JPH0673475B2 - イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法 - Google Patents
イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法Info
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- JPH0673475B2 JPH0673475B2 JP60088850A JP8885085A JPH0673475B2 JP H0673475 B2 JPH0673475 B2 JP H0673475B2 JP 60088850 A JP60088850 A JP 60088850A JP 8885085 A JP8885085 A JP 8885085A JP H0673475 B2 JPH0673475 B2 JP H0673475B2
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- nad
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、検体中の各種物質の測定又は各種酵素活性の
測定に用いられるNADH（還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド）NAD+（酸化型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド）系におけるイソクエン酸脱水素酵素
の反応停止法に関するものである。
測定に用いられるNADH（還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド）NAD+（酸化型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド）系におけるイソクエン酸脱水素酵素
の反応停止法に関するものである。
更に、詳細には、本発明は、NADHNAD+系におけるイソ
クエン酸脱水素酵素の反応を停止させ、NADH→NAD+系に
転換せしめる方法に関するものである。
クエン酸脱水素酵素の反応を停止させ、NADH→NAD+系に
転換せしめる方法に関するものである。
一般に、尿、血液等の検体に存在する尿素、クレアチニ
ン、クレアチン、グアニン、アデノシンなどを検出した
り、これら物質に関与する各種酵素の活性を測定するこ
とは普通に行なわれている。
ン、クレアチン、グアニン、アデノシンなどを検出した
り、これら物質に関与する各種酵素の活性を測定するこ
とは普通に行なわれている。
そして、これら物質の検出や酵素反応においては、アン
モニアを生成させ、生成したアンモニアGlDH（グルタミ
ン酸脱水素酵素）によってグルタミン酸に変換し、この
際NADH→NAD+の共役反応によって減少するNADHの量を34
0nmで測定して定量していた。
モニアを生成させ、生成したアンモニアGlDH（グルタミ
ン酸脱水素酵素）によってグルタミン酸に変換し、この
際NADH→NAD+の共役反応によって減少するNADHの量を34
0nmで測定して定量していた。
しかし、この反応系では必ずアンモニアを生成するため
に、あらかじめ検体中に存在するアンモニアが測定値に
含まれてしまって、正確な定量を困難にしていた。
に、あらかじめ検体中に存在するアンモニアが測定値に
含まれてしまって、正確な定量を困難にしていた。
そこで、検体中に存在するアンモニアを前処理でGlDHに
よってα−KG（α−ケトグルタル酸）と反応させてグル
タミン酸に変換させてしまえば問題はなくなる。そし
て、このアンモニア→グルタミン酸の系にはNADH→NAD+
の変化を伴うために、NAD+→NADHの逆反応でNADHに戻す
必要があり、この際イソクエン酸を基質としてiCDH（イ
ソクエン酸脱水素酵素）とマグネシウムイオン又はマン
ガンイオンなどの金属イオンによって共役反応を生起さ
せることができる。この反応系は、次の式（Ｉ）に示さ
れる。
よってα−KG（α−ケトグルタル酸）と反応させてグル
タミン酸に変換させてしまえば問題はなくなる。そし
て、このアンモニア→グルタミン酸の系にはNADH→NAD+
の変化を伴うために、NAD+→NADHの逆反応でNADHに戻す
必要があり、この際イソクエン酸を基質としてiCDH（イ
ソクエン酸脱水素酵素）とマグネシウムイオン又はマン
ガンイオンなどの金属イオンによって共役反応を生起さ
せることができる。この反応系は、次の式（Ｉ）に示さ
れる。
式（Ｉ）に示されるように、検体中のアンモニアの消費
と尿素を分解して得たアンモニアの測定は同じ共役反応
によって行うことができるのであるが、検体中のアンモ
ニアの消費が完了し、NAD+→NADHの反応を完了させてNA
DH量を最初の値にまで回復せしめた後、この再生反応を
完全に停止せしめてはじめて尿素を分解して得たアンモ
ニアの正確な定量が行なえる。
と尿素を分解して得たアンモニアの測定は同じ共役反応
によって行うことができるのであるが、検体中のアンモ
ニアの消費が完了し、NAD+→NADHの反応を完了させてNA
DH量を最初の値にまで回復せしめた後、この再生反応を
完全に停止せしめてはじめて尿素を分解して得たアンモ
ニアの正確な定量が行なえる。
そこで、問題となるのは、式（Ｉ）におけるNADHNAD+
においてNAD+→NADHの反応をいかにして完全に停止させ
るかであった。従来NAD+→NADHの反応のみを完全に停止
させることは知られていなかった。
においてNAD+→NADHの反応をいかにして完全に停止させ
るかであった。従来NAD+→NADHの反応のみを完全に停止
させることは知られていなかった。
また、一般に、血液などの検体中にトリグリセライドを
測定したり、GOT（グルタミン酸オキザロ酢酸トランス
アミナーゼ）やGPT（グルタミン酸ピルビン酸トランス
アミナーゼ）の活性を測定することは普通に行われてい
る。
測定したり、GOT（グルタミン酸オキザロ酢酸トランス
アミナーゼ）やGPT（グルタミン酸ピルビン酸トランス
アミナーゼ）の活性を測定することは普通に行われてい
る。
そして、トリグリセライドの検出や各種酵素反応におい
ては最終段階でピルビン酸を生成させ、生成したピルビ
ン酸をLDH（乳酸脱水素酵素）によって乳酸に変換し、
この際NADH→NAD+の共役反応によって減少するNADHの量
を340nmで測定して定量していた。
ては最終段階でピルビン酸を生成させ、生成したピルビ
ン酸をLDH（乳酸脱水素酵素）によって乳酸に変換し、
この際NADH→NAD+の共役反応によって減少するNADHの量
を340nmで測定して定量していた。
しかし、この反応系では必ずピルビン酸を生成するため
に、そもそも検体に存在するピルビン酸や遊離のグリセ
ロールが測定値に含まれてしまって、正確な定量を困難
にしていた。
に、そもそも検体に存在するピルビン酸や遊離のグリセ
ロールが測定値に含まれてしまって、正確な定量を困難
にしていた。
そこで、そもそも検体中に存在するピルビン酸を前処理
でLDHによって乳酸に変換させてしまえば問題はなくな
る。そして、このピルビン酸→乳酸の系にはNADH→NAD+
の変化に伴うために、NAD+→NADHの逆反応でNADHに戻す
必要があり、この際イソクエン酸を基質としてiCDHとマ
グネシウムイオン又はマンガンイオンなどの金属イオン
によって共役反応を生起させることができる。この反応
系は次の式（II）に示される。
でLDHによって乳酸に変換させてしまえば問題はなくな
る。そして、このピルビン酸→乳酸の系にはNADH→NAD+
の変化に伴うために、NAD+→NADHの逆反応でNADHに戻す
必要があり、この際イソクエン酸を基質としてiCDHとマ
グネシウムイオン又はマンガンイオンなどの金属イオン
によって共役反応を生起させることができる。この反応
系は次の式（II）に示される。
式（II）に示されるように、検体中のピルビン酸や遊離
のグリセロールの消費とトリグリセライドからもたらさ
れたピルビン酸の測定は同じ共役反応によって行うこと
ができるのであるが、検体中のピルビン酸の消費が完了
したらNAD+→NADHの反応を完了させてNADH量を最初の値
にまで回復せしめた後、この再生反応を完全に停止せし
めてはじめてトリグリセライドからもたらされたピルビ
ン酸の正確な定量が行なえる。
のグリセロールの消費とトリグリセライドからもたらさ
れたピルビン酸の測定は同じ共役反応によって行うこと
ができるのであるが、検体中のピルビン酸の消費が完了
したらNAD+→NADHの反応を完了させてNADH量を最初の値
にまで回復せしめた後、この再生反応を完全に停止せし
めてはじめてトリグリセライドからもたらされたピルビ
ン酸の正確な定量が行なえる。
そこで、問題となるのは、式（II）におけるNADHNAD+
においてNAD+→NADHの反応をいかにして完全に停止させ
るかであった。従来NAD+→NADHの反応のみを完全に停止
させることは知られていなかった。
においてNAD+→NADHの反応をいかにして完全に停止させ
るかであった。従来NAD+→NADHの反応のみを完全に停止
させることは知られていなかった。
本発明者らは、上述の式（Ｉ）及び式（II）における の反応のみを完全に停止させる方法を求めて鋭意研究し
たところ、ATP又は／及びキレート剤の添加によってイ
ソクエン酸→α−KGの反応を完全に停止させることに成
功した。
たところ、ATP又は／及びキレート剤の添加によってイ
ソクエン酸→α−KGの反応を完全に停止させることに成
功した。
本発明は、NADHからNAD+への反応により検体中の特定の
物質を測定する際に、測定系に悪影響を与える物質をあ
らかじめNADHを用いて消去することにより生成するNAD+
を、イソクエン酸塩、マグネシウムイオン又はマンガン
イオンなどの金属イオン、およびイソクエン酸脱水素酵
素の共存下でNADHに再生する系で、NADHへの再生が完了
した後に、イソクエン酸脱水素酵素反応をATP又は／及
びキレート剤の添加によって停止せしめることを特徴と
するイソクエン酸脱水素酵素の反応停止法、に関するも
のであるが、測定系に悪影響を与える物質とは、検体中
に混在するものだけでなく、測定に使用する器具、装置
等に付着しているものが混入するものも含むものであ
る。
物質を測定する際に、測定系に悪影響を与える物質をあ
らかじめNADHを用いて消去することにより生成するNAD+
を、イソクエン酸塩、マグネシウムイオン又はマンガン
イオンなどの金属イオン、およびイソクエン酸脱水素酵
素の共存下でNADHに再生する系で、NADHへの再生が完了
した後に、イソクエン酸脱水素酵素反応をATP又は／及
びキレート剤の添加によって停止せしめることを特徴と
するイソクエン酸脱水素酵素の反応停止法、に関するも
のであるが、測定系に悪影響を与える物質とは、検体中
に混在するものだけでなく、測定に使用する器具、装置
等に付着しているものが混入するものも含むものであ
る。
ここで、金属イオンとはマグネシウムイオン、マンガン
イオン、鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、スズイオ
ン、カルシウムイオンなどを云うが、これらのイオン種
に制限されることはない。
イオン、鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、スズイオ
ン、カルシウムイオンなどを云うが、これらのイオン種
に制限されることはない。
また、キレート剤とはEDTAおよびその塩、1,2−ビス
（０−アミノフェノキシ）エタン−N,N,N′,N′−四酢
酸およびその塩、トランス−1,2−シクロヘキサンジア
ミン−N,N,N′,N′−四酢酸およびその塩、ジヒドロキ
シエチルグリシンおよびその塩、1,3−ジアミノプロパ
ノール−N,N,N′,N′−四酢酸およびその塩、ジエチレ
ントリアミン五酢酸およびその塩、エチレンジアミンジ
オルトヒドロキシフェニル酢酸およびその塩、エチレン
ジアミン二酢酸およびその塩、エチレンジアミン二プロ
ピル酸およびその塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミ
ン三酢酸およびその塩、エチレンジアミンテトラキス
（メチレンホスホン酸）およびその塩、グリコールエー
テルジアミン四酢酸およびその塩、ヒドロキシエチルイ
ミノ二酢酸およびその塩、イミノ二酢酸およびその塩、
ジアミノプロパン四酢酸およびその塩、ニトリロ三酢酸
およびその塩、ニトリロ三プロピオン酸およびその塩、
ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）およびその塩、
トリエチレンテトラミン六酢酸およびその塩などを云う
が、これらのキレート剤に制限されることはない。
（０−アミノフェノキシ）エタン−N,N,N′,N′−四酢
酸およびその塩、トランス−1,2−シクロヘキサンジア
ミン−N,N,N′,N′−四酢酸およびその塩、ジヒドロキ
シエチルグリシンおよびその塩、1,3−ジアミノプロパ
ノール−N,N,N′,N′−四酢酸およびその塩、ジエチレ
ントリアミン五酢酸およびその塩、エチレンジアミンジ
オルトヒドロキシフェニル酢酸およびその塩、エチレン
ジアミン二酢酸およびその塩、エチレンジアミン二プロ
ピル酸およびその塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミ
ン三酢酸およびその塩、エチレンジアミンテトラキス
（メチレンホスホン酸）およびその塩、グリコールエー
テルジアミン四酢酸およびその塩、ヒドロキシエチルイ
ミノ二酢酸およびその塩、イミノ二酢酸およびその塩、
ジアミノプロパン四酢酸およびその塩、ニトリロ三酢酸
およびその塩、ニトリロ三プロピオン酸およびその塩、
ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）およびその塩、
トリエチレンテトラミン六酢酸およびその塩などを云う
が、これらのキレート剤に制限されることはない。
本発明はATP又は／及びキレート剤の添加によって上記
式（III）→式（IV）への変化を行わせるものである。
即ち、検体中のアンモニア又はピルビン酸の完全消費を
式（III）で行わせ、完全消費ののち反後系にATP又は／
及びキレート剤を添加し、NAD+→NADHの反応を停止さ
せ、その後は検体中の被検物を分解し、NADH→NAD+の反
応によってNADHを消費して正確な被検物の定量を行うも
のである。
式（III）→式（IV）への変化を行わせるものである。
即ち、検体中のアンモニア又はピルビン酸の完全消費を
式（III）で行わせ、完全消費ののち反後系にATP又は／
及びキレート剤を添加し、NAD+→NADHの反応を停止さ
せ、その後は検体中の被検物を分解し、NADH→NAD+の反
応によってNADHを消費して正確な被検物の定量を行うも
のである。
本発明における、ATP又は／及びキレート剤によるiCDH
反応の停止は、反応を停止したそのままの媒質でNADH→
NAD+の反応を用い各種反応が行える点できわめて有用で
ある。
反応の停止は、反応を停止したそのままの媒質でNADH→
NAD+の反応を用い各種反応が行える点できわめて有用で
ある。
反応系に対するATPの添加量は15mM以上であればよい。
第１図はiCDH活性におよぼすATP濃度の影響をみた図で
あるが、ATP濃度が15mM以上でiCDHは完全に活性を失っ
ているのが分る。
第１図はiCDH活性におよぼすATP濃度の影響をみた図で
あるが、ATP濃度が15mM以上でiCDHは完全に活性を失っ
ているのが分る。
また、反応系に対するキレート剤、例えばEDTAの添加量
は10mM以上であればよい。第２図はiCDH活性におよぼす
EDTA濃度の影響をみた図であるが、EDTA濃度が10mM以上
でiCDHは完全に活性を失っているのが分る。
は10mM以上であればよい。第２図はiCDH活性におよぼす
EDTA濃度の影響をみた図であるが、EDTA濃度が10mM以上
でiCDHは完全に活性を失っているのが分る。
本発明のiCDHの反応停止法は、分解してアンモニアを生
成する物質の定量やこれに関連する酵素活性の測定に利
用でき、また、分解してピルビン酸を生成する物質の定
量やこれに関連する酵素活性の測定に利用できるもので
ある。
成する物質の定量やこれに関連する酵素活性の測定に利
用でき、また、分解してピルビン酸を生成する物質の定
量やこれに関連する酵素活性の測定に利用できるもので
ある。
次に本発明の実施例を示す。
実施例1. MgCl2 5mM イソクエン酸 2mM NAD+ 1mM AMP 0.5mM 以上を含有する0.1Mトリス−塩酸緩衝液（pH＝8.0）3ml
にATP濃度が０〜20mMになるように添加し、それぞれ25
℃に保温した後、約3u/mlののiCDHを20μ添加し、分
光光度計により340nmの吸収の増大でiCDH活性を測定し
た。
にATP濃度が０〜20mMになるように添加し、それぞれ25
℃に保温した後、約3u/mlののiCDHを20μ添加し、分
光光度計により340nmの吸収の増大でiCDH活性を測定し
た。
結果を第１図に示した。
実施例2. MgCl2 1mM イソクエン酸 2mM NAD+ 1mM AMP 0.5mM 以上を含有する0.1M Tris−塩酸緩衝液（pH＝8.0）3ml
にEDTA濃度が０〜20mMになるように添加し、それぞれ25
℃に保温した後、約3u/mlののiCDHを20μ添加し、分
光光度計により340nmの吸収の増大でiCDH活性を測定し
た。
にEDTA濃度が０〜20mMになるように添加し、それぞれ25
℃に保温した後、約3u/mlののiCDHを20μ添加し、分
光光度計により340nmの吸収の増大でiCDH活性を測定し
た。
結果を第２図に示した。
実施例3. α−KG 10mM NADH 0.16mM イソクエン酸 5mM ADP 0.5mM MgCl2 1mM GlDH 100u/ml iCDH 2u/ml 以上を含有する0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）2.4mlに160m
Mアンモニアを含む様々な濃度に調整した尿素含有検体
（尿素態−窒素として０〜1000mg/dl）30μ添加し
た。それぞれ37℃で５分間保温したのちATP、ウレアー
ゼ濃度がそれぞれ20mM、0.1u/mlになるようにATP、ウレ
アーゼ混液を0.6ml加え分光光度計により25℃での340nm
の１分間における吸収の減少から検体中の尿素態−窒素
を測定した。測定結果を下に示す。
Mアンモニアを含む様々な濃度に調整した尿素含有検体
（尿素態−窒素として０〜1000mg/dl）30μ添加し
た。それぞれ37℃で５分間保温したのちATP、ウレアー
ゼ濃度がそれぞれ20mM、0.1u/mlになるようにATP、ウレ
アーゼ混液を0.6ml加え分光光度計により25℃での340nm
の１分間における吸収の減少から検体中の尿素態−窒素
を測定した。測定結果を下に示す。
実施例4. α−KG 10mM NADH 0.16mM イソクエン酸 5mM ADP 0.5mM MgCl2 1mM GlDH 100u/ml iCDH 4u/ml 以上を含有する0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5）2.4mlに160m
Mアンモニアを含む様々な濃度に調整した尿素含有検体
（尿素態−窒素として０〜1000mg/dl）30μ添加し
た。それぞれ37℃で５分間保温したのちEDJA、ウレアー
ゼ濃度がそれぞれ10mM、0.1u/mlになるようにEDTAウレ
アーゼ混液を0.6ml加え分光光度計により25℃での340nm
の１分間における吸収の減少から検体中の尿素態−窒素
を測定した。
Mアンモニアを含む様々な濃度に調整した尿素含有検体
（尿素態−窒素として０〜1000mg/dl）30μ添加し
た。それぞれ37℃で５分間保温したのちEDJA、ウレアー
ゼ濃度がそれぞれ10mM、0.1u/mlになるようにEDTAウレ
アーゼ混液を0.6ml加え分光光度計により25℃での340nm
の１分間における吸収の減少から検体中の尿素態−窒素
を測定した。
測定結果を下に示す。
第１図はiCDH活性におよぼすATP濃度の影響をみた図
で、第２図はiCDH活性におよぼすEDTA濃度の影響をみた
図である。
で、第２図はiCDH活性におよぼすEDTA濃度の影響をみた
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−31697（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−31700（ＪＰ，Ａ) 丸尾文治、田宮信雄監修「酵素ハンドブ ック」朝倉書店（1982−12−１）Ｐ．15− 16 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．229 （３），Ｐ．817−822，1985 Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ ｙｓ，240（１）Ｐ．128−134，1985
Claims (1)
- 【請求項１】NADHからNAD+への反応により検体中の特定
の物質を測定する際に、測定系に悪影響を与える物質を
あらかじめNADHを用いて消去することにより生成するNA
D+を、イソクエン酸塩、マグネシウムイオン又はマンガ
ンイオンなどの金属イオン、およびイソクエン酸脱水素
酵素の共存下でNADHに再生する系で、NADHへの再生が完
了した後に、イソクエン酸脱水素酵素反応をATP又は／
及びキレート剤の添加によって停止せしめることを特徴
とするイソクエン酸脱水素酵素の反応停止法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60088850A JPH0673475B2 (ja) | 1985-04-26 | 1985-04-26 | イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法 |
| US06/856,440 US4742001A (en) | 1985-04-26 | 1986-04-22 | Method of terminating isocitrate dehydrogenase reaction in an analytical system |
| EP86105729A EP0199363B1 (en) | 1985-04-26 | 1986-04-25 | Method of terminating isocitrate dehydrogenase reaction |
| DE8686105729T DE3668471D1 (de) | 1985-04-26 | 1986-04-25 | Verfahren zur beendigung von isocitrat-dehydrogenasereaktionen. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60088850A JPH0673475B2 (ja) | 1985-04-26 | 1985-04-26 | イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61247400A JPS61247400A (ja) | 1986-11-04 |
| JPH0673475B2 true JPH0673475B2 (ja) | 1994-09-21 |
Family
ID=13954455
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60088850A Expired - Lifetime JPH0673475B2 (ja) | 1985-04-26 | 1985-04-26 | イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4742001A (ja) |
| EP (1) | EP0199363B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0673475B2 (ja) |
| DE (1) | DE3668471D1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5258286A (en) * | 1985-07-02 | 1993-11-02 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Method of terminating isocitrate dehydrogenase reaction |
| EP0207493B1 (en) * | 1985-07-02 | 1990-08-16 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Method of terminating isocitrate dehydrogenase reaction |
| US5229270A (en) * | 1986-11-17 | 1993-07-20 | Kanto Kagaku Kabushiki Kaisha | Reagent for the determination of chlorine ion |
| JP2534859B2 (ja) * | 1987-03-04 | 1996-09-18 | オリエンタル酵母工業株式会社 | 生体物質のエンザイムアツセイ |
| JP2748134B2 (ja) * | 1988-11-29 | 1998-05-06 | オリエンタル酵母工業株式会社 | マグネシウムの定量方法 |
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