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JP2660095B2 - 大腸菌分泌性株 - Google Patents

大腸菌分泌性株

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Publication number
JP2660095B2
JP2660095B2 JP2500321A JP50032189A JP2660095B2 JP 2660095 B2 JP2660095 B2 JP 2660095B2 JP 2500321 A JP2500321 A JP 2500321A JP 50032189 A JP50032189 A JP 50032189A JP 2660095 B2 JP2660095 B2 JP 2660095B2
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coli
bacterium
medium
dna sequence
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JP2500321A
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ルン，チャールズ・エイ
ナルラ，サトワント・ケイ
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Schering Corp
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Publication date
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組み換えベクターによって形質転換され、ヘ
テロな組み換えタンパク質を培地中に分泌することので
きる大腸菌（E.coli）変異株と、そのような株を産生
し、同定する方法に関する。本発明はまた、正しい立体
構造をとり生物学的に活性のあるヘテロな組み換えタン
パク質を産生するための、そのような形質転換体の使用
方法に関する。
発明の背景 組み換えDNA技術の手法によって、比較的大量の生物
学的に重要なポリペプチドおよびタンパク質の産生が可
能になってきた。この仕事の多くの領域で、細菌Escher
ichia coli（大腸菌）は組み換えベクターの発現用の宿
主生物として用いられてきたが、この細菌の利用は非常
に限定されている。その物理的構造のため、組み換えポ
リペプチドまたはタンパク質の遺伝子を発現しているE.
coli細菌は一般に、物理的、化学的または酵素的手段に
よって、組み換え産物が単離され得る前に破壊されてし
まう。
E.coliおよびその他のグラム陰性細菌は、タンパク質
が合成される細胞質中心部および複雑な細胞膜構造によ
って特徴づけられる。脂質がリンクされた多数のオリゴ
糖が結合している外膜が存在する。病原性グラム陰性細
菌が動物に感染すると、これらの表面オリゴ糖に特異的
な抗体の産生は疾病の経過の決定に重要となり得る。
外膜の内側は、主な細胞の浸透性のある障壁である細
胞膜である。この膜は、ある種の栄養とその他の化合物
を、その他のものを排除する一方で、細胞の中へまたは
外へ通過させるタンパク質を含んでいる。
外膜と細胞膜の間はペリプラズミック領域またはペリ
プラズム（周辺質）である。この領域は外膜と接してお
り、高度に交差結合した壁様タンパク質複合体であるペ
プチドグリカンと、細胞に剛性を与えるオリゴ糖を含ん
でいる。
E.coliによって合成されるタンパク質の多くは細胞質
中に残っているが、ペリプラズムで見いだされるものも
ある。細胞質中からペリプラズムに輸送されるタンパク
質は“シグナルペプチド”を含んでおり、これは、タン
パク質のアミノ末端にペプチド結合によって共有結合さ
れており、細胞膜を通過する輸送を促進する。E.coliに
おけるいくつかのペリプラズムのタンパク質の例を挙げ
ると、β−ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼおよ
びある種の核酸分解酵素、ペプチド分解酵素およびタン
パク質分解酵素である。ペリプラズムのタンパク質のシ
グナルペプチドは、一般に輸送の過程でいくつかのポイ
ントで切断され、ペリプラズムに“成熟した”構造のタ
ンパク質を残す。
E.coliを利用した組み換えタンパク質の産生の過程
で、ヘテロな、または外来の遺伝子の発現産生物は一般
に細胞質ゾル中に集積する。このようなタンパク質はし
ばしば沈澱し不溶性の“封入体（inclusion）”または
“屈折体”を形成する。このような形態となった組み換
えタンパク質は、本来の構造をとっておらず生物学的に
活性はない〔Mitraki et al.,Bio/Technology 7:690
（1989）〕。有用な形態にあるそのようなタンパク質を
単離するためには、細菌は破壊されなければならず、そ
して不溶性画分にあるタンパク質は、清浄剤または尿素
やグアニジン−ヒドロクロリドといったカオトロピック
剤を用いて可溶化させなければならない。このようにし
て可溶化されたタンパク質はその本来の構造を保ってい
ないため、それらはBuilder et al．（欧州特許公開第
114 506号）によって記載されているような、比較的複
雑な方法によって正しい構造に再び戻さなくてはならな
い。
細胞質細胞封入体中に蓄積しないヘテロなタンパク質
の産生に組み換えDNA法を利用しようとする企てにおい
て、Villa-Komaroff et al．〔Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 75:3727（1978）〕はE.coliのβ−ラクタマーゼ遺伝
子中にラットのプレプロインスリン遺伝子を挿入した。
すでに言及したように、ｂ−ラクタマーゼはペリプラズ
ミック酵素で、前駆体の形状ではシグナルペプチドを持
っている。β−ラクタマーゼ／プレプロインスリン融合
遺伝子の発現によって生じる融合タンパク質は上述した
輸送機構によってペリプラズムに輸送される。
同様に、Gilbert et al.,（欧州特許公開第006 694
号）は、ペリプラズムにあるタンパク質のシグナルペプ
チドをコードしているDNA塩基配列と融合された、所望
の外来タンパク質をコードしている遺伝子を含むDNA塩
基配列の発現による、遺伝学的に作製された融合タンパ
ク質の産生を開示している。
本来の輸送過程をわずかにさらに利用して、Silhavy
et al．（米国特許第4,336,336号）は細菌の外膜へ輸
送される融合タンパク質の産生法を記載している。この
方法は、細胞質にある細菌タンパク質をコードする遺伝
子と、非細胞質担体タンパク質の遺伝子との融合、およ
びそれによって外膜に輸送される融合タンパク質を産生
することを含んでいる。Silhavy et al．はまた、この
方法は外来遺伝子（例えば真核生物のタンパク質をコー
ドしている遺伝子）をすでに構築された融合遺伝子中に
挿入するのに利用され得ると開示している。
しかしながら前述の過程では、所望の組み換えタンパ
ク質は、細胞の外膜を越えて輸送されてはいない。どの
場合も、タンパク質を回収するためにやはり細胞は破壊
されなければならない。その結果、無数の細菌のタンパ
ク質もまた放出され、所望のタンパク質の単離をさらに
困難で複雑なものにしている。そのうえ細菌のタンパク
質に融合された産物を産生する過程では、その産物は通
常、所望のタンパク質を産生するために切断されなけれ
ばならない。この過程は複雑になり，変成条件の利用を
伴い、完全な生物活性を持ったタンパク質の回収を困難
にし得る。
さらに最近では、Sakaguchi et al．〔Agric.Biol.C
hem.52:2669（1988）〕はE.coli発現ベクター中で顆粒
球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）をコー
ドしている遺伝子へのompAシグナル配列をコードしてい
るDNA配列の融合を報告している。E.coli HB101を形質
転換し、発現した後、あるGM-CSFが培地中に分泌される
ことが見いだされている。
培地中に様々なペリプラズミック酵素を漏出するE.co
li変異株が作製されている。例えばLopes et al．〔J.
Bacteriol.109:520（1972）〕はニトロソグアニジンの
ような変異誘起物質でE.coli細胞を処理し、リボヌクレ
アーゼＩ、エンドヌクレアーゼＩおよびアルカリホスフ
ァターゼを分泌する“ペリプラズミック漏出性”変異株
を産生した。同様にAnderson et al．〔J.Bacteriol.1
40:351（1979）〕とLazzaroni et al．〔J.Bacteriol.
145:1351（1981）〕は免疫沈降またはSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を用いて、ペリプラズミック漏出
性変異株の解析において、分泌されたペリプラズミック
タンパク質の検出を行っている。
このような変異株の漏出は、浸透性を増加させる細菌
外膜の正常な構成要素の欠落を反映していると信じられ
ている。培地中に組み換えタンパク質を分泌することを
目的として作製された漏出性変異株はない。代わりに、
細菌の表面膜の構造と機能および、膜構造中にある様々
な酵素の局在の解析することで、それらの構築は行われ
てきたようにみえる。
さらに最近では、Zinder et al．（米国特許第4,59
5,658号）は細菌中で合成されたタンパク質の外部への
放出を促進する方法を開示している。この方法は、プラ
スミドまたは細菌の染色体へ、f1バクテリオファージの
遺伝子IIIの全てまたは一部を導入することを伴ってい
る。遺伝子の発現によって産生されたf1バクテリオファ
ージ遺伝子IIIタンパク質は細菌外膜を乱し、細胞から
のペリプラズミックタンパク質の漏出を引き起こす。
Zinder et al．はさらに、彼らの漏出性変異株は、
所望のタンパク質をコードしている遺伝子を、ペリプラ
ズミック空間へ該タンパク質を輸送することのできるリ
ーダーをコードしているDNA配列へ融合する方法によっ
て、遺伝学的に作製された融合タンパク質の産生に利用
され得ることを開示している。Zinder et al．は、し
かしながら、どのようにしてそのような融合を行うかに
ついての教示および、その方法が仮定どおりに実際に働
くことを示す例を提供していない。実際に示されている
ことの全ては、変異株において本来のβ−ラクタマーゼ
が周囲の培地中に細胞から漏出されているということで
ある。
誤ったアミノ酸鎖の折り畳みとタンパク質の変性は、
細胞質中で成熟した組み換えタンパク質と関連してい
て、細胞外に運び出されたタンパク質には普通生じない
ため、E.coli分泌性株を作製し利用するための信頼性の
ある方法が必要である。
発明の概要 本発明は、生物学的に活性のあるヘテロな遺伝子産物
を培地中に分泌することのできるE.coli細菌を提供し、
以下のものを含んでおり： （ａ）バクテリオファージT7による感染に耐性があり、
培地中に十分量のペリプラズミックタンパク質を分泌す
る能力をもつE.coli細菌、および （ｂ）所望のヘテロなタンパク質をコードしている第二
のDNA配列に作用的に連結されたペリプラズミック空間
へのタンパク質の輸送を媒介することのできるシグナル
ペプチドをコードしている第一のDNA配列を含む組み換
えベクター、 この細菌は両方のDNA配列を発現することができる。
本発明はさらに以下のものを含む、所望のタンパク質
を産生するための方法を提供する： （ａ）培地中に、生物学的に活性のあるヘテロなタンパ
ク質を分泌することのできる、以下のものを含むE.coli
細菌の培養 （ｉ）バクテリオファージT7による感染に耐性があり、
培地中に十分量のペリプラズミックタンパク質を分泌す
る能力をもつE.coli細菌、および （ii）所望のヘテロなタンパク質をコードしている第二
のDNA配列に作用的に連結されたペリプラズミック空間
へのタンパク質の輸送を媒介することのできるシグナル
ペプチドをコードしている第一のDNA配列を含む組み換
えベクター、 ここで、上記培養は、該細菌が両方のDNA配列を発現
し、培地中にヘテロなタンパク質を分泌するような条件
下で行う；および （ｂ）培地中からの分泌されたタンパク質の単離。
本発明はさらに、生物学的に活性のあるヘテロな遺伝
子産物を培地中に分泌することのできる、以下のものを
含むE.coli細菌を作製し同定するための方法を提供す
る： （ａ）E.coli細菌を、該細菌のDNAに突然変異を引き起
こすために十分量の変異誘起剤で処理すること； （ｂ）ステップ（ａ）で産生された変異株から、バクテ
リオファージT7の感染耐性と、培地中への十分量のペリ
プラズミックタンパク質の分泌能ために、クローンを選
択すること； （ｃ）ステップ（ｂ）で選択されたひとつまたはそれ以
上のクローンを、所望のヘテロなタンパク質をコードし
ている第二のDNA配列に作用的に連結されたペリプラズ
ミック空間へのタンパク質の輸送を媒介することのでき
るシグナルペプチドをコードしている第一のDNA配列を
含む組み換えベクター（この組み換えベクターは細菌内
において両方のDNA配列の発現を制御することができ
る）によって形質転換すること；および （ｄ）形質転換されたどのクローンが培地中に十分量の
ヘテロなタンパク質を分泌しているかを決定するために
分析すること。
好適な態様では、形質転換されたクローンの分析は以
下のことを含む方法によって行われる： （ａ）培養されたコロニーの一部がメンブレン（膜）の
一方の側の上にトランスファーされるような条件下で、
形質転換され分散して培養された細菌と第一のニトロセ
ルロースメンブレンを接触させること； （ｂ）ステップ（ａ）の第一のメンブレンのもう一方の
面を、メンブレンの集合体を作製するために増殖培地と
接触している第二のニトロセルロースメンブレンと接触
させること； （ｃ）トランスファーされた細菌によって分泌された生
物学的に活性のあるタンパク質が第一のメンブレンから
第二のメンブレンに移行するような条件下で、メンブレ
ンの集合体をインキュベートすること； （ｄ）メンブレンを分離し、ステップ（ｃ）の第二のメ
ンブレンを、特異的な抗体−タンパク質複合体を形成す
る条件下で、該タンパク質に特異的な第一の抗体と接触
させること； （ｅ）結合しなかった物質を除去するために、ステップ
（ｄ）の第二のメンブレンを洗浄すること； （ｆ）洗浄したメンブレンを、第一の抗体−タンパク質
複合体がメンブレン上に存在する所において、目に見え
る反応が起きる条件下で、目に見えるフォーカスを生じ
させるために、第一の抗体に特異的であるラベルされた
第二の抗体と接触させること；そして （ｇ）目に見えるフォーカスを、培養している細菌のコ
ロニーと並べて調整し（aligning）、それによって培地
中に十分量のタンパク質を分泌することが可能な細菌を
同定すること。
好適には、第一の抗体が生物学的に活性のあるタンパ
ク質に特異的に結合し、変性した（すなわち誤って折り
畳まれた）形態のタンパク質に結合しないことが望まし
い。
図面の簡単な説明 本発明は付随する図面を参照することで更に容易に理
解されることができる。ここにおいて： 図１は、分析的なニトロセルロースメンブレンの写真
で、目に見えるフォーカスを示しており、そこでは分泌
されたインターロイキン−４が存在していた。インター
ロイキン−４は、タンパク質に特異的な多価抗血清を用
いたメンブレンの最初の処理と、次に抗−インターロイ
キン−４抗血清に特異的なラベルされた抗血清を用いた
処理によって可視化された。矢印は、クローニングおよ
び更なる評価のために選択された、分泌性コロニーを示
す特に強いスポットを指している。
図２はプラスミドpRGT857-11の構造を図式的に示して
いる。
発明の説明 当業者によって通常利用される組み換えDNA技術の方
法の多くはCohen et al．（米国特許第4,237,224
号）、Collins et al．（米国特許第4,304,863号）お
よびManiatis et al．（Molecullar Cloning:A Labora
tory Manual,1982,Cold Spring Harbor Laboratory）に
よって記述されている。これらおよびここで引用される
その他の全ての参考文献はこれによって参考文献にその
まま組み入れられる。
本発明は、E.coliを、培地中に直接ヘテロなタンパク
質を分泌するように修正し得るという驚くべき発見に基
づいている。ここで用いたように、用語“ヘテロなタン
パク質”は、哺乳動物のタンパク質のように通常はE.co
liによって作られないタンパク質を意味している。本発
明により、通常行われる細胞の破壊および／またヘテロ
なタンパク質を単離する過程における清浄剤またはカオ
トロピック剤を用いた抽出の必要がなくなった。
この結果は二つの主要な進展によってもたらされた。
まず第一に、組み換えDNA方法論が、ペリプラズミック
空間への、またはそれを越えて、タンパク質の輸送を媒
介することのできるシグナルペプチドに融合された、所
望のヘテロなタンパク質を産生することに用いられてき
た。第二に、細菌の膜が、タンパク質を透過できるよう
に、細菌のDNAの突然変異によって、変化させられてき
た。
分泌性の細菌と本発明の方法を用いて産生されたタン
パク質は完全な生物学的活性を持っており、正しく折り
畳まれた構造をとっていると信じられている。従って、
従来技術によってE.coliから生物学的に活性のある組み
換えタンパク質を得るために一般に必要とされた操作は
除去されている。
広範な種類のE.coli株が本発明で用いることができ、
C600,W3110,AB1157,P678,C511,HB101,MM294,JM83および
TB1を含むがこれらに限定されてはいない。以下に示す
実施例では、突然変異に先立ち、商業的に入手可能なMM
294株がストレプトマイシン耐性株に転換された（294S
と称する）が、それは、本発明とは全く関係しない理由
による。しかし、MM294株またはその他の入手可能なE.c
oli株の多くを、代わりに用いることができる。
細菌の変異誘起はいかなる標準的な公知技術によって
も行うことができる。以下に示す実施例では、変異誘起
源として紫外線照射を用いているが化学的作用剤も同様
に使用可能である。例えば、Lopes et al.,supra，ま
たはLazzaroni et al.,supra．に記載されているよう
に、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ンも使用できる。
本発明における使用に適したE.coli変異株は二つの重
要な基準で特徴づけられる−−バクテリオファージT7に
よる感染耐性と、変異株が増殖している培地中への十分
量のペリプラズミックタンパク質の分泌能である。T7に
よる感染耐性の分析はBranes et al．〔J.Bacteriol.1
54:1462（1983）〕による記述に従って従来法で行うこ
とが可能であり、以下に述べられている。
ペリプラズミックタンパク質の透過性の増大の分析
は、マーカーとしてのいかなる既知のペリプラズミック
タンパク質と、選択されたタンパク質のための容易に可
視化できる適切な方法を用いて行うことが可能である。
以下に示す実施例では、ペリプラズムからのリボヌクレ
アーゼＩの分泌は、分泌された酵素が酵母RNAを含んで
いる寒天中に“ハロ”または透明な区域を生み出すこと
ができる能力を観察することによって検出される。も
し、アンピシリン耐性E.coli株が用いられる場合は、分
泌されたβ−ラクタマーゼの分析は、Zinder et al.,s
upra，による記述などによって行うことが可能である。
多くのヘテロなタンパク質は本発明の方法によって産
生され得る。ヒトインターロイキン−４は、以下に本発
明を説明するために用いられているが、原則としてタン
パク質をコードするDNA配列に従っていかなるタンパク
質も作製することが可能であり、得ることが可能であ
る。そのようなDNA配列は例えば、タンパク質を産生し
ていることが分かっている細胞から単離したmRNAから用
いてcDNAを作製する標準的なクローニング法を行うこと
によって、容易に作製することができる。そのようなcD
NAから構築されるライブラリーは標準的な方法によって
作製し、プローブを用いて検索することが可能である。
実際、ヒトGM-CSFおよび可溶性ガンマインターフェロ
ン受容体は本発明の分泌性株を利用して産生されてい
る。どちらも高いレベルの生物学的活性を示している。
必要とされる方法論は例えばOkayama et al．〔Mol.
Cell.Biol.2:161（1982）Meth.Enzymol.154:3（198
7）〕、Margolskee et al．〔Mol.Cell.Biol.8:2837
（1988）〕およびGubler et al．〔Gene 25:263（198
3）〕によって記述されている。cDNAクローニング法の
レビューとしてはKimmel et al.,Meth.Enzymol.152:30
7（1987）を参照のこと。標準的な化学的合成法による
遺伝子の作製も、もしヌクレオチドの配列が既知であれ
ば、行うことが可能である。
E.coliの細胞質内で合成されたタンパク質はペリプラ
ズムへの輸送のためにアミノ末端にシグナルペプチドを
融合させなければならない。既知のE.coliのペリプラズ
ミック膜タンパク質または外膜タンパク質のシグナルペ
プチドの多くはこの目的に用いることが可能である。例
えば、Talmadge et al.,〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
7:3369（1980）〕はpBR322のbla遺伝子を含むpKT287と
称されるベクターの構築を記述している。blaによって
コードされる最初の23アミノ酸はβ−ラクタマーゼのシ
グナル配列を含んでいる。pKT287のPstＩサイト（部
位）にフレームを合わせて遺伝子が挿入されると、発現
の間にシグナルペプチドを含んだ融合タンパク質が産生
されるであろう。プラスミドpKT287はManiatis et a
l.,supraによって428ページに示されている。
同様に、SilhavyはE.coliのompFシグナルペプチド（M
aniatis et al.,supra,pp.429-430）をコードする遺伝
子を含むpMH621を称されるプラスミドを調製した。pMH6
21のBglIIサイトに所望のタンパク質をコードしている
ヘテロなDNA配列を挿入するとompFのシグナルペプチド
を含む融合タンパク質が産生されるであろう。以下に述
べる実施例では、別のompシグナルペプチドである,ompA
ペプチドが使用された。
ompAおよびompFはE.coliの外膜タンパク質のためのシ
グナルペプチドである。これらのシグナルペプチドのア
ミノ酸配列はPollitt et al.,in Bacterial Outer Mem
branes as Model Systems,1987,M.Inouye（ed）,John W
iley ＆ Sons,New York,pp.117-139によって開示されて
いる。Watson〔Nucleic Acids Res.12:5145（1984）〕
は277以上の原核および真核細胞生物のシグナル配列の
一次構造がいまや知られていることを開示している。こ
のような原核生物のシグナル配列を持っているオリゴヌ
クレオチドは、ホスフォトリエステルまたはその他の既
知の方法（固相系が望ましい）を用いて、本発明におい
て使用するために化学的に合成され、適切な発現ベクタ
ー中に挿入されることができる。
アミノ酸配列は異なっていても、細菌のシグナルペプ
チドは３つの共通領域を保持しているようである。アミ
ノ末端にはひとつまたはそれ以上のリジンあるいはアル
ギニン残基を含む数個の親水性残基からなる領域があ
る。この塩基性領域に続いて、中心部にはLeu,Alaおよ
びValが多い、約８から15の疎水性残基を含む疎水性の
核がある。疎水性領域のカルボキシル側はペリプラズム
または外膜において成熟したタンパク質を産生するため
の過程で切断される領域が存在する。切断は通常、疎水
性領域から約４から８残基のところで起きる。
以下に示す実施例では、ompAシグナルペプチドの切断
は、成熟したヒトインターロイキン−４の完全長のアミ
ノ酸配列を含むタンパク質を産生するが、これはE.coli
における細胞質内での発現時にタンパク質にしばしば付
加される余分なアミノ末端のMet残基を持たない。
E.coliシグナルペプチドをコードするDNA配列と所望
のヘテロなタンパク質は、E.coli内で自律的に複製およ
び発現が可能な多くの既知のベクターにフレームを合わ
せて作用的に結合することが可能であり、このようなベ
クターはpBR322,pBR325,pUC8,pUC9,pUC18,pUC19,pAH3,p
KGT269-2およびpRGT857-11を含んでいるがこれらに限定
されてはいない。二つのDNA配列は互いに連結すること
が可能で、それからベクター内に挿入され、あるいは、
単独のペプチドをコードする配列を含むように最初に調
製され得る。それから、いかなるヘテロなDNA配列も、
所望の融合配列を作製するためにシグナルペプチドサイ
トに挿入され得る。好適には、挿入された、いかなる与
えられたヘテロな遺伝子も正しいフレームで読まれるよ
うに、シグナルペプチドをコードするベクターが３つ調
製されることが望ましい。
シグナルペプチドをコードするヘテロな遺伝子の本来
の核酸配列を利用することも可能である。例えば、Talm
adge et al．〔Nature 294:176（1981）〕は通常プロ
インスリンと関係しているシグナル配列はまた、E.coli
においてプロインスリンを分泌させるために機能してい
ることを報告している。
本発明で用いられる組み換えベクターはtrp，lacまた
はλpLプロモーターといったよく知られた制御可能なプ
ロモーター／オペレーター（po）系の制御下にあること
が望ましい。多くのpo系は温度感受性リプレッサーの制
御下にあることが知られている；培養温度を上昇させる
と抑制が解除され、発現を制御することができる。その
他のものは化学的な誘導剤〔例えばインドリル酢酸（tr
p）およびイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（I
PTG、lac）〕を用いて制御することが可能である。
本発明を説明するために以下に特異的な組み換えプラ
スミドが記述されているが、それらは、単に、代わりに
用いることのできる多くの組み換えプラスミドをの代表
するものであることを強調しておかなくてはならない。
組み換えベクターは、構築後、標準的な方法（例えば
Maniatis et al.,supra,250ページ参照）によって細菌
変異株に形質転換され、その形質転換体は適当な培地中
でクローン化することが可能である。
与えられた形質転換体クローンが生物学的に活性のあ
るタンパク質を分泌しているかどうかの決定は、標準的
な免疫化学的または生物学的分析法によって行うことが
できる。インターロイキン−２あるいはインターロイキ
ン−４といったリンホカインが分泌された培地の一部
は、例えばDevos et al．〔Nucleic Acids Res.11:430
7（1983）〕によって記述されたようにＴ細胞成長因子
活性に関して分析され得る。そのような分析の最終部分
は放射性標識または発色によって測定することが可能で
ある〔Mosmann、J.Immunol.Meth.65:55（1983）〕。イ
ンターフェロン生物活性分析は例えばDeChiara et a
l．（米国特許第4,816,566号）などによって記述されて
いるように行うことが可能である。
分泌性クローンの更に迅速なスクリーニングは、免疫
沈降または酵素結合した免疫吸着剤分析（ELISA）によ
って行うことができる。所望のタンパク質に対する抗体
は、通常の方法によって調製することが可能である。モ
ノクローナル抗体が望ましいが、KohlerおよびMilstein
〔Nature 256:495（1975）;Eur.J.Immunol.6:511（197
6）〕の方法によって簡便に調製することができる。
モノクローナル抗体の作製時にはミエローマ細胞と融
合するための抗体産生体細胞を得るために、所望のタン
パク質はマウス、ラット、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ
などの動物を免疫するのに用いられる。
抗体を産生能力のある体細胞、とりわけＢ細胞は、ミ
エローマ細胞系統と融合するのにふさわしい。これらの
体細胞は免疫された動物のリンパ節、脾臓細胞、末梢血
液から派生する。本発明の典型的な態様ではラット脾臓
細胞が使用されているが、その理由の一部として、これ
らの細胞がマウスミエローマ細胞系との安定した融合を
比較的高い割合で起こすことが挙げられる。しかしなが
ら代わりに、マウス、ラビット、カエルまたはその他の
細胞を使用することも可能であろう。
特殊化したミエローマ細胞系はハイブリドーマ産生融
合法で使用するためにリンパ腫から開発された〔Kohler
and Milstein,Eur.J.Immunol.6:511（1976）;Shulman
et al.Nature 276:269（1978）;Volk et al.,J.Viro
l.42:220（1982）〕。これらの細胞系少なくとも３つの
理由から開発された。最初に、融合していないハイブリ
ドーマと、同様に無期限に自己増殖するミエローマ細胞
からの、融合したハイブリドーマの選択の促進が挙げら
れる。通常、ミエローマは酵素に欠陥があり、ハイブリ
ドーマの増殖を与えるある種の選択培地中で生育できな
いことを利用して、選択を行う。第二の理由はそれ自身
の抗体を産生する、リンパ腫細胞に固有の能力の起因し
ている。モノクローナル技術を用いる目的は無限に増殖
する融合ハイブリッド細胞系を得て、ハイブリドーマの
体細胞構成部分の遺伝的制御のもとで所望の単独の抗体
を産生することにある。ハイブリドーマによる腫瘍細胞
の抗体産生を除去するために、イムノグロブリンの軽鎖
または重鎖を産生できない、あるいは抗体産生機構に欠
陥があるミエローマ細胞系を利用する。これらの細胞系
を選択する３つめの理由は融合に適切で、頻度が高いこ
とが挙げられる。
多くのミエローマ細胞系は融合細胞ハイブリッドの産
生に用いることができ、例えば、P3X63-Ag8,P3/NS1-Ag4
-1,Sp2/0-Ag14およびS194/5.XXO.Bu.1を含んでいる。P3
X63-Ag8およびP3/NS1-Ag4-1細胞系はKohler and Milste
in〔Eur.J.Immunol.6:511（1976）〕によって記述され
ている。Shulman et al．〔Nature 276:269（1978）〕
はSp2/0-Ag14ミエローマ細胞系を開発した。S194/5.XXO
Bu.1細胞系はTrowbridgeによって報告されている〔J.Ex
p.Med.148:313（1979）〕。本発明の実施例では、P3X63
-Ag8.653細胞系（ATCC CRL 1580）が用いられている。
抗体を産生する脾臓またはリンパ節細胞とミエローマ
細胞のハイブリッドの作製法は通常，細胞膜の融合を促
進するひとつまたはそれ以上の作用剤（化学的、ウイル
ス性あるいは電気的な）の存在下で、10:1の割合で体細
胞とミエローマ細胞をそれぞれ混合する（割合は約20:1
から約1:1まで変化してもよい）。融合法はKohlerおよ
びMilstein,supra,Gefter et al．〔Somatic Cell Gen
et.3:231（1977）〕およびVolk et al．〔J.Virol.42:
220（1982）〕によって記述されている。これらの研究
者に用いられた融合促進剤は、センダイウイルスおよび
ポリエチレングリコール（PEG）である。本発明の融合
法の実施例はPEGを用いている。
融合法では非常に低頻度（例えば脾臓が体細胞として
用いられた場合、大まかに見積もって1x105個の脾臓細
胞に対してたったひとつのハイブリッドが得られる）で
生育可能なハイブリッドが産生されるため、融合したハ
イブリッド細胞を残りの融合していない細胞、とりわけ
融合していないミエローマ細胞から選択する手段を有す
ることが重要である。所望の抗体産生ハイブリドーマを
その他に生じた融合ハイブリッド細胞から検出する方法
もまた必要である。
一般的には、融合ハイブリッド細胞の選択は、ハイブ
リドーマの生育を助けるが通常無限に分裂を続ける融合
していないミエローマ細胞の成長を妨げる培地中で、細
胞を培養することによって行う。融合に用いた体細胞は
in vitroでの培養では長時間生育することはなく、従っ
て問題を提起しない。本発明の実施例では、ヒポキサン
チンホスフォリボシルトランスフェラーゼを欠いている
（HPRT陰性）ミエローマ細胞を用いている。これらの細
胞に対する選択はヒポキサンチン／アミノプテリン／チ
ミジン（HAT）培地で行うがこの培地は脾臓細胞のHPRT
陽性という遺伝子型によって融合ハイブリッド細胞は生
存する。異なった遺伝的欠陥（薬剤感受性など）を持つ
ミエローマ細胞も、遺伝型で競合しているハイブリッド
の生育を助ける培地中で選択が可能であれば、使用する
ことが可能である。
融合ハイブリッド細胞を選択的に培養するには数週間
を要する。この期間の初期には、どのハイブリッドをク
ローン化し増殖させるか決定するために、所望の抗体を
産生するハイブリッドを同定する必要がある。一般には
得られたハイブリッドの10％前後は所望の抗体を産生す
るが、約１％から約30％までの領域となる場合もないわ
けではない。抗体を産生するハイブリッドの検出は、い
くつかの標準的な分析方法〔文献（例えばKennet et a
l．（editors）,Monoclonal Antibodies and Hybridoma
s:A New Dimension in Biological Analyses,pp.376-38
4,Plenum Press,New−York（1980）参照〕に記述されて
いる酵素結合免疫分析および放射性免疫分析〕のうちの
どれを用いても行うことができる。
ひとたび所望の融合ハイブリッド細胞が選択され各抗
体産生細胞系クローン化されると、各細胞系は標準的な
二つの方法のうちのどちらかによって増殖させられるこ
とになる。ハイブリドーマ細胞の懸濁液は組織適合性動
物に注入され得る。注入された動物は、それから、融合
ハイブリッド細胞から産生される特異的なモノクローナ
ル抗体を分泌する腫瘍を増大させる。血清または腹水と
いった動物の体液は、高濃度でモノクローナル抗体を供
給するために抜き取られる。代わりに、各細胞系は実験
室培養容器内でin vitroで増殖させることもできる。単
独の特異的モノクローナル抗体を高頻度で含む培地は容
器を傾けるか、ろ過するか、遠心によって集めることが
可能である。
モノクローナル抗体は正しく折り畳まれ、生物学的に
活性のある、望みのタンパク質に特異的に結合し、変性
したタンパク質に結合しないことが望ましい。このよう
な抗体は、タンパク質に対する抗体を分泌する大量のハ
イブリドーマクローンを産生し、ハイブリドーマが望む
抗体を産生しているかどうかを見いだすために、活性の
あるタンパク質と変性したタンパク質の両方に対して、
ハイブリドーマの培地をスクリーニングすることによっ
て得ることが可能である。タンパク質の非活性型はタン
パク質試料をタンパク質を変性させるためにドデシル硫
酸ナトリウム（SDS）で処理することによって容易に調
製することが可能である。
活性のあるタンパク質のみを認識する抗体の利用によ
って、さらに時間を浪費する生物学的分析の必要がなく
なる。このような特異性を持たない抗体は、しかしなが
ら、迅速なスクリーニングには用いることが可能であ
る。このようなスクリーニングで陽性となったクローン
は、それから生物学的活性について分析されることが可
能である。
好適な態様では、分泌性クローンのスクリーニングは
ニトロセルロースメンブレンの集合体を用いて行われ
る。第一のニトロセルロースメンブレンは分散して培養
している形質転換体の表面と接するように持ってくる。
このメンブレンは、接したためにその面に培養している
コロニーの一部が移ることになるが、それから増殖培地
と接している第二のニトロセルロースメンブレンの上に
直接おかれ、メンブレン集合体が形成される。この集合
体はそれから、形質転換された細菌の変異株が分泌する
ヘテロなタンパク質が、第一のメンブレンを通じて二つ
目のメンブレンに到達するような条件下で、インキュベ
ートされる。これらのメンブレンはインキュベーション
の後に分離され、第二のメンブレン上のタンパク質はタ
ンパク質と結合し、抗体−タンパク質複合体を形成する
特異的な抗体を用いて検出される。
結合していない物質を除去するために第二のメンブレ
ンを洗浄した後に、タンパク質−抗体複合体は、メンブ
レン上の第一の抗体を認識するラベルされた２つめの抗
体を用いて検出される。例えば、タンパク質に特異的な
抗体がネズミのモノクローナル抗体である場合には、ラ
ベルされた抗−マウス−イムノグロブリン抗体が用いら
れる。これら第二の抗体は、ローダミンの様に特有の波
長に対して蛍光を発する化合物あるいは、望ましくは、
目に見える化学的反応を触媒する酵素で標識されること
が可能である。様々なペルオキシダーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリフォ
スファターゼはこの目的に使用することの可能な酵素で
ある。標識された第二の抗体の使用を通じて、メンブレ
ン上で分泌されたタンパク質が存在しているところで
は、目に見えるフォーカスが現れるであろう。
このようなフォーカスを含む代表的なメンブレンを図
１に示しているが、ここでは、矢印が、さらなるなる評
価のために選択されたコロニーであることを示す強いス
ポットを指している。
第二のメンブレンに結合したタンパク質の位置を目で
みることができるようになった後は、培養しているコロ
ニーと第二のメンブレンを並べて比較し、タンパク質を
分泌している形質転換されたコロニーに目で見えるフォ
ーカスを重ね合わせる。このようにして分泌しているコ
ロニーは同定され、培養から移動され、適当な増殖培地
または、発行培養液中でサブカルチャーされる。
いくつかの例では、メンブレン集合体において第三の
ニトロセルロースメンブレンを用いることが望ましいこ
とがある。このメンブレンは第二のメンブレンと増殖培
地の間に置かれ、上述したインキュベーションの間、形
質転換されたコロニーから分泌されたタンパク質は第二
および第三のメンブレンの両方に到達する。メンブレン
の分離に続いて、上述したように第三のメンブレン上に
生じたタンパク質のフォーカスの免疫化学的検出によっ
て、第二のメンブレン上で観察されたどんな陰性反応も
誤った陰性反応ではないことを確かめる。第二のメンブ
レンの解析に用いられた第一の抗体は生物学的に活性の
ある、正しく折り畳まれた構造のタンパク質のみに特異
的であることのみが望ましいが、第三のメンブレンに対
して用いられた第一の抗体はどんな形態の、変性または
非変性のタンパク質に対して結合していてもよい。
変異誘起剤にさらすことで細菌DNAにおけるのと同様
に、発現プラスミド中にも変異による変化が起き得るた
め、最初にプラスミドを選択されたクローンから除き、
変異誘起剤にさらされたことのない別の細胞に置き直す
ことによって、選択されたクローンを“治療”する必要
がある。この治療は標準的な方法によって容易に行うこ
とが可能である。
例えば、Watanabe et al．〔J.Bacteriol.81:679（1
961）〕によって記述されているように、アクリジンオ
レンジの存在下で細胞を培養することによってプラスミ
ドを除くことが可能である。その他の方法としては、形
質転換体を単離するために用いた選択マーカーが存在し
ない条件で単に細胞を培養する方法がある。以下に述べ
る実施例では形質転換された細胞は、プラスミドが抗生
物質を分解する酵素の発現を制御しているということだ
けのために、アンピシリン存在下で生育することが可能
である。培地中にアンピシリンが存在すると、その他の
感受性宿主細胞に対して、プラスミドを保持するように
選択圧がかけられる；アンピシリン非存在下ではプラス
ミドは細胞の生存に不必要であり、したがって自然に失
われる。
本発明を説明するために以下にほんの数種のE.coli分
泌性クローンについてのみ詳細に記述しているが、規定
どおりに用いられる方法では有益な分泌変異株が十分量
産生される。変異誘起剤にさらされた約1011の細胞のう
ちで、T7による感染に耐性であるコロニーが約300-500
産生される。これらの抵抗性コロニーのうちで３分の１
から半分もまた、培地中に十分量のペリプラズミックタ
ンパク質を分泌する。
本発明における分泌性株は、長期の培養に安定である
こと、および一般的な細胞性分解によって望むヘテロな
タンパク質を漏出しているわけではないことを確かめる
ために、更に評価することが好ましい。
選択した株が安定であることを確かめるために、何世
代かにわたってサブカルチャーし、自然発生した溶解の
様な変質の証拠がないか観察することが望ましい。所望
のヘテロなタンパク質が単に細胞が変質したために培地
中に現れていないことの証拠は、代表的なE.coli細胞質
タンパク質が培地中に存在するかを分析することによっ
て得ることが好ましい。もし細胞が構造的に損なわれて
いなければ十分量のこのようなタンパク質はもちろん培
地中に存在しない。このような分析はグルコース−６−
ホスフェイトデヒドロゲナーゼの様な簡便な分析を行う
ことのできるいかなる細胞質タンパク質に関しても行う
ことが可能である。
多くの場合、更に効果的に分泌する株は、上述の方法
によって得られた株をサブクローニングして培養し、細
胞を更に１回あるいはそれ以上変異誘起剤処理し、クロ
ーニングし選択することによって産生され得る。
同定されたE.coli分泌性株は、シグナルペプチドをコ
ードしているDNA配列と所望のヘテロなタンパク質をコ
ードする配列の両方が発現している条件下で培養され
る。細菌細胞はそれから培地から分離され、標準的な技
術によってタンパク質が単離される。タンパク質の単離
に利用することのできる方法は例えば、酸または塩によ
る沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、金属キレート
クロマトグラフィー、ゲルろ過、高分解能液体クロマト
グラフィー、作製済ディスクゲル、またはカーテン電気
泳動、等電点フォーカシング、低温有機溶媒フラクショ
ネイション、向流分配、および免疫親和性クロマトグラ
フィーを含んでいる。
分泌性株と本発明の方法を用いて得られた、ヘテロな
タンパク質分泌の量と質の両方はこれまでの方法で得ら
れた結果よりも優れたものになり得る。例えば、Lundel
l et al．〔J.Ind.Microbilo.,in the press〕はompA
シグナルペプチドをコードするDNA配列を組み換えベク
ター中でヒトインターロイキン−４遺伝子と融合させて
いる。変異誘起していないE.coli294株において,IPTGを
用いてDNAの発現を誘導すると、Lundell et al．は約3
0-50％の処理されたインターロイキン−４が培地中に分
泌されることを見いだしている。
対照的に、処理されたインターロイキン−４の実質的
に全てのものが本発明の変異株によって培地中に分泌さ
れる。更に、Lundell et al．の培地から回収した分泌
されたインターロイキン−４を続いて解析すると、その
生理化学的および、生物学的な性質は本発明の方法で作
製されたリンホカインの性質と異なっていることが明ら
かになった。
まず第１にE.coli294株から回収されたインターロイ
キン−４活性の量は、本発明の分泌性株のひとつのほぼ
同じ数の細胞から得られた量よりもずっと少ない。第二
に、Lundell et al．の系によって産生されたインター
ロイキン−４は、高度に活性を持つインターロイキン−
４に特異的なモノクローナル抗体（以下の抗体の使用11
B4参照）によって認識されない。第三にLundell et a
l．の系の培地から回収されたインターロイキン−４は
本発明のE.coli変異株によって分泌されたインターロイ
キン−４を保持するクロマトグラフィーカラムに結合し
ない。非変異細菌によって分泌されたインターロイキン
−４の活性が低いことおよび物理的性質が異なること
は、タンパク質が異なっており、活性の低い構造であり
得ることを示唆している。
実施例 以下の実施例において、固体の固体混合物に、液体の
液体に、及び固体の液体に対する百分率は、特に示さな
い限り、それぞれ、wt/wt、vol/vol、及びwt/volに則っ
ている。細胞培養中は、滅菌状態に維持している。O.D.
波長は全てナノメーターで示す。
ヒトインターロイキン−４に対する抗体の調製 オスのLewisラットを、完全フロインドアジュバント
（CFA）1mlで乳化したヒトインターロイキン−４溶液1m
lを用いて腹腔内（i.p.）免疫した。この溶液は、COS細
胞で発現され、10mM Tris-HCl、0.5M NaCl、pH7.4中14
μg/ml濃度で107units/mgの比活性を有するグリコシル
化された組換えヒトインターロイキン−４を含んでい
た。
最初の免疫から２週間後、CFA1mlで乳化したヒトイン
ターロイキン−４溶液1mlを再びラットにi.p.注射し
た。二回目の注射から三ヵ月後、タンパク15μｇを含む
ヒトインターロイキン−４溶液1mlを静脈内注射するこ
とによりラットに追加免疫を施した。追加免疫注射より
４日後、ラットを殺し、血液を回収し、脾臓を融合用に
採取した。
脾細胞をマウスP3X63-Ag8.653ミエローマ細胞（ATCC
CRL 1580）と、PEGを使用して1:1の比率で融合させた。
HAT培地に懸濁した細胞液（3.5x105 cells/ml）を96−
ウェルプレート40枚に分注した。10日後、ハイブリドー
マ上清を、マイクロタイタープレートに直接固定したヒ
トインターロイキン−４に対する（間接ELISA）、ある
いは固定されているウサギポリクローナル抗ヒトインタ
ーロイキン−4IgG画分に結合しているヒトインターロイ
キン−４に対するその結合能についてテストした。結合
した抗体を、標準的な方法に従い、ペルオキシダーゼ結
合抗ラット免疫グロブリンによって検出した。インター
ロイキン−４と反応する抗体を分泌するハイブリドーマ
を、限界希釈によってクローン化した。IC1.11B4.6は、
これらの手順により選択されたこのようなハイブリドー
マの一つである。CI1.11B4.6より得た抗体（抗体11B4と
名付けられた）は、IgG2aアイソタイプであると決定さ
れ、生物学的に活性なヒトインターロイキン−４に対し
て特異的であることがわかった。
この特異性は、11B4モノクローナル抗体を免疫用イン
ターロイキン−４、及びLaemmli,Nature 227:680（197
0）の記載に従って変性SDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動したインターロイキン−４と反応させることにより
確認した。この抗体は、前者のインターロイキン−４の
みを認識し、リンホカインを0.04％SDSという低濃度
で、室温で５分間前処理するだけで、十分抗体による認
識が不可能となった。
ハイブリドーマは10％DMSO（ジメチルスルフォキシ
ド）を含む培養培地中に−70℃で保存し、標準的な哺乳
類細胞培養技術（RPMI 1640,1mMグルタミン及び50mM2−
メルカプトエタノールを添加した、10％胎生牛血清を含
む培地）を利用して培養した。
SDS変性した組換えヒトインターロイキン−４に対す
る多価抗血清は、標準的な技術を利用して、リンホカイ
ンサンプルを前述したようにSDSポリアクリルアミド電
気泳動して、ゲルからバンドを切り出し、そのように回
収したタンパク質でウサギを免疫することによって作製
した。インターロイキン−４は、Kimmenade et al．
［Eur.J.Biochem.173:109（1988）］の記載に従って大
腸菌発現システムにおいて生産されていた。
プラスミドpRGT857-11の構築 ヒトインターロイキン−４発現プラスミドpAH3及びpK
GT269-2、及びpUC19の構築は、Lundell et al．［J.In
d.Microbiology,印刷中］及びYanisch-Perron et al．
［Gene 33:103（1985）］に記載されている。
Maniatis et al.,supra.368ページの方法に従い、飽
和した一晩培養液から小スケールのプラスミドDNA単離
を行った。この方法により、分析を目的として細菌培養
液から少量のDNAを単離することが可能である。Maniati
s et al.,supra.90ページの記載に従い、大量のプラス
ミドDNAを調製した。プラスミドDNAを制限酵素で切断し
て生じた特定の制限酵素断片を、0.8％アガロース中で
準備しておいた電気泳動を行うことにより単離した。ゲ
ルに、トリス−ホウ酸緩衝液中で４時間150ボルトで流
し（Maniatis et al.,supra.156ページ）、それからゲ
ルをエチジウムブロミドで染色しDNAを視覚化した。適
当なゲル部分を切断し、150ボルトで60分間エレクトロ
エルーションを行った。その後、DNAをエタノール２倍
容量を用いて沈澱させて濃縮した。
制限酵素、DNAポリメラーゼＩ（クレノーフラグメン
ト（klenow fragment））及びT4DNAリガーゼは、New En
gland Biolab,Beverly,MAの製品であり、これらの酵素
の使用方法及び条件は、製造業者が示しているものと根
本的に同じであった。
T4DNAリガーゼによるライゲーションは、４℃で最低2
4時間行った。一本鎖DNA末端のクレノーフラグメントに
よる平滑末端化は、10mM Tris-HCl,pH7.5,2.5mM dGTP,d
ATP,dCTPとdTTP、及び10mM MgC12を含む緩衝液中で行っ
た。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動は、根本的にはL
aemmli,supra．の記載に従って行った。15％のSepragel
（登録商標;Integrated Separation Systems,Hyde Par
k,MA）を使用し、溶菌液に含まれる全タンパク質を、ク
ーマシーブリリアントブルーR-250（Bio-Rad Laborator
ies）で染色して視覚化した。インターロイキン−４
は、Hoefer Scientific Model TE 50 Transphor（登録
商標）電気泳動ユニットを使用して、電気泳動して分離
したタンパク質をニトロセルロースシートにトランスフ
ァーした後、後述するように特異的抗体を用いて免疫化
学的に視覚化した。
この実施例で用いられているpRGT857-11を構築するた
めに、pAH3をAvaＩで切断した。この酵素により生じた
５′突出部分を大腸菌ポリメラーゼＩのクレノーフラグ
メントを用いて埋め、そのDNAをPvuＩで切断した。イン
ターロイキン−４とLacｉ領域を含む5.8kb断片を、pUC
の複製オリジンを含む、pUC19の1.4kb PvuII-PvuＩ断片
にライゲーションした。次に大腸菌294を形質転換し
て、pRGT839-2と名付けた、pUC複製オリジンを持つアン
ピシリン耐性インターロイキン−４発現プラスミドを単
離した（第２図）。
プラスミドpRGT857-11及びpKGT269-2をその後AatII及
びPvuIIで切断した。I14とLacｉ領域を含む、pRGT839-2
の6.7kb断片を、pKGT269-2由来の、クロラムフェニコー
ル耐性をコードする1kb断片にライゲーションした。大
腸菌294を形質転換には、ライゲーション混合液を直接
使用した。プラスミドpRGT857-11を含む形質転換体を単
離した。
大腸菌の分泌性株の調製と選択 TYEブロース［20g/lバクトトリプトン（Difco）,10g/
lバクト酵母エキストラクト（Difco）,5g/lNaCl］を細
菌株の規定の培養、プレート実験、ある種の発酵に使用
した。発酵の大部分は改変したGC培地［20g/lグリセロ
ール,30g/lカサミノ酸（Difco）,5g/l KH2PO4,1g/l MgS
O4・7H2O］中でバッフルの付いた振蘯フラスコを用いて
30℃で行われた。必要な場合は、アンピシリンやクロラ
ムフェニコール（Sigma Chemical Co.,St.Louis,MOより
入手）をそれぞれ100μg/ml,10μg/mlで加えた。
貯蔵株は40％グルセロール中で−20℃で保存した。接
種培養は10mlのTYEブロースを含む試験管にグリセロー
ルストックを加えることにより調製した。30℃で一晩培
養した後、細胞を500mlのバッフルの付いたエルレンマ
イヤー（Erlenmeyer）振蘯フラスコ（Bellco,Vineland,
NJ）中のTYE培地100mlに、A660＝0.2となるように接種
した。そのフラスコをニュー・ブルンスウィック・コン
トロールド・エンバイロンメント・インキュベーター・
シェーカー（New Brunswick Controlled Environment I
ncubator Shaker）を使用して250rpmの振蘯速度で30℃
で培養した。A660＝1.0になったところで、IPTGを0.25m
Mになるように加え、発酵を４または18時間続けた。
マニアティス（Maniatis）ら、前述、250頁に記載さ
れているようにして、様々な大腸菌株の形質転換が行わ
れた。
大腸菌PAM163［ジョンソン（Johnson）,Gen.Res.30:2
73（1977）］上で増殖させておいたバクテリオファージ
P1 cm1,clr100［ミラー（Miller）,Experiments in Mol
ecular Genetics,1972,Cold Spring Harbor Laborator
y］をMM294株に形質導入することによって大腸菌のスト
レプトマイシン耐性型が作成され、294Sと名付けられ
た。大腸菌株MM294は受託番号ATCC33625でアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションから入手することが
できる。
大腸菌294Sを滅菌水中で殺菌用の紫外線ランプを使用
して10インチの距離から40秒間照射した。トリプトン：
酵母エキストラクト：塩化ナトリウム（20:10:5）を含
む栄養豊富なTYEブロース上にプレートして決定したと
ころ、この処理により、99.9％の細胞が死んだ。この突
然変異を起こした細胞の懸濁液を栄養豊富なTYEブロー
スを使って1:5に希釈して最終体積を約50mlにし、250ml
フラスコ中で振蘯しながら暗所で37℃で３時間インキュ
ベートした。
外膜に変化が生じた突然変異体を選択するため、イン
キュベーション後、野生型バクテリオファージT7を108
プラーク形成単位/mlの濃度で加えた。このフラスコを
溶菌が観察されるまで37℃で振蘯し（約30分）、その後
４℃で10分間、10,000×ｇで遠心することによってT7耐
性細胞を回収した。そのペレットを新鮮なブロース1ml
に再懸濁した。
その細胞をTYE［トリプトン：酵母エキストラクト：
塩化ナトリウム（20:10:5）］寒天プレート上にまき、3
7℃でインキュベートした。24時間後、各プレートは約3
0-50コロニーを含んでいた。これらのコロニーを外膜の
損傷について更に調べた。使用した一つの方法は、培地
中へのリボヌクレアーゼの漏出の増加を観察することで
あった。
T7バクテリオファージ耐性の単一コロニーを、１％酵
母RNA（Sigma Chemical）を含むpH7のTYE寒天4mlを重層
した、新鮮なTYE寒天プレートにひいた。37℃で一晩イ
ンキュベートした後、そのプレートを1N HClで満たし
た。ハロの大きさを利用して、培地中にリボヌクレアー
ゼ活性を漏出した株を決定した［ウェイガンド（Weigan
d）ら,J.Bacteriol.125:340（1976）］。
大腸菌の外膜の損傷を知る別の指標は、マッコンキー
寒天［ハンコック（Hancock）,Ann.Rev.Microbiol.38:2
37（1984）］上で増殖できないことである。マッコンキ
ーに特別な感受性を示し、相当量の周辺細胞質のリボヌ
クレアーゼを放出しうる、約30のT7耐性コロニーの内２
つが単離され、RL7,RZ21と名付けられた。
大腸菌RL7,RZ21をプラスミドpAH3（図２）で形質転換
し、RZ21/pAH3,RL7/pAH3株を作成した。プラスミドpAH3
はシグナルペプチドを生産し、インターロイキン４の輸
送を指示して内膜を横切らせ周辺細胞質へと向かわせ
る。両方の形質転換体を改変したGC培地中で発酵させ
た。両方の形質転換体において使用した培地を、ヒトの
インターロイキン４に対するウサギポリクローナル抗血
清を使用したウェスタンブロッド分析によって、漏出性
に対してスクリーニングした。
より多くの量のインターロイキン４を分泌する株を作
成するため、RZ21/pAH3を前記のようにして紫外線照射
により突然変異を起こさせた。暗所で最低２時間増殖さ
せた後、照射した細胞をアンピシリン（100μg/ml）の
入ったTYE寒天プレート上にまき、30℃で一晩インキュ
ベートした。そのコロニーを、分泌性コロニーのもとで
より強く発色することにより示されるような、インター
ロイキン４の放出増加に対する（ポリクローナル抗血清
を使用した）二重膜免疫検定法によってスクリーニング
した。
突然変異を起こさせた細胞を希釈し、100μg/mlのア
ンピシリンを含むTYE寒天プレート（直径142mm）上に巻
いた（0.1ml/プレート）。30℃で一晩インキュベートし
た後、プレートには直径1mmのコロニーが約500-2000個
含まれていた。次にそのプレートに0.45μの孔径の137m
mニトロセルロース円盤（Schleicher ＆ Schuell）を被
せた。円盤は、徐々にかつ一様に濡れるよう、一端より
静かに被せた。その円盤を、コロニーの一部が寒天プレ
ートからニトロセルロース円盤上に移るように、即座に
一気に剥がした。その円盤を、予め滅菌した寒天プレー
トの表面に置いておいた別のニトロセルロース円盤の上
に置いた。これを30℃で一晩インキュベートした。
培養後、底の円盤をコロニーをつけた円盤から離し
た。その２つのフィルターを、10mMトリス,pH8,150mM N
aCl,0.05％（v/v）ツウィン−20（ポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウリン酸;Bio-Rad,酵素免疫検定純
度）（TBST）に１％BSA（ウシ血清アルブミン）を加え
たものの中で、室温で60分、インキュベートした。次
に、このフィルターを、ウサギポリクローナル抗血清
（TBST/BSAで1:1500に希釈；全インターロイキン４の決
定に使用）、モノクローナル抗体（11B4抗体）（TBST/B
SAでハイブリドーマの培養液の上清を1:10に希釈；本来
の構造をとっているインターロイキン４の決定に使用）
のいずれかの一次抗体とともに室温で30分、インキュベ
ートした。
フィルターをTBSTで３回洗い、使用した一次抗体に特
異的なアルカリフォスファターゼを架橋した二次抗体と
ともに30分、インキュベートした。フィルターをTBSTで
３回洗い、アルカリホスファターゼの基質（Promega Bi
otecのProtoBlot System）で染色した。現れた目にみえ
るフォーカスを元のプレートにアラインさせ、ヒトイン
ターロイキン４特異的な染色が増加したコロニーを選択
した。
選択したコロニーを非選択培地（アンピシリンを含ま
ない）に連続的に移すことによりプラスミドを落とし、
次いで非選択TYEプレート上にひいた。アンピシリンプ
レート上での増殖に対しネガティブとされたコロニー
を、プラスミドを持っていないことを確認した上で再び
pAH3で形質転換した。
pAH3をもったRZ21由来のクローンを100μg/mlのアン
ピシリンの入ったTYEで培養した。これらのクローン
を、10ml試験管での発酵から得られたブロース全体をド
ットイムノブロットすることによってリンホカインの放
出増加に対してスクリーニングした。コロニーを、上記
のように、ヒトインターロイキン４に対する11B4モノク
ローナル抗体とアルカリホスファターゼをつないだヤギ
抗ラットIgGとを使用して評価した。
RZ21に更に突然変異を起こさせて作成し、高生産性株
として選択されたある株を、RS631と名付けた。
突然変異のない大腸菌，単一突然変異の大腸菌，二重突
然変異の大腸菌によるヒトインターロイキン４生産の比
較 本発明中の株の高められた分泌能力と、反復突然変異
誘発および選択の効果を示すため、各々プラスミドpAH3
を持つ、突然変異のない株294S,単一突然変異株RZ21,二
重突然変異株RS631を培養し、上記のように20:10:5 TYE
培地で発酵させた。次いで1mM IPTGを加えることによっ
て発現を誘導した。誘導してから六時間後に、2mM EDTA
を含む20:10:5 TYE培地で10×の細胞濃度で種々の形質
転換体を37℃で一時間、インキュベーションすることに
よって放出されたインターロイキン−４の量を決定し
た。培地中のインターロイキン４はヨコタ（Yokota）
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5894（1986）の方法に
よって分析し、その結果を表１に示した。
表１ インターロイキン−４の生産 生理活性＊ 大腸菌株 （ユニット／ml） 294S/pAH3 2,005 RZ21/pAH3 21,798 RS631/pAH3 97,010 ＊活性値は、同数の細胞による分泌を比較するため、
O.D.660＝30に対して補正されている。１マイクログラ
ムの純粋なヒトインターロイキン−４は使用した分析に
おいては約20,000の活性値を示す。
表１のデータは、単一突然変異分泌株RZ21が突然変異
のない株294Sに比べて10倍量のインターロイキン−４を
培地中に生産したことを示している。また、二重突然変
異株RS631ではRZ21に比べ、更に５倍の活性が生み出さ
れていた。
培養寄託 突然変異大腸菌株RZ21,RS631,RL7はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託されてお
り、受託番号はそれぞれ、ATCC53951,53953,53954であ
る。プラスミドpAH3,pKGT269-2をもつ大腸菌株294SはAT
CCに寄託されており、受託番号はそれぞれ、ATCC68136,
68137である。モノクローナル抗体11B4を生産するハイ
ブリドーマIC1.11B4.6はATCCに寄託されており、受託番
号はHB9809である。これらの寄託のすべては、特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約
の規定のもとで行われた。
当業者にとって明らかであるだろうが、本発明の意図
および範囲を離れずに、多くの改変や変法をなすことが
できる。ここで記載された特定の態様は、実施例のみに
よって提供されるものであり、本発明は付随の請求の範
囲によってのみ制限される。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 レイム，リチャード・エル アメリカ合衆国ニュージャージー州 08837，エディソン，エバーグリーン・ ロード 172，アパートメント 10ビー (56)参考文献 特開 昭62−166881（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−237790（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−501401（ＪＰ，Ａ) Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，162 （３） （1978） Ｐ．345−346

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生物学的に活性があるヘテロな遺伝子産物
    を培地中に分泌することのできるE.coli（大腸菌）細菌
    であって、該細菌は、 （ａ）バクテリオファージT7による感染に対する耐性
    と；該細菌がそこから誘導された、そのような耐性を欠
    く細胞に比べて、培地中に少なくとも約10倍以上のペリ
    プラズミックタンパク質を分泌する能力；とによって特
    徴づけられるE.coli細菌、および （ｂ）所望のヘテロなタンパク質をコードしている第二
    のDNA配列に作用的に連結されたペリプラズミック空間
    へのタンパク質の輸送を媒介することのできるシグナル
    ペプチドをコードしている第一のDNA配列を含む、組み
    換えベクター、 を含み、該細菌は両方のDNA配列を発現することが可能
    である、上記E.coli細菌。
  2. 【請求項２】所望のヘテロなタンパク質の産生方法であ
    って、該方法は、 （ａ）培地中に、生物学的に活性のあるヘテロなタンパ
    ク質を分泌することのできるE.coli細菌の培養であっ
    て、該培養は、 （ｉ）バクテリオファージT7による感染に対する耐性
    と；該細菌がそこから誘導された、そのような耐性を欠
    く細胞に比べて、培地中に少なくとも約10倍以上のペリ
    プラズミックタンパク質を分泌する能力；とによって特
    徴づけられるE.coli細菌、および （ii）所望のヘテロなタンパク質をコードしている第二
    のDNA配列に作用的に連結されたペリプラズミック空間
    へのタンパク質の輸送を媒介することのできるシグナル
    ペプチドをコードしている第一のDNA配列を含む組み換
    えベクター、 を含み、ここで該培養は、該細菌が両方のDNA配列を発
    現し、培地中にヘテロなタンパク質を分泌するような条
    件下で行われる；および、 （ｂ）培地中からの分泌されたタンパク質の単離、 を含む、上記産生方法。
  3. 【請求項３】生物学的に活性のあるヘテロな遺伝子産物
    を培地中に分泌することができるE.coli細菌を作製し同
    定する方法であって、該方法は、 （ａ）該細菌のDNAに突然変異を引き起こすために十分
    量の変異誘起剤でE.coli細菌を処理すること； （ｂ）ステップ（ａ）で産生された変異株から、バクテ
    リオファージT7による感染に対する耐性と、下記クロー
    ンがそこから誘導された、そのような耐性を欠く細胞に
    比べて、培地中に少なくとも約10倍以上のペリプラズミ
    ックタンパク質を分泌する能力とのために、クローンを
    選択すること； （ｃ）ステップ（ｂ）で選択されたひとつまたはそれ以
    上のクローンを、所望のヘテロなタンパク質をコードし
    ている第二のDNA配列に作用的に連結されたペリプラズ
    ミック空間へのタンパク質の輸送を媒介することのでき
    るシグナルペプチドをコードしている第一のDNA配列を
    含む組み換えベクターであって、細菌内において両方の
    DNA配列の発現を制御することができる組み換えベクタ
    ーによって形質転換すること；および （ｄ）どのクローンがヘテロなタンパク質を分泌してい
    るかを決定するために、 形質転換されたクローンを分析すること； を含むものである、上記方法。
  4. 【請求項４】組み換えベクターがプラスミドpRGT857-11
    である、請求項１記載の細菌。
  5. 【請求項５】組み換えベクターがプラスミドpRGT857-11
    である、請求項２記載の方法。
  6. 【請求項６】組み換えベクターがプラスミドpRGT857-11
    である、請求項３記載の方法。
  7. 【請求項７】RZ21、RS631またはRL7株であって、アメリ
    カン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、
    受託番号がそれぞれATCC53951、53953および53954であ
    る、E.coli細菌。
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