações de ureia sérica em comparação ao tratamento de camundongos com 500 ug de um anticorpo de controle de isótipo. Teste de Kruskal-Wallis e ANOVA unidirecional, Teste de Comparações Múltiplas de Dunn, *p<0,05, **p<0,01 (n = 6 a 8 camundongos por grupo).

[142] A Figura 12 é uma representação gráfica de concentrações de creatinina sérica no modelo de IRI renal quente (média SEM). O tratamento de camundongos com 500 ug do anticorpo anti-G-CSFR VR81 reduziu significativamente as concentrações de creatinina sérica em comparação ao tratamento de camundongos com 500 pg de um anticorpo de controle de isótipo. Teste de Kruskal-Wallis e ANOVA unidirecional, Teste de Comparações Múltiplas de Dunn, *p<0,05, (n = 6 a 8 camundongos por grupo).

[143] A Figura 13 é uma representação gráfica da porcentagem da frequência de neutrófilos (CDllb'Grl1*Ly6G*) no (A) sangue e no (B) rim no modelo de IRI renal quente. O tratamento com 200 ug/camundongo e 500 ug/camundongo do anticorpo anti-G-CSFR VR8l reduziu significativamente a frequência de neutrófilos no rim em comparação ao tratamento com 500 ug/camundongo de um anticorpo de controle de isótipo. Situação: ANOVA unidirecional (com correção de Bonferroni), *p<0,05, **p<0,01 (n = 6 a 7 camundongos por grupo).

[144] A Figura l14 é uma representação gráfica de deposição de C5a plasmático (A) e de C5b-9 renal (B).

[145] A Figura 15 é uma representação gráfica da frequência de Neutrófilos (CDllbt+Grl1+Ly6G+) no sangue e no rim no modelo de IRI renal quente. O tratamento com 500 u1ug/camundongo do anticorpo anti-G-CSFR VR81 1 h antes da isquemia reduziu significativamente a frequência dos neutrófilos no rim em comparação ao tratamento com um anticorpo de controle de isótipo. O tratamento com 500 ug/camundongo do anticorpo de controle BB5.1 não reduziu significativamente a frequência dos neutrófilos no rim em comparação ao tratamento com um anticorpo de controle de isótipo. Situação: Teste de Kruskal-Wallis e ANOVA unidirecional, Teste de Comparações Múltiplas de Dunn, *p<0,05, **p<0,01 (n = 5 a8 camundongos por grupo). Descrição detalhada Geral

[146] Ao longo do presente relatório descritivo, salvo quando declarado especificamente de outro modo ou quando o contexto ditar de outro modo, a referência a uma única etapa, composição de matéria, grupo de etapas ou grupo de composições de matéria devem ser consideradas como abrangentes de uma e de uma pluralidade (isto é, um ou mais dessas etapas, composições de matéria, grupos de etapas ou grupos de composições de matéria.

[147] As pessoas versadas na técnica observarão que a presente revelação é suscetível a variações e modificações diferentes das descritas especificamente. Deve-se entender que a revelação inclui todas essas variações e modificações. A revelação também inclui todas as etapas, recursos, composições e compostos denominados ou indicados no presente relatório descritivo, individual ou coletivamente e qualquer e todas as combinações ou qualquer duas ou mais dentre as ditas etapas ou recursos.

[148] A presente revelação não deve ter o escopo limitado pelos exemplos específicos descritos no presente documento que servem apenas a título de exemplo. Produtos, composições e métodos funcionalmente equivalentes são claramente abrangidos pelo escopo da presente revelação.

[149] Qualquer exemplo da presente revelação no presente documento pode ser considerado como aplicável mutatis mutandis a qualquer outro exemplo da revelação, salvo quando especificamente de outro modo.

[150] Salvo quando definido especificamente de outro modo, todos os termos técnicas e científicos usados no presente documento devem ser considerados como tendo o mesmo significado conforme entendido comumente por uma pessoa de habilidade comum na técnica (por exemplo, em cultura celular, genética molecular, imunologia, imuno-histoquímica, química de proteína e bioquímica).

[151] Salvo quando indicado de outro modo, a proteína recombinante, cultura celular e técnica imunológicas utilizadas na presente revelação são procedimentos padrão, bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Tais técnicas são descritas e explicadas por toda a literatura em fontes, tais como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular

Cloning, John Wiley e Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 e 2, IRL Press (1991), D.M. Glover e B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1 a 4, IRL Press (1995 e 1996) e F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates e MWiley- Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o presente), Ed Harlow e David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), e J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até presente data).

[152] A descrição e definições de regiões variáveis e partes dos mesmos, imunoglobulinas, anticorpos e fragmentos dos mesmos no presente documento podem ser esclarecidos adicionalmente pela discussão em Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 e 1991, Bork et al., J Mol. Biol. 242 309 a 320, 1994, Chothia e Lesk J. Mol Biol. 196:901 a 917 1987, Chothia et al. Nature 342, 877 a 883, 1989 e/ou Al- Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927 a 948, 1997.

[153] O termo “e/ou”, por exemplo, “X e/ou Y” deve ser entendido como significativo de ou “X e Y" ou “X ou Y”" e deve ser considerado apoio explícito para ambos os significados ou para qualquer um dos significados.

[154] Ao longo do presente relatório descritivo, a palavra “compreende” ou variações tais como “compreender” ou “que compreende” serão entendidas como implicativas da invenção de um elemento, número inteiro ou etapa declarada, ou grupo de elementos, número inteiros ou etapas, porém não como excludentes de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa ou grupo de elementos, número inteiros ou etapas.

[155] Conforme usado no presente documento o termo "derivado de" deve ser considerado como indicativo de que um número inteiro especificado pode ser obtido a de uma fonte particular embora não necessariamente diretamente dessa fonte. Definições selecionadas

[156] Um “composto”, conforme contemplado pela presente revelação, pode assumir várias formas incluindo compostos naturais, compostos químicos de molécula pequena ou compostos ou macromoléculas biológicas. Os compostos exemplificativos incluem um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, um ácido nucleico, um polipeptídeo, um peptídeo e uma molécula pequena.

[157] A referência no presente documento a “fator estimulador de colônia de granulócitos” (G-CSF) inclui formas nativas de G-CSF, formas mutantes do mesmo, por exemplo, filgrastim e formas peguiladas de G-CSF ou filgrastim. Esse termo também abrange formas mutantes de do G-CSF que retém atividade para se ligar ao G-CSFR (por exemplo, G-CSFR humano) e induzir sinalização.

[158] O G-CSF é um regulador principal da produção de granulócito. O G-CSF é produzido por células estromais da medula óssea, células endoteliais, macrófagos e fibroblastos e a produção é induzida por estímulos inflamatórios. O G-CSF atua por meio do receptor de G-CSF (G-CSFR), que é expresso em progenitores mieloides precoces, neutrófilos maduros,

monócitos/macrófagos, T e B linfócitos e células endoteliais.

[159] A título de nomenclatura apenas e não de limitação, uma sequência exemplificativa de um G-CSFR humano é definida na Sequência de Referência NCBI: NP 000751.1 (e apresentada na SEQ ID NO: 16). A sequência de G-CSFR de outras espécies pode ser determinada com o uso de sequências fornecidas no presente documento e/ou em bancos de dados disponíveis publicamente e/ou determinados com o uso de técnicas padrão (por exemplo, conforme descrito em Ausubel et al., (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates e Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até presente data) ou Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) A referência a G-CSFR humano pode ser abreviada como hG-CSFR, e a referência a G-CSFR de macaco cinomolgo pode ser abreviada como cinoG-CSFR. A referência a G-CSFR solúvel se refere a polipeptídeos que compreendem a região de ligação de ligante de G-CSFR. Os domínios de Ig e CRH do G-CSFR estão envolvidos na ligação do ligante e dimerização do receptor (Layton et al., J. Biol Chem., 272:

29.735 a 29.741, 1997 e Fukunaga et al, EMBO J. 10: 2.855 a

2.865, 1991). As formas solúveis de G-CSFR que compreendem essas porções do receptor foram usadas em vários estudos do receptor, e a mutação de cisteínas livres nas posições 78, 163 e 228 do receptor auxilia na expressão e isolamento do polipeptídeo de receptor solúvel (Mine et al., Biochem., 43:

2.458 a 2.464 2004) sem afetar a ligação do ligante.

[160] Conforme usado no presente documento, o termo “lesão por isquemia-reperfífusão” se refere aos danos no tecido ou no órgão causados quando o fornecimento de sangue retorna para o tecido ou órgão após um período de isquemia ou falta de oxigênio (anóxia ou hipóxia). A ausência de oxigênio e nutrientes do sangue durante o período isquêmico cria uma condição na qual a restauração de circulação resulta na inflamação e em danos oxidativos através da invenção de estresse oxidativo em vez da restauração da função normal. A lesão por isquemia-reperfusão (IRI) também é conhecida como “lesão por reperfusão”, “injúria por reperfusão” e “injúria por reoxigenação”. Conforme usado no presente documento, “lesão por isquemia-reperfusão” inclui tanto lesão por isquemia-reperfusão .—* quente quanto lesão por isquemia- reperfusão fria.

[161] Conforme usado no presente documento, o termo “isquemia” (também conhecido como “isquemia”) se refere a uma restrição no fornecimento de sangue aos tecidos, causando um uma escassez de oxigênio e glicose necessária para oO metabolismo celular causando também um acúmulo e remoção reduzida de resíduo metabólico.

[162] O termo "reperfusão", conforme usado no presente documento, se refere à restauração do fluxo de sangue ou oxigênio ao tecido.

[163] Conforme usado no presente documento, o termo “afecção” se refere a um rompimento ou interferência da função normal, e isso não se limita a qualquer afecção específica e inclui doenças ou distúrbios.

[164] Conforme usado no presente documento, os termos “prevenir”, “previne” ou “prevenção” incluem administrar um composto da revelação para, então, interromper ou retardar, pelo menos parcialmente, o desenvolvimento pelo menos um sintoma de uma afecção. Esse termo também abrange tratamento de um indivíduo na remissão para prevenir ou retardar o relapso.

[165] Conforme usado no presente documento, os termos “tratar”, “trata” ou “tratamento” incluem administrar um composto descrito no presente documento para, então, reduzir ou eliminar pelo menos um sintoma de uma doença ou afecção especificada.

[166] Conforme usado no presente documento, o termo “neutropenia” é usado para se referir a uma contagem absoluta de neutrófilos (ANC) abaixo do limite inferior da faixa normal, por exemplo, uma ANC inferior a 2.000 células/pl de sangue ou inferior a 1.500 células/pl de sangue ou inferior a

1.000 células/nl de sangue, por exemplo, inferior a 500 células/nul de sangue (consultar Sibille et al. 2010 Br J Clin Pharmacol 70(5): 736 a 748). Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade que não causa neutropenia grave. Conforme usado no presente documento, o termo “neutropenia grave” é usado para se referir a uma contagem absoluta de neutrófilos (ANC) inferior a 1.000 células/pl de sangue.

[167] Conforme usado no presente documento, o termo “indivíduo” deve ser considerado como significando qualquer animal, incluindo seres humanos, por exemplo, um mamífero. Os indivíduos exemplificativos incluem, porém sem limitação, seres humanos e primatas não humanos. Por exemplo, o indivíduo é um ser humano.

[168] Ficará evidente para a pessoa versadas na técnica a partir do parágrafo supracitado que um doador (por exemplo um doador de órgão) ou um recipiente (por exemplo, um recipiente de órgão) inclui mamíferos, por exemplo, seres humanos.

[169] O termo “proteína” deve ser considerado como inclusivo de uma única cadeia de polipeptídeos, isto é, uma série de aminoácidos contíguos ligados por ligações de peptídeo ou uma série de cadeias de polipeptídeos ligadas de maneira covalente ou não covalente entre si (isto é, um complexo de polipeptídeos). Por exemplo, a série de cadeias de polipeptídeo podem ser ligadas de maneira covalente com o uso de um produto químico adequado ou uma ligação química ou ligação de dissulfeto adequada. Os exemplos de ligações não covalentes incluem ligações de hidrogênio, ligações iônicas, forças de Van der Waals e interações hidrofóbicas.

[170] O termo “polipeptídeo” ou “cadeia de polipeptídeos” serão entendidos a partir do parágrafo antecedentes para significando uma série de aminoácidos contíguos ligados por ligações de peptídeo.

[171] O termo "proteína isolada" ou "polipeptídeo isolado” é uma proteína ou polipeptídeo que, devido à sua origem ou fonte de derivação, não está associada a componentes naturalmente associados que acompanham a mesma em seu estado nativo; é substancialmente livre de outras proteínas da mesma fonte. Uma proteína pode se tornar substancialmente livre de componentes naturalmente associados ou substancialmente purificados por isolamento, com o uso de técnicas de purificação de proteína conhecidas na técnica. Por “substancialmente purificada” entende-se a proteína que é substancialmente livre de agentes contaminantes, por exemplo, pelo menos cerca de 70% ou 75% ou 80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 96% ou 97% ou 98% ou 99% livres de agentes contaminantes.

[172] O termo “recombinante” deve ser entendido como significando o produto de recombinação genética artificial. Consequentemente, no contexto de uma proteína recombinante que compreende um domínio de ligação de antígeno de anticorpo, esse termo não abrange um anticorpo que ocorre naturalmente dentro do corpo de um indivíduo que é o produto de recombinação natural que ocorre durante a maturação da célula B. No entanto, caso tal anticorpo seja isolado, este deve ser considerado uma proteína isolada que compreende um domínio de ligação de antígeno de anticorpo. De modo semelhante, caso o ácido nucleico que codifica a proteína seja isolado e expresso com o uso de meios recombinantes, a proteína resultante é uma proteína recombinante que compreende um domínio de ligação de antígeno de anticorpo. Uma proteína recombinante também abrange uma proteína expressa por meios recombinantes artificiais quando está dentro de uma célula, tecido ou indivíduo, por exemplo, na qual é expressa.

[173] Conforme usado no presente documento, o termo “sítio de ligação a antígeno” deve ser considerado como significando uma estrutura formada por uma proteína que tem capacidade para se ligar ou se ligar especificamente a um antígeno. O sítio de ligação a antígeno não precisa ser uma série de aminoácidos contíguos ou até mesmo aminoácidos em uma cadeia única de polipeptídeos. Por exemplo, em um FEFv produzido a partir de duas cadeias diferentes de polipeptídeo, o sítio de ligação a antígeno é produzido a partir de uma série de aminoácidos de uma Vr e a Vr que interage com o antígeno e que são geralmente, no entanto, nem sempre na uma ou mais dentre as CDRs em cada região variável. Em alguns exemplos, um sítio de ligação a antígeno é uma V"

ou uma V, ou um Fv.

[174] A pessoa versada na técnica estará ciente de que um “anticorpo” é considerado geralmente como uma proteína que compreende uma região variável produzida a partir de uma pluralidade de cadeias de polipeptídeo, por exemplo, um polipeptídeo que compreende uma V1 e um polipeptídeo que compreende uma Vr. Um anticorpo também compreende geralmente domínios constantes, dentre os quais alguns podem estar dispostos em uma região constante, que inclui um fragmento constante ou um fragmento cristalizável (Fc), no caso de uma cadeia pesada. Uma Vx e uma V1 interagem para formar um EFv que compreende uma região de ligação a antígeno que tem capacidade para se ligar especificamente a um ou alguns antígenos de relação próxima. De modo geral, uma cadeia leve de mamíferos é ou uma cadeia leve x ou uma cadeia leve A e uma cadeia pesada de mamíferos é a, à, £&, y ou yu. os anticorpos podem ser qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGi, IgG», IgG;3, IgG., IgA e IgA) ou subclasse. O termo “anticorpo” também abrange anticorpos humanizados, anticorpos primatizados, anticorpos humanos e anticorpos quiméricos.

[175] Os termos "anticorpo de comprimento completo," "anticorpo intacto" ou "anticorpo inteiro" são usados de maneira intercambiável para se refere a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, diferentemente de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo. De modo específico, anticorpos inteiros incluem aqueles com cadeias pesada e leve incluindo uma região Fc. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência do tipo selvagem (por exemplo, domínios constantes de sequência humana do tipo selvagem) ou variantes de sequência de aminoácidos das mesmas.

[176] Conforme usado no presente documento, “região variável" se refere às porções das cadeias leve e/ou pesada de um anticorpo, conforme definido no presente documento que tem capacidade para se ligar especificamente a um antígeno e inclui sequências de aminoácido de regiões de determinação da complementaridade (CDRs); isto é, CDRl, CDR2, e CDR3, e regiões estruturantes (FRsS) . As regiões variáveis exemplificativas compreendem três ou quatro FRs (por exemplo, FRl, FR2, FR3 e opcionalmente FR4) junto de três CDRs. No caso de uma proteína derivada de uma IgNAR, a proteína pode carecer de uma CDR2. Vrx se refere à região variável da cadeia pesada. Vx se refere à região variável da cadeia leve.

[177] Conforme usado no presente documento, o termo "regiões de determinação da complementaridade” (syn. CDRs; isto é, CDRl, CDR2 e CDR3) se refere aos resíduos de aminoácido de uma região variável de anticorpo cuja presença é necessária para a ligação a antígeno. Cada região variável tem tipicamente três regiões de CDR identificadas como CDR1, CDR2 e CDR3. As posições de aminoácidos atribuídas às CDRs e FRs podem ser definidas de acordo com Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 e 1991 ou outros sistemas de numeração na realização da presente revelação, por exemplo, o sistema de numeração canônico de Chothia e Lesk J. Mol Biol. 196: 901 a 917, 1987; Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989; e/ou Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273: 927 a 948, 1997; o sistema de numeração de IMGT de Lefranc et al., Devel. e Compar. Immunol., 27: 55 a 77, 2003; ou o sistema de numeração AHO de Honnegher e Plúkthun J. Mol. Biol., 309: 657 a 670, 2001. Por exemplo, de acordo com o sistema de numeração de Kabat, as regiões estruturantes de (FRs) e CDRs de Vx são posicionadas de acordo com o seguinte: resíduos 1 a (FRl ), 31 a 35 (CDR1), 36 a 49 (FR2), 50 a 65 (CDR2), 66 a 94 (FR3), 95 a 102 (CDR3) e 103 a 113 (FR4). De acordo com o sistema de numeração de Kabat, as FRs e CDRs de V, são posicionados de acordo com o seguinte: resíduos 1-23 (FRl), 24 a 34 (CDR1), 35 a 49 (FR2), 50 a 56 (CDR2), 57 a 88 (FR3), 89 a 97 (CDR3) e 98 a 107 (FR4). A presente revelação não se lita às FRs e CDRs, conforme definido pelo sistema de numeração Kabat, porém inclui todos os sistemas de numeração, incluindo aqueles discutidos acima. Em um exemplo, a referência no presente documento a uma CDR (ou um FR) se refere às regiões de acordo com o sistema de numeração Kabat.

[178] "Regiões estruturantes" (FRs) são aqueles resíduos de região variável diferentes dos resíduos de CDR.

[179] Conforme usado no presente documento, o termo “Fv” deve ser considerado como significando qualquer proteína, seja compreendida de múltiplos polipeptídeos ou um único polipeptídeo, no qual uma V"1 e uma Vrx se associam e formam um complexo que tem um sítio de ligação a antígeno, isto é, com capacidade para se ligar especificamente a um antígeno. A Vr e a Vir que formam o sítio de ligação a antígeno podem estar em uma única cadeia de polipeptídeos ou em diferentes cadeias de polipeptídeo. Além disso, um Fv da revelação (assim como qualquer proteína da revelação) podem ter múltiplos sítios de ligação a antígeno que podem ou não se ligar ao mesmo antígeno. Esse termo deve ser entendido como abrangente de fragmentos derivados de um anticorpo assim como proteínas correspondentes a tal fragmento produzido com o uso de meios recombinantes.

Em alguns exemplos, a Vx não é ligada a um domínio constante de cadeia pesada (Cn) l1 e/ou a V1, não é ligada a um domínio constante de cadeia leve (CL). O Ev exemplificativo que contém os polipeptídeos ou as proteínas incluem um fragmento Fab, um fragmento Fab'!, um fragmento F(ab'!), um scFv, um dia-anticorpo, um tria-anticorpo, um tetra-anticorpo ou complexo de ordem superior ou qualquer um dentre o supracitado ligado a uma região constante ou domínio da mesma, por exemplo, domínio Cx2 ou Crx3, por exemplo, um minianticorpo.

Um "fragmento Fab" consiste em um fragmento de ligação a antígeno monovalente de uma imunoglobulina, e pode ser produzido por digestão de um anticorpo inteiro com a enzina papaína, para gerar um fragmento que consiste em uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada ou pode ser produzido com o uso de meios recombinantes.

Um “fragmento Fab'" de um anticorpo pode ser obtido tratando-se um anticorpo inteiro com pepsina, seguido por redução, para gerar uma molécula que consiste em uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada que compreende uma Vrx e um domínio constante único.

Dois fragmentos Fab' são obtidos por anticorpo tratado dessa maneira.

Um fragmento Fab" também pode ser produzido por meios recombinantes.

A "fragmento F(ab')2” de um anticorpo consiste em um dímero de dois fragmentos Fab' mantidos juntos por duas ligações de dissulfeto e é obtido tratando-se um anticorpo inteiro molécula com a enzima pepsina, sem redução subsequente.

Um fragmento “Fab” é um fragmento recombinante que compreende dois fragmentos Fab ligados com o uso, por exemplo, de um zíper de leucina ou um domínio Cr3. Um “Fv de cadeia única”

ou “scFv” é uma molécula recombinante que contém o fragmento de região variável (Fv) de um anticorpo no qual a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada são ligados de maneira covalente por um ligante polipeptídeo flexível adequado.

[180] Conforme usado no presente documento, o termo “se liga” com referência à interação de um composto ou um sítio de ligação a antígeno do mesmo com um antígeno significa que a interação depende da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante antigênico ou epítopo) no antígeno. Por exemplo, um anticorpo reconhece e se liga a uma estrutura específica de proteína e não a proteínas em geral. Caso um anticorpo se ligue a um epítopo "A", a presença de uma molécula que contém o epítopo “A” (ou “A” livre não identificado), em uma reação que contém “A” identificado e a proteína, reduzirá a quantidade de “A” identificado ligado ao anticorpo.

[181] Conforme usado no presente documento, o termo “se liga especificamente” ou “se liga especificamente” deve ser interpretado de modo que signifique que um composto da revelação reage ou se associa mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com um antígeno ou célula particular que se expressa da mesma maneira que com antígenos ou células alternativas. Por exemplo, um composto se liga ao G-CSFR (por exemplo, hG-CSFR) com materialmente maior afinidade (por exemplo, 20 vezes ou 40 vezes ou 60 vezes ou 80 vezes a 100 vezes ou 150 vezes ou 200 vezes) do que se liga a outro receptor de citocina ou a antígenos comumente reconhecidos por anticorpos naturais polirreativos (isto é, por anticorpos de ocorrência natural conhecidos por se ligaren a uma variedade de antígenos naturalmente encontrados em seres humanos). De modo geral, não necessariamente, a referência a ligação significa ligação específica, e cada termo deve ser entendido como fornecendo apoio explícito para o outro termo.

[182] Uma proteína ou anticorpo pode ser considerada como “se liga preferencialmente” a um polipeptídeo, caso se liga a esse polipeptídeo com uma constante de dissociação (Kr) que é menor que à Kpy da proteína ou do anticorpo para outro polipeptídeo. Em um exemplo, uma proteína ou anticorpo é considerada como se ligando, de preferência, a um polipeptídeo, caso se ligue ao polipeptídeo com uma afinidade (isto é, K”) que é pelo menos cerca de 20 vezes ou 40 vezes ou 60 vezes ou 80 vezes ou 100 vezes ou 120 vezes ou 140 vezes ou 160 vezes mais que a Kp da proteína ou do anticorpo para outro polipeptídeo.

[183] A título de esclarecimento e assim como ficará evidente para a pessoa versada na técnica com base na matéria exemplificada no presente documento, a referência a “afinidade” no presente relatório descritivo é uma referência à Ko” de uma proteína ou anticorpo.

[184] A título de esclarecimento e conforme ficará evidente para a pessoa versada na técnica com base na descrição no presente documento, a referência a uma “afinidade de pelo menos cerca de” será entendida como significando que a afinidade (ou Kp”) é igual ao valor recebido ou maior (isto é, o valor recitado como afinidade é inferior ), isto é, uma afinidade de 2 nM é maior que a afinidade de 3 nM. Declarado de outro modo, esse termo pode ser “uma afinidade de X ou menor”, em que X é um valor recitado no presente documento.

[185] Uma “ICso de pelo menos cerca de” será entendido como significando que a ICso é igual ao valor recitado ou maior (isto é, o valor recitado como a ICsºo é inferior), isto é, uma ICso de 2 nM é maior que uma ICsº de 3 nM. Declarado de outro modo, esse termo pode ser “uma ICso de X ou menor”, em que X é um valor recitado no presente documento.

[186] Conforme usado no presente documento, o termo “epítopo” (syn. “Determinante antigênico”) deve ser entendido como uma região de hG-CSFR à qual uma proteína que compreende um sítio de ligação a antígeno de uma anticorpo se liga. Esse termo não se limita necessariamente aos resíduos ou estrutura específicos com os quais a proteína entra em contato. Por exemplo, esse4 termo inclui a região que abrange aminoácidos em contato com a proteína e/ou 5 a 10 ou 2 a 5 ou l a 3 aminoácidos fora dessa região. Em alguns exemplos, o epítopo compreende uma série de aminoácidos descontínuos que são estão posicionados próximos um do outro quando o hG-CSFR é dobrado, isto é, um “epítopo conformacional”. Por exemplo, um epítopo conformacional compreende aminoácidos em uma ou mais ou duas ou mais ou todas as regiões correspondentes a 111 a 115, 170 a 176, 218 a 234 e/ou 286 a 300 da SEQ ID NO: l. A pessoa versada na técnica também estará ciente de que o termo "epítopo" não se limita a peptídeos ou polipeptídeos. Por exemplo, o termo “epítopo” inclui agrupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas, tais como cadeias laterais de açúcar, cadeias laterais de fosforila ou cadeias laterais de sulfonila e, em determinados exemplos, pode ter três características estruturais dimensionais específicas e/ou características de carga específica.

[187] O termo “inibe competitivamente” deve ser entendido como significando que uma proteína da revelação (ou um sítio de ligação a antígeno da mesma) reduz ou impede a ligação de um anticorpo ou proteína recitado o G-CSFR, por exemplo, a hG-CSFR. Isso pode ser devido à proteína (ou sítio de ligação a antígeno) e ao anticorpo que se ligam à mesma ou um epítopo de sobreposição. Ficará evidente a partir do supracitado que a proteína não precisa inibir a ligação do anticorpo, de preferência, precisa apenas reduzir a ligação em uma quantidade estatisticamente significativa, por exemplo, por pelo menos cerca de 10% ou 20% ou 30% ou 40% ou 50% ou 60% ou 70% ou 80% ou 90% ou 95%. De preferência, a proteína reduz a ligação do em pelo menos cerca de 30%, com mais preferência, em pelo menos cerca de 50%, com mais preferência, em pelo menos cerca de 70% ainda, com mais preferência, em pelo menos cerca de 75%, com ainda mais preferência, em pelo menos cerca de 80% ou 85% e com ainda mais preferência, em pelo menos cerca de 90%. Os métodos para determinar inibição competitiva da ligação são conhecidos na técnica e/ou descritos no presente documento. Por exemplo, o anticorpo é exposto a G-CSFR ou na presença ou na ausência da. Caso na presença da proteína haja menos ligação de anticorpos do que na ausência da proteína, a proteína é considerada como inibindo competitivamente a ligação do anticorpo. Em um exemplo, a inibição competitiva não é devido ao impedimento estérico.

[188] “Sobreposição” no contexto de dois epítopos devem ser considerados como significando que dois epítopos compartilham um número suficiente de resíduos de aminoácido para permitir uma proteína (ou sítio de ligação a antígeno do mesmo) que se liga a um epítopo para inibir competitivamente a ligação de uma proteína (ou sítio de ligação a antígeno) que se liga ao outro epítopo. Por exemplo, os epítopos “de sobreposição” compartilham pelo menos 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8 ou 9 ou 20 aminoácidos.

[189] Conforme usado no presente documento, o termo “neutralizar” deve ser considerado como significando um composto que tem capacidade para bloquear, reduzir ou impedir sinalização mediada por G-CSF em uma célula através do G- CSFR. Os métodos para determinar a neutralização são conhecidos na técnica e/ou descritos no presente documento. Prevenção ou tratamento de lesão por isquemia-reperfusão

[190] A presente revelação fornece, por exemplo, um método para prevenir ou tratar lesão por isquemia-reperfusão em um indivíduo que compreende administrar um composto que inibe o fator estimulador de colônia de granulócitos sinalização de G-CSF. Por exemplo, o composto se liga ao G- CSF ou G-CSFR.

[191] Uma lesão por isquemia-reperfusão pode ser causada por um evento natural (por exemplo, restauração de fluxo de sangue após um infarto do miocárdio ou acidente vascular cerebral), um trauma, um tumor ou por um ou mais procedimentos cirúrgicos ou outras intervenções terapêuticas que restauram fluxo de sangue ou oxigênio a um tecido ou órgão que foi submetido a um fornecimento diminuído de sangue ou oxigênio.

[192] Em um exemplo, a lesão por isquemia-reperífusão é causada por um procedimento cirúrgico. Tais procedimentos cirúrgicos incluemy por exemplo, ponte aorto-coronária,

cirurgia de enxerto, angioplastia coronária, cirurgia de transplante de órgão e semelhantes (por exemplo, desvio cardiopulmonar).

[193] Em alguns exemplos, a lesão por isquemia e/ou reperfusão é devido ou está associada à transplantação de órgão, armazenamento de órgão a frio, morte encefálica, aterosclerose, trombose, tromboembolismo, embolia lipídica, trauma, sangramento, estente, cirurgia, angioplastia, cirurgia de ponte de safena, isquemia total, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, doença vascular periférica, sepse ou combinações das mesmas.

[194] Em alguns exemplos, a lesão por isquemia-reperfusão é devido ou está associada à transplantação de órgão. Em alguns exemplos, o órgão é um órgão sólido. Em alguns exemplos, a transplantação de órgão é uma transplantação de rim. Em alguns exemplos, a transplantação de órgão é uma transplantação fígado. Em alguns exemplos, a transplantação de órgão é uma transplantação de coração. Em alguns exemplos, a transplantação de órgão é uma transplantação de pâncreas. Em um exemplo, a transplantação de órgão é uma transplantação de pulmão. Em um exemplo, a transplantação de órgão é uma transplantação de estômago. Em um exemplo, a transplantação de órgão é uma transplantação de intestino. Em um exemplo, a transplantação de órgão é uma transplantação de testículo.

[195] Em um exemplo, a lesão por isquemia-reperfusão é devido ou está associada a uma transplantação de tecido. Em um exemplo, a transplantação de tecido é uma transplantação de vaso sanguíneo. Em um exemplo, a transplantação de tecido é uma transplantação de pele, por exemplo, pele vascularizada. Em um exemplo, a transplantação de tecido [é uma transplantação de ilhotas pancreáticas.

[196] Os efeitos de uma lesão por isquemia-reperfusão incluem disfunção de órgão, infarto, inflamação, danos oxidativos, danos potenciais à membrana da mitocôndria, apoptose, arritmia relacionada à reperfusão, atordoamento cardíaco, lipotoxicidade cardíaca, formação de cicatrizes derivadas de isquemia e combinações das mesmas. Para a lesão por isquemia-reperfusão devido ou associado à transplantação de rim, os efeitos também incluem lesão renal aguda e função atrasada do enxerto (DGF).

[197] Em alguns exemplos, o método da presente revelação previne ou reduz a probabilidade de lesão renal aguda em seguida da transplantação. Por exemplo, o método da presente revelação impede ou reduz o risco de um ou mais dentre o seguinte:

[198] um aumento nos níveis de creatinina plasmática de pelo menos 2 0,3 mg por dl (26,52 umol por 1) ou 2 1,5 a duas vezes da linha basal;

[199] inferior a cerca de 0,5 ml de urina por kg por hora por pelo menos seis horas; e/ou

[200] tratamento de substituição renal necessário.

[201] Em alguns exemplos, o método da presente revelação previne ou reduz a probabilidade da função atrasada do enxerto após a transplantação, por exemplo, transplantação de rim. Conforme ficará evidente para a pessoa versada na técnica, a função atrasada do enxerto está associada a resultados insuficientes do enxerto a longo prazo, rejeição crônica do enxerto e/ou sobrevivência do órgão. Por exemplo, o método da presente revelação impede ou reduz o risco de um ou mais dentre o seguinte:

[202] A necessidade de um ou mais tratamento de hemodiálise dentro de cerca de 7 dias de transplantação antes do início da função de enxerto;

[203] A razão de redução de creatinina entre o Dia O e o Dia 7 inferior a 70 por cento.

[204] Em alguns exemplos, o método da presente revelação previne ou reduz a probabilidade de um ou mais dentre o seguinte:

[205] Disfunção primária do enxerto: uma afecção em que o rim nunca funciona adequadamente após a transplantação, e o paciente ainda precisa da diálise apesar de um transplante; e/ou

[206] Função lenta do enxerto: definida como creatinina sérica maior que 3 miligramas (mg) por decilitro e nenhuma necessidade de diálise no Dia 5 após transplantação.

[207] Em alguns exemplos, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir inflamação, por exemplo, em um órgão transplantado. Conforme usado no presente documento, o termo "inflamação" ou "resposta inflamatória", se refere a um conjunto de mudanças que ocorrem em um tecido que se submete à inflamação. Em particular, a inflamação se refere à resposta biológica a estímulos nocivos, incluindo patógenos, células danificadas ou irritações. Os métodos para determinar a inflamação são conhecidos na técnica e incluem, sem limitação, medida de taxa de sedimentação eritrócito (ESR), em que uma ESR mais alta indica inflamação, medida de proteína C-reativa (CRP), em que um nível mais alto de CRP indica inflamação e contagem de leucócitos (aumentada na inflamação).

[208] Em alguns exemplos, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir danos oxidativos, por exemplo, em um órgão transplantado.

Conforme usado no presente documento, o termo "danos oxidativos" se refere aos danos biomoleculares que podem ser causados por espécies reativas durante restauração de oxigênio.

Os danos oxidativos podem envolver peroxidação de lipídeo, danos oxidativos ao DNA e danos oxidativos às proteínas.

Os métodos para determinar peroxidação de lipídeo incluem, sem limitação, determinação de MDA (malondialdeído)-TBA (ácido tiobarbituríco) por HPLC, e quantificação de isoprostanos (que são produtos finais específicos da peroxidação de ácidos graxos poli-insaturados) por espectrometria de massa.

Os métodos para determinar danos oxidativos ao DNA incluem, sem limitação, medida de 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (80HdG). Os métodos para determinar danos oxidativos às proteínas incluem, sem limitação, quantificação de produtos de oxidação de aminoácido individual incluindo cinureninas (de triptofano), bitirosina (que parecer ser estável em termos de metabolismo e podem ser detectada na urina), hidróxidos de valina e leucina, L-di-hidroxifenilalanina (L- DOPA), orto- tirosina, 2-oxo-histidina, glutamato semialdeído e semialdeído adípico, assim como o ensaio de carbonila (envolvendo medição dos grupos de carbonila de proteína). O potencial da membrana mitocondrial (AViln) se refere ao potencial da membrana na forma de um gradiente de próton por toda a membrana interna da mitocôndria.

Os métodos para avaliação de danos potenciais à membrana da mitocôndria são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica e incluem o uso de sondas fluorescentes para monitorar o potencial da membrana incluindo o corante JCl (Cell Technology) e a medida da fluorescência geral nos comprimentos de onda de excitação e de emissão, o que permite a quantificação de fluorescência verde (485 nm e 535 nm) e vermelha (550 nm e 600 nm). A isquemia prolongada de qualquer tecido ou órgão é conhecida por induzir danos potenciais à membrana da mitocôndria.

[209] Em alguns exemplos, o composto —. que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir infiltração de neutrófilos e/ou de macrófagos. Conforme usado no presente documento, os termos “infiltração de neutrófilos” e “infiltração de macrófagos” se referem ao recrutamento ou acúmulo de neutrófilos e macrófagos nos tecidos ou células em resposta a uma variedade de substância que são liberadas nos sítios de reações inflamatórias devido à lesão por isquemia- reperfusão. Por exemplo, a infiltração de neutrófilos e/ou macrófagos pode ocorrer no tecido do órgão do doador após a transplantação de órgão. Os métodos para medir infiltração de neutrófilos e/ou de macrófagos são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Por exemplo, os neutrófilos ou macrófagos podem ser medidos diretamente, tal como por visualização por microscopia de fluorescência ou indiretamente medindo-se a abundância ou atividade de proteínas ou enzimas específicas de neutrófilo/macrófago em um tecido afetado. Os métodos adequados para medir a infiltração de neutrófilos e/ou de macrófagos são descritos em Soo-Jeong Yu et al Korean J Intern Med (2008) e Pulli et al PloS One (2013).

[210] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir ativação de C5 de complemento. Os métodos para medir ativação de C5a do complemento incluem, porém sem limitação, avaliação de níveis plasmáticos de C5a por ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA).

[211] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir a deposição de C5b-9. Os métodos para medir a deposição de C5b-9 incluem, porém sem limitação análise por marcação com imunofluorescência de seções do rim.

[212] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir a expressão de um ou mais dentre o seguinte:

[213] receptor de interleucina 8 beta (IL-8RB);

[214] proteína de quimioatração de monócitos 1 (MCP-1);

[215] molécula de lesão ao rim 1 (KIM-1);

[216] lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL) ;

[217] interleucina 1 beta (IL-16);

[218] interleucina 6 (IL-6);

[219] fator de necrose tumoral alfa (TNFa);

[220] receptor do componente 5a do complemento 1 (C5AR1);

[221] proteína inflamatória de macrófagos 2-alfa (MIP2- alfa);

[222] molécula de adesão intercelular 1 (ICAM-1);

[223] E-selectina; e

[224] ligante 1 de quimiocina com motivo C-X-C (CXCL1).

[225] Os métodos para medir a nível de expressão de uma gene serão conhecidos na técnica. Por exemplo, o nível de expressão de um gene pode ser medido quantificando-se a quantidade de mRNA, por exemplo, por northern blot ou por PCR de transcrição reversa quantitativa (GRT-PCR) conforme descrito em Riedy et al Biotechniques (1995). Alternativa ou adicionalmente, o nível de expressão de um gene pode ser medido quantificando-se o nível de proteína codificada pelo gene, por exemplo, por ensaio de imunoadsorção ligado à enzima (ELISA), ensaio de imunoadsorção ligado à fluorescência (FLISA), imunofluorescência ou immunoblotting (consultar Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

[226] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir a função atrasada do enxerto, por exemplo, associado à transplantação de rim. A função atrasada do enxerto é uma manifestação de lesão renal aguda resultante em oligúria pós-transplantação, imunogenicidade de aloenxerto aumentada e risco de episódios de rejeição aguda e sobrevivência a longo prazo diminuída. Os biomarcadores adequados para detectar a função atrasada do enxerto incluem NGAL, KIM-l, proteína de ligação de ácido graxo do tipo hepático (L-FABP), interleucina 18 (IL-18), YKL-40 (a 40kDa glicoproteína de ligação a heparina e quitina, consultar, por exemplo, Hakala et al., J Biol Chem 1993), clusterina e cistatina C. Tais biomarcadores para detectar função atrasada do enxerto são descritos em Malyszko et al., Sci Rep (2015), que é incorporado no presente documento a título de referência.

[227] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir um aumento nos níveis de creatinina sérica ou plasmática. Uma pessoa versada na técnica observará que níveis aumentados de creatinina sérica (plasmática) são um indicador de função renal prejudicada. Quando um rim é prejudicado por qualquer motivo, por exemplo, devido à lesão por isquemia-reperfusão, o nível de creatinina no sangue elevará devido à depuração insuficiente de creatinina pelos rins. Níveis altos fora do normal de creatinina são, então, um aviso de possível mau funcionamento ou insuficiência nos rins. Os métodos adequados para medir níveis de creatinina sérica (ou plasmática) são conhecidos na técnica, por exemplo, a reação de Jaffe com o uso de picrato alcalino e são destinados em Peake e Whiting, Clin Biochem Rev (2006).

[228] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir um aumento nos níveis de ureia sérica ou plasmática. Os níveis aumentados de ureia sérica ou plasmática são um indicador de função renal prejudicada e podem resultar de lesão por isquemia- reperfusão. A ureia sérica ou plasmática pode ser medida por qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, a ureia sérica ou plasmática pode ser medida por métodos químicos, tais como a reação de diacetila (gerada a partir de diacetilmonoxima e ácido) com ureia para formar diazina, ou por meio de métodos enzimáticos com o uso de, por exemplo, urease para gerar e medir amônia ou glutamato desidrogenase, nos quais o consumo de NADH é medido. Por exemplo, o Kit de

Ensaio de Ureia da Cell Biolabs se baseia na reação de Berthelot na qual a ureia degrada primeiramente em amônia e dióxido de carbono, O que reage primeiramente com um desenvolvedor alcalino para produzir um produto de cor azul- verde que pode ser medido com um leitor de placa espectrofotométrico padrão a uma densidade óptica entre 580 a 630 nm. Os métodos adequados para medir níveis de ureia sérica ou plasmática incluem aqueles que são descritos em Lamb E et al., Kidney Function Tests (Capítulo 25): Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics (2012).

[229] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir um aumento nos níveis de albumina de urina. Os níveis aumentados de albumina na urina são um indicador de função renal prejudicada e podem resultar de lesão por isquemia-reperfusão. O níveis de albumina na urina podem ser medidos por qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, os níveis de albumina na urina podem ser medidos com o uso de um teste de microalbuminuria.

[230] Em um exemplo, a composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir um aumento nos níveis de sangue na urina do indivíduo. A presença de sangue na urina (também conhecida como “hematuria”) é um indicador de função renal prejudicada e pode resultar de lesão por isquemia-reperfusão. Os níveis de sangue na urina do indivíduo podem ser medidos por qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, os níveis de sangue na urina do indivíduo podem ser medidos com o uso de uma vareta de imersão na urina ou com a detecção da presença de células vermelhas sanguíneas por exame microscópico de uma amostra de urina. Anticorpos

[231] Em um exemplo, um composto, conforme descrito no presente documento de acordo com qualquer exemplo é uma proteína que compreende um sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é um anticorpo. Em alguns exemplos, o anticorpo se liga ao G-CSFR. Em alguns exemplos, o anticorpo se liga ao G-CSF.

[232] Os métodos para gerar anticorpos são conhecidos na técnica e/ou descritos em Harlow and Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988). De modo geral, em tais métodos, o G-CSFR ou o G-CSF (por exemplo, hG-CSFR ou hG-CSF) ou uma região dos mesmos (por exemplo, um domínio extracelular) ou fragmento imunogênico ou epítopo dos mesmos ou uma célula que expressa e exibe os mesmos (isto é, um imunogênio), formulados opcionalmente com qualquer carreador, adjuvante ou excipiente farmaceuticamente aceitável adequado ou desejado, é administrado a um animal não humano, por exemplo, um camundongo, galinha, rato, coelho, porquinho-da-índia, cachorro, cavalo, vaca, cabra ou porco. O imunogênio pode ser administrado por via intranasal, intramuscular, subcutânea, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal ou por outra rota conhecida.

[233] os anticorpos monoclonais são uma forma exemplificativa de um anticorpo contemplado pela presente revelação. O termo “anticorpo monoclonal" ou “mAL” se refere a uma população de anticorpos homogêneos com capacidade para se ligarem ao mesmo antígeno (ou antígenos), por exemplo, ao mesmo epítopo dentro do antígeno. Esse termo não deve ser limitado em relação à fonte do anticorpo ou em relação à maneira que é produzido.

[234] Para produção de mAbs, qualquer uma dentre várias técnicas conhecidas podem ser usadas, tal como, por exemplo, o procedimento exemplificado no documento nº US4196265 ou Harlow and Lane (1988), supra.

[235] Alternativamente, a tecnologia de ABL-MYC (NeoClone, Madison WI 53713, EUA) é usada para produzir linhagens celulares que secretam MAbs (por exemplo, conforme descrito em Largaespada et al, J. Immunol. Methods. 197: 85 a 95, 1996).

[236] Os anticorpos também podem ser produzidos ou isolados triando-se uma biblioteca de exibição, por exemplo, uma biblioteca de exibição de fago, por exemplo, conforme descrito no documento nº US6300064 e/ou nº US5885793. Por exemplo, os presentes inventores têm anticorpos humanos completamente isolados de uma biblioteca de exibição de fago.

[237] O anticorpo da presente revelação pode ser um anticorpo sintético. Por exemplo, o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano ou um anticorpo desumanizado.

[238] Em um exemplo, um anticorpo descrito no presente documento é um anticorpo quimérico. O termo “anticorpo quimérico” se refere a anticorpos nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular (por exemplo, murganho, tal como camundongo) ou que pertencem a uma classe ou subclasse particular de anticorpos, ao passo que o restante da cadeia (ou cadeias) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de outras espécies (por exemplo, primata, tal como ser humano) ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpos. Os métodos para produzir anticorpos —quiméricos são descritos, por exemplo, no documento nº US4816567; e nº US5807715.

[239] Os anticorpos da presente revelação podem ser humanizados ou humanos.

[240] O termo "anticorpo humanizado” deve ser entendido como se referindo a uma subclasse de anticorpos quiméricos que têm um sítio de ligação a antígeno ou região variável derivada de um anticorpo de uma espécie não humana e a estrutura restante do anticorpo com base na estrutura e/ou sequência de um anticorpo humano. Em um anticorpo humanizado, o sítio de ligação a antígeno compreende geralmente as regiões de determinação da complementaridade (CDRs) do anticorpo não humano enxertado em FRs apropriadas nas regiões variáveis de um anticorpo humano e as regiões restantes de um anticorpo humano. Os sítios de ligação a antígeno podem ser de um tipo selvagem (isto é, idênticos àqueles do anticorpo não humano) ou modificados por uma ou mais substituições de aminoácidos. Em algumas ocorrências, os resíduos de FR do anticorpo humano são substituídos por resíduos não humanos correspondentes.

[241] Os métodos para humanizar anticorpos não humanos ou partes dos mesmos (por exemplo, regiões variáveis) são conhecidos na técnica. A humanização pode ser realizada seguindo o método do documento nº US5225539 ou US5585089.

Outros métodos para humanizar um anticorpo não são excluídos.

[242] O termo "anticorpo humano" conforme usado no presente documento se refere a anticorpos que têm regiões variáveis (por exemplo, Vn, V1L) e opcionalmente regiões constantes derivadas das sequências encontradas em seres humanos, ou correspondente às mesmas, por exemplo, na linhagem germinativa ou células somáticas humanas.

[243] os anticorpos humanos exemplificativos são descritos no presente documento e incluem C1.2 e C1.2G e/ou regiões variáveis dos mesmos. Esses anticorpos humanos fornecem uma vantagem de imunogenicidade reduzida em um ser humano em comparação a anticorpos não humanos. Os anticorpos exemplificativos são descritos no documento nº WO2012171057 que é incorporado no presente documento a título de referência. Domínio de ligação a anticorpo que contém proteínas Anticorpos de domínio único

[244] Em alguns exemplos, um composto da revelação é uma proteína que é ou compreende um anticorpo de domínio único (que é usado de maneira intercambiável com o termo “anticorpo de domínio” ou “daAb”). Um anticorpo de domínio único é uma cadeia de polipeptídeo único que compreende toda ou uma porção da região variável de cadeia pesada de um anticorpo. Em determinados exemplos, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; consultar, por exemplo, US6248516). Dia-anticorpos, Tria-anticorpos, Tetra-anticorpos

[245] Em alguns exemplos, uma proteína da revelação é ou compreende um dia-anticorpo, tria-anticorpo, tetra-anticorpo ou complexo de proteínas de ordem superior, tal como aqueles descritos no documento nº WO98/044001 e/ou WO94/007921. Fv de cadeia única (scfv)

[246] A pessoa versada na técnica observará que os scFvs compreende regiões Vu e Vi em um a cadeia de polipeptídeo único e um ligante de polipeptídeo entre a Vx e V1, o que possibilita que o scFv forme a estrutura desejada para ligação a antígeno (isto é, para que a Vx e à V1, da cadeia de polipeptídeo único se associem uma à outra a fim de formar um Fv). Por exemplo, o ligante compreende além de 12 resíduos de aminoácido, em que (GlysSer); é um dentre o um ou mais ligantes favorecidos para um scFv. Anticorpos de cadeia pesada

[247] Os anticorpos de cadeia pesada são diferentes estruturalmente de outras formas de anticorpos, desde que compreendam uma cadeia pesada, porém compreendam uma cadeia leve. Consequentemente, esses anticorpos também são denominados de “anticorpos apenas de cadeia pesada”. Os anticorpos de cadeia pesada são encontrados, por exemplo, em camelídeos e peixes cartilaginosos (também denominados de IgNAR).

[248] Uma descrição geral de anticorpos de cadeia pesada dos camelídeos e as regiões variáveis dos mesmos e os métodos para a produção e/ou isolamento e/ou uso dos mesmos é encontrado inter alia nas seguintes referências nº WO94/04678, WO97/49805 e WO 97/49805.

[249] Uma descrição geral de anticorpos de cadeia pesada dos peixes cartilaginosos e as regiões variáveis dos mesmos e os métodos para a produção e/ou isolamento e/ou uso dos mesmos é encontrado inter alia no documento nº WO2005/118629. Outros anticorpos e fragmentos de anticorpo

[250] A presente revelação também contempla outros anticorpos e fragmentos de anticorpo, tal como:

[251] (i) proteínas biespecíficas de “chave e furo”, conforme descrito no documento nº U.S. 5.731.168;

[252] (ii) proteínas heteroconjugadas, por exemplo, conforme descrito no documento nº US4,676,980;

[253] (iii) proteínas heteroconjugadas produzidas com o uso de um reticulador químico, por exemplo, conforme descrito in US4,676,980; e

[254] (iv) Fab;3 (por exemplo, conforme descrito no documento nº EP19930302894). Proteínas tipo V

[255] Um exemplo de um composto da revelação é um receptor de célula T. Os receptores de célula T têm dois domínios V que se combinam em uma estrutura semelhante ao módulo Fv de um anticorpo. Novotny et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 8.646 a 8.650, 1991 descreve como os dois domínios V do receptor de célula T (denominado de alfa e beta) pode ser fundido e expresso como um polipeptídeo de cadeia única e, também, como alterar os resíduos de superfície para reduzir a hidrofobicidade diretamente análogo a um anticorpo scFv. Outras publicações que descrevem a produção de receptores de célula T de cadeia única ou receptores de célula T multiméricos que compreendem dois domínios V-alfa e V-beta incluem o documento nº WO1999/045110 ou WO2011/107595.

[256] Outras proteínas de não anticorpo que compreendem domínios de ligação a antígeno incluem proteínas com domínio do tipo V, que são geralmente monoméricos. Os exemplos de proteínas que compreendem tal domínio do tipo V incluem CTLA- 4, CD28 e ICOS. A revelação adicional de proteínas que compreendem tal domínio do tipo V está incluída no documento nº WO1999/045110. Adnectinas

[257] Em um exemplo, um composto da revelação é uma adnectina. As adnectinas se baseiam no décimo domínio de fibronectina tipo III (*ºFnôi) da fibronectina humana na qual as regiões de alça são alteradas para conferir ligação de antígeno. Por exemplo, três alças em uma extremidade do B- sanduíche do domínio *ºFnô podem ser modificadas para possibilitar que uma Adnectina reconheça especificamente um antígeno. Para mais detalhes, consultar o documento nº US20080139791 ou WO2005/056764. Anticalinas

[258] Em um exemplo adicional, um composto da revelação é uma anticalina. As anticalinas são derivadas de lipocalinas que são uma família de proteínas extracelulares que transportam pequenas moléculas hidrofóbicas, tais como esteroides, bilinas, retinoides e lipídeos. As lipocalinas têm uma estrutura secundária de B-folha rígida com uma pluralidade de alças na extremidade aberta da estrutura cônica que pode ser modificada para se ligar a um antígeno. Tais lipocalinas modificadas são conhecidas como anticalinas. Para descrição adicional de anticalinas, consultar os documentos nº US7250297B1l ou US20070224633. Affianticorpos

[259] Em um exemplo adicional, um composto da revelação é um affianticorpo. Um affianticorpo é um arcabouço derivado do domínio Z (domínio de ligação a antígeno) da proteína A de Staphylococcus aureus que pode ser modificado para se ligar ao antígeno. O domínio Z consiste em um conjunto de três hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. As bibliotecas foram gerados por randomização de resíduos de superfície. Para mais detalhes, consultar o documento nº EP1641818. Avímeros

[260] Em um exemplo adicional, um composto da revelação é um avímero. Os avímeros são proteínas de múltiplos domínios derivadas da família de arcabouço do domínio A. Os domínios nativos de aproximadamente 35 aminoácidos adotam uma estrutura ligada de dissulfeto definida. A diversidade é gerada transportando-se a variação natural pela família de domínios A. Para mais detalhes, consultar o documento nº WO2002088171. DARPins

[261] Em um exemplo adicional, um composto da revelação é uma proteína de repetição de anquirina projetada (DARPin) As DARPins são derivadas da Anquirina que é uma família de proteínas que medeiam a fixação de proteínas membranares integrais ao citoesqueleto. Uma única repetição de anquirina é um motivo de 33 resíduos que consiste em duas a-hélices e uma B-volta. As mesmas podem ser modificadas de modo que se liguem a diferentes antígenos-alvo randomizando-se resíduos na primeira a-hélice e uma B-volta de cada repetição. A interface de ligação das mesmas podem ser aumentada aumentando-se o número de módulos (um método de maturação de afinidade). Para mais detalhes, consultar o documento nº US20040132028. G-CSFR Solúvel

[262] A presente revelação também contempla uma forma solúvel do G-CSFR que compete com o G-CSFR associado à membrana de ocorrência natural para interação de G-CSF. As pessoas versadas na técnica podem preparar prontamente as formas solúveis do receptor, consultar, por exemplo, a patente nº U.S. 5.589.456 e Honjo et al, Acta Crystalograph Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61(Pt 8) :788 a 790, 2005. Anticorpos e proteínas desimunizados

[263] A presente revelação também contempla um anticorpo ou proteína desimunizada. Os anticorpos e proteínas desimunizados têm um ou mais epítopos, por exemplo, epítopos de B célula ou epítopos de T célula removidos (isto é, submetidos à mutação) para, então, reduzir a probabilidade de um mamífero gerar uma resposta imunológica contra o anticorpo ou proteína. Os métodos para produzir anticorpos e proteínas desimunizados são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, no documento nº MWO2000/34317, MWO2004/108158 e WO2004/064724.

[264] Os métodos para introduzir mutações adequadas e expressar e ensaiar a proteína resultante ficarão evidentes para a pessoa versada na técnica com base na descrição no presente documento. Mutações às proteínas

[265] A presente revelação também contempla formas mutantes de uma proteína da revelação. Nesse sentido, os dados apresentados no presente documento indicam sítios dentro de uma CDR de uma proteína da revelação que podem ser mudados além das mudanças exemplificativas que podem ser feitas. A pessoa versada na técnica entenderá que as mudanças podem ser feitas adicional ou alternativas dentro de uma região estruturante de uma região variável que contém a proteína sem inibir ou sem reduzir significativamente sua função no contexto da presente revelação.

[266] Por exemplo, tal proteína mutante compreende uma ou mais substituições de aminoácido em comparação a uma sequência apresentada no presente documento. Em alguns exemplos, a proteína compreende 30 ou menos ou 20 ou menos ou ou menos, por exemplo, 9 ou 8 ou 7 ou 6 ou 5 ou 4 ou 3 ou 2 substituições conservativas de aminoácido. Uma "substituição conservativa de aminoácido” é quando o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral semelhante e/ou hidropaticidade e/ou hidrofilicidade.

[267] Em um exemplo, uma proteína mutante tem apenas, ou no máximo, uma ou duas ou três ou quatro ou cinco seis mudanças conservativas de aminoácido quando em comparação a uma proteína de ocorrência natural. Os detalhes de mudanças conservativas de aminoácido são fornecidas abaixo. Conforme a pessoa versada na técnica observará, por exemplo, a partir da revelação no presente documento, tais mudanças menores podem ser previstas razoavelmente para não alterar a atividade da proteína.

[268] As famílias de resíduos de aminoácido que têm cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não mudadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais B-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo,

tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).

[269] A presente revelação também contempla mudanças não conservativas de aminoácido (por exemplo, substituições) em uma proteína da presente revelação, por exemplo, em uma CDR, tal como CDR3. Por exemplo, os presentes inventores identificaram diversas substituições não conservativas de aminoácido que podem ser feitas ao mesmo tempo que retêm uma atividade de uma proteína da revelação. Em um exemplo, a proteína compreende menos que 6 ou 5 ou 4 ou 3 ou 2 ou 1 substituições não conservativas de aminoácido, por exemplo, em uma CDR3, tal como em uma CDR3.

[270] A presente revelação também contempla um ou mais inserções ou deleções em comparação a uma sequência apresentada no presente documento. Em alguns exemplos, a proteína compreende 10 ou menos, por exemplo, 9 ou 8 ou 7 ou 6 ou 5 ou 4 ou 3 ou 2 inserções e/ou deleções. Regiões constantes

[271] A presente revelação abrange proteínas e/ou anticorpos descritos no presente documento que compreendem uma região constante de um anticorpo. Isso inclui o fragmento de ligação a antígenos de um anticorpo fundido a um Fc.

[272] As sequências de regiões constantes úteis para produzir as proteínas da presente revelação podem ser obtidas a partir de várias fontes diferentes. Em alguns exemplos, a região constante ou porção das mesmas da proteína é derivada de um anticorpo humano. A região constante ou porção das mesmas pode ser derivadas de qualquer classe de anticorpo, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE e qualquer anticorpo isótipo, incluindo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Em um exemplo, a região constante é um isótipo humano IgG4 ou uma região constante de IgG4 estabilizada.

[273] Em um exemplo, a região Fc da região constante tem uma capacidade reduzida para induzir a função efetora, por exemplo, em comparação a uma região Fc de IgGl ou IgG3 humano do tipo selvagem ou nativo. Em um exemplo, a função efetora é citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e/ou fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Os métodos para avaliar o nível da função efetora de uma região Fc que contém a proteína são conhecidos na técnica e/ou são descritos no presente documento.

[274] Em um exemplo, a região Fc é uma região Fc de IgG4 (isto é, de uma região constante de IgG4), por exemplo, uma região Fc de IgG4 humana. As sequências de regiões Fc de IgG4 Fc adequadas ficarão evidentes para as pessoas versadas na técnica e/ou disponíveis em bancos de dados disponíveis publicamente (por exemplo, disponíveis junto ao National Center para Biotechnology Information).

[275] Em um exemplo, a região constante é uma região constante de IgG4 estabilizada. O termo “região constante de IgG4 estabilizada” será entendido como significando uma região constante de IgG4 que foi modificada para reduzir uma troca de braço de Fab ou a propensão à submissão à troca de braço de Fab ou formação de um meio anticorpo ou uma propensão à formação de um meio anticorpo. “Troca de braço de Fab" se refere a um tipo de modificação de proteína para IgG4 humana, na qual uma cadeia pesada de IgG4 e a cadeia leve fixada (meia molécula) é trocada por um par leve de cadeia pesada de outra molécula de IgG4. Desse modo, as moléculas de IgG4 podem obter dois braços de Fab distintos que reconhecem antígenos distintos (resultando em moléculas biespecíficas). A troca de braço de Fab ocorre naturalmente in vivo e pode ser induzido in vitro por células sanguíneas purificadas ou agentes de redução, tais como glutationa reduzida. Um “meio anticorpo” se forma quando um quando um anticorpo de IgG4 se desassociar para formar duas moléculas que contêm, cada uma, uma única cadeia pesada e uma única cadeia leve.

[276] Em um exemplo, uma região constante de IgG4 estabilizada compreende uma prolina na posição 241 da região articulada de acordo com o sistema de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health e Human Services, 1987 e/ou 1991). Essa posição corresponde à posição 228 da região articulada de acordo com o sistema de numeração EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health e Human Services, 2001 e Edelman et al., Proc. Natl. Acad. EUA, 63 78 a 85, 1.969). Na humana de IgG4, esse resíduo é geralmente uma serina. Após a substituições da serina pela prolina, a região articulada de IgG4 compreende uma sequência CPPC. Nesse sentido, a pessoa versada observará que a “região articulada” é uma porção rica em prolina de uma região constante de cadeia pesada de anticorpo que liga as regiões Fc e Fab que conferem mobilidade aos dois braços Fab de um anticorpo. A região articulada inclui resíduos de cisteína que são envolvidos em ligações de dissulfeto entre cadeias pesadas. De modo geral, a mesma é definida como esticando da Glu226 até a Pro243 da IgGl humana de acordo com o sistema de numeração de Kabat. As regiões articuladas de outros isótipos de IgG podem ser alinhadas à sequência de IgGl colocando-se o primeiro e último resíduos de cisteína que formam ligações de dissulfeto (S-S) entre cadeias pesadas nas mesmas posições (consultar, por exemplo, WO2010/080538).

[277] Os exemplos de anticorpos IgG4 estabilizados são anticorpos em que a arginina na posição 409 em uma cadeia pesada região constante de IgG4 humana (de acordo com o sistema de numeração EU) é substituída por lisina, treonina, metionina ou leucina (por exemplo, conforme descrito no documento nº WO2006/033386). A região Fc da região constante pode compreender adicional ou alternativamente um resíduo selecionado a partir do grupo que consiste em: alanina, valina, glicina, isoleucina e leucina na posição correspondentes a 405 (de acordo com o sistema de numeração EU). Opcionalmente, a região articulada compreende uma prolina na posição 241 (isto é, uma sequência CPPC) (conforme descrito acima).

[278] Em outro exemplo, a região Fc é uma região modificada para ter uma função efetora reduzida, isto é uma a “região Fc não imunoestimuladora”. Por exemplo, a região Fc é uma região Fc de IgGl que compreende uma substituição em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em 268, 309, 330 e 331. Em outro exemplo, a região Fc é uma região Fc de IgGl que compreende uma ou mais dentre as mudanças a seguir E233P, L234V, L235A e deleção de G236 e/ou uma ou mais dentre as mudanças a seguir A327G, A330S e P331S (Armour et al., Eur J Immunol. 29:2.613 a 2.624, 1999; Shields et al., J Biol Chem. 276(9):6.591 a 604, 2001). os exemplos adicionais de regiões Fc não imunoestimuladoras são descritos, por exemplo, em Dall'Acqua et al., J Immunol. 177 : 1.129 a 1.138 2006; e/ou Hezareh J Virol ;75: 1.2161 a

1.2168, 2001).

[279] Em outro exemplo, a região Fc é uma região Fc quimérica, por exemplo, que compreende pelo menos um domínio Cx2 de um anticorpo de IgG4 e pelo menos um domínio C'n3 de um anticorpo de IgGl, em que a região Fc compreende uma substituição em uma ou mais posições de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em 240, 262, 264, 266, 297, 299, 307, 309, 323, 399, 409 e 427 (numeração EU) (por exemplo, conforme descrito no documento nº WO2010/085682). As substituições exemplificativas incluem 240F, 262L, 264T, 266F, 2970, 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399S e 427F. Modificações adicionais

[280] A presente revelação também contempla modificações adicionais a um anticorpo ou proteína da revelação.

[281] Por exemplo, o anticorpo compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que aumenta a meia-vida da proteína. Por exemplo, o anticorpo compreende uma região Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácido que aumentam a afinidade da região Fc para a região Fc neonatal (FcRn) . Por exemplo, a região Fc aumentou a afinidade com FcRn em um pH inferior, por exemplo, cerca de pH 6,0, para facilitar a ligação de Fc/FckRn em um endossoma. Em um exemplo, a região Fc tem afinidade aumentada com FcRn em cerca de pH 6 em comparação a sua afinidade a cerca de pH 7,4, o que facilita a liberação nova do Fc no sangue após a reciclagem celular. Essas substituições de aminoácido são úteis para estender a meia-vida de uma proteína, reduzindo-se a depuração do sangue.

[282] As substituições de aminoácido exemplificativos incluem T250Q e/ou M428L ou T252A, T254S e T266F ou M252Y, S254T e T256E ou H433K e N434F de acordo com o sistema de numeração EU. As substituições de aminoácido adicionais ou alternativas são descritas, por exemplo, nos documentos nº US20070135620 ou UST7083784.

[283] Em um exemplo, a proteína da revelação compreendem adicionalmente albumina, um fragmento funcional ou variante da mesma. Em um exemplo, a albumina, fragmento funcional ou variante da mesma é albumina sérica, tal como albumina sérica humana. Em um exemplo, a albumina, fragmento funcional ou variante da mesma, compreende uma ou mais substituições de aminoácido, deleções ou inserções, por exemplo, no máximo 5 ou 4 ou 3 ou 2 ou 1 substituições. As substituições de aminoácido adequadas para uso na presente revelação ficarão evidentes para a pessoa versada e incluem substituições de ocorrência natural e substituições modificadas, tais como aquelas descritas, por exemplo, nos documentos nº WO2011051489, WO2014072481, WO2011103076, WO2012112188, WO2013075066, WO2015063611 e WO2014179657. Produção de proteína

[284] Em um exemplo, uma proteína descrita no presente documento de acordo com qualquer exemplo é produzida cultivando-se uma hibridoma sob condições suficientes para produzir a proteína, por exemplo, conforme descrito no presente documento e/ou conforme é conhecido na técnica. Expressão recombinante

[285] Em outro exemplo, uma proteína descrita no presente documento, de acordo com qualquer exemplo, é recombinante.

[286] No caso de uma proteína recombinante, o ácido nucleico que codifica à mesma pode ser clonado em construtos ou vetores de expressão, que, em seguida são submetidos à transfecção em células hospedeiras, tal como células de E. coli, células de levedura, células de inseto ou células de mamíferos, tais como como células COS de símio, células de Ovário de Hamster Chinês, células embrionárias de rim humano (HEK) ou células de mieloma que, de outro modo, não produzem a proteína. As células exemplificativas usadas para expressar uma proteína são células CHO, células de mieloma ou células de HEK. Técnicas de clonagem molecular para alcançar essas finalidades são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, em Ausubel et al., (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates e Wiley- Interscience (1988, incluindo todas as atualizaçoes até presente data) ou Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Uma ampla variedade de métodos de amplificação e de clonagem in vitro são adequados para a construção de ácidos nucleicos recombinantes. Os métodos para produzir anticorpos recombinantes também são conhecidos na técnica, consultar, por exemplo, o documento nº US4816567 ou US5530101.

[287] Após o isolamento, o ácido nucleico é inserido ligado de maneira operacional a um promotor em um construto de expressão ou vetor de expressão para clonagem adicional (amplificação do DNA) ou para expressão em um sistema livre de células ou em células.

[288] Conforme usado no presente documento, o termo “promotor” deve ser interpretado em seu contexto mais amplo e inclui as sequências reguladores transcricionais de um gene genômico, incluindo à caixa de TATA ou elemento de iniciador, que é necessário para iniciação de transcrição precisa, com ou sem elementos reguladores adicionais (por exemplo, sequências de ativação a montante, sítios de ligação de fator de transcrição, intensificadores ou silenciadores) que alteram a expressão de um ácido nucleico, por exemplo, em resposta a um estímulo de desenvolvimento e/ou externo ou de maneira tecido-específica. No presente contexto, o termo “promotor” também é usado para descrever um ácido nucleico recombinante, sintético ou de fusão ou derivado que confere, ativa ou intensifica a expressão de um ácido nucleico ao qual está ligado de maneira operacional. Os promotores exemplificativos podem ser conter cópias adicionais de um ou mais elementos reguladores específicos para intensificar adicionalmente a expressão e/ou alterar a expressão especial e/ou expressão temporal do dito ácido nucleico.

[289] Conforme usado no presente documento, o termo “ligado (a) de maneira opcionalmente a" significa o posicionamento de um promotor em relação a um ácido nucleico de modo que a expressão do ácido nucleico seja controlada pelo promotor.

[290] Muitos vetores para expressão nas células estão disponíveis. Os componentes de vector incluem geralmente, porém sem limitação, um ou mais dentre o seguinte: uma sequência sinal, uma sequência que codifica uma proteína (por exemplo, derivada das informações fornecidas no presente documento), um elemento intensificador, um promotor e uma sequência de terminação de transcrição. A pessoa versada na técnica saberá sequências adequadas para expressão de uma proteína. As sequências sinal incluem sinais de secreção procariótica (por exemplo, pelB, alcalina fosfatase, penicilinase, Ipp ou enterotoxina termoestável II), sinais de secreção de levedura (por exemplo, líder de invertase, líder de fator a ou líder de ácido fosfatase) ou sinais de secreção de mamíferos (por exemplo, sinal de herpes simples gD).

[291] Os promotores exemplificativos em células de mamíferos incluem promotor precoce imediato do citomegalovírus (CMV-IE), promotor de fator de alongamento humano 1-a (EFl), promotores de RNA nuclear pequenos (Ula e Ulb), promotor de cadeia pesada de a-miosina, promotor do vírus símio 40 (SV40), promotor do vírus do sarcoma de Rous (RSV), promotor tardio maior do adenovírus, promotor de fB- actina; elemento —“regulador híbrido que compreende um intensificador de CMV/promotor de B-actina ou um promotor de imunoglobulina ou fragmento ativo do mesmo. Os exemplos de linhagens celulares de célula hospedeira de mamíferos úteis são linhagem de CVl de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem renal embrionária humana (293 ou 293 células subclonadas para crescimento na cultura de suspensão; células de rim de hamster filhote (BHK, ATCC CCL 10); ou células de ovário de hamster chinês (CHO).

[292] Os promotores adequados para expressão em células de levedura, tais como, por exemplo, uma célula de levedura selecionada a partir do grupo que compreende Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae e S. pombe, include, porém sem limitação, o promotor ADH1, o promotor GAL1I, o promotor GALA4, o promotor CUPI, o promotor PHO5, o promotor nmt, o promotor RPR1 ou o promotor TEF1.

[293] Os meios para introduzir o ácido nucleico isolado ou construto de expressão que compreende o mesmo em uma célula para expressão são conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. A técnica usada para uma determinada célula depende das técnicas bem-sucedidas conhecidas. Meios para introduzir DNA recombinante em células incluem microinjeção, transfecção mediada por DEAE-dextran, transfecção mediada por lipossomas, tal como com o uso de lipofectamina (Gibco, MD, USA) e/ou cellfectin (Gibco, MD, USA), absorção de DNA mediada por PEG, eletroporação e bombardeamento com micropartículas, tal como com o uso de tungstênio revestido com DNA ou partículas douradas (Agracetus Inc., WI, EUA) entre outros.

[294] As células hospedeiras usadas para produzir a proteína podem ser cultivadas em vários meios, dependendo do tipo de célula usado. Os meios comercialmente disponíveis, tais como FlI0 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM) (Sigma), RPMl1-1640 (Sigma) e Meio de Dulbecco ou de Eagle Modificado ((DMEM), Sigma) são adequados para cultivar células de mamíferos. Os meios para cultivar outros tipos de células discutidos no presente documento são conhecidos na técnica. Isolamento de proteínas

[295] Os métodos para isolar uma proteína são conhecidos na técnica e/ou descritos no presente documento.

[296] Quando uma proteína é secretada em meio de cultura, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão podem ser concentrados primeiramente com o uso de um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração de Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease, tal como PMSF, pode ser incluídos em qualquer uma das etapas antecedentes para inibir proteolise e antibióticos podem ser incluídos para impedir o crescimento de contaminantes adventícios. Alternativa ou adicionalmente, os sobrenadantes podem ser filtrados e/ou separados das células que expressam a proteína, por exemplo, com o uso de centrifugação contínua

[297] A proteína preparada a partir da células podem ser purificadas com o uso, por exemplo, de troca de íons, cromatografia de hidroxiapatita, cromatografia de interação hidrofóbica, eletroforese em gel, diálise, cromatografia de afinidade (por exemplo, cromatografia de afinidade de proteína A ou cromatografia de proteína G) ou qualquer combinação dos mesmos. Esses métodos são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, no documento nº WO99/57134 ou Ed Harlow e David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988).

[298] A pessoa versada na técnica também terá ciência de que uma proteína pode ser modificada para incluir uma tag a fim de facilitar purificação ou detecção, por exemplo, uma tag de poli-histidina, por exemplo, uma tag de hexa-histidina ou uma tag de hemaglutinina de vírus influenza (HA) ou uma tag de Vírus Simio 5 (V5) ou uma tag de FLAG ou uma tag de glutationa S-transferase (GST). Em seguida, a proteína resultante é purificada com o uso de métodos conhecidos na técnica, tais como purificação de afinidade. Por exemplo, uma proteína que compreende uma tag de hexa-his é purificada por meio do contato com uma amostra que compreende a proteína com ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA) que se liga especificamente a uma tag de hexa-his imobilizada em um suporte sólido ou semissólido, por meio da lavagem da amostra para remover proteína não ligada e subsequentemente por meio da eluição da proteína ligada. Alternativa ou adicionalmente, um ligante ou anticorpo que se liga a uma tag é usado em um método de purificação por afinidade. Inibidores de sinalização de G-CSF à base de ácido nucleico

[299] Em um exemplo da revelação, métodos terapêuticos e/ou profiláticos, conforme descrito no presente documento de acordo com qualquer exemplo da revelação, envolvem reduzir expressão de G-CSF e/ou G-CSFR. Por exemplo, tal método envolve administrar um composto que reduz transcrição e/ou tradução de um ácido nucleico que codifica G-CSF ou G-CSFR. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é um ácido nucleico, por exemplo, um polinucleotídeo antissenso, um ribozima, um PNA, um RNA de interferência, um siRNA, um microRNA.

[300] Em outro exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é um ácido nucleico que codifica um composto de proteína que inibe sinalização de G-CSF (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo). Ácidos nucleicos antissenso

[301] O termo “ácido nucleico antissenso” deve ser considerado como significando um a DNA ou RNA ou derivado dos mesmos (por exemplo, LNA ou PNA) ou uma combinação dos mesmos que é complementar a pelo menos uma de uma molécula específica de mRNA que codifica um polipeptídeo, conforme descrito no presente documento, em qualquer exemplo da revelação e com capacidade para interferir com um evento pós- transcricional, tal como tradução de mMRNA. O uso dos métodos antissenso é conhecido na técnica (consultar, por exemplo, Hartmann e Endres (editores), Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)).

[302] Um ácido nucleico antissenso da revelação hibridizará para um ácido nucleico-alvo sob condições fisiológicas. Os ácidos nucleicos antissenso incluem sequências que correspondem a genes estruturais ou regiões de codificações ou a sequências que efetuam controle sobre a expressão gênica ou splicing. Por exemplo, o ácido nucleico antissenso pode corresponder à região de codificação tida como alvo de um ácido nucleico que codifica o G-CSF ou G-CSFR ou a região 5" não traduzida (UTR) ou a 3'”-UTR ou combinação das mesmas. Isso pode ser complementar parcialmente para as sequências de íntrons, que pode ser submetida a splicing durante ou após transcrição, por exemplo, apenas para as sequências de éxon do gene-alvo. O comprimento da sequência antissenso deve ter pelo menos 19 nucleotídeos contíguos, por exemplo, pelo menos 50 nucleotídeos, tal como pelo menos 100, 200, 500 ou 1000 nucleotídeos de um ácido nucleico que codificam G-CSF ou G-CSFR. A sequência de comprimento total complementar a toda a transcrição de gene pode ser usada. O comprimento pode ser 100 a 2.000 nucleotídeos. O grau de identidade da sequência antissenso com relação à transcrição tida como alvo deve ser pelo menos 90%, por exemplo, 95 a 100%.

[303] Os ácidos nucleicos antissenso exemplificativos em relação ao G-CSF ou G-CSFR são descritos, por exemplo, no documento nº WO2011032204.

Ácido nucleico catalítico

[304] O termo “ácido nucleico catalítico” se refere a uma molécula de DNA ou molécula que contém DNA (também conhecida na técnica como “desoxirribozima” ou “DNAzima”) ou um RNA ou molécula que contém RNA (também denominado de “ribozima” ou

“RNAzima”) que reconhece especificamente um substrato distinto e catalisa uma modificação química desse substrato. O ácido nucleico bases no ácido nucleico catalítico pode ser as bases A, C, G, T (e U para RNA).

[305] Tipicamente, o ácido nucleico catalítico contém uma sequência antissenso para reconhecimento específico de um ácido nucleico alvo, e uma atividade enzimática de clivagem de ácido nucleico (também denominada no presente documento de “domínio catalítico”). Os tipos de ribozimas que são úteis na presente revelação são uma ribozima cabeça de martelo e um ribozima grampo. Interferência de RNA

[306] A interferência de RNA (RNAi) é útil para inibir especificamente a produção de uma proteína particular. sem se ater a nenhuma teoria, essa tecnologia depende da presença de moléculas de dsRNA que contêm uma sequência que é essencialmente idêntica ao mRNA do gene de interesse ou parte do mesmo, no caso de um mRNA que codifica o G-CSF ou G-CSFR. Convenientemente, o dsRNA pode ser produzido a partir de um único promotor em uma célula hospedeira de vetor recombinante, em que as sequências senso e antissenso são flanqueadas por uma sequência não relacionada que possibilita que as sequências senso e antissenso se hibridizem para formar a molécula de dsRNA com a sequência não relacionada para formar uma estrutura de alça. O projeto e produção de moléculas de dsRNA adequadas para a presente revelação é conhecido por uma pessoa versada na técnica, particularmente considerando os documentos nº WO099/32619, WO99/53050, WO99/49029 e WOO01/34815. Tais moléculas de dsRNA para RNAi incluem, porém sem limitação, RNA grampo curto (shRNA) e

ShRNA bifuncional.

[307] O comprimento das sequências senso e antissenso que hibridizam é, cada um, pelo menos 19 nucleotídeos contíguos, tal como pelo menos 30 ou 50 nucleotídeos, por exemplo pelo menos 100, 200, 500 ou 1000 nucleotídeos. A sequência de comprimento total correspondente a toda a transcrição de gene pode ser usada. Os comprimentos podem ser 100 a 2.000 nucleotídeos. O grau de identidade das sequências senso e antissenso à transcrição tida como alvo deve ser pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 90% tal como, 95 a 100%.

[308] Moléculas de RNA de pouca interferência (“siRNA”) compreendem uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a cerca de 19 a 21 nucleotídeos contíguos do mRNA-alvo. Por exemplo, a sequência de siRNA começa com o dinucleotídeo AA, compreende um teor GC de cerca de 30 a 70% (por exemplo, 30 a 60%, tal como 40 a 60% por exemplo, cerca de 45% a 55%) e não tem uma alta identidade de porcentagem a qualquer sequência de nucleotídeos diferentes do alvo no genoma do mamífero no qual deve ser introduzido, por exemplo, conforme determinado por pesquisa padrão BLAST. Aptâmeros

[1309] Em outro exemplo, um composto é um aptâmeros de ácido nucleico (oligômero adaptável). Os aptâmeros são oligonucleotídeos de fita simples ou análogos de oligonucleotídeo que têm capacidade para formar uma estrutura secundária e/ou terciária que fornece a capacidade para se ligar a uma molécula-alvo particular, tal como uma proteína ou uma molécula pequena, por exemplo, G-CSF ou G-CSFR. Desse modo, os aptâmeros são a analogia de oligonucleotídeo aos anticorpos. De modo geral, os aptâmeros compreendem cerca de a cerca de 100 nucleotídeos, tal como cerca de 15 a cerca de 40 nucleotídeos, por exemplo cerca de 20 a cerca de 40 nucleotídeos, visto que os oligonucleotídeos de um comprimento que são abrangidos por essas faixas podem ser preparados por técnicas convencionais.

[310] Um aptâmero pode ser isolado ou identificado de uma biblioteca de aptâmeros. Uma biblioteca de aptâmeros é produzida, por exemplo, clonando-se oligonucleotídeos aleatórios em um vetor (ou um vetor de expressão no caso de um aptâmero de RNA), em que a sequência aleatório é flanqueada por sequências conhecida que fornece o sítio de ligação para iniciadores de PCR. Um aptâmero que fornece a atividade biológica desejada (por exemplo, se liga especificamente ao G-CSF ou G-CSFR) é selecionado. Um aptâmero com atividade aumentada é selecionado, por exemplo, com o uso de SELEX (Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial). Os métodos adequados para produzir e/ou triar uma biblioteca de aptâmeros são descritos, por exemplo, em Elloington e Szostak, Nature 346:818-22, 1990; US 5270163; e/ou US 5475096. Atividade de ensaio de um composto Ligação a G-CSFR e mutantes dos mesmos

[311] Ficará evidente para a pessoa versada na técnica a partir da revelação no presente documento que alguns compostos da presente revelação se ligam ao domínio de ligação ao ligante de hG-CSFR e às formas mutantes específicas do domínio de ligação ao ligante de hG-CSFR (por exemplo, SEQ ID NO: ll sem ou com determinadas mutações pontuais) e/ou se ligam a G-CSFR tanto de um ser humano quanto de um macaco cinomolgo. Os métodos para avaliar a ligação a uma proteína são conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito em Scopes (In: Protein purification: principles and practice, Third Edition, Springer Verlag, 1994). Tal método envolve geralmente identificar a proteína e colocar a mesma em contato com composto imobilizado. Em seguida da lavagem para remover uma proteína ligada não específica, a quantidade de identificação e, consequentemente, a proteína ligada é detectada. Evidentemente, a proteína pode ser imobilizada e o composto que inibe a sinalização de G-CSF identificado. Ensaios do tipo pan também podem ser usados. Alternativa ou adicionalmente, ensaios de ressonância de plasmônio de superfície podem ser usados.

[312] Os ensaios descritos acima também podem ser usados para detectar o nível de ligação de um composto ao hG-CSFR ou um domínio de ligação ao ligante do mesmo (por exemplo, SEQ ID NO: 1) ou forma mutante do mesmo.

[313] Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela lisina na posição 167 da SEQ ID NO: 1 e/ou em que uma alanina é substituída pela histidina na posição 168 da SEQ ID NO: 1 substancialmente no mesmo nível (por exemplo, dentro de 10% ou 5% ou 1%) visto que se liga à SEQ ID NO: 1.

[314] Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela arginina na posição 287 da SEQ ID NO: l a um nível pelo menos cerca de 100 vezes ou 150 vezes ou 160 vezes ou 200 vezes inferior a quando se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: l. Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela arginina na posição 287 da SEQ ID NO: 1 a um nível pelo menos cerca de 160 vezes inferior a quando se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1.

[315] Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela histidina na posição 237 da SEQ ID NO: la um nível pelo menos cerca de 20 vezes ou 40 vezes ou 50 vezes ou 60 vezes inferior a quando se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1. Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela histidina na posição 237 da SEQ ID NO: 1 a um nível pelo menos cerca de 50 vezes inferior a quando se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1.

[316] Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela metionina na posição 198 da SEQ ID NO: la um nível pelo menos cerca de 20 vezes ou 40 vezes ou 60 vezes ou 70 vezes inferior a quando se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1. Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela metionina na posição 198 da SEQ ID NO: 1 a um nível pelo menos cerca de 40 vezes inferior a quando se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1.

[317] Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela tirosina na posição 172 da SEQ ID NO: l a um nível pelo menos cerca de 20 vezes ou 30 vezes ou 40 vezes inferior a quando se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1. Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela tirosina na posição 172 da SEQ ID NO: l à um nível pelo menos cerca de 40 vezes inferior a quando se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1.

[318] Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela leucina na posição 171 da SEQ ID NO: l a um nível pelo menos cerca de 100 vezes ou 120 vezes ou 130 vezes ou 140 vezes inferior a quando se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1. Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela leucina na posição 171 da SEQ ID NO: 1 a um nível pelo menos cerca de 140 vezes inferior a quando se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1.

[319] Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela leucina na posição 111 da SEQ ID NO: l a um nível pelo menos cerca de 20 vezes ou 40 vezes ou 60 vezes ou 70 vezes inferior a quando se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1. Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela leucina na posição 111 da SEQ ID NO: 1 a um nível pelo menos cerca de 60 vezes inferior a quando se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1.

[320] Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela histidina na posição 168 da SEQ ID NO: la um nível de no máximo 5 vezes ou 4 vezes ou 3 vezes ou 2 vezes ou 1 vezes inferior a quando se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[321] Em um exemplo, uma proteína da presente revelação se liga a um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1 em que uma alanina é substituída pela lisina na posição 167 da SEQ ID NO: l1 a um nível de no máximo 5 vezes ou 4 vezes ou 3 vezes ou 2 vezes ou 1 vezes inferior a quando se liga a um polipeptídeo de SEQ ID NO: 1.

[322] O nível de ligação é determinado convencionalmente com o uso de um biossensor.

[323] A presente revelação contempla qualquer combinação das características a seguir. Em um exemplo, uma proteína descrita no presente documento tem todas as características de ligação apresentadas nos sete parágrafos anteriores. Mapeamento de epítopo

[324] Em outro exemplo, o epítopo ligado a uma proteína descrito no presente documento é mapeado. Os métodos de mapeamento de ficarão evidentes para a na técnica. Por exemplo, uma série de peptídeos em sobreposição que abrangem a sequência hG-CSFR, ou uma região da mesma que compreende um epítopo de interesse, por exemplo, peptídeos que compreendem a 15 aminoácidos são produzidos. Em seguida, a proteína entra em contato com cada peptídeo, e o peptídeo (ou peptídeos) ao qual a mesma se liga é determinado. Isso permite a determinação do peptídeo (ou peptídeos) que compreende o epítopo ao qual a proteína se liga. Caso múltiplos peptídeos não contíguos estejam ligados à proteína, a proteína pode se ligar a um epítopo conformacional.

[325] Alternativa ou adicionalmente, os resíduos de aminoácido dentro do hG-CSFR sofrem mutação, por exemplo, por mutagênese de varredura de alanina, e as mutações que reduzem ou impedem a ligação à proteína são determinadas. Qualquer mutação que reduz ou impede a ligação da proteína está propensa a estar dentro do epítopo ao qual a proteína se liga.

[326] Um método adicional é exemplificado no presente documento e envolve a ligação do hG-CSFR ou uma região do mesmo a uma proteína imobilizada da presente revelação e a digestão do complexo resultando com proteases. Os peptídeos que permanece ligado à proteína imobilizada, em seguida, são isolados e analisados, por exemplo, com o uso de espectrometria de massa para determinar a sequência do mesmos.

[327] Um método adicionalmente envolve converter hidrogênios em hG-CSFR ou uma região do mesmo em deutrons e ligar a proteína resultante e uma proteína imobilizada da presente revelação. Em seguida, os deutrons são convertidos novamente em hidrogênio, o hNhG-CSFR ou região do mesmo isolado, digerido com enzimas e analisado, por exemplo, com o uso de espectrometria de massa para identificar aquelas regiões que compreendem deutrons que teriam sido protegidas contra conversão em hidrogênio pela ligação de uma proteína descrita no presente documento.

[328] Opcionalmente, a constante de dissociação (Kd) de uma proteína para hG-CSFR ou um epítopo do mesmo é determinada. A "Kd" ou "valor de Kd" para uma proteína de ligação de hG-CSFR é um exemplo medido por um ensaio de ligação de hG-CSFR identificado com fluorescência e radioidentificado. O ensaio equilibra a proteína com uma concentração mínima de G-CSFR identificado na presença de uma série de titulação de hG-CSFR não identificado. Após a lavagem remover o hG-CSFR não ligado, a quantidade de identificação é determinada, o que indica a Kd da proteína.

[329] De acordo com outro exemplo, a Kd ou valor de Kd é medida com o uso de ensaios de ressonância de plasmônio de superfície, por exemplo, com o uso de ressonância de plasmônio de superfície BIAcore (BIAcore, Inc., Piscataway NJ) com hG-CSFR imobilizado ou uma região do mesmo.

[330] Em alguns exemplos, as proteínas que têm uma Kd semelhante ou uma Kd superior a Cl.2 ou C1l.2G são selecionados, devido ao fato de que estão propensos a competir pela ligação a hG-CSFR. Determinação de ligação competitiva

[331] Os ensaios para determinar uma proteína que inibe competitivamente a ligação do anticorpo monoclonal Cl.2 ou C1.2G ficarão evidentes para a pessoa versada na técnica. Por exemplo, Cl.2 ou Cl1.2G é conjugado a uma identificação detectável, por exemplo, uma identificação fluorescente ou uma identificação radioativa. Em seguida, oO anticorpo identificado e a proteína de teste são misturados e entram em contato com hG-CSFR ou uma região do mesmo (por exemplo, um polipeptídeo que compreende SEQ ID NO: 1) ou uma célula que expressa à mesma. Em seguida, o nível de Cl.2 ou Cl.2G identificados é determinado e em comparação ao nível determinado quando o anticorpo identificado entra em contato com o hG-CSFR, a região ou células na ausência da proteína. Caso o nível de Cl.2 ou C1.2G identificado seja reduzido na presença da proteína de teste em comparação à ausência da proteína, a proteína é considerada como inibindo competitivamente a ligação de Cl1.2 ou C1.2G ao hG-CSFR.

[332] Opcionalmente, a proteína de teste é conjugada a uma identificação diferente para Cl.2 ou Cl.2G. Essa identificação alternativa permite a detecção do nível de ligação da proteína de teste ao hG-CSFR ou a região do mesmo ou a célula.

[333] Em outro exemplo, permite-se que a proteína se ligue ao hG-CSFR ou uma região da mesma (por exemplo, um polipeptídeo que compreende a SEQ ID NO: 1) ou uma célula que expressa a mesma antes de entrar em contato com o hG-CSFR, a região ou célula com Cl.2 ou Cl.2G. Uma redução na quantidade de C1.2 ou C1.2G ligados na presença da proteína em comparação à ausência da proteína indica que a proteína inibe competitivamente a ligação de Cl.2 ou Cl1.2G ao hG-CSFR. Um ensaio recíproco pode ser realizado com o uso da proteína identificada e permitindo primeiramente que o Cl.2 ou C1l.2G se liguem ao G-CSFR. Nesse caso, uma quantidade reduzida de proteína identificada ligada ao hG-CSFR na presença de Cl.2 ou C1.2G em comparação à ausência de Cl.2 ou Cl.2G indica que a proteína inibe competitivamente a ligação de Cl.2 ou C1.2G ao hG-CSFR.

[334] Qualquer um dos ensaios supracitados pode ser realizado com um mutante de hG-CSFR e/ou SEQ ID NO: 1 e/ou um ligante que se liga à região de hG-CSFR ao qual Cl1.2 ou Cl1.2G se liga, por exemplo, conforme descrito no presente documento. Determinação da neutralização

[335] Em alguns exemplos da presente revelação, um composto tem capacidade para neutralizar a sinalização de hG- CSFR.

[336] Vários ensaios são conhecidos na técnica para avaliar a capacidade de um composto para neutralizar a sinalização de um ligante através de um receptor.

[337] Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF reduz ou impede a ligação do G-CSF ao hG-CSFR. Esses ensaios podem ser realizados como um ensaio de ligação competitivo, conforme descrito no presente documento, com o uso G-CSF identificado e/ou proteína identificada.

[338] Em outro exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF reduz a formação de CFU-G quando as células da medula óssea CD34* são cultivadas na presença de G-CSF. Em tais ensaios, as células da medula óssea CD34* são cultivadas em um meio de cultura celular semissólido na presença de G- CSF (por exemplo, cerca de 10 ng/ml de meio de cultura celular) e, opcionalmente fator de célula-tronco (por exemplo, cerca de 10 ng/ml de meio de cultura celular) na presença ou ausência de um composto-teste. Após um tempo suficiente para que os clones de granulócito (CFU-G) se formem, o número de clones ou colônias é determinado. Uma redução no número de colônias na presença do composto que inibe sinalização de G-CSF em comparação à ausência do composto que inibe sinalização de G-CSF indica que o composto que inibe sinalização de G-CSF neutraliza a sinalização de G- CSF. Por meio do teste de múltiplas concentrações do composto que inibe a sinalização de G-CSF, uma TICs é determinada, isto é, uma concentração na qual 50% da inibição máxima de formação de CFU-G ocorre. Em um exemplo, a ICso é 0,2 nM ou menos, tal como 0,1 nM ou menos, por exemplo, 0,09 nM ou menos ou 0,0 8nM ou menos ou 0,07 nM ou menos ou 0,06nM ou menos ou 0,05 nM ou menos. Em um exemplo, a ICso é 0,04 nM ou menos. Em outro exemplo, a ICso é 0,02 nM ou menos. As ICsso supracitadas se referem a qualquer ensaio de CFU-G descrito no presente documento.

[339] Em um exemplo adicional, o composto que inibe a sinalização de G-CSF reduz a proliferação de células (por exemplo, células BaF3) que expressam hG-CSFR que são cultivadas na presença de G-CSF. As células são cultivadas na presença de G-CSF (por exemplo, 0,5 ng/ml) e a presença ou ausência de um composto de teste. Os métodos para avaliar a proliferação de células são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, redução de MTT e incorporação de timidina. Um composto que reduz o nível de proliferação em comparação ao nível observado na ausência do composto é considerado para neutralizar sinalização de G-CSF. Testando-se múltiplas concentrações do composto, uma TICso é determinada, isto é, uma concentração na qual 50% da inibição máxima da proliferação de células ocorre. Em um exemplo, a ICso é 6 nM ou menos, tal como 5,9 nM ou menos. Em outro exemplo, a ICso é 2 nM ou menos ou lnM ou menos ou 0,7 nM ou célula ou 0,6 nM ou menos ou 0,5 nM ou menos. As TICsSso supracitadas se referem a qualquer ensaio de proliferação de células descrito no presente documento.

[340] Em um exemplo adicional, o composto que inibe a sinalização de G-CSF reduz a mobilização de células-tronco hematopoiéticas e/ou células progenitores endoteliais in vivo após a administração de G-CSF e/ou reduz os vários neutrófilos in vivo, por exemplo, após a administração de G- CSF (no entanto, isso não é essencial). Por exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado, opcionalmente antes, durante ou após a administração de G-CSF ou uma forma modificada do mesmo (por exemplo, G-CSF peguilado ou filgrastim). O número de células-tronco hematopoiéticas (por exemplo, que expressam CD34 e/ou Thyl)

e/ou células progenitores endoteliais (por exemplo, que expressam CD34 e VEGFR2) e/ou neutrófilos (identificadas morfologicamente e/ou expressando, por exemplo, CDl10, CDl4, CD31 e/ou CD88) é avaliado. Um composto que reduz o nível da célula (ou células) em comparação ao nível observado na ausência do composto é considerado como neutralizador da sinalização de G-CSF. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF reduz o número de neutrófilos sem induzir neutropenia.

[341] Outros métodos para avaliar neutralização da sinalização de G-CSF são contemplados pela presente revelação. Determinação da função efetora

[342] Conforme discutido no presente documento, algumas proteínas da presente revelação têm função efetora reduzida. Os métodos para avaliar a atividade de ADCC são conhecidos na técnica.

[343] Em um exemplo, o nível de atividade de ADCC é avaliado com o uso de um ensaio de liberação de “!Cr, um ensaio de liberação de európio ou um ensaio de liberação de ?”S. Em cada um desses ensaios, as células que expressam G- CSFR são cultivadas com um ou mais dentre os compostos recitados que inibem a sinalização de G-CSF por um período e sob condições suficientes para que o composto seja absorvido pela célula. No caso de um ensaio de liberação de **S, as células que expressam hG-CSFR podem ser cultivadas com metionina e/ou cisteína identificada com *?”S por um período suficiente para que os aminoácidos identificados sejam incorporados em proteínas recentemente sintetizadas. Em seguida, as células são cultivadas na presença ou na ausência da proteína e na presença de células efetoras imunológicas, por exemplo, células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e/ou células NK. A quantidade de “Cr, európio e/ou ?**S em meio de cultura celular é, em seguida, detectada e pouca ou nenhuma mudança na presença da proteína em comparação à ausência da proteína (ou um nível reduzido do composto em comparação ao nível observado na presença de um anticorpo anti-hG-CSFR que compreende uma IgGl Fc humana) indica que a proteína tem função efetora reduzida. Publicações exemplificativas que revelam ensaios para avaliar o nível de ADCC induzido por uma proteína incluem Hellstrom, et al. Proc. Natl Acad. Sci. EUA 83:7.059 a 7.063, 1986 e Bruggemann, et al., J. Exp. Med. 166:1.351 a 1.361, 1987.

[344] Outros ensaios para avaliar o nível de ADCC induzido por uma proteína incluem ensaio de citotoxicidade não radioativa ACTI"” para citometria de fluxo (Cell Technology, Inc. CA, EUA) ou ensaio de citotoxicidade não radioativo citoTox 9680 (Promega, WI, EUA).

[345] Os de ligação Clq também podem ser realizados para confirmar que a proteína pode se ligar a Clq e pode induzir CDC. A fim de avaliar a ativação de complemento, um ensaio CDC pode ser realizado (consultar, por exemplo, Gazzano- Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163, 1996. Determinação da meia-vida

[346] Algumas proteínas abrangidas pela presente revelação têm uma meia-vida aprimorada, por exemplo, são modificadas sua meia-vida seja prolongada em comparação a proteínas que não são modificadas. Os métodos para determinar uma proteína com uma meia-vida aprimorada ficarão evidentes para a pessoa versada. Por exemplo, a capacidade de uma proteína para se ligar a um receptor de Fc neonatal (FcRn) é avaliado. Nesse sentido, a afinidade de ligação aumentada para FCcRn aumentou a meia-vida sérica da molécula (consultar, por exemplo, Kim et al., Eur J Immunol., 24:2.429, 1994).

[347] A meia-vida de uma proteína da revelação também pode ser medida por estudos farmacocinéticos, por exemplo, de acordo com o método descrito por Kim et al, Eur J of Immunol 24:542, 1994. De acordo com esse método, a proteína radioidentificada é injetada de maneira intravenosa em camundongos e sua concentração plasmática é medida periodicamente como uma função de tempo, por exemplo, a 3 minutos, 72 horas após a injeção. A curva de depuração então obtida deve ser bifásica, ou seja, uma fase alfa e uma fase beta. Para a determinação da meia-vida in vivo da proteína, a taxa de depuração em fase beta é calculada e comparada àquela do tipo selvagem ou proteína não modificada. Eficácia terapêutica

[348] A eficácia de um composto para tratar a lesão por isquemia-reperfusão pode ser avaliada com o uso de um ensaio in vivo. Por exemplo, com o uso de um modelo de camundongo, conforme descrito, em Bohl et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol (2009), Hartsock et al., J Vis Exp (2016), Greenberg et al., Method Enzymol (2008) ou Zhang et al., The FASEB Journal (2016). Composições

[349] Em alguns exemplos, um composto, conforme descrito no presente documento, pode ser administrado por via oral, parenteral, por aspersão para inalação, adsorção, absorção, por via tópica, retal, nasal, bucal, vaginal,

intraventricular, por meio de um reservatório implantado em formulações de dosagem que contêm carreadores farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos convencionais ou por qualquer outra forma de dosagem conveniente. O termo “parenteral” conforme usado no presente documento inclui técnicas de injeção ou de infusão subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intraesternal e intracraniana.

[350] Os métodos para preparar um composto em uma forma adequada para administração (por exemplo, uma composição farmacêutica) são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, métodos, conforme descrito em Remington's Pharmaceutical Sciences (18º edição, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990) e U.S. Pharmacopeia: National Formulary (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1984).

[351] As composições farmacêuticas da presente revelação são particularmente úteis para administração parenteral, tal como administração intravenosa ou administração subcutânea ou administração em uma cavidade do corpo ou lúmen de um órgão ou articulação. As composições para administração compreenderão comumente uma solução do composto que inibe sinalização de G-CSF dissolvida em um carreador farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um carreador aquoso. Uma variedade de carreadores aquosos pode ser usada, por exemplo, solução salina tamponada e semelhantes. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, conforme necessário para aproximar afecções fisiológicas, tais como agentes de ajuste de pH e de tamponamento, agentes de ajuste de toxicidade e semelhantes, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio,

cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio e semelhantes. A concentração do composto da presente revelação nessas formulações pode variar amplamente e será selecionada primariamente com base em volumes de fluido, viscosidades, peso corporal e semelhantes em conformidade com o modo particular de administração selecionado e com as necessidades do paciente. Os carreadores exemplificativos incluem água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e 5% de albumina sérica humana. Os veículos não aquosos, tais como óleos misturados e oleato de etila também podem ser usados. Os lipossomas também podem ser usados como carreadores. Os veículos podem conter quantidades menos de aditivos que intensifican a isotonicidade e solubilidade química, por exemplo, tampões e conservantes.

[352] Mediante a formulação, os compostos da presente revelação serão administrados de maneira compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade de modo que seja terapeuticamente/profilaticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em várias formas de dosagem, tais como o tipo de soluções injetáveis descritas acima, porém outras formas farmaceuticamente aceitáveis também — são contempladas, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas ou outros sólidos para administração oral, supositórios, pessários, soluções ou aspersões nasais, aerossóis, inalantes, formas lipossomais e semelhantes. Cápsulas ou composições farmacêuticas de “liberação lenta” também podem ser usadas. As formulações de liberação lenta são projetadas geralmente para gerar um nível de fármaco constante ao longo de um período de prolongado e podem ser usadas para entregar compostos da presente revelação.

[353] O documento nº WO2002/080967 descreve composições e métodos para administrar composições em aerossol que compreendem anticorpos para o tratamento, por exemplo, asma, que também são adequados para administração de uma proteína da presente revelação.

Terapias de combinação

[354] Em um exemplo, um composto da presente revelação é administrado em combinação com outro composto útil para tratar uma doença ou afecção descrita no presente documento, ou como etapas de tratamento combinadas ou adicionais ou como componentes adicionais de uma formulação terapêutica.

[355] Por exemplo, o outro composto é um composto anti- inflamatório. Alternativa ou adicionalmente, o outro composto é um imunossupressor. Alternativa ou adicionalmente, o outo composto é um corticosteroide, tal como prednisona e/ou prednisolona. Alternativa ou adicionalmente, o outro composto é metotrexato. Alternativa ou adicionalmente, o outro composto é ciclofosfamida.

Alternativa ou adicionalmente, o outro composto é micofenolato de mofetila. Alternativa ou adicionalmente, o outro composto é ativador de plasminogênio tecidual (t-PA).

[356] Em alguns exemplos, o outro composto inibe ou reduz a expressão ou atividade de um ou mais dentre:

[357] (1) molécula de lesão ao rim 1 (KIM-1);

[358] (ii) lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL);

[359] (iii) interleucina 1 beta (IL-16);

[360] (iv) interleucina 6 (IL-6);

[361] (v) fator de necrose tumoral alfa (TNFo);

[362] (vi) receptor do componente 5a do complemento 1

(C5ARL);

[363] (vii) proteína inflamatória de macrófagos 2-alfa (MIP2-alfa);

[364] (viii) Molécula de Adesão Intercelular 1 (ICAM-1);

[365] (ix) E-selectina;

[366] (x) ligante 1 de quimiocina com motivo C-X-C (CXCL1);

[367] (xi) receptor de interleucina 8 beta (IL-8R$B); e

[368] (xii) proteína de quimioatração de monócitos 1 (MCP-1).

[369] Em alguns exemplos, o outro composto é sulfeto de hidrogênio. Em alguns exemplos, o outro composto é ciclosporina. Em alguns exemplos, o outro composto é TRO40303, conforme descrito em Le Lamer et al., J Transl Med (2014). Em alguns exemplos, o outro composto é superóxido dismutase. Em alguns exemplos, o outro composto é um canabinoide ou um análogo sintético do mesmo.

[370] Em alguns exemplos, o outro composto é um que é usado normalmente em cirurgia de transplantação.

[371] Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado simultaneamente com o outro composto.

Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado antes do outro composto. Em um exemplo, oO composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado após o outro composto.

[372] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em combinação com uma célula. Em alguns exemplos, a célula é uma célula-tronco, tal como uma célula-tronco mesenquimal.

[373] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em combinação com uma terapia de genes.

[374] Dosagens e Tempo de administração

[375] As dosagens adequadas de compostos da presente revelação variarão dependendo do composto específico, da afecção a ser tratada e/ou do indivíduo que é tratado. o médico versado na técnica tem capacidade para determinar uma dosagem adequada, por exemplo, começando com uma dosagem subideal e modificando, de maneira incrementar, a dosagem para determinar uma dosagem ideal ou útil. Alternativamente, a fim de determinar uma dosagem apropriada para tratamento/profilaxia, os dados dos ensaios de cultura celular ou estudos animais são usados, em que uma dose adequada está dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem o EDso do composto ativo com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro dessa faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da rota de administração utilizada. Uma dose terapeuticamente/profilaticamente eficaz pode ser estimada inicial a partir dos ensaios de cultura celular. Uma dose pode ser formada em modelos animais para obter uma faixa de concentração plasmática circulante que inclui a ICso (isto é, a concentração do composto que alcança uma inibição meio máxima de sintomas) conforme determinado na cultura celular. Tais informações podem ser usadas para determinar com precisão doses em seres humanos. Os níveis em plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho.

[376] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado sistematicamente. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado localmente.

[377] Será observado pelas pessoas versadas na técnica que a fim de impedir ou de tratar a lesão por isquemia- reperfusão em um indivíduo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF não é necessariamente administrado diretamente ao indivíduo. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um doador de órgão ou a um órgão (por exemplo, um órgão obtido) antes da transplantação ao indivíduo, o que, então, reduz os efeitos da lesão resultante por isquemia- reperfusão no indivíduo após transplantação. Desse modo, a lesão por isquemia-reperfusão em um indivíduo pode ser tratado sem administrar diretamente ao indivíduo o composto que inibe sinalização de G-CSF.

[378] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao indivíduo. Em alguns exemplos, o indivíduo é um receptor de transplante de órgão.

[379] Em alguns exemplos, um método da presente revelação compreende administrado a quantidades terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um composto descrito no presente documento.

[380] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” pé a quantidade que, quando administrada, aprimora a prognose e/ou estado do indivíduo e/ou que reduz ou inibe um ou mais sintomas de uma afecção clínica descrita no presente documento a um nível que está abaixo do que é observado e aceito como clinicamente diagnóstica ou clinicamente característica dessa afecção. A quantidade a ser administrada dependerá das características particulares da afecção a ser tratada, do tipo e do estágio da afecção que é tratada, o modo de administração e das características do indivíduo, tal como saúde geral, outras doenças, idade, sexo, genótipo e peso corporal. Uma pessoa versada na técnica poderá determinar as dosagens adequadas dependendo desses e de outros fatores. Consequentemente, esse termo não deve ser interpretado para limitar a presente revelação a uma quantidade específica, por exemplo, peso ou quantidade do composto, de preferência, a presente revelação abrange qualquer quantidade do composto que inibe sinalização de G- CSF suficiente para obter o resultado declarado em um indivíduo. Em um exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto que inibe sinalização de G-CSF não induz neutropenia.

[381] Conforme usado no presente documento, o termo “quantidade profilaticamente eficaz” deve ser interpretado como significando uma quantidade suficiente para prevenir ou inibir ou atrasar o início de um ou mais sintomas detectáveis de uma afecção clínica. Uma pessoa versada na técnica observará que tal quantidade variará dependendo, por exemplo, do composto específico administrado e/ou do particular indivíduo e/ou do tipo ou da gravidade ou nível de afecção e/ou pré-disposição (genética ou outra) à afecção. Consequentemente, esse termo não deve ser interpretado para limitar a presente revelação a uma quantidade específica, por exemplo, peso ou quantidade do composto, de preferência, a presente revelação abrange qualquer quantidade do composto que inibe sinalização de G-CSF suficiente para obter o resultado declarado em um indivíduo. Em um exemplo, uma quantidade profilaticamente eficaz do composto que inibe sinalização de G-CSF não induz neutropenia.

[382] Para administração in vivo dos compostos descritos no presente documento, quantidades normais de dosagem podem variar de cerca de l0ng/kg até cerca de 100 mg/kg de um peso corporal do indivíduo ou mais por dia. As dosagens e faixas exemplificativas dos mesmos são descritas no presente documento. Para administrações repetidas durante diversos dias ou mais, dependendo da gravidade da doença ou do distúrbio a ser tratado, o tratamento pode ser mantido até que uma supressão desejada dos sintomas seja alcançada.

[383] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose (ou carga) inicial entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, tal como de cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg ou cerca de 2 mg/kg a 8mg/kg ou cerca de 4 mg/kg a 6 mg/kg. Em seguida, o composto que inibe a sinalização de G-CSF pode ser administrado em uma dose de manutenção mais baixa dose entre cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 5 mg/kg, tal como de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 1 mg/kg, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 1 mg/kg, tal como cerca de 0,1 mg/kg ou 0,5 mg/kg ou 1 mg/kg ou 2mg/kg ou 3mg/kg ou 4 mg/kg ou 5 mg/kg. As doses de manutenção podem ser administradas a cada 7 a 30 dias, tal como, a cada 10 a c15 dias, por exemplo, a cada 10 ou 11 ou 12 ou 13 ou 14 ou 15 dias. Nesse sentido, uma dose de manutenção pode ser usada para manter um nível terapeuticamente eficaz do composto no sangue do indivíduo por um período de tempo, por exemplo, após cirurgia de transplantação de órgão.

[384] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose entre cerca de 0,1 mg/kg a cerca de lmg/kg. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose entre cerca de 0,4 mg/kg a cerca de 0,5mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,1 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,2 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,3 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,4 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,5 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,6 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,7 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 0,8 mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 1 ma/kg.

[385] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose entre cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, tal como entre cerca de 0,1mg/kg a cerca de 40mg/kg, por exemplo, entre cerca de 2mg/kg a cerca de 30mg/kg, por exemplo, entre cerca de 5 mg/kg a cerca de 25 mg/kg.

[386] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose entre cerca de 2mg/kg a cerca de 8mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose entre cerca de 4 mg/kg a cerca de 6 mg/kg.

[387] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose entre cerca de 10mg/kg a cerca de 40mg/kg. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose entre cerca de 20mg/kg a cerca de 30mg/kg.

[388] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 5 mg/kg. Em alguns exemplos o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 10 mg/kg. Em alguns exemplos o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a uma dose de cerca de 25 mg/kg.

[389] Em alguns exemplos, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado sem uma dose de carga superior ou uma dose de manutenção inferior.

[390] Em alguns exemplos, o composto —. que inibe sinalização de G-CSF é administrado como uma dose única.

[391] Em alguns exemplos, inúmeras doses são administradas por exemplo, a cada 7 a 30 dias, tal como, a cada 10 a 22 dias, por exemplo, a cada 10 a 15 dias, por exemplo, a cada 10 ou 11 ou 12 ou 13 ou 14 ou 15 ou 16 ou 17 ou 18 ou 19 ou 20 ou 21 ou 22 dias. Por exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a cada 7 dias ou a cada 14 dias ou a cada 21 dias.

[392] Em alguns exemplos, no momento de início da terapia, ao mamífero é administrado o composto que inibe a sinalização de G-CSF durante, no máximo, 7 dias consecutivos ou 6 dias consecutivos ou 5 dias consecutivos ou 4 dias consecutivos. 1393] No caso de um mamífero que não responde adequadamente ao tratamento, múltiplas doses em uma semana podem ser administradas. Alternativa ou adicionalmente o aumento de pode ser administrado.

[394] Em outro exemplo, para mamíferos que sofrem uma reação adversa, a dose (ou carga) inicial pode ser dividida durante vários dias em uma semana ou durante vários dias consecutivos.

[1395] A administração de um composto de acordo com os métodos da presente revelação pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, das condições fisiológica do receptor, caso o propósito seja terapêutico ou profilático, e de outros fatores conhecidos pelos profissionais versados na técnica. A administração de um composto pode ser essencialmente contínua durante um período de tempo pré-selecionado ou pode ser em uma série de doses com intervalos, por exemplo, ou durante ou apóIs o desenvolvimento de uma afecção.

[396] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado antes de uma isquemia. Desse modo, em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre O dia (por exemplo, imediatamente antes da isquemia) a 7 dias antes da isquemia. Por exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre O dia e 6 dias ou 5 dias ou 4 dias antes da isquemia. Por exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre O e 48 horas antes da isquemia. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre 12 e 36 horas antes da isquemia. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado cerca de 36 horas antes da isquemia. Em outros exemplos, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado após a isquemia. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado antes e após a isquemia. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado durante a isquemia, por exemplo durante transplantação de tecido ou de órgão cirurgia.

[397] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado pelo menos 1 hora antes da isquemia (por exemplo, até 7 dias ou mais antes da isquemia). Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado pelo menos 2 ou pelo menos 4 ou pelo menos 6 ou pelo menos 8 ou pelo menos 10 ou pelo menos 12 horas ou pelo menos 14 horas ou pelo menos 16 horas ou pelo menos 18 horas ou pelo menos 20 horas ou pelo menos 22 horas ou pelo menos 24 horas antes da isquemia.

[398] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado antes da reperfusão. Desse modo, em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre O dia (por exemplo, imediatamente reperífusão) a 7 dias antes da reperíusão. Por exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre O dia e 6 dias ou 5 dias ou 4 dias antes da reperfusão. Por exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre O e 48 horas antes da reperfusão. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre 12 e 36 horas antes da reperfusão. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado cerca de 24 horas antes da reperíusão. Em outros exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado após reperfífusão. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado antes e após reperfusão.

[1399] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado pelo menos 1 hora antes da reperfusão. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado pelo menos 2 ou pelo menos 4 ou pelo menos 6 ou pelo menos 8 ou pelo menos 10 ou pelo menos 12 horas ou pelo menos 14 horas ou pelo menos 16 horas ou pelo menos 18 horas ou pelo menos 20 horas ou pelo menos 22 horas ou pelo menos 24 horas antes da isquemia (por exemplo, até 7 dias ou mais) antes da reperfusão. Transplantação de tecido ou de órgão

[400] Quando a lesão por isquemia-reperfusão é devido ou está associada a transplantação de tecido ou de órgão, o composto que inibe sinalização de G-CSF pode ser administrado ou antes, durante ou após transplantação. Desse modo, em alguns exemplos o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado antes da transplantação. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado durante transplantação, por exemplo antes de o grampo ser liberado, nesse momento, o fluxo de sangue é restaurado para o órgão transplantado. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado após a transplantação.

[401] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao indivíduo, em que o indivíduo é um receptor da transplantação de tecido ou de órgão. Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao receptor da transplantação de tecido ou de órgão antes da reperífusão. Em um exemplo, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao receptor da transplantação de tecido ou de órgão após a reperfusão.

[402] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao doador de transplantação de tecido ou de órgão antes da obtenção de tecido ou órgão.

[403] Em alguns exemplos, o doador de transplantação de tecido ou de órgão é um doador vivo. Em alguns exemplos, o doador é um doador falecido. Doadores falecidos podem ser classificados em diversos grupos dependendo da qualidade do órgão e/ou da sequência e de mecanismos de cessação de funções circulatórias e respiratórias. A classificação de doadores falecidos é descrita em Panduranga & Akinlolu (Clin J Am Soc Nephrol 4: 1.827 a 1.831, 200).

[404] Em alguns exemplos, o doador é um doador para doação após morte encefálica (DBD), também denominado de doador "com morte encefálica". Um doador de DBD é um doador que que teve morte encefálica primária porém cujo sistema circulatório permanece funcional, seja naturalmente ou por meio de medidas médicas (por exemplo, ventilação mecânica, fármacos, bomba de balão intra-aórtico ou dispositivo de oxigenação por máquina extracorpórea). Em alguns exemplos, o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado ao doador de DBD antes da obtenção de órgão e é distribuído aos órgãos de transplante potenciais pela circulação sanguínea.

[405] Em alguns exemplos, o doador é um doador para doação após morte circulatória (DCD), também denominado de doador para “doação após morte cardíaca” ou um “doador sem batimentos cardíacos”. Um doador DCD é um doador que perdeu a função circulatória (por exemplo, parada cardíaca) antes da obtenção do órgão. Em alguns exemplos, a circulação artificial, tal como por instrumentos para ponte cardiopulmonar, pode ser necessária para entregar o composto administrado ao doador DCD ao órgão (ou órgãos) contemplados para obtenção e transplante. Os doadores de DCD podem ser classificados adicionalmente em subgrupos adicionais. Em alguns exemplos, o doador DCD é um doador de DCD controlado (cDCD). Um doador cDCD é um doador cujo suporte vital será interrompido e cuja família forneceu consentimento escrito para doação de órgão no ambiente controlado da sala de cirurgia. Em alguns exemplos, o doador DCD é um doador DCD (uDCD) não controlado. Um doador uDCD é um doador, por exemplo, que morre na sala de emergência ou em outro lugar no hospital antes de o consentimento para doação do órgão ser obtido e antes de os cateteres serem colocados nos vasos femorais e no peritônio para resfriar os órgãos até que o consentimento seja obtido. Um doador uDCD também é um doador que consentiu doação de órgão, porém sofreu parada cardíaca o que exigiu CPR durante a obtenção dos órgãos.

[406] Em alguns exemplos, o doador é um doador com critérios expandidos (ECD). Um ECD é um doador que, no momento da morte, tem 60 anos de idade ou mais ou que tem 50 a 59 anos e atende a quaisquer dois dentre os três seguintes: (1) causa da morte é acidente vascular cerebral; (2 histórico de pré-existente de hipertensão sistêmica; e (3) creatinina sérica terminal superior a 1,5 mg/dl.

[407] Em alguns exemplos, o doador é um doador de critério padrão (SCD). Um SCD é um doador que tem menos que 50 anos de idade. De modo geral, todos os doadores falecidos para os quais a doação ocorreu após a morte encefálica e que não atenderam aos critérios para um ECD (consultar acima) são considerados um SCD.

[408] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado logo após a determinação da morte encefálica ou logo após morte encefálica uma vez que é viável, dadas as considerações legais, éticas e do pacientes. O método assistente ou cirurgião do transplante reconhecerá vários fatores que influenciam o tempo da obtenção do órgão de um doador adequado e do transplante dos órgãos obtidos em um receptor adequado. Desse modo, em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao doador a qualquer momento entre a ocorrência da morte encefálica e a remoção de um órgão destinado para transplante.

[409] Em alguns exemplos, o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a um tecido ou órgão obtido ex vivo, antes da transplantação de tecido ou de órgão. Por exemplo, o órgão ou tecido obtido pode ser perfurado ou infundido com uma solução que compreende o composto que inibe sinalização de G-CSF antes da transplantação. Kits

[410] Outro exemplo da revelação fornece kits que contêm compostos úteis para o tratamento de lesão por isquemia- reperfusão, conforme descrito acima.

[411] Em um exemplo, o kit compreende (a) um recipiente que compreende um composto que inibe sinalização de G-CSF conforme descrito no presente documento, opcionalmente em um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável; e (b) um inserto de pacote com instruções para reduzir um efeito de lesão por isquemia-reperfusão em um indivíduo.

[412] Em conformidade com esse exemplo da revelação, o inserto de pacote está do recipiente, ou está associado ao mesmo. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas etc. Os recipientes podem ser formados a partir de vários materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente retém ou contém uma composição que é eficaz para tratar a lesão por isquemia-reperfusão e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem um batente passível de perfuração por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é o composto que inibe a sinalização de G-CSF que inibe sinalização de G-CSF. O inserto de identificação ou de pacote indica que a composição é usada para tratar um indivíduo elegível para tratamento, por exemplo, um receptor de transplante de órgão, com orientação especial em relação a quantidade e intervalos de dosagem do composto e qualquer outro medicamento que é fornecido. O kit pode compreender adicionalmente um recipiente adicional que compreende um tampão diluente farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada por fosfato, solução de Ringer e/ou solução de dextrose. O kit pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial de usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros e agulhas e seringas.

[413] A presente revelação inclui os exemplos não limitativos a seguir. Exemplos Exemplo 1: métodos e materiais

Camundongos

[414] camundongos machos adultos do tipo selvagem C57BL/6 com idade de 10 a 12 semanas foram obtidos do Animal Resource Centre, Perth, Austrália. Os camundongos foram alojados em uma instalação de animal aprovada dentro do Hospital St. Vincent de Melbourne, e todos os experimentos que envolvem animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Hospital St. Vincent de Melbourne. Modelo de lesão por isquemia-reperfusão renal quente

[415] Os camundongos foram anestesiados por administração i.p. de cetamina a 85 mg/kg e xilazina 15 mg/kg. Após os camundongos serem anestesiados, os mesmos foram colocados em um bloco de aquecimento para manter a temperatura corporal principal dos mesmos a 37 ºC durante a cirurgia. Uma incisão abdominal na linha intermediária foi feita, e os pedículos renais foram dessecados abruptamente. Após nefrectomia direita, um grampo microvascular (Roboz, Rockville, MD) foi colocado no pendículo renal esquerdo por 22 minutos, ao passo que o animal foi mantido a 37 ºC em um incubador e bem hidratado. O grampo foi removido após a isquemia, e foi observado que o rim confirmou reperfusão completa. Os ferimentos cirúrgicos foram em seguida, suturados em duas camadas com 5 a O de seda. A solução salina normal (100 ml/kg) foi instilada na cavidade peritoneal durante o procedimento. Permitiu-se que os camundongos se recuperassem por 2 horas sob uma lâmpada de aquecimento e, em seguida, mantidos em um bloco de aquecimento. Os camundongos foram submetidos à eutanásia 24 horas após reperfusão, e as amostras de sangue e de rim foram obtidas. Os camundongos operados por meio de Sham foram submetidos apenas à nefrectomia direita, sem IR. Anticorpos

[416] O G-CSFR anticamundongo (Ch5E2-VR8l1-mIgGl, controle de isótipo (BM4, IgGl de camundongo isótipo ou anticorpo anti-C5 (muBB5S.l-mIgGl (Rother R, et al. Nat Biotechnol. 2007) foram injetados a 100/camundongo em 0,2 ml PBS por via intraperitoneal 24 horas antes de iniciar a isquemia. Em um estudo de titulação de dose, o G-CSFR anticamundongo (Ch5E2- VR81-mIgG1 foi injetado a 200/camundongo ou 500/camundongo em 0,2 ml PBS por via intraperitoneal 24h antes da isquemia. O controle de isótipo foi injetado na dose mais alta, portanto, 500/camundongo. VR81l é um anticorpo IgGlXK monoclonal de camundongo produzido contra do domínio extracelular de G-CSFR de murganho e bloqueia a ligação de G-CSF ao G-CSFR, conforme descrito (Campbell et al. Journal of Immunology, 197(11) (2016) 4.392 a 4.402). Nesse sentido, o VR81 é um anticorpo substituto de camundongo para Cl.2 e Cl.2G descrito no presente documento e no documento nº WO2012171057. Avaliação de função renal

[417] A função renal foi avaliada por medição de creatinina sérica e ureia sérica ou plasmática 24 horas após a reperfusão. A creatinina foi medida com o uso de um ensaio colorimétrico cinético com base no método Jaffé, analisado em um analisador de Roche COBAS Integra 400 Plus. O Kit de Ensaio de Ureua da Cell Biolabs' se baseia na reação de Berthelot. A ureia degrada primeiramente em amônia e dióxido de carbono, o que reage primeiramente com um desenvolvedor alcalino para produzir um produto de cor azul-verde que pode ser medido com um leitor de placa espectrofotométrico padrão a uma densidade óptica entre 580 a 630 nm.

Histologia renal e pontuação

[418] As seções de tecido do rim (4 mm) foram 10% fixas em formalina e incorporadas em parafina, em seguida, marcadas com H&E. As pontuações de histologia foram avaliadas por um método semiquantitativo (Lu B et al. Nephrology 2008). Em suma, três campos de grande aumento em cada um dentre o córtex, junção corticomedular e a medula em um mínimo de duas seções submetidos à avaliação cega. O grau de necrose tubular foi classificado e um sistema de pontuação modificado foi usado. 0 = rim normal; 1 = mínimo (nº 10% de envolvimento); 2 = intermediário (10 a 25% de envolvimento); 3 = moderado (26 a 50% de envolvimento); 4 = grave (51 a 75% de envolvimento); e 5 = muito grave (75% de envolvimento). Ativação e deposição completas

[419] A ativação do complemento em plasma de camundongo foi medido com o uso de um Kit C5a DuoSet ELISA para camundongo (DY2150; R&D Systems, Minneapolis, MN) de acordo com as instruções do fabricante. A deposição do C5b-9 em seções do rim foi medido por imunofluorescência (consultar a seguir). Imunofluorescência

[420] Amostras de biópsia por congelamento instantâneo foram cortadas em seções de 5 mm de espessura, secas a ar e ou processadas imediatamente ou armazenadas a 280 “C até análise adicional. Após fixação com acetona e hidratação, as seções foram marcadas com o uso de: C9 Alexa 488 anticamundongo de coelho (Bioss Antibodies, Woburn, MA), Ly- 6GFITC de rato anticamundongo (Hycult Bio- tech), F4/80 FITC de rato anticamundongo (Bio-Rad, Raleigh, NC) ou Ab de controle pareado com isótipo conjugado a FITC: IgGl de rato

(BD Biosciences, San Diego, CA). As lâminas foram analisadas com o uso de um microscópio de fluorescência/confocal (Nikon AIR). A quantificação da intensidade da fluorescência como densidade integrada bruta foi realizada com o uso do software ImageJ, versão 10.2 (National Institutes of Health) em imagens TIFF não manipuladas. Extração de RNA, síntese complementar de DNA e reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa

[421] O RNA total de rins congelados de camundongo foi isolado com o uso do minikit de RNA PureLink (Life Technologies, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A qualidade e quantidades totais do RNA foram determinados com o uso do espectrômetro NanoDrop (NanoDrop Technologies, Oxfordshire, UK). A síntese de DNA complementar da primeira fita foi realizada incubando-se 1,0 ug do RNA total em uma mistura de reação de 50 pl que contém 0,5 ug de iniciadores Oligo (dT) e 1 ug de iniciadores aleatórios (ambos da Invitrogen, Carlsbad, CA) a 70 “C por 10 minutos. A mistura de reação de 50 pl que contém 10 mM de dNTP, inibidor de ribonuclease recombinante 300 U SuperScript III, inibidor de ribonuclease recombinante 60 U RNaseOUT, DTT 0,1 M e 5 tampões de cinco fitas (todos da Invitrogen) foram, então, adicionados. A transcrição reversa foi realizada a 42 “C pro 1 hora e 70 “C por 10 minutos. O DNA complementar foi armazenado a -20 ºC. A reação em cadeia da polimerase em tempo real foi realizada com o uso do sistema de Mistura Mestre de PCR Universal TaqMan de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystem, Bedford, MA). Digestão renal e preparação de sangue periférico

[422] Um pedaço de 1/8 do rim foi cortado com um bisturi em pedaços menores, que foi digerido em 500 ul de Colagenase Tipo I (10 ug/ml em PBS com EDTA 2 mM) sob condições de agitação a 37 “C por 30 minutos. As células foram isoladas passando a digestão do tecido através de um filtro de 70 um. As células vermelhas sanguíneas foram lisadas com o uso do tampão RCRB (NH4Cl 156 mM, NaHCO3 11,9 mM, EDTA 0,097 mM, pH 7,3). As células foram, por fim, suspensas novamente em PBS com EDTA 2 mM.

[423] ( sangue periférico foi coletado em tubos revestidos com EDTA, células vermelhas sanguíneas foram lisadas com o uso do tampão RCRB (conforme acima), e as células foram suspensas novamente em PBS com EDTA 2 mM. Citometria de fluxo

[424] As suspensões de célula única do rim e sangue periférico foram suspensas novamente em PBS com EDTA 2 mM. As células foram marcadas com os seguintes Abs: Gr-1 anticamundongo conjugado a PE (R86-8C5; BD Biosciences), Ly6G anticamundongo conjugado a Cy7 de aloficocianina (1A8; BD Biosciences), CDllb anticamundongo conjugado a FITC (M1/70; BD Biosciences), CD69 anticamundongo conjugado a PECy7 (H1.2F3; BD Biosciences), CD62L anticamundongo conjugado a eFluor450 (MEL-14; eBiosecience), CD45.2 anticamundongo conjugado a aloficocianina (104; eBioseciences). O CDl6/32 anticamundongo de bloqueio de FcR (93; Biolegend) foi adicionado para reduzir a ligação não específica, e o Amarelo Fixável Live/Dead (Thermo Fisher Scientific) foi usado para excluir células mortas. As amostras foram fixas de um dia para o outro com o uso de um tampão de Fixação BD Cytofix (BD Biosciences) e, em seguida, analisadas em um BD Fortessa, com o uso do software FlowJo.

Análise estatística

[425] Os testes estatísticos foram realizados com o uso do software GraphPad Prism. Os grupos múltiplos foram comparados com uso de ANOVA unidirecional com uma correção de Bonferroni pós-teste ou um teste de Kruskal-Wallis com teste de comparações múltiplas de Dunn. Dois grupos foram comparados com o uso de um teste t de student não pareado (bicaudal) ou um teste U de Mann-Whitney. Os resultados são expressos como média +SEM. Um valor p <0,05 foi considerado como estatisticamente significativo. Exemplo 2: Inibição da sinalização de G-CSF em um modelo de IRI renal quente reduz concentrações de creatinina sérica e ureia plasmática

[426] A fim de avaliar se a inibição da sinalização de G- CSF em camundongos submetidos a lesão por isquemia-reperfusão renal “quente (IRI) reduz lesão renal, a análise das concentrações de creatinina sérica e plasma/ureia sérica foi realizada.

[427] A redução significativa nas concentrações de creatinina sérica foi observada nos camundongos tratados com 100 ug de um anticorpo anti-G-CSFR (VR81) (n=8; média t+ SEM; 66,13 + 25,18) em comparação a concentrações de creatinina sérica em camundongos tratados com 100 ug de um anticorpo de controle de isótipo (n=8; média t SEM; 134,38 t+ 20,57) (Figura 1, Tabela 1).

[428] Uma redução significativa nas concentrações de ureia plasmática foi observada nos camundongos tratados com um anticorpo anti-G-CSFR (VR81) (n=8; média t+ SEM; 159,02 t 44,42) em comparação a um anticorpo de controle de isótipo (n=8; média + SEM; 292,49 + 21,35) (Figura 2, Tabela 1). As concentrações de creatinina sérica e ureia plasmática em camundongos tratados com um anticorpo anti-G-CSFR (VR81) antes da IRI foram comparáveis àqueles observados em camundongos não submetidos a tratamento ou cirurgia (sham) (Figuras 1 e 2; Tabela 1). Além disso, as concentrações de creatinina sérica e ureia plasmática em camundongos tratados com VR81 não foram significativamente diferentes daquelas observados nos camundongos tratados com um anticorpo anti-C5 (BB5.1) (Figuras 9 e 10).

Tabela 1 Níveis de creatinina sérica e ureia plasmática nos camundongos tratados com 100 ug de anticorpo anti-G-CSFR (VR81) ou um anticorpo de controle de isótipo por via intraperitoneal (IP) - modelo de IRI renal quente.

4 Creatinina Ureia Número do Ari + Camundongo Grupo de tratamento sérica plasmática (pmol/1) (mg/dl)

2.276 Controle de isótipo)| 183 324 2278 Controle de isótipo) 90 225 2279 — controle de isótipo| — 208 — | 3% | 2285 Controle de isótipo) 122 302 2286 Controle de isótipo)| 85 295 2289 — Controle de isótipo| — 205 — | 335 | | 2290 |controle de isótipo| 55 | 185 2275 Controle de isótipo)| 127 299 2277 — |anti-G-CSFR (VRS1) 2280 anti-G-CSFR (VR81) 19 71 2261 — JantiGcesmR (vRBD| — 3 / 2% 2202 — Jantizo-cssR (VROD 2283 anti-G-CSFR (VR81) 38 159 2284 — anti GesrR (VRAL) 2287 anti-G-CSFR (VR81) 26 57 2268 — lancice-csmr (vReD | 2 [| “E Exemplo 3: Inibição da sinalização de G-CSF em um modelo de IRI renal quente reduz infiltração inflamatória no tecido renal

[429] A fim de avaliar o efeito de administração do anticorpo anti-G-CSFR (VR81) aos camundongos submetidos à lesão por isquemia-reperfusão renal quente (IRI), a infiltração de neutrófilos e de macrófagos no tecido renal foi medida por microscopia imunofluorescência de acordo com o Exemplo 1.

[430] A infiltração de neutrófilos e macrófagos dentro do interstício tubular nas junções corticomedulares dos rins foi significativamente reduzida nos camundongos tratados com 100 pg do anticorpo anti-G-CSFR (VR81) em comparação aos camundongos tratados com 100 pg de um anticorpo de controle de isótipo. Pouca/nenhuma infiltração foi observada nos camundongos sham (Figuras 3 e 4). A ANOVA unidirecional (com correção Bonferroni) foi usada para significância de teste.

[431] Em um experimento separado, a infiltração de neutrófilos e macrófagos também foi reduzida de maneira significativa em camundongos tratados com 200 pg e 500 ug de VR81 em comparação a camundongos tratados com 500 1pg de um anticorpo de controle de isótipo (Tabela 2 e Figura 5). Tabela 2 redução na infiltração de neutrófilos e de macrófagos dentro “do interstício tubular nas junções corticomedulares do teste omnibus de normalidade de D'Agostino & Pearson nos rins, teste de Kruskal-Wallis e ANOVA unidirecional, teste de comparações múltiplas de Dunn para VR81 vs. controle de Ab (* p<0,05, ** p<0,01).

Tratamento |Neutrófilos (contagens/HPF) (contagens/HPF) Controle de | 51,0+6,40 52,0+3,38 Ab (500 ug) (200 ug) (500 ug) Exemplo 4: A inibição da sinalização de G-CSF em um modelo de IRI renal quente reduz necrose no córtex renal

[432] Os danos ao rim no córtex renal foram avaliados no modelo de IRI renal quente nos camundongos tratados com 100 ug de um anticorpo anti-G-CSFR (VR81). O grau de necrose tubular foi classificado e expresso como uma pontuação de Lesão Tubular (TI) em conformidade com a Tabela 3. A TI foi determinada sem conhecimento do grupo de tratamento por dois operadores "independentes que avalian a porcentagem de envolvimento de lesão tubular renal (necrose, formação de cilindro urinário, edema celular e dilatação).

[433] Uma tendência de lesão tubular reduzida foi observada nos rins de camundongos tratados com o anticorpo anti-G-CSFR (VR81) (Figura 6; média de duas avaliações independentes exibidas por camundongo). Os camundongos sham não exibiram lesão tubular conforme esperado. Tabela 3: Tabela de referência que define a porcentagem de células necróticas no córtex renal e a pontuação de lesão tubular (TI) correspondente.

Pontuação de lesão tubular% de necrose tubular (córtex (TI) lapenas) o h , Exemplo 5: Expressão de KIM-l1, NGAL, IL-6, IL-8RB/CXCR2, MCP-1/CCL2, CXCLl1, MIP-2/CXCL2, ICAM-l1 e C5aR mRNA no tecido renal - modelo de IRI renal quente

[434] Em um experimento inicial, os camundongos foram injetados com 100 ug/camundongo do anticorpo anti-G-CSFR VR81 24 h antes de a lesão por isquemia/reperfusão ter sido induzida no modelo de IRI renal quente. Após a reperfífusão, o RNA foi isolado dos rins e submetidos à qaRT-PCR, conforme descrito no Exemplo 1. Os níveis de transcrição de mRNA de KIM-1, NGAL, IL-6, IL-8REB/CXCR2, MCP-1/CCL2, ICAM-l1, C5aR, IL-18, TNFa, CXCL1, MIP-2/CXCL2 e E-selectina foram determinados. Os níveis de transcrição desses genes foram quantificados e normalizados em relação a GAPDH.

[435] O tratamento com anticorpo anti-G-CSFR (VR81) a uma dosagem de 100 ug/camundongo em 24 h reduziu a expressão gênica of NGAL, IL-6, IL-8REB/CXCR2, ICAM-l, C5aR, MIP- 2/CXCL2, MCP-1/CCL2, E-selectina e CXCLl em comparação ao tratamento com o anticorpo de controle de isótipo. Esses dados sugerem que a inibição da sinalização de G-CSF é eficaz na redução da resposta inflamatória associada à IRI. Um padrão semelhante de expressão reduzida dos genes acima foi observado nos rins dos camundongos tratados com anticorpo anti-C5 (BB5.1).

[436] Os resultados iniciais foram confirmados com o uso de uma dose de 200 upg/camundongo ou 500 upg/camundongo de VR81. A Tabela 4 e a Figura 7 mostra que o tratamento VR81 a uma dosagem de 500 ug/camundongo reduziu significativamente a expressão de KIM-l1, NGAL, IL-6, IL-S8REB/CXCR2, ICAM-l, C5aR, MIP-2/CXCL2, MCP-1/CCL2, e CXCL1l em comparação ao tratamento com o anticorpo de controle de isótipo.

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Exemplo 6: A inibição de sinalização de G-CSF reduz infiltração de neutrófilos no rim em um modelo de IRI renal quente

[437] Neutrófilos (CDllb'Grl*) e leucócitos (CD1l1b-Grl1" CD45.2*) renais foram enumerados por digestão de tecido e citometria de fluxo de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1. A porcentagem de células vivas foi determinado com base na marcação PI do total de populações celulares.

[438] os números reduzidos de neutrófilos foram observados nos rins de camundongos tratados com 100 upug/camundongo de um anticorpo anti-GCSFR (VR81) ou anticorpo anti-C5 (BB5.1) (e camundongos sham) em comparação a camundongos tratados com um anticorpo de controle de isótipo (Figura 8A). Os números de neutrófilo de sangue periférico foram semelhantes em todos os grupos experimentais (Figura 8B) .

[439] De modo semelhante, houve uma redução significativa nos números de neutrófilos observados nos rins de camundongos tratados com 200 ug/camundongo ou 500 ug/camundongo de VR81 em comparação aos camundongos tratados com um anticorpo de controle de isótipo (Figura 13A). No entanto, não houve redução significativa de neutrófilos observados no sangue periférico, em relação ao anticorpo de controle de isótipo (Figura 13B).

[440] Esses dados sugerem que o tratamento com anticorpo anti-G-CSFR (VR81) reduz infiltração de neutrófilos no rim e não impacta significativamente os números de neutrófilos no sangue periférico.

[441] Nenhuma diferença significativa foi observada na expressão de CD69 ou CD62L por neutrófilos nos rins ou sangue periférico em todos os grupos experimentais de camundongos.

[442] Nenhuma diferença significativa na porcentagem de leucócitos (CDl1b Gr1-CD45.2*) foi observada nos rins de camundongos tratados com anticorpo anti-G-CSFR (VR81) ou anticorpo anti-C5 (BB5.1) em comparação a camundongos tratados com um anticorpo de controle de isótipo. Exemplo 7: Titulação de dose de VR81 no modelo de IRI renal quente

[443] Em um estudo de titulação de dose no modelo de IRI renal quente descritos no Exemplo 1, o anticorpo G-CSFR anticamundongo (VR81) foi injetado 24 h antes da lesão por isquemia-reperfusão a uma dose de 200 ug/camundongo ou 500 ug/camundongo. Os camundongos tratados com 500 ug/camundongo do anticorpo de controle de isótipo serviu como controles.

[444] Houve uma redução significativa nos níveis de creatinina sérica e ureia sérica nos camundongos tratados com 500 ug de VR81, porém não nos camundongos tratados com 200 ug de VR81 ou 500 ug do anticorpo de controle de isótipo, conforme mostrado na Tabela 5 e nas Figuras 11 e 12. Tabela 5 Níveis de creatinina sérica e ureia sérica em camundongos doseados com 200 ug e 500 ug VR81/camundongo. Teste omnibus de normalidade de D'Agostino & Pearson, teste de Kruskal-Wallis e ANOVA unidirecional, teste de Comparações Múltiplas de Dunn para VR81 vs. controle de Ab (* p<0,05, ** p<0,01).

e ee Creatinina (pM) (mg/dl) mo 116,0+38,5 344+94,2 ug) Exemplo 8: Inibição de sinalização de G-CSF reduz ativação de C5 de complemento e da deposição de C5b-9 em um modelo de IRI renal quente

[445] A fim de avaliar a administração do anti-G-CSFR (VR81) a camundongos submetidos a lesão por isquemia- reperfusão renal quente (IRL), a ativação de Cc5 de complemento foi medida analisando-se o C5a no plasma com o uso de um kit ELISA de C5a para camundongo, e a deposição do Cc5b-9 foi medida por marcação com imunofluorescência de seções do rim de acordo com o Exemplo 1.

[446] Houve uma redução significativa nos níveis de C5a plasmático nos camundongos tratados com 500 ug de VR81, em comparação a camundongos tratados com 500 ug do anticorpo de controle de isótipo, conforme mostrado na Tabela 6 e na Figura 14A.

[447] Houve, também, uma redução significativa na deposição de C5b-9 dos rins de camundongos tratados com 500 pg de VR81, em comparação a camundongos tratados com 500 ug do anticorpo de controle de isótipo, conforme mostrado na Tabela 6 e Figura 14B. Tabela 6 ativação de C5 de complemento e deposição de C5b-9 nos camundongos tratados com 200 pg ou 500 pg de VR81 (*p<0,05, **p<0,02, ***p<0,001 versus controle de Ab).

Tratamento C5a Deposição de C5b-9 (ng/ml) (RawIntDen) Ssham 2,93+0,26 |/3,52+0,38x10* Controle del25+0,99 1,14+0,17x107 ab (500 ug) IVR81 17,31+1,95 |7,73+1,6x105 (200 ug) IVR81 10,69+0,90 |4,31+0,78x105º (500 ug) Exemplo 9: A administração de um inibidor de sinalização de G-CSF 1 h antes da isquemia reduz frequência de neutrófilos no rim e no sangue em um modelo de IRI renal quente

[448] A fim de avaliar o efeito de administração do anticorpo anti-G-CSFR (VR81) nos camundongos 1 h antes da isquemia no modelo de IRI renal quente, a frequência dos neutrófilos (CDllb+Grl+Ly6G+) no rim e no sangue foram medidos por digestão de tecido e citometria de fluxo de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1. Os 500 ug/camundongo do anticorpo anti-C5, BB5.1, foram usados para comparação.

[449] O tratamento com 500 ug/camundongo do anticorpo anti-G-CSFR VR81 1 h antes da isquemia reduziu significativamente a frequência dos neutrófilos no sangue e no rim em comparação ao tratamento com um anticorpo de controle de isótipo (Figura 15). O tratamento com 500 ug/camundongo do anticorpo de controle BB5.1 não reduziu significativamente a frequência dos neutrófilos no rim em comparação ao tratamento com um anticorpo de controle de isótipo. Esses resultados demonstram que o tratamento com um inibidor de sinalização de G-CSF 1 h antes da isquemia,

embora não seja tão eficaz quanto o tratamento 24 h antes da isquemia (Figura 13), é suficiente para reduzir significativamente os números de neutrófilo no sangue e no rim.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para prevenir ou tratar lesão por isquemia- reperfusão em um indivíduo, sendo — que o método é caracterizado pelo fato de que compreende administrar um composto que inibe sinalização de fator estimulador de colônia de granulócitos (G-CSF).

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a lesão por isquemia-reperfusão é devido ou associada à transplantação de tecido ou órgão.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a transplantação de órgão é uma transplantação de rim.

4, Método, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado ao indivíduo, em que o indivíduo é um receptor da transplantação de tecido ou de órgão.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado a um doador de transplantação de tecido ou de órgão antes da coleta do órgão e/ou a um tecido ou órgão antes da transplantação.

6. Método de transplantação de tecido ou de órgão ou para aprimorar o resultado de um transplantação de tecido ou de órgão ou para aprimorar a função de um tecido ou órgão transplantado ou para prevenir função atrasada do enxerto, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende administrar um composto que inibe sinalização de G-CSF a um receptor de transplante de tecido ou de órgão antes ou no momento do transplante do tecido ou órgão e, em seguida, transplantar o tecido ou órgão para o receptor de transplante de tecido ou órgão.

7. Método de transplantação de tecido ou de órgão ou para aprimorar o resultado de uma transplantação de tecido ou de órgão ou para aprimorar a função de um tecido ou órgão transplantado ou para prevenir função atrasada do enxerto, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende administrar um composto que inibe sinalização de G-CSF a um doador de transplante de tecido ou de órgão antes da coleta do tecido ou órgão; coletar o tecido ou órgão e transplantar o tecido ou órgão para um receptor de transplante de tecido ou órgão.

8. Método de transplantação de tecido ou de órgão ou para aprimorar resultado de uma transplantação de tecido ou de órgão ou para aprimorar a função de um tecido ou órgão transplantado ou para prevenir função atrasada do enxerto, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende administrar um composto que inibe sinalização de G-CSF a um tecido ou órgão obtido ex vivo e transplantar o tecido ou órgão obtido para um receptor de transplante de tecido ou órgão.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações l1 a 8, caracterizado pelo fato de que o composto que inibe a sinalização de G-CSF é administrado antes da isquemia ou da reperfusão.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado entre O e 48 horas antes da isquemia ou da reperfusão.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado cerca de 48 horas antes da isquemia ou da reperfusão.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a lesão por isquemia-reperfusão é devida ou está associada a um ou mais dentre o seguinte: (i) transplantação de órgão; (ii) cirurgia; (111) trauma; (iv) sepse; (v) um tumor; e (vi) acidente vascular cerebral.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 to 12, caracterizado pelo fato de que o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou prevenir inflamação.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações l1 a 13, caracterizado pelo fato de que o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para ter um ou mais dentre os seguintes efeitos: (i) reduzir ou prevenir a infiltração de neutrófilos; (ii) reduzir ou prevenir infiltração de macrófagos; (v) reduzir ou prevenir ativação de C5 de complemento; e (vi) reduzir ou prevenir deposição de C5b-9.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações l1 a 14, caracterizado pelo fato de que o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para ter um ou mais dentre os seguintes efeitos: (i) reduzir ou prevenir um aumento em níveis de creatinina sérica ou plasmática; e

(ii) reduzir ou prevenir um aumento em níveis de ureia sérica ou plasmática.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações l1 a 15, caracterizado pelo fato de que o composto que inibe sinalização de G-CSF é administrado em uma quantidade suficiente para reduzir ou inibir expressão de um ou mais dentre o seguinte: (1) molécula de lesão ao rim 1 (KIM-1); (ii) lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos (NGAL); (iii) interleucina 1 beta (IL-16); (iv) interleucina 6 (IL-6); (v) fator de necrose tumoral alfa (TNFa); (vi) receptor do componente 5a do complemento 1 (C5AR1); (vii) proteína inflamatória de macrófagos 2-alfa (MIP2-alfa); (viii) Molécula de Adesão Intercelular 1 (ICAM-1); (ix) E-selectina; (x) ligante 1 de quimiocina com motivo C-X-C (CXCL1); (xi) receptor de interleucina 8 beta (IL-8RB); e (xii) proteína de quimioatração de monócitos 1 (MCP-1).

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações l1 a 16, caracterizado pelo fato de que o composto que inibe a sinalização de G-CSF se liga ao receptor de G-CSF ou G-CSF (G-CSFR) .

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o composto que inibe sinalização de G-CSF é uma proteína que compreende uma região variável de anticorpo que se liga ou se liga especificamente a G-CSF ou G-CSFR e neutraliza a sinalização de G-CSF.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o composto que inibe sinalização de G-CSF é uma proteína que compreende um Fv.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a proteína é selecionada a partir do grupo que consiste em: (i) um fragmento Fv de cadeia única (scFv); (ii) um scFv dimérico (di-scFv); ou (iv) um dia-anticorpo; (v) um tria-anticorpo; (vi) um tetra-anticorpo; (vii) um Fab; (viii) um F(ab')>2; (ix) um Fv; (x) um dentre (1) a (ix) ligado a uma região constante de um anticorpo, Fc ou um domínio constante de cadeia pesada (Cm) 2 e/ou Cr3; (xi) um dentre (i) a (ix) ligado a uma albumina ou um fragmento funcional ou variantes dos mesmos ou uma proteína que se liga à albumina; ou (xii) um anticorpo.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de que a proteína compreende uma região variável de anticorpo que se liga, ou se liga especificamente, ao G-CSFR e inibe competitivamente a ligação do anticorpo C1l1.2G que compreende uma região variável de cadeia pesada (Vrx) que compreende uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve (V1) que compreende uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 5 a G- CSFR.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de que a proteína que se liga a um epítopo que compreende resíduos dentro de uma ou duas ou três ou quatro regiões selecionadas a partir de 111 a 115, 170 a 176, 218 a 234 e/ou 286-300 da SEQ ID NO: 1.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que a proteína é um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma sequência de aminoácidos apresenta na SEQ ID NO: 5.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que a proteína é um anticorpo que compreende um VH que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3.

25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que a proteína é um anticorpo que compreende uma VH que compreende três CDRs de uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 e uma VL que compreende três CDRs de uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 5.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que a proteína é um anticorpo que compreende uma VH que compreende três CDRs de uma VH que compreente uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 e uma VL que compreende três CDRs de uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 3.