CN113331178B - 一种利用蛋氨酸制备猪精液常温保存稀释液的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用蛋氨酸制备猪精液常温保存稀释液的应用，该稀释液主要成分为蛋氨酸、葡萄糖、EDTA二钠、柠檬酸钠、柠檬酸、碳酸氢钠、Tris、青霉素、链霉素和多粘菌素，本发明的稀释液可以用于常温下对猪精液以液态形式进行有效保存，提高了鲜精保存品质，延长了精液的保存时间，有利于提高优良种畜利用率并获得高受胎率；同时稀释液制作方法简单、使用方便，便于大规模推广应用。

Description

一种利用蛋氨酸制备猪精液常温保存稀释液的应用

技术领域

本发明涉及猪繁殖技术领域，特别涉及一种猪精液常温保存稀释液配方。

背景技术

人工授精技术(Artificial insemination technology，AI)是采用人工的方法采集雄性动物的精液，经过精液品质检查、稀释、保存等一系列处理后输入到雌性动物生殖道的特定部位以代替自然交配繁殖后代的一项技术。该技术有效地改变了家畜的配种过程，提高了优良种公畜的配种效率和种用价值，在加快育种进程的同时降低了生产成本。近年来，随着人工授精技术的不断推广，越来越多的集约化农场选择采用人工授精的方式进行配种以期获得更高的受胎率，因而也对体外保存精液品质提出了更高的要求。体外保存(invitro storage)是将人工采集的品质达标的精液与稀释液混合，并配合相应的保存设施和保存温度，以达到延长猪精液保存时间的技术。种公畜精液的保存方式根据保存温度可以分为冷冻保存和液态保存。

冷冻保存是指将精液保存于干冰(-79℃)或液氮(-196℃)中，使精子的代谢活动静止，通过快速降温度过冰晶期(0～-60℃)，避免细胞内外液体形成冰晶穿破细胞膜，使精子细胞形成玻璃化状态，在应用于母畜授配时又通过迅速升温使精子恢复正常生物活性，从而达到保持其活率和受精能力的目的。然而在精子冷冻-解冻过程中，精子细胞胞内和胞外不可避免的产生大量冰晶，影响精液渗透压和酸碱度，从而造成精子大量死亡。虽然近年来猪精液冷冻保存技术有了一定的进步，但冷冻保存相对于其他保存方式，对设备要求高，操作工艺复杂繁琐，且精子保存效果差，受胎率低，故仍主要应用于试验研究或种质资源保护等方面。

液态保存是指在猪精液中加入相应的稀释液以提供能量物质与保护剂，并缓慢降至常温(15～25℃)或低温(0～5℃)，使精液保持流体状态的同时降低精子代谢活动、减少精子代谢产物积累与能量消耗。液态保存不仅延长了精子体外存活时间、提高了精液的利用率，还保持了精子较高的存活率与受精能力。

猪人工授精的广泛推广，对优良猪种繁殖和高质猪肉的生产均有重要的推动作用。随着猪人工授精技术的应用，猪精液的保存成为了其中的关键步骤。使用冷冻精液进行猪人工授精的普及率极低(在世界上不到1％，每次输精精子数量不少于50亿，受孕率约70％左右)，而精液的液态保存在生产中应用更广泛。99％以上使用的是液态保存3天左右的精液，对于发情期的母猪输精二至三次，每次精子数量不少于25亿，输精量100mL左右，受孕率达到了80～90％，产仔率和产仔数接近甚至高于自然交配。

与牛等其它畜类相比，猪精子中胆固醇/磷脂的比例较低而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂含量较高的生物学特性导致猪精子对低温比较敏感。低温会引起精子质膜、超微结构及细胞活性组分等结构及机能的损伤，从而使精子活力、质膜和顶体的完整性降低，以及精子线粒体膜电位的降低，而这些变化都会降低猪精子保存后的受胎能力。因此，现阶段在猪人工授精中通常使用常温保存(例如，17℃)方式保存精液。

商业化的猪精液保存稀释液种类繁多，通常添加能量物质以维持精子的各项代谢进程，添加Tris或HEPES缓冲液以控制pH值。常见的精液常温保存稀释液可使精子的活率保持在0.8左右、活力保持在60％左右，但保存时间有限，不能满足对于扩大良种公畜站的辐射范围及种畜利用率的发展需要。精子的运动能力是活精子的重要特征之一；精子的运动方式主要有直线前进、圆周运动以及原地摆动3种；直线前进运动的精子才可能具有正常的冲击能力和受精能力；而常温保存(17℃)的精子都是静息状态。此外，常温保存中线粒体氧化磷酸化的副产物，即活性氧自由基(ROS)水平也对精子的受精能力有一定的影响。

谷胱甘肽(GSH)是调节精子氧化还原稳态的最重要的细胞因子。精子可以利用蛋氨酸(属于非极性氨基酸)或半胱氨酸合成GSH。合成的GSH可以缓解ROS引发的质膜损伤，维持精子的运动。在猪精浆中发现蛋氨酸含量较高，而半胱氨酸和胱氨酸的含量较低。中国专利CN107094755A报道了含有包括蛋氨酸在内的多种氨基酸成分的稀释液配方，其中氨基酸用于提供能量以维持精子运动和活力，但复合添加多种氨基酸可能会对精子产生毒害作用，随着精子代谢活动的持续进行这种作用愈发明显，从而无法延长精液有效保存时间。

商品化稀释液Modena仅能在一定保存时间范围内满足精子保存期间正常的能量需求，随着保存时间延长，其无法消除精子保存期间受到的不利因素，例如能量代谢降低、ROS产生增多等的影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用蛋氨酸制备猪精液常温保存稀释液的应用。所制备的稀释液对猪精液具有良好的常温保存效果。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种猪精液常温保存稀释液，该常温保存稀释液的成分包括27.5～28.5g/L的葡萄糖、2.35～2.55g/L的EDTA二钠、5.65～5.85g/L的Tris、6.9～7.86g/L的柠檬酸钠、2.9～3.174g/L的柠檬酸、1.0～1.15g/L的碳酸氢钠、60～70万IU/L的青霉素、180～200万IU/L的链霉素、1.6～2万IU/L的多粘菌素和<1mmol/L的蛋氨酸。

优选的，所述常温保存稀释液的pH为7.15～7.25。

优选的，所述常温保存稀释液的成分包括27.5g/L的葡萄糖、2.35g/L的EDTA二钠、5.65g/L的Tris、6.9g/L的柠檬酸钠、2.9g/L的柠檬酸、1.0g/L的碳酸氢钠、60万IU/L的青霉素、180万IU/L的链霉素、1.6万IU/L的多粘菌素和0.1mmol/L的蛋氨酸。

一种猪精液常温保存方法，包括以下步骤：

将上述常温保存稀释液与猪精液混合后于15～20℃下进行保存。

优选的，所述混合具体包括以下步骤：将采集的新鲜猪精液用所述常温保存稀释液进行稀释，并将猪精子的密度稀释至0.5～0.6×10⁸个/mL。

优选的，所述常温保存稀释液在与新鲜猪精液混合前预先加热至37～38.5℃(例如，与新鲜猪精液等温)。

优选的，所述新鲜猪精液的精子活力在80％以上，精子活率在0.80以上。

优选的，所述保存的时间至少为7天。

本发明的有益效果体现在：

本发明选择将蛋氨酸与葡萄糖、EDTA二钠、Tris、柠檬酸钠、柠檬酸、碳酸氢钠、青霉素、链霉素、多黏菌素组合，形成了能够高效保存猪精液的稀释液配方，可以补充精子的营养消耗、维持精子的渗透压、降低精子代谢产物的危害，以及氧化应激对精子质膜结构的损坏。而且通过添加蛋氨酸能在更长的保存时间内有效的维持精子质膜完整性以及保持精子的冲击能力，从而维持较高的精子活力。实验结果表明，本发明的稀释液可以使猪精液在常温下存放一周后活力仍达到70％以上，有效解决鲜精人工授精的时效性问题。同时利用该稀释液进行猪精液保存的操作简单方便，便于大规模推广应用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。

本发明以满足良种公畜站在扩大对周边企业、养殖户(场)的人工授精辐射范围中的精液保存需求为出发点，结合能量物质、缓冲液等基础成分，对抗菌剂及氨基酸添加剂进行了筛选和配比优化，研制出能高效保存猪精液(在常温下保存一周以上)的稀释液配方，与商用稀释液(例如，Modena稀释液)相比，可以更好的克服采精时限及输精地点远近不同等实际情况对充分发挥良种公猪利用率、实现良种资源共享的不利影响。

实施例1

(一)猪精液常温保存稀释液配制

稀释液配方成分及用量：葡萄糖2.75g、EDTA二钠0.235g、Tris 0.565g、柠檬酸钠0.69g、柠檬酸0.29g、碳酸氢钠0.1g、青霉素6万IU、链霉素18万IU、多粘菌素0.16万IU和蛋氨酸0.01mmol。

按用量称取上述稀释液配方各成分并与双蒸水充分混匀后定容至100mL，即得到猪精液常温保存稀释液，pH值约为7.2。

本发明稀释液中葡萄糖具有提供营养以补充精子生存和运动所消耗的能量，以及维持精子高活性的作用，EDTA二钠、柠檬酸钠、柠檬酸、碳酸氢钠和Tris具有提供缓冲及平衡渗透压的作用(所添加的葡萄糖、EDTA二钠、柠檬酸钠、柠檬酸、碳酸氢钠、Tris无毒性，且具有pH调节及良好的缓冲稳定性)。在此基础上，本发明稀释液中按配比添加的青霉素、链霉素、多粘菌素可有效控制精液中细菌的菌落数量并且对精子无毒害作用，从而维持精子较高的活率。同时，本发明稀释液中按配比添加的蛋氨酸不仅对精子无毒害作用，而且有助于细胞生成还原型谷胱甘肽(还原型谷胱甘肽具有极强的抗氧化、抗衰老和防止细胞凋亡等特性)，能有效降低活性氧自由基(ROS)的脂质过氧化反应，具有提高精子运动性能、介导信号传递和防止脂质过氧化作用对精子的损伤(例如，防止损伤精子质膜)及抗氧化等作用，并且可显著提高精子膜脂流动性，从而提高精子活力。

(二)猪鲜精常温保存方法

鲜精采集及质量评定：采用假阴道法或手握法采集成年健康种猪精液，采集的新鲜精液放置于保温杯中并在60min内送至实验室进行品质检测。

取10μL新鲜精液，用血细胞计数板计数，正常猪精液的精子密度在2～5亿个/mL。

用Modena稀释液稀释新鲜精液的精子密度至1亿个/mL后放入37℃水浴锅孵育10min，取6μL滴于预热的载玻片上，使用计算机辅助分析系统(CASA)进行精子活力检测，活力大于80％的新鲜精液可以用于保存。

常温保存：根据新鲜精液(温度为37℃)体积及精子密度，加入等温(预热至37℃)的(一)中配制的稀释液，使精子密度为0.5～0.6×10⁸个/mL，颠倒混匀、密封，避光保存在17℃环境中7天以上，期间可根据具体情况反复用于人工授精。

(三)猪精液保存后质量评定

精子活力、活率及其他精子运动参数测定：从17℃恒温冰箱中取出当天待检测的精液样品(即经过常温保存的精液)，在37℃水浴锅中孵育10min，之后取10μL样品在250倍显微镜视野下用计算机辅助分析系统(CASA)测定精子活率、活力及精子直线运动速率和曲线运动速率；测定时选取5个以上不同的视野，每个视野内的精子数在200个以上且分布均匀，进行检测。

精子质膜完整性检测(使用PI/SYBR-14法)：从17℃恒温冰箱中取出当天待检测的精液样品，取100μL精液样品置于1.5mL离心管中并在37℃水浴锅中孵育5min，加入0.2μL的SYBR-14工作液，混匀后37℃水浴加热5min，加入0.3μL的PI工作液，混匀，取2.5μL染色后精液置于载玻片上，盖好盖玻片，分别使用488nm蓝色光、525nm绿色光激发，观察质膜完整(SYBR-14染色)、质膜受损(PI染色)情况。随机选取5个清晰视野观察，每个视野计数大于200个精子，在荧光显微镜下拍照。精液中具有完整质膜的精子占精子总数的百分率为精子的质膜完整率；精子作为唯一在体外发挥功能的细胞，保持质膜的完整是维持其内部系统正常运行的基础，也是精子完成受精的根本保障。

精子线粒体膜电位检测(使用荧光染料JC-1检测精子的线粒体膜电位)：取50μL精液样品，800g离心5min，去上清，收集精子细胞沉淀，使用Modena稀释液洗涤两遍；加入200μL的JC-1染色工作液，用移液枪轻轻吹打混匀，37℃恒温孵育20～30min；孵育结束后，800g离心5min，收集精子细胞沉淀，使用预冷的JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2～3遍；使用JC-1染色缓冲液(1×)重悬，放置于冰上，使用多功能酶标仪检测(激发波长525/488nm，发射波长590/525nm)两万个精子，其中发橙红色荧光的为具有较高线粒体膜电位的精子，发绿色荧光的为具有较低线粒体膜电位的精子，较高的膜电位代表线粒体较高的产能活性。

(四)猪精液常温保存实例

在陕西省杨凌示范区选取成年、健康的10头公猪，采用手握法采集精液，在37℃下检测精液的精子表观活率，活率、活力及密度，从而对采集自每只猪的精液进行质量评定，结果参见表1。结果表明所采集猪鲜精精子密度在3～4×10⁸个/mL范围内，表观活率均达到最高值，活率在0.80以上，且平均值约为0.9，活力在80％以上。

利用(二)中保存方法将猪精液保存一周(将鲜精与稀释液混合，使精子密度为0.5×10⁸个/mL，完成混合后保存至17℃恒温冰箱)，以Modena稀释液作为实验对照，对鲜精保存质量进行了比较。

结果显示(表1)，利用本发明的稀释液常温保存猪精液一周后精子活率达到0.9左右，活力可达到70％以上，质膜完整率在70％以上。

表1.稀释液对猪精液常温保存的影响

	对照组(Modena稀释液)	本发明稀释液
			数量(头)	10	10
<![CDATA[鲜精密度(×10<sup>8</sup>个/mL)]]>	3.55±0.36	3.55±0.36
			鲜精活率	0.90±0.09	0.90±0.09
保存后活率	0.87±0.09	0.91±0.055
			保存后活力(％)	64.86±1.52	72.38±1.18
保存后质膜完整率(％)	66.62±0.16	73.7±0.19
			保存后线粒体膜电位	3.89±0.25	4.55±0.35

结果表明，本发明的稀释液相比于Modena稀释液，能够有效的消除精子保存期间受到的不利因素的影响，为延长精液的保存时间提供了可靠的基础。同时，本发明的稀释液避免了添加氨基酸不当对精子产生的毒害作用。

综上，本发明所公开的稀释液配方对于猪精液常温保存具有良好的效果，不仅精液保存时间长，而且能有效保持精子活率、活力，使猪鲜精在常温下存放一周后精子活力仍可达到70％以上，完全满足良种公畜站对扩大人工授精辐射范围的需求，有利于提高人工授精生产效率。同时该稀释液配方简单易配制，便于大规模推广应用，有利于提高优良品种种公猪利用率并获得高受胎率，实现真正意义上的良种资源共享。

Claims (7)

1.一种猪精液常温保存稀释液，其特征在于：该常温保存稀释液由27.5g/L的葡萄糖、2.35g/L的EDTA二钠、5.65g/L的Tris、6.9g/L的柠檬酸钠、2.9g/L的柠檬酸、1.0g/L的碳酸氢钠、60万IU/L的青霉素、180万IU/L的链霉素、1.6～2万IU/L的多粘菌素和0.1mmol/L的蛋氨酸组成。

2.根据权利要求1所述一种猪精液常温保存稀释液，其特征在于：所述常温保存稀释液的pH为7.15～7.25。

3.一种猪精液常温保存方法，其特征在于：包括以下步骤：

将稀释液与猪精液混合后于15～20℃下进行保存；所述稀释液由27.5g/L的葡萄糖、2.35g/L的EDTA二钠、5.65g/L的Tris、6.9g/L的柠檬酸钠、2.9g/L的柠檬酸、1.0g/L的碳酸氢钠、60万IU/L的青霉素、180万IU/L的链霉素、1.6～2万IU/L的多粘菌素和0.1mmol/L的蛋氨酸组成。

4.根据权利要求3所述一种猪精液常温保存方法，其特征在于：所述混合具体包括以下步骤：将采集的新鲜猪精液用所述稀释液进行稀释，将猪精子的密度稀释至0.5～0.6×10⁸个/mL。

5.根据权利要求3所述一种猪精液常温保存方法，其特征在于：所述稀释液在与猪精液混合前预先加热至37～38.5℃。

6.根据权利要求3所述一种猪精液常温保存方法，其特征在于：所述猪精液的精子活力在80％以上，精子活率在0.80以上。

7.根据权利要求3所述一种猪精液常温保存方法，其特征在于：所述保存的时间至少为7天。