KR100903581B1 - 돼지 액상정액 장기보존을 위한 희석제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인공수정에 사용되는 돼지 액상정액의 장기보존 희석제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하나 이상의 당(sugar)이 결합된 항산화 효과가 있는 플라보노이드 제재를 포함하는 돼지 액상정액 장기보존 희석제에 관한 것이다. 본 발명의 상기 희석제에는 정자 세포막의 지질 대사를 억제하여 채취 후 산폐되는 과정을 억제하는 항산화 효과가 있는 플라보노이드 제제를 포함하고 있어서, 보존 시간경과에 따른 정자 세포막 지질의 산패로 인한 정자의 생존율 및 운동성, 정자 DNA 손상에 있어 종래에 개시된 pH 완충작용제 및 대사성 영양소 첨가제에 비해 10일 이상 보존하여도 정자의 운동성이나, 생존성, 나아가 수태율에 영향을 끼치지 않는 탁월한 효과가 있다.

돼지 정액(Porcine semen), 희석제(Diluent), 항산화제(Antioxidant), 장기 보존(Long term preservation)

Description

돼지 액상정액 장기보존을 위한 희석제{Porcine Liquid Semen Diluent for Long Term Preservation}

본 발명은 돼지 액상정액 장기보존 희석제에 관한 것으로, 돼지 정액을 장기 보존한 경우에도 정액 내에 살아 있는 정자의 수, 정자의 성상과 활력 등이 10일 이상 그대로 유지될 수 있게 하는 돼지 액상 정액 장기보존용 희석제에 관한 것이다.

근래 산업의 발달과 더불어 유전공학은 그 국가의 과학발전을 가늠할 수 있는 척도라 할 만큼 중요한 학문으로 자리 잡고 있으며, 이러한 유전공학은 우량 품종을 보존 개발하고, 나아가 인류의 생명을 보존하기 위해 필요한 학문으로서 기초 단계를 넘어 상당한 수준에 이르고 있다.

인간이 사육하고 있는 가축이나 애완동물의 번식을 위하여 종부를 시킬 때에 자연종부를 실시하게 되면 수컷 1마리와 암컷 1마리밖에 종부시킬 수 없으나, 액상 정액을 이용하여 인공수정을 시키면 한번 채취한 수컷의 원 정액을 희석액과 혼합 하여 정액량을 증가시켜 여러 마리의 암컷에 수정을 시킬 수 있다. 따라서 인공수정에 의하면 우수한 유전형질을 가진 정액을 채취하여 동시에 여러 마리의 암컷에 수정이 가능하므로 혈통이 우수한 종자의 생산 및 순종의 보존이 가능해진다.

이러한 장점을 가지고 있는 인공수정 방법이 성공하기 위해서는 희석제의 개발이 중요한 관건이 되는데, 이에 대한 연구가 수십 년 전부터 시작되어 여러 동물 및 가축에 적용할 수 있는 정자의 동결 보존법은 개발되어 사용되고 있으나, 돼지의 경우 정자 생리학적 특성상 동결 보존된 정자로는 수태율이 너무 저조하여 액상 정액을 이용하여 인공수정을 하고 있는 실정이나, 정액을 액상형상으로 장기 보존할 수 있는 희석제에 대한 개발은 현재 미비한 시점이다.

국내의 양돈 농가들은 양돈사육 규모가 전업화로 확대되고 사육 형태가 협업 또는 단지화로 구성되면서 돼지 인공수정에 대한 필요성이 높아지고 있으며 대부분의 양돈농가들이 인공수정을 실시하고 있다. 그러나 돼지의 인공수정 실용화와 확대보급을 위해서는 돼지 액상정액을 이용한 인공수정기술 확립이 급선무이지만, 돼지의 인공수정에 필요한 희석제는 대부분 외국산을 도입하여 이용하고 있거나 희석제 제조기술을 전수 받아서 국내에서 제조하는 복제사용에 의존하고 있는 실정이며, 국내의 연구진에 의해 실험실에서 제조된 희석제는 계란의 노른자(난황), pH 보존제, 대사성 영양소가 첨가된 정도이며 이 역시 보존기간이 3~4일 미만인 실정이다. 따라서, 수태율 및 분만율 등의 측면에서 자연 종부와 비교하여 열등하지 않으며 산업화가 가능한 돼지 정액의 인공수정용 희석제의 개발이 강력하게 요구되 어 왔다.

정자 세포막에 존재하는 지질은 시간이 지남에 따라 산화가 발생하고 정자의 운동성, 정자 두부 첨체의 구조적 온전성 및 생존성을 급격히 감소시키는 것으로 보고되어 있다(Michael R et al., 2004. Sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertility & Sterility. Vol 81. N0.5 1289~1295 ; Charlotte D. et al., 2004. Boar sperm storage capacity of BTS and androhep plus: viability, motility, capacitation, and tyrosine phosphosrylation. Theriogenology 62. 874~886). 지질의 산화는 대사 과정 중에 발생하는 활성산소계의 영향으로 알려져 있으며, 포유류의 정자 특히 돼지 정자는 불포화 지방산을 많이 가지고 있는 반면 상대적으로 적은 항산화제를 가지고 있기 때문에 활성산소종의 유해한 영향에 매우 민감하게 반응하고 사출되어 시간이 경과함에 따라 발생하는 산화작용로 인하여 정자의 생존성, 운동성저하, 세균증식 등에 의해 수정 능력에 큰 영향을 받게 된다. 체내에서는 정액과 정장 내에 존재하는 복합 항산화제 계통은 정상적인 상태 하에서 발생하는 활성산소종을 완화할 수 있는 기능이 있다. 그러나 체외조건에서 항산화제 기능이 부족하거나 과도하게 발생될 경우 정자는 심각한 손상을 받게 되므로 최근에는 활성 산소종을 완화시킬 수 있는 연구가 활발히 진행되고 있다. 정자 세포막에 악영향을 미치는 산화 작용이 강력한 활성 산소종의 종류로는 superoxide anion(O₂ ^-), peroxyl radical(ROO^-), hydroxyl radical(OH^-), hydrogen peroxide(H₂O₂) 등이 알려져 있으며, 이와 같은 활성 산소종의 악영향을 완화시키는 항산화제로는 효소계 항산화제와 비효소계 항산화제가 알려져 있는데, Superoxide dismutase(SOD), catalase, Glutathione Peroxidase(GSHPx) 등이 대표적인 효소계 항산화제이며, 비타민E(α-tocopherol), 비타민C(ascorbic acid), 카로티노이드(carotenoids) 거의 대부분, ubiquinol/quinine(coenzyme Q), 플라보노이드(flavonoids) 등이 비효소계 항산화제로 알려져 있다.

국내에서는 돼지정액의 보존을 위하여 pH 완충작용제 및 대사성 영양소 첨가 희석 보존액이 사용되고 있으나, 사실상 거의 모든 희석액이 보존 후 3~4일부터는 정자의 운동성 및 생존율이 급격히 저하되어 희석 후 3일 이내에 사용하여야 되기 때문에 종모돈으로부터의 정액채취빈도와 정액의 유통상에 문제가 되고 있어 희석제는 거의 전량 외국으로부터 수입에 의존하고 있고 돼지 정자의 생리 특성에 맞추어 새로운 정자 희석액의 국내 개발과 보급이 시급한 실정이다

국외의 경우 미국에서 개발한 Beltsville Thawing Solution(BTS) 이나, 독일에서 개발된 Androhep, 그리고 스페인에서 개발된 Ensure와 그 외에도, Modena, Zorlesco라는 희석 보존액이 보급되어 사용되어 지고 있으며 이들 제품에는 버퍼용액 조성에 Tris, Citrate, EDTA, HEPES, BSA 등을 첨가하여 대사조절, pH 변화억제, 정자의 응결 등을 방지하는 수준으로 국내 제품에 비해서는 보존기간이 다소 길다고는 하나, 이들 제품 역시 3~7일 이상 보존했을 때 생존율 및 운동성 저하로 인하여 수태율이 저조하기 때문에 사용시간에 제약이 있고, 보존 시간경과에 따른 근본적인 산화 억제와 정자 성상에 있어 본 발명과는 상이한 차이가 있다고 볼 수 있다.

이와 같이, 현재까지 돼지의 번식을 위한 인공수정에는 돼지 정자의 생리학적 특성상 동결정액이 원활하게 사용되지 못하고 있고 거의 대부분 액상정액이 사용되어지고 있으나 액상정액은 동결보존된 정액에 비해 보존기간이 짧은 단점이 있어 우수한 웅돈의 정액 활용이 원활하지 못하고 보존기간에 따른 정자 운동성 저하 및 세균감염으로 인한 수태율 저하로 인한 엄청난 경제적인 손실을 가져오고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 돼지 인공수정에 사용되는 돼지 액상정액을 정자 운동성이나 정자 두부 첨체 등에 손상되지 않으면서도 보존기간을 늘려 돼지 액상정액을 장기간 사용 할 수 있는 방법을 찾고자 노력하던 중, 두 개의 당(3-glucoside 7-glucuronide, 구조식 1)이 붙어있는 식물에서 추출한 플라보노이드 항산화제가 함유된 버퍼 보존액을 이용하여 돼지수컷에서 채취한 정액을 희석한 결과, 체외로 사출된 정자가 처하는 여러 유해 환경을 개선해 주어 생존성과 활력을 보존시킴으로써 정액보존 시간을 연장시켜 줌을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 돼지 정자 특이성에 따른 액상정액의 장기보존을 가능하게 하는 희석제를 제공하는 것이다. 상기 본 발명의 희석제를 이용하면 정액을 10일 이상 보관이 가능하고, 희석하여 상기 보관된 정액을 이용하여도 수태율에 전혀 손상을 주지 않는다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나 이상의 당(sugar)이 결합된 항산화 효과가 있는 플라보노이드 제재를 포함하는 돼지 액상정액 장기보존 희석제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 희석제에 있어서, 상기 플라보노이드는 2개의 당(sugar)이 결합된 것이 바람직하고, 하기 구조식 1과 같이 3-glucoside-7-glucuronide가 결합된 것이 보다 바람직하다. 상기 플라보노이드는 하기 구조식과 같이, 3번 탄소와 7번 탄소위치에 포도당과 글루쿠론산이 결합된 3-glucoside 7-O-glucuronide 구조를 포함하고 있다.

(구조식 1)

또한, 본 발명의 희석제에 있어서, 상기 플라보노이드는 식물로부터 추출되는 것이 바람직하고, 증류수 100 ㎖ 당 0.01 내지 10 ㎎을 함유하는 것이 바람직하다. 본 발명의 상기 희석제는 10 내지 22℃에서 돼지 액상정액을 처리하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 희석제에 있어서, 상기 희석제는 플라보노이드 이외에 포도당, Sodium citrate, Sodium bicarbonate, EDTA, Potassium chloride, Potassium phosphate, Citric acid, Bovine Serum Albumin(Fraction V), glycine, Tris, 및 Trehalose로 구성된 기본용액을 포함하는 것이 바람직하고, 상기 기본용액은 증류수 100 ㎖ 당 포도당 1~10 g, Sodium citrate 0.2~3 g, Sodium bicarbonate 0.05~1 g, EDTA 0.05~2 g, Potassium chloride 0.01~2 g, Potassium phosphate 0.01~0.5 g, Citric acid 0.005~0.1 g, Bovine Serum Albumin(Fraction V) 5~100 ㎎, glycine 0.5~3 g, Tris 0.5~30 g 및 Trehalose 0.01~1 g를 포함하는 것이 보다 바람직하다.

아울러, 상기 기본용액은 추가적으로 항생제로 겐타마이신(gentamycin) 네오마이신(neomycin), 및 아프라마이신(apramycin)으로 구성된 군중에서 선택된 항생 제를 함유하는 것이 보다 바람직하고, 결국, 상기 희석제는 증류수 100 ㎖ 당 플라보노이드 0.01 내지 10 ㎎, 포도당 1~10 g, Sodium citrate 0.2~3 g, Sodium bicarbonate 0.05~1 g, EDTA 0.05~2 g, Potassium chloride 0.01~2 g, Potassium phosphate 0.01~0.5 g, Citric acid 0.005~0.1 g, Bovine Serum Albumin(Fraction V) 5~100 ㎎, glycine 0.5~3 g, Tris 0.5~30 g, Trehalose 0.01~1 g 및 겐타마이신 50~10,000 IU를 포함하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 돼지 액상정액 장기보존 희석제는 천연물 상태로 식물에서 추출한 비효소계 항산화물질인 플라보노이드(구조식 1)를 함유하고 있어서, 정액보존 시간경과에 따른 정자 세포막 지질의 산패로 인한 정자의 생존율 및 운동성, 정자 DNA 손상에 있어 종래에 개시된 pH 완충작용제 및 대사성 영양소 첨가제에 비해 10일 이상 보존하여도 정자의 운동성이나, 생존성, 나아가 수태율에 영향을 끼치지 않는 탁월한 새로운 희석제이다.

본 발명에 따른 돼지 액상정액의 장기보존용 희석제에 사용되는 성분 중 포도당은 대사기질 및 에너지원으로 작용한다. Sodium citrate, Sodium bicarbonate, Bovine Serum Albumin, EDTA, Potassium chloride, Potassium phosphate, Citric acid, glycine, Tris 및 Trehalose 등은 정자의 완충작용, 및 산도(pH)와 삼투압을 조절하고, 온도 충격을 완화하기 위함이다. 아울러, 항생제인 겐타마이신(gentamycin), 네오마이신(neomycin), 혹은 아프라마이신(apramycin) 은 보존기간의 연장에 따른 액상 정액 내의 세균오염에 의한 정자의 생존성 저하를 방지하기 위함이다. 본 발명에 따른 희석제는 돼지 정액의 정자 생존성 및 활력을 유지시켜 정액을 장기간 보존할 수 있으며 정상적인 수태율과 분만율을 유지하게 해준다.

본 발명의 돼지 액상정액의 장기보존용 희석제의 제조과정은 다음과 같다.

(1) 플라보노이드 추출

식물의 잎을 수확 및 동결건조 하여 메탄올 등을 이용하여 추출 및 여과 농축하고, 클로로포름 및 에틸아세테이트로 용매 등으로 농축시켜 1차 농축한다. 상기 추출물을 고성능 액체크로마토그래피로 각 성분별로 회수하고, 상기 성분들을 2차원 크로마토그래피 및 자외선 분광기 등을 이용하여 플라보노이드 성분 중 하나 이상, 바람직하게는 두 종류 이상의 당이 결합된 배당체를 얻어낸다(구조식 1). 이후 유기용매 성분을 완전히 제거하고 동결 건조를 통하여 냉동 보관하며 항산화제로 사용한다.

(2) 항산화제 첨가된 정자 희석액의 제조 및 선발

정자 희석액의 기본 조성으로는 Glucose, Sodium citrate, Sodium bicabonate, Bovine Serum Albumin (Fraction V), EDTA, Potassium chloride, Potassium phosphate, Citric acid, glycine, Tris, Trehalose 등 무기 염류를 기반으로 기본 용액을 제조한다. 이 기본 용액에 추출하여 상기 준비된 플라보노이 드 배당체 화합물들을 다양한 농도 및 pH, 항생제 별로 첨가하여 여러 조합의 용액을 제조한다. 상기 용액을 이용하여 돼지 정자를 희석하여 보존 일수에 따른 정자 운동성을 우선적으로 확인한 후 활력이 우수한 조성을 선발한다.

(3) 보존 시간경과에 따른 정자 성상 검사

신선하게 채취된 정액은 즉시 정자 운동성 검사(computer assisted sperm analysis)를 실시하여 운동성이 양호한 개체의 것을 시료로 선택한 후 여러 희석제에 희석 보존한 후 유세포 분석기(flowcytometer)를 이용하여 시간경과에 따른 정자 생존율, 운동성(미토콘드리아 기능검사)을 실시하여 비교하고, 아울러 정자 DNA 구조 이상 유무(sperm chromatin structure assay)를 실시하여 위해 성분이 있는지에 대해 시판되고 있는 제품들과 비교한다.

본 발명은 정자 세포막의 지질 대사를 억제하여 채취 후 산폐되는 과정을 억제하는 항산화 효과가 있는 플라보노이드 제제를 포함하는 희석제를 제공함으로써, 보존 시간경과에 따른 정자 세포막 지질의 산패로 인한 정자의 생존율 및 운동성, 정자 DNA 손상에 있어 종래에 개시된 pH 완충작용제 및 대사성 영양소 첨가제에 비해 10일 이상 보존하여도 정자의 운동성이나, 생존성, 나아가 수태율에 영향을 끼치지 않는 탁월한 효과가 있다. 따라서, 지금까지 보관이 곤란한 돼지 액상정액을 장기보존할 수 있어서 혈통이 우수한 돼지의 품종을 보존할 수 있고, 돼지의 정액 을 적절한 시기 및 장소에서 암돼지에 인공수정하여 수태율을 높일 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

<실시예 1 > 항산화제 플라보노이드 추출

활엽수에 속하는 식물 10 종의 잎을 수확하여 동결 건조시켰다. 이것을 85% 및 50% 메탄올을 이용하여 3일간 연속 추출 및 여과하고 회전증발기를 이용하여 40℃ 이하의 항온 수조에서 감압증발 방법으로 통하여 농축하였다. 그리고 나서, 이를 클로로포름을 이용하여 3,000 rpm의 원심력으로 20분간 원심분리하여 엽록소를 제거한 색소성분만을 추출하였다. 상기 추출물을 에틸아세테이트를 이용하여 용매 분획을 통하여 안토시아닌 성분을 제거하여 플라보노이드 성분들만을 분리해내었다. 그리고 나서, 이를 회전 증발기를 이용하여 농축시켜 1차 농축 원액 추출물을 확보하였다.

상기 1차 농축 원액 추출물을 아세토나이트릴과 2% 초산을 이동상으로 하여 고성능 액체크로마토그래피에 전개시켜 각 성분별로 회수하고 이를 다시 농축하여 플라보노이드 성분들을 순수 분리하였다. 순수 분리된 각 물질들은 2차원 크로마토그래피 및 자외선 분광기 등을 이용하여 각각의 전개율 값 및 방출 시간 그리고 스펙트럼 자료에 의거하여 성분을 동정한 후, 플라보노이드 성분 중 두 종류 이상의 당이 결합된 배당체(구조식 1)를 분리하였다. 그리고 나서, 에틸알콜과 증류수를 이용하여 유기용매 성분을 완전히 제거하고 동결 건조를 통하여 순수한 플라보노이드 결정들만을 얻어내어 냉동 보관하며 항산화제로 사용하였다.

<실시예 2 > 희석제의 제조 및 정액 희석

다음과 같은 조성을 갖는 혼합물을 혼합기를 이용하여 균일하게 혼합하여 돼지 정액 희석제를 제조하였다.

증류수 100 ㎖ 당 플라보노이드 배당체(구조식 1) 0.1 ㎎, 포도당 4 g, Sodium citrate 0.7 g, Sodium bicabonate 0.12 g, Bovine Serum Albumin(Fraction V) 30 ㎎, EDTA 0.15 g, Potassium chloride 0.1 g, Potassium phosphate 0.05 g, Citric acid 0.02 g, glycine 0.3 g, Tris 6 g, Trehalose 0.1 g, 및 겐타마이신 900 IU를 함유하도록 잘 섞어주었다.

상기 제조한 희석제를 이용하여 신선하게 음경 수압법으로 채취된 정액을, 희석액 1 ㎖당 200 만개의 정자로 희석시켰다. 이때, 상기 정액의 채취 과정은 당업자에게 명백한 사항이라 자세한 내용은 생략한다.

<시험예> 액상정액 희석제가 정자활력에 미치는 영향 테스트

신선하게 채취된 정액을 즉시 3개의 그룹으로 나뉘어(Androhep (A), Beltsville Thowing Solution (B), 그리고 본 발명의 희석제 Q), 희석액 1 ㎖당 2000만 마리의 정자로 희석하여 17℃의 정액 보관고에 보관하면서 보관 경과일수에 따라 정자 생존율, 운동성(미토콘드리아 검사), DNA 손상(염색질인 크로마틴 구조) 검사를 위해 형광 염색을 한 후 성상검사를 FACS Aria 유세포 분석기를 이용해 실시하였다. 이때, Androhep (A)의 구성성분은 100 ㎖당 glucose 0.26 g, Sodium citrate 0.8 g, EDTA 0.24 g, Sodium bicarbonate 0.12 g, HEPES 0.9 g, Bovine Serum Albumin 25 ㎎을 함유하고 있다. 또한, Beltsville Thowing Solution (B)의 구성성분은 증류수 100 ㎖당 glucose 0.37 g, Sodium citrate 0.6 g, EDTA 0.125 g, Sodium bicarbonate 0.125 g, potassium chloride 75 ㎎을 함유하고 있다. 각 테스트를 이하에서 보다 상세히 설명한다.

<시험예 1> 정자 생존율 테스트

정자세포의 생존율 검사는 200 x 현미경상에서 기본적인 관찰을 실시한 후, 보다 객관적이고 정확한 분석을 위하여 생사염색을 실시하여 유세포 분석기 (flowcytometer)로 분석하였다. 구체적으로, 희석된 정자세포의 각 군을 보존시간 경과별로 SYBR-14 형광염료{살아있는 세포는 블루 레이저 광원(488 ㎚)에 의해 녹색의 형광을 발광하며 530/30 ㎚ 밴드필터에 의하여 형광 시그널이 집광됨}와 propidium iodide 형광염료{사멸된 세포는 블루 레이저 광원(488 ㎚) 에 의해 빨강색의 형광을 발광하며 610/20 ㎚ 밴드필터에 의하여 형광 시그널이 집광됨}을 5분 간 실온에서 염색하여. 유세포 분석기에 옮겨 평균 20,000만개의 정자에서 녹색 및 빨강색 형광 비율을 분석하여 보존 시간 경과별 정자의 생존비율을 분석하였다(도 1).

그 결과, 보존 후 처음 4일간 정자 생존율에는 3개 그룹에서 유의적인 차이가 인정되지 않았으나, 희석 보존 경과 후 5일부터는 A 및 B 제품군은 생존율이 저하되기 시작하였고, 특히 B 제품에서의 생존율 저하가 두드러지게 나타났다. 반면 본 발명의 희석제인 Q에서는 보존 경과 후 10일까지 비교적 안정되게 처음 생존율을 유지하는 것으로 나타났다.

<시험예 2> 정자 운동성 테스트

정자 활력 검사를 위해 정자의 에너지원인 정자 내 미토콘드리아 활성을 조사하였다. 구체적으로, 200 x 현미경하에서 기본적인 활력을 관찰 한 후 보다 정확하고 객관적인 활력 검사를 위해 미토콘드리아 막을 특정하게 염색할 수 있는 Rhodamine-123(미토콘드리아 기능이 정상인 세포는 블루 레이저 광원(488 ㎚) 에 의해 녹색형광을 발광하고 575/26 ㎚ 파장영역에서 형광 시그널이 집광됨) 형광 염료와 아울러 사멸한 정자를 선별하기 위하여 propidium iodide 형광염료를 각각 실온에서 10분간 염색하여 정자내 미토콘드리아 기능을 평균 20,000개의 정자를 유세포 분석기를 이용하여 보존 시간경과별로 비교 검사하였다(도 2).

그 결과, 정자 운동성은 정자 생존율 검사에서와 같은 유사한 패턴을 나타남을 확인하였다. 전 시험기간을 통해 Q는 정자 운동성에 큰 변화가 없이 유지하고 있어 10 일 이상 보존된 정자를 이용하여 인공수정을 실시하였을 때에도 수태율에 문제가 없음을 시사하고 있다.

<시험예 3> 정자 DNA 손상 테스트

보존 경과 일수에 따른 정자세포막 지질의 산화로 발생할 수 있는 정자 DNA 손상을 검사하였다. 구체적으로, 정상적인 2중 나선구조의 DNA 가닥은 Acridine Orange 형광 염료에 의해 염색이 되고 블루 레이저 광원(488 ㎚) 에 의해 녹색의 형광을 발광하게 되어 530/30 ㎚ 밴드 필터에 의해 형광 시그널이 집광되는 반면 손상된 단일 가닥의 DNA 구조는 블루 레이저 광원(488 ㎚)에 의해 빨강 형광을 발광하게 되어 610/20 ㎚ 밴드 필터에 의해 형광 시그널이 집광된다. 상기 열거한 두 개의 형광염료를 실온에서 각각 5분간 염색한 후 평균 20,000개의 정자에서 보존 시간 경과별 형광 비율을 유세포 분석기로 비교, 분석하였다(도 3).

그 결과, 보존 후 7일 경과부터 A 및 B 제품군에서 2중 나선구조의 DNA 가닥에 대한 손상이 발생함을 보여주고 있고, 이는 현재 알려진 정자 크로마틴 구조의 변화와 남성 불임 간에 상관관계가 높다는 보고(D'Occhio et al., 2007. Biology of sperm chromatin structure and relationship to male fertility and embryonic survival. Anim Reprod Sci. 101(1-2):1-17)에 비추어 보아 이들 제품군에 보존된 정자로 인공수정을 실시할 경우 수태율 저하를 가져올 수 있음을 시사한다. 그에 반하여, Q 군에서는 거의 안정되게 발광을 나타내어 상당한 기간 경과후에도 안정된 수태율을 유지시킬 수 있음을 나타낸다.

<시험예 4> 정자 산화도 테스트

보존 경과 일수에 따른 정자 산화 정도를 측정하기 위하여 pH 변화를 pH 미터를 이용하여 희석하지 않은 원정액을 포함하여 제품별로 희석 보존된 정액 각 5 ㎖을 취하여 보존 시간 경과별로 비교 측정하였다(도 4).

그 결과, 채취한 후 보존액에 희석하지 않은 원 정액은 예상대로 지질 대사로 인해 4일 이후부터는 급격한 산화 현상을 나타냈으며, A군은 4일 이후부터 산성쪽으로 하강하기 시작하였고, 반면에 B군은 오히려 pH가 알칼리성으로 올라가는 현상이 발생했으며(대사 증진으로 인한 일시적으로 활력의 증가를 가져오나 결국 짧은 시간 안에 활력의 급격한 저하를 가져온다), Q군은 비교적 전 기간을 통하여 pH가 유지되어 항산화 효과가 탁월함을 확인하였다.

도 1은 종래의 희석제 A와 B 제품군 및 본 발명의 희석제 Q를 사용한 경우의 정자 생존율을 나타내는 그래프이고,

도 2는 종래의 희석제 A와 B 제품군 및 본 발명의 희석제 Q를 사용한 경우의 정자 운동성을 나타낸 그래프이고,

도 3은 종래의 희석제 A와 B 제품군 및 본 발명의 희석제 Q를 사용한 경우의 정자 DNA 2중 나선 구조의 이상 유무를 퍼센트로 나타낸 그래프이고,

도 4는 종래의 희석제 A와 B 제품군 및 본 발명의 희석제 Q를 사용한 경우의 정액의 pH 변화를 나타낸 그래프이다.

Claims (10)

1. 하기 구조식 1과 같이 3-glucoside-7-glucuronide가 결합된 항산화 효과가 있는 플라보노이드 제재를 포함하는 돼지 액상정액 장기보존 희석제.

   (구조식 1)

   
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5. 제 1항에 있어서, 상기 플라보노이드는 증류수 100 ㎖ 당 0.01 내지 10 ㎎을 함유하는 것을 특징으로 하는 돼지 액상정액 장기보존 희석제.
6. 제 1항에 있어서, 상기 희석제는 플라보노이드 이외에 포도당, Sodium citrate, Sodium bicarbonate, EDTA, Potassium chloride, Potassium phosphate, Citric acid, Bovine Serum Albumin(Fraction V), glycine, Tris, 및 Trehalose로 구성된 기본용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 액상정액 장기보존 희석제.
7. 제 6항에 있어서, 상기 기본용액은 증류수 100 ㎖ 당 포도당 1~10 g, Sodium citrate 0.2~3 g, Sodium bicarbonate 0.05~1 g, EDTA 0.05~2 g, Potassium chloride 0.01~2 g, Potassium phosphate 0.01~0.5 g, Citric acid 0.005~0.1 g, Bovine Serum Albumin(Fraction V) 5~100 ㎎, glycine 0.5~3 g, Tris 0.5~30 g 및 Trehalose 0.01~1 g을 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 액상정액 장기보존 희석제.
8. 제 6항에 있어서, 상기 기본용액은 추가적으로 항생제로 겐타마이신(gentamycin) 네오마이신(neomycin), 및 아프라마이신(apramycin)으로 구성된 군중에서 선택된 항생제를 함유하는 것을 특징으로 하는 돼지 액상정액 장기보존 희석제.
9. 제 5항에 있어서, 상기 희석제는 증류수 100 ㎖ 당 플라보노이드 0.01 내지 10 ㎎, 포도당 1~10 g, Sodium citrate 0.2~3 g, Sodium bicarbonate 0.05~1 g, EDTA 0.05~2 g, Potassium chloride 0.01~2 g, Potassium phosphate 0.01~0.5 g, Citric acid 0.005~0.1 g, Bovine Serum Albumin(Fraction V) 5~100 ㎎, glycine 0.5~3 g, Tris 0.5~30 g, Trehalose 0.01~1 g 및 겐타마이신 50~10,000 IU를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 액상정액 장기보존 희석제.
10. 제 1항에 있어서, 상기 희석제는 10 내지 22℃에서 돼지 액상정액을 처리하는 것을 특징으로 하는 돼지 액상정액 장기보존 희석제.

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