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KR100807141B1 - 고분자량 비펩티드성 중합체 유도체의 합성 - Google Patents

고분자량 비펩티드성 중합체 유도체의 합성 Download PDF

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Publication number
KR100807141B1
KR100807141B1 KR1020037008077A KR20037008077A KR100807141B1 KR 100807141 B1 KR100807141 B1 KR 100807141B1 KR 1020037008077 A KR1020037008077 A KR 1020037008077A KR 20037008077 A KR20037008077 A KR 20037008077A KR 100807141 B1 KR100807141 B1 KR 100807141B1
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South Korea
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polymer
poly
peg
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KR1020037008077A
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Inventor
코즈로브스키안토니
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벤틀리마이클데이비드
팡지하오
Original Assignee
넥타르 테라퓨틱스 에이엘, 코포레이션
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Abstract

큰 PEG 분자를 작은 PEG 분자에 접합시킴으로써 활성화된 폴리(에틸렌 글리콜) 등의 중합체의 고분자량 유도체를 고순도로 제조한다. 대부분의 반응 단계는 고분자량 유도체의 힘든 정제를 피하기 위하여 더욱 쉽게 정제된 작은 분자상에서 달성될 수 있다.

Description

고분자량 비펩티드성 중합체 유도체의 합성{SYNTHESIS OF HIGH MOLECULAR WEIGHT NON-PEPTIDIC POLYMER DERIVATIVES}
본 발명은 폴리(에틸렌 글리콜)및 이와 연관된 중합체의 유도체 및 이의 합성 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 고분자량 유도체 및 고분자량 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.
친수성 중합체 폴리(에틸렌 글리콜), 약자로 PEG, 및 폴리(에틸렌 옥시드)로 공지된, 약자로 PEO 의 분자 및 표면에 대한 공유 결합은 생물공학 및 의학분야에서 상당한 이용성이 있다. 이의 가장 일반적인 형태인 PEG 는 각 말단에서 히드록실기로 종결된 선형 중합체이다:
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2 -OH
상기 중합체, α,ω-디히드록시폴리(에틸렌 글리콜)은 간단한 형태로 HO-PEG-OH 로 표시될 수 있으며, 여기서 -PEG- 기호는 하기 구조 단위를 나타낸다:
-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-
(식 중, n 은 전형적으로 약 3 내지 4000 범위임).
PEG 는 일반적으로 메톡시-PEG-OH, 또는 간략히 mPEG 로서 사용되며, 여기 서, 한 말단은 상대적으로 불활성인 메톡시기이고, 한편 다른 말단은 화학적 개질이 준비된 히드록실기이다. mPEG 의 구조는 하기로 주어진다:
-CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
에틸렌 옥시드 및 프로필렌 옥시드의 공중합체는 그들의 화학 구조가 PEG 와 매우 유사하고, 그들은 많은 활용에서 PEG 를 대체할 수 있다:
HO-CH2CHRO(CH2CHRO)nCH2CH2-OH
(식 중, R=H 또는 알킬, 예컨대 CH3 임).
PEG 는 또한 선형 PEG가 중앙 핵에 결합되는 멀티암(multi-arm) 형태로 일반적으로 사용된다:
R(-O-PEG-OH)n
(식 중, R 은 핵 유도된 형태, 예를 들어 펜타에리트리톨 또는 글리세롤 올리고머임). PEG 는 골격내의 분해가능한 결합으로 제조될 수 있다.
PEG 는 물 및 많은 유기 용매에서의 용해성을 가지며, 독성 및 면역원성(immunogenicity)이 없는 중합체이다. PEG 의 한가지 용도는 이 중합체가 불용성 분자에 공유결합되어 수득되는 PEG-분자 "접합(conjugate)"을 용해성이 되도록 하는 것이다. 예를 들어, 수불용성 약물 파클리탁셀(paclitaxel)이 PEG와 결합되면, 수용성이 된다는 것이 입증되었다[Greenwald, et al., J. Org. Chem., 60:331-336(1995)].
PEG 가 분자, 예컨대 단백질에 결합하기 위하여, 종종 PEG를 "활성"화시켜, 말단에 관능기를 갖는 PEG 의 유도체를 제조하는 것이 필요하다. 관능기는 단백질상의 특정 부분, 예컨대 아미노기와 반응할 수 있어, PEG-단백질 접합을 형성한다. 많은 활성화된 PEG 유도체가 기재되어 있다. 그러한 활성화된 유도체의 예는 숙신이미딜 숙시네이트 "활성 에스테르"이다:
CH3O-PEG-O2C-CH2CH2-CO2-NS
(식 중, NS =
Figure 112003021526373-pct00001
임)
이후부터, 숙신이미딜 활성 에스테르 부분은 -CO2-NS 로 표시될 것이다. 그러한 활성화된 PEG 는 또한 상술된 멀티암 형태 또는 분지형, 예컨대:
(PEG-O-CO-NH)2LYS-NS
[Harris, et al., U.S. 5,932,462에 기재되며, 여기서 이의 전체가 참조로서 삽입됨]으로부터 제조될 수 있다.
관능기는 출발 히드록실의 직접 전환에 의해 PEG 의 말단에 결합되어 다른 형태로 될 수 있거나 또는 유기 스페이서(spacer)기로 결합되어 히드록실기로 될 수 있다. 예를 들어, 상기 숙시네이트 PEG는 숙신산 무수물의 PEG로의 결합에 의해 제조된다. 유사하게, 이것은 글루타르산 무수물과 반응하여 PEG 글루타레 이트, PEG-O2C-CH2CH2CH2-CO2H 로 제조될 수 있다. 더 큰 지방족 스페이서도 첨가될 수 있다. Okamoto, et al., Eur. Polym. J., 19, 341-346(1983)에 개시된 것처럼, PEG 는 PEG-OH와 ONC-(CH2)6-NCO를 반응시킨 후, 남아있는 이소시아네이트를 아민 생성물 PEG-O2CNH-(CH2)6-NH2 로 전환하여 PEG 아민으로 전환될 수 있다.
PEG 화학의 활용은 더욱 복잡해질 수 있으므로, 고분자량, 고순도의 PEG 유도체에 대한 요구가 증가되고 있다. 이들 화합물의 합성은 다단계 제조동안 축적되는 중합성 불순물의 제거에서의 어려움에 의해 복잡해진다. 작은 분자 불순물은 일반적으로 단순한 절차, 예컨대 침전에 의해 용이하게 제거된다. 그러나, 고분자량 중합성 부산물은 일반적으로 제거하는 것이 상당히 어렵고, 시간 소모적이며 고가의 크로마토그래피 기술의 이용을 요구한다. 고분자량 PEG 유도체를 제조하는 개선된 방법이 당업계에서 요구된다.
[발명의 개요]
본 발명은 고분자량의 활성화된 중합체 유도체 및 이의 제조 방법을 포함한다. 작은, 이관능성 올리고(에틸렌 글리콜)("OEG") 유도체 또는 유사한 올리고머 또는 작은 중합체는 더 큰 폴리(에틸렌 글리콜)중합체("PEG")유도체 또는 유사한 중합체에 공유적으로 결합된다. 이런 방식으로, 대부분의 화학적 변형이 올리고머성 또는 작은 중합성 화합물상에서 수행될 수 있다. 큰 중합성 불순물은 더 작은 중합체보다 바람직한 생성물로부터 분리하는 것이 더욱 어렵고, 이들 중합체를 포함하는 이들 반응의 생성물은 전형적으로 미반응된 시약, 가교 결합으로 수득될 수 있는 이관능성 성분, 부분적으로 반응된 성분 및 기타 중합성 불순물을 포함한다. 본 발명은 더 큰 중합체를 만드는데 요구되는 반응의 수를 감소시켜서 이들 불순물을 방지한다.
따라서, 하기에 보여지는 것처럼, 복잡한 올리고머, 예컨대 Y'-OEG-Y(식 중, Y 및 Y' 은 활성 부분임)를 간단한 고분자량 중합성 화합물, 예를 들어 mPEG-Z(식 중, Z 는 Y 또는 Y'와 반응함)와 반응시켜, 더 큰 PEG 와 더 작은 PEG 사이의 새로운 연결기 X 를 만들어, 1 단계로 복잡한 중합성 화합물을 만들 수 있다. 이러한 방식으로, 중합성 불순물이 축적되지 않는다. Y 및 Y' 은 동일하거나 상이할 수 있지만, 두 부분이 혼화성이고, 서로 반응하지 않도록 선택되어야 한다.
고분자량 일관능성 큰 분자를 제조하는 전형적인 반응에서, 모노메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)은 더 작은 PEG 중합체와 반응하며, 더 큰 일관능성 PEG 중합체상의 관능기 Z 는 더 작은 헤테로이관능성 중합체상의 관능기 Y' 과 반응한다. 고분자량 생성물은 활성기 Y 를 보유하고 있다. 반응물은 Z 및 Y' 부분의 반응으로 형성된 X 기에 의해 연결된다. 이 반응은 하기와 같이 예증될 수 있다:
mPEG-Z + Y'-OEG-Y →mPEG-X-OEG-Y
예를 들어, mPEG-OH 로부터 몇 단계에 의해 전형적으로 만들어지는 화합물인 분자량 32,000 의 mPEG-프로피온산은 mPEG-OH로부터 1 단계로 제조된 활성화된 mPEG 카르보네이트 30,000 와 분자량 2000 의 α-아미노-ω-프로피온산을 반응시키는 단독 단계로 제조된다. 화학적 변형의 대부분은 작고, 저렴하며 더욱 쉽게 정제된 PEG 2000 으로 수행될 수 있다.
필수적으로 모두가 동일한 결과를 주지는 않지만, 일관능성, 호모이관능성 및 헤테로이관능성 큰 분자는 본 발명의 실행에 의해 제조될 수 있다. 불순물이 다단계 반응으로 증가된다면, 생성물 분자의 더 큰 중합성 성분에 복잡성을 도입하는 경향이 있는 반응은 이 방법의 효과가 감소될 것이다.
더욱 일반화된 구현예에서, 더 큰 특이성을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)중합체를 나타내는 본 발명의 생성물의 구조는 하기와 같이 기재될 수 있다:
R-(OCH2CH2)n-X-(CH2CH2-O)m-Y
상기 구조는 R-(OCH2CH2)n-Z 와 Y'-(CH2CH2-O)m-Y(식 중, Z 는 Y' 과의 반응성 기이며, Y 및 R 은 Z 또는 Y' 과 반응성이 아님) 를 반응시켜 제조된다.
R 은 다양한 알킬 부분, 전형적으로 PEG 에 결합된 메톡시를 포함하는 캡핑 부분일 수 있다. 또한, R 은 반응성 기가 보호될 수 있고, 일부 후속하는 바람직한 시기의 반응에 이용가능한 반응성기 또는 보호된 반응성기 Y" 일 수 있다. Y" 이 보호된 기라면 Y 및 Y'' 은 동일할 수 있고, 또는 생성물 분자를 만드는데 사용되는 반응에 참여하지 않는 상이한 기일 수 있다. 관능기는 알데히드, 말레이미드, 활성 에스테르, 티오술포네이트 또는 아민을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. X 는 작은 친수성 링커, 예컨대 아미드 또는 카르바메이트이며, n 은 약 200 내지 2000 이고, m 은 약 1 내지 120 이다. X 는 바람직하게는 작고 친수성인 부분이며, 수득되는 고분자량 중합체의 화학적 및 물리적 특성에 부정적인 영향을 주지 않을 것이다.
대안적으로, 이관능성이거나 부가적인 관능기를 갖는 큰 중합성 부분은 하나 이상의 관능기에서 더 작은 분자에 연결될 수 있다. 큰 분자의 생성물의 관능기는 바람직하다면 큰 중합성 부분 또는 더 작은 올리고머성 또는 중합성 부분으로부터 유래할 수 있다. 중합체 골격은 생성물 분자의 제어된 분해성이 바람직하다면, 골격내로 만들어진 가수분해 또는 효소적 분해가 수행되는 기 또는 링커를 가질 수 있다.
상기 중합체 부분은 넓게는 더 큰 중합체 부분의 경우 (폴리)a 로서 또는 더 작은 중합체 부분의 경우 (폴리)b 로서 간주될 수 있으며, 여기서 폴리는 그의 다양한 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 임의의 중합체 및 당업계에서 유사한 특성을 갖는다고 간주되는 중합체일 수 있다.
따라서, 고분자량 중합체는 이로부터 불순물을 제거하는 것이 훨씬 덜 곤란한 더 저분자량 중합체로부터, 및 중합성 불순물을 제거하기 위하여 연속된 반응 단계 또는 복잡한 정제 단계가 수행되지 않는 더 고분자량 중합체로부터 제조될 수 있다.
이후부터 본 발명은 이제 더욱 상세히 기재될 것이다. 그러나, 본 발명은 많은 다른 형태로 구현될 수 있으며, 여기서 구현된 구현예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려, 이들 구현예는 이 내용이 철저하고 완벽하게 되도록 제공되는 것이고, 당업자에게 본 발명의 범주를 완전히 알리려는 것이다.
정의
용어 "관능기", "활성 부분", "활성화기", "반응 사이트", "말단기", "화학적 반응성 부분"은 당업계에서 사용되고 있으며, 여기서 분자의 구별되며 정의가능한 부분 또는 단위로 언급된다. 용어들은 화학 분야에서 어느 정도는 동일한 의미이며, 약간의 기능 또는 활성을 수행하고 다른 분자와 반응성인 분자의 부분을 나타내는데 사용된다. 용어 "활성"이 관능기와 결합되어 사용될 때는, 반응을 위해 강한 촉매 또는 상당히 비실용적인 반응 조건을 요구하는 기(예: "비반응성" 또는 "불활성"기)들과는 반대로, 다른 분자상의 친전자성 또는 친핵성기와 쉽게 반응하는 그러한 관능기를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 당업계에서는, 용어 "활성 에스테르" 는 친핵성기, 예컨대 아민과 쉽게 반응하는 그러한 에스테르를 포함하는 것으로 이해된다. 예시적인 활성 에스테르는 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 또는 1-벤조트리아졸릴 에스테르를 포함한다. 전형적으로, 활성 에스테르는 수분간 수성 매질에서 아민과 반응할 것이며, 반면 특정한 에스테르, 예컨대 메틸 또는 에틸 에스테르는 친핵성기와 반응하기 위하여 강한 촉매를 요구한다.
용어 "알킬"은 길이가 약 1 내지 약 12 개의 탄소 원자 범위인 탄화수소 사슬를 언급하며, 직선형 사슬 또는 분지형 사슬을 포함한다. 탄화수소 사슬은 포화 또는 불포화일 수 있다. 용어 "치환된 알킬"은 하나 이상의 비간섭성 치 환체, 예컨대 C3-C6 시클로알킬, 예를 들어 시클로프로필, 시클로부틸, 등; 아세틸렌; 시아노; 알콕시, 예를 들어 메톡시, 에톡시 등; 저급 알카노일옥시, 예를 들어 아세톡시; 히드록시; 카르복실; 아미노; 저급 알킬아미노, 예를 들어 메틸아미노; 케톤; 할로, 예를 들어 클로로 또는 브로모; 페닐; 치환된 페닐(이에 한정되지는 않음) 등으로 치환된 알킬기를 언급한다.
여기서 사용되는 것처럼, "비펩티드성"은 실질적으로 펩티드 결합이 없는 중합체 골격을 언급한다. 그러나, 중합체 골격은 골격의 길이에 따라 펩티트 결합의 최소수, 예컨대 약 50 단량체 단위 당 약 1 개 이하의 펩티드 결합을 포함할 수 있다.
"중합체 접합"은 여기서 정의된 것처럼, 생물학적으로 활성인 분자에 공유결합된 수용성 중합체 골격을 언급한다. 중합체의 접합부가 펩티드인지 기타 결합인지의 여부와 상관없이, 중합체 접합이 확장된 중합체 골격을 형성하기 위해 제 2 중합체와 반응하는 경우, 용어 "중합체 접합"은 생물학적 활성 제제에 결합된 중합체의 전체 길이를 언급한다.
용어 "결합", "링커" 또는 "결합기" 는 여기서 일반적으로 화학 반응의 결과로서 형성되는 기 또는 결합을 언급하는데 사용되며, 전형적으로 공유 결합이다. 가수분해적으로 안정한 결합은 결합이 실질적으로 수중에서 안정하며 유용한 pH, 예컨대 생리학적 조건에서 확장된 시간동안, 바람직하게는 무제한적인 시간동안 물과 반응하지 않는 것을 의미한다. 가수분해적으로 불안정하거나 분해가능한 결 합은 결합이 수중에서 또는 예를 들어 혈액을 포함하는 수성 용액에서 분해가능한 것을 의미한다. 효소적으로 불안정하거나 분해가능한 결합은 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있는 것을 의미한다.
용어 "생물학적으로 활성인 분자", "생물학적으로 활성인 부분", "생물학적으로 활성인 제제" 또는 "약물"이 여기서 사용될 때는, 바이러스, 박테리아, 진균류, 식물, 동물 및 인간을 포함하며, 이에 한정되지 않는 생물학적 유기체의 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 줄 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 여기서 사용되는 것처럼, 생물학적으로 활성인 분자는 사람 또는 기타 동물에서 질병의 진단, 치료 완화, 치료, 또는 예방을 위한 임의의 물질, 또는 사람 또는 동물의 신체적 또는 정신적 건강함을 강화하기 위한 임의의 물질을 포함한다. 생물학적 활성 분자의 예는 펩티드, 단백질, 효소, 작은 분자 약물, 염료, 지질, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 세포, 바이러스, 리포좀, 미소입자 및 마이셀(micelles)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 용도를 위해 적합한 생물학적으로 활성인 제제의 계열은 항생제, 살진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항암제, 심혈관제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드제 등을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "저중량 중합체" 및 "저분자량 중합체" 는 넓게는 1 내지 약 120 개의 반복 단위를 갖는 수용성 및 비펩티드성 중합체를 포함하는 선형, 분지형, 멀티암, 또는 포크형 중합체 골격을 언급한다. 이들 중합체는 전형적으로 선형 중합체상에서 양끝 말단에 위치한 전형적으로 1 내지 2 개의 관능기 내지, 더 작은 수가 중합체 골격을 따라 위치할 수 있지만, 말단에 더 많이 분지된 또는 멀티암 구조로 위치할 수 있는 약 300 개의 관능기를 갖는다. 적합한 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜 등의 공중합체, 폴리(옥시에틸렌화 폴리올), 폴리(올레핀성 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시프로필메타크릴아미드), 폴리(α-히드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 및 공중합체, 삼원중합체, 이들의 유도체 및 혼합물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 올리고머성 및 단량체성 길이는 상기에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 작은 중합체 또는 올리고머의 분자량이 변할 수 있지만, 전형적으로 약 100 Da 내지 약 10,000 Da 범위내이며, 물론 이는 개별적인 반복 단위의 분자량에 의존한다. PEG 의 경우, 하나의 PEG 단량체 단위는 약 44 Da의 분자량을 가지며, 저중량 중합체는 약 44 Da 내지 약 5280 Da 의 분자량을 가질 것이다. 2000, 3200, 3400, 및 5,000 의 분자량이 일반적으로 시판된다. 당업자는 실질적인 수용성 및 비펩티드성 중합체 골격을 위한 앞서의 목록이 결코 소모적이지 않으며, 단지 예시적인 것으로 인식되어야 할 것이며, 상술된 품질의 모든 중합성 물질이 고려된다는 것을 인식할 것이다.
용어 "고중량 중합체" 및 "고분자량 중합체"는 넓게는 약 200 개의 반복 단위를 초과하는 수용성 및 비펩티드성 중합체를 포함하는 선형, 분지형, 또는 멀티암 중합체 골격을 언급한다. 이들 중합체는 전형적으로 선형 중합체 상의 양 말단에 위치한 전형적으로 1 내지 2 개의 관능기, 내지 매우 분지된 또는 멀티암 구조의 말단 또는 중합체 골격을 따라 위치할 수 있는 약 300 개의 관능기를 전형적으로 갖는다. 포크형 구조는 또한 말단이 분지되어 2 개의 관능기를 제공하는 것을 포함한다. 적합한 중합체는 저중량 중합체가 선택된 이들 동일한 중합체를 포함하며, 이에 한정되지는 않는다. 중합체의 분자량이 변할 수 있지만, 전형적으로 약 8,000 Da을 초과하며, 개별적인 단량체 단위의 분자량에 의존한다. PEG 의 경우, 고중량 중합체는 약 8,800 Da 초과의 분자량을 갖는다. 시판되는 PEG 는 10,000, 12,000, 15,000, 18,000, 20,000, 30,000, 40,000 및 이를 초과하는 명목(nominal) 분자량을 갖는 것을 포함한다. 분지된 PEG 는 더 고분자량으로 시판된다. 당업자는 실질적으로 수용성 및 비펩티드성 중합체 골격을 위한 앞서의 목록이 결코 소모적이지 않으며, 단지 예시적인 것이며, 상기 기술된 품질을 갖는 모든 중합성 물질이 고려된다는 것을 인식할 것이다.
여기서 사용되는 것처럼, "PEG" 는 넓게는 CH2CH2O 단위를 반복하여 가지는 수용성 및 비펩티드성 중합체를 포함하는 선형, 멀티암, 또는 분지형 중합체 골격을 언급한다. 중합체 α,ω-디히드록시폴리(에틸렌 글리콜)은 간략한 형태로 HO-PEG-OH 로서 표시될 수 있으며, 이는 -PEG- 기호가 하기 구조 단위 -CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2- (식 중, n 은 약 3 내지 약 2000 범위임)를 나타내는 것으로 이해되어진다. 중합체의 PEG 계열은 일반적으로 물 및 많은 유기 용매중에서 용해성을 가지고, 독성이 없고, 면역원성이 없다. 용어 PEG 는 포괄적이며, 알콕시 PEG, 이관능성 PEG, 포크형 PEG, 분지형 PEG, 펜던트형 PEG 또는 내부에 분해가 능한 결합이 있는 PEG 를 포함하는 이의 선형, 분지형 또는 멀티암 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 것으로 이해되야 한다.
여기서 기재된 임의의 형태의 PEG 는 전형적으로 깨끗하고, 무색, 무취, 수용성, 열안정성이며, 많은 화학 제제에 불활성이며, 가수분해되거나 열화되지 않으며(특별히 그렇게 되도록 설계되지 않는다면), 일반적으로 비독성이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체적합성인 것으로 고려되며, 즉, PEG 는 해를 끼치지 않으면서 생체 조직 또는 유기체와 공존할 수 있다. 더욱 구체적으로, PEG 는 실질적으로 비면역원성이며, 즉 PEG 는 체내에서 면역 반응을 일으키지 않는 경향성이다. 체내에서 일부 바람직한 기능을 갖는 분자, 예컨대 생물학적으로 활성인 제제와 결합될 때, PEG 는 그 제제를 차단하려는 경향이 있고, 유기체가 그 제제의 존재를 용인할 수 있도록 임의의 면역 반응을 감소시키거나 제거할 수 있다. PEG 접합은 실질적인 면역 반응을 일으키지 않는 경향성이거나, 응고 또는 기타 바람직하지 않은 효과를 야기하지 않는 경향성이다.
-PEG-는 -CH2CHRO(CH2CHRO)cCH2CHR- (식 중, 각 R 은 독립적으로 H 또는 CH3이고, c 는 m 및 n 에 대해 상기에 기재된 것이며, 분자가 큰지 작은지에 의존함)로 대체된 본 발명의 고중량 또는 저중량으로 보여지는 에틸렌 옥시드 및 프로필렌 옥시드의 랜덤 또는 블락 공중합체이다.
용어 "중합체 유도체" 는 때때로 결합으로 연결된 저중량 중합체 부분 및 고중량 중합체 부분을 갖는 본 발명의 고중량 중합체 생성물을 기재하는데 사용된다. 이 용어는 단지 편리함을 위한 것이며, 그렇게 표시될 때 이의 고중량 및 저중량 중합체 성분으로부터 생성물 중합체를 구별하기 위해 사용된다.
본 발명에서 유용한 한 형태에서, 고분자량 중합체는 한쪽 말단은 히드록실기이고, 다른쪽 말단은 관능기 Z 로 종결된 선형 PEG 이다:
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2 -Z
상기 중합체는 간략하게 HO-PEG-Z 로서 표시될 수 있으며, 여기서 -PEG- 기호는 하기 구조 단위를 나타내는 것으로 이해된다:
-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-
(식 중, n 은 200 초과이며, 전형적으로는 고중량 중합체에 대해 약 200 내지 2000 의 범위임). 이 중합체는 또한 더욱 일반적으로 R-(폴리)a-Z 로서 표시될 수 있으며, 여기서 (폴리)a 는 본 발명의 큰 중합체 성분을 나타내며, R 은 캡핑 부분 또는 적합한 반응성기 또는 보호된 반응성기 Y" 이다.
본 발명의 고중량 중합체로서 유용한 PEG 의 또다른 형태, (폴리)a 는 메톡시-PEG-Z 또는 간략히 mPEG-Z 이며, 여기서 한 말단은 상대적으로 불활성인 메톡시기인 한편, 나머지 말단은 관능기 Z 이다. mPEG 의 구조는 하기로 주어진다:
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Z
(식 중, n 은 상기와 같음). 관능기 Z를 갖거나 알킬, 아릴 또는 기타 비반응성기 또는 보호기로 캡핑된 Z 외의 기타 활성 사이트를 갖는 mPEG 의 사용은 고중량 중합체가 자가 중합성 및 반응 혼합물에서 기타 분자와 바람직하지 않게 결합되는 것을 방지한다.
고중량 중합체의 관능기 Z 는 Z기가 저중량 중합체에서 발견되는 대응하는 반응성 종인 Y 또는 Y' 과 공유 결합을 쉽게 형성하여, 반응할 때 고중량 중합체와 저중량 중합체 사이에 결합 X를 형성하도록 선택된다. 적합한 관능기는 하기에서 논의된다.
본 발명의 실행에서 유용한 예시적인 형태로서, 저분자량 중합체는 고중량 중합체의 Z 성분과 반응할 때 가수분해적으로 안정한 결합기를 쉽게 형성할 수 있는 관능기 Y 또는 Y', 및 생물학적으로 활성인 제제와 공유 결합을 형성할 수 있는 또는 생물학적으로 활성인 제제와 공유 결합을 형성할 수 있는 형태로 개질될 수 있는 부가적인 관능기 Y 또는 Y' 으로 종결된 선형 PEG 중합체이다:
Y'-CH2CH2O-(CH2CH2O)m-CH2CH2 -Y
상기 중합체는 간략한 형태로 Y'-PEG-Y 로 표시될 수 있으며, 여기서 -PEG- 기호는 하기 구조 단위를 나타내는 것으로 이해된다:
-CH2CH2O-(CH2CH2O)m-CH2CH2 -
(식 중, m 은 1 내지 약 120 범위이고, 저중량 중합체의 경우 전형적으로 약 60미만임). 더욱 일반적으로, 중합체는 Y'-(폴리)b-Y 로 표시될 수 있으며, 여기서 (폴리)b 는 본 발명의 작은 중합체 성분을 나타낸다.
저중량 중합체의 관능기 Y' 및 Y 는 그들이 반응 조건하에서 서로와 쉽게 결 합되지 않도록 선택되며, 따라서 저중량 중합체의 자가 중합을 피한다. 허용가능한 Y' 및 Y 기는 하기에 더욱 상세하게 명시된다.
하기는 그들의 화학적 성질이 PEG 와 매우 관련이 있으며, 또한 중합체 골격으로서 사용될 수 있다.
또한, 중합체 골격은 전형적으로 중앙의 분지된 핵 부분 및 다수의 중합체 사슬, 바람직하게는 중앙 핵에 연결된 선형 중합체 사슬을 갖는 분지된 구조를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, PEG 는 예를 들어 에틸렌 옥시드를 다양한 폴리올의 중앙 핵 구조, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리트리톨 및 소르비톨에 첨가하여 제조된 분지형으로 사용된다. 중합체 사슬에의 접합에 이용가능한 다수의 히드록실기를 제공하는 임의의 폴리올은 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 폴리올 분지 핵 구조는 약 3 내지 100 개의 이용가능한 히드록실기를 제공할 수 있으며, 전형적으로 약 3 내지 20 개를 제공할 수 있으며, 따라서 분지된 중합체 구조는 약 3 내지 100 개의 중합체 사슬을 갖는다. 이 형태의 분지된 폴리(에틸렌 글리콜)분자는 R(-PEG-OH)a 의 일반형으로 표시될 수 있으며, 여기서 R 은 중앙 핵 부분으로부터 유도되며, 예컨대 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 또는 펜타에리트리톨이고, "a" 는 암(arm)의 수, 전형적으로 약 3 내지 20 개를 나타낸다.
고분자량 중합체로서 사용을 위해, 분지된 PEG 의 히드록실기는 일반적으로 저중량 중합체와 결합되기에 앞서 관능기 Z 로 전환된다. 분지된 또는 멀티암 고중량 중합체는 R(-PEG-Z)a 형태를 가지며, 약 3 내지 20 개의 본 발명의 저중량 중합체에 결합될 수 있으며, 이는 분지도 또는 활성기를 갖는 암(arm)의 수에 의존한다. 분지된 분자의 중앙 핵 부분은 임의의 수의 아미노산, 예컨대 라이신으로부터 유도될 수 있으며, 여기서 중앙 핵 부분은 전형적으로 중합체 사슬의 결합을 위해 둘 이상의 사이트, 예를 들어 아미노기를 제공한다. 멀티암 PEG 분자, 예컨대 여기서 전체가 참조로서 삽입된 U.S. 특허 제 5,932,462호에 기재된 것이 또한 중합체 골격으로서 사용될 수 있다.
고분자량 중합체의 중합체 골격은 대안적으로 포크형 PEG 를 포함할 수 있다. 포크형 PEG 의 예는 PEG-ACHZ2 로서 표시되며, 여기서 A는 결합기이고, Z 는 한정된 길이의 원자 사슬에 의해 CH 에 결합된 활성화된 말단기이다. 국제 출원 PCT/US99/05333 은 여기서 전체가 참조로서 삽입되며, 본 발명의 한 구현예에서 사용을 위한 다양한 포크형 PEG 구조를 개시한다. 분지된 탄소 원자에 Z 관능기를 결합시키는 원자의 사슬은 구속기로서 제공되며, 예를 들어 알킬 사슬, 에테르 사슬, 에스테르 사슬, 아미드 사슬 및 이의 조합을 포함할 수 있다. Z 관능기는 본 발명에서 저중량 중합체 상의 관능기 Y 또는 Y' 중의 하나와 반응하여 저중량 중합체 및 고중량 중합체 사이의 결합을 형성하는데 사용될 수 있다.
저중량 또는 고중량 중합체의 중합체 골격은 경우에 따라 PEG 사슬 말단에서 보다는 PEG 골격의 길이를 따라 공유결합된 관능기 Z, Y 또는 Y'를 갖는 펜던트 PEG 분자를 포함할 수 있다. 펜던트 반응기는 직접적으로 또는 결합 부분, 예컨대 알킬렌을 통해 PEG 골격에 결합될 수 있다.
1 초과의 관능기 Z 를 갖는 고중량 중합체의 경우, 저중량 중합체 상의 상응하는 관능기 Y 또는 Y' 이 결합될 수 있는 중합체를 따라 많은 사이트가 있다. 이들로부터 생성되는 중합체 유도체는 편의상 하기와 같이 표시된다:
PEG-[X-(CH2CH2O)m-Y]q
(식 중, PEG 는 중합도가 약 200 이상, 바람직하게는 약 1000 초과, 및 바람직하게는 약 2000 미만인 선형 폴리(에틸렌 글리콜), 알콕시-폴리(에틸렌 글리콜), 분지형 폴리(에틸렌 글리콜), 또는 포크형 폴리(에틸렌 글리콜)이며, X 는 결합 부분이고, m 은 1 내지 약 120, 바람직하게는 60 미만이며, Y 는 생물학적으로 활성 제제에 결합을 위한 관능기이고, q 는 중합체 말단기의 수와 동일하며, 1 내지 약 500 일 수 있음). q 가 2 이면, Y' 는 동일하거나 상이할 수 있으며, q 가 3 또는 4 초과이면, Y' 은 일반적으로 모두 동일할 것이다. 더욱 일반적으로, 상기 구조에서, PEG 는 (폴리)a 일 수 있고, 단량체 단위 CH2CH2O 는 (폴리)b 로서 표시되어 유사한 작은 중합체, 공중합체, 올리고머 등을 포함할 수 있다.
상술된 PEG 의 형태외에, 임의의 상기 중합체는 골격에서 하나 이상의 약하거나 분해가능한 결합으로 제조될 수 있다. 예를 들어, PEG 는 가수분해되는 중합체 골격에서의 에스테르 결합으로 제조될 수 있다. 하기에서 보여지는 것처럼, 이 가수분해는 중합체를 저분자량의 조각으로 절단한다:
-PEG-CO2-PEG- + H2O →-PEG-CO2H + HO-PEG-
유사하게, 중합체 골격은 약하거나 분해가능한 결합 부분을 통해 생물학 적으로 활성인 제제에 공유결합될 수 있다. 예를 들어, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산과 생물학적으로 활성인 제제상의 알콜기와의 반응에 의해 형성된 에스테르 결합은 일반적으로 생리학적인 조건하에서 가수분해되어 그 제제를 방출한다.
중합체 골격내에서 분해가능한 결합으로서 또는 중합체 골격을 생물학적으로 활성인 제제에 연결시키는 분해가능한 결합으로서 유용한, 기타 가수분해적으로 분해가능한 결합은 카르보네이트 결합; 아민 및 알데히드의 반응으로부터 생성되는 이민 결합(Ouchi et al., Polymer Preprints, 38(1):582-3(1997) 참고, 여기서 전체가 참조로서 삽입됨); 예를 들어 알콜을 포스페이트기와 반응시켜 형성된 포스페이트 에스테르 결합; 전형적으로 히드라지드 및 알데히드의 반응으로 형성되는 히드라존 결합; 전형적으로 알데히드와 알콜 사이의 반응에 의해 형성되는 아세탈 결합; 예를 들어 포르메이트와 알콜 사이의 반응에 의해 형성되는 오르소에스테르 결합; 예를 들어 PEG 와 같은 중합체의 말단의 아민기와 펩티드의 카르복실기에 의해 형성된 펩티드 결합; 및 예를 들어 중합체의 말단에서 포스포르아미디트기와 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다.
많은 기타 중합체가 또한 본 발명에 적합하다. 비펩티드성 및 수용성인 중합체 골격이 특히 본 발명에서 유용하다. 상기에 명시된 방식에서 PEG 를 대체하여 사용될 수 있는 적합한 중합체의 예로는 기타 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체 등, 폴리(올레핀성 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카리드), 폴리(α-히드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 예컨대 U.S. 특허 제 5,629,384 에 기재됨, 이는 전체가 여기서 참조로서 삽입됨, 및 이들의 공중합체, 삼원중합체 및 혼합물을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
당업자들은 실질적으로 수용성 중합체에 대한 상기 목록이 결코 소모적이지 않으며, 단지 예시적인 것이고, 상기에 기재된 품질을 갖는 모든 중합성 물질이 고려된다는 것을 인식할 것이다.
X 결합기 형성 성분
언급된 것처럼, 상기 방법 및 수득되는 관능화된 중합체는 하기와 같이 표시될 수 있다:
R-(폴리)a-Z + Y'-(폴리)b-Y →Y-(폴리)b-X-(폴리)a-X-(폴리) b-Y
Z 는 고중량 중합체 (폴리)a 의 관능화된 말단기이고, Y 및 Y' 은 저중량 중합체 (폴리)b 의 관능화된 말단기이다. R 은 보이는 것처럼 호모이관능성 중합체를 제조하는 것이 바람직하다면 관능화된 말단기 Z 를 포함할 수 있거나, 헤테로이관능성 큰 중합체가 바람직하다면, 다른 기인 Y"으로 활성화된 또다른 더 작은 활성화된 중합체에 나중에 커플링되기 위한 보호된 활성기를 포함할 수 있다.
다양한 반응성 기 Y, Y', Y" 및 Z 는 N-숙신이미딜 카르보네이트(U.S. 특허 제 5,281,698 호, 제 5,468,478 호 참고), 아민(Buckmann et al, Makromol.Chem. 182:1379(1981), Zaplipsky et al., Eur. Polym. J. 19:1177(1983) 참고), 히드라지드(예를 들어 Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301(1978) 참고), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트(예를 들어 Olson et al., in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zaplipsky Eds., ACS, Washington DC, 1997 참고; 또한 U.S. 특허 제 5,672,662 호 참고), 숙신이미딜 숙시네이트(예를 들어 Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175(1984) 및 Joppich et al. Macrolol. Chem. 180:1381(1979) 참고), 숙신이미딜 에스테르(U.S. 특허 제 4,670,417 호 참고), 벤조트리아졸 카르보네이트(예, U.S. 특허 제 5,650,234 호 참조), 글리시딜 에테르(예, Pitha et al. Eur. J. Biochem. 94:11(1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354(1991) 참고), 옥시카르보닐이미다졸(예, Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25(1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251(1985) 참고), p-니트로페닐 카르보네이트(예, Veronese et al., Appl. Biochem. Biotech., 11:141(1985); 및 Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45(1991) 참고), 알데히드(예, Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), U.S. 특허 제 5,824,784 호, U.S. 특허 제 5,252,714 호 참고), 말레이미드 (예, Goodson et al. Bio/Technology 8:343(1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29(1984), 및 Kogan, Synthetic Comm. 22:2417(1992) 참고), 오르소피리딜-디술피드(예, Woghiren et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993) 참고), 아크릴롤(예, Sawhney et al., Macromolecules, 26:581(1993) 참고), 비닐술폰(예, U.S.특허 제 5,900,461 호 참고)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 상기 참고문헌 모두는 여기서 참조로서 삽입된다.
말단기 Z 와 Z와의 반응성 기 Y, Y' 또는 Y" 은 말단기 부분이 상보적이도록 선택되는데, 즉 말단기가 반응 조건하에서 서로와 쉽게 반응하여 생리학적 조건하에서 전형적으로 가수분해적으로 안정한 결합기 X 를 형성하는 것을 의미한다. 결합기 X 의 형성은 고분자량 중합체를 저분자량 중합체에 결합시켜, 전제적으로 고분자량 관능화된 중합체 유도체를 형성하는 것이다.
Y, Y' 및 Y" 은 그들이 서로 반응성이 아닌 한 동일하거나 상이할 수 있다. 추가적으로, 하나 이상의 반응성 기 Y 또는 Y' 은 완료된 중합체를 위한 관능기를 제공하기 위하여 Z 와 반응해서는 안된다.
저중량 중합체 상의 관능기 또는 화학적으로 반응성인 기는 히드록실, 보호된 히드록실, 활성 에스테르, 활성 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 히드레이트, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 티올, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 티오술포네이트, 및 트레실레이트로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
반응성 말단기는 하기의 조합으로부터 선택될 수 있다:
-(CH2)rCO2H, -(CH2)r'CO2NS, -(CH2 )r'CO2Bt, -(CH2)rCH(OR)2, -(CH2) rCHO, -(CH2)2-NH2, -(CH2)rM, -(CH2)r -S-SO2-R (식 중, r 은 1 내지 5 이고, r' 은 0 내지 5 이며, R 은 아릴 또는 알킬이고, NS 는 N-숙신이미딜이며, Bt 는 1-벤조트리아졸릴이고, M 은 N-말레이미딜임).
전형적으로, 결합 부분 X 는 친수성이며 짧다. 그러나, 결합기는 친수성이든 소수성이든, 결합기가 실질적으로 중합체의 성질을 변경시키지 않는 한 수소성 성분으로부터 제조될 수 있다. 즉, PEG 의 경우, 결합기는 PEG 의 정의에서 상기에 설명된 것처럼 특성을 변경시키지 않아야 한다.
반응 조건
X 결합기의 형성에서 Z 및 Y, Y' 또는 Y" 말단기의 반응을 위한 매질을 제공하는 적합한 용매는 톨루엔, 테트라히드로푸란, 디옥산, 아세토니트릴, 메틸렌 클로리드, 클로로포름, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 벤젠, 자일렌, 및 유사한 화학적 특성의 용매를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 개질된 및 접합된 저중량 중합체는 더욱 효율적으로 그리고 과거의 유사한 개질된 또는 접합된 고중량 중합체보다 더 나은 결과로 여과, 분리 및 정제될 수 있음을 발견하였다.
말단기 개질 및 접합은 일반적으로 각 관능화 단계가 중합성 불순물을 생성시키는 다단계 방법이다. 정제가 비효율적이면, 고중량 중합체를 다룰 때, 불순물이 중합체의 관능화를 통해 허용불가능한 수준으로 축적되는 경우일 수 있다. 저중량 중합체 상에서 관능화 및 정제 방법을 먼저 수행하고, 이어서 정제된 저중량 중합체를 본 발명의 고중량 중합체와 결합시킴으로써, 고중량 중합체를 포함하는 방법 단계가 최소화되고, 고중량 관능화된 또는 접합된 중합체 유도체를 전체적으로 바람직한 순도로 생성한다.
본 발명의 고분자량 활성화된 중합체를 형성하는 방법
하나 이상의 관능기 Z를 갖는 고분자량, 수용성, 비펩티드성 중합체는 둘 이상의 관능기 Y' 및 Y 를 갖는 저분자량, 전형적으로 올리고머성, 수용성, 비펩티드성 중합체에 공유결합하며, 단, Y가 Y'과 반응성이 아니며, Z가 Y 또는 Y' 중 하나 이상과 반응성인 한, Y 및 Y'은 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명은 또한 관능화된 중합체 유도체가 본 발명에 따라 제조된 후, 생물학적으로 활성인 제제와 중합체 유도체의 접합을 구현한다.
일반적으로, 본 방법 및 수득되는 관능화된 중합체는 하기로 표시된다:
(폴리)a-Z + Y'-(폴리)b-Y →(폴리)a-X-(폴리)b-Y
(식 중, (폴리)a 는 약 200 개 이상의 반복 단위, 전형적으로 약 1000 개 이상, 더욱 전형적으로 1000 내지 2000 개의 반복 단위를 가지고, (폴리)b 는 약 120 개, 전형적으로 60 개 미만의 반복 단위를 가짐). Y 및 Y' 은 Y' 이 Y 와 반응하지 않는 한, 동일하거나 상이할 수 있으며, 관능기이며, X 는 Z 및 Y 또는 Y' 성분의 반응에 의해 형성된 결합 분자이다. 예에서, 상기 Z 는 Y' 와 반응성이어서 결합 X를 형성한다. (폴리)a 는 추가적으로 관능화되어 각 말단에 Y 반응성 기가 있는 호모이관능성 중합체를 생성할 수 있다. 부가기가 반응으로부터 보호된다면, 보호성기는 수득되는 중합체 접합으로부터 제거되어 헤테로이관능성 중합체를 만들 수 있다.
수득되는 본 발명의 중합체 유도체는 결합기를 통해 저분자량 수용성 중합체 부분에 공유결합적으로 연결된 고분자량 수용성 중합체 부분을 포함한다. 저분자량 중합체 부분은 고중량 중합체 부분과의 결합을 제공하는 말단기외에, 관능화된 말단기 Y를 갖는다. 저중량 중합체 부분상의 부가적인 관능화된 말단기 Y 는 생물학적으로 활성인 제제와의 공유결합 또는 그러한 기로의 전환을 위한 결합기를 제공한다.
하기는 본 발명의 비제한적인 예로서 제공된다.
실시예 1. α-t-Boc 아미노-ω-메탄술포네이트 PEG(3400)의 합성
α-N-t-Boc 아미노-ω-히드록시 PEG(3400) (MW 3318 Da, 4.0g, 0.0012 moles)(Shearwater Corp.) 은 35℃에서 회전식 증발기 상에서 클로로포름(80ml) 중에 공비되어 건조되고, 클로로포름(50 ml) 을 남아있는 시럽에 첨가했다. 용액을 아르곤 하에서 4℃에서 냉각시키고, 트리에틸아민(0.31ml, 0.0022 moles)을 주입하고, 이어서 메탄술포닐 클로리드(0.15ml, 0.0019 moles)를 서서히 주입했다. 반응 혼합물을 아르곤 하에서 하룻밤 교반하고, 한편 수조를 실온으로 상승시켰다. 무수 소듐 카르보네이트(4.0mg)를 반응 혼합물에 첨가하고, 수득된 용액을 실온에서 한 시간동안 교반했다. 그 후 혼합물을 여과하고, 여과물을 농축시켜 건조 했다. 이소프로판올(40ml) 을 첨가하고, 침전된 생성물을 진공하에서 여과 및 건조하여 수집했다. 수율: 3.7g 의 α-N-t-Boc 아미노-ω-메탄술포네이트 PEG(3400).
NMR:
Figure 112003021526373-pct00002
이 실시예는 저중량 중합체 α-t-Boc 아미노-ω-히드록시 PEG(3400)의 관능기 Y 가 어떻게 개질되어 양호한 수율로 저중량 중합체를 수득하는지를 예증한다.
실시예 2. α-t-Boc 아미노-ω-p-톨루엔티오술포네이트 PEG(3400)의 합성
α-t-Boc 아미노-ω-메탄술포네이트 PEG(3400)(실시예 1 의 생성물) (1.0g, 0.30 mmoles) 은 35℃에서 회전식 증발기 상에서 클로로포름(30ml) 중에 공비되어 건조되고, 무수 에탄올(15 ml) 을 남아있는 시럽에 첨가했다. 포타슘 p-톨루엔티오술포네이트 (292mg, 1.25 mmoles)을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에서 하룻밤 환류시켰다. 용매를 40℃에서 회전식 증발기 상에서 제거하고, 잔류물을 30분간 진공하에 건조했다. 조생성물을 100ml 의 1M NaH2PO4-Na2HPO4 버퍼 용액(10 중량% NaCl 함유)에 pH5.8 에서 용해시키고, 수득된 혼합물을 디클로로메탄(100ml ×3) 으로 추출했다. 디클로로메탄 상을 무수 소듐 술페이트 상에서 건조하고, 여과하고, 여과물을 회전 증발기상에서 농축하여 거의 건조시켰다. 생성물을 이소프로판올/에테르(40ml/20 ml)의 첨가에 의해 침전하고, 여과하여 수집하고 진공하에 건조했다. 수율: 0.7g 의 α-t-Boc 아미노-ω-p- 톨루엔티오술포네이트 PEG(3400). NMR:(DMSO-d6):1.37 ppm(s, -OC(CH3)3), 2.43 ppm(s, CH3-CH2=CH2/Ar), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 6.76 ppm(t, -CH2NH-CO-), 7.49 ppm(dd, CH3-CH2=CH2/Ar), 7.82 ppm(dd, CH3-CH2=CH2/Ar). 이 실시예는 저중량 중합체 α-t-Boc 아미노-ω-메탄술포네이트 PEG(3400)의 관능기 Y 가 어떻게 개질되어 양호한 수율로 저중량 중합체를 수득하는지를 다시 예증한다.
실시예 3. α-NH 2 -ω-p-톨루엔티오술포네이트 PEG(3400) 의 합성
α-t-Boc 아미노-ω-p- 톨루엔티오술포네이트 PEG(3400)(실시예 2 의 생성물)(0.7 g) 을 아르곤 하에서 무수 디클로로메탄(3.5ml) 및 트리플루오로아세트산 (3.5ml) 중에 용해시켰다. 용액을 실온에서 한 시간동안 교반하고 농축시켜 건조했다. 이소프로판올(20 ml) 을 첨가하고 침전된 생성물을 여과에 의해 수집하고 진공하에 건조했다. 수율: 0.6g 의 α-NH2-ω-p-톨루엔티오술포네이트 PEG(3400). NMR(DMSO-d6): 2.43 ppm(s, CH3-CH2=CH2/Ar), 2.95 ppm(t, -OCH2CH2NH2), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 7.49 ppm (dd, CH3-CH 2=CH2/Ar), 7.82 ppm(dd, CH3-CH2=CH2/Ar). 이 실시예는 저중량 중합체 α-t-Boc 아미노-ω-p- 톨루엔티오술포네이트 PEG(3400)의 관능기 Y 가 어떻게 개질되어 양호한 수율로 저중량 중합체를 수득하는지를 다시 예증한다.
실시예 4. mPEG(23.4kDa)-p-톨루엔티오술포네이트의 합성
mPEG(20 kDa)-1-벤조트리아졸(813mg, MW 21kDa, 0.039 mmoles)(Shearwater Corp.) 및 PEG(3400)-α-NH2-ω-p-톨루엔티오술포네이트(실시예 3 의 생성물)(MW 3805Da, 0.053mmoles)를 아르곤 하에서 무수 디클로로메탄(20ml) 중에 용해시키고, 트리에틸아민(30.8㎕, 0.22 mmoles)을 주입했다. 용액을 실온에서 하룻밤 교반한 후, 농축시켜 건조했다. 2-프로판올(10 ml) 을 첨가하고, 침전된 생성물을 여과하여 수집하고 진공하에 건조했다. 수율: 843 mg. 50 ml 탈이온수중의 조 mPEG(23.4 kDa)-p-톨루엔티오술포네이트(560 mg)를 50 ml Poros media 로 채워진 컬럼상에 넣었다. 컬럼을 100ml 탈이온수로 용출시켰다. 소듐 클로리드(15g) 를 용출액에 첨가하고, 수득된 용액을 디클로로메탄(100ml ×3) 으로 추출했다. 추출물을 무수 소듐 술페이트상에서 건조하고, 여과하고, 여과물을 회전 증발기상에서 농축하여 거의 건조시켰다. 에틸 에테르(50ml)를 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 생성물을 여과하여 수집하고 진공하에 건조했다. 수율: 495 mg 의 mPEG(23.4 kDa)-p-톨루엔티오술포네이트. NMR(DMSO-d6): 2.43 ppm(s, CH3-CH2=CH2/Ar), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 7.23 ppm(t, NHCOO-), 7.49 ppm(dd, CH3-CH2=CH2/Ar), 7.82 ppm(dd, CH3-CH2=CH 2/Ar). 이 실시예는 벤조트리아졸의 Z 관능기와 아민의 Y' 관능기를 반응시켜 고중량 중합체 및 저중량 중합체 부분 사이의 결합기를 형성함으로써, 고중량 중합체 mPEG(20 kDa)-1-벤조트리아졸과 개질된 저중량 중합체 PEG(3400)-α-NH2-ω-p-톨루엔티오술포네이트와의 조합을 예증한다.
실시예 5. α1-안티트립신의 PEG화
100mM 소듐 포스페이트(pH 7.2, 1 ml) 중의 α1-안티트립신(1 mg, Sigma, MW 25 kDa) 의 용액에 2.8 mg 의 mPEG p-톨루엔티오술포네이트(실시예 4 의 생성물)(24 kDa) 를 첨가하고, 용액을 실온에서 하룻밤 교반했다. 모세관 전기영동은 PEG α1-안티트립신 접합이 36%의 수율로 형성되었음을 나타냈다. SDS 겔 전기영동은 또한 PEG 접합의 존재를 증명했다. β-머캅토에탄올과의 PEG 접합의 처리는 겔 전기영동에 의해 증명된 것과 같이 α1-안티트립신의 형성을 초래했으며, 따라서 PEG α1-안티트립신 접합에서의 디술피드 결합의 존재를 나타냈다. 이 실시예는 생물학적으로 활성인 제제, α1-안티트립신과 실시예 4 의 고중량 중합체 유도체의 p-톨루엔티오술포네이트의 관능화된 말단기 Y 를 통한 조합을 증명한다.
실시예 6: m-PEG(22 kDa)-프로피온산
메틸렌 클로리드(20 ml) 중의 m-PEG(20 kDa)-벤조트리아졸 카르보네이트(2.0g, 0.0001 moles)(Shearwater Corporation) 의 용액에, PEG(2 kDa)-α-아미노-ω-프로피온산(0.24g, 0.00012 moles)(Shearwater Corporation) 및 트리에틸아민(0.060 ml) 을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 아르곤 분위기하에서 하룻밤 교반했다. 다음 혼합물을 여과하고 용매를 증발시켜 건조했다. 조생성물을 메틸렌 클로리드 중에 용해시키고 이소프로필 알콜로 침전시켰다. 습윤 생성물을 감압하에 건조했다. 수율: 1.9 g. NMR (d6-DMSO): 2.44 ppm(t, -CH2-COO-), 3.11 ppm(q, -CH 2 -NH-), 3.24 ppm(s, -OCH3), 3.51 ppm (s, PEG 골격), 4.04 ppm(m, -CH2-O(C=O)-), 7.11 ppm(t, -(C=O)-NH-). 음이온 교환 크로마토그래피로 m-PEG(22 kDa)-프로피온산 (93%) 및 m-PEG-20kDa(7%) 을 수득했다. 이 실시예는 고중량 중합체, m-PEG(20 kDa)-벤조트리아졸 카르보네이트와 저중량 중합체 PEG(2 kDa)-α-아미노-ω-프로피온산의 관능화된 카르보네이트 Z 와 아미노 Y' 말단기를 통한 조합을 증명한다.
실시예 7: m-PEG(22 kDa)-프로피온산, N-히드록시숙신이미드 에스테르
무수 메틸렌 클로리드(10 ml) 중의 m-PEG(22kDa)-프로피온산(실시예 6 의 생성물)(1.1g, 0.000050 moles)의 용액에, N-히드록시숙신이미드(0.0063g, 0.000055 moles) 를 첨가하고, 이어서 메틸렌 클로리드(0.05ml, 0.000055 moles) 중의 1,3-디시클로헥실카르보디이미드 1.0 M 용액을 첨가했다. 반응 혼합물을 아르곤하에서 실온에서 하룻밤 교반했다. 다음, 혼합물을 여과하고 용매를 증발시켰다. 조생성물을 메틸렌 클로리드 중에 용해시키고, 이소프로필 알콜로 침전시키고 감압하 건조했다. 수율: 0.9 g. NMR (d6-DMSO): 2.81 ppm(s, -CH2-CH2-(숙시네이트)), 2.92 ppm(t, -CH2-COO-), 3.11 ppm(q, CH 2 -NH-), 3.24 ppm (s, -OCH3), 3.51 ppm (s, PEG 골격), 4.03 ppm(m, -CH2-O(C=O)-), 7.11 ppm(t, -(C=O)-NH-). 이 실시예는 실시예 6 에서 생성된 중합체의 관능기 Y 의 프로피온산으로부터 프로피온산, N-히드록시숙신이미드 에스테르로의 개질을 증명한다.
실시예 8: PEG(2 kDa)-α-아미노-ω-프로피온산, 메틸 에스테르
무수 메틸렌 클로리드(100 ml) 중의 PEG(2 kDa)-α-아미노-ω-프로피온산 (10 g, 0.0050 moles)(Shearwater Corporation) 의 용액에, 1-히드록시벤조트리아졸(0.30g), 4-(디메틸아미노)피리딘(1.0g), 메틸 알콜 (3.2g, 0.100 moles) 및 1,3-디시클로헥실카르보디이미드(메틸렌 클로리드 중의 1.0 M 용액, 7.5ml, 0.0075 moles)를 첨가했다. 반응 혼합물을 아르곤하에서 실온에서 하룻밤 교반했다. 다음, 혼합물을 약 50 ml 로 농축하여 여과하고 800 ml 의 차가운 디에틸 에테르에 첨가했다. 침전된 생성물을 여과제거하고 감압하 건조했다. 수율: 9.5g. NMR(d6-DMSO): 2.53 ppm(t, -CH2-COO-), 2.95 ppm(t, -CH2-아민), 3.51 ppm(s, PEG 골격). 이 실시예는 저중량 중합체 PEG(2 kDa)-α-아미노-ω-프로피온산의 관능화 말단기 Y 의 프로피온산으로부터 프로피온산 메틸 에스테르로의 개질을 증명한다.
실시예 9: m-PEG(32 kDa)-프로피온산, 메틸 에스테르
메틸렌 클로리드 (20 ml) 중의 m-PEG(30 kDa)-벤조트리아졸 카르보네이트 (3.0g, 0.0001 moles)(Shearwater Corporation) 의 용액에, PEG(2 kDa)-α-아미노-ω-프로피온산, 메틸 에스테르(실시예 8 의 생성물)(0.24g, 0.00012 moles) 및 트리에틸아민(0.060 ml) 을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 아르곤 하에서 하룻밤 교반했다. 다음, 혼합물을 여과하고 용매를 증발시켰다. 조생성물을 메틸렌 클로리드 중에 용해시키고, 이소프로필 알콜로 침전시키고, 감압하 건조했다. 수율: 2.8g. NMR(d6-DMSO): 2.53 ppm(t, -CH2-COO-), 3.11 ppm(q, -CH 2 -NH-), 3.24 ppm(s, -OCH3), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 4.04 ppm(m, -CH2-O(C=O)-), 7.11 ppm (t, -(C=O)-NH-). 이 실시예는 실시예 8 에서 제조된 저중량 중합체와 고중량 중합체 m-PEG(30 kDa)-벤조트리아졸 카르보네이트의 벤조트리아졸의 Z 및 아미노의 Y' 관능기를 통한 조합을 예증한다.
실시예 10: m-PEG(32 kDa)-프로피온산
20 ml 탈이온수 중에 m-PEG(32 kDa)-프로피온산, 메틸 에스테르 (실시예 9 의 생성물)(2.8g, 0.000082 moles)을 용해시키고, 0.5M NaOH 용액으로 pH 를 12.0 으로 조정했다. 반응 혼합물을 pH=12.0±0.1 에서 1.5 시간 동안 교반했다. 다음, 소듐 클로리드(3g) 를 첨가하고, 5% 인산으로 pH를 3 으로 조정했다. 생성물을 메틸렌 클로리드로 3회 추출하고, 조합된 추출물을 무수 마그네슘 클로리드로 건조했다. 용매를 감압하 제거하고 생생물을 감압하에 건조했다. 수율: 1.6g. NMR(d6-DMSO): 2.44 ppm(t, -CH2-COO-), 3.11 ppm(q, -CH 2 -NH-), 3.24 ppm(s, -OCH3), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 4.04 ppm(m, -CH2-O(C=O)-), 7.11 ppm (t, -(C=O)-NH-). 음이온 교환 크로마토그래피를 m-PEG(32 kDa)-프로피온산 (97.5%), m-PEG-30kDa(2.5%)를 수득했다. 이 실시예는 실시예 9 에서 제조된 중합체의 관능기 Y의 프로피온산, 메틸 에스테르로부터 프로피온산으로의 개질을 예증한다.
실시예 11: mPEG(32kDa)-프로피온산, N-히드록시숙신이미드 에스테르
무수 메틸렌 클로리드 (10 ml) 중의 m-PEG(32 kDa)-프로피온산(실시예 10 의 생성물)(1.6g, 0.000050 moles)의 용액에, N-히드록시숙신이미드(0.0063g, 0.000055 moles)을 첨가하고, 이어서 1,3-디시클로헥실카르보디이미드(메틸렌 클로리드 중의 1.0 M 용액, 0.05 ml, 0.000055 moles)을 첨가했다. 반응 혼합물을 아르곤 하에서 실온에서 하룻밤 교반하고, 여과하고, 용매를 증발시켰다. 조생성물을 메틸렌 클로리드에 용해시키고, 이소프로필 알콜로 침전시키고, 감압하 건조했다. 수율: 0.9g. NMR(d6-DMSO): 2.81 ppm(s, -CH2-CH2-(숙시네이트)), 2.92 ppm(t, -CH2-COO-), 3.11 ppm(q, -CH 2 -NH-), 3.24 ppm(s, -OCH 3), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 4.03 ppm(m, -CH2-O(C=O)-), 7.11 ppm (t, -(C=O)-NH-). 이 실시예는 실시예 9 에서 제조된 중합체의 관능기 Y의 프로피온산으로부터 프로피온산, N-히드록시술신이미드 에스테르로의 개질을 예증한다.
실시예 12: m-PEG(23.4 kDa)-부탄산
메틸렌 클로리드 (20 ml) 중의 m-PEG(20 kDa)-벤조트리아졸 카르보네이트(2.0g, 0.0001 moles)(Shearwater Corporation)의 용액에, PEG(3.4kDa)-α-아미노-ω-부탄산(0.45g, 0.00012 moles)(Shearwater Corporation) 및 트리에틸아민(0.060 ml)을 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤 분위기하에서 실온에서 하룻밤 교반했다. 다음, 혼합물을 여과하고, 용매를 증발시켜 건조했다. 조생성물을 메틸렌 클로리드에 용해시키고, 이소프로필 알콜로 침전시키고, 감압하 건조했다. 수율: 2.2g. NMR(d6-DMSO): 1.72ppm(q, CH 2 -CH2 -COO-), 2.24 ppm(t, -CH2-COO-), 3.11 ppm(q, -CH 2 -NH-), 3.24 ppm(s, -OCH3 ), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 4.04 ppm(m, -CH2-O(C=O)-), 7.11 ppm (t, -(C=O)-NH-). 음이온 교환 크로마토그래피로 m-PEG(23.4 kDa)-부탄산(92%), m-PEG-20 kDa (8%)를 수득했다. 이 실시예는 저중량 중합체, PEG(3.4 kDa)-α-아미노-ω-부탄산과 고중량 중합체, m-PEG(20 kDa)-벤조트리아졸 카르보네이트의 벤조트리아졸 카르보네이트 Z 및 아미노 Y' 관능기를 통한 조합을 예증한다.
실시예 13: m-PEG(22 kDa)-부탄산, N-히드록시숙신이미드 에스테르
무수 메틸렌 클로리드 (10 ml) 중의 m-PEG(23.4 kDa)-부탄산 (실시예 12 의 생성물) (1.17g, 0.000050 moles)의 용액에, N-히드록시숙신이미드(0.0063g, 0.000055 moles)를 첨가하고, 이어서 1,3-디시클로헥실카르보디이미드(메틸렌 클로리드 중의 1.0M 용액, 0.05 ml, 0.000055 moles)를 첨가했다. 반응 혼합물을 아르곤 분위기하에서 실온에서 하룻밤 교반하고, 여과하고, 용매를 증발시켜 건조했다. 조생성물을 메틸렌 클로리드에 용해시키고, 이소프로필 알콜로 침전시키고, 감압하 건조했다. 수율: 1.0g. NMR(d6-DMSO): 1.83ppm(q, CH 2 -CH2-COO-), 2.70 ppm(t, -CH2-COO-), 2.81 ppm(s, -CH2-CH2-(숙시네이트)), 2.92 ppm, 3.11 ppm(q, -CH 2 -NH-), 3.24 ppm(s, -OCH3), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 4.03 ppm(m, -CH2-O(C=O)-), 7.11 ppm (t, -(C=O)-NH-). 이 실시예는 실시예 12 에서 생성된 중합체의 관능기 Y 의 부탄산으로부터 부탄산, N-히드록시숙신이미드 에스테르로의 개질을 예증한다.
실시예 14: m-PEG(20 kDa)-아민
메틸렌 클로리드 (20 ml) 중의 m-PEG(20 kDa)-벤조트리아졸 카르보네이트 (2.0g, 0.0001 moles)(Shearwater Corporation)의 용액에, 트리에틸렌 글리콜 디아민 FW=148.21 (0.3g, 0.0020 moles)을 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤하에서 실온에서 하룻밤 교반했다. 다음, 용매를 증발시켜 건조하고, 조생성물을 메틸렌 클로리드중에 용해시키고, 이소프로필 알콜로 침전시켰다. 생성물을 감압하에 건조했다. 수율: 1.8g. NMR(d6-DMSO): 2.64 ppm(t, -CH2-아민-), 3.11 ppm (q, -CH 2 -NH-), 3.24 ppm(s, -OCH3), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 4.04 ppm(m, -CH2-O(C=O)-), 7.11 ppm (t, -(C=O)-NH-). 양이온 교환 크로마토그래피로 m-PEG(20kDa)-아민(97.5%)을 수득했다. 이 실시예는 저중량 중합체, 트리에틸렌 글리콜 디아민과 고중량 중합체, m-PEG(20 kDa)-벤조트리아졸 카르보네이트의 벤조트리아졸 카르보네이트, Z 와 아미노 Y' 관능기를 통한 조합을 예증한다.
실시예 15: PEG(3.4 kDa)-α-아민-ω-프로피온알데히드, 디에틸 아세탈
PEG(3.4 kDa)-α-히드록시-ω-프로피온알데히드의 용액에, 톨루엔(20 ml) 및 디클로로메탄(5ml) 의 혼합물 중의 디에틸 아세탈(NOF)(1.0g, 0.000294 moles), 트리에틸아민(0.07 ml, 0.000502 moles, 171% 의 화학양론적 양) 및 메탄술포닐 클로리드(0.028 ml, 0.000362 moles, 123%의 화학양론적 양)을 첨가하고, 수득되는 혼합물을 질소 분위기 하에서 하룻밤 교반했다. 혼합물을 여과하고, 용매를 감압하 증류제거했다. 잔류물을 16 ml 의 농축 암모늄 히드록시드 및 1.6g 의 암모늄 클로리드의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 42 시간동안 교반했다. 반응 생성 물을 디클로로메탄(3회 20 ml)으로 추출했다. 추출물을 5ml의 1M 염산, 5ml 의 증류수로 세척하고, 무수 소듐 술페이트로 건조했다. 다음, 용매를 감압하 증류시켜, 0.78g 의 PEG(3.4 kDa)-α-아민 히드로클로리드-ω-프로피온알데히드, 디에틸 아세탈을 수득했다. NMR(d6-DMSO): 1.10 ppm(t, CH3-, 아세탈), 1.74 ppm(q, -OCH2 CH 2 CH-, 아세탈), 2.94 ppm(t, -CH2-아민 히드로클로리드), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 4.55 ppm(t, CH-, 아세탈), 7.11 ppm (t, -(C=O)-NH-). 이 실시예는 저중량 중합체, PEG(3.4 kDa)-α-히드록시-ω-프로피온알데히드의 관능 말단기 Y' 의 히드록시로부터 아민기로의 개질을 예증한다.
실시예 16: m-PEG(23.4 kDa)-프로피온알데히드, 디에틸 아세탈
메틸렌 클로리드(20 ml) 중의 m-PEG(20 kDa)-벤조트리아졸 카르보네이트 (2.0 g, 0.0001 moles)(Shearwater Corporation) 용액에, PEG(3.4 kDa)-α-아민-ω-프로피온알데히드 디에틸 아세탈(0.36g, 0.000106 moles) 를 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤 분위기 하에 실온에서 하룻밤 교반했다. 다음, 용매를 증발시켜 건조했다. 조생성물을 메틸렌 클로리드에 용해시키고, 이소프로필 알콜로 침전시켰다. 습윤 생성물을 감압하에 건조시켰다. 수율: 1.8g. NMR(d6-DMSO): 1.10 ppm(t, CH3-, 아세탈), 1.74 ppm(q, -OCH2 CH 2 CH-, 아세탈), 3.11 ppm(q, -CH 2 -NH-), 3.24 ppm(s, -OCH3), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 4.04 ppm(m, -CH2-O(C=O)-), 4.55 ppm(t, -CH-, 아세탈), 7.11 ppm(t, -(C=O)-NH-). 이 실시 예는 실시예 15 에서 생성된 저중량 중합체, PEG(3.4 kDa)-α-아미노-ω-프로피온알데히드 디에틸 아세탈과 고중량 중합체, m-PEG(20 kDa)-벤조트리아졸 카르보네이이트의 벤조트리아졸 카르보네이트 Z 와 아미노 Y' 관능기를 통한 조합을 예증한다.
실시예 17: m-PEG(23.4 kDa)-프로피온알데히드
m-PEG(23.4 kDa)-프로피온알데히드, 디에틸 아세탈 (실시예 16 의 생성물) (1.8 g)을 20 ml 증류수에 용해시키고, 용액의 pH 를 희석 인산으로 3 으로 조정했다. 용액을 실온에서 3 시간동안 교반하고, 0.5M 소듐 히드록시드를 사용하여 용액의 pH 를 7 로 조정했다. 생성물을 메틸렌 클로리드로 추출하고, 추출물을 무수 마그네슘 술페이트로 건조하고, 용매를 감압하에 증류제거했다. 수율: 1.6g. NMR(d6-DMSO): 2.60 ppm(q, -OCH2 CH 2 CH-, 알데히드), 3.24 ppm(q, -CH 2 -NH-), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 4.04 ppm(m, -CH2-O(C=O)-), 7.11 ppm(t, -(C=O)-NH-), 9.65 ppm(t, -CH, 알데히드). 이 실시예는 실시예 16 에서 생성된 중합체의 관능기 Y 의 프로피온알데히드, 디에틸 아세탈로부터 프로피온알데히드로의 개질을 예증한다.
실시예 18: 분지형 PEG2(43.4 kDa)-프로피온알데히드, 디에틸 아세탈
메틸렌 클로리드 (8 ml) 중의 분지형 PEG2(40 kDa)-N-히드록시숙신이미드 에스테르 (1.0g, 0.000025 moles)(Shearwater Corporation) 용액에, PEG(3.4 kDa)-α-아민 히드로클로리드-ω-프로피온알데히드 디에틸 아세탈(0.12 g, 0.0000352 moles) 및 트리에틸아민(0.01 ml) 을 첨가하고, 반응 혼합물을 아르곤 분위기하에서 실온에서 하룻밤 교반했다. 다음, 용매를 증발시켜 건조했다. 조생성물을 메틸렌 클로리드 중에 용해시키고 디에틸 에테르로 침전시켰다. 습윤 생성물을 감압하에 건조했다. 수율: 0.83g. NMR(d6-DMSO): 1.10 ppm(t, CH3-, 아세탈), 1.74 ppm(q, -OCH2 CH 2 CH-, 아세탈), 3.24 ppm(s, -OCH3), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 4.55 ppm(t, -CH3-, 아세탈). 이 실시예는 저중량 중합체, PEG(3.4 kDa)-α-아민 히드로클로리드-ω-프로피온알데히드 디에틸 아세탈을, 고중량 분지형 중합체, PEG2(40 kDa)-N-히드록시숙신이미드 에스테르로의 N-히드록시숙신이미드 에스테르, Z 및 아민 히드로클로리드 Y' 관능기를 통한 조합을 예증한다.
실시예 19: 분지형 PEG2(43.4 kDa)-프로피온알데히드
분지형 PEG2(43.4 kDa)-프로피온알데히드, 디에틸 아세탈(실시예 18의 생성물)(0.4g)을 10 ml 수중에 용해시키고, 희석 인산을 사용하여 용액의 pH를 3 으로 조정했다. 용액을 실온에서 3 시간동안 교반하고, 0.5 M 소듐 히드록시드를 사용하여 용액의 pH 를 7 로 조정했다. 생성물을 메틸렌 클로리드로 추출했다. 추출물을 무수 마그네슘 술페이트로 건조하고 용매를 감압하 증류제거했다. 수율: 0.35g. NMR(d6-DMSO): 2.60 ppm(dt, -OCH2 CH 2 CH-, 알데히드), 3.24 ppm(s, -OCH3), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 9.65 ppm(t, -CH-, 알데히드). 이 실시예는 실시예 18 에서 생성된 중합체의 말단기, Y의 프로피온알데히드, 디에틸 아세탈로부 터 프로피온알데히드로의 개질을 예증한다.
실시예 20. M-PEG 20K -말레이미드
메틸렌 클로리드 (200 ml) 중의 m-PEG(20kDa)-벤조트리아졸 카르보네이트 (20.0 g, 0.001 moles)(Shearwater Corporation) 의 용액에, 말레이미드-트리에틸렌글리콜아민 TFA (0.68g, 0.002 moles) 및 4-메틸모르폴린 (0.44 ml, 0.004 moles)를 첨가했다. 실온에서 아르곤하에 4 시간동안 교반하여 반응시켰다. 다음, 용매를 증발시켜 건조하고 이소프로필 알콜(1000 ml)로 침전시켰다. 침전물을 진공 여과로 수집하고, 진공하에 하룻밤동안 건조했다. 수율: 19.5 g.
NMR(d6-DMSO): 3.11 ppm(q, -CH 2 -NH-), 3.24 ppm(s, -OCH3), 3.51 ppm(s, PEG 골격), 4.04 ppm(t, -CH2-O(C=O)-), 7.04 ppm(s, -(C=O)-CH=CH-(C=O)-), 7.11 ppm(t, -(C=O)-NH-). 이 실시예는 고중량 중합체, mPEG-(20 kDa)-벤조트리아졸 카르보네이트와 저중량 중합체, 말레이미드-트리에틸렌글리콜-아민 TFA의 벤조트리아졸 카르보네이트 Z 및 아민 Y' 관능기를 통한 조합을 예증한다.

Claims (51)

  1. 하기를 포함하는 수용성 중합체에 있어서:
    (i) 하기 (ii)에 결합 X 를 통해 공유결합된 약 200 개 이상의 반복 단위 (폴리)a 를 포함하는 제 1 수용성, 비펩티드성 중합체 부분,
    (ii) 약 120 개 이하의 반복 단위 (폴리)b 를 포함하는 제 2 수용성, 비펩티드성 중합체 부분,
    (iii) (폴리)a 또는 (폴리)b 에 위치한 관능기 Y,
    (폴리)a 및 (폴리)b 는 각각 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(올레핀성 알콜) 및 폴리(비닐 알콜)로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되는 수용성 중합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 관능기는 (폴리)b 상에 위치하는 중합체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, (폴리)a 는 관능기를 포함하는 중합체.
  4. 제 1 항에 있어서, (폴리)a 및 (폴리)b 는 각각 독립적으로 관능기를 포함하는 중합체.
  5. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관능기는 친전자성인 중합체.
  6. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관능기는 친핵성인 중합체.
  7. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, (폴리)a 는 약 200 내지 약 2000 개의 반복 단위를 포함하는 중합체.
  8. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, (폴리)b 는 약 1 내지 약 120 개의 반복 단위를 포함하는 중합체.
  9. 제 8 항에 있어서, (폴리)b 는 약 60 개 미만의 반복 단위를 포함하는 중합체.
  10. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, (폴리)a 및 (폴리)b 는 각각 독립적으로 폴리(에틸렌 글리콜)인 중합체.
  11. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, X 는 친수성 결합인 중합체.
  12. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, X 는 아미드 또는 카르바메이트를 포함하는 중합체.
  13. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관능기는 히드록실, 보호된 히드록실, 활성 에스테르, 활성 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 히드레이트, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 티올, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 티오술포네이트, 및 트레실레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 중합체.
  14. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, (폴리)a 및 (폴리)b 는 각각 독립적으로 선형, 분지형, 및 멀티암(multi-armed) 중합체 부분으로 구성되는 군으로부터 선택되는 중합체.
  15. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, (폴리)a, (폴리)b, X 또는 상기 관능기 중 둘 이상을 포함하고, 상기 (폴리)a, (폴리)b, X 및 상기 관능기 각각은 독립적으로 선택되는 중합체.
  16. 제 10 항에 있어서, 비독성 및 비면역원성(non-immunogenic)인 것을 특징으로 하는 중합체.
  17. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체는 선형인 중합체.
  18. 제 17 항에 있어서, 각 말단에 관능기를 포함하는 중합체.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 관능기는 동일한 중합체.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 관능기는 상이한 중합체.
  21. 제 11 항에 있어서, (폴리)a 는 말단-캡핑된 폴리에틸렌 글리콜인 중합체.
  22. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관능기는 숙신이미딜 카르보네이트, 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 에스테르, 벤조트리아졸 카르보네이트, 글리시딜 에테르, 옥시카르보닐이미다졸, p-니트로페닐 카르보네이트, 오르소피리딜 디술피드로 구성되는 군으로부터 선택되는 중합체.
  23. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관능기는 -(CH2)rCO2H, -(CH2)r'CO2NS, -(CH2)r'CO2Bt, -(CH2)rCH(OR)2, -(CH2)rCHO, -(CH2)2-NH2, -(CH2)rM, -(CH2)r-S-SO2-R (식 중, r 은 1 내지 5 이고, r' 은 0 내지 5 이며, R 은 아릴 또는 알킬이고, NS 는 N-숙신이미딜이며, Bt 는 1-벤조트리아졸릴이고, M 은 N-말레이미딜임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 중합체.
  24. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관능기를 통해 생물학적으로 활성인 제제에 공유결합된 중합체.
  25. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 구조를 갖는 중합체:
    Y-(폴리)b-X-(폴리)a-X-(폴리)b-Y
  26. 제 25 항에 있어서, Y 는 아미노 또는 보호된 아미노이고, X 는 우레탄 또는 아미드인 중합체.
  27. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, (폴리)a 또는 (폴리)b 는 각각 독립적으로 가수분해적으로 또는 효소적으로 분해가능한 상기 반복 단위를 분리시키는 결합을 추가적으로 포함하는 중합체.
  28. 하기 구조를 갖는 중합체:
    [화학식 I]
    PEG-[X-CH2CH2O-(CH2CH2O)m-CH2CH2-Y]q
    또는
    [화학식 II]
    PEG-[X-(CH2CH2O)m-Y]q
    (식 중, PEG 는 약 200 개 이상의 반복 단위를 포함하는, 선형 폴리(에틸렌 글리콜), 분지형 폴리(에틸렌 글리콜), 또는 포크형 폴리(에틸렌 글리콜)을 나타내며, X 는 결합 부분이고, m 은 1 내지 약 120 이며, Y 는 말단 관능기이고, q 는 1 내지 약 500 범위임).
  29. 제 28 항에 있어서, Y는 히드록실, 보호된 히드록실, 활성 에스테르, 활성 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 히드레이트, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 티올, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 티오술포네이트, 및 트레실레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 관능기를 포함하는 중합체.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, PEG 는 선형 폴리(에틸렌 글리콜)인 중합체.
  31. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 상기 PEG 는 말단 캡핑기를 포함하는 중합체.
  32. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, m 은 약 60 미만인 중합체.
  33. 제 28 항에 있어서, q 는 2 내지 4 의 범위이고, 각 Y 는 독립적으로 히드록실, 보호된 히드록실, 활성 에스테르, 활성 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 히드레이트, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 티올, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 티오술포네이트, 및 트레실레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 중합체.
  34. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, Y 는 -(CH2)rCO2H, -(CH2)r'CO2NS, -(CH2)r'CO2Bt, -(CH2)rCH(OR)2, -(CH2)rCHO, -(CH2)2-NH2, -(CH2)rM, -(CH2)r-S-SO2-R (식 중, r 은 1 내지 5 이고, r' 은 0 내지 5 이며, R 은 아릴 또는 알킬이고, NS 는 N-숙신이미딜이며, Bt 는 1-벤조트리아졸릴이고, M 은 N-말레이미딜임)로 구성되는 군으로부터 선택되는 중합체.
  35. 제 28 항, 제 29 항 또는 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, X 는 아미드 또는 카르바메이트인 중합체.
  36. 제 28 항, 제 29 항 또는 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 는 약 200 내지 약 2000 개의 반복 단위를 포함하는 중합체.
  37. 하기 구조를 갖는 중합체:
    R-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-(CH2CH2-O)m-CH2CH2-Y
    (식 중, R 은 탄소수 1 내지 5 의 알콕시기 및 말단 친전자성 또는 친핵성기를 갖는 관능기로부터 선택되며, n 은 200 초과이고, m 은 1 내지 약 120 이며, X 는 결합이고, Y 는 R과 동일하거나 상이할 수 있는 관능기임).
  38. 둘 이상의 중합성 부분을 포함하는 수용성, 비펩티드성 중합체의 형성 방법에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법이며:
    약 200 개 이상의 반복 단위를 포함하고 하나 이상의 관능기 Z 를 갖는 제 1 수용성 비펩티드성 중합체와, 1 내지 약 120 개의 반복 단위를 포함하며 하나 이상의 제 2 관능기 Y' 을 갖는 제 2 수용성 비펩티드성 중합체를 반응시켜 Z 와 Y' 의 반응에 의해 상기 제 1 및 제 2 중합체를 공유결합시키는 단계,
    여기서, 상기 제 2 관능기 Y' 은 상기 제 1 관능기 Z 와 반응성이고,
    상기 제 1 또는 제 2 중합체는 추가적으로 Z 또는 Y' 과 쉽게 반응하지 않는 추가적인 관능기 Y 를 포함하며,
    상기 제 1 및 제 2 중합체 각각은 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(올레핀성 알콜) 및 폴리(비닐 알콜)로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, Z 및 Y' 은 N-숙신이미딜 카르보네이트, 아민, 히드라지드, 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트, 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 에스테르, 벤조트리아졸 카르보네이트, 글리시딜 에테르, 옥시카르보닐이미다졸, p-니트로페닐 카르보네이트, 알데히드, 말레이미드, 오르소피리딜-디술피드, 아크릴롤, 및 비닐술폰으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  40. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, Y 는 히드록실, 보호된 히드록실, 활성 에스테르, 활성 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 히드레이트, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 술폰, 아민, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 티올, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 티오술포네이트, 및 트레실레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  41. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 상기 반응 단계는 톨루엔, 테트라히드로푸란, 디옥산, 아세토니트릴, 메틸렌 클로리드, 클로로포름, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 벤젠, 자일렌 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 용매중에서 수행되는 방법.
  42. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 중합체는 각각 독립적으로 선형, 분지형, 멀티암 및 포크형 폴리에틸렌 글리콜로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  43. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 상기 제 1 중합체는 선형 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)인 방법.
  44. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 생물학적으로 활성인 제제를 상기 반응 단계에서 형성된 중합체에 접합시키는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 생물학적으로 활성인 제제는 단백질, 펩티드, 카르보히드레이트, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA 및 지질로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  46. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 상기 제 1 중합체는 보호된 반응기를 추가적으로 포함하고, 상기 방법은 상기 반응 단계 후, 상기 보호된 반응기를 탈보호시키는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  47. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, (폴리)b 는 약 100 Da 이상의 분자량을 갖는 중합체.
  48. 제 38 항 또는 제 39 항에 있어서, 상기 제 2 중합체는 약 100 Da 이상의 분자량을 갖는 중합체.
  49. 제 38 항 또는 제 39 항의 방법에 의해 수득가능한 중합체.
  50. 제 7 항에 있어서, (폴리)a 는 약 200 내지 약 700 개의 반복 단위를 포함하는 중합체.
  51. 제 8 항에 있어서, (폴리)b 는 약 40 내지 약 80 개의 반복 단위를 포함하는 중합체.
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