JPH0218078B2 - - Google Patents
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- JPH0218078B2 JPH0218078B2 JP14050382A JP14050382A JPH0218078B2 JP H0218078 B2 JPH0218078 B2 JP H0218078B2 JP 14050382 A JP14050382 A JP 14050382A JP 14050382 A JP14050382 A JP 14050382A JP H0218078 B2 JPH0218078 B2 JP H0218078B2
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- adenine dinucleotide
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はクレアチニンの定量方法に関するもの
である。
である。
更に詳細には、本発明はアンモニアを含有する
検体中に存在するクレアチニンをそのまま直接定
量する方法に関するものである。
検体中に存在するクレアチニンをそのまま直接定
量する方法に関するものである。
従来、生体に由来する血液、尿等の検体に存在
するクレアチニンを定量するには、検体中にすで
に存在しているアルカリピクリン酸反応（Jaffe
法）を妨害する物質を、透析処理や樹脂による吸
着処理等をして除去した後、Jaffe法にて定量す
るか、又は検体中のクレアチニンをクレアチンに
変換せしめる酵素を用いてクレアチンに変換せし
め、生成したクレアチンを種々の方法により定量
することによりクレアチニンを定量していた。
するクレアチニンを定量するには、検体中にすで
に存在しているアルカリピクリン酸反応（Jaffe
法）を妨害する物質を、透析処理や樹脂による吸
着処理等をして除去した後、Jaffe法にて定量す
るか、又は検体中のクレアチニンをクレアチンに
変換せしめる酵素を用いてクレアチンに変換せし
め、生成したクレアチンを種々の方法により定量
することによりクレアチニンを定量していた。
しかしながら、検体の透析処理は煩雑な上に検
体が希釈される欠点があり、樹脂による吸着処理
を操作が煩雑であるという欠点もあつて、いずれ
も好ましくない。またクレアチニンをクレアチニ
ンに変換せしめ、生成したクレアチニンを定量す
る方法は、クレアチンの定量にすでに３段階以上
もの反応をカツプリングさせた多段階の反応系で
あり、また検体中のクレアチンをあらかじめ消去
せしめるか、あらかじめ検体の盲検を行なわなけ
ればならず二度手間がかかる上に、検体量が少な
い場合は測定できないことになつて好ましいもの
ではなかつた。
体が希釈される欠点があり、樹脂による吸着処理
を操作が煩雑であるという欠点もあつて、いずれ
も好ましくない。またクレアチニンをクレアチニ
ンに変換せしめ、生成したクレアチニンを定量す
る方法は、クレアチンの定量にすでに３段階以上
もの反応をカツプリングさせた多段階の反応系で
あり、また検体中のクレアチンをあらかじめ消去
せしめるか、あらかじめ検体の盲検を行なわなけ
ればならず二度手間がかかる上に、検体量が少な
い場合は測定できないことになつて好ましいもの
ではなかつた。
本発明はこのようなクレアチニンの定量におけ
る従来の欠点を改善するためになされたものであ
る。
る従来の欠点を改善するためになされたものであ
る。
本発明はアンモニアを含有する検体にグルタミ
ン酸脱水素酵素（以下GlDHという）、α−オキ
ソグルタール酸（以下α−OGという）、還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエ
ート（以下NADPHという）、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドホスフエート（以下
NADP+という）を還元する酵素、及びNADP+
を還元する酵素の基質を添加し、検体中にすでに
存在するアンモニアを水とグルタミン酸に変化せ
しめ、その際生成されたニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフエートを、ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドホスフエートを還元せし
める酵素を用いて再度還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドホスフエートに変換せしめ、
しかる後、検体に過剰量のクレアチニンデイミナ
ーゼと還元型ニコチンアミドアデニン（以下
NADHという）を添加して反応せしめ、NADH
の減少量を340nmの吸光度の減少によつてクレア
チニンを定量する方法である。
ン酸脱水素酵素（以下GlDHという）、α−オキ
ソグルタール酸（以下α−OGという）、還元型
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ート（以下NADPHという）、ニコチンアミドア
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NADP+という）を還元する酵素、及びNADP+
を還元する酵素の基質を添加し、検体中にすでに
存在するアンモニアを水とグルタミン酸に変化せ
しめ、その際生成されたニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフエートを、ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドホスフエートを還元せし
める酵素を用いて再度還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドホスフエートに変換せしめ、
しかる後、検体に過剰量のクレアチニンデイミナ
ーゼと還元型ニコチンアミドアデニン（以下
NADHという）を添加して反応せしめ、NADH
の減少量を340nmの吸光度の減少によつてクレア
チニンを定量する方法である。
本発明の特色とするところは検体中にすでに存
在するアンモニアをGlDH、α−OGとNADPH
によつてグルタミン酸に変化させ、後にクレアチ
ンデイミナーゼの反応によりクレアチニンから生
ずるアンモニアを同じGlDHとNADHによつて
反応させてグルタミン酸と水に変化せしめる点に
ある。
在するアンモニアをGlDH、α−OGとNADPH
によつてグルタミン酸に変化させ、後にクレアチ
ンデイミナーゼの反応によりクレアチニンから生
ずるアンモニアを同じGlDHとNADHによつて
反応させてグルタミン酸と水に変化せしめる点に
ある。
本発明のクレアチニンの定量方法によれば検体
中にすでに存在するアンモニアを前もつて消費さ
せてしまつているので、同一検体でそのまま添加
したクレアチニンデイミナーゼにより検体中のク
レアチニンからアンモニアを生成させ直接生成す
るアンモニア全量をクレアチンデイミナーゼによ
つて分解されたアンモニアとして測定することが
できるのでクレアチニン含量は正確に測定するこ
とができる。
中にすでに存在するアンモニアを前もつて消費さ
せてしまつているので、同一検体でそのまま添加
したクレアチニンデイミナーゼにより検体中のク
レアチニンからアンモニアを生成させ直接生成す
るアンモニア全量をクレアチンデイミナーゼによ
つて分解されたアンモニアとして測定することが
できるのでクレアチニン含量は正確に測定するこ
とができる。
ここに示した本発明のアンモニア消費系の反応
の一例を式(1)で表せば次の通りである。
の一例を式(1)で表せば次の通りである。
本発明のクレアチニンの定量方法はアンモニア
を含有する検体中、例えば血清・尿中のクレアチ
ニンの定量に用いられる。これらの検体にはすで
に多量のアンモニアが絶えず存在しているために
直接グルタミン酸生成反応によつて測定するとク
レアチニン量に、相当量のアンモニア量を付加し
て測定されてしまうので正確な定量値が得られな
かつたものである。
を含有する検体中、例えば血清・尿中のクレアチ
ニンの定量に用いられる。これらの検体にはすで
に多量のアンモニアが絶えず存在しているために
直接グルタミン酸生成反応によつて測定するとク
レアチニン量に、相当量のアンモニア量を付加し
て測定されてしまうので正確な定量値が得られな
かつたものである。
本発明ではあらかじめ検体中のアンモニアを
NADPHにより消費させてしまつた後にクレア
チニンデイミナーゼを検体中のクレアチニンに作
用させるので、そこに生成するNADの量は正確
にクレアチニンの量として測定されるものであ
る。
NADPHにより消費させてしまつた後にクレア
チニンデイミナーゼを検体中のクレアチニンに作
用させるので、そこに生成するNADの量は正確
にクレアチニンの量として測定されるものであ
る。
本発明のクレアチンの定量法は、単にエンドポ
イント法によつてもアンモニアを含有する検体中
のクレアチニンを定量できるし、また適量なクレ
アチンデイミナーゼの量を選択することによつて
Rate Assayにてクレアチニンを定量できる。
イント法によつてもアンモニアを含有する検体中
のクレアチニンを定量できるし、また適量なクレ
アチンデイミナーゼの量を選択することによつて
Rate Assayにてクレアチニンを定量できる。
本発明においてあらかじめ存在するアンモニア
を消費させるには第一にアンモニアとα−ケトグ
ルタール酸より水とグルタミン酸を生成するグル
タミン酸脱水素酵素（GlDH）（EC1.4.1.3）が必
要となる。
を消費させるには第一にアンモニアとα−ケトグ
ルタール酸より水とグルタミン酸を生成するグル
タミン酸脱水素酵素（GlDH）（EC1.4.1.3）が必
要となる。
この反応には助酵素としてNADPHの存在が
必要であるが、NADPHの添加量を少なくする
ために反応で生成するNADP+を還元するグルコ
ース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−PDH）
（EC1.1.1.49）などのNADP+を還元する酵素を過
剰のグルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）など
のNADP+を還元する酵素反応基質と一緒に添加
しておいて６−ホスホグルコン酸（６−PG）を
生成させると同時にアンモニアをα−ケトグルタ
ール酸によつて完全に水とグルタミン酸に変化さ
せてしまうのである。
必要であるが、NADPHの添加量を少なくする
ために反応で生成するNADP+を還元するグルコ
ース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−PDH）
（EC1.1.1.49）などのNADP+を還元する酵素を過
剰のグルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）など
のNADP+を還元する酵素反応基質と一緒に添加
しておいて６−ホスホグルコン酸（６−PG）を
生成させると同時にアンモニアをα−ケトグルタ
ール酸によつて完全に水とグルタミン酸に変化さ
せてしまうのである。
式(1)の反応においてα−OG→グルタミン酸の
変化によつてNADPHがNADP+になると340nm
による吸光度が一旦は減少するがＧ−６−PDH
によつて再びNADPHに変化するために340nmに
よる吸光度は上昇し、吸光度の変化がなくなつた
らアンモニアが全部消費されたことになる。
変化によつてNADPHがNADP+になると340nm
による吸光度が一旦は減少するがＧ−６−PDH
によつて再びNADPHに変化するために340nmに
よる吸光度は上昇し、吸光度の変化がなくなつた
らアンモニアが全部消費されたことになる。
本発明のアンモニア消費群のうちGlDHは必須
であるが助酵素のNADP+を還元する酵素はＧ−
６−PDHに限らずNADP+を助酵素として還元す
る酵素であれば任意に選択することができる。例
えば Ｇ−６−PDH（EC1.1.1.49）（グルコース−６−
リン酸脱水素酵素） ６−Ｐ−GDH（EC1.1.1.44）（６ホスホグルコ
ン酸脱水素酵素） iC−DH（EC1.1.1.42）（イソクエン酸脱水素酵
素） などがあり、これらを用いる場合は、それぞれ過
剰の基質としてＧ−６−Ｐ、６−PG、イソクエ
ン酸をそれぞれ選択して添加すれば良い。このよ
うに検体中のすでに存在していたアンモニアは消
費されクレアチンデイミナーゼの作用によつて生
成するアンモニアは直接測定できる状態となつた
わけである。
であるが助酵素のNADP+を還元する酵素はＧ−
６−PDHに限らずNADP+を助酵素として還元す
る酵素であれば任意に選択することができる。例
えば Ｇ−６−PDH（EC1.1.1.49）（グルコース−６−
リン酸脱水素酵素） ６−Ｐ−GDH（EC1.1.1.44）（６ホスホグルコ
ン酸脱水素酵素） iC−DH（EC1.1.1.42）（イソクエン酸脱水素酵
素） などがあり、これらを用いる場合は、それぞれ過
剰の基質としてＧ−６−Ｐ、６−PG、イソクエ
ン酸をそれぞれ選択して添加すれば良い。このよ
うに検体中のすでに存在していたアンモニアは消
費されクレアチンデイミナーゼの作用によつて生
成するアンモニアは直接測定できる状態となつた
わけである。
次に本発明におけるクレアチニンを定量する場
合の反応系を式(2)で表わせば次の通りである。
合の反応系を式(2)で表わせば次の通りである。
なお、太線はアンモニア消費系の反応に関する
係で、細線はクレアチニンデイミナーゼの反応に
関する系である。
係で、細線はクレアチニンデイミナーゼの反応に
関する系である。
即ち、検体に定量するクレアチニン量に応じた
基質・酵素及び過剰のNADHを添加して反応せ
しめることによつてクレアチニン量をNADHの
減少量として340nmによる測定で定量することが
できる。
基質・酵素及び過剰のNADHを添加して反応せ
しめることによつてクレアチニン量をNADHの
減少量として340nmによる測定で定量することが
できる。
ここで添加に必須のものとしてはα−OG並び
に牛肝臓GlDHであるが最初のアンモニア消費反
応系に添加されていたものを使用することもでき
る。最初の添加量が少ないときは、ここで追加し
て添加することもできる。またクレアチニンデイ
ミナーゼの添加も必須である。
に牛肝臓GlDHであるが最初のアンモニア消費反
応系に添加されていたものを使用することもでき
る。最初の添加量が少ないときは、ここで追加し
て添加することもできる。またクレアチニンデイ
ミナーゼの添加も必須である。
またNADHの添加は必須であつてNADHの
NAD+への変化によつて生じる340nmの減少によ
つてクレアチニン含量が測定できることになる。
反応はPH7.5の緩衝液中で25℃で行なわれる。式
(2)の反応においてクレアチニンがクレアチニンデ
イミナーゼによつて分解されアンモニアからα−
OGとともにGlDHによつてグルタミン酸になる
ときにNADHかNAD+になつて蓄積する。
NAD+への変化によつて生じる340nmの減少によ
つてクレアチニン含量が測定できることになる。
反応はPH7.5の緩衝液中で25℃で行なわれる。式
(2)の反応においてクレアチニンがクレアチニンデ
イミナーゼによつて分解されアンモニアからα−
OGとともにGlDHによつてグルタミン酸になる
ときにNADHかNAD+になつて蓄積する。
この時検体中のアンモニアを消費するために添
加されていた、NADPHがNADHと同様に酸化
されて、さらにＧ−６−PDHによつてNADHに
もどると危惧される。しかしNADPHはNADH
に比較してごく微量、例えば10分の１以下しか存
在しないため、Ｇ−６−PGHサイクルが回る事
は無視できるものである。
加されていた、NADPHがNADHと同様に酸化
されて、さらにＧ−６−PDHによつてNADHに
もどると危惧される。しかしNADPHはNADH
に比較してごく微量、例えば10分の１以下しか存
在しないため、Ｇ−６−PGHサイクルが回る事
は無視できるものである。
また検体中のアンモニアを消費するために含有
されているＧ−６−PDHがNAD+を還元すると
危惧されるが、ここで含有される酵素は助酵素に
高い特異性を持つものが選ばれているため、その
心配は必要としない。生成したNAD+はそのまま
340nmの吸光度の減少によつてクレアチニン含量
を測定することができる。また尿素の定量もクレ
アチニンの定量と同様に行なうことができる。そ
して他のアンモニア生成反応系ではクレアチニン
の定量と全く同様にアンモニアを生成する物質を
定量することができるものである。
されているＧ−６−PDHがNAD+を還元すると
危惧されるが、ここで含有される酵素は助酵素に
高い特異性を持つものが選ばれているため、その
心配は必要としない。生成したNAD+はそのまま
340nmの吸光度の減少によつてクレアチニン含量
を測定することができる。また尿素の定量もクレ
アチニンの定量と同様に行なうことができる。そ
して他のアンモニア生成反応系ではクレアチニン
の定量と全く同様にアンモニアを生成する物質を
定量することができるものである。
このように本発明はクレアチニンの定量におい
て前もつて検体中のアンモニアを消費せしめたた
めに引続き同一検体で直接クレアチニンの定量を
可能としたもので、クレアチニンの自動分析に極
めて適した方法である。
て前もつて検体中のアンモニアを消費せしめたた
めに引続き同一検体で直接クレアチニンの定量を
可能としたもので、クレアチニンの自動分析に極
めて適した方法である。
次に本発明の実施例を示す。
実施例
クレアチニンの定量の場合
α−OG 4.2mM
NADPH 0.013mM
Ｇ−６−Ｐ 3.2mM
Ｇ−６−PDH（酵母由来） 3.2u／ml
GlDH（牛肝臓由来） 38u／ml
以上を含有する0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
7.5）３mlに2mMアンモニアを含む様々な濃度に
調整したクレアチニン含有検体（Ａ＝0.12mg／
ml、Ｂ＝0.24mg／ml、Ｃ＝0.48mg／ml、Ｄ＝0.96
mg／ml）20μを添加した。それぞれ25℃で５分
間保温した後340nmの吸光度を測定し、吸光度の
変化が停したところで5mM NADH72μを添加
し、340nmの吸光度の増加を約２分間追跡した後
クレアチンデイミナーゼ50μを添加し、340nm
の吸光度の減少を測定した。
7.5）３mlに2mMアンモニアを含む様々な濃度に
調整したクレアチニン含有検体（Ａ＝0.12mg／
ml、Ｂ＝0.24mg／ml、Ｃ＝0.48mg／ml、Ｄ＝0.96
mg／ml）20μを添加した。それぞれ25℃で５分
間保温した後340nmの吸光度を測定し、吸光度の
変化が停したところで5mM NADH72μを添加
し、340nmの吸光度の増加を約２分間追跡した後
クレアチンデイミナーゼ50μを添加し、340nm
の吸光度の減少を測定した。
ΔE；Ａ＝0.042 Ｂ＝0.084 Ｃ＝0.168 Ｄ＝0.335
であつた。
であつた。
これを次式により計算した結果、検体中にすで
に存在していたアンモニア2mMは完全に消去さ
れ、引き続き測定されるクレアチニンの定量に影
響なく、検体中のクレアチニン含量が定量され
た。
に存在していたアンモニア2mMは完全に消去さ
れ、引き続き測定されるクレアチニンの定量に影
響なく、検体中のクレアチニン含量が定量され
た。
クレアチニン量
mg／ml＝ΔE／6.2×3.142／0.02×113／1000
ΔE＝NADHの減少による吸光度の減少
6.2＝NADHの1mMの吸光度
3.11＝全反応液量
0.02＝検体量
113＝クレアチニンの分子量
Claims (1)
- １ 検体にグルタミン酸脱水素酵素、α−オキソ
グルタール酸、還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドホスフエート、及びニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドホスフエートを還元する
酵素と基質を添加混合し、混合液中にすでに存在
するアンモニアを消費せしめ、その際生成された
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフエ
ートを、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ホスフエートを還元せしめる酵素を用いて再度還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホス
フエートに変換せしめ、しかる後還元型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド及びクレアチニン
デイミナーゼを添加して反応せしめることを特徴
とするクレアチニンの定量方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14050382A JPS5931696A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | クレアチニンの定量方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14050382A JPS5931696A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | クレアチニンの定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5931696A JPS5931696A (ja) | 1984-02-20 |
| JPH0218078B2 true JPH0218078B2 (ja) | 1990-04-24 |
Family
ID=15270150
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14050382A Granted JPS5931696A (ja) | 1982-08-14 | 1982-08-14 | クレアチニンの定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5931696A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59198995A (ja) * | 1983-04-25 | 1984-11-10 | Toyo Jozo Co Ltd | Ｎａｄ合成酵素を用いる測定法 |
| US5206146A (en) * | 1983-04-25 | 1993-04-27 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Assay method using NAD synthetase |
| JPH0673476B2 (ja) * | 1985-07-02 | 1994-09-21 | オリエンタル酵母工業株式会社 | イソクエン酸脱水素酵素反応の停止方法 |
| JPH0675516B2 (ja) * | 1985-07-02 | 1994-09-28 | オリエンタル酵母工業株式会社 | アンモニアを反応生成物とする生体物質の定量法 |
| JPS6234061A (ja) * | 1985-08-08 | 1987-02-14 | Oriental Yeast Co Ltd | クレアチニンの定量方法 |
-
1982
- 1982-08-14 JP JP14050382A patent/JPS5931696A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5931696A (ja) | 1984-02-20 |
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