JPS60155134A - 体液中のだ液α―アミラーゼの存在下にすいぞうα―アミラーゼを特異的に測定するための試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、だ液のα−アミラーゼと共にすいぞうのα−
アミラーゼの特殊測定法に関する。

従来の技術 α−アミラーゼ（Ｅ、　ｃ、　３．２．１．１．　）は
、１．４−ｄ−グルコシＰ結合のオリゴ−及びポリサッ
カライｒを、主として１．４−ｄ−グリコシＰ結合のマ
ルトース及びマルト−オリゴサッカライ１への加水分解
によって分解する。酵素は工業的発酵技術と共に、臨床
分析及び診断法で著しい重要性を有する。即ち多くの発
病では、体液、例えば血清、尿又は十二指腸分泌液中の
α−アミラーゼ含量が変化する。しかしながら、体内で
は主として２種のα−アミラーゼ酵素、即ちすいぞうの
酵素及びだ液の酵素が生じる。

診断上の重要性はすいぞうの酵素であるのに過ぎないの
で、この両方（まれであると共に、わずかな量で生じる
のに過ぎない他のイソ酵素）のα−アミラーゼを分析上
区別する課題が存在する。この場合難点は、両方の多発
形は類似構造を有し、免疫学上同一なことである［Ｋ、
Ｌｏｒｅｎｔｚ。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍｓｂｌｉｔｔｅｒ　３２　：
　１１８　（１９８２年）〕。だ液の酵素の活性を除去
するためには、陰イオン交換剤の吸着、小麦の蛋白質に
よる抑制又は電気泳動又は電気焦点集中を使用すること
は公知である。しかしこれらの方法は、その分離作用が
不十分であるか又は日常の診断には費用がかｋる。前記
方法では、単にＣｌ１ｎ。

Ｃｈｅｍ、　２８　／　７巻、１５２５〜１５２７頁（
１９８２年）に記載されているだ液系酵素の抑制法は、
小麦の芽から得られた抑制剤によって日常の診断上引受
けられる時間を伴なうが、選択度は不十分である。抑制
剤の最適″□濃度の場合でも、だ液系の酵素の活性約１
３％が得られる”が、発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の課題はこの欠点を除去し、体液のだ液
系のα−アミラーゼと共に、すいぞうのα−アミラーゼ
の迅速で簡嘔なかつ確実な測定が可能な方法及び試薬を
得ることである。

問題点を解決するための手段 この課題は、本発明によれば体液、殊に血清、十二指腸
分泌液又は尿のだ液のα−アミラーゼと共にすいぞうの
α−アミラーゼを、α−アミラーゼの検出系とだ液のα
−アミラーゼの抑制物質の存在で反応させて特別に測定
する方法によって解決される。この方法は抑制物質の代
りに、すいぞうのα−アミラーゼに対して５％以下の交
叉反応度を有するモノクロン抗体を添加する。

本発明方法は、すいぞうの酵素に対して著しくわずかな
交叉反応度を有するモノクロン抗体の驚異的発見に基づ
く。このことは予期することができなかった。それとい
うのもだ液とすいぞうとの酵素は免疫学上同一であるこ
とは公知だったからである（Ｇｅｒｈａｒｄ　Ｐｆｌｅ
ｉｄｅｒｅｒ、　Ｌａｂ、　Ｍｅｄ。

７巻、１８９〜１９３貞；　Ｋ、　Ｌｏｒｅｎｔｚ　ｌ
ｏｔ、　ｃｉｔ、）０このようにして、モルトン・シュ
ノζルツ（ＭｏｒｔｏｎＫｎ　Ｓｃｈｗａｒｚ）じＩｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　−ａｎ　
Ｏｖｅｒｖｔｅｗ（１９＆３年）、４〜９頁〕によって
、人間のだ液のα−アミラーゼに対する抗体はだ液系の
酵素を７８％、すいぞ５の酵素を′７５％抑制すること
が記載されている。それ□故、実際に免疫学的基礎での
両酵素の定量的区別が可能になる方法を解明することは
予期されなかった。

本発明方法に使用した新規モノクロン抗体は、ＮＣＡＣ
Ｃ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　
ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　、ボートン
・ダウン（ＰｏｒｔｏｎＤｏｗｎ　）　、英国〕で供給
された：クロン　７９　二ＮＣＡｑＣ、８４１１１３０
５、クロン　ｌＡ３１３Ｅ１０　二ＮＣＡＣＣ８４１１
１３０４、クロン　ｌＡ３１４Ａ　７　二ＮＣＡＣＣ８
４１１１３０３、クロン　３２Ｃ５１６Ｅ３　＝ＮＣＡ
ＣＣ８４１１１３０２，１、／）ロソ　ス−）ＣＲＩＲ
ＦＩＩ　＝ＮＣＡＣＣ８４１１１３０１本発明によれば
、これは実験動物を自然又は変性されただ液のα−アミ
ラーゼで免疫し１．このようにして得られた免疫動物の
Ｂ　ＩＪン・２球を形質転換因子と融合し、クローニン
グし、こ″　のようにして形成したモノクロン抗体を生
じる混合細胞を培養し、モノクロン抗体を単離して得る
ことができる。だ液のα−アミラーゼ抗体を製造するた
めの特に適当な動物は、ねずみ及。

びはつかねずみである。免疫は、人間の自然のだ液のα
−アミラーゼか又は変性されただ液のα−アミラーゼで
行なう。自然の酵゛素を使用する場合には、市場で得ら
れる電気泳動による均一な調剤が適当である。化学的に
変性されただ液のα−アミラーゼは、同じようにして、
例えばドイツ特許公開公報第２５４３９９４号に記載さ
れている酵素変性の公知方法によって得ることができる
。適当な変性剤は、例、えば蛋白質のトリシトファン基
の酸化［ＢＢＡ、１４３−８（１９６７年）、４６２〜
４７２頁］、主としてヒス、チジンに作用する酢酸ヨー
ド（ＩＡＡ）でのカルゼキシメチル化又はテトラニトロ
メタンでのニトロ化［：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、２３８巻（１９６３年）３３０７頁〕、ジアゾ化スル
ファニル酸でのジアゾ化［Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ
、　２５巻（１９７２年）、５１５〜５３１頁］並びに
ジニトロフルオルペンゾール（ＤＮＦＢ）と反応（Ｊ、
Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２４３巻（１９６８年）、５３４４〜２５
３Ｎ］させたＮ−プロムサクシンイミト（ＮＢＳ）であ
る。この場合自然の酵素は別として、ＤＮＦＢで変性し
た酵素が最も適当であることが判明した。

免疫は、自然又は変性された酵素の、好ましくはアクユ
・Ｓントと組合せた常用の投与によって行なう。好まし
くはアジュノＺントとしては、水酸化アルミニウムを号
？ルダテラ・ベルトウシイス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ　
Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）　と−緒に使用する。

免疫に自然のだ液のα−アミラーゼを使用する場合には
、免疫は好ましくは少くとも９ケ月にわたって少くとも
７回の免疫（注入１．Ｐ、）で行なう。変性されただ液
のα−アミラーゼを使用する場合には、免疫の１部分を
試験管内で行なうのが有利であることが判明した。しか
しながら試験管内の免疫を行なう前に、生体内の免疫を
少くとも２回行なわなければならない。試験管内の免疫
の場合には、免疫動物の１３　１Ｊンノｅ球を胸腺細胞
で調整した培地で培養し、培地に抗原を添加する。

免疫後に、免疫動物の１３　１Ｊン・ξ球を、常法で形
質転換因子と融合させる。本発明範囲内で使用すること
のできる形質転換因子の例は、骨・隨腫細胞、形質転換
ウィルス、例えばＥ−Ｂウィルス又はドイツ公開特許第
３２４５６６５号明細書に記・成されている因子である
。融合は、ケーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）及びミルシュタ
イン（Ｍｉｌ　−５ｔｅｉｎ）の公知方法［Ｎａｔｕｒ
ｅ　２５６巻（１９７５年）、４９５〜９９７頁〕によ
って行なう。

この場合形成した混合細胞は公知方法で、例えば市場で
得られるセルツルター（Ｚｅｌｌｓｏｒｔｅｒ）を使用
してクローニングし、所望のモノクロン抗体を形成する
クロンも培養する。混合細胞の癌腫状の成長に基づいて
、これは不定時間で培養し、所望のモノクロン抗体を任
意の量で生じることができる。このようにして得られた
モノクロン抗体で体液からのだ液のα−アミラーゼを犬
遣に吸着することができるので、残留するアミラーゼの
活性はすいぞ５のα−アミラーゼに関係すげることがで
きる。

本発明による測定法には、モノクロン抗体はそのま（か
又はその相応する免疫学的性質を有する７ラグメント（
Ｆｃフラグメント）として使用することができる。それ
故この場合゛モノクロン抗体”とは、フラグメントでも
ある。完全な抗体並びにそのフラグメントは固定形で使
用することができる。

意外なことにも本発明によって使用したモノクロン抗体
は、すいぞうのα−アミラーゼに対して５％以下の交叉
反応□□□を有し、多くの場合にはなお１％に過ぎない
交叉反応度に達する。

それ故、この抗体は小麦の芽から得られた公知抑制物質
の代りに、体液のすいぞうのα−アミラーゼの特殊測定
に適当である。

α−アミラーゼそのものの測定は、公知方法によって行
なう。本発明によるモノクロン抗体は選択的にだ液系の
α−アミラーゼを結合し、これをこのようにして酵素活
性の測定から取上げるので、α−アミラーゼの測定の際
モノクロン抗体の存在で得られた値は、単にすいぞうの
酵素に該当する活性に相応する。

好ましくは本発明方法は、分子にグルコース基４〜７個
を有するマルトポリオース、マルトースホスホリラーゼ
、β−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−ホスフ
ァ（・デヒドロゲナーゼ及びＮＡＤを含有するα−アミ
ラーゼ検出系で実施する。

本発明範囲内で好ましく使用したα−アミラーゼの池の
検出系は、分子にグルコース基４〜７個を有するニトロ
フェニルマルトポリオース及びα−グルコシダーゼから
なる。

α−アミラーゼのもう１つの好ましい検出糸は、−宇の
塙で変性さねている澱粉からなる。

変性さＪじＣいる澱粉とは、例えば一定の活で変１１−
サれている１殿粉、例えば”ファデ・ぐス（Ｐｈａｄ−
ｅｂａｓ）　’どし、て重唱で得”−、ｉ　ｔｌる生成
ＳＣスエーフ゛ゝンの７アルマＳ）　ｒ　（Ｐｌ＋ａｒ
ｎｉａｚｉａ）外脚〕並びに１・゛ｆツ公開牛１許第２
８　］、　２１５４υ明細書に記載ン＼れ′Ｃいる生成
物、１ｐびに分解挙動が変えられている澱゛粉、例えば
カルｒＪｊギンメ丁＝ル澱扮及び限￥ｆニア′″キスト
リンて゛ある。これらのすべての−会は公知で本、す、
ぞね故ＩＩＹ説は不必貿である。、本発明方法へで実１
寵するためい−は、試料の液体ｌｉ′Ｘ本発明による抗
Ｓ＋を、θ１′−圧しくは）”ｅ濁液の形で添脂シ２、
次いで不溶物々好」、Ｌ　＜　＆：ｌ′短時間の遠心分
離に」、って分離する。透明なト、澄みな・、常用のα
−アミラーゼ試験で使用する。

杢゛発明による試薬の範囲内では、千２／クロン１１℃
体は完全な杉並びにフ−７グメントの形で固体（−１１
体、例えば免疫吸着１１、紐、叉はプラスデーツクの小
管又はホースの表面に存在Ｉ〜でいてもよい〇この方法
では、だ液系のα−γミ〉−ゼは担体、即ち同相に結合
し、それ故液相では他に分離しないで寸いそうの酵素に
基づく残りの活性の測定を行なうことができる。

本発明範囲内で特に１゛分な結末は、敬神のす（なろク
ロ’、（ｌＣよって得ら土する壬７ノクロノ抗体から混
合しているモノクロン抗体調剤な使用する場合に１１ら
れる。

モノクロン抗体を固定形で使用しない嚇合には、モノク
ロン抗体及びその因］′−１だ液のα−アミラーーーピ
から形成Ｉ−，た錯体は可溶であるσ）で、その分離の
人めの他の方法（、よ、ｆ・［−加的にモ・′クロン抗
体又は免疫の１祭に実験動向から形成した抗体の沈降囚
了ヤ添加することである。この場合には不溶錯体が１杉
成４し、こオ′【はだ液・７つα　アミラー・ゼ、モ・
′クロン抗体及び沈降因子ｔ　ａ　ｆ’１する。

沈降因子とｌ〜ては、好ましくは王ツクロン１１″Ｉ、
体に対するか又は実験動物から免疫の際に形１戊しまた
抗体の抗体（つまり抗−抗体）を使用する。

他の方法は、蛋白質Ａの好ましくは固定形での添加であ
るθ 本発明方法のこの実施形式を行なう好ましい方法は、先
づモノクロン抗体と抗抗体とからなる錯体を形成し、次
いでこれをα−アミラーゼをａｆｆする破験液に添加す
ることである。しかしながら選択的に、先づモノクロン
抗体だけを帆＋Ｊ［Ｉ　ｔ、　、培養後に、だ液のα−
アミラー］ぞとの抗原−抗体−錯体な形成するために、
抗−杭体を添加して不溶性錯体な形成１−でもよい。

抗−抗体な使用する本発明方法の実施形式には、原則と
してモノクロン抗体又は実験動物から形成した抗体に刈
してＡｉ４整されたすべての抗−抗体が適当である。好
ま１．　＜ははつかねずみ又はねずみを使用する場合、
抗−だ液−α−アミラーゼ−血清を作るためには羊から
形成１〜た抗−抗体を使用する。

本発明のもう１つの課題は、α−アミラーゼの検出系及
びだ液のα−アミラーゼの抑制物質を含有する、体液、
殊に血清、七二指腸分泌液、血漿又は尿のだ液のα−ア
ミラーゼと共にすいぞうのα−アミラーゼを特別に測定
する試薬であり、この試薬は抑制物質の代りに、すいそ
うのα−アミラーゼに対して５％以１−゛の交叉反応度
を有するモノ２クロン抗体を含イｊ−Ｊ”る。

本発明による試薬中に含有きれたα−アミラーゼの検出
系及びその他の条件に関し２ては、方法に関”する前記
詳述があてはまる。

本発明によく）で、大きい特異性を有する体液のだ液系
のα−アミラーゼと共にずいぞうのα−アミラーゼの簡
単で迅速な測定が得られ、これによって臨床診断法が改
良される。

実施例 例　１ （Ｎ　）々ルプ（Ｂａｌｂ）／　ｃ−ばつかねずみを、
人間のだ液のアミラーゼ１００　ｉｔｇ　でボルデテラ
・波ルトウシス（ＢＯＲＤＥ置ＬＡ　ＰＥＲＴｔＪＳＳ
ＩＳ）　を有する水酸化アルミニウムで免疫する。約８
週間のリズムで、人間のだ液のアミラーゼそれぞれ５０
１１ｇ　で同！ニアシュ・ζントで３〜４回更に免疫す
る。融合前の４日間に最後の免疫を、生理学的食塩水に
とかしただ液のアミラーゼ５０μｇで静脈内で行なう。

（Ｂ）　牌ぞう細胞とＡｇ８．６５４（ＡＴＣＣＣＲＬ
１５８０）又はＳＰ　２１０　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５
８１）骨髄腫細胞との融合を、Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍ、　
Ｍｅｔｈ、、３９巻、２８５〜３０８頁による標準法に
よって行なう。牌ぞう細胞と骨髄腫細胞との融合割合は
５：１である。融合生成物をＮα２４の培養シャーレ〔
コスタール（Ｃｏｓｔａｒ）　社製１１０個に入れ、培
養シャー１１１個当りペリトネアル・エクシュダト（ｐ
ｅｒｉｔｏｎｅａｌ　−ｅｘｓｕｄａｔ）　細胞５×ｌ
Ｏを与える。、ｔ？ジの１次培養物（例５参照）を、融
合後３〜４週間に螢光活性のセルツルター（Ｚｅｌｌｓ
ｏｒｔｅｒ）　を用いてクローニングする。細胞を個別
にＮα９６のコスタール　（Ｃｏｓｔａｒ）のプレート
に入れ、ベリトネアル・エクシュダト（ｐｅｒｉｔｏｎ
ｅａｌ　−ｅｘｓｕｄａｔ）　２　Ｘ　Ｉ　Ｑ　を与え
る。

例　２ クニトロフルオルベンゾールでのα−アミラーゼの変性
。

だ液のアミラーゼ２０μモル／ｌ及びジニトロフルオル
ペンゾール２０ｍモル／ｌわずかなエタノールに溶解）
を混合し、室温で１０分間恒温に保つ。次いで溶液を、
燐酸塩緩衝液（５０ｍモル／　ｌ！　、　ｐＨ６，８’
）に対して２０時間透析する（令室）。透析液は、差異
スペクトルで波長３６０１ｍで吸光の増大値○０７０を
示す。

溶液を、免疫まで冷凍する。透析液中の蛋白質の濃度は
１５μモル／ｌでアル。

このようにして得られた変性α−アミラーゼで、はつか
ねずみを例１のようにして免疫した。

変性アミラーゼで免疫したはつかねずみは、第２の免疫
後にすべて死ぬ。それ故このはつかねずみの牌ぞう細胞
を第１のブース）　（Ｂｏｏｓｔ）　７ｆｚに培養し、
ルベン（Ｌｕｂｅｎ）の方法（Ｍｏｌｅｃ、　Ｉｍｍ−
ｕｎｏｌｏｇｙ　％　１７巻（１９８０年）、６３５〜
６３９頁〕によって、培地３Ｑｍｌにとがした抗原１０
０μｇの存在で”試験管内“でなお４日間免疫する。４
日間後に、細胞を、例１によって得られた牌ぞう細胞の
ようにして融合させ、”ｌＤ＝理する。

例　３ 免疫はつかねずみの血清中又は混合細胞の培養の上澄み
中又は腹水中のアミラーゼ結合性抗体の濃度及び特異性
を検出するために、エリザ（ＥＬＩＳＡ）を試吟原理と
して使用する。このためにＮα９６のエリザ（ＥＬＩＳ
Ａ）（ＮＵＮＣ社製）に羊−抗一はつかねずみ−Ｆ０−
抗体を被覆する。

非特異結合を減少するために、牛の血清−アルブミン（
生理学的食塩水にとかした２％）を後被覆する。次いで
抗体を含有する試料とか又はその異なる希釈液と培養す
る。

これに続く培養を、だ液のアミラーゼ−ペルオキシダー
ゼ−（ｐｏｏ　）−結合物又はすいぞうのアミラーゼ−
ＰＯＤ−結合物で行なう。結合したＰＯＤの活性を、Ａ
ＢＴＳ（２，２’−アジンジー／３−エチルベンズチア
ゾリンスルホネート（６）／　）　（ｐｆ（＋、＋　）
で測定し、吸光を、結合したはつかねずみの抗体の尺度
として直接に採用する。交叉反応を測定するために、そ
れぞれの試料に対してだ液−ＰＯＤ及びすいぞうのアミ
ラーゼ−ＰＯＤの結合を別々に測定し、だ液のアミラー
ゼ−ＰＯＤで得られた吸光を結合１００％とする。同時
に得られたすいぞうのアミラーゼ−ＰＯＤでの吸光によ
って、だ液のアミラーゼ−ＰＯＤの吸光の％で試料の交
叉反応が判明する。

一般にすいぞうのα−アミラーゼ−ＰＯＤの結合が行な
われなかったクロン４個及び交叉反応１５〜５％を有す
るクロン５個が判明した。

スクリーニング後に得られたクロンを拡大する。

ＲＰＭＩ−培地は、Ｊ、Ａ、Ｍ、Ａ、１９９巻（１９５
７年）５１９頁に記載されており、市場で得られる。

例　４ 羊−抗−はつかねずみ−ＡＫによるモノクロン抗体（Ｍ
ＡＲ）の固定及び続くだ液のアミラーゼの結合。

はつかねずみからの腹水 羊−抗一はつかねずみ−Ａ　Ｋ　（ＩｇＧＦｃｐ）：　
１９ｇ／ｌ燐酸塩緩衝液、…＝７．Ｏ；０．０５モル／
ｌ牛の血清アルブミン２％を有する燐酸塩緩衝液、ｐＨ
＝７．ｏ　；　０．０５モル／１１人間のだ液のアミラ
ーゼ＝１０００Ｕ／ｉ基質変換歌μモル／　ｍｌ　７分
（３７°Ｃ）、基質トシテの４−二トロフエニルマルト
へシタオシＰを有する） 人間のすいぞうのアミラー−＋；：：：ｃｏｏ○Ｕ／酢
酸：０．５モル／ｌ 硫酸水素二カリウム溶液＝２モル／ｌ 腹水からのＭＡＫを、羊−抗一はつかねずみの抗体と１
：１００の割合で混合する。この混合物を燐酸塩緩衝液
で１＝２で希釈し、３７’Ｃで１５分間振盪する。得ら
れた沈澱物を緩衝液で２回洗浄し、次いで酢酸（出発容
量の約１１５）に溶解する。５分間振盪後にに２ＨＰＯ
４溶液を１＝２の割合で添加する。再び沈澱物が生じる
。これを、Ｒ８Ａ（牛の血清アルブミン）を有する燐酸
塩緩衝液で２回、次いで緩衝液だけで２回洗浄する。続
いて沈澱物を、出発容量の１１５に緩衝液で懸濁させる
。沈澱物５０μｌをだ液又はすいぞうのアミラーゼ５０
μｌに添加し、室温で１５分間恒温に保つ。次いで沈澱
物を遠心分離して除き、上澄みを例７によって処理する
。対照物としては、沈澱物の代りに緩衝液５０μｌで処
理したアミラーゼ試料が役立つＯ 例　５ だ液のアミラーゼに対するＭＡＫの結合及び続く羊−抗
一はつかねずみの抗体での沈澱。

モノクロン抗体を有する腹水な、緩衝液で１＝５０の割
合で希釈する。この溶液５０μｌを、だ液又はすいぞう
のアミラーゼ５０μｌと室温で１５分間振盪する。対照
物としては、１方では緩衝液での腹水希釈液からなる混
合物（腹水の空試験）、他方ではアミラーゼと緩（資）
液とからなる混合物（アミラーゼ活性の対照物）が役立
つ。続いて沈澱性抗−抗体５０μｇを添加する。室温で
１０分間後に、沈澱物を遠心分離して除き、上澄みを例
７によって処理する。

例　６ 羊−抗一はつかねずみ一抗体によるＭＡＲの固定及び続
くだ液及びすいぞうのアミラーゼの混合物からの人間の
だ液のアミラーゼの結合。

例５に相応して、人間のすいぞう及びだ液のアミラーゼ
（それぞれ１００ＯＵ／ｌ）からなる混合物を、予処理
した沈澱物と培養する。遠心分離後に、上澄みを例７に
相応して処理する。

例　７ 残留するすいぞうのアミラーゼの測定。

例４〜６による上澄み５０μｌを市場で得られろ試薬ｌ
　ｍｌに、α−アミラーゼを、基質としての４−ニトロ
フェニルマルトへブタオシド（ベーリンガー社製、Ｎ［
Ｌ５６８５８９）で測定するために添加する。上澄みの
活性度を、導入後に３７℃で測定する。残留活性度が、
それぞれ同伴する対照物に対する活性度（％）として測
定される。例４での残留活性度は、だ液のアミラーゼで
は０〜５％であり、すいそうのアミラーゼでは７０〜９
５％である。例５による試１ゆによって、だ液のアミラ
ーゼでの残留活性度０〜５％及びすいそうのアミラーゼ
での残留活性度８０〜９５％が得られる。両酵素の同時
の存在（例６）によって、だ液のアミラーゼの選択的低
下が得られ、すいぞうのアミラーゼは活性であり、８０
〜９５％測定することができる。

（ほか１名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ１体液のだ液のα−アミラーゼと共にすいぞうのα−
   アミラーゼを、α−アミラーゼの検出系とだ液のα−ア
   ミラーゼの抑制物質の存在で反応させて特別に測定する
   方法において、′抑制物質の代りに、すいぞうのα−ア
   ミラーゼに対して５％以下の交叉反応度を有するモノク
   ロン抗体を添加することを特徴とする、体液の□だ液の
   α−アミラーゼと共にすいぞうのα−アミラーゼを特別
   に測定する方法。 ２、実験動物を自然又は変性されただ液のα−アミラー
   ゼで免疫しＪ免疫動物のＢ−リンノソ球を形質転換因子
   と融合□させ、・クローニングし、このようにして形成
   した混合細胞を培養し、これからモノクロン抗体を単離
   することによって得られたモノクロン抗体を特徴する特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、実験動物とし文ねずみ又ははつかねずみを特徴する
   特許請求の範囲第２項記載の方疾。 先　免疫を、アジュ・２ントとしての水酸化アルミニウ
   ム及びゼルダテラ・ペルトウシス（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌ
   ａ　ｐｅｒｔｕａｓｉｓ）　で行なう、特許請求の範囲
   第２項又は第３項記載の方法。 ５、　自然のだ液のα−アミラーゼで免疫し、免疫を少
   くとも９ケ月にわたって少（とも７回行なう、特許請求
   の範囲第２項から第４項ま゛でのいずれか１項記載の方
   法。 ６、免疫を、変性されただ液のα−アミラーゼで行ない
   、生体内の□免疫少くとも２回、続いて少くともＢ−リ
   ンＡ球を胸腺細胞で調整した培地で培養する試検管内の
   免疫を行なう、特許請求の範囲第２項から第４項までの
   いずれか１項記載の方法。 ７、形質転換因子と尼て骨髄腫細胞を使用する、特許請
   求の範囲第２項から第６項までのいずれか１項記載の方
   法。 ８　モノクロン抗体を固定形で使用する、特許請求の範
   囲第１項から第７項までのいずれか１項記載の方法。 ９　付加的に沈降性因子を添加し、形成しただ液のα−
   アミラーゼ、モノクロン抗体及び抗−抗体からなる不溶
   性錯体を溶液から分離する、特許請求の範囲第１４項か
   ら第７項までのいずれか１項記載の方法。 １０　沈降性因子として、モノクロン抗体か又は実験動
   物から形成した抗体の抗体（抗−抗体）を特徴する特許
   請求の範囲第９項記載の方法。 １１、沈降性因子として蛋白質Ａを特徴する特許請求の
   範囲第９項記載の方法。 １２、予め形成したモノクロン抗体と抗抗体とからなる
   錯体を添加する特許請求の範囲第９項から第１１項まで
   のいずれか１項記載の方法。 ■３．　先づモノクロン抗体を添加し、培養し、錯体を
   、抗−抗体を添加して不溶にする、特許請求の範囲第９
   項記載の方法。 １４、羊の抗−抗体を特徴する特許請求の範囲第９項か
   ら第１３項までのいずれか１項記載の方法。 １５、α−アミラーゼの検出系として、グルコース基４
   〜７個を有するマルトポリオース、マルトースホスホリ
   ラ・−ぜ、β−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６
   −ホスファトデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤを特徴する特
   許請求の範囲第１項から第１４項までのいずれか１項記
   載の方法。 １６、α−アミラーゼの検出系として、分子にグルコー
   ス単位４〜’Ｎ［ｉ！ｉｌヲ有ｔルニトロフェニルマル
   トポリオースをα−グルコシダーゼと一緒に使用する、
   特許請求の範囲第１項から第１４項までのいずれか１項
   記載の方法。 １７、α−アミラーゼの検出系として一定の基で変性さ
   れている澱粉を特徴する特許請求の範囲第１項から第１
   ４項までのいずれか１項記載の方法。 １８、α−アミラーゼの検出系及びだ液のα−アミラー
   ゼの抑制物質を含有する、体液のだ液のα−アミラーゼ
   と共にすいぞうのα−アミラーゼを特別に測定する試薬
   において、抑制物質の代りにすいぞうのα−アミラーゼ
   に対して５％以下の交叉反応度を有するモノクロン抗体
   を含有する試薬。 １９、α−アミラーゼの検出系として、グルコース基４
   〜７個を有するマルトポリオース、マルトースホスホリ
   ラーゼ、β−ホスホグルコムターゼ、グルコース−６−
   ホスファトデヒドロゲナーゼ及びＮＡＤを特徴する特許
   請求の範囲第１８項記載の試薬。 ２０、α−アミラーゼの検出系として、グルコース単位
   ４〜７個ヲ有スルー”　）　０７　ｘ　＝　／ｌ／７　
   ／Ｌ／トポリオース及びα−グルコシダーゼを特徴する
   特許請求の範囲第１δ項記載の試薬。 ２１、α−アミラーゼの検出系として一定の基で変性さ
   れている澱粉を特徴する特許請求の範囲第１８項記載の
   試薬。 ２２、すいぞうのα−アミラーゼ、サブ群ＩｇＧ２ｂカ
   ・ｅ　（Ｋａｐｐａ）に対して５％以下の交叉反応度を
   有する、だ液のα−アミラーゼに対するモノクロン抗体
   。