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JPS61247400A - イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法 - Google Patents

イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法

Info

Publication number
JPS61247400A
JPS61247400A JP60088850A JP8885085A JPS61247400A JP S61247400 A JPS61247400 A JP S61247400A JP 60088850 A JP60088850 A JP 60088850A JP 8885085 A JP8885085 A JP 8885085A JP S61247400 A JPS61247400 A JP S61247400A
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JP
Japan
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reaction
nad
nadh
acid
atp
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JP60088850A
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JPH0673475B2 (ja
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Yoji Marui
丸井　洋二
Taku Nakano
卓 中野
Chozo Hayashi
林　長蔵
Takeshi Fujita
剛 藤田
Isamu Kokawara
高河原　勇
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Oriental Yeast Co Ltd
Original Assignee
Oriental Yeast Co Ltd
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、検体中の各種物質の測定又は各種酵素活性の
測定に用いられるＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド）　讃ＮＡＤ“（酸化型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチ穀系　におけるイソクエン酸
脱水素酵素の反応停止法に関するものである。
更に、詳細には１本発明は、ＮＡＤＨｄＮＡＤ＋系にお
けるイソクエン酸脱水素酵素の反応を停止させ。
ＮＡＤＨ−）ＮＡＤ＋系に転換せしめる方法に関するも
のである。
一般に、尿、血液等の検体に存在する尿素、クレアチニ
ン、クレアチン、グアニン、アデノシンなどを検出した
り、これら物質に関与する各種酵素の活性を測定するこ
とは普通に行なわれている。
そして、これら物質の検出や酵素反応においては、アン
モニアを生成させ、生成したアンモニアをＧｆｉＤＨ（
グルタミン酸脱水素酵素）によってグルタミン酸に変換
し、この際ＮＡＤＨ→ＮＡＤ“の共役反応によって減少
するＮＡＤＨの量を３４０ｎｍで測定して定量していた
。
しかし、この反応系では必ずアンモニアを生成するため
に、あらかじめ検体中に存在するアンモニアが測定値に
含まれてしまって、正確な定量を困難にしていた。
そこで、検体中に存在するアンモニアを前処理でＧＱＤ
Ｈによってα−ＫＧ（α−ケトグルタル酸）と反応させ
てグルタミン酸に変換させてしまえば問題はなくなる。
そして、このアンモニア→グルタミン酸の系にはＮＡＤ
ＩＩ→ＮＡＤ＋の変化を伴うために、ＮＡＤ”→ＮＡＤ
Ｈの逆反応でＮＡＤＨに戻す必要があり、この際イソク
エン酸を基質として１ＣＤＨ（イソクエン酸脱水素酵素
）とマグネシウムイオン又はマンガンイオンなどの金属
イオンによって共役反応を生起させることができる。こ
の反応系は、次の式（Ｉ）に示される。
式（１）に示されるように、検体中のアンモニブの消費
と尿素を分解して得たアンモニアの測定は同じ共役反応
によって行うことができるのであるが、検体中のアンモ
ニアの消費が完了し、　ＮＡＤ“→ＮＡＤＨの反応が完
全に停止されてはじめて尿素を分解して得たアンモニア
の正確な定量が行なえる。
そこで１問題となるのは、式（Ｉ）におけるＮＡＤＨｍ
ＮＡＤ”においてＮＡＤ＋→ＮＡＤＨの反応をいかにし
て完全に停止させるかであった。従来ＮＡＤ＋→ＮＡＤ
Ｉ（の反応のみを完全に停止させることは知られていな
かった・ また、一般に、血液などの検体中のトリグリセライ“ド
を測定したり、　ＧＯＴ（グルタミン酸オキザロ酢酸ト
ランスアミナーゼ）やＧＰτ（グルタミン酸ピルビン酸
トランスアミナーゼ）の活性を測定することは普通に行
われている。
そし°て、トリグリセライドの検出や各種酵素反応にお
いては最終段階でピルビン酸を生成させ、生成したピル
ビン酸をＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）によって乳酸に変換
し、この際ＮＡＤＨ−）ＮＡＤ＋の共役反応によって減
少するＮＡＤＨの量を３４０ｎｍで測定して定量してい
た。
しかし、この反応系では必ずピルビン酸を生成するため
に、そもそも検体中に存在するピルビン酸や遊離のグリ
セロールが測定値に含まれてしまって、正確な定量を困
難にしていた。
そこで、そもそも検体中に存在するピルビン酸を前処理
でＬＤＨによって乳酸に変換させてしまえば問題はなく
なる。そして、このピルビン酸→乳酸の系にはＮＡＤＦ
＋−＋ＮＡＤ＋の変化を伴うために、ＮＡＤ”→ＮＡＤ
Ｈの逆反応でＮＡＤＨに戻す必要があり、この際イソク
エン酸を基質として１ＣＤＨとマグネシウムイオン又は
マンガンイオンなどの金属イオンによって共役反応を生
起させることができる。この反応系は、次の式（Ｉｆ）
に示される。
式（ＩＩ）に示されるように、検体中のピルビン酸や遊
離のグリセロールの消費とトリグリセライドからもたら
されたピルビン酸の測定は同じ共役反応によって行うこ
とができるのであるが、検体中のピルビン酸の消費が完
了したらＮＡＤ＋→ＮＡＤＩＩの反応が完全に停止され
てはじめてトリグリセライドからもたらされたピルビン
酸の正確な定量が行なえる。
そこで、問題となるのは、式（ｎ）におけるＮＡＤＨ！
ＮＡＤ＋においてＮＡＤ＋→ＮＡＤＨの反応をいかにし
て完全に停止させるかであった。従来ＮＡＤ＋→ＮＡＤ
Ｈの反応のみを完全に停止させることは知られていなか
った・ 本発明者らは、上述の式（Ｉ）及び式（ｎ）におけ停せ
る方法を求めて鋭意研究したところ、ＡＴＰ又は／及び
キレート剤の添加によってイソクエン酸→　α−ＫＧの
反応を完全に停止させることに成功ＣＤＨ した。
本発明は、ＮＡＤＨからＮＡＤ＋への反応により物質を
測定する際に、ＮＡＤＨから生成したＮＡＤ＋を、イソ
クエン酸塩、マグネシウムイオン又はマンガンイオンな
どの金属イオン、および１ＣＤＨの共存下でＮＡＤＨに
再生する系で、１ＣＤＨ反応をＡＴＰ又は／及びキレー
ト剤の添加によって停止せしめることを特徴とする１Ｃ
ＤＨの反応停止法である。
ここで、金属イオンとはマグネシウムイオン、マンガン
イオン、鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、スズイオン
、カルシウムイオンなどを云うが、これらのイオン種に
制限されることはない。
また、キレート剤とはＥＤＴＡおよびその塩、１，２−
ビス（０−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ
’、　Ｎ’−四節酸およびその塩、トランス−１，２−
シクロヘキサンジアミン−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’、　Ｎ’−
四節酸およびその塩、ジヒドロキシエチルグリシンおよ
びその塩、　１．３−ジアミノプロパノ−ルーＮ、　Ｎ
、　Ｎ’、　Ｎ−四節酸およびその塩、ジエチレントリ
アミン五酢酸およびその塩、エチレンジアミンジオルト
ヒドロキシフェニル酢酸およびその塩、エチレンジアミ
ンニ酢酸およびその塩、エチレンジアミンニプロピオン
酸およびその塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三
酢酸およびその塩、エチレンジアミンテトラキス（メチ
レンホスホン酸）およびその塩、グリコールエーテルジ
アミン四酢酸およびその塩、ヒドロキシエチルイミノニ
酢酸およびその塩、イミノ二酢酸およびその塩、ジアミ
ノプロパン四酢酸およびその塩、ニトリロ三酢酸および
その塩、ニトリロ三プロピオン酸およびその塩、ニトリ
ロトリス（メチレンホスホン酸）およびその塩、トリエ
チレンテトラミン六酢酸およびその塩などを云うが、こ
れらのキレート剤に制限されることはない。
α−ＫＧ ↑ 本発明はＡＴＰ又は／及びキレート剤の添加によって上
記式（ｍ）→式（ＩＶ）への変化を行わせるものである
。即ち、検体中のアンモニア又はピルビン酸の完全消費
を式（ＩＩＩ）で行わせ、完全消費ののち反応系にＡＴ
Ｐ又は／及びキレート剤を添加し、ＮＡＤ＋→ＮＡＤＨ
の反応を停止させ、その後は検体中の被検物を分解し、
ＮＡＤＨ４ＮＡＤ＋の反応によってＮＡＤＨを消費して
正確な被検物の定量を行うものである６本発明における
。　ＡＴＰ又は／及びキレート剤による１ＣＤＨ反応の
停止は、反応を停止したそのままの媒質でＮＡＤＨ−）
ＮＡＤ＋の反応を用い各種反応が行える点できわめて有
用である。
反応系に対するＡＴＰの添加量は１５ｍＭ以上であれば
よい。第１図は１ＣＤＨ活性におよぼすＡＴＰ濃度の影
響をみた図であるが、　ＡＴＰ濃度が１５ｍＭ以上で１
ＣＤＨは完全に活性を失っているのが分る。
また１反応系に対するキレート剤、例えばＥＤＴＡの添
加量はｌＯ＋ｉＭ以上であればよい。第２図は１ｃＤＨ
活性におよぼすＥＤＴＡ濃度の影響をみた図であるが、
ＥＤＴＡ濃度が１０ｍＭ以上で１ＣＤＨは完全に活性を
失っているのが分る。
本発明の１ＣＤＨの反応停止法は１分解してアンモニア
を生成する物質の定量やこれに関連する酵素活性の測定
に利用でき、また、分解してピルビン酸を生成する物質
の定量やこれに関連する酵素活性の測定に利用できるも
のである。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１゜ ＭｇＣＱ　　　　　　　　　５ｍＭ イソクエン酸　　　　２ｍＭ ＮＡＤ”　　　　　　　　　１ｍに ＡＭＰ　　　　　　　　　０．５ｎ＋Ｍ以、上を含有す
る０、１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐｌ（＝８．０）３ｍ
ｆｆｉにＡＴＰ濃度が０〜２０ｍＭになるように添加し
、それぞれ２５℃に保温した後、約３ｕ／ｍＱのの１Ｃ
ＤＨを２０μＱ添加し、分光光度計により３４０ｎｍの
吸収の増大で１ＣＤＨ活性を測定した。
結果を第１図に示した。
実施例２゜ Ｍｇ（４１ｍＭ イソクエン酸　　　　２ｍＭ ＮＡＤ”　　　　　　　　　１ｍＭ ＡＭＰ　　　　　　　　　０　、５ｍＭ以上を含有する
０、ＩＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ＝８．０）３ｍ
ＭにＥＤＴＡ濃度が０〜２０ｍＭになるように添加し、
それぞれ２５℃に保温した後、約３ｕ／ｍｆｆ１のの１
ＣＤＨを２０μＱ添加し、分光光度計により３４０ｎｍ
の吸収の増大で１ｃＤＨ活性を測定した。
結果を第２図に示した。
実施例３゜ α−ＫＧ　　　　　　　１０ｍＭ ＮＡＤＨ０，１６ｍＭ イソクエン酸　　　５ｍＭ ＡＤＰ　　　　　　　　０．５ｍＭ ＭｇＣＱ”　　　　　　　１ｍＭ Ｇ２ＤＨ１ｏｏｕ／ｍ　Ｑ ｉＣＤＨ２ｕ／ｍ　２ 以上を含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）２
．４ｍＭに１６０ｍＭアンモニアを含む様々な濃度に調
整した尿素含有検体（尿素態−窒素として０〜１０００
ｏ＋ｇ／ｄＱ）３０μΩ添加した。それぞれ３７℃で５
分間保温したのちＡＴＰ、ウレアーゼ濃度がそれぞれ２
０鱈、０．１ｕ／＋　ＱになるようにＡＴＰ、ウレアー
ゼ混液を０．６ｍｊｌ加え分光光度計により２５℃での
３４０ｎｍの１分間における吸収の減少から検体中の尿
素態−窒素を測定した。測定結果を下に示す。
検体番号　　１　　２　　３　４　　５　　６　７　　
８　　９　　１０　　１１測定値　　７１８７１０７０
０６６５５９０４９８４０３　３０１　２００　１００
　０実施例４゜ ａ　−ＫＧ　　　　　　　１０ｍＭ ＮＡＤＨＯ，１６膳に イソクエン酸　　　５ｍＫ ＡＤＰ　　　　　　　　０．５ａ＋Ｍ ＭｇＣｆｆｉ”　　　　　　　１ｍＭ ＧＩＤＨ１００ｕ／ｍ　（１ ｉＣＤＨ４ｕ／ｍ　１１ 以上を含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）２
．４ｍＭに１６０ｍＮアンモニアを含む様々な濃度に調
整した尿素含有検体（Ｍ素層−窒素としてＯ”ｌ０００
ｍｇ／ｄρ）３０μａ添加した。それぞれ３７℃で５分
間保温したのちＥＤＴＡ、ウレアーゼ濃度がそれぞれ１
０ｍＭ、　０．１ｕ／ｍＱになるようにＥＤＴＡウレア
ーゼ混液を０．６ｖｓ（１加え分光光度計により２５℃
での３４０ｎｍの１分間における吸収の減少から検体中
の尿素態−窒素を測定した。
測定結果を下に示す。
検体番号　　１　　２　　３　　４　　５　　６　　７
　　８　　９　　１０　　１測定値　　　７２０　７０
５　６９０　５６０　５２５　５０２　４０５　２９８
　２００　１００　　　ｔ
【図面の簡単な説明】
第１図は１ｃＤＨ活性におよぼすＡＴＰ濃度の影響をみ
た図で、第２＠は１ｃＤＨ活性におよぼすＥ［）ＴＡ濃
度の影響をみた図である。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 ＥＤＴＡム度ｍＭ

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ＮＡＤＨからＮＡＤ＾＋への反応により物質を測
    定する際に、ＮＡＤＨから生成したＮＡＤ＾＋を、イソ
    クエン酸塩、マグネシウムイオン又はマンガンイオンな
    どの金属イオン、およびイソクエン酸脱水素酵素の共存
    下でＮＡＤＨに再生する系で、イソクエン酸脱水素酵素
    反応をＡＴＰ又は１及びキレート剤の添加によって停止
    せしめることを特徴とするイソクエン酸脱水素酵素の反
    応停止法。
JP60088850A 1985-04-26 1985-04-26 イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法 Expired - Lifetime JPH0673475B2 (ja)

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