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CN111771873B - 一种改善解冻后猪精子品质的方法 - Google Patents

一种改善解冻后猪精子品质的方法 Download PDF

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CN111771873B CN202010745843.XA CN202010745843A CN111771873B CN 111771873 B CN111771873 B CN 111771873B CN 202010745843 A CN202010745843 A CN 202010745843A CN 111771873 B CN111771873 B CN 111771873B
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Abstract

本发明公开了一种改善解冻后猪精子品质的方法，包括以下操作步骤：(1)将采集后的合格精液采用精液保护稀释剂稀释后，恒温平衡处理；(2)将精液离心，向得到的离心沉淀中加入冷冻基础液Ⅰ，重悬后恒温箱中恒温平衡处理；(3)再向其中加入冷冻基础液Ⅱ，混匀后灌装于细管中，封口，在液氮上熏蒸或使用程序冷冻仪冷冻，然后放入液氮中保存；(4)精液解冻时，先从液氮中取出细管，水浴锅中孵育，然后加入解冻稀释液，解冻完成。本发明通过在冷冻基础液Ⅰ联合添加相应浓度的咖啡酸苯乙酯和羟乙基淀粉，两者产生的协同作用，能有效的提高解冻后猪精子的活力、质膜完整率、顶体完整率、DNA完整率，提升冷冻后猪精子的质量。

Description

一种改善解冻后猪精子品质的方法
技术领域
本发明涉及猪精子冷冻保存技术领域，具体涉及一种改善解冻后猪精子品质的方法。
背景技术
随着猪人工授精技术的迅速崛起，大多数猪业养殖者都采用该方式来繁育仔猪，以降低公猪饲养成本。精液的冷冻保存可使精液使用不受时间、地点、使用对象的限制，显著增加优良种公猪精液的使用时间和利用率，这些优点使得人工授精技术更为普及。因此，冷冻精液技术具有重要作用。
精液的冷冻保存可以有效保留生物的遗传育种和种质资源。随着猪冷冻精液生产工艺和人工授精技术的迅速发展，采用冷冻精液繁育的种猪在受孕率和仔猪分娩数方面均得到了有效的提高，已经接近鲜精的配种水平。但猪冷冻精液生产因难度大、冻精-解冻后活率及受胎率低等诸多原因，导致猪精液冷冻技术的研究仍未完全成熟。
冷冻过程中猪精子质量降低的原因主要包括氧化损伤、细胞渗透损伤和细胞内冰晶形成等。
冷冻解冻后精液中的氧化损伤主要是过量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)引起的。过量的ROS主要引起精子脂质过氧化(lipid Peroxidation)和DNA片段化。使精子畸形率上升，活率、精子运动速率等下降，最终导致受胎率、产子率下降，流产率、胎儿畸形率上升。
细胞渗透损伤和细胞内冰晶形成主要是由于冷冻速率引起的。研究表明，在零下10摄氏度左右时，在精子细胞内液没有形成冰晶之前，精子细胞外液已经形成冰晶，若此时冷冻速率低，精子细胞内液中的水分渗出胞外，精子细胞内渗透压升高，使精子细胞器及质膜因高渗皱缩而受到损伤；若此时冷冻速率高，精子细胞内液中的水无法渗出，精子细胞内液中的水则会形成冰晶，损伤精子细胞器及器膜。
近年来，现有技术对于影响冻存精子质量的外部条件已经有了详细的研究，可以在冻存过程中控制外部条件到适宜范围内，使外部条件造成的影响降到最低；然而内部损伤机理却没有明确，如何最大程度的避免冷冻过程中猪精子的质量损失成为了函待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种能显著降低猪精子在冷冻过程中氧化损伤、细胞渗透损伤和细胞内冰晶形成造成损伤的改善解冻后猪精子品质的方法。。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种改善解冻后猪精子品质的方法，包括以下操作步骤：
(1)将采集后的合格精液采用精液保护稀释剂稀释后，恒温平衡处理；
(2)将精液离心，向得到的离心沉淀中加入冷冻基础液Ⅰ，重悬后恒温箱中恒温平衡处理，其中冷冻基础液Ⅰ按重量份计，由以下重量份的组分制成：葡萄糖200-300份、乳糖300-400份、碳酸氢钠10-15份、青霉素钠5-7份、硫酸链霉素8-12份、卵黄1800-2200份、三蒸水7000-9000份，其中冷冻基础液Ⅰ中还包括咖啡酸苯乙酯和羟乙基淀粉，其中咖啡酸苯乙酯在冷冻基础液Ⅰ中的摩尔浓度为30-50μmol/L，羟乙基淀粉在冷冻基础液Ⅰ中的质量分数为0.8-1.2％；
(3)再向其中加入冷冻基础液Ⅱ，使精子终浓度为4×108-8×108个/mL，混匀后灌装于细管中，封口，在液氮上熏蒸或使用程序冷冻仪冷冻，然后放入液氮中保存；
(4)精液解冻时，先从液氮中取出细管，48-52℃水浴锅中孵育15-17s，转移至36.9-37.1℃预热的输精瓶中，解冻完成。
具体地，精液在公猪体内采集后，用保温箱装好，在2小时内采用精液保护稀释剂稀释。
具体地，上述步骤(1)中，所述合格精液采用以下方法选择：选择略带腥味、乳白色的精液进行镜检活力在90％上、密度介于2.0-4.0亿/mL的精液为合格精液。
具体地，上述精液保护稀释剂由以下重量份的组分制成：乙二胺四乙酸1.20-1.30份、二水柠檬酸钠1.20-1.30份、氯化钾0.70-0.80份、碳酸氢钠1.20-1.30份、葡萄糖36.00-37.00份、青霉素钠0.50-0.70份、硫酸链霉素0.80-1.20份、900-1100份三蒸水，精液保护稀释剂的PH值为7.2-7.4，渗透压为300-320mOsm/L。
具体地，上述步骤(1)中，恒温平衡处理的具体操作为：25℃恒温箱静置平衡处理1h，期间不定时混匀精液，然后放入17℃恒温箱静置平衡处理2h，期间不定时混匀；
上述步骤(2)中恒温平衡处理的具体操作为：4℃恒温箱中静置平衡3h。
具体地，上述步骤(3)中，其中冷冻基础液Ⅱ按重量份计，由以下重量份的组分制成：葡萄糖200-300份、乳糖300-400份、碳酸氢钠10-15份、青霉素钠5-7份、硫酸链霉素8-12份、卵黄1800-2200份、三蒸水7000-9000份，所述冷冻基础液Ⅱ还包括氨基-钠-十二烷基硫酸酯和甘油，按体积分数算，其中氨基-钠-十二烷基硫酸酯终浓度为0.50％，甘油终浓度为3.00％。
具体地，上述步骤(3)中，细管在放入液氮中保存前，将细管在液氮面上方3cm处熏蒸10min。
具体地，上述步骤(4)中，从液氮中取出细管后，在8秒内放入水浴锅中孵育。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
咖啡酸苯乙酯是蜂胶提取物的主要活性载体，是一种酚类物质，具有广泛的药理活性，如抗微生物、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血等，在医药及动物生产中具有广泛的意义。现有技术中，咖啡酸苯乙酯常应用于以下方面：咖啡酸苯乙酯可以降低心肌肥厚，心肌纤维化并且增加心脏泵血功能，降低组织形态学肥大变化；咖啡酸苯乙酯治疗能显著抑制糖尿病大鼠牙周炎的氧化应激和RANKL诱导的破骨细胞生成及牙槽骨丢失；咖啡酸苯乙酯可能是维持氧化还原稳态的种子化合物之一；咖啡酸苯乙酯在体外，通过激活SIRT1/eNOS通路和抑制NF-κB的表达，抑制HR诱导的H9c2细胞凋亡和ROS生成。但是，至今未有研究者把它运用到冷冻猪精液中。
羟乙基淀粉是主要以支链淀粉为原料，通过与环氧乙烷、氯乙醇等羟乙基化剂发生化学反应，在其上引入亲水基团羟乙基而得到的变性淀粉，具有稳定性高的醚键。在经过水解、氧化、交联、羧甲基化等反应过程中，醚键稳定不会轻易断裂，同时受pH和电解质的影响小。羟乙基淀粉添加到冷冻液中，破坏性渗透应力发生的可能性较小；此外，它是无毒的，因此细胞可以在解冻后移植，而不需要花费时间成本的洗涤步骤。羟乙基淀粉被大量证实在冷冻干细胞和红细胞时具有良好的保护性，但是，至今仍未有数据表明其对液氮冷冻猪精液的影响。
本发明通过在冷冻基础液Ⅰ联合添加相应浓度的咖啡酸苯乙酯和羟乙基淀粉，两者产生的协同作用，能有效的提高解冻后猪精子的活力、质膜完整率、顶体完整率、DNA完整率，进而提升了冷冻后猪精子的质量。
本发明通过将咖啡酸苯乙酯和羟乙基淀粉加入至冷冻基础液Ⅰ中，先采用冷冻基础液Ⅰ对猪精液进行恒温平衡处理，使得咖啡酸苯乙酯和羟乙基淀粉与猪精液充分混合后，再添加冷冻基础液Ⅱ，可有效的避免冷冻基础液Ⅱ中的氨基-钠-十二烷基硫酸酯和甘油对咖啡酸苯乙酯、羟乙基淀粉与猪精液的结合作用产生不利的影响，进而提升了咖啡酸苯乙酯、羟乙基淀粉的作用效果。
本发明提供的精液保护稀释剂，降低了离心作用对猪精子活性的损伤，并且精液保护稀释剂的添加，还提升了猪精液的离心效果，避免了猪精液中活性成分的损失。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种改善解冻后猪精子品质的方法，包括以下操作步骤：
(1)将采集后的合格精液在2小时内采用精液保护稀释剂稀释后，在25℃恒温箱静置平衡处理1h，期间不定时混匀精液，然后放入17℃恒温箱静置平衡处理2h，期间不定时混匀，恒温平衡处理完成；其中合格精液采用以下方法选择：选择略带腥味、乳白色的精液进行镜检活力在90％上、密度介于2.0-4.0亿/mL的精液为合格精液，精液保护稀释剂由以下重量份的组分制成：乙二胺四乙酸1.25份、二水柠檬酸钠1.25份、氯化钾0.75份、碳酸氢钠1.25份、葡萄糖36.50份、青霉素钠0.60份、硫酸链霉素1.00份、1000份三蒸水，精液保护稀释剂的PH值为7.3，渗透压为310mOsm/L；
(2)将精液离心，向得到的离心沉淀中加入冷冻基础液Ⅰ，重悬后恒温箱中恒温平衡处理，此处恒温平衡处理是在4℃恒温箱中静置平衡3h，其中冷冻基础液Ⅰ按重量份计，由以下重量份的组分制成：葡萄糖250份、乳糖350份、碳酸氢钠13份、青霉素钠6份、硫酸链霉素10份、卵黄2000份、三蒸水8000份，其中冷冻基础液Ⅰ中还包括咖啡酸苯乙酯和羟乙基淀粉，其中咖啡酸苯乙酯在冷冻基础液Ⅰ中的摩尔浓度为40μmol/L，羟乙基淀粉在冷冻基础液Ⅰ中的质量分数为1.0％；
(3)再向其中加入冷冻基础液Ⅱ，使精子终浓度为5×108个/mL，混匀后灌装于细管中，封口，然后将细管在液氮面上方3cm处熏蒸10min后，将细管放入液氮中保存，其中冷冻基础液Ⅱ按重量份计，由以下重量份的组分制成：葡萄糖250份、乳糖350份、碳酸氢钠13份、青霉素钠6份、硫酸链霉素10份、卵黄2000份、三蒸水8000份，所述冷冻基础液Ⅱ还包括氨基-钠-十二烷基硫酸酯和甘油，按体积分数算，其中氨基-钠-十二烷基硫酸酯终浓度为0.50％，甘油终浓度为3.00％；
(4)精液解冻时，先从液氮中取出细管，在8秒内放入50℃水浴锅中孵育16s，转移至37.0℃预热的输精瓶中，解冻完成。
实施例2
一种改善解冻后猪精子品质的方法，包括以下操作步骤：
(1)将采集后的合格精液在2小时内采用精液保护稀释剂稀释后，在25℃恒温箱静置平衡处理1h，期间不定时混匀精液，然后放入17℃恒温箱静置平衡处理2h，期间不定时混匀，恒温平衡处理完成；其中合格精液采用以下方法选择：选择略带腥味、乳白色的精液进行镜检活力在90％上、密度介于2.0-4.0亿/mL的精液为合格精液，精液保护稀释剂由以下重量份的组分制成：乙二胺四乙酸1.20份、二水柠檬酸钠1.20份、氯化钾0.70份、碳酸氢钠1.20份、葡萄糖36.00份、青霉素钠0.50份、硫酸链霉素0.80份、900份三蒸水，精液保护稀释剂的PH值为7.2，渗透压为300mOsm/L；
(2)将精液离心，向得到的离心沉淀中加入冷冻基础液Ⅰ，重悬后恒温箱中恒温平衡处理，此处恒温平衡处理是在4℃恒温箱中静置平衡3h，其中冷冻基础液Ⅰ按重量份计，由以下重量份的组分制成：葡萄糖200份、乳糖300份、碳酸氢钠10份、青霉素钠5份、硫酸链霉素8份、卵黄1800份、三蒸水7000份，其中冷冻基础液Ⅰ中还包括咖啡酸苯乙酯和羟乙基淀粉，其中咖啡酸苯乙酯在冷冻基础液Ⅰ中的摩尔浓度为30μmol/L，羟乙基淀粉在冷冻基础液Ⅰ中的质量分数为0.8％；
(3)再向其中加入冷冻基础液Ⅱ，使精子终浓度为4×108个/mL，混匀后灌装于细管中，封口，然后将细管在液氮面上方3cm处熏蒸10min后，将细管放入液氮中保存，其中冷冻基础液Ⅱ按重量份计，由以下重量份的组分制成：葡萄糖200份、乳糖300份、碳酸氢钠10份、青霉素钠5份、硫酸链霉素8份、卵黄1800份、三蒸水7000份，所述冷冻基础液Ⅱ还包括氨基-钠-十二烷基硫酸酯和甘油，按体积分数算，其中氨基-钠-十二烷基硫酸酯终浓度为0.50％，甘油终浓度为3.00％；
(4)精液解冻时，先从液氮中取出细管，在8秒内放入48℃水浴锅中孵育15s，转移至36.9℃预热的输精瓶中，解冻完成。
实施例3
一种改善解冻后猪精子品质的方法，包括以下操作步骤：
(1)将采集后的合格精液在2小时内采用精液保护稀释剂稀释后，在25℃恒温箱静置平衡处理1h，期间不定时混匀精液，然后放入17℃恒温箱静置平衡处理2h，期间不定时混匀，恒温平衡处理完成；其中合格精液采用以下方法选择：选择略带腥味、乳白色的精液进行镜检活力在90％上、密度介于2.0-4.0亿/mL的精液为合格精液，精液保护稀释剂由以下重量份的组分制成：乙二胺四乙酸1.30份、二水柠檬酸钠1.30份、氯化钾0.80份、碳酸氢钠1.30份、葡萄糖37.00份、青霉素钠0.70份、硫酸链霉素1.20份、1100份三蒸水，精液保护稀释剂的PH值为7.4，渗透压为320mOsm/L；
(2)将精液离心，向得到的离心沉淀中加入冷冻基础液Ⅰ，重悬后恒温箱中恒温平衡处理，此处恒温平衡处理是在4℃恒温箱中静置平衡3h，其中冷冻基础液Ⅰ按重量份计，由以下重量份的组分制成：葡萄糖300份、乳糖400份、碳酸氢钠15份、青霉素钠7份、硫酸链霉素12份、卵黄2200份、三蒸水9000份，其中冷冻基础液Ⅰ中还包括咖啡酸苯乙酯和羟乙基淀粉，其中咖啡酸苯乙酯在冷冻基础液Ⅰ中的摩尔浓度为50μmol/L，羟乙基淀粉在冷冻基础液Ⅰ中的质量分数为1.2％；
(3)再向其中加入冷冻基础液Ⅱ，使精子终浓度为8×108个/mL，混匀后灌装于细管中，封口，然后将细管使用程序冷冻仪冷冻处理后放入液氮中保存，其中冷冻基础液Ⅱ按重量份计，由以下重量份的组分制成：葡萄糖300份、乳糖400份、碳酸氢钠15份、青霉素钠7份、硫酸链霉素12份、卵黄2200份、三蒸水9000份，所述冷冻基础液Ⅱ还包括氨基-钠-十二烷基硫酸酯和甘油，按体积分数算，其中氨基-钠-十二烷基硫酸酯终浓度为0.50％，甘油终浓度为3.00％；
(4)精液解冻时，先从液氮中取出细管，在8秒内放入52℃水浴锅中孵育17s，转移至37.1℃预热的输精瓶中，解冻完成。
对比例1
将冷冻基础液Ⅰ中的咖啡酸苯乙酯替换为等量的绿原酸，其余操作步骤与实施例1完全相同。
对比例2
将冷冻基础液Ⅰ中的羟乙基淀粉替换为等量的聚乙烯吡咯烷酮，其余操作步骤与实施例1完全相同。
对比例3
将氨基-钠-十二烷基硫酸酯和甘油添加至冷冻基础液Ⅰ中，并且按体积分数算，其中氨基-钠-十二烷基硫酸酯终浓度为0.50％，甘油终浓度为3.00％，其余操作步骤与实施例1完全相同。
分别用各实施例和对比例的方法对同一只松辽黑猪的精液进行冷冻后解冻处理，然后测试解冻后猪精液中猪精子活力、质膜完整率、顶体完整率、DNA完整率，其中：
猪精子活力通过计算机辅助精子分析系统(computer-aided semen analysissystem，CASA)检测。
许多研究表明，精子代谢、顶体反应、获能和精卵融合与精子膜的功能完整性密切相关，因此评价精子受精能力的重要指标之一是精子膜的功能完整性。精子膜是隔断精子内外的重要屏障，也包含精子进行内外交流的重要通道，它通过接受精子胞内胞外传递的信号而影响的代谢以及生命活动，因此，精子质膜的完整是精子进行正常生命活动所必需的。本发明通过精子低渗透膨胀试验(hypoosmotic swelling test，HOST)检验精子质膜完整率，解冻后的精液与37℃预热的果糖-柠檬酸钠低渗溶液混合，使精液终浓度为5×106个/mL，37℃孵育15min，涂片镜检，尾部卷曲的是质膜完整的精子，尾部不卷曲的精子是质膜受损的精子，本试验至少计数200个精子，重复5次以上，精子质膜完整率(％)＝尾部弯曲的精子/计数的总精子数×100％。
顶体完整是精子发生顶体反应的必要条件，顶体结构的缺陷或功能障碍与动物的繁殖问题密切相关。本发明使用异硫氰荧光素标记的花生凝集素(fluo白藜芦醇ceinisothiocyanate peanut agglutinin，FITC-PNA)荧光染色法检测。解冻后的精液中加入1mL于37℃预热好的PBS(磷酸缓冲盐溶液)，使用控温离心机2400r/min离心5min，留下沉淀，在其中加入PBS溶液重悬，反复三次。最后一次用PBS调整精液浓度，使精子密度保持在5×106个/mL左右，混匀，取30μL均匀涂在载玻片上，自然晾干后用甲醇均匀涂片，室温下固定10min，然后在黑暗环境下取30μL FITC-PNA染液均匀涂在载玻片上，把载玻片放入37℃湿暗盒温育30min，PBS缓慢冲洗，黑暗环境下自然晾干。200×荧光显微镜下计数不少于200个精子，激发光在480nm，发射光在530nm。顶体完整的精子发出绿色荧光，荧光部分呈帽状，每组试验重复5次以上，精子顶体完整率(％)＝顶体完整的精子/计数的总精子数×100％。
DNA是生物生长发育和进行正常生命活动必要的生物大分子。本发明使用AO荧光染色法检测精子DNA完整率。精子前处理同顶体完整率检测，解冻精液用PBS洗三遍，使精子浓度保持在5×106个/mL左右，取30μL均匀涂在载玻片上，自然晾干后用无水乙醇-冰醋酸(3:1)固定3h，放入黑暗环境下新配的AO染液中10min，PBS缓慢冲洗，黑暗中自然晾干后加石蜡油封片。200×荧光显微镜下计数精子不少于200个，激发光在480nm，发射光在530nm。DNA完整的精子发出绿色荧光，DNA受损的精子发出黄色甚至红色荧光，每组试验重复5次以上，精子DNA完整率(％)＝DNA完整的精子/计数的总精子数×100％。
试验结果如表1所示：
Figure BDA0002608325890000081
由表1可知，本发明提供的一种改善解冻后猪精子品质的方法，将咖啡酸苯乙酯和羟乙基淀粉联合使用后，可有效的提升解冻后猪精子的品质；先采用冷冻基础液Ⅰ对猪精液进行恒温平衡处理，使得咖啡酸苯乙酯和羟乙基淀粉与猪精液充分混合后，再添加冷冻基础液Ⅱ，可有效的避免冷冻基础液Ⅱ中的氨基-钠-十二烷基硫酸酯和甘油对咖啡酸苯乙酯、羟乙基淀粉与猪精液的结合作用产生不利的影响。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种改善解冻后猪精子品质的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
(1)将采集后的合格精液采用精液保护稀释剂稀释后，恒温平衡处理；
(2)将精液离心，向得到的离心沉淀中加入冷冻基础液Ⅰ，重悬后恒温箱中恒温平衡处理，其中冷冻基础液Ⅰ按重量份计，由以下重量份的组分制成：葡萄糖200-300份、乳糖300-400份、碳酸氢钠10-15份、青霉素钠5-7份、硫酸链霉素8-12份、卵黄1800-2200份、三蒸水7000-9000份，其中冷冻基础液Ⅰ中还包括咖啡酸苯乙酯和羟乙基淀粉，其中咖啡酸苯乙酯在冷冻基础液Ⅰ中的摩尔浓度为30-50μmol/L，羟乙基淀粉在冷冻基础液Ⅰ中的质量分数为0.8-1.2％；
(3)再向其中加入冷冻基础液Ⅱ，使精子终浓度为4×108-8×108个/mL，混匀后灌装于细管中，封口，然后放入液氮中保存；
(4)精液解冻时，先从液氮中取出细管，48-52℃水浴锅中孵育15-17s，转移至36.9-37.1℃预热的输精瓶中，加入解冻稀释液，解冻完成；
上述精液保护稀释剂由以下重量份的组分制成：乙二胺四乙酸1.20-1.30份、二水柠檬酸钠1.20-1.30份、氯化钾0.70-0.80份、碳酸氢钠1.20-1.30份、葡萄糖36.00-37.00份、青霉素钠0.50-0.70份、硫酸链霉素0.80-1.20份、900-1100份三蒸水，精液保护稀释剂的PH值为7.2-7.4，渗透压为300-320mOsm/L；
上述步骤(3)中，其中冷冻基础液Ⅱ按重量份计，由以下重量份的组分制成：葡萄糖200-300份、乳糖300-400份、碳酸氢钠10-15份、青霉素钠5-7份、硫酸链霉素8-12份、卵黄1800-2200份、三蒸水7000-9000份，所述冷冻基础液Ⅱ还包括氨基-钠-十二烷基硫酸酯和甘油，按体积分数算，其中氨基-钠-十二烷基硫酸酯终浓度为0.50％，甘油终浓度为3.00％。
2.根据权利要求1所述的一种改善解冻后猪精子品质的方法，其特征在于，精液在公猪体内采集后，用保温箱装好，在2小时内采用精液保护稀释剂稀释。
3.根据权利要求1所述的一种改善解冻后猪精子品质的方法，其特征在于，上述步骤(1)中，所述合格精液采用以下方法选择：选择略带腥味、乳白色的精液进行镜检活力在90％上、密度介于2.0-4.0亿/mL的精液为合格精液。
4.根据权利要求1所述的一种改善解冻后猪精子品质的方法，其特征在于，上述步骤(1)中，恒温平衡处理的具体操作为：25℃恒温箱静置平衡处理1h，期间不定时混匀精液，然后放入17℃恒温箱静置平衡处理2h，期间不定时混匀；
上述步骤(2)中恒温平衡处理的具体操作为：4℃恒温箱中静置平衡3h。
5.根据权利要求1所述的一种改善解冻后猪精子品质的方法，其特征在于，上述步骤(3)中，细管在放入液氮中保存前，将细管在液氮面上方3cm处熏蒸10min。
6.根据权利要求1所述的一种改善解冻后猪精子品质的方法，其特征在于，上述步骤(4)中，从液氮中取出细管后，在8秒内放入水浴锅中孵育。
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