JPH0235098A - モノクローナル抗体及び該抗体を用いるヒトアルカリホスフアターゼアイソザイムの免疫活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はモノクローナル抗体及び該抗体を用いるヒトア
ルカリホスファターゼアイソザイムの免疫活性測定法に
係り、各種疾患の臨床検査に利用され、診断の一助とな
る。

（従来の技術） ヒトアルカリホスファターゼは燐酸エステルに作用して
加水分解を行う酵素であり骨、肝、胎慇、小腸結膜等生
体内に汎く分布しており、細胞膜に局在して細胞膜を通
じ燐酸の移動に関与しているものと考えられている。従
って、その測定は各種疾患例えば肝炎、閉塞性黄痕、肝
胆道疾患、悪性腫瘍、骨疾患の診断に際して有用な指標
を与えるものとされている。

このヒトアルカリホスファターゼには３種のアイソザイ
ム、即ちヒト肝／骨／腎臓型アルカリホスファターゼ、
ヒト小腸型アルカリホスファターゼ及びヒト胎盤型アル
カリホスファターゼがある。

これらのヒトアルカリホスファターゼアイソザイムの定
量、即ち免疫活性の測定に関して、総活性についてはに
ｉｎｄ　−１［ｉＢ法（“Ｊ、　Ｃｌ１ｎ。

Ｐａｔｈ、”第７巻第３２２頁（１９５４年）１、Ｂｅ
５ｓａｙ　−Ｌｏｗｒｙ法［”Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ
ｅｗ、”第　１６４巻第３２１頁（１９４６年）１等が
採用されており、又個々のアイソザイムの免疫活性を測
定するためには、従来、電気泳動を主体とし分子量、ノ
イラミダーゼ感受性、阻害剤に対する感受性、熱安定性
、にｍ、基質特異性等の内の２−３の測定を組合せるこ
とにより行われてきた［“臨床検査″第２５巻第７８６
−７９２頁（１９８１年）］。

（発明が解決しようとする課題及び発明の目的）上記の
従来技術によるヒトアルカリホスファターゼアイソザイ
ムの分別定量法は数種頭の測定を組合わせるものである
ために、全体として操作が繁雑であって長時間を要し、
又定量性や測定感度も低いために日常の臨床検査には不
適当とされているのが実情であり、従って総活性の測定
法であるＫｉｎｄ　−Ｋｉｎｇ法及びＢｅ５ｓａｙ　−
Ｌａｗｒｙ法が汎用されている。

しかしながら、個々のアイソザイムがもたらす臨床情報
は互いに異なり、即ちヒト肝／骨／腎臓型アルカリホス
ファターゼ活性値の変動は肝胆道系疾患及び骨疾患に関
する情報をもたらし、ヒト小腸型アルカリホスファター
ゼ活性値の変動は急性や慢性の肝炎及び肝硬変に関する
情報をもたらし、又ヒト胎盤型アルカリホスファターゼ
活性値の変動は華丸腫瘍、子宮頚部癌及び卵巣癌に関す
る情報をもたらすので、従来汎用されてきた総活性の測
定は当然のことながら各アイソザイムの個々の活性値を
与えるものではないので、的確な診断を容易に下すため
の適切な臨床情報をもたらすものではない点に課題を有
していた。

従って、本発明の本質的な目的は、各ヒトアルカリホス
ファターゼアイソザイムのの活性を簡便な操作で且つ高
精度を以て測定し得る方法を提供することにある。

本発明の付随的な、但し基本的な目的は、各アイソザイ
ムの活性を測定可能にするために、特定のアイソザイム
と特異的に免疫反応する抗体を提供することにある。

（課題を解決し、目的を達成する手段及び作用）本発明
によれば、上記の課題は、各ヒトアルカリホスファター
ゼアイソザイムに対するモノクローナル抗体を作製する
と共に、このモノクローナル抗体を用いた分別定量法を
確立することにより解決され、上記の目的が達成される
。

即ち、上記の基本的な目的は、ヒトアルカリホスファタ
ーゼアイソザイムに対するモノクローナル抗体により達
成される。このヒトアルカリホスファターゼアイソザイ
ムとはヒト肝／骨／腎臓型アルカリホスファターゼ、ヒ
ト小腸型アルカリホスファターゼ及びヒト胎盤型アルカ
リホスファターゼから選択されたものであり、これらア
イソザイムに対するモノクローナル抗体は自体周知の手
法を用いて得ることができる。即ち、精製した特定のア
イソザイムを抗原として動物に感作させ、感作細胞とマ
ウスミエローマ細胞とを細胞融合させ、得られたハイブ
リドーマをクローニングしてモノクローン由来のハイブ
リドーマを選出し、このモノクローン化ハイブリドーマ
を動物に移植するか試験管内で培養して所望のモノクロ
ーナル抗体を産生させ、次いでハイブリドーマ移植動物
の腹水から又はハイブリドーマ培養液から抽出精製する
ことによりモノクローナル抗体を得ることができる。

本発明方法によれば、各ヒトアルカリホスファターゼア
イソザイムの免疫活性測定は、上記のようにして得られ
る特定のヒトアルカリホスファターゼアイソザイムに対
するモノクローナル抗体に検体を添加しインキュベート
して抗原抗体反応させ、この反応液の吸光度を測定する
ことにより行うことができる。この測定法の実施におい
て、モノクローナル抗体を固相に吸着させておくことが
でき、この固相としてはプレート、濾紙、ビーズ、ラテ
ックス等の慣用の担体であることができる。尚、ヒト小
腸型アルカリホスファターゼの免疫活性測定に際しては
、このアルカリホスファターゼとモノクローナル抗体と
の結合が阻害されて精度の低下する場合があるが、予め
測定系にアミノ糖を添加しておくことにより精度の低下
を防止することができる。このアミノ糖としては、Ｎ−
アセチル−Ｄ−ガラクトサミンが有利であり、その濃度
は０．１−１．０Ｍ程度が好ましい。

（実施例等） 次に、参考例、製造例、実施例等により本発明を更に詳
細に且つ具体的に説明する。

１１匠（ハイブリドーマの作製） ａ）　ディスク及びＳＯ３−ポリアクリルアミド電気泳
動的に均一とされる程度に精製された肝／骨／腎臓型、
小腸型及びヒト胎盤型の３種のアルカリホスファターゼ
アイソザイム［“ＣｈｅｌｌＩ。

Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ”第２３巻第２３６９頁（１９
７５年〉、同第２３巻第１５３７頁（１９７５年）、及
び同第４２巻第１６１頁（１９７２年）１を抗原として
それぞれ準備し、フロイント完全アジュバントによりエ
マルジョン化させた。

この抗原エマルジョンを雌性［ＩＡＬＢ／ｃマウス（６
週令）に１回１００μｇの割合で２週間おきに計３回腹
腔内投与して感作させた。オフタロニー法により抗体価
の上昇を確認し、最終感作から２週間後に、生理食塩水
に溶解させた抗原１００μｇを静脈内に投与し、この静
脈内への抗原投与から４日後に膵臓を摘出して常法によ
り肺細胞浮遊液を調製した。

ｂ）ハイブリドーマの作製及びクローニング上記のａ）
項で得た肺細胞浮遊液（２Ｘ　１０　　個含有）と、別
途に調製したマウスミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ＆−
６５３）浮遊液（２ｘ　１０’個含有）とを組合した後
に、１１０００ｒｐで１分間遠心処理して上清を除去し
、両細胞の混合物である沈殿を採取した。この沈殿物に
５０％（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコール溶液１１を、
３７℃において緩く攪拌しながら添加して両細胞を融合
させた。その後に、ＲＰＭＩ　１６４０培地を徐々に添
加して細胞融合反応を停止させ、ＲＩ’ＭＩ　１６４０
培地で２−３回洗浄（１０００ｒｐｍ、５分間）した。

上記のようにして得た融合細胞であるハイブリドーマを
、牛胎児血清を１５％添加したＲＰＭ１１６４０培地に
浮遊させて　１０７個／１のハイブリドーマ懸濁液を調
製した。

９６穴の組織培養プレートに上記のハイブリドーマ懸濁
液を０．１１宛入れ、炭酸ガスインキュベータにより　
９５％空気７５％炭酸ガス気流中、３７℃の条件下で２
４時間培養し、次いでヒボキサンチン−アミノプテリン
−チミジン（）１人Ｔ）選択培地を０．１１宛添加して
更に培養を行った。培養開始から２．３．５．７及びｌ
Ｏ日目に）ＩＡＴ培地の交換を行いながら培養を継続し
、１４日目に各培養上清を採取し、エンザイムイムノア
ッセイ　（ＥＩＡ）により抗体産生細胞の選別を行った
。この選別は限界稀釈法を採用し、１ウエル当９０．５
個のハイブリドーマが含まれるようにして増殖させるこ
とにより行った。得られた各抗体産生クローンについて
、更に２回にわたり稀釈−培養を繰り返してモノクロー
ン化された抗体産生ハイブリドーマを得た。

尚、上記の諸操作は、Ｋｏｈｌｅｒ、　Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ等により確立された方法［“Ｎａｔｕｒｅ”第２５６
巻第４９５頁（１９７５年）ｌに準拠するものである。

１１匹（モノクローナル抗体の製造） 各雌性［ＩＡＬＢ／ｃマウス（６−８週令）にブリスタ
ン０．５ｍｌを腹腔的投与し、このブリスタン投与から
１０日後に、上記の参考例で得た抗体産土ハイブリドー
マを１０’　−１０７個採取しマウスの腹腔内に投与し
て増殖させた。１−２週間後に、貯溜した腹水を採取し
、３０００ｒｐｍで１０分間遠心処理した後に５０％硫
酸アンモニウムで分画処理し、得られた沈殿を０．１Ｍ
燐酸緩衝液（ｐＨ８，１））に溶解させ、この緩衝液を
用いて透析処理した。

得られた透析処理物を、０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８，
０）で平衡化させたＤＥＦＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６
８カラムに吸着させ、０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ８，０
＞で溶出させた。この溶出画分を、０．１Ｍ燐酸緩衝液
（ｐ）ｌ　８．０）で平衡化させたＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ
−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４［１カラム（スウェーデ
ン在、ファルマシア社製）に吸着させ、０．１Ｍ燐ｉ！
！２緩衝液（ｐ）Ｉ　８．０）で洗浄し、１Ｍ酢酸溶液
で溶出させた。得られた溶出画分を、０．１５Ｍ燐酸緩
衝液（ｐＨ７，４＞により充分に透析処理して所望のモ
ノクローナル抗体溶液を得た。

ハイブリドーマが腹腔内で産生じたモノクローナル抗体
の量は５−２０ｍｇ／ｍｌ腹水であった。

ＬＬＩＬ　１　（免疫グロブリンクラス及びサブクラス
の同定） 上記の製造例に記載のようにして産生され精製された各
モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス及びサブク
ラスの同定は、マウス１ｇサブクラスタイピングキット
　（米国布、ザイメット社製）を用い、下記のようにし
て行った。

１０８ｇの各アルカリホスファターゼアイソザイムを固
相化させ、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０　（関東化学
株式会社製）、０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有１０ｍＭ
燐酸緩衝液（Ｐ［ｌＳ−Ｔｗｅｅｎ）にて稀釈したモノ
クローナル抗体溶液を添加し、３７℃で２時間インキュ
ベートした。　ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより洗浄した後に
、パーオキシダーゼ標識を施したウサギ抗血清（抗マウ
スＩｇＧ、、１ｇＧ２．１ｇＧ２．１ｇＧ３、ＩｇＭ及
びＩｇＡ）を別々に添加し、３７℃で２時間インキュベ
ートした０次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより洗浄した
後に、パーオキシダーゼ活性を測定して免疫グロブリン
クラス及びサブクラスを同定した。その結果は下記の表
１に示されている。

漣１１２　（モノクローナル抗体の特異性乃至抗原に対
する親和定数） 上記の製造例に記載のようにして産生され精製された各
モノクローナル抗体の特異性乃至親和定数を下記のよう
にして求めた。

ラット血清により稀釈した５０μｇ／ｉｆのモノクロー
ナル抗体５０μｍと、０．１Ｍ塩化ナトナトリウム含有
１ｈＴｒｉｓ−塩酸）１衝液（ｐＨ７，２＞に溶解させ
た０、５．０．２５及び０．１２５　ｍｇ／ｍｌ濃度の
アルカリホスファターゼ抗原溶液５０μｍとを混合し、
２５°Ｃにおいて　１時間放置した０次いで、５０％飽
和［酸アンモニウム溶液０．２１を添加し、直ちに混合
させた後に２５°Ｃにおいて　１時間放置した。その後
、４℃において４０００ｒｐｍで５分間遠心処理して、
上清画分と沈殿画分とに分け、各画分を０．１Ｍ塩化ナ
トリウム含有１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７
，２）により稀釈した後にアルカリホスファターゼ活性
を測定し、遊離のアルカリホスファターゼ量と、抗体に
結合したアルカリホスファターゼ量とを求めた。これら
の値を用いて　Ｉａｎｇｍｕｒ−ｐｌｏｔを実施し、直
線の傾きと切片の値から関連モノクローナル抗体の親和
定数を求めた。これらの結果は前記の表１に併記されて
いる。

表１に示されているように、冬型のアルカリホスファタ
ーゼエンザイムに対する数種のモノクローナル抗体が既
述の製造例で作製されたが、何れのモノクローナル抗体
も感作抗原であるアイソザイムに対して１０’　Ｍ”以
上の親和定数を有していることが判明した。尚、表１中
においてＨＰＭＳ−１及び２ＨＩＭＳ−２と命名されて
いるモノクローナル抗体には、抗血清（ポリクローナル
抗体）において生じるような小腸型と胎盤型アルカリホ
スファターゼに対する交差反応が認められなかった。

２ｉ！ＬｆＬ（免疫活性の測定） ＆）モノクローナル抗体の固相化 製造例により得たモノクローナル抗体（前記の表１にお
いてｒ　Ｉ（ＬＭＳ−ＩＪ、「２旧ＭＳ−２Ｊ及びｒ　
Ｉ（ＰＭＳ−１ｊと命名されている抗体〉を下記の要領
でマルチウェルプレートに物理吸着させた。

０．１５Ｍ塩化ナトリウムと　０．０２％アジ化ナトリ
ウムとを含有する　ｌＯａ＋Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４
）で７μに／Ｉｌｌ　＋に稀釈したモノクローナル抗体
溶液を１ウェル当り　１００μｍ宛でマルチウェルプレ
ートに分注し、４°Ｃにおいて２４時間放置した０次い
で、各ウェルをｆ’Ｂｓ−Ｔｗｃｅｎで２回洗浄した後
ニ、０．５％　［ｌＳＡと　０．１５Ｍ塩化ナトリウム
と０．０２％アジ化ナトリウムとを含有する　Ｉ　００
１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，４）を各ウェル当９２００μ
ｍ宛分注して固相化モノクローナル抗体とした。この固
相化モノクローナル抗体は、用時迄４℃の温度条件下で
保存される。

尚、吸着に使用される抗体の濃度とプレートに物理吸着
した抗体と抗原（ヒトアルカリホスファターゼ）との反
応性を調べた結果は第１図に示される通りであり、この
図から何れのモノクローナル抗体の場合にも７μｇ／ａ
１以上の濃度とすればプレートに吸着される抗体量はプ
ラトーに達すること及びこの場合に抗原抗体反応により
抗原量の約９０％又はそれ以上が抗体に吸着されること
が判明した。

ｂ）アルカリホスファターゼの免疫活性測定この測定に
用いたアルカリホスファターゼ標準液は通常の精製に加
えてアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行
ったアルカリホスファターゼを稀釈することにより調製
された。この標準液を調製するための稀釈及び場合によ
り行われる血清検体の稀釈は０．５％　ｌＳＡ、０．１
５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｘアジ化ナトリウム、０
．５％トリトンＸ−４０５、ｌＯμＭマグネシウム及び
ｌＯμＭ塩化亜鉛を含有するＴｒｉｓ−塩酸ｔａ衝液液
ｐＨ８，０）を用いて行われた。尚、肝／骨／腎臓型及
び小腸型アルカリホスファターゼの測定においては血清
原液がその侭検体として用いられ、又胎盤型アルカリホ
スファターゼの測定においては血清原液を　１０倍に稀
釈して検体とした。

マルチウェルプレートの各ウェルに、検体及びアルカリ
ホスファターゼ標準液をそれぞれ１００μｍ添加して抗
原抗体反応を行わせた後に、０．０５％　Ｔｗｅｅｎと
０．１５Ｍ塩化ナトリウムと含有する５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）により洗浄し、次いで充
分に液切りした後に、アルカリホスファターゼ活性の測
定を行った。この活性測定はＩＦＣＣ法（ＩＦＣＣＤｏ
ｃｕｍｅｎｔ　１９８１）に準じて、即ちｌｓ’ＪＩ溶
液［４０μＭｐ−ニトロフェニールホスフェート、２．
２４ｔａＭ　ａ−ハイドロキシエチルエチレンジアミン
三酢酸、１．１２ｄ　ｉｌ酸亜鉛７水和物及び２．２４
ｍＭ酢酸マグネシウムを含有する０、３９３Ｍ２−アミ
ノ−２−メチル−１−プロパノ−ルー塩酸緩衝液（ｐＨ
１０，４）］を加温して３７℃になした後に、ウェルに
１００μｉ宛分注し、３７℃の恒温槽内で反応させ、各
ウェル内の液の吸光度を波長４０５ｎｍで且つ９６穴プ
レート用リーダー（タイターチックマルチスキャン）を
用いて測定し、この測定値を、アルカリホスファターゼ
標準液の活性と吸光度との関係を示す別途作製の検量線
に照合することにより、検体中のアルカリホスファター
ゼ活性を調べた。

尚、第２．３及び４図は各エンザイムに関して抗原抗体
反応に必要な時間と温度とを設定するために行われた予
備試験結果を示すものであり、これらの図から明らかな
ように、何れのエンザイムの測定に関しても、２８及び
３７℃では約６時間で、又４℃では約１２時間で反応が
プラトーに達する。

第５．６及び７図は各エンザイムについてアルカリホス
ファターゼ標準液の活性と吸光度との関係を示す検量線
であり、従来の臨床データに基いた測定範囲から、活性
測定時間を肝／骨／腎臓型の場合には５分間、小腸型の
場合には１時間、胎盤型の場合には１．５時間に設定し
て測定を行ったものである。

Ｋ１涯ユ（本発明によるアイソザイム免疫活性測定法の
精度） 本発明によるアイソザイム免疫活性測定法の精度を調べ
るために、肝／骨／腎臓型のアイソザイム及び胎盤型の
アイソザイムに関して、既述の実施例と同様にして、但
し血清検体に各種濃度のアルカリホスファターゼ標準液
を添加し、モノクローナル抗体としては肝／骨／腎臓型
のアイソザイムの活性測定にＩＩＬＭｓ−１を、又胎盤
型のアイソザイムの活性測定には２ＨＩＭＳ−２を用い
て抗原抗体反応させ、反応液の吸光度を４０５ｎｍで測
定し、得られた吸光度値を検量線に照合してアルカリホ
スファターゼ活性を求め、これから回収率を算出し、又
同時及び日差再現性を調べた結果は、下記の表２乃至５
に示される通りであった。

これらの結果から、肝／骨／腎臓型並びに胎盤型のアイ
ソザイムの場合には、血清因子による阻害が認められず
、添加回収率は９０％以上に達すること及び再現性も良
好なことが判る。

Ｌ（肝／骨／腎臓型アルカシホスファ ターゼの回収率） 注）表２中において、測定値及び回収率は５検体に関す
る平均値上標準偏差で 示されている 表 ３（胎盤型アルカリホス ファターゼの回収率） Ｌま（肝／骨／腎臓型アルカリホスファターゼの免疫活
性測定法の再現性） 注）表３中において、測定値及び回収率は５検体に関す
る平均値士標準清差 で示されている。

灸ユ（胎盤型アルカリホスファターゼ の免疫活性測定法の再現性） Ｕ（小腸型アイソザイム免疫活性測定法の精度） 小腸型アイソザイムに関する本発明による免疫活性測定
法の精度を調べるために、試験例３に準じて回収率を調
べた処、９０％以上を示さない検体が３９例中１５例（
３８，５％）あった（下記の表６参照）、この原因とし
ては、ＡＢＯ式血液型がＢ又は０型であり且つＬｅｗｉ
　Ｓ式血液型において分泌型［Ｌｅ（ａ−、ｂ＋）又は
Ｌｅ（ａ＋、　ｂ＋）］を有するヒトは脂肪食を摂取す
ると小腸型アルカリホスファターゼの出現し易いことが
従来から報告されているので［Ｂｅｃｋｍａｎ、　Ｌ″
Ａｃｔａ　Ｇｅｎｅｔ、”　　第１４巻第２８６頁（１
９６４年）及びＬａｎｇ＊ａｎ、　Ｍ、　Ｊ。

Ｓｏ等“Ｎａｔｕｒｅ”第２１２巻第４１頁（１９６６
年）１、小腸型アルカリホスファターゼと血液型活性物
質又はその類似糖鎖が結合して小腸型アルカリホスファ
ターゼの血中消失速度が遅延するものと推定された。

そこで、血液型活性物質の構成糖であるし一フコース（
Ｌ−Ｆｕｃ）及びＮ−アセチル−トガラクトサミン（Ｌ
−Ｇａ　１ＮＡｃ　）について、これらを別個に検体稀
釈緩衝液に添加して効果を調べた処、Ｎ−アセチル−Ｄ
−ガラクトサミンを添加した場合に回収率の向上が認め
られたく下記の表６参照）、尚、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガ
ラクトサミンの濃度としては０．１１．０Ｍ程度が好ま
しいことも併せて判明した。

ｒＬ６（小腸型アルカリホスファターゼの免疫活性測定
に及ぼす糖類の影響） ＴＬ！ＬｆＬｉ（小腸型アイソザイム免疫活性測定法−
改良法−の精度） 試験例４による結果を考慮に入れ、Ｎ−アセチル−Ｄ−
ガラクトサミンを０．６Ｍ濃度において反応系に存在さ
せた場合の小腸型アイソザイムに関する免疫活性測定法
の精度を確認するために、試験例３に準じて回収率並び
に同時及び日差再現性を調べた結果は下記の表７及び８
に示される通りであり、極めて良好なものとなった。

注）糖類は０．６Ｍ濃度において添加された注）表７中
において、測定値及び回収率は５検体に関する平均値上
標準偏差で 示されている （発明の効果） 本発明によれば、ヒト肝／骨／腎臓型アルカリホスファ
ターゼ、ヒト小腸型アルカリホスファターゼ及びヒト胎
盤型アルカリホスファターゼに対する、それぞれ固有の
モノクローナル抗体が提供され、又この抗体を用いる、
上記の各アイソザイムの免疫活性測定法が提供される。

従って、本発明を臨床検査に適用することによって、ヒ
ト肝／骨／腎臓型アルカリホスファターゼ活性値の上昇
から肝胆道系疾患及び骨疾患に関する情報がもたらされ
、ヒト小腸型アルカリホスファターゼ活性値の上昇から
急性や慢性の肝炎及び肝硬変に関する情報がもたらされ
、又ヒト胎悠型アルカリホスファターゼ活性値の上昇か
ら畢丸腫瘍、子宮頴部癌及び卵巣癌に関する情報がもた
らされるので、従来汎用されてきた総括性の測定により
もたらされる情報と比較する場合に、情報内容が細部に
わたるものとなる。従って、的確な診断を可能ならしめ
る。尚、本発明による各アイソザイムの免疫活性測定法
は、従来の組合せ法と比較する場合に操作が極めて簡便
であり、又測定精度が著しく高い。

【図面の簡単な説明】

第１図は固相への吸着に使用されるモノクローナル抗体
の濃度と、この場合に固相に物理吸着された上記の抗体
と抗原であるアルカリホスファターゼとの抗原抗体反応
により抗体に吸着された抗原の量との関係を示すグラフ
、第２図は肝／骨／腎臓型アルカリホスファターゼとモ
ノクローナル抗体（ＨＬＭＳ−１）との結合に及ぼす反
応温度及び時間条件の影響を示すグラフ、第３図は第２
図と同様の、但し小腸型アルカリホスファターゼとモノ
クローナル抗体（２）１１ＭＳ−２）との反応の場合を
示すグラフ、第４図は第２図と同様の、但し胎盤型アル
カリホスファターゼとモノクローナル抗体（ＨＰＭＳ−
１＞との反応の場合を示すグラフ、第５図は肝／骨／腎
臓型アルカリホスファターゼの免疫活性測定用の検量線
を示すグラフ、第６図は小腸型アルカリホスファターゼ
の免疫活性測定用の検量線を示すグラフ、第７図は胎盤
型アルカリホスファターゼの免疫活性測定用の検量線を
示すグラフである。 ）−ＩＬＭｓ−１ ２ＨＩＭＳ−２ ＨＰＭＳ〜１ インキュヘーンコン時間 反定温度 ０４°Ｃ Δ　２８’ｃ 口　　　３７６Ｃ （ｈｒ　） インキュベー：／−１ｉン時間 （ｈｒ） 反元温度 ４°Ｃ ２８た 口 ：Ｓ７　’Ｃ 第５図 ○ 耳〒／骨ヅＷＶ％７＋しｎ’ｌｔｌ　７７ｆ　で’３Ｂ
＆（’Ｕ／’）イ〉午ニー（−ン、ン叶問 （ｈ「） 及仄ｄ墨度 ４°Ｃ ２８”ｃ 第６図 ｔＩ、８Ｍ７．ｕ力ｉｔ”Ｒスフ７ターｒ５６ｚＬ生（
ＩＵ／手続補正書（自発） 昭和６３年９月１３日

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトアルカリホスファターゼアイソザイムに対す
   るモノクローナル抗体。
2. （２）ヒトアルカリホスファターゼアイソザイムがヒト
   肝／骨／腎臓型アルカリホスファターゼ、ヒト小腸型ア
   ルカリホスファターゼ及びヒト胎盤型アルカリホスファ
   ターゼから選択されたものであることを特徴とする、請
   求項（１）に記載のモノクローナル抗体。
3. （３）ヒトアルカリホスファターゼアイソザイムに対す
   るモノクローナル抗体に検体を添加しインキュベートし
   て抗原抗体反応させ、この反応液の吸光度を測定するこ
   とを特徴とする、ヒトアルカリホスファターゼアイソザ
   イムの免疫活性測定法。
4. （４）モノクローナル抗体が固相に吸着せしめられてお
   り、この固相がプレート、濾紙、ビーズ及びラテックス
   から選択されたものであることを特徴とする、請求項（
   ３）に記載のヒトアルカリホスファターゼアイソザイム
   の免疫活性測定法。
5. （５）ヒト小腸型アルカリホスファターゼの免疫活性測
   定に際して、測定系にアミノ糖を添加することを特徴と
   する、請求項（３）に記載のヒト小腸型アルカリホスフ
   ァターゼの免疫活性測定法。
6. （６）アミノ糖がＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンで
   あることを特徴とする、請求項（５）に記載のヒト小腸
   型アルカリホスファターゼの免疫活性測定法。