KR20100019467A

KR20100019467A - 변형된 인터페론 베타 폴리펩티드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20100019467A
Application number: KR1020097024914A
Authority: KR
Inventors: 바딤 크레이노브; 닉 누드슨; 푸트남 안나-마리아 에이 헤이스; 데니스 크레위츠; 제이슨 핑크스태프; 헤더 마일러
Original assignee: 암브룩스, 인코포레이티드
Priority date: 2007-05-02
Filing date: 2008-04-30
Publication date: 2010-02-18
Also published as: WO2008137471A3; BRPI0810622A2; US20120197006A1; HK1134822A1; CA2685596A1; NZ580686A; CN101675071B; CN101675071A; MX2009011870A; CN103965347A; IL201791A0; US20090208454A1; EP2076533A4; US8114630B2; IL201791A; AU2008247815B2; EP2076533A2; AU2008247815A1; WO2008137471A2; US8329869B2

Abstract

본 발명은 변형된 인터페론 베타 폴리펩티드 및 그의 용도를 제공한다.

Description

변형된 인터페론 베타 폴리펩티드 및 그의 용도{MODIFIED INTERFERON BETA POLYPEPTIDES AND THEIR USES}

본 발명은 적어도 하나의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 임의 변형된 인터페론 베타 폴리펩티드에 관한 것이다.

인터페론(IFN)은 다수의 각종 진핵세포에 의해 분비되는 사이토카인 계열로서 잘 알려져 있다. 인터페론은 항바이러스성, 면역조정성, 면역조절성, 신생물성, 및 항증식성 특성을 비롯한 다양한 생물학적 활성을 갖고 있으며, 예를 들면, 암과 같은 질환, 및 다양한 바이러스 질환의 치료용 치료제로서 사용되어 왔다. 인터페론은 다양한 질환의 치료에서 그의 유용성이 입증되었고, 다발성 경화증 및 바이러스 간염 치료를 위해 광범위하게 사용되고 있으며; 현재 가장 보편적으로는 C형 간염 및 다발성 경화증 치료에 있어 치료학적으로 적용되고 있다. 인터페론은 유사한 구조적 특징을 갖는 하나의 단백질 세트를 나타내는 성장 호르몬(GH: growth hormone) 초유전자 계열의 구성원이다(문헌([Bazan, F. Immunology Today 11:350-354(1990)]; [Mott, H. R. and Campbell, I. D. Current Opinion in Structural Biology 5:114-121(1995)]; [Silvennoinen, O. and IhIe, J. N. (1996) SIGNALING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS]). 이러한 단백질 계열의 각 구성원은 4 개의 나선형 다발을 포함한다. 상기 계열의 구성원 중에는 아직 밝혀져야 할 구성원들이 훨씬 더 많이 남아있지만, 상기 계열의 일부 구성원은 하기: 성장 호르몬, 프로락틴, 태반 락토겐, 에리트로포이에틴(EPO: erythropoietin), 트롬보포이에틴(TPO: thrombopoietin), 인터루킨-2(IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12(p35 서브유니트), IL-13, IL-15, 온코스타틴 M, 섬모 신경영양 인자, 백혈병 억제 인자, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 감마 인터페론, 오메가 인터페론, 타우 인터페론, 엡실론 인터페론, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF: granulocyte-colony stimulating factor), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF: granulocyte-macrophage colony stimulating factor), 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF: macrophage colony stimulating factor) 및 카디오트로핀-1(CT-1: cardiotrophin)("GH 초유전자 계열")을 포함한다. 일반적으로, GH 초유전자 계열의 구성원은 아미노산 또는 DNA 서열 동일성이 제한되어 있다는 사실에도 불구하고, 유사한 2차 및 3차 구조를 갖는다. 이러한 공통된 구조적 특징으로 인해 상기 유전자 계열의 신규한 구성원을 용이하게 동정할 수 있다. 4개의 나선형 다발 및 인터페론 폴리펩티드는 WO 2005/074650(발명의 명칭 "Modified Human 4 Helical Bundle Polypeptides and Their Uses"), WO 2005/074524(발명의 명칭 "Modified Human Interferon Polypeptides and Their Uses"), WO 2006/133089 및 WO 2006/133088(발명의 명칭 "Improved Human Interferon Polypeptides and Their Uses")(이들 모두의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

인터페론은 다수의 관련 단백질들, 예를 들면, 인터페론-알파(IFN-α), 인터 페론-베타(IFN-β), 인터페론-감마(IFN-γ) 인터페론-카파(IFN-κ, 이는 인터페론-엡실론 또는 IFN-ε로도 알려져 있다), 인터페론-타우(IFN-τ), 및 인터페론-오메가(IFN-ω)를 포함한다. 이러한 인터페론 단백질은 다양한 종류의 세포에서 생산된다: IFN-α(백혈구), IFN-β(섬유모세포), IFN-γ(림프구), IFN-ε 또는 IFN-κ(각질세포), IFN-ω(백혈구) 및 IFN-τ(영양모세포). IFN-α, IFN-β, IFN-ε 또는 IFN-κ, IFNω, 및 IFNτ는 I형 인터페론으로 분류되는 반면, IFN-γ는 II형 인터페론으로 분류된다. 인터페론 알파는 다중 유전자 계열에 의해 코딩되는 반면, 그 나머지 인터페론들은 각각 인간 게놈 중 단일 유전자에 의해 코딩되는 것으로 보인다. 추가로, 인간 군집 중 상이한 구성원들 간에는 인터페론 서열에 있어 일부의 대립유전자 변이가 존재한다.

인터페론은 상대적으로 소형인 단일 쇄 당단백질로서, 바이러스에 의해 침범을 받았거나, 다른 특정 물질에 노출되어진 세포에 의해 방출된다. 현재, 인터페론은 하기: 1) 백혈구 인터페론(인터페론-알파, α-인터페론, IFN-α), 2) 섬유모세포 인터페론(인터페론-베타, β-인터페론, IFN-β), 및 3) 면역성 인터페론(인터페론-감마, γ-인터페론, IFN-γ)으로 지정된 3가지 주요 부류로 나뉜다. 바이러스 감염에 대한 반응으로, 림프구는 주로 α-인터페론(오메가 인터페론(IFN-ω)과 함께)을 합성하며, 통상적으로 섬유모세포의 감염은 β-인터페론의 생산을 유도한다. IFNα 및 IFNβ는 약 20-30%의 아미노산 서열 상동성을 공유한다. 인간 IFN-β에 대한 유전자에는 인트론이 없고, 상기 유전자는 인간 IFN-α와 29%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하며, 이는 IFN-α 및 IFN-β 유전자가 공통의 조 상으로부터 진화되었다는 것을 시사한다(문헌 [(Taniguchi et al., Nature 285 547-549(1980)]). 반대로, IFN-γ는 미토겐에 대한 반응으로 림프구에 의해 합성된다. 문헌 [Pestka et al. in Annu. Rev. Immunol. (2004) 22:929-79](그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에는 인터페론(IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ, IFN-ω, IFN-δ, IFN-τ, 및 IFN-γ) 뿐만 아니라, 인터페론 유사 분자, 예를 들면, 리미틴, IL-28A, IL-28B, 및 IL-29를 비롯한 클래스 2의 α-나선형 사이토카인, 및 리간드, 수용체, 및 이들 분자들에 의해 사용되는 신호 전달 경로가 기재되어 있다. 인터페론은 상이한 종 및 다수의 대립유전자 변이체를 가진다. 또한, 신규 활성 및 돌연변이체 서열을 가진 인터페론이 각종 질환을 앓는 환자의 세포로부터 단리되었다.

인터페론은 원래 천연적으로 발생된 공급원, 예를 들면, 연막 백혈구 및 섬유모세포 세포로부터 유래되었고, 임의로는 인터페론 생성을 증가시키기 위해 유도제를 사용하였다. 또한, 인터페론은 재조합 DNA 기술에 의해 생산되었다. 성숙 IFNβ의 클로닝 및 발현은 문헌 [Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057(1980)]에 기재되어 있다.

I형 인터페론은 모두 IFNAR1 및 IFNAR2 서브유니트로 이루어진, 공통 수용체 I형 IFN-R에 결합하는 것으로 보인다. 정확한 결합 모드와 하류 신호 전달 캐스캐이드는 I형 인터페론 간에 있어 다소 차이가 있다. 그러나, 일반적으로 JAK/STAT 신호 전달 경로는 인터페론이 인터페론 수용체에 결합한 이후에 활성화된다. 이어서, STAT 전사 인자는 핵으로 전위함으로써 항바이러스성, 항신생물성, 및 면역조 정성 활성을 갖는 단백질 다수를 발현시키게 된다.

천연적으로 발생된 I형 인터페론 단백질의 특성이 치료학적 용도로 최적인 것은 아니다. I형 인터페론은 주사 부위에 반응을 일으키고, 다수의 기타 부작용을 유도한다. I형 인터페론은 고도의 면역원성을 띠며, 상당수의 환자에서 중화 및 비중화 항체를 유발한다. 인터페론은 피하 주사 부위로부터는 충분하게 흡수되지 못하며, 짧은 혈청 반감기를 갖는다. 마지막으로, I형 인터페론은 원핵 숙주에서는 가용성 발현을 하지 않기 때문에, 비용이 더 많이 들고, 더 어려운 리폴딩 또는 포유동물 발현 프로토콜을 필요로 한다.

상업적으로 이용가능한 IFN 제품의 구체적인 예로는 IFNγ-1b(Actimmune^®), IFNβ-1a(Avonex^®, 및 Rebif^®), IFNβ-1b(Betaseron^®), IFN 알파콘-1(Infergen^®), IFNα-2(Intron A^®), IFNα-2a(Roferon-A^®), 페그인터페론 알파-2a(PEGASYS^®), 및 페그인터페론 알파-2b(PEG-Intron^®)를 포함한다. PEG화된 버전의 IFN 단백질 생산과 관련된 일부 문제점은 문헌 ([Wang et al. (2002) Adv. Drug Deliv. Rev. 54:547-570]; 및 [Pedder, S.C. Semin Liver Dis. 2003;23 Suppl 1:19-22])에 기재되어 있다. (Wang) 등은 PEG-인트론(PEG-Intron)^®의 위치 이성체를 특징화하였고, (Pedder) 등은 페가시스(PEGASYS)^®를 PEG-인트론^®과 비교하며, 사용된 PEG화 화학기법의 불안정성 및 제형화에 미치는 효과를 기술하였다. 페가시스^®는 항바이러스 활성이 상이한 특이적인 이소형인 9개의 확인가능한 이소형으로 구성되어 있다(문헌 [Foser et al., Pharmacogenoms J 2003; 3:312]). 다수의 IFN 제품이 현재 시판되고 있지만, 인터페론 치료제에 대한 요구는 여전히 충족되지 못하고 있는 상태이다. 본 발명은 특성이 개선된 인터페론 단백질을 동정하는 것에 관한 것이다. 여러 단체들이 특성이 개선된 변형된 인터페론을 생성하였다(하기 참고 문헌들 모두의 전문이 명확하게 참고로 인용된다).

분자내 또는 분자 간의 원치 않는 디설피드 결합이 형성되는 것을 최소화시키기 위해 시스테인 소실 변이체가 생성되었다(미국 특허 번호 제4,518,584호; 제4,588,585호; 및 제4,959,314호(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)). 산화에 대한 감수성을 최소화시키기 위해 메티오닌 소실 변이체가 생성되었다(EPO 260350(본원에서 참고로 인용된다)).

활성이 변형된 인터페론이 생성되었다(미국 특허 번호 제6,514,729호; 제4,738,844호; 제4,738,845호; 제4,753,795호; 제4,766,106호; WO 00/78266(본원에서 참고로 인용된다)). 미국 특허 번호 제5,545,723호 및 제6,127,332호(본원에서 참고로 인용된다)는 101번 위치에 존재하는 인터페론 베타의 치환 돌연변이체를 개시하고 있다. 하나 이상의 인터페론으로부터 유래된 서열을 포함하는 키메라 인터페론이 제조되었다(문헌 ([Chang et. al. Nature Biotech. 17: 793-797(1999)], 미국 특허 번호 제4,758,428호; 제4,885,166호; 제5,382,657호; 제5,738,846호(참고로 인용된다)). 49번 및 51번 위치에서의 인터페론 베타에 대한 치환 돌연변이 또한 기재되어 있다(미국 특허 번호 제6,531,122호(참고로 인용된다)). IFN 베타 변 이체 및 접합체의 발현 및 생성은 미국 특허 번호 제7,144,574호 및 제6,531,111호(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에서 논의된 바 있다. 논의된 바 있는 변형으로는, IFN 베타로 도입되었거나, 폴리펩티드로부터 제거된 글리코실화 부위, 글리코실화 부위에 근접한 부위에서의 치환, 리신 또는 시스테인 잔기로의 접합화, 및 아미노산의 도입 또는 제거를 포함하였다.

안정성이 증강된 인터페론 베타 변이체가 논의된 바 있는데, 여기서는 소수성 코어가 합리적인 디자인 방법의 사용으로 최적화되었다(WO 00/68387(참고로 인용된다)). 인터페론 안정성 또는 가용성을 촉진시키는 대체 제제 또한 논의된 바 있다(미국 특허 번호 제4,675,483호; 제5,730,969호; 제5,766,582호; WO 02/38170(참고로 인용된다)).

가용성이 증강된 인터페론 베타 뮤테인이 논의된 바 있는데, 여기서는, 수개의 류신 및 페닐알라닌 잔기가 세린, 트레오닌, 티로신 잔기로 대체되어 있다(WO 98/48018(참고로 인용된다)). 가용성을 개선시키는 다른 변형은 US 2005/0054053(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에서 논의되고 있다.

면역원성이 감소된 인터페론 알파 및 인터페론 베타 변이체가 논의된 바 있다(WO 02/085941 및 WO 02/074783(참고로 인용된다) 참조).

면역원성이 현 인터페론(인터페론 베타를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 치료제가 갖는 주된 한계이다. 면역 반응은 전형적으로 비인간 단백질에 대해서 가장 심각하게 나타나지만, 인간 단백질, 예를 들면, 인터페론 베타에 기초한 치료제인 경우에도 자주 면역원성을 띠는 것으로 관찰된다. 면역원성은 외래의 것으로서 인식되는 물질에 대한 복잡한 일련의 반응이며, 이는 중화 및 비중화 항체의 생산, 면역 복합체 형성, 보체 활성화, 비만 세포 활성화, 염증 및 아나필락시스를 포함할 수 있다. 많은 환자에서 IFN 베타에 대한 중화 항체가 발생되었다(문헌 [Int. Arch. Allergy Immunol. 118:368 371, 1999]). IFN 베타-중화 항체가 발생하면 IFN 베타에 대한 생물학적 반응은 감소하게 되고, 치료 효과는 감소하는 추세로 기울어진다(문헌 [Neurol. 50:1266 1272, 1998]). 중화 항체는 또한 다른 질환의 치료와 관련하여 IFN 베타의 치료학적 유용성을 방해할 가능성도 있다(문헌 [Immunol. Immuther. 39:263 268, 1994]).

단백질 서열, 투여 경로 및 빈도, 및 환자 군집을 포함하나, 이에 한정되지 않는 수개의 인자가 단백질 면역원성의 원인이 될 수 있다. 응집은 관련 단백질 치료제인 인터페론 알파의 면역원성과 연관되어 있다(문헌 [Braun et. al. Pharm. Res. 1997 14: 1472-1478]). 또다른 연구에서는, DR15 MHC 대립유전자가 존재하면 중화 항체 형성에 대한 감수성은 증가하게 되고; 흥미롭게도, 동일한 대립유전자가 다발성 경화증에 대한 감수성을 부여한다는 것을 시사한다(문헌 [Stickler et. al. Genes Immun. 2004 5: 1-7]).

응집이 인터페론(특히, 인터페론 베타)의 면역원성에 원인이 될 수 있는 바, 가용성을 개선시키기 위해 공학처리된 변이체는 또한 감소된 면역원성을 가질 수 있다. 분자내 또는 분자 간의 원치 않는 디설피드 결합이 형성되는 것을 최소화시키기 위해 시스테인 소실 변이체가 생성되었는데(미국 특허 번호 제4,518,584호; 제4,588,585호; 및 제4,959,314호(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)); 그러 한 변이체는 응집 성향이 감소된 것으로 나타났다. 소수성 코어가 합리적인 디자인 방법의 사용으로 최적화되고(WO 00/68387(참고로 인용된다)), 안정성이 증강된 인터페론 베타 변이체가 제조되었는데; 몇몇 경우에서, 가용성은 안정성 개선에 의해 증강될 수 있다. 인터페론 안정성 또는 가용성을 촉진시키는 대체 제제 또한 논의된 바 있다(미국 특허 번호 제4,675,483호; 제5,730,969호; 제5,766,582호; WO 02/38170(참고로 인용된다)). 가용성이 증강된 인터페론 베타 뮤테인이 논의된 바 있는데, 여기서는, 수개의 류신 및 페닐알라닌 잔기가 세린, 트레오닌, 티로신 잔기로 대체되어 있다(WO 98/48018(참고로 인용된다)).

폴리에틸렌 글리콜("PEG: polyethylene glycol")의 첨가로 인터페론이 변형되었다(미국 특허 번호 제4,917,888호; 제5,382,657호; 및 제6,962,978호; WO 99/55377; WO 02/09766; WO 00/23114(그의 전문 모두가 본원에서 참고로 인용된다) 참조). PEG 첨가가 혈청 반감기 및 가용성을 개선시킬 수 있다. 몇몇 경우에서, PEG화는 항체 아그레토프(agretope)에의 접근을 입체적으로 차단시킴으로써 중화 항체를 일으키는 환자 중 일부를 감소시키는 것으로 관찰되었다(예를 들면, 문헌 ([Hershfield et. al. PNAS 1991 88:7185-7189(1991)]; [Bailon. et al. Biocojug. Chem. 12: 195-202(2001)]; [He et al. Life Sci. 65: 355-368(1999)]) 참조).

야생형 단백질에 비하여 감소된 친화도로 MHC 클래스 II 대립유전자에 결합할 것으로 예측되는 인터페론 베타 변이체 또한 생성되었으며; 상기 2가지 일례인 야생형 단백질과 인터페론 베타 변이체, 둘 모두에서 주로 결합을 감소시키는데에는 알라닌 돌연변이가 사용되었다(문헌 WO 02/074783(참고로 인용된다); [Stickler 상기 문헌 동일]). IFN 베타의 일부에 상응하는 합성 펩티드에 대한 항체의 면역반응성은 문헌 [Redlich et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1991) 88:4040-4044]에서 논의된 바 있다.

단백질의 면역원성을 조정하는 여러 방법들이 개발되었는데; 바람직한 접근법은 MHC 결합 아그레토프를 제거함으로써 T 세포 활성화를 붕괴시키는 것이다. 다양한 MHC 분자는 단지 ~10³개의 대립유전자를 포함하는 반면, 항체 레파토리는 대략 10⁸개로 추정되고, T 세포 수용체 레파토리는 더욱더 많은 바, 상기 접근법이 T 세포 수용체 또는 항체 결합을 회피하는 것보다는 취급이 더 용이하다. 단백질 서열 내의 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 동정하고, 제거 또는 변형시킴으로써 분자적 원리에 기초하여 면역원성을 회피할 수 있다. 면역원성이 감소된 단백질을 생성하기 위한 목적으로 상기와 같은 아그레토프를 제거하는 것은 종래에 개시된 바 있다; 예를 들면, WO 98/52976 및 WO 02/079232(참고로 인용된다)를 참조한다.

MHC 결합 아그레토프 중 면역원성을 감소시키는 것으로 예측되는 다수의 돌연변이가 동정될 수 있지만, 이들 아미노산 치환들 대부분은 에너지 효율면에서는 바람직하지 못한다. 그 결과, 상기 기술된 방법을 사용하여 동정된, 면역원성이 감소된 서열 대다수는 단백질의 구조 및/또는 기능과 화합하지 못할 것이다. MHC 아그레토프를 제거하는 것이 면역원성을 감소시키는 실현가능한 접근법이 될 수 있도록 하기 위해서는 단백질의 구조, 안정성, 및 생물학적 활성을 보유시키고자 하는 노력을 동시에 기울이는 것이 중요하다.

면역원성은 여러가지 방식으로 인터페론 치료제의 효능 및 안전성을 제한할 수 있다. 치료제 효능은 중화 항체의 형성에 의해서 직접 감소될 수 있다. 중화 또는 비중화 항체가 혈청 반감기를 변경시킬 수 있는 바, 효능 또한 간접적으로 감소될 수 있다. 원치 않는 면역 반응은 지연형 과민반응을 포함하나, 이에 한정되지 않는 주사 부위의 반응 형태를 취할 수 있다. 또한, 항인터페론 베타 중화 항체는 내인성 인터페론 베타와 교차 반응할 수 있고, 그의 기능을 차단할 수도 있다.

면역원성이 감소된 신규한 인터페론 단백질이 여전히 요구되고 있다. 면역원성이 감소된 인터페론의 변이체는 다수의 인터페론 반응성 병증 치료에서 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 미국 특허 공보 번호 제2005/0054053호(본원에서 참고로 인용된다)에는 야생형 IFN 베타와 비교하여 면역원성이 조정된 변이체 IFN 베타 단백질이 기재되어 있다.

그 결과, 효능 증가, 부작용의 감소, 면역원성 감소, 가용성 증가, 및 원핵생물의 가용성 발현 증강을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과 같은, 특성이 개선된 인터페론 단백질을 개발하고 발견해야 할 필요가 있다. 덜 빈번하게 주사되어야 하고/거나, 그를 통해 중화 항체가 발생될 수 있는 위험이 감소된 인터페론 폴리펩티드가 요구되고 있다. 다른 것들 및 이식 거부 중 자가면역 질환, 바이러스 감염, 및 염증성 질환, 세포 증식 질환, 세균 감염, 수정능 증가, 및 암을 비롯한 각종 질환 및 병증의 치료에서 개선된 인터페론 치료제가 유용할 수 있다. 또한, 인터페론은 특정 포유동물에서 임신 확립을 촉진시키는데 사용될 수 있다.

인터페론 계열의 한 구성원인 인간 인터페론 베타의 용도는 다발성 경화증 치료에서 가장 잘 확립되어 있다. 최근 유럽과 미국에서는 상기 질환 치료용으로서 2가지 형태의 재조합 인터페론 베타가 허가를 받았다. 한가지 형태는 인터페론 베타-1a(상표명 AVONEX^®(제조사: 매사추세츠주 캠브리지 소재의 Biogen, Inc.); 또는 REBIF^®(제조사: Merck Serono)로서 시판된다)이고, 이하, "인터페론 베타-1a" 또는 "IFN 베타-1a" 또는 "IFNβ-1a" 또는 "인터페론 β-1a"로, 또는 하이픈으로 연결된 형태 및 하이픈이 붙지 않은 형태 등의 다양한 형태로 상호교환적으로 사용된다. 현재 시판되는 아보넥스(AVONEX) 제제는 30 ug/용량(200 MIU/mg)을 갖고, 주당 4회에 걸쳐 근육내로 투여되는 CHO(차이니즈 햄스터 난소: Chinese hamster ovary) 유래의 IFN 베타 1a를 제공한다. 현재 시판되는 레비프(REBIF) 제제는 44 ㎍/용량(270 MIU/mg)을 피하 TIW로 투여하고, 또한, CHO 유래의 IFN 베타 1a를 제공한다. 나머지 한 형태는 인터페론 베타-1b(상표명 BETASERON^®(캘리포니아주 리치몬드 소재의 Berlex)로서 시판된다), 이하, "인터페론-베타-1b"이다. 현재 시판되는 베타세론(BETASERON) 제제는 250 ㎍/용량(32 MIU/mg)을 갖고, 이틀에 1번씩 또는 매일 3회에 걸쳐 피하로 투여되는 E. 콜라이(E. Coli) 유래의 IFN-베타 1b를 제공한다. 인터페론 베타-1a는 천연 인간 유전자 서열을 사용하여 포유동물에서 생산되고, 글리코실화된 것인 반면, 인터페론 베타-1b는 유전공학적으로 아미노산 위치 17번에서 시스테인이 세린으로 치환된(C17S) 것을 함유하는 변형된 인간 유전자 서열을 사용하여 E. 콜라이에서 생산되고, 글리코실화되지 않은 것이다. 공통된 부작용으로는 열, 두통, 피로감, 불안감, 우울증, 간 질병, 및 주사 부위의 반응을 포 함하나, 이에 한정되지 않는다. 문헌 [Yong et al. Neurology(1998) 51:682-689]는 다발성 경화증 치료에서의 인터페론 베타의 용도를 논의하고 있고, MS로부터 유발되는 장애 누적율이 감소되었음을 언급하고 있다.

문헌 [Karpusas et al. in Proc Natl Acad Sci 1997 94:11813-11818]에는 글리코실화된 인간 인터페론 베타의 결정 구조가 기재되어 있다. 이러한 단백질은 단일 부위(Asn80)에서 글리코실화되어 있다. 상기 단백질은 E. 콜라이에서 생산된 경우에는 응집하는 경향이 있다(문헌 [Mitsui et al. Pharmacol Ther 1993 58:93-132]). (Karpusas) 등은 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO)에서의 인간 인터페론 베타 생산과 블루 세파로스(Sepharose) 및 SP-세파로스(이온 교환)를 사용한 분비된 단백질의 정제에 관해 기술하였다.

알파 및 베타 인터페론이 급성 바이러스 질환인 대상 포진(문헌 ([T. C. Merigan et al, N. Engl. J. Med. 298, 981-987(1978)]; [E. Heidemann et al., Onkologie 7, 210-212(1984)])), 만성 바이러스 감염, 예로서, C형 간염 및 B형 간염 감염(문헌 ([R. L. Knobler et al., Neurology 34(10): 1273-9(1984)]; [M. A. Faerkkilae et al., Act. Neurol. Sci. 69, 184-185(1985)])) 치료에 사용되어 왔다.

인간 IFNβ는 분자량이 약 22 kDa이며, 166개의 아미노산 잔기로 구성된 조절성 폴리펩티드이다. 이는 바이러스 감염 또는 다른 병원체에의 노출에 대한 반응으로 체내 비만세포에 의해, 특히 섬유모세포에 의해 생산될 수 있다. 이는 다량체 세포 표면 수용체에 결합하고, 생산성 수용체 결합은 세포내 이벤트의 캐스캐이드 를 일으켜 IFNβ 유도성 유전자를 발현시키고, 결국에는 항바이러스성, 항증식성 및 면역조정성으로 분류될 수 있는 효과를 가져오게 된다.

인간 IFNβ의 아미노산 서열이 공지되어 있다(문헌 ([Taniguchi, Gene 10:11-15, 1980], 및 EP 83069, EP 41313 및 미국 특허 번호 제4,686,191호)(본원에서 참고로 인용된다)). 인간 및 뮤린 IFNβ 결정 구조는 (문헌 ([Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11813-11818, 1997]; [J. Mol. Biol. 253:187-207, 1995]; 미국 특허 번호 제5,602,232호; 제5,460,956호; 제5,441,734호; 제4,672,108호)(본원에서 참고로 인용된다))에 기술되어 있고, 문헌 [Cell Mol. Life Sci. 54:1203-1206, 1998]에서 논의된 바 있다. IFNβ의 변이체가 보고된 바 있다(문헌 (WO 95/25170, WO 98/48018, 미국 특허 번호 제6,572,853호, 미국 특허 번호 제5,545,723호, 미국 특허 번호 제4,914,033호, EP 260350, 미국 특허 번호 제4,588,585호, 미국 특허 번호 제4,769,233호, [Stewart et al, DNA Vol. 6 no. 2 1987 pp. 119-128], [Runkel et al, 1998, J. Biol. Chem. 273, No. 14, pp. 8003-8008])(본원에서 참고로 인용된다)). 미국 특허 번호 제4,966,843호, 미국 특허 번호 제5,376,567호, 미국 특허 번호 제5,795,779호, 미국 특허 번호 제7,144,574호(본원에서 참고로 인용된다)에는 CHO 세포에서의 IFNβ 발현이 기재되어 있다. 특정 글리코실화 패턴을 갖는 IFNβ 분자 및 그의 제조 방법이 보고된 바 있다(EP 287075 및 EP 529300).

IFNβ 1a 및 β1b의 구조 및 기능은 문헌 [Pharmaceut. Res. 15:641-649, 1998]에서 비교된 바 있다. IFN 베타의 사용으로 다발성 경화증의 진행이 지연되는 것으로 나타났다. 다발성 경화증은 중추 신경계의 재발성에 이은 진행성 염증성 퇴 행성 질환이다. IFNβ가 가질 수 있는 다른 효과로는 백혈구 증식 및 항원 제시에 대한 억제 효과, 항염증성 표현형으로의 사이토카인 생산 프로파일의 조정, 및 MS에서 IFNβ 기전의 원인이 되는 T 세포 매트릭스 메탈로프로테아제의 활성을 억제시킴으로써 일어나는 T 세포 유주의 감소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다(문헌 [Neurol. 51:682-689, 1998]).

IFN 베타는 골육종, 기저 세포암종, 자궁경부 이형성증, 신경교종, 급성 골수성 백혈병, 다발 골수종, 호지킨병, 유방암종, 흑색종, 및 바이러스 감염(유두종 바이러스, 바이러스 간염, 음부 포진, 대상 포진, 포진성 각막염, 단순 포진, 바이러스성 뇌염, 사이토메갈로바이러스 폐렴, 및 리노바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 질환 치료에서 사용될 수 있다. 현 IFNβ 치료제가 갖고 있는 부작용으로는 주사 부위의 반응, 열, 오한, 근육통, 관절통, 및 다른 플루 유사 증상들을 포함한다(문헌 [Clin. Therapeutics, 19:883-893, 1997]).

현 IFNβ 제품이 갖는 다수의 부작용, 그와 빈번한 주사와의 관련성, IFNβ의 원하는 치료학적 효과를 방해하는 중화 항체가 발생될 수 있는 위험, 및 동시에 치료학적 효과는 증강되면서 보다 최적의 치료학적 IFNβ 수준을 수득할 수 있는 잠재능을 고려하면, 개선된 IFNβ 유사 분자가 요구되고 있다.

인터페론-베타-1a 및 인터페론 베타 1b의 상대적인 시험관내 잠재능을 기능 분석법으로 비교하였는데, 이는 인터페론-베타-1a의 특이적인 활성이 인터페론-베타-1b의 특이적인 활성보다 대략 10배 정도 더 큰 것으로 나타났다(문헌 [Runkel et al., 1998, Pharm. Res. 15: 641-649]). 이러한 활성 차이를 가져오는 구조적인 근거를 확인하기 위해 디자인된 연구를 통해, 특이적인 활성에 영향을 미치는 생성물 간의 공지된 구조적 차이 중 유일한 것은 글리코실화라는 것을 확인하게 되었다. 당질이 갖는 효과는 대체로 구조에 대한 그의 안정화 역할을 통해 명백해졌다. 당질이 갖는 안정화 효과는 열적 변성 실험 및 SEC 분석에서 명백해졌다. 글리코실화의 결여는 응집 증가와 열적 변성에 대한 감도 증가와도 상관관계에 있었다. PNG아제 F를 사용하여 인터페론-베타-1a로부터 당질을 효소적으로 제거할 경우, 이는 탈글리코실화된 생성물을 광범위하게 침전시켰다.

본 발명의 인터페론-베타 분자는 그들의 생물학적 활성 모두 또는 대부분을 보유할 수 있으며, 하기와 같은 특성이 일어날 수 있다: 약동학적 성질 및 약력학적 성질의 변경으로 인한 반감기 증가 및 조직 분포의 변경(예로서, 보다 장기간 동안 맥관 구조내 체류할 수 있는 능력), 용액 중에서의 안정성 증가, 면역원성 감소, 단백질 분해적 분해와 이에 이어지는 활성 폐기로부터의 보호. 그러한 분자는 약제학적 분야 및 의약 분야에 있어서 실질적인 진보가 될 것이며, 예를 들면, 다발성 경화증, 섬유증, 및 다른 염증성 또는 자가면역 질환, 암, 간염 및 다른 바이러스성 질환과 같이, 인터페론이 몇몇 유용성을 갖는 다양한 질환을 관리하는데 상당한 기여를 하게 될 것이다. 특히 보다 장기간 동안 맥관 구조내 체류할 수 있는 능력으로 인하여 사용되는 인터페론 베타는 신생혈관형성을 억제시킬 수 있고, 잠재적으로는 혈액 뇌장벽을 통과할 수 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인터페론 베타와, 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 또다른 분자 사이 에 형성된 접합체를 통해 접합체의 열적 안정성을 조정할 수 있다. 그러한 열적 안정성의 조정은 흡입에 의한 순차적 투여용의 분말 형태로 인터페론-베타를 제제화할 때의 장점이 될 수 있다.

친수성 중합체 폴리(에틸렌 글리콜)(약칭, PEG)의 공유적인 부착이 수용성, 생체이용성을 증가시키거나, 혈청 반감기를 증가시키거나, 치료학적 반감기를 증가시키거나, 면역원성을 조정하거나, 생물학적 활성을 조정하거나, 단백질, 펩티드, 및 특히 소수성 분자를 비롯한 다수의 생물학적 활성 분자의 순환 시간을 연장시키는 방법이다. PEG는 약제에서, 인공 임플란트 상에서, 및 생체적합성, 독성 결여, 및 면역원성 결여가 중요한 다른 적용에 있어서 광범위하게 사용되어 왔다. PEG의 원하는 특성을 최대화시키기 위해 생물학적 활성 분자에 부착된 PEG 중합체 또는 중합체들의 전체 분자량 및 수화 상태는 모체 분자의 생체활성에는 역효과를 주지 않으면서, 예를 들면, 수용성 및 순환 반감기 증가와 같이 전형적으로 PEG 중합체 부착과 관련된 유익한 특징들을 부여하기에 충분히 높아야 한다.

PEG 유도체는 종종 예를 들면, 리신, 시스테인 및 히스티딘 잔기와 같은 반응성 화학 관능기, N 말단 및 당질 부분을 통해 생물학적 활성 분자에 연결되어 있다. 단백질 및 다른 분자들은 종종 중합체 부착에 이용가능한 한정된 수의 반응성 부위를 가진다. 종종, 중합체 부착을 통한 변형에 가장 적합한 부위는 수용체 결합에 있어서 중요한 역할을 하고, 그 분자의 생물학적 활성의 보유를 위해 필수적이다. 그 결과, 생물학적 활성 분자 상의 상기와 같은 반응성 부위에 중합체 쇄가 무차별적으로 부착됨으로써 중합체 변형된 분자의 생물학적 활성이 현저한 감소하거 나 심지어는 완전히 상실된다(문헌 [R. Clark et al., (1996), J. Biol. Chem., 271:21969-21977]). 표적 분자에 원하는 장점을 부여하기에 충분한 중합체 분자량을 가진 접합체를 형성하기 위해, 선행 기술의 접근법은 전형적으로 다수의 중합체 암을 분자에 무작위적으로 부착시키는 단계를 포함함으로써, 모체 분자의 생체활성의 감소 또는 심지어 완전한 상실의 위험을 증가시킨다.

PEG 유도체가 단백질에 부착되기 위한 위치를 형성하는 반응성 부위는 단백질의 구조에 의해 결정된다. 효소를 비롯한 단백질은 일반 화학식 H₂N--CHR--C00H를 가지는 알파 아미노산의 다양한 서열로 구성된다. 하나의 아미노산의 알파 아미노 부분(H₂N-)은 인접 아미노산의 카르복실 부분(--C00H)에 결합되어 --(NH--CHR--CO)_n--로서 표시될 수 있는 아미드 결합을 형성하는데, 여기서, 아래첨자 "n"은 수백 또는 수천일 수 있다. R로 표시되는 단편은 단백질의 생물학적 활성 및 PEG 유도체의 부착을 위한 반응성 부위를 함유할 수 있다.

예를 들어, 아미노산 리신의 경우, 알파 위치 뿐만 아니라, 엡실론 위치에도 --NH₂ 부분이 존재한다. 엡실론 -NH₂는 염기성 pH의 조건하의 반응에 대해 자유롭다. PEG를 사용한 단백질 유도체화 분야에서 많은 기법이 단백질에 존재하는 리신 잔기의 엡실론 --NH₂ 부분에 부착될 PEG 유도체의 개발에 관한 것이다. (문헌 ["Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17]). 그러나, 이러한 PEG 유도체들 은 모두 그들이 단백질의 표면 상에 존재하는 아주 많은 리신 잔기들 중에서 일부에만 선택적으로 안착될 수 없다는 공통된 한계를 가진다. 이는 예를 들어, 효소 활성 부위에 존재하는 리신 잔기가 단백질 활성에 중요한 경우, 또는 수용체 결합 부위의 경우와 같이 리신 잔기가 단백질과 다른 생물학적 분자의 상호작용을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 수행하는 경우, 상당한 한계일 수 있다.

단백질 PEG화에 대한 기존 방법들 중 2번째로 똑같이 중요하게 여겨지는 문제점은 PEG 유도체가 원하는 잔기들 외의 잔기와 원치 않는 부반응을 할 수 있다는 점이다. 히스티딘은 구조적으로 --N(H)--로 표시되는 반응성 이미노 부분을 함유하지만, 엡실론 --NH₂와 반응하는 많은 화학적 반응성 종 또한 --N(H)--와 반응할 수 있다. 유사하게, 아미노산 시스테인의 측쇄는 구조적으로 -SH로 표시되는 유리 설프하이드릴 기를 보유한다. 몇몇 경우에 있어서, 리신의 엡실론 --NH₂ 기에서 유도된 PEG 유도체는 시스테인, 히스티딘 또는 다른 잔기들과도 반응할 수 있다. 이는 PEG 유도체화된 생체활성 분자의 복잡한 비균질 혼합물을 생성시킬 수 있고, 표적이 되는 생체활성 분자의 활성을 파괴할 수 있다. 명확하고 예측가능한 단백질 표면 상의 특정 부위에서 생체활성 분자에 하나 이상의 PEG 중합체를 선택적으로 커플링시킬 수 있는 단백질 내의 단일 부위에 화학적 작용기가 도입될 수 있게 하는 PEG 유도체를 개발하는 것이 바람직할 것이다.

리신 잔기 이외에, 당업계에서 시스테인, 히스티딘 및 N 말단을 비롯한 다른 아미노산 측쇄를 표적화하는 활성화된 PEG 시약의 개발을 위해 상당히 노력하고 있 다. 예로서, 미국 특허 번호 제6,610,281호(본원에서 참고로 인용된다), 및 ["Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17]을 참조한다. 시스테인 잔기는 부위 지정 돌연변이 유발법 및 당업계에 공지된 다른 기법들을 사용하여 단백질의 구조 내로 부위 선택적으로 도입될 수 있고, 생성된 유리 설프하이드릴 부분은 티올 반응성 작용기를 갖는 PEG 유도체와 반응할 수 있다. 그러나, 이러한 접근법은 유리 설프하이드릴 기의 도입이 생성된 단백질의 발현, 폴딩 및 안정성을 복잡하게 할 수 있다는 점에서 문제가 된다. 따라서, 설프하이드릴, 및 전형적으로 단백질에서 발견되는 다른 화학적 작용기들과 상용가능하면서(즉, 원하지 않는 부반응에 참여하지 않으면서) 동시에 하나 이상의 PEG 중합체를 단백질에 선택적으로 커플링시킬 수 있는 생체활성 분자 내로 화학적 작용기를 도입하는 수단을 가지는 것이 바람직하다.

당업계의 샘플링으로부터 알 수 있는 바와 같이, 단백질의 측쇄, 특히 리신 아미노산 측쇄 상의 --NH₂ 부분 및 시스테인 측쇄 상의 -SH 부분에 부착시키기 위해 개발된 이들 유도체들의 대다수는 이들의 합성 및 사용에 있어서 문제점이 있는 것으로 입증되었다. 일부는 예를 들면, 혈류와 같은 수성 환경에서 가수분해되어 분해되거나, 질이 저하되거나, 아니면 불안정화된 단백질과의 불안정한 결합을 형성한다. 일부는 보다 안정한 결합을 형성하나, 결합이 형성되기 전에 가수분해되는데, 이는 PEG 유도체 상의 반응기가 단백질이 부착될 수 있기 전에 불활성화될 수 있다는 것을 의미한다. 일부는 다소 독성을 나타내므로 생채내에서 사용하기에 덜 적합하다. 일부는 실용적으로 유용하기에는 너무 느리게 반응한다. 일부는 단백질의 활성을 책임지는 부위에 부착함으로써 단백질의 활성을 상실시킨다. 일부는 이들이 부착될 부위에 대해 특이적이지 않기 때문에 원하는 활성을 상실할 수도 있고 결과의 재현가능성도 없다. 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 사용한 단백질의 변형과 관련된 문제점을 극복하기 위해, 보다 안정하거나(예를 들어, 미국 특허 제6,602,498호(본원에서 참고로 인용된다)), 분자 상의 티올 잔기 또는 표면과 선택적으로 반응하는 PEG 유도체가 개발되었다(예를 들어, 미국 특허 제6,610,281호(본원에서 참고로 인용된다)). 안정한 화학 결합을 형성하도록 선택적으로 반응될 것이 요구될 때까지 생리적 환경에서 화학적으로 불활성을 나타내는 PEG 유도체가 당업계에서 명백히 필요하다.

최근, 단백질의 부위 특이적 변형과 관련된 다수의 한계를 극복할 것이라고 기대되는 완전히 새로운 기술이 단백질 과학에서 보고된 바 있다. 구체적으로, 생체내에서 비유전적으로 코딩된 아미노산을 단백질 내로 도입할 수 있는, 원핵생물 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)(E. 콜라이(E. coli))(예를 들면, 문헌 [L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500]) 및 진핵생물 사카로마이세스 세레비지애(Sacchromyces cerevisiae)(S. 세레비지애(S. cerevisiae))(예를 들면, 문헌 [J. Chin et al., Science 301:964-7(2003)])의 단백질 생합성 기구에 새로운 성분들을 첨가한다. 광친화성 표지 및 광이성질체화가능한 아미노산, 광가교결합 아미노산(예를 들면, 문헌 ([Chin, J. W., et al. (2002) Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 99:11020-11024]; 및 [Chin, J. W., et al., (2002) J. Am . Chem . Soc. 124:9026-9027]) 참조), 케토 아미노산, 중원자를 함유하는 아미노산 및 글리코실화된 아미노산을 비롯한 신규의 화학적, 물리적 또는 생물학적 특성 가진 다수의 새로운 아미노산이 이러한 방법에 의해 앰버 코돈인 TAG에 대한 반응으로 E. 콜라이 및 효모에서 단백질 내로 효율적이고 신뢰도 높은 방식으로 도입되었다. 예를 들면, 문헌 ([J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027]; [J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11):1135-1137]; [J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024]; 및 [L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem . Comm ., 1:1-11])을 참조한다(상기 참고 문헌 모두의 전문이 참고로 인용된다). 이 연구들은 단백질에서 발견되지 않으며, 유전적으로 코딩된 20종의 일반 아미노산에서 발견된 모든 작용기에 대해 화학적으로 불활성이고, 효율적으로 그리고 선택적으로 반응하여 안정한 공유 결합을 형성하는데 사용될 수 있는 화학적 작용기, 예를 들면, 케톤 기, 알킨 기 및 아지드 부분을 선택적으로 그리고 통상적으로 도입할 수 있다는 것을 입증하였다.

비유전적으로 코딩된 아미노산을 단백질 내로 도입할 수 있는 능력을 통해 천연적으로 발생된 작용기, 예를 들면, 리신의 엡실론-NH₂, 시스테인의 설프하이드릴-SH, 히스티딘의 이미노 기 등에 대한 귀중한 대안을 제공할 수 있는 화학적 작용기를 도입할 수 있다. 일부 화학적 작용기는 유전적으로 코딩된 20종의 일반 아 미노산에서 발견된 작용기에 대해 불활성을 나타내지만, 명백히 효율적으로 반응하여 안정한 결합을 형성하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들면, 아지드 및 아세틸렌 기는 촉매량의 구리의 존재하의 수성 조건에서 휘스겐(Huisgen) [3+2] 사이클로첨가 반응을 하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 ([Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem . 67:3057-3064]; 및 [Rostovtsev, et al., (2002) Angew . Chem. Int . Ed . 41:2596-2599])를 참조한다. 예를 들어, 당업자는 아지드 부분을 단백질 구조 내로 도입함으로써 단백질에서 발견된 아민, 설프하이드릴, 카르복실산, 하이드록실 기에 대해 화학적으로 불활성이지만, 아세틸렌 부분과 원활히 효율적으로 반응하여 사이클로첨가 생성물을 형성하는 작용기를 도입할 수 있다. 중요하게는, 아세틸렌 부분의 부재하에서 아지드는 다른 단백질 측쇄의 존재 및 생리학적 조건하에서 화학적으로 불활성이며 반응되지 않은 상태로 남아있다.

본 발명은 특히 IFN 베타 폴리펩티드의 활성 및 제조와 관련된 문제점을 다루고, 생물학적 또는 약리학적 특성이 개선된, 예를 들면, 항바이러스성 활성이 증강되고/거나, 치료학적 반감기가 개선된 IFN 베타 폴리펩티드의 제조 또한 다룬다.

본 발명의 요약

본 발명은 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 제공한다.

몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자에 연결되어 있다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 이작용성 중합체, 이작용성 링커, 또는 적어도 하나의 추가 IFN 베타 폴리펩티드에 연결되어 있다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 IFN 베타의 C17S 돌연변이체 형태에 대한 하나 이상의 번역 후 변형을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 링커를 통해 수용성 중합체에 연결되어 있거나, 수용성 중합체에 결합되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 이작용성 중합체이다. 몇몇 실시태양에서, 이작용성 중합체는 제2 폴리펩티드에 연결되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 제2 폴리펩티드는 IFN 베타 폴리펩티드이다. 본 발명은 또한 IFN 내의 C17S 돌연변이 이외에도 상기 실시태양들 각각을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 수용성 중합체에 연결된 적어도 2개의 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 하나의 아미노산은 비천연적으로 코딩된 아미노산이다. 몇몇 실시태양에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 수용성 중합체에 연결된 적어도 2개의 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드는 C17S 돌연변이를 포함하고, 다른 실시태양에서는, IFN 베타 폴리펩티드 내의 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 이외에 17번 위치에서의 임의의 돌연변이가 포함된다.

몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN 내의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 위치 1 앞(즉, N 말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167(즉, 단백질의 카르복실 말단에서), 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산). 몇몇 실시태양에서, 이러한 도입들 중 하나는 17번 위치에서 발생한다.

몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다음과 같은 인터페론 베타 내의 2차 구조에 상응하는 하기 영역들 중 하나 이상의 영역 내의 임의의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산으로부터 나선 A(2-22); 나선 B(51-71); 나선 C(80-107); 나선 D(118-136); 나선 E(139-162); AB 루프: AB1(23-35); AB2(36-40); AB3(41-50). 다른 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인터페론 베타(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4로부터의 상응하는 아미노산)의 잔기 25-35, 80-100, 및 121-135로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환된다. 다른 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4로부터의 상응하는 아미노산으로부터의 인터페론 베타로부터 잔기 41-49로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환된다. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN 베타의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산). 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN 베타의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 및 그의 임의 조합. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN 베타의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155, 및 그의 임의 조합. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN 베타의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 15, 42, 80, 108, 111, 155, 및 그의 임의 조합. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN 베타의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 36, 111. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 천연 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 C17S 치환(17번 위치에서 시스테인에서 세린으로의 치환)을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 C17S 치환(17번 위치에서 시스테인에서 세린으로의 치환) 및 하나 이상의 천연 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 신호 서열 중에 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 4의 신호 서열 중에 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 4의 신호 서열 중 하나 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산은 서열번호 4의 리더 또는 신호 서열 중에, 또는 다른 IFN 베타 서열 중에 도입된다. 본 발명은 또한 IFN 베타 내의 C17S 돌연변이 이외에도 상기 실시태양들 각각을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기 위치를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 위치들 중 하나 이상의 위치에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 위치 1 앞(즉, N 말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167(즉, 단백질의 카르복실 말단에서), 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산, 또는 또다른 IFN 베타 서열에서의 상응하는 아미노산).

몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 영역들 중 하나 이상의 영역에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산으로부터 나선 A(2-22); 나선 B(51-71); 나선 C(80-107); 나선 D(118-136); 나선 E(139-162); AB 루프: AB1(23-35); AB2(36-40); AB3(41-50). 다른 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 영역들 중 하나 이상의 영역에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 인터페론 베타(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4로부터의 상응하는 아미노산)의 잔기 25-35, 80-100, 및 121-135. 다른 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 영역들 중 하나 이상의 영역에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4로부터의 상응하는 아미노산으로부터 인터페론 베타으로부터의 잔기 41-49. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기 위치를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 위치들 중 하나 이상의 위치에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산). 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기 위치를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 위치들 중 하나 이상의 위치에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 및 그의 임의 조합. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기 위치를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 위치들 중 하나 이상의 위치에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155, 및 그의 임의 조합. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기 위치를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 위치들 중 하나 이상의 위치에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 15, 42, 80, 108, 111, 155, 및 그의 임의 조합. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기 위치를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 위치들 중 하나 이상의 위치에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 36, 111. 몇몇 실시태양에서, 신호 또는 리더 서열 중 비천연적으로 발생된 아미노산은 수용성 중합체에 연결되어 있다(서열번호 4 또는 다른 IFN 베타 서열). 본 발명은 또한 IFN 베타 내의 C17S 돌연변이 이외에도 상기 실시태양들 각각을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 단백질, 폴리펩티드, 소분자, 또는 핵산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 IFN 폴리펩티드 또는 결합 파트너에 대한 IFN 베타 폴리펩티드의 친화도를 조정하는 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하지 않는 상응하는 IFN 베타의 안정성과 비교하였을 때, IFN 베타 폴리펩티드의 안정성을 증가시키는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 안정성 및/또는 가용성은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 다수의 상이한 분석법을 사용함으로써 측정될 수 있다. 예를 들면, 분석법으로는 SE-HPLC 및 RP-HPLC를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하지 않는 상응하는 IFN 베타의 면역원성과 비교하였을 때, IFN 베타 폴리펩티드의 면역원성을 조정하는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하지 않는 상응하는 IFN 베타의 혈청 반감기 또는 순환 시간과 비교하였을 때, IFN 베타 폴리펩티드의 혈청 반감기 또는 순환 시간을 조정하는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하지 않는 상응하는 IFN 베타의 수용성과 비교하였을 때, IFN 베타 폴리펩티드의 수용성을 증가시키는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하지 않는 상응하는 IFN 베타의 가용성과 비교하였을 때, 숙주 세포에서 생산된 IFN 베타 폴리펩티드의 가용성을 증가시키는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하지 않는 상응하는 IFN 베타의 발현 또는 합성과 비교하였을 때, 숙주 세포에서의 IFN 베타 폴리펩티드의 발현을 증가시키거나, 시험관내 합성을 증가시키는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 이러한 치환을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드는 효현제 활성을 보유할 수 있고, 숙주 세포에서의 발현 수준을 보유 또는 개선시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하지 않는 상응하는 IFN 베타의 프로테아제 내성과 비교하였을 때, IFN 베타 폴리펩티드의 프로테아제 내성을 증가시키는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하지 않는 상응하는 IFN 베타와의 상호작용시에 IFN 수용체의 신호 전달 활성과 비교하였을 때, 상기 IFN 수용체의 신호 전달 활성을 조정하는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하지 않는 상응하는 IFN 베타 폴리펩티드의 결합과 비교하였을 때, IFN 베타 폴리펩티드가 또다른 분자, 예를 들면, 수용체에 결합하는 것을 조정하는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하지 않는 상응하는 IFN 베타 폴리펩티드의 항바이러스성 활성과 비교하여, 그의 항바이러스성 활성을 조정하는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하지 않는 상응하는 IFN 베타 폴리펩티드의 항바이러스성 활성과 비교하여 그의 항바이러스성 활성을 증강시키는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하지 않는 상응하는 IFN 베타의 적합성과 비교하였을 때, IFN 베타 폴리펩티드의 약제학적 방부제(예로서, m-크레졸, 페놀, 벤질 알코올)와의 적합성을 증기시키는 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 이와 같은 적합성의 증가를 통해 저장하는 동안 단백질의 물리화학적 특성과 생물학적 활성을 갖는 보존 약제학적 제제를 제조할 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 공학처리된 결합은 하나 이상의 비-천연 아미노산으로 형성된다. 분자내 결합은 적합한 조건하의 단백질내 2개의 아미노산 사이의 반응(하나 또는 둘 모두의 아미노산은 비-천연 아미노산일 수 있다); 적합한 조건하의 2개의 아미노산(이들 각각은 천연적으로 코딩된 것이거나, 비천연적으로 코딩된 것일 수 있다)과 링커, 중합체, 또는 다른 분자와의 반응 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 방법으로 형성될 수 있다.

몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드 중의 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 천연적으로 발생된 아미노산 또는 비천연적으로 발생된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드 중의 아미노산 치환은 천연적으로 발생된 아미노산 또는 비천연적으로 발생된 아미노산으로 이루어질 수 있는데, 단, 적어도 하나의 치환은 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 이루어진다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드 중의 하나 이상의 아미노산 치환은 하나 이상의 천연적으로 발생된 아미노산으로 이루어질 수 있고, 추가로, 적어도 하나의 치환은 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 이루어진다.

몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기, 아세틸 기, 아미노옥시 기, 히드라진 기, 히드라지드 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기, 또는 알킨 기를 포함한다.

몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 하기 화학식을 갖는다:

상기 식에서, n은 0-10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이고; R₂는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 및 치환된 아릴이고; R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이며, R₄는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다.

몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 아미노옥시 기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 히드라지드 기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 히드라진 기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 세미카르바지드 기를 포함한다.

몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 아지드 기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 하기 화학식을 갖는다:

상기 식에서, n은 0-10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고; m은 0-10이고; R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다.

몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 알킨 기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 하기 화학식을 갖는다:

상기 식에서, n은 0-10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고; m은 0-10이며, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다.

몇몇 실시태양에서, 폴리펩티드는 IFN 베타 폴리펩티드 효현제, 부분적인 효현제, 길항제, 부분적인 길항제, 또는 역 효현제이다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드 효현제, 부분적인 효현제, 길항제, 부분적인 길항제, 또는 역 효현제는 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드 효현제, 부분적인 효현제, 길항제, 부분적인 길항제, 또는 역 효현제는 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 하나 이상의 번역 후 변형, 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자를 포함한다.

본 발명은 또한 엄격한 조건하에서 서열번호 2에, 또는 서열번호 3, 4의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 엄격한 조건하에서 서열번호 2에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 엄격한 조건하에서 서열번호 3, 4로 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산을 제공하는데, 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함한다. 본 발명은 또한 서열번호: 1, 3, 4로 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하며, 서열번호: 1, 3, 4로 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 다수의 상이한 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 임의의 폴리펩티드를 코딩할 수 있다는 것을 당업계의 숙련인은 명백히 이해할 것이다.

몇몇 실시태양에서, 셀렉터 코돈은 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특이 코돈, 희귀 코돈, 5 염기 코돈, 및 4 염기 코돈으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 수용성 중합체에 연결된 IFN 베타 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 단리된 IFN 베타 폴리펩티드를, 비천연적으로 코딩된 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 수용성 중합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드 내로 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산 중 임의의 아미노산에 대해 별다른 반응성을 나타내지 않는 수용성 중합체에 대해 반응성을 나타낸다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드 내로 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산 중 임의의 아미노산에 대해 별다른 반응성을 나타내지 않는 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자에 대해 반응성을 나타낸다.

몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체에 연결된 IFN 베타 폴리펩티드는 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조한다. 몇몇 실시태양에서, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기는 카바메이트 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결되어 있다.

몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체에 연결된 IFN 베타 폴리펩티드는 카르보닐 기를 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드와 반응시킴으로써 제조한다.

몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체에 연결된 IFN 베타 폴리펩티드는 알킨 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를, 아지드 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조한다. 몇몇 실시태양에서, 아지드 또는 알킨 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결되어 있다.

몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체에 연결된 IFN 베타 폴리펩티드는 아지드 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를, 알킨 부분을 포함하는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자와 반응시킴으로써 제조한다. 몇몇 실시태양에서, 아지드 또는 알킨 기는 아미드 결합을 통해 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결되어 있다.

몇몇 실시태양에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자의 분자량은 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa이다. 몇몇 실시태양에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자의 분자량은 0.1 kDa 내지 50 kDa이다.

몇몇 실시태양에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형 중합체이다. 몇몇 실시태양에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분지형 중합체의 분지 각각의 분자량은 1 kDa 내지 100 kDa, 또는 1 kDa 내지 50 kDa이다.

몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드에 연결된 수용성 중합체는 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드 내로 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라지드 기, 히드라진, 세미카르바지드 기, 아지드 기, 또는 알킨 기를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드 내로 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 카르보닐 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 아미노옥시, 히드라지드, 히드라진, 또는 세미카르바지드 부분을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드 내로 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 알킨 부분을 포함하고, 수용성 중합체는 아지드 부분을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드 내로 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기는 아지드 부분을 포함하고 수용성 중합체는 알킨 부분을 포함한다.

본 발명은 또한 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결되어 있다.

본 발명은 또한 IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하며, 셀렉터 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 세포는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 IFN 베타 폴리펩티드 내로 치환시키기 위한 오르토고날 RNA 합성효소 및/또는 오르토고날 tRNA를 포함한다.

본 발명은 또한 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들, 오르토고날 RNA 합성효소 및/또는 오르토고날 tRNA를 포함하는 세포를 상기 IFN 베타 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계; 및 상기 세포 및/또는 배양 배지로부터 IFN 베타 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 IFN 베타 폴리펩티드의 치료학적 반감기, 혈청 반감기 또는 순환 시간을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 IFN 베타 폴리펩티드의 면역원성을 조정하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법들은 천연적으로 발생된 IFN 베타 폴리펩티드 중의 임의의 하나 이상의 아미노산을 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시키는 단계, 및/또는 IFN 베타 폴리펩티드를 링커, 중합체, 수용성 중합체, 또는 생물학적 활성 분자에 연결시키는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 유효량의 본 발명의 IFN 베타 분자를 사용하여 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 치료학적 유효량으로 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결되어 있다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 글리코실화된 것이다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 글리코실화되지 않은 것이다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 아미노산이 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 점을 제외하고, 서열번호 1, 3, 4에 나타낸 서열 또는 임의의 다른 IFN 베타 폴리펩티드 서열을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 서열번호 1, 3, 4에 나타낸 서열을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라지드 기, 히드라진 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기, 또는 알킨 기를 포함한다.

본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체, 및 서열번호 1, 3, 4에 나타낸 서열 또는 임의의 다른 IFN 베타 폴리펩티드 서열을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는데, 여기서, 적어도 하나의 아미노산이 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다. 본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체, 및 서열번호 1, 3, 4에 나타낸 서열을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 당류 부분을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체는 당류 부분을 통해 폴리펩티드에 연결되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자는 당류 부분을 통해 IFN 베타 폴리펩티드에 연결되어 있다.

본 발명은 또한 단일 아미노산에서 공유 결합에 의해 IFN 베타 폴리펩티드에 연결된 수용성 중합체를 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체에 공유적으로 연결된 아미노산은 폴리펩티드에 존재하는 비천연적으로 코딩된 아미노산이다.

본 발명은 적어도 하나의 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서, 상기 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자는 리보좀에 의해 폴리펩티드 내로 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산의 작용기를 통해 폴리펩티드에 부착된다. 몇몇 실시태양에서, 폴리펩티드는 단일 PEG화되어 있다. 본 발명은 또한 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착된 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서, 상기 비천연적으로 코딩된 아미노산은 리보좀에 의해 미리 선택된 부위에서 폴리펩티드 내로 도입된다.

IFN 베타 코딩 영역에 결합된 IFN 베타 리더 또는 신호 서열 뿐만 아니라, IFN 베타 코딩 영역에 결합된 이종 신호 서열도 본 발명의 범주 내에 포함된다. 선택된 이종 리더 또는 신호 서열은 숙주 세포에 의해, 예를 들면, 분비하는 숙주 세포 분비 시스템에 의해 인식되고, 프로세싱되고, 가능하게는 신호 펩티다제에 의해 절단되는 것이어야 한다. 본 발명의 IFN 베타를 사용하여 병증 또는 질병을 치료하는 방법은 신호 또는 리더 펩티드를 포함하거나 포함하지 않는 IFN 베타를 사용하여 치료하는 것을 포함한다는 의미이다.

본 발명은 또한 항바이러스성 활성의 증가를 유도하는데 유효한 양으로 IFN 베타를 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 세포에서 항바이러스성 활성의 증가를 유도하는 방법을 제공한다.

또다른 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드와, PEG를 포함하나, 이에 한정되지 않는 또다른 분자의 접합은 비-천연 아미노산과의 접합에 사용되는 독특한 화학 반응으로 인해 실질적으로 정제된 IFN 베타를 제공한다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는IFN 베타와 또다른 분자, 예를 들면, PEG의 접합은 접합 단계 전에 또는 후에 수행되는 다른 정제 기법과 함께 수행하여 실질적으로 순수한 IFN 베타를 제공할 수 있다.

도 1 - IFN 베타의 결정 구조 모델을 나타낸 것이다. 표시된 각 부위들은 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환되었다.

도 2 - IFN 베타의 결정 구조 모델을 나타낸 것이다. 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환되는 선택 부위를 나타낸 것이다.

도 3 - 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 발현에 관한 SDS PAGE 분석을 나타낸 것이다.

도 4 - 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 발현에 관한 SDS PAGE 분석을 나타낸 것이다.

도 5 - PEG화 이전 및 이후의, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드를 나타낸 것이다.

도 6A - 시간 경과(시간)에 따라 측정된 혈청 IFN 베타 농도(ng/mL)를 나타내는, 실시예 27의 투여 수준이 3 ㎍/kg인 투여군으로부터 얻은 약동학적 데이타의 그래프.

도 6B - 시간 경과(시간)에 따라 측정된 혈청 IFN 베타 농도(ng/mL)를 나타내는, 실시예 27의 투여 수준이 15 ㎍/kg인 투여군으로부터 얻은 약동학적 데이타의 그래프.

도 7A - 시간 경과(시간)에 따라 측정된 혈청 IFN 베타 농도(ng/mL)를 나타내는, 실시예 27의 투여 수준이 50 ㎍/kg인 투여군으로부터 얻은 약동학적 데이타의 그래프.

도 7B - 시간 경과(시간)에 따라 측정된 혈청 IFN 베타 농도(ng/mL)를 나타내는, 실시예 27의 M36-30K로 처리된 동물 및 레비프 대조군으로부터 얻은 약동학적 데이타의 그래프.

도 8A - 시간 경과(시간)에 따라 측정된 혈청 IFN 베타 농도(ng/mL)를 나타내는, 실시예 27의 M36-40K로 처리된 동물 및 레비프 대조군으로부터 얻은 약동학적 데이타의 그래프.

도 8B - 시간 경과(시간)에 따라 측정된 혈청 IFN 베타 농도(ng/mL)를 나타내는, 실시예 27의 F111-30K로 처리된 동물 및 레비프 대조군으로부터 얻은 약동학적 데이타의 그래프.

도 9A - 시간 경과(시간)에 따라 측정된 혈청 IFN 베타 농도(ng/mL)를 나타내는, 실시예 27의 F111-40K로 처리된 동물 및 레비프 대조군으로부터 얻은 약동학적 데이타의 그래프.

도 9B - 대조군과 비교되는 본 발명의 몇몇 IFN 베타 변이체의 Cmax를 나타내는, 실시예 27로부터 얻은 데이타의 그래프(혈청 IFN 베타 Cmax/투여량).

도 10A - 대조군과 비교되는 본 발명의 몇몇 IFN 베타 변이체의 AUC를 나타내는, 실시예 27로부터 얻은 곡선하 면적(AUC: area under the curve) 데이타의 그래프(혈청 IFN AUC/투여량).

도 10B - 투여량 수준을 달리하는, 상이한 본 발명의 IFN 베타 변이체 2개, 및 대조군을 투여한 후 168시간째의 혈청 IFN 베타 농도를 나타내는, 실시예 27로부터 얻은 데이타의 막대 그래프.

도 11A - 위약 및 대조군과 비교되는, 3 ㎍/kg 투여군에서 본 발명의 몇몇 IFN 베타 변이체의 네오프테린 반응을 나타내는, 실시예 27로부터 얻은 데이타의 그래프(혈청 네오프테린(Neopterin)/시간).

도 11B - 위약 및 대조군과 비교되는, 15 ㎍/kg 투여군에서 본 발명의 몇몇 IFN 베타 변이체의 네오프테린 반응을 나타내는, 실시예 27로부터 얻은 데이타의 그래프(혈청 네오프테린/시간).

도 12A - 위약 및 대조군과 비교되는, 50 ㎍/kg 투여군에서 본 발명의 몇몇 IFN 베타 변이체의 네오프테린 반응을 나타내는, 실시예 27로부터 얻은 데이타의 그래프(혈청 네오프테린/시간).

도 12B - 위약 및 대조군과 비교되는, 본 발명의 몇몇 IFN 베타 변이체의 혈청 네오프테린 측정치 대 투여량 측정치에 관한 곡선하 면적을 나타내는, 실시예 27로부터 얻은 데이타의 그래프(혈청 네오프테린 AUC/투여량).

도 13A - 실시예 27로부터 얻은 혈청 네오프테린 수준 데이타는 위약, 대조군, 3개의 투여량으로 투여량 수준을 달리하는 M36-30K를 투여한 후 168시간째의 것을 나타낸다.

도 13B - 실시예 27로부터 얻은 혈청 네오프테린 수준 데이타는 위약, 대조군, 3개의 투여량으로 투여량 수준을 달리하는 M36-40K를 투여한 후 168시간째의 것을 나타낸다.

도 13C - 실시예 27로부터 얻은 혈청 네오프테린 수준 데이타는 위약, 대조군, 3개의 투여량으로 투여량 수준을 달리하는 F111-30K를 투여한 후 168시간째의 것을 나타낸다.

도 13D - 실시예 27로부터 얻은 혈청 네오프테린 수준 데이타는 위약, 대조군, 3개의 투여량으로 투여량 수준을 달리하는 F111-40K를 투여한 후 168시간째의 것을 나타낸다.

도 14 - 실시예 27에 개시된 프로토콜로부터 얻은 레비프 및 BLA로부터 얻은 레비프의 네오프테린 AUC/투여량을 나타내는 그래프.

도 15A - 레서스 원숭이에서 정맥 투여 이후의 항바이러스성 활성으로 측정되는 혈청 IFN 베타 a1(그래프 상에서 닫힌 기호 및 실선) 및 네오프테린 농도(그래프 상에서 열린 기호 및 점선)를 나타내는 그래프.

도 15B - 레서스 원숭이에서 피하 투여 이후의 항바이러스성 활성으로 측정되는 혈청 IFN 베타 a1(그래프 상에서 닫힌 기호 및 실선) 및 네오프테린 농도(그래프 상에서 열린 기호 및 점선)를 나타내는 그래프.

도 15C - EMC 바이러스로 시험감염된 인간 폐 암종(A549) 세포를 사용한 항바이러스성 분석에서 평가된 비변형된 IFN 베타 1a 및 페길화된 IFN 베타 1a의 항바이러스성 활성을 나타내는 그래프. 바이러스와 함께 2일간 인큐베이션시킨 후, 생존 세포를 XTT로 염색하고, 플레이트를 450 nm에서 판독하고, 세포의 생존능을 반영하는 흡광도를 y축에 나타내었다. 샘플을 2중으로 분석하였다.

도 16A - 시간에 따른, 비히클, 레비프, 및 투여량 수준이 3 ㎍/kg인 상이한 본 발명의 IFN 베타 변이체 4개의 OAS1 유전자 발현에 관한 유도 배수(투여 전과의 비교)를 나타내는, 실시예 27로부터 얻은 데이타의 그래프.

도 16B - 시간에 따른, 레비프, 및 3개의 투여량으로 투여량 수준을 달리하는 본 발명의 IFN 베타 변이체 4개의 평균의 OAS1 유전자 발현에 관한 유도 배수(투여 전과의 비교)를 나타내는, 실시예 27로부터 얻은 데이타의 그래프.

도 17A - 시간에 따른, 비히클, 레비프, 및 투여량 수준이 15 ㎍/kg인 상이한 본 발명의 IFN 베타 변이체 4개의 OAS1 유전자 발현에 관한 유도 배수(투여 전과의 비교)를 나타내는, 실시예 27로부터 얻은 데이타의 그래프.

도 17B - 시간에 따른, 비히클, 레비프, 및 투여량 수준이 50 ㎍/kg인 상이한 본 발명의 IFN 베타 변이체 4개의 OAS1 유전자 발현에 관한 유도 배수(투여 전과의 비교)를 나타내는, 실시예 27로부터 얻은 데이타의 그래프.

도 18 - 비히클, 대조군, 및 상이한 본 발명의 IFN 베타 1a 변이체 4개의 투여량 수준에 따른 OAS1 유전자 발현의 유도 배수에 관한 곡선하 면적을 나타내는, 실시예 27로부터 얻은 데이타의 그래프.

도 19 - 투여량으로 투여한 후 처음 24시간 동안 일어난 주사 부위의 반응을 백분율로 나타낸 막대 그래프.

도 20 - 실시예 27에서 각각의 상이한 처리군에 대해서 수집한 데이타 표. -N. S.는 유의하지 않음을 나타낸다.

도 21 - 실시예 27에서 각각의 상이한 처리군에 대해서 수집한 데이타 표. -N. S.는 유의하지 않음을 나타낸다.

도 22 - 메티오닌 산화에 대한 잠재성을 지닌 부위를 갖는 IFN 베타의 결정 구조 모델을 나타낸 것이다. M36 및 117은 산화되기 쉽고, M1이 좀더 산화되기 쉽 지만, E. 콜라이에서 생산된 경우, M1은 절단되어야 하고(그러나, 완전하게 프로세싱될 수는 없다), M62는 산화되기 어려운 부위이다.

도 23 - 탈아미드화에 대한 잠재성을 지닌 부위를 갖는 IFN 베타의 결정 구조 모델을 나타낸 것이다. M36 및 N25, 둘 모두가 잠재성을 지닌 부위이고-N25는 탈아미드화에 대해 공지되어 있는 부위이다.

도 24 - 실시예 28에서 기술하는 방법을 사용하여 분석된 IFN M36pAF 크로마토그램.

도 25 - 실시예 28에서 기술하는 방법을 사용하여 분석된 PEG40-M36pAF 크로마토그램.

도 26 - 실시예 28에서 기술하는 방법을 사용한, IFN M36pAF 및 PEG40-M36pAF에 관한 중첩 크로마토그램.

도 27 - 실시예 28에서 기술하는 방법을 사용하여 분석된, 디설피드 결합이 환원된 IFN M36pAF.

도 28 - 실시예 28에서 기술하는 방법을 사용하여 분석된, 디설피드 결합이 환원된 PEG40-IFN36pAF.

정의

본 발명은 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 구성체 및 시약에 한정되지 않으며, 변할 수 있다는 점이 이해되어야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 오직 특정 실시태양을 설명하기 위한 것이며, 오직 첨부되는 청구 범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범주를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.

본원 및 청구범위에서 사용된 단수 형태의 표현인 "하나"("a," "an") 및 "그"는 달리 명시하지 않는다면 복수의 표현을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "IFN 베타," "IFNβ," 및 "IFN 베타 폴리펩티드" 및 각종의 하이픈으로 연결된 형태 및 하이픈이 붙지 않은 형태에 대한 언급은 이러한 단백질 하나 이상을 지칭하며, 당업계의 숙련인에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다.

달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련인에게 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본원에 기술된 것들과 유사하거나, 등가인 임의의 방법, 장치 및 물질들을 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용할 수 있지만, 지금부터 바람직한 방법, 장치 및 물질을 기술한다.

본원에서 언급된 모든 공보 및 특허는 예를 들면, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 공보에 기술되는 구성체 및 방법론을 기술하고 개시할 목적으로 본원에서 참고로 인용된다. 본원에서 논의되는 공보는 오직 본 출원의 출원일 전 그들의 개시내용만이 제공된다. 본원 중 어떤 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시내용을 선행하지 않을 권리를 갖는다는 것을 용인하는 것으로서 해석되어서는 안 될 것이다.

"실질적으로 정제된"이란 용어는 그의 천연적으로 발생된 환경, 즉, 본래의 세포, 또는 재조합으로 생산된 IFN 베타 폴리펩티드의 경우, 숙주 세포에서 발견되는 단백질을 보통 수반하거나, 그와 상호작용하는 성분을 실질적으로 또는 본질적으로 함유하지 않을 수 있는 IFN 베타 폴리펩티드를 지칭한다. 실질적으로 세포 물 질을 함유하지 않을 수 있는 IFN 베타 폴리펩티드는 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만(건조 중량 기준)의 오염 단백질을 갖는 단백질로 된 제제를 포함한다. IFN 베타 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합으로 생산되는 경우, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 이하로 존재할 수 있다. IFN 베타 폴리펩티드 또는 그의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합으로 생산되는 경우, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 5 g/L, 약 4 g/L, 약 3 g/L, 약 2 g/L, 약 1 g/L, 약 750 mg/L, 약 500 mg/L, 약 250 mg/L, 약 100 mg/L, 약 50 mg/L, 약 10 mg/L, 또는 약 1 mg/L 이하로 배양 배지 중에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 "실질적으로 정제된" IFN 베타 폴리펩티드는 적절한 방법, 예를 들면, SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC, 및 모세관 전기영동에 의해 측정된 바와 같이, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%의 순도 수준, 특히 적어도 약 75%, 80%, 85%의 순도 수준, 더욱 특히 적어도 약 90%의 순도 수준, 적어도 약 95%의 순도 수준, 적어도 약 99% 이상의 순도 수준을 가질 수 있다.

"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는 삽입에 사용되는 방법, 예를 들면, 직접 흡수, 형질도입, f-교배, 또는 당업계에 알려져 있는 다른 재조합 숙주 세포 생성 방법에 상관없이 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 지칭한다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 비통합 벡터, 예를 들면, 플라스미드로서 보유될 수 있거 나, 별법으로, 숙주 게놈으로 통합될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "배지" 또는 "배지들"은 세균 숙주 세포, 효모 숙주 세포, 곤충 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진핵 숙주 세포, 포유동물 숙주 세포, CHO 세포, 원핵 숙주 세포, E. 콜라이, 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 숙주 세포, 및 세포 함유물을 비롯한 임의의 숙주 세포를 지지하거나 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함한다. 따라서, 상기 용어는 숙주 세포가 성장하는 배지, 예를 들면, 증식 단계 전후의 배지를 비롯한 IFN 베타 폴리펩티드가 분비되는 배지를 포함할 수 있다. 또한, 상기 용어는 예를 들면, IFN 베타 폴리펩티드가 세포내에서 생산되고, 숙주 세포가 용해되거나, 붕괴되어 IFN 베타 폴리펩티드를 방출하는 경우, 숙주 세포 용해물을 함유하는 완충액 또는 시약을 포함할 수 있다.

본원에서 단백질 리폴딩과 관련하여 사용된 "환원제"란 환원된 상태에서 설프하이드릴기를 보유시키고, 세포내 또는 세포간의 디설피드 결합을 감소시키는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 적합한 환원제로는 디티오트레이톨(DTT: dithiothreitol), 2-머캅토에탄올, 디티오에리트리톨, 시스테인, 시스테아민(2-아미노에탄티올) 및 환원된 글루타티온을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 매우 다양한 환원제가 본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기에 적합하다는 점이 당업계의 숙련인에게는 명백히 이해될 것이다.

본원에서 단백질 리폴딩과 관련하여 사용된 "산화제"란 산화되는 화합물로부터 전자를 제거할 수 있는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 적합한 산화제로 는 산화된 글루타티온, 시스틴, 시스타민, 산화된 디티오트레이톨, 산화된 에리트레이톨 및 산소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 매우 다양한 산화제가 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다는 점이 당업계의 숙련인에게는 명백히 이해될 것이다.

본원에서 사용된 "변성 제제" 또는 "변성제"는 단백질의 가역적 언폴딩을 일으키는 임의의 화합물 또는 물질로 정의된다. 변성 제제 또는 변성제의 강도는 특정 변성 제제 또는 변성제의 특성 및 농도, 둘 모두에 의해 결정된다. 적합한 변성 제제 또는 변성제로는 카오트로프, 계면활성제, 유기 용매, 수용성 용매, 인지질, 또는 2개 이상의 상기 제제의 조합물일 수 있다. 적합한 카오트로프는 우레아, 구아니딘 및 나트륨 티오시아네이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 유용한 계면활성제로는 강한 계면활성제, 예를 들면, 황산나트륨 도데실, 또는 폴리옥시에틸렌 에테르(예를 들면, 트윈(Tween) 또는 트리톤 계면활성제), 사르코실(Sarkosyl), 온화한 비이온성 계면활성제(예를 들면, 디지토닌), 온화한 양이온성 계면활성제, 예를 들면, N→2,3-(디올레이옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸암모늄, 온화한 이온성 계면활성제(예를 들면, 나트륨 콜레이트 또는 나트륨 데옥시콜레이트), 또는 설포베타인(쯔비터젠트(Zwittergent)), 3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-1-프로판 설페이트(CHAPS), 및 3-(3-클로라미도프로필)디메틸암모니오-2-하이드록시-1-프로판 설포네이트(CHAPSO)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 쯔비터이온성 계면활성제를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 유기 수용성 용매, 예를 들면, 아세 토니트릴, 저급 알카놀(특히, C₂-C₄ 알카놀, 예를 들면, 에탄올 또는 이소프로판올), 또는 저급 알칸디올(특히, C₂-C₄ 알칸디올, 예를 들면, 에틸렌-글리콜)은 변성제로서 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 인지질은 천연적으로 발생된 인지질, 예를 들면, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린 및 포스파티딜이노시톨 또는 합성 인지질 유도체 또는 변이체, 예를 들면, 디헥사노일포스파티딜콜린 또는 디헵타노일포스파티딜콜린일 수 있다.

본 명세서에 사용된 "리폴딩"은 디설피드 결합 함유 폴리펩티드가 디설피드 결합에 대해 부적합하게 폴딩된 또는 언폴딩된 상태로부터 본래의 또는 적합하게 폴딩된 형태로 형질전환되는 임의의 공정, 반응 또는 방법을 기술한다.

본 명세서에 사용된 "코폴딩"은 구체적으로 서로 상호작용하는 적어도 2개의 폴리펩티드를 사용하여 언폴딩된 또는 부적합하게 폴딩된 폴리펩티드를 본래의 적합하게 폴딩된 폴리펩티드로 형질전환시키는 리폴딩 공정, 반응 또는 방법을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 "IFN 베타 폴리펩티드," "IFN 베타" 또는 "IFNβ" 및 그의 하이픈으로 연결된 형태 및 하이픈이 붙지 않은 형태는 IFN 베타의 적어도 하나의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 및 단백질 뿐만 아니라, 그의 생물학적 활성과는 상관없이, 그리고, 추가로는 핵산 분자 미세주입, 합성, 트랜스제닉, 및 유전자 활성화 방법에 의한 시험관내, 생체내의 재조합(cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 핵산의 다른 형태로부터 생산되든)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 그의 합성 또 는 제조 방법과는 상관없이, 그의 1a 및 1b 형태, 및 b 형태, IFN 베타 유사체, IFN 베타 이소형, IFN 베타 모사체, IFN 베타 단편, 하이브리드 IFN 베타 단백질, 융합 단백질, 올리고머 및 다량체, 그의 동족체, 글리코실화 패턴 변이체, 변이체, 스플라이스 변이체, 및 뮤테인을 포함하여야 한다. 용어 "IFN 베타 폴리펩티드," "IFNβ," 및 "IFN 베타"는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 포함한다.

본원에서 사용된 "인터페론" 또는 "IFN"은 IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNω, IFNε, 또는 IFNτ 또는 인터페론 유사 사이토카인, 예를 들면, 리미틴(예를 들면, 미국 특허 4,414,150; 4,456,748; 4,727,138; 4,762,791, 4,929,554; 5,096,705; 4,695,623; 4,614,651; 4,678,751; 4,925,793; 5,460,811; 5,120,832; 4,780,530; 4,908,432; 4,970,161 ; 4,973,479; 4,975,276; 5,098,703; 5,278,286; 5,661,009; 6,372,206; 6,433,144; 6,472,512; 6,572,853; 6,703,225; 6,200,780; 6,299,869; 6,300,475; 6,323,006; 6,350,589; 5,705,363; 5,738,845; 5,789,551; 6,117,423; 6,174,996; 5,540,923; 5,541,293; 5,541,312; 5,554,513; 5,593,667(본원에서 참고로 인용된다)에 기술되어 있는 것)을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 인터페론의 적어도 하나의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드 및 단백질 뿐만 아니라, 그의 생물학적 활성과는 상관없이, 그리고, 추가로는 핵산 분자 미세주입, 합성, 트랜스제닉, 및 유전자 활성화 방법에 의한 시험관내, 생체내의 재조합(cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 핵산의 다른 형태로부터 생산되든)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 그의 합성 또는 제조 방법과는 상관없이, 그의 IFN 유사체, IFN 이소형, IFN 모사 체, IFN 단편, 하이브리드 IFN 단백질, 융합 단백질, 올리고머 및 다량체, 동족체, 글리코실화 패턴 변이체, 변이체, 스플라이스 변이체, 및 뮤테인을 포함하여야 한다. IFN의 구체적인 예로는 IFNγ-1b(Actimmune^®), IFNβ-1a(Avonex®, 및 Rebif^®), IFNβ-1b(Betaseron^®), 컨센서스 IFN, IFN 알파콘-1(Infergen^®), IFNα-2(Intron A^®), IFNα-2a(Roferon-A^®), 페그인터페론 알파-2a(PEGASYS^®), 페그인터페론 알파-2b(PEG-Intron^®), IFN 유사체, IFN 돌연변이체, 변형된 글리코실화된 인간 IFN, 및 PEG 접합화된 IFN 유사체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 내인성 인간 IFN의 발현을 위해 변형된 세포의 구체적인 예로는 문헌 ([Devlin et al., J. Leukoc. Biol. 41:306(1987)]; 미국 특허 번호 제6,610,830호; 제6,482,613호; 제6,489,144호; 제6,159,712호; 제5,814,485호; 제5,710,027호; 제5,595,888호; 제4,966,843호(본원에서 참고로 인용된다))에 기재되어 있다. 또한, GH 계열 구성원의 발현에 관해서는 미국 특허 번호 제6,716,606호; 제6,379,661호; 제6,004,548호; 제5,830,705호; 제5,582,823호; 제4,810,643호; 및 제6,242,218호(본원에서 참고로 인용된다)도 참조한다.

IFN 베타 내의 매우 다양한 아미노산 위치에서의 치환이 기재되어 있다. 치환은 약제학적 안정성을 조정하고, 약제학적 안정성을 증가시키며, 프로테아제 내성을 증가시키고, 폴리펩티드를 길항제로 전환시키는 등의 치환을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 이는 "IFN 베타 폴리펩티드" 또는 "IFNβ"라는 용어에 포함된다. 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드가 미국 특허 공보 번호 제2005/0054053호에 기재되어 있다. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 12, 15, 16, 22, 28, 30, 32, 36, 42, 43, 46, 47, 48, 49, 51, 92, 93, 96, 100, 101, 104, 111, 113, 116, 117, 120, 121, 124, 130, 148, 및 155번으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에 적어도 하나의 변형을 포함하며, 변형된 면역원성을 나타내는 IFN-β 변이체가 기재되어 있다. 잔기 5, 8, 15, 47, 111, 116, 및 120에 대한 변형은 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 및 리신으로 구성된 군으로부터 선택되는 치환 돌연변이일 수 있다. 잔기 22, 28, 30, 32, 36, 92, 130, 148, 및 155에 대한 변형은 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 세린, 트레오닌 및 리신을 비롯한 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 변이체는 가용성을 증가시킴으로써 면역원성을 감소시킨다고 기술된 바 있다. L5A, L5D, L5E, L5K, L5N, L5Q, L5R, L5S, L5T, F8A, F8D, F8E, F8K, F8N, F8Q, F8R, F8S, S12E, S12K, S12Q, S12R, W22E, L28Q, Y30H, L32A, E43K, E43R, L47K, Y92Q, E104R, E104K, E104H, E104Q, E104A, F111N, R113D, R113E, R113Q, R113A, L116D, L116E, L116N, L116Q, L116R, M117R, L120D, L120R, L130R, V148A, 및 Y155S로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 변형이 본 발명의 폴리펩티드에 존재할 수 있다. 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 하나 이상의 천연 아미노산 치환을 포함할 수 있다. C17S 치환은 종래 기술된 바 있다. 미국 특허 번호 제2005/0054053호에는 C17S 치환 이외에 L5Q 치환(미국 특허 번호 제2005/0054053호의 서열번호 19), C17S 치환 이외에 L5Q 및 F8E 치환 (미국 특허 번호 제2005/0054053호의 서열번호 20), C17S 치환 이외에 L5Q, F8E, 및 F111N 치환(미국 특허 번호 제2005/0054053호의 서열번호 21), C17S 치환 이외에 LL5Q, F8E, 및 L116E 치환(미국 특허 번호 제2005/0054053호의 서열번호 22), C17S 치환 이외에 F8E, F111N, 및 L116E 치환(미국 특허 번호 제2005/0054053호의 서열번호 23), C17S 치환 이외에 L5Q, F8E, F111N, 및 L116E 치환(미국 특허 번호 제2005/0054053호의 서열번호 24), 및 C17S 치환 이외에 L5Q, F8E, L47K, F111N, L116E, 및 L120R 치환(미국 특허 번호 제2005/0054053호의 서열번호 25)을 포함하는 IFN 베타 변이체가 기재되어 있다.

추가의 측면에서, 면역원성이 감소된 단백질인 변이체 IFN 베타는 적어도 하나의 인간 MHC 클래스 II 대립유전자에 대한 결합이 감소된 것으로 나타난다. 이러한 실시태양에서(뿐만 아니라, 다른 변형된 면역원성 변이체의 경우에도), 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 아미노산 변형이 이루어질 수 있다: 아그레토프 1: 잔기 3-11; 아그레토프 2: 잔기 5-13; 아그레토프 3: 잔기 8-16; 아그레토프 4: 잔기 9-17; 아그레토프 5: 잔기 15-23; 아그레토프 6: 잔기 22-30; 아그레토프 7: 잔기 30-38; 아그레토프 8: 잔기 36-44; 아그레토프 9: 잔기 47- 55; 아그레토프 10: 잔기 57-65; 아그레토프 11: 잔기 60-68; 아그레토프 12: 잔기 63-71; 아그레토프 13: 잔기 70-78; 아그레토프 14: 잔기 79-87; 아그레토프 15: 잔기 95-103; 아그레토프 16: 잔기 122-130; 아그레토프 17: 잔기 125-133; 아그레토프 18: 잔기 129-137; 아그레토프 19: 잔기 130-138; 아그레토프 20: 잔기 143-151; 아그레토프 21: 잔기 145-153; 아그레토프 22: 잔기 146-154; 아그레토프 23: 잔기 148-156; 아그레토프 24: 잔기 151-159; 아그레토프 25: 잔기 154-162; 아그레토프 26: 잔기 156-164; 아그레토프 27: 잔기 157-165. 변이체는 또한 이들 아그레토프들 중 2개 이상에서 아미노산 변형을 포함한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 변이체 단백질을 코딩하는 재조합 핵산, 변이체 핵산을 함유하는 발현 벡터, 변이체 핵산 및/또는 발현 벡터을 포함하는 숙주 세포, 및 변이체 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 환자에게 통상적으로는 약제학적 담체와 함께 변이체 단백질을 치료학적 유효량으로 투여함으로써 인터페론 반응성 질병을 치료하는 것을 제공한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 MHC 클래스 II 에피토프를 변경시킴으로써 인터페론(특히, IFN 베타)의 면역원성을 조정하는(특히, 면역원성을 감소시키는) 방법을 제공한다.

미국 특허 번호 제7,144,574호(그의 전문이 참고로 인용된다)에서 논의되고 있는 IFN 베타 돌연변이체는 하기 변형들 중 하나 이상을 포함하며, 글리코실화되어 있거나, 글리코실화되어 있지 않은 폴리펩티드를 포함한다: D110F; C17S; Q49N; Q51T; F111N; R113T; K19R; K33R; K45R; Q51S; R113S; Q48F; Q48V; Q48W; Q48Y; D110V; D110W; D110Y. WO 2005/016371(본원에서 참고로 인용된다)에는 선택적으로 산화되어 있는 IFN 베타-1b 폴리펩티드가 기재되어 있다. 다른 돌연변이체로는 25번 위치에 있는 아스파라긴이 탈아미드화된 본래의 인터페론-베타를 포함하는 유사체(WO 2006/053134 참조), 및 WO 2006/049423에 기술되어 있는 것과 같이 상이한 글리코실화를 포함하는 것(상기 2개의 문헌들 모두 본원에서 참고로 인용된다)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. IFN 베타의 E. 콜라이 발현을 위한 코돈 최적화 는 WO 2006/015165(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

리더 서열이 없는 IFN 베타의 서열에 대해서는 본원 서열번호 1 및 3을 참조한다. 리더 서열을 포함하는 IFN 베타의 서열에 대해서는 본원 서열번호 4를 참조한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 IFN 베타 폴리펩티드의 서열번호 1, 3, 4, 또는 임의의 다른 서열과 실질적으로 동일하다. 돌연변이체를 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 및 IFN 베타 폴리펩티드를 발현시키고 정제하는 방법은 잘 알려져 있으며, 이는 미국 특허 번호 제4,462,940호; 미국 특허 번호 제4,518,584호; 미국 특허 번호 제5,702,699호; 미국 특허 번호 제6,962,978호; 미국 특허 번호 제5,814,485호; 미국 특허 번호 제6,887,462호; 미국 특허 번호 제6,800,735호; 미국 특허 번호 제6,514,729호; 미국 공보 번호 US2002/0137895, US2004/0115169, 및 US2005/0054053(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 개시되어 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

용어 "IFN 베타 폴리펩티드"는 또한 약제학적으로 허용되는 염 및 프로드럭, 및 상기 염의 프로드럭, 다형체, 수화물, 용매화물, 생물학적으로 활성인 단편, 생물학적으로 활성인 변이체 및 천연적으로 발생된 IFN 베타의 입체이성체 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 IFN 베타의 효현제, 모사체, 및 길항제 변이체 및 그의 폴리펩티드 융합체를 포함한다. 아미노 말단, 카르복실 말단, 또는 그 둘 모두에 추가의 아미노산을 포함하는 융합체는 용어 "IFN 베타 폴리펩티드"에 포함된다. 예시적인 융합체로는 예로서, 리더 또는 신호 펩티드가 없는 IFN 베타의 성숙한 형태의 재조합 발현으로부터 생성된 IFN 베타의 N 말단에 메티오닌이 연결되어 있는 메티 오닐 IFN 베타 또는 그의 일부(재조합 발현으로부터 생성된 IFN 베타의 N 말단에 메티오닌이 연결되어 있는 것), 정제용 융합체(폴리히스티딘 또는 친화성 에피토프를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 혈청 알부민 결합 펩티드를 포함하는 융합체, 및 혈청 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민을 포함하는 융합체를 포함한다. 미국 특허 번호 제5,750,373호(본원에서 참고로 인용된다)에는 그의 각 수용체 분자에 대한 결합 특성이 변경되어 있는 신규의 단백질, 예를 들면, 성장 호르몬 및 항체 단편 변이체를 선별하는 방법이 기재되어 있다. 상기 방법은 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 유전자를 섬유상 파지 M13의 유전자 III 피복 단백질의 카르복시 말단 도메인에 융합시키는 단계를 포함한다. 키메라 분자는 IFN 베타 및 하나 이상의 다른 분자를 포함한다. 키메라 분자는 IFN 베타 및 다른 분자(들) 중 하나 또는 그 둘 모두의 특이적인 영역 또는 단편을 함유할 수 있다. 그러한 임의의 단편은 상기 단백질로부터 표준 생화학적 방법에 의해, 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 제조될 수 있다. IFN 베타, 또는 그의 단편은 인간 혈청 알부민(HSA: human serum albumin), Fc, 또는 그의 일부를 포함하는 융합 단백질로서 제조될 수 있다. 그러한 융합 구성체는 진핵 숙주 세포에서 IFN 베타, 또는 그의 단편의 발현을 증강시키는데 적합하다. 예시적인 HSA 일부로는 미국 특허 번호 제5,766,883호 및 공보 미국 특허 번호 제5,766,883(본원에서 참고로 인용된다)에 개시되어 있는 것과 같은 N 말단 폴리펩티드(아미노산 1-369, 1-419, 및 아미노산 1에서부터 출발한 중간 길이의 것)를 포함한다. 다른 키메라 폴리펩티드는 HSA의 C 말단 및 N 말단 종단부 각각에 IFN 베타, 또는 그의 단편이 부착되어 있는 HSA 단 백질을 포함할 수 있다. 그러한 HSA 구성체는 미국 특허 번호 제5,876,969호(본원에서 참고로 인용된다)에 개시되어 있다. 다른 융합체는 a) 면역글로불린의 Fc 부분; b) 면역글로불린의 Fc 부분의 유사체; 및 c) 면역글로불린의 Fc 부분의 단편과 인터페론 베타를 융합시킴으로써 형성될 수 있다. 미국 특허 공보 번호 제2005/0054053호에는 순환 교환된 인터페론 베타, 및 IFN 베타와 면역글로불린 또는 면역글로불린의 영역과의 융합체가 기재되어 있다.

다양한 참고 문헌에 중합체의 구성 또는 글리코실화에 의한 폴리펩티드의 변형이 개시되어 있다. 용어 "IFN 베타 폴리펩티드"는 중합체, 예를 들면, PEG에 접합화된 폴리펩티드를 포함하고, 이는 시스테인, 리신, 또는 다른 잔기의 하나 이상의 추가적인 유도체화로 이루어질 수 있다. 또한, IFN 베타 폴리펩티드는 링커 또는 중합체를 포함할 수 있는데, 여기서, 링커 또는 중합체가 접합되는 아미노산은 본 발명에 따른 비-천연 아미노산일 수 있거나, 예를 들면, 리신 또는 시스테인에 커플링되는 것과 같이, 당업계에 공지된 기법을 사용하여 천연적으로 코딩된 아미노산에 접합될 수 있다.

본래의 IFNβ 또는 그의 C17S 변이체의 중합체 변형은 보고된 바 있다(EP 229108, 미국 특허 번호 제5,382,657호; EP 593868; 미국 특허 번호 제4,917,888호 및 WO 99/55377(본원에서 참고로 인용된다)). 인터페론-베타-1a의 중합체 접합체 또한 미국 특허 번호 제6,962,978호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 인터페론은 미국 특허 공보 번호 US 2005/0220762; WO 2006/133089; 및 WO 2006/133088(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에서 기술된 바 있다. 문헌 [Basu et al. in Bioconjugate Chem 2006 17:618-630]에서는 20개의 부위에 대해 선택적으로 단일 PEG화된 또는 다중 PEG화된 인터페론-베타-1b 폴리펩티드의 안정성, 가용성, 응집, 면역원성, 및 약동학적 특성이 평가되었다. 접합체는 리신 잔기 또는 N 말단에서 형성되었다.

PEG화된 IFN 분자의 일례는 미국 특허 번호 제6,524,570호; 제6,250,469호; 제6,180,096호; 제6,177,074호; 제6,042,822호; 제5,981,709호; 제5,951,974호; 제5,908,621호; 제5,738,846호; 제5,711,944호; 제5,382,657호(본원에서 참고로 인용된다)에 개시되어 있는 것을 포함한다. IFNβ는 성장 호르몬 슈퍼계열에 속하는 폴리펩티드의 한가지 일례로서 언급되어 있다. WO 00/23114에는 글리코실화 및 페길화된 IFNβ가 개시되어 있다. WO 00/23472에는 IFNβ 융합 단백질이 개시되어 있다. 미국 특허 번호 제4,904,584호에는 적어도 하나의 리신 잔기가 결실되어 있거나, 임의의 다른 아미노산 잔기로 대체되어 있는 PEG화된 리신 소실 폴리펩티드가 개시되어 있다. WO 99/67291에는 단백질 상의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 결실시키고, 단백질에 접합될 수 있도록 하는데 충분한 조건하에서 단백질을 PEG와 접촉시키는 것인, 단백질을 PEG와 접합시키는 방법이 개시되어 있다. WO 99/03887에는 시스테인 잔기가 폴리펩티드의 특정 영역에 위치하는 비필수 아미노산 잔기로 치환되어 있는, 성장 호르몬 슈퍼계열에 속하는 폴리펩티드의 PEG화된 변이체가 개시되어 있다. WO 00/26354에는 상응하는 모체 폴리펩티드와 비교하여 적어도 하나의 추가 글리코실화 부위를 포함하는 것인, 알레르기 유발성이 감소된 글리코실화된 폴리펩티드 변이체를 제조하는 방법이 개시되어 있다. IFNβ는 미국 특허 번호 제5,218,092호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 기술에 따라 변형될 수 있는 다수의 폴리펩티드 중의 한가지 일례로서 개시되어 있다. 미국 특허 번호 제5,218,092호(본원에서 참고로 인용된다)에는 본래의 폴리펩티드와 비교하여 적어도 하나의 추가 당질 쇄를 도입하도록 하는 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 및 다른 폴리펩티드의 변형이 개시되어 있다.

용어 "IFN 베타 폴리펩티드"는 또한 글리코실화된 IFN 베타, 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 임의의 아미노산 위치에서 글리코실화된 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드의 N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화된 형태를 포함한다. 단일 뉴클레오티드 변화를 포함하는 변이체 또한 IFN 베타 폴리펩티드의 생물학적으로 활성인 변이체로서 간주된다. 또한, 스플라이스 변이체도 포함된다. 용어 "IFN 베타 폴리펩티드" 또한 화학적 수단에 의해 연결되거나, 융합 단백질로서 발현된, 임의의 하나 이상의 IFN 베타 폴리펩티드 또는 임의의 다른 폴리펩티드, 단백질, 당질, 중합체, 소분자, 링커, 리간드, 또는 임의 유형의 다른 생물학적 활성 분자의 IFN 베타 폴리펩티드 이종이량체, 동종이량체, 이종다량체, 또는 동종다량체 뿐만 아니라, 예를 들면, 특이적인 결실 또는 다른 변형을 포함하여도, 생물학적 활성은 유지하는 폴리펩티드 유사체를 포함한다.

달리 언급하지 않는 한(즉, 서열번호 3, 4, 또는 다른 IFN 베타 서열에 기초하여 비교한다고 언급할 경우), 본원에 기술된 IFN 베타 내의 아미노산 위치에 대한 모든 언급은 서열번호 1에서의 위치에 기초한다. 예를 들면, 서열번호 1의 1번 위치에 있는 아미노산은 메티오닌이고, 상응하는 메티오닌은 서열번호 4 중 22번 위치에 위치한다. 서열번호 1 중의 위치에 상응하는 아미노산 위치는 임의의 다른 IFN 베타 분자, 예를 들면, 서열번호 3 및 4에서 쉽게 확인할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 서열번호 1, 3, 4, 또는 임의의 다른 IFN 베타 서열 중의 위치에 상응하는 아미노산 위치는 임의의 다른 IFN 베타 분자, 예를 들면, IFN 베타 융합체, 변이체, 단편 등에서 쉽게 확인할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들면, 서열 정렬 프로그램, 예를 들면, BLAST를 사용하여 서열번호 1, 3, 4, 또는 다른 IFN 베타 서열 중의 위치에 상응하는 단백질을 정렬하고, 상기 단백질 중의 특정 위치를 확인할 수 있다. 서열번호 1, 3, 4, 또는 다른 IFN 베타 서열에 관한, 본원에 기술된 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가는 본원에 기술되어 있거나, 당업계에 공지되어 있는 IFN 베타 융합체, 변이체, 단편 등의 상응하는 위치에서의 치환, 결실 또는 첨가도 언급하고자 하는 것이며, 이는 명백히 본 발명에 포함된다.

용어 "IFN 베타 폴리펩티드" 또는 "IFN 베타"는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 하나 이상의 비-천연 아미노산 변형과 함께, 하나 이상의 천연 아미노산으로 이루어진 변형도 포함할 수 있다. 천연적으로 발생된 IFN 베타 폴리펩티드 중의 매우 다양한 아미노산 위치에서 이루어진 예시적인 치환이 기술되어 있으며, 이는 약제학적 안정성을 조정하는 치환, 예를 들면, 효현제 활성을 증가, 폴리펩티드의 가용성을 증가, 프로테아제 감수성 감소, 폴리펩티드의 길항제로의 전환 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과 같은, IFN 베타 폴리펩티드의 생물학적 활성들 중 하나 이상을 조정하는 치환을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 용어 "IFN 베타 폴리펩티드"에 포함된다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 길항제는 IFN 베타 분자의 수용체 결합 영역에 존재하는 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 추가로 IFN 베타 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조정하는 첨가, 치환 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 추가로 IFN 베타 폴리펩티드의 항바이러스성 활성을 조정하는 첨가, 치환 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 추가로 IFN 베타 폴리펩티드의 항바이러스성 활성을 증강시키는 첨가, 치환 또는 결실을 포함한다. 예를 들면, 첨가, 치환 또는 결실은 IFN 베타의 하나 이상의 특성 또는 활성을 조정할 수 있다. 예를 들면, 첨가, 치환 또는 결실은 IFN 수용체에 대한 친화성을 조정할 수 있거나, 순환 반감기를 조정할 수 있거나, 치료학적 반감기를 조정할 수 있거나, 폴리펩티드의 안정성을 조정할 수 있거나, 프로테아제에 의한 절단을 조정할 수 있거나, 투여량을 조정할 수 있거나, 방출 또는 생체이용성을 조정할 수 있거나, 정제를 촉진시킬 수 있거나, 특정 투여 경로를 개선 또는 변경시킬 수 있다. 유사하게, IFN 베타 폴리펩티드는 프로테아제 절단 서열, 반응기, 항체 결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 다른 친화성에 기초한 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 폴리펩티드의 검출(GFP를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 정제 또는 다른 형질을 개선시키는 연결된 분자(비오틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 포함할 수 있다.

용어 "IFN 베타 폴리펩티드"는 또한 비천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 통해 동일하거나 상이한 비천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄, 천연적으로 코딩된 아미노산 측쇄에 직접 연결되거나, 링커를 통해 간접적으로 연결된 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체, 및 이종다량체를 포함한다. 예시적인 링커로는 소형 유기 화합물, 다양한 길이의 수용성 중합체, 예를 들면, 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리덱스트란, 또는 다양한 길이의 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"비천연적으로 코딩된 아미노산"은 20종의 일반 아미노산 중 하나 또는 피롤리신 또는 셀레노시스테인이 아닌 아미노산을 지칭한다. 용어 "비천연적으로 코딩된 아미노산"과 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어들로는 "비-천연 아미노산," "비천연 아미노산," "비천연적으로 발생된 아미노산" 및 그들의 다양한 하이픈으로 연결된 버전 및 하이픈이 붙지 않은 버전이 있다. 용어 "비천연적으로 코딩된 아미노산"은 또한 천연적으로 코딩된 아미노산(20종의 일반 아미노산 또는 피롤리신 및 셀레노시스테인을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 변형(예로서, 번역 후 변형)에 의해 발생하지만, 그 자체로는 번역 복합체에 의해 폴리펩티드 쇄에 천연적으로 도입되지 않는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 비천연적으로 발생된 아미노산의 예는 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌 및 O-포스포티로신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"아미노 말단 변형기"는 폴리펩티드의 아미노 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 유사하게, "카르복시 말단 변형기"는 폴리펩티드의 카르복시 말 단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 말단 변형기로는 펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 다양한 수용성 중합체, 펩티드 또는 단백질, 예를 들면, 혈청 알부민, 또는 다른 부분들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

용어 "작용기," "활성 부분," "활성화 기," "이탈기," "반응성 부위," "화학적 반응기" 및 "화학적 반응성 부분"은 당업계 및 본원에서 분자의 독특한 정의가능한 부분 또는 단위를 지칭하는 것으로 사용된다. 이 용어들은 화학 분야에서는 다소 동일한 의미를 가지며, 본원에서는 일부 기능 또는 활성을 수행하고, 다른 분자와 반응성을 갖는 분자의 부분을 나타내는데 사용된다.

용어 "결합" 또는 "링커"는 보통 화학 반응의 결과로서 형성되고, 전형적으로는 공유 결합인 기 또는 결합을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다. 가수분해에 안정한 결합은 결합이 수중에서 실질적으로 안정하고, 생리학적 조건하에 장기간 동안, 아마도 심지어는 무기한의 기간 동안을 포함하나, 이에 한정되지 않는 조건에서 유용한 pH 값에서 물과 반응하지 않는 것을 의미한다. 가수분해에 불안정한 또는 가수분해로 분해가능한 결합은 결합이 물 또는 예를 들면, 혈액을 비롯한 수용액에서 분해가능하다는 것을 의미한다. 효소적으로 불안정한 또는 분해가능한 결합은 결합이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있다는 것을 의미한다. 당업계에서 이해되고 있는 바와 같이, PEG 및 관련 중합체는 중합체 골격 중, 또는 중합체 골격과 중합체 분자의 말단 작용기들 중 하나 이상의 말단 작용기 사이의 링커 기 중에 분해가능한 결합을 포함할 수 있다. 예를 들면, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산을 생물학적 활성제 상의 알코올 기와 반응시킴으로써 형성된 에 스테르 결합은 일반적으로 생리학적 조건하에서 가수분해됨으로써 상기 제제를 유리시킨다. 다른 가수분해로 분해가능한 결합은 카르보네이트 결합; 아민 및 알데히드의 반응으로부터 생성된 이민 결합; 알코올을 포스페이트 기와 반응시킴으로써 형성된 포스페이트 에스테르 결합; 히드라지드 및 알데히드의 반응 생성물인 히드라존 결합; 알데히드 및 알코올의 반응 생성물인 아세탈 결합; 포름에이트 및 알코올의 반응 생성물인 오르토에스테르 결합; 중합체, 예를 들면, PEG의 말단을 포함하나, 이에 한정되지 않는 아민 기 및 펩티드의 카르복실 기에 의해 형성된 펩티드 결합; 및 중합체의 말단을 포함하나, 이에 한정되지 않는 포스포라미다이트 기, 및 올리고뉴클레오티드의 5' 하이드록실 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오티드 결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 경우, 용어 "생물학적 활성 분자," "생물학적으로 활성인 부분" 또는 "생물학적 활성제"는 바이러스, 세균, 박테리오파지, 트랜스포존, 프리온, 곤충, 진균, 식물, 동물, 및 인간을 포함하나, 이에 한정되지 않는 유기체와 관련된 생물학적 시스템, 경로, 분자, 또는 상호작용의 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 줄 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히 본원에서 사용된 생물학적 활성 분자는 인간 또는 다른 동물의 질환을 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방하거나, 다르게는, 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 안녕을 증강시키기 위한 임의의 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 생물학적 활성 분자의 예는 펩티드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 백신, 면역원, 경질 약물, 연질 약물, 당질, 무기 원자 또는 분자, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 방사성 핵종, 올리고뉴클레오티드, 톡소이드, 독소, 원핵 및 진핵세포, 바이러스, 다당류, 핵산 및 바이러스, 세균, 곤충, 동물 또는 임의의 다른 세포 또는 세포 유형으로부터 수득되거나 유래되는 그의 일부, 리포좀, 미세입자 및 미셀을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. IFN 베타 폴리펩티드는 미셀 제제에 첨가될 수 있다: 미국 특허 번호 제5,833,948호(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 생물학적 활성제의 부류로는 약물, 프로드럭, 방사성 핵종, 영상화제, 중합체, 항생제, 살진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드성 약제, 미생물 유래의 독소 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

"이작용성 중합체"는 다른 부분(아미노산 측기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)과 특이적으로 반응하여 공유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2개의 별개의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 특정의 생물학적으로 활성인 성분 상의 기와 반응성을 띠는 하나의 작용기, 및 제2 생물학적 성분 상의 기와 반응성을 띠는 또다른 기를 갖는 이작용성 링커를 사용하여 제1 생물학적으로 활성인 성분, 이작용성 링커 및 제2 생물학적으로 활성인 성분을 포함하는 접합체를 형성할 수 있다. 펩티드에 다양한 화합물을 부착시키기 위한 많은 절차 및 링커 분자들이 공지되어 있다. 예로서, 유럽 특허 공보 번호 제188,256호; 미국 특허 번호 제4,671,958호, 제4,659,839호, 제4,414,148호, 제4,699,784호; 제4,680,338호; 및 제4,569,789호(본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다. "다작용성 중합체"는 다른 부분(아미노산 측기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)과 특이적으로 반응하여 공 유 또는 비공유 결합을 형성할 수 있는 2개 이상의 별개의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 이작용성 중합체 또는 다작용성 중합체는 임의의 원하는 길이 또는 분자량을 가질 수 있고, IFN 베타에 연결된 하나 이상의 분자와 그의 수용체 또는 IFN 베타 사이의 특정의 원하는 공간 또는 입체형태를 제공하도록 선택될 수 있다.

치환기 기가 왼쪽으로부터 오른쪽으로 쓰여진 그들의 통상적인 화학식에 의해 특정되는 경우, 이들은 화학식을 오른쪽에서 왼쪽으로 씀으로써 형성되는 화학적으로 동일한 치환기 기도 동일하게 포함하며, 예를 들면, 화학식 -CH₂O-는 화학식 -OCH₂-와 일치한다.

용어 "치환기"는 "비간섭 치환기"를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "비간섭 치환기"는 안정한 화합물을 생성하는 기이다. 적합한 비간섭 치환기 또는 라디칼은 할로, C₁-C₁₀ 알킬, C₂-C₁₀ 알케닐, C₂-C₁₀ 알키닐, C₁-C₁₀ 알콕시, C₁-C₁₂ 아르알킬, C₁-C₁₂ 알크아릴, C₃-C₁₂ 사이클로알킬, C₃-C₁₂ 사이클로알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 톨루오일, 크실레닐, 비페닐, C₂-C₁₂ 알콕시알킬, C₂-C₁₂ 알콕시아릴, C₇-C₁₂ 아릴옥시알킬, C₇-C₁₂ 옥시아릴, C₁-C₆ 알킬설피닐, C₁-C₁₀ 알킬설포닐, --(CH₂)_m--0-(C₁-C₁₀ 알킬)(여기서, m은 1 내지 8이다), 아릴, 치환된 아릴, 치환된 알콕시, 플루오로알킬, 헤테로사이클릭 라디칼, 치환된 헤테로사이클릭 라디칼, 니트로알킬, - -NO₂, --CN, --NRC(O)--(C₁-C₁₀ 알킬), --C(O)--(C₁-C₁₀ 알킬), C₂-C₁₀ 알킬 티오알킬, --C(O)O--(C₁-C₁₀ 알킬), --OH, --SO₂, =S, --C00H, --NR₂, 카르보닐, --C(O)--(C₁-C₁₀ 알킬)-CF₃, --C(O)-CF₃, --C(O)NR₂, --(C₁-C₁₀ 아릴)-S--(C₆-C₁₀ 아릴), --C(O)--(C₁-C₁₀ 아릴), --(CH₂)_m--0--(--(CH₂)_m--O--(C₁-C₁₀ 알킬)(여기서, 각각의 m은 1 내지 8이다), --C(O)NR₂, --C(S)NR₂, --SO₂NR₂, --NRC(O)NR₂, --NRC(S)NR₂, 그의 염 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에서 사용된 각각의 R은 H, 알킬 또는 치환된 알킬, 아릴 또는 치환된 아릴, 아르알킬, 또는 알크아릴이다.

용어 "할로겐"은 불소, 염소, 요오드 및 브롬을 포함한다.

용어 "알킬"은 달리 언급하지 않는 한, 그 자체로 또는 또다른 치환기의 일부로서, 완전히 포화, 단일- 또는 다중불포화될 수 있고, 지정된 탄소 원자의 수를 갖는 2가 및 다가 라디칼(즉, C₁-C₁₀은 1 내지 10개의 탄소를 의미한다)을 포함할 수 있는 직쇄 또는 분지형 쇄, 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼, 또는 그의 조합물을 의미한다. 포화 탄화수소 라디칼의 예는 기, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 사이클로헥실, (사이클로헥실)메틸, 사이클로프로필메틸, 그의 동족체 및 이성체, 예를 들면, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 불포화된 알킬 기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 것이다. 불포화 알킬 기의 예는 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고급 동족체 및 이성체를 포함하 나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 용어 "알킬"은 달리 언급하지 않는 한, 이하 더 상세히 정의되는 알킬의 유도체, 예를 들면, "헤테로알킬"을 포함하는 것을 의미한다. 탄화수소 기로 제한된 알킬 기를 "동종알킬"이라 칭한다.

용어 "알킬렌"은 그 자체로 또는 또다른 치환기의 일부로서, 제한하는 것은 아니지만, 화학식 -CH₂CH₂- 및 -CH₂CH₂CH₂CH₂-에 의해 예시되는, 알칸으로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하며, 하기에서 "헤테로알킬렌"으로 설명되는 기를 추가로 포함한다. 전형적으로, 알킬(또는 알킬렌) 기는 1 내지 24개의 탄소 원자를 갖고, 본원에 기술된 방법 및 조성물의 특정 실시태양에서 상기 기는 10개 이하의 탄소 원자를 갖는다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 갖는 짧은 쇄 알킬 또는 알킬렌 기이다.

용어 "알콕시," "알킬아미노" 및 "알킬티오"(또는 티오알콕시)는 그들의 통상적인 의미로 사용되며, 각각 산소 원자, 아미노 기 또는 황 원자를 통해 분자 나머지 부분에 부착된 알킬 기를 지칭한다.

용어 "헤테로알킬"은 달리 언급하지 않는 한, 그 자체로 또는 또다른 용어와 함께, 언급된 갯수의 탄소 원자 및 0, N, Si 및 S로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 헤테로원자로 구성된 안정한 직쇄 또는 분지형 쇄, 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼, 또는 그의 조합물을 의미하며, 여기서, 상기 질소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 헤테로원자는 임의로 4급화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N 및 S 및 Si는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치 또는 알킬 기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치에 위치할 수 있다. 예로는 -CH₂-CH₂-O-CH₃, -CH₂-CH₂-NH-CH₃, -CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃, -CH₂-S-CH₂-CH₃, -CH₂-CH₂, -S(O)-CH₃, -CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃, -CH=CH-O-CH₃, -Si(CH₃)₃, -CH₂-CH=N-OCH₃, 및 -CH=CH-N(CH₃)-CH₃을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 2개 이하의 헤테로원자는 연속적일 수 있으며, 예를 들면, -CH₂-NH-OCH₃ 및 -CH₂-O-Si(CH₃)₃과 같다. 유사하게, 용어 "헤테로알킬렌"은 그 자체로 또는 또다른 치환기의 일부로서, 제한하는 것은 아니지만, -CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂- 및 -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-에 의해 예시되는, 헤테로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌 기의 경우, 동일하거나 상이한 헤테로원자는 또한 쇄 말단의 한쪽 또는 양쪽 모두를 차지할 수 있다(알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 아미노옥시알킬렌 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다). 또한, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 멀티아암형(multiarmed)의 경우, 연결기의 화학식이 쓰여지는 방향은 연결기의 배향을 암시하지 않는다. 예를 들면, 화학식 -C(O)₂R'-는 -C(O)₂R'- 및 -R'C(O)₂- 둘 모두를 나타낸다.

용어 "사이클로알킬" 및 "헤테로사이클로알킬"은 달리 언급하지 않는 한, 그 자체로 또는 다른 용어와 함께, 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬" 사이클릭 버전을 나타낸다. 따라서, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬은 포화, 부분적으로 불포화, 및 완전히 불포화된 환 결합을 포함한다. 추가로, 헤테로사이클로알킬의 경우, 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치를 차지할 수 있 다. 사이클로알킬의 예로는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 헤테로사이클로알킬의 예로는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라하이드로푸란-2-일, 테트라하이드로푸란-3-일, 테트라하이드로티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 상기 용어는 비사이클릭 및 트리사이클릭 환 구조를 포함한다. 유사하게, 용어 "헤테로사이클로알킬렌"은 그 자체로 또는 또다른 치환기의 일부로서, 헤테로사이클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미하고, 용어 "사이클로알킬렌"은 그 자체로 또는 또다른 치환기의 일부로서, 사이클로알킬로부터 유도된 2가 라디칼을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "수용성 중합체"는 수성 용매 중에서 가용성인 임의의 중합체를 지칭한다. IFN 베타 폴리펩티드에 수용성 중합체를 결합함으로써, 변형되지 않은 형태에 비해 증가된 또는 조정된 혈청 반감기, 또는 증가된 또는 조정된 치료학적 반감기, 조정된 면역원성, 조정된 물리적 회합 특징, 예를 들면, 응집 및 다량체 형성, 변경된 수용체 결합, 하나 이상의 결합 파트너에의 변경된 결합, 및 변경된 수용체 이량체화 또는 다량체화를 포함하나, 이에 한정되지 않는 변화를 일으킬 수 있다. 수용성 중합체는 그 자신의 생물학적 활성을 가질 수 있거나, 가질 수 없고, IFN 베타를, 하나 이상의 IFN 베타 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 물질에 부착시키기 위한 링커로서 사용될 수 있다. 적합한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프 로피온알데히드, 그의 모노 C₁-C₁₀ 알콕시 또는 아릴옥시 유도체(미국 특허 번호 제5,252,714호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재됨), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레산 무수물, N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 설페이트를 비롯한 덱스트란 유도체, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 다당류, 올리고당, 글리칸, 셀룰로스 및 메틸셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 셀룰로스 유도체, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩티드, 폴리알킬렌 글리콜 및 그의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜의 공중합체 및 그의 유도체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파-베타-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파르트아미드 등, 또는 그의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 수용성 중합체의 예는 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용된 용어 "폴리알킬렌 글리콜" 또는 "폴리(알켄 글리콜)"은 폴리에틸렌 글리콜(폴리(에틸렌 글리콜)), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜 및 그의 유도체를 지칭한다. 용어 "폴리알킬렌 글리콜"은 선형 및 분지형 중합체, 둘 모두 및 0.1 kDa 내지 100 kDa의 평균 분자량을 포함한다. 다른 예시적인 실시태양들은 예를 들면, 상업적 공급업체 카탈로그, 예를 들면, 쉐어워터 코퍼레이션 (Shearwater Corporation)의 카탈로그 ["Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001)]에 열거되어 있다.

용어 "아릴"은 달리 언급하지 않는 한, 함께 융합되거나 공유적으로 연결된 단일 환 또는 다중 환(1 내지 3개의 환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)일 수 있는 다중불포화, 방향족, 탄화수소 치환기를 의미한다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S로부터 선택되는 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하고, 여기서, 상기 질소 및 황 원자가 임의로 산화되고, 질소 원자(들)가 임의로 4급화되는 아릴 기(또는 환)를 지칭한다. 헤테로아릴 기는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지 부분에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 기의 비제한적인 예는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 5-퀴녹살리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기 언급된 각각의 아릴 및 헤테로아릴 환 시스템계에 대한 치환기는 하기 기술하는 허용가능한 치환기의 군으로부터 선택된다.

간략히, 용어 "아릴"이 다른 용어들(아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)과 함께 사용되는 경우, 상기 정의한 아릴 및 헤테로아릴 환, 둘 모두를 포함한다. 따라서, 용어 "아릴알킬"은 아릴 기가, 탄소 원자 (메틸렌 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)가 예를 들면, 산소 원자(페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등을 포함하나, 이에 한정되지 않 는다)에 의해 대체된 알킬 기를 비롯한 알킬 기(벤질, 페네틸, 피리딜메틸 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 부착된 라디칼을 포함하는 것을 의미한다.

상기 용어들("알킬," "헤테로알킬," "아릴" 및 "헤테로아릴"을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 각각은 지시된 라디칼의 치환된 형태 및 비치환된 형태, 둘 모두를 포함하는 것을 의미한다. 각 유형의 라디칼에 대한 예시적인 치환기를 하기에 제공한다.

알킬 및 헤테로알킬 라디칼(종종, 알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 헤테로사이클로알케닐로 지칭되는 기를 포함한다)에 대한 치환기는 0 내지 (2m' + 1)(여기서, m'는 상기 라디칼 중 탄소 원자의 총 갯수이다) 범위의 수의 -OR', =0, =NR', =N-0R', -NR'R", -SR', -할로겐, - SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NR"C(0)₂R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSO₂R', -CN 및 -NO₂로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는 다양한 기 중 하나 이상일 수 있다. R', R", R"' 및 R""는 각각 독립적으로 수소, 치환되거나, 비치환된 헤테로알킬, 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하나, 이에 한정되지 않는 치환되거나, 비치환된 아릴, 치환되거나, 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 1 초과의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들면, 각각의 R 기는 R', R", R"' 및 R"" 기 중 1 초과의 기가 존재하는 경우, 독립적으로 R', R", R"' 및 R"" 기로부터 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착된 경우, 이들은 질소 원자와 합쳐져 5-, 6-, 또는 7-원 환을 형성할 수 있다. 예를 들면, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 의미한다. 치환기의 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예를 들면, 할로알킬(-CF₃ 및 -CH₂CF₃를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 아실(-C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함하는 것을 의미함을 이해할 것이다.

알킬 라디칼에 대해 기재된 치환기와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환기는 다양하고, 0 내지 방향족 환 시스템 상의 총개방 원자가 갯수 범위의 수로 다음으로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는다: 할로겐, -OR', =0, =NR', =N-0R', -NR'R", -SR', -할로겐, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO₂R', -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NR"C(0)₂R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -NRSO₂R', -CN 및 -NO₂, -R', -N₃, -CH(Ph)₂, 플루오로(C₁-C₄)알콕시, 및 플루오로(C₁-C₄)알킬(여기서, R', R", R"' 및 R""는 수소, 알킬, 헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된다). 본 발명의 화합물이 1 초과의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들면, 각각의 R 기는 R', R", R"' 및 R"" 기 중 1 초과의 기가 존재하는 경우, 독립적으로 R', R", R"' 및 R"" 기로부터 선택된다.

본원에서 사용된 "혈청 반감기가 조정되었다"라는 용어는 그의 변형되지 않은 형태에 비하여 변형된 IFN 베타의 순환 반감기가 양성 또는 음성적으로 변하였다는 것을 의미한다. 혈청 반감기는 IFN 베타의 투여 후 다양한 시점에서 혈액 샘플을 채취하고, 각 샘플 중에서 상기 분자의 농도를 측정함으로써 측정된다. 혈청 농도와 시간의 상관관계를 통해 혈청 반감기를 계산할 수 있다. 혈청 반감기의 증가는 바람직하게 적어도 약 2배이지만, 예를 들면, 투여 요법을 만족스럽게 하거나, 독성 효과를 피하는 경우에는 상기보다 더 적게 증가한 것도 유용할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 증가는 적어도 약 3배, 적어도 약 5배, 또는 약 10배이다.

본원에서 사용된 "치료학적 반감기가 조정되었다"라는 용어는 그의 변형되지 않은 형태에 비하여 치료학적 유효량의 IFN 베타의 반감기가 양성 또는 음성적으로 변하였다는 것을 의미한다. 치료학적 반감기는 투여 후 다양한 시점에서 분자의 약동학적 및/또는 약력학적 특성을 측정함으로써 측정된다. 바람직하게는, 치료학적 반감기 증가는 유익한 특정 투여 요법, 유익한 특정 총 투여량을 가능하게 하거나, 원치 않는 효과를 피할 수 있게 한다. 몇몇 실시태양에서, 치료학적 반감기의 증가로 효능 증가, 변형된 분자의 그의 표적에 대한 결합의 증가 또는 감소, 예를 들면, 프로테아제와 같은 효소에 의한 분자의 분해 증가 또는 감소, 또는 변형되지 않은 분자의 또다른 파라미터 또는 작용 기전의 증가 또는 감소, 또는 수용체에 매개되는 분자 제거의 증가 또는 감소가 일어난다.

"단리된"이란 용어가 핵산 또는 단백질에 적용되는 경우, 이는 핵산 또는 단백질이 천연 상태에서 그와 회합하고 있는 다른 세포 성분들 중 적어도 일부라도 함유하지 않거나, 핵산 또는 단백질이 그의 생체내 농도 또는 시험관내 생산 농도보다 더 높은 수준으로 농축된 것을 나타낸다. 이는 균질한 상태에서 이루어질 수 있다. 단리된 물질은 건조 또는 반건조 상태이거나, 수용액을 포함하나, 이에 한정되지 않는 용액 중에 존재할 수 있다. 추가로 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 성분이 될 수 있다. 전형적으로, 순도 및 균질성은 분석 화학 기법, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피의 사용으로 측정된다. 제제 중에 존재하는 우세한 종인 단백질은 실질적으로 정제된 것이다. 특히 단리된 유전자는 그 유전자 측면에 위치하고, 관심의 대상이 되는 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리된다. "정제된"이란 용어는 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 하나의 밴드를 생성하는 것을 나타낸다. 특히 이는 핵산 또는 단백질의 순도가 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 이상인 것을 의미한다.

용어 "핵산"은 싱글 스트랜드 또는 더블 스트랜드 형태의 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 달리 구체적으로 한정하지 않는 한, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 천연적으로 발생된 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 구체적으로 한정하지 않는 한, 상기 용어는 또한 PNA(펩티도핵산)를 포함하는 올리고뉴클레오티드 유사체, 안티센스 기술에 사용되는 DNA의 유사체(포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)를 지칭한다. 달리 언급이 없는 한, 특정 핵산 서열은 또한 보존적으로 변형된 그의 변이체(축퇴 코돈 치환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 상보적 서열 뿐만 아니라, 명확하게 지시된 서열을 내재적으로 포함한다. 특히 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 수행될 수 있다(문헌 ([Batzer et al., Nucleic Acids Res . 19: 5081 (1991)]; [Ohtsuka et al., J. Biol . Chem. 260: 2605-2608 (1985)]; 및 [Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol . Cell . Probes 8: 91-98 (1994)]) 참조).

용어 "폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 즉, 폴리펩티드에 관한 설명은 펩티드에 관한 설명 및 단백질에 관한 설명에 동일하게 적용되고, 그의 반대 경우도 성립한다. 이 용어들은 천연적으로 발생된 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연적으로 코딩된 아미노산인 아미노산 중합체에 적용된다. 본원에서 사용된 용어들은 전장 단백질을 비롯한 임의의 길이로 된 아미노산 쇄을 포함하며, 여기서, 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연결되어 있다.

용어 "아미노산"은 천연적으로 발생된 아미노산 및 비천연적으로 발생된 아미노산 뿐만 아니라, 천연적으로 발생된 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체를 지칭한다. 천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린) 및 피롤리신 및 셀레노시스테 인이다. 아미노산 유사체는 천연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소에 결합된 α 탄소, 카르복실 기, 아미노 기, 및 R 기, 예를 들면, 동종세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 갖는 화합물을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들면, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만, 천연적으로 발생된 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산에 관해 언급하는 것은 예를 들면, 천연적으로 발생된 프로테오게닉(proteogenic) L-아미노산; D-아미노산, 화학적으로 변형된 아미노산 예를 들면, 아미노산 변이체 및 유도체; 천연적으로 발생된 비프로테오게닉 아미노산 예를 들면, β-알라닌, 오르니틴 등; 및 아미노산의 특징적 성질을 갖는 것으로 당업계에 알려진, 화학적으로 합성된 화합물을 포함한다. 비천연적으로 발생된 아미노산의 예로는 α-메틸 아미노산(예로서, α-메틸 알라닌), D-아미노산, 히스티딘-유사 아미노산(예로서, 2-아미노-히스티딘, β-하이드록시-히스티딘, 동종히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘 및 α-메틸- 히스티딘), 측쇄에 여분의 메틸렌을 갖고 있는 아미노산("동종" 아미노산), 및 측쇄에 있는 카르복실산 작용기가 설폰산기(예로서, 시스테인산)으로 대체되어 있는 아미노산을 포함한다. 합성 비-천연 아미노산을 비롯한 비-천연 아미노산, 치환된 아미노산, 또는 하나 이상의 D-아미노산을 본 발명의 단백질 내로 도입하는 것이 여러가지의 다른 면에서 장점이 될 수 있다. D-아미노산 함유 펩티드 등은 L-아미노산 함유 대응물과 비교하였을 때 시험관내 또는 생체내에서 안정성이 증가한 것으로 나타났다. 따라서, 더욱 큰 세포내 안정성을 원하거나, 그러한 것이 필요할 경우, D-아미노산을 도입하여 펩티드를 구성하는 것 등이 특히 유용할 수 있다. 더욱 특히 D-펩티드 등은 내인성 펩티다제 및 프로테아제에 대해 내성을 띠는 바, 이로써, 상기와 같은 특성이 바람직할 경우, 분자의 생체이용성은 개선되고, 생체내 수명은 연장된다. 추가로, D-펩티드 등은 T 헬퍼 세포에 대한 주요 조직적합성 복합체 클래스 II 제한된 제시에 대해 효과적으로 프로세싱될 수 없으며, 따라서, 모든 유기체에서 체액성 면역 반응을 유도할 가능성이 낮다.

본원에서 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학적 학명 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장되는 통상 공지된 3문자 기호 또는 1문자 기호에 의해 지칭될 수 있다. 유사하게, 뉴클레오티드도 통상 허용되는 1문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.

"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열, 둘 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여 "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나, 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하거나, 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들면, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 하나의 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드를 변경시키지 않고 기술된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 그러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변그의 한 종인 "침묵 변이"이다. 또한, 본 원에서 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당 업계의 숙련인은 핵산 중의 각각의 코돈(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG 및 보통 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)이 변형되어 기능적으로 동일한 분자를 생성할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 각각의 기술되는 서열에 내재한다.

아미노산 서열에 관해, 당업계의 숙련인은 단일 아미노산 또는 코딩된 서열 중 비율이 적은 아미노산을 변경시키거나, 첨가하거나, 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 첨가가, 이러한 변경이 아미노산을 결실, 아미노산을 첨가, 또는 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 경우, "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 이해할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계의 숙련인에게 알려져 있다. 본 발명의 다형체 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자 외에도 상기와 같은 보존적으로 변형된 변이체가 존재하며, 그러한 변이체는 본 발명의 다형체 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자를 배제하지 않는다.

기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계의 숙련인에게 알려져 있다. 다음의 8개의 군 각각은 서로 보존적 치환인 아미노산을 함유한다:

1) 알라닌(A), 글리신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M)

(예를 들면, 문헌 [Creighton, Proteins : Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd Edition (December 1993)] 참조)

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "동일한" 또는 "동일성(%)"이란 용어는 동일한 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 지칭한다. 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나 (또는 당업계의 숙련인이 사용할 수 있는 다른 알고리즘)를 사용하거나, 수동 정렬 및 육안 조사에 의해 측정시, 비교 창 또는 지정된 영역에 대한 최대 상응에 대해 비교하고 정렬할 때, 동일한 (즉, 특정 영역에 대해 즉, 약 60% 동일성, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% 동일성) 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 백분율(%)을 갖는 경우, 서열은 "실질적으로 동일하다". 또한, 이러한 정의는 테스트 서열의 보체를 지칭한다. 동일성은 길이가 적어도 약 50개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역, 또는 길이가 75-100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재할 수 있거나, 특정되지 않은 경우, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 인간 이외의 종으로부터 유래된 동족체를 비롯한, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편을 갖는 표지된 프로브를 사용하여 엄격한 하이브리드화 조건하에서 라이브러리를 스크리닝하는 단 계, 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 전장 cDNA 및 게놈 클론을 단리시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 수득할 수 있다. 그러한 하이브리드화 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

서열 비교를 위해 전형적으로는 하나의 서열이 기준 서열로서 작용하고, 이에 대해 테스트 서열을 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하여, 테스트 서열 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하는 경우, 서브서열 좌표가 지정되고, 필요에 따라, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터를 사용하거나, 대체 파라미터를 지정할 수 있다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기초로 하여 기준 서열에 대한 테스트 서열의 서열 동일성(%)을 계산한다.

본원에서 사용된 "비교 창"은 20 내지 600개, 통상적으로 약 50 내지 약 200개, 더욱 통상적으로 약 100 내지 약 150개로 구성된 군으로부터 선택되는 인접 위치 수 중 어느 하나로 이루어진 절편에 대한 기준을 포함하며, 여기서, 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치의 기준 서열과 비교될 수 있다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 문헌 [Smith and Waterman (1970) Adv . Appl . Math . 2: 482c]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌 [Needleman and Wunsch (1970) J Mol . Biol . 48: 443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌 [Pearson and Lipman (1988) Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 85; 2444]의 유사성 방법 탐색, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행([Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 육안 조사(예를 들면, 문헌 [Ausubelet al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것에 의해 수행될 수 있다.

서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%)을 결정하기에 적합한 알고리즘의 한가지 예로는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이 있는데, 이들 각각 문헌 ([Altschul et al. (1977) Nuc . Acids Res . 25: 3389-3402], 및 [Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol. 215: 403-410])에 기재되어 있다. BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)(월드 와이드 웹 상의 ncbi.nlm.nih.gov에서 이용가능)를 통해 공개적으로 입수가능하다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열의 경우)은 디폴트로서 단어 길이(W) 11, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 스트랜드의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어 길이 3 및 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌 [Henikoff and Henikoff(1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915] 참조) 정렬(B) 50, 기대값(E) 10, M = 5, N = -4 및 양쪽 스트랜드의 비교를 사용한다. 전형적으로, BLAST 알고리즘은 작동하지 않는 "저 복잡성" 필터를 사용하여 수행된다.

또한, BLAST 알고리즘은 2개의 서열 사이의 유사성을 통계적으로 분석한다 (예를 들면, 문헌 [Karlin and Altschul(1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 기준은 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생하는 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률(P(N))이다. 예를 들면, 기준 핵산에 대해 테스트 핵산을 비교할 때 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 또는 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만인 경우, 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 간주된다.

"~에 선택적으로 (또는 특이적으로) 하이브리드화한다"라는 어구는 서열이 복합 혼합물 (전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 중에 존재하는 경우, 엄격한 하이브리드화 조건하에서 특정 뉴클레오티드 서열에만 분자를 결합시키거나, 이중체를 형성하거나, 하이브리드화하는 것을 의미한다.

"엄격한 하이브리드화 조건"이란 어구는 당업계에 공지된 바와 같이 낮은 이온 강도 및 고온 조건하에서 이루어진 DNA, RNA, PNA, 또는 다른 핵산 모의체, 또는 그의 조합물의 서열의 하이브리드화를 지칭한다. 전형적으로, 엄격한 조건하에서, 프로브는 핵산의 복합 혼합물(전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 중의 그의 표적 서브서열에 하이브리드화하지만, 복합 혼합물 중의 다른 서열에는 하이브리드화하지 않는다. 엄격한 조건은 서열 의존성이고, 상이한 환경 중에서는 상이할 수 있다. 서열이 길수록 특이적으로 더 높은 온도에서 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 가이드는 문헌 [Tijssen , Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization 및 strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 살펴볼 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정해진 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 열적 융점(T_m)보다 약 5-10℃ 낮게 선택된다. T_m은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태에서 표적 서열에 하이브리드화하는 (표적 서열이 과량으로 존재하는 바, T_m에서, 평형 상태에서 프로브의 50%가 존재함) (정해진 이온 강도, pH 및 핵산 농도하의) 온도이다. 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 전형적으로 약 0.01 내지 1.0 M의 나트륨 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 온도가 짧은 프로브 (10 내지 50개의 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 경우, 적어도 약 30℃이고, 긴 프로브 (50개 초과의 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 경우, 적어도 약 60℃인 것일 수 있다. 또한, 엄격한 조건은 탈안정화제, 예를 들면, 포름아미드의 첨가를 사용하여 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 하이브리드화의 경우, 양성 신호는 배경 하이브리드화의 적어도 2배, 임의로 배경 하이브리드화의 10배일 수 있다. 예시적인 엄격한 하이브리드화 조건은 다음과 같을 수 있다: 50% 포름아미드, 5 X SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는 5 X SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션과 65℃에서 0.2 X SSC 및 0.1% SDS로 세척. 이러한 세척은 5, 15, 30, 60, 120분 이상 수행될 수 있다.

본원에서 사용된 "진핵생물"이란 용어는 계통발생적 도메인 진핵생물류, 예를 들면, 동물(포유동물, 곤충, 파충류, 조류 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 섬모충, 식물(외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물, 해조류 등을 포함하나, 이에 한정되 지 않는다), 진균, 효모, 편모충, 미포자충, 원생생물 등에 속하는 유기체를 지칭한다.

본원에서 사용된 "비진핵생물"이란 용어는 비진핵생물 유기체를 지칭한다. 예를 들면, 비진핵생물 유기체는 진정세균(에스케리치아 콜라이, 써머스 써모필러스(Thermos thermophilus), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 계통발생적 도메인, 또는 고세균(메타노코커스 잔나스키이(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움(Halobacterium), 예를 들면, 할로페락스 볼카니이(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아키오글로부스 풀기더스(Archaeoglobus fulgidus), 피로코쿠스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus), 피로코쿠스 호리코시이(Pyrococcus horikoshii), 오로피룸 페르닉스(Aeuropyrum pernix) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 계통발생적 도메인에 속할 수 있다.

본원에서 사용된 "피험체"란 용어는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물, 몇몇 실시태양에서는, 포유동물, 및 다른 실시태양에서는 인간을 지칭한다. 동물은 반려 동물(예로서, 개, 고양이 등), 가축(예로서, 소, 양, 돼지, 말 등) 또는 실험실용 동물(예로서, 래트, 마우스, 기니 피그 등)일 수 있다.

본원에서 사용된 "유효량"이란 용어는 치료되는 질환, 병증, 또는 질병의 증 상 중 하나 이상을 어느 정도로 경감시키는 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드의 투여량을 지칭한다. 본원에 기술된 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예방 치료, 증강 치료 및/또는 치료학적 치료의 목적으로 투여될 수 있다.

"증강시키다" 또는 "증강"이란 용어는 원하는 효과의 효능 또는 기간을 증가시키거나, 연장시키는 것을 의미한다. 따라서, 치료제의 효과를 증강시키는 것과 관련하여, "증강"이란 용어는 한 시스템에 대한 다른 치료제 효과의 효능 또는 기간을 증가시키거나, 연장시킬 수 있는 능력을 지칭한다. 본원에서 사용된 "증강 유효량"은 원하는 시스템에서 또다른 치료제의 효과를 증강시키는데 적합한 양을 지칭한다. 환자에게 사용되는 경우, 이러한 용도에 유효한 양은 질환, 질병, 또는 병증의 중증도 및 진행 과정, 이전 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응 및 치료하는 의사의 판단에 따라 좌우된다.

본원에서 사용된 "변형된"이란 용어는 예를 들면, 폴리펩티드 길이, 아미노산 서열, 화학 구조, 공번역 변형, 또는 폴리펩티드의 번역 후 변형에 대한 변화와 같이, 주어진 폴리펩티드에 대해 이루어진 임의의 변화를 지칭하는 것이다. "(변형된)"의 형태를 갖는 용어는 논의되는 폴리펩티드가 임의로 변형된 것인, 즉, 논의 중인 폴리펩티드가 변형되거나, 변형되지 않을 수 있다는 것을 의미한다.

"번역 후 변형된"이란 용어는 폴리펩티드 쇄에 도입된 후 천연 또는 비-천연 아미노산에 발생하는 상기 아미노산의 임의의 변형을 지칭한다. 이러한 용어는 오직 예시를 위한 것인 공번역 생체내 변형, 공번역 시험관내 변형(예를 들면, 무세 포 번역 시스템에서의 변형), 번역 후 생체내 변형 및 번역 후 시험관내 변형을 포함한다.

예방학적 적용시, IFN 베타 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 특정 질환, 질병 또는 병증에 걸리기 쉽거나, 걸릴 위험이 있는 환자에게 투여한다. 이러한 양은 "예방학적 유효량"으로 정의된다. 이러한 사용시, 정확한 양은 또한 환자의 건강 상태, 체중 등에 따라 좌우된다. 통상의 실험(예를 들면, 용량 증가 임상 시험)에 의해서 이러한 예방학적 유효량을 결정하는 것은 당업계의 지식 내에 속하는 것으로 고려된다.

"보호된"이란 용어는 특정 반응 조건하에서 화학적 반응성 작용기의 반응을 방지하는 "보호기" 또는 부분의 존재를 지칭한다. 보호기는 보호되는 화학적 반응기의 유형에 따라 변화한다. 예를 들면, 화학적 반응기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 t-부틸옥시카르보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)의 군으로부터 선택될 수 있다. 화학적 반응기가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딜디설피드일 수 있다. 화학적 반응기가 카르복실산, 예를 들면, 부탄산 또는 프로피온산, 또는 하이드록실 기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예를 들면, 메틸, 에틸, 또는 t-부틸일 수 있다. 또한, 예를 들면, Nvoc 및 MeNvoc와 같은 광분해성 기를 비롯한, 당업계에 공지된 다른 보호기들도 본원에 기술된 방법 및 조성물에 또는 그와 함께 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 다른 보호기들도 본원에 기술된 방법 및 조성물에 또는 그와 함께 사용될 수 있다.

단지 일례로서, 차단기/보호기는 하기로부터 선택될 수 있다:

다른 보호기는 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999](그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

치료학적 적용시, 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 함유하는 조성물을 이미 질환, 병증 또는 질병을 앓고 있는 환자에게 질환, 질병 또는 병증의 증상을 치유하거나, 적어도 부분적으로 정지시키기 충분한 양으로 투여한다. 이러한 양은 "치료학적 유효량"으로 정의되고, 질환, 질병, 또는 병증의 중증도 및 과정, 이전 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응 및 치료하는 의사의 판단에 따라 좌우된다. 이러한 치료학적 유효량을 통상의 실험(예를 들면, 투여량 증가 임상 시험)에 의한 결정하는 것은 당업계의 지식 내에 속하는 것으로 고려된다.

"치료하다"라는 용어는 예방학적 치료 및/또는 치료학적 치료를 지칭하는데 사용된다.

본원에 제시된 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩티드는 하나 이상의 원자가 천연 상태에서 통상적으로 발견되는 원자량 또는 질량수와 상이한 원자량 또는 질량수를 갖는 원자로 치환된 동위원소 표지 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물 내로 도입될 수 있는 동위원소의 예는 각각 예를 들면, ²H, ³H, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁷O, ³⁵S, ¹⁸F, ³⁶Cl과 같은 수소, 탄소, 질소, 산소, 불소 및 염소의 동위원소를 포함한다. 본원에 기술된 특정의 동위원소 표지 화합물, 예를 들면, ³H 및 ¹⁴C와 같은 방사성 동위원소가 도입된 화합물은 약물 및/또는 기질 조직 분포 분석에 유용할 수 있다. 추가로, 중수소, 즉, ²H와 같은 동위원소로의 치환은 보다 큰 대사 안정성, 예를 들어, 생체내 반감기 증가 또는 투여량 요구 감소로부터 비롯된 특정의 치료학적 장점을 제공할 수 있다.

디아스테레오머, 에난티오머, 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 모든 이성체가 본원에 기술된 조성물의 일부인 것으로서 간주된다. 첨가적인 또는 추가의 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩티드는 그를 필요로 하는 유기체에게 투여될 때 대사되어 대사산물을 생성하고, 이 대사산물은 원하는 치료학적 효과를 비롯한 원하는 효과를 얻는데 사용된다. 추가의 또는 첨가적인 실시태양에는 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩티드의 활성 대사산물이 존재한다.

몇몇 상황에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩티드는 토토머로서 존재할 수 있다. 또한, 본원에 기술된 비천연적으로 코딩된 아미노산 폴리펩티드는 비용매화된 형태 뿐만 아니라, 예를 들면, 물, 에탄올 등과 같은 약제학적으로 허용되는 용매와의 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 용매화된 형태 또한 본원에 개시되어 있는 것으로 간주된다. 당업계의 숙련인은 본원의 화합물 중 일부는 수개의 토토머 형태로 존재할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그러한 토토머 형태 모두 본원에 기술된 조성물의 일부로서 간주된다.

달리 언급이 없는 한, 질량 분광분석법, NMR, HPLC, 단백질 화학법, 생화학법, 재조합 DNA 기법 및 약리학적 기법과 같은 통상적인 방법이 사용된다.

발명의 상세한 설명

I. 도입

적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 IFN 베타 분자를 본 발명에서 제공한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드는 적어도 하나의 번역 후 변형을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 번역 후 변형은 제2 반응기를 포함하는 표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 방사성 핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 당질, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 당류, 수용성 덴드리머, 사이클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생체물질, 나노 입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사능 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드(photocaged) 부분, 화학선 방사 여기 부분, 광이성화 가능한 부분, 비오틴, 비오틴 유도체, 비오틴 유사체, 중원자 도입 부분, 화학적으로 절단 가능한 기, 광절단 가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소 연결 당, 산화환원 활성 제제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위 원소로 표지된 부분, 생체물리적 프로브, 인광성 기, 화학발광성 기, 전자 밀집 기, 자성 기, 인터칼레이팅 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 양자점, 나노트랜스미터, 방사성뉴클레오티드, 방사성트랜스미터, 중성자 포획제, 또는 상기 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 분자를 특정 반응기에 적합한 것으로 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 화학 방법론을 사용하여 제1 반응기를 포함하는 적어도 하나의 비천연 아미노산에 부착시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 제1 반응기는 알키닐 부분(비천연 아미노산 중 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 여기서 프로파르길 기는 때때로 아세틸렌 부분로도 지칭된다)이고, 제2 반응기는 아지도 부분이고, [3+2] 사이클로첨가 화학 방법론이 사용된다. 또다른 예에서, 제1 반응기는 아지도 부분(비천연 아미노산 중의 p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)이고, 제2 반응기는 알키닐 부분이다. 본 발명의 변형된 IFN 베타 폴리펩티드의 특정 실시태양에서, 적어도 하나의 번역 후 변형을 포함하는 적어도 하나의 비천연 아미노산(케토 작용기를 함유하는 비천연 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)은 적어도 하나의 번역 후 변형이 당류 부분을 포함하는 경우, 사용된다. 특정 실시태양에서, 번역 후 변형은 진핵세포 또는 비진핵세포 중 생체내에서 이루어진다. 링커, 중합체, 수용성 중합체, 또는 다른 분자는 상기 분자를 폴리펩티드에 부착시킬 수 있다. 상기 분자는 폴리펩티드에 직접 연결될 수 있다.

특정 실시태양에서, 단백질은 하나의 숙주 세포에 의해 생체내에서 이루어지는 적어도 하나의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서, 번역 후 변형은 보통 또다른 숙주 세포 유형에 의해서는 이루어지지 않는다. 특정 실시태양에서, 단백질은 진핵세포에 의해 생체내에서 이루어지는 적어도 하나의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서, 번역 후 변형은 보통 비진핵세포에 의해서는 이루어지지 않는다. 번역 후 변형의 예는 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 당지질 결합 변형 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 폴리펩티드의 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 또는 당지질 결합 변형을 위한 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 폴리펩티드의 글리코실화를 위한 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 폴리펩티드의 글리코실화, 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 또는 당지질 결합 변형을 위한 하나 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 폴리펩티드의 글리코실화를 위한 하나 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 폴리펩티드의 글리코실화를 증강시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 첨가 및/또는 치환을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 폴리펩티드의 글리코실화를 증강시키는 하나 이상의 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 폴리펩티드 중 상이한 아미노산에서의 글리코실화를 증강시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 첨가 및/또는 치환을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 폴리펩티드 중 상이한 아미노산에서의 글리코실화를 증강시키는 하나 이상의 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 폴리펩티드 중 비천연적으로 코딩된 아미노산에서의 글리코실화를 증강시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 첨가 및/또는 치환을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 폴리펩티드 중 천연적으로 코딩된 아미노산에서의 글리코실화를 증강시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 첨가 및/또는 치환을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 폴리펩티드 중 상이한 아미노산에서의 글리코실화를 증강시키는 하나 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산 첨가 및/또는 치환을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 폴리펩티드 중 천연적으로 코딩된 아미노산에서의 글리코실화를 증강시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 첨가 및/또는 치환을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 폴리펩티드 중 비천연적으로 코딩된 아미노산에서의 글리코실화를 증강시키는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 첨가 및/또는 치환을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 결합에 의해 올리고당을 아스파라긴에 부착시키는 것을 포함한다(올리고당이 (GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc 등을 포함하는 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는다). 또다른 실시태양에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린, GalNAc-트레오닌, GlcNAc-세린, 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 올리고당(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 포함한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드는 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함할 수 있다. 분비 신호 서열의 예로는 원핵 분비 신호 서열, 진핵 분비 신호 서열, 세균 발현을 위해 5' 최적화된 진핵 분비 신호 서열, 신규한 분비 신호 서열, 펙테이트 리아제 분비 신호 서열, Omp A 분비 신호 서열, 및 파지 분비 신호 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 분비 신호 서열의 예로는 STII(원핵), Fd GIII 및 M13(파지), Bgl2(효모), 및 트랜스포존으로부터 유도된 신호 서열 bla를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 하나의 신호 서열을 상이한 신호 서열로 치환하거나, 리더 서열을 상이한 리더 서열로 치환하는 것 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 임의의 상기 서열의 변형을 통해 폴리펩티드에 원하는 결과를 제공할 수 있다.

관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 10개 이상의 비천연 아미노산을 함유할 수 있다. 비천연 아미노산은 동 일하거나, 상이할 수 있으며, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 중에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있다. 특정 실시태양에서, 천연적으로 발생된 버전의 단백질 중에 존재하는 특정 아미노산 중 적어도 하나의, 단, 전체 아미노산보다 적은 수의 아미노산이 비천연 아미노산으로 치환된다.

본 발명은 적어도 하나의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타를 기초로 하는 방법 및 조성물을 제공한다. 적어도 하나의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 IFN 베타에 도입시키는 것은 통상 발생된 20종의 아미노산과는 반응하지 않으면서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과 특이적으로 화학 반응하는 것을 포함하는 접합 화학 작용을 적용할 수 있게 한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄를 통해 수용성 중합체, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 연결되어 있다. 본 발명은 케톤, 아지드 또는 아세틸렌 부분을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 20종의 천연적으로 도입된 아미노산에서는 발견되지 않는 작용기 또는 치환기를 함유하는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 비유전적으로 코딩된 아미노산을 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 단백질 내로 선택적으로 도입하고, 이러한 아미노산을 적합한 반응성을 띠는 PEG 유도체를 사용하여 추후 변형시키는 것을 포함하는 것인, PEG 유도체를 사용하여 단백질을 선택적으로 변형시키는데 매우 효과적인 방법을 제공한다. 일단 도입되면, 이어서, 아미노산 측쇄는 비천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 특정 작용기 또는 치환 기에 적합한 것으로 당업계의 숙련인에게 공지된 화학 방법론을 사용하여 변형될 수 있다. 수용성 중합체를 단백질 내로 도입하는 매우 다양한 공지된 화학 방법론들이 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 이러한 방법론은 각각 아세틸렌 또는 아지드 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과의 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 반응(예를 들면, 문헌 ([Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis , Vol . 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109]; 및 [Huisgen, R. in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176]) 참조)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 방법은 친핵성 치환 반응 이외의 사이클로첨가를 포함하기 때문에, 단백질은 극히 높은 선택성으로 변형될 수 있다. 반응은 실온에서 수성 조건하에 우수한 위치선택성(1,4 > 1,5)으로 촉매량의 Cu(I) 염을 반응 혼합물에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064]; 및 [Rostovtsev, et al., (2002) Angew . Chem . Int . Ed. 41:2596-2599]; 및 WO 03/101972)를 참조한다. [3+2] 사이클로첨가를 통해 본 발명의 단백질에 첨가될 수 있는 분자는 아지도 또는 아세틸렌 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 적합한 작용기 또는 치환기를 갖는 사실상 모든 분자를 포함한다. 이러한 분자들은 각각 p-아지도-페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는 아지도 기, 또는 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는 아세틸렌 기를 갖는 비천연 아미노산에 첨가될 수 있다.

휘스겐 [3+2] 사이클로첨가로부터 생성된 5원 환은 일반적으로 환원 환경에 서는 가역적이지 않고, 장기간 동안 수성 환경에서 가수분해에 대해 안정하다. 결과적으로, 매우 다양한 물질의 물리적 및 화학적 특징은 본 발명의 활성 PEG 유도체를 사용하여 요구되는 수성 조건하에서 변형될 수 있다. 더욱더 중요하게는, 아지드 및 아세틸렌 부분이 서로 특이적(그리고, 예를 들면, 20종의 유전적으로 코딩된 일반 아미노산 중 어느 것과도 반응하지 않는다)이기 때문에, 단백질은 극히 높은 선택성으로 하나 이상의 특이 부위에서 변형될 수 있다.

본 발명은 또한 하나 이상의 아세틸렌 또는 아지드 부분을 갖는 PEG 유도체 및 관련된 친수성 중합체의, 수용성이며 가수분해에 안정한 유도체를 제공한다. 아세틸렌 부분을 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 단백질 내로 선택적으로 도입된 아지드 부분과의 커플링에 매우 선택적이다. 유사하게, 아지드 부분을 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 단백질 내로 선택적으로 도입된 아세틸렌 부분의 커플링에 매우 선택적이다.

더욱 특히 아지드 부분은 알킬 아지드, 아릴 아지드 및 이들 아지드의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 알킬 및 아릴 아지드의 유도체는 아세틸렌 특이 반응성이 유지되는 한 다른 치환기를 포함할 수 있다. 아세틸렌 부분은 알킬 및 아릴 아세틸렌 및 그들 각각의 유도체를 포함한다. 알킬 및 아릴 아세틸렌의 유도체는 아지드 특이 반응성이 유지되는 한 다른 치환기를 포함할 수 있다.

본 발명은 매우 다양한 작용기, 치환기 또는 부분을 갖는 물질과, 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 방사성 핵종; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 보조인자; 지방산; 당질; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류; 수용성 덴드리머; 사이클로덱스트린; 억제성 리보핵산; 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광발색단, 금속 함유 부분; 방사능 부분; 신규한 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 포토케이지드 부분; 화학선 방사 여기 부분; 광이성화 가능한 부분; 비오틴; 비오틴 유도체; 비오틴 유사체; 중원자 도입 부분; 화학적으로 절단 가능한 기; 광절단 가능한 기; 신장된 측쇄; 탄소 연결 당; 산화환원 활성 제제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위 원소로 표지된 부분; 생체물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 양자점; 나노트랜스미터; 방사성뉴클레오티드; 방사성트랜스미터; 중성자 포획제; 또는 상기 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 물질의 접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 아지드 또는 아세틸렌 부분을 갖는 물질과 상응하는 아세틸렌 또는 아지드 부분을 갖는 PEG 중합체 유도체의 접합체를 포함한다. 예를 들면, 아지드 부분을 함유하는 PEG 중합체는 아세틸렌 관능기를 함유하는 비유전적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 단백질 중의 위치에서 생물학적 활성 분자에 커플링될 수 있다. PEG 및 생물학적 활성 분자를 커플링시키는 결합으로는 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 생성물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

PEG가 생체물질의 표면을 변형시키는데 사용될 수 있다는 점은 당업계에 잘 정립되어 있다(예를 들면, 예로서, 미국 특허 6,610,281; 문헌 [Mehvar, R., J. Pharmaceut. Sci., 3(1); 125-136 (2000)](본원에서 참고로 인용된다) 참조). 또한, 본 발명은 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 결합을 통해 표면에 커플링된 본 발명의 아지드 함유 중합체 또는 아세틸렌 함유 중합체 중 하나 이상, 및 하나 이상의 반응성 아지드 또는 아세틸렌 부위를 갖는 표면을 포함하는 생체물질을 포함한다. 생체물질 및 다른 물질들은 또한 아지드 또는 아세틸렌 결합 이외의 결합, 예를 들면, 카르복실산, 아민, 알코올 또는 티올 부분을 포함하는 결합을 통해 아지드 활성화된 중합체 유도체 또는 아세틸렌 활성화된 중합체 유도체에 커플링되어 후속 반응에 이용가능한 아지드 또는 아세틸렌 부분을 남길 수 있다.

본 발명은 본 발명의 아지드 함유 중합체 또는 아세틸렌 함유 중합체를 합성하는 방법을 포함한다. 아지드 함유 PEG 유도체의 경우, 아지드는 중합체의 탄소 원자에 직접 결합될 수 있다. 별법으로, 아지드 함유 PEG 유도체는 생성된 중합체가 그의 말단에서 아지드 부분을 갖도록 하나의 말단에서 아지드 부분을 갖는 결합제를 통상적인 활성화된 중합체에 부착시킴으로써 제조될 수 있다. 아세틸렌 함유 PEG 유도체의 경우, 아세틸렌은 중합체의 탄소 원자에 직접 결합할 수 있다. 별법으로, 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 생성된 중합체가 그의 말단에서 아세틸렌 부분을 갖도록 하나의 말단에서 아세틸렌 부분을 갖는 결합제를 통상적인 활성화된 중합체에 부착시킴으로써 제조될 수 있다.

더욱 특히 아지드 함유 PEG 유도체의 경우, 적어도 하나의 활성 하이드록실 부분을 갖는 수용성 중합체는 그 위에 더욱 반응성을 띠는 부분, 예를 들면, 메실 레이트, 트레실레이트, 토실레이트 또는 할로겐 이탈기를 갖는 치환된 중합체를 생성하는 반응을 수행한다. 설포닐 산 할라이드, 할로겐 원자 및 다른 이탈기를 함유하는 PEG 유도체의 제조 및 용도는 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 이어서, 생성된 치환된 중합체는 중합체의 말단에서 더욱 반응성을 띠는 부분을 대신하여 아지드 부분으로 치환하는 반응을 수행한다. 별법으로, 적어도 하나의 친핵성 또는 친전자성 활성 부분을 갖는 수용성 중합체는 공유 결합이 PEG 중합체와 결합제 사이에서 형성되고, 아지드 부분이 중합체의 말단에 위치하도록 하나의 말단에서 아지드를 갖는 결합제와 반응을 수행한다. 아민, 티올, 히드라지드, 히드라진, 알코올, 카르복실레이트, 알데히드, 케톤, 티오에스테르 등을 비롯한 친핵성 및 친전자성 부분은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다.

더욱 특히 아세틸렌 함유 PEG 유도체의 경우, 적어도 하나의 활성 하이드록실 부분을 갖는 수용성 중합체는 아세틸렌 부분을 함유하는 전구체로부터 할로겐 또는 다른 활성화된 이탈기를 옮겨 놓는 반응을 수행한다. 별법으로, 적어도 하나의 친핵성 또는 친전자성 활성 부분을 갖는 수용성 중합체는 공유 결합이 PEG 중합체와 결합제 사이에서 형성되고, 아세틸렌 부분이 중합체의 말단에 위치하도록 하나의 말단에서 아세틸렌를 갖는 결합제와 반응을 수행한다. 유기 합성과 관련한 할로겐 부분, 활성화된 이탈기, 친핵성 및 친전자성 부분의 용도 및 PEG 유도체의 제조 및 용도 역시 당업계에 숙련인에게 잘 정립되어 있다.

본 발명은 또한 수용성 중합체, 예를 들면, 아지드 또는 아세틸렌 부분을 함유하는 PEG 및 PEG 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 변형된 단백질에 다른 물질을 첨가하는 단백질의 선택적 변형 방법을 제공한다. 생체적합성, 안정성, 가용성, 및 면역원성 결여가 중요하고, PEG 유도체를 단백질에 부착시키는 수단에 있어 동시에 종래 당업계에 공지된 것보다 더욱 선택적인 수단을 제공하는 경우, 아지드 함유 PEG 유도체 및 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 표면 및 분자의 특성을 변형시키는데 사용될 수 있다.

II . 인터페론 베타

IFNβ의 시판용 제제는 다발성 경화증의 악화 속도를 감소시키는데 효과적인 것으로 나타으며, 위약으로 치료받은 환자와 비교하였을 때 더 많은 환자가 장기간 동안 악화되지 않은 상태로 남아있었다. 추가로, 장애의 누적 속도가 감소한다(문헌 [Neurol. 51:682-689, 1998]). 현재 3개의 제품이 베타세론(Betaseron)^®(재조합 세균 세포를 사용하여 생산되고, 비글리코실화된 것으로서, N 말단 메티오닌 잔기의 결실과 C17S 돌연변이를 갖는 인터페론 β1b), 및 아보넥스(Avonex)^® 및 레비프(Rebif)^®(재조합 포유동물 세포를 사용하여 생산되고 글리코실화된 인터페론 β1a)라는 이름으로 시판되고 있다.

IFN 계열의 추가 구성원이 추후에도 발견될 가능성이 있다. IFN 계열의 신규 구성원은 예측되는 단백질 서열의 2차 및 3차 구조의 컴퓨터 보조 분석을 통해, 및 특정 표적에 결합하는 분자를 확인하도록 디자인된 선별 기법에 의해 확인할 수 있다.

따라서, IFN 계열에 관한 설명은 예시적인 목적으로 단지 일례로서 제공되는 것이며, 본원에 기술된 방법, 조성물, 전략법 및 기법의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다. 추가로, 본 출원에서 IFN 베타에 관한 언급은 IFN 계열의 임의의 구성원들 중의 일례로서 일반명으로 사용하고자 하는 것이다. 따라서, IFN 베타 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여 본원에 기술된 변형 및 화학 작용은 본원에 구체적으로 열거된 것을 비롯한 IFN 계열의 임의의 구성원들에게 동일하게 적용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

III . 본 발명에 사용하기 위한 일반적 핵산 재조합 방법

본 발명의 다수의 실시태양에서, 관심의 대상이 되는 IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 단리시키고, 클로닝하고, 종종, 재조합 방법을 사용하여 변경시킬 것이다. 이러한 실시태양은 단백질 발현시 또는 변이체, 유도체, 발현 카세트, 또는 IFN 베타 폴리펩티드로부터 유도된 다른 서열 생성시를 포함하나, 이에 한정되지 않는 경우에 사용된다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된다.

비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1, 3, 4에 나타낸 아미노산 서열을 갖고, 이어서, 관련 아미노산 잔기(들)를 도입(즉, 도입 또는 치환) 또는 제거(즉, 결실 또는 치환)하기 위해 뉴클레오티드 서열을 변화시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 모체 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 합성될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 통상적인 방법에 따라 부위 지정 돌연변이 유발법에 의해 편리하게 변형될 수 있다. 별법으로, 뉴클레오티드 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있으며, 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기초로 하여 디자인되며, 바람직하게는, 재조합 폴리펩티드가 생성된 숙주 세포에서 유리한 코돈을 선택한다. 예를 들면, 원하는 폴리펩티드 부분에 대한 몇몇의 소형 올리고뉴클레오티드 코딩은 PCR, 결찰 또는 결찰 연쇄 반응에 의해 합성되고, 조립될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Barany, et al., Proc . Natl . Acad . Sci. 88: 189-193(1991)]; 미국 특허 6,521,427(본원에서 참고로 인용된다)을 참조한다.

본 발명은 재조합 유전학 분야의 통상의 기법을 사용한다. 본 발명에 사용되는 일반 방법을 개시하는 기본서로는 문헌 ([Sambrook et al., Molecular Cloning , Laboratory Manual (3rd ed. 2001)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., eds., 1994)])을 포함한다.

분자 생물학적 기법을 설명하는 일반 교재로는 문헌 ([Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques , Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA(Berger)]; [Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2 nd Ed .), Vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989("Sambrook")] 및 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999)("Ausubel")])을 포함한다. 이러한 교재 들은 비천연 아미노산, 오르토고날 tRNA, 오르토고날 합성효소, 및 그들의 쌍을 포함하는 단백질을 생산하기 위한 셀렉터 코돈을 포함하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과 관련된 돌연변이 유발법, 벡터의 용도, 프로모터 및 많은 다른 관련 주제를 기재하고 있다.

다양한 유형의 돌연변이 유발법은 신규한 합성효소 또는 tRNA의 제조, tRNA 분자의 돌연변이화, 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 돌연변이화, tRNA의 라이브러리 생성, 합성효소의 라이브러리 생성, 셀렉터 코돈 생성, 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드 중의 비천연 아미노산을 코딩하는 셀렉터 코돈 삽입을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 본 발명에서 사용된다. 이들은 부위 지정, 무작위 점 돌연변이 유발법, 상동성 재조합, DNA 셔플링 또는 다른 반복적 돌연변이유발 방법, 키메라 구성, 우라실 함유 주형을 사용한 돌연변이 유발법, 올리고뉴클레오티드 지정 돌연변이 유발법, 포스포로티오에이트 변형 DNA 돌연변이 유발법, 갭을 갖는 이중체 DNA를 사용한 돌연변이 유발법 등, PCT 매개 돌연변이 유발법, 또는 그의 임의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가의 적절한 방법은 점 미스매치 수복법, 수복 결함 숙주 균주를 사용한 돌연변이 유발법, 제한 선택 및 제한 정제법, 결실 돌연변이 유발법, 전체 유전자 합성에 의한 돌연변이 유발법, 더블 스트랜드 파괴 수복법 등을 포함한다. 키메라 구성체를 사용하는 돌연변이 유발법을 포함하나, 이에 한정되지 않는 돌연변이 유발법도 본 발명에 포함된다. 하나의 실시태양에서, 돌연변이 유발법은 서열, 서열 비교, 물리적 특성, 2차, 3차, 또는 4차 구조, 결정 구조 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 천연적으로 발생된 분자, 또는 변경된 또는 돌연변이화된 천연적으로 발생된 분자의 공지된 정보를 지침으로 할 수 있다.

본원에서 살펴볼 수 있는 기재된 문헌 및 예에는 이러한 방법들이 기재되어 있다. 추가 정보는 하기 공보 및 이러한 공보에 인용된 참고 문헌에서 살펴볼 수 있다: 문헌 ([Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis : an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997)]; [Dale et al., Oligonucleotide - directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol . Biol . 57:369-374 (1996)]; [Smith, In vitro mutagenesis , Ann . Rev . Genet. 19:423-462 (1985)]; [Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985)]; [Carter, Site - directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986)]; [Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J, eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)]; [Kunkel, Rapid and efficient site - specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82:488-492 (1985)]; [Kunkel et al., Rapid and efficient site - specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)]; [Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA - binding specificities, Science 242:240-245 (1988)]; [Zoller & Smith, Oligonucleotide - directed mutagenesis using M13 - derived vectors : an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982)]; [Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)]; [Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis : a simple method using two oligonucleotide primers and a single - stranded DNA template, Methods in Enzvmol. 154:329-350 (1987)]; [Taylor et al., The use of phosphorothioate -modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl . Acids Res . 13: 8749-8764 (1985)]; [Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide- directed mutations at high frequency using phosphorothioate -modified DNA, Nucl . Acids Res. 13: 8765-8785 (1985)]; [Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide - directed mutagenesis, Nucl . Acids Res . 14: 9679-9698 (1986)]; [Sayers et al., 5'-3 ' Exonu cleases in phosphorothioate-based oligonucleotide - directed mutagenesis, Nucl . Acids Res. 16:791-802 (1988)]; [Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence ofethidium bromide, (1988) Nucl . Acids Res. 16:803-814]; [Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide - directed mutation construction, Nucl . Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)]; [Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987)]; [Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide -directed construction of mutations, Nucl . Acids Res. 16:7207 (1988)]; [Fritz et al., Oligonucleotide - directed construction of mutations : a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl . Acids Res. 16: 6987-6999 (1988)]; [Kramer et al., Different base / base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl - directed DNA mismatch -repair system of E. coli, Cell 38:879-887 (1984)]; [Carter et al., Improved oligonucleotide site - directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl . Acids Res. 13: 4431-4443 (1985)]; [Carter, Improved oligonucleotide - directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)]; [Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl . Acids Res. 14: 5115 (1986)]; [Wells et al., Importance of hydrogen - bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil . Trans . R. Soc . Lond . A 317: 415-423 (1986)]; [Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein , Science 223: 1299-1301 (1984)]; [Sakmar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha -subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide - binding protein (transducin), Nucl . Acids Res . 14: 6361-6372 (1988)]; [Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985)]; [Grundstrom et al., Oligonucleotide -directed mutagenesis by microscale ' shot - gun ' gene synthesis, Nucl . Acids Res. 13: 3305-3316 (1985)]; [Mandecki, Oligonucleotide - directed double - strand break repair in plasmids of Escherichia coli : a method for site - specific mutagenesis, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 83:7177-7181 (1986)]; [Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993)]; [Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001)]; [W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994)]; 및 [I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)]). 상기의 여러 방법들에 관한 추가 설명은 문헌 [Methods in Enzymology Volume 154]에서 찾아볼 수 있는데, 이 문헌은 또한 다양한 돌연변이 유발 방법과 관련된 문제 해결을 위한 유용한 제어법을 기술하고 있다.

예로서, 본 발명의 돌연변이 유발법에서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 합성효소의 라이브러리를 돌연변이화시키거나, tRNA를 변경시키는데 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 예를 들면, 문헌 [Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984)]에 기재되어 있는 바와 같이 자동 합성기를 사용하여 문헌 [Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20): 1859-1862, (1981)]에 기재되어 있는 고체상 포스포라미다이트 트리에스테르 방법에 따라 화학적으로 합성된다.

본 발명은 또한 오르토고날 tRNA/RS 쌍을 통한 비천연 아미노산의 생체내 도 입을 위한 진핵 숙주 세포, 비진핵 숙주 세포 및 유기체에 관한 것이다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명의 벡터(예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다)를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구성체에 의해 유전공학적으로 처리된다(형질전환, 형질도입 또는 형질감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다). 예를 들면, 오르토고날 tRNA, 오르토고날 tRNA 합성효소, 및 유도체화시키고자 하는 단백질에 대한 코딩 영역은 원하는 숙주 세포에서 기능성인 유전자 발현 제어 요소에 작동가능하게 연결된다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지, 세균, 바이러스, 나형 폴리뉴클레오티드 또는 접합화된 폴리뉴클레오티드의 형태일 수 있다. 벡터는 전기천공법(문헌 [Fromm et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 82, 5824(1985)]), 바이러스 벡터에 의한 감염, 소형 비드 또는 입자로 된 매트릭스 내에 또는 표면 상에 핵산을 갖는 소립자에 의한 고속 탄도 침투(문헌 [Klein et al., Nature 327, 70-73(1987)) 등을 비롯한 표준 방법에 의해 세포 및/또는 미생물 내로 도입된다. 시험관내에서 핵산을 세포 내로 전이시키는데 적합한 기법으로는 리포좀, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등을 포함한다. 생체내 유전자 전이 기법으로는 바이러스(전형적으로 레트로바이러스) 벡터를 사용하는 형질감염 및 바이러스 피복 단백질 리포좀 매개 형질감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(문헌 [Dzau et al., Trends in Biotechnology 11:205-210(1993)]). 몇몇 상황하에서는, 표적 세포를 표적하는 제제, 예를 들면, 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등과 함께 핵산 공급원을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 리포좀을 사용하는 경우, 표적화를 위해 및/또는 흡수 촉진을 위해 세포내이입과 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질, 예로서, 특정 세포 유형에 대하여 향성을 갖는 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시에 내재화되는 단백질에 대한 항체, 세포내 국소화를 표적하고 세포내 반감기를 증강시키는 단백질을 사용할 수 있다.

공학처리된 숙주 세포는 예를 들면, 단계를 스크리닝하거나, 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선별하는 것과 같이 상기 활성에 적합하게 변형된 통상의 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 이들 세포는 임의로 트랜스제닉 유기체로 배양될 수 있다. 세포 단리 및 배양(예를 들면, 후속 핵산 단리를 위한 배양)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것에 대한 다른 유용한 참조 문헌은 문헌 [Freshney(1994) Culture of Animal Cells , Manual of Basic Technique , third edition, Wiley-Liss, New York] 및 여기에 인용된 참조 문헌; ([Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY]; [Gamborg and Phillips(eds.)(1995) Plant Cell , Tissue and Organ Culture]; [Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer- Verlag(Berlin Heidelberg New York) and Atlas and Parks(eds.) The Handbook of Microbiological Media(1993) CRC Press, Boca Raton, FL])을 포함한다.

표적 핵산을 세포 내로 도입시키는 몇몇 공지된 방법이 이용가능하며, 이들 중 임의의 것이 본 발명에 사용될 수 있다. 이들은 수용 세포와 DNA를 함유하는 세균 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격, 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 (또한, 하기에서 추가로 논의된다) 등을 포함한다. 세균 세포를 본 발명의 DNA 구성체를 함유하는 다수의 플라스미드를 증폭시키는데 사용할 수 있다. 세균은 대수증식기까지 성장하고, 세균 내의 플라스미드는 당업계에 공지된 다양한 방법 (예를 들면, 문헌 [Sambrook] 참조)에 의해 단리될 수 있다. 또한, 세균으로부터 플라스미드를 정제하기 위한 수많은 키트가 상업적으로 이용가능하다(예를 들면, 둘 모두 Pharmacia Biotech로부터 입수되는 EasyPrep™, FlexiPrep™; Stratagene으로부터 입수되는 StrataClean™; 및 Qiagen으로부터 입수되는 QIAprep™). 이어서, 단리되고 정제된 플라스미드를 추가로 조작하여 다른 플라스미드를 제조하거나, 세포를 형질감염시키는데 사용하거나, 유기체를 감염시키기 위해 관련 벡터 내로 도입한다. 전형적인 벡터는 전사 및 번역 종결자, 전사 및 번역 개시 서열, 및 특정 표적 핵산의 발현 조절에 유용한 프로모터를 포함한다. 벡터는 임의로 적어도 하나의 독립된 종결자 서열, 진핵생물, 또는 원핵생물 또는 그 둘 모두에서 카세트의 복제를 가능하게 하는 서열(셔틀 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 및 원핵 및 진핵 시스템 둘 모두에 대한 선별 마커를 포함하는 범용 발현 카세트를 포함한다. 벡터는 원핵생물, 진핵생물 또는 그 둘 모두에 있어서 복제 및 통합에 적합하다. 문헌 ([Gillam & Smith, Gene 8:81(1979)]; [Roberts, et al, Nature , 328:731(1987)]; [Schneider, E., et al, Protein Expr . Purif. 6(1):10-14(1995)]; [Ausubel, Sambrook, Berger(모두 상기 문헌 동일)])를 참조한다. 클로닝에 유용한 세균 및 박테리오파지의 카탈로그는, 예를 들어, ATCC에 의해 제공되며, 그 예로는 ATCC가 발행한 카탈로그 [The ATCC Catalogue of bacteria and bacteriophage (1992) Gherna et al., (eds)]가 있다. 또한, 서열 분석, 클로닝 및 분자생물학의 다른 측면에 대한 추가 기본 방법 및 기초적인 이론적 고려사항은 문헌 [Watson et al., (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY]에서 살펴볼 수 있다. 또한, 본질적으로 임의의 핵산(및 표준 또는 비표준이든 간에 사실상 어떠한 표지된 핵산도) 다양한 임의의 상업적 공급업체로부터, 예를 들어, 미드랜드 써티파이드 리에이전트 컴퍼니(Midland Certified Reagent Company)(텍사스주 미드랜드 소재, 월드 와이드 웹 상의 mcrc.com에서 이용가능), 더 그레이트 아메리칸 진 컴퍼니(The Great American Gene Company)(캘리포니아주 라모마 소재, 월드 와이드 웹 상의 genco.com에서 이용가능), 익스프레스젠 인크.(ExpressGen Inc.)(일리노이주 시카고 소재, 월드 와이드 웹 상의 expressgen.com에서 이용가능), 오페론 테크놀로지스 인크.(Operon Technologies Inc.)(캘리포니아주 알라메다 소재) 및 많은 다른 공급업체로부터 맞춤 주문 또는 일반 주문할 수 있다.

셀렉터 코돈

본 발명의 셀렉터 코돈은 단백질 생합성 기구의 유전자 코돈 골격구조를 확장시킨다. 예를 들어, 셀렉터 코돈은 특이한 3 염기 코돈, 넌센스 코돈, 예를 들면, 앰버 코돈(UAG), 오커 코돈, 또는 오팔 코돈(UGA)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 정지 코돈, 비천연 코돈, 4 이상의 염기 코돈, 희귀 코돈 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. IFN 베타 폴리펩티드의 적어도 일부를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드에서 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상을 포 함하나, 이에 한정되지 않는 갯수 범위가 매우 광범위한 셀렉터 코돈이 원하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 내로 도입될 수 있다는 것이 당업계의 숙련인에게는 명백히 이해될 것이다.

하나의 실시태양에서, 본 방법은 하나 이상의 비천연 아미노산을 생체내로 도입하기 위한 정지 코돈인 셀렉터 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, UAG를 포함하나, 이에 한정되지 않는 정지 코돈을 인식하는 O-tRNA가 생산되고, O-RS에 의해 원하는 비천연 아미노산으로 아미노아실화된다. 이러한 O-tRNA는 천연적으로 발생된 숙주의 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해서는 인식되지 않는다. 통상의 부위 지정 돌연변이 유발법을 사용하여 관심의 대상이 되는 폴리펩티드 내의 관심의 대상이 되는 부위에, TAG를 포함하나, 이에 한정되지 않는 정지 코돈을 도입할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Sayers, J.R., et al. (1988), 5'-3 ' Exonucleases in phosphorothioate - based oligonucleotide - directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16:791-802]를 참조한다. O-RS, O-tRNA, 및 관심의 대상이 되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 생체내에서 조합되는 경우, 비천연 아미노산은 UAG 코돈에 대한 반응으로 도입되어 특정 위치에서 비천연 아미노산을 함유하는 폴리펩티드를 제공한다.

비천연 아미노산을 생체내에서 도입하는 것은 진핵 숙주 세포에 유의적인 혼란없이 수행될 수 있다. 예를 들면, UAG 코돈에 대한 억제 효율은 앰버 서프레서 tRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 O-tRNA와 진핵 방출 인자(eRF를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)(이는 정지 코돈에 결합하고, 리보좀으로부터 성장 펩티드의 방출을 개시한다) 사이의 경쟁에 따라 달라지기 때문에, 이러한 억제 효율은 O-tRNA 및/또는 서프레서 tRNA의 발현 수준을 증가시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것에 의해 조정될 수 있다.

비천연 아미노산은 또한 희귀 코돈을 갖도록 코딩될 수도 있다. 예를 들어, 시험관내 단백질 합성 반응에 있어서 아르기닌 농도를 감소시킬 경우, 희귀 아르기닌 코돈인 AGG가 알라닌에 의해 아실화된 합성 tRNA에 의한 Ala의 삽입에 효율적인 것으로 입증된 바 있다. 예를 들면, 문헌 [Ma et al., Biochemistry. 32:7939(1993)]을 참조한다. 이러한 경우, 합성 tRNA는 에스케리치아 콜라이에서 소수 종으로서 존재하는 천연적으로 발생된 tRNAArg과 경쟁한다. 일부 유기체는 모든 3 염기 코돈을 사용하지는 않는다. 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에 있어서 미지정 코돈인 AGA는 시험관내 전사/번역 추출물 중에서의 아미노산의 삽입에 사용되고 있다. 예를 들면, 문헌 [Kowal and Oliver, Nucl . Acid . Res., 25:4685 (1997)]을 참조한다. 본 발명의 성분들은 생체내에서 이같은 희귀 코돈을 사용하도록 제조될 수 있다.

셀렉터 코돈은 또한 4 이상의 염기 코돈, 예를 들면, 4, 5, 6 이상의 염기 코돈을 포함하나, 이에 한정되지 않는 연장된 코돈을 포함한다. 4 염기 코돈의 예로는 AGGA, CUAG, UAGA, CCCU 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 5 염기 코돈의 예로는 AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 한가지 특징은 프레임쉬프트 억제를 기초로 하여 연장된 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 4 이상의 염기 코돈은 하나 또는 다수의 비천연 아 미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 동일한 단백질 내로 삽입시킬 수 있다. 예를 들면, 안티코돈 루프, 예를 들면, 적어도 8-10 nt의 안티코돈 루프를 갖는 특이 프레임쉬프트 서프레서 tRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 돌연변이화된 O-tRNA의 존재하에서, 4 이상의 염기 코돈은 단일 아미노산으로서 판독된다. 다른 실시태양에서, 안티코돈 루프는 적어도 4 염기 코돈, 적어도 5 염기 코돈, 또는 적어도 6 염기 코돈 또는 그 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것들을 데코딩할 수 있다. 256개의 가능한 4개 염기 코돈이 존재하기 때문에, 다수의 비천연 아미노산은 4 이상의 염기 코돈을 사용하여 동일한 세포에서 코딩될 수 있다. 문헌 ([Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244]; [Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol . Biol. 307: 755-769])를 참조한다.

예를 들면, 4 염기 코돈은 시험관내 생합성 방법을 사용하여 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는데 사용되어 왔다. 예를 들면, 문헌 ([Ma et al., (1993) Biochemistry. 32: 7939]; 및 [Hohsaka et al., (1999) J. Am . Chem . Soc. 121:34])를 참조한다. CGGG 및 AGGU는, 시험관내에서 2개의 화학적으로 아실화된 프레임쉬프트 서프레서 tRNA를 사용하여 2-나프틸알라닌 및 리신의 NBD 유도체를 동시에 스트렙타비딘으로 도입하는데 사용되었다. 예를 들면, 문헌 [Hohsaka et al., (1999) J. Am . Chem . Soc ., 121: 12194-12195]를 참조한다. 생체내 연구에서, (Moore) 등은 NCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu 유도체가 UAGN 코돈(N은 U, A, G 또는 C일 수 있다)을 억제할 수 있는 능력에 관해 조사하였고, 4개의 염기로 구성된 UAGA가 0 또는 -1 프레임에서 거의 데코딩하지 않은 채 13∼26%의 효율로 UCUA 안티코돈을 갖는 tRNALeu에 의해 데코딩될 수 있다는 것을 발견하였다. 문헌 [Moore et al., (2000) J. Mol . Biol., 298:195]를 참조한다. 하나의 실시태양에서, 희귀 코돈 또는 넌센스 코돈을 기초로 하여 연장된 코돈이 본 발명에서 사용될 수 있으며, 이는 원치 않는 다른 부위에서의 미스센스 리드쓰루 및 프레임쉬프트 억제를 감소시킬 수 있다.

또한, 소정의 시스템의 경우, 셀렉터 코돈은 천연 3 염기 코돈 중 하나를 포함할 수 있으며, 여기서, 내인성 시스템은 천연 염기 코돈을 사용하지 않는다(또는 거의 사용하지 않는다). 예를 들어, 이는 천연 3 염기 코돈을 인식하는 tRNA가 결여된 시스템, 및/또는 3 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한다.

셀렉터 코돈은 임의로 비천연 염기쌍을 포함한다. 이들 비천연 염기쌍은 기존의 유전자 알파벳을 추가로 확장시킨다. 추가의 1개 염기쌍은 3 염기 코돈의 수를 64개에서 125개로 증가시킨다. 세번째 염기쌍의 특성은 안정하고 선택적인 염기쌍 형성, 높은 충실도로 폴리머라제에 의한 DNA 내로의 효율적인 효소적 도입, 및 초기 비천연 염기쌍의 합성 후 효율적인 연속 프라이머 연장을 포함한다. 방법 및 조성물에서 채용될 수 있는 비천연 염기쌍에 대한 설명은, 예를 들면, 문헌 [[Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182]를 포함한다. 또한, 문헌 [Wu, Y., et al., (2002) J. Am . Chem . Soc. 124: 14626-14630]을 참조한다. 다른 관련 공보들도 열거되어 있다.

생체내 사용에 있어서는, 비천연 뉴클레오시드는 막 투과성을 지니고 인산화되어 상응하는 트리포스페이트를 형성한다. 또한, 증가된 유전 정보는 안정성이 있고 세포내 효소에 의해 파괴되지 않는다. (Benner) 등에 의해 이루어진 종래의 연구는 정규 왓슨-크릭(Watson-Crick) 쌍에서의 수소 결합 패턴과 상이한 수소 결합 패턴을 사용하였는데, 이 중 가장 주목할 만한 예는 이소-C:이소-G 쌍이다. 예를 들면, 문헌 ([Switzer et al., (1989) J. Am . Chem . Soc . 111:8322]; 및 [Piccirilli et al., (1990) Nature. 343:33]; [Kool, (2000) Curr . Opin . Chem . Biol., 4:602])를 참조한다. 이 염기들은 일반적으로 어느 정도까지 천연 염기와 잘못 쌍을 이루어 효소적으로 복제될 수 없다. (Kool)과 그의 동료들은 염기 사이의 소수성 패킹 상호작용이 수소 결합을 대체하여 염기쌍의 형성을 유도할 수 있다는 것을 입증하였다. 문헌 ([Kool, (2000) Curr . Opin . Chem . Biol ., 4:602]; 및 [Guckian and Kool, (1998) Angew . Chem . Int . Ed . Engl., 36, 2825])를 참조한다. 상기 요건들 모두를 만족시키는 비천연 염기쌍을 개발하기 위한 노력으로, (Schultz), (Romesberg) 및 그 동료들은 일련의 비천연 소수성 염기들을 체계적으로 합성하여 연구하였다. PICS:PICS 자가 쌍은 천연 염기쌍보다 더 안정한 것으로 밝혀졌고, 에스케리치아 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클레나우(Klenow) 단편(KF)에 의해 DNA 내로 효율적으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([McMinn et al., (1999) J. Am . Chem . Soc. 121:11585-6]; 및 [Ogawa et al., (2000) J. Am . Chem. Soc, 122:3274])를 참조한다. 3MN:3MN 자가 쌍은 생물학적 기능에 충분한 효율성 및 선택성으로 KF에 의해 합성될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Ogawa et al., (2000) J. Am . Chem . Soc , 122:88034]를 참조한다. 그러나, 2개의 염기 모두 추가 복제를 위한 쇄 종결자로서 작용한다. 최근, PICS 자가 쌍을 복제하는데 사용될 수 있는 돌연변이체 DNA 폴리머라제가 개발되었다. 또한, 7AI 자가 쌍도 복제될 수 있다. 예를 들어, 예로서, [Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439]를 참조한다. 새로운 메탈로염기쌍인 Dipic:Py도 개발되었는데, 이는 Cu(II)와 결합할 때 안정한 쌍을 형성한다. 문헌 [Meggers et al., (2000) J. Am . Chem . Soc. 122:10714]를 참조한다. 연장된 코돈 및 비천연 코돈은 본질적으로 천연 코돈에 오르토고날하기 때문에, 본 방법은 이러한 특성을 사용하여 이들에 대한 오르토고날 tRNA를 생성할 수 있다.

번역 우회 시스템을 사용하여 원하는 폴리펩티드 내로 비천연 아미노산을 도입할 수 있다. 번역 우회 시스템에서, 큰 서열이 유전자 내로 도입되기는 하나, 단백질로 번역되지는 않는다. 이 서열은 리보솜이 서열을 건너 뛰어, 삽입 부위 하류의 번역을 재개하도록 유도하는 신호로서 작용하는 구조를 포함한다.

특정 실시태양에서, 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그의 일부분)는 핵산에 의해 코딩된다. 전형적으로, 핵산은 적어도 하나의 셀렉터 코돈, 적어도 2개의 셀렉터 코돈, 적어도 3개 셀렉터 코돈, 적어도 4개 셀렉터 코돈, 적어도 5개 셀렉터 코돈, 적어도 6개 셀렉터 코돈, 적어도 7개 셀렉터 코돈, 적어도 8개 셀렉터 코돈, 적어도 9개 셀렉터 코돈, 10개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다.

당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 방법의 사용으로 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 돌연변이를 생성할 수 있고, 예를 들면, 비천연 아미노산의 도입을 위해 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 것으로 본원에 기재되어 있다. 예를 들면, 관심의 대상이 되는 핵산에 돌연변이를 생성하여 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하며, 하나 이상의 비천연 아미노산의 도입을 제공한다. 본 발명은 예를 들면, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 비롯한 임의의 단백질의 버전인 돌연변이체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 상기와 같은 변이체를 포함한다. 유사하게, 본 발명은 또한 상응하는 핵산, 즉, 하나 이상의 비천연 아미노산을 코딩하는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 갖는 임의의 핵산을 포함한다.

관심의 대상이 되는 단백질, 예를 들면, IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 폴리펩티드의 임의의 원하는 위치에서 시스테인이 도입되도록 용이하게 돌연변이화될 수 있다. 시스테인은 반응성 분자, 수용성 중합체, 단백질 또는 매우 다양한 다른 분자를 관심의 대상이 되는 단백질 내로 도입하는데 광범위하게 사용된다. 시스테인을 폴리펩티드의 원하는 위치에 도입하기에 적합한 방법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있으며, 예를 들면, 미국 특허 번호 제6,608,183호(본원에서 참고로 인용된다)에 기술되어 있는 것, 및 표준 돌연변이 유발 기법이 있다.

IV . 비천연적으로 코딩된 아미노산

매우 광범위한 비천연적으로 코딩된 아미노산이 본 발명에 사용하기에 적합하다. 임의의 많은 비천연적으로 코딩된 아미노산이 IFN 베타 폴리펩티드 내로 도 입돌 수 있다. 일반적으로, 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 유전적으로 코딩된 일반 아미노산(즉, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린)에 대해 실질적으로는 화학적으로 불활성이다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 20종의 일반 아미노산(아지도, 케톤, 알데히드 및 아미노옥시 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에서 발견되지 않는 작용기와 유효하게 선택적으로 반응하여 안정한 접합체를 형성하는 측쇄 작용기를 포함한다. 예를 들면, 아지도 작용기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드는 중합체(폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 또는 별법으로, 알킨 부분을 함유하는 제2 폴리펩티드와 반응하여 안정한 접합체를 형성함으로써 아지드 및 알킨 작용기의 선택적 반응이 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 생성물을 형성할 수 있게 할 수 있다.

알파 아미노산의 일반 화학식은 하기에 도시한 바와 같다(하기 화학식(I)):

비천연적으로 코딩된 아미노산은 전형적으로 하기 열거한 화학식을 갖는 임 의의 화학식을 갖는데, 여기서, R 기는 20종의 천연 아미노산에서 사용되는 치환기 이외의 임의의 치환기이며, 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있다. 본 발명의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 전형적으로 오직 측쇄 구조에서만 천연 아미노산과 차이를 나타내기 때문에 비천연적으로 코딩된 아미노산은 천연적으로 발생된 폴리펩티드에서 그들이 형성하는 방식과 동일한 방식으로 천연 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 다른 아미노산과 아미드 결합을 형성한다. 그러나, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 천연 아미노산과 식별되는 측쇄 기를 갖는다. 예를 들면, R은 임의로 알킬-, 아릴-, 아실-, 케토-, 아지도-, 하이드록실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 설포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로사이클릭, 에논, 이민, 알데히드, 에스테르, 티오산, 하이드록실아민, 아미노 기 등 또는 그의 임의 조합을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는, 관심의 대상이 되는 다른 비천연적으로 발생된 아미노산으로는 광활성화 가능한 가교결합제를 포함하는 아미노산, 스핀 표지 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속 함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규한 작용기를 갖는 아미노산, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 아미노산, 포토케이지드 및/또는 광이성화 가능한 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 예를 들면, 당 치환된 세린, 다른 당질에 의해 변형된 아미노산, 케토 함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자로 치환된 아미노산, 화학적으로 절단 가능한 및/또는 광절단 가능한 아 미노산, 천연 아미노산에 비해 신장된 측쇄(약 5개 초과 또는 약 10개 초과의 탄소를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 폴리에테르 또는 장쇄 탄화수소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 갖는 아미노산, 탄소 연결 당 함유 아미노산, 산화환원 활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 및 하나 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있고, 수용성 중합체와의 반응에 유용한 비천연적으로 코딩된 아미노산의 일례로는 카르보닐, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드, 세미카르바지드, 아지드 및 알킨 반응기를 갖는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 당류 부분을 포함한다. 상기 아미노산의 예로는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 상기 아미노산의 예는 또한 아미노산과 당류 사이의 천연적으로 발생된 N-결합 또는 0-결합이 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 천연 상태에서는 통상 발견되지 않는 공유 결합에 의해 대체된 예를 포함한다. 상기 아미노산의 예는 또한 천연적으로 발생된 단백질에서는 통상 발견되지 않는 당류, 예를 들면, 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등을 포함한다.

본원에 제공된 많은 비천연적으로 코딩된 아미노산은 예로서, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재), 노나바이오켐(Novabiochem) (독일 다름스타드트 소재의 EMD Biosciences의 분사), 또는 펩테 크(Peptech)(미국 매사추세츠주 버링톤 소재)로부터 상업적으로 이용가능하다. 상업적으로 이용될 수 없는 것들은 임의로 본원에 제공된 바와 같이, 또는 당업계의 숙련인에게 공지된 표준 방법을 사용하여 합성된다. 유기 합성 기법의 경우, 예를 들면, 문헌 ([Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)]; [Advanced Organic Chemistry by March(Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]; 및 [Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg(Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)])을 참조한다. 또한, 미국 특허 번호 제7,045,337호 및 제7,083,970호(본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다. 신규한 측쇄를 함유하는 비천연 아미노산 외에도, 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 비천연 아미노산은 하기 화학식(II) 및 화학식(III)의 화학식으로 도시한 구조를 포함하나, 이에 한정되지 않는 변형된 골격 구조를 포함한다:

상기 식에서,

Z는 전형적으로 S 또는 O를 포함하며, 임의로 동일하거나 상이할 수 있는 R 및 R'은 전형적으로 화학식(I)을 갖는 비천연 아미노산에 대해 상기 기술된 R 기에 대한 구성성분으로 된 동일한 목록 뿐만 아니라, 수소로부터 선택된다. 예를 들면, 본 발명의 비천연 아미노산은 임의로 화학식(II) 및 화학식(III)에 도시되는 바와 같이 아미노 또는 카르복실 기에서의 치환을 포함한다. 이러한 유형의 비천연 아미노산은 20종의 일반 천연 아미노산에 상응하는 측쇄 또는 비천연 측쇄을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 갖는 α-하이드록시산, α-티오산, α-아미노티오카르복실레이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, α-탄소에서의 치환은 임의로 L, D 또는 α-α-이치환된 아미노산, 예를 들면, D-글루타메이트, D-알라닌, D-메틸-O-티로신, 아미노부티르산 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다른 구조적 대체물은 사이클릭 아미노산, 예를 들면, 프롤린 유사체 뿐만 아니라 3, 4, 6, 7, 8 및 9원 환 프롤린 유사체, β 및 γ 아미노산, 예를 들면, 치환된 β-알라닌 및 γ-아미노 부티르산을 포함한다.

많은 비천연 아미노산은 천연 아미노산, 예를 들면, 티로신, 글루타민, 페닐 알라닌 등을 기초로 하고, 본 발명에 사용하기에 적합하다. 티로신 유사체는 파라 치환된 티로신, 오르토 치환된 티로신 및 메타 치환된 티로신을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 여기서 치환된 티로신은 케토 기(아세틸 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 벤조일 기, 아미노 기, 히드라진, 하이드록시아민, 티올 기, 카르복시 기, 이소프로필 기, 메틸 기, C₆-C₂₀ 직쇄 또는 분지형 탄화수소, 포화된 또는 불포화된 탄화수소, O-메틸 기, 폴리에테르 기, 니트로 기, 알키닐 기 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 포함한다. 또한, 다중 치환된 아릴 환도 고려된다. 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 글루타민 유사체로는 α-하이드록시 유도체, γ-치환된 유도체, 사이클릭 유도체, 및 아미드 치환된 글루타민 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 예시적인 페닐알라닌 유사체는 파라 치환된 페닐알라닌, 오르토 치환된 페닐알라닌, 및 메타 치환된 페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 여기서, 치환기는 하이드록시 기, 메톡시 기, 메틸 기, 알릴 기, 알데히드, 아지도, 요오도, 브로모, 케토 기(아세틸 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 벤조일, 알키닐 기 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것들을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 비천연 아미노산의 구체적인 예는 p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-도파, 불소화된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세 린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, 및 p-프로파르길옥시-페닐알라닌 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 다양한 비천연 아미노산의 구조의 예는 예를 들면, WO 2002/085923(발명의 명칭 "In vivo incorporation of unnatural amino acids")에 제공되어 있다. 또한, 추가적인 메티오닌 유사체에 대해서는 문헌 [Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudifzger ligation, PNAS 99: 19-24]을 참조할 수 있다. 국제 출원 번호 PCT/US06/47822(발명의 명칭 "Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides")(본원에서 참고로 인용된다)에는 p-아미노- 페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방향족 아민 부분의 환원적 알킬화 및 환원적 아미노화가 기재되어 있다.

하나의 실시태양에서, 비천연 아미노산(예를 들면, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌)을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드의 조성물을 제공한다. p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌을 포함하고, 단백질 및/또는 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 조성물 또한 제공한다. 하나의 측면에서, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌 비천연 아미노산을 포함하는 조성물은 오르토고날 tRNA를 추가로 포함한다. 비천연 아미노산은 오르토고날 tRNA에 결합할 수 있으며(공유 결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 이는 아미노 아실 결합을 통해 오르토고날 tRNA에 공유 결합하는 것, 오르토고날 tRNA의 말단 리보스 당의 3' OH 또는 2' OH에 공유 결합하는 것 등 을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

비천연 아미노산을 통해 단백질로 도입될 수 있는 화학적 부분은 다양한 장점 및 이러한 단백질의 조작을 제공한다. 예를 들면, 케토 작용기의 독특한 반응성으로 인해 임의의 다수의 히드라진 함유 시약 또는 하이드록실아민 함유 시약을 사용하여 단백질을 시험관내 및 생체내에서 선택적으로 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 중원자 비천연 아미노산은 X선 구조 데이터를 위상화하는데 유용할 수 있다. 또한, 비천연 아미노산을 사용한 중원자의 부위 특이적 도입은 중원자의 위치를 선택하는데 있어 선택성 및 유연성을 제공한다. 예를 들면, 광반응성 비천연 아미노산(벤조페논 및 아릴아지드(페닐아지드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 측쇄를 갖는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)은 단백질의 효과적인 생체내 및 시험관내 광가교결합을 가능하게 한다. 광반응성 비천연 아미노산의 예는 p-아지도-페닐알라닌 및 p-벤조일-페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이어서, 광반응기를 제공하는 시간 제어를 자극시켜 광반응성 비천연 아미노산을 갖는 단백질을 마음대로 가교결합시킬 수 있다. 일례로, 비천연 아미노의 메틸 기는 핵 자기 공명 및 진동 분광학을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 사용하여 국소 구조의 프로브 및 원동력으로서 동위 원소로 표지화된 메틸 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것으로 치환될 수 있다. 예를 들면, 알키닐 또는 아지도 작용기는 [3+2] 사이클로첨가 반응을 통해 분자를 사용하여 단백질을 선택적으로 변형시킬 수 있다.

아미노 말단에서 폴리펩티드 내로 도입된 비-천연 아미노산은 보통 α-아미 노산 중에 존재하는 NH₂ 기와 상이한 제2 반응기 및 20종의 천연 아미노산에서 사용되는 것 이외의 임의의 치환기인 R 기로 구성될 수 있다(화학식(I) 참조). 유사한 비-천연 아미노산은 보통 α-아미노산 중에 존재하는 COOH 기와 상이한 제2 반응기를 갖는 카르복실 말단에서 도입될 수 있다(화학식(I) 참조).

본 발명의 비천연 아미노산은 20종의 천연 아미노산에서는 사용할 수 없는 추가의 특징들을 제공할 수 있도록 선택되거나 디자인될 수 있다. 예를 들면, 비천연 아미노산은 예로서, 그들이 도입되는 단백질의 생물학적 특성을 변형시킬 수 있도록 임의로 디자인되거나 선택될 수 있다. 예를 들면, 비천연 아미노산을 단백질 내로 포함시킴으로써 하기 특성: 독성, 생체분포, 가용성, 안정성, 예로서, 열, 가수분해, 산화에 대한 안정성, 효소 분해 등에 대한 내성, 정제 및 프로세싱의 용이함, 구조적 특성, 분광학적 특성, 화학적 및/또는 광화학적 특성, 촉매 활성, 산화환원 전위, 반감기, 예로서, 공유적으로 또는 비공유적으로 다른 분자와 반응할 수 있는 능력 등을 임의로 변형시킬 수 있다.

비-천연 아미노산의 구조 및 합성: 카르보닐 기, 카르보닐 유사 기, 차폐된 카르보닐 기, 보호된 카르보닐 기 및 하이드록실아민 기

몇몇 실시태양에서 본 발명은 옥심 결합에 의해 수용성 중합체, 예로서, PEG에 연결되어 있는 IFN 베타를 제공한다.

여러 유형의 비천연적으로 코딩된 아미노산이 옥심 결합을 형성하는데 적합하다. 카르보닐, 디카르보닐, 또는 하이드록실아민 기를 포함하는 비천연적으로 코 딩된 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그러한 아미노산이 미국 특허 공보 번호 제2006/0194256호, 제2006/0217532호, 및 제2006/0217289호 및 WO 2006/069246(발명의 명칭 "Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides")(그들의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산 또한 미국 특허 번호 제7,083,970호 및 미국 특허 번호 제7,045,337호(그들의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

본 발명의 몇몇 실시태양은 하나 이상의 위치에서 파라 아세틸페닐알라닌 아미노산으로 치환된 IFN 베타 폴리펩티드를 사용한다. p-아세틸-(+/-)-페닐알라닌 및 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성은 문헌 [Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746(2003)](참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 다른 카르보닐 함유 아미노산 또는 디카르보닐 함유 아미노산이 당업계의 숙련인에 의해 유사하게 제조될 수 있다. 추가로, 본원에 포함되는 비-천연 아미노산의 합성에 관한 비제한적인 예는 미국 특허 번호 제7,083,970호(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)의 도 4, 24-34 및 36-39에 제시되어 있다.

친전자성 반응기를 갖는 아미노산은 특히 친핵성 첨가 반응을 통해 분자를 연결시키는 다양한 반응을 가능하게 한다. 이러한 친전자성 반응기로는 카르보닐 기(케토 기 및 디카르보닐 기를 포함), 카르보닐 유사 기(이것은 카르보닐 기(케토 기 및 디카르보닐 기를 포함)와 유사한 반응성을 갖고, 카르보닐 기와 구조적으로 유사), 차폐된 카르보닐 기(이는 카르보닐 기(케토 기 및 디카르보닐 기를 포함)로 쉽게 전환될 수 있다), 또는 보호된 카르보닐 기(이는 탈보호시 카르보닐 기(케토 기 및 디카르보닐 기를 포함)와 유사한 반응성을 갖는다)를 포함한다. 이러한 아미노산은 하기 화학식(IV)의 구조를 갖는 아미노산을 포함한다:

상기 식에서,

A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 사이클로알킬렌, 치환된 저급 사이클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로사이클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고;

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬 렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N-, 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이며, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

J는

이고;

R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 또는 치환된 사이클로알킬이고;

각각의 R"은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 또는 보호기이거나, 1 초과의 R" 기가 존재할 경우, 2개의 R"이 임의로 헤테로사이클로알킬을 형성하며;

R₁은 임의적인 것으로서, 존재할 경우, H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;

R₂는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노 산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;

R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, R₃과 R₄, 또는 2개의 R₃ 기가 임의로 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬을 형성하거나; 또는

-A-B-J-R 기는 함께 디카르보닐 기를 비롯한 적어도 하나의 카르보닐 기, 보호된 디카르보닐 기를 비롯한 보호된 카르보닐 기, 또는 차폐된 디카르보닐 기를 비롯한 차폐된 카르보닐 기를 포함하는 비사이클릭 또는 트리사이클릭 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬을 형성하거나; 또는

-J-R 기는 함께 디카르보닐 기를 비롯한 적어도 하나의 카르보닐 기, 보호된 디카르보닐 기를 비롯한 보호된 카르보닐 기, 또는 차폐된 디카르보닐 기를 비롯한 차폐된 카르보닐 기를 포함하는 모노사이클릭 또는 비사이클릭 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬를 형성하고;

단, A가 페닐렌이고 각각의 R₃이 H인 경우, B는 존재하며; A가 -(CH₂)₄이고 각각의 R₃이 H인 경우, B는 -NHC(O)(CH₂CH₂)-가 아니고; A와 B가 존재하지 않고 각각의 R₃이 H인 경우, R은 메틸이 아니다.

또한, 하기 화학식(V)의 구조를 갖는 것도 포함한다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -0-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(0)0-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N-, 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이며, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

R₂는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고;

단, A가 페닐렌인 경우, B는 존재하고; A가 -(CH₂)₄인 경우, B는 -NHC(O)(CH₂CH₂)-가 아니고; A와 B가 존재하지 않는 경우, R은 메틸이 아니다.

또한, 하기 화학식(VI)의 구조를 갖는 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

B는 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -0-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(0)0-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')N=N-, 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(0)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -C(O)N(R')₂, -OR', 및 -S(O)_kR'로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.

또한, 하기 아미노산도 포함하며:

여기서, 화합물은 임의로 아미노 보호된 기, 카르복실 보호된 형태 또는 그의 염이다. 또한, 하기 비-천연 아미노산 중 임의의 것이 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다.

또한, 하기 화학식(VII)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저 급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -0-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N-, 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -C(O)N(R')₂, -OR', 및 -S(O)_kR'로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

n은 O 내지 8이고;

단, A가 -(CH₂)₄인 경우, B는 -NHC(O)(CH₂CH₂)-가 아니다.

또한, 하기 아미노산을 포함하고:

여기서, 상기 화합물은 임의로 아미노 보호된 형태, 임의로 카르복실 보호된 형태, 임의로 아미노 보호된 형태 및 카르복실 보호된 형태, 또는 그의 염이다. 또한, 이들 비-천연 아미노산 및 하기 비-천연 아미노산 중 임의의 것이 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다.

또한, 하기 화학식(VIII)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환 된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N-, 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이며, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

R₂는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다.

또한, 하기 화학식(IX)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬 렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N-, 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

여기서, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -C(0)N(R')₂, -OR', 및 -S(O)_kR'로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬 이다.

또한, 하기 아미노산도 포함되며:

여기서, 화합물은 임의로 아미노 보호된 형태, 임의로 카르복실 보호된 형태, 임의로 아미노 보호된 및 카르복실 보호된 형태, 또는 그의 염이다. 또한, 이들 비-천연 아미노산 및 하기 비-천연 아미노산 중 임의의 것이 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다.

또한, 하기 화학식(X)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬 렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)_kN(R')-, -N(R')-N= -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N-, 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -C(0)N(R')₂, -OR', 및 -S(O)_kR'로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬 이고; n은 0 내지 8이다.

또한, 하기 아미노산도 포함되며:

여기서, 화합물은 임의로 아미노 보호된 형태, 임의로 카르복실 보호된 형태, 임의로 아미노 보호된 형태 및 카르복실 보호된 형태, 또는 그의 염이다. 또한, 이들 비-천연 아미노산 및 하기 비-천연 아미노산 중 임의의 것이 비-천연 아미노산 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다.

모노카르보닐 구조 이외에도, 본원에 기술된 비-천연 아미노산은 예를 들면, 디카르보닐 기, 디카르보닐 유사 기, 차폐된 디카르보닐 기 및 보호된 디카르보닐 기와 같은 기를 포함할 수 있다.

예를 들어, 하기 화학식(XI)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R' H알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(0)0-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)_kN(R')-, -N(R')-N= -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N-, 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이며, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

또한, 하기 화학식(XII)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -0-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(0)0-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(0)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')₂-N=N-, 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

여기서, 각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(O)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -C(O)N(R')₂, -OR', 및 -S(O)_kR'로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.

또한, 하기 아미노산도 포함되며:

또한, 하기 화학식(XIII)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

B는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -0-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)_k-(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -S(O)_k(알킬렌 또는 치환된 알킬 렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)_kN(R')-, -N(R')C(0)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)_kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(RVN=N-, 및 -C(R')₂-N(R')-N(R')-로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이고, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고;

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')₂, -C(0)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -C(0)N(R')₂, -OR', 및 -S(O)_kR'로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이고; n은 0 내지 8이다.

또한, 하기 아미노산도 포함되며:

이고,

또한, 하기 화학식(XIV)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

X₁은 C, S, 또는 S(O)이고; L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이고, 여기서, R'은 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 또는 치환된 사이클로알킬이다.

또한, 하기 화학식(XIV-A)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

[화학식 XIV-A]

상기 식에서,

L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이고, 여기서, R'은 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 또는 치환된 사이클로알킬이 다.

또한, 하기 화학식(XIV-B)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

[화학식 XIV-B]

상기 식에서,

L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이고, 여기서, R'은 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 또는 치환된 사이클로알킬이다.

또한, 하기 화학식(XV)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

X₁은 C, S, 또는 S(O)이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; 각 CR⁸R⁹기 상의 각각의 R⁸ 및 R⁹는 독립적으로 H, 알콕시, 알킬아민, 할로겐, 알킬, 아릴로 구성된 군으로부터 선택되거나, 임의의 R⁸ 및 R⁹는 함께 =0 또는 사이클로알킬을 형성할 수 있거나, 인접한 R⁸ 기에 대해 임의의 것은 함께 사이클로알킬을 형성할 수 있다.

또한, 하기 화학식(XV-A)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

[화학식 XV-A]

상기 식에서,

A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 사이클로알킬렌, 치환된 저급 사이클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로사이클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환 된 아르알킬렌이고;

R₂는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; n은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5이고; 각 CR⁸R⁹기 상의 각각의 R⁸ 및 R⁹는 독립적으로 H, 알콕시, 알킬아민, 할로겐, 알킬, 아릴로 구성된 군으로부터 선택되거나, 임의의 R⁸ 및 R⁹는 함께 =0 또는 사이클로알킬을 형성할 수 있거나, 인접한 R⁸ 기에 대해 임의의 것은 함께 사이클로알킬을 형성할 수 있다.

또한, 하기 화학식(XV-B)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

[화학식 XV-B]

상기 식에서,

A는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저 급 사이클로알킬렌, 치환된 저급 사이클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로사이클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알크아릴렌, 치환된 알크아릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고;

또한, 하기 화학식(XVI)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

X₁은 C, S, 또는 S(O)이고; L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이며, 여기서, R'은 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 또 는 치환된 사이클로알킬이다.

또한, 하기 화학식(XVI-A)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

[화학식 XVI-A]

상기 식에서,

또한, 하기 화학식(XVI-B)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

[화학식 XVI-B]

상기 식에서,

R₂는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; L은 알킬렌, 치환된 알킬렌, N(R')(알킬렌) 또는 N(R')(치환된 알킬렌)이고, 여기서, R'은 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 또는 치환된 사이클로알킬이다.

또한, 하기 화학식(XVII)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

M은

이며, 여기서, (a)는 A 기에의 결합을 나타내고, (b)는 각각의 카르보닐 기에의 결합을 나타내며, R₃ 및 R₄는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 또는 치환된 사이클로알킬로부터 선택되거나, R₃과 R₄, 또는 2개의 R₃ 기 또는 2개의 R₄ 기가 임의로 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬을 형성하고;

R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 또는 치환된 사이클로알킬이고;

T₃은 결합, C(R)(R), O, 또는 S이고, R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 또는 치환된 사이클로알킬이고;

R₁은 임의적인 것으로서, 존재할 경우, H, 아미노 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이고; R₂는 임의적인 것으로서, 존재할 경우, OH, 에스테르 보호기, 수지, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드이다.

또한, 하기 화학식(XVIII)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

M은

각각의 R_a는 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, -N(R')2, -C(0)_kR'(여기서, k는 1, 2 또는 3이다), -C(0)N(R')₂, -OR', 및 -S(O)_kR'로 구성된 군으로부터 선택되고, 여기서, 각각의 R'은 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이다.

또한, 하기 화학식(XIX)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 또는 치환된 사이클로알 킬이고; T₃은 O, 또는 S이다.

또한, 하기 화학식(XX)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

상기 식에서,

R은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 또는 치환된 사이클로알킬이다.

또한, 하기 화학식(XXI)의 구조를 갖는 하기 아미노산도 포함한다:

이다.

몇몇 실시태양에서, 비-천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 화학적으로 변형되어 반응성 카르보닐 또는 디카르보닐 작용기를 생성한다. 예를 들면, 접합화 반응에 유용한 알데히드 관능기는 인접 아미노 및 하이드록실 기를 갖는 관능기로부터 생성될 수 있다. 생물학적 활성 분자가 폴리펩티드인 경우, 예를 들면, N 말단 세린 또는 트레오닌(이는 보통 존재할 수 있거나, 화학적 또는 효소적 분해를 통해 노출될 수 있다)을 사용하여, 페리오데이트를 사용하는 온화한 산화 절단 조건하에서 알데히드 관능기를 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Gaertner, et. al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268(1992)]; [Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146(1992)]; [Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230(1994)])를 참조한다. 그러나, 당업계에 공지된 방법은 펩티드 또는 단백질의 N 말단에 있는 아미노산으로 한정된다.

본 발명에서, 인접 하이드록실 기 및 아미노 기를 갖는 비-천연 아미노산은 "차폐된" 알데히드 관능기로서 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 5-하이드록시리신은 엡실론 아민에 인접한 하이드록실 기를 보유한다. 전형적으로, 알데히드 생성 반응 조건은 온화한 조건하에서 과몰량의 나트륨 메타페리오데이트를 첨가하여 폴리펩티드내 다른 부위의 산화를 막는 것을 포함한다. 산화 반응의 pH는 전형적으로 약 7.0이다. 전형적인 반응은 약 1.5 과몰량의 나트륨 메타페리오데이트를 폴리펩티드 완충액에 첨가한 후, 약 10분 동안 암실에서 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 예로서, 미국 특허 번호 제6,423,685호를 참조한다.

카르보닐 또는 디카르보닐 관능기는 온화한 조건하에 수용액 중에서 하이드록실아민 함유 시약과 선택적으로 반응하여 각각 생리학적 조건하에서 안정한 상응하는 옥심 결합을 형성할 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481(1959)]; [Shao, J. and Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899(1995)])를 참조한다. 또한, 카르보닐 또는 디카르보닐 기의 독특한 반응성으로 인해 다른 아미노산 측쇄의 존재하에서 선택적으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151(1996)]; [Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146(1992)]; [Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128(1997)])을 참조한다.

비-천연 아미노산: 하이드록실아민 함유 아미노산의 구조 및 합성

미국 가특허 출원 번호 제60/638,418호는 그의 전문이 참고로 인용된다. 따라서, 미국 가특허 출원 번호 제60/638,418호 중 섹션 V(표제 "비-천연 아미노산"), 파트 B(표제 "비-천연 아미노산: 하이드록실아민 함유 아미노산의 구조 및 합성")에서 제공하는 개시내용은 상기 개시내용이 전체적으로 본원에서 제시되는 것과 동일한 정도로 본원에 기술되어 있는, 비-천연 아미노산, 비-천연 아미노산 폴리펩티드 및 변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 제조, 정제, 특징화, 및 사용하는 방법, 조성물(화학식( I )-(XXXV)), 기법 및 전략법에 전체적으로 적용된다. 미국 특허 공보 번호 제2006/0194256, 2006/0217532, 및 2006/0217289 및 WO 2006/069246(발명의 명칭 "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides") 또한 그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다.

비천연 아미노산의 화학적 합성

본 발명에 사용하기 적합한 많은 비천연 아미노산들이 예를 들면, 시그마 (미국) 또는 알드리치(미국 위스콘신주 밀워키 소재)로부터 상업적으로 이용가능하다. 상업적으로 이용될 수 없는 것들은 임의로 본원에 제공된 바와 같이, 또는 다양한 공보에서 제공된 바와 같이, 또는 당업계의 숙련인에게 공지된 표준 방법을 사용하여 합성된다. 유기 합성 기법에 대해, 예를 들면, 문헌 ([Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)]; [Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]; 및 [Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)])을 참조한다. 비천연 아미노산의 합성을 기재하는 추가적인 공보로는 예를 들면, 문헌 (WO 2002/085923(발명의 명칭 "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids"); [Matsoukas et al., (1995) J. Med . Chem., 38, 4660-4669]; [King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ- Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates . J. Chem . Soc, 3315-3319]; [Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti - Tumor Agents. J. Am . Chem . Soc . 81, 3750-3752]; [Craig, J. C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7- Chloro -4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline ( Chloroquine ). J. Org. Chem . 53, 1167-1170]; [Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur . J. Med . Chem. 26, 201-5]; [Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4- Substituted Prolines as Conformational Constrained Amino Acid Analogues . J. Org . Chem. 54, 1859-1866]; [Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L- Asparagine . Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org . Chem. 50:1239-1246]; [Barton et al., (1987) Synthesis of Novel alpha - Amino - Acids and Derivatives Using Radical Chemistry : Synthesis of L- and D-alpha-Amino-Adipic Acids , L- alpha - aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308]; 및 [Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues : synthesis of beta - heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate -sensitized site. J. Med . Chem. 35:4602-7])을 포함한다. 미국 특허 공보 번호 US 2004/0198637(발명의 명칭 "Protein Arrays")(본원에서 참고로 인용된다) 또한 참조한다.

A. 카르보닐 반응기

카르보닐 반응기를 갖는 아미노산은 다양한 반응으로 특히 친핵성 첨가 또는 알돌 축합 반응을 통해 분자(PEG 또는 다른 수용성 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 연결시킨다.

예시적인 카르보닐 함유 아미노산은 하기와 같이 나타낼 수 있다:

상기 식에서, n은 0-10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이고; R₂는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 및 치환된 아릴이고; R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이며, R₄는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, R₂는 단순 알킬(즉, 메틸, 에틸, 또는 프로필)이고, 케톤 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, R₂는 단순 알킬(즉, 메틸, 에틸, 또는 프로필)이고, 케톤 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 메타 위치에 위치한다.

p-아세틸-(+/-)-페닐알라닌 및 m-아세틸-(+/-)-페닐알라닌의 합성은 문헌 [Zhang, Z., et al., Biochemistry 42:6735-6746(2003)](본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 다른 카르보닐 함유 아미노산은 당업계의 숙련인에 의해 유사하게 제조될 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 폴리펩티드는 화학적으로 변형되어 반응성 카르보닐 작용기를 생성한다. 예를 들면, 접합화 반응에 유용한 알데히드 관능기는 인접 아미노 및 하이드록실 기를 갖는 관능기로부터 생성될 수 있다. 생물학적 활성 분자가 폴리펩티드인 경우, 예를 들면, N 말단 세린 또는 트레오닌(이는 보통 존재할 수 있거나, 화학적 또는 효소적 분해를 통해 노출될 수 있다)을 사용하여, 페리오데이트를 사용하는 온화한 산화 절단 조건하에서 알데히드 관능기를 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Gaertner, et al, Bioconjug . Chem. 3:262-268(1992)]; [Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug . Chem. 3:138- 146(1992)]; [Gaertner et al, J. Biol Chem. 269:7224-7230(1994)])를 참조한다. 그러나, 당업계에 공지된 방법은 펩티드 또는 단백질의 N 말단에서 있는 아미노산으로 한정된다.

본 발명에서, 인접 하이드록실 기 및 아미노 기를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 "차폐된" 알데히드 관능기로서 폴리펩티드 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 5-하이드록시리신은 엡실론 아민에 인접한 하이드록실 기를 보유한다. 전형적으로, 알데히드 생성 반응 조건은 온화한 조건하에서 과몰량의 나트륨 메타페리오데이트를 첨가하여 폴리펩티드내 다른 부위의 산화를 막는 것을 포함한다. 산화 반응의 pH는 전형적으로 약 7.0이다. 전형적인 반응은 약 1.5 과몰량의 나트륨 메타페리오데이트를 폴리펩티드 완충액에 첨가한 후, 약 10분 동안 암실에서 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 예로서, 미국 특허 번호 제6,423,685호를 참조한다.

카르보닐 관능기는 온화한 조건하에 수용액 중에서 히드라진 함유 시약, 히드라지드 함유 시약, 하이드록실아민 함유 시약, 또는 세미카르바지드 함유 시약과 선택적으로 반응하여 각각 생리학적 조건하에서 안정한 상응하는 히드라존, 옥심, 또는 세미카르바존 결합을 형성할 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Jencks, W. P., J Am. Chem . Soc. 81, 475-481(1959)]; [Shao, J. and Tarn, J. P., J. Am . Chem . Soc. 117:3893-3899(1995)])를 참조한다. 또한, 카르보닐 기의 독특한 반응성으로 인해 다른 아미노산 측쇄의 존재하에서 선택적으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Cornish, V. W., et al, J. Am . Chem . Soc. 118:8150-8151(1996)]; [Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug . Chem . 3:138- 146(1992)]; [Mahal, L. K., et al, Science 276:1125-1128(1997)])을 참조한다.

B. 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 반응기

친핵성 기, 예를 들면, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다양한 친전자성 기와 반응하여 (PEG 또는 다른 수용성 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과의) 접합체를 형성하게 한다.

예시적인 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 함유 아미노산은 하기와 같이 나타낼 수 있다:

상기 식에서, n은 0-10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고; X는 O, N, 또는 S이거나, 존재하지 않고; R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이며, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또 는 카르복시 말단 변형기이다.

몇몇 실시태양에서, n은 4이고, R₁은 존재하지 않고, X는 N이다. 몇몇 실시태양에서, n은 2, R₁은 존재하지 않고, X는 존재하지 않는다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 O이고, 산소 원자는 아릴 환 상의 지방족 기에 대해 파라 위치에 위치한다.

히드라지드 함유 아미노산, 히드라진 함유 아미노산, 및 세미카르바지드 함유 아미노산은 상업적 공급업체로부터 이용가능하다. 예를 들면, L-글루타메이트-γ-히드라지드는 시그마 케미칼(Sigma Chemical)(미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 입수가능하다. 상업적으로 이용가능하지 않는 다른 아미노산은 당업계의 숙련인에 의해 제조될 수 있다. 예로서, 미국 특허 번호 제6,281,211호(본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다.

히드라지드, 히드라진 또는 세미카르바지드 관능기를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 폴리펩티드는 유사한 화학적 반응성을 갖는 알데히드 또는 다른 작용기를 함유하는 다양한 분자와 유효하게 선택적으로 반응할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Shao, J. and Tam, J., S; Am . Chem . Soc. 117: 3893-3899 (1995)]를 참조한다. 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드 작용기의 독특한 반응성으로 인해 20종의 일반 아미노산 상에 존재하는 친핵성 기(세린 또는 트레오닌의 하이드실 기 또는 리신 및 N 말단의 아미노 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)와 비교하여 알데히드, 케톤 및 다른 친전자성 기에 대한 현저히 더 큰 반응성 을 갖게 된다.

C. 아미노옥시 함유 아미노산

아미노옥시(또한, 하이드록실아민으로도 불린다) 기를 함유하는 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다양한 친전자성 기와 반응하여(PEG 또는 다른 수용성 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과의) 접합체를 형성시킨다. 히드라진, 히드라지드 및 세미카르바지드와 마찬가지로, 아미노옥시 기의 증강된 친핵성은 유사한 화학적 반응성을 갖는 알데히드 또는 다른 작용기를 함유하는 다양한 분자와 유효하게 선택적으로 반응할 수 있게 한다. 예를 들면, 문헌 ([Shao, J. and Tarn, J., J. Am . Chem . Soc. 117:3893-3899(1995)]; [H. Hang and C. Bertozzi, cc. Chem. Res. 34: 727-736(2001)])을 참조한다. 히드라진 기와의 반응의 결과, 상응하는 히드라존이 생성되지만, 일반적으로 옥심은 아미노옥시 기와 카르보닐 함유 기, 예를 들면, 케톤의 반응으로부터 발생한다.

아미노옥시 기를 함유하는 예시적인 아미노산은 하기와 같이 나타낼 수 있다:

상기 식에서, n은 0-10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고; m은 0-10이고; Y = C(O)이거나 존재하지 않고; R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형 기이며, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 O이고, m은 1이며, Y가 존재한다. 몇몇 실시태양에서, n은 2이고, R₁ 및 X는 존재하지 않고, m은 0이고, Y는 존재하지 않는다.

아미노옥시 함유 아미노산은 용이하게 이용가능한 아미노산 전구체(동종세린, 세린 및 트레오닌)로부터 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [M. Carrasco and R. Brown, J. Org . Chem . 68: 8853-8858(2003)]을 참조한다. 특정 아미노옥시 함유 아미노산, 예를 들면, L-2-아미노-4-(아미노옥시)부티르산은 천연 공급원으로부터 단리되었다(문헌 [Rosenthal, G. et al., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997)]을 참조). 다른 아미노옥시 함유 아미노산은 당업계의 숙련인에 의해 제조될 수 있다.

D. 아지드 및 알킨 반응기

아지드 및 알킨 작용기의 독특한 반응성으로 인해 이들은 폴리펩티드 및 다른 생물학적 분자의 선택적 변형에 극히 유용하게 된다. 유기 아지드, 특히 지방족 아지드, 및 알킨은 공통의 반응 화학 조건에 대해 일반적으로 안정하다. 특히 아지드 및 알킨 작용기, 그 둘 모두는 천연적으로 발생된 폴리펩티드에서 발견되는 20종의 일반 아미노산의 측쇄(즉, R 기)에 대해 불활성이다. 그러나, 좀더 면밀히 살펴보면, 아지드 및 알킨 기의 "스프링 로딩된(spring-loaded)" 특성이 드러나며, 이들은 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 반응을 통해 선택적으로 유효하게 반응하여 상응하는 트리아졸을 생성한다. 예를 들면, 문헌 ([Chin J., et al, Science 301:964-7(2003)]; [Wang, Q., et al, J. Am . Chem . Soc. 125, 3192-3193(2003)]; [Chin, J. W., et al., J. Am . Chem . Soc . 124:9026-9027(2002)])를 참조한다.

휘스겐 사이클로첨가 반응은 친핵성 치환 이외의 선택적 사이클로첨가 반응을 포함하기 때문에(예를 들면, 문헌 ([Padwa, A., in COMPREHENSIVE Organic Synthesis, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109]; [Huisgen, R. in 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176)]) 참조), 아지드 및 알킨 함유 측쇄를 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입함으로써 생성된 폴리펩티드는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 위치에서 선택적으로 변형될 수 있다. 아지드 또는 알킨 함유 IFN 베타 폴리펩티드를 포함하는 사이클로첨가 반응은 실온에서 수성 조건하에서 Cu(II)를 Cu(I)로 환원시키는 환원제의 존재하에서, 계내에서, 촉매량으로 Cu(II)(촉매량의 CuSO₄의 형태를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 첨가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Wang, Q., et al, J. Am . Chem . Soc. 125, 3192-3193(2003)]; [Tornoe, C. W., et al, J. Org. Chem . 67:3057-3064(2002)]; [Rostovtsev, et al., Angew . Chem . Int . Ed . 41:2596-2599(2002)])를 참조한다. 예시적인 환원제는 아스코르베이트, 금속성 구리, 퀴닌, 하이드로퀴논, 비타민 K, 글루타티온, 시스테인, Fe² ⁺, Co² ⁺ 및 인가된 전기 전위를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 포함한다.

몇몇 경우에서, 아지드와 알킨 사이의 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 반응이 바람직한 경우, IFN 베타 폴리펩티드는 알킨 부분을 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하고, 아미노산에 부착되는 수용성 중합체는 아지드 부분을 포함한다. 별법으로, 반대 반응(즉, 아미노산 상의 아지드 부분 및 수용성 중합체 상에 존재하는 알킨 부분과의 반응) 또한 수행될 수 있다.

아지드 작용기는 또한 아릴 에스테르를 함유하고 아릴 포스핀 부분을 사용하여 적절히 작용화된 수용성 중합체와 선택적으로 반응하여 아미드 결합을 생성할 수 있다. 아릴 포스핀 기는 계내에서 아지드를 환원시킨 다음, 이어서, 생성된 아민은 근접한 에스테르 결합과 유효하게 반응하여 상응하는 아미드를 생성시킨다. 예를 들면, 문헌 [E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010(2000)]을 참조한다. 아지드 함유 아미노산은 알킬 아지드(2-아미노-6-아지도-1-헥사노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 아릴 아지드(p-아지도-페닐알라닌)일 수 있다.

아릴 에스테르 및 포스핀 부분을 함유하는 예시적인 수용성 중합체는 하기와 같이 나타낼 수 있다:

상기 식에서, X는 O, N, S이거나, 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이며, W는 수용성 중합체이고, R은 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴 기일 수 있다. 예시적인 R 기로는 -CH₂, -C(CH₃)₃, -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -CN 및 -NO₂를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. R', R", R'" 및 R""은 각각 독립적으로 수소, 치환되거나, 비치환된 헤테로알킬, 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하나, 이에 한정되지 않은 치환된 아릴 또는 비치환된 아릴, 치환되거나, 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기, 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 1 초과의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들면, 각각의 R 기는 이들 기 중 1 초과의 기가 존재하는 경우, 각각의 R', R", R'" 및 R"" 기로서 독립적으로 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착되는 경우, 이들은 질소 원자와 조합되어 5원, 6원 또는 7원 환을 형성할 수 있다. 예를 들면, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 의미한다. 치환기에 관한 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이, 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예를 들면, 할로알킬(-CF₃ 및 -CH₂CF₃를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 아실(-C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는)을 포함하는 것을 의미한다는 점을 이해할 것이다.

아지드 작용기는 또한 티오에스테르를 함유하고 아릴 포스핀 부분을 사용하여 적절히 작용화된 수용성 중합체와 선택적으로 반응하여 아미드 결합을 생성할 수 있다. 아릴 포스핀 기는 계내에서 아지드를 환원시킨 다음, 이어서, 생성된 아민은 티오에스테르 결합과 유효하게 반응하여 상응하는 아미드를 형성한다. 티오에스테르 및 포스핀 부분을 함유하는 예시적인 수용성 중합체는 하기와 같이 나타낼 수 있다:

상기 식에서, n은 1-10이고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않을 수 있으며, Ph는 페닐이고, W는 수용성 중합체이다.

예시적인 알킨 함유 아미노산은 하기와 같이 나타낼 수 있다:

상기 식에서,

n은 0-10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고; m은 0-10이고, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이며, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 존재하지 않고, m은 0이며, 아세틸렌 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 O이고, m은 1이며, 프로파르길옥시 기는 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다(즉, O-프로파르길-티로신). 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R₁ 및 X는 존재하지 않고, m은 0이다(즉, 프로프아릴글리신).

알킨 함유 아미노산은 상업적으로 이용가능하다. 예를 들면, 프로파르길글리 신은 펩테크(미국 매사추세츠주 버링톤 소재)로부터 상업적으로 이용가능하다. 별법으로, 알킨 함유 아미노산은 표준 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, p-프로파르길옥시페닐알라닌은 예를 들면, 문헌 [Deiters, A., et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783(2003)]에 기술된 바와 같이 합성될 수 있고, 4-알키닐-L-페닐알라닌은 문헌 [Kayser, B., et al., Tetrahedron 53(7): 2475-2484(1997)]에 기술된 바와 같이 합성될 수 있다. 다른 알킨 함유 아미노산은 당업계의 숙련인에 의해 제조될 수 있다.

예시적인 아지드 함유 아미노산은 하기와 같이 나타낼 수 있다:

상기 식에서, n은 0-10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고; m은 0-10이고; R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이며, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 존재하지 않고, m은 0이며, 아지드 부분은 알킬 측쇄에 대해 파라 위치에 위치한다. 몇몇 실시태양에서, n은 0-4이고, R₁ 및 X는 존재하지 않고, m=0이다. 몇몇 실시태양에서, n은 1이고, R₁은 페닐이며, X는 O이고, m은 2이며, β-아지도에톡시 부분은 알킬 측쇄를 기준으로 파라 위치에 위치한다.

아지드 함유 아미노산은 상업적 공급업체로부터 입수가능하다. 예를 들면, 4-아지도페닐알라닌은 켐-임펙스 인터내셔널, 인크.(Chem-Impex International, Inc.)(일리노이주 우드 다일 소재)로부터 입수할 수 있다. 상업적으로 이용될 수 없는 아지드 함유 아미노산의 경우, 아지드 기는 적합한 이탈기(할라이드, 메실레이트, 토실레이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 치환 또는 적합하게 보호된 락톤의 개방을 포함하나, 이에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 비교적 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)]을 참조한다.

E. 아미노티올 반응기

베타 치환된 아미노티올 작용기의 독특한 반응성은 이들을 티아졸리딘의 형성을 통해 알데히드 기를 함유하는 폴리펩티드 및 다른 생물학적 분자의 선택적 변형에 극히 유용하게 한다. 예를 들면, 문헌 [J. Shao and J. Tam , J. Am . Chem . Soc. 1995, 117 (14) 3893-3899]를 참조한다. 몇몇 실시태양에서, 베타 치환된 아미노티올 아미노산은 IFN 베타 폴리펩티드 내로 도입된 후, 알데히드 관능기를 포함하는 수용성 중합체와 반응할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 수용성 중합체, 약물 접합체 또는 다른 페이로드(payload)를 티아졸리딘의 형성을 통해 베타 치환된 아미노티올 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드에 커플링시킬 수 있다.

F. 추가 반응기

본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드 내로 도입될 수 있는 것으로서, 파라 아미노 -페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는 비천연적으로 코딩된 아미노산과 추가 반응기는 하기의 특허 출원들(이들 모두는 그들의 전문이 참고로 인용된다)에 기재되어 있다: 미국 특허 공보 번호 제2006/0194256호, 미국 특허 공보 번호 제2006/0217532호, 미국 특허 공보 번호 제2006/0217289호, 미국 가특허 번호 제60/755,338호; 미국 가특허 번호 제60/755,711호; 미국 가특허 번호 제60/755,018호; 국제 특허 출원 번호 PCT/US06/49397; WO 2006/069246; 미국 가특허 번호 제60/743,041호; 미국 가특허 번호 제60/743,040호; 국제 특허 출원 번호 PCT/US06/47822; 미국 가특허 번호 제60/882,819호; 미국 가특허 번호 제60/882,500호; 및 미국 가특허 번호 제60/870,594호. 이들 출원은 또한 PEG 또는 다른 중합체 상에 존재할 수 있는 반응기를 논의하고 있으며, 이러한 반응기로는 접합을 위한 하이드록실아민(아미노옥시) 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

비천연 아미노산의 세포 흡수

세포에 의한 비천연 아미노산 흡수는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입시키기 위한 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는 비천연 아미노산을 디자인하고 선택하는 경우에 전형적으로 고려되는 문제이다. 예를 들면, α-아미노산의 높은 전하 밀도는 이러한 화합물들이 세포 투과성을 가질 수 있는 가능성은 없다는 것을 시사한다. 천연 아미노산은 단백질 기재 수송 시스템의 수집을 통해 진핵세포 내로 흡수된다. 존재한다면, 비천연 아미노산이 세포에 의해 흡수되는지 평가하는 신속한 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들면, 문헌 (미국 특허 공보 번호 US 2004/0198637(발명의 명칭 "Protein Arrays")(본원에서 참고로 인용된다); 및 [Liu, D.R. & Schultz, P. G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785])에 기재되어 있는 독성 분석법을 참조한다. 비록 흡수는 다양한 분석법을 사용하여 용이하게 분석되지만, 세포 흡수 경로를 따르는 비천연 아미노산을 디자인하는 것에 대한 대안은 생합성 경로를 제공하여 생체내에서 아미노산을 생성하는 것이다.

비천연 아미노산의 생합성

세포에는 아미노산 및 다른 화합물을 생산하는 많은 생합성 경로들이 이미 존재한다. 특정 비천연 아미노산에 대한 생합성 방법은 진핵세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 자연계에는 존재할 수 없지만, 본 발명은 이러한 방법을 제공한다. 예를 들면, 비천연 아미노산에 대한 생합성 경로는 신규한 효소를 첨가하거나, 존재하는 숙주 세포 경로를 변형시킴으로써 숙주 세포에서 임의로 생성된다. 추가적인 신규의 효소로는 임의로 천연적으로 발생된 효소 또는 인공적으로 진화된 효소가 있다. 예를 들면, p-아미노페닐알라닌의 생합성(WO 2002/085923(발명의 명칭 "In vivo incorporation of unnatural amino acids")에서 실시예로서 제공)은 다른 유기체로부터 유래된 공지 효소의 조합물의 첨가에 의존한다. 이들 효소에 대한 유전자는 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용하여 세포를 형질전환시킴으로써 진핵세포 내로 도입될 수 있다. 유전자는 세포에서 발현되는 경우, 효소 경로를 제공하여 원하는 화합물을 합성한다. 임의로 첨가되는 효소 유형의 예가 하기 실시예에서 제공된다. 추가적인 효소 서열은 예를 들면, 진뱅크(Genbank)에서 살펴볼 수 있다. 또한, 인공적으로 진화된 효소는 임의로 동일한 방식으로 세포에 첨가된다. 이러한 방식으로, 세포 기구 및 세포 공급원을 조작하여 비천연 아미노산을 생산한다.

다양한 방법들이 생합성 경로에서의 사용을 위해 신규한 효소를 생산하거나, 현존하는 경로를 진화시키는데 이용될 수 있다. 임의로, 예를 들면, 멕시겐, 인크.(Maxygen, Inc.)(월드 와이드 웹 상의 maxygen.com에서 이용가능)에 의해 개발된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 반복적 재조합을 사용하여 신규한 효소 및 경로를 개발한다. 예를 들면, 문헌 ([Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391]; 및 [Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc . Natl . Acad . Sci . USA., 91:10747-10751])을 참조한다. 유사하게, 제넨코어(Genencor)(월드 와이드 웹 상의 genencor.com에서 이용가능)에 의해 개발된 디자인 패쓰(DesignPath)™는 임의로 세포에서 경로를 조작하여 0-메틸-L-티로신을 생성하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 대사 경로 조작에 사용된다. 이 기술은 기능적 게놈을 통해 동정된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 신규한 유전자의 조합물, 및 분자 진화 및 디자인을 사용하여 숙주 유기체 중에 현존하는 경로를 재구성한다. 또한, 다이버사 코퍼레이션(Diversa Corporation)(월드 와이드 웹 상의 diversa.com에서 이용가능) 또한 유전자 및 유전자 경로의 라이브러리를 신속하게 스크리닝하여 신규한 경로를 제공하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 기술을 제공한다.

전형적으로, 본 발명의 공학처리된 생합성 경로를 사용하여 생산된 비천연 아미노산은 다른 아미노산의 농도에 영향을 미치거나, 세포 공급원을 고갈시키는 정도는 아닌 천연 세포의 양을 포함하나, 이에 한정되지 않는 양으로 효과적인 단백질 생합성에 충분한 농도로 생산된다. 이러한 방식으로 생체내에서 생산되는 전형적인 농도는 약 10 mM 내지 약 0.05 mM이다. 세포를, 특이 경로에 바람직한 효소를 생산하는데 사용되는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시키고, 비천연 아미노산을 생성시킨 후, 임의로, 생체내 선택을 사용하여 리보좀 단백질 합성 및 세포 성장, 그 둘 모두를 위한 비천연 아미노산의 생산을 추가로 최적화시킨다.

비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드

비천연 아미노산의 도입은 단백질 구조 및/또는 기능의 변화를 조정하거나, 크기, 산도, 친핵성, 수소 결합, 소수성, 프로테아제 표적 부위의 접근성을 변화시키거나, 부분에 대한 표적화 (단백질 어레이에 대한 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 변화시키거나, 생물학적 활성 분자를 첨가하거나, 중합체를 부착시키거나, 방사성 핵종을 부착시키거나, 혈청 반감기를 조정하거나, 조직 침투(예로서, 종양)를 조정하거나, 능동 수송을 조정하거나, 조직, 세포 또는 기관의 특이성 또는 생체분포를 조정하거나, 면역원성을 조정하거나, 프로테아제 내성을 조정하는 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 목적을 위해 수행될 수 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 증강되거나, 심지어 완전히 신규한 촉매적 성질 또는 생체물리적 성질을 가질 수 있다. 예를 들면, 비천연 아미노산을 단백질 내로 포함시킴으로써 하기 특성: 독성, 생체분포, 구조적 특성, 분광학적 특성, 화학적 및/또는 광화학적 특성, 촉매 능력, 반감기(혈청 반감기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 공유적으로 또는 비공유적으로 반응할 수 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 분자와 반응할 수 있는 능력 등을 임의로 변형시킨다. 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물은 신규한 치료제, 진단제, 촉매 효소, 공업용 효소, 결합 단백질(항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 및 단백질 구조 및 기능의 연구를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것들에 유용하다. 예를 들면, 문헌 [Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology. 4:645-652]를 참조한다.

본 발명의 하나의 측면에서, 본 조성물은 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개 이상의 비천연 아미노산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 갖는 적어도 하나의 단백질을 포함한다. 비천연 아미노산은 동일하거나, 상이할 수 있고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 중의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 상이한 부위가 존재할 수 있는 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또다른 측면에서, 조성물은 단백질 중에 존재하는 특정 아미노산 중 적어도 하나를 갖는 단백질을 포함하며, 단백질 중에 존재하는 특정 아미노산 중의 전첨가 비천연 아미노산으로 치환되지는 않는다. 1 초과의 비천연 아미노산을 갖는 주어진 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나, 상이할 수 있다(상기 단백질이 2개 이상의 상이한 유형의 비천연 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 동일한 비천연 아미노산 2개를 포함할 수 있는 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는다). 2 초과의 비천연 아미노산을 갖는 주어진 단백질의 경우, 비천연 아미노산은 동일하거나, 상이하거나, 적어도 하나의 상이한 비천연 아미노산을 갖는 동일한 종류로 된 다수의 비천연 아미노산의 조합물일 수 있다.

적어도 하나의 비천연 아미노산을 갖는 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드가 본 발명의 한가지 특징이 된다. 본 발명은 또한 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 생산된 적어도 하나의 비천연 아미노산을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 또한, 부형제(약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)도 단백질과 함께 존재할 수 있다.

적어도 하나의 비천연 아미노산을 갖는 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드를 진핵세포에서 생산함으로써, 이러한 단백질 또는 폴리펩티드는 전형적으로 번역 후 진핵세포 변형물을 포함하게 된다. 특정 실시태양에서, 단백질은 적어도 하나의 비천연 아미노산, 및 진핵세포에 의해 생체내에서 이루어진 적어도 하나의 번역 후 변형을 포함하며, 여기서, 이러한 번역 후 변형은 원핵세포에 의해서는 이루어지지 않는다. 예를 들면, 번역 후 변형은 아세틸화, 아실화, 지질 변형, 팔미토일화, 팔미테이트 첨가, 인산화, 당지질 결합 변형, 글리코실화 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것들을 포함한다. 하나의 측면에서, 번역 후 변형은 GlcNAc-아스파라긴 결합에 의해 올리고당((GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 아스파라긴에 부착시키는 것을 포함한다. 진핵 단백질의 N-연결된 올리고당의 일부 예를 나열한 하기 표 1을 참조한다(또한, 추가적 인 잔기가 존재할 수 있으며, 이는 나타내지 않는다). 또다른 측면에서, 번역 후 변형은 GalNAc-세린 또는 GalNAc-트레오닌 결합, 또는 GlcNAc-세린 또는 GlcNAc-트레오닌 결합에 의해 올리고당(Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 포함한다.

추가의 또다른 측면에서, 번역 후 변형은 전구체(칼시토닌 전구체, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 전구체, 전전구부갑상선(preproparathyroid) 호르몬, 전전구 인슐린(preproinsulin), 전구 인슐린, 전전구 오피오멜라노코르틴(prepro-opiomelanocortin), 전구 오피오멜라노코르틴 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 단백질 분해 프로세싱, 다중서브유니트 단백질 또는 거대분자 조립체로의 조립, 세포내 다른 부위로의 이동(소기관, 예를 들어, 소포체, 골지체, 핵, 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 엽록체, 액포 등으로의 이동 또는 분비 경로를 통한 이동을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다)을 포함한다. 특정 실시태양에서, 단백질은 분비 또는 국소화 서열, 에피토프 태그, FLAG 태그, 폴리히스티딘 태그, GST 융합 등을 포함한다.

비천연 아미노산의 한가지 장점은 이것이 추가 분자를 첨가하는데 사용될 수 있는 추가의 화학적 부분을 제공한다는 것이다. 이러한 변형은 진핵세포 또는 비진핵세포의 생체내에서 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다. 따라서, 특정 실시태양에서, 번역 후 변형은 비천연 아미노산을 통해 이루어진다. 예를 들면, 상기 번역 후 변형은 친핵성 친전자성 반응을 통해 이루어질 수 있다. 현재, 단백질의 선택적 변형에 사용되는 대부분의 반응은 α-할로케톤과 히스티딘 또는 시스테인 측쇄의 반응을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 친핵성 반응 파트너와 친전자성 반응 파트너 사이의 공유 결합 형성을 포함한다. 이러한 경우, 선택성은 단백질 내의 친핵성 잔기의 수 및 접근성에 의해 결정된다. 본 발명의 단백질에서, 시험관내 및 생체내에서의 비천연 케토 아미노산과 히드라지드 또는 아미노옥시 화합물의 반응과 같은, 선택성이 더욱 큰 다른 반응들이 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Cornish, et al., (1996) J. Am . Chem . Soc 118:8150-8151]; [Mahal, et al., (1997) Science , 276:1125-1128]; [Wang, et al., (2001) Science 292:498-500]; [Chin, et al., (2002) J. Am . Chem . Soc. 124:9026-9027]; [Chin, et al., (2002) Proc . Natl . Acad . Sci ., 99:11020-11024]; [Wang, et al., (2003) Proc. Natl . Acad . Sci ., 100:56-61]; [Zhang, et al., (2003) Biochemistry . 42:6735-6746]; 및 [Chin, et al., (2003) Science, 301:964-7])(이들 모두 본원에서 참고로 인용된다)을 참조한다. 이를 통해 형광단, 가교결합제, 당류 유도체 및 세포독성 분자를 비롯한 다수의 시약으로 사실상 어떠한 단백질도 선택적으로 표지할 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 제6,927,042호(발명의 명칭 "Glycoprotein synthesis")(본원에 참고로 인용된다)를 참조한다. 아지도 아미노산을 통한 번역 후 변형을 포함하나, 이에 한정되지 않는 번역 후 변형 또한 스타우딩어 결찰(Staudinger ligation)(트리아릴포스핀 시약을 사용한 결찰을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 통해 이루어질 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24]를 참조한다.

본 발명은 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 아지드 또는 알키닐 부분을 함유하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 비천연 아미노산을 단백질 내로 유전적으로 도입시키는 단계를 포함하는, 단백질을 선택적으로 변형시키는데 매우 효과적인 방법을 제공한다. 이어서, 이러한 아미노산 측쇄는 각각 알키닐 또는 아지드 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과의 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 반응(예를 들면, 문헌 ([Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis , Vol . 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109]; 및 [Huisgen, R. in 1,3- Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176]) 참조)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 반응에 의해 변형될 수 있다. 이러한 방법은 친핵성 치환 반응 이외의 사이클로첨가를 포함하기 때문에, 단백질은 극히 높은 선택성으로 변형될 수 있다. 이러한 반응은 실온에서 수성 조건하에 우수한 위치선택성(1,4 > 1,5)으로 촉매량의 Cu(I) 염을 반응 혼합물에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Tornoe, et al., (2002) J. Org . Chem. 67:3057-3064]; 및 [Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599])를 참조한다. 사용될 수 있는 또다른 방법은 비스비소 화합물 상에서 테트라시스테인 모티프와 리간드 교환을 하는 것이다(예를 들면, 문헌 [Griffin, et al., (1998) Science 281:269-272] 참조).

[3+2] 사이클로첨가를 통해 본 발명의 단백질에 첨가될 수 있는 분자로는 사실상 아지드 또는 알키닐 유도체를 갖는 어떤 분자도 모두 포함한다. 상기 분자는 염료, 형광단, 가교결합제, 당류 유도체, 중합체(폴리에틸렌 글리콜의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 광가교결합제, 세포독성 화합물, 친화성 표지, 비오틴의 유도체, 수지, 비드, 제2 단백질 또는 폴리펩티드(또는 그 이상), 폴리뉴클레오티드(들) (DNA, RNA 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 당질 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 분자들은 각각 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는 알키닐 기 또는 p-아지도-페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는 아지도 기를 갖는 비천연 아미노산에 첨가될 수 있다.

V. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드의 생체 내 제조

본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 천연적으로 발생된 시스템에서는 코딩되지 않는 아미노산을 첨가하거나 이것으로 치환시키기 위해 변형된 tRNA 및 tRNA 합성효소의 사용으로 생체내에서 제조될 수 있다.

천연적으로 발생된 시스템에서 코딩되지 않는 아미노산을 사용하는 tRNA 및 tRNA 합성효소를 제조하는 방법은 예로서, 미국 특허 번호 제7,045,337호 및 제7,083,970호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 이러한 방법은 번역 시스템에 대해 내인성인 합성효소 및 tRNA에 독립적으로 기능하는(따라서, 때때로 "오르토고날"이라고도 지칭된다) 번역 기구를 제조하는 것을 포함한다. 전형적으로, 번역 시스템은 오르토고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함한다. 전형적으로, O-RS는 우선적으로 번역 시스템에서 적어도 하나의 비천연적으로 발생된 아미노산으로 O-tRNA를 아미노아실화시키고, O-tRNA는 상기 시스템에서 다른 tRNA에 의해서는 인식되지 않는 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 인식한다. 따라서, 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 비천연적으로 코딩된 아미노산을 상기 시스템 내에서 생산된 단백질 내로 삽입시킴으로써 코딩된 폴리펩티드 내의 위치로 아미노산을 "치환"시킨다.

특정 합성 아미노산을 폴리펩티드 내에 삽입하기 위한 매우 다양한 오르토고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소가 당업계에 기술되어 있고, 일반적으로 본 발명에 사용하기에 적합하다. 예를 들면, 케토 특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 문헌 ([Wang, L., et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 100:56-61(2003)] 및 [Zhang, Z. et al., Biochem. 42(22):6735-6746(2003)])에 기재되어 있다. 예시적 O-RS 또는 그의 일부는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고, 미국 특허 번호 제7,045,337호 및 제7,083,970호(각각 본원에서 참고로 인용된다)에 개시된 아미노산 서열을 포함한다. 또한, ORS와 함께 사용되는 상응하는 O-tRNA 분자 또한 미국 특허 번호 제7,045,337호 및 제7,083,970호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍의 추가적인 예가 WO 2005/007870, WO 2005/007624; 및 WO 2005/019415에 기재되어 있다.

아지드 특이적 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 시스템의 일례는 문헌 [Chin, J. W., et al, J. Am . Chem . Soc. 124:9026-9027(2002)]에 기재되어 있다. p-아지도-L-Phe에 대한 예시적인 O-RS 서열로는 미국 특허 번호 제7,083,970호(본원에서 참고로 인용된다)에 개시되어 있는 뉴클레오티드 서열 서열번호 14-16 및 29-32, 및 아미노산 서열 서열번호 46-48 및 61-64를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 사용하기에 적합한 예시적인 O-tRNA 서열로는 미국 특허 번호 제7,083,970호(본원에서 참고로 인용된다)에 개시되어 있는 것과 같은 뉴클레오티드 서열 서열번호 1-3을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 비천연적으로 코딩된 아미노산에 대해 특이적인 0-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍의 다른 예는 미국 특허 번호 제7,045,337호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. S. 세레비지애에서 케토 함유 아미노산 및 아지드 함유 아미노산, 둘 모두를 도입하는 O-RS 및 O-tRNA는 문헌 [Chin, J. W., et al, Science 301:964-967(2003)]에 기재되어 있다.

수개의 다른 오르토고날 쌍이 보고된 바 있다. E. 콜라이에서 비천연 아미노산을 잠재적으로 도입시키는 것에 관해 S. 세레비지애 tRNA 및 합성효소로부터 유래된 글루타미닐(예를 들면, 문헌 [Liu, D. R., and Schultz, P. G. (1999) Proc . Natl. Acad . Sd . U. S. A. 96:4780-4785] 참조), 아스파틸(예를 들면, 문헌 [Pastrnak, M., et al., (2000) Helv . Chim . Acta 83:2277-2286] 참조), 및 티로실(예를 들면, 문헌 ([Ohno, S., et al., (1998) J. Biochem. (Tokyo , Jpn.) 124:1065-1068]; 및 [Kowal, A. K., et al., (2001) Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 98:2268-2273]) 시스템이 기술된 바 있다. S. 세레비지애에서의 사용에 관해 E. 콜라이 글루타미닐(예를 들면, 문헌 [Kowal, A. K., et al., (2001) Proc . Natl . Acad . Sci. U. S. A. 98:2268-2273) 및 티로실(예를 들면, 문헌 [Edwards, H., and Schimmel, P. (1990) Mol . Cell . Biol . 10:1633-1641]) 합성효소로부터 유래된 시스템이 기술된 바 있다. 포유동물 생체내에서 3-요오도-L-티로신을 도입시키기 위해 E. 콜라이 티로실 시스템이 사용되어 왔다. 문헌 [Sakamoto, K., et al., (2002) Nucleic Acids Res . 30:4692-4699]를 참조한다.

O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소를 사용하는 것은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 코딩하는 특이적인 코돈을 선택하는 것을 포함한다. 임의의 코돈이 사용될 수 있지만, 일반적으로는 O-tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소가 발현되는 세포에서 거의 사용되지 않거나, 전혀 사용되지 않는 코돈을 선택하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 예시적인 코돈은 넌센스 코돈, 예를 들면, 정지 코돈(앰버, 오커, 및 오팔), 4 이상의 염기 코돈, 및 거의 사용되지 않거나, 전혀 사용되지 않는 다른 천연 3 염기 코돈을 포함한다.

특이적인 셀렉터 코돈(들)은 당업계에 공지된 돌연변이 유발 방법(부위 특이적 돌연변이 유발법, 카세트 돌연변이 유발법, 제한 선택 돌연변이 유발법 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다)을 사용하여 IFN 베타 폴리뉴클레오티드 코딩 서열 내의 적절한 위치에 도입할 수 있다.

비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는데 사용될 수 있는 단백질 생합성 기구의 성분, 예를 들면, O-RS, O-tRNA, 및 오르토고날 0-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법은 문헌 [Wang, L. et al., Science 292:498-500 (2001)]; 문헌 [Chin, J. W. et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002)]; 문헌[Zhang, Z. et al., Biochemistry 42:6735-6746 (2003)]에 기재되어 있다. 비천연 아미노산의 생체내 도입을 위한 방법 및 조성물은 본원에서 참고로 인용되는 미국 특허 제7,045,337호에 기재되어 있다. 또한, 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선별하는 방법은 문헌 ([Wang, L., et al., Science 292:498-500(2001)]; [Chin, J. W., et al., J. Am . Chem . Soc. 124:9026-9027(2002)]; [Zhang, Z. et al, Biochemistry 42:6735-6746(2003)])에 기재되어 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 생체내에서 도입히는 방법 및 조성물은 미국 특허 번호 제7,045,337호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선별하는 방법 또한 미국 특허 번호 제7,045,337호 및 제7,083,970호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. PCT 공보 번호 WO 04/035743(발명의 명칭 "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins")(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에는 케토 아미노산의 도입을 위한 오르토고날 RS 및 tRNA 쌍이 기재되어 있다. PCT 공보 번호 WO 04/094593(발명의 명칭 "Expanding the Eukaryotic Genetic Code")(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에는 진핵 숙주 세포에서 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 오르토고날 RS 및 tRNA 쌍이 기재되어 있다.

적어도 하나의 재조합 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 제조하는 방법은 (a) 원핵 유기체, 예를 들면, 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, E. 콜라이, A. 풀기더스(A. fulgidus), P. 푸리오서스(P. furiosus), P. 호리코쉬이(P. horikoshii), A. 페르닉스(A. pernix), T. 써모필러스(T. thermophilus) 등, 또는 진핵 유기체를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 제1 유기체로부터 유래된 적어도 하나의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)로부터 유도된 (임의로 돌연변이체) RS의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재하에 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화시키는 구성원에 대해 RS(임의로 돌연변이체 RS)의 라이브러리를 선별(및/또는 스크리닝)함으로써, 활성(임의로 돌연변이체) RS의 풀을 제공하는 단계; 및/또는 (c) 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부재하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 활성 RS(돌연변이체 RS를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 대해 상기 풀을 (임의로 음성 선별을 통해) 선별함으로써, 적어도 하나의 재조합 O-RS를 제공하는데; 여기서, 적어도 하나의 재조합 O-RS는 비천연 아미노산으로 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 것인 단계를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 상기 RS는 비활성 RS이다. 이러한 비활성 RS는 활성 RS를 돌연변이화시켜 생성할 수 있다. 예를 들어, 상기 비활성 RS는 적어도 약 1개, 적어도 약 2개, 적어도 약 3개, 적어도 약 4개, 적어도 약 5개, 적어도 약 6개, 또는 적어도 약 10개 이상의을 상이한 아미노산(알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)으로 돌연변이화시킴으로써 생성할 수 있다.

돌연변이체 RS의 라이브러리는, 단백질의 3차원적 RS 구조에 기초한 합리적 디자인을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 기법, 또는 무작위적 또는 합리적 디자인 기법을 사용한 RS 뉴클레오티드의 돌연변이 유발법을 사용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 RS는 부위 특이적 돌연변이, 무작위 돌연변이, 다양성 발생 재조합 돌연변이, 키메라 구성체, 합리적 디자인, 및 본원에 기재되어 있는 다른 방법에 의해 생성될 수 있다.

하나의 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재하에 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 아미노아실화시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 활성을 갖는 구성원에 대해 RS(임의로 돌연변이체 RS)의 라이브러리를 선별(및/또는 스크리닝)하는 것은, 항생제 내성 유전자 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 양성 선별 또는 스크리닝 마커, 및 (임의로 돌연변이체) RS의 라이브러리를 복수개의 세포 내로 도입하는 단계(여기서, 상기 양성 선별 및/또는 스크리닝 마커는 앰버, 오커, 또는 오팔 코돈을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함한다); 선별제의 존재하에 상기 복수개의 세포를 배양하는 단계; 양성 선별 또는 스크리닝 마커 중의 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 억제시켜 선별제 및/또는 스크리닝제의 존재하에 생존하는(또는 특이적 반응을 나타내는) 세포를 확인함으로써 활성 (임의로 돌연변이체) RS의 풀을 함유하는 양성적으로 선별된 세포의 서브세트를 제공하는 단계를 포함한다. 임의로, 상기 선별제 및/또는 스크리닝제 농도는 변화시킬 수 있다.

하나의 측면에서, 상기 양성 선별 마커는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT: chloramphenicol acetyltransferase) 유전자이고, 상기 셀렉터 코돈은 CAT 유전자 내의 앰버 정지 코돈이다. 임의로, 상기 양성 선별 마커는 β-락타마제 유전자이고, 상기 셀렉터 코돈은 β-락타마제 유전자 내의 앰버 정지 코돈이다. 또다른 측면에서, 상기 양성 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성에 기초한 스크리닝 마커(세포 표면 마커를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 포함한다.

하나의 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부재하에 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화시키는 활성 RS에 대해 풀을 음성적으로 선별하거나 스크리닝하는 것은, 양성 선별 또는 스크리닝으로부터의 활성 (임의로 돌연변이체) RS의 풀과 함께 음성 선별 또는 스크리닝 마커를 제2 유기체의 복수개의 세포 내로 도입하는 단계(여기서, 상기 음성 선별 또는 스크리닝 마커는 적어도 하나의 셀렉터 코돈(클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 항생제 내성 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함한다); 및 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 스크리닝제 또는 선별제로 보충된 제1 배지에서 생존하거나 특이적인 스크리닝 반응을 나타내지만, 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 선별제 또는 스크리닝제로 보충되지 않은 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 특이적 반응을 나타내지 않는 세포를 확인하여 적어도 하나의 재조합 O-RS를 갖는 생존 세포 또는 스크리닝된 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 예를 들어, CAT 확인 프로토콜은 임의로 적절한 O-RS 재조합체를 확인함에 있어서 양성 선별 및/또는 음성 스크리닝으로서 작용한다. 예를 들어, 클론의 풀은 임의로 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하거나 함유하지 않고 CAT(이는 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함한다)를 함유하는 배양 플레이트 상에서 복제된다. 따라서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 플레이트 상에서만 성장하는 콜로니는 재조합 O-RS를 함유하는 콜로니로 간주된다. 하나의 측면에서, 선별제(및/또는 스크리닝제)의 농도는 변화시킬 수 있다. 몇몇 측면에서, 제1 유기체와 제2 유기체는 상이하다. 따라서, 제1 유기체 및/또는 제2 유기체는 임의로 원핵생물, 진핵생물, 포유동물, 에스케리치아 콜라이, 진균, 효모, 원시세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 스크리닝 마커는 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성에 기초한 스크리닝 마커를 포함한다.

또다른 실시태양에서, 활성 (임의로 돌연변이체) RS의 풀을 스크리닝 또는 선별(음성 선별을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)하는 것은, 양성 선별 단계 (b)로부터 활성 돌연변이체 RS의 풀을 단리시키는 단계; 음성 선별 또는 스크리닝 마커를 도입하는 단계(여기서, 음성 선별 또는 스크리닝 마커는 적어도 하나의 셀렉터 코돈(적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함하는 리보뉴클레아제 바르나제 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는 독성 마커 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함한다), 및 활성 (임의로 돌연변이체) RS의 풀을 제2 유기체의 복수개의 세포 내로 도입하는 단계; 및 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 보충되지 않은 제1 배지에서는 생존하거나 특이적인 스크리닝 반응을 나타내지만, 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 보충된 제2 배지에서는 생존하지 못하거나 특이적인 스크리닝 반응을 나타내지 않는 세포를 확인함으로써 비천연적으로 코딩된 아미노산에 특이적인 적어도 하나의 재조합 O-RS를 갖는 생존 세포 또는 스크리닝된 세포에 제공하는 단계를 포함한다. 하나의 측면에서, 적어도 하나의 셀렉터 코돈은 약 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함한다. 임의로 이러한 실시태양은 적어도 하나의 셀렉터 코돈이 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함하고, 제1 유기체와 제2 유기체가 상이한 경우(각각의 유기체는 임의로 원핵생물, 진핵생물, 포유동물, 에스케리치아 콜라이, 진균, 효모, 원시세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다)를 포함할 수 있다. 또한, 일부 측면은 음성 선별 마커가 리보뉴클레아제 바르나제 유전자(적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함한다)를 포함하는 경우를 포함한다. 다른 측면은 스크리닝 마커가 임의로 형광 또는 발광 스크리닝 마커 또는 친화성에 기초한 스크리닝 마커를 포함하는 경우를 포함한다. 본원의 실시태양에서, 스크리닝 및/또는 선별은 임의로 스크리닝 및/또는 선별 엄격도의 변동을 포함한다.

하나의 실시태양에서, 적어도 하나의 재조합 오르토고날 아미노아실-tRNA 합성효소(O-RS)를 제조하는 방법은 (d) 적어도 하나의 재조합 O-RS를 단리시키는 단계; (e) 적어도 하나의 재조합 O-RS로부터 유도된 O-RS(임의로, 돌연변이화됨)의 제2 세트를 생성하는 단계; 및 (f) O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화할 수 있는 능력을 포함하는 돌연변이된 O-RS를 수득할 때까지 단계(b) 및 단계(c)를 반복하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의로, 단계(d)-(f)를 적어도 약 2회 반복하는 것을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 하나의 측면에서, 적어도 하나의 재조합 O-RS로부터 유도된 돌연변이화된 O-RS의 제2 세트는 무작위 돌연변이 유발법, 부위 특이적 돌연변이 유발법, 재조합 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 돌연변이 유발법에 의해 생성될 수 있다.

상기 기술한 방법에서 양성 선별/스크리닝 단계(b), 음성 선별/스크리닝 단계(c), 또는 양성 및 음성 선별/스크리닝 단계(b) 및 단계(c), 둘 모두를 포함하나, 이에 한정되지 않는 선별/스크리닝 단계의 엄격도는 임의로 선별/스크리닝 엄격도를 변화시키는 것을 포함한다. 또다른 실시태양에서, 양성 선별/스크리닝 단계(b), 음성 선별/스크리닝 단계(c), 또는 양성 및 음성 선별/스크리닝 단계(b) 및 단계(c), 둘 모두는 리포터를 사용하는 것을 포함하는데, 여기서, 리포터는 형광 활성화 세포 분류(FACS: fluorescence-activated cell sorting; FACS)에 의해 검출되거나, 리포터는 발광에 의해 검출된다. 임의로, 리포터는 세포 표면상, 파지 디스플레이상 등에 디스플레이되고, 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 유사체를 포함하는 친화성 또는 촉매 활성을 기초로 선택된다. 하나의 실시태양에서, 돌연변이된 합성효소는 세포 표면상, 파지 디스플레이상 등에 디스플레이된다.

재조합 오르토고날 tRNA(O-tRNA)를 제조하는 방법은 (a) 제1 유기체로부터의 서프레서 tRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재하에서 제2 유기체로부터의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화된(임의로 돌연변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 선별(음성적으로 선별하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)하거나, 스크리닝하여 tRNA(임의로 돌연변이체)의 풀을 제공하는 단계; 및 (c) 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대한 tRNA(임의로 돌연변이체)의 풀을 선별하거나 스크리닝함으로써, 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체로부터의 RS에 의해서는 유효하게 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화되는 적어도 하나의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 하나의 tRNA는 서프레서 tRNA이고/거나, 천연 및/또는 비천연 염기로 된 특이한 3 염기 코돈을 포함하거나, 또는 넌센스 코돈, 희귀 코돈, 비천연 코돈, 적어도 4개의 염기를 포함하는 코돈, 앰버 코돈, 오커 코돈, 또는 오팔 정지 코돈이다. 하나의 실시태양에서, 재조합 O-tRNA는 개선된 오르토고날성을 갖는다. 몇몇 실시태양에서, O-tRNA는 임의로 변형될 필요없이 제2 유기체로부터 제1 유기체로 임의로 유입된다는 점이 이해될 것이다. 다양한 실시태양에서, 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나 상이하고, 임의로 원핵생물(메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 에스케리치아 콜라이, 할로박테리움 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 진핵생물, 포유동물, 진균, 효모, 원시세균, 진정세균, 식물, 곤충, 원생생물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것들로부터 선택된다. 추가로, 재조합 tRNA는 임의로 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 아미노아실화되는데, 여기서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 천연적으로 또는 유전자 조작을 통해 생체내 생합성된다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 임의로 적어도 제1 유기체 또는 제2 유기체에 대한 성장 배지에 첨가한다.

하나의 측면에서, 아미노아실-tRNA 합성효소에 의해 (임의로 돌연변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 선별(음성적으로 선택하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)하거나, 스크리닝하는 단계(단계(b))는 독성 마커 유전자(여기서, 독성 마커 유전자는 셀렉터 코돈(또는 이러한 마커 유전자가 적어도 하나의 셀렉터 코돈을 포함하는 것인 유기체에 필수적인 유전자 또는 독성 약제 또는 항균제를 생산하게 하는 유전자) 및 (임의로 돌연변이체) tRNA의 라이브러리 중 적어도 하나를 포함함)을 제2 유기체로부터의 다수의 세포 내로 도입시키고; 적어도 하나의 오르토고날 tRNA 또는 비기능적 tRNA를 포함하는(임의로 돌연변이체) tRNA의 풀을 포함하는 생존하는 세포를 선별하는 것을 포함한다. 예를 들면, 생존하는 세포는 비교 비율 세포 밀도 분석을 사용함으로써 선별될 수 있다.

또다른 측면에서, 독성 마커 유전자는 2개 이상의 셀렉터 코돈을 포함할 수 있다. 본 방법의 또다른 실시태양에서, 독성 마커 유전자는 리보뉴클레아제 바르나제 유전자이며, 여기서, 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 적어도 하나의 앰버 코돈을 포함한다. 임의로, 리보뉴클레아제 바르나제 유전자는 2개 이상의 앰버 코돈을 포함할 수 있다.

하나의 실시태양에서, 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대해 (임의로 돌연변이체)의 풀을 선별하거나, 스크리닝하는 것은 양성 선별 또는 스크리닝 마커 유전자(여기서, 양성 마커 유전자는 약물 내성 유전자(적어도 하나의 셀렉터 코돈, 예를 들면, 적어도 하나의 앰버 정지 코돈을 포함하는 β-락타마아제 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 유기체에 필수적인 유전자, 또는 O-RS와 함께 독성 약제를 해독하는 유전자를 포함함), 및 (임의로 돌연변이체) tRNA의 풀을 제2 유기체로부터의 다수의 세포에 도입시키는 단계; 및 항생제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 선별제 또는 스크리닝제의 존재하에서 성장하는 생존하거나, 스크리닝된 세포를 동정함으로써 적어도 하나의 재조합 tRNA(여기서, 적어도 하나의 재조합 tRNA는 O-RS에 의해 아미노아실화되고, 적어도 하나의 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 양성 마커 유전자에 의해 코딩된 번역 생성물 내로 아미노산을 삽입함)를 갖는 세포의 풀을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 선별제 및/또는 스크리닝제의 농도는 변화한다.

특이적 O-tRNA/O-RS 쌍을 생성하는 방법을 제공한다. 본 방법은 (a) 제1 유기체로부터의 적어도 하나의 tRNA로부터 유도된 돌연변이체 tRNA의 라이브러리를 생성하는 단계; (b) 제1 유기체로부터의 RS의 부재하에서 제2 유기체로부터 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)에 의해 아미노아실화된 (임의로 돌연변이체) tRNA에 대한 라이브러리를 음성적으로 선별하거나, 스크리닝함으로써 (임의로 돌연변이체) tRNA의 풀을 제공하는 단계; (c) 도입된 오르토고날 RS(O-RS)에 의해 아미노아실화된 구성원에 대한 (임의로 돌연변이체) tRNA의 풀을 선택하거나, 스크리닝함으로써 적어도 하나의 재조합 O-tRNA를 제공하는 단계를 포함한다. 적어도 하나의 재조합 O-tRNA는 셀렉터 코돈을 인식하고, 제2 유기체로부터의 RS에 의해 유효하게 인식되지 않으며, O-RS에 의해 우선적으로 아미노아실화된다. 또한, 본 방법은 (d) 제3 유기체로부터의 적어도 하나의 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)로부터 유도된 (임의로 돌연변이체) RS의 라이브러리를 생성하는 단계; (e) 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 천연 아미노산의 존재하에서 적어도 하나의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 구성원에 대한 돌연변이체 RS의 라이브러리를 선별하거나, 스크리닝하여 활성 (임의로 돌연변이체) RS의 풀을 제공하는 단계; 및 (f) 비천연적으로 코딩된 아미노산의 부재하에서 적어도 하나의 재조합 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 활성 (임의로 돌연변이체) RS에 대한 풀을 음성적으로 선별하거나, 스크리닝함으로써, 적어도 하나의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍(여기서, 하나 이상의 특이적 O-tRNA/O-RS 쌍은 비천연적으로 코딩된 아미노산 및 적어도 하나의 재조합 O-tRNA에 특이적인 적어도 하나의 재조합 O-RS를 포함함)을 제공하는 단계를 포함한다. 본 방법에 의해 제조된 특이적인 0-tRNA/O-RS 쌍을 포함한다. 예를 들면, 특이적인 O-tRNA/O-RS 쌍은 mutRNATyr-mutTyrRS 쌍, 예를 들면, mutRNATyr-SS12TyrRS 쌍, mutRNALeu-mutLeuRS 쌍, mutRNAThr-mutThrRS 쌍, mutRNAGlu-mutGluRS 쌍 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것들을 포함할 수 있다. 추가로, 이러한 방법은 제1 유기체와 제3 유기체가 동일한(메타노코커스 잔나스키이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 경우를 포함한다.

또한, 제2 유기체의 생체내 번역 시스템에 사용하기 위한 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 선별하는 방법도 본 발명에 포함된다. 본 방법은 마커 유전자, tRNA 및 제1 유기체로부터 단리되거나, 또는 유도된 아미노아실-tRNA 합성효소(RS)를 제2 유기체로부터의 세포의 제1 세트 내로 도입시키고; 상기 마커 유전자 및 tRNA를 제2 유기체로부터의 중복 세포 세트에 도입시키고; 중복 세포 세트에서는 생존하지 못하는 제1 세트에서 생존하는 세포를 선별하거나, 중복 세포 세트에서는 이러한 반응을 제공하지 못하는 특이적 스크리닝 반응을 나타내는 세포를 스크리닝하는 것을 포함하는데, 여기서, 상기 제1 세트 및 중복 세포 세트는 선별제 또는 스크리닝제의 존재하에서 성장하고, 상기 생존하거나 스크리닝된 세포는 제2 유기체의 생체내 번역 시스템에서 사용되는 오르토고날 tRNA-tRNA 합성효소 쌍을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 한 실시양태에서, 비교 및 선별 또는 스크리닝은 생체내 상보성 분석을 포함한다. 선별제 또는 스크리닝제의 농도는 변화할 수 있다.

본 발명의 유기체는 다양한 유기체 및 다양한 조합체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 사용되는 제1 유기체 및 제2 유기체는 동일하거나, 상이할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 유기체는 임의로 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 에스케리치아 콜라이, A. 풀기더스, P. 푸리오서스, P. 호리코쉬이, A. 페르닉스, T. 써모필러스 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 원핵생물 유기체이다. 별법으로, 상기 유기체는 임의로 식물(예를 들어, 외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물 등과 같은 고등 식물), 조류, 원생 생물, 진균(예를 들어, 효모 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 동물(예를 들어, 포유동물, 곤충 및 절지 동물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 진핵생물 유기체이다. 또다른 실시태양에서, 제2 유기체는 메타노코커스 잔나스키이, 메타노박테리움 써모오토트로피쿰, 할로박테리움, 에스케리치아 콜라이, A. 풀기더스, 할로박테리움, P. 푸리오서스, P. 호리코쉬이, A. 페르닉스, T. 써모필러스 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 원핵생물 유기체이다. 별법으로, 제2 유기체는 효모, 동물 세포, 식물 세포, 진균, 포유동물 세포 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 진핵생물 유기체이다. 다양한 실시태양에서, 제1 및 제2 유기체는 상이한다.

VI . IFN 베타 폴리펩티드 내의 비천연적으로 발생된 아미노산의 위치

본 발명은 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 IFN 베타 폴리펩티드 내로 도입하는 것에 관한 것이다. 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산은 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않는 특정 위치에 도입될 수 있다. 이는 소수성 아미노산과 소수성 아미노산의 치환, 벌키한 아미노산과 벌키한 아미노산의 치환, 친수성 아미노산과 친수성 아미노산의 치환 및/또는 활성에 필요치 않은 위치에 비천연적으로 발생된 아미노산을 삽입하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 "보존적" 치환을 수행함으로써 이루어질 수 있다.

비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환되기에 바람직한 IFN 베타 폴리펩티드 내의 위치를 선택하기 위하여 다양한 생화학적 및 구조적 접근법을 사용할 수 있다. 상기 폴리펩티드 쇄 중 임의의 위치가 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입시키는 선택 방법에 적합하고, 이러한 선택은 합리적인 디자인에 기초하여 이루어질 수 있거나, 임의의 원하는 목적을 위해 또는 별다른 특정의 원하는 목적없이 무작위적인 선택에 의해 이루어질 수 있다는 사실이 당업계의 숙련인에게는 명백히 이해될 것이다. 원하는 부위를 선택함으로써 효현제, 초 효현제, 역 효현제, 길항제, 수용체 결합 조정제, 수용체 활성 조정제, 이량체 또는 다량체를 형성하는 활성 또는 특성, 본래의 분자와 차이가 없는 활성 또는 특성, 또는 또는 폴리펩티드의 임의의 물리적 또는 화학적 특성, 예를 들어, 가용성, 응집성 또는 안정성을 조정하는 활성 또는 특성을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 원하는 특성 또는 활성을 갖는 IFN 베타 분자를 생산해낼 수 있다. 예를 들어, IFN 베타 폴리펩티드의 생물학적 활성에 필요한 폴리펩티드내 위치는 당업계에 공지되어 있는 점 돌연 변이 분석법, 알라닌 스캐닝법, 포화 돌연변이 유발법 및 생물학적 활성에 대한 스크리닝법, 또는 상동체 스캐닝법을 사용하여 확인할 수 있다. IFN 베타 폴리펩티드의 변형을 위한 잔기를 확인하는데 사용될 수 있는 다른 방법으로는 서열 프로파일링(문헌 [Bowie and Eisenberg, Science 253(5016): 164-70, (1991)]), 로타머 라이브러리 선별(문헌 ([Dahiyat and Mayo, Protein Sci 5(5):895-903(1996)]; [Dahiyat and Mayo, Science 278(5335): 82-7(1997)]; [Desjarlais and Handel, Protein Science 4:2006-2018(1995)]; [Harbury et al, PNAS USA 92(18): 8408-8412 (1995)]; [Kono et al., Protein: Structure, Function and Genetics 19: 244-255(1994)]; [Hellinga and Richards, PNAS USA 91:5803-5807(1994)])); 및 잔기 쌍 전위(문헌 [Jones, Protein Science 3:567-574, (1994)]), 및 단백질 디자인 자동화^® 기술(Protein Design Automation^® technology)을 사용하는 합리적 디자인을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(미국 특허 번호 제6,188,965호; 제6,269,312호; 제6,403,312호; WO 98/47089(참고로 인용된다) 참조). 생체활성에 중요한 잔기, 약제학적 안정성에 관여하는 잔기, 항체 에피토프, 또는 수용체 결합 잔기가 돌연변이화될 수 있다. 미국 특허 번호 제5,580,723호; 제5,834,250호; 제6,013,478호; 제6,428,954호; 및 제6,451,561호(본원에서 참고로 인용된다)에는 표적 물질을 사용하여 폴리펩티드의 활성에 영향을 주는 활성 도메인을 확인함으로써, 폴리펩티드 예를 들면, IFN 베타의 구조와 기능을 체계적으로 분석하는 방법이 기재되어 있다. 문헌 ([Runkel et al. Biochemistry(2000) 39:2538-2551] 및 [Journal of Interferon and Cytokine Research(2001) 21:931-941])에는 수용체 결합 및 생물학적 활성에 관여하는 영역을 확인하기 위하여 인간 IFN 베타 1a의 돌연변이 항체 및 모노클로날 항체를 분석하는 것이 기재되어 있다. IFN 베타 돌연변이체의 클로닝, 발현, 정제, 비아코어 분석, 및 항바이러스성 및 항증식성 분석에 의한 평가가 기재된 바 있다. 문헌 [Basu et al. Bioconjugate Chem(2006) 17:618-630]에는 PEG 중합체를 사용하여 제조된 IFN 베타 및 상이한 접합체의 부위 지정 돌연변이 유발법이 기재되어 있다. 알라닌 또는 상동체 스캐닝 돌연변이 유발법에 의해서 생물학적 활성에 중요한 것으로서 확인된 것 이외의 잔기는 폴리펩티드에 필요한 원하는 활성에 따라, 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의한 치환에 대해 우수한 후보자가 될 수 있다. 별법으로, 생물학적 활성에 중요한 것으로서 확인된 부위 또한 이 역시 폴리펩티드에 필요한 원하는 활성에 따라, 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의한 치환에 대해 우수한 후보자가 될 수 있다. 또다른 대안은 폴리펩티드 상의 각 위치에서 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 간단하게 일련의 치환을 일으키고, 상기 폴리펩티드의 활성에 미치는 효과를 관찰하는 것일 수 있다. 임의의 폴리펩티드에서 비-천연 아미노산에 의한 치환 위치를 선별하는 임의의 수단, 기법, 또는 방법이 본 발명에 사용하기에 적합하다는 것이 당업계의 숙련인에게는 명백히 이해될 것이다.

결실을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드 돌연변이체의 구조 및 활성을 조사하여 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의한 치환에 내성을 가지기 쉬운 단백질의 영역을 결정할 수 있다. 유사한 방식으로, 프로테아제 분해 및 모노클로날 항체를 사용하여 IFN 수용체의 결합을 담당하는 IFN 베타의 영역을 확인할 수 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의한 치환에 대해 내성을 갖지 않을 것으로 보이는 잔기를 제거한 후, 남아있는 각 위치에서 제안되는 치환의 영향을 조사할 수 있다. 모델은 다른 IFN 계열 구성원 및 IFN 수용체의 3차 결정 구조로부터 생성할 수 있다. 단백질 데이터 뱅크(PDB: Protein Data Bank, 월드 와이드 웹 상의 rcsb.org에서 이용가능)는 단백질 및 핵산의 대형 분자의 3차원 구조적 데이터를 함유하는 중앙집중형 데이터베이스이다. 3차원 구조적 데이터가 이용할 수 없는 경우, 폴리펩티드의 2차 및 3차 구조를 조사하기 위한 모델을 제조할 수 있다. 따라서, 당업계의 숙련인은 비천연적으로 코딩된 아미노산에 의해 치환될 수 있는 아미노산 위치를 쉽게 확인할 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 폴리펩티드의 구조를 붕괴시키지 않는 단백질의 영역에 위치한 하나 이상의 비천연적으로 발생된 아미노산을 포함한다.

비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 예시적인 잔기는 잠재적 수용체 결합 영역으로부터 배제된 잔기일 수 있거나, 완전히 또는 부분적으로 용매에 노출될 수 있거나, 인접 잔기와의 최소한의 수소 결합 상호작용을 하거나 수소 결합 상호작용을 전혀 하지 않을 수 있거나, 인접 반응성 잔기에 최소한으로 노출될 수 있거나, 하나 이상의 노출면 상에 존재할 수 있거나, 제2 IFN 베타, 또는 다른 분자 또는 그의 단편과 병치되는 부위 또는 부위들일 수 있거나, IFN 베타의 수용체에 결합하고 있거나, 결합하지 않은, 또는 또다른 생물학적 활성 분자에 커플링되어 있거나, 커플링되지 않은 IFN 베타의 3차원, 2차, 3차, 또는 4차 구조에 에 의해 예측할 때 고도의 가용성을 갖거나, 구조상 강직한 영역일 수 있거나, 전체 구조의 가용성 또는 강직성을 원하는 대로 변경시켜 IFN 베타 그 자체, 또는 하나 이상의 IFN 베타를 포함하는 이량체 또는 다량체의 형태를 조정할 수 있다.

상기와 같은 IFN 베타의 분석을 통해 단백질의 3차 구조 내에 묻혀있는 아미노산 잔기와 비교하여 표면에 노출되어 있는 잔기가 어떤 잔기인지를 결정할 수 있다는 것을 당업계의 숙련인은 이해할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 실시태양은 표면에 노출된 잔기인 아미노산을 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하는 것이다.

몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN 내의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 위치 1 앞(즉, N 말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167(즉, 단백질의 카르복실 말단에서), 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산).

몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다음과 같은 인터페론 베타 내의 2차 구조에 상응하는 하기 영역들 중 하나 이상의 영역 내의 임의의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산으로부터 나선 A(2-22); 나선 B(51-71); 나선 C(80-107); 나선 D(118-136); 나선 E(139-162); AB 루프: AB1(23-35); AB2(36-40); AB3(41-50). 다른 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인터페론 베타(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4로부터의 상응하는 아미노산)의 잔기 25-35, 80-100, 및 121-135로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환된다. 다른 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 서열번호 1로부터, 또는 서열번호 3, 4로부터의 상응하는 아미노산으로부터의 인터페론 베타로부터 잔기 41-49로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환된다. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN 베타의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 및 그의 임의 조합. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN 베타의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155, 및 그의 임의 조합. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN 베타의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 15, 42, 80, 108, 111, 155, 및 그의 임의 조합. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 천연 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 C17S 치환(17번 위치에서 시스테인에서 세린으로의 치환)을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 C17S 치환(17번 위치에서 시스테인에서 세린으로의 치환) 및 하나 이상의 천연 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 신호 서열 중에 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 4의 신호 서열 중에 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 4의 신호 서열 중 하나 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산은 서열번호 4의 리더 또는 신호 서열 중에, 또는 다른 IFN 베타 서열 중에 도입된다.

IFN 베타 또는 IFN 계열 구성원(들)의 결정 구조, 및 그와 IFN 수용체와의 상호작용에 관한 조사를 통해 어떤 특정 아미노산 잔기가 용매에 대한 완전한 또는 부분적인 접근가능성을 갖는 측쇄를 가지고 있는지를 나타낼 수 있다. 이들 위치에 있는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄는 단백질 표면에서 떨어져 있는 부분을 향해 용매쪽으로 향해 있을 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 영역들 중 하나 이상의 영역에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산으로부터 나선 A(2-22); 나선 B(51-71); 나선 C(80-107); 나선 D(118-136); 나선 E(139-162); AB 루프: AB1(23-35); AB2(36-40); AB3(41-50). 다른 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 영역들 중 하나 이상의 영역에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 인터페론 베타(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4로부터의 상응하는 아미노산)의 잔기 25-35, 80-100, 및 121-135. 다른 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 영역들 중 하나 이상의 영역에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4로부터의 상응하는 아미노산으로부터 인터페론 베타로부터의 잔기 41-49. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기 위치를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 위치들 중 하나 이상의 위치에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 및 그의 임의 조합. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기 위치를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 위치들 중 하나 이상의 위치에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155, 및 그의 임의 조합. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기 위치를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 위치들 중 하나 이상의 위치에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 15, 42, 80, 108, 111, 155, 및 그의 임의 조합. 몇몇 실시태양에서, 신호 또는 리더 서열 중 비천연적으로 발생된 아미노산은 수용성 중합체에 연결되어 있다(서열번호 4 또는 다른 IFN 베타 서열).

매우 다양한 비천연적으로 코딩된 아미노산이 IFN 베타 폴리펩티드 중 주어진 위치에서 치환될 수 있거나, 그 위치 내로 도입될 수 있다. 일반적으로, 도입을 위한 특정 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN 베타 폴리펩티드 또는 다른 IFN 계열 구성원과 그의 수용체의 3차원 결정 구조, 보존적 치환에 대한 선호성(즉, Phe, Tyr 또는 Trp를 아릴계 비천연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들면, p-아세틸페닐알라닌 또는 O-프로파르길티로신으로 치환), 및 IFN 베타 폴리펩티드 내로 도입시키고자 하는 특이적 접합화 화학(예를 들면, 알킨 부분을 갖는 수용성 중합체를 사용한 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 또는 아릴 에스테르를 가짐으로써 포스핀 부분을 혼입하는 수용성 중합체를 사용한 아미드 결합 형성에 영향을 미치고자 하는 경우, 4-아지도페닐알라닌을 도입시킴)의 조사를 기초로 선택된다.

하나의 실시태양에서, 본 방법은 제1 반응기를 포함하는 비천연 아미노산을 단백질에 도입시키고; 상기 단백질을 제2 반응기를 포함하는 분자(표지, 염료, 중합체, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 광가교결합제, 방사성 핵종, 세포독성 화합물, 약물, 친화성 표지, 광친화성 표지, 반응성 화합물, 수지, 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 금속 킬레이트제, 보조인자, 지방산, 당질, 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 당류, 수용성 덴드리머, 사이클로덱스트린, 억제성 리보핵산, 생체물질, 나노입자, 스핀 표지, 형광발색단, 금속 함유 부분, 방사능 부분, 신규한 작용기, 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지드 부분, 화학선 방사 여기 부분, 광이성화 가능한 부분, 비오틴, 비오틴 유도체, 비오틴 유사체, 중원자 도입 부분, 화학적으로 절단 가능한 기, 광절단 가능한 기, 신장된 측쇄, 탄소 연결 당, 산화환원 활성 제제, 아미노 티오산, 독성 부분, 동위 원소로 표지된 부분, 생체물리적 프로브, 인광성 기, 화학발광성 기, 전자 밀집 기, 자성 기, 인터칼레이팅 기, 발색단, 에너지 전달제, 생물학적 활성제, 검출가능한 표지, 소분자, 양자점, 나노트랜스미터, 방사성뉴클레오티드, 방사성트랜스미터, 중성자 포획제, 또는 상기 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 제1 반응기는 제2 반응기와 반응하여 [3+2] 사이클로첨가를 통해 분자를 비천연 아미노산에 부착시킨다. 하나의 실시태양에서, 제1 반응기는 알키닐 또는 아지도 부분이고, 제2 반응기는 아지도 또는 알키닐 부분이다. 예를 들면, 제1 반응기는 알키닐 부분(비천연 아미노산 중의 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)이고, 제2 반응기는 아지도 부분이다. 또다른 예에서, 제1 반응기는 아지도 부분(비천연 아미노산 중의 p-아지도-L-페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)이고, 제2 반응기는 알키닐 부분이다.

몇몇 경우에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환(들)은 IFN 베타 폴리펩티드에 의한 다른 첨가, 치환 또는 결실과 조합되어 IFN 베타 폴리펩티드의 다른 생물학적 형질에 영향을 미치게 된다. 몇몇 경우에서, 다른 첨가, 치환 또는 결실은 IFN 베타 폴리펩티드의 안정성(단백질 분해적 분해에 대한 내성을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 증가시키거나, IFN 베타 폴리펩티드의 그의 수용체에 대한 친화성을 증가시킬 수 있다. 몇몇 경우에서, 다른 첨가, 치환 또는 결실은 IFN 베타 폴리펩티드의 약제학적 안정성을 증가시킬 수 있다. 몇몇 경우에서, 다른 첨가, 치환 또는 결실은 IFN 베타 폴리펩티드의 항바이러스성 활성을 증강시킬 수 있다. 몇몇 경우에서, 다른 첨가, 치환 또는 결실은 IFN 베타 폴리펩티드의 가용성(E. 콜라이 또는 다른 숙주 세포 중에서 발현되는 경우를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 증가시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서 첨가, 치환 또는 결실은 E. 콜라이 또는 다른 재조합 숙주 세포에서 발현된 후 IFN 베타 폴리펩티드 가용성을 증가시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, E. 콜라이 또는 다른 재조합 숙주 세포에서 발현된 후 폴리펩티드 가용성을 증가시키게 되는 비-천연 아미노산의 혼입을 위한 또다른 부위 외에도 천연적으로 코딩된 아미노산 또는 비-천연 아미노산에 의한 치환을 위한 부위도 선택된다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 IFN 베타 폴리펩티드 수용체, 결합 단백질, 또는 관련 리간드에 대한 친화성을 조정하거나, IFN 수용체에의 결합 후에 신호 전달을 조정하거나, 순환 반감기를 조정하거나, 방출 또는 생체이용률을 조정하거나, 정제를 용이하게 하거나, 특정 투여 경로를 개선시키거나 변경시키는 또다른 첨가, 치환 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 IFN 베타 변이체의 수용체에 대한 IFN 베타 변이체의 친화성을 증가시키는 첨가, 치환 또는 결실을 포함한다. 유사하게, IFN 베타 폴리펩티드는 화학적 또는 효소적 절단 서열, 프로테아제 절단 서열, 반응기, 항체 결합 도메인(FLAG 또는 폴리-His를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 다른 친화성에 기초한 서열(FLAG, 폴리-His, GST 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 폴리펩티드의 검출(GFP를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 정제, 조직 또는 세포막을 통한 수송, 프로드럭 방출 또는 활성화, IFN 베타 크기 축소 또는 다른 형질을 개선시키는 연결된 분자(비오틴을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 포함할 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산의 치환은 IFN 베타 길항제를 생성한다. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 수용체 결합에 관여하는 영역에서 치환되거나, 그 영역에 첨가된다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 길항제는 IFN 베타가 길항제로서 작용할 수 있도록 하는 적어도 하나의 치환을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 길항제는 IFN 베타 분자의 수용체 결합 영역에 존재하는, 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.

몇몇 경우에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산이 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다. 몇몇 경우에서, IFN 베타 폴리펩티드는 천연적으로 발생된 아미노산이 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 치환을 추가로 포함한다. 예를 들면, 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 내의 하나 이상의 잔기가 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다. 몇몇 경우에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 잔기는 하나 이상의 저분자량의 선형 또는 분지형 PEG에 연결됨으로써 단일의 고분자량의 PEG에 부착된 종과 비교할 때 결합 친화성과 동등한 혈청 반감기를 증강시킨다.

몇몇 실시태양에서, IFN 베타의 하기 잔기들 중 2개 이하의 잔기가 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다.

VII . 비진핵생물 및 진핵생물에서의 발현

클로닝된 IFN 베타 폴리뉴클레오티드를 높은 수준으로 발현시키기 위해 본 발명자들은 전형적으로 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 전사를 지시하는 강한 프로모터, 전사/번역 종결자, 및 단백질을 코딩하는 핵산의 경우에는 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위를 함유하는 발현 벡터에 서브클로닝한다. 적합한 세균 프로모터는 당업계의 숙련인에게 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌 [Sambrook et al. and Ausubel et al.]에 기재되어 있다.

본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드를 발현시키기 위한 세균 발현 시스템은 E. 콜라이, 바실러스 속(Bacillus sp .), 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 에어루기노사, 슈도모나스 푸티다, 및 살모넬라를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것에서 이용가능하다(문헌 ([Palva et al., Gene 22:229-235(1983)]; [Mosbach et al., Nature 302:543-545(1983)])). 이러한 발현 시스템용 키트는 상업적으로 이용가능하다. 포유동물 세포, 효모 및 곤충 세포를 위한 진핵 발현 시스템은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있고, 또한 상업적으로 이용가능하다. 오르토고날 tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소(상기한 바와 같음)를 사용하여 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드를 발현시키는 경우, 발현을 위한 숙주 세포는 오르토고날 성분을 사용할 수 있는 그들의 능력을 기초로 선택된다. 예시적인 숙주 세포로는 그람 양성 세균(B. 브레비스(B. brevis), B. 서브틸리스(B. subtilis), 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 그람 음성 세균(E. 콜라이, 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 에어루기노사, 슈도모나스 푸티다) 뿐만 아니라, 효모 및 다른 진핵세포를 포함한다. O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포는 본원에 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.

본 발명의 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 많은 유용한 양으로 합성할 수 있는 능력을 제공한다. 하나의 측면에서, 조성물은 임의로 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 적어도 10 ㎍, 적어도 50 ㎍, 적어도 75 ㎍, 적어도 100 ㎍, 적어도 200 ㎍, 적어도 250 ㎍, 적어도 500 ㎍, 적어도 1 mg, 적어도 10 mg, 적어도 100 mg, 적어도 1 g 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 양, 또는 생체내 단백질 생산 방법(재조합 단백질 생산 및 정제에 관한 상세한 설명은 본원에 제공되어 있음)을 사용함으로써 달성될 수 있는 양을 포함한다. 또다른 측면에서, 단백질은 세포 용해물, 완충액, 약제학적 완충액, 또는 다른 액체 현탁액을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것(약 1 nl 내지 약 100 ℓ 중 임의의 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 부피를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 중의 1 ℓ당 적어도 10 ㎍의 단백질, 1 ℓ당 적어도 50 ㎍의 단백질, 1 ℓ당 적어도 75 ㎍의 단백질, 1 ℓ당 적어도 100 ㎍의 단백질, 1 ℓ당 적어도 200 ㎍의 단백질, 1 ℓ당 적어도 250 ㎍의 단백질, 1 ℓ당 적어도 500 ㎍의 단백질, 1 ℓ당 적어도 1 mg의 단백질, 또는 1 ℓ당 적어도 10 mg 이상의 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 농도로 조성물 중에서 존재한다. 진핵세포에서 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 대량(전형적으로, 시험관내 번역을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 방법을 사용하여 생산할 수 있는 양보다 더 많은 양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 생산하는 것이 본 발명의 한 특징이다.

본 발명의 진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 많은 유용한 양으로 생합성할 수 있는 능력을 제공한다. 예를 들면, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 세포 추출물, 세포 용해물, 배양 배지, 완충액 등 중 적어도 10 ㎍/ℓ, 적어도 50 ㎍/ℓ, 적어도 75 ㎍/ℓ, 적어도 100 ㎍/ℓ, 적어도 200 ㎍/ℓ, 적어도 250 ㎍/ℓ, 또는 적어도 500 ㎍/ℓ, 적어도 lmg/ℓ, 적어도 2mg/ℓ, 적어도 3 mg/ℓ, 적어도 4 mg/ℓ, 적어도 5 mg/ℓ, 적어도 6 mg/ℓ, 적어도 7 mg/ℓ, 적어도 8 mg/ℓ, 적어도 9 mg/ℓ, 적어도 10 mg/ℓ, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/ℓ, 1 g/ℓ, 5 g/ℓ, 10 g/ℓ 이상의 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 농도로 생산될 수 있다.

IFN 베타의 발현에 적합한 다수의 벡터가 상업적으로 이용가능한다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터로는 SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 사이토메갈로바이러스로부터 유래된 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 그러한 벡터로는 pCDNA3.1(+)/Hyg(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재) 및 pCI-neo(Stratagene, 미국 캘리포니아주 라호야 소재)를 포함한다. 세균 플라스미드, 예를 들면, pBR322, pET3a 및 pET12a를 포함하는, E. 콜라이로부터 유래된 플라스미드, 숙주 범위가 더 광범위한 플라스미드, 예를 들면, RP4, 파지 DNA, 예로서, 파지 람다의 많은 유도체, 예로서, NM989, 및 다른 DNA 파지, 예를 들면, M13 및 섬유상의 싱글 스트랜드 DNA 파지가 사용될 수 있다. 2 μ 플라스미드 및 그의 유도체, POT1 벡터(미국 특허 번호 제4,931,373호(참고로 인용된다))), 문헌 [Okkels, Ann. New York Aced. Sci. 782, 202 207, 1996]에 기재되어 있는 pJSO37 벡터, 및 pPICZ A, B 또는 C(Invitrogen)가 효소 숙주 세포와 함께 사용될 수 있다. 숙주 세포의 경우, 벡터는 pVL941, pBG311(문헌 [Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685 98 (1986)]), pBluebac 4.5 및 pMelbac(Invitrogen, 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

IFNB 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있거나, 포함하지 않을 수 있다. 신호 펩티드는 폴리펩티드가 발현된 세포로부터 분비될 때에 존재한다. 그러한 신호 펩티드는 임의의 서열일 수 있다. 신호 펩티드는 원핵세포 또는 진핵세포로부터 유래할 수 있다. 문헌 [Coloma, M(1992) J. Imm. Methods 152:89 104]에는 포유동물 세포에서 사용되는 신호 펩티드(뮤린 Ig 카파 경쇄 신호 펩티드)가 기재되어 있다. 다른 신호 펩티드로는 S. 세레비지애로부터 유래된 α-인자 신호 펩티드(미국 특허 번호 제4,870,008호(본원에서 참고로 인용된다)), 마우스 타액 아밀라제의 신호 펩티드(문헌 [O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643-646]), 변형된 카르복시펩티다제 신호 펩티드(문헌 [L. A. Vails et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897]), 효모 BAR1 신호 펩티드(WO 87/02670(본원에서 참고로 인용된다)), 및 효모 아스파르트산 프로테아제 3(YAP3: yeast aspartic protease 3) 신호 펩티드(문헌 [M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137] 참조)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

적합한 포유동물 숙주 세포의 예는 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 그러한 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO) 세포(예로서, CHO-K1; ATCC CCL-61), 녹색 원숭이 세포(COS)(예로서, COS 1(ATCC CRL-1650), COS 7(ATCC CRL-1651)); 마우스 세포(예로서, NS/O), 새끼 햄스터 신장(BHK: Baby Hamster Kidney) 세포주(예로서, ATCC CRL-1632 또는 ATCC CCL-10), 및 인간 세포(예로서, HEK 293(ATCC CRL-1573)) 뿐만 아니라, 조직 배양물 중의 세포일 수 있다. 이러한 세포주 및 다른 세포주들은 예를 들면, 메릴랜드주 로크빌 소재의 아메리칸 타이프 컬쳐 컬랙숀과 같은 기탁 공공기관으로부터 이용가능하다. IFN 베타 폴리펩티드의 글리코실화를 개선시키기 위해 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,047,335호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 바와 같이, 시알릴트랜스퍼라제, 예로서, 1,6-시알릴트랜스퍼라제를 발현하도록 포유동물 숙주 세포를 변형시킬 수 있다.

외인성 DNA를 포유동물 숙주 세포 내로 도입하는 방법은 인산칼슘 매개 형질감염, 전기천공, DEAE 덱스트란 매개 형질감염, 리포좀 매개 형질감염, 바이러스 벡터, 및 라이프 테크놀로지스 리미티드(Life Technologies Ltd)(영국 페이즐리 소재)에 의해 기술된 리포펙트아민(Lipofectamin) 2000을 사용하는 형질감염 및 로슈 다이아그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnostics Corporation)(미국 인디애나폴리스 소재)에 의해 기술된 FuGENE 6을 사용하는 형질감염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 방법들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 문헌 [Ausbel et al. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA]에 기재되어 있다. 포유동물 세포의 배양은 예를 들면, 문헌 ([Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999], [Human Press Inc. Totowa, N. J., USA and Harrison Mass. and Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997])에 기재되어 있는 방법과 같은 확립된 방법에 따라 수행될 수 있다.

I. 발현 시스템, 배양 및 단리

IFN 베타 폴리펩티드는 예를 들면, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포 및 세균을 비롯한 임의의 많은 적합한 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 하기에서 예시적인 발현 시스템에 대해 설명한다.

효모 본원에 사용된 용어 "효모"는 IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있는 임의의 다양한 효모를 포함한다. 이러한 효모는 자낭포자형성(ascosporogenous) 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자포자(basidiosporogenous) 효모 및 불완전 진균류(Fungi imperfecti)(블라스토마이세테스(Blastomycetes)) 군에 속하는 효모를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 자낭포자형성 효모는 2개의 족, 스퍼모프토라세에(Spermophthoraceae) 및 사카로마이세타세에(Saccharornycetaceae)로 나뉜다. 후자는 4 개의 아족, 스키조사카로마이코이데에(Schizosaccharomycoideae)(예를 들면, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속), 마드소니오이데에(Nadsonioideae), 리포마이코이데에(Lipomycoideae) 및 사카로마이코이데에(Saccharomycoideae)(예를 들면, 피치아(Pichia) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속 및 사카로마이세스(Saccharomyces) 속)를 포함한다. 담자포자 효모는 류코스포리디움(Leucosporidium) 속, 로도스포리디움(Rhodosporidium) 속, 스포리디오볼루스(Sporidiobolus) 속, 필로바시디움(Filobasidium) 속 및 필로바시디엘라(Filobasidiella) 속을 포함한다. 불완전 진균류(블라스토마이세테스) 군에 속하는 효모는 2개의 족, 스포로볼로마이세타세에(Sporobolomycetaceae)(예를 들면, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces) 속 및 불레라(Bullera) 속) 및 크립토코카세에(Cryptococcaceae)(예를 들면, 칸디다(Candida) 속)로 나뉜다.

본 발명에 사용하기에 특히 관심의 대상이 되는 것으로는 P. 파스토리스(P. pastoris), P. 귈러리몬디이(P. guillerimondii), S. 세레비지애(S. cerevisiae), S. 칼스버겐시스(S. carlsbergensis), S. 디아스타티쿠스(S. diastaticus), S. 더글라시이(S. douglasii), S. 클루이베리(S. kluyveri), S, 노르벤시스(S, norbensis), S. 오비포르미스(S. oviformis), K. 락티스(K. lactis), K. 프라길리스(K. fragilis), C. 알비칸스(C. albicans), C. 말토사(C. maltosa) 및 H. 폴리모르파(H. polymorpha)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 피치아 속, 클루이베로마이세스 속, 사카로마이세스 속, 스키조사카로마이세스 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 토룰롭시스(Torulopsis) 속 및 칸디다 속에 속하는 종이 있다.

IFN 베타 폴리펩티드를 발현시키는데 적합한 효모의 선택 방법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 발현용 효모 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주로서는 예를 들면, 분비능이 우수한 숙주, 단백 분해 활성이 낮은 숙주, 분비능이 우수한 숙주, 및 가용성 단백질 생산이 우수한 숙주, 전체적으로 건강한 숙주를 포함할 수 있다. 일반적으로, 효모는 캘리포니아 대학(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 인섹트 제네틱 스톡 센터(Bacterial Genetic Stock Center) 및 아메리칸 타이프 컬쳐 컬랙숀("ATCC": American Type Culture Collection)(버지니아주 만나사스 소재)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 이용가능하다.

용어 "효모 숙주" 또는 "효모 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나, 또는 사용된 효모를 지칭한다. 상기 용어는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA를 받은 원래의 효모 숙주 세포의 자손들도 포함한다. 단일 모세포의 자손은 우발적이거나, 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원래의 모체와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 상보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 특성, 예를 들면, IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.

염색체외 레플리콘 또는 통합 벡터를 비롯한 발현 벡터 및 형질전환 벡터가 많은 효모 숙주로의 형질전환을 위해 개발되었다. 예를 들면, S. 세레비지애(문헌 [Sikorski et al., GENETICS(1989) 122:19]; [Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153:163]; [Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA(1978) 75:1929]); C. 알비칸스(문헌 [Kurtz et al., MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142]); C. 말토사(문헌 [Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141]); H. 폴리모르파(문헌 ([Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459]; [Roggenkamp et al., MOL. GENETICS AND GENES(1986) 202:302])); K. 프라길리스(문헌 [Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158:1165]); K. 락티스(문헌 ([De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154:737]; [Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY(NY)(1990) 8:135])); P. 귈러리몬디(문헌 [Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141]); P. 파스토리스(미국 특허 번호 제5,324,639호; 제4,929,555호; 및 제 4,837,148호; [Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376]); 스키조사카로마이세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe)(문헌 [Beach et al., NATURE(1982) 300:706]); 및 Y. 리폴리티카(Y. lipolytica); A. 니둘란스(A. nidulans)(문헌 ([Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89]; [Tilburn et al., GENE(1983) 26:205-221]; 및 [Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA(1984) 81:1470-74]); A. 니거(A. niger)(문헌 [Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479]); T. 리시아(T. reesia)(EP 0 244 234); 및 섬유상 진균, 예를 들면, 예로서, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium)(WO 91/00357)(상기 각 문헌은 본원에서 참고로 인용된다)에 대한 발현 벡터가 개발되었다.

효모 벡터에 대한 제어 서열은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있고, 알코올 데하이드로게나아제(ADH: alcohol dehydrogenase)(EP 0 284 044); 에놀라제; 글루코키나제; 글루코스-6-포스페이트 이소머라제; 글리세르알데히드-3-포스페이트-데하이드로게나아제(GAP 또는 GAPDH); 헥소키나제; 포스포프룩토키나제; 3-포스포글리세레이트 뮤타아제; 및 피루베이트 키나제(PyK)(EP0 329 203)와 같은 유전자로부터의 프로모터 영역을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 산 포스파타제를 코딩하는 효모 PH05 유전자도 유용한 프로모터 서열을 제공할 수 있다(문헌 [Miyanohara et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA(1983) 80:1]). 효모 숙주에 사용될 수 있는 다른 적합한 프로모터 서열은 3-포스포글리세레이트 키나제(문헌 [Hitzeman et al., J. BiOL. CHEM. (1980) 255:12073]) 및 다른 해당 효소, 예를 들면, 피루베이트 데카르복실라제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 및 포스포글루코스 이소머라제(문헌 ([Holland et al., BIOCHEMISTRY(1978) 17:4900]; [Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:149]))를 포함할 수 있다. 전사가 성장 조건에 의해 조절되는 추가적인 장점을 갖는 유도성 효모 프로모터는 알코올 데하이드로게나제 2; 이소시토크롬 C; 산 포스파타제; 메탈로티오네인; 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나아제; 질소 기전과 관련된 분해성 효소 및 말토스 및 갈락토스 이용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 효모 발현에 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 0 073 657에 추가로 기재되어 있다.

또한, 효모 인핸서를 효모 프로모터와 함께 사용할 수 있다. 또한, 합성 프로모터도 효모 프로모터로서 작용할 수 있다. 예를 들면, 효모 프로모터의 상류 활성화 서열(UAS: upstream activating sequence)이 또다른 효모 프로모터의 전사 활성화 영역과 결합되어 합성 하이브리드 프로모터를 생성할 수 있다. 이러한 하이브리드 프로모터의 예는 GAP 전사 활성화 영역에 연결된 ADH 조절 서열을 포함한다. 미국 특허 제 4,880,734호 및 제 4,876,197호(본원에서 참고로 인용된다)를 참조할 수 있다. 하이브리드 프로모터의 다른 예는 해당 효소 유전자, 예를 들면 GAP 또는 PyK의 전사 활성화 영역과 조합된 ADH2, GAL4, GAL10 또는 PH05 유전자로 된 조절 서열로 이루어진 프로모터를 포함한다. EP 0 164 556을 참조한다. 추가로, 효모 프로모터는 효모 RNA 폴리머라제에 결합하고 전사를 개시할 수 있는 능력을 갖는 비효모 기원의 천연적으로 발생된 프로모터를 포함할 수 있다.

효모 발현 벡터의 일부를 포함할 수 있는 다른 제어 요소는 예를 들면, GAPDH 또는 에놀라제 유전자로부터의 종결자를 포함한다(문헌 [Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256:1385]). 또한, 2 μ 플라스미드 기원으로부터의 복제 기점은 효모에 적합하다. 효모에 사용하기 적합한 선별 유전자로는 효모 플라스미드에 존재하는 trp1 유전자가 있다. 문헌 ([Tschumper et al., GENE(1980) 10:157]; [Kingsman et al., GENE(1979) 7:141])을 참조한다. trp1 유전자가 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주에 선별 마커를 제공한다. 유사하게, Leu2 결핍 효모 균주(ATCC 20,622 또는 38,626)는 Leu2 유전자를 갖는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

외인성 DNA를 효모 숙주에 도입시키는 방법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있고, 전형적으로 스페로플라스트의 형질전환 또는 알칼리 양이온으로 처리된 온전한 효모 숙주 세포의 형질전환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 효모의 형질전환은 문헌 ([Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA(1979) 76:3829] 및 [Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130:946])에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 그러나, 또한 일반적으로 문헌 [SAMBR00K ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL(2001)]에 기재된 바와 같이 예를 들면, 핵 주사, 전기천공 또는 원형질체 융합에 의해 DNA를 세포에 도입시키는 다른 방법도 사용될 수 있다. 이어서, 당업계의 숙련인에게 공지된 표준 기술을 사용하여 효모 숙주 세포를 배양할 수 있다.

효모 숙주 세포에서 이종 단백질을 발현시키는 다른 방법이 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 일반적으로 미국 특허 공보 번호 20020055169, 미국 특허 번호 제6,361,969호; 제6,312,923호; 제6,183,985호; 제6,083,723호; 제6,017,731호; 제5,674,706호; 제5,629,203호; 제5,602,034호; 및 제5,089,398호; 재심사된 미국 특허 번호 RE37,343 및 RE35J49; PCT 공개 특허 출원 WO 99/07862; WO 98/37208; 및 WO 98/26080; 유럽 특허 출원 EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 480; WO 90/10277; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 274; 및 EP 0 164 556을 참조한다. 또한, 문헌 ([Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK(1992) 62(1-2):79-93]; [Romanos et al., YEAST(1992) 8(6):423-488]; [Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY(1990) 185:3-7])(이들 각각은 본원에서 참고로 인용된다)을 참조한다.

효모 숙주 균주는 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 공급 회분식 발효 방법을 사용하여 증폭 단계 동안 발효기에서 성장할 수 있다. 발효 방법은 특정 효모 숙주의 탄소 이용 경로 또는 발현 제어 방식에서의 차이를 유발하도록 적합화될 수 있다. 예를 들면, 사카로마이세스 효모 숙주의 발효는 단일 글루코스 공급물, 복합 질소원(예를 들면, 카제인 가수분해물) 및 복합 비타민 보충물을 필요로 할 수 있다. 대조적으로, 메탄올자화(methylotrophic) 효모 P. 파스토리스는 글리세롤, 메탄올 및 미량의 무기질 공급물을 필요로 할 수 있지만, 최적의 성장 및 발현을 위해서는 오직 단순한 암모늄(질소) 염만을 필요로 할 수 있다. 예를 들면, 문헌 (미국 특허 번호 제5,324,639호; [Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95]; 및 [Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) 29:1113])(본원에서 참고로 인용된다)을 참조한다.

그러나, 그러한 발효 방법은 사용되는 효모 숙주 균주와는 독립적인 특정한 공통된 특징을 가질 수 있다. 예를 들면, 성장 제한 영양분, 전형적으로 탄소를 증폭기 동안 발효기에 첨가하여 최대 성장을 유발시킬 수 있다. 또한, 일반적으로 발효 방법은 적합한 양의 탄소, 질소, 기초 염, 인, 및 다른 소량의 영양분(비타민, 미량의 무기질 및 염 등)을 함유하도록 디자인된 발효 배지를 사용한다. 피치아를 사용하는데 적합한 발효 배지의 예는 미국 특허 번호 제5,324,639호 및 제5,231,178호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

바큘로바이러스 감염 곤충 세포 "곤충 숙주" 또는 "곤충 숙주 세포"란 용어는, 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나, 또는 사용된 곤충을 지칭한다. 상기 용어는 형질감염된 원래의 곤충 숙주 세포의 자손들도 포함한다. 단일 모세포의 자손은 우발적이거나, 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원래의 모세포와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 상보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 특성, 예를 들면, IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다. IFN 베타 폴리펩티드의 바큘로바이러스 발현은 미국 특허 번호 제7,144,574호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

IFN 베타 폴리펩티드를 발현시키는데 적합한 곤충 세포의 선택 방법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 아에데스 아에집티(Aedes aegypti), 봄빅스 모리(Bombyx mori), 드로소필라 멜라노개스터(Drosophila melanogaster), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 및 트리코플러시아 니(Trichoplusia ni)를 비롯한 수개의 곤충 종이 당업계에 잘 기술되어 있고, 상업적으로 이용가능하다. 발현용 곤충 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주로서는 특히 분비능이 우수한 숙주, 단백 분해 활성이 낮은 숙주, 및 전체적으로 건강한 숙주를 포함할 수 있다. 곤충은 일반적으로 캘리포니아 대학(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 인섹트 제네틱 스톡 센터 및 아메리칸 타이프 컬쳐 컬랙숀("ATCC")(버지니아주 만나사스 소재)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 이용가능하다.

일반적으로, 바큘로바이러스 감염 곤충 발현 시스템의 성분으로는 전이 벡터, 통상적으로 세균 플라스미드(바큘로바이러스 게놈 단편과, 발현될 이종 유전자를 삽입하기 위한 편리한 제한 부위 둘 모두를 함유); 전이 벡터 내에 바큘로바이러스 특이 단편에 상동성인 서열을 보유하는 야생형 바큘로바이러스(이종 유전자의 상동성 재조합에 의해 바큘로바이러스 게놈 내에 도입 가능); 및 적절한 곤충 숙주 세포 및 성장 배지를 포함한다. 벡터를 구성하고, 세포를 형질감염시키며, 플라크를 선택하고, 배양액 중에서 세포를 성장시키는 등에 사용되는 물질, 방법 및 기법에 관하여는 당업계에 공지되어 있으며, 이에 관한 매뉴얼에는 이러한 기법에 관하여 설명되어 있다.

이종 유전자를 전이 벡터에 삽입한 이후, 상기 벡터 및 야생형 바이러스 게놈은 벡터와 바이러스 게놈이 재조합되는 곤충 숙주 세포 내로 형질감염된다. 패킹된 재조합 바이러스는 발현되며, 재조합 플라크는 동정 및 정제된다. 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 사용되는 물질 및 방법은 예를 들어, 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.; 캘리포니아주 칼즈배드 소재)으로부터 입수한 키트 형태로 상업적으로 이용가능하다. 이러한 기법은 일반적으로 당업계의 숙련인에게 공지되어 있으며, 문헌 [SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555(1987)](참고로 인용된다)에 상세히 설명되어 있다. 또한, 문헌 ([RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995)]; [AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994)]; [KING AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992)]; 및 [O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)])를 참조한다.

실제로, 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 다양한 이종 단백질을 생산하는 방법에 관하여는 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 예로서, 미국 특허 번호 제6,368,825호; 제6,342,216호; 제6,338,846호; 제6,261,805호; 제6,245,528, 6,225,060호; 제6,183,987호; 제6,168,932호; 제6,126,944호; 제6,096,304호; 제6,013,433호; 제5,965,393호; 제5,939,285호; 제5,891,676호; 제5,871,986호; 제5,861,279호; 제5,858,368호; 제5,843,733호; 제5,762,939호; 제5,753,220호; 제5,605,827호; 제5,583,023호; 제5,571,709호; 제5,516,657호; 제5,290,686호; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/02628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082(본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다.

바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에 유용한 벡터에 관하여는 당업계에 공지되어 있으며, 그 예로서는 헬퍼 독립성 바이러스 발현 벡터인 바큘로바이러스 오토그라파캘리포니카(Autographacalifornica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV: Autographacalifornica nuclear polyhedrosis virus)로부터 유래하는 곤충 발현 및 전이 벡터를 포함한다. 이러한 시스템으로부터 유래하는바이러스 발현 벡터는 통상적으로 강한 바이러스 폴리헤드린 유전자 프로모터를 사용하여 이종 유전자를 발현시킨다. 일반적으로, 문헌 [O 'Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)]를 참조한다.

외래 유전자를 바큘로바이러스 게놈 내에 삽입하기 이전에, 프로모터, 리더 (원하는 경우), 관심의 대상이 되는 코딩 서열 및 전사 종결 서열을 포함하는 상기 기술된 성분들은 전형적으로 중간 대체 구성체(전이 벡터) 내로 조립된다. 중간 대체 구성체는 종종 레플리콘 예를 들어, 숙주, 예를 들면, 세균 내에서 안정하게 유지될 수 있는 염색체 외부 요소(예를 들어, 플라스미드) 내에 유지된다. 상기 레플리콘은 복제 시스템를 가지므로, 클로닝 및 증폭에 적합한 숙주 내에 유지될 수 있다. 더욱 특히 상기 플라스미드는 폴리헤드린 폴리아데닐화 신호(문헌 [Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177])와 원핵 앰피실린 내성(amp) 유전자, 및 E. 콜라이 내에서의 선별 및 증식을 위한 복제 기점을 포함할 수 있다.

외래 유전자를 AcNPV 내로 도입하는데 통상 사용되는 전이 벡터는 pAc373이다. 또한, 예를 들면, 폴리헤드린 출발 코돈을 ATG에서 ATT로 변화시키고, ATT로부터 32개 염기쌍만큼 떨어진 하류 위치 내로 BamHI 클로닝 부위를 도입하는 pVL985와 같은 벡터를 비롯한 당업자에게 공지된 많은 다른 벡터들이 디자인되었다. 문헌 [Luckow and Summers, 17 VIROLOGY 31 (1989)]를 참조한다. 다른 상업적으로 이용가능한 벡터는 예를 들면, PBlueBac4.5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; pBlueBac4.5(Invitrogen Corp., 캘리포니아주 칼즈배드 소재)를 포함한다.

이종 유전자의 삽입 후, 전이 벡터 및 야생형 바큘로바이러스 게놈은 곤충 세포 숙주 내로 동시에 형질감염된다. 이종 DNA를 바큘로바이러스 바이러스 내의 원하는 부위 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 문헌 ([SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555(1987)]; [Smith et al., M[theta]L. CELL. BIOL. (1983) 3:2156]; [Luckow and Summers, VIROLOGY(1989) 170:31])을 참조한다. 예를 들면, 상동성 이중 교차 재조합에 의해 유전자, 예를 들면, 폴리헤드린 유전자 내로 삽입될 수 있고; 또한, 원하는 바큘로바이러스 유전자 내로 공학처리된 제한 효소 부위 내로 삽입될 수 있다. 문헌 [Miller et al., BIOESSAYS(1989) 11(4):91]을 참조한다.

형질감염은 전기천공법에 의해 수행될 수 있다. 문헌 ([TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)]; [Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501])을 참조한다. 별법으로, 재조합 발현 벡터 및 바큘로바이러스를 사용하여 곤충 세포를 형질감염시키기 위해 리포좀을 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Liebman et al., BIOTECHNIQUES(1999) 26(1):36]; [Graves et al., BIOCHEMISTRY(1998) 37:6050]; [Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570]; [Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1998) 12:323]; [Siffert et al., NATURE GENETICS(1998) 18:45]; [TILKINS ET AL., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDB00K 145-154(1998)]; [Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1997) 10:263]; [Dolphin et al., NATURE GENETICS(1997) 17:491]; [Kost et al., GENE(1997) 190:139]; [Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271:22203]; [Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37):22376]; [Reverey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39):23607-10]; [Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270:4121]; [Sisk et al., J. ViROL. (1994) 68(2):766]; 및 [Peng et al., BIOTECHNIQUES(1993) 14(2):274])를 참조한다. 상업적으로 이용가능한 리포좀으로는 예를 들면, 셀펙틴(Cellfectin)® 및 리포펙틴(Lipofectin)®(Invitrogen, Corp., 캘리포니아주 칼즈배드 소재)을 포함한다. 또한, 인산칼슘 형질감염도 사용될 수 있다. 문헌 ([TROTTER AND W00D, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)]; [Kitts, NAR(1990) 18(19):5667]; 및 [Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501])을 참조한다.

통상적으로 바큘로바이러스 발현 벡터는 바큘로바이러스 프로모터를 포함한다. 바큘로바이러스 프로모터는 바큘로바이러스 RNA 폴리머라제를 결합시킬 수 있고, 코딩 서열(예로서, 구조 유전자)의 mRNA로의 하류(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상적으로 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 갖게 된다. 전형적으로, 이러한 전사 개시 영역은 RNA 폴리머라제 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 바큘로바이러스 프로모터는, 통상적으로 구조 유전자와 멀리 떨어져 위치하는 인핸서(존재하는 경우)로 불리는 제2 도메인을 가질 수 있다. 또한, 발현은 조절되거나, 구성적일 수 있다.

감염 주기의 후기에서 풍부하게 전사되는 구조 유전자는 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예는 바이러스 폴리헤드론 단백질을 코딩하는 유전자(문헌 ([FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)]; EP 0 127 839 및 0 155 476)) 및 p10 단백질을 코딩하는 유전자(문헌 [Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69:765])로부터 유래된 서열을 포함한다.

새로이 형성된 바큘로바이러스 발현 벡터는 감염성 재조합 바큘로바이러스 내로 패킹된 후, 성장한 플라크는 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 기법에 의해 정제될 수 있다. 문헌 ([Miller et al., BIOESSAYS (1989) 4: 91]; [SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987)]을 참조한다.

재조합 바큘로바이러스 발현 벡터는 수개의 곤충 세포에 감염시키기 위한 목적으로 개발되었다. 예를 들면, 재조합 바큘로바이러스는 특히 아에데스 아에집티(ATCC 번호 CCL-125), 봄빅스 모리(ATCC 번호 CRL-8910), 드로소필라 멜라노개스터(ATCC 번호 1963), 스포도프테라 프루기페르다 및 트리코플러시아 니에 사용하기 위한 것으로서 개발되었다. 문헌 ([Wright, NATURE(1986) 321:718]; [Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56:153]; [Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156])을 참조한다. 일반적으로, 문헌 [Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225]를 참조한다. 더욱 특히 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템용으로 사용되는 세포주로는 통상 Sf9(스포도프테라 프루기페르다)(ATCC 번호 CRL-1711), Sf21(스포도프테라 프루기페르다)(Invitrogen Corp., 카탈로그 번호 11497-013(캘리포니아주 칼즈배드 소재)), 트리-368(트리코플러시아 니), 및 하이-파이브(High-Five)™ BTI-TN-5B1-4(트리코플러시아 니)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

바큘로바이러스/발현에서의 이종 폴리펩티드의 직접 발현 및 융합 발현 둘 모두를 위한 세포 및 배양 배지가 상업적으로 이용가능하고, 일반적으로 세포 배양 기술은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다.

E. 콜라이 , 슈도모나스 종, 및 다른 원핵세포 세균 발현 기법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 세균 숙주에 사용하기 위한 매우 다양한 벡터들이 이용가능하다. 벡터는 단일 카피 벡터이거나 낮은 또는 높은 다중카피 벡터일 수 있다. 벡터는 클로닝 및/또는 발현을 위해 사용될 수 있다. 벡터, 많은 벡터들의 상업적 이용가능성, 및 심지어 벡터 및 그들의 제한 지도 및 특징을 기재하는 매뉴얼에 관한 충분한 문헌이 존재한다는 점을 고려할 때, 본 명세서에서 광범위한 논의는 불필요하다. 공지된 바와 같이, 보통 벡터는 선별을 가능케 하는 마커를 포함하며, 여기서, 마커는 세포독성제 내성, 원영양성(prototrophy) 또는 면역성을 제공할 수 있다. 흔히, 상이한 특징을 제공하는 다수의 마커가 존재한다.

세균 프로모터는 세균 RNA 폴리머라제를 결합시킬 수 있고, 코딩 서열(예로서, 구조 유전자)의 mRNA로의 하류(3') 전사를 개시할 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 통상적으로 코딩 서열의 5' 말단에 근접하게 위치하는 전사 개시 영역을 갖게 된다. 전형적으로, 이러한 전사 개시 영역은 RNA 폴리머라제 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 또한, 세균 프로모터는 RNA 합성이 시작되는 RNA 폴리머라제 결합 부위와 중첩될 수 있는, 오퍼레이터로 불리는 제2 도메인을 가질 수 있다. 유전자 리프레서 단백질이 오퍼레이터에 결합함으로써 특이 유전자의 전사를 억제할 수 있음에 따라 오퍼레이터는 음성 조절된(유도성) 전사를 일으킨다. 구성적 발현은 음성 조절 요소, 예를 들면, 오퍼레이터의 부재하에서 발생할 수 있다. 또한, 양성 조절은 존재하는 경우, 통상적으로 RNA 폴리머라제 결합 서열에 근접한(5') 유전자 활성자 단백질 결합 서열에 의해 수행될 수 있다. 유전자 활성자 단백질의 예는 에스케리치아 콜라이(E. 콜라이)에서 lac 오페론의 초기 전사를 돕는 이화 생성물 활성자 단백질(CAP: catabolite activator protein)이다(문헌 [Raibaud et al., ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173]). 따라서, 조절된 발현은 양성 또는 음성이므로 전사를 증강시키거나, 감소시킬 수 있다.

대사 경로 효소를 코딩하는 서열은 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 그 예는 당 대사 효소, 예를 들면, 갈락토스, 락토스(lac)(문헌 [Chang et al., NATURE (1977) 198: 1056] 참조) 및 말토스로부터 유도된 프로모터 서열을 포함한다. 추가적인 예는 생합성 효소, 예를 들면, 트립토판(trp)으로부터 유도된 프로모터 서열을 포함한다(문헌 ([Goeddel et al., Nuc. ACIDS RES. (1980) 8:4057]; [Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731]; 미국 특허 번호 제4,738,921호; EP 공보 번호 036 776 및 121 775(본원에서 참고로 인용된다)). 또한, β-갈락토시다제(bla) 프로모터 시스템(문헌 [Weissmann(1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon(Ed. I. Gresser)]), 박테리오파지 람다 PL(문헌 [Shimatake et al., NATURE(1981) 292:128]) 및 T5(미국 특허 번호 제4,689,406호(본원에서 참고로 인용된다)) 프로모터 시스템은 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 본 발명의 바람직한 방법은 강한 프로모터, 예를 들면, T7 프로모터를 사용하여 높은 수준으로 IFN 베타 폴리펩티드를 유도하는 것이다. 이러한 벡터의 예는 당업계의 숙련인에게 공지되어 있고, 노바겐(Novagen)으로부터의 pET29 시리즈, 및 WO 99/05297(본원에서 참고로 인용된다)에 기재된 pPOP 벡터를 포함한다. 이러한 발현 시스템은 숙주 세포 생존능 또는 성장 파라미터를 약화시키지 않으면서 숙주에서 IFN 베타 폴리펩티드를 높은 수준으로 생산한다. pET19(Novagen)는 당업계에 공지된 또다른 벡터이다.

또한, 자연계에서 발생하지 않는 합성 프로모터도 세균 프로모터로서 작용한다. 예를 들면, 하나의 세균 또는 박테리오파지 프로모터의 전사 활성화 서열을 또 다른 세균 또는 박테리오파지 프로모터의 오페론 서열과 결합시켜 합성 하이브리드 프로모터를 생성할 수 있다(미국 특허 번호 제4,551,433호(본원에서 참고로 인용된다)). 예를 들면, tac 프로모터는 trp 프로모터, 및 lac 리프레서에 의해 조절되는 lac 오페론 서열, 둘 모두를 포함하는 하이브리드 trp-lac 프로모터이다(문헌 [Amann et al., GENE(1983) 25:167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21]). 추가로, 세균 프로모터는 세균 RNA 폴리머라제를 결합시킬 수 있고 전사를 개시할 수 있는 능력을 갖는 비세균 기원의 천연적으로 발생된 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 비세균 기원의 천연적으로 발생된 프로모터를 상용가능한 RNA 폴리머라제와 커플링하여 원핵생물에서 일부 유전자를 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제/프로모터 시스템은 커플링된 프로모터 시스템의 일례이다(문헌 ([Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189:113]; [Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82:1074])). 또한, 하이브리드 프로모터도 박테리오파지 프로모터 및 E. 콜라이 오퍼레이터 영역을 포함할 수 있다(EP 공보 번호 267 851).

기능성 프로모터 서열 외에도, 효과적인 리보좀 결합 부위는 또한 원핵생물에서의 외래 유전자의 발현에 유용하다. E. 콜라이에서, 리보좀 결합 부위는 샤인 달가노(SD: Shine-Dalgarno) 서열로 불리고, 개시 코돈(ATG) 및 개시 코돈으로부터 3-11개 뉴클레오티드만큼 상류에 위치하는, 길이가 3-9개의 뉴클레오티드인 서열을 포함한다(문헌 [Shine et al., NATURE(1975) 254:34]). 이러한 SD 서열은 E. 콜라이 16S rRNA의 3' 말단과 SD 서열 사이에 염기쌍을 형성함으로써 mRNA의 리보좀에의 결합을 촉진시키는 것으로 생각된다(문헌 [Steitz et al. "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]). 약한 리보좀 결합 부위를 사용하여 진핵 유전자 및 원핵 유전자를 발현시키는 것은 문헌 [Sambrook et al. "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989]를 참조한다.

용어 "세균 숙주" 또는 "세균 숙주 세포"는 재조합 벡터 또는 다른 전이 DNA에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나, 또는 사용된 세균을 지칭한다. 상기 용어는 형질감염된 원래의 세균 숙주 세포의 자손들도 포함한다. 단일 모세포의 자손은 우발적이거나, 또는 의도적인 돌연변이로 인해 원래의 모체와 형태학적으로 완전히 동일하거나 게놈 또는 총 DNA 상보체 면에서 완전히 동일할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 관련 특성, 예를 들면, IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 존재를 특징으로 하는 모세포와 충분히 유사한 모세포의 자손은 이 정의에 의해 의도되는 자손에 포함된다.

IFN 베타 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세균을 선택하는 것은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 발현용 세균 숙주를 선택함에 있어서, 적합한 숙주로서는 특히 봉입체 형성능이 우수한 숙주, 단백 분해 활성이 낮은 숙주, 및 전체적으로 건강한 숙주를 포함할 수 있다. 세균 숙주는 일반적으로 캘리포니아 대학(캘리포니아주 버클리 소재) 생체물리학 및 의료 물리학부 인섹트 제네틱 스톡 센터 및 아메리칸 타이프 컬쳐 컬랙숀("ATCC")(버지니아주 만나사스 소재)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 이용가능하다. 산업적/약제학적 발효는 일반적으로 K 균주(예로서, W3110)로부터 유래된 세균 또는 B 균주(예로서, BL21)로부터 유래된 세균을 사용한다. 이러한 균주는 성장 파라미터가 매우 잘 알려져 있고, 강건하기 때문에 특히 유용하다. 또한, 이러한 균주는 비병원성이며, 안전성 및 환경적 이유에서 상업적으로 중요하다. 적합한 E. 콜라이 숙주의 다른 예로는 BL21, DH10B 균주 또는 그의 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법의 또다른 실시태양에서, E. 콜라이 숙주는 OMP- 및 LON-을 포함하나, 이에 한정되지 않는 프로테아제 마이너스 균주를 포함한다. 숙주 세포 균주는 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 에어루기노사, 및 슈도모나스 푸티다를 포함하나, 이에 한정되지 않는 슈도모나스 종일 수 있다. 균주 MB101로 명명된, 슈도모나스 플루오레센스 바이오바 1은 재조합 생산에 유용한 것으로 알려져 있으며, 치료용 단백질 생산 방법에 유용하다. 슈도모나스 발현 시스템의 예로서는, 다우 케미칼 컴파니(The Dow Chemical Company)(미시간주 미들랜드 소재, 월드 와이드 웹 dow.com 상에서 이용가능함)로부터 이용가능한 발현 시스템을 숙주 균주로서 포함한다.

일단 재조합 숙주 세포 균주가 확립되면(즉, 발현 구성체가 숙주 세포 내로 도입되었고, 적절한 발현 구성체를 갖는 숙주 세포가 단리되면), 재조합 숙주 세포 균주를 IFN 베타 폴리펩티드 제조에 적합한 조건하에서 배양한다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 재조합 숙주 세포 균주의 배양 방법은 사용되는 발현 구성체의 성질 및 숙주 세포의 본질에 따라 달라진다. 보통 재조합 숙주 균주는 당업계의 숙련인에게 공지된 방법을 이용하여 배양한다. 전형적으로, 재조합 숙주 세포는 탄소, 질소 및 무기 염의 동화가능한 공급원, 및 임의로, 비타민, 아미노산, 성장 인자 및 당업계의 숙련인에게 공지된 다른 단백질성 배양 보충물을 함유하는 액체 배지 중에서 배양한다. 임의로, 숙주 세포 배양용 액체 배지는 바람직하지 못한 미생물의 성장을 방지하는 항생제 또는 항진균제; 및/또는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 선별을 위한 항생제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 화합물을 함유할 수 있다.

재조합 숙주 세포는 회분식 또는 연속식으로 세포를 수거하거나(IFN 베타 폴리펩티드가 세포내 축적되는 경우) 또는 배양 상등액을 수거하면서 회분식 또는 연속식으로 배양될 수 있다. 원핵 숙주 세포에서 제조하는 경우, 회분식 배양 및 세포 수거가 바람직하다.

본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 보통 재조합 시스템에서 발현된 이후에 정제된다. IFN 베타 폴리펩티드는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 정제될 수 있다. 세균 숙주 세포에서 생산된 IFN 베타 폴리펩티드는 난용성이거나 불용성일 수 있다(봉입체 형태로). 본 발명의 하나의 실시태양에서, 본원에 개시된 방법 뿐만 아니라, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 재조합적으로 생산된 단백질을 가용성을 증가시키기 위한 목적으로 선택된 IFN 베타 폴리펩티드 내에서 아미노산 치환이 용이하게 이루어질 수 있다. 불용성 단백질일 경우, 단백질은 숙주 세포 용해물로부터 원심 분리에 의해 수집될 수 있으며, 세포를 추가로 균질화시킬 수도 있다. 난용성 단백질의 경우, 폴리에틸렌 이민(PEI)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 화합물을 첨가하여 부분적으로 가용성인 단백질의 침전을 유도할 수 있다. 이어서, 침전된 단백질은 원심 분리에 의해 편리하게 수집할 수 있다. 재조합 숙주 세포는 분쇄 또는 균질화되어 당업계의 숙련인에게 공지된 다수의 방법을 이용하여 세포 내에서 봉입체를 방출하도록 만들 수 있다. 숙주 세포 분쇄 또는 균질화는 효소 세포 분쇄, 초음파 처리, 다운스 균질화 또는 고압 방출 분쇄 기법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 잘 알려져 있는 기법을 사용함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 하나의 실시태양에서, 고압 방출 분쇄 기법을 사용하여 E. 콜라이 숙주 세포를 분쇄함으로써 IFN 베타 폴리펩티드의 봉입체를 방출시킬 수 있다. IFN 베타 폴리펩티드의 봉입체를 취급할 때에는 예를 들어, 가용화, 기계적 전단성 또는 단백질분해와 같은 인자로 인하여 손상되지 않은 채로 봉입체의 수율을 최대화하도록, 균질화 반복 시간을 최소화하는 것이 유리할 수 있다.

이어서, 불용성 또는 침전된 IFN 베타 폴리펩티드는 당업계에 공지된 다수의 적합한 가용화제 중 임의의 것을 이용하여 가용화될 수 있다. IFN 베타 폴리펩티드는 우레아 또는 구아니딘 하이드로클로라이드를 이용하여 가용화될 수 있다. 용해된 IFN 베타 폴리펩티드의 부피는 최소화되어, 관리가 용이한 회분 크기를 갖는 다량의 회분을 생산할 수 있어야 한다. 이러한 인자는 재조합 숙주가 수천 리터 부피의 회분식으로 성장할 수 있는 상업용의 대규모 환경하에서 중요할 수 있다. 또한, 상업용의 대규모 환경하에서 IFN 베타 폴리펩티드를 생산하는 경우, 특히 인간 의약용으로 생산하는 경우, 기계와 용기, 또는 단백질 생성물 자체에 손상을 줄 수 있는 강력한 화학물질은 가능한한 피해야 한다. 본 발명의 방법에 있어서, IFN 베타 폴리펩티드 봉입체를 가용화시키기 위해서는 강력한 변성 제제인 구아니딘 하이드로클로라이드 대신에 보다 약한 변성 제제인 우레아를 사용할 수도 있는 것으로 파악된다. 우레아를 사용하면 IFN 베타 폴리펩티드의 제조 및 정제 공정에 사용되는 스테인레스 스틸 장치에 손상을 줄 위험성이 상당히 줄어 듦과 동시에, IFN 베타 폴리펩티드 봉입체도 효율적으로 가용화시킬 수 있다.

가용성 IFN 베타 단백질의 경우, IFN 베타는 세포질 주변 공간이나 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 또한, 가용성 IFN 베타는 숙주 세포의 세포질에 존재할 수 있다. 정제 단계를 수행하기 이전에 가용성 IFN 베타를 농축하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 세포 용해물 또는 배양 배지로부터 가용성 hGH를 농축시키기 위해서는 당업계의 숙련인에게 공지된 표준 기술이 사용될 수 있다. 또한, 당업계의 숙련인에게 공지된 표준 기법은 숙주 세포를 파괴하고 이 숙주 세포의 세포질 또는 세포질 주변 공간으로부터 가용성 IFN 베타를 방출시키는데에 사용될 수 있다.

IFN 베타 폴리펩티드가 융합 단백질로서 생산될 때, 상기 융합 서열은 제거될 수 있다. 효소적 절단 또는 화학적 절단에 의해 융합 서열을 제거할 수 있다. 융합 서열을 효소적으로 제거하는 것은 당업계의 숙련인에게 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 융합 서열을 제거하기 위한 효소의 선택은 융합체의 본질에 의해 결정될 것이며, 반응 조건은 당업계의 숙련인에게 자명한 바와 같이, 효소를 선택함으로써 특정될 것이다. 화학적 절단은 브롬화시아노겐, TEV 프로테아제 및 기타 시약을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계의 숙련인에게 공지된 시약을 사용함으로써 수행될 수 있다. 절단된 IFN 베타 폴리펩티드는 당업계의 숙련인에게 공지된 방법에 의해 절단된 융합 서열로부터 정제될 수 있다. 그러한 방법은 당업계의 숙련인에게 자명한 바와 같이, 융합 서열 및 IFN 베타 폴리펩티드의 본질과 특성에 따라서 결정될 것이다. 정제 방법으로서는 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 투석 또는 그의 임의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, IFN 베타 폴리펩티드를 정제하여 단백질 용액으로부터 DNA를 제거할 수 있다. DNA는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 침전 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있지만, 예를 들면, 프로타민 설페이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는 핵산 침전제를 사용하여 침전시킴으로써 제거될 수 있다. 원심분리 또는 여과를 포함하나, 이에 한정되지 않는 공지된 표준 방법을 사용하여 침전된 DNA로부터 IFN 베타 폴리펩티드를 분리할 수 있다. 숙주 핵산 분자의 제거는 IFN 베타 폴리펩티드가 인간을 치료하는데 사용되는 환경에서 중요한 인자이며, 본 발명의 방법은 숙주 세포 DNA를 약제학적으로 허용되는 수준으로 감소시킨다.

발효기, 진탕 플라스크, 유동층 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 롤러 병 배양 시스템 및 교반 탱크 생물반응기 시스템을 포함하나, 이에 한정되지 않는 소규모 또는 대규모 발효 방법은 또한 단백질 발현에 사용될 수 있다. 이러한 방법들 각각은 회분식, 공급 회분식 또는 연속식 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명의 인간 IFN 베타 폴리펩티드는 일반적으로 당업계의 표준적인 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 배양 배지 또는 세포 용해물을 원심 분리 또는 여과하여 세포 파편을 제거할 수 있다. 상등액은 원하는 부피로 농축 또는 희석시키거나, 추가 정제용 제제를 조절하는데 적합한 완충액으로 투석여과할 수 있다. 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드를 추가로 정제하는 것은 온전한 형태로부터 IFN 베타 폴리펩티드 변이체의 탈아미드화 형태 및 단축 형태를 분리하는 것을 포함한다.

하기 예시적인 방법들 중 임의의 방법을 사용하여 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드를 정제할 수 있다: 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스를 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다); 실리카 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스(SEPHADEX) G-75를 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피, 금속 킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/투석여과; 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기영동법(분취용 등전 포커싱을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 차등 용해도법(황산암모늄 침전을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), SDS-PAGE, 또는 추출.

비천연 아미노산을 포함하는 단백질, 비천연 아미노산을 포함하는 펩티드, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 항체, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질에 대한 결합 파트너 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 본 발명의 단백질은 당업자에게 공지되고 당업자에 의해 사용되는 표준 방법에 따라 부분적으로 또는 실질적으로 균질하게 정제될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 또는 염기 추출법, 칼럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계의 숙련인에게 공지된 다수의 방법들 중 어느 것에 의해 회수되고 정제될 수 있다. 필요에 따라, 폴딩된 성숙 단백질을 정확하게 제조하고자 하는 경우 단백질 리폴딩 단계를 사용할 수 있다. 고 순도가 바람직한 최종 정제 단계에 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC: high performance liquid chromatography), 친화성 크로마토그래피 또는 다른 적합한 방법을 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 비천연 아미노산(또는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 또는 펩티드)에 대하여 생성된 항체를 하나 이상의 비천연 아미노산(들)을 포함하는 단백질 또는 펩티드의 친화성에 기초한 정제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 위한 정제 시약으로서 사용한다. 폴리펩티드를 부분적으로 또는 균질하게 정제한 후, 필요에 따라, 임의로 분석시험 성분, 치료제, 예방, 진단제, 연구 시약 및/또는 항체 생산용 면역원을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것으로서 매우 다양한 용도에 사용한다. 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 생성되는 항체는 통상의 프로토콜을 사용하여 폴리펩티드 또는 에피토프를 보유하는 단편, 또는 세포를 동물, 바람직하게는 비인간 동물에 투여함으로써 수득할 수 있다. 당업계의 숙련인은 다양한 공지 기법을 사용하여 항체를 제조할 수 있다. 또한, 트랜스제닉 마우스, 또는 다른 포유동물을 비롯한 다른 유기체를 사용하여 인간화된 항체를 발현시킬 수 있다. 상기 기술된 항체를 사용하여 상기 폴리펩티드를 발현하는 클론을 단리시키거나 동정할 수 있거나, 또는 상기 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체는 또한 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 또한 백신으로서 사용될 수 있다. 따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 질환이 개체 내에 이미 확립되었든지 간에 동물을 질환으로부터 보호하기 위하여 예를 들면, 사이토카인 생산 T 세포 또는 세포독성 T 세포를 비롯한, 항체 및/또는 T 세포 면역 반응을 일으키기에 적합한, 본 발명의 폴리펩티드를 포유동물에 접종하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 포유동물에서의 면역 반응은 또한 본 발명의 질환으로부터 동물을 보호하기 위해 항체를 생산하는 면역 반응을 유도하기 위해서 폴리뉴클레오티드의 발현을 지시하고 생체내에서 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 벡터를 통해 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 전달하는 단계를 포함하는 방법에 의해 유도될 수 있다. 벡터를 투여하는 한가지 방법은 벡터를 입자 상의 코팅제로서 또는 다르게 원하는 세포 내로 촉진시켜 투여하는 것이다. 그러한 핵산 벡터로는 DNA, RNA, 변형된 핵산, 또는 DNA/RNA 하이브리드를 포함할 수 있다. 백신으로서 사용하는 경우, 폴리펩티드 또는 핵산 벡터는 보통 백신 제제(조성물)로서 제공될 것이다. 상기 제제는 추가로 적합한 담체를 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 위에서 분해될 수 있기 때문에 비경구적으로(예를 들면, 피하, 근육내, 정맥내, 또는 진피내 주사) 투여될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충액, 정균제와, 제제가 해당 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사액; 및 현탁제, 또는 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 백신 제제는 또한 제제의 면역원성을 증강시키기 위해 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 애주번트 시스템을 포함할 수 있다. 투여량은 백신의 특이적인 활성에 따라 달라질 것이며, 이는 통상의 실험을 통해 용이하게 결정될 수 있다.

본원에서 언급된 다른 참고 문헌 이외에도, 다양한 정제/단백질 폴딩 방법이 당업계의 숙련인에게 공지되어 있으며, 문헌 ([R. Scopes, Protein Purification , Springer-Verlag, N. Y. (1982)]; [Deutscher, Methods in Enzymology Vol . 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990)]; [Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.]; [Bollag et al. (1996) Protein Methods. 2nd Edition Wiley-Liss, NY]; [Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ], [Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications : A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England]; [Harris and Angal, Protein Purification Methods : A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England]; [Scopes, (1993) Protein Purification : Principles and Practice 3 rd Edition Springer Verlag, NY]; [Janson and Ryden, (1998) Protein Purification : Principles , High Resolution Methods and Applications , Second Edition Wiley-VCH, NY]; 및 [Walker (1998), Protein Protocols on CD - ROM Humana Press, NJ]; 및 상기 문헌들에서 인용된 참고 문헌)에 기재되어 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

진핵 숙주 세포 또는 비진핵 숙주 세포에서 비천연 아미노산을 갖는, 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하는 것이 갖는 한가지 장점은 전형적으로 단백질 또는 폴리펩티드가 그의 본래의 형태로 폴딩된다는 것이다. 그러나, 본 발명의 특정 실시태양에서, 당업자는 합성, 발현 및/또는 정제 이후에 단백질 또는 폴리펩티드는 관련 폴리펩티드의 원하는 형태와는 다른 형태를 가질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 하나의 측면에서, 발현된 단백질 또는 폴리펩티드는 임의로 변성되고 재생될 수 있다. 이는 관심의 대상이 되는 단백질 또는 폴리펩티드에 샤페로닌을 첨가하거나, 카오트로픽 제제, 예를 들어, 구아니딘 HCl 중에 단백질을 가용화시키거나, 또는 단백질 디설피드 이소머라제를 사용하거나 하는 등의 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지되는 방법을 사용함으로써 달성될 수 있다.

일반적으로, 발현된 폴리펩티드를 변성 및 환원시킨 다음, 폴리펩티드를 바람직한 형태로 리폴딩시키는 것이 때로는 바람직할 수도 있다. 예를 들면, 구아니딘, 우레아, DTT, DTE, 및/또는 샤페로닌을 관심의 대상이 되는 번역 생성물에 첨가할 수 있다. 단백질을 환원, 변성 및 재생하는 방법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다(상기 참고 문헌들 및 문헌 ([Debinski, et al. (1993) J. Biol . Chem ., 268: 14065-14070]; [Kreitman and Pastan(1993) Bioconiug . Chem .. 4: 581-585]; 및 [Buchner, et al., (1992) Anal . Biochem .. 205: 263-270])을 참조). (Debinski) 등은 예를 들면, 구아니딘-DTE 중에서 봉입체 단백질을 변성시키고 환원시키는 것에 관해 기술하였다. 제한하는 것은 아니지만, 산화된 글루타티온 및 L-아르기닌을 함유하는 산화 환원 완충액 중에서 단백질을 리폴딩할 수 있다. 리폴딩 시약을 유동시키거나, 다르게는 이동시켜 하나 이상의 폴리펩티드 또는 다른 발현 생성물과 접촉할 수 있도록 할 수 있거나, 그 반대로 할 수 있다.

IFN 베타 폴리펩티드를 원핵생물 내에서 생산하는 경우, 그렇게 생산된 IFN 베타 폴리펩티드는 미스폴딩되어 생물학적 활성을 갖지 않거나, 감소된 생물학적 활성을 가질 수 있다. 상기 단백질의 생체활성은 "리폴딩"에 의해 회복될 수 있다. 일반적으로, 예를 들면, 하나 이상의 카오트로픽 제제(예로서, 우레아 및/또는 구아니딘) 및 디설피드 결합을 환원시킬 수 있는 환원제(예로서, 디티오트레이톨, DTT 또는 2-머캅토에탄올, 2-ME)를 사용하여 폴리펩티드 쇄를 가용화(IFN 베타 폴리펩티드가 또한 불용성인 경우), 언폴딩, 및 환원시킴으로써 미스폴딩된 IFN 베타 폴리펩티드는 리폴딩된다. 이어서, 카오트로프의 농도가 적당할 때, 산화제(예를 들어, 산소, 시스틴 또는 시스타민)를 첨가하면, 이황화 결합이 재형성될 수 있다. IFN 베타 폴리펩티드는 당업계에 공지된 표준 방법, 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,511,502호, 제4,511,503호, 및 제4,512,922호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재된 방법을 이용하여 리폴딩될 수 있다. IFN 베타 폴리펩티드는 또한 다른 단백질과 코폴딩되어 이종이량체 또는 이종다량체를 형성할 수 있다.

리폴딩 후, IFN 베타는 추가로 정제될 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등 또는 그의 임의 조합을 비롯한, 당업계의 숙련인에게 공지된 다양한 기법을 사용하여 IFN 베타를 정제할 수 있다. 추가 정제 또한 정제된 단백질을 건조시키거나 침전시키는 단계를 포함할 수 있다.

정제 이후, IFN 베타는 투석여과 및 투석을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 다양한 방법 중 임의의 방법에 의해 상이한 완충액으로 교환되고/거나, 농축될 수 있다. 단일의 정제 단백질로서 제공되는 IFN 베타는 응집 및 침전될 수 있다.

정제된 IFN 베타는 (역상 고성능 액체 크로마토그래피, RP-HPLC, 또는 황산나트륨 도데실-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법, SDS-PAGE로 측정된 바) 순도가 적어도 90% 또는 적어도 95%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 이상일 수 있다. IFN 베타의 순도에 관한 정확한 수치와는 상관없이, IFN 베타는 약품으로서 사용되기에 충분히 순수하거나, 또는 추가의 공정, 예를 들어, 수용성 중합체, 예를 들어, PEG와의 접합화와 같은 공정을 수행하기에 충분히 순수할 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 약동학적으로 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 투여량과 선형의 Cmax 및 AUC를 갖는다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 약동학적 성질은 투여량이 동일한 레비프의 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상의 Cmax를 갖는다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 약동학적 성질은 투여량이 동일한 레비프의 100% 이상의 Cmax를 갖는다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 약동학적 성질은 투여량이 동일한 레비프의 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195%, 200% 또는 그보다 큰 값 이상의 Cmax를 갖는다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 약동학적 성질은 동일한 투여량으로 투여되는 아보넥스 또는 또다른 대조군의 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상의 Cmax를 갖는다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 약동학적 성질은 동일한 투여량으로 투여되는 아보넥스 또는 또다른 대조군의 100% 이상의 Cmax를 갖는다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 약동학적 성질은 동일한 투여량으로 투여되는 아보넥스 또는 또다른 대조군의 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195%, 200% 또는 그보다 큰 값 이상의 Cmax를 갖는다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 약동학적 성질은 상대 성장 측정시 1주 1회 투여를 지지하기에 충분한 PK 최저 수준을 갖는다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 약력학적 성질은 네오프테린을 유도하고, 1주 동안 네오프테린 수준을 지속시킨다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 또는 그보다 장기간 동안 네오프테린 수준이 지속될 수 있도록 유도한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 약력학적 성질은 양성 대조군(현재 시판되는 IFN 베타 치료제) 못지않게 OAS1 유전자 발현을 유도하고, 1주 동안 그 수준을 지속시킨다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 대조군(현재 시판되는 IFN 베타 치료제) 못지않게 OAS1 유전자 발현을 유도하고, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 또는 그보다 장기간 동안 그 수준을 지속시킨다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 주사 부위의 반응은 실시예 27에서 투여량이 동일한 양성 대조군보다 불량하지 않다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 주사 부위의 반응은 투여량이 동일한 양성 대조군보다 양호하다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드에 의해 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 또는 80% 적게 주사 부위의 반응이 일어난다.

특정 IFN 베타 분자는 다른 활성 성분 또는 단백질(부형제, 담체, 및 안정화제, 혈청 알부민 등 이외의 것)의 부재하에서 치료제로서 사용될 수 있거나, 이는 또다른 단백질 또는 중합체와 복합체를 형성할 수 있다.

일반 정제 방법 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC"), 역상 HPLC("RP-HPLC: reversed phase-HPLC"), 팽창 층 흡착법, 또는 그의 임의의 조합법 및/또는 이들 방법을 (임의의 적당한 순서로) 반복 수행하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 단리 단계로부터 수득한 IFN 베타 폴리펩티드 또는 임의의 IFN 베타 폴리펩티드 혼합물을 포함하는 세포 용해물, 추출물, 세포 배지, 봉입체, 숙주 세포의 주변세포질 공간, 숙주 세포의 세포질 또는 다른 물질에 대해 다양한 단리 단계 중 임의의 하나를 수행할 수 있다.

본원에 기술된 기법을 수행하는데 사용되는 장치 및 다른 필요한 물질은 상업적으로 이용가능하다. 펌프, 분획 수집기, 모니터, 기록기 및 전체 시스템은 예를 들면, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)(캘리포니아주 포스터 시티 소재), 바이오-래드 라보라토리즈, 인크.(Bio-Rad Laboratories, Inc.)(캘리포니아주 허큘레스 소재), 및 아머샴 바이오사이언시즈, 인크.(Amersham Biosciences, Inc.)(뉴 저지주 피스카타웨이 소재)로부터 이용가능하다. 또한, 교환 매트릭스 물질, 배지 및 완충액을 포함하나, 이에 한정되지 않는 크로마토그래피 물질들도 상기 회사들로부터 이용가능하다.

평형화, 및 본원에 기술된 칼럼 크로마토그래피 방법에서의 다른 단계, 예를 들면, 세척 및 용리는 특수 장치, 예를 들면, 펌프를 사용하여 더욱 신속하게 수행될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 펌프로는 하이로드(HILOAD)^® 펌프 P-50, 페리스탈틱 펌프(Peristaltic Pump) P-1, 펌프 P-901, 및 펌프 P-903(Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

분획 수집기의 예로는 레디프락(RediFrac) 분획 수집기인 FRAC-100 및 FRAC-200 분획 수집기, 및 슈퍼프랙(SUPERFRAC)® 분획 수집기(Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재)를 포함한다. pH 및 선형 농도 구배를 형성하는 혼합기 또한 이용가능하다. 상업적으로 이용가능한 혼합기는 그라디안트 혼합기 (Gradient Mixer) GM-1 및 인-라인 혼합기(In-Line Mixer)(Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재)를 포함한다.

임의의 상업적으로 이용가능한 모니터를 사용하여 크로마토그래피 과정을 모니터할 수 있다. 그러한 모니터는 UV, pH 및 전도성과 같은 정보를 모으는데 사용될 수 있다. 검출기의 예로는 모니터(Monitor) UV-1, 유니코드(UVICORD)® S II, 모니터 UV-M II, 모니터 UV-900, 모니터 UPC-900, 모니터 pH/C-900 및 컨덕티비티 모니터(Conductivity Monitor)(Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재)를 포함한다. 실제로, 아머샴 바이오사이언시즈, 인크.(뉴 저지주 피스카타웨이 소재)로부터의 다양한 AKTA® 시스템을 비롯한 전체 시스템이 상업적으로 이용가능하다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 예를 들면, IFN 베타 폴리펩티드는, 먼저 생성된 정제된 IFN 베타 폴리펩티드를 우레아 중에서 변성시킨 후, 적합한 pH에서 환원제(예를 들면, DTT)를 함유하는 트리스 완충액으로 희석시킴으로써 환원되고 변성될 수 있다. 또다른 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 약 2 M 내지 약 9 M 농도 범위의 우레아 중에서 변성된 후, pH가 약 5.0 내지 약 8.0 범위인 트리스 완충액 중에서 희석된다. 이어서, 본 실시태양의 리폴딩 혼합물을 인큐베이션시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 리폴딩 혼합물을 실온에서 4 내지 24시간 동안 인큐베이션시킨다. 이어서, 환원되고 변성된 IFN 베타 폴리펩티드 혼합물을 추가로 단리시키거나, 정제할 수 있다.

본원에서 언급된 바와 같이, 임의의 후속 단리 단계를 수행하기 전에 제1 IFN 베타 폴리펩티드 혼합물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 제1 IFN 베타 폴리펩티드 혼합물 또는 그의 임의의 후속 혼합물을 당업계에 공지된 기법을 사용하여 농축시킬 수 있다. 또한, 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 기법을 사용하여 제1 IFN 베타 폴리펩티드 혼합물 또는 그의 임의의 후속 혼합물을 포함하는 용리 완충액을 다음 단리 단계에 적합한 완충액으로 교환할 수 있다.

이온 교환 크로마토그래피 하나의 실시태양에서, 선택적 추가 단계로서 이온 교환 크로마토그래피를 제1 IFN 베타 폴리펩티드 혼합물에 대해 수행할 수 있다. 일반적으로, 문헌 [ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS](카탈로그 번호 18-1114-21, Amersham Biosciences(뉴 저지주 피스카타웨이 소재))을 참조한다. 상업적으로 이용가능한 이온 교환 칼럼은 하이트랩(HITRAP)®, 하이프랩(HIPREP)^®, 및 하이로드^® 칼럼(Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재)을 포함한다. 이러한 칼럼은 강한 음이온 교환기, 예를 들면, Q 세파로스^® 패스트 플로우(Fast Flow), Q 세파로스^® 하이 퍼포먼스(High Performance) 및 Q 세파로스^® XL; 강한 양이온 교환기, 예를 들면, SP 세파로스^® 하이 퍼포먼스, SP 세파로스^® 패스트 플로우 및 SP 세파로스^® XL; 약한 음이온 교환기, 예를 들면, DEAE 세파로스^®패스트 플로우; 및 약한 양이온 교환기, 예를 들면, CM 세파로스^® 패스트 플로우(Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재)를 사용한다. 정제 과정 중 임의의 단계에서 IFN 베타 폴리펩티드에 대해 음이온 또는 양이온 교환 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 실질적으로 정제된 IFN 베타 폴리펩티드를 단리시킬 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 임의의 적합한 양이온 교환 매트릭스를 사용하여 수행할 수 있다. 유용한 양이온 교환 매트릭스는 섬유상, 다공성, 비다공성, 미세구형, 비드형 또는 가교 결합된 양이온 교환 매트릭스 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 양이온 교환 매트릭스 물질로는 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리스티렌, 실리카, 폴리에테르, 또는 그의 임의의 복합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

양이온 교환 매트릭스는 강한 양이온 교환기 및 약한 양이온 교환기를 포함하는 임의의 적합한 양이온 교환기일 수 있다. 강한 양이온 교환기는 광범위한 pH 범위에서 이온화된 채로 존재할 수 있으며, 따라서, 광범위한 pH 범위에서 IFN 베타와 결합할 수 있다. 그러나, 약한 양이온 교환기는 pH에 따라서 이온화되지 않을수도 있다. 예를 들어, 약한 양이온 교환기는 pH가 약 4 또는 5 아래로 떨어질 경우에는 하전되지 않을 수 있다. 적합한 강한 양이온 교환기로는 하전된 작용기, 예를 들면, 설포프로필(SP), 메틸 설포네이트(S), 또는 설포에틸(SE)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 양이온 교환 매트리스는 강한 양이온 교환기일 수 있고, 약 2.5 내지 약 6.0의 pH 범위에서 IFN 베타와 결합하는 강한 양이온 교환기가 바람직하다. 별법으로, 강한 양이온 교환기는 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.5의 pH 범위에서 IFN 베타와 결합할 수 있다. 상기 양이온 교환 매트릭스는 pH 약 3.0에서 IFN 베타와 결합하는 강한 양이온 교환기일 수 있다. 별법으로, 상기 양이온 교환 매트릭스는 강한 양이온 교환기일 수 있으며, 약 6.0 내지 약 8.0의 pH 범위에서 IFN 베타와 결합하는 강한 양이온 교환기가 바람직하다. 상기 양이온 교환 매트릭스는 바람직하게 약 8.0 내지 약 12.5의 pH 범위에서 IFN 베타와 결합하는 강한 양이온 교환기일 수 있다. 별법으로, 강한 양이온 교환기는 약 pH 8.0 내지 약 pH 12.0의 pH 범위에서 IFN 베타와 결합할 수 있다.

IFN 베타를 로딩하기 이전에, 양이온 교환 매트릭스는 예를 들어, 수 칼럼 부피의 희석액, 약산, 예를 들어, 4 칼럼 부피의 20 mM 아세트산(pH 3)으로 평형 화될 수 있다. 평형화 이후, IFN 베타를 첨가하고, 칼럼을 1회 내지 수 회에 걸쳐 세척한 다음, 실질적으로 정제된 IFN 베타를 용리시킬 수 있으며, 이 경우에도 약산 용액, 예를 들어, 약한 아세트산 용액 또는 인산 용액을 사용할 수 있다. 예를 들어, 2-4 칼럼 부피의 20 mM 아세트산(pH 3)을 사용하여 상기 칼럼을 세척할 수 있다. 예를 들어, 2-4 칼럼 부피의 0.05 M 아세트산나트륨(pH 5.5) 또는 0.1M 염화나트륨과 혼합된 0.05 M 아세트산나트륨(pH 5.5)을 사용하여 추가로 세척할 수도 있다. 별법으로, 당업계에 공지된 방법을 이용하여, 수 칼럼 부피의 희석액 및 약염기를 사용함으로써 양이온 교환 매트릭스를 평형화시킬 수 있다.

별법으로, 양이온 교환기 매트릭스와, 매트릭스로부터 IFN 베타를 치환시키는데 충분히 낮은 pH 또는 이온 강도를 갖는 완충액을 접촉시켜 실질적으로 정제된 IFN 베타를 용리시킬 수 있다. 용리 완충액의 pH 범위는 약 pH 2.5 내지 약 pH 6.0일 수 있다. 더욱 특히 용리 완충액의 pH 범위는 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.5, 약 pH 2.5 내지 약 pH 5.0일 수 있다. 용리 완충액의 pH는 약 3.0일 수 있다. 또한, 용리 완충액의 양은 매우 다양할 수 있으며, 일반적으로는 그 범위는 약 2 내지 약 10 칼럼 부피일 수 있다.

양이온 교환기 매트릭스에 IFN 베타 폴리펩티드를 흡착시킨 이후에, 상기 매트릭스와, 매트릭스로부터 IFN 베타 폴리펩티드를 치환시키는데 충분히 높은 pH 또는 이온 강도를 갖는 완충액을 접촉시켜 실질적으로 정제된 IFN 베타 폴리펩티드를 용리시킬 수 있다. 실질적으로 정제된 IFN 베타 폴리펩티드의 고 pH 용리에 사용하기에 적합한 완충액으로서는 농도 범위가 적어도 약 5 mM 내지 적어도 약 100 mM인 시트레이트, 포스페이트, 포름에이트, 아세테이트, HEPES 및 MES 완충액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

역상 크로마토그래피 RP-HPLC를 수행하여 당업계의 숙련인에게 공지된 적합한 프로토콜에 따라서 단백질을 정제할 수 있다. 예를 들어, 문헌 ([Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230(1982)]; [Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268:112-119]; [Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359:391-402])를 참조할 수 있다. RP-HPLC를 IFN 베타 폴리펩티드에 대하여 수행하여 실질적으로 정제된 IFN 베타 폴리펩티드를 단리시킬 수 있다. 이와 관련하여, 적어도 약 C₃ 내지 적어도 약 C₃₀, 적어도 약 C₃ 내지 적어도 약 C₂₀, 또는 적어도 약 C₃ 내지 적어도 약 C₁₈ 수지를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 다양한 길이를 갖는 알킬 관능기를 포함하는 실리카 유도체화된 수지가 사용될 수 있다. 별법으로, 중합체 수지가 사용될 수 있다. 예를 들어, 스티렌 중합체 수지인 토소하스 앰버크롬 CG1000sd 수지(TosoHaas Amberchrome CG1000sd resin)가 사용될 수 있다. 알킬 쇄 길이가 매우 다양한 시아노 또는 중합체 수지도 사용될 수 있다. 추가로, 상기 RP-HPLC 칼럼을 용매, 예를 들어, 에탄올로 세척할 수 있다. 공급원 RP 칼럼은 RP-HPLC 칼럼의 또다른 예이다.

이온 쌍 형성제 및 유기 개질제, 예를 들어, 메탄올, 이소프로판올, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴 또는 에탄올을 함유하는 적합한 용리 완충액을 RP-HPLC 칼럼으로부터 IFN 베타 폴리펩티드를 용리시키는데 사용할 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 이온 쌍 형성제로서는 아세트산, 포름산, 과염소산, 인산, 트리플루오로아세트산, 헵타플루오로부티르산, 트리에틸아민, 테트라메틸암모늄, 테트라부틸암모늄 및 아세트산트리에틸암모늄을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 용리는 하나 이상의 구배 조건 또는 등용매 조건을 사용하여 수행될 수 있으며, 분리 시간을 단축시키고 피크 폭을 줄이는 것이 바람직한 구배 조건이다. 또다른 방법은 상이한 용매로 2가지 농도 구배를 걸어주어 수행하는 것을 포함한다. 본원에 사용하기에 적합한 용리 완충액의 예로서는 아세트산암모늄 및 아세토니트릴 용액을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

소수성 상호작용 크로마토그래피 정제 기법 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC: Hydrophobic interaction chromatography)를 IFN 베타 폴리펩티드에 대해 수행할 수 있다. 일반적으로, 문헌 [HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS(카탈로그 번호 18-1020-90, Amersham Biosciences (뉴 저지주 피스카타웨이 소재))](본원에서 참고로 인용된다)을 참조한다. 적합한 HIC 매트릭스는 아가로스, 가교 결합된 아가로스, 세파로스, 셀룰로스, 실리카, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 비롯한 알킬- 또는 아릴-치환 매트릭스, 예를 들면, 부틸-, 헥실-, 옥틸- 또는 페닐-치환 매트릭스, 및 폴리에틸렌아민 수지 또는 부틸- 또는 페닐-치환 폴리(메타크릴레이트) 매트릭스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 혼합된 형태의 수지를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 소수성 상호작용 칼럼 크로마토그래피에 대한 상업적으로 이용가능한 공급원으로는 하이트랩^®, 하이프랩^®, 및 하이로드^® 칼럼(Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

간략하면, 로딩 전, HIC 칼럼을 당업계의 숙련인에게 공지된 표준 완충액, 예를 들면, 아세트산/염화나트륨 용액 또는 황산암모늄을 함유하는 HEPES를 사용하여 평형화시킬 수 있다. 황산암모늄은 HIC 칼럼에 로딩하기 위한 완충액으로서 사용될 수 있다. 이어서, IFN 베타 폴리펩티드를 로딩시킨 후, 칼럼을 표준 완충액과 조건을 사용하여 세척함으로써 IFN 베타 폴리펩티드는 HIC 칼럼 상에서 체류시키면서 원치 않는 물질은 제거할 수 있다. 약 3 내지 약 10 칼럼 부피의 표준 완충액, 예를 들면, 특히 EDTA, 및 평형 완충액보다 낮은 농도의 황산암모늄을 함유하는 HEPES 완충액, 또는 아세트산/염화나트륨 완충액 등을 사용하여 IFN 베타 폴리펩티드를 용리시킬 수 있다. 또한, 예를 들면, 인산칼륨의 구배를 사용하여 선형 염 구배를 줄여가면서 IFN 베타 분자를 용리시킬 수 있다. 이어서, 예를 들면, 여과, 예를 들면, 투석여과 또는 한외여과에 의해 용리액을 농축시킬 수 있다. 투석여과를 사용하여 IFN 베타 폴리펩티드를 용리시키는데 사용되는 염을 제거할 수 있다.

기타 정제 기법 예를 들어, 겔 여과(GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS(카탈로그 번호 18-1022-18, Amersham Biosciences, 뉴 저지주 피스카타웨이 소재))(본원에서 참고로 인용된다), 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(적당한 매트릭스로는 HA-울트로겔(HA-Ultrogel), 하이 레솔루션(High Resolution; Calbiochem), CHT 세라믹 하이드록시아파타이트(CHT Ceramic Hydroxyapatite; BioRad), 바이오-겔 HTP 하이드록시아파타이트(Bio-Gel HTP Hydroxyapatite; BioRad)를 포함하나, 이에 한정되지 않음, HPLC, 팽창 층 흡착법, 한외여과법, 투석여과 및 동결 건조법 등을 사용하는 추가의 또다른 단리 단계를 제1 IFN 베타 폴리펩티드 혼합물 또는 그의 임의의 후속 혼합물에 대해 수행하여 임의의 과량의 염을 제거하고, 상기 완충액을 다음 단리 단계 또는 심지어 최종 약품의 제형화를 위한 적합한 완충액으로 대체할 수 있다.

본원에 기술된 각 단계에서 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 기법을 사용하여, 실질적으로 정제된 IFN 베타 폴리펩티드를 비롯한 IFN 베타 폴리펩티드의 수율을 모니터할 수 있다. 또한, 그러한 기법은 마지막 단리 단계 후 실질적으로 정제된 IFN 베타 폴리펩티드의 수율을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 다양한 알킬 쇄 길이를 갖는 몇몇 역상 고압 액체 크로마토그래피 칼럼, 예를 들면, 시아노 RP-HPLC, C18RP-HPLC; 뿐만 아니라, 양이온 교환 HPLC 및 겔 여과 HPLC 중 임의의 기법을 사용하여 IFN 베타 폴리펩티드의 수율을 모니터할 수 있다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 각 정제 단계 후 IFN 베타의 수율은 각 정제 단계에 사용되는 출발 물질 중 IFN 베타의 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.9%, 또는 적어도 약 99.99%일 수 있다.

순도는 표준 기법, 예를 들면, SDS-PAGE를 사용하거나 웨스턴 블롯(Western blot) 및 ELISA 분석을 사용하여 IFN 베타 폴리펩티드를 측정함으로써 측정할 수 있다. 예를 들면, 음성 조절 효모 발효 및 양이온 교환 회수로부터 단리된 단백질에 대한 폴리클로날 항체를 생성할 수 있다. 또한, 오염 숙주 세포 단백질의 존재를 검출하기 위해 항체를 사용할 수 있다.

RP-HPLC 물질 비다크(Vydac) C4(Vydac)는 그 표면이 C4-알킬 쇄를 보유하는 실리카 겔 입자로 이루어져 있다. 단백질 불순물로부터의 IFN 베타 폴리펩티드의 분리는 소수성 상호작용의 강도의 차이를 기초로 한다. 묽은 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴 구배를 사용하여 용리시킬 수 있다. 스테인레스 스틸 칼럼(2.8 내지 3.2 ℓ의 비다크 C4 실리카 겔로 충진됨)을 사용하여 분취형 HPLC를 수행한다. 트리플루오로아세트산을 첨가함으로써 하이드록시아파티트 울트로겔 용리액을 산성화시키고, 비다크 C4 칼럼에 로딩한다. 세척 및 용리를 위해, 묽은 트리플루오로아세트산 중의 아세토니트릴 구배를 사용한다. 분획을 수거하고, 즉시 포스페이트 완충액으로 중성화시킨다. IPC 한계 내에 존재하는 IFN 베타 폴리펩티드 분획을 풀링한다.

DEAE 세파로즈(Pharmacia) 물질은 세파로즈 비드의 표면에 공유 결합되어 있는 디에틸아미노에틸(DEAE) 기로 이루어져 있다. IFN 베타 폴리펩티드를 DEAE 기에 결합시키는 과정은 이온 상호작용에 의해 매개된다. 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산은 체류하지 않고 칼럼을 통과한다. 이 물질들이 씻겨져 나간 후, 낮은 pH의 아세테이트 완충액으로 칼럼을 세척하여 미량의 불순물을 제거한다. 이어서, 상기 칼럼을 중성의 포스페이트 완충액으로 세척하고, IFN 베타 폴리펩티드는 이온 강도를 점점 높여가면서 완충액으로 용리시킨다. 칼럼을 DEAE 세파로스 패스트 플로우로 팩킹한다. 칼럼 부피는 IFN 베타 폴리펩티드 로딩량이 3-10 mg IFN 베타 폴리펩티드/ml 겔 범위가 되도록 조정한다. 칼럼을 물과 평형 완충액(인산나트륨/인산 칼륨)으로 세척한다. 풀링된 HPLC 용리액 분획을 로딩하고, 이 칼럼을 평형 완충액으로 세척한다. 이어서, 상기 칼럼을 세척 완충액(아세트산나트륨 완충액)으로 세척한 후, 다시 평형 완충액으로 세척한다. 이어서, 용리 완충액(염화나트륨, 인산나트륨/인산칼륨)을 사용하여 상기 칼럼으로부터 IFN 베타 폴리펩티드를 용리시키고, 마스터 용리 프로파일에 따라 단일 분획물에서 수집한다. DEAE 세파로오스 칼럼의 용리액을 특수 전도성을 갖도록 조정한다. 생성된 약물 물질을 멸균 여과하여 테플론(Teflon) 병에 넣고, -70℃에서 보관한다.

사용될 수 있는 추가의 방법으로는 내독소를 제거하는 단계를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 내독소는 그람 음성 숙주 세포, 예를 들어, 에스케리치아 콜라이의 외막 상에 존재하는 지질다당류(LPS)가 있다. 내독소 수준을 낮추는 방법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있으며, 그 예로서는 실리카 지지체, 유리 분말 또는 하이드록시아파타이트를 이용하는 정제 기법, 역상 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 이들 방법의 조합법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 변형법 및 추가의 방법에서는 오염 물질, 예를 들어, 관심의 대상이 되는 폴리펩티드와 함께 이동하는 단백질을 제거할 필요가 있을 수 있다. 내독소 수준을 측정하는 방법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있으며, 그 예로서는 리물러스 아메보사이트 용해물(LAL: Limulus Amebocyte Lysate) 분석을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 엔도세이프™-PTS(Endosafe™-PTS) 분석은 LAL 시약, 발색 기질 및 대조군 표준 내독소가 미리 로딩되어 있는 카트리지를 소형 분광계와 함께 사용하는 비색성 단일 튜브 시스템이다. 별법으로는 탁도를 측정하며 96 웰 포맷을 사용하는 동적(Kinetic) LAL 방법이 있지만, 이로 한정되지 않는다.

브래드포드(Bradford) 분석, SDS-PAGE, 은 염색 SDS-PAGE, 쿠마시 염색 SDS-PAGE, 질량 분광분석법(MALDI-TOF)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는, 단백질을 특징화하는 다른 방법들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 매우 다양한 방법 및 절차들이 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 단백질의 수율 및 순도를 평가하는데 사용될 수 있다.

추가 방법으로는 단백질 염색 방법과 커플링된 SDS-PAGE, 면역블롯팅, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광분석법(MALDI-MS: matrix assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry), 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법, 등전위 포커싱, 분석 음이온 교환, 크로마토포커싱 및 원평광 이색성 분광 분석(circular dichroism)이 있으나, 이들로 한정되지 않는다.

VIII . 대체 시스템에서의 발현

비-재조합 숙주 세포, 돌연변이를 생성 숙주 세포, 또는 무세포 시스템에서 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하기 위해 수개의 전략법들이 사용되었다. 또한, 이러한 시스템들은 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드를 제조하는데 사용하기에 적합하다. 반응성 측쇄, 예를 들면, Lys, Cys 및 Tyr로 아미노산을 유도체화시킴으로써 리신을 N²-아세틸-리신으로 전환시켰다. 또한, 화학적 합성은 비천연 아미노산을 도입하는 직접적인 방법을 제공한다. 펩티드 단편의 효소적 결찰 및 본래의 화학적 결찰이 최근 개발됨으로써 더 큰 단백질을 제조하는 것이 가능하다. 예를 들면, 문헌[P. E. Dawson and S. B. H. Kent, Annu . Rev . Biochem., 69: 923 (2000)]을 참조한다. 화학적 펩티드 결찰 및 본래의 화학적 결찰은 미국 특허 번호 제6,184,344호, 미국 특허 공보 번호 제2004/0138412호, 미국 특허 공보 번호 2003/0208046, WO 02/098902, 및 WO 03/042235(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 원하는 비천연 아미노산으로 화학적으로 아실화된 서프레서 tRNA를 단백질 생합성을 지지할 수 있는 시험관내 추출물에 첨가하는 일반 시험관내 생합성 방법을 사용하여 100개가 넘는 비천연 아미노산을 거의 모든 크기의 다양한 단백질에 부위 특이적으로 도입시켰다. 예를 들면, 문헌 ([V. W. Cornish, D. Mendel and P. G. Schultz, Angew . Chem . Int . Ed . Engl. 1995, 34:621 (1995)]; [CJ. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for site -specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989)]; 및 [J.D. Bain, CG. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosynthetic site - specific incorporation of a non - natural amino acid into a polypeptide, J. Am . Chem . Soc . 111:8013-8014 (1989)])를 참조한다. 단백질 안정성, 단백질 폴딩, 효소 기전 및 신호 전달의 연구를 위해 광범위한 작용기가 단백질 내로 도입되었다.

선택적 압력 도입으로 불리는 생체내 방법을 개발하여 야생형 합성효소의 무차별 혼합(promiscuity)을 실시하였다. 예를 들면, 문헌 [N. Budisa, C Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder and R. Huber, FASEB J., 13:41(1999)]를 참조한다. 세포에 특정한 천연 아미노산을 공급하는 관련 대사 경로가 작동하지 않는(switched off) 영양요구성 균주는 제한된 농도의 천연 아미노산을 함유하는 최소 배지에서 성장하지만, 표적 유전자의 전사는 억제된다. 성장 정체기의 개시 시점에서, 천연 아미노산은 소실되고, 비천연 아미노산 유사체로 대체된다. 재조합 단백질의 발현 유도는 비천연 유사체를 함유하는 단백질을 축적시킨다. 예를 들면, 이 전략법을 사용하여, o, m 및 p-플루오로페닐알라닌은 단백질 내로 도입되고, 용이하게 확인될 수 있는 UV 스펙트럼 중의 2개의 특징적인 숄더 (shoulder)를 나타내며(예를 들면, 문헌 [C. Minks, R. Huber, L. Moroder and N. Budisa, Anal . Biochem ., 284:29(2000)] 참조); 트리플루오로메티오닌을 사용하여 박테리오파지 T4 리소자임에서 메티오닌을 대체함으로써 ¹⁹F NMR을 사용하여 키토올리고당 리간드와 메티오닌의 상호작용을 연구하였고(예를 들면, 문헌 [H. Duewel, E. Daub, V. Robinson and J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404(1997)] 참조); 트리플루오로류신을 류신 대신 도입한 결과, 루신 지퍼 단백질의 열 안정성 및 화학적 안정성이 증가하였다. 예를 들면, 문헌 [Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado and D. A. Tirrell, Angew . Chem . Int . Ed . Engl., 40:1494(2001)]을 참조한다. 또한, 셀레노메티오닌 및 텔루로메티오닌을 다양한 재조합 단백질에 도입하여 X선 결정학에서의 위상의 해석을 용이하게 한다. 예를 들면, 문헌 ([W. A. Hendrickson, J. R. Horton and D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665(1990)]; [J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda and M. Hatada, Nat . Struct . Biol, 1:283(1994)]; [N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann and R. Huber, Eur . J. Biochem, 230:788(1995)]; 및 [N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder and R. Huber, J. Mol . Biol ., 270:616(1997)])을 참조한다. 또한, 알켄 또는 알킨 관능기를 갖는 메티오닌 유사체를 유효하게 도입함으로써 화학적 수단에 의해 단백질을 추가적으로 변형시켰다. 예를 들면, 문헌 ([J. C. van Hest and D. A. Tirrell, FEBS Lett .. 428:68(1998)]; [J. C. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am . Chem . Soc, 122:1282(2000)]; 및 [K. L. Kiick and D. A. Tirrell, Tetrahedron , 56:9487(2000)]; 미국 특허 번호 제6,586,207호; 미국 특허 공보 2002/0042097)(본원에서 참고로 인용된다)을 참조한다.

이러한 방법의 성공 여부는 아미노아실-tRNA 합성효소에 의한 비천연 아미노산 유사체의 인식에 따라 좌우되며, 이는 일반적으로, 단백질 번역의 신뢰도를 보증하기 위해 높은 선택성을 필요로 한다. 이 방법의 범위를 확장하는 한가지 방법은 아미노아실-tRNA 합성효소의 기질 특이성을 완화시키는 것이며, 이는 수가 제한된 경우에 달성되었다. 예를 들면, 에스케리치아 콜라이 페닐알라닐-tRNA 합성효소(PheRS)에서 Gly에 의한 Ala²⁹⁴의 치환은 기질 결합 포켓의 크기를 증가시켜 p-Cl-페닐알라닌(p-Cl-Phe)에 의한 tRNAPhe의 아실화를 일으킨다. 문헌 [M. Ibba, P. Kast and H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107(1994)]를 참조한다. 이 돌연변이체 PheRS를 보유하는 에스케리치아 콜라이 균주는 페닐알라닌 대신에 p-Cl-페닐알라닌 또는 p-Br-페닐알라닌을 도입한다. 예를 들면, 문헌 ([M. Ibba and H. Hennecke, FEBS Lett ., 364:272(1995)]; 및 [N. Sharma, R. Furter, P. Kast and D. A. Tirrell, FEBS Lett ., 467:37(2000)])을 참조한다. 유사하게, 에스케리치아 콜라이 티로실-tRNA 합성효소의 아미노산 결합 부위 근처의 점 돌연변이 Phe130Ser은 티로신보다 아자티로신을 더 효율적으로 도입하는 것으로 밝혀졌다. 문헌 [F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soil and S. Nishimura, J. Biol . Chem .. 275:40324(2000)]을 참조한다.

생체내에서 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입하는 또다른 전략법은 교정 기전을 갖는 합성효소를 개질시키는 것이다. 이러한 합성효소는 식별할 수 없기 때문에 동족 천연 아미노산과 구조적으로 유사한 아미노산을 활성화시킨다. 이러한 오류는 분리 부위에서 정정되며, tRNA로부터 잘못 충전된(mischarged) 아미노산을 탈아실화하여 단백질 번역의 신뢰도를 유지시킨다. 상기 합성효소의 교정 활성이 작용하지 못하는 경우, 잘못 활성화된 구조적 유사체는 수정 기능을 벗어나 도입될 수 있다. 최근, 이러한 접근법은 발릴-tRNA 합성효소(ValRS)를 사용하여 입증되었다. 문헌 [V. Doring, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel and P. Marliere, Science. 292:501(2001)]을 참조한다. ValRS는 Cys, Thr 또는 아미노부티레이트(Abu)로 tRNAVal을 잘못 아미노아실화할 수 있고; 이러한 비동족 아미노산들은 추후 교정 도메인에 의해 가수분해된다. 에스케리치아 콜라이 염색체의 무작위적 돌연변이유발 후, ValRS의 교정 부위에서 돌연변이를 갖는 돌연변이체 에스케리치아 콜라이 균주를 선별하였다. 이러한 교정 결핍 ValRS는 부정확하게 tRNAVal을 Cys로 충전시킨다. Abu는 입체적으로 Cys와 유사하기 때문에(Cys의 -SH 기는 Abu 중에서 -CH3로 치환됨), 돌연변이체 ValRS도 이 돌연변이체 에스케리치아 콜라이 균주가 Abu의 존재하에 성장하는 경우 Abu를 단백질 내로 도입한다. 질량 분광 분석은 본래의 단백질 내의 각각의 발린 위치에서 발린의 약 24%가 Abu로 치환된다는 것을 보여준다.

또한, 고체상 합성 및 반합성 방법도 새로운 아미노산을 함유하는 다수의 단백질을 합성할 수 있게 하였다. 예를 들면, 하기 공보 및 그 안에서 인용되고 있는 참고 문헌을 참조한다: 문헌 ([Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature of the genetic code for proteins. Nature, 192:1227- 1232 (1961)]; [Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptides. XXXVI. The effect ofpyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S- peptide fragment, J. Am Chem . 88(24):5914-5919 (1966)]; [Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Ace Chem Res, 22:47-54 (1989)]; [Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987)]; [Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science. 256(5054):221-225 (1992)]; [Chaiken, LM. Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem. 11(3):255-301 (1981)]; [Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1(3):151-157 (1987)]; 및 [Jackson, D. Y., Burnier, J., Quan, C, Stanley, M., Tom, J., Wells, J. A. A Designed Peptide Ligasefor Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science. 266(5183):243 (1994)]).

화학적 변형은 보조인자, 스핀 표지 및 올리고뉴클레오티드를 비롯한 다양한 비천연 측쇄를 시험관내에서 단백질에 도입하는데 사용되어 왔다. 예를 들면, 문헌 ([Corey, D.R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832):1401-1403 (1987)]; [Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S. E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985)]; [Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enyzme active sites, Science. 226(4674):505-511 (1984)]; [Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem. 243(24):6392-6401 (1968)]; [Polgar, L. et M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 88:3153-3154 (1966)]; 및 [Pollack, S. J., Nakayama, G. Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science. 242(4881):1038-1040 (1988)])을 참조한다.

별법으로, 화학적으로 변형된 아미노아실-tRNA을 사용하는 생합성 방법을 사용하여 시험관내에서 합성된 단백질 내로 수개의 생체물리적 프로브를 도입하였다. 하기 공보 및 그 안에서 인용되고 있는 참고 문헌을 참조한다: 문헌 ([Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu . Rev Biochem , 62:483-514 (1993)]; 및 [Krieg, U. C, Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54- kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc . Natl . Acad . Sci, 83(22):8604-8608 (1986)]).

종래, 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA를, 원하는 앰버 넌센스 돌연변이를 함유하는 유전자로 프로그램화된 단백질 합성 반응에 첨가함으로써 비천연 아미노산이 시험관내에서 부위 특이적으로 도입될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 접근법을 사용하여, 특정 아미노산에 대해 영양요구성을 갖는 균주를 사용하여 다수의 20종의 일반 아미노산을 근접한 구조적 동족체로 치환시킬 수 있고, 예를 들면, 페닐알라닌의 경우 플루오로페닐알라닌으로 치환시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌 ([Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M. C, Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989)]; [M. W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995)]; [Bain, J.D., Glabe, C. G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989)]; [N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999)]; [Ellman, J.A., Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C. J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins. Methods in Enz., vol. 202, 301-336 (1992)]; 및 [Mendel, D., Cornish, V. W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995)])를 참조한다.

예를 들면, 정지 코돈 UAG를 인식하고, 비천연 아미노산으로 화학적으로 아미노아실화된 서프레서 tRNA를 제조하였다. 통상적인 부위 지정 돌연변이 유발법을 사용하여 단백질 유전자 내의 관심의 대상이 되는 부위에 정지 코돈 TAG를 도입하였다. 예를 들면, 문헌 [Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate - based olignoucleotide - directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3):791-802 (1988)]을 참조한다. 아실화된 서프레서 tRNA 및 돌연변이체 유전자가 시험관내 전사/번역 시스템에서 조합된 경우, 특정한 위치에 그 아미노산을 함유하는 단백질을 제공하는 UAG 코돈에 반응하여 비천연 아미노산이 도입되었다. [³H]-Phe을 사용한 실험 및 α-하이드록시산을 사용한 실험은 원하는 아미노산만이 UAG 코돈에 의해 특정된 위치에만 도입되고, 이 아미노산이 단백질 내의 임의의 다른 부위에는 도입되지 않는다는 것을 입증하였다. 예를 들면, 문헌 ([Noren, et al, 상기 문헌 동일]; [Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432]; 및 [Ellman, J. A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site - specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science. 255(5041):197-200(1992)])를 참조한다.

tRNA는 화학적 또는 효소적 아미노아실화를 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 방법 또는 기법에 의해 원하는 아미노산으로 아미노아실화될 수 있다.

아미노아실화는 아미노아실 tRNA 합성효소에 의해 또는 리보자임을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 효소적 분자에 의해 달성될 수 있다. 용어 "리보자임"은 "촉매 RNA"와 상호교환적으로 사용된다. (Cech)와 동료들은 (문헌 ([Cech, 1987, Science, 236:1532-1539]; [McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226])촉매(리보자임)로서 작용할 수 있는 천연적으로 발생된 RNA의 존재를 입증하였다. 그러나, 이러한 천연 RNA 촉매가 절단 및 스플라이싱을 위한 리보핵산 기질에 대해 작용하는 것으로만 밝혀져 있다 하더라도, 최근 리보자임의 인위적 진화의 개발은 다양한 화학 반응에 대한 촉매활성의 레파토리를 확장시켰다. 연구에 의해, 그 자신의 (2')3'-말단 상의 아미노아실-RNA 결합을 촉매작용에 의해 촉진할 수 있는 RNA 분자(문헌 [Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647]), 및 하나의 분자를 또다른 분자로 전달할 수 있는 RNA 분자(문헌 [Lohse et al., 1996, Nature 381:442-444])가 확인되었다.

미국 특허 출원 공보 2003/0228593(본원에서 참고로 인용된다)에는 아미노산을 구성하는 방법과, tRNA를 천연적으로 코딩된 아미노산 및 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 아미노아실화하는데 있어서 상기 리보자임의 용도가 기재되어 있다. 리보자임을 포함하나, 이에 한정되지 않는, tRNA를 아미노아실화시킬 수 있는, 기질 고정 형태의 효소적 분자는 아미노아실화된 생성물의 효율적인 친화 정제를 가능하게 할 수 있다. 적합한 기질의 예로는 아가로스, 세파로스 및 자기 비드를 포함한다. 아미노아실화를 위한 기질 고정 형태의 리보자임 생산 및 용도는 문헌 ([Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084] 및 미국 특허 출원 공보 2003/0228593)(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

아미노아실화에 있어서 합성효소의 사용을 피하기 위한 화학적 아미노아실화 방법은 (Hecht)와 동료들 (문헌 ([Hecht, S. M. Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545]; [Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254]; [Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517])), 및 (Schultz), (Chamberlin), (Dougherty)와 동료들 (문헌 ([[Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem.Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621]; [Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722]; [Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182]; [Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013]; [Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537]; [Gallivan, J. P.; Lether, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740]; [Turcatti, et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991]; [Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439]; [Saks, M. E. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169]; [Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34])(본원에서 참고로 인용된다))에 의해 도입된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 방법 또는 다른 화학적 아미노아실화 방법을 사용하여 tRNA 분자를 아미노아실화시킬 수 있다.

촉매 RNA의 제조 방법은 무작위화된 리보자임 서열의 분리된 풀을 제조하는 단계, 상기 풀에 대한 지시된 진화를 수행하는 단계, 원하는 아미노아실화 활성에 대해 상기 풀을 스크리닝하는 단계, 및 원하는 아미노아실화 활성을 나타내는 리보자임의 서열을 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

리보자임은 예를 들면, GGU 모티프 및 U가 풍부한 영역과 같은, 아실화 활성을 촉진하는 모티프 및/또는 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, U가 풍부한 영역은 아미노산 기질의 인식을 촉진할 수 있고, GGU 모티프는 tRNA의 3' 말단과 염기쌍을 형성할 수 있다고 보고되어 있다. 추가로, GGU 모티프와 U가 풍부한 영역은 아미노산과 tRNA, 둘 모두를 동시에 인식하는 것을 촉진하며, 또한 그에 따라서 tRNA의 3' 말단의 아미노아실화도 촉진한다.

리보자임은 tRNA^Asn _CCCG와 접합화된 부분적으로 무작위화된 r24mini를 사용한 시험관내 선별 후, 활성 클론에서 발견되는 공통 서열의 전체적 조작에 의해 제조할 수 있다. 이 방법에 의해 수득되는 예시적 리보자임은 "Fx3 리보자임"으로서 지칭되며, 미국 출원 공보 2003/0228593(그의 내용이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있으며, 이는 동족 비-천연 아미노산으로 충전된 다양한 아미노아실-tRNA의 합성에 있어서 다용도 촉매로서 작용한다.

기질 상의 고정화를 사용하여 아미노아실화된 tRNA를 효율적으로 친화 정제할 수 있다. 적합한 기질의 예로는 아가로스, 세파로스 및 자기 비드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 리보자임은 RNA의 화학 구조를 사용하여 수지 상에 고정시킬 수 있으며, 예를 들면, RNA의 리보스 상의 3'-시스-디올을 페리오데이트로 산화시켜 상응하는 디알데히드를 생성함으로써 수지 상의 RNA의 고정화를 촉진시킬 수 있다. 저렴한 히드라지드 수지를 비로한 다양한 유형의 수지가 사용될 수 있는데, 여기서, 환원적 아미노화는 수지와 리보자임 사이의 상호작용을 비가역적 결합으로 만든다. 아미노아실-tRNA의 합성은 이 칼럼 상의 아미노아실화 기법에 의해 상당히 촉진될 수 있다. 문헌 [Kourouklis et al. Methods 2005; 36:239-4]에는 칼럼 기반 아미노아실화 시스템이 기재되어 있다.

아미노아실화된 tRNA의 단리는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 한가지 적합한 방법은 완충액, 예를 들면, 10 mM EDTA를 포함하는 아세트산나트륨 용액, 50 mM N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(3-프로판설폰산), 12.5 mM KCl(pH 7.0), 10 mM EDTA를 함유하는 완충액, 또는 단순히 EDTA로 완충처리된 완충수(pH 7.0)를 사용하여 칼럼으로부터 아미노아실화된 tRNA를 용리시키는 것이다.

번역 반응에 의해 제조된 폴리펩티드의 선택된 위치에서 tRNA를 아미노아실화시키는 아미노산을 도입하기 위해 아미노아실화된 tRNA를 번역 반응에 첨가할 수 있다. 본 발명의 아미노아실화된 tRNA가 사용될 수 있는 번역 시스템의 예에는 세포 용해물이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 세포 용해물은 유입 mRNA로부터 폴리펩티드를 시험관내에서 번역하기 위해 필요한 반응 성분들을 제공한다. 이러한 반응 성분들의 예로는 리보좀 단백질, rRNA, 아미노산, tRNA, GTP, ATP, 번역 개시 및 신장 인자, 및 번역과 관련된 다른 인자들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가로, 번역 시스템은 회분식 번역 또는 구획화된 번역일 수 있다. 회분식 번역 시스템은 단일 구획에서 반응 성분들을 조합시키는 반면, 구획화된 번역 시스템은 번역 효율을 억제할 수 있는 반응 생성물들로부터 번역 반응 성분들을 분리한다. 이러한 번역 시스템은 상업적으로 이용가능하다.

또한, 커플링된 전사/번역 시스템을 사용할 수 있다. 커플링된 전사/번역 시스템은 유입 DNA가 상응하는 mRNA로 전사되게 하고, 결국은 상기 mRNA가 반응 성분들에 의해 번역되게 한다. 상업적으로 이용가능한 커플링된 전사/번역의 예는 래피드 트랜스레이션 시스템(RTS: Rapid Translation System, Roche Inc.)이다. 이 시스템은 예를 들면, 리보좀 및 번역 인자들과 같은 번역 성분들을 제공하기 위해 E. 콜라이 용해물을 함유하는 혼합물을 포함한다. 추가로, RNA 폴리머라제는 유입 DNA를 번역에 사용될 mRNA 주형으로 전사시키기 위해 포함된다. RTS는 공급/소비 구획 및 전사/번역 구획을 비롯한 반응 구획 사이에 삽입된 막에 의한 반응 성분들의 구획화를 이용할 수 있다.

tRNA의 아미노아실화는 트랜스퍼라제, 폴리머라제, 촉매 항체, 다작용성 단백질 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 물질에 의해 수행될 수 있다.

문헌 [Stephan in Scientist 2005 Oct 10; pages 30-33]에는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 단백질 내로 도입하는 추가의 방법이 기재되어 있다. 문헌 [Lu et al. in Mol Cell. 2001 Oct; 8(4): 759-69]에는 비-천연 아미노산을 함유하는 합성 펩티드에 단백질을 화학적으로 결찰시키는 방법(발현된 단백질 결찰)이 기재되어 있다.

또한, 미세주입 기법을 사용하여 비천연 아미노산을 단백질에 도입하였다. 예를 들면, 문헌 ([M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty and H. A. Lether, Science, 268:439(1995)]; 및 [D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645(2000)])을 참조한다. 시험관내에서 제조된 2개의 RNA 종(관심의 대상이 되는 아미노산 위치에 UAG 정지 코돈을 갖는 표적 단백질을 코딩하는 mRNA, 및 원하는 비천연 아미노산으로 아미노아실화된 앰버 서프레서 tRNA)을 제노푸스(Xenopus) 난모세포에 함께 주입하였다. 이어서, 난모 세포의 번역 기작은 UAG로 특정되는 위치에 인위적 아미노산을 삽입한다. 이러한 방법은 일반적으로 시험관내 발현 시스템을 따르지 않는 통합 막 단백질의 생체내 구조 기능 연구를 가능케 하였다. 그 예는 형광 아미노산을 타치키닌 뉴로키닌-2 수용체에 도입시켜 형광 공명 에너지 전달에 의한 거리를 측정하는 것(예를 들면, 문헌 [G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel and A. Chollet, J, Biol . Chem ., 271:19991(1996)] 참조); 이온 채널에서 표면 노출된 잔기를 확인하기 위해 비오티닐화된 아미노산을 도입하는 것(예를 들면, 문헌 [J. P. Gallivan, H. A. Lether and D. A. Dougherty, Chem . Biol., 4:739(1997)] 참조); 실시간으로 이온 채널의 구조적 변화를 모니터하기 위해 케이징된 티로신 유사체를 사용하는 것(예를 들면, 문헌 [J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty and H. A. Lether, Neuron, 20:619(1998)] 참조); 및 관문(gating) 기전을 프로빙하기 위해 알파 하이드록시 아미노산을 사용하여 이온 채널 골격을 변화시키는 것을 포함한다. 예를 들면, 문헌 ([P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty and H. A. Lether, Cell, 96:89(1999)]; 및, [T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz and J. Yang, Nat . Neurosci .. 4:239(2001)])을 참조한다.

생체내에서 비천연 아미노산을 단백질 내로 직접 도입하는 능력은 돌연변이체 단백질의 고 수율, 기술적 용이성, 세포, 또는, 가능한 경우, 생명체에서 돌연변이체 단백질 연구 가능성, 및 치료학적 치료 및 진단 용도에 있어서 이러한 돌연변이체 단백질의 사용이라는 장점을 포함하나, 이에 한정되지 않는 매우 다양한 장점을 제공한다. 다양한 크기, 산도, 친핵성, 소수성 및 다른 특성을 갖는 비천연 아미노산을 단백질 내로 도입할 수 있는 능력은 단백질의 구조를 합리적 및 체계적으로 개조하는 능력 및 단백질 기능을 프로빙하고, 새로운 특성을 갖는 신규 단백질 또는 유기체를 생성할 수 있는 능력을 크게 확장시킬 수 있다.

파라-F-Phe를 부위-특이적으로 도입하려는 한 시도에서, 효모 앰버 서프레서 tRNAPheCUA/페닐알라닐-tRNA 합성효소 쌍을 p-F-Phe 내성 Phe 영양요구성 에스케리치아 콜라이 균주에서 사용하였다. 예를 들면, 문헌 [R. Furter, Protein Sci . 7:419 (1998)]을 참조할 수 있다.

무세포(시험관내) 번역 시스템을 사용하여 본 발명의 IFN 베타 폴리뉴클레오티드의 발현을 얻을 수도 있다. 번역 시스템은 세포 번역 시스템 또는 무세포 번역 시스템일 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포로부터 유래할 수 있다. 세포 번역 시스템에는 투과가능한 세포 또는 세포 배양물과 같은 전체 세포 샘플을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 여기서, 원하는 핵산 서열은 mRNA로 전사될 수 있고, mRNA는 번역될 수 있다. 무세포 번역 시스템은 상업적으로 이용가능하고, 많은 다양한 유형 및 시스템이 잘 공지되어 있다. 무세포 시스템의 예로는 원핵세포 용해물, 예를 들면, 에스케리치아 콜라이 용해물, 및 진핵세포 용해물, 예를 들면, 밀 생식세포 추출물, 곤충 세포 용해물, 토끼 망상적혈구 용해물, 토끼 난자 용해물 및 인간 세포 용해물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 진핵세포 추출물 또는 용해물은 생성된 단백질이 글리코실화되거나, 인산화되거나, 또는 달리 변형될 때 바람직할 수 있는데, 이는 이러한 많은 변형이 진핵세포 시스템에서만 가능하기 때문이다. 이 추출물 및 용해물 중 일부는 상업적으로 이용가능하다((Promega; 위스콘신주 매디슨 소재; Stratagene; 캘리포니아주 라호야 소재; Amersham; 일리노이주 알링톤 하이츠 소재; GIBCO/BRL; 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재). 분비 단백질을 번역하기에 유용한 막 추출물, 예컨대, 마이크로좀 막을 함유하는 개 췌장 추출물 또한 사용될 수 있다. 주형(시험관내 번역)으로서의 mRNA 또는 주형(시험관내 전사와 번역이 조합됨)으로서의 DNA를 포함할 수 있는 이러한 시스템에서, 시험관내 합성은 리보좀에 의해 지시된다. 무세포 단백질 발현 시스템을 개발하기 위한 상당한 노력이 이루어졌다. 예를 들면, 문헌 ([Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74:309-316(2001)]; [Kim, D.M. and J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000)]; [Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000)]; [Kim, D.M., and J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999)]; 및 [Patnaik, R. and J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998)]; 미국 특허 번호 제6,337,191호; 미국 특허 공부 번호 2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785)(본원에서 참고로 인용된다)를 참조한다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드의 발현에 적용될 수 있는 또다른 접근법은 mRNA 펩티드 융합 기법을 포함한다. 예를 들면, 문헌 ([R. Roberts and J. Szostak, Proc . Natl Acad . Sci. (USA ) 94:12297-12302(1997)]; [A. Frankel, et al, Chemistry & Biology 10:1043-1050(2003)])을 참조한다. 이러한 접근법에서, 퓨로마이신에 연결된 mRNA 주형은 리보좀 상에서 펩티드로 번역된다. 하나 이상의 tRNA 분자가 변형된 경우, 비-천연 아미노산 역시 펩티드 내로 도입될 수 있다. 마지막 mRNA 코돈이 판독된 후, 퓨로마이신은 펩티드의 C 말단을 포획한다. 생성된 mRNA 펩티드 접합체가 시험관내 분석에서 관심의 대상이 되는 특성을 갖는 것으로 발견되는 경우, 그의 정체는 mRNA 서열로부터 용이하게 밝혀질 수 있다. 이 방식으로, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드의 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 특성을 갖는 폴리펩티드를 확인할 수 있다. 보다 최근에는 정제된 성분을 사용한 시험관내 리보좀 번역이 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된 펩티드의 합성을 가능하게 하는 것으로 보고되었다. 예를 들면, 문헌 [A. Forster et al., Proc . Natl Acad . Sci. (USA ) 100:6353(2003)]을 참조한다.

재구성된 번역 시스템 또한 사용할 수도 있다. 또한, 정제된 번역 인자들의 혼합물 뿐만 아니라, 개시 인자-1(IF-1), IF-2, IF-3(α 또는 β), 신장 인자 T(EF-Tu) 또는 말단 인자와 같은 정제된 번역 인자들로 보충된 용해물 또는 용해물의 조합물도 mRNA를 단백질로 성공적으로 번역하는데 사용되고 있다. 또한, 무세포 시스템은 커플링된 전사/번역 시스템일 수 있으며, 여기서, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. editors, Wiley Interscience, 1993)](본원에서 참고로 구체적으로 인용된다)에 기재된 바와 같이 DNA는 시스템에 도입되어 mRNA로 전사되고, 이 mRNA는 번역된다. 진핵세포 번역 시스템 내에서 전사된 RNA는 일부 번역 시스템에서 장점이 될 수 있는, 이종핵 RNA(hnRNA) 또는 5'-말단 캡(7-메틸 구아노신) 및 3'-말단 폴리 A 테일 보유 성숙 mRNA의 형태일 수 있다. 예를 들면, 캡핑된 mRNA는 망상적혈구 용해물 시스템에서 고 효율로 번역된다.

IX . IFN 베타 폴리펩티드에 커플링된 거대분자 중합체

본원에 기술된 조성물, 방법, 기법 및 방법을 사용하여 본원에 기술된 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 다양한 변형을 수행할 수 있다. 이러한 변형은 표지; 염료; 중합체; 수용성 중합체; 폴리에틸렌 글리콜의 유도체; 광가교결합제; 방사성 핵종; 세포독성 화합물; 약물; 친화성 표지; 광친화성 표지; 반응성 화합물; 수지; 제2 단백질 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 유사체; 항체 또는 항체 단편; 금속 킬레이트제; 보조인자; 지방산; 당질; 폴리뉴클레오티드; DNA; RNA; 안티센스 폴리뉴클레오티드; 당류; 수용성 덴드리머; 사이클로덱스트린; 억제성 리보핵산; 생체물질; 나노입자; 스핀 표지; 형광발색단, 금속 함유 부분; 방사능 부분; 신규한 작용기; 다른 분자와 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 기; 포토케이지드 부분; 화학선 방사 여기 부분; 광이성화 가능한 부분; 비오틴; 비오틴 유도체; 비오틴 유사체; 중원자 도입 부분; 화학적으로 절단 가능한 기; 광절단 가능한 기; 신장된 측쇄; 탄소 연결 당; 산화환원 활성 제제; 아미노 티오산; 독성 부분; 동위 원소로 표지된 부분; 생체물리적 프로브; 인광성 기; 화학발광성 기; 전자 밀집 기; 자성 기; 인터칼레이팅 기; 발색단; 에너지 전달제; 생물학적 활성제; 검출가능한 표지; 소분자; 양자점; 나노트랜스미터; 방사성뉴클레오티드; 방사성트랜스미터; 중성자 포획제; 또는 상기 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 추가 관능기를 폴리펩티드의 비-천연 아미노산 성분 상에 도입하는 단계를 포함한다. 본원에 기술된 조성물, 방법, 기법 및 방법의 예시적인 비제한적인 예로서, 하기 설명은 거대분자 중합체를 비-천연 아미노산 폴리펩티드에 첨가하는 것에 초점을 맞출 것이지만, 이때 본원에 기술된 조성물, 방법, 기법 및 방법(필요에 따라, 당업자가 본원의 개시내용에 근거하여 실시할 수 있는 적절한 변형을 포함함)은 상기 열거한 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 관능기를 첨가하는 것도 적용될 수 있음을 이해해야 한다.

매우 다양한 거대분자 중합체 및 다른 분자를 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드에 연결시켜 IFN 베타 폴리펩티드의 생물학적 특성을 조정하고/거나, IFN 베타 분자에 새로운 생물학적 특성을 부여할 수 있다. 이들 거대분자 중합체는 천연적으로 코딩된 아미노산, 비천연적으로 코딩된 아미노산, 천연 또는 비천연 아미노산의 임의의 작용성 치환기, 또는 천연 또는 비천연 아미노산에 첨가되는 임의의 치환기 또는 작용기를 통해 IFN 베타 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 넓은 범위 내의 분자량일 수 있다. 중합체의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da을 포함하나, 이에 한정되지 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 50,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, 중합체의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.

본 발명은 중합체:단백질 접합체로 된 실질적으로 균질한 제제를 제공한다. 본원에서 사용된 "실질적으로 균질한"이라는 것은 중합체:단백질 접합체 분자가 총 단백질의 절반을 초과하는 정도의 수준으로 관찰되는 것을 의미한다. 중합체:단백질 접합체는 생물학적 활성을 가지며, 본 명세서에 제공되는 본 발명의 "실질적으로 균질한" PEG화된 IFN 베타 폴리펩티드 제제는 예를 들면, 롯 투 롯(lot to lot) 약동학의 예측가능성에 있어 임상적으로 쉽게 적용할 수 있는 것과 같은 균질한 제제의 장점을 나타내기에 충분한 정도로 균질한 제제이다.

또한, 당업자는 중합체:단백질 접합체 분자의 혼합물을 제조하는 방법을 선택할 수 있으며, 이때 제공되는 장점은 혼합물 중에 포함되는 단일-중합체:단백질 접합체의 비율을 선택할 수 있다는 것이다. 따라서, 원한다면, 당업자는 다양한 갯수의 중합체 잔기(즉, 디-, 트리-, 테트라- 등)가 부착된 다양한 단백질의 혼합물을 제조할 수 있고, 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 모노-중합체:단백질 접합체와 상기 접합체를 조합할 수 있고, 소정의 비율로 모노-중합체:단백질 접합체를 갖는 혼합물을 수득할 수 있다.

선택된 중합체는 부착되는 단백질이 수성 환경, 예를 들면, 생리학적 환경 중에서 침전하지 않도록 수용성일 수 있다. 중합체는 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 최종 생성물 제제의 치료학적 사용을 위해, 중합체는 약제학적으로 허용되는 것이다.

중합체의 예에는 폴리알킬 에테르 및 그의 알콕시-캡핑된 유사체(예로서, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌/프로필렌 글리콜, 및 그의 메톡시 또는 에톡시-캡핑된 유사체, 특히 폴리에틸렌글리콜 또는 PEG로도 공지되어 있는 폴리옥시에틸렌 글리콜); 폴리비닐피롤리돈; 폴리비닐알킬 에테르; 폴리옥사졸린, 폴리알킬 옥사졸린 및 폴리하이드록시알킬 옥사졸린; 폴리아크릴아미드, 폴리알킬 아크릴아미드, 및 폴리하이드록시알킬 아크릴아미드(예로서, 폴리하이드록시프로필메타크릴아미드 및 그의 유도체); 폴리하이드록시알킬 아크릴레이트; 폴리시알산 및 그의 유사체; 친수성 펩티드 서열; 다당류 및 그의 유도체(덱스트란 및 덱스트란 유도체, 예로서, 카르복시메틸덱스트란, 덱스트란 설페이트, 아미노덱스트란을 포함함); 셀룰로스 및 그의 유도체, 예로서, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스; 키틴 및 그의 유도체, 예로서, 키토산, 숙시닐 키토산, 카르복시메틸키틴, 카르복시메틸키토산; 하이알루론산 및 그의 유도체; 전분; 알기네이트; 콘드로이틴 설페이트; 알부민; 풀루란 및 카르복시메틸 풀루란; 폴리아미노산 및 그의 유도체, 예로서, 폴리글루탐산, 폴리리신, 폴리아스파르트산, 폴리아스파르트아미드; 말레산 무수물 공중합체, 예컨대, 스티렌 말레산 무수물 공중합체, 디비닐에틸 에테르 말레산 무수물 공중합체; 폴리비닐 알코올; 그의 공중합체; 그의 3원중합체; 그의 혼합물; 및 그들의 유도체가 포함되나, 이들로 한정되지 않는다.

폴리에틸렌 글리콜 분자:단백질 분자의 비는 반응 혼합물 중 그들의 농도와 같이 달라질 것이다. 일반적으로, (과량의 미반응 단백질 또는 중합체가 최소로 존재한다는 점에서 반응 효율을 환산하면) 최적의 비는 선택된 폴리에틸렌 글리콜의 분자량 및 이용가능한 반응기의 갯수에 의해 결정될 수 있다. 분자량과 관련하여 전형적으로 중합체의 분자량이 높을수록, 단백질에 부착될 수 있는 중합체 분자의 수는 적다. 유사하게, 이들 파라미터를 최적화하는 경우, 중합체의 분지화를 고려해야 한다. 일반적으로, 분자량이 높을수록 (또는 분지가 많을수록) 중합체:단백질 비가 높다.

본원에서 사용되는 바와 같이, PEG:IFN 베타 폴리펩티드 접합체를 고려하는 경우, 용어 "치료학적 유효량"은 환자에게 유리한 효과를 주는 양을 지칭한다. 이 양은 개인마다 다르고, 환자의 전반적인 신체 상태 및 치료하고자 하는 증상의 병인을 비롯한 다수의 인자에 달려 있다. 요법에 사용되는 IFN 베타 폴리펩티드의 양은 허용가능한 속도로 변화를 일으키며, 유익한 수준으로 원하는 반응을 유지시킨다. 본 조성물의 치료학적 유효량은 공개적으로 입수가능한 물질 및 절차를 사용하여 당업계의 숙련인에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

수용성 중합체는 선형, 갈래형(forked) 또는 분지형을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 구조 형태일 수 있다. 전형적으로, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들면, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이지만, 다른 수용성 중합체도 사용될 수 있다. 일례로, 본 발명의 특정한 실시태양을 기술하는데 있어서 PEG를 사용한다.

PEG는 상업적으로 이용가능하거나, 당업계의 숙련인에게 공지된 방법에 따라 에틸렌 글리콜의 개환 중합화에 의해 제조될 수 있는 잘 알려져 있는 수용성 중합체이다(문헌 [Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161]). 용어 "PEG"는 크기 또는 PEG 말단에서의 변형과 관계없이 임의의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포괄하는 용어로서 널리 사용되며, 하기 화학식으로 표시되는 바와 같이 IFN 베타 폴리펩티드에 연결된 것으로서 나타낼 수 있다:

XO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y

(상기 식에서, n은 2 내지 10,000이고, X는 H이거나, C₁ _-4 알킬, 보호기 또는 말단 작용기를 포함하나 이로 한정되지 않는 말단 변형이다).

몇몇 경우에서, 본 발명에 사용되는 PEG는 하이드록시 또는 메톡시(즉, X는 H 또는 CH₃이다)를 갖는 하나의 말단 상에서 종결된다("메톡시 PEG"). 별법으로, PEG는 반응기로 종결되어 이작용성 중합체를 형성할 수 있다. 전형적인 반응기는 20종의 일반 아미노산에서 발견되는 작용기와 반응하는데 통상적으로 사용되는 반응기(말레이미드 기, 활성화된 카르보네이트(p-니트로페닐 에스테르를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 활성화된 에스테르(N-하이드록시숙신이미드, p-니트로페닐 에스테르를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 알데히드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 뿐만 아니라, 20종의 일반 아미노산에 대해 불활성을 나타내지만 비천연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 상보적 작용기(아지드 기 및 알킨 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)와 특이적으로 반응하는 작용기를 포함할 수 있다. 상기 화학식에서 Y로 표시되는 PEG의 다른 한쪽의 말단이 천연적으로 발생된 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 IFN 베타 폴리펩티드에 직접 또는 간접적으로 부착된다는 점이 주목된다. 예를 들면, Y는 폴리펩티드의 아민 기(리신의 엡실론 아민 또는 N 말단을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 대한 아미드, 카바메이트 또는 우레아 결합일 수 있다. 별법으로, Y는 티올 기(시스테인의 티올 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 대한 말레이미드 결합일 수 있다. 별법으로, Y는 20종의 일반 아미노산을 통해 통상적으로는 접근할 수 없는 잔기에 대한 결합일 수 있다. 예를 들면, PEG 상의 아지드 기는 IFN 베타 폴리펩티드 상의 알킨 기와 반응하여 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 생성물을 형성할 수 있다. 별법으로, PEG 상의 알킨 기는 비천연적으로 코딩된 아미노산 중에 존재하는 아지드 기와 반응하여 유사한 생성물을 형성할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 강한 친핵성 물질(히드라진, 히드라지드, 하이드록실아민, 세미카르바지드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)은 비천연적으로 코딩된 아미노산 중에 존재하는 알데히드 또는 케톤 기와 반응하여 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존을 형성할 수 있으며, 해당되는 경우, 몇몇 경우에서, 히드라존, 옥심 또는 세미카르바존은 적절한 환원제의 처리에 의해 더 환원될 수 있다. 별법으로, 강한 친핵성 물질은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 통해 IFN 베타 폴리펩티드 내로 도입될 수 있으며, 수용성 중합체 중에 존재하는 케톤 또는 알데히드 기와 우선적으로 반응하는데 사용될 수 있다.

필요에 따라 약 100 달톤(Da) 내지 100,000 Da 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 (때때로 0.1 내지 50 kDa 또는 10-40 kDa를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 임의의 분자량을 가진 PEG가 사실상 필요에 따라 사용될 수 있다. PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 넓은 범위 내에 있을 수 있다. PEG는 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da을 포함하나, 이에 한정되지 않는 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, PEG는 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, PEG는 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, PEG는 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, PEG는 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, PEG는 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 각 쇄의 MW 범위가 1-100 kDa(1-50 kDa 또는 5-20 kDa을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)인 분지형 쇄 PEG(PEG 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 사용할 수도 있다. 분지형 쇄 PEG의 각 쇄의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 범위 내에 있을 수 있다. 분지형 쇄 PEG의 각 쇄의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 및 1,000 Da을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 약 1,000 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 분지형 쇄 PEG의 각 쇄의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 50,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, 분지형 쇄 PEG의 각 쇄의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, 분지형 쇄 PEG의 각 쇄의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, 분지형 쇄 PEG의 각 쇄의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 20,000 Da이다. 매우 다양한 PEG 분자들이 쉐어워터 폴리머, 인크.(Shearwater Polymer, Inc.) 카탈로그, 넥타 테라퓨틱스(Nektar Therapeutics) 카탈로그(본원에서 참고로 인용된다)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 문헌에 기재되어 있다.

일반적으로, PEG 분자의 적어도 하나의 말단은 비천연적으로 코딩된 아미노산과의 반응에 이용될 수 있다. 예를 들면, 아미노산 측쇄와의 반응을 위해 알킨 및 아지드 부분을 갖는 PEG 유도체를 사용하여 본원에 기술된 바와 같이 PEG를 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착시킬 수 있다. 비천연적으로 코딩된 아미노산이 아지드를 포함하는 경우, PEG는 전형적으로 알킨 부분을 함유하여 [3+2] 사이클로첨가 생성물을 형성하거나, 포스핀 기를 함유하는 활성화된 PEG 종(즉, 에스테르, 카르보네이트)을 함유하여 아미드 결합을 형성한다. 별법으로, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 알킨을 포함하는 경우, PEG는 전형적으로 아지드 부분을 함유하여 [3+2] 휘스겐 사이클로첨가 생성물을 형성한다. 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐기를 포함하는 경우, PEG는 각각 상응하는 히드라존, 옥심 및 세미카르바존 결합을 형성하기 위해 전형적으로 강한 친핵성 물질(히드라지드, 히드라진, 하이드록실아민 또는 세미카르바지드 관능기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함한다. 다른 대안으로, 상기 기술한 반응기의 역 배향을 사용할 수 있다. 즉, 비천연적으로 코딩된 아미노산 중의 아지드 부분을 알킨을 함유하는 PEG 유도체와 반응시킬 수 있다.

몇몇 실시태양에서, PEG 유도체를 갖는 IFN 베타 폴리펩티드 변이체는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 화학적 관능기와 반응하는 화학적 관능기를 함유한다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명은 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 D인 수용성 중합체 골격을 포함하는 아지드 함유 중합체 유도체 및 아세틸렌 함유 중합체 유도체를 제공한다. 수용성 중합체의 중합체 골격은 폴리(에틸렌 글리콜)일 수 있다. 그러나, 또한, 폴리(에틸렌) 글리콜, 및 폴리(덱스트란) 및 폴리(프로필렌 글리콜)을 포함하는 다른 관련된 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 매우 다양한 수용성 중합체들도 본 발명을 실시하기에 적합하고, 용어 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)의 사용은 모든 이러한 분자를 포괄하고 포함하기 위한 것이라는 점을 이해해야 한다. 용어 PEG는 이작용성 PEG, 멀티아암형 PEG, 유도체화된 PEG, 갈래형 PEG, 분지형 PEG, 현수 PEG(즉, 중합체 골격에 현수된 하나 이상의 작용기를 갖는 PEG 또는 관련된 중합체), 또는 그 안에 분해가능한 결합을 갖는 PEG를 비롯한 임의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

전형적으로, PEG는 투명하고, 무색 무취이며, 수용성이고, 열에 대해 안정하며, 많은 화학 제제에 대해 불활성을 띠고, 가수분해되거나 악화되지 않으며, 일반적으로 비독성이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 생체적합성 물질로서 간주되는데, 즉, PEG는 유해하지 않으며, 생명체 조직 또는 유기체와 공존할 수 있다. 더욱 특히 PEG는 실질적으로 비면역원성인데, 즉, PEG는 체내에서 면역 반응을 일으키지 않는 경향을 나타낸다. PEG가 체내에서 일부 바람직한 기능을 갖는 분자, 예를 들면, 생물학적 활성 제에 부착된 경우, PEG는 상기 물질을 차폐하는 경향을 나타내며, 유기체가 상기 물질의 존재에 대한 내성을 가질 수 있도록 임의의 면역 반응을 감소시키거나 제거할 수 있다. PEG 접합체에는 실질적인 면역 반응을 일으키거나 응고 또는 다른 바람직하지 못한 효과를 일으키는 경향은 없다. 화학식 --CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂--(상기 식에서, n은 약 3 내지 약 4000, 전형적으로 약 20 내지 약 2000이다)을 갖는 PEG가 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 PEG가 중합체 골격으로서 특히 유용하다. PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 100,000 Da 이상을 포함하나, 이에 한정되지 않는 넓은 범위 내에 있을 수 있다. PEG의 분자량은 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, PEG의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, PEG의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, PEG의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, PEG의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.

중합체 골격은 선형 또는 분지형일 수 있다. 일반적으로, 분지형 중합체 골격이 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 분지형 중합체는 중심 분지 코어 부분, 및 중심 분지 코어에 연결된 다수의 선형 중합체 쇄를 갖는다. 통상, PEG는 다양한 폴리올, 예를 들면, 글리세롤, 글리세롤 올리고머, 펜타에리쓰리톨 및 소르비톨에 에틸렌 옥시드를 첨가함으로써 제조될 수 있는 분지 형태로 사용된다. 또한, 중심 분지 부분은 몇몇 아미노산, 예를 들면, 리신으로부터 유도될 수 있다. 분지형 폴리(에틸렌 글리콜)은 일반식 R(-PEG-OH)_m(여기서, R은 코어 부분, 예를 들면, 글리세롤, 글리세롤 올리고머 또는 펜타에리쓰리톨로부터 유도되고, m은 아암의 갯수를 나타낸다)로 표시될 수 있다. 또한, 멀티아암형 PEG 분자, 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,932,462호; 제5,643,575호; 제5,229,490호; 제4,289,872호; 미국 특허 출원 2003/0143596; WO 96/21469호; 및 WO 93/21259(그들 각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재된 것들도 중합체 골격으로서 사용될 수 있다.

또한, 분지형 PEG는 PEG(--YCHZ₂)_n(상기 식에서, Y는 연결기이고, Z는 원자로 이루어진 일정 길이의 쇄에 의해 CH에 연결된 활성화된 말단기이다)으로 표시되는 갈래형 PEG의 형태로 존재할 수 있다.

또한, 또다른 분지형 형태인 현수 PEG는 PEG 쇄의 말단이 아닌, PEG 골격을 따라 반응기, 예를 들면, 카르복실 기를 갖는다.

또한, 이러한 PEG 형태 이외에, PEG 중합체는 골격 상의 약한 또는 분해가능한 결합을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, PEG는 가수분해되기 쉬운 중합체 골격 내의 에스테르 결합을 사용하여 제조될 수 있다. 하기에 나타낸 바와 같이, 이러한 가수분해는 상기 중합체를 저 분자량의 단편으로 절단시킨다:

-PEG-CO₂-PEG-+H₂O → PEG-CO₂H+HO-PEG-

용어 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 PEG가 본원에 개시된 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는 당업계에 공지된 모든 형태를 나타내거나 포함한다는 점을 당업계의 숙련인은 이해할 것이다.

또한, 다수의 다른 중합체들도 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 몇몇 실시태양에서, 2 내지 약 300개의 말단을 갖는 수용성 중합체 골격은 본 발명에 특히 유용하다. 적합한 중합체의 예로는 다른 폴리(알킬렌 글리콜), 예를 들면, 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 그의 공중합체(에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하나, 이로 한정되지 않는다), 그의 3원중합체, 그의 혼합물 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비록 중합체 골격의 각 쇄의 분자량은 달라질 수 있지만, 전형적으로는 약 800 Da 내지 약 100,000 Da, 종종 약 6,000 Da 내지 약 80,000 Da이다. 중합체 골격의 각 쇄의 분자량은 00,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, 및 100 Da을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 약 100 Da 내지 약 100,000 Da일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 중합체 골격의 각 쇄의 분자량은 약 100 Da 내지 약 50,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, 중합체 골격의 각 쇄의 분자량은 약 100 Da 내지 약 40,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, 중합체 골격의 각 쇄의 분자량은 약 1,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, 중합체 골격의 각 쇄의 분자량은 약 5,000 Da 내지 약 40,000 Da이다. 몇몇 실시태양에서, 중합체 골격의 각 쇄의 분자량은 약 10,000 Da 내지 약 40,000 Da이다.

실질적으로, 당업자는 상기 수용성 골격에 대한 목록이 결코 한정적인 것이 아니며, 단순히 예시를 위한 것이고, 상기한 품질을 갖는 모든 중합체 물질들이 본 발명에 사용하기 적합한 것으로 고려된다는 점을 인식할 것이다.

본 발명의 몇몇 실시태양에서, 중합체 유도체는 "다작용성"이며, 이는 중합체 골격이 적어도 2개의 말단을 갖고, 가능하게는 작용기로 작용화되거나, 활성화된 약 300개 정도의 말단을 갖는다는 것을 의미한다. 다작용성 중합체 유도체는 각각의 말단이 동일하거나, 상이할 수 있는 작용기에 결합되는 2개의 말단을 갖는 선형 중합체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

하나의 실시태양에서, 중합체 유도체 하기 화학식을 갖는다:

X-A-POLY-B-N=N=N

상기 식에서,

N=N=N은 아지드 부분이고;

B는 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 연결 부분이고;

POLY는 수용성 비항원성 중합체이고;

A는 존재하거나, 존재하지 않을 수 있고, B와 동일하거나, 상이할 수 있는 연결 부분이고;

X는 제2 작용기이다.

A 및 B에 대한 연결 부분의 예는 18개 이하의, 1-10개의 탄소 원자를 함유할 수 있는 다작용화된 알킬 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 알킬 쇄에 헤테로원자, 예를 들면, 질소, 산소 또는 황이 포함될 수 있다. 또한, 알킬 쇄는 헤테로원자에서 분지형일 수 있다. A 및 B에 대한 연결 부분의 다른 예로는 10개 이하, 5-6개의 탄소 원자를 함유할 수 있는 다작용화된 아릴 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 아릴 기는 하나 이상의 탄소 원자, 질소, 산소 또는 황 원자로 치환될 수 있다. 적합한 연결기의 다른 예로는 미국 특허 제5,932,462호, 제5,643,575호 및 미국 특허 출원 공보 2003/0143596(각각이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재된 연결기를 포함한다. 당업계의 숙련인은 상기 연결 부분에 대한 목록이 결코 한정적인 것이 아니며, 단순히 예시를 위한 것이고, 상기한 품질을 갖는 모든 연결 부분들이 본 발명에 사용하기 적합한 것으로 고려된다는 점을 인식할 것이다.

X로 사용하기 적합한 작용기의 예는 하이드록실, 보호된 하이드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예를 들면, N-하이드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예를 들면, N-하이드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세타미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 트레실레이트, 알켄, 케톤, 및 아지드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 당업계의 숙련인에 의해 이해되는 바와 같이, 아지드 기와의 반응이 일어나지 않도록 선택된 X 부분은 아지드 기와 상용가능해야 한다. 아지드 함유 중합체 유도체는 동종이작용성(여기서, 동종이작용성이란 제2 작용기(즉, X)도 아지드 부분인 것을 의미한다)이거나, 이종이작용성(여기서, 이종이작용성이란 제2 작용기가 상이한 작용기인 것을 의미한다)일 수 있다.

용어 "보호된"은 특정한 반응 조건하에서 화학적 반응 작용기의 반응을 방지하는 보호기 또는 그러한 부분의 존재를 지칭한다. 보호기는 보호되는 화학적 반응기의 유형에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 화학적 반응기가 아민 또는 히드라지드인 경우, 보호기는 t-부틸옥시카르보닐(t-Boc) 및 9-플루오레닐메톡시카르보닐(Fmoc)의 군으로부터 선택될 수 있다. 화학적 반응기가 티올인 경우, 보호기는 오르토피리딜디설피드일 수 있다. 화학적 반응기가 카르복실산, 예를 들면, 부탄산 또는 프로피온산 또는 하이드록실 기인 경우, 보호기는 벤질 또는 알킬 기, 예를 들면, 메틸, 에틸 또는 t-부틸일 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 다른 보호기도 본 발명에 사용될 수 있다.

문헌 중의 말단 작용기의 구체적인 예로는 N-숙신이미딜 카르보네이트(예로서, 미국 특허 번호 제5,281,698호, 제5,468,478호 참조), 아민(예를 들면, 문헌 ([Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379(1981)], [Zalipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177(1983)]) 참조), 히드라지드(예를 들면, 문헌 [Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301(1978)] 참조), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트(예를 들면, 문헌 [Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Washington, D. C, 1997] 참조; 또한, 미국 특허 번호 제5,672,662호도 참조), 숙신이미딜 숙시네이트(예를 들면, 문헌 ([Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175(1984)] 및 [Joppich et al. Makromol. Chem. 180:1381(1979)]) 참조), 숙신이미딜 에스테르(예로서, 미국 특허 번호 제4,670,417호 참조), 벤조트리아졸 카르보네이트(예로서, 미국 특허 번호 제5,650,234호 참조), 글리시딜 에테르(예를 들면, 문헌 [Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11(1979)], [Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354(1991)]) 참조), 옥시카르보닐이미다졸(예를 들면, 문헌 ([Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25(1983)], [Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251(1985)]) 참조), p-니트로페닐 카르보네이트(예를 들면, 문헌 ([Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11:141(1985)]; 및 [Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45(1991)]) 참조), 알데히드(예로서, [Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341(1984)], 미국 특허 번호 제5,824,784호, 미국 특허 번호 제5,252,714호) 참조), 말레이미드(예를 들면, 문헌 ([Goodson et al. Biotechnology(NY) 8:343(1990)], [Romani et al. in Chemistry of Peptide and Protein 2:29(1984)], 및 [Kogan, Synthesis Comm. 22:2417(1992)]) 참조), 오르토피리딜디설피드(예를 들면, 문헌 [Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993)] 참조), 아크릴로(예를 들면, 문헌 [Sawhney et al., Macromolecular, 26:581(1993)] 참조), 비닐설폰(예로서, 미국 특허 번호 제5,900,461호 참조)을 포함한다. 상기 참고 문헌 모두가 본원에서 참고로 인용된다.

본 발명의 특정 실시태양에서, 본 발명의 중합체 유도체는 하기 화학식을 갖는 중합체 골격을 포함한다:

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-N=N=N

상기 식에서,

X는 상기한 바와 같은 작용기이고,

n은 약 20 내지 약 4000이다.

또다른 실시태양에서, 본 발명의 중합체 유도체는 하기 화학식을 갖는 중합체 골격을 포함한다:

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-W-N=N=N

상기 식에서,

W는 1-10개의 탄소 원자를 포함하는 지방족 또는 방향족 링커 부분이고;

n은 약 20 내지 약 4000이고;

X는 상기한 바와 같은 작용기이고, m은 1 내지 10이다.

본 발명의 아지드 함유 PEG 유도체는 당업계에 공지되고/거나 본원에 개시되어 있는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 하나의 방법에서, 이하 나타내는 바와 같이, 제1 작용기에 결합된 제1 말단 및 적합한 이탈기에 결합된 제2 말단을 갖고, 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 수용성 중합체 골격은 아지드 음이온(이는 나트륨, 칼륨, t-부틸암모늄 등을 비롯한 다수의 적합한 반대이온들 중 어느 것과 쌍을 이룰 수 있음)과 반응한다. 이러한 이탈기는 친핵성 치환을 수행하고, 아지드 부분에 의해 대체되어 원하는 아지드 함유 PEG 중합체를 제공한다.

X-PEG-L + N₃ ^- → X-PEG-N₃

나타낸 바와 같이, 본 발명에 사용하기 적합한 중합체 골격은 화학식 X-PEG-L(여기서, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, X는 아지드 기와 반응하지 않는 작용기이며, L는 적합한 이탈기이다)을 갖는다. 적합한 작용기의 예로는 하이드록실, 보호된 하이드록실, 아세탈, 알케닐, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 말레이미드, 디티오피리딘, 및 비닐피리딘, 및 케톤을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 이탈기의 예로는 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 메실레이트, 트레실레이트, 및 토실레이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 아지드 함유 중합체 유도체를 제조하는 또다른 방법에서, 아지드 관능기를 갖는 결합제를 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 수용성 중합체 골격과 접촉시켜 아지드가 연결기에 의해 중합체 골격으로부터 분리되어 있는 아지드 함유 중합체 유도체 생성물을 형성하는데, 여기서, 결합제는 PEG 중합체 상에서 화학적 관능기와 선택적으로 반응하는 화학적 관능기를 갖는다.

예시적인 반응도는 다음과 같이 도시된다:

X-PEG-M + N-링커-N=N=N → PG-X-PEG-링커-N=N=N

상기 식에서,

PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고;

X는 캡핑 기, 예를 들면, 알콕시 또는 상기한 바와 같은 작용기이고;

M은 아지드 관능기와는 반응하지 않지만, N 작용기와는 유효하게 선택적으로 반응하는 작용기이다.

적합한 작용기의 예로는 N이 아민인 경우, M은 카르복실산, 카르보네이트 또는 활성 에스테르이고; N이 히드라지드 또는 아미노옥시 부분인 경우, M은 케톤이고; N이 친핵성 물질인 경우, M은 이탈기인 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

조 생성물의 정제는 생성물을 침전시킨 후, 필요에 따라 크로마토그래피하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

더욱 구체적인 예는 아민 중 하나가 보호기 부분, 예를 들면, t-부틸-Boc에 의해 보호되는 PEG 디아민의 경우로 다음에 도시되고, 생성된 단일 보호된 PEG 디아민은 아지드 관능기를 갖는 연결 부분과 반응한다:

BocHN-PEG-NH₂ + H0₂C-(CH₂)₃-N=N=N

이 경우, 아민 기는 다양한 활성화제, 예를 들면, 티오닐 클로라이드 또는 카보디이미드 시약 및 N-하이드록시숙신이미드 또는 N-하이드록시벤조트리아졸을 사용하여 카르복실산 기에 커플링되어 모노아민 PEG 유도체와 아지드를 갖는 링커 부분 사이에 아미드 결합을 형성할 수 있다. 아미드 결합이 성공적으로 형성된 후, 생성된 N-t-부틸-Boc-보호된 아지드 함유 유도체를 생체활성 분자를 변형시키는데 바로 사용하거나, 추가로 다른 유용한 작용기를 안착시키도록 할 수 있다. 예를 들면, N-t-Boc 기는 강한 산 처리에 의해 가수분해되어 오메가-아미노-PEG-아지드를 생성할 수 있다. 생성된 아민을 중요한 이종이작용성 시약의 생성을 위한 합성 기회로 사용하여 다른 유용한 관능기, 예를 들면, 말레이미드 기, 활성화된 디설피드, 활성화된 에스테르 등을 안착시킬 수 있다.

상이한 분자를 중합체의 각 말단에 부착시키는 것이 바람직한 경우, 이종이작용성 유도체가 특히 유용하다. 예를 들면, 오메가-N-아미노-N-아지도 PEG는 활성화된 친전자성 기, 예를 들면, 알데히드, 케톤, 활성화된 에스테르, 활성화된 카르보네이트 등을 갖는 분자를 PEG의 한 말단에 부착시키고, 아세틸렌 기를 갖는 분자를 PEG의 다른 말단에 부착시킨다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 중합체 유도체는 하기 화학식을 갖는다:

X-A-POLY-B-C≡C-R

상기 식에서,

R은 H 또는 알킬, 알켄, 알킬옥시, 또는 아릴 또는 치환된 아릴 기일 수 있고;

B는 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 연결 부분이고;

POLY는 수용성 비항원성 중합체이고;

A는 존재하거나, 존재하지 않을 수 있고 B와 동일하거나, 상이할 수 있는 연결 부분이고;

X는 제2 작용기이다.

X로 사용하기 적합한 작용기의 예는 하이드록실, 보호된 하이드록실, 알콕실, 활성 에스테르, 예를 들면, N-하이드록시숙신이미딜 에스테르 및 1-벤조트리아졸릴 에스테르, 활성 카르보네이트, 예를 들면, N-하이드록시숙신이미딜 카르보네이트 및 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세타미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 및 트레실레이트, 알켄, 케톤, 및 아세틸렌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이해되는 바와 같이, 아세틸렌 기와의 반응이 일어나지 않도록 선택된 X 부분은 아세틸렌 기와 상용가능해야 한다. 아세틸렌 함유 중합체 유도체는 동종이작용성(여기서, 동종이작용성이란 제2 작용기(즉, X)도 아세틸렌 부분인 것을 의미한다)이거나, 이종이작용성(여기서, 이종이작용성이란 제2 작용기가 상이한 작용기인 것을 의미한다)일 수 있다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 중합체 유도체는 하기 화학식을 갖는 중합체 골격을 포함한다:

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-C≡CH

상기 식에서,

X는 상기한 바와 같은 작용기이고;

n은 약 20 내지 약 4000이고;

m은 1 내지 10이다.

각 이종이작용성 PEG 중합체의 구체적인 예는 하기에 나타낸다.

본 발명의 아세틸렌 함유 PEG 유도체는 당업계의 숙련인에 공지되고/거나 본원에 개시되어 있는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 하나의 방법에서, 제1 작용기에 결합된 제1 말단 및 적합한 이탈기에 결합된 제2 말단을 갖고, 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 수용성 중합체 골격은 아세틸렌 관능기 및 PEG 상의 친핵성 기와 반응하기 적합한 이탈기, 둘 모두를 갖는 화합물과 반응한다. 친핵성 부분을 갖는 PEG 중합체 및 이탈기를 갖는 분자가 조합된 경우, 이탈기는 친핵성 치환을 수행하고, 친핵성 부분에 의해 대체되어 원하는 아세틸렌 함유 중합체를 제공한다.

X-PEG-Nu + L-A-C → X-PEG-Nu-A-C≡CR'

나타낸 바와 같이, 반응에 사용하기 바람직한 중합체 골격은 화학식 X-PEG-Nu(여기서, PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고, Nu는 친핵성 부분이고, X는 Nu, L 또는 아세틸렌 관능기와 반응하지 않는 작용기이다)이다.

Nu의 예는 주로 SN2 유형의 기전에 의해 반응하는 아민, 알콕시, 아릴옥시, 술프히드릴, 이미노, 카르복실레이트, 히드라지드, 아민옥시 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. Nu 기의 추가적인 예는 주로 친핵성 첨가 반응을 통해 반응하는 작용기를 포함한다. L 기의 예는 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 메실레이트, 트레실레이트, 및 토실레이트 및 친핵성 치환을 수행할 것으로 예상되는 다른 기 뿐만 아니라 케톤, 알데히드, 티오에스테르, 올레핀, 알파-베타 불포화된 카르보닐 기, 카르보네이트 및 친핵성 물질에 의한 첨가를 수행할 것으로 예상되는 다른 친전자성 기를 포함한다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, A는 1-10개의 탄소 원자의 지방족 링커 또는 6-14개의 탄소 원자의 치환된 아릴 환이다. X는 아지드 기와 반응하지 않는 작용기이고, L은 적합한 이탈기이다.

본 발명의 아세틸렌 함유 중합체 유도체를 제조하는 또다른 방법에서, 하나의 말단에서 보호된 작용기 또는 캡핑제를 갖고, 나머지 다른 하나의 말단에서 적합한 이탈기를 갖는 평균 분자량이 약 800 Da 내지 약 100,000 Da인 PEG 중합체는 아세틸렌 음이온에 의해 접촉된다.

예시적인 반응도는 다음과 같이 도시된다:

X-PEG-L + -C≡CR'→ X-PEG-C≡CR'

상기 식에서,

PEG는 폴리(에틸렌 글리콜)이고;

R'는 H, 알킬, 알콕시, 아릴 또는 아릴옥시 기 또는 치환된 알킬, 알콕실, 아릴 또는 아릴옥시 기이다.

상기 예에서, 이탈기 L은 충분한 농도의 아세틸렌 음이온과 접촉하는 경우, SN2 유형의 치환이 이루어지도록 충분한 반응성을 띠어야 한다. 아세틸렌 음이온에 의한 이탈기의 SN2 치환을 달성하는데 필요로 하는 반응 조건은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다.

통상, 조 생성물의 정제는 생성물을 침전시킨 후, 필요에 따라, 크로마토그래피하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

수용성 중합체는 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 수용성 중합체는 IFN 베타 폴리펩티드에 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 천연적으로 코딩된 아미노산의 임의의 작용기 또는 치환기, 또는 비천연적으로 코딩된 아미노산 또는 천연적으로 코딩된 아미노산에 첨가된 임의의 작용기 또는 치환기를 통해 연결될 수 있다. 별법으로, 수용성 중합체는 천연적으로 발생된 아미노산(시스테인, 리신 또는 N 말단 잔기의 아민 기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 통해 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하는 IFN 베타 폴리펩티드에 연결되어 있다. 몇몇 경우에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 비-천연 아미노산을 포함하는데, 여기서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들)은 수용성 중합체(들)(PEG 및/또는 올리고당을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 연결되어 있다. 몇몇 경우에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 추가로 수용성 중합체에 연결된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 천연적으로-코딩된 아미노산(들)을 포함한다. 몇몇 경우에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 수용성 중합체에 연결된 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산(들) 및 수용성 중합체에 연결된 하나 이상의 천연적으로 발생된 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명에 사용되는 수용성 중합체는 비접합화된 형태에 비해 IFN 베타 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증강시킨다.

본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드에 연결된 수용성 중합체의 갯수(즉, PEG화 또는 글리코실화 정도)를 조정하여 변경된(증가되거나, 감소되는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 약리학적, 약동학적 또는 약력학적 특징, 예를 들면, 생체 내 반감기를 제공할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타의 반감기는 비변형된 폴리펩티드에 비해 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%, 2배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 또는 적어도 약 100배 증가된다.

강한 친핵성 기(즉, 히드라지드 , 히드라진, 히드록실아민 또는 세미카르바지드 )를 함유하는 PEG 유도체

본 발명의 하나의 실시태양에서, 카르보닐 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드는 PEG 골격에 직접 연결된 말단 히드라진, 하이드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.

몇몇 실시태양에서, 하이드록실아민 말단 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-O-NH₂

상기 식에서,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000(즉, 평균 분자량은 5-40 kDa이다)이다.

몇몇 실시태양에서, 히드라진 함유 PEG 유도체 또는 히드라지드 함유 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X-NH-NH₂

상기 식에서,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이고, X는 임의로 존재하거나, 존재하지 않을 수 있는 카르보닐기(C=O)이다.

몇몇 실시태양에서, 세미카르바지드 함유 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

상기 식에서,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드는 아미드 결합에 의해 PEG 골격에 연결된 말단 하이드록실아민, 히드라지드, 히드라진, 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-O-NH₂

상기 식에서,

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-X-NH-NH₂

상기 식에서,

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

상기 식에서,

본 발명의 또다른 실시태양에서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드는 말단 히드라진, 하이드록실아민, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체에 의해 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 쇄의 분자량은 10-40 kDa 범위이고, 5-20 kDa 범위일 수 있다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드는 분지형 구조를 갖는 PEG 유도체에 의해 변형된다. 예를 들면, 몇몇 실시태양에서, 히드라진 말단 PEG 유도체 또는 히드라지드 말단 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-NH-NH₂

상기 식에서,

몇몇 실시태양에서, 세미카르바지드 기를 함유하는 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

상기 식에서,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 임의로 NH, 0, S, C(O)이거나, 존재하지 않고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이다.

몇몇 실시태양에서, 하이드록실아민 기를 함유하는 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-O-NH₂

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, X는 임의로 NH, O, S, C(O)이거나, 존재하지 않고, m은 2-10이며, n은 100-1,000이다.

수용성 중합체(들)가 IFN 베타 폴리펩티드에 연결되는 정도 및 부위가 IFN 베타 폴리펩티드의 IFN 베타 폴리펩티드 수용체에의 결합을 조정할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 결합은 평형 결합 분석, 예를 들면, 문헌 [Spencer et al, J. Biol. Chem., 263:7862- 7867(1988)]에 기재된 것에 의해 측정한 바, 약 400 nM 이하의 K_d, 150 nM 이하의 K_d, 및 몇몇 경우에서, 100 nM 이하의 K_d로 IFN 베타 폴리펩티드가 IFN 베타 폴리펩티드 수용체에 결합하도록 정렬된다.

중합체의 활성화 뿐만 아니라, 펩티드의 접합화 방법 및 화학 작용은 문헌에 기재되어 있고, 당업계에 공지되어 있다. 중합체의 활성화에 통상 사용되는 방법은 시아노겐 브로마이드, 페리오데이트, 글루타르알데히드, 비에폭시드, 에피클로로히드린, 디비닐술폰, 카르보디이미드, 설포닐 할라이드, 트리클로로트리아진 등을 사용하여 작용기를 활성화시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다(문헌 ([R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N. Y.]; [S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton]; [G. T. Hermanson et al, (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N. Y.]; [Dunn, R.L., et al, Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991]) 참조).

PEG의 관능화 및 접합화에 대한 몇몇 검토 및 논문이 이용가능하다. 예를 들면, 문헌 ([Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985)]; [Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987)]; [Wong et al, Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992)]; [Delgado et al, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992)]; [Zalipsky, Bioconjugate Chem . 6: 150-165 (1995)])를 참조한다.

또한, 중합체의 활성화 방법은 WO 94/17039, 미국 특허 번호 제5,324,844호, WO 94/18247, WO 94/04193, 미국 특허 번호 제5,219,564호, 미국 특허 번호 제5,122,614호, WO 90/13540, 미국 특허 번호 제5,281,698호, 및 WO 93/15189에서 살펴볼 수 있고, 활성화된 중합체와 효소 사이의 접합화의 경우로는 응고 인자 VIII(WO 94/15625 참조), 헤모글로빈(WO 94/09027 참조), 산소 운반 분자(미국 특허 제 4,412,989호 참조), 리보뉴클레아제 및 슈퍼옥시드 디스뮤타아제(문헌 [Veronese et al., App . Biochem . Biotech . 11: 141-45(1985)])를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 인용된 모든 참고 문헌 및 특허는 본원에서 참고로 인용된다.

비천연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들면, p-아지도-L-페닐알라닌을 함유하는 IFN 베타 폴리펩티드의 PEG화(즉, 임의의 수용성 중합체의 첨가)는 임의의 편리한 방법에 의해 수행된다. 예를 들면, IFN 베타 폴리펩티드는 알킨 종결 mPEG 유도체로 PEG화된다. 간략하면, 실온에서 과량의 고체 mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH를 교반하면서 p-아지도-L-Phe 함유 IFN 베타 폴리펩티드의 수용액에 첨가한다. 전형적으로, 이 수용액은 반응이 수행되는 pH(일반적으로, 약 pH 4-10) 근처에서 pK_a를 갖는 완충액으로 완충 처리된다. 예를 들면, pH 7.5에서 PEG화하기 적합한 완충액의 예로는 HEPES, 포스페이트, 보레이트, 트리스-HCl, EPPS, 및 TES를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. pH를 연속적으로 모니터하고, 필요에 따라 조정한다. 전형적으로, 반응을 약 1-48시간 동안 계속한다.

이어서, 반응 생성물을 소수성 상호작용 크로마토그래피하여 차단되지 않은 PEG가 분자의 양쪽 말단에서 활성화되어 IFN 베타 폴리펩티드 변이체 분자를 가교 결합시키는 경우 형성될 수 있는 페길화된 IFN 베타 폴리펩티드의 임의의 고분자 복합체 및 유리 mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH로부터 PEG화된 IFN 베타 폴리펩티드 변이체를 분리시킨다. 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 동안의 조건은 임의의 가교 결합된 PEG화된 IFN 베타 폴리펩티드 변이체 복합체가 하나 이상의 PEG 기에 접합화된 하나의 IFN 베타 폴리펩티드 변이체 분자를 함유하는 원하는 형태를 따라 용리되는 반면, 유리 mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH는 컬럼을 통해 유동하도록 하는 것이다. 적합한 조건은 가교 결합된 복합체 대 원하는 접합체의 상대적 크기에 따라 달라지며, 당업계의 숙련인에 의해 용이하게 결정된다. 원하는 접합체를 함유하는 용리액을 한외여과에 의해 농축시키고, 투석여과에 의해 탈염시킨다.

필요에 따라, 소수성 크로마토그래피로부터 수득한 PEG화된 IFN 베타 폴리펩티드를 친화성 크로마토그래피; 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피(DEAE 세파로스를 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다); 실리카 크로마토그래피; 역상 HPLC; 겔 여과(세파덱스(SEPHADEX) G-75를 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다); 소수성 상호작용 크로마토그래피; 크기 배제 크로마토그래피, 금속 킬레이트 크로마토그래피; 한외여과/투석여과; 에탄올 침전; 황산암모늄 침전; 크로마토포커싱; 치환 크로마토그래피; 전기영동법(분취용 등전 포커싱을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 차등 용해도법(황산암모늄 침전을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 또는 추출을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 당업계의 숙련인에게 공지된 하나 이상의 방법으로 추가 정제할 수 있다. 겉보기 분자량은 구형 단백질 표준 물질과 비교함으로써 GPC에 의해 추정할 수 있다(문헌 [Preneta AZ, PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306] 참조). IFN 베타-PEG 접합체의 순도는 단백질 분해적 분해(트립신 절단을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 후 질량 분광분석법으로 평가할 수 있다(문헌 [Pepinsky R. B., et al., J. Pharmacol . & Exp . Ther. 297 (3): 1059-66 (2001)].

본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 아미노산에 연결된 수용성 중합체는 제한없이 추가로 유도체화되거나 치환될 수 있다.

아지드 함유 PEG 유도체

본 발명의 또다른 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 알킨 부분과 반응하는 아지드 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체는 1-100 kDa 범위, 몇몇 실시태양에서, 10-40 kDa 범위의 평균 분자량을 갖는다.

몇몇 실시태양에서, 아지드 말단 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-N₃

상기 식에서,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, n은 100- 1,000(즉, 평균 분자량은 5-40 kDa이다)이다.

또다른 실시태양에서, 아지드 말단 PEG 유도체는 하기 구조를 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-N₃

상기 식에서,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000(즉, 평균 분자량은 5-40 kDa이다)이다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드는 말단 아지드 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체에 의해 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 쇄의 MW은 10-40 kDa 범위이고, 5-20 kDa 범위일 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 아지드 말단 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_pN₃

상기 식에서,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000이며, X는 임의로 O, N, S 또는 카르보닐 기(C=O)이고, 각각의 경우, 존재하거나 존재하지 않을 수 있다.

알킨 함유 PEG 유도체

본 발명의 또다른 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 부분과 반응하는 알킨 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.

몇몇 실시태양에서, 알킨 말단 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-C≡CH

상기 식에서,

본 발명의 또다른 실시태양에서, 알킨 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드는 아미드 결합에 의해 PEG 골격에 연결된 말단 아지드 또는 말단 알킨 부분을 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다.

RO-(CH₂CH₂O)_n -O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-C≡CH

상기 식에서,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000이다.

본 발명의 또다른 실시태양에서, 아지드 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드는 말단 알킨 부분을 함유하는 분지형 PEG 유도체에 의해 변형되며, 이러한 분지형 PEG의 각 쇄의 MW은 10-40 kDa 범위이고, 5-20 kDa 범위일 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시태양에서, 알킨 말단 PEG 유도체는 하기 화학식을 갖는다:

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_p-C≡CH

상기 식에서,

R은 단순 알킬(메틸, 에틸, 프로필 등)이고, m은 2-10이며, p는 2-10이고, n은 100-1,000이며, X는 임의로 O, N, S 또는 카르보닐 기(C=O)이거나, 존재하지 않을 수 있다.

포스핀 함유 PEG 유도체

본 발명의 또다른 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 비천연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 아지드 부분과 반응하는 아릴 포스핀 기를 추가로 포함하는 활성화된 작용기(에스테르, 카르보네이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 함유하는 PEG 유도체에 의해 변형된다. 일반적으로, PEG 유도체는 1-100 kDa 범위, 몇몇 실시태양에서, 10-40 kDa 범위의 평균 분자량을 갖는다.

몇몇 실시태양에서, PEG 유도체는 화학식을 갖는다:

상기 식에서, n은 1-10이고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이며, W는 수용성 중합체이다.

몇몇 실시태양에서, PEG 유도체는 화학식을 갖는다:

상기 식에서, X는 O, N, S이거나, 존재하지 않을 수 있고, Ph는 페닐이며, W는 수용성 중합체이고, R은 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬 및 치환된 아릴 기일 수 있다. 예시적인 R 기로는 -CH₂, -C(CH₃)₃, -OR', -NR'R", -SR', -할로겐, -C(O)R', -CONR'R", - S(O)₂R', -S(O)₂NR'R", -CN 및 -NO₂를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. R', R", R'" 및 R""은 각각 독립적으로 수소, 치환되거나, 비치환된 헤테로알킬, 1-3개의 할로겐으로 치환된 아릴을 포함하나, 이에 한정되지 않는 치환되거나, 비치환된 아릴, 치환되거나, 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 1 초과의 R 기를 포함하는 경우, 예를 들면, 각각의 R 기는 R', R", R"' 및 R"" 기 중 1 초과의 기가 존재하는 경우, 독립적으로 R', R", R"' 및 R"" 기로부터 선택된다. R' 및 R"가 동일한 질소 원자에 부착된 경우, 이들은 질소 원자와 합쳐져 5-, 6-, 또는 7-원 환을 형성할 수 있다. 예를 들면, -NR'R"는 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 의미한다. 치환기의 상기 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예를 들면, 할로알킬(-CF₃ 및 -CH₂CF₃를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 및 아실(-C(O)CH₃, -C(O)CF₃, -C(O)CH₂OCH₃ 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함하는 것을 의미함을 이해할 것이다.

다른 PEG 유도체 및 일반 PEG 화 기법

IFN 베타 폴리펩티드에 연결될 수 있는 다른 예시적인 PEG 분자 뿐만 아니라, PEG화 방법으로는 예로서, 미국 특허 공보 번호 제2004/0001838호; 제2002/0052009호; 제2003/0162949호; 제2004/0013637호; 제2003/0228274호; 제2003/0220447호; 제2003/0158333호; 제2003/0143596호; 제2003/0114647호; 제2003/0105275호; 제2003/0105224호; 제2003/0023023호; 제2002/0156047호; 제2002/0099133호; 제2002/0086939호; 제2002/0082345호; 제2002/0072573호; 제2002/0052430호; 제2002/0040076호; 제2002/0037949호; 제2002/0002250호; 제2001/0056171호; 제2001/0044526호; 제2001/0021763호; 미국 특허 번호 제6,646,110호; 제5,824,778호; 제5,476,653호; 제5,219,564호; 제5,629,384호; 제5,736,625호; 제4,902,502호; 제5,281,698호; 제5,122,614호; 제5,473,034호; 제5,516,673호; 제5,382,657호; 제6,552,167호; 제6,610,281호; 제6,515,100호; 제6,461,603호; 제6,436,386호; 제6,214,966호; 제5,990,237호; 제5,900,461호; 제5,739,208호; 제5,672,662호; 제5,446,090호; 제5,808,096호; 제5,612,460호; 제5,324,844호; 제5,252,714호; 제6,420,339호; 제6,201,072호; 제6,451,346호; 제6,306,821호; 제5,559,213호; 제5,747,646호; 제5,834,594호; 제5,849,860호; 제5,980,948호; 제6,004,573호; 제6,129,912호; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 및 EP 154 316(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 단일 쇄, 분지형 쇄, 멀티아암형 쇄, 단일 작용성, 이작용성, 다작용성, 또는 그의 임의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의 형태의, 본원에 기술된 PEG 분자들 중 임의의 것을 사용할 수 있다.

추가 중합체 및 하이드록실아민(아미노옥시) PEG 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 PEG 유도체는 하기 특허 출원: 미국 특허 공보 번호 제2006/0194256호, 미국 특허 공보 번호 제2006/0217532호, 미국 특허 공보 번호 제2006/0217289호, 미국 가특허 번호 제60/755,338호; 미국 가특허 번호 제60/755,711호; 미국 가특허 번호 제60/755,018호; 국제 특허 출원 번호PCT/US06/49397; WO 2006/069246호; 미국 가특허 번호 제60/743,041호; 미국 가특허 번호 제60/743,040; 국제 특허 출원 번호 PCT/US06/47822; 미국 가특허 번호 제60/882,819호; 미국 가특허 번호 제60/882,500호; 및 미국 가특허 번호 제60/870,594호(이들 모두의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

이종 Fc 융합 단백질

상기 기술된 인터페론 베타 화합물은 직접 또는 펩티드 링커를 통해 면역글로불린의 Fc 부분에 융합될 수 있다. 면역글로불린은 디설피드 결합에 의해 결합된 폴리펩티드 쇄를 포함하는, 전형적으로는 2개의 경쇄와 2개의 중쇄를 갖는 분자이다. 각 쇄에서 하나의 도메인(V)은 분자의 항체 특이성에 따라 다른 가변 아미노산 서열을 갖는다. 나머지 도메인(C)은 동일 클래스의 분자에 공통적인 상당한 불변 서열을 갖는다.

본원에서 사용되는 바, 면역글로불린의 Fc 부분은 면역학 분야의 용어에서 보편적으로 주어지는 의미를 갖는다. 특히 상기 용어는 항체로부터 2개의 항원 결합 영역(Fab 단편)을 제거함으로써 수득되는 항체 단편을 지칭한다. Fab 단편을 제거하는 한가지 방법은 면역글로불린을 파파인으로 분해하는 것이다. 따라서, 비공유 상호작용 및 디설피드 결합을 통해 결합되어 있는 2개의 중쇄, 둘 모두로부터 유래된 불변 영역의 크기가 대략적으로 동일한 단편으로부터 Fc 부분이 형성된다. Fc 부분은 힌지 영역을 포함할 수 있고, CH2 및 CH3 도메인을 거쳐 항체 C 말단으로까지 이어질 수 있다. 인간 및 마우스 면역글로불린에 대한 대표적인 힌지 영역에 관해서는 문헌 [Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C. A. K., ed., W. H. Freeman and Co., 1992](그의 교시는 본원에서 참고로 인용된다)에서 살펴볼 수 있다. Fc 부분은 하나 이상의 글리코실화 부위를 추가로 포함한다. 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인, 및 하나의 N-글리코실화 부위를 포함하는 다수의 대표적인 Fc 단백질의 아미노산 서열이 당업계에 잘 알려져 있다.

효과기 기능 및 약동학적 특성이 상이한, 5가지 유형의 인간 면역글로불린 Fc 영역이 존재한다: IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE. 혈청 중 가장 풍부한 면역글로불린은 IgG이다. IgG는 또한 임의의 면역글로불린들 중 혈청 반감기가 가장 긴 면역글로불린이다(23일). 다른 면역글로불린들과는 달리 IgG는 Fc 수용체에 결합한 후에 효과적으로 재순환한다. 4개의 IgG 서브클래스 G1, G2, G3, 및 G4가 존재하는데, 이들 각각은 상이한 효과기 기능을 갖는다. G1, G2, 및 G3은 C1q에 결합할 수 있고, 보체를 고정시킬 수 있는 반면, G4는 그렇지 못하다. G3이 G1보다는 더욱 효과적으로 C1q에 결합할 수 있지만, G1는 보체 지정 세포 용해를 매개하는데 더욱 효과적이다. G2는 매우 효과적으로 보체를 고정시킨다. IgG 중 C1q 결합 부위는 CH2 도메인의 카르복시 말단 영역에 위치한다.

모든 IgG 서브클래스는 Fc 수용체(CD16, CD32, CD64)에 결합할 수 있는데, G1 및 G3이 G2 및 G4보다 더욱 효과적이다. IgG의 Fc 수용체 결합 영역은 CH2 도메인의 카르복시 말단 영역과 힌지 영역, 둘 모두에 위치하는 잔기에 의해 형성된다.

IgA는 J 쇄에 의해 결합된 단량체 및 이량체 형태, 둘 모두의 형태로 존재할 수 있다. IgA는 혈청 중 두번째로 가장 풍부한 Ig이지만, 그의 반감기는 단지 6일이다. IgA는 3가지 효과기 기능을 갖는다. 이는 대식세포 및 호산구 상의 IgA 특이 수용체에 결합하는데, 이는 각각 포식작용과 탈과립화를 일으킨다. 이는 또한 알려지지 않은 대체 경로를 통해 보체를 고정시킬 수 있다.

IgM은 오량체 또는 육량체로서 발현되는데, 이 둘 모두 J 쇄에 의해 결합되어 있다. IgM의 혈청 반감기는 5일이다. IgM은 그의 CH3 도메인에 위치하는 결합 부위를 통해 C1q에 약하게 결합한다. IgD의 혈청 반감기는 3일이다. 어떤 효과기 기능이 상기 Ig에 기인하는지는 불명확하다. IgE는 단량체 Ig이고, 혈청 반감기는 3일이다. IgE는 2개의 Fc 수용체에 결합하는데, 이것이 탈과립화를 일으키고, 염증전 물질을 방출시킨다.

원하는 생체내 효과에 따라 본 발명의 이종 융합 단백질은 상기 기술된 이소형들 중 임의의 것을 함유할 수 있거나, 보체 및/또는 Fc 수용체 결합 기능이 변경된, 돌연변이화된 Fc 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이종 융합 단백질은 인터페론 베타 화합물에 융합된, 면역글로불린의 전체 Fc 부분, 면역글로불린의 Fc 부분의 단편, 또는 그의 유사체를 포함할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 단일 쇄 단백질로 또는 다중 쇄 폴리펩티드로서 구성될 수 있다. 2개 이상의 Fc 융합 단백질은 Fc 영역 사이에서 천연적으로 형성되는 디설피드 결합을 통해 상호작용할 수 있도록 생성될 수 있다. 이러한 다량체는 인터페론 베타 화합물과 관련하여 동종일 수 있거나, 융합 단백질의 Fc 부분의 N 말단에 융합된 상이한 인터페론 베타 화합물을 포함할 수 있다.

융합 단백질의 최종 구조와는 상관없이, Fc 또는 Fc 유사 영역은 N 말단에 융합된 인터페론 베타 화합물의 생체내 혈장 반감기를 연장시키는 작용을 할 수 있다. 또한, 융합 단백질 화합물의 인터페론 베타 성분은 인터페론 베타의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하여야 한다. 치료학적 반감기 또는 순환 반감기의 증가는 본원에 기술되어 있는 방법 또는 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 입증될 수 있으며, 여기서, 융합 단백질의 반감기는 단독으로 인터페론 베타 화합물만의 반감기와 비교된 것이다. 생물학적 활성은 당업계에 공지된 시험관내 및 생체내 방법에 의해 측정될 수 있다.

단백질분해에 의해 생산된 IgG의 Fc 영역은 온전한 IgG 분자와 동일한 생체내 반감기를 갖고, Fab 단편은 신속하게 분해되기 때문에, 반감기를 연장시키는 것과 관련된 서열은 CH2 및/또는 CH3 도메인에 존재하는 것으로 여겨진다. 추가로, 고 친화성 Fc 수용체 또는 C1q에 결합하지 않는 IgG 변이체의 이화율은 모체 야생형 항체의 제거율과는 구별할 수 없고, 이는 이화 부위가 Fc 수용체 또는 C1q 결합에 관여하는 부위와는 별개의 것이라는 것을 시사한다고 문헌에서 밝힌 바 있다(문헌 [Wawrzynczak et al., (1992) Molecular Immunology 29:221]). 뮤린 IgG1 Fc 영역을 사용한 부위 지정 돌연변이 유발법 연구에서는 IgG1 Fc 영역 중 이화율을 조절하는 부위가 CH2-CH3 도메인 경계에 위치한다고 제안하였다. Fc 영역은 융합 단백질의 반감기를 최적화시키기 위해 이화 부위에서 변형될 수 있다. 본 발명의 융합 단백질에 사용되는 Fc 영역은 IgG1 또는 IgG4 Fc 영역으로부터 유래될 수 있으고, 힌지 영역을 포함하는, CH2 및 CH3 영역, 둘 모두를 포함할 수 있다.

Fc-IFN 베타 융합 단백질은 WO 2006/000448(참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

이종 알부민 융합 단백질

상기 기술된 인터페론 베타는 직접 또는 펩티드 링커, 수용성 중합체, 또는 프로드럭 링커를 통해 알부민, 또는 그의 유사체, 단편, 또는 유도체에 융합될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 융합 단백질의 일부인 알부민 단백질은 인간을 비롯한 임의의 종으로부터 클로닝된 알부민으로부터 유래될 수 있다. 인간 혈청 알부민(HSA)은 585개의 아미노산으로 이루어진 단일 비-글리코실화된 폴리펩티드 쇄로 구성된 것이며, 공식 분자량은 66,500이다. 인간 HSA의 아미노산 서열은 공지되어 있다(문헌 ([Meloun, et al. (1975) FEBS Letters 58:136]; [Behrens, et al. (1975) Fed. Proc. 34:591]; [Lawn, et al. (1981) Nucleic Acids Research 9:6102-6114]; [Minghetti, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6747])(이들 각각은 본원에서 참고로 인용된다)을 참조). 알부민의 다양한 다형태 변이체 뿐만 아니라, 유사체 및 단편도 기재되어 있다(문헌 [Weitkamp, et al., (1973) Ann. Hum. Genet. 37:219] 참조). 예를 들면, EP 322,094에는 다양한 짧은 형태의 HSA가 기재되어 있다. HSA의 이러한 단편들 중 몇몇이 개시되어 있으며, HSA(1-373), HSA(1-388), HSA(1-389), HSA(1-369), 및 HSA(1-419), 및 1-369 사이 및 1-419 사이의 단편을 포함한다. EP 399,666에는 HSA(1-177) 및 HSA(1-200), 및 HSA(1-177) 사이 및 HSA(1-200) 사이의 단편을 포함하는 알부민 단편이 개시되어 있다.

본 발명의 이종 융합 단백질은 단편, 유사체, 및 유도체를 비롯한, 임의의 알부민 단백질에 커플링된 인터페론 베타 화합물을 포함하며, 여기서, 상기 융합 단백질은 생물학적으로 활성이고, 단독의 인터페론 베타 화합물보다는 더욱 긴 혈장 반감기를 갖고 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 융합 단백질의 알부민 부분이 반드시 본래의 인간 알부민과 동일한 혈장 반감기를 가질 필요는 없다. 단편, 유사체, 및 유도체는 공지되어 있거나, 본래의 인간 알부민 및 관심의 대상이 되는 인터페론 베타 화합물의 반감기보다 더욱 긴 반감기를 갖거나, 그 중간의 반감기를 갖는 단편, 유사체, 및 유도체가 생성될 수 있다.

본 발명의 이종 융합 단백질은 인터페론 베타 화합물 및/또는 융합 단백질의 Fc 또는 알부민 부위에 보존적 아미노산 치환을 갖는 단백질을 포함한다. "보존적 치환"은 하나의 아미노산을, 순 전자 전하가 동일하고 크기 및 형상이 대략적으로 동일한 또다른 아미노산으로 대체되는 것이다. 지방족 또는 치환된 지방족 아미노산 측쇄를 갖는 아미노산의 경우, 이들 측쇄내 존재하는 탄소 및 헤테로원자의 총 갯수가 약 4개 이하까지 상이하다면, 이들 크기는 대략적으로 동일한 것이다. 이들 측쇄내 존재하는 분지의 갯수가 약 1개 이하까지 상이하다면, 이들 형상은 대략적으로 동일한 것이다. 이들 측쇄내 페닐 또는 치환된 페닐 기를 갖는 아미노산은 대략적으로 크기 및 형상이 동일한 것으로 간주된다. 본원에서 달리 구체적으로 제공되는 것을 제외하면, 보존적 치환은 천연적으로 발생된 아미노산으로 이루어지는 것이 바람직하다.

야생형 알부민 및 면역글로불린 단백질은 다양한 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, 이러한 단백질은 관심의 대상이 되는 mRNA를 발현하는 조직 또는 세포로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 검출가능한 수준으로 수득될 수 있다. 관심의 대상이 되는 특정 단백질에 대한 공개된 DNA 또는 단백질 서열을 사용하여 디자인된 프로브를 이용하여 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 영역은 문헌 ([Adams, et al. (1980) Biochemistry 19:2711-2719]; [Goughet, et al. (1980) Biochemistry 19:2702-2710]; [Dolby, et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:6027-6031]; [Rice et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7862-7862]; [Falkner, et al. (1982) Nature 298:286-288]; 및 [Morrison, et al. (1984) Ann. Rev. Immunol. 2:239-256])에 기재되어 있다. 알부민 단백질 및 DNA 서열을 개시하는 몇몇 참고 문헌으로는 문헌 ([Meloun, et al. (1975) FEBS Letters 58: 136]; [Behrens, et al. (1975) Fed. Proc. 34:591]; [Lawn, et al. (1981) Nucleic Acids Research 9:6102-6114]; 및 [Minghetti, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6747])을 포함한다.

본 발명의 이종 융합 단백질의 특징화

본 발명의 융합 단백질을 특징화하는 방법은 다수 존재한다. 이들 방법들 중 일부는 단백질 염색 방법과 커플링된 SDS-PAGE 또는 항IgG 또는 항HSA 항체를 사용하는 면역블롯팅을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 기타 방법으로는 예를 들면, 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광분석법(MALDI-MS: 매트릭스 assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry), 액체 크로마토그래피/질량 분광분석법, 등전 포커싱, 분석용 음이온 교환, 크로마토포커싱 및 원평광 이색성 분광분석법을 포함한다.

혈청 알부민에 대한 친화성 증강

또한, 다양한 분자를 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드에 융합시켜 혈청 중의 IFN 베타 폴리펩티드의 반감기를 조정할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 분자를 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드에 연결시키거나 융합시켜 동물 내의 내인성 혈청 알부민에 대한 친화성을 증강시킨다.

예를 들면, 몇몇 경우에서, IFN 베타 폴리펩티드와 알부민 결합 서열의 재조합 융합체가 제조된다. 예시적인 알부민 결합 서열은 연쇄상구균성(streptococcal) 단백질 G로부터의 알부민 결합 도메인(예를 들면, 문헌 ([Makrides et al., J. Pharmacol. Exp . Ther. 277: 534-542 (1996)] 및 [Sjolander et al., J, Immunol . Methods 201: 115123 (1997)]) 참조), 또는 알부민 결합 펩티드, 예를 들면, 문헌 [Dennis, et al., J. Biol . Chem . 277: 3503535043 (2002)]에 기재된 펩티드들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

다른 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 지방산으로 아실화된다. 몇몇 경우에서, 지방산은 혈청 알부민에의 결합을 촉진시킨다. 예를 들면, 문헌 [Kurtzhals, et al., Biochem . J. 312; 725-731 (1995)]를 참조한다.

다른 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 혈청 알부민(인간 혈청 알부민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 직접 융합된다. 당업자는 매우 다양한 다른 분자들도 또한 본 발명에서 IFN 베타에 연결되어 혈청 알부민 또는 다른 혈청 성분에 대한 결합을 조정할 수 있다는 점을 인식할 것이다.

X. IFN 베타 폴리펩티드의 글리코실화

본 발명은 당류 잔기를 갖는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입한 IFN 베타 폴리펩티드를 포함한다. 당류 잔기는 천연 당류 잔기(N-아세틸글루코사민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 비천연 당류 잔기(3-플루오로갈락토스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)일 수 있다. 당류는 N- 또는 0-연결된 글리코시드 결합(N-아세틸갈락토스-L-세린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 또는 비-천연 결합(옥심 또는 상응하는 C- 또는 S-연결된 글리코시드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 의해 비천연적으로 코딩된 아미노산에 연결될 수 있다.

당류(글리코실을 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 부분은 생체내 또는 시험관 내에서 IFN 베타 폴리펩티드에 첨가될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 카르보닐 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 아미노옥시 기로 유도체화된 당류에 의해 변형시켜 옥심 결합을 통해 연결된 상응하는 글리코실화된 폴리펩티드를 생성한다. 일단 당류가 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착되면, 글리코실트랜스퍼라제, 및 IFN 베타 폴리펩티드에 결합된 올리고당류를 생성할 있는 다른 효소를 사용하여 추가로 처리함으로써 당류를 더 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003)]을 참조할 수 있다. 당류를 글리코실트랜스퍼라제 및 다른 효소로 추가 처리하여 IFN 베타 폴리펩티드에 결합된 올리고당을 생성할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [H. Liu, et al. J. Am . Chem . Soc . 125: 1702-1703(2003)]을 참조한다.

본 발명의 몇몇 실시태양에서, 카르보닐 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드는 아미노옥시 유도체로서 제조된 정해진 구조를 갖는 글리칸에 의해 직접 변형된다. 당업계의 숙련인은 아지드, 알킨, 히드라지드, 히드라진 및 세미카르바지드를 비롯한 다른 관능기를 사용하여 당류를 비천연적으로 코딩된 아미노산에 연결시킬 수 있다는 점을 인식할 것이다.

본 발명의 몇몇 실시태양에서, 이어서, 아지드 또는 알키닐 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드는 각각 알키닐 또는 아지드 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것과의 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가 반응을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것에 의해 변형될 수 있다. 이 방법은 단백질이 극히 높은 선택성으로 변형될 수 있게 한다.

WO 2007/022799에는 무혈청 배양 조건하에서 재조합 인간 IFN 베타를 제조하고, 독특한 글리코실화 패턴을 갖는 IFN 베타를 정제하는 방법이 기재되어 있다.

XI . IFN 베타 이량체 및 다량체

본 발명은 또한, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 IFN 베타가 또다른 IFN 베타 또는 그의 IFN 베타 변이체, 또는 IFN 베타 또는 그의 IFN 베타 변이체가 아닌 임의의 다른 폴리펩티드에 상기 폴리펩티드 골격에 직접 또는 링커를 통해 결합된, IFN 베타 및 IFN 베타 유사체 조합물, 예를 들면, 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체, 또는 이종다량체(즉, 3량체, 4량체 등)를 제공한다. IFN 베타 이량체 또는 다량체 접합체는 단량체에 비해 그의 분자량이 증가되어 있기 때문에, 단량체 IFN 베타와 비교하여 상이한 약리학적 성질, 약동학적 성질, 약력학적 성질, 조정된 치료학적 반감기, 또는 조정된 혈장 반감기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 신규하거나 바람직한 특성을 나타낼 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 이량체는 IFN 수용체의 신호 전달을 조정할 것이다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 IFN 베타 이량체 또는 다량체는 IFN 수용체 길항제, 효현제 또는 조정제로 작용하게 된다.

몇몇 실시태양에서, 이량체 또는 다량체를 함유하는 IFN 베타에 존재하는 하나 이상의 IFN 베타 분자는 수용성 중합체에 연결된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다.

몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드는 Asn-Lys 아미드 결합 또는 Cys-Cys 디설피드 결합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 결합에 의해 직접 연결된다. 몇몇 실시태양에서, IFN 베타 폴리펩티드 및/또는 연결된 비-IFN 베타 분자는 상이한 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함함으로써 이량체화를 용이하게 하는데, 제1 IFN 베타 폴리펩티드의 하나의 비천연적으로 코딩된 아미노산 중 알킨과 제2 분자의 제2 비천연적으로 코딩된 아미노산 중 아지드가 휘스겐 [3+2] 사이클로첨가를 통해 접합화되는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 별법으로, IFN 베타, 및/또는 케톤 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 연결된 비-IFN 베타 분자는 하이드록실아민 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 제2 폴리펩티드에 접합화될 수 있고, 폴리펩티드는 상응하는 옥심의 형성을 통해 반응한다.

별법으로, 2개의 IFN 베타 폴리펩티드, 및/또는 연결된 비-IFN 베타 분자는 링커를 통해 연결된다. 임의의 이종이작용성 또는 동종이작용성 링커를 사용함으로써, 동일하거나, 상이한 1차 서열을 가질 수 있는 2개의 분자, 및/또는 연결된 비-IFN 베타 분자를 연결시킬 수 있다. 몇몇 경우에서, IFN 베타, 및/또는 연결된 비-IFN 베타 분자를 함께 연결시키는데 사용되는 링커는 이작용성 PEG 시약일 수 있다. 링커는 매우 광범위한 범위의 분자량 또는 분자 길이를 가질 수 있다. 더 크거나 더 작은 분자량을 갖는 링커를 사용하여 IFN 베타와 연결된 엔티티 사이 또는 IFN 베타와 그의 수용체 사이, 또는 만약에 있다면, 연결된 엔티티와 그의 결합 파트너 사이의 원하는 공간 관계 또는 구조를 제공할 수 있다. 또한, 더 길거나 더 짧은 분자 길이를 갖는 링커를 사용하여 IFN 베타와 연결된 엔티티 사이, 또는 만약에 있다면, 연결된 엔티티와 그의 결합 파트너 사이의 원하는 거리 또는 가요성을 제공할 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명은 a) 중합체 골격의 적어도 제1 말단 상의 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 하이드록실아민, 또는 카르보닐 함유 부분; 및 b) 중합체 골격의 제2 말단 상의 적어도 제2 작용기를 포함하며, 아령 구조를 갖는 수용성 이작용성 링커를 제공한다. 제2 작용기는 제1 작용기와 동일하거나 상이할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 제2 작용기는 제1 작용기와 반응하지 않는다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 분지형 분자 구조로 된 적어도 하나의 아암을 포함하는 수용성 화합물을 제공한다. 예를 들면, 분지형 분자 구조는 수지상일 수 있다.

몇몇 실시태양에서, 본 발명은 화학식을 갖는 활성화된 수용성 중합체와의 반응에 의해 형성된, 하나 이상의 IFN 베타 폴리펩티드를 포함하는 다량체를 제공한다:

R-(CH₂CH₂O)_n-0-(CH₂)_m-X

상기 식에서, n은 약 5 내지 3,000이고, m은 2-10이며, X는 아지드, 알킨, 히드라진, 히드라지드, 아미노옥시 기, 하이드록실아민, 아세틸, 또는 카르보닐 함유 부분일 수 있고, R은 X와 동일하거나 상이할 수 있는 캡핑 기, 작용기 또는 이탈기이다. R은 예를 들면, 하이드록실, 보호된 하이드록실, 알콕실, N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 1-벤조트리아졸릴 에스테르, N- 하이드록시숙신이미딜 카르보네이트, 1-벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아세탈, 알데히드, 알데히드 수화물, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 활성 설폰, 아민, 아미노옥시, 보호된 아민, 히드라지드, 보호된 히드라지드, 보호된 티올, 카르복실산, 보호된 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 말레이미드, 비닐설폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세타미드, 에폭시드, 글리옥살, 디온, 메실레이트, 토실레이트, 및 트레실레이트, 알켄, 및 케톤으로 구성된 군으로부터 선택되는 작용기일 수 있다.

XII . IFN 베타 폴리펩티드 활성 및 IFN 수용체에 대한 IFN 베타 폴리펩티드의 친화성의 측정

표준 또는 공지된 시험관내 또는 생체내 분석법을 사용하여 IFN 베타 폴리펩티드 활성을 측정할 수 있다. 당업계에 공지된 적합한 방법에 의해 IFN 베타 폴리펩티드의 생물학적 활성에 의해 분석할 수 있다. 예를 들면, 분석법으로는 인터페론 반응성 유전자 활성화, 수용체 결합 분석법, 항바이러스성 활성 분석법, 세포변성 효과 저해 분석법(문헌 [Familletti et. al., Meth. Enzymol. 78:387-394]), 항증식성 분석법(문헌 [Aebersold and Sample, Meth. Enzymol. 119:579-582]), 면역조정성 분석법(미국 특허 번호 제4,914,033호; 제4,753,795호), 및 문헌 [Meager, J. Immunol. Meth., 261:21-36(2002)]에 기재되어 있는 바와 같이, MHC 분자(예를 들면, 문헌 [Hokland et al, Meth. Enzymol. 119:688-693])의 유도를 모니터하는 분석법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

IFN 베타 폴리펩티드는 인터페론에 감수성인 신호 전달 경로를 활성화시킬 수 있는 그의 능력에 대해 분석될 수 있다. 일례는 인터페론에 자극을 받는 반응 요소(ISRE: interferon-stimulated response element) 분석법이다. I형 인터페론 수용체(예를 들면, Hela 세포, 293T 세포)를 구성적으로 발현하는 세포를 일시적으로 ISRE-루시퍼라제 벡터(pISRE-luc, Clontech)로 형질감염시켰다. 형질감염시킨 후, 세포를 인터페론 베타 폴리펩티드로 처리한다. 예를 들면, 0.0001-10 ng/mL와 같은 다수의 단백질 농도를 테스트하여 용량-반응 곡선을 작성한다. 인터페론 베타 폴리펩티드가 IFN 수용체에 결합하고, 그를 활성화시킨다면, 생성된 신호 전달 캐스캐이드는 루시퍼라제 발현을 유도하게 된다. 탑카운트(TopCount)™ 또는 퓨전(Fusion)™ 마이크로플레이트 판독기 및 스테디-글로(Steady-Glo)^R 루시퍼라제 분석 시스템(Promega)를 사용하는 것과 같은 다수의 방법으로 발광성을 측정할 수 있다.

IFN 베타 폴리펩티드는 I형 인터페론 수용체(IFNAR)에 결합할 수 있는 그의 능력에 대해 분석될 수 있다. 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 기법 및 방법을 사용하여 IFN 수용체를 제조할 수 있다. hIFN 수용체는 미국 특허 번호 제6,566,132호; 제5,889,151호; 제5,861,258호; 제5,731,169호; 제5,578,707호(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들면, 성장, 또는 hIFN에 대한 반응으로 MHC 클래스 I 또는 II 항원 생산을 조정하거나, hIFN에 결합하는 세포 또는 세포주(활성 IFN 수용체를 함유하는 세포, 예를 들면, 인간 림프아구성 다우디(Daudi) 세포, 또는 재조합 IFN 수용체 생산 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)를 사용하여 hIFN 수용체 결합을 모니터할 수 있다. 비-천연 아미노산을 포함하는 비-PEG화된 IFN 베타 폴리펩티드 또는 PEG화된 IFN 베타 폴리펩티드의 경우, IFN 베타의 그의 수용체에 대한 친화성은 비아코어™ 바이오센서(Pharmacia)를 사용하여 측정할 수 있다. 적합한 결합 분석법으로는 비아코어 분석법(문헌 [Pearce et al., Biochemistry 38:81-89(1999)]) 및 알파스크린(AlphaScreen)™ 분석법(PerkinElmer)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 알파스크린™은, 공여체 비드가 680 nm 레이저로 여기되면 단일상태 산소를 방출시키는 것인, 비드 기반 비방사성 발광 근접 분석법이다. 단일상태 산소는 확산되어 수용체 비드의 표면 상에 있는 티옥센 유도체와 반응함으로써 ~600 nm에서 형광 방출을 일으킨다. 형광 방출은 오직 각각의 공여체 비드 및 수용체 비드가 각각 리간드 및 수용체에 결합하였을 때 발생하는 분자간 상호작용에 의해서 상기 비드들이 매우 근접하게 위치하는 경우에만 일어난다. 이러한 리간드-수용체 간의 상호작용은 수용체-결합 변이체의 사용으로 경쟁이 이루어질 수 있지만, 비결합 변이체의 경우에는 경쟁이 이루어지지 않을 것이다.

모체 hIFN 유사체를 생성하기 위해 어떤 방법을 사용하는지와는 상관없이, 생물학적 활성에 대해 유사체를 분석한다. 삼중수소화된 티미딘 분석법을 수행하여 세포 분열 정도를 확인할 수 있다. 그러나, 다른 생물학적 분석법을 사용하여 원하는 활성을 확인할 수 있다. IFN 베타 폴리펩티드의 항바이러스성 활성 및/또는 항증식성 활성에 대해 분석할 수 있다. 항증식성 분석법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 문헌 [Basu et al. in Bioconjugate Chem(2006) 17:618-630]에는 A549 세포 및 MTT를 사용하여 증식을 측정하는 것인 항증식 분석법이 기재되어 있다. 예를 들면, 바이러스 복제를 억제시킬 수 있는 능력에 관해 분석하는 생물학적 분석법 또한 IFN 활성을 제시해 준다. 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 생물학적 활성 및 잠재적인 부작용을 평가하기 위해 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 분석법 또한 사용할 수 있다.

문헌 [Platanias et al. in Experimental Hematology 1999; 27:1583-1592(본원에서 참고로 인용된다)]에서는 Jak-Stat 경로를 포함하는, 인터페론에 의해 활성화된 신호 전달 경로가 논의된 바 있다. 신호 전달과, 인터페론 수용체 결합으로부터 하류에 있는 경로를 평가하는 분석법을 사용하여 IFN 본 발명의 폴리펩티드를 평가할 수 있다.

항바이러스성 활성에 대해 스크리닝하기 위해 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드를 사용하여 바이러스 복제 분석법 또는 생체내 연구를 수행할 수 있다. 바이러스 복제 분석법은 당업자에게 공지되어 있고, 이는 HCV(C형 간염 바이러스: Hepatitis C Virus), VSV(소낭성 구내염 바이러스: Vesicular Stomatitis Virus), 또는 EMCV(뇌심근염 바이러스: Encephalomyocarditis Virus)를 포함할 수 있다. 예를 들면, VSV로 감염된 새끼 햄스터 신장 BHK21 세포와 같은 세포의 세포병변 효과(CPE: cytopathic effect)의 감소 또한 IFN 베타 폴리펩티드를 사용하여 측정할 수 있다. 다양한 세포주 및 계산 알고리즘을 사용하여 CPE 분석법에서의 효능을 측정할 수 있다. 공지된 참조 표준과 비교하고, 국제 단위로 계산할 수 있다. 다른 시험관내 분석법을 사용하여 생물학적 활성을 확인할 수 있다. 일반적으로, 생물학적 활성에 대한 테스트는 예를 들면, (변경되지 않은 IFN 베타와 비교하였을 때) 생물학적 활성의 증가 또는 감소, (변경되지 않은 IFN 베타와 비교하였을 때) 상이한 생물학적 활성과 같은 원하는 결과에 대한 분석, 친화성 분석, 또는 혈청 반감기 분석을 하여야 한다.

다른 분석법으로는 항바이러스성 활성의 항체 중화, 단백질 키나제, 올리고아데닐레이트 2,5-A 합성효소 또는 포스포디에스테라제 활성의 유도(EP 41313(이는 본원에서 참고로 인용된다)); 면역조정성 분석법(미국 특허 번호 제4,753,795(본원에서 참고로 인용된다)), 성장 억제 분석법, 및 인터페론 수용체를 발현하는 세포를 사용하는 결합 분석법(미국 특허 번호 제7,144,574(본원에서 참고로 인용된다))을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

IFN 베타 폴리펩티드를 생성하기 위해 어떤 방법을 사용하는지와는 상관없이, 생물학적 활성에 대해 IFN 베타 폴리펩티드를 분석한다. 일반적으로, 생물학적 활성에 대한 테스트는 예를 들면, (변형된 IFN 베타와 비교하였을 때) 생물학적 활성의 증가 또는 감소, (변형된 IFN 베타와 비교하였을 때) 상이한 생물학적 활성과 같은 원하는 결과에 대한 분석, 수용체 또는 결합 파트너 친화성 분석, (변형된 IFN 베타와 비교하였을 때) IFN 베타 그 자체 또는 그의 수용체의 형태상의 변화 또는 구조적인 변화, 또는 혈청 반감기 분석을 하여야 한다.

분석 방법론에 관한 참고 문헌을 상기와 같이 수집해 놓은 것은 한정적인 것이 아니며, 당업계의 숙련인은 다른 분석법도 원하는 최종 결과를 테스트하는데 유용하다는 것을 이해할 것이다. 상기 분석법들을 변경하는 것도 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다.

폴리펩티드에 대한 항체 형성 측정 및 면역원성에 대한 임상전 테스트

항체 형성을 측정하고 평가하는 분석법으로는 생물학적 분석법 및 결합 분석법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 생물학적 분석법으로는 동물 피험체 또는 환자로부터 유래된 혈청을 사용하여 중화 항체를 검출하는 분석법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 혈청이 외인성 분자의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있는 능력에 관해 측정하는 것이다. 예를 들면, 세포 기반 생물학적 분석법은 증식, 세포독성, 신호 전달, 또는 사이토카인 방출을 측정할 수 있다. 중화 항체 및 비중화 항체, 둘 모두를 검출하는 결합 분석법은 혈청이 외인성 단백질에 결합할 수 있는 능력에 관해 측정한다. 그러한 항체를 측정하는 방법으로는 ELISA를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 항체, 둘 모두의 존재가 갖는 중요성은 문헌 [Schellekens, H et al. Clinical Therapeutics 2002; 24(11):1720-1740](본원에서 참고로 인용된다)에서 논의된 바 있다.

문헌 [Schellekens, H et al. Clinical Therapeutics 2002; 24(11):1720- 1740](그의 전문이 참고로 인용된다)에서는 또한 내인성 인간 단백질을 발현하는 비인간 영장류에서 및 트랜스제닉 마우스 모델에서의 동물 테스트 뿐만 아니라, 시험관내 테스트 방법도 논의된 바 있다. 문헌 [Whiteley et al. in J. Clin. Invest. 1989; 84:1550-1554](본원에서 참고로 인용된다)에서는 인간 인슐린을 사용한 면역원성 연구에서의 트랜스제닉 마우스의 용도가 논의된 바 있다. 문헌 [Wadhwa, M. et al. J of Immunol Methods 2003; 278:1-17](본원에서 참고로 인용된다)에서는 면역원성을 검출 및 측정하는 다수의 기법들, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명(SPR; surface plasmon resonance, Biacore), 방사면역침전법(RIPA: radioimmunoprecipitation assay), 면역분석법, 예를 들면, 고체상 결합 면역분석법, 가교 및 경쟁 ELISA, 및 면역블롯팅이 논의된 바 있다. 다른 기법으로는 전기화학발광법(ECL: electrochemiluminescence)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

문헌 [Chirino et al. DDT 2004; 9(2): 82-90](본원에서 참고로 인용된다)에는 단백질 치료제의 면역원성을 조사하는 생체외 T 세포 활성화 분석법이 기재되어 있다. 항원 제시 세포에 의한 야생형 및 변이체 인터페론 단백질의 흡수를 모니터한다. 생체외 T 세포 활성화 분석법을 사용하여 면역원성을 실험적으로 정량할 수 있다. 상기 방법에서, 매치되는 공여자로부터 얻은 항원 제시 세포 및 순수한 T 세포를 관심의 대상이 되는 펩티드 전체 단백질로 1회 이상 시험감염시킨다. 이어서, 예를 들면, 사이토카인 생성을 모니터하거나, 삼중수소화된 티미딘의 흡수를 측정하는 것과 같은 다수의 방법을 사용하여 T 세포 활성화를 검출할 수 있다. 다른 적합한 T 세포 분석법으로는 문헌 ([Meidenbauer, et al. Prostate 43, 88-100(2000)]; [Schultes, B. C and Whiteside, T. L., J. Immunol. Methods 279, 1-15(2003)]; 및 [Stickler, et al., J. Immunotherapy, 23, 654-660(2000)])에 개시되어 있는 것들을 포함한다. 상기 기술된 T 세포 활성화 분석법에 사용되는 PBMC 공여자는 인터페론 베타 반응성 질병 치료를 필요로 하는 환자들에게서 공통적인 MHC 클래스 II 대립유전자를 포함할 수 있다. 예를 들면, 대부분의 질환 및 질병의 경우, 공여자 군집내 우세하게 존재하는 대립유전자 모두를 포함하는 공여자를 테스트하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 특정 MHC 대립유전자와 관련이 있는 질환 및 질병의 경우에는 인터페론 베타 반응성 질병에 대한 감수성을 부여하는 대립유전자에 대해 중점을 두고 스크리닝하는 것이 더욱 적절할 수 있다. 인터페론 베타에 대하여 면역 반응을 일으키는 PBMC 공여자 또는 환자의 MHC 반수체를, 반응을 일으키지 않는 환자의 MHC 반수체와 비교할 수 있다. 이러한 데이타를 사용함으로써 임상전 및 임상 연구에 대한 지침을 제시할 수 있을 뿐만 아니라, 구체적으로, 인터페론 베타 치료제에 대하여 유리한 반응을 보이거나, 불리한 반응을 나타낼 가능성이 있는 환자를 확인하는데 도움을 줄 수 있다. 면역원성은 트랜스제닉 마우스 시스템에서 측정할 수 있다. 예를 들면, 인간 MHC 클래스 II 분자를 완전히 또는 부분적으로 발현하는 마우스를 사용할 수 있다. 설치류 및 영장류를 비롯한 하나 이상의 동물에게 인터페론 베타 변이체를 투여하고, 항체 형성에 대하여 모니터함으로써 면역원성을 테스트할 수 있다. 비인간 영장류에서의 MHC 분자의 서열 특이성과, 이에 따른 펩티드 결합 특이성이 인간의 서열 특이성 및 펩티드 결합 특이성과 매우 유사할 수 있기 때문에 정의된 MHC 반수체를 갖는 비인간 영장류가 특히 유용할 수 있다. 유사하게, 인간 MHC 펩티드 결합 도메인을 발현하는 유전적으로 공학처리된 모델을 사용할 수 있다(예를 들면, 문헌 ([Sonderstrup et. al. Immunol. Rev. 172: 335-343(1999)] 및 [Forsthuber et. al. J. Immunol. 167: 119-125(2001)]) 참조).

본 발명의 폴리펩티드를 평가하는 추가 방법이 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다.

XIII . 효능, 기능적 생체내 반감기 및 약동학적 파라미터의 측정

본 발명의 중요한 측면은 폴리펩티드를 수용성 중합체 부분에 접합화하거나 또는 접합화하지 않고 IFN 베타 폴리펩티드를 구성함으로써 얻은 연장된 생물학적 반감기이다. 투여 후 IFN 베타 폴리펩티드 혈청 농도의 신속한 감소는 접합화된 IFN 베타 폴리펩티드 및 비접합화된 IFN 베타 폴리펩티드 및 그의 변이체 처리에 대한 생물학적 반응을 평가하는데 중요하다. 바람직하게는, 또한, 본 발명의 접합화된 IFN 베타 폴리펩티드 및 비접합화된 IFN 베타 폴리펩티드 및 그의 변이체는 투여, 예를 들면, 피하 또는 정맥내 투여 이후에도 연장된 혈청 반감기를 가짐으로써, 예를 들면, ELISA 방법 또는 1차 스크리닝 분석법에 의한 측정을 가능케 한다. 예를 들면, 인비트로젠(Invitrogen)(캘리포니아주 칼즈배드 소재))과 같은 상업적 공급업체로부터 입수한 ELISA 또는 RIA 키트를 사용할 수 있다. 생체내 생물학적 반감기의 측정은 본원에 기술되어 있는 바와 같이 수행한다.

비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드의 효능 및 기능적 생체내 반감기는 당업계의 숙련인에게 공지된 프로토콜에 따라 측정될 수 있다.

비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드에 대한 약동학적 파라미터는 정상적인 스프래그 다우리(Sprague-Dawley) 수컷 래트(처리군 당 N = 5마리 동물)에서 평가될 수 있다. 동물은 래트 1마리 당 25 ug의 단일 투여량을 정맥내로 투여받거나 또는 50 ug의 단일 투여량을 피하 투여받게 되고, 일반적으로, 수용성 중합체에 접합화되지 않은 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드의 경우 약 6시간, 및 수용성 중합체에 접합화된 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드의 경우 약 4일 동안의 미리 정해진 시간에 따라 대략 5-7개의 혈액 샘플을 채취하게 된다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하지 않는 IFN 베타에 대한 약동학적 데이타는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드에 대하여 수득한 데이타와 직접 비교할 수 있다.

문헌 [Basu et al. in Bioconjugate Chem(2006) 17:618-630]에는 마우스 및 래트에서 이루어진 IFN 베타 폴리펩티드의 약동학적 성질 및 면역원성에 관한 연구가 기재되어 있다. 약동학적 파라미터 또한 예로서, 사이노몰거스 원숭이와 같은 영장류에서 평가될 수 있다. 전형적으로, 단일 주사는 피하로 또는 정맥내로 투여되며, 혈청 IFN 베타 수준은 시간 경과에 따라 모니터된다.

본 발명에 따른 IFN 베타 폴리펩티드의 특이적인 활성은 당업계에 공지된 다양한 분석법에 의해 측정될 수 있다. 본 발명에 따라 수득되고 정제된, IFN 베타 폴리펩티드 뮤테인, 또는 그의 단편의 생물학적 활성은 본원에 기술되어 있거나, 본원에서 참고하고 있거나, 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 방법에 의해 테스트될 수 있다.

IFN 베타 폴리펩티드는 질환을 앓는 동물 모델, 예를 들면, 다발성 경화증에 대한 마우스 또는 래트 EAE 모델을 치료하는 경우에 그의 효능에 대해서 분석될 수 있다. 동물 모델, 예를 들면, 보편적으로 사용되는 실험 자가면역 알레르기성 뇌척수염(EAE: autoimmune encephalomyelitis) 모델을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드의 효능을 확립시킬 수 있다. EAE 모델에서 마이엘린 또는 마이엘린 유도성 단백질로 면역화시키면 인간에서 다발성 경화증의 염증성 및 신경학적 특징 대부분을 모사하는 질환이 발생하게 된다. EAE는 마우스, 래트, 토끼, 및 마모셋에서 사용되어 왔다(문헌 ([Cannella et al. PNAS, 95, 10100 5, 1998], [Zaprianova et al. Morfologiia, 112, 25 8, 1997], [Hassouna et al. J. Urology, 130, 806 10, 1983], [Genain & Hauser J. Mol. Med. 75, 187 97, 1997])). 기타 다른 모델로는 타일러 뮤린 뇌척수염 바이러스(TMEV: Theiler's murine encephalomyelitis virus) 모델을 포함하며(문헌 [Murray et al. J. Neurosci. 18, 7306 14, 1998]), 이는 IFN 베타 폴리펩티드의 효능을 확립시키는데 사용될 수 있다.

XIV . 투여 및 약제학적 조성물

본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질(하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 IFN 베타, 합성효소, 단백질 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)은 임의로 적합한 약제학적 담체와 함께 조합되어(이를 포함하나, 이에 한정되지 않는다) 치료학적 용도로 사용된다. 이러한 조성물은, 예를 들면, 치료학적 유효량의 본 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체 또는 부형제로는 염수, 완충처리된 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및/또는 그의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이 제제는 투여 방식에 적합하도록 제조된다. 일반적으로, 단백질 투여 방법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있고, 본 발명의 폴리펩티드의 투여에 적용될 수 있다. 조성물은 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 염(이는 산 첨가염 및 염기 첨가염 둘 모두를 의미한다)으로서 존재할 수 있는, 수용성 형태로 존재할 수 있다.

효능 및 조직 대사를 확인하고, 투여량을 평가하기 위해 본 발명의 폴리펩티드를 하나 이상 포함하는 치료학적 조성물을 하나 이상의 적절한 시험관내 및/또는 생체내 동물 질환 모델에서 당업계의 숙련인에게 공지된 방법에 따라 임의로 테스트한다. 특히 투여량은, 즉, 관련 분석에서 측정된, 천연 아미노산 상동체에 대한 본원의 비천연 아미노산 상동체의 활성, 안정성 또는 다른 적합한 척도(하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형된 IFN 베타 폴리펩티드와 천연 아미노산 IFN 베타 폴리펩티드의 비교, 및 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형된 IFN 베타 폴리펩티드와 현재 이용가능한 IFN 베타 치료법의 비교를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)에 의해 초기에 결정할 수 있다.

투여는 보통 분자를 최종적으로 혈액 또는 조직 세포와 접촉시키는데 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 본 발명의 비천연 아미노산 폴리펩티드는 임의로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 임의의 적합한 방식으로 투여된다. 본 발명와 관련하여 상기 폴리펩티드를 환자에게 투여하기에 적합한 방법이 이용가능하고, 특정 조성물을 투여하는데 1 초과의 경로를 사용할 수 있지만, 대개 특정 경로가 또다른 경로보다 더 빠르고 더 효과적인 작용 또는 반응을 제공할 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는 부분적으로는 투여되는 특정 조성물 뿐만 아니라, 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해서도 결정된다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물로 이루어진 적합한 제제는 매우 다양하게 존재한다.

본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 비경구적으로(예를 들어, 피하 또는 정맥 주사 또는 임의의 다른 형태의 주사 또는 주입을 포함하나, 이에 한정되지 않는 주사)를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 단백질 또는 펩티드에 적합한 임의의 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다. 폴리펩티드 조성물은 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하 또는 직장 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 경로를 통해 투여될 수 있다. 변형되거나 비변형된 비-천연 아미노산 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 또한 리포좀을 통해 투여될 수도 있다. 그러한 투여 경로와 적절한 제형이 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. IFN 베타 폴리펩티드는 단독으로, 또는 예를 들면, 약제학적 담체와 같은 다른 적합한 성분들과 함께 조합되어 사용될 수 있다. IFN 베타 폴리펩티드는 다른 제제 및 치료제와 함께 조합되어 사용될 수 있다.

또한, 비-천연 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를, 단독으로 또는 다른 적합한 성분들과 함께 조합하여 흡입 투여를 위한 에어로졸 제제(즉, 이것은 "분무"될 수 있음)로 제조할 수 있다. 에어로졸 제제는 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같이 허용가능한 압축 추진제 중에 함유될 수 있다.

예를 들어, 관절내(관절 안), 정맥내, 근육내, 진피내, 복강내 및 피하 경로에 의한 비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충액, 정균제와, 제제가 해당 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성의 등장성 멸균 주사액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. IFN 베타 제제는 예를 들면, 앰플 및 바이알과 같이 단회 투여 또는 다회 투여용 밀봉 용기로 제공될 수 있다.

비경구 투여 및 정맥내 투여가 바람직한 투여 방법이다. 특히 현재 사용되고 있는 제제와 함께, 천연 아미노산 동족체 치료제에 대해 이미 사용되고 있는 투여 경로(EPO, GH, G-CSF, GM-CSF, IFN, 예로서, IFN 베타, 인터루킨, 항체, FGF 및/또는 임의의 다른 약제학적으로 전달되는 단백질에 대해 전형적으로 사용되는 투여 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)가 본 발명의 폴리펩티드에 대한 바람직한 투여 경로 및 제제를 제공한다.

본 발명과 관련하여, 환자에게 투여되는 투여량은 시간이 경과함에 따라 환자에게 유익한 치료학적 반응, 또는 적용 분야에 따른 다른 적절한 활성을 나타내기에 충분하다. 투여량은 특정 벡터, 또는 제제의 효능과, 사용된 비천연 아미노산 폴리펩티드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기 및 환자의 상태 뿐만 아니라, 치료 받을 환자의 체중 또는 체표면적에 의해 결정된다. 또한, 투여량의 크기는 특정 환자에 있어서의 특정 벡터, 제제 등의 투여에 수반되는 임의의 유해 부작용의 존재, 성질 및 정도 등에 의해 결정된다.

질환(암, 유전 질환, 당뇨병, AIDS 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다)의 치료 또는 예방을 위해 투여되는 벡터 또는 제제의 유효량을 결정함에 있어서, 의사는 순환 혈장 수준, 제제의 독성, 질환의 진행도, 및/또는 관련이 있는 경우, 항비천연 아미노산 폴리펩티드 항체의 생성을 평가한다.

예를 들어, 체중 70 kg의 환자에게 투여되는 투여량은 전형적으로 해당 조성물의 변경된 활성 또는 혈청 반감기에 맞추어 조정된, 현재 사용되는 치료학적 단백질의 투여량과 등가인 범위 내에 있다. 본 발명의 벡터 또는 약제학적 제제는 항체 투여, 백신 투여, 세포독성제의 투여, 천연 아미노산 폴리펩티드의 투여, 핵산의 투여, 뉴클레오티드 유사체의 투여, 생물학적 반응 개질제의 투여를 비롯한 임의의 공지된 통상적인 요법에 의해 치료 조건을 보충할 수 있다.

투여시, 본 발명의 제제는 관련 제제의 LD-50 또는 ED-50 및/또는 환자의 체중 및 환자의 전반적인 건강 상태를 포함하나, 이에 한정되지 않는 것에 적용되는 바와 같이 다양한 농도에서의 비천연 아미노산 폴리펩티드의 임의의 부작용의 관찰에 의해 결정되는 속도로 투여된다. 투여는 단일 투여 또는 분할 투여를 통해 수행될 수 있다.

제제를 주입받은 환자가 고열, 오한 또는 근육통을 앓는 경우, 적절한 투여량의 아스피린, 이부프로펜, 아세트아미노펜 또는 다른 통증/고열 조절 약물을 투여한다. 아스피린, 아세트아미노펜, 또는 디펜하이드라민을 포함하며, 이에 한정되지 않는 것들을 추가 주입하기 30분 전에 주입에 대한 반응, 예를 들면, 고열, 근육통 및 오한을 경험하는 환자에게 마취 전 투여한다. 해열제 및 항히스타민제에 빠르게 반응하지 않는 더욱 심한 오한 및 근육통에 대해서는 메페리딘(meperidine)을 사용한다. 반응의 심도에 따라 세포 주입을 늦추거나, 중단한다.

본 발명의 인간 IFN 베타 폴리펩티드는 포유동물 피험체에게 직접 투여될 수 있다. 투여는 IFN 베타 폴리펩티드를 피험체에 도입하는데 통상적으로 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 임의의 주어진 사례에서 가장 적합한 경로는 치료하고자 하는 병증의 성질 및 중증도에 따라 달라지지만, 본 발명의 실시태양에 따른 IFN 베타 폴리펩티드 조성물은 경구, 직장, 국소, 흡입(에어로졸을 사용하는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 협측(설하를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 질내, 비경구(피하, 근육내, 진피내, 관절내, 흉막강내, 복강내, 뇌내, 동맥내 또는 정맥내 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 국소(즉, 피부 및 기도 표면을 비롯한 점막 표면 모두), 폐, 안내, 비내, 및 경피 투여에 적합한 것들을 포함한다. 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 화합물 제제는 예를 들면, 앰플 및 바이알과 같은 단회 투여 또는 다회 투여용의 밀봉 용기로 제공될 수 있다. 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 단위 제형의 주사제 형태(액제, 현탁제 또는 에멀젼을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다)로 혼합물로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는는 연속 주입(예를 들면, 삼투압 펌프와 같은 미니펌프를 포함하나, 이에 한정되지 않는다), 단일 볼루스 또는 서방형 데포 제제에 의해 투여될 수 있다.

투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충액, 정균제, 및 제제를 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 용액, 상기의 등장성 멸균 용액과, 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 용액 및 현탁액은 이미 기술된 유형의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.

동결 건조는, 관심의 대상이 되는 단백질 제제로부터 물을 제거하는 역할을 하는, 단백질을 제공하기 위해 통상적으로 이용되는 기법이다. 동결 건조 또는 냉동 건조는 건조시키고자 하는 물질을 먼저 동결시킨 후 진공 환경하에 승화로 얼음 또는 동결된 용매를 제거하는 공정이다. 동결 건조 과정 동안 안정성을 증강시키고 저장시 동결 건조된 생성물의 안정성을 개선시키기 위해 부형제를 동결 건조 전 제제에 포함시킬 수 있다(문헌 ([Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30(1990)] 및 [Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291(1991])).

약제의 분무 건조는 또한 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Broadhead, J. et al., "The Spray Drying of Pharmaceuticals," in Drug Dev. Ind. Pharm., 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992)]를 참조한다. 소분자 약제 이외에도, 다양한 생물학적 물질이 분무 건조되었으며, 여기에는 효소, 혈청, 혈장, 미생물 및 효모가 포함된다. 분무 건조는 1 단계 공정으로 액상 약제학적 제제를 미세한 미분진 또는 과립 분말로 전환할 수 있기 때문에 유용한 기법이다. 기본적인 기법은 하기 4 단계를 포함한다: a) 공급 용액을 분무하여 분무물로 만드는 단계; b) 분무물과 공기를 접촉시키는 단계; c) 분무물을 건조시키는 단계; 및 d) 건조된 생성물을 건조 공기로부터 분리하는 단계. 미국 특허 번호 제6,235,710호 및 제6,001,800호(본원에서 참고로 인용된다)에는 분무 건조에 의한 재조합 에리트로포이에틴의 제조 방법이 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물 및 제제는 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 부분적으로는 투여되는 특정 조성물과, 조성물을 투여하는데 이용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물(임의의 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함함)로 이루어진 적합한 제제는 매우 다양하게 존재한다(예를 들면, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17^th ed. 1985)).

적합한 담체로는 숙시네이트, 포스페이트, 보레이트, HEPES, 시트레이트, 히스티딘, 이미다졸, 아세테이트, 바이카르보네이트 및 다른 유기산을 함유하는 완충액; 아스코르브산을 포함하나, 이에 한정되지 않는 항산화제; 저분자량의 폴리펩티드(약 10개 미만의 잔기를 갖는 폴리펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다); 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린을 포함하나, 이에 한정되지 않는 단백질; 폴리비닐피롤리돈을 포함하나, 이에 한정되지 않는 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 히스티딘 또는 히스티딘 유도체, 메티오닌, 글루타메이트 또는 리신을 포함하나, 이에 한정되지 않는 아미노산; 단당류, 이당류, 및 다른 당질(트레할로스, 수크로스, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다); EDTA 및 에덴테이트 디소듐을 포함하나, 이에 한정되지 않는 킬레이트제; 아연, 코발트 또는 구리를 포함하나, 이에 한정되지 않는 2가 금속 이온; 만닛톨 및 솔비톨을 포함하나, 이에 한정되지 않는 당 알코올; 나트륨 또는 염화나트륨을 포함하나, 이에 한정되지 않는 염 형성 반대 이온; 충진제, 예를 들면, 미세결정질 셀룰로스, 락토스, 옥수수 전분 및 다른 전분; 결합제; 감미제 및 다른 향미제; 착색제; 및/또는 트윈™(트윈 80(폴리소르베이트 80) 및 트윈 20(폴리소르베이트 20)을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다), 플루로닉스(Pluronics)™ 및 다른 플루론산(플루론산 F68(폴록사머 188)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 플루론산 또는 PEG를 포함하나, 이에 한정되지 않는다)을 포함하나 이들에 한정되지 않는 비이온성 계면활성제를 들 수 있다. 적합한 계면활성제로는, 예를 들면, 폴리(에틸렌 옥시드)-폴리(프로필렌 옥시드)-폴리(에틸렌 옥시드), 즉, (PEOPPO-PEO), 또는 폴리(프로필렌 옥시드)-폴리(에틸렌 옥시드)-폴리(프로필렌 옥시드), 즉, (PPO-PEO-PPO)에 기초한 폴리에테르 또는 그의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. PEO-PPO-PEO 및 PPO-PEO-PPO는 상표명 플루로닉스™, R-플루로닉스™, 테로닉스(Tetronics)™ 및 R-테로닉스™(미시간주 와이언도트 소재의 BASF Wyandotte Corp.)로 상업적으로 이용가능하고, 미국 특허 번호 제4,820,352호(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 추가로 기재되어 있다. 다른 에틸렌/폴리프로필렌 블록 중합체도 적합한 계면활성제일 수 있다. 계면활성제 또는 그의 조합을 사용하여, 교반으로 인해 발생하는 스트레스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 하나 이상의 스트레스로부터 PEG화된 IFN 베타를 안정화시킬 수 있다. 상기 물질들 중 일부 물질은 벌크제로서 불리기도 한다. 또한, 일부 물질은 "장성 조절제"로서 불리기도 한다. 항균 방부제도 제품 안정성 및 항균 효능을 위해 사용될 수 있고; 적합한 방부제로는 벤질 알코올, 벤즈알코늄 클로라이드, 메타크레졸, 메틸/프로필 파라벤, 크레졸 및 페놀, 및 그의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 미국 특허 번호 제7,144,574호(본원에서 참고로 인용된다)에는 본 발명의 약제학적 조성물 및 제제 및 다른 전달 제제에서 적합할 수 있는 추가의 물질이 기재되어 있다.

예를 들면, PEG와 같은 수용성 중합체에 연결된 것들을 비롯한, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 서방형 시스템 또는 그의 일부에 의해 투여될 수도 있다. 서방형 조성물은 필름 또는 마이크로캡슐을 포함하나, 이에 한정되지 않는 성형품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 서방형 매트릭스는 생체적합성 물질, 예컨대 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)(문헌 ([Langer et al., J. Biomed . Mater . Res., 15:267-277(1981)]; [Langer, Chem . Tech., 12: 98-105(1982)])), 에틸렌 비닐 아세테이트(문헌 [Langer et al, 상기 문헌 동일]) 또는 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산(EP 133,988), 폴리락티드(폴리락트산)(미국 특허 번호 제3,773,919호; EP 58,481), 폴리글리콜리드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드(락트산과 글리콜산의 공중합체) 폴리무수물, L-글루탐산과 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(문헌 [U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983)]), 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩티드, 하이알루론산, 콜라겐, 콘트로이틴 설페이트, 카르복실산, 지방산, 인지질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘을 포함한다. 또한, 서방형 조성물은 리포솜에 포획된 화합물을 포함한다. 이 화합물을 함유하는 리포좀은 문헌 (DE 3,218,121; [Eppstein et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 82:3688-3692(1985)]; [Hwang et al, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 77:4030- 4034(1980)]; EP 52,322; EP 36,676; 미국 특허 번호 제4,619,794호; EP 143,949; 미국 특허 번호 제5,021,234호; 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 번호 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324)에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 인용된 모든 참고 문헌 및 특허는 본원에 참고로 인용된다.

리포솜에 포획된 IFN 베타 폴리펩티드는 예를 들면, 문헌 (DE 3,218,121; [Eppstein et al, Proc . Natl Acad . Sci . U.S.A., 82:3688-3692(1985)]; [Hwang et al, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 77:4030-4034(1980)]; EP 52,322; EP 36,676; 미국 특허 번호 제4,619,794호; EP 143,949; 미국 특허 번호 제5,021,234호; 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 번호 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 102,324]에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포좀의 조성 및 크기는 잘 공지되어 있거나, 당업계의 숙련인에 의해 실험적으로 용이하게 결정될 수 있다. 리포좀의 몇 가지 예가, 예를 들어 문헌 ([Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331 (1995)]; [Lasic D and Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998)]; [Drummond DC, et al, Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002)]; [Park JW, et al, Clin . Cancer Res . 8:1172-1181 (2002)]; [Nielsen UB, et al, Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3):109-118 (2002)]; [Mamot C, et al, Cancer Res . 63: 3154-3161 (2003)])에 기재되어 있다. 인용된 모든 참고 문헌 및 특허는 본원에 참고로 인용된다. 비내용 제제, 하이드로겔 제제, 및 액상 제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 IFN 베타 제제가 기재되어 있다(WO 2005/120551, WO 2005/110466, 및 WO 2005/058346(본원에서 참고로 인용된다) 참조). 다른 제제는 WO 95/31479 및 WO 95/31213(본원에서 참고로 인용된다)에서 논의되어 있다.

본 발명과 관련하여 환자에게 투여되는 투여량은 시간이 경과함에 따라 피험체에서 유익한 반응을 유발하기에 충분하여야 한다. 일반적으로, 1회 투여당 비경구적으로 투여되는, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 총 약제학적 유효량 범위는 약 0.01 ㎍/kg/일 내지 약 100 ㎍/kg, 또는 환자 체중 기준으로 약 0.05 mg/kg 내지 약 1 mg/kg이나, 이 양은 치료학적 자유 재량에 따른다. 또한, 투여 빈도 역시 치료학적 자유 재량에 따르지만, 인체 사용에 대해 승인받은 상업적으로 이용가능한 IFN 베타 폴리펩티드 제품보다 더 빈번하거나, 덜 빈번할 수 있다. 일반적으로, 예를 들어, 본 발명의 PEG화된 IFN 베타 폴리펩티드는 상기한 투여 경로 중 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다.

XV. 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드의 치료학적 용도

본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 광범위한 질병을 치료하는데 유용하다.

본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 다발성 경화증을 앓는 개체에게 투여될 수 있다. 각종 악성종양, 암, 종양 또는 종양 신생혈관형성, 예를 들면, 급성 골수성 백혈병, 다발 골수종, 호지킨병, 기저 세포암종, 난소암종, 자궁경부 이형성증, 자궁경부암종, 후두 유두종증, 균상식육종, 신경교종, 급성 골수성 백혈병, 다발 골수종, 호지킨병, 흑색종, 유방암종, 비소세포폐암, 악성 흑색종(애주번트, 말기 뿐만 아니라, 예방용), 카르시노이드 종양, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 소포 림프종, 카포시 육종, 만성 골수성 백혈병, 신 세포암종, 재발 표재성 방광암, 결장직장암종, 털세포 백혈병, 및 골육종 치료에 사용될 수 있다. IFN 베타는 바이러스 간염, 대상 포진 및 생식기, 유두종 바이러스, 바이러스성 뇌염, 사이토메갈로바이러스 폐렴, 포진성 각막염, 단순 포진, 리노바이러스 만성 지속 간염, 만성 활성 HCV(I형), 만성 활성 HCV(II형) 및 만성 B형 간염을 포함하나, 이에 한정되지 않는 각종 바이러스 감염, 궤양성 대장염, 길랑-바레 증후군, 신경교종, 특발성 폐 섬유증, 비정상적인 세포 성장에 대한 치료제로서, 또는 면역조정을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 다발성 경화증(MS), 예를 들면, 일반적으로 인정되는 4가지 유형의 MS(악성, 재발 완화성 MS(RRMS: relapsing remitting MS), 1차 진행형 MS(PPMS: primary progressive MS) 및 2차 진행형 MS(SPMS: secondary progressive MS) 및 단일증상성 MS) 중 어느 것, 암 또는 종양, 간염, 예로서, B형 간염 및 C형 간염, 또는 포진 감염(후자에 대한 치료법은 임의로 IL-10을 사용하는 치료법과 병용될 수 있다)의 치료를 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 IFN 베타 1a, 예로서, 아보넥스™ 또는 레비프™에 대한 순환 항체, 또는 IFN 베타 1b, 예로서, 베타세론™에 대한 순환 항체를 갖는 포유동물을 치료하는 바업을 포함한다. 그러한 방법은 상기 항체와 감소된 반응을 나타내거나, 반응하지 않는 IFN 베타 폴리펩티드를 유효량 투여하는 단계를 포함한다. 치료하고자 하는 포유동물은 상기 열거한 질환들 중 어느 것 또는 IFN 베타가 유용한 치료법이 되는 임의의 병증으로 고생할 수 있다. 또한, 본 발명은 IFN 베타 1a, 예로서, 아보넥스™ 또는 레비프™에 대한 순환 항체, 또는 IFN 베타 1b, 예로서, 베타세론™에 대한 순환 항체를 갖는 포유동물의 치료에 사용하기 위한 약제학적 생성물의 제조 방법을 포함한다. 상기 순환 항체와 감소된 반응을 나타내거나, 반응하지 않는(예로서, 반응은 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 100%(즉, 반응하지 않는다) 만큼 감소) 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드는 주사용 제제 또는 적합한 제제로 제조된다. 항체, 특히 상업적으로 이용가능한 IFN 베타 제제(레비프^®, 베타세론^®, 아보넥스^®) 중 어느 것으로 치료를 받은 것에 대한 반응으로 포유동물에서 형성된 중화 항체를 "순환 항체"로 지칭할 수 있다.

WO 2007/042602(본원에서 참고로 인용된다)에는 허혈성 재관류 손상 또는 다발성 장기부전의 예방 또는 치료를 위한 IFN 베타의 용도가 기재되어 있다. 비정상적인 손상, 장경색, 심혈관 수술 및 쇼크를 비롯한 수개의 병증은 장 허혈 재관류 손상(IRI: intestinal ischemia-reperfusion injury)을 일으킬 수 있다. 국소 손상을 유발하는 것 이외에도, IRI는 또한 멀리 떨어져 있는 기관에서 전신 염증성 반응을 일으킴으로써 다발성 장기부전으로 불리는 증후군을 일으킨다. 이러한 증후군에서 폐는 특히 취약하다. 미국 특허 공보 번호 US 2004/0105843(본원에서 참고로 인용된다)에는 환자의 저산소증/허혈 관련 혈류 저항에서 인터페론 베타의 용도가 기재되어 있다.

WO 2007/025991(본원에서 참고로 인용된다)에는 스테로이드 화합물 및 인터페론 베타 단백질을 순차적으로 또는 동시에 투여하는 것을 포함하는, 탈수초성 시 신경염(DON: demyelinating optic neuritis)을 앓는 환자를 치료하는 방법이 기재되어 있다. 또한, 조기 ON(시 신경염: optic neuritis)의 소견을 갖는 환자도 IFN 베타 치료를 통해 이익을 얻는 것으로 보인다.

WO 2006/064026(본원에서 참고로 인용된다)에는 앞서 IFN 알파로 치료받은 적이 없는, HCV로 감염된 개체를 치료하기 위한 IFN 베타의 용도가 기재되어 있다.

WO 2003/075944에는 뇌졸증 또는 일과성 뇌허혈 발작의 치료를 위한 인터페론 베타 유사 폴리펩티드가 기재되어 있다. 염증성 장질환 예로서, 궤양성 대장염 및 크론병과 같은 염증성 장 질환의 치료를 위해서는 인자 XIII과 함께 인터페론 베타를 사용하거나; 자가면역 질환, 예를 들면, 다발성 경화증을 위해서는 IL-2R 길항제와 함께 IFN 베타를 사용하거나; 리바비린과 함께 IFN 베타를 사용하는 것과 같이, 다른 제제와 함께 조합하여 IFN 베타를 사용할 수 있다(WO 2004/017921; WO 2004/002500; WO 2004/075903(본원에서 참고로 인용된다) 참조). IFN 베타 폴리펩티드는 CML 단일요법, B 세포 림프종 단일요법, 소포 림프종 요법, C형 간염 단일요법, 다발 골수종 단일요법, 또는 신장암종 단일요법에 사용될 수 있다. IFN 베타 폴리펩티드는 CML 요법용의 시타라빈과 함께 조합하여, B 세포 림프종 요법용의 독소루비신에 기초하는 요법과 함께 조합하여, 소포 림프종 요법용으로 CHOP 유사 영역에 대한 보조제로서, C형 간염 요법용의 리바비린과 함께 조합하여, 다발 골수종 요법용의 VBMCP, BCNU 또는 VBMCP+HiCy와 함께 조합하여, 또는 신장암종 요법용의 빈블라스틴, 플록스우리딘, 5-플루오로우라실 또는 IL-10과 함께 조합하여 사용될 수 있다.

IFN 베타의 평균 정량은 달라질 수 있고, 특히 이는 자격을 갖춘 의사의 권고와 처방에 기초하여야 한다. IFN 베타의 정확한 양은 치료할 병증의 정확한 유형, 치료 환자의 상태 뿐만 아니라, 조성물 중의 다른 성분들과 같은 인자에 대한 선호 대상의 문제이다. 본 발명은 또한 치료학적 유효량의, 또다른 활성제를 투여하는 것을 제공한다. 제공되는 양은 IFN 베타를 사용한 요법에 기초하여 당업계의 숙련인에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 종래 방식으로 제조될 수 있다.

하기 실시예는 청구된 본 발명을 예시하기 위해 제공되는 것이며, 청구된 본 발명을 제한하기 위해 제공되는 것은 아니다.

실시예 1

본 실시예는 비천연적으로 코딩된 아미노산이 IFN 베타 내로 도입되는 부위를 선택하는 것에 관한 다수의 가능한 기준 세트 중 일부를 설명하기 위한 것이다.

PDB ID 1AU1을 갖는 결정 구조체에 관한 분석에 기초하여 비천연적으로 코딩된 아미노산 p-아세틸페닐알라닌으로의 치환을 위한 7개의 부위: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 및 111을 선택하였다. 도 1을 참조한다. 잔기 80(N80)은 글리코실화 부위이다. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 및 그의 임의 조합. 몇몇 실시태양에서, 이들 위치들: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 및 그의 임의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는 위치들 중 하나 이상의 위치에 존재하는 비천연적으로 발생된 아미노산이 수용성 중합체에 연결된다.

별도의 분석으로, PDB ID 1AU1을 갖는 결정 구조체에 기초하여 인터페론 베타의 평균 Cx 값을 계산하였다. Cx 프로그램(문헌 [Pintar et al. (2002) Bioinformatics, 18, pp 980])을 사용하여 각 단백질 원자에 대한 도출 정도를 평가하였다. 이들 구조체에 대한 배위는 단백질 데이터 뱅크(PDB)(문헌 [Berstein et al. J Mol . Biol. 1997, 112, pp 535])로부터 이용가능하다. (Karpusas, M., Nolte, M., Benton, C.B., Meier, W., Lipscomb, W.N., Goelz, S.)는 문헌 [Proc Natl Acad Sci 1997 94:11813-11818]에 인간 인터페론 베타의 결정 구조를 기술하였다. 하기 기준을 사용하여 비천연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 인터페론 베타의 각 위치를 평가하였다: 잔기는 (a) 구조 분석을 기초로 한 IFN 수용체의 결합을 방해하지 않아야 하고, (b) 알라닌 또는 상동체 돌연변이 유발법에 의해 영향을 받지 않아야 하고, (c) 표면에 노출되어야 하고, 주변 잔기와 최소의 반 데르 발스 또는 수소 결합 상호작용을 나타내야 하며, (d) 인터페론 베타 변이체에서 결실되거나, 변형되어야 하고, (e) 비천연적으로 코딩된 아미노산을 사용한 치환시 보존적 변화를 일으키고, (f) 고도로 가요성인 영역 또는 구조적으로 강성인 영역 에서 발견될 수 있다.

하기는 상이한 나선과 관련된 잔기를 나타낸다: 잔기 2-22(나선 A); 잔기 51-71(나선 B); 잔기 80-107(나선 C); 잔기 118-136(나선 D); 및 잔기 139-162(나선 E). AB 루프를 절편들 - AB1(잔기 23-35); AB2(잔기 36-40); 및 AB3(잔기 41-50)로서 나타낼 수 있다. 인터페론 베타는 80번 위치(Asn80)에서 글리코실화되어 있다. 유리 시스테인은 인터페론 베타의 야생형 서열 중 17번 위치(Cysl7)에 존재한다. 중화 항체 결합 영역은 잔기 41-49이다. IFN 수용체(IFN 알파 R2)에 대한 추정의 결합 영역 2개: 1) 잔기 25-35 및 2) 잔기 121-135가 존재한다. IFN 알파 R1에 대한 추정의 결합 영역은 잔기 80-100이다.

몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN 베타 내의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 위치 1 앞(즉, N 말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167(즉, 단백질의 카르복실 말단에서), 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산).

몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 다음과 같은 인터페론 베타 내의 2차 구조에 상응하는 하기 영역들 중 하나 이상의 영역 내의 임의의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산으로부터 나선 A(2-22); 나선 B(51-71); 나선 C(80-107); 나선 D(118-136); 나선 E(139-162); AB 루프: AB1(23-35); AB2(36-40); AB3(41-50). 다른 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 인터페론 베타(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4로부터의 상응하는 아미노산)의 잔기 25-35, 80-100, 및 121-135로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환된다. 다른 실시태양에서, 비천연적으로 코딩된 아미노산은 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4로부터의 상응하는 아미노산으로부터의 인터페론 베타로부터 잔기 41-49로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환된다. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN 베타의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산의 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155, 및 그의 임의 조합. 도 1 및 2와, 표 2를 참조한다. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산은 IFN 베타의 하기 위치들 중 하나 이상의 위치에 도입된다: 15, 42, 80, 108, 111, 155, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산). 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 천연 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에 서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산에서의 C17S 치환(17번 위치에서의 시스테인이 세린으로 치환)을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산에서의 C17S 치환(17번 위치에서의 시스테인이 세린으로 치환) 및 하나 이상의 천연 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 신호 서열 중에 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 4의 신호 서열 중에 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 4의 신호 서열 중 하나 이상의 천연적으로 코딩된 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 비-천연 아미노산은 서열번호 4의 리더 또는 신호 서열 중에, 또는 다른 IFN 베타 서열 중에 도입된다.

몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 영역들 중 하나 이상의 영역에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산으로부터 나선 A(2-22); 나선 B(51-71); 나선 C(80-107); 나선 D(118-136); 나선 E(139-162); AB 루프: AB1(23-35); AB2(36-40); AB3(41-50). 다른 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 영역들 중 하나 이상의 영역에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 인터페론 베타(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4로부터의 상응하는 아미노산)의 잔기 25-35, 80-100, 및 121-135. 다른 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 영역들 중 하나 이상의 영역에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4로부터의 상응하는 아미노산으로부터의 인터페론 베타로부터 잔기 41-49. 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기 위치를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 위치들 중 하나 이상의 위치에서 수용성 중 합체에 연결되어 있다: 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산). 몇몇 실시태양에서, 비천연적으로 발생된 아미노산은 하기 위치를 포함하나, 이에 한정되지 않는 이들 위치들 중 하나 이상의 위치에서 수용성 중합체에 연결되어 있다: 15, 42, 80, 108, 111, 155, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산). 몇몇 실시태양에서, 신호 또는 리더 서열 중 비천연적으로 발생된 아미노산은 수용성 중합체에 연결되어 있다(서열번호 4 또는 다른 IFN 베타 서열).

리더 또는 신호 서열/펩티드를 포함하지 않지만, C17S 치환을 갖는 IFN 베타의 아미노산 서열을 서열번호 1로 나타낸다. 리더 또는 신호 서열/펩티드를 포함하지 않고, C17S 치환을 갖지 않는 IFN 베타의 아미노산 서열을 서열번호 3으로 나타낸다. 리더 또는 신호 서열/펩티드를 포함하고, C17S 치환을 갖는 IFN 베타의 아미노산 서열을 서열번호 4로 나타낸다.

실시예 2

본 실시예는 E. 콜라이에서의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 설명한다. 본 실시예는 또한 변형된 IFN 베타 폴리펩티드의 생물학적 활성을 평가하는 방법을 기술한다.

IFN 베타를 클로닝하는 방법은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있다. IFN 베타의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열, IFN 베타의 숙주 세포 내로의 클론 뿐만 아니라, IFN 베타의 정제는 문헌 ([Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057(1980)], 미국 특허 번호 제7,144,574호; 제6,531,111호; 제4,966,843호; 제5,376,567호; 제5,795,779호; 제7,144,574호; 제4,462,940호; 제4,894,330호; 제4,518,584호; 제5,702,699호; 제6,962,978호; 제5,814,485호; 제6,887,462호; 제6,800,735호; 제6,514,729호; 및 미국 공보 번호 US2002/0137895, US2004/0115169, 및 US2005/0054053(이들 모두의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 설명되어 있다.

리더 또는 신호 서열은 포함하지 않고, C17S 치환을 갖는 IFN 베타를 코딩하는 cDNA를 서열번호 2로서 나타낸다. 5' 말단에서 야생형 IFN 유전자 서열에 대해 변형시킴으로써 처음 4개의 코돈은 더욱 풍부한 A-T를 가졌다. 5' 말단에서의 이러한 변형이 아미노산 서열을 변경시키지는 않았다. 상기 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 서열번호 1로서 나타낸다.

서열번호 3은 리더 또는 신호 서열을 포함하지 않고, C17S 치환을 갖지 않는 IFN 베타의 아미노산 서열이다.

서열번호 4는 리더 서열은 포함하고, C17S 치환을 갖지 않는 IFN 베타의 아미노산 서열이다.

오르토고날 tRNA(O-tRNA) 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함하는 도입된 번역 시스템을 사용하여 비천연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 IFN 베타를 발현시켰다. 그 결과, 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 비천연적으로 코딩된 아미노산을 IFN 베타 내로 삽입한다. 적합한 O-RS 및 O-tRNA 서열은 WO 2006/068802(발명의 명칭 "Compositions of Aminoacyl-tRNA Synthetase and Uses Thereof")(E9--서열번호 5 & E9--서열번호 24)의 D286R 돌연변이체) 및 WO 2007/021297(발명의 명칭 "Compositions of tRNA and Uses Thereof")(F13; 서열번호 6)(그의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.

O- RS 및 O- tRNA 서열
서열번호 7	M. 잔나스키이 mtRNA ^Tyr _CUA	tRNA
서열번호 8	HLAD03 ; 최적화된 앰버 서프레서 tRNA	tRNA
서열번호 9	HL325A ; 최적화된 AGGA 프레임쉬프트 서프레서 tRNA	tRNA
서열번호 10	p- 아지도 -L-페닐알라닌 p- Az - PheRS (6)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 11	p- 벤조일 -L-페닐알라닌 p- BpaRS (1)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 12	프로파르길 -페닐알라닌 프로파르길 - PheRS 의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 13	프로파르길 -페닐알라닌 프로파르길 - PheRS 의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 14	프로파르길 -페닐알라닌 프로파르길 - PheRS 의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 15	p- 아지도 -페닐알라닌 p- Az - PheRS (1)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 16	p- 아지도 -페닐알라닌 p- Az - PheRS (3)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 17	p- 아지도 -페닐알라닌 p- Az - PheRS (4)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 18	p- 아지도 -페닐알라닌 p- Az - PheRS (2)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 19	p-아세틸-페닐알라닌 ( LW1 )의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 20	p-아세틸-페닐알라닌 ( LW5 )의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 21	p-아세틸-페닐알라닌 ( LW6 )의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 22	p- 아지도 -페닐알라닌 ( AzPheRS -5)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS
서열번호 23	p- 아지도 -페닐알라닌 ( AzPheRS -6)의 도입을 위한 아미노아실 tRNA 합성효소	RS

변형된 IFN 베타 폴리뉴클레오티드 서열 및 오르토고날 아미노아실 tRNA 합성효소/tRNA 쌍(원하는 비천연적으로 코딩된 아미노산에 대해 특이적이다)을 함유하는 플라스미드로 E. 콜라이를 형질전환시킴으로써 비천연적으로 코딩된 아미노산을 IFN 베타 폴리펩티드 내로 부위 특이적으로 도입시킬 수 있다. T7 프로모터의 제어하에 IFN 베타 폴리펩티드를 발현시켰다.

파라 아세틸-페닐알라닌( pAF )을 사용한 억제

서열번호 3으로 나타낸 폴리펩티드 서열에 기초하여 발현 구성체를 제조하였다. 각각의 구성체는 이들 위치: 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111 중 하나에서 비천연적으로 코딩된 아미노산 치환을 갖는 IFN 베타 폴리펩티드를 제조하는 앰버 정지 코돈을 가졌다.

IFN 베타 폴리펩티드를 발현시키기 위한 플라스미드를 BL21DE3 E. 콜라이 세포 내로 형질전환시켰다. 파라-아세틸-페닐알라닌(pAF)을 세포에 첨가하고, 단백질 발현을 유도하였다. IFN 베타 폴리펩티드 발현에 관한 SDS PAGE 분석을 도 3에 나타내었는데, IFN 베타 폴리펩티드는 화살표로 표시되어 있다. 래인 1 - 원래의 야생형 IFN 베타 폴리펩티드(캘리포니아주 라구나 힐스 소재의 CODA로부터 입수한 폴리뉴클레오티드 서열); 래인 2 - L28pAF; 래인 3 - M36pAF; 래인 4 - S76pAF; 래인 5 - N80pAF; 래인 6 - E107pAF; 래인 7 - K108pAF; 래인 8 - F111pAF; 래인 9 - 5' 말단이 최적화된 야생형 IFN 베타. pAF 치환된 IFN 베타 폴리펩티드의 경우, 예를 들면, L28pAF는 28번 위치(류신)에 파라 아세틸페닐알라닌 치환을 갖는 IFN 베타 폴리펩티드를 언급한다(치환 이전의 원래 서열에 대해서는 서열번호 3을 참조). 도 3에 나타낸 하기 IFN 폴리펩티드는 C17S 치환을 갖지 않았다: L28pAF, M36pAF, S76pAF, N80pAF, E107pAF, K108pAF, 및 F111pAF. CODA로부터 입수한 폴리뉴클레오티드 서열로부터 생성된 IFN 베타 아미노산 서열이 변경되지는 않았을지라도, 상기 폴리뉴클레오티드는 본래의 IFN 베타 폴리뉴클레오티드 서열은 아니었다. 래인 9에 나타낸 샘플의 경우, IFN 베타 폴리뉴클레오티드 서열의 처음 4개의 코돈은 변형됨으로써, 비록 IFN 베타 아미노산 서열이 변경되지는 않았을지라도, 상기 영역은 더욱 풍부한 A-T를 가졌다.

IFN 베타 폴리펩티드를 발현시키기 위한 플라스미드를 또한 W3110-B2 E. 콜라이 세포 내로 형질전환시켰다. T7 폴리머라제의 발현은 아라비노스 유도성 프로모터의 제어하에서 이루어졌다. p-아세틸-페닐알라닌(pAF)을 세포에 첨가하고, 아라비노스(0.2% 최종)를 첨가함으로써 단백질 발현을 유도하였다. 배양물을 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션시켰다. 1 ℓ의 플라스크 배양물로부터 100-200 mg의 봉입체를 단리시켰다. 도 4는 W3110-B2 E. 콜라이 세포에서의 억제로부터 전체 용해물(TL: total lysate), 상등액(S), 및 펠릿(P)에 관한 SDS PAGE 분석을 나타내고; 화살표는 생산된 IFN 베타 폴리펩티드를 나타낸다. 래인 1 & 8 - 마커; 래인 2 - 폴리뉴클레오티드 서열 중 A-T가 풍부한 5' 말단 변형을 갖는 야생형 IFN 베타의 TL; 래인 3 - 폴리뉴클레오티드 서열 중 A-T가 풍부한 5' 말단 변형을 갖는 야생형 IFN 베타의 S; 래인 4 - 폴리뉴클레오티드 서열 중 A-T가 풍부한 5' 말단 변형을 갖는 야생형 IFN 베타의 P; 래인 5 - 폴리뉴클레오티드 서열 중 N80pAF 치환을 갖고, A-T가 풍부한 5' 말단 변형을 갖는 IFN 베타의 TL; 래인 6 - 폴리뉴클레오티드 서열 중 N80pAF 치환을 갖고, A-T가 풍부한 5' 말단 변형을 갖는 IFN 베타의 S; 래인 7 - 폴리뉴클레오티드 서열 중 N80pAF 치환을 갖고, A-T가 풍부한 5' 말단 변형을 갖는 IFN 베타의 P. 어떤 구성체도 C17S 치환을 코딩하지는 않았다.

추가 구성체

A-T가 풍부한 5' 말단을 갖고, C17S 돌연변이를 코딩하고, 비-천연 아미노산 치환에 대한 셀렉터 코돈을 갖는 IFN 베타 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 발현 구성체를 제조하였다. 이러한 구성체로 제조된 IFN 베타 폴리펩티드를 단리시키고, PEG화시켰다.

봉입체의 사전 가용화

4℃의 봉입체(IB) 완충액 I(50 mM 트리스(pH 8.0); 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% 트리톤 X-100; 4℃) 중 최종 10%의 고체로 혼합하여 세포 페이스트를 재현탁시켰다. 재현탁된 물질을 총 2시간 동안 마이크로플루이다이저를 통과시켜 세포를 용해시켰다. 샘플을 원심분리시키고(14,000 g; 15분; 4℃), 상등액을 버렸다. 추가 부피의 IB 완충액 I(50 mM 트리스(pH 8.0); 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% 트리톤 X-100; 4℃) 중에 재현탁시켜 봉입체 펠릿을 세척하고, 재현탁된 물질을 재현탁된 물질을 총 2시간 동안 마이크로플루이다이저를 통과시켰다. 이어서, 샘플을 원심분리시키고(14,000 g; 15분; 4℃), 상등액을 버렸다. 봉입체 펠릿을 각각 1 부피의 완충액 II(50 mM 트리스(pH 8.0); 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 4℃) 중에 재현탁시켰다. 샘플을 원심분리시키고(14,000 g; 15분; 4℃), 상등액을 버렸다. 봉입체 펠릿을 ½ 부피의 완충액 II(50 mM 트리스(pH 8.0); 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 4℃) 중에 재현탁시켰다. 이어서, 봉입체를 적절한 용기 내로 분취하였다. 샘플을 원심분리시키고(14,000 g; 15분; 4℃), 상등액을 버렸다. 봉입체를 가용화시키거나, 추가로 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.

봉입체의 가용화

봉입체를 가용화 완충액(20 mM 트리스(pH 8.0); 8 M 구아니딘; 10 mM β-ME) 중 10-15 mg/mL의 최종 농도로 가용화시켰다. 이어서, 가용화된 봉입체를 1시간 동안 또는 완전히 가용화될 때까지 일정하게 혼합하면서 실온에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 샘플을 원심분리시켜(10,000 g; 20분; 4℃) 가용화되지 않은 임의의 물질을 제거하였다. 이어서, 단백질 농도가 높을 경우, 추가의 가용화 완충액으로 희석시켜 각 샘플의 단백질 농도를 조정하였다.

리폴딩

4℃에서 20 mM 트리스(pH 8.0); 60% 수크로스 중 0.5 mg/mL의 최종 단백질 농도로 샘플을 희석시켜 리폴딩을 실시하였다. 4℃에서 5일 동안 리폴딩시켰다.

정제

리폴딩된 물질을 밀리 Q(Milli-Q) H₂O를 사용하여 1:1로 희석시켰다. 물질을 0.22 ㎛ PES 필터를 통해 여과하고, 20 mM 트리스(pH 8.0); 0.15M NaCl(완충액 A)로 평형화된 블루 세파로스 FF 칼럼(GE Healthcare) 상에 로딩하였다. 상향류 중 칼럼을 5 칼럼 부피의 30% 완충액 B(20 mM 트리스(pH 8.0); 2M NaCl; 50% 에틸렌 글리콜)로 세척하였다. 10 칼럼 부피의 100% 완충액 B로 칼럼을 세척하여 IFNβ 폴리펩티드를 용리시켰다.

PEG 화 및 정제

IFNβ 풀을 취하고, 밀리 Q 수를 사용하여 10X로 희석시켰다. 각 샘플의 pH는 50% 빙초산을 사용하여 4.0으로 조정하였다. 샘플을 ~1.0 mg/mL까지 농축시켰다. 1:12 몰 과량의 활성화된 PEG(하이드록실아민 PEG)를 각 샘플에 첨가하였다. 이어서, 샘플을 48-72시간 동안 27℃에서 인큐베이션시켰다. 샘플을 취하고, 물(<8 m/S)을 사용하여 8-10배로 희석시키고, 완충액 A(50 mM NaAc(pH 6.0); 50 mM NaCl; 0.05% 쯔비터젠트 3-14) 중에서 평형화된 SP HP 칼럼(GE Healthcare) 상에 로딩하였다. IFNβ 폴리펩티드를 5 칼럼 부피의 완충액 B(50 mM NaAc(pH 6.0); 500 mM NaCl; 0.05% 쯔비터젠트 3-14)로 용리시켰다. IFNβ 분획을 풀링하고, IFNβ 저장용 완충액(20 mM NaAc(pH 5.0); 150 mM NaCl; 0.05% 쯔비터젠트 3-14) 중에서 평형화된 슈퍼덱스(Superdex) 200 사이징 칼럼 상에 전개시켰다. PEG화된 물질을 수집하고, 4℃에서 저장하였다.

도 5는 PEG화 전후의 IFN 베타 폴리펩티드를 나타낸다: 래인 1: C17S 치환을 갖는 IFN 베타; 래인 2: C17S 및 L28pAF 치환을 갖는 IFN 베타; 래인 3: C17S 및 M36pAF 치환을 갖는 IFN 베타; 래인 4: C17S 및 S76pAF 치환을 갖는 IFN 베타; 래인 5: IC17S 및 F111pAF 치환을 갖는 IFN 베타; 래인 6: C17S 및 L28pAF-30K PEG를 갖는 IFN 베타; 래인 7: C17S 및 M36pAF-30K PEG를 갖는 IFN 베타; 래인 8: C17S 및 S76pAF-30K PEG를 갖는 IFN 베타; 래인 9: C17S 및 F111pAF-30K PEG를 갖는 IFN 베타. pAF에 대해 나타낸 위치에서 PEG화된 분자를 접합시켰다. 이들 IFN 베타 폴리펩티드들 모두의 폴리뉴클레오티드 서열은 앞서 언급한 바와 같이 A-T가 풍부한 5' 말단 변형을 가졌다.

비아코어 연구(수용체 결합 친화성)

(서열 LLPPGQ로 끝나는 206개의 아미노산으로 구성된) IFNAR2 세포외 도메인에 대한 서열을 클론 MHS1011-61064(앨라배마주 헌츠빌 소재의 OpenBiosystems)로부터 증폭시켰다. 이 삽입체를 pET20 발현 벡터(Novagen) 내의 T7 프로모터의 하류로 클로닝하였다. 단백질 발현을 BL21(DE3) 세포(Novagen)에서 0.4 mM IPTG로 유도하였다.

발현된 단백질이 불용성이기 때문에, 봉입체를 용해된 세포로부터 정제시키고, 6 M GndCl 중에 가용화시켰다. 5 ml 분취액(50 mg 양)을 37℃에서 45분 동안 10 mM DTT로 환원시켰다. 이어서, 4℃에서 50 mM 트리스(pH 8), 20 mM NaCl, 0.5 M 아르기닌 및 10% 글리세롤로 구성된 200 ml의 리폴딩 완충액 내로 혼합물을 주입하고, 온화하게 교반하면서 밤새도록 인큐베이션시켰다.

이어서, 리폴딩 반응액을 아미콘(Amicon) 교반 셀을 사용하여 25 ml 농축시키고, 20 mM 트리스(pH 8), 20 mM NaCl 및 10% 글리세롤에 대해 밤새도록 투석하였다. 리폴딩된 단량체 IFNAR ECD를 AKTA FPLC 시스템(Amersham)을 사용하여 HP Q 세파로스 상에서 정제하였다. 정제된 IFNAR2 ECD를, 제조자에 의해 권고되는 리신 특이적 커플링 방법을 사용하여 CM5 비아코어 칩 상에 고정화시켰다. 약 200 RU의 기능성 단백질을 고정화시켰다. HBS EP 완충액(Biacore) 중 다양한 농도의 IFN 베타 변이체를, 고정화된 IFNAR2를 함유하는 유동셀(flowcell) 및 고정화된 소혈청 알부민을 함유하는 대조군 유동셀 상에서 50 mcl/분의 유속으로 주입하였다. 작성된 센소그램(Sensogram)을 비아에발루션(BiaEvaluation) 소프트웨어(Biacore)를 사용하여 1:1 상호작용 모델에 피팅함으로써 k_온, k_오프 및 K_d 값을 계산하였다. 인터페론 알파 제품인, 페가시스^® 및 로페론(Roferon)^®을 대조군 샘플로서 포함하였다. 표 4에는 IFN 베타 폴리펩티드를 사용하여 수득한 평균 K_d를 나타낸다.

VSV 항바이러스 분석

IFN 베타 폴리펩티드의 항바이러스성 활성을 다양한 분석법에 의해 측정할 수 있다. IFN 베타 폴리펩티드의 항바이러스성 활성은 소낭성 구내염 바이러스(VSV)를 사용하여 측정하였다. 본 분석을 위한 배양 배지는 DMEM, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 5 ml HEPES였다. 추가 시약으로는 FBS 및 페놀 레드 미함유의 RPMI를 포함하였다. 사용된 MTT 스톡의 농도는 PBS 중 5 mg/mL였다. 상기 스톡 용액을 4℃에서 오직 2주 동안만 저장하였다.

인간 WISH 세포를 50 ㎕의 배양 배지 중에 30,000 세포/웰로 시딩하였다. 그 다음날, 배양 배지 중에서 IFN 베타 폴리펩티드의 2x 일련의 희석을 실시하였다. C17S 천연 아미노산 치환을 갖는 IFN 베타를 본 실험에서 대조군으로서 사용하였다. 3개로 제조된, 100 ㎕의 희석된 IFN 베타 폴리펩티드를 최종 웰 부피 150 ㎕에 대해 WISH 세포에 첨가하였다. 세포 및 IFN 베타 폴리펩티드를 CO₂ 인큐베이터 중 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기와 같이 6시간 동안 인큐베이션시킨 후, 50 ㎕ 부피의 배지 중 각 웰당 10,000 PFU의 VSV를 첨가하고; 20 ㎕의 VSV를 96 웰/플레이트 당 5 ml 배지 중에 희석하였다. 감염 후 45시간 동안 흡인시켜 배지를 제거하였다. 플레이트를 종이 타올 상에서 가볍게 두드려서 남아있는 배지를 제거하였다.

페놀 레드 및 FBS 미함유의 RPMI에서 제조된, 50 ㎕의 1 mg/mL MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일) 2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드)를 5 mg/mL MTT 스톡 용액으로부터 첨가하였다. 1 mg/mL MTT는 통상 매 분석때마다 새로 제조하였다. 이어서, 플레이트를 CO₂ 인큐베이터 중 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 흡인시켜 MTT를 주의깊에 제거하였다. 각 웰당 50 ㎕의 이소프로판올을 첨가하였다. 30-40초 동안 플레이트 진탕기 상에 플레이트를 놓음으로써 MTT가 완전히 형성될 수 있도록 하였다. 690 nm을 기준 파장으로 하여 플레이트를 560 nm에서 판독하였다. 데이타를 플롯팅하고, 시그마-플롯(Sigma-Plot) 프로그램을 사용하여 IC₅₀을 계산하였다.

표 5는 IFN 베타 폴리펩티드의 항바이러스성 활성을 요약한다. 2번째 칸에는 각 화합물에 대한 평균 IC₅₀ 값을 열거되어 있다. 2개의 분자, (C17S) M36pAF-30K PEG 및 (C17S) F111pAF-30K PEG는 야생형 분자 (C17S)-IFN 베타보다 증강된 항바이러스성 활성을 가졌다.

실시예 3

본 실시예는 카르보닐 함유 아미노산의 도입, 및 아미노옥시 함유 PEG와의 후속 반응에 관해 설명한다.

본 실시예는 케톤 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하고, 이어서,대략 5,000 MW의 아미노옥시 함유 PEG와 반응하는 IFN 베타 폴리펩티드를 생성하는 방법을 설명한다. 잔기 위치 1 앞(즉, N 말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167(즉, 단백질의 카르복실 말단에서), 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산) 각각은 개별적으로 하기 화학식을 갖는 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다:

p-아세틸-페닐알라닌을 IFN 베타 내로 부위 특이적으로 도입하는데 사용되는 서열은 서열번호 1(IFN 베타), 및 서열번호 6 또는 7(muttRNA, M. 잔나스키이(M. jannaschii) mtRNA^Tyr _CUA), 및 상기 실시예 2에 기술되어 있는 서열번호 24, 5, 19, 20, 21(TyrRS LW1, 5, 또는 6)이다.

일단 변형되면, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드 변이체를

화학식: R-PEG(N)-O-(CH₂)_n-O-NH₂

(상기 식에서, R은 메틸이고, n은 3이며, N은 대략 5,000 MW이다)를 갖는 아미노옥시 함유 PEG 유도체와 반응시킨다. 25 mM MES(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)(pH 6.0), 25 mM Hepes(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)(pH 4.5) 중 10 mg/mL로 용해된, p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 IFN 베타를 10 내지 100배 과량의 아미노옥시 함유 PEG와 반응시킨 후, 10-16시간 동안 실온에서 교반한다(문헌 [Jencks, W. J Am. Chem . Soc . 1959, 81, pp 475]). 이어서, 즉시 정제하고 분석하기 위해 PEG-IFN 베타를 적절한 완충액 내로 희석시킨다.

실시예 4

아미드 결합을 통해 PEG에 연결되어 있는 하이드록실아민 기로 구성된 PEG와의 접합화

하기 화학식을 갖는 PEG 시약을 실시예 3에 기술되어 있는 방법을 사용하여 케톤 함유 비천연적으로 코딩된 아미노산에 커플링시킨다:

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-O-NH₂

(상기 식에서, R = 메틸, n=4, 및 N은 대략 2,000 MW이다). 반응, 정제, 및 분석 조건은 실시예 3에 기술되어 있는 바와 같다.

실시예 5

본 실시예는 2개의 독특한 비천연적으로 코딩된 아미노산을 IFN 베타 폴리펩티드 내로 도입하는 것을 설명한다.

본 실시예는 하기 잔기 중 2개의 위치에 케톤 관능기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 도입하고 있는 IFN 베타 폴리펩티드를 생성하는 방법을 설명한다: 위치 1 앞(즉, N 말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167(즉, 단백질의 카르복실 말단에서), 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산). IFN 베타 폴리펩티드는 실시예 1 및 2에 기술되어 있는 바와 같이 제조되는데, 단, 예외적으로, 셀렉터 코돈은 핵산내 2개의 독특한 부위에 도입된다.

실시예 6

본 실시예는 IFN 베타 폴리펩티드의 히드라지드 함유 PEG에의 접합화 및 후속하는 계내 환원을 설명한다.

카르보닐 함유 아미노산을 도입하고 있는 IFN 베타 폴리펩티드는 실시예 2 및 3에 기술되어 있는 방법에 따라 제조한다. 일단 변형되면, 하기 화학식을 갖는 히드라지드 함유 PEG를 IFN 베타 폴리펩티드에 접합시킨다:

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-X-NH-NH₂

(상기 식에서, R = 메틸, n=2 및 N = 10,000 MW 및 X는 카르보닐(C=O) 기를 포함한다). p-아세틸페닐알라닌을 함유하는 정제된 IFN 베타를 25 mM MES(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)(pH 6.0), 25 mM Hepes(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)(pH 7.0), 또는 10 mM 아세트산나트륨(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)(pH 4.5) 중에 0.1-10 mg/mL로 용해시키고, 1 내지 100배 과량의 히드라지드 함유 PEG와 반응시키고, 최종 농도 10-50 mM로 H₂O에 용해되어 있는 스톡 1 M NaCNBH₃(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)을 첨가하여 상응하는 히드라존을 계내에서 환원시킨다. 반응은 암실에서 4℃ 내지 실온하에 18-24시간 동안 수행한다. 최종 트리스 농도 50 mM로 1 M 트리스(미주리주 세인트루이스 소재의 Sigma Chemical)(약 pH 7.6)를 첨가하여 반응을 종결시키거나, 즉시 정제하기 위해 적절한 완충액 내로 희석시킨다.

실시예 7

본 실시예는 알킨 함유 아미노산의 IFN 베타 폴리펩티드 내로의 도입 및 mPEG-아지드에 의한 유도체화를 설명한다.

하기 잔기, 위치 1 앞(즉, N 말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167(즉, 단백질의 카르복실 말단에서), 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)는 각각 하기 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다:

p-프로파르길-티로신을 IFN 베타 내로 부위 특이적으로 도입하는데 사용되는 서열은 서열번호 1(IFN 베타), 및 서열번호 7(muttRNA, M. 잔나스키이 mtRNA^Tyr _CUA), 및 상기 실시예 2에 기술되어 있는 서열번호 12, 13 또는 14이다. 프로파르길 티로신을 함유하는 IFN 베타 폴리펩티드를 E. 콜라이에서 발현시키고, 실시예 3에 기술된 조건을 사용하여 정제한다.

PB 완충액(100 mM 인산나트륨, 0.15 M NaCl(pH = 8))에 0.1-10 mg/mL로 용해된, 프로파르길-티로신을 함유하는 정제된 IFN 베타 및 10 내지 1000배 과량의 아지드 함유 PEG를 반응 혼합물에 첨가한다. 이어서, 촉매량의 CuSO₄ 및 Cu 선을 반응 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 인큐베이션시킨 후(실온 또는 37℃에서 약 4시간, 또는 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다), H₂O를 첨가하고, 혼합물은 투석 막을 통과시켜 여과시킨다. 실시예 3에 기술되어 있는 것과 유사한 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는 방법에 의해 샘플을 첨가에 대하여 분석할 수 있다.

본 실시예에서, PEG는 하기 화학식을 갖는다:

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-N₃

(상기 식에서, R은 메틸이고, n은 4이며, N은 10,000 MW이다).

실시예 8

본 실시예는 IFN 베타 폴리펩티드 중의 큰 소수성 아미노산을 프로파르길 티로신으로 치환하는 것을 설명한다.

IFN 베타의 하기 영역들: 위치 1 앞(즉, N 말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167(즉, 단백질의 카르복실 말단에서), 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산) 중 하나에 존재하는 Phe, Trp 또는 Tyr 잔기는 실시예 7에 기술되어 있는 바와 같은 하기의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환된다:

일단 변형되면, PEG를, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드 변이체에 부착시킨다. PEG는 하기 화학식을 가지며:

Me-PEG(N)-O-(CH₂)₂-N₃

커플링 방법은 실시예 7예 기술되어 있는 것을 따른다. 이는 천연 발생의 대형 소수성 아미노산 중 하나와 대략 등전자이고, 폴리펩티드내 별개의 부위에서 PEG 유도체를 사용하여 변형되는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드 변이체를 제조하게 된다.

실시예 9

본 실시예는 하나 이상의 PEG 링커에 의해 분리된 IFN 베타 폴리펩티드 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체, 또는 이종다량체의 제조를 설명한다.

실시예 7에서 생산된 알킨 함유 IFN 베타 폴리펩티드 변이체를

화학식: N₃-(CH₂)_n-C(O)-NH-(CH₂)₂-O-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)-(CH₂)_n-N₃

(상기 식에서, n은 4이고, PEG는 대략 5,000의 평균 MW를 갖는다)의 이작용성 PEG 유도체와 반응시켜 2개의 IFN 베타 분자가 PEG에 의해 물리적으로 분리된 상응하는 IFN 베타 폴리펩티드 동종이량체를 제조하였다. 유사한 방식으로, IFN 베타 폴리펩티드를 하나 이상의 다른 폴리펩티드에 커플링시켜 이종이량체, 동종다량체, 또는 이종다량체를 형성시킬 수 있다. 커플링, 정제 및 분석을 실시예 7 및 실시예 3에서와 같이 수행하였다.

실시예 10

본 실시예는 당류 부분을 IFN 베타 폴리펩티드에 커플링시키는 것을 설명한다.

다음 중 하나의 잔기를 실시예 3에 기술한 바와 같이 하기 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시킨다: 위치 1 앞(즉, N 말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167(즉, 단백질의 카르복실 말단에서), 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산).

일단 변형되면, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드 변이체를 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 β-연결된 아미노옥시 유사체와 반응시켰다. IFN 베타 폴리펩티드 변이체(10 mg/mL) 및 아미노옥시 당류(21 mM)를 수성 100 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.5) 중에서 혼합시키고, 37℃에서 7 내지 26시간 동안 인큐베이션시켰다. 150 mM HEPES 완충액(pH 7.4) 중에서 당류 접합화된 IFN 베타 폴리펩티드(5 mg/mL)를 UDP 갈락토스(16 mM) 및 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제(0.4 단위/mL)와 48시간 동안 주변 온도에서 인큐베이션시킴으로써 제2 당류를 먼저 효소적으로 커플링시켰다(문헌 [Schanbacher et al. J Biol . Chem . 1970, 245, 5057-5061]).

실시예 11

본 실시예는 PEG화된 IFN 베타 폴리펩티드 길항제의 제조를 설명한다.

IFN 수용체 결합에 관여하는 잔기를 포함하나, 이에 한정되지 않는 잔기를, 실시예 3에 기술되어 있는 것과 같은 하기 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환한다.

일단 변형되면, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드 변이체는

화학식: R-PEG(N)-O-(CH₂)_n-O-NH₂

(여기서, R은 메틸이고, n은 4이며, N은 20,000 MW이다)의 아미노옥시 함유 PEG 유도체와 반응하여 폴리펩티드 내의 단일 부위에서 PEG 유도체로 변형된, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드 길항제를 생성한다. 커플링, 정제, 및 분석을 실시예 3에서와 같이 수행한다.

실시예 12

IFN 베타 분자가 직접 연결된 IFN 베타 폴리펩티드 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체의 생성

알킨 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드 변이체를, 아지도 함유 아미노산을 포함하는 또다른 IFN 베타 폴리펩티드 변이체에 직접 커플링시킬 수 있다. 유사한 방식으로, IFN 베타 폴리펩티드 폴리펩티드를 하나 이상의 다른 폴리펩티드에 커플링시켜 이종이량체, 동종다량체, 또는 이종 이량체를 형성할 수 있다. 커플링, 정제, 및 분석을 실시예 3, 6 및 7에서와 같이 수행한다.

실시예 13

폴리알킬렌 글리콜(P-OH)은 알킬 할라이드(A)와 반응하여 에테르(B)를 형성한다. 이러한 화합물에서, n은 1 내지 9의 정수이고, R'는 직쇄 또는 분지형 쇄, 포화된 또는 불포화된 C1 내지 C20 알킬 또는 헤테로알킬 기일 수 있다. 또한, R'는 C3 내지 C7 포화된 또는 불포화된 사이클릭 알킬 또는 사이클릭 헤테로알킬, 치환되거나, 비치환된 아릴 또는 헤테로아릴 기, 또는 치환되거나, 비치환된 알크아릴(알킬은 C1 내지 C20 포화된 또는 불포화된 알킬이다) 또는 헤테로알크아릴 기일 수 있다. 전형적으로, PEG-OH는 800-40,000 달톤(Da)의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이다.

실시예 14

mPEG-OH + Br-CH₂-C≡CH → mPEG-O-CH₂-C≡CH

20,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-OH(mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio)를 THF(35 mL) 중에서 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였다. 이어서, 크실렌 중의 80중량% 용액(0.56 mL, 5 mmol, 50 당량, Aldrich)으로서 용해된 프로파르길 브로마이드, 및 촉매량의 KI의 용액을 상기 용액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 2시간 동안 환류하도록 가열하였다. 이어서, 물(1 mL)을 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물에 CH₂Cl₂(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH₂Cl₂ 용액을 디에틸 에테르(150 mL)에 적가하였다. 생성된 침전물을 수집하고, 몇 부의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켜 프로파르길-O-PEG를 수득하였다.

실시예 15

mPEG-OH + Br-(CH₂)₃-C≡CH → mPEG-O-(CH₂)₃-C≡CH

20,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-OH(mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio)를 THF(35 mL) 중에서 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하였다. 이어서, 50 당량의 5-브로모-1-펜틴(0.53 mL, 5 mmol, Aldrich) 및 촉매량의 KI를 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 16시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 이어서, 물(1 mL)을 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물에 CH₂Cl₂(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH₂Cl₂ 용액을 디에틸 에테르(150 mL)에 적가하였다. 생성된 침전물을 수집하고, 몇 부의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켜 상응하는 알킨을 수득하였다. 5-클로로-1-펜틴을 유사한 반응에 사용할 수 있다.

실시예 16

THF(50 mL) 및 물(2.5 mL) 중의 3-하이드록시벤질알코올(2.4 g, 20 mmol)의 용액에 먼저 분말 수산화나트륨(1.5 g, 37.5 mmol)을 첨가한 다음, 크실렌(3.36 mL, 30 mmol) 중의 80중량% 용액으로서 용해시킨 프로파르길 브로마이드의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 6시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 혼합물에 10% 시트르산(2.5 mL)을 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물을 에틸 아세테이트(3x15 mL)로 추출하고, 합쳐진 유기층을 NaCl 포화 용액(10 mL)으로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 3-프로파르길옥시벤질 알코올을 수득하였다.

메탄설포닐 클로라이드(2.5 g, 15.7 mmol) 및 트리에틸아민(2.8 mL, 20 mmol)을 0℃에서 CH₂Cl₂ 중의 화합물 3(2.0 g, 11.0 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 냉장고에 16시간 동안 놓았다. 통상적으로 후처리하여 메실레이트를 연한 황색 오일로서 수득하였다. 이 오일(2.4 g, 9.2 mmol)을 THF(20 mL) 중에 용해시키고, LiBr(2.0 g, 23.0 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 환류하도록 가열시킨 다음, 실온으로 냉각시켰다. 혼합물에 물(2.5 mL)을 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물을 에틸 아세테이트(3x15 mL)로 추출하고, 합쳐진 유기층을 NaCl 포화 용액(10 mL)으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 원하는 브로마이드를 제공하였다.

mPEG-OH 20 kDa(1.0 g, 0.05 mmol, Sunbio)을 THF(20 mL) 중에 용해시키고, 이 용액을 얼음조 중에서 냉각시켰다. NaH(6 mg, 0.25 mmol)를 왕성하게 교반하면서 몇 분에 걸쳐 첨가한 후, 상기로부터 수득한 브로마이드(2.55 g, 11.4 mmol) 및 촉매량의 KI를 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 생성된 혼합물을 12시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 물(1.0 mL)을 혼합물에 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물에 CH₂Cl₂(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 에테르 용액(150 mL)을 적가하여 백색 침전물을 수득하고, 이를 수집하여 PEG 유도체를 수득하였다.

실시예 17

mPEG-NH₂ + X-C(O)-(CH₂)_n-C≡CR'→ mPEG-NH-C(O)-(CH₂)_n-C≡CR'

또한, 상기 나타낸 바와 같이 말단 작용기를 함유하는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를 알킨 관능기를 함유하는 반응성 분자에 커플링시킴으로써 말단 알킨 함유 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를 수득할 수 있다. n은 1 내지 10이다. R'는 H 또는 C1 내지 C4의 작은 알킬 기일 수 있다.

실시예 18

4-펜티노산(2.943 g, 3.0 mmol)을 CH₂Cl₂(25 mL) 중에 용해시켰다. N-하이드록시숙신이미드(3.80 g, 3.3 mmol) 및 DCC(4.66 g, 3.0 mmol)를 첨가하고, 이 용액을 밤새 실온에서 교반하였다. 생성된 조 NHS 에스테르 7을 추가 정제없이 하기 반응에 사용하였다.

5,000 Da의 분자량을 갖는 mPEG-NH₂(mPEG-NH₂, 1 g, Sunbio)를 THF(50 mL) 중에 용해시키고, 혼합물을 4℃로 냉각시켰다. NHS 에스테르 7(400 mg, 0.4 mmol)을 왕성하게 교반하면서 조금씩 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 실온으로 가온시키면서 교반하였다. 이어서, 물(2 mL)을 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물에 CH₂Cl₂(50 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 이 CH₂Cl₂ 용액을 에테르(150 mL)에 적가하였다. 생성된 침전물을 수집하고, 진공에서 건조시켰다.

실시예 19

본 실시예는, 또한 폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄설포네이트 또는 메실레이트로도 지칭될 수 있는 폴리(에틸렌 글리콜)의 메탄 설포닐 에스테르의 제조를 나타낸다. 상응하는 토실레이트 및 할라이드는 유사한 방법에 의해 제조할 수 있다.

mPEG-OH + CH₃SO₂Cl + N(Et)₃ → mPEG-O-SO₂CH₃ → mPEG-N₃

150 mL의 톨루엔 중의 mPEG-OH(MW = 3,400, 25 g, 10 mmol)를 2시간 동안 질소하에서 공비 증류시키고, 이 용액을 실온으로 냉각시켰다. 40 mL의 건조 CH₂Cl₂ 및 2.1 mL의 건조 트리에틸아민(15 mmol)을 용액에 첨가하였다. 이 용액을 얼음조 중에서 냉각시키고, 1.2 mL의 증류된 메탄설포닐 클로라이드(15 mmol를 적가하였다. 이 용액을 실온에서 질소하에서 밤새도록 교반하고, 2 mL의 무수 에탄올을 첨가함으로써 반응을 퀀칭시켰다. 혼합물을 진공하에서 증발시켜 주로 톨루엔 이외의 용매를 제거하고, 여과시키고, 진공하에서 다시 농축시킨 다음, 100 mL의 디에틸 에테르로 침전시켰다. 여액을 몇 부의 냉각된 디에틸 에테르로 세척하고, 진공에서 건조시켜 메실레이트를 수득하였다.

메실레이트(20 g, 8 mmol)를 75 mL의 THF 중에 용해시키고, 용액을 4℃로 냉각시켰다. 냉각된 용액에 나트륨 아지드(1.56 g, 24 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 질소하에서 2시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 이어서, 용매를 증발시키고, 잔여물을 CH₂Cl₂(50 mL)로 희석시켰다. 유기 분획물을 NaCl 용액으로 세척하고, 무수 MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 부피를 20 ml로 감소시키고, 150 mL의 냉각 건조 에테르를 첨가함으로써 생성물을 침전시켰다.

실시예 20

4-아지도벤질 알코올을 미국 특허 5,998,595(본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 메탄설포닐 클로라이드(2.5 g, 15.7 mmol) 및 트리에틸아민(2.8 mL, 20 mmol)을 0℃℃에서 CH₂Cl₂ 중의 4-아지도벤질 알코올(1.75 g, 11.0 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 냉장고에 16시간 동안 놓았다. 통상적으로 후처리하여 메실레이트를 연한 황색 오일로서 수득하였다. 상기 오일(9.2 mmol)을 THF(20 mL) 중에 용해시키고, LiBr(2.0 g, 23.0 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 환류하도록 가열시킨 다음, 실온으로 냉각시켰다. 혼합물에 물(2.5mL)을 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물을 에틸 아세테이트(3x15 mL)로 추출하고, 합쳐진 유기층을 NaCl 포화 용액(10 mL)으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 원하는 브로마이드를 수득하였다.

mPEG-OH 20 kDa (2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio)를 THF (35 mL) 중의 NaH(12 mg, 0.5 mmol)로 처리하고, 브로마이드(3.32 g, 15 mmol)를 촉매량의 KI와 함께 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 12시간 동안 환류하도록 가열시켰다. 물(1.0 mL)을 혼합물에 첨가하고, 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔여물에 CH₂Cl₂(25 mL)를 첨가하고, 유기층을 분리시키고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 부피를 대략 2 mL로 감소시켰다. 에테르 용액(150 mL)을 적가하여 침전물을 수득하고, 이를 수집하여 mPEG-O-CH2-C₆H₄-N₃을 수득하였다.

실시예 21

NH₂-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H + N₃-CH₂CH₂CO₂-NHS → N₃-CH₂CH₂-C(O)NH-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H

NH₂-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H(MW 3,400 Da, 2.0 g)를 NaHC0₃(10 mL)의 포화 수용액 중에 용해시키고, 이 용액을 0℃로 냉각시켰다. 3-아지도-1-N-하이드록시숙신이미도 프로피오네이트(5 당량)를 왕성하게 교반하면서 첨가하였다. 3시간 후, 20 mL의 H₂O를 첨가하고, 혼합물을 추가의 45분 동안 실온에서 교반하였다. 0.5 N H₂SO₄를 pH를 사용하여 pH 3으로 조정하고, NaCl을 대략 15중량%의 농도로 첨가하였다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂(100 mLx3)로 추출하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 냉 디에틸 에테르로 침전시킨 후, 여과하여 생성물을 수집하고, 이를 진공하에서 건조시켜 오메가-카르복시-아지드 PEG 유도체를 수득하였다.

실시예 22

mPEG-OMs + HC≡CLi → mPEG-O-CH₂-CH₂-C≡C-H

당업계에 공지된 바와 같이 제조되고, THF 중에서 -78℃로 냉각된 리튬 아세틸리드(4 당량) 용액에 THF 중에 용해된 mPEG-OM의 용액을 왕성하게 교반하면서 적가한다. 3시간 후, 반응물을 실온으로 가온시키고, 1 mL의 부탄올을 첨가하여 퀀칭시켰다. 이어서, 20 mL의 H₂O를 첨가하고, 혼합물을 추가의 45분 동안 실온에서 교반하였다. 0.5 N H₂SO₄를 사용하여 pH를 pH 3으로 조정하고, NaCl을 대략 15중량%의 농도로 첨가하였다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂(100 mLx3)로 추출하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 냉 디에틸 에테르로 침전시킨 후, 생성물을 여과에 의해 수집하고, 진공하에서 건조시켜 1-(부트-3-이닐옥시)-메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)을 수득하였다.

실시예 23

문헌 ([L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500], [J. W. Chin et al., Science 301:964-7(2003)], [J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027]; [J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 3(11):1135-1137]; [J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024]: 및 [L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Conim., 1:1-11])에 기재된 방법을 사용하여 아지드 함유 아미노산 및 아세틸렌 함유 아미노산을 단백질 내로 부위 선택적으로 도입할 수 있다. 일단 아미노산이 도입되고 나면, 37℃에서 4시간 동안 2 mM PEG 유도체, 1 mM CuSO₄, 및 ~1 mg Cu 선의 존재하에 포스페이트 완충처리된 용액(PB)(pH 8) 중 0.01 mM 단백질을 사용하여 사이클로첨가 반응을 수행한다.

실시예 24

본 실시예는 p-아세틸-D,L-페닐알라닌(pAF) 및 m-PEG-하이드록실아민 유도체의 합성을 기술한다.

문헌 [Zhang, Z., Smith, B. A. C, Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P. G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746]에 앞서 기재되어 있는 방법을 사용하여 라세믹 pAF를 합성한다.

m-PEG-하이드록실아민 유도체를 합성하기 위하여 하기 방법을 이행한다. 1시간 동안 실온(RT)에서 교반시킨, 디클로로메탄(DCM, 70 mL) 중의 (N-t-Boc-아미노옥시)아세트산(0.382 g, 2.0 mmol) 및 1,3-디이소프로필카보디이미드(0.16 mL, 1.0 mmol) 용액에 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 아민(m-PEG-NH₂, 7.5 g, 0.25 mmol, Mt. 30 K, BioVectra로부터 입수) 및 디이소프로필에틸아민(0.1 mL, 0.5 mmol)을 첨가한다. 반응물을 RT에서 48시간 동안 교반한 후, 약 100 mL로 농축시킨다. 혼합물을 냉 에테르(800 mL)에 적가한다. t-Boc-보호된 생성물을 침전시키고, 여과하여 수집하고, 에테르 3x100 mL로 세척한다. DCM(100 mL) 중에 다시 용해시키고, 2회에 걸쳐 에테르(800 mL) 중에 침전시켜 추가로 정제시킨다. 생성물을 진공에서 건조시켜 7.2 g(96%)을 수득하고, 이는 NMR 및 니히드린 테스트로 확인한다.

상기에서 수득한 보호된 생성물(7.0 g)의 deBoc는 0℃에서 1시간 동안, 이어서, RT에서 1.5시간 동안 50% TFA/DCM(40 mL) 중에서 수행한다. 진공에서 대부분의 TFA를 제거한 후에, 디옥산(1 mL) 중의 디옥산(1 mL)을 잔여물에 첨가하여 하이드록실아민 유도체의 TFA 염을 HCl 염으로 전환시킨다. 침전물을 DCM(50 mL)에 용해시키고, 에테르(800 mL) 중에서 다시 침전시킨다. 여과하여 최종 생성물(6.8 g, 97%)을 수집하고, 에테르 3x100 mL로 세척하고, 진공에서 건조시키고, 질소하에 저장한다. 다른 PEG(5K, 20K) 하이드록실아민 유도체를 동일한 방법을 사용하여 합성한다.

실시예 25

PEG화된 IFN 베타의 시험관내 연구

PEG-IFN 베타, 비변형된 IFN 베타 및 완충액을 마우스 또는 래트에 투여한다. 비변형된 IFN 베타와 비교하여 본 발명의 PEG화된 IFN 베타의 활성이 더 우수하고, 그의 반감기가 더 길다는 결과가 나올 것이다. 유사하게, 변형된 IFN 베타, 비변형된 IFN 베타, 및 완충액을 마우스 또는 래트에 투여한다.

약동학적 분석

WO 2005/091944에는 본 발명의 IFN 베타 화합물을 사용하여 실시할 수 있는 약동학적 연구가 기재되어 있다. 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드를 정맥내 또는 피하 경로를 통해 마우스에 투여한다. 투여 이전 및 투여 후의 시점에 동물을 출혈시킨다. 각 샘플로부터 혈장을 수집하고, 방사성면역분석법에 의해 분석한다. 제거 반감기를 계산하고, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드와, 야생형 IFN 베타 또는 다양한 형태의 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드 사이를 비교할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 IFN 베타 폴리펩티드를 사이노몰거스 원숭이에게 투여할 수 있다. 투여 이전 및 투여 후의 시점에 동물을 출혈시킨다. 각 샘플로부터 혈장을 수집하고, 방사성면역분석법에 의해 분석한다. 미국 특허 번호 제 6,962,978호(본원에서 참고로 인용된다)에는 영장류에서의 IFN 베타에 관한 약력학 및 약동학 연구가 기재되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 질환의 동물 모델, 예를 들면, 다발성 경화증의 마우스 또는 래트 EAE 모델에게 투여할 수 있다. 예를 들면, 통상 사용되는 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE: experimental autoimmune encepgalomyelitis) 모델과 같은 동물 모델을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드의 효능을 정립시킬 수 있다. EAE 모델에서 마이엘린 또는 마이엘린 유래의 단백질로 면역화시키면 인간에서의 다발성 경화증의 염증성 및 신경성 특징 대부분은 모사하는 질환이 유도된다. 마우스, 래트, 토끼, 및 마모셋에서 EAE를 사용하였다(문헌 ([Cannella et al. PNAS, 95, 10100 5, 1998], [Zaprianova et al. Morfologiia, 112, 258, 1997], [Hassouna et al. J. Urology, 130, 806 10, 1983], [Genain & Hauser J. Mol. Med. 75, 187 97, 1997])). 다른 모델로는 타일러 뮤린 뇌척수염 바이러스(TMEV) 모델을 포함하며(문헌 [Murray et al. J. Neurosci. 18, 7306 14, 1998]), 이를 사용하여 IFN 베타 폴리펩티드의 효능을 정립시킬 수 있다.

실시예 26

비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 IFN 베타의 안전성 및/또는 효능에 관한 인간 임상 시험

목적 피하 투여된, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 재조합 인간 IFN 베타의 안정성 및 약동학적 성질을 관찰하기 위한 것이다.

환자 20-40세이고 체중이 60-90 kg인 18명의 건강한 지원자들을 이 연구에 등록시킨다. 이 피험체들은 혈액 검사 또는 혈청 화학 검사, 및 음성 뇨 독성 스크린, HIV 스크린 및 B형 간염 표면 항원에 대해 임상적으로 유의한 비정상적인 실험값을 나타내지 않을 것이다. 이들은 다음 중 어느 하나에도 해당되지 않아야 한다: 고혈압; 임의의 원발성 혈액 질환의 병력; 중증 간, 신장, 심혈관, 위장관, 비뇨생식기, 대사, 신경 질환의 병력; 빈혈 또는 발작 장애의 병력; 세균 또는 포유동물 유래 생성물, PEG, 또는 인간 혈청 알부민에 대해 알려진 감수성; 카페인 함유 음료의 상습적인 다량 소비자; 연구 시작 전 30일 이내에 임의의 다른 임상 시험에 참가했거나 혈액을 수혈받았거나 수혈한 적이 있는 자; 연구 시작 전 3개월 이내에 IFN 베타에 노출된 자; 연구 시작 전 7일 이내에 질환을 앓은 적이 있는 자; 및 연구 시작 전 14일 이내에 연구 전 신체 검사 또는 임상 실험 평가에서 유의한 이상을 나타낸 자. 모든 피험체에 대해 안전성 평가를 수행하고, 계획대로 약동학적 분석을 위한 모든 채혈을 실시한다. 모든 연구는 윤리 위원회의 승인과 환자의 동의하에 수행된다.

연구 디자인 이 연구는 건강한 남성 지원자들을 대상으로 한 I 기, 단일 센터, 공개의, 무작위화된 두 기간의 교차연구로 이루어진다. 18명의 피험체를 2개의 치료 순서 군 중 하나(군당 9명의 피험체)에 무작위로 배정하였다. 독립된 두 투여 기간에 걸쳐, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 IFN 베타 및 상업적으로 이용가능한 제품, 예를 들면, 베타세론^®, 레비프^®, 또는 아보넥스^®을 동량으로 사용하여 상대퇴부에 볼루스 피하 주사로서 IFN 베타를 투여한다. 상업적으로 이용가능한 제품의 투여량 및 투여 빈도는 포장 라벨에 지시된 것과 같다. 추가 군의 피험체를 포함시킴으로써, 상업적으로 이용가능한 제품을 사용하여, 추가 투여, 투여 빈도, 또는 원하는 경우, 다른 파라미터를 연구에 포함시킬 수 있다. 각각의 투여 기간 사이에 14일간의 세척 기간을 둔다. 피험체들은 두 투여 기간 각각에 대해 적어도 투여 12시간 전 및 투여 72시간 후에만 연구 센터에 있었고 투여 기간 사이에는 그렇지 않았다. 또한 PEG화된 IFN 베타에 대해 테스트할 추가 투여, 투여 빈도 또는 다른 파라미터가 존재할 경우, 추가 군의 피험체를 연구에 포함시킬 수 있다. IFN 베타의 실험 제제는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 IFN 베타이다.

혈액 샘플링 IFN 베타 전과 투여 후에 직접 정맥 천자를 통해 연속적으로 채혈하였다. 혈청 IFN 베타 농도 측정을 위해 정맥혈 샘플(5 mL)을 투여 약 30분전, 20분전 및 10분전에 입수하고(3개의 기준선 샘플), 투여 후 대략 30분, 및 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 및 72시간째에 입수하였다. 각각의 혈청 샘플을 2개의 분액으로 나누었다. 모든 혈청 샘플을 -20℃에 저장하였다. 혈청 샘플은 드라이아이스에 넣어 이송하였다. 금식 임상 실험실 테스트(혈액 검사, 혈청 화학 검사 및 뇨 검사)는 첫째날에 최초 투여 직전, 4일째 아침, 16일째 투여 직전, 및 19일째 아침에 수행하였다.

생체분석 방법 혈청 IFN 베타 농도를 측정하는데 ELISA 키트를 사용하였다.

안전성 측정 매회 투여 직전(첫째날 및 16일째)과, 매회 투여 후 6, 24, 48, 및 72시간째 바이탈 사인을 기록하였다. 안전성 측정은 유해 사건의 발생률 및 유형과 임상 실험실 테스트에 있어서 기준선으로부터의 변화에 기초한다. 또한, 혈압을 비롯한 바이탈 사인 측정 및 신체 검사 결과에 있어서 연구 전으로부터의 변화를 평가하였다.

데이터 분석 투여 후 혈청 농도값은, 투여 후의 각각의 값으로부터, 투여 30분전, 20분전, 및 10분전에 수집된 3개 샘플의 IFN 베타 수준의 평균값을 구하여 결정된 평균 기준선 IFN 베타 농도를 감산함으로써, 투여 전 기준선 IFN 베타 농도에 대해 보정하였다. 투여 전 혈청 IFN 베타 농도가 분석의 정량 수준 미만인 경우, 이 농도는 평균값 계산에 포함시키지 않았다. 약동학적 파라미터는 최신 버전의 BIOAVL 소프트웨어를 사용하여 디지탈 이큅먼트 코퍼레이션(Digital Equipment Corporation) VAX 8600 컴퓨터 시스템에서 모델 독립적 방법에 의해 계산하였다. 하기 약동학적 파라미터를 결정하였다: 피크 혈청 농도(C_max); 피크 혈청 농도까지 걸리는 시간(t_max); 선형 사다리꼴 법칙을 사용하여 계산한 0시간 내지 마지막 혈액 샘플링 시간(AUC₀ _-72)의 농도-시간 곡선하 면적(AUC); 및 제거율 상수로부터 계산된 최종 제거 반감기(t_½). 제거율 상수는 로그 선형 농도 시간 플롯의 최종 선형 영역에서의 연속적인 데이터 점의 선형 회귀에 의해 추정하였다. 각각의 처리군에 대해 약동학적 파라미터의 평균, 표준 편차(SD: 표준 deviation) 및 변동 계수(CV: coefficient of variation)를 계산하였다. 파라미터 평균의 비(보존된 제제/비보존된 제제)를 계산하였다.

안전성 결과 유해 사건 발생률은 처리군 전반에 동일하게 분포하였다. 기준선 또는 연구 전 임상 실험실 테스트 또는 혈압으로부터 임상적으로 유의한 변화는 없었고, 연구 전 신체 검사 결과 및 바이탈 사인 측정에 있어서도 연구 전으로부터 뚜렷한 변화가 없었다. 두 처리군에 대한 안전성 프로필은 유사한 것으로 보인다.

약동학적 결과 각각의 시점에서 측정된, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 IFN 베타를 투여받은 후 18명의 피험체 모두에서의 평균 혈청 IFN 베타 농도 시간 프로필(기준선 IFN 베타 수준에 대해 보정되지 않는다). 모든 피험체들은 정상적인 생리학적 범위 내의 투여 전 기준선 IFN 베타 농도를 나타내야 한다. 약동학적 파라미터는 투여 전 평균 기준선 IFN 베타 농도에 대해 보정된 혈청 데이터로부터 결정되고, C_max 및 t_max가 결정된다. 선택된 임의의 임상 비교 대상(들)에 대한 평균 t_max는 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 IFN 베타에 대한 t_max보다 현저히 더 짧다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 IFN 베타에 대한 최종 반감기와 비교할 때, 테스트된 임상전 비교 대상(들)의 최종 반감기가 현저히 더 짧다.

본 연구는 건강한 남성 피험체를 대상으로 수행되었지만, 다른 환자 집단, 예를 들면, 암 또는 만성 신부전증을 앓고 있는 남성 또는 여성 환자, 소아 신부전증 환자, 자가조직 예치(autologous predeposit) 프로그램의 환자, 또는 선택 수술이 예정된 환자에 있어서도 유사한 흡수 특징 및 안전성 프로필이 예상된다.

결론적으로, 피하 투여되는 1회분의, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 IFN 베타는 건강한 남성 피험체에게 안전하고, 상기 피험자들에 의해 잘 용인된다. 유해 사건의 상대 발생률, 임상 실험실 값, 바이탈 사인 및 신체 검사 결과에 기초할 때, 상업적으로 이용가능한 형태의 IFN 베타와 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 IFN 베타의 안전성 프로필은 동등할 것이다. 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 PEG화된 IFN 베타는 환자와 건강 관리 제공자에게 잠재적으로 큰 임상적 유용성을 제공한다.

실시예 27

영장류에 대한 시험 - 최종 인터페론 베타 PK / PD

사이노몰거스 원숭이에서 피하로 단일 투여된 이후 14일째 4개의 인터페론- β-1b 유사체의 PK / PD 연구

목적: 사이노몰거스 원숭이에서 피하로 단일 투여된 이후 4개의 인터페론- β-1b 유사체에 대한 약동학 반응 및 혈액 반응을 비히클 및 레비프^®와 비교 평가하기 위한 것이다.

순화는 연구일 A1로 시작하고, 그 이후의 후속일들을 연속적으로 번호화였다. 투여일을 D1로 지정하고, 그 이후의 후속일들을 연속적으로 번호화하였다. 사용된 테스트 품목은 레비프(15 ㎍/kg), M36-30K(3, 15, 및 50 ㎍/kg), M36-40K(3, 15, 및 50 ㎍/kg), F111-30K(3, 15, 및 50 ㎍/kg), 및 F111-40K(3, 15, 및 50 ㎍/kg)였다. 사용된 비히클인 IFB 제제 2007은 10 mM 아스파르트산, 9% 트레할로스(pH 4.0)였다.

사용된 저장 조건은 -60℃ 이하였고, 사용된 취급 지침서는 SNBL USA SOP에서 정의된 바와 같은 표준 실험실 지침이었다.

테스트 또는 대조군 품목/ 비히클 제제:

테스트 품목: 테스트 품목을 밤새도록 2-8℃에서 해동시킨다. 바이알을 5-6회에 걸쳐 온화하게 도립시킴으로써 테스트 품목을 주의깊게 혼합시킨다. 상기 용액을 진탕시키거나 교반시키지 않는다. 혼합 후 즉시 희석 절차를 수행한다.

테스트 품목 투여 용액은 스폰서가 0.20 mg/mL의 농도로 제조한 스톡 테스트 품목으로부터 제조할 것이다. 테스트 품목 투여 용액은 일련의 희석에 의해 제조할 것이다. 멸균 용기에 최종 농도와 전체 부피를 표지하고, 제조하는 동안에는 얼음 상에 둘 것이다. 적절한 부피의 비히클을 먼저 첨가한 후, 이어서, 적절한 크기의 피펫을 사용하여 적절한 부피의 테스트 품목 용액을, 앞서 비히클이 첨가되어 있는 표지된 바이알에 천천히 첨가할 것이다. 기포가 생기지 않도록 하고, 거품이 생기지 않도록 한다. 5 내지 10회에 걸쳐 상하로 피펫팅하여 잘 혼합시킨다. 용기를 7-10회에 걸쳐 도립시킴으로써 최종 용액을 잘 혼합시킨다.

양성 대조군 품목: 사용하기 전에 바이알을 5-6회에 걸쳐 온화하게 도립시킴으로써 양성 대조군 품목을 주의깊게 혼합시킨다.

비히클: 비히클 용액을 밤새도록 2-8℃에서 해동시킨다. 바이알을 5-6회에 걸쳐 온화하게 도립시킴으로써 비히클을 주의깊게 혼합시킨다.

테스트 시스템:

종: 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)(목적을 가지고 번식시킨(purpose-bred) 사이노몰거스 원숭이)는 계통발생학적인 면과 생리학적인 면, 둘 모두의 분석을 용이하게 해주는, 인간과 매우 밀접한 관련이 있는 종이며, 통상 비임상 독성 평가를 위해 사용되는 종이다. 추가로, 이러한 종은 테스트 품목에 대하여 약리학적 반응을 나타내었다.

약물 투여력	순수한 동물
체중 범위	4.0-6.5 kg
연령	3-6세
성별	수컷
공급원	SNBL USA 스톡
기원	중국
확인 방법	피부에 새긴 독특한 타투 및 특정 동물의 마릿수에 관한 연구
순화시킨 동물의 마릿수	수컷 49마리
투여받은 동물의 마릿수	수컷 42마리

환경 조건:

온도와 습도가 조절되는 환경하에서 동물을 사육하였다. 표적 온도 범위 및 상대 습도는 각각 18 내지 29℃, 및 30 내지 70% 사이였다. 60분 미만의 시간 동안 표적화된 습도 범위를 벗어나는 것은 우발적인 것으로 간주하고, 기록하지 않는다. 자동 조명 시스템이 12시간의 일변화를 제공한다. 암주기가 연구와 관련되거나 설비와 관련된 활성을 방해할 수 있다.

또한, 문헌 ["The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals"(National Research Council 1996)]에 기재된 동물복지법(Animal Welfare Act)과 권고에 따라 동물을 개별적으로 케이지에서 사육하였다.

섭식 및 급식:

SNBL USA SOP에 따라 하루에 두번씩 동물에게 먹이를 주었다. 특정한 방법에 의해 필요에 따라서는 동물을 금식시킬 수 있다(예로서, 혈청 화학 검사를 위한 채혈 이전, 뇨 수집 이전, 또는 마취를 포함하는 수술을 실시할 때). 사료를 오염 물질에 대해서 통상적으로 분석하여, 제조사의 규격 내에 있는지 확인한다. 어떤 오염 물질도 본 연구 결과를 방해할 수 있는 수준으로 존재할 것으로는 예상되지 않았다. 식품 분석 기록을 테스트 설비 기록에 보관할 것이다.

신선한 음용수를 모든 동물에게 맘껏 제공하였다. 물을 오염 물질에 대하여 통상적으로 분석하고, 놀이 기구(enrichment toy)와 보수(produce treat)를 SNBL USA SOP에 따라 통상적으로 공급할 것이다.

실험 디자인

동물 선택:

SNBL USA 스톡으로부터 적절한 마릿수의 동물을 선택하였다. 수의학 스탭에 의해 동물의 건강 상태를 검사하였고, 혈청 화학 검사, 혈액 검사, 및 응고에 관해 스크리닝하였다. 본 연구에 건강한 것으로 확인된 49마리의 수컷 동물을 할당받았다. PE 동안 추가로 1 ml의 혈액을 수집하고, 혈청을 프로세싱하고, 바이러스 스크리닝을 위해 스폰서에 배송하였다.

42마리의 수컷 동물을 스폰서의 재량에 따라 특정 연구군으로 배정하고, 남은 동물은 예비용으로 사용할 수 있었다.

무작위배정:

체중에 따라 층화 무작위배정 계획안을 사용하여 동물을 연구군으로 배정하였다.

순화기:

사전에 격리시켰던 동물을 투여 개시에 앞서 최소 14일 동안 연구실에 적응할 수 있도록 순화시켰다. 예비용 동물을 포함하는 모든 동물로부터 순화 데이타를 수집하였다. 연구 수행에 영향을 줄 수 있는 행동 이상에 대해 모든 동물을 평가하였다. 순화기 동안 일어난 결과에 기초하여 배정 동물을 예비용 동물로 교체할 수 있다. 예비용 동물은 D1 이후에는 연구에서 뺐다.

동물을 하기 표에 나타낸 바와 같은 군으로 배정하고, 그렇게 처리하였다:

테스트 및 대조군 품목 투여:

사이노몰거스 원숭이를 사용한 이전 연구에 기초하여 표 6의 처리군 배정에서 언급한, 연구 투여량 수준에 근접한 인간 예상 투여량에서부터 상기 인간 예상 투여량의 고배수 정도의 투여량까지의 범위가 되도록 선택하였다

투여 경로 및 빈도: 등의 잘린 견갑사이 부위로 모든 군에 피하 투여하였고, 상기 투여 경로는 인간에서 제안되는 투여 경로와 일치하며, 조사에 적절한 혈청 수준과 관련된 약리학적 활성 내지 약동학적 성질을 제공할 것으로 기대된다. 빈도는 1회이다.

관찰 및 조사: 도 6-21 전체에서 나타낸 데이타, 및 본 실시예에 포함된 표 전체에서 나타낸 데이타는 본 프로토콜을 사용하여 수행된 관찰 및 조사를 제공한다. A2를 시작으로 각 동물마다 하루에 2번씩 임상 관찰을 수행하였다. 실내 청소 이전인, 오전에 1차 관찰이 이루어졌다. 2차 관찰은 오전에 이루어진 관찰 후 4시간 후에 이루어졌다. 동물의 임상 관찰을 통해 동물 상태가 쇠약해지는 것으로 보이면, 수의학적 평가를 수행하고, 책임연구원에게 통보하였다. D1을 시작으로 각 동물마다 하루에 1번씩 주사 부위를 평가하였다. PK 및 네오프테린 시점은 투여 후 3, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 216, 264, 및 336시간째였다. PD 시점은 투여 1일전, 투여 후 2, 3, 5, 9, 11, 및 15일째였다. 혈액 검사 시점은 투여 1일전, 투여 후 2, 5, 8, 11, 15일째였고; 면역원성 및 임상 화학 검사 시점은 투여 1일전 및 투여 후 15일째였다. 케이지사이드(cageside) 관찰: 매일 체크하고 ISR은 하루에 2번 체크하였다.

체중:

순화 1주 동안, 투여 전날, 및 각 연구 기간 종료시에 각 동물의 체중을 측정하였다.

4.7. 실험실 방법

빈도 표

연구일 Heme

EDTA(1.3 mL) Chem

SST(1.0 mL) PK

SST(1.0 mL) PD/qPCR

채혈:

일반 채혈/샘플링 방법 및 표본 프로세싱:

의식이 있는 차분한 동물의 말초 정맥으로부터 정맥 천자에 의해 채혈하였다. 언제든 가능할 때마다 단일 드로를 통해 채혈하고, 적절히 분할하였다. SNBL USA SOP에 따라 표본(Paxgene 제외)을 혈청 또는 혈장으로 프로세싱하였다.

혈액 검사:

모든 동물/군으로부터 1.3 mL 부피의 혈액 샘플을 채혈하고, 항응고제 EDTA를 첨가하고, 샘플을 분석하고, 아드비아(Advia) 자동 분석 장치를 사용하여 혈액 검사 파라미터를 측정하였다.

혈액 검사 파라미터: 하기 파라미터를 측정하고, 정상 범위와 비교하였다:

(Xybion code) 백혈구(WBC: White Blood Cell), 적혈구(RBC: Red Blood Cell), 헤모글로빈(HGB: Hemoglobin), 적혈구용적율(HCT: Hematocrit), 평균적혈구용적(MCV: Mean Corpuscular Volume), 평균 혈구 헤모글로빈(MCH: Mean Corpuscular Hemoglobin), 평균 혈구 헤모글로빈 농도(MCHC: Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration), 적혈구 분포폭(RDW: Red Cell Distribution Width), 혈소판(PLT: Platelet), 평균 혈소판 용적(MPV: Mean Platelet Volume), 망상 적혈구(%)(RET%: Reticulocyte Percent), 절대 망상 적혈구 수(RETA: Reticulocyte Absolute), 및 절대 중성구 수(NEUA: Neutrophils Absolute), 절대 림프구 수(LYMA: Lymphocytes Absolute), 절대 단핵구 수(MONA: Monocytes Absolute), 절대 호산구 수(EOSA: Eosinophils Absolute), 및 절대 호염기구 수(BASA: Basophils Absolute)를 비롯한 백혈구 감별 계수(절대치).

혈청 화학 검사 측정:

혈청 화학 검사 측정을 위해서는 모든 동물/군에서 수행하였고, 밤새도록 금식시켰고, 1 mL 부피의 혈액 샘플이 필요하였다. 항응고제를 사용하지는 않았지만, 혈청 분리기 튜브를 사용하였고, 화학 검사 파라미터는 올림푸스(Olympus) 자동 분석 장치를 사용하여 측정하였다. 파라미터로는 하기를 포함하였다: (Xybion 코드)알부민(ALB: Albumin), 알칼리성 포스파타제(ALP: Alkaline Phosphatase), 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파테이트 트랜스아미나제(AST: Aspartate Transaminase), 총 빌리루빈(TBIL: Total Bilirubin), 칼슘(Ca), 총 콜레스테롤(TCho: Total Cholesterol), 크레아틴 키나제(CK: Creatine Kinase), 크레아티닌(CRN: Creatinine), 감마 글루타밀트랜스아미나제(GGT: Gamma Glutamyltransaminase), 글루코스(GLU: Glucose), 무기 인(IP: Inorganic Phosphorus), 총 단백질(TP: Total Protein), 트리글리세리드(TRIG: Triglyceride), 혈액 우레아 질소(BUN: Blood Urea Nitrogen), 글로불린(GLOB: Globulin), 알부민/글로불린 비율(A/G: Albumin/Globulin Ratio), 클로라이드(Cl), 칼륨(K), 및 나트륨(Na).

표본 프로세싱 및 보관: 혈청을 대략적으로 동일한 2개의 부피로 분할하고, 각각을 매트릭스 브랜드의 바이알로 옮기고, -20℃ 이하에서 보관하였다.

표 7에 제시되어 있는 빈도로 모든 동물/군에서 약력학 및 중합효소 연쇄 반응을 실시하고, SNBL USA 표준 실험 절차를 사용하여 수집하였다. 항응고제가 있는 PAXgene 튜브 중 대략 2.5 mL 부피의 혈액 샘플을 프로세싱하고, -15℃ 내지 -25℃에 저장하였다.

영장류에 대한 시험으로부터 얻은 데이타:

시판되는 현 제품 치료제의 투여량에 기초하여 체표면적에 대해 조정한 경우, 베타세론 = 32 MIU/mg; 레비프 = 270 MIU/mg, 및 아보넥스 = 200 MIU/mg.

3 ㎍/kg 레비프(등가의 인간 투여량)의 AUC = 13.6 ng*hr/mL, 주당 3회 투여시 = 40.8 ng*hr/mL, 및 3 ㎍/kg의 M36-40K를 단일 투여하였을 때의 AUC는 레비프를 매주 투여하였을 때 AUC의 19배였다.

백혈구 세포의 경우, 레비프, M36-30K(15 및 50 ㎍/kg의 투여량), M36-40K(15 및 50 ㎍/kg의 투여량), F111-30K(50 ㎍/kg의 투여량), 및 F111-40K(3 및 50 ㎍/kg의 투여량)에서 호중구의 유의적인 감소가 일부 있었다. 그러나, 투여 1일전 범위는 1.92 내지 5.66(10³/㎕)이고, SNBL로부터 얻은 과거 범위는 5.37 ± 2.75(10³/㎕)였고, 모든 군은 처리 후 15일째 투여 전 수준으로 돌아왔다(대부분은 처리 후 5일째까지 돌아왔다).

임상 화학과 관련하여, 대조군 값과의 유의적인 차이는 없었고, 하나의 군에서는 혈청 ALT 수준이 증가한 경향을 보였다. F111-30K는 모두 군에서 투여 1일전부터 처리 후 15일째까지 증가를 보였지만, 모든 군에서 표준 편차가 매우 컸고, SNBL로부터 얻은 과거 범위는 36 ± 12 U/L[F111-30K(3 ㎍/kg의 투여량): 36 내지 49 U/L; F111-30K(15 ㎍/kg의 투여량): 34 내지 60 U/L; F111-30K(50 ㎍/kg의 투여량): 32 내지 57 U/L]였고, 간 기능 수치에 있어 관련된 다른 변화는 없었다.

실시예 28

목적

하기 방법은 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 비-PEG화된 인터페론 β, 및 40KPEG화된 인터페론 β(PEG-IFB)의 상대 순도 및 잠재적인 화학적 분해(즉, 산화), 및 프로세스 관련 불순물을 평가하기 위해 사용하려는 것이다.

원리

RP-HPLC는 상대적인 소수성 정도에 기초하여 분자를 분리하는 기법이다. 샘플을, 탄화수소 쇄에 공유 결합되어 있는 실리카의 고정상을 통과시킨다. 관심의 대상이 되는 분자는 고정상에 의해 이동속도는 느려지고, 구배 유도상으로 용리된다. 크로마토그래피 용리 시간이 특정 분자의 특징이 된다. 이러한 방법은 소수성, 및 예를 들면, 산화와 같은 구조적 변형과 관련된 체류 양상에서의 미세한 차이에 기초하여 IFB와 PEG-IFB를 이소형으로부터 분리시킨다.

범주

본 방법은 IFB 및 PEG-IFB의 동정과 순도 평가를 입증하기 위한 것이다. 몇몇 부분적인 분해 생성물, 및 프로세스 관련 불순물은 상기 기법을 사용하여 관찰할 수 있다. 본 방법의 사용으로는 오직 특정 메티오닌 산화 부위의 부분적인 분해와 잠재적인 탈아미드화에 관해서 관찰할 수 있다.

한계

명목 주입량 = 10 ㎍

주입량을 명목 주입량의 50 - 150%로 하였을 때 선형성을 달성하였다.

1. 물질 및 장치

조정형 P20, P200, P1000 피펫맨(Pipetman), 또는 등가물.

1회용 P20, P200, 및 P1000 피펫 팁.

HPLC 바이알 및 캡(Alltech 100 ㎕ 스크류형 캡 폴리프로필렌 바이알 #12962, TFE 라이너형 캡 #73048, 오픈 홀 스크류형 캡 #73044, 또는 등가물)

세정용 1 ℓ 및 2 ℓ 유리병

칼럼 - 애질런트 조르박스(Agilent Zorbax) 300SB-C3, 4.6x150 mm, 3.5-미크론, 300 Å(P.N. 863973-909)

선형 구배를 실행할 수 있는 고압 액체 크로마토그래피 장치

(예를 들면, 진공 탈가스기, 4차 펌프, 자동으로 온도가 조절되는 자동 샘플 채취기, 자동으로 온도가 조절되는 칼럼 구획, 다이오드 어레이 디텍터(DAD: diode array detector), 및 켐스테이션(Chemstation) 크로마토그래피 소프트웨어가 장착된 애질런트 1100 HPLC)

2. 시약

a. 물, 밀리 Q 품질, 또는 등가물

b. 달리 언급하지 않는 한, 고체 화학물질은 분석 등급 이상이고, 용매는 HPLC 등급 이상이다. 달리 언급이 없는 한, 시약 저장 및 방법 단계는 실온에서 이루어진다.

c. 암브룩스(Ambrx) 화학물질의 예:

i. 아세토니트릴, 피셔(Fisher) A998, HPLC 등급, 또는 등가물

ii. 트리플루오로아세트산, 할로카본(Halocarbon) UN2699, 생체등급, 또는 등가물

d. 유동상 A: H₂O 중의 0.1 %(v/v) TFA

e. 유동상 B: 아세토니트릴 중의 0.1%(v/v) TFA

샘플

a. 10 ㎍의 단백질을 로딩할 수 있는 정도의 충분한 부피로 샘플 용액을 주입한다.

방법

a. 장치를 하기 조건으로 설정할 수 있다

i. 칼럼: 애질런트 조르박스 300SB-C3, 4.6x150 mm, 3.5-미크론, 300 Å

ii. 자동 샘플 채취기 온도: 4℃

iii. 유속: 1.0 mL/분

iv. 펌프 설정:

주입 장치 설정:

주입: 표준 주입

주입 부피: 다양함

드로 속도: 100 ㎕/분

주입 속도: 100 ㎕/분

바늘 세척: 20 ㎕ H₂O

중단 시간: 펌프로서

DAD 신호:

샘플 Bw 참조 Bw 단위

모니터 파장

214 4 600 100 nm

276 4 600 100 nm

280 16 600 100 nm

220 4 600 100 nm

250 8 600 100 nm

피크 폭: >0.1 min

슬릿: 4 nm

중단 시간: 펌프로서

칼럼 자동 온도 조절 장치: 온도: 25℃

적분 이벤트: 분석 소프트웨어에 따라 달라진다

b. 새 칼럼을 적어도 10 CV의, HPLC 등급의 증류수로 플러싱하여 이송시에 사용된 용매를 제거하여야 한다.

c. 세정 방법: 10 CV 초과의, HPLC 등급의 물로, 이어서, 10-15 CV의 100% 메탄올로 칼럼을 플러싱한다.

d. 저장 방법: 칼럼을 100% 메탄올에서 저장한다.

e. 전개 방법: 10-15 칼럼 부피의 100% 유동상 A를 사용하여 칼럼을 평형화시킨다.

f. 테스트 품목을 주입하고, HPLC 프로그램을 진행시킨다.

데이타 분석

a. 체류 시간(A₂₁₄ 사용)

테스트 품목의 체류 시간 기록:

b. 순도

테스트 품목의 순도 계산:

(주요 피크의 적분 면적/모든 피크의 적분 면적) x 100%

이러한 방법으로부터 작성된 크로마토그램 및 순도에 관한 예는 도 24-28에서 제공한다.

본원에 기술된 실시예 및 실시태양은 예시 목적으로만 제공된 것이고, 그의 변형 또는 변화가 당업계의 숙련인에게 제시될 것이며, 본 출원의 정신과 범위, 및 첨부된 청구의 범위의 범주 내에 포함된다는 것을 이해해야 한다. 본 출원에서 인용된 모든 공보, 특허, 특허 출원들 및/또는 다른 문헌들은 이들 공보, 특허, 특허 출원들 및/또는 다른 문헌 각각이 개별적으로 모든 목적을 위해 참고로 인용되는 것으로 기재된 것처럼 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그의 전문이 참고로 인용된다.

[표 6]

인용 서열
서열 번호	서열 명칭
1	C17S 치환을 갖는 IFN 베타의 아미노산 서열
2	C17S 치환(최적화된 5' 말단)을 갖는 IFN 베타의 뉴클레오티드 서열
3	C17S 치환을 포함하지 않는 IFN 베타의 아미노산 서열
4	C17S 치환을 포함하지 않는, N 말단 서열을 갖는 아미노산 서열

SEQUENCE LISTING <110> Kraynov, Vadim Knudsen, Nick Hays Putnam, Anna-Maria A. Krawitz, Denise Pinkstaff, Jason Myler, Heather <120> Modified Interferon Beta Polypeptides and Their Uses <130> AMBX-0136.00PCT <150> 60/927,528 <151> 2007-05-02 <160> 24 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 166 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of IFN beta with C17S substitution <400> 1 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 2 <211> 498 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of IFN beta with C17S substitution (optimized 5' end) <400> 2 atgagctaca acttgcttgg attcctgcag cgttcttcta actttcagag ccagaaactg 60 ctgtggcagc ttaacggtcg tctggagtac tgccttaaag accgtatgaa cttcgacatc 120 ccggaagaaa tcaaacagct ccagcagttc caaaaagaag acgcggccct gaccatctac 180 gaaatgctgc agaacatctt cgcgatcttt cgtcaggata gctctagcac cggttggaat 240 gaaaccatcg ttgaaaacct gcttgctaac gtttaccacc agattaacca ccttaaaacc 300 gttcttgaag aaaaactgga gaaagaagac ttcacccgtg gtaaactgat gtctagcctg 360 cacctgaagc gttactacgg tcgtatcctg cactacctta aagccaaaga atattctcac 420 tgcgcgtgga ccatcgttcg tgttgaaatc ctgcgtaact tctacttcat caaccgtctg 480 accggctacc tgcgcaac 498 <210> 3 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 4 <211> 187 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15 Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg 20 25 30 Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg 35 40 45 Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu 50 55 60 Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile 65 70 75 80 Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val 100 105 110 Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu 115 120 125 Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys 130 135 140 Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160 His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr 165 170 175 Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 180 185 <210> 5 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutant tRNA derived from Methanococcus jannaschii tRNA <400> 5 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccagcccgc cggacca 77 <210> 6 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant synthetase derived from Methanococcus jannaschii synthetase <400> 6 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Val 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Tyr Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu His Gly Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Ile His 145 150 155 160 Tyr Glu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 7 <211> 77 <212> DNA <213> Methanococcus jannaschii <400> 7 ccggcggtag ttcagcaggg cagaacggcg gactctaaat ccgcatggcg ctggttcaaa 60 tccggcccgc cggacca 77 <210> 8 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Optimized amber supressor tRNA <400> 8 cccagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggactctaa atccgttctc gtaggagttc 60 gagggttcga atcccttccc tgggacca 88 <210> 9 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Optimized AGGA frameshift supressor tRNA <400> 9 gcgagggtag ccaagctcgg ccaacggcga cggacttcct aatccgttct cgtaggagtt 60 cgagggttcg aatccctccc ctcgcacca 89 <210> 10 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-L-phenylalanine <400> 10 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 11 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-benzoyl-L-phenylalanine <400> 11 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Ser His 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 12 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of propargyl-phenylalanine <400> 12 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Pro Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Ala Ile Tyr 145 150 155 160 Leu Ala Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile His 165 170 175 Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His Asn 180 185 190 Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser Lys 195 200 205 Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala Lys 210 215 220 Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro Ile 225 230 235 240 Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg 245 250 255 Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu Leu 260 265 270 Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn 275 280 285 Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg 290 295 300 Leu 305 <210> 13 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of propargyl-phenylalanine <400> 13 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 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Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys Arg 245 250 255 Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu Leu 260 265 270 Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys Asn 275 280 285 Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys Arg 290 295 300 Leu 305 <210> 14 <211> 305 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of propargyl-phenylalanine <400> 14 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Lys Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu 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p-azido-phenylalanine <400> 15 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Thr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 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Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Leu His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 17 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 17 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Val His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly 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Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Ser Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Pro Ser His 145 150 155 160 Tyr Gln Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 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Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Cys His 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 20 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-acetyl -phenylalanine <400> 20 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Thr His 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp 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Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 22 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 22 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Ala 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Arg Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Val Ile His 145 150 155 160 Tyr Asp Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Asp Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305 <210> 23 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Aminoacyl tRNA synthetase for the incorporation of p-azido-phenylalanine <400> 23 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Thr Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Leu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly 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Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Ile His 145 150 155 160 Tyr Glu Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu Gly Lys Met Ser Ser Ser 195 200 205 Lys Gly Asn Phe Ile Ala Val Asp Asp Ser Pro Glu Glu Ile Arg Ala 210 215 220 Lys Ile Lys Lys Ala Tyr Cys Pro Ala Gly Val Val Glu Gly Asn Pro 225 230 235 240 Ile Met Glu Ile Ala Lys Tyr Phe Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Ile Lys 245 250 255 Arg Pro Glu Lys Phe Gly Gly Asp Leu Thr Val Asn Ser Tyr Glu Glu 260 265 270 Leu Glu Ser Leu Phe Lys Asn Lys Glu Leu His Pro Met Arg Leu Lys 275 280 285 Asn Ala Val Ala Glu Glu Leu Ile Lys Ile Leu Glu Pro Ile Arg Lys 290 295 300 Arg Leu 305

Claims

하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, IFN 베타 폴리펩티드가 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 폴리펩티드가 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자에 연결되어 있는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제3항에 있어서, 폴리펩티드가 수용성 중합체에 연결되어 있는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 폴리펩티드가 이작용성 중합체, 이작용성 링커, 또는 하나 이상의 추가 IFN 베타 폴리펩티드에 연결되어 있는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제5항에 있어서, 이작용성 링커 또는 중합체가 제2 폴리펩티드에 연결되어 있는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제6항에 있어서, 제2 폴리펩티드가 IFN 베타 폴리펩티드인 IFN 베타 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 상기 IFN 베타 폴리펩티드에 존재하는 비천연적으로 코딩된 아미노산에 연결되어 있는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 위치 1 앞(즉, N 말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167(즉, 단백질의 카르복실 말단에서), 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제10항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제10항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제10항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제10항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 15, 42, 80, 108, 111, 155, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열번호 4의 리더 또는 신호 서열 중의 잔기로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 위치 1 앞(즉, N 말단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167(즉, 단백질의 카르복실 말단에서), 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아 미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제16항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제16항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제16항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제16항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 15, 42, 80, 108, 111, 155, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아 미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열번호 4의 리더 또는 신호 서열 중의 잔기로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, IFN 베타 폴리펩티드가 IFN 수용체에 대한 IFN 베타 폴리펩티드의 친화성을 조절하는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, IFN 베타 폴리펩티드가 IFN 베타 폴리펩티드의 안정성 또는 가용성을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, IFN 베타 폴리펩티드가 재조합 숙주 세포에서의 IFN 베타 폴리펩티드의 발현을 증가시키거나, 시험관내 합성을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, IFN 베타 폴리펩티드가 IFN 베타 폴리펩티드의 프로테아제 내성을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 폴리펩티드 중의 20종의 일반 아미노산 중 임의의 아미노산에 대해서는 반응성을 나타내지 않는 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자에 대해 반응성을 나타내는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라진 기, 히드라지드 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기, 또는 알킨 기를 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제27항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐 기를 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제28항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 하기 화학식을 갖는 것인 IFN 베타 폴리펩티드:

상기 식에서, n은 0-10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아릴이고; R₂는 H, 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 및 치환된 아릴이고; R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이고, R₄는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다.
제27항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 아미노옥시 기를 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제27항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 히드라지드 기를 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제27항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 히드라진 기를 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제27항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기가 세미카르바지드 기를 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제27항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산 잔기가 아지드 기를 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제34항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 하기 화학식을 갖는 것인 IFN 베타 폴리펩티드:

상기 식에서, n은 0-10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 치환된 아릴이거나, 존재하지 않고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고; m은 0-10이고; R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다.
제27항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 알킨 기를 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제36항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 하기 화학식을 갖는 것인 IFN 베타 폴리펩티드:

상기 식에서, n은 0-10이고; R₁은 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 아 릴이고; X는 O, N, S이거나, 존재하지 않고; m은 0-10이고, R₂는 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 아미노 말단 변형기이고, R₃은 H, 아미노산, 폴리펩티드, 또는 카르복시 말단 변형기이다.
제4항에 있어서, 수용성 중합체의 분자량이 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa인 IFN 베타 폴리펩티드.
제38항에 있어서, 수용성 중합체의 분자량이 약 0.1 kDa 내지 약 50 kDa인 IFN 베타 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 카르보닐 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 수용성 중합체와 반응시켜 제조되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제40항에 있어서, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기가 아미드 결합을 통해 수용성 중합체에 연결되어 있는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 카르보닐 기를 포함하는 수용성 중합체를 아미노옥시, 히드 라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 기를 포함하는 비천연적으로 코딩된 아미노산과 반응시켜 제조되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 알킨 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 아지드 부분을 포함하는 수용성 중합체와 반응시켜 제조되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 아지드 함유 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 알킨 부분을 포함하는 수용성 중합체와 반응시켜 제조되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제27항에 있어서, 아지드 또는 알킨 기가 아미드 결합을 통해 수용성 중합체에 연결되어 있는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 수용성 중합체가 분지형 또는 멀티아암형(multiarmed) 중합체인 IFN 베타 폴리펩티드.
제46항에 있어서, 수용성 중합체의 각 분지의 분자량이 약 1 kDa 내지 약 100 kDa인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 폴리펩티드가 IFN 베타 길항제인 IFN 베타 폴리펩티드.
제48항에 있어서, 폴리펩티드가 하나 이상의 번역 후 변형, 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제49항에 있어서, 중합체가 수용성 중합체 및 폴리(에틸렌 글리콜)로 구성된 군으로부터 선택되는 부분을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제48항에 있어서, 폴리펩티드가 IFN 수용체의 활성화를 방지하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 당류 부분을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제3항에 있어서, 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자가 당류 부분을 통해 폴리펩티드에 연결되어 있는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
엄격한 조건하에서 서열번호 2, 또는 서열번호 3 또는 4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산으로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 셀렉터 코돈을 포함하는 것인 단리된 핵산.
제54항에 있어서, 셀렉터 코돈이 앰버 코돈, 오커 코돈, 오팔 코돈, 특이 코돈, 희귀 코돈, 및 4 염기 코돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 단리된 핵산.
비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 단리된 IFN 베타 폴리펩티드를, 비천연적으로 코딩된 아미노산과 반응하는 부분을 포함하는 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 제3항의 IFN 베타 폴리펩티드의 제조 방법.
제56항에 있어서, 중합체가 수용성 중합체 및 폴리(에틸렌 글리콜)로 구성된 군으로부터 선택되는 부분을 포함하는 것인 제조 방법.
제56항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라지드 기, 히드라진 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기, 또는 알킨 기를 포함하는 것인 제조 방법.
제56항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐 부분을 포함하고, 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자가 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분을 포함하는 것인 제조 방법.
제59항에 있어서, 아미노옥시, 히드라진, 히드라지드 또는 세미카르바지드 부분이 아미드 결합을 통해 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자에 연결되어 있는 것인 제조 방법.
제56항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 알킨 부분을 포함하고, 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자가 아지드 부분을 포함하는 것인 제조 방법.
제56항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 아지드 부분을 포함하고, 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자가 알킨 부분을 포함하는 것인 제조 방법.
제58항에 있어서, 아지드 또는 알킨 부분이 아미드 결합을 통해 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자에 연결되어 있는 것인 제조 방법.
제57항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분의 평균 분자량이 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa인 제조 방법.
제57항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분이 분지형 또는 멀티아암형 중합 체인 제조 방법.
제1항의 IFN 베타 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
제66항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 수용성 중합체에 연결되어 있는 것인 조성물.
IFN 베타에 의해 조절되는 질환을 앓는 환자에게 제66항의 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, IFN 베타에 의해 조절되는 질환을 앓는 환자의 치료 방법.
제54항의 핵산을 포함하는 세포.
제69항에 있어서, 세포가 오르토고날 tRNA 합성효소 또는 오르토고날 tRNA를 포함하는 것인 세포.
셀렉터 코돈을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들, 오르토고날 RNA 합성효소 및 오르토고날 tRNA를 포함하는 세포를 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드의 발 현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계; 및 IFN 베타 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하는, 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드의 제조 방법.
IFN 베타 폴리펩티드 중의 임의의 하나 이상의 천연 아미노산을 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하는 단계를 포함하는, IFN 베타 폴리펩티드의 혈청 반감기 또는 순환 시간의 조절 방법.
서열번호 2에 나타낸 서열을 갖거나, 서열번호 3 또는 4로서 나타낸 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 IFN 베타 폴리펩티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 셀렉터 코돈을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제73항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 링커, 중합체, 수용성 중합체, 또는 생물학적 활성 분자에 연결되어 있는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제74항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제73항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 위치 1 앞(즉, N 말 단에서), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167(즉, 단백질의 카르복실 말단에서), 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제76항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제76항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 28, 36, 76, 80, 107, 108, 111, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제76항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 8, 15, 19, 36, 42, 46, 48, 49, 80, 108, 111, 113, 155, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제76항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 15, 42, 80, 108, 111, 155, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제73항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 서열번호 4의 리더 또는 신호 서열 중의 잔기로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제73항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 카르보닐 기, 아미노옥시 기, 히드라지드 기, 히드라진 기, 세미카르바지드 기, 아지드 기, 또는 알킨 기를 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제75항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분의 분자량이 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa인 IFN 베타 폴리펩티드.
제75항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분이 분지형 또는 멀티아암형 중합체인 IFN 베타 폴리펩티드.
제84항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜) 부분의 분자량이 약 1 kDa 내지 약 100 kDa인 IFN 베타 폴리펩티드.
제73항의 IFN 베타 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
재조합 숙주 세포에서의 IFN 베타 폴리펩티드의 발현을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드.
IFN 베타 폴리펩티드의 단일 아미노산에 공유 결합에 의해 연결된 수용성 중합체를 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드.
제88항에 있어서, 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜) 부분을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제88항에 있어서, 수용성 중합체에 공유 결합에 의해 연결된 아미노산이 비천연적으로 코딩된 아미노산인 IFN 베타 폴리펩티드.
제10항에 있어서, 상기 비천연적으로 코딩된 아미노산이 폴리(에틸렌 글리콜) 분자에 연결되어 있는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
하나 이상의 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드로서, 상기 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자는 리보좀에 의해 폴리펩티드 내로 도입된 비천연적으로 코딩된 아미노산의 작용기를 통해 폴리펩티드에 부착된 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제92항에 있어서, 상기 IFN 베타 폴리펩티드가 단일 PEG화된 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산에 부착된 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 IFN 베타 폴리펩티드로서, 상기 비천연적으로 코딩된 아미노산은 리보좀에 의해 폴리펩티드 내의 미리 선택된 부위로 도입된 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제94항에 있어서, IFN 베타 폴리펩티드가 하나의 상기 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, IFN 베타 폴리펩티드가 IFN 베타 폴리펩티드의 면역원성을 조절하는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, IFN 베타 폴리펩티드가 IFN 베타 폴리펩티드의 혈청 반감기 또는 순환 시간을 조절하는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
IFN 베타 폴리펩티드 중의 임의의 하나 이상의 천연 아미노산을 하나 이상의 비천연적으로 코딩된 아미노산으로 치환하는 단계를 포함하는, IFN 베타 폴리펩티드의 면역원성의 조절 방법.
제1항 또는 제4항에 있어서, 폴리펩티드가 또한 천연적으로 코딩된 아미노산 치환을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항 또는 제4항에 있어서, 비천연적으로 코딩된 아미노산이 잔기 36 및 F111, 및 그의 임의 조합(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)으로 구성된 군으로부터 선택되는 위치에서 치환되는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항 또는 제4항에 있어서, 폴리펩티드가 또한 C17S 천연 아미노산 치환(서열번호 1, 또는 서열번호 3, 4에서의 상응하는 아미노산)을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제1항에 있어서, IFN 베타 폴리펩티드가 IFN 베타 폴리펩티드의 항바이러스성을 증강시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 포함하는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 수용성 중합체가 옥심 결합에 의해 상기 폴리펩티드에 연결되어 있는 것인 IFN 베타 폴리펩티드.