SK279686B6

SK279686B6 - Spôsob hydrolýzy reťazca aminokyselín preproinzulí

Info

Publication number: SK279686B6
Application number: SK2711-91A
Authority: SK
Inventors: Michael D�Rschug; Klaus-Peter Koller; R�Diger Marquardt; Johannes Meiwes
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date: 1990-09-05
Filing date: 1991-09-03
Publication date: 1999-02-11
Also published as: CA2050606C; CZ283234B6; NO913474L; IE913117A1; FI103805B; EP0474212A2; AU637254B2; IL99383A0; KR920006504A; NO300980B1; AU8356791A; IL99383A; RU2062301C1; HRP940766A2; DE59108392D1; LV10508B; ZA917008B; YU147491A; LTIP712A; PL291617A1

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu konverzie preproinzulínov na inzulíny.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je spôsob hydrolýzy reťazca aminokyselín preproinzulínu všeobecného vzorca (I),

Doterajší stav techniky

Inzulíny pozostávajú z dvoch polypeptidových reťazcov , reťazca A, ktorý obsahuje 21 zvyškov aminokyselín a reťazca B s 30 zvyškami aminokyselín. A a B reťazce sú spolu spojené disulfidovými mostmi, pričom zvyšky cysteínu sú spolu spojené v polohe A7 a B7 ako aj A20 a B19. Tretí disulfidový mostík je medzi A6 a All. Zvieracie a ľudské inzulíny sa tvoria v slinivke brušnej vo forme preproinzulínu. Ľudský preproinzulín pozostáva napríklad z prepeptidu s 24 zvyškami aminokyselín, na ne sa pripojuje proinzulin s 86 zvyškami aminokyselín s nasledujúcou konfiguráciou: prepeptid-B-arg-arg-C-lys-arg-A, pričom C je reťazec aminokyselín s 31 zvyškami. V priebehu exkrécie z Langerhansových ostrovčekov sa odštiepi prepeptid a vznikne proinzulin. Konečne sa C-reťazec štiepi proteolyticky a vznikne účinný ľudský inzulín.

Génovo technické metódy dovolia v zvyšujúcej sa miere exprimovať preproinzulíny v mikroorganizmoch (EP-A-347 781, EP-A-367 163). Odštiepenie preprosekvencií sa robí spravidla chemicky alebo enzymaticky (DE-P-3 440 988, EP-A-0264250). Známe enzymatické metódy konverzie spočívajú na štiepení trypsínom a karboxypeptidázou B (Kemmler W. et al. J. Biol. Chem., 246 (1971) 6786-6791, EP-A-195 691, EP-B-89007). Nedostatkom týchto metód je vznik veľkého množstva vedľajších produktov, ktoré sa dajú len ťažko oddeliť z reakčného roztoku. Hlavne pri konverzii ľudského preproinzulínu na ľudský inzulín (humánny inzulín, Hl) vznikajú väčšie množstvá des-thr(B30)-humánneho inzulínu (des-thr(B30)-HI). Tento vedľajší produkt sa líši od Hl len tým, že chýba koncová aminokyselina a dá sa veľmi ťažko oddeliť z reakčného roztoku.

Na zníženie tvorby tohto vedľajšieho produktu sa môžu k štiepnej dávke pridávať určité ťažké kovy, predovšetkým nikel (EP-A-0264 250). Takéto vedenie reakcie nie je z hľadiska veľkovýroby na základe veľkého zaťaženia odpadovými vodami žiaduce. Je teda potrebné nájsť čo najšpecifickejšiu a pre životné prostredie znesiteľnú konverziu preproinzulínov.

Clostripain (clostriopeptidáza B, EC 3.4.22.8) je enzým z filtrátu kultúry Clostridium histolyticum s molekulovou hmotnosťou asi 30 000 až 80 000, ktorý má tak proteolytickú aktivitu, ako aj aktivitu amidázy esterázy (Mitchell, W. M„ Harington, W. F. J. of Biol. Chem. 243 (18), 4683, 4692, 1988). Vyznačuje sa veľkou špecifickosťou k väzbám arg-C. Tak sa v izolovanom reťazci B inzulínu arg-gly-väzba clostripainom 500krát rýchlejšie odštiepi než väzba lysala a v glukagone len arg-arg, arg-ala a lys-tyr. Rýchlosť hydrolýzy pre tieto väzby je vo vzájomnom pomere 1,1/7 1/300. (Labousse, B. Bull. Soc. Chim. Biol., 42,1293,1960). S prekvapením bolo teraz nájdené, že clostripain štiepi preproinzulín špecificky na terminálnom C za arginínom bez toho, aby u arginínu (B22) prítomného za ním v reťazci B prišlo k štiepeniu reťazca aminokyselín, ktoré by stálo za zmienku.

CA-1)	Gly-BE	K
(A-S)	Cyi-S-S
	I	(*-20)	(i-21)
(Λ-7)	1 1	-------Cya -	I - í3
	I	I
	I	\|			(I)
	s I	3
	I s	S
(B-2)		\|
Cya ——	-----Cys—		—)
	ζΒ-7)			(B-30)

v ktorom

R’ znamená n aminokyselín, pričom n je celé číslo 0 alebo 1, R² je vodík alebo chemicky alebo enzymaticky odštiepiteľná alebo peptid s 2 až 30 zvyškami aminokyselín,

R³ je hydroxyskupina, aminokyselina alebo peptid s 2 až 10 aminokyselinami,

X je L-arginín alebo peptid s 2 až 45 aminokyselinami, na ktorého terminálnom C a N je zvyšok L-arginínu

Y je geneticky kódovateľná aminokyselina, Zje geneticky kódovateľná aminokyselina,

Al až A20 alebo B2 až B29 je prirodzená alebo výmenou jedného alebo viacerých zvyškov aminokyselín zmenená sekvencia aminokyseliny ľudských alebo zvieracích inzulínov, spočívajúci v tom, že sa preproinzulín hydrolyzuje v prítomnosti clostripainu a prípadne sa karboxypeptidázou B prevedie na zodpovedajúci inzulín.

Sekvencia aminokyseliny peptidov a proteínov sa na N-terminálnom konci označí. Proteázy hydrolyzujú peptidovú väzbu medzi aminokyselinami peptidov a proteínov. Clostripain hydrolyzuje peptidy alebo proteíny obsahujúce L-arginín špecifický za arginínom. Ako reakčné produkty hydrolýzy preproinzulínu vznikajú deriváty inzulínu alebo polypeptidy, ktoré majú na terminálnom C zvyšok arginínu alebo aminokyseliny.

Pod pojmom prirodzené aminokyseliny sa rozumejú napríklad Gly, Ala, Ser. Thr., Val, Leu, Íle, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Eyp, Trp, Arg, Lys, Hyl, Orn, Cit alebo His.

Pod pojmom geneticky kódovateľné aminokyseliny sú napríklad Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro alebo selenocysteín.

Výhodné sú preproinzulíny všeobecného vzorca (I), v ktorom

R¹ je Phe,

R² vodík, prirodzená aminokyselina alebo peptid s 2 až 30 prirodzenými aminokyselinami, ich terminálne C končí L-arginínom,

R³ je hydroxyskupina, prirodzená aminokyselina alebo peptid s 2 až 10 prirodzenými aminokyselinami,

X je L-arginín alebo C-reťazec ľudského alebo zvieracieho proinzulínu,

Y je aminokyselina zo skupiny Thr, Ala alebo Ser,

Z je aminokyselina zo skupiny Asn, Gin, Asp, Glu, Gly,

Ser, Thr, Ala alebo Met,

Al až A20 alebo B2 až B29 je sekvencia aminokyseliny ľudských alebo zvieracích proinzulínov.

Obzvlášť výhodné sú preproinzulíny všeobecného vzorca (I), v ktorom

R¹ je Phe,

R vodík alebo peptid s 2 až 30 prirodzenými aminokyselinami, ktorý na terminálnom C končí L-argínom,

X je L-arginín alebo C-reťazec ľudského, bravčového alebo hovädzieho proinzulínu,

Y je Thr, Zje Asn,

A1 až A20 alebo B2 až B29 je sekvencia aminokyseliny ľudského, bravčového alebo hovädzieho inzulínu.

Najvýhodnejšie sú inzulíny, ktoré už boli navrhnuté v nemeckých patentových prihláškach P 39 19 852 a P 40 12 818.0. Napríklad InsuArg s nasledujúcou sekvenciou aminokyseliny:

NH2-Asp Thr Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly íle Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser íle Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn -CCOH

Clostripain (EC 3.4.22.8) je extraceluláma tiolproteáza z clostridienu. Enzým je heterodimér a nie je homologický s inými známymi tiolproteázami. Enzým má mimoriadne vysokú špecifickosť k väzbám Arg-XXX, hlavne Arg-Pro. Táto sa dá charakterizovať molekulovou hmotnosťou pohybujúcou sa medzi 30 000 až 80 000 izoelektrickým bodom, pH 4,8 až 4,9. Ako aktivátor pôsobí napríklad cysteín, merkaptoetanol, ditiotreitol alebo ióny kalcia.

V prítomnosti napríklad tozyl-lyzín-chlórmetylketónu, peroxidu vodíka, EDTA, Co²⁺, Cu²⁺, Cd ²⁺ , iónov albocitrátu dochádza k inhibícii clostripainu.

Clostripain sa vyrába fermentáciou pomocou mikroorganizmov. Pri tomto spôsobe sa clostridion kultivuje až do rozmnoženia clostripainu v živnom prostredí. Vhodné je napríklad Clostridium hystolyticum, hlavne Clostridium histolyticum DSM 627. Vhodné sú ale aj mutanty a varianty uvedených mikroorganizmov, pokiaľ syntetizujú clostripain.

Kultivácia sa robí anaeróbne buď samostatne alebo v zmesovej kultúre, napríklad submerzne v stojacej kultúre v neprítomnosti kyslíka alebo vo fermentátoroch, prípadne za zavádzania dusíka, vzácnych plynov alebo iných plynov, bez kyslíka. Fermentácia sa robí v rozmedzí teplôt asi 10 až 45 °C, výhodne asi 25 až 40 °C, hlavne potom pri 30 až 38 °C. Fermentácia sa robí v oblasti hodnôt pH medzi 5 až 8,5, výhodne medzi 5,5 až 8. Za týchto podmienok má kultivačná brečka všeobecne po 1 až 3 dňoch akumuláciu enzýmu, ktorá stojí za zmienku. Syntéza clostripainu spočíva v neskorej log-fáze a dosahuje svojho maxima v stacionárnej fáze rastu. Produkcia enzýmu sa môže sledovať pomocou testu aktivity (Mitchell W., Meth. of Enzým., zv. 47 (1977) strany 165-170).

Živný roztok použitý na výrobu clostripainu obsahuje 0,2 až 6 % výhodne 0,5 až 3 %, organických dusíkatých zlúčenín, ako aj anorganických solí. Ako organické dusíkaté zlúčeniny prichádzajú do úvahy: aminokyseliny, peptóny, ďalej masové extrakty, mleté semená, napríklad kukurica, pšenica, bôby, sója alebo bavlníkové rastliny, destilačné zvyšky z výroby alkoholov, mäsové múčky alebo kvasnicové extrakty. Z anorganických soli môže živný roztok obsahovať napríklad chloridy, uhličitany, sírany alebo fosforečnany alebo alkalické kovy alebo kovy alkalických zemín, železo, zinok a mangán, ale aj amónne soli a dusičnany.

Optimálne podmienky fermentácie sú síce pre každý mikroorganizmus rozdielne, ale buď sú už odborníkovi známe alebo sa dajú zistiť pomocou ľahkých predbežných pokusov. Čistenie clostripainu sa môže robiť klasickými spôsobmi, napríklad zrážaním cez alumíniumsulfonát, pomocou iónomeničov alebo pomocou gélovej permeačnej chromatografie. Agregácia enzýmu je možná bežnými metódami (Colowick a Kaplan, Meth. Enzymol., Vol. XLIV).

Na enzymatickú konverziu sa môžu používať tak celé bunky vo voľnej alebo imobilizovanej forme, ako aj izolovaný enzymatický produkt, ktorý môže byť rovnako viazaný na nosič.

Štiepenie preproinzulínov všeobecného vzorca (I) clostripainom sa robí vo vodnom prostredí, ku ktorému sa môžu pridávať rovnako s vodou miešateľné organické zložky, ako napríklad alkoholy, ketóny, močovina, N,N-dimetylformamid. K reakčnej dávke sa môžu predovšetkým pre ľahšiu kontrolu hodnoty pH reakcie pridávať zodpovedajúce anorganické alebo organické pufry ako fosfát, Tris, Glycín HEPES a. i. Koncentrácia preproinzulínu sa behom štiepenia pohybuje napríklad medzi 0,01 mg/ml až 100 mg/ml, výhodne medzi 0,1 mg/ml až 10 mg/ml. Pomer preproinzulínu k clostripainu robí / mg k unit (U) 1 : 0,01 až 1 : 1000, výhodne 1 : 0,1 až 1 : 50.

Teplota pri reakcii sa môže rovnako meniť v širokom rozmedzí. Výhodne ide o teplotný rozsah medzi 0 °C až + 80 °C, hlavne potom teplota pohybujúca sa medzi +20 °C až + 40 °C.

Hodnota pH variácie sa môže meniť medzi pH 4 až pH 12, hlavne výhodná je oblasť medzi pH 6 až pH 9.

Čas, ktorý je na konverziu preproinzulínov na zodpovedajúce intermediáty nevyhnutný, sa môže meniť podľa reakčných podmienok v širokom rozmedzí, napríklad sa môže pohybovať medzi 15 minútami až 48 h, výhodne sa reakcia pohybuje medzi 1 h až 6 h.

Enzým sa pred použitím aktivuje vhodným spôsobom v prítomnosti merkaptánu. Ako merkaptány prichádzajú pritom v zásade do úvahy všetky zlúčeniny, ktoré obsahujú SH-skupiny, výhodne sa používa DTT, DTE, merkaptoetanol, tioglykolová kyselina alebo cysteín. Koncentrácia merkaptánu sa môže meniť v širokom rozmedzí, výhodné sú koncentrácie medzi 0,1 mM až lOOmM. Aktivačný pufor obsahuje ďalej ióny Ca²⁺, výhodne CaCl₂. Aktivácia sa robí medzi pH 4 až pH 12, výhodne pri hodnote pH 6 až pH 8, najvýhodnejšia je oblasť pH 7 až pH 8. Na udržanie hodnoty pH sa môže pridať vhodná pufračná látka, napríklad Tris, HEPES, glycín a. i. Teplota aktivácie sa môže pohybovať medzi 0 °C až 60 °C, výhodná je oblasť 0 °C až 10 °C, najvýhodnejšie 0 °C až 5 °C. Takto aktivovaný enzým sa môže používať buď priamo, alebo sa prípadne môže pomocou chromatografie ccz R Ultrogel AcA 202 zbaviť aktivačného pufru.

Štiepenie preproinzulínu všeobecného vzorca (I) podľa vynálezu vedie k derivátom inzulínu so zvyškami arginínu na C-terminálnom konci inzulínu a k zodpovedajúcim odštepným aminokyselinám alebo peptidom. Deriváty inzulínu sa môžu prípadne previesť pomocou karboxypeptidázy B na zodpovedajúce inzulíny. To sa môže stať súčasne s clostripainom v rovnakej reakčnej várke, ale aj za reakčných podmienok, uvedených, po sebe, pričom sa derivát inzulínu môže prípadne pred spracovaním s karboxypeptidázou B izolovať známymi metódami, napríklad chromatograficky alebo kryštalizáciou. Karboxypeptidáza B sa môže použiť v rozpustenej alebo imobilizovanej forme. Pomer karboxypeptidázy B k derivátu inzulínu robí (hmotnosť ku hmotnosti) asi 1 : 10 až 1 : 5000, výhodne asi 1 : 500 až 1 : 5000 a najvýhodnejšie asi 1 : 1000 až 1 : 3000.

Pomer karboxypeptidázy' B ku clostripainu je (hmotnosť ku hmotnosti) asi 1 :1 až 10 :1 a výhodne 2 :1 až 5 : 1.

Reakčné produkty štiepenia clostripainu alebo karboxypeptidázy B sa môžu napríklad vyzrážať znížením hodnoty pH alebo sa môžu čistiť pomocou známych metód stĺpcovej chromatografie. Získaný inzulín sa môže pripraviť v obvyklých formách na podávanie a ako liečivo na liečenie diabetu mellitus (úplavice cukrovej).

Príklady uskutočnenia vynálezu

V nasledujúcich príkladoch je spôsob podľa vynálezu podrobne opísaný. Údaje o percentách sa týkajú hmotnostných percent. Ak to nie je uvedené inak.

Príklad 1

Kultivácia Clostridium histolyticum DSM 627 sa robí v

živnom roztoku nasledujúceho zloženia:
Kazeínpepton	3 %
mäsový extrakt	3 %
kvasnicový extrakt	0,5 7»
cysteín	0,05 %
KH₂PO₄	0,15 %
pH 7,2

Naočkuje sa 1 % predkultúra. Kultivácia sa robí v uzatvorených fľašiach za anaeróbnych podmienok pri 37 °C asi 2 dni. Kmeň mikroorganizmov sa uchováva v uvedenom živnom roztoku s 50 % glycerínu pri - 20 °C. Fermentor sa naočkuje 1 % predkultúry. Očkuje sa fermentor s obsahom 10 1 a 8 1 živného roztoku. Kultivácia sa robí pri zaplynovaní dusíkom, pri 33 °C, 24 h, a konštantnom pH 7,0. Vo filtráte kultúry bola namierená aktivita enzýmu 20 000 U/l (Mitchell W., Meth. of Enzým., zv. 47, str. 165 -170,1977).

Spracovanie sa robilo odstredením buniek asi pri 6000 g, sterilnou filtráciou cez filter s veľkosťou pórov 0,22 pm, prídavkom 60 % ľadovo studeného (-20 °C) metanolu k filtrátu. Potom bol roztok udržiavaný 24 h pri -20 °C a potom odstredený (8000 g). Peleta bola rozpustená v sterilnej bidestilovanej vode a vzniknutý roztok sa odstredil (12 000 g). V pelete bola nameraná aktivita enzýmu 300 U/ml, 200 U/mg proteínu. Výťažok predstavoval 75 % nameranej aktivity vo fermentore.

Príklad 2

Kultivácia buniek sa robila rovnako ako v príklade

1. Produkčné médium vo fermentore pozostávalo z: proteáza pepton (Difco) 5 % cysteín 0,05 %

KH₂PO₄ 0,15 % pH 7,2 a bola naočkovaná 2 % predkultúry

Aktivita clostripainu bola vo filtráte kultúry 45 000 U/ml.

Spracovanie sa robilo tangenciálnou-flow-filtráciou na 0,3 pm membránach (Filtron, Omega Membrán) na oddelenie buniek a tangenciálnou-flow-filtráciou na 10 KD membránach (Filtron, Omega Membrán) na nakoncentrovanie rozpusteného clostripainu. Činiteľ nakoncentrovania predstavuje 20. Potom bol koncentrát deionizovaný a chromatografovaný cez DEAE-celulózu. Aktivita clostripainu lOOOU/ml, výťažok 85 %. Uskladnenie až do použitia enzymatického preparátu sa vykonáva pri -20 °C.

Príklad 3

A. Aktivácia clostripainu pl enzymatického preparátu (200 U/ml, 286 U/mg z príkladu 1) pl aktivačného pufru (250 mM DTT, 152 mM CaCl₂) Obsah v dávke:

DTT 5 mM

CaCl₂ 2,5 mM

- inkubácia 2 h na ľade na štiepiacu reakciu sa enzým zriedi v pomere 1 : 40 mM Tris/HCl pufru, pH 7,8

B. Štiepna dávka clostripainu na uvoľnenie (B31) Arginzulínu

100 pl Insu-Arg (1 mg/ml) pl Kel (1 M) pl Tris/HCI/IM, pH 7,8/ pl H₂O pl clostripainu (zriedenie 1/40) obsah v dávke:

Insu-Arg clostripain DTT Tris/HCl

KC1

0,5 mg/ml

2,5 U/ml

12,5 pM mM

100 mM

CaCl₂ 6 pM inkubácia 1 až 2 h pri 28 °C, reakcia sa môže ľahko kontrolovať pomocou HPLC, potom zastavenie reakcie s tosylL-lyzínchlórmetylketónom (TLCK),

- zastavenie reakcie prídavkom 1 pl TLCK (15 mM)

- skladovanie pri 4 °C

- výsledok: humánny inzulín-Arg. Pomocou HPCL nie je namerateľný žiadny humánny inzulín (DesB30).

C. Štiepna dávka karboxypeptidáza B na uvoľnenie ľudského inzulínu

200 pl štiepnej dávky clostripainu pl karboxypeptidázy B (zriedený 1:100)

- obsah karboxypeptidázy v dávke: 2,5 pg/ ml

- inkubácia 2 až 4 h pri 28 °C, reakcia sa dá ľahko preskúšať pomocou HPLC

- na reakciu sa karboxypeptidáza B (750 U) ml, 150 U/mg, z pankreasu prasiat (zriedi v pomere 1 : 1000 25 mM Tris) HCI pufru, pH 7,8

- výsledok: ľudský inzulín, žiadna tvorba inzulínu (DesB30), ktorý je merateľný pomocou HPLC,

D. Analytika HPLC

Štiepenie bolo kontrolované s použitím RP 18 stĺpca (0,125 M NH₄(SO₄)₂, s H₂SO₄ nastavené na hodnotu pH 4, 25 - 50 % gradient acetonitrilu), prípadne C 8 stĺpca (0,1 % TFA, 20 % - 50 % gradient acetonitrilu).

Príklad 4

Clostripain: 200 U/ml ( z príkladu 1) aktivačný pufor:

500 mM Tris/HCl, pH 7,8

100 mM DTT mM CaCl₂

Aktivácia:

100 μΐ roztoku clostripainu pl aktivačného pufru

Skladacia várka:

35,7 mg ľudského pre-B-reťazec-A-reťazec inzulínu-S-sulfonátu

315 μί IM merkaptoetanolu

105 μΐ IM kyseliny askorbovej

100 ml 20 mM glycínového pufru, pH 10,7

Skladanie sa vykonávalo cez noc v chladničke pri 4 °C, výťažok skladania predstavoval 0,152 mg/ml. Po oddelení nečistôt znížením pH pri pH 5,0 sa pridá Tris v konečnej koncentrácii 50 mM a hodnota pH sa nastaví pomocou HCI na 7,8. Pridalo sa 30 μί roztoku enzýmu. Štiepenie sa robilo pri 30 °C a sledovalo pomocou HPLC.

Výsledok: Uvedený preproinzulín sa dá Štiepiť na ľudský inzulínArg. Tvorba inzulínu (DesB30) je minimálna,

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob hydrolýzy reťazca aminokyselín preproinzulínu, vyznačujúci sa tým, že sa preproinzulín všeobecného vzorca (I), (A-Π Gly-NB---CA-6) Cys-s-3 :a-7) Cy»—- Cys— | ΪΑ-11)

S

I (B-2) | ft2.Ri.HN-m—cys-----•x .Cys - 1 - ft3

S

I s

•cys---------0-7)

0-19)

0-30) v ktorom

R¹ znamená n aminokyselinových zvyškov, pričom n znamená celé číslo O alebo 1,

R² znamená vodíkový atóm, chemicky alebo enzymaticky odštiepiteľný aminokyselinový zvyšok, alebo peptidový zvyšok s 2 až 30 aminokyselinami,

R³ znamená hydroxyskupinu, aminokyselinový zvyšok alebo peptidový zvyšok s 2 až 10 aminokyselinovými zvyškami,

X znamená L-arginínový zvyšok alebo peptidový zvyšok s 2 až 45 aminokyselinami, na ktorého C-terminálnom konci je L-arginínový zvyšok

Y znamená zvyšok geneticky kódovateľnej aminokyseliny , Z znamená zvyšok geneticky kódovateľnej aminokyseliny a A-l až A-20 a B-2 až B-29 znamená prirodzenú alebo výmenou jedného, alebo viacerých zvyškov aminokyselín zmenenú aminokyselinovú sekvenciu ľudského, alebo zvieracieho inzulínu, v koncentrácii 0,01 až 100 mg/ml hydrolyzuje za prítomnosti clostripainu pri hodnote pH v rozmedzí 4 až 12, pri reakčnej teplote 0°c až 80°C a pri pomere preproinzulin/clostripain 1:0,01 až 1:1000, vyjadrené v mg/unit a prípadne sa pomocou karboxypeptidázy B prevedie na zodpovedajúci inzulín.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa hydrolyzuje preproinzulín všeobecného vzorca (1), v ktorom

R¹ znamená fenylalanínový zvyšok,

R² znamená vodíkový atóm, zvyšok prírodnej aminokyseliny alebo peptidový zvyšok s 2 až 24 prírodnými aminokyselinami, ktorá končí na C-terminálnom konci L-arginínom,

R³ znamená hydroxyskupinu, prírodný aminokyselinový zvyšok alebo peptidový zvyšok s 2 až 10 aminokyselinovými zvyškami,

X znamená L-argininový zvyšok alebo C-reťazec ľudského, bravčového alebo hovädzieho proinzulínu

Y znamená aminokyselinový zvyšok zo skupiny Thr, Ala, alebo Ser,

Z znamená zvyšok aminokyseliny zo skupiny Asn, Gin, Asp, Glu, Gly, Ser, Thr, Ala, Met a

A-l až A-20 a B-2 až B-29 znamená aminokyselinovú sekvenciu ľudského alebo zvieracieho inzulínu.
3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že sa hydrolyzuje preproinzulín všeobecného vzorca (I), v ktorom

R¹ znamená fenylalanínový zvyšok

R² znamená vodíkový atóm alebo peptidový zvyšok s 2 až 30 prírodnými aminokyselinami, ktorý končí na C-terminálnom konci L-arginínom,

R³ znamená hydroxyskupinu, prírodný aminokyselinový zvyšok alebo peptidový zvyšok s 2 až 10 aminokyselinovými zvyškami,

X znamená L-arginínový zvyšok alebo C-reťazec ľudského, bravčového alebo hovädzieho proinzulínu,

Y znamená treonínový zvyšok a

Z znamená asparagínový zvyšok a A-l až A-20 a B-2 až B-29 znamená aminokyselinovú sekvenciu ľudského, bravčového alebo hovädzieho inzulínu.
4. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že sa pracuje pri hodnote pH v rozmedzí 6 až 9.
5. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že sa koncentrácia preproinzulínu všeobecného vzorca I pohybuje v rozmedzí 0,1 až 10 mg/ml.
6. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že pomer preproinzulínu ku clostripainu v mg /unit je 1:0,l a 1:50.
7. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že reakčná teplota je v rozmedzí 20 až 40 °C.
8. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých nárokov 1 až 7, vyznačujúci sa tým, že súčasne je prítomná karboxypeptidáza B alebo sa použije po štiepení clostripainom.
9. Spôsob podľa jedného alebo niekoľkých nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že sa clostripain a/alebo karboxypeptidáza B vyskytuje v imobilizovanej forme.