KR100714116B1 - 췌장의 프로카복시펩티다제 ｂ를 사용한 인슐린의 제조 - Google Patents

Abstract

본 발명은, (a) 카복시펩티다제 B의 천연 또는 비천연 전구체 형태를 미생물에서 분비 방식으로 발현시키는 단계, (b) 분비 방식으로 발현된 전구체 형태를 정제하는 단계, 및 (c) 정제된 전구체 형태를 효소적 처리를 사용하여 활성 카복시펩티다제 B, 또는 이의 동질 효소 또는 뮤테인으로 전환시키는 단계를 포함하여, 췌장 카복시펩티다제 B 또는 카복시펩티다제 B의 동질 효소 또는 뮤테인을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 핵산 작제물, 전술한 방법에서의 이의 용도, 및 이의 제조 방법 뿐만 아니라 숙주 세포, 이의 제조 방법 및 췌장 카복시펩티다제 B 또는 이의 동질 효소 또는 뮤테인을 생산하는 방법에서 이의 용도에 관한 것이다.

카복시펩티다제 B, 프로카복시펩티다제 B, 동질 효소, 뮤테인, 피치아 파스토리스, 트립신, 인슐린

Description

췌장의 프로카복시펩티다제 Ｂ를 사용한 인슐린의 제조{Production of insulin with pancreatic procarboxypeptidase B}

본 발명은 카복시펩티다제 B 및 프로카복시펩티다제 B의 제조 및 생명공학적 공정에서 활성이 있는 카복시펩티다제 B의 제조를 위한 프로카복시펩티다제 B의 용도에 관한 것이다.

카복시펩티다제는 단백질 및 펩타이드를 절단하는 아연-함유 효소(프로테아제)의 한 그룹이며, 이로 인해 개별적인 아미노산들은 분해하고자 하는 단백질 또는 펩타이드의 카복실 말단으로부터 단계적으로 가수분해적으로 제거된다. 따라서, 카복시펩티다제는 엑소펩티다제에 속한다. 동물 카복시펩티다제는 전구체(프로카복시펩티다제)로서 췌장에서 형성되고, 펩타이드의 소화에서 매우 중요한 소장내 트립신에 의해서 활성형, 즉 상기 단백질의 1차 절단 생성물로 전환된다. 기질 특이성에 따라서, 다양한 카복시펩티다제는 구분된다.

예를 들면, 카복시펩티다제 B는 전적으로 염기성 아미노산, 예를 들면, 아르기닌, 라이신 및 오르니틴을 절단시킨다. 카복시펩티다제는 펩타이드 및 단백질의 서열 결정에 사용되고, 이로써 카복실 말단상의 아미노산을 확인할 수 있다. 또한, 단백질은 카복시펩티다제 B를 사용하여 측정할 수 있다.

카복시펩티다제 B를 사용하는 산업적 예는 중요한 약제학적 생성물인 인슐린의 제조이다. 이러한 펩타이드 호르몬의 제조는 특히 문헌[유럽 특허원 EP-A 제0 489 780호]에 기술되어져 있다. 상기 출원에서, 카복시펩티다제 B는 트립신 처리로 개방된 프로인슐린 구조의 인슐린으로의 전환에서 중요한 단계에서 사용된다.

일반적으로, 이러한 유형의 산업적 공정에서 사용되는 카복시펩티다제 B는 시판중인 카복시펩티다제 B 제제로부터 공급된다. 이러한 제제는 바람직하게는 돼지 췌장으로부터 수득된다[Folk, J.E., Meth. Enzym.: 19, 504, 1970].

그러나, 동물 기원의 효소는 동물 바이러스에 의한 오염의 위험이 있을 수 있다는 단점을 갖는다. 바이러스를 함유하지 않는다는 것을 검출하는 것은 복잡하며 상기 제제의 생산비의 계산에 필수적인 항목으로서 기록된다. 상기 효소가 인슐린의 산업적인 생산과 같은, 대규모 산업적인 공정에서 사용되는 경우, 동결된 판크레아제를 수득하고 저장하기 위한 병참학적 비용이 높다는 추가의 단점이 있다.

생명공학적 제조는 그 자체로 췌장 조직의 적출에 의한 카복시펩티다제 B의 생산에 대한 대안으로서 제공된다. 이러한 방법에서는, 세균에서 직접적인 세포내 발현 또는 융합 단백질을 통한 발현, 예를 들면, 효모에서 β-갈락토시다제-카복시펩티다제 B 융합 단백질[J. Biol. Chem., 267:2575-2581, 1992]의 형태로 또는 상응하는 발현과 같은, 수 많은 공지된 제조 경로가 있다. 이에 대한 추가의 대안은 카복시펩티다제 B의 아미노산 서열과 발현 생성물의 분비를 초래하는 시그날 서열로 이루어진, 카복시펩티다제 B 전구체, 즉 프로카복시펩티다제 B의 발현이다. 적합한 발현 시스템은 바실러스 서브틸리스, 스트렙토마이세스, 이. 콜라이 및 효모 사카로마이세스, 칸디다, 한세눌라 폴리모퍼스(Hansenula polymorphus) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에 대해서 기술되어져 있으며, 이중 일부는 시판중이다.

카복시펩티다제 B를 제조하기 위한 발현 시스템의 사용에서 전제조건은 각각의 경우에서 선택된 숙주 균주의 성장이 활성 카복시펩티다제 B의 존재로 인해 억제되지 않아야 하며, 결과적으로, 발현이 최초로 실제로 가능해 진다는 것이다. 이러한 특성을 갖는 숙주 균주는 일반적으로 발효시키기 어려우며, 따라서, 공간과 시간에 대해 상대적으로 낮은 수율이 수득된다.

카복시펩티다제 B의 세포내 발현(직접 발현 또는 융합 단백질로서의 발현)에서 한 가지 문제점은, 상기 단백질이 처음에는 정확한 공간적 구조로 존재하지 않으며 따라서 불활성이라는 것이다. 따라서, 정제 및 프로세싱 동안 시험관내에서 폴딩되어져야만 한다. 이러한 방법에서, 불완전한 폴딩이 일어날 수 있으며, 이는 상기 효소의 활성 및 특이성에 악영향을 미치고 약제학적 제제에서 사용하기 어렵게 만든다.

상기 효소를 성숙한 활성 형태로 분비시키는 카복시펩티다제 B의 제조 방법은 또한 단점을 갖는다. 발효 동안 카복시펩티다제 B는, 기질로서 인식되는 세포 성분 또는 영양 배지 성분의 펩타이드-유사 단편과의 반응으로 인해 빈번히 불활성화되며, 따라서 수율 손실이 발생한다.

이러한 딜레마를 해결하는 한 가지 방법은 공간적으로 정확한 형태의 불활성 카복시펩티다제 B 형태를 발현 및 분비시키는 것이다. 한 가지 효소와 반응시킴으로써, 활성 카복시펩티다제 B는 시험관내에서 이의 전구체로부터 제조할 수 있다. 본 명세서 내용에서 "활성 카복시펩티다제 B"는 천연에서 발견되는 카복시펩티다제 B, 예를 들면, 사람의 카복시펩티다제 B 또는 이의 천연 동질 효소를 의미한다. "활성 카복시펩티다제 B"는 또한 아미노산 서열의 결실, 부가 또는 치환이 일어나는 천연 카복시펩티다제 B의 뮤테인을 의미할 수 있지만, 뮤테인의 효소 활성은 천연 카복시펩티다제 B의 효소 활성과 질적으로 상응한다. 언급되는 전구체는 천연 프로카복시펩티다제 B 또는 이의 유도체, 예를 들면, 동질 효소, 뮤테인, 또는 펩타이드 서열의 부가에 의해 불활성화된 카복시펩티다제 B일 수 있다. 부가된 단백질 서열의 특성은 하기에서 보다 상세히 기술된다. 프로카복시펩티다제 B 또는 이의 유도체가 바람직한데, 이는 활성 카복시펩티다제 B가 매우 용이하게 조절가능한 방식으로 상기 단백질로부터 제조될 수 있기 때문이다. 또한, 언급된 프로카복시펩티다제 B 및 이의 유도체는 상대적으로 긴 기간 동안 저장할 수 있는 반면, 카복시펩티다제 B의 저장 동안에는 활성 손실이 관찰된다.

언급된 프로카복시펩티다제 B의 유도체는 카복시펩티다제 B의 아미노산 서열과, 발현에 사용되는 숙주 유기체로부터 상기 유도체를 분비하기 위한 시그날 펩타이드의 아미노산 서열, 임의로 100개 아미노산 길이 이하의 모든 바람직한 아미노산 서열 및 상기 유도체의 카복시펩티다제 B 부분으로부터 부가적으로 N-말단 부착된 펩타이드를 효소적으로 제거할 수 있게 하는 엔도펩티다제 인식 서열을 갖는 N-말단 부착된 펩타이드를 함유한다. 이러한 유형의 엔도펩티다제 인식 서열의 예는 트립신, 인자 Xa, 엘라스타제, 키모트립신 및 콜라게나제의 상응하는 공지된 인식 서열이다.

놀랍게도, 또한, 프로카복시펩티다제 B는 한번의 반응(one-pot reaction)에서 프로인슐린 및 트립신과 반응하며, 결과적으로 새롭게 형성된 활성 카복시펩티다제 B는 즉시 인슐린 B 쇄의 수득된 카복시-말단 아르기닌을 인식하고 가수분해시킬 수 있다는 것이 확인되었다. 상기 방법 동안 수득된 카복시펩티다제 B는 또한, 이전에 저장된 후 프로인슐린과의 반응에 부가되는 카복시펩티다제 B 보다 더 활성적이다. 상기 반응 혼합물에 존재하는 트립신은 프로카복시펩티다제 B의 활성화 뿐만 아니라 특이적으로 프로인슐린을 절단시키는 작용을 하며, 결과적으로 성숙 인슐린을 방출시킨다.

트립신에 의한 활성화의 역학은 놀랍게도 프로카복시펩티다제 B 또는 언급된 유도체의 N 말단에서의 테트라-His 서열의 부가에 의해서 악영향을 받지 않는다. 상기 부가의 장점은 결과적으로 상기 단백질이 니켈 킬레이트 착화법을 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 용이하게 정제될 수 있다는 것이다. 상기 변형된 프로카복시펩티다제 B의 사용은 마찬가지로 본 발명의 요지이다.

본 발명의 예로서, 사람 췌장 프로카복시펩티다제 B의 cDNA 서열이 발현된다. 그러나, 사람 효소 및 상응하는 효소, 예를 들면, 소, 랫트, 돼지 또는 췌장 조직을 형성하는 다른 종으로부터의 효소 사이에서, DNA와 단백질 측면 모두에서 높은 서열 상동성으로 인해, 상기 종들의 DNA 서열을 마찬가지로 사람 DNA 서열 대신 사용할 수 있다는 것은 명백하다. 카복시펩티다제 B의 뮤테인을 암호화하는 상응하는 DNA를 또한 사용할 수 있다. 마찬가지로, 카복시펩티다제 B 또는 프로카복시펩티다제 B의 천연 또는 인공 생산된 동질 효소를 암호화하는 DNA 서열을 사용할 수 있다. 또한, 물론, 유전자 암호의 축퇴성으로 인해, 카복시펩티다제 B 또는 프로카복시펩티다제 B, 또는 각각의 경우 이의 뮤테인을 암호화하는 전술한 DNA 서열을 교체할 수 있는 천연적으로 생성되지 않는 모든 DNA 서열을 사용할 수 있다.

마찬가지로, 제조원(Invitrogen)으로부터 구입할 수 있는 피치아 파스토리스 발현 시스템을 사람 프로카복시펩티다제 B의 생산을 위한 이종 단백질의 분비를 위한 예로서 사용한다. 세균 시스템, 예를 들면, 문헌[유럽 특허원 EP-A 제0 448 093호]에 기술된 이. 콜라이 분비 돌연변이체를, 상기 문헌에 기술된 히루딘 서열을 프로카복시펩티다제의 서열로 교체하는 경우에 또한 사용할 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련자에게는 명백하다. 추가의 대안은 예를 들면, 글루타릴아미다제의 발현에 관한 문헌[유럽 특허원 EP-A 제0 504 798호]에서 기술된 것과 같이, 스트렙토마이세테스 중에서 사람 프로카복시펩티다제 B를 발현시키는 것이다.

마찬가지로, 상대적으로 대량의 효소를 분리하기 위한 상기 방법을 대규모 산업적 용도로 사용하는 경우, 당해 분야에서와 같이, 본 실시예에 기술된 것 이상의 다른 단백질 정제 단계들을 사용할 수 있다는 것은 명백하다.

따라서, 본 발명의 한 가지 주제는, (a) 카복시펩티다제 B 또는 카복시펩티다제 B의 동질 효소 또는 뮤테인의 천연 또는 비천연 전구체 형태를 미생물에서 발현 분비시키는 단계, (b) 발현 분비된 전구체 형태를 정제하는 단계, 및 (c) 정제된 전구체 형태를 효소적 처리를 사용하여 활성 카복시펩티다제 B, 또는 카복시펩티다제 B의 동질 효소 또는 뮤테인으로 전환시키는 단계를 포함하여, 췌장 카복시펩티다제 B 또는 카복시펩티다제 B의 동질 효소 또는 뮤테인을 제조하는 방법, 특히 췌장 카복시펩티다제 B 또는 이의 동질 효소가 사람 기원 유형인 방법, 바람직하게는, 천연 전구체 형태가 프로카복시펩티다제 B 또는 이의 동질 효소에 상응하는 유형의 방법에 관한 것이다.

이하에서, 상기 기술된 방법을 언급하는 경우, 일반적으로 표현 "이러한 유형의 방법"은 특별히 또 다른 방법을 인용하지 않는 경우에 사용된다. 카복시펩티다제 B의 "천연" 및 "비천연" 전구체 형태는 천연적으로 생성되는 유형("천연 전구체 형태") 또는 이러한 유형의 천연 전구체 형태로부터 아미노산의 치환, 부가 또는 결실에 의해 야기되는 유형("비천연 전구체 형태")의 분자이지만, 이때, 비천연 전구체 형태는 효소 처리에 의해서 활성 췌장 카복시펩티다제 B 또는 이의 동질 효소 또는 뮤테인으로 전환될 수 있는 것이다.

특히 바람직한 방법은 비천연 전구체 형태가 화학식 I의 구조를 갖는 유형의 방법이다.

S-(As)_x-E-CB

상기식에서,

S는 각각의 미생물로부터 발현 동안 형성된 융합 단백질의 분비를 유도하는 시그날 펩타이드이고,

As는 모든 바람직한 유전학적으로 암호화될 수 있는 아미노산이고,

E는 엔도펩티다제 인식 서열로 이루어진 펩타이드 링커이고,

CB는 카복시펩티다제 B 또는 카복시펩티다제 B의 동질 효소 또는 뮤테인의 아미노산 서열이며,

x는 0 내지 100의 정수이다.

또한, 본 발명은 친화성 크로마토그래피에 의해서 전구체 형태의 정제를 가능하게 하는 펩타이드 서열이 천연 또는 비천연 전구체 형태에 부착되는 유형의 방법, 특히 바람직하게는 친화성 크로마토그래피에 의한 정제를 위해 부착된 서열이 1 내지 6개, 바람직하게는 4개의 히스티딘 잔기인 유형의 방법에 관한 것이다.

본 발명은 마찬가지로 효모 피치아 파스토리스를 발현을 위한 미생물로서 사용하는 유형의 방법에 관한 것이다.

본 발명의 부가적인 목적은 효소 트립신, 엘라스타제, 인자 Xa, 키모트립신 또는 콜라게나제, 바람직하게는 트립신을 효소적 처리를 위해서 사용하는 유형의 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 단계 (c)가 인슐린 또는 인슐린 유도체의 B, C 및 A 쇄를 포함하는 인슐린 전구체 형태의 존재하에서 적합한 반응 조건하에서 수행되는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법에서 성숙 인슐린 또는 성숙 인슐린 유도체가 형성되어, 반응 혼합물로부터 분리된다.

본 발명의 추가의 목적은 이러한 유형의 방법에서의 프로카복시펩티다제 B 및 카복시펩티다제 B의 용도이다.

또한, 본 발명은 카복시펩티다제 B, 또는 카복시펩티다제 B의 동질 효소 또는 뮤테인의 천연 또는 비천연 전구체 형태를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는, 이러한 유형의 방법에서 사용하기 위한 핵산 작제물에 관한 것이며, 이때, 언급된 암호화 서열은 적합한 미생물에서 전구체 형태의 발현을 가능하게 하는 프로모터에 작동적으로 결합된다. 바람직하게는 본 발명은 상기 DNA 서열이 화학식 I의 단백질을 암호화하는 핵산 작제물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 1 내지 6개, 바람직하게는 4개의 히스티딘 잔기를 암호화하는 DNA 서열이 카복시펩티다제 B, 또는 카복시펩티다제 B의 동질 효소 또는 뮤테인의 천연 또는 비천연 전구체 형태를 암호화하는 DNA 서열에 부가적으로 부착되는 핵산 작제물에 관한 것이다.

하기에서, 상술한 핵산 작제물을 언급하는 경우, 일반적으로 표현 "이러한 유형의 핵산 작제물"은 특별히 또 다른 핵산 작제물을 인용하지 않는 경우에 사용된다.

본 발명은 마찬가지로, (a) 언급된 DNA 서열을 분리하고 제조하는 단계, 및 (b) 이를 적합한 방식으로 벡터내로 삽입하는 단계를 포함하여, 이러한 유형의 핵산 작제물의 제조 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 언급된 췌장 카복시펩티다제 B의 제조 방법에서 이러한 유형의 핵산 작제물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 언급된 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포, 및 이러한 유형의 숙주 세포의 제조를 위한 방법에 관한 것이며, 이때, 상기 언급된 핵산 작제물은 적합한 미생물내에 포함된다.

본 발명은 또한 상기 언급된 췌장 카복시펩티다제 B의 제조를 위한 방법에서 이러한 유형의 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 실시예는 프로카복시펩티다제 B 및 (His)4-프로카복시펩티다제 B를 발현시키고 정제하는 방법을 예시하고자 하는 것이다. 또한, 인슐린 제조를 위한 트립신과 카복시펩티다제 B의 분리된 형태 및 혼합 사용에서, 프로카복시펩티다제 B를 트립신으로 활성화시키는 방법을 예시한다.

실시예 1

본 실시예는 사람 프로카복시펩티다제 B의 분비를 위한 재조합 피. 파스토리스 균주의 제조를 기술한다. 사용되는 출발 물질은 사람 췌장 조직으로부터 분리된 RNA로부터 공지된 방법에 따라서 제조되는 바와 같은 cDNA 제제이다. 이러한 유형의 cDNA 제제는 예를 들면, 제조원(Clontech, 카탈로그 번호 7410-1)으로부터 구입할 수 있다. 목적하는 cDNA 표적 서열의 증폭을 위해서, 두 개의 프라이머를 합성한다. 이의 서열은 유전자뱅크 데이터베이스로부터 수득한다. 사람 췌장 카복시펩티다제 B의 cDNA 서열은 상기 데이터베이스에서 '승인 번호' M81057로 이용할 수 있다. 정방향 프라이머 서열 P-CPBf22는 22 내지 32bp 영역에 상응하며 역방향 프라이머 서열 P-CPBrev1271은 1271 내지 1250bp 영역에 상응한다. 증폭을 위해서, 표준 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 수행한다. PCR의 반응 생성물은 겔 전기영동으로 분리시키며, 약 1250bp의 예견되는 길이의 수득된 DNA 밴드를 용출시켜 키트(Original TA Cloning

kit, 제조원: Invitrogen) 중 pCR

벡터와 함께 연결 반응시킨다. 상기 키트의 성분으로서 추가로 제공되는 이. 콜라이 균주 INVα F'의 컴피턴트 세포를 상기 연결 혼합물로 형질전환시키고 암피실린 25㎎/ℓ를 함유하는 NA 플레이트 상에 도말하고 37℃에서 배양한다. 성장시킨 콜로니로부터 수득된 세포를 다음날 아침 멸균수 20㎕에 재현탁시키고 10분 동안 94℃에서 항온처리한다. 이후, 각각의 경우에 기술된 두 개의 프라이머 P-CPBf22 및 P-CPBrev1271 0.2㎍을 함유하는 PCR 반응 완충액을 상기 현탁액에 부가하여 100㎕의 반응 용적중에서 표준 PCR을 수행한다. 반응 생성물을 겔 전기영동으로 분석한다. 증폭되어 약 1250bp 단편을 제공할 수 있는 DNA를 함유하는 형질전환체가 정확한 것으로 인식된다. 플라스미드 DNA를 이러한 방법으로 정의된 콜로니 중 하나로부터 분리시키고 삽입된 cDNA 서열을 서열 분석으로 완전히 특성결정한다. 결정된 서열은 문헌[Aloy et al., Biol. Chem., 379:149-155, 1998]에서 공지된 서열과 완전히 일치하는 것으로 나타난다. 상기 문헌에 따라서, 프로카복시펩티다제의 -95 내지 307번 아미노산을 암호화하는 코돈을 발현용으로 사용한다. 사용된 발현 벡터는 플라스미드 pPIC9이며, 이는 문헌[Cregg, J.M. et al., Bio/Technologie, 11:905-910, 1993, and Scorer, C.A. et al., Bio/Technologie, 12:181-184, 1994]에 기술되어져 있다. 이를 위해서, 플라스미드 pPIC9를 제한 효소 XhoI 및 EcoRI으로 개방시킨다. cDNA 서열의 벡터내로의 삽입을 위해서, 두 개의 프라이머를 합성한다. 정방향 프라이머 PPICCPBf는 서열 1의 서열을 가지며, 역방향 프라이머 PPICCPBrev는 서열 2의 서열을 갖는다.

서열 1

서열 2

표준 PCR 반응에서, 상기 cDNA를 상기 두 개의 프라이머를 사용하여 증폭시키고 수득되는 단편을 정제 후 효소 XhoI 및 EcoRI으로 절단시킨다. 이러한 방법에서 정확한 단편을 반응 혼합물로부터 침전시키고, 물에 넣어 리가제 반응에서 개방된 벡터 단편과 반응시킨다. 컴피턴트 INVαF' 세포를 상기 연결 혼합물로 형질전환시키고 선택 플레이트 상에 도말한다. 바람직한 발현 플라스미드를 함유하는 콜로니를 기술된 바와 같은 PCR 기술을 사용하여 확인한다. 플라스미드 DNA를 정확한 것으로 확인된 클론으로부터 수득한다. 상기 DNA를 문헌[Cregg J.M. 등]에 기술된 바와 같이 히스티딘에 대해 영양요구성인 피. 파스토리스 균주 GS115[Scorer C.A. et al., Biotechnology, 12:181-184, 1994]내로 도입시킨다. 형질전환시킨 후, 히스티딘에 대해서 원영양성이 된 콜로니를 프로카복시펩티다제 단백질의 발현에 대해서 조사한다. 이를 위해서, 문헌[Clare, J.J. et al., Gene, 105:205-212, 1991]에 기술된 바와 같이, 50개의 클론을 발현시킨다. 발현 종결시, 배양 배지 1㎖를 제거하고, 세포를 원심분리시켜 제거하고 투명한 상등액을 동결 건조시킨다. 상등액의 분취액을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석한다. 쿠마시 블루 염색 후, 일부 상등액 샘플에서는 45,000 dt 분자량 범위의 명백한 밴드가 나타나며, 이는 유도되지 않은 배양물의 상등액 샘플에서는 관찰되지 않는 것으로 나타난다. 이러한 밴드는 제조원(Chemicon, 주문 번호 AB1801)으로부터의 항-돼지 카복시펩티다제 B 항체의 웨스턴 블롯 분석에서 명백히 확인된다. 본 실험에서 최고의 수율로 생산하는 클론의 프로카복시펩티다제 B를 발현하며 실시예 2에 따라서 분리되는 100㎖ 배양물을 2ℓ교차-방지 진탕기 플라스크에서 배양시킨다.

실시예 2

본 실시예는 실시예 1에 따른 배양물 브로쓰의 상등액으로부터 사람 프로카복시펩티다제 B의 정제를 기술한다. 우선, 세포를 원심분리시켜 제거한다. 이후, 투명한 상등액을 대략 55%의 농도로 포화될 때까지 암모늄 설페이트로 처리한다. 침전된 단백질을 원심분리시켜 제거하고 펠렛을 1mM EDTA를 포함하는 50mM 트리스 HCl(pH 7.5) 5㎖ 중에 용해시킨다. 이후, 단백질 현탁액을 DEAE 셀룰로오스 크로마토그래피로 분리시킨다. 용출 크로마토그램을 0 내지 0.5M NaCl 농도 구배에 대해서 플롯팅한다. 목적하는 단백질을 함유하는 분획을 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 확인한다. 상기 분획을 합하고 한외여과시켜 농축시킨다. 보유액 중 단백질의 농도는 브래드포드 방법에 따른 단백질 측정법으로 결정한다. 이후, 이러한 방법으로 집적시킨 프로카복시펩티다제를 저장을 위해서 동결 건조시키거나 트립신 처리로 실시예 4에 따라서 직접적으로 활성화시킨다. 겔 전기영동으로 분리시킨 물질의 쿠마시 블루 염색 결과, 물질의 대략 60%가 약 45,000 dt 분자량의 단백질 밴드에서 확인되는 것으로 나타난다. 상기 밴드는 웨스턴 블롯에서 확인된 영역에 상응한다.

실시예 3

본 실시예는 (His)₄-프로카복시펩티다제 B의 합성을 위한 발현 벡터의 제조를 기술한다. 실시예 1에 기술된 과정을 따라서 작제를 수행한다. 프라이머 PPICCPBrev를 사용한다(실시예 1 참조). 정방향 프라이머를 변형하여 히스티딘에 대한 부가적인 4개의 코돈을 함유하도록 한다. 따라서, 프라이머 PCPBHisf의 서열은 서열 3과 같다.

서열 3

이러한 방법으로 작제된 피. 파스토리스 균주를 발현에 사용하며 HIS-프로카복시펩티다제 B 단백질은 용액 중 암모늄 설페이트로 침전시킨 후 니켈 친화성 크로마토그래피로 직접 정제한다. 사용되는 크로마토그래피용 지지체 물질은 제조원의 상세한 기술에 상응하는 "ProBond^TM NICKEL 킬레이팅 수지"(제조원: Invitrogen, 카탈로그 번호 R801-01)이다. 쿠마시 블루 염색 후, 겔 전기영동에 의한 분석 결과, 실질적으로 단지 하나의 가시적인 밴드가 나타나며, 이는 약 45,000 dt의 분자량을 갖는다. 이러한 밴드는 웨스턴 블롯 실험에서 사용된 항체에 의해 인식된다. 이러한 방법으로 정제된 물질을 한외여과시키고, 브래드포드 방법에 따라서 단백질 결정한 후, 저장을 위해서 동결 건조시키거나 실시예 4에 따라서 직접적으로 활성화시킨다.

실시예 4

본 실시예는 트립신을 사용한 반응에 의한 프로카복시펩티다제 B의 활성화를 기술한다. 이를 위해서, 실시예 2로부터의 동결 건조시킨 물질 22㎎을 0.1몰 트리스 HCl 용액(pH 7.8) 14㎖중에 용해시키고, 26℃로 가열하고 트립신 용액(0.1U/㎖) 15㎕와 혼합하고 3시간 동안 교반시키면서 항온처리한다. 이후, 상기 용액을 두유 트립신 억제제와 혼합하며, 트립신, 억제제, 카복시펩티다제 B로부터 제거된 프로펩타이드 단편들, 및 다른 성분들을 분자량 배척 한계가 30,000 dt인 Centriprep

필터 유니트(제조원: Amicon)를 사용하여 미세여과시켜 카복시펩티다제 B로부터 분리시킨다. 활성 카복시펩티다제 B를 5mM 트리스 완충액(pH 7.5)에서 동결시켜 저장한다. 특이적인 활성은 문헌[Folk, J.E., Meth. Enzym., 19:504-508, 1970]의 방법에 따라서 단백질 농도를 결정한 후 측정한다. 실시예 3에 따라 제조된 출발 물질을 사용하는 경우, 출발 물질 15㎎만을 활성화에 사용한다.

실시예 5

본 실시예는 모노-Arg 인슐린으로부터 인슐린을 제조하기 위한 트립신 및 프로카복시펩티다제 B의 혼합 사용을 기술한다. 문헌[유럽 특허원 EP-A 제0 347 781 호]의 실시예 6은 하나의 동일한 반응 용기에서 모노-Arg 인슐린과 트립신 및 카복시펩티다제 B의 반응을 기술하고 있다. 본 실시예에서는, 문헌[유럽 특허원 EP-A 제0 347 781호]의 실시예 6에서의 카복시펩티다제 B를 본 출원의 실시예 2로부터의 프로카복시펩티다제 B 15㎍ 또는 본 출원의 실시예 3으로부터의 프로카복시펩티다제 B 10㎍으로 교체시킨다. 두 반응 모두에서, 스톡 용액[유럽 특허원 EP-A 제0 347 781호의 실시예 6에 따른] 2.5㎕ 대신에 트립신 3㎕을 사용하여 트립신 농도를 증가시킨다.

Claims (18)

1. (a) 카복시펩티다제 B의 천연 전구체 형태를 미생물에서 발현 분비시키는 단계,

   (b) 발현 분비된 전구체 형태를 정제하는 단계, 및

   (c) 정제된 전구체 형태를 효소적 처리를 사용하여 활성 췌장 카복시펩티다제 B로 전환시키는 단계를 포함하며,

   이때 단계 (c)가 인슐린 또는 인슐린 유도체의 B, C 및 A 쇄를 포함하는 인슐린 전구체 형태의 존재하에서 적합한 반응 조건하에서 수행되며, 이러한 과정에서 성숙 인슐린 또는 성숙 인슐린 유도체가 형성되어 반응 혼합물로 부터 분리됨을 특징으로 하는,

   성숙 인슐린 또는 성숙 인슐린 유도체를 제조하는 방법
2. 제1항에 있어서, 췌장 카복시펩티다제 B가 사람 기원 유형인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 천연 전구체 형태가 프로카복시펩티다제 B와 상응하는 방법.
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5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 친화성 크로마토그래피에 의한 전구체 형태의 정제를 가능하게 하는 펩타이드 서열이 천연 전구체 형태에 부착되는 방법.
6. 제5항에 있어서, 친화성 크로마토그래피에 의한 정제를 위해서 부착된 서열이 1 내지 6개의 히스티딘 잔기인 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 발현을 위해 사용되는 미생물이 효모 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)인 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 효소 트립신, 엘라스타제, 인자 Xa, 키모트립신 또는 콜라게나제가 효소적 처리를 위해서 사용되는 방법.
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