JPH09328500A - 膵型α−アミラーゼアイソザイムの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】膵型α−アミラーゼアイソザイム活性を特異的
に測定するために有用なモノクローナル抗体、及び特異
的且つ高精度な膵型α−アミラーゼアイソザイム活性の
測定法、並びにこれに用いる試薬の提供。 【解決手段】膵型α−アミラーゼアイソザイムの抗体に
よる活性阻害作用を防止する性質を有するモノクローナ
ル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ及び該モノクローナル抗体を用いた膵型α−アミラー
ゼアイソザイム活性の測定法、並びにこれに用いる試
薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、モノクローナル抗
体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ及
び該モノクローナル抗体を用いた膵型α−アミラーゼア
イソザイム活性の測定法、並びにこれに用いる膵型α−
アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬及びキットに関
する。

【０００２】

【従来の技術】生体試料などの被検試料、特にヒトの唾
液、膵液、血液、尿中のα−アミラーゼ活性の測定は医
学上の診断に於いて重要である。例えば、膵炎、膵臓
癌、耳下線炎に於いては、血液や尿中のα−アミラーゼ
活性は通常の値に比べて著しい上昇を示す。更に、例え
ば血中α−アミラーゼ活性を各アイソザイムに分離して
測定することは高アミラーゼ血症の解析や病態の解明に
重要であり、日常臨床検査にも応用されている。

【０００３】ヒトα−アミラーゼアイソザイムとして
は、唾液腺由来の唾液型α−アミラーゼアイソザイムと
膵臓由来の膵型α−アミラーゼアイソザイムの２種類が
古くから知られている。中でも、主に膵臓疾患の診断指
標として膵型α−アミラーゼアイソザイム活性の測定は
重要であり、現在までに種々の膵型α−アミラーゼアイ
ソザイムの分別測定法が開発されてきた。このようなα
−アミラーゼアイソザイムの分別測定法としては、例え
ば電気泳動法，ゲル濾過法，アフィニティークロマトグ
ラフィーを利用する方法等のアイソザイム間のタンパク
質化学的な差を利用して分離・測定する方法、例えば唾
液型α−アミラーゼアイソザイムインヒビター等の阻害
剤を利用する方法、例えば抗原抗体反応により唾液型α
−アミラーゼアイソザイムの活性を特異的に阻害し得る
ことを利用した免疫学的方法（免疫阻害法）等、種々の
方法が知られている。特に、免疫阻害法は、特別な装置
を必要とせず、且つ操作手順が比較的簡単で、測定が短
時間ですむ等の点から、自動分析装置による大量検体処
理を必要とする近年の臨床検査分野に於て重要な方法で
ある。

【０００４】しかしながら、唾液型α−アミラーゼアイ
ソザイムと膵型α−アミラーゼアイソザイムは、そのア
ミノ酸構造が極めて類似しており、その結果、その抗原
性も当然のことながら極めて類似したものであるため、
膵型α−アミラーゼアイソザイム活性を全く阻害せず、
唾液型α−アミラーゼアイソザイム活性のみを完全に阻
害するような抗体を取得することは極めて困難なことで
ある。そのため、従来の免疫阻害法による膵型α−アミ
ラーゼアイソザイム活性の測定に於ては、正確な測定値
を得ることが困難とされていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した如
き状況に鑑みなされたもので、抗体による膵型α−アミ
ラーゼアイソザイムの活性阻害作用を防止する性質を有
する、膵型α−アミラーゼアイソザイムに対するモノク
ローナル抗体、該モノクローナル抗体を用いた高精度の
膵型α−アミラーゼアイソザイム活性の測定法、並びに
これに用いる膵型α−アミラーゼアイソザイム活性測定
用試薬を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】

（１）本発明は、抗体による膵型α−アミラーゼアイソ
ザイムの活性阻害作用を防止する性質を有する、膵型α
−アミラーゼアイソザイムに対するモノクローナル抗体
の発明である。

【０００７】（２）また、本発明は、上記（１）のモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマの発明であ
る。

【０００８】（３）更に、本発明は、唾液型α−アミラ
ーゼアイソザイム活性を阻害する抗体と、上記（１）の
モノクローナル抗体とを組み合わせて使用することを特
徴とする、膵型α−アミラーゼアイソザイム活性の測定
法の発明である。

【０００９】（４）また、本発明は、唾液型α−アミラ
ーゼアイソザイム活性を阻害する抗体と、上記（１）の
モノクローナル抗体を含んでなることを特徴とする、膵
型α−アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬の発明で
ある。

【００１０】（５）更にまた、本発明は、緩衝剤、共役
酵素、唾液型α−アミラーゼアイソザイム活性を阻害す
る抗体及び上記（１）のモノクローナル抗体を含んでな
る第一試薬と、緩衝剤及び合成基質を含んでなる第二試
薬とを組み合わせてなる膵型α−アミラーゼアイソザイ
ム活性測定用試薬キットの発明である。

【００１１】（６）また、本発明は、共役酵素、唾液型
α−アミラーゼアイソザイム活性を阻害する抗体及び上
記（１）のモノクローナル抗体を含んでなる凍結乾燥試
薬と、緩衝剤を含んでなる凍結乾燥試薬用溶解液と、合
成基質を含んでなる凍結乾燥基質試薬と、緩衝剤を含ん
でなる凍結乾燥基質試薬用溶解液とを組み合わせてなる
膵型α−アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬キット
の発明である。

【００１２】即ち、本発明者等は、免疫阻害法を利用し
た、高精度の膵型α−アミラーゼアイソザイムの測定法
を開発するために鋭意研究の結果、抗体による膵型α−
アミラーゼアイソザイムの活性阻害作用を防止する性質
を有するモノクローナル抗体を取得することに成功し
た。そこで更に研究を重ねた結果、免疫阻害法を利用し
た膵型α−アミラーゼアイソザイム活性測定法に於て、
該モノクローナル抗体を、唾液型α−アミラーゼアイソ
ザイム活性を阻害する抗体（以下、抗唾液型α−アミラ
ーゼ活性阻害抗体と略記する。）と組み合わせて用いれ
ば、抗唾液型α−アミラーゼ活性阻害抗体が一般的に有
している、膵型α−アミラーゼアイソザイムの活性を阻
害する作用を防止することができるので、唾液型α−ア
ミラーゼアイソザイム活性のみを阻害させ、膵型α−ア
ミラーゼアイソザイム活性を特異的に精度よく測定する
ことが可能であることを見出し、本発明を完成するに至
った。

【００１３】本発明のモノクローナル抗体は、膵型α−
アミラーゼアイソザイムに対する抗体であって、抗体に
よる膵型α−アミラーゼアイソザイムの活性阻害作用を
防止する性質を有するものであればよく、その由来につ
いては特に限定されない。また、このような性質を有す
るものであれば唾液型α−アミラーゼアイソザイムに結
合する性質を有するものであってもよいが、膵型α−ア
ミラーゼアイソザイム測定の際の特異性の点を考慮する
と、唾液型α−アミラーゼアイソザイムに対する結合率
よりも膵型α−アミラーゼアイソザイムに対する結合率
の方が大きいものの方が好ましく、特に唾液型α−アミ
ラーゼアイソザイムに対する結合率よりも膵型α−アミ
ラーゼアイソザイムに対する結合率の方が５倍以上大き
いものがより好ましい。また、本発明のモノクローナル
抗体を膵型α−アミラーゼアイソザイム活性測定に使用
するにあたっては、単独で用いても良いし、適宜組み合
わせて用いても良い。

【００１４】本発明のモノクローナル抗体に於ける抗体
による膵型α−アミラーゼアイソザイムの活性阻害作用
を防止する性質とは、例えば膵型α−アミラーゼアイソ
ザイムの活性を阻害する性質を有する抗唾液型α−アミ
ラーゼ活性阻害抗体と組み合わせて用いた場合に膵型α
−アミラーゼアイソザイム活性を全く阻害しないか、或
いはその阻害の程度が測定誤差程度であるような性質
（例えば、抗唾液型α−アミラーゼ活性阻害抗体の種類
により異なるため一概には言えないが、抗唾液型α−ア
ミラーゼ活性阻害抗体と本発明のモノクローナル抗体と
を組み合わせて用いた場合の膵型α−アミラーゼアイソ
ザイム活性阻害率が、通常５％以下、好ましくは３％以
下、より好ましくは２％以下である。）を言う。尚、上
記阻害率は、本発明のモノクローナル抗体を２種以上組
み合わせた場合に得られるものであっても良い。また、
本発明のモノクローナル抗体には、上記の如き性質を有
するものであれば、これらの一部、例えば、これらをパ
パイン等で部分分解して得られるＦａｂフラグメント、
ペプシン等で部分分解して得られるＦ（ａｂ’）₂フラ
グメント、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントを還元処理して
得られるＦａｂ’フラグメント等の所謂抗体フラグメン
トも包含される。尚、本発明のモノクローナル抗体は、
当然の事ながら、それ自身が膵型α−アミラーゼアイソ
ザイム活性を全く阻害しないか、或いはその阻害の程度
が測定誤差程度であるような性質を有するものであるこ
とは言うまでもない。

【００１５】本発明のハイブリドーマは、上記の如き性
質を有するモノクローナル抗体を産生するものであれば
特に限定されない。

【００１６】本発明のモノクローナル抗体及びハイブリ
ドーマを得る方法としては、例えばヒト膵液より精製し
たヒト膵型α−アミラーゼアイソザイムを、例えばモル
モット、ラット、マウス等の、例えば脾細胞、リンパ球
等の免疫感作された細胞と、例えば骨髄腫細胞等の永久
的に増殖する性質を有する細胞とを、ケラーとミルシュ
タインらにより開発された自体公知の細胞融合技術によ
り融合させてハイブリドーマを作製し、抗体による膵型
α−アミラーゼアイソザイムの活性阻害作用を防止する
性質を有するモノクローナル抗体を生産するハイブリド
ーマを選択することによって、目的のハイブリドーマを
取得し、該ハイブリドーマを培地中に培養するか、動物
の腹腔内に接種して腹水中に抗体を産生させて、該培養
物又は腹水より目的のモノクローナル抗体を採取する方
法、例えば遺伝子組換え技術等を応用した自体公知の細
胞融合法〔例えば、Eur. J. Immunol., 6, 511 (1976)
等〕等により上記した如き性質を有する抗体を産生する
細胞（ハイブリドーマ）を作製・取得し、この細胞を培
養することにより目的のモノクローナル抗体を採取する
方法等が挙げられる。

【００１７】本発明のモノクローナル抗体及びハイブリ
ドーマを得る方法に於て、免疫感作された細胞と融合さ
せる、永久的に増殖する性質を有する細胞としては、通
常ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トラン
スフェラーゼやチミジンキナーゼ等の核酸合成に於ける
サルベージ回路の酵素を欠損している腫瘍細胞の変異株
が用いられる。このような腫瘍細胞の具体例としては、
例えばＰ３−×６３−Ａｇ８（×６３）、Ｐ３−ＮＳＩ
／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３−×６３−Ａｇ８
−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＭＰＣ１１−４５，６，ＴＧ１．
７（ＭＰＣ１１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２）、
×６３−Ａｇ８−６，５，３（×６３，６．５．３）、
２１０，ＲＣ，Ｙ３−Ａｇ１．２．３（Ｙ３−Ａｇ１．
２．３）等が挙げられる。

【００１８】本発明のモノクローナル抗体及びハイブリ
ドーマを得る方法に於て用いられる免疫原としては、通
常、膵型α−アミラーゼアイソザイムが用いられ、その
由来についても特に限定されないが、好ましくはヒト由
来の膵型アミラーゼが用いられる。より具体的には、例
えば膵液中より精製する方法〔ANN. CLIN. LAB. SCI.(U
SA)., 7/4, 298-309(1977)、NATURE., Vol.197, 591-59
2(1963)等〕、遺伝子組換えを利用する方法〔Gene., 6
0, 57-64(1987)、Gene., 89, 253-258(1990)等〕等の自
体公知の方法により得られるヒト由来の膵型アミラーゼ
や、市販品〔例えば、スクリプス社製等〕の膵型アミラ
ーゼ等が挙げられる。

【００１９】本発明のモノクローナル抗体及びハイブリ
ドーマを得る方法をより具体的に述べれば、例えば以下
の如くなる。

【００２０】即ち、先ず、上記の如きヒト膵型α−アミ
ラーゼアイソザイムと、完全フロイントアジュバント等
のアジュバントとを混合して懸濁液を作製する。この懸
濁液をマウス等の前述の如き適当な動物に適当量、例え
ば膵型α−アミラーゼアイソザイムタンパク質量とし
て、通常１回量１μg／マウス以上、好ましくは10〜100
μg／マウスとなる量で、通常１〜５週間毎に、好まし
くは２〜５週間毎に、通常２〜10回、好ましくは３〜８
回、皮下、静脈内或いは腹腔内に投与する。免疫後、該
動物より採血し、その抗血清中に、膵型α−アミラーゼ
アイソザイムに対する抗体が存在することを以下の方法
により確認する。即ち、予め膵型α−アミラーゼアイソ
ザイムを固定化した96穴マイクロプレートに、得られた
抗血清を適当量分注して反応を行った後に、適宜洗浄す
る。次いで、これにＰＯＤ等の酵素で標識した抗マウス
ＩｇＧ抗体を反応させる。適宜洗浄を行った後に、ｏ−
フェニレンジアミン等の酵素基質と過酸化水素とを含有
する発色剤を添加して反応させ、生ずる色素量を測定す
ることにより、残存するＰＯＤ等の酵素活性確認して、
膵型α−アミラーゼアイソザイムに対する抗体が産生し
ているか否かを確認する。確認後、最終免疫から通常１
〜５日後、好ましくは２〜４日後に免疫化動物から脾臓
を摘出し、脾細胞を常法により調製する。得られた脾細
胞と、例えばＮＳ−１細胞等の骨髄腫細胞とを常法に従
い細胞融合する。この際、例えば、ポリエチレングリコ
ール（以下、ＰＥＧと略記する。）を融合剤として使用
する細胞融合法に於ては、平均分子量が、通常1000〜20
000、好ましくは4000〜6000のＰＥＧを、通常10〜80
％、好ましくは35〜55％の濃度で用いて、通常0.5〜30
分、好ましくは４〜10分処理することにより脾細胞と骨
髄腫細胞とを効率よく融合させることができる。次い
で、常法に従って、融合細胞をヒポキサンチン−アミノ
プテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地〔ネイチャー，第25
6巻，第495頁（1975）〕等を用いて選択的に増殖させ
る。選択された融合細胞を培養し、培養上清中に目的の
性質を有する抗体が存在することを以下の方法により確
認し、目的の抗体を産生する細胞を更に選択する。即
ち、先ず産生されたモノクローナル抗体が、膵型α−ア
ミラーゼアイソザイム活性を阻害するか否かについて
は、例えば該培養上清と既知活性の膵型α−アミラーゼ
アイソザイムとを反応させ、反応後、自体公知のα−ア
ミラーゼ活性測定法により、膵型α−アミラーゼアイソ
ザイムの残存活性を測定することにより判定する。ま
た、該培養上清中のモノクローナル抗体が、抗体による
膵型α−アミラーゼアイソザイムの活性阻害作用を防止
し得るか否かについては、例えば既知濃度の膵型α−ア
ミラーゼアイソザイムと、膵型α−アミラーゼアイソザ
イムの活性阻害作用を有する抗体（例えば唾液型α−ア
ミラーゼアイソザイム活性を阻害すると共に膵型α−ア
ミラーゼアイソザイム活性をも若干阻害してしまう性質
を有するモノクローナル抗体等）とを反応させた場合の
膵型α−アミラーゼアイソザイムの残存活性と、既知濃
度の膵型α−アミラーゼアイソザイムと、該培養上清と
膵型α−アミラーゼアイソザイムの活性阻害作用を有す
る抗体とを反応させた場合の膵型α−アミラーゼアイソ
ザイムの残存活性とを自体公知のα−アミラーゼアイソ
ザイム活性測定法により夫々測定し、この結果に基づい
て判定すれば良い。次いで、目的の抗体を産生する融合
細胞について、限界希釈法等によるクローニングを１〜
３回行い、産生する抗体価が高く、抗体を安定に産生す
ることが認められたものを本発明のモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマ株として選択する。次いで常法に従
い、得られたハイブリドーマを、例えばダルベッコ改変
イーグル培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、市販の無血清培
地等の適当な培地で培養し、その培養液中に目的のモノ
クローナル抗体を産生させるか、或いは動物の腹腔内に
接種し、腹水中に目的のモノクローナル抗体を産生させ
る。この培養液又は腹水を採取し、例えば硫酸アンモニ
ウム塩析、例えばリン酸緩衝液等の緩衝液を用いた透
析、例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー等の通常この分野で使用される
精製方法に従い精製し、精製モノクローナル抗体とす
る。尚、モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、二
重免疫拡散法（金原出版株式会社 臨床検査法提要 第
30版 P.842-843）等の自体公知の方法によって行えば
よい。

【００２１】本発明のモノクローナル抗体及びハイブリ
ドーマのより好ましい具体例としては、ハイブリドーマ
Ｐ−７並びにこれが生産するモノクローナル抗体Ｐ−７
及びハイブリドーマＰ−３６並びにこれが生産するモノ
クローナル抗体Ｐ−３６等が挙げられる。尚、ハイブリ
ドーマＰ−７及びハイブリドーマＰ−３６は、夫々平成
８年４月２日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に、寄託番号P15548及び寄託番号P15549として
寄託されている。

【００２２】本発明のモノクローナル抗体及びハイブリ
ドーマを得る方法に於て使用される膵型α−アミラーゼ
アイソザイムの活性阻害作用を有する抗体としては、膵
型α−アミラーゼアイソザイムや唾液型α−アミラーゼ
アイソザイムを、例えば馬、牛、羊、山羊、兎、モルモ
ット、ラット、マウス等の動物に免疫する常法により得
られる抗血清中に含まれる上記の如き性質を有する抗体
を、常法により精製することにより得られたものや、前
述した如き自体公知の方法により、上記の如き性質を有
するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作
製して、これを適当な培地で培養するかマウス等の腹腔
内で増殖させて得られるモノクローナル抗体等が挙げら
れる。

【００２３】本発明のモノクローナル抗体を、免疫阻害
法による膵型α−アミラーゼアイソザイムの測定法に於
て、抗唾液型α−アミラーゼ活性阻害抗体と組み合わせ
て用いれば、膵型α−アミラーゼアイソザイム活性を精
度よく測定することができる。

【００２４】本発明の膵型α−アミラーゼアイソザイム
活性の測定法に於て使用される抗唾液型α−アミラーゼ
活性阻害抗体としては、本発明のモノクローナル抗体と
組み合わせて用いた場合でも、唾液型α−アミラーゼア
イソザイム活性を完全に阻害するか、或いは、膵型α−
アミラーゼアイソザイムの測定に支障がない程度以上に
唾液型α−アミラーゼアイソザイムの活性を阻害し得る
ようなものであって、本発明のモノクローナル抗体と組
み合わせて用いた場合に、その膵型α−アミラーゼアイ
ソザイム活性阻害作用が事実上問題とならない程度であ
るような抗体であれば良く特に限定されない。また、抗
唾液型α−アミラーゼ活性阻害抗体は、単独で用いて
も、適宜２種以上組み合わせて用いても何れにても良
く、本発明のモノクローナル抗体と組み合わせた場合
に、唾液型α−アミラーゼアイソザイム活性阻害率が通
常95％以上、好ましくは97％以上、より好ましくは98％
以上で、且つ膵型α−アミラーゼアイソザイム活性阻害
率が通常５％以下、好ましくは３％以下、より好ましく
は２％以下のものが挙げられる。また、抗唾液型α−ア
ミラーゼ活性阻害抗体としては、上記の如き性質を有す
るものであればその由来については特に限定されず、例
えば前述の如き自体公知の方法により得られるポリクロ
ーナル抗体でも、例えば前述の如き自体公知の方法によ
り得られるモノクローナル抗体でも何れにても良いが、
キットの調製の容易さ、ロット管理（品質管理）の容易
さ等を考慮すると、モノクローナル抗体の方が望まし
い。より具体的には、例えば特公平4-37380号公報、特
開昭61-164161号公報、特公昭63-2600号公報、特公平7-
10238号公報、特公平8-5919号公報等に記載の唾液型α
−アミラーゼアイソザイム活性阻害作用を有するモノク
ローナル抗体等は全て使用可能である。尚、当該抗体を
使用するにあたっては、上記の如き性質を有するもので
あれば、これらの一部、例えば、パパイン等で部分分解
して得られるＦａｂフラグメント、ペプシン等で部分分
解して得られるＦ（ａｂ’）₂フラグメント、Ｆ（ａ
ｂ’）₂フラグメントを還元処理して得られるＦａｂ’
フラグメント等、即ち、モノクローナル抗体フラグメン
トとして使用しても良いことは言うまでもない。

【００２５】本発明の膵型α−アミラーゼアイソザイム
活性の測定法は、抗唾液型α−アミラーゼ活性阻害抗体
と、本発明のモノクローナル抗体とを使用する以外は、
自体公知の免疫阻害法を利用した膵型α−アミラーゼア
イソザイム活性測定法に準じて、実施すればよく、使用
される試液類もこれら自体公知の方法に準じて適宜選択
すればよい。即ち、唾液型α−アミラーゼアイソザイム
及び膵型α−アミラーゼアイソザイムが共存している検
体と、抗唾液型α−アミラーゼ活性阻害抗体と、本発明
のモノクローナル抗体とを反応させて、検体中に共存し
ている唾液型α−アミラーゼアイソザイム活性のみを阻
害し、残存する膵型α−アミラーゼアイソザイムの活性
を自体公知のα−アミラーゼ活性測定法に準じて測定す
ることにより、検体中の膵型α−アミラーゼアイソザイ
ムのみを測定することができる。

【００２６】これら自体公知のα−アミラーゼアイソザ
イム活性測定法としては、免疫阻害法に利用し得るもの
であれば特に限定されないが、例えばデンプンにアミラ
ーゼを作用させて、残存するデンプン量をヨードデンプ
ン反応で測定するAmyloclastic法、例えばアミラーゼに
よって分解される還元糖量を測定するSaccharogenic
法、例えば色素をデンプンに結合させたものを基質と
し、アミラーゼの作用により遊離した寡糖結合の色素量
（反応生成物である低分子色素結合物）を定量するChro
mogenic法、例えばオリゴサッカライド、デンプン、又
はそれらの誘導体を基質とし、検体中のアミラーゼと添
加共役酵素の作用により生成するグルコース、グルコー
ス−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）、色素等を更に常法（例え
ば、酵素法若しくは可視部の比色法等）によって定量
し、アミラーゼ活性を求める共役酵素法等が挙げられる
（金原出版株式会社 臨床検査法提要 第30版 P630-6
40等）。なかでも、従来のデンプン、アミロース、アミ
ロペクチン等の天然物及びその修飾物等の代わりに、グ
ルコース残基数が３〜７個のオリゴサッカライド誘導体
等を基質として使用する共役酵素法が好ましく挙げら
れ、特に、還元末端に発色基を有し、非還元末端グルコ
ースの６位又は４，６位を修飾したマルトオリゴサッカ
ライド誘導体、所謂合成基質を基質として用いる共役酵
素法は、合成基質そのものがα−グルコシダーゼ、β−
グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ等の共役酵素の基質
とならず、且つα−アミラーゼ活性に応じて遊離してく
る発色物質の量を測定することにより行うことができる
のでより好ましい。

【００２７】本発明に於て、例えば上記の如き合成基質
を用いた共役酵素法により膵型α−アミラーゼアイソザ
イム活性を測定する場合は、例えば特開平6-9676号公報
等に記載の方法に準じて以下の如くして行えばよい。

【００２８】即ち、先ず、膵型α−アミラーゼアイソザ
イム及び唾液型α−アミラーゼアイソザイムを含む生体
由来の検体と、前述の如き性質を有する本発明のモノク
ローナル抗体と、抗唾液型α−アミラーゼ活性阻害抗体
とを反応させ、検体中に共存している唾液型α−アミラ
ーゼアイソザイム活性のみを阻害する。次いで、検体中
に残存する膵型α−アミラーゼアイソザイムと、上記の
如き合成基質とを反応させ、残存する膵型α−アミラー
ゼアイソザイムの加水分解作用を受けて生じる水解生成
物に、１〜３種の共役酵素を作用させ、生じる成績体の
測定結果に基づいて膵型α−アミラーゼアイソザイム活
性を求めれば良い。

【００２９】本発明の上記方法に於て使用される合成基
質としては、α−アミラーゼ活性測定に用いられる自体
公知の合成基質は全て使用することが可能である。この
ような合成基質としては、例えば還元末端グルコース
が、例えばｐ−ニトロフェニル基、２−クロロ−４−ニ
トロフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基等の光学
的に検出可能な基や、フルクトース残基等により修飾さ
れたものや、更に、非還元末端グルコースが、例えばベ
ンジル基、エチリデン基、３−ケトブチリデン基、ベン
ジリデン基、糖残基等により修飾されたもの等が挙げら
れる。また、これら合成基質の使用濃度としては、基質
の種類によっても異なり一概には言えないが、α−アミ
ラーゼ活性測定時の濃度として通常約0.1〜30mMの範囲
から適宜選択される。

【００３０】本発明の上記方法に於て使用する共役酵素
としては、例えばグルコアミラーゼ、α−グルコシダー
ゼ、β−グルコシダーゼ、イソマルターゼ、β−アミラ
ーゼ等が挙げられ、これら共役酵素の由来としては特に
限定されないが、例えば、動物、植物、微生物由来のも
のが利用でき、単独で、或は適宜組み合わせて用いられ
る。これら共役酵素の使用量としては、α−アミラーゼ
活性測定時の濃度として通常0.5〜1000U／ml、好ましく
は２〜500U／mlの範囲から適宜選択される。

【００３１】本発明の膵型α−アミラーゼアイソザイム
の測定法を実施する際の反応条件としては、反応温度は
特に限定されないが、好ましくは約25〜40℃であり、反
応時間は目的により適宜決定すれば良く、特に限定され
ない。

【００３２】また、反応時のpHも目的の測定を実施でき
る範囲であれば特に限定されないが、高感度の測定が可
能であることから、α−アミラーゼ活性の至適pHである
pH約６〜８が望ましい。pHを維持するための緩衝剤は、
目的のpHを維持し得るものであれば特に限定されず、通
常この分野で用いられる緩衝剤、例えば、リン酸塩、ト
リスハイドロキシメチルアミノメタン、グッドの緩衝剤
等が好ましく挙げられる。

【００３３】本発明の測定法を実施するに際しては、要
すればα−アミラーゼの賦活剤を使用しても良い。賦活
剤としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カルシウム、
塩化カリウム等の金属塩類や、アジ化物、チオシアン酸
塩、シアン酸塩等が挙げられる。これら賦活剤は、単独
で使用しても、適宜任意に組み合わせて使用しても何れ
にても良い。また、これら賦活剤の使用濃度は、その種
類により自ら異なるが、α−アミラーゼ活性測定時の濃
度として通常１〜10mM程度の範囲から適宜選択される。

【００３４】本発明の膵型α−アミラーゼアイソザイム
活性の測定法に於ける検体としては、膵型α−アミラー
ゼアイソザイムを含有するものであれば特に限定されな
いが、より具体的には、例えば血清、血漿、尿、膵液、
髄液、組織抽出液等の生体由来試料が挙げられる。

【００３５】検体中の膵型α−アミラーゼアイソザイム
を測定する目的で使用される、抗唾液型α−アミラーゼ
活性阻害抗体と、本発明のモノクローナル抗体を含んで
なる膵型α−アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬
は、抗唾液型α−アミラーゼ活性阻害抗体と、上記した
如き性質を有する本発明のモノクローナル抗体を含んで
いる以外は、自体公知のα−アミラーゼ活性測定用試薬
に使用される試薬類を、この分野で使用される濃度範囲
内で含有するように調製されたものであり、構成要件の
好ましい態様や使用濃度等は、上で述べた通りである。
また、本発明の膵型α−アミラーゼアイソザイム活性測
定用試薬は、上で述べた如き種々の膵型α−アミラーゼ
アイソザイム活性測定法に於て使用することが可能であ
る。尚、本発明の膵型α−アミラーゼアイソザイム活性
測定用試薬は、市販のα−アミラーゼ活性測定用試薬キ
ット、例えばアミラーゼII−ＨＡテストワコー〔和光純
薬工業（株）製〕等のＲ１溶液に、本発明のモノクロー
ナル抗体及び抗唾液型α−アミラーゼ活性阻害抗体を適
当量添加することによっても容易に調製することができ
る。

【００３６】本発明の膵型α−アミラーゼアイソザイム
活性測定用試薬キットは、血清等検体中の膵型α−アミ
ラーゼアイソザイム活性の測定を実施するために使用さ
れる試薬キットであり、このようなキットとしては、緩
衝剤、共役酵素、抗唾液型α−アミラーゼアイソザイム
抗体及び本発明のモノクローナル抗体を含んでなる第一
試薬と、緩衝剤及び合成基質を含んでなる第二試薬とを
組み合わせてなる形態のものや、共役酵素、抗唾液型α
−アミラーゼアイソザイム抗体及び本発明のモノクロー
ナル抗体を含んでなる凍結乾燥試薬と、緩衝剤を含んで
なる凍結乾燥試薬用溶解液と、合成基質を含んでなる凍
結乾燥基質試薬と、緩衝剤を含んでなる凍結乾燥基質試
薬用溶解液とを組み合わせてなる形態のものが挙げられ
る。尚、試薬の保存安定性等を考慮すると後者の形態の
方が望ましい。また、夫々の構成要素の好ましい態様、
具体例等については先に述べた通りである。尚、当該キ
ットには、必要に応じて、膵型α−アミラーゼアイソザ
イム標準品等が適宜組み合わされていても良いことは言
うまでもない。

【００３７】以下に、実施例を挙げて本発明をより具体
的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等限
定されるものではない。

【００３８】

【実施例】

参考例１．唾液型α−アミラーゼアイソザイム活性を阻
害するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの
作製 （１）免疫 ヒト唾液型α−アミラーゼアイソザイム（シグマ社製）
を、500μg／mlとなるように生理食塩水に溶解し、この
溶液0.1mlとフロインドコンプリートアジュバント〔和
光純薬工業（株）製〕0.1mlとで調製した懸濁液を、Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に免疫した。１回目の免疫か
ら２週間毎に計４回の追加免疫を行った（免疫１回当た
りのα−アミラーゼ量：50μg／匹）。 （２）ハイブリドーマの作製 最終免疫から３日後に、該マウスから摘出した脾細胞
（1.0×10⁸個）と骨髄腫細胞ＮＳ−１（1.0×10⁷個）を
ＲＰＭＩ−１６４０培地〔日本製薬（株）製〕中で混合
し、得られた混合液を1000r.p.mで５分間遠心分離処理
した。得られた沈さに、50%ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）1500溶液１mlを37℃で１分間かけて徐々に加
えて細胞を融合させ、更に37℃のＲＰＭＩ−１６４０培
地 ７mlを５分間かけて加えた後、1000r.p.mで５分間
遠心処理した。得られた融合細胞をＨＡＴ培地50mlで希
釈し、このうち0.1mlを96穴マイクロプレートに分注し
た後、２〜３日間隔でＨＡＴ培地を半量ずつ交換しなが
ら培養を続けた。細胞融合反応より５〜10日後、培養上
清について、以下の方法によりスクリーニングを行っ
た。即ち、培養上清100μlを96穴マイクロプレートに添
加する。次いで、これに既知濃度（170IU／l）の活性を
有する唾液型α−アミラーゼアイソザイム溶液３μlを
加え、５分間反応させる。反応後、予め調製した測定試
薬〔グルコアミラーゼ 122.8IU／ml、α−グルコシダー
ゼ 28.6IU／ml及び2.4mmol／l ｐ−ニトロフェニル ベ
ンジル−マルトペンタオシド（BG5P）を含有する、148m
M Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノ
エタンスルホン酸（BES）緩衝液。pH7.6〕100μlを加え
て室温で反応させ、反応開始７分後からの３分間に於け
る１分間当たりの吸光度変化（ΔE／min）を測定し、個
々のウェルの唾液型α−アミラーゼアイソザイム活性を
算出した。上記で得られた結果に基づき、高い唾液型α
−アミラーゼアイソザイム活性阻害作用を有するモノク
ローナル抗体を産生する融合細胞を選択し、限界希釈法
によりクローニングした。更に、得られたクローンの培
養上清について、上記と同様の試薬を用い、同様の方法
により、唾液型α−アミラーゼアイソザイム活性阻害作
用を調べ、安定且つ大量に目的の抗体を産生するクロー
ン２種類（２−１及び２５−１）を得た。 （３）モノクローナル抗体の作製 予め、プリスタン〔2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ
ン、和光純薬工業（株）製〕0.5mlを腹腔内に注射後、
３日経過したマウスの腹腔内に、ＲＰＭＩ−１６４０培
地0.5mlに懸濁した、上記（２）で得たハイブリドーマ
２−１又は２５−１の５×10⁶個を接種した。接種後14
日目に、腹腔内に貯留された腹水を採取し、得られた腹
水３〜10mlを40％飽和硫安溶液で塩析した。得られた沈
澱を生理食塩水に溶解し、生理食塩水で透析した後、Ｄ
ＥＡＥセルロースカラムにより精製して、目的の唾液型
α−アミラーゼアイソザイム活性を阻害するモノクロー
ナル抗体を得た。

【００３９】参考例２．唾液型α−アミラーゼアイソザ
イム活性阻害作用の検討 参考例１で得られた２クローンが産生する夫々のモノク
ローナル抗体が有する、唾液型α−アミラーゼアイソザ
イム及び膵型α−アミラーゼアイソザイムに対する活性
阻害作用の程度を、以下の方法により調べた。即ち、参
考例１で得られたモノクローナル抗体溶液100μlを96穴
マイクロプレートに添加し、次いで、これに既知濃度
（170IU／l）の唾液型α−アミラーゼアイソザイム溶液
３μlを加え、５分間反応させた。反応後、予め調製し
た測定試薬〔グルコアミラーゼ 122.8IU／ml、α−グル
コシダーゼ 28.6IU／ml及び2.4mmol／l BG5Pを含有する
148mM BES緩衝液。pH7.6〕100μlを加えて室温で反応さ
せ、反応開始７分後からの３分間に於ける１分間当たり
の吸光度変化（ΔE）を測定した。対照としてモノクロ
ーナル抗体溶液の代わりに生理食塩水100μlを使用した
以外は上と同様にして吸光度変化（ΔE_std）を測定し、
得られた測定値を下記式に代入して唾液型α−アミラー
ゼアイソザイム活性の阻害率を算出した。 阻害率（％）＝（ΔE_std−ΔE）÷ΔE_std×100 また、唾液型α−アミラーゼアイソザイム溶液の代わり
に膵型α−アミラーゼアイソザイム溶液（170IU／l）を
用いた以外は同様にして膵型α−アミラーゼアイソザイ
ム活性の阻害率についても調べた。その結果を表１に示
す。

【００４０】

【表１】

【００４１】表１の結果から、得られた唾液型α−アミ
ラーゼアイソザイム活性を阻害するモノクローナル抗体
２−１及び２５−１は、膵型α−アミラーゼアイソザイ
ム活性をも阻害する性質を有するモノクローナル抗体で
あることが判る。

【００４２】実施例１．抗体による膵型α−アミラーゼ
アイソザイムの活性阻害作用を防止する性質を有するモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製 （１）免疫 ヒト膵型α−アミラーゼアイソザイム（スクリプス社
製）を、500μg／mlとなるように生理食塩水に溶解し、
この溶液0.1mlとフロインドコンプリートアジュバント
〔和光純薬工業（株）製〕0.1mlとで調製した懸濁液
を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に免疫した。１回目の
免疫から２週間毎に計２回の追加免疫を行い（免疫１回
当たりのα−アミラーゼ量：50μg／匹）、免疫後、該
マウスより採血し、該抗血清中に、膵型α−アミラーゼ
アイソザイムに対する抗体が存在することを確認した。 （２）ハイブリドーマの作製 最終免疫から３日後に、該マウスから摘出した脾細胞
（1.0×10⁸個）と骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１（1.0×10⁷個）を
ＲＰＭＩ−１６４０培地〔日本製薬（株）製〕中で混合
し、得られた混合液を1000r.p.mで５分間遠心分離処理
した。得られた沈さに、50%ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）1500溶液１mlを37℃で１分間かけて徐々に加
えて細胞融合させ、更に37℃のＲＰＭＩ−１６４０培地
７mlを５分間かけて加えた後、1000r.p.mで５分間遠
心処理した。得られた融合細胞をＨＡＴ培地50mlで希釈
し、このうち0.1mlを96穴マイクロプレートに分注した
後、２〜３日間隔でＨＡＴ培地を半量ずつ交換しながら
培養を続けた。細胞融合反応より５〜10日後、培養上清
について、以下の方法によりスクリーニングを行った。
即ち、培養上清100μlを96穴マイクロプレートに添加
し、次いで、これに既知濃度（300IU／l）の活性を有す
る膵型α−アミラーゼアイソザイム溶液３μlを加え、
５分間反応させた。反応後、予め調製した測定試薬〔グ
ルコアミラーゼ 122.8IU／ml、α−グルコシダーゼ 28.
6IU／ml及び2.4mmol／l BG5Pを含有する、148mM BES pH
7.6〕100μlを加えて室温で反応させ、反応開始７分後
からの３分間に於ける１分間当たりの吸光度変化（ΔE
_std）を測定し、個々のウェルの膵型α−アミラーゼア
イソザイム活性を算出した。また、培養上清100μlと実
施例１で得られたクローン２−１が産生するモノクロー
ナル抗体 0.3mg／ml（タンパク質濃度）とを96穴マイク
ロプレートに添加し、次いで、これに既知濃度（300IU
／l）の活性を有する膵型α−アミラーゼアイソザイム
溶液３μを加え、５分間反応させた。反応後、予め調製
した測定試薬〔グルコアミラーゼ 122.8IU／ml、α−グ
ルコシダーゼ 28.6IU／ml及び2.4mmol／l BG5Pを含有す
る、148mM BES pH7.6〕100μlを加えて室温で反応さ
せ、反応開始７分後からの３分間に於ける１分間当たり
の吸光度変化（ΔE）を測定した。また、対照として培
養上清100μlの代わりにＨＡＴ培地100μlを添加して
（即ち、クローン２−１が産生するモノクローナル抗体
のみを添加）、同様の操作により測定を行なって、吸光
度変化（ΔE_2-1）を求めた。得られたΔE_std、ΔE及び
ΔE_2-1を比較して、抗体による膵型α−アミラーゼアイ
ソザイムの活性阻害作用を防止する性質を有するモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択した。次
いで、このハイブリドーマを限界希釈法によりクローニ
ングした。更に、得られたクローンの培養上清につい
て、上記と同様の試薬を用い、同様の方法により、目的
のモノクローナル抗体が該培養上清中に産生されている
ことを確認し、安定且つ大量に抗体を産生するクローン
２種類（Ｐ−７及びＰ−３６）を得た。 （３）モノクローナル抗体の作製 予め、プリスタン〔2,6,10,14-テトラメチルペンタデカ
ン、和光純薬工業（株）製〕0.5mlを腹腔内に注射後、
３日経過したマウスの腹腔内に、ＲＰＭＩ−１６４０培
地0.5mlに懸濁した、上記（２）で得たハイブリドーマ
Ｐ−７又はＰ−３６ ５×10⁶個を接種した。接種後14
日目に、腹腔内に貯留された腹水を採取し、得られた腹
水３〜10mlを40％飽和硫安溶液で塩析した。得られた沈
澱を生理食塩水に溶解し、生理食塩水で透析した後、Ｄ
ＥＡＥセルロースカラムにより精製して、目的のモノク
ローナル抗体を得た。

【００４３】実施例２．参考例１で得られた唾液型α−
アミラーゼアイソザイム活性を阻害するモノクローナル
抗体と、実施例１で得られた本発明のモノクローナル抗
体とを使用して、膵型、唾液型の各α−アミラーゼアイ
ソザイムに対する阻害率がどのように変化するかを検討
した。 〔試薬〕 酵素液：0.1M ＢＥＳ緩衝液（pH7.7）に、グルコアミラ
ーゼ 86IU／ml、α−グルコシダーゼ 20IU／ml及び所定
のモノクローナル抗体を所定濃度（タンパク質濃度）と
なるように夫々添加したものを酵素液として用いた。ま
た、モノクローナル抗体無添加のものを対照として用い
た。 基質液：10mM ＢＥＳ緩衝液（pH5.7）に、ＢＧ５Ｐを4.
2mmol／lとなるように添加したものを基質液として用い
た。 〔検体〕 唾液型α−アミラーゼアイソザイム検体：シグマ社製の
唾液型α−アミラーゼアイソザイムを200IU／lとなるよ
うに生理食塩水に溶解したもの。 膵型α−アミラーゼアイソザイム検体：スクリプス社製
の膵型α−アミラーゼアイソザイムを200IU／lとなるよ
うに生理食塩水に溶解したもの。 〔測定機器〕日立自動分析装置７１５０型を使用した。 〔アミラーゼ活性の測定及び阻害率の算出〕所定の検体
５μlと酵素液250μlとを混合し、37℃で５分間インキ
ュベートした後、更に、基質液を100μl添加した。測定
主波長405nm副波長505nmに於ける、基質液添加後の1.8
分後からの２分間に於ける１分間当たりの吸光度変化
（ΔE／min）を測定し、これに係数（4830）を乗じてア
ミラーゼ活性（Ａ_ex）を求めた。また、モノクローナル
抗体無添加の酵素液を使用し、同様の操作を行ってアミ
ラーゼ活性（Ａ_std）を求めた。得られた各値を下記式
に代入して、所定の酵素液を使用した場合の阻害率を算
出した。 阻害率（％）＝（Ａ_std−Ａ_ex）÷Ａ_std×100 〔結果〕各種酵素液を使用した場合の膵型及び唾液型α
−アミラーゼアイソザイムに対する阻害率を、表２に示
す。

【００４４】

【表２】

【００４５】この結果から明らかなように、実施例１で
得られた２種類のモノクローナル抗体（Ｐ−７及びＰ−
３６）は何れも、参考例１で得られたモノクローナル抗
体（２−１及び２５−１）が有する膵型α−アミラーゼ
アイソザイム活性阻害作用を防止する性質を有する抗体
であることが判る。尚、上記のモノクローナル抗体を産
生するクローン２種類、Ｐ−７とＰ−３６は、通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてお
り、その寄託番号及び寄託日は以下の通りである。 クローンＰ−７ ：寄託番号；FERM P-15548 寄託日；平成８年４月２日 クローンＰ−３６：寄託番号；FERM P-15549 寄託日；平成８年４月２日

【００４６】実施例３．膵型α−アミラーゼアイソザイ
ム活性測定用試薬の作製並びにこれを用いたα−アミラ
ーゼアイソザイム活性の測定 （１）試薬の作製 実施例２の結果に基づいて、Ｐ−３６及び２−１のモノ
クローナル抗体を使用した膵型α−アミラーゼアイソザ
イム活性測定用試薬を作製した。 酵素液：0.1M ＢＥＳ緩衝液（pH7.7）に、グルコアミラ
ーゼ 86IU／ml、α−グルコシダーゼ 20IU／ml、Ｐ−３
６モノクローナル抗体 0.01mg／ml（タンパク質濃度）
及び２−１モノクローナル抗体 0.3mg／ml（タンパク質
濃度）となるように夫々添加したものを酵素液として用
いた。また、対照としてモノクローナル抗体無添加の酵
素液も調製した。 基質液：10mM ＢＥＳ緩衝液（pH5.7）に、ＢＧ５Ｐを4.
2mmol／lとなるように添加したものを基質液として用い
た。 （２）膵型α−アミラーゼアイソザイム活性の測定 上記（１）で作製した膵型α−アミラーゼアイソザイム
活性測定用試薬を用いて、膵型α−アミラーゼアイソザ
イム活性の直線性、及び膵型α−アミラーゼアイソザイ
ム並びに唾液型α−アミラーゼアイソザイム夫々の濃度
の違いによる阻害率の検討を行った。 〔検体〕 膵型α−アミラーゼアイソザイム検体：スクリプス社製
の膵型α−アミラーゼアイソザイムを、3600IU／lとな
るように生理食塩水に溶解したものを、生理食塩水で所
定倍率に希釈したもの。 唾液型α−アミラーゼアイソザイム検体：シグマ社製の
唾液型α−アミラーゼアイソザイムを、2300IU／lとな
るように生理食塩水に溶解したものを、生理食塩水で所
定倍率に希釈したもの。 〔測定機器〕日立自動分析装置７１５０型を使用した。 〔アミラーゼ活性の測定及び阻害率の算出〕上記の試薬
及び検体を使用した以外は、実施例２と同様の操作法に
よりアミラーゼの活性測定及び阻害率の算出を行った。 〔結果〕各種希釈倍率の膵型α−アミラーゼアイソザイ
ム検体についての、測定値（IU／l）及び阻害率を表３
に、また、膵型α−アミラーゼアイソザイム濃度と測定
値との関係を図１に夫々示す。尚、図１に於て、□は抗
体無添加酵素液を使用して測定した膵型α−アミラーゼ
アイソザイム活性値を、＋は抗体添加酵素液を使用して
測定した膵型α−アミラーゼアイソザイム活性値を夫々
示す。更に、各種希釈倍率の唾液型α−アミラーゼアイ
ソザイム検体についての、測定値（IU／l）及び阻害率
を表４に、また、唾液型α−アミラーゼアイソザイム濃
度と測定値との関係を図２に夫々示す。尚、図２に於
て、□は抗体無添加酵素液を使用して測定した唾液型α
−アミラーゼアイソザイム活性値を、＋は抗体添加酵素
液を使用して測定した唾液型α−アミラーゼアイソザイ
ム活性値を夫々示す。

【００４７】

【表３】 ＊阻害率は、抗体無添加酵素液での膵型α−アミラーゼアイソザイムの測定 値を阻害率０％とした場合の値。

【００４８】

【表４】 ＊阻害率は、抗体無添加酵素液での唾液型α−アミラーゼアイソザイムの測 定値を阻害率０％とした場合の値。

【００４９】表３及び図１の結果から、本発明の膵型α
−アミラーゼアイソザイム測定用試薬は、膵型α−アミ
ラーゼアイソザイム活性を精度良く測定し得ること、並
びに、少なくとも膵型α−アミラーゼアイソザイム2500
IU／lまでの直線性を有していること等が判る。また、
表４及び図２の結果から、本発明の膵型α−アミラーゼ
アイソザイム測定用試薬の唾液型α−アミラーゼアイソ
ザイム阻害率は、唾液型α−アミラーゼアイソザイム濃
度の違いによっては変化せず、何れの濃度に於ても一定
の唾液型α−アミラーゼアイソザイム活性阻害作用を有
していることが判る。以上の結果から、本発明の膵型α
−アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬は、膵型α−
アミラーゼアイソザイム活性のみを特異的に、且つ精度
良く測定し得る試薬であることが判る。

【００５０】実施例４．膵型α−アミラーゼアイソザイ
ム活性の測定 〔試薬〕 酵素液：実施例３で調製した酵素液と同じものを用い
た。また、対照としてモノクローナル抗体無添加の酵素
液を使用した。 基質液：実施例３で調製した基質液と同じものを用い
た。 〔検体〕 膵型α−アミラーゼアイソザイム検体：スクリプス社製
の膵型α−アミラーゼアイソザイムを、1500IU／lとな
るように生理食塩水に溶解したものを、生理食塩水で所
定倍率に希釈したもの。 〔測定機器〕日立自動分析装置７１５０型を使用した。 〔アミラーゼ活性の測定及び阻害率の算出〕上記の試薬
及び検体を使用した以外は、実施例２と同様の操作法に
よりアミラーゼの活性測定及び阻害率の算出を行った。 〔結果〕各濃度の膵型α−アミラーゼアイソザイムに於
ける、測定値（IU／l）及び阻害率を表５に示す。

【００５１】

【表５】 ＊阻害率は、抗体無添加酵素液での膵型α−アミラーゼアイソザイムの測定 値を阻害率０％とした場合の値。

【００５２】表５の結果から明らかなように、本発明の
膵型α−アミラーゼアイソザイム測定用試薬は、何れの
濃度に於ても膵型α−アミラーゼアイソザイム活性を精
度良く測定し得ることが判る。

【００５３】実施例５．膵型α−アミラーゼアイソザイ
ム活性の測定 〔試薬〕 酵素液：実施例３で調製した酵素液と同じものを用い
た。尚、唾液型α−アミラーゼアイソザイムと膵型α−
アミラーゼアイソザイムの合計の値（総アミラーゼ）を
測定するためには、モノクローナル抗体無添加の酵素液
を使用した。 基質液：実施例３で調製した基質液と同じものを用い
た。 〔検体〕膵型α−アミラーゼアイソザイム（スクリプス
社製）と唾液型α−アミラーゼアイソザイム（シグマ社
製）とを夫々1500 IU/l含有する生理食塩水を検体とし
た（総アミラーゼ活性が3000 IU／l）。 〔測定機器〕日立自動分析装置７１５０型を使用した。 〔アミラーゼ活性の測定〕上記の試薬及び検体を使用し
た以外は、実施例２と同様の操作法によりアミラーゼ活
性の測定を行った。 〔結果〕得られた総アミラーゼ活性値を100％とした場
合の膵型α−アミラーゼアイソザイム活性測定値を表６
に示す。

【００５４】

【表６】

【００５５】表６の結果から明らかなように、総アミラ
ーゼ活性値に対する膵型α−アミラーゼアイソザイム活
性値は理論値（50％）とほぼ同じ値であった。このこと
から、本発明の試薬を用いることによりは、唾液型α−
アミラーゼアイソザイムと膵型α−アミラーゼアイソザ
イムとが共存した場合でも、膵型α−アミラーゼアイソ
ザイムを特異的に測定し得ることがわかる。

【００５６】実施例６．血清中の膵型α−アミラーゼア
イソザイム活性の測定 〔試薬〕 酵素液：実施例３で調製した酵素液と同じものを用い
た。 基質液：実施例３で調製した基質液と同じものを用い
た。 〔検体〕人血清50検体を使用した。 〔測定機器〕東芝メディカル（株）製自動分析装置ＴＢ
Ａ−８０ＦＲを使用した。 〔アミラーゼ活性の測定〕所定の検体５μlと酵素液250
μlとを混合し、37℃で５分間インキュベートした後、
更に、基質液を100μl添加した。測定主波長405nm副波
長500nmに於ける、基質液添加後の1.7分後からの３分間
に於ける１分間当たりの吸光度変化（ΔE／min）を測定
し、これに係数（4797）を乗じてアミラーゼ活性を求め
た。 〔結果〕各検体の夫々の測定値及びその平均値を表７に
示す。

【００５７】比較例１．市販キットを用いた血清中の膵
型α−アミラーゼアイソザイム活性の測定 〔試薬〕市販の膵型α−アミラーゼアイソザイム測定用
試薬キット（アイソアミラーゼＥＰＳ「ＢＭＹ」：ベー
リンガーマンハイム社製）を使用した。 〔検体〕実施例６と同じ。 〔測定機器〕実施例６と同じ。 〔アミラーゼ活性の測定〕製品説明書の標準操作法に従
って測定を行った。 〔結果〕各検体の夫々の測定値及びその平均値を表７に
示す。また、実施例６で得られた膵型α−アミラーゼア
イソザイム活性値と比較例１で得られた膵型α−アミラ
ーゼアイソザイム活性値との相関関係を図３に示す。

【００５８】

【表７】

【００５９】また、実施例６で得られた膵型α−アミラ
ーゼアイソザイム活性値と比較例１で得られた膵型α−
アミラーゼアイソザイム活性値との間の相関係数（ｒ）
及び回帰直線式は下記の如くであった。 ｒ＝0.9999 ｙ＝0.53ｘ−1.93

【００６０】これらの結果から明らかな如く、本発明の
試薬を用いて測定した場合の膵型α−アミラーゼアイソ
ザイム活性値と、市販キットを用いて測定した場合の膵
型α−アミラーゼアイソザイム活性値との間に良好な相
関関係が認められ、本発明によれば、人血清を試料とし
た場合も問題なく膵型α−アミラーゼアイソザイムを特
異的に測定し得ることがわかる。尚、本発明の試薬を用
いた場合と市販キットを用いた場合の各アミラーゼ活性
測定値が異なっているが、これは使用する基質の種類が
異なる（アミラーゼとの反応性が異なる）ので、国際単
位（IU）に換算すると異なった値となるためである。

【００６１】実施例７．膵型α−アミラーゼアイソザイ
ム活性測定用試薬の作製 血清等体液中の膵型α−アミラーゼアイソザイム活性の
測定を実施するために使用される、膵型α−アミラーゼ
アイソザイム活性測定用試薬キットの代表的な例として
は、以下のようなものが挙げられる。 （１）第一試薬（pH５〜pH８）： 緩衝剤、 共役酵素、 抗唾液型α−アミラーゼアイソザイム抗体、 抗体による膵型α−アミラーゼアイソザイム活性阻害
作用を防止する性質を有する膵型α−アミラーゼアイソ
ザイムに対するモノクローナル抗体、 （２）第二試薬（pH５〜pH８）： 緩衝剤、 合成基質。

【００６２】また、本発明のα−アミラーゼアイソザイ
ム活性測定用試薬キットとしては、試薬の保存安定性等
の問題から、以下のような形態のものも好ましく挙げら
れる。 （１）凍結乾燥試薬： 共役酵素、 抗唾液型α−アミラーゼアイソザイム抗体、 抗体による膵型α−アミラーゼアイソザイム活性阻害
作用を防止する性質を有する膵型α−アミラーゼアイソ
ザイムに対するモノクローナル抗体、 （２）凍結乾燥試薬用溶解液（pH５〜pH８）： 緩衝剤、 （３）凍結乾燥基質試薬： 合成基質 （４）凍結乾燥基質試薬用溶解液（pH５〜pH８）： 緩衝液。

【００６３】

【発明の効果】本発明は、抗体による膵型α−アミラー
ゼアイソザイムの活性阻害作用を防止する性質を有する
モノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ及び該モノクローナル抗体を用いた膵型
α−アミラーゼアイソザイム活性の測定法、並びにこれ
に用いる膵型α−アミラーゼアイソザイム活性測定用試
薬及びキットを提供するものであり、本発明のモノクロ
ーナル抗体を、免疫阻害法を利用した膵型α−アミラー
ゼアイソザイム活性測定法に於て、抗唾液型α−アミラ
ーゼ活性阻害抗体と組み合わせて用いれば、膵型α−ア
ミラーゼアイソザイムの活性を阻害することなく唾液型
α−アミラーゼアイソザイム活性のみを阻害することが
できるので、膵型α−アミラーゼアイソザイム活性を特
異的に精度よく測定することが可能となる点に顕著な効
果を奏するものである。

【００６４】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３で得られた膵型α−アミラーゼアイソ
ザイム濃度と測定値との関係を示したものである。

【図２】実施例３で得られた唾液型α−アミラーゼアイ
ソザイム濃度と測定値との関係を示したものである。

【図３】実施例６で得られた膵型α−アミラーゼアイソ
ザイム活性値と、比較例１で得られた膵型α−アミラー
ゼアイソザイム活性値との相関関係を示したものであ
る。

【符号の説明】

図１に於て、□は抗体無添加酵素液を使用して測定した
膵型α−アミラーゼアイソザイム活性値を、＋は抗体添
加酵素液を使用して測定した膵型α−アミラーゼアイソ
ザイム活性値を夫々示す。図２に於て、□は抗体無添加
酵素液を使用して測定した唾液型α−アミラーゼアイソ
ザイム活性値を、＋は抗体添加酵素液を使用して測定し
た唾液型α−アミラーゼアイソザイム活性値を夫々示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/573 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 小林 高久 兵庫県尼崎市高田町６番１号 和光純薬工 業株式会社大阪研究所内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗体による膵型α−アミラーゼアイソザ
   イムの活性阻害作用を防止する性質を有する、膵型α−
   アミラーゼアイソザイムに対するモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のモノクローナル抗体を
   産生するハイブリドーマ。
3. 【請求項３】 唾液型α−アミラーゼアイソザイム活性
   を阻害する抗体と、請求項１に記載のモノクローナル抗
   体とを組み合わせて使用することを特徴とする、膵型α
   −アミラーゼアイソザイム活性の測定法。
4. 【請求項４】 唾液型α−アミラーゼアイソザイム活性
   を阻害する抗体と、請求項１に記載のモノクローナル抗
   体を含んでなることを特徴とする、膵型α−アミラーゼ
   アイソザイム活性測定用試薬。
5. 【請求項５】 緩衝剤、共役酵素、唾液型α−アミラー
   ゼアイソザイム活性を阻害する抗体及び請求項１に記載
   のモノクローナル抗体を含んでなる第一試薬と、緩衝剤
   及び合成基質を含んでなる第二試薬とを組み合わせてな
   る膵型α−アミラーゼアイソザイム活性測定用試薬キッ
   ト。
6. 【請求項６】 共役酵素、唾液型α−アミラーゼアイソ
   ザイム活性を阻害する抗体及び請求項１に記載のモノク
   ローナル抗体を含んでなる凍結乾燥試薬と、緩衝剤を含
   んでなる凍結乾燥試薬用溶解液と、合成基質を含んでな
   る凍結乾燥基質試薬と、緩衝剤を含んでなる凍結乾燥基
   質試薬用溶解液とを組み合わせてなる膵型α−アミラー
   ゼアイソザイム活性測定用試薬キット。