JP2534859B2 - 生体物質のエンザイムアツセイ - Google Patents
生体物質のエンザイムアツセイInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生体物質の酵素分析法に関し、更に詳細に
は、本発明は、過酸化水素（H2O2）含有のエンザイムア
ッセイつまり、生物学的液体例えば血中や尿中に含まれ
る物質、又はH2O2を反応生成物とする生体物質を分析す
る方法に関するものである。したがって本発明によれ
ば、試料に存在するH2O2生成に関する多様な前駆物質の
量が定量され、それに対応して本発明は、そのような前
駆物質をオキシダーゼで処理してH2O2の量を定量するこ
とによって試料中の前駆物質の量、又はそれに関する酵
素の定量をも包含するものである。
は、本発明は、過酸化水素（H2O2）含有のエンザイムア
ッセイつまり、生物学的液体例えば血中や尿中に含まれ
る物質、又はH2O2を反応生成物とする生体物質を分析す
る方法に関するものである。したがって本発明によれ
ば、試料に存在するH2O2生成に関する多様な前駆物質の
量が定量され、それに対応して本発明は、そのような前
駆物質をオキシダーゼで処理してH2O2の量を定量するこ
とによって試料中の前駆物質の量、又はそれに関する酵
素の定量をも包含するものである。
（従来の技術） 従来、H2O2を検出系に用いる基質又は酸素の測定法に
おいて、生成したH2O2を定量する方法としては、ペルオ
キシダーゼ（POD）の存在下で水素供与体と電子又はラ
ジカル受容体（カプラー）を酸化縮合させ、H2O2で着色
物質を生成せしめ、これを比色定量する手法が知られて
いる。水素供与体として、比色試薬は一般にジメチルア
ニリン、ジエチルアニリン、ｏ−トリジン、ｏ−トルイ
ジン、ｐ−トルイジン、ｏ−フェニレンジアミン、Ｎ−
エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル−Ｎ′Ｍサクシニル
エチレンジアミン）、N,N′−ジメチル−ｐ−フェニレ
ンジアミン、ベンジジン、ｏ−アニシジン、ｐ−アニシ
ジン、ジアニシジン、ｏ−クレゾール、ｐ−クロロフェ
ノール、N,N−ジエチルメタトルイジン、Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−ト
ルイジンナトリウム（TDOS）、ｍ−クレゾール、α−ナ
フトール、β−ナフトール、カテコール、グアイアコー
ル、ピロガロール、2,7−ジアミノフルオレン、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′−アセチルエ
チレンジアミン、ロイコインドフェノール、2,4−ジク
ロロフェノール、２−ヒドロキシル−3,5−ジクロロベ
ンゼンスルホン酸のような化合物を含むものである。カ
プラーとしての比色試薬は、一般に２−チオフェネカル
ボン酸ヒドラジン、ベンジジン、３−メチル−２−ベン
ズチアゾリノン・ヒドラゾン、および４−アミノアンチ
モンのような化合物を含むものである。
おいて、生成したH2O2を定量する方法としては、ペルオ
キシダーゼ（POD）の存在下で水素供与体と電子又はラ
ジカル受容体（カプラー）を酸化縮合させ、H2O2で着色
物質を生成せしめ、これを比色定量する手法が知られて
いる。水素供与体として、比色試薬は一般にジメチルア
ニリン、ジエチルアニリン、ｏ−トリジン、ｏ−トルイ
ジン、ｐ−トルイジン、ｏ−フェニレンジアミン、Ｎ−
エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル−Ｎ′Ｍサクシニル
エチレンジアミン）、N,N′−ジメチル−ｐ−フェニレ
ンジアミン、ベンジジン、ｏ−アニシジン、ｐ−アニシ
ジン、ジアニシジン、ｏ−クレゾール、ｐ−クロロフェ
ノール、N,N−ジエチルメタトルイジン、Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−ト
ルイジンナトリウム（TDOS）、ｍ−クレゾール、α−ナ
フトール、β−ナフトール、カテコール、グアイアコー
ル、ピロガロール、2,7−ジアミノフルオレン、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ′−アセチルエ
チレンジアミン、ロイコインドフェノール、2,4−ジク
ロロフェノール、２−ヒドロキシル−3,5−ジクロロベ
ンゼンスルホン酸のような化合物を含むものである。カ
プラーとしての比色試薬は、一般に２−チオフェネカル
ボン酸ヒドラジン、ベンジジン、３−メチル−２−ベン
ズチアゾリノン・ヒドラゾン、および４−アミノアンチ
モンのような化合物を含むものである。
又、過酸化物活性化剤としてパーオキシダーゼの他に
タングステン酸、タングステン酸の塩、モリブデン酸、
モリブデン酸の塩、ヨウ化物とこれら無機化合物の１つ
との混合物等がある。
タングステン酸、タングステン酸の塩、モリブデン酸、
モリブデン酸の塩、ヨウ化物とこれら無機化合物の１つ
との混合物等がある。
しかし、このような従来法によれば、感度が低いこ
と、悪臭があること、試薬安定性が悪い事、血清等検体
によってはヘモグロビンやビリルビン等色素体の色調に
影響を受けやすい事、又、相対的な測定しかできないか
ら試薬ブランクの変動に対して安定したデータが得られ
ないという欠点を有するものであった。
と、悪臭があること、試薬安定性が悪い事、血清等検体
によってはヘモグロビンやビリルビン等色素体の色調に
影響を受けやすい事、又、相対的な測定しかできないか
ら試薬ブランクの変動に対して安定したデータが得られ
ないという欠点を有するものであった。
又、H2O2をエタノール又はメタノールとともにカタラ
ーゼを反応させ、生成するアセトアルデヒド又は、ホル
ムアルデヒドをそれぞれアセトアルデヒド脱水素酵素、
ホルムアルデヒド脱水素酵素を添加し、NAD（Ｐ）Ｈの
増加によって測定する方法も知られている。
ーゼを反応させ、生成するアセトアルデヒド又は、ホル
ムアルデヒドをそれぞれアセトアルデヒド脱水素酵素、
ホルムアルデヒド脱水素酵素を添加し、NAD（Ｐ）Ｈの
増加によって測定する方法も知られている。
しかしアセトアルデヒドの場合、アルコールを多飲す
るようなヒトの検体では血中や尿中に大量のアセトアル
デヒドが含有されるので、正確な測定が困難であった。
それらの問題点の対策として内因性の物質の影響の回避
法が実施されている。
るようなヒトの検体では血中や尿中に大量のアセトアル
デヒドが含有されるので、正確な測定が困難であった。
それらの問題点の対策として内因性の物質の影響の回避
法が実施されている。
第１の方法は、消去段階でカタラーゼを用い消去完了
後、アジ化ナトリウムによってカタラーゼ活性を停止
し、その後反応生成物としてH2O2を生成する酵素又は基
質を添加し、POD発色系によって測定するものである。
これは、カタラーゼがアジ化ナトリウムによって完全に
停止するかが不明である事又は、POD等のオキシダーゼ
酵素全般において阻害作用がある事等に問題を有する。
後、アジ化ナトリウムによってカタラーゼ活性を停止
し、その後反応生成物としてH2O2を生成する酵素又は基
質を添加し、POD発色系によって測定するものである。
これは、カタラーゼがアジ化ナトリウムによって完全に
停止するかが不明である事又は、POD等のオキシダーゼ
酵素全般において阻害作用がある事等に問題を有する。
第２の方法は、影響物質に直接的又は、他の酵素や基
質の存在のもとで間接的にオキシダーゼを作用させ、生
じたH2O2をPODの存在下で水素供与体と縮合させ、可視
部に吸収を示さない不活性な化合物を生成させる事によ
って消去した後、測定を開始させるものである（特公昭
57−29159号）。
質の存在のもとで間接的にオキシダーゼを作用させ、生
じたH2O2をPODの存在下で水素供与体と縮合させ、可視
部に吸収を示さない不活性な化合物を生成させる事によ
って消去した後、測定を開始させるものである（特公昭
57−29159号）。
しかし実際は可視部に少しながら吸収を有し、比色測
定に、とりわけ、微量の体液物質の測定に正の誤差を与
えてしまう欠点を有する。
定に、とりわけ、微量の体液物質の測定に正の誤差を与
えてしまう欠点を有する。
第３の方法は、特開昭61−1737に示されるように、共
存するPODの10倍以下のカタラーゼを使用する事により
アジ化ナトリウムの添加を不用にできる事も公知であ
る。しかし、この場合もカタラーゼ活性を停止せずに測
定を開始するので、測定中にカタラーゼによるH2O2の分
解は避けられず、負の誤差ができる事は明らかである。
存するPODの10倍以下のカタラーゼを使用する事により
アジ化ナトリウムの添加を不用にできる事も公知であ
る。しかし、この場合もカタラーゼ活性を停止せずに測
定を開始するので、測定中にカタラーゼによるH2O2の分
解は避けられず、負の誤差ができる事は明らかである。
このように、いずれも何らかの問題を有している。
（発明が解決しようとする問題点） 上記したようにペルオキシダーゼ法は、感度が低く正
確な測定ができない等の欠点があるし、カタラーゼ法に
おいても、正確な測定を行うために実施されている内因
性物質の除去も満足のいくような結果は得られないとい
う欠点があり、いずれも既知の方法には問題がある。
確な測定ができない等の欠点があるし、カタラーゼ法に
おいても、正確な測定を行うために実施されている内因
性物質の除去も満足のいくような結果は得られないとい
う欠点があり、いずれも既知の方法には問題がある。
（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記した欠点のない全く新規なH2O2を反応
生成物とする、生体物質の定量方法を開発するためにな
されたものであるが、検体を希釈することなく簡単にし
かも他のものに影響を受けず又、自動分析装置に応用可
能な方法が望まれているという業界の要望に応えるには
紫外部での吸光度測定が最適であるとの観点にたち、新
規なエンザイムアッセイに開発するためになされたもの
である。
生成物とする、生体物質の定量方法を開発するためにな
されたものであるが、検体を希釈することなく簡単にし
かも他のものに影響を受けず又、自動分析装置に応用可
能な方法が望まれているという業界の要望に応えるには
紫外部での吸光度測定が最適であるとの観点にたち、新
規なエンザイムアッセイに開発するためになされたもの
である。
上記の目的を達成するために酵素分析、酵素学、生化
学、分析化学等多分野に亘って鋭意研究した結果、本発
明が完成されたものである。すなわち、本発明はH2O2を
検出系に用いる基質又は酵素の測定法において検出系に
必要なすべての酵素又は酵素群、基質又は基質群を添加
し、生成した物質にオキシダーゼを作用させ、生成した
H2O2に還元型グルタチオン（GSH）の存在下にGSHPODの
作用により生成した酸化型GSH（GSSG）をGSH還元酵素
（GR）によってNADPH又はNADHからNADP+又はNAD+を生成
させ、紫外部の吸光度変化で該生成したH2O2を測定する
事によって目的の基質又は、酵素を測定する際に、あら
かじめ、検体中に存在する測定系に関与し測定誤差を生
じる内因性物質をイソクエン酸、金属イオン及びイソク
エン酸脱水素酵素（iCDH）の共役反応によって消費し、
消去終了後金属キレート剤を添加し、iCDHの反応を完全
に停止し、これと同時又はしかる後最終反応生成物とし
て過酸化水素を生じる酵素又は基質を添加し、それによ
って生成するH2O2を何れの物質の影響も受けることなく
測定する事を特徴としたH2O2を反応生成物とする生体物
質の定量法である。以下、本発明を詳細に説明する。
学、分析化学等多分野に亘って鋭意研究した結果、本発
明が完成されたものである。すなわち、本発明はH2O2を
検出系に用いる基質又は酵素の測定法において検出系に
必要なすべての酵素又は酵素群、基質又は基質群を添加
し、生成した物質にオキシダーゼを作用させ、生成した
H2O2に還元型グルタチオン（GSH）の存在下にGSHPODの
作用により生成した酸化型GSH（GSSG）をGSH還元酵素
（GR）によってNADPH又はNADHからNADP+又はNAD+を生成
させ、紫外部の吸光度変化で該生成したH2O2を測定する
事によって目的の基質又は、酵素を測定する際に、あら
かじめ、検体中に存在する測定系に関与し測定誤差を生
じる内因性物質をイソクエン酸、金属イオン及びイソク
エン酸脱水素酵素（iCDH）の共役反応によって消費し、
消去終了後金属キレート剤を添加し、iCDHの反応を完全
に停止し、これと同時又はしかる後最終反応生成物とし
て過酸化水素を生じる酵素又は基質を添加し、それによ
って生成するH2O2を何れの物質の影響も受けることなく
測定する事を特徴としたH2O2を反応生成物とする生体物
質の定量法である。以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は２つの反応系により成り、まず第１の反応系
はH2O2の検出系となる反応で、反応系は次の（１）式で
表される。
はH2O2の検出系となる反応で、反応系は次の（１）式で
表される。
H2O2を検出系に用いる酵素及び基質を測定する際、生
成したH2O2をGSHの充分存在する中でGSHPODと反応さ
せ、生成するGSSGをGRによって還元し、それにともなう
NAD（Ｐ）Ｈの減少を通常波長340nmで測る事によって定
量する方法である。すなわち本発明の方法は、NAD
（Ｐ）Ｈの減少による吸光度の減少を測定するため、測
定波長は検体等の色調の影響を受けず、分子吸光係数も
既知であるので最も正確に測定できるのである。又過剰
量のGSHが加えられているため、システイン、GSH、アス
コルビン酸等還元性物質の影響を受けにくい方法であ
る。
成したH2O2をGSHの充分存在する中でGSHPODと反応さ
せ、生成するGSSGをGRによって還元し、それにともなう
NAD（Ｐ）Ｈの減少を通常波長340nmで測る事によって定
量する方法である。すなわち本発明の方法は、NAD
（Ｐ）Ｈの減少による吸光度の減少を測定するため、測
定波長は検体等の色調の影響を受けず、分子吸光係数も
既知であるので最も正確に測定できるのである。又過剰
量のGSHが加えられているため、システイン、GSH、アス
コルビン酸等還元性物質の影響を受けにくい方法であ
る。
次に第２の反応系である測定に誤差ないし悪影響を与
える体液中の内因性物質を消去する系（消去系）を式
（２）に示す。本発明の消去系の特徴は消去に際して減
少したNAD（Ｐ）Ｈをイソクエン酸及び金属イオンの存
在下でiCDHによってNAD（Ｐ）＋から再生することにあ
る。
える体液中の内因性物質を消去する系（消去系）を式
（２）に示す。本発明の消去系の特徴は消去に際して減
少したNAD（Ｐ）Ｈをイソクエン酸及び金属イオンの存
在下でiCDHによってNAD（Ｐ）＋から再生することにあ
る。
（式中、α−KG:α−ケトグルタル酸） そもそも血清や尿等の生物検体中には、GSSGが含まれ
るほか、過酸化物をはじめとするGSHを酸化する物質が
含まれ、それと同時に、測定対象物である基質や酵素等
の生体物質を測定する反応系に関与するとともに測定に
誤差を与える物質（内因性物質）が含まれることが多
い。
るほか、過酸化物をはじめとするGSHを酸化する物質が
含まれ、それと同時に、測定対象物である基質や酵素等
の生体物質を測定する反応系に関与するとともに測定に
誤差を与える物質（内因性物質）が含まれることが多
い。
例えば次のような生体物質を測定する場合、内因性物
質としては、次のものが例示される。
質としては、次のものが例示される。
（１）トリグリセライドの場合： 遊離グリセロール、グリセロール−３−リン酸。
（２）クレアチニンの場合： クレアチン、ザルコシン。
（３）クレアチンの場合： ザルコシン。
（４）エステル型コレステロールの場合： 遊離コレステロール。
（５）レシチン、リゾレシチン、スフィンゴミエリン等
リン脂質の場合： コリン。
リン脂質の場合： コリン。
（６）遊離脂肪酸の場合： アセチルCoA。
（７）コリンエステラーゼの場合： コリン、オルソトルオイルコリン。
（８）アミラーゼの場合： マルトース、グルコース。
（９）モノアミンオキシダーゼの場合： アリルアミン。
（10）無機リンの場合： ヒポキサンチン。
（11）トランスアミナーゼの場合： オギザロ酢酸、ピルビン酸。
（12）シアル酸の場合： Ｎ−アセチルノイラミン酸、ピルビン酸。
（13）グアナーゼの場合： キサンチン。
（14）α−グルコースの場合： β−グルコース。
本発明は、このような内因性物質を含有する場合の検
体中において、これらの物質の影響を受けることなく目
的とする生体物質を正確に測定する方法に係り、特に、
下記するような重要な特徴を有するものである。
体中において、これらの物質の影響を受けることなく目
的とする生体物質を正確に測定する方法に係り、特に、
下記するような重要な特徴を有するものである。
すなわち、予じめ、反応生成物としてH2O2を生じる反
応に必要な酵素及び酵素群、基質及び基質群を添加し、
それによって生成した内因性物質に由来するH2O2をGSHP
OD、GRで消去しておき、一方、それによって消費された
NAD（Ｐ）Ｈについては、イソクエン酸、iCDH、マグネ
シウムイオン、マンガンイオン等の金属イオンの共役反
応によって、これを生成し、その後キレート剤でiCDHの
活性を止め、NAD（Ｐ）＋からNAD（Ｐ）Ｈへの反応を完
全に停止させ、これと同時もしくはしかる後、反応生成
物としてH2O2を生成せしめる酵素又は基質を添加するこ
とにより、H2O2を最終反応生成物とする測定対象物を、
他の物質の影響を受けず、正確に測定できるところに本
発明の重要な特徴が存するのである。
応に必要な酵素及び酵素群、基質及び基質群を添加し、
それによって生成した内因性物質に由来するH2O2をGSHP
OD、GRで消去しておき、一方、それによって消費された
NAD（Ｐ）Ｈについては、イソクエン酸、iCDH、マグネ
シウムイオン、マンガンイオン等の金属イオンの共役反
応によって、これを生成し、その後キレート剤でiCDHの
活性を止め、NAD（Ｐ）＋からNAD（Ｐ）Ｈへの反応を完
全に停止させ、これと同時もしくはしかる後、反応生成
物としてH2O2を生成せしめる酵素又は基質を添加するこ
とにより、H2O2を最終反応生成物とする測定対象物を、
他の物質の影響を受けず、正確に測定できるところに本
発明の重要な特徴が存するのである。
なお、本発明の測定系において、スーパーオキシドジ
スムターゼを更に添加してもさしつかえない。
スムターゼを更に添加してもさしつかえない。
ここで金属イオンとは、マグネシウムイオン、マンガ
ンイオン、鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、スズイオ
ン、カルシウムイオン等を云うが、これらのイオン種の
制限されることはない。
ンイオン、鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、スズイオ
ン、カルシウムイオン等を云うが、これらのイオン種の
制限されることはない。
又、キレート剤とはEDTAおよびその塩、1,2−ビス
（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−N,N,N′,N′−四酢
酸およびその塩、1,3−ジアミノプロパノール−N,N,
N′,N′−四酢酸およびその塩、ジエチレントリアミン
五酢酸、およびその塩、ジエチレンジアミンジオルトヒ
ドロキシフェニル酢酸およびその塩、エチレンジアミン
二酢酸およびその塩、エチレンジアミン二プロピオン酸
およびその塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢
酸およびその塩、エチレンジアミンテトラキス（メチレ
ンホスホン酸）およびその塩、グリコールエーテルジア
ミン四酢酸およびその塩、ヒドロキシエチルイミノ二酢
酸およびその塩、イミノ二酢酸およびその塩、ジアミノ
プロパン四酢酸及びその塩、ニトリロ三酢酸およびその
塩、ニトリロ三プロピオン酸およびその塩、ニトリロト
リス（メチレンホスホン酸）およびその塩、トリエチレ
ンテトラミン六酢酸およびその塩などを云うが、これら
のキレート剤に制限されることはない。
（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−N,N,N′,N′−四酢
酸およびその塩、1,3−ジアミノプロパノール−N,N,
N′,N′−四酢酸およびその塩、ジエチレントリアミン
五酢酸、およびその塩、ジエチレンジアミンジオルトヒ
ドロキシフェニル酢酸およびその塩、エチレンジアミン
二酢酸およびその塩、エチレンジアミン二プロピオン酸
およびその塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢
酸およびその塩、エチレンジアミンテトラキス（メチレ
ンホスホン酸）およびその塩、グリコールエーテルジア
ミン四酢酸およびその塩、ヒドロキシエチルイミノ二酢
酸およびその塩、イミノ二酢酸およびその塩、ジアミノ
プロパン四酢酸及びその塩、ニトリロ三酢酸およびその
塩、ニトリロ三プロピオン酸およびその塩、ニトリロト
リス（メチレンホスホン酸）およびその塩、トリエチレ
ンテトラミン六酢酸およびその塩などを云うが、これら
のキレート剤に制限されることはない。
本発明によってH2O2を反応生成物とする定量可能な基
質及び酵素の測定におけるH2O2生成系は、下記のごとき
ものがあるが、これは説明のために例示したものであっ
て、本発明の限定を意図するものではない。
質及び酵素の測定におけるH2O2生成系は、下記のごとき
ものがあるが、これは説明のために例示したものであっ
て、本発明の限定を意図するものではない。
次に本発明を具体的に説明するために下記に実施例を
示す。
示す。
実施例１ 0.6mMオキソン酸、2mM GSH、0.5mM NADPH、2mM Na
N3、0.5u/ml GR、1u/ml GSHPOD、1u/ml iCDH、5mMイソ
クエン酸、0.2mM MgCl2を含む0.1M K−PO4、pH7.5溶液
1.5mlに、検体として、120mg/dlの尿酸を順次希釈した
ものを75μ注入し、混和後37℃で３〜５分間報知し、
その後9u/mlウリカーゼ、20mM EDTA−4Naを含む0.1M K
−PO4、pH7.5溶液1.5mlを加え、混和し、37℃で反応さ
せ、340nmの吸光度の減少を３分間測定した。直線関係
の良い部分を読みとり、１分間あたりの吸光度変化（Δ
A340nm/分）を算出した。
N3、0.5u/ml GR、1u/ml GSHPOD、1u/ml iCDH、5mMイソ
クエン酸、0.2mM MgCl2を含む0.1M K−PO4、pH7.5溶液
1.5mlに、検体として、120mg/dlの尿酸を順次希釈した
ものを75μ注入し、混和後37℃で３〜５分間報知し、
その後9u/mlウリカーゼ、20mM EDTA−4Naを含む0.1M K
−PO4、pH7.5溶液1.5mlを加え、混和し、37℃で反応さ
せ、340nmの吸光度の減少を３分間測定した。直線関係
の良い部分を読みとり、１分間あたりの吸光度変化（Δ
A340nm/分）を算出した。
次表に示す結果が得られた。
表に示した通り、試薬比1:40で尿酸120mg/dlまで直線
性が得られた。
性が得られた。
実施例２ 次の成分 2 mM GSH 0.5mM NADPH 2 mM アジ化ナトリウム 0.5u/ml GR 2 u/ml iCDH 10 mM イソクエン酸 1 u/ml GSHPOD 0.2mM MgCl2 以上を含有する0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）
1.5mlに、０〜300mg/dlに希釈したコレステロール水溶
液を20μ添加し、37℃で５分間放置する。その後20mM
EDTA−4Na及び6u/mlのコレステロールオキシダーゼを
含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）1.5mlを添加後
37℃で15分間放置し、恒温槽から取り出し、室温で約10
分間放温した後、波長340nmで吸光度を測定した。
1.5mlに、０〜300mg/dlに希釈したコレステロール水溶
液を20μ添加し、37℃で５分間放置する。その後20mM
EDTA−4Na及び6u/mlのコレステロールオキシダーゼを
含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）1.5mlを添加後
37℃で15分間放置し、恒温槽から取り出し、室温で約10
分間放温した後、波長340nmで吸光度を測定した。
次表に示す結果が得られた。
表に示した通り試薬比1:150で検体中のコレステロー
ルが定量され、直線性も良好であった。
ルが定量され、直線性も良好であった。
コレステロール量の計算式は次のとおりである。
ただし ΔＡ＝Ａ−A0（A0は試薬ブランクを表わし、検体番号１
を使用） 6.2 ＝NADPHの1mMの吸光度 3.02＝全反応液量（ml） 0.02＝検体量（ml） 386.64＝コレステロールの分子量 実施例３ 次の成分 5 u/ml マルトースホスホリラーゼ 10 u/ml グルコースオキシダーゼ 0.2 mM MgCl2 1.5 mM GSH 0.38mM NADPH 0.75u/ml GR 1.5 u/ml GSHPOD 1.5 u/ml iCDH 7.5 mM イソクエン酸 0.1 M リン酸緩衝液（pH7.2） 以上の反応液2mlに、アミラーゼ活性の既知の患者血
清検体A 152u/、B 329u/、C 192u/、D 211u/、
E 436u/を、50μ注入し、混和後37℃で３〜５分間
放置し、その後、0.03mMマルトペンタオース、30mM EDT
Aを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.2）1mlを加え混和し、3
7℃で反応させ340nmでの１分間あたりの吸光度の変化量
を測定した。次の表のような結果を得た。
を使用） 6.2 ＝NADPHの1mMの吸光度 3.02＝全反応液量（ml） 0.02＝検体量（ml） 386.64＝コレステロールの分子量 実施例３ 次の成分 5 u/ml マルトースホスホリラーゼ 10 u/ml グルコースオキシダーゼ 0.2 mM MgCl2 1.5 mM GSH 0.38mM NADPH 0.75u/ml GR 1.5 u/ml GSHPOD 1.5 u/ml iCDH 7.5 mM イソクエン酸 0.1 M リン酸緩衝液（pH7.2） 以上の反応液2mlに、アミラーゼ活性の既知の患者血
清検体A 152u/、B 329u/、C 192u/、D 211u/、
E 436u/を、50μ注入し、混和後37℃で３〜５分間
放置し、その後、0.03mMマルトペンタオース、30mM EDT
Aを含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.2）1mlを加え混和し、3
7℃で反応させ340nmでの１分間あたりの吸光度の変化量
を測定した。次の表のような結果を得た。
アミラーゼ活性値計算式は次のとおりである。
但し、 3.05:最終液量（ml） 0.05:検体液量（ml） 6.2 :NADPHの分子吸光係数（mM） 実施例４ 20u/mlクレアチンアミジノハイドロラーゼ、0.5u/ml
ザルコシンオキシダーゼ、2mM GSH、0.4mM NADPH、0.5u
/ml GR、1u/ml GSHPOD、2u/ml iCDH、5mMイソクエン
酸、0.2mM MgCl2を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.8）1ml
に、０から100mg/dlに希釈したクレアチン水溶液を20μ
添加し、37℃で５分間放置する。その後、20mM EDTA
・4Na、32u/mlのクレアチニンアミドハイドロラーゼを
含む0.1Mリン酸緩衝液pH7.8を1ml添加後、37℃で反応さ
せ、２分後から30秒間の吸光度の変化をよみとり、１分
間あたりの吸光度変化を算出した。
ザルコシンオキシダーゼ、2mM GSH、0.4mM NADPH、0.5u
/ml GR、1u/ml GSHPOD、2u/ml iCDH、5mMイソクエン
酸、0.2mM MgCl2を含む0.1Mリン酸緩衝液（pH7.8）1ml
に、０から100mg/dlに希釈したクレアチン水溶液を20μ
添加し、37℃で５分間放置する。その後、20mM EDTA
・4Na、32u/mlのクレアチニンアミドハイドロラーゼを
含む0.1Mリン酸緩衝液pH7.8を1ml添加後、37℃で反応さ
せ、２分後から30秒間の吸光度の変化をよみとり、１分
間あたりの吸光度変化を算出した。
以下の表が示すようなデータを得た。
以上のように良好な直線関係が認められた。
実施例５ 先ずはじめに、標準トリオレイン（250mg/dl）溶液と
グリセロール溶液を用いて、下記の表に示す濃度を有す
る検体を調製した。
グリセロール溶液を用いて、下記の表に示す濃度を有す
る検体を調製した。
次に、0.36u/mlグリセロールキナーゼ、2mM GSH、0.2
mM MgCl2、1u/ml iCDH、5mMイソクエン酸、5u/mlグリセ
ロール−３−リン酸−オキシダーゼ、0.5mM NADPH、0.5
u/ml GR、1u/ml GSHPOD、0.002mM ATPを含む50mMトリス
塩酸緩衝液（pH7.8）1.5mlに、上記検体各々20μを注
入し、混合後、37℃で10分間放置し、その後10u/mlリポ
プロティンリパーゼ、20mM EDTA−4Naを含む50mMトリス
・塩酸緩衝液pH7.8を1.5ml添加後、37℃で15分間放置
し、恒温槽からとり出し、室温で約10分間放置した後、
波長340nmで吸光度を測定した。
mM MgCl2、1u/ml iCDH、5mMイソクエン酸、5u/mlグリセ
ロール−３−リン酸−オキシダーゼ、0.5mM NADPH、0.5
u/ml GR、1u/ml GSHPOD、0.002mM ATPを含む50mMトリス
塩酸緩衝液（pH7.8）1.5mlに、上記検体各々20μを注
入し、混合後、37℃で10分間放置し、その後10u/mlリポ
プロティンリパーゼ、20mM EDTA−4Naを含む50mMトリス
・塩酸緩衝液pH7.8を1.5ml添加後、37℃で15分間放置
し、恒温槽からとり出し、室温で約10分間放置した後、
波長340nmで吸光度を測定した。
その結果は以下の表のとおりであった。
トリオレインの分子量を885.45として試薬ブランクを
引いたΔA340nmからグリセロール量を算出した。
引いたΔA340nmからグリセロール量を算出した。
以上のことより、トリオレインを、添加したグリセロ
ールの影響なしに測定できる事が証明された。
ールの影響なしに測定できる事が証明された。
（発明の効果） 本発明はiCDHを用いたNAD（Ｐ）Ｈ再生系で内因性物
質を消去した後、生成してくる過酸化水素を測定すると
いう新規な構成を採用したことによって、既知の方法に
優る次のような卓越した利点を有する。すなわち、本発
明は、過酸化水素を検出系に用いる生体物質の測定法に
おいて、検体にグルタチオン・パーオキシターゼ、グル
タチオン還元酵素、イソクエン酸、NAD（Ｐ）Ｈ、金属
イオン及びイソクエン酸脱水素酵素とともに、反応生成
物として過酸化水素を生じる反応に必要な酵素もしくは
酵素群及び又は基質もしくは基質群を添加混合し、検体
中に存在する目的の基質及び酵素等の生体物質を測定す
る反応系に関与し、しかも測定に誤差を与える体液中の
内因性物椎を消費せしめ、次いで金属キレート剤を添加
し、イソクエン酸脱水素酵素の反応を停止し、これと同
時もしくは、しかる後反応生成物として過酸化水素を生
じる酵素もしくは基質を添加してそれによって生成する
過酸化水素を測定する事を重要なポイントとする過酸化
水素を反応生成物とする生体物質の定量法という新規な
構成を採用することによって、測定を妨害する因子を排
除して正確な測定を実施できるという著効を奏するもの
である。生体内にはこのような因子が多数含まれている
ので、本発明は、特に、生体サンプル内の生体物質を定
量する方法としてすぐれており、各種診断に有利に利用
することができる。
質を消去した後、生成してくる過酸化水素を測定すると
いう新規な構成を採用したことによって、既知の方法に
優る次のような卓越した利点を有する。すなわち、本発
明は、過酸化水素を検出系に用いる生体物質の測定法に
おいて、検体にグルタチオン・パーオキシターゼ、グル
タチオン還元酵素、イソクエン酸、NAD（Ｐ）Ｈ、金属
イオン及びイソクエン酸脱水素酵素とともに、反応生成
物として過酸化水素を生じる反応に必要な酵素もしくは
酵素群及び又は基質もしくは基質群を添加混合し、検体
中に存在する目的の基質及び酵素等の生体物質を測定す
る反応系に関与し、しかも測定に誤差を与える体液中の
内因性物椎を消費せしめ、次いで金属キレート剤を添加
し、イソクエン酸脱水素酵素の反応を停止し、これと同
時もしくは、しかる後反応生成物として過酸化水素を生
じる酵素もしくは基質を添加してそれによって生成する
過酸化水素を測定する事を重要なポイントとする過酸化
水素を反応生成物とする生体物質の定量法という新規な
構成を採用することによって、測定を妨害する因子を排
除して正確な測定を実施できるという著効を奏するもの
である。生体内にはこのような因子が多数含まれている
ので、本発明は、特に、生体サンプル内の生体物質を定
量する方法としてすぐれており、各種診断に有利に利用
することができる。
また、本発明によれば、試料中の物質又は特定の反応
を経て生成した物質に酸化酵素を作用させる事によっ
て、その反応系に関与するすべての酵素あるいは基質を
過酸化水素に導くことによって測定を実施する優れた測
定試薬も提供することができる。
を経て生成した物質に酸化酵素を作用させる事によっ
て、その反応系に関与するすべての酵素あるいは基質を
過酸化水素に導くことによって測定を実施する優れた測
定試薬も提供することができる。
これは分子吸効係数の明確なNAD（Ｐ）Ｈの減少で測
定する事、検体の色調及び反応pH等の影響を受けにくい
測定法である事、iCDHとGRの共約反応を利用し、還元型
グルタチオン、NAD（Ｐ）Ｈの再生が可能で、内因性の
影響物質の消去によるバックグランドの変動を回避でき
る事を意味する。又本発明によって、エンドポイント法
およびレートアッセイ法による自動分析機への適応が可
能で短時間に正確かつ容易な測定が可能になったのであ
る。
定する事、検体の色調及び反応pH等の影響を受けにくい
測定法である事、iCDHとGRの共約反応を利用し、還元型
グルタチオン、NAD（Ｐ）Ｈの再生が可能で、内因性の
影響物質の消去によるバックグランドの変動を回避でき
る事を意味する。又本発明によって、エンドポイント法
およびレートアッセイ法による自動分析機への適応が可
能で短時間に正確かつ容易な測定が可能になったのであ
る。
Claims (1)
- 【請求項１】ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（NAD）−還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド（NADH）、またはニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸（NADP）−還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸（NADPH）の酸化還元反応を共役反
応として利用し、過酸化水素を測定する酵素分析方法に
おいて； 予じめ試料にイソクエン酸、金属イオン及びイソクエン
酸脱水素酸素を添加して分析を阻害する内因性物質を消
費せしめると同時に減少したNAD（Ｐ）Ｈを再生し、し
かる後にイソクエン酸脱水素酵素を失活せしめ、これと
同時に又はその後で反応生成物として過酸化水素を生成
する酵素又は基質を添加し、それによって生成する過酸
化水素を測定すること、を特徴とする過酸化水素を反応
生成物とする生体物質の定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62047725A JP2534859B2 (ja) | 1987-03-04 | 1987-03-04 | 生体物質のエンザイムアツセイ |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62047725A JP2534859B2 (ja) | 1987-03-04 | 1987-03-04 | 生体物質のエンザイムアツセイ |
| PCT/JP1988/000881 WO1990002817A1 (en) | 1988-09-02 | 1988-09-02 | Enzyme assay of biological substances |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63214199A JPS63214199A (ja) | 1988-09-06 |
| JP2534859B2 true JP2534859B2 (ja) | 1996-09-18 |
Family
ID=13930781
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62047725A Expired - Lifetime JP2534859B2 (ja) | 1987-03-04 | 1987-03-04 | 生体物質のエンザイムアツセイ |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2534859B2 (ja) |
| CA (1) | CA1335170C (ja) |
| DE (1) | DE3852498T2 (ja) |
| WO (1) | WO1990002817A1 (ja) |
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| KR100394213B1 (ko) * | 2000-07-24 | 2003-08-09 | 김미라 | 카보네이트 이온 선택성 ｆｉａ 바이오센서 및 이를이용한 이소시트레이트 정량분석방법 |
| JP3853744B2 (ja) * | 2002-10-31 | 2006-12-06 | キリンビバレッジ株式会社 | 飲食品有害菌の検査 |
| WO2013069645A1 (ja) * | 2011-11-10 | 2013-05-16 | ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 | エタノールアミンリン酸の測定方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59205999A (ja) * | 1983-05-10 | 1984-11-21 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 還元型補酵素の定量方法 |
| JPH0673475B2 (ja) * | 1985-04-26 | 1994-09-21 | オリエンタル酵母工業株式会社 | イソクエン酸脱水素酵素の反応停止法 |
| EP0207493B1 (en) * | 1985-07-02 | 1990-08-16 | Oriental Yeast Co., Ltd. | Method of terminating isocitrate dehydrogenase reaction |
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1987
- 1987-03-04 JP JP62047725A patent/JP2534859B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-09-02 DE DE3852498T patent/DE3852498T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-09-02 WO PCT/JP1988/000881 patent/WO1990002817A1/ja active IP Right Grant
- 1988-09-02 EP EP88907812A patent/EP0386237B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-05-24 CA CA000600565A patent/CA1335170C/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| DE3852498T2 (de) | 1995-08-03 |
| WO1990002817A1 (en) | 1990-03-22 |
| CA1335170C (en) | 1995-04-11 |
| EP0386237B1 (en) | 1994-12-14 |
| EP0386237A1 (en) | 1990-09-12 |
| JPS63214199A (ja) | 1988-09-06 |
| EP0386237A4 (en) | 1990-12-05 |
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