JPH07503374A - ポリフェノールオキシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリフェノールオキシダーゼ ポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）は、ｏ２を消費してフェノールがらキノ ンへの酸化を触媒する、被子植物の遍在性銅金属酵素である。より詳細には、こ れらの酵素は、モノフェノールの０−ヒドロキシ化とこれに続（０−ジキノンへ のその酸化（クレゾラーゼ活性［Ｅ、Ｃ，１，１４，１８，１コ）、または。− ジキノンへの０−ジヒドロキンフェノールの酸化（カテコラーゼ活性［Ｅ、　Ｃ ，１，１０゜３２コ）を触媒する。ＰＰＯはカテコラーゼおよびクレゾラーゼ活 性の両者を有することがあるが、典型的にはクレゾラーゼ活性は、無いが、不安 定であるが、または還元剤もしくは少量の０−ジヒドロキンフェノールによる反 応の開始を必要とする。ＰＰＯにより形成されるキノノイド反応生成物は、それ ら自身との二次反応を受け、または、スルフヒドリル、アミン、アミド、インド ールおよびイミダゾール置換基のような蛋白の核試薬を包含する種々の細胞内求 核試薬を共有結合により修飾および架橋するよう挙動する、極めて活性の電子性 分子である。キノン付加物（通常、茶色または黒色）の形成は、収穫後の生理機 能および食品加工の面でＰＰＯの主たる有害作用を代表し、そしてこれが食品工 学の面でのＰＰＯに対する興味の主たる理由である［アドヴアンンズ・イン・フ ード・リサーチ、１９巻７５頁（１９７１）を参照されたい］。栽培馬鈴薯一つ をとっても、ＰＰＯによりもたらされる黒化は、馬鈴薯加工における毎年の多大 な損失（皮剥き前の黒化、黒斑、圧迫による傷みおよび黒色芯腐れ）の原因とな っている。ＰＰＯの活性を阻害するため、亜硫酸塩またはアスコルビン酸塩添加 物が、食品、ワインおよび飲物の産業においてしばしば使用されている。逆に、 キノン類が植物蛋白を共有結合により修飾し、その栄養価を低下させる能力は、 植物の草食動物抵抗性を高めるが故にＰＰＯに対する関心を招いてきた［ナチュ ラリー・才力−リング・ベスト・バイオレギュレーターズ、１６６−１９７頁、 ＡＣＥブックス、ワシントン（１９９１）を参照されたい］。

ＰＰＯが１８９５年に最初に記載されて以来の精力的な研究にも拘らず、多数の 生化学的および生理学的研究は、ＰＰＯの機能および発現に関する疑問に対する 回答を殆ど提供してこなかった。ＰＰＯの機能の理解に対する生たる障害は、キ ノン付加物の形成に起因する人工的な蛋白種の形成および酵素の不活性化ならび に単離精製中のＰＰＯの架橋である。即ち、迅速なキノンの形成が非修飾ＰＰＯ の単離を極めて困難とし、この問題が、高い植物ＰＰＯの数および性質に対する 高い且つ変動する評価を招（重要な因子である。加えて、ＰＰＯの無い植物の取 得の困難さが、これらの酵素の機能および発現を理解するための遺伝子学の寄与 をごく小さなものとしている。

１８９５年にＰＰＯの活性が最初に認識されて以来、ＰＰＯの機能に関する様々 な仮説が提起されてきた。提起されたこれらの機能はＰＰＯの酸素還元活性なら びにフェノール類をキノン類に酸化する能力に関連するものである。ＰＰＯは、 色素体の酸素レベルの緩衝化、フェノール類の生合成、傷の治癒、および、草食 動物が食べる気を無くすような植物蛋白の抗栄養的修飾に関与していると提唱さ れてきた［ナチュラリー・才力−リング・ベスト・バイオレギュレーターズ、１ ６６−１９７頁、ＡＯブノクス、ワシントンχ、（１９９１）を参照されたいコ 。

ＰＰＯは多くの器官および組織に存在する。これはしばしば葉、塊茎、貯蔵器、 花部および果実に大量にある。ＰＰＯが、高レベルのフェノール性基質と共に発 生の初期段階の塊茎および果実に多量に存在するということは、ＰＰＯが、未熟 な果実および貯蔵器官を捕食者に食べられなくさせているという示唆を導く　［ リースント・アドヴアンンズ・イン・バイオケミストリー・オブ・フルート・ア ンド・ヴエジタブルズ、１５９−１８０頁、アカデミツク・プレス（１９８１） を参照されたい］。ＰＰＯは、根の色素体、馬鈴薯の澱粉体、白色体、エチオブ ラストおよび雑色体、ならびにテンサイの葉から単離される色素体様粒子に検出 されている［イスラエル・／ヤーナル・オブ・ボタニー、１２巻７４頁（１９６ ４）を参照されたいコ。

殆どの研究は、ＰＰＯが、非老化組織の色素体で膜と結合していることを示して いる〔）、ｆトケミストリー、２６巻１頁（１９８７）を参照されたい］。ＰＰ Ｏの活性はしばしば潜在性であって、蛋白分解、洗浄剤、またはＣａ−“による 活性化を必要とする。この酵素は専ら色素体に存在し、細胞が何らかの方法で破 壊されるまでフェノール類との相互作用を防いでいるということが示唆されてい る。

即ち、ＰＰＯは、細胞小器官が傷つき、老化し、または劣化した時にのみサイト ツルに放出される［フォトバイオケミストリー・アンド・フォトバイオフィジク ス、３巻６９頁（１９８１）およびフィンオロノア・プランタールム、７２巻６ ５９頁（１９８８）を参照されたい］。

ＰＰＯは核の遺伝子によりコードされているが［ンヤーナル・オブ・ヘレディテ ィー、８１巻４７５頁（１９９０）を参照されたい］、ＰＰＯの細胞小器官への 標的化および取り込み、細胞小器官膜へのその挿入ならびに膜内でのこの酵素の 空間配置については殆ど知られていない。

モロコシ属（Ｃ４植物）の葉において、ＰＰＯは葉肉の細胞にのみ検出され、維 管束鞘の細胞には存在しなかった。チラコイド、グラナの積層およびＰＳＩＩ活 性の分布を考慮すると、この観察は、ＰＰＯが光合成活性と機能的に関連してい る可能性を示唆する。しかしながら、ＰＰＯは、根、塊茎、果実等のような多く の非光合成器官の細胞にも存在する。非光合成色素体またはテントキシンで処理 された色素体においては、ＰＰＯは、色素体の包膜に付着しているように見える 小胞中に検出されている。これらの観察、ならびに発生中にしばしば観察される ＰＰＯレベルの著量な変化および潜在性は、ＰＰＯ発現の調節がかなり複雑であ り、且つ幾つか、−レベルで行なわれているかも知れないことを示唆するもので ある。

植物におけるＰＰＯの役割を説明する幾つかの機能が提起されている。チラコイ ド膜上に存在し０２に対するに７が高いことに基づき、ＰＰＯが、偽循環的光燐 酸化（ＮＡＤＰ“ではなくＰＰＯを最終的電子受容体とするＡＴＰの生成）、お よび色素体の酸素レベルの調節において機能していることが提起された。しかし ながら、ＰＰＯを基礎とする酸素還元サイクルを作動させ得るこのコンパートメ ントにおける適当なＰＰＯの基質の証拠はない。

これに対し、トリコーム滲出物の重合および昆虫の捕捉におけるＰＰＯの役割は 、比較的良く確立されている［インセクッ・アンド・ザ・プラント・サーフェス 、１５１−１７２頁、ニドワード・アーノルド、ロンドン（１９８６）を参照さ れたい］。種々のナス科植物において、ＰＰＯは主たる蛋白、および腺のトリコ ームの酸化酵素であって（総トリコーム蛋白の約４０−８０％）、昆虫の捕捉を もたらすトリコーム滲出物の０２要求性重合、故に昆虫に食べられることへの抵 抗性を司っているようである［ＰＡＮＳ、２３巻２７２頁（１９７７）およびナ チュラリー・才力−リング・ペスト・バイオレギュレーターズ、１６６−１９７ 頁、ＡＣＳブノクス、ワノントンＤＣ（１９９１）を参照されたいコ。

植物組織におけるＰＰＯの機能の第三の可能性は、チラコイド中へのＰＰＯの隔 離が、草食動物、病原体、老化またはその他の傷害により細胞が破壊されるまで 、フェノール類との相互作用を防ぐということである。フェノール類に対するＰ ＰＯの活性によってこのように生成したキノン類は、それ自身と、そして蛋白と 架橋して、植物組織の嗜好性、易消化性および栄養価を低下させる。この観点は 、ＰＰＯにより形成されるキノン類の第一の標的は核的アミノ駿、ヒスチジン、 ンステイン、メチオニン、トリプトファン、およびリジンであることを示唆する 。これら必須アミノ酸が植物蛋白中に少ないということが、植物を餌とする昆虫 の生育を制限する。ＰＰＯの産生ずるキノン類によるこれら必須アミノ酸の共有 結合的修飾は、さらに、草食動物に対するそれらの栄養効果を減じ、昆虫の挙動 をより貧弱なものとするかも知れない。さらに、キノンにより修飾された蛋白は 、草食動物にとって魅力または嗜好性が低く、故に食べる気を無くさせると考え られる。傷害時の植物蛋白を共有結合的に修飾するＰＰＯの能力は、これらが、 植物の病害虫抵抗性において、植物の誘導され得るプロテイナーゼインヒビター と補足的に機能する、「抗栄養的酵素」であるとの指摘を導いた。

ＰＰＯのｃＤＮＡは、植物の形質転換に使用される多くのベクター（例えば、ア グロバクテリウム・トゥメファシエンスに基づくベクター類［ネイチャー、３１ ０巻１１５頁を参照されたいコ）中にライゲーションして、ＰＰＯの過剰発現ま たはダウンレギュレーションを達成することができる。過剰発現は、カリフラワ ーモザイクウィルスの３５３プロモーターのようなプロモーターを用いてＰＰＯ ｃＤＮＡを「センス」な向きにライゲーションすることによって達成される［プ ラ゛／ト・セル、２巻７頁を参照されたいコ。これとは異なり、ＰＰＯのダウン レギュレーションは、ＰＰＯｃＤＮＡまたはこの配列の成るフラグメントを、同 様のプロモーターに、「アンチセンス」な向きにライゲーションすることによっ て得ることができる［プラント・モレキュラー・バイオロジー、１１巻３０１頁 、ジーン、７２巻４５頁ニブラント・モレキュラー・バイオロジー、１４巻４５ ７頁、セル、５５巻６７３頁：およびネイチャー、３３４巻７２４頁を参照され たいコ。ダウンレギュレーションは、共同抑制として知られる現象により、「セ ンス」組み立て物から得ることもできるかも知れない［プラント・セル、２巻２ ７９−２８９頁、プラント・セル、２巻２９１−２９９頁を参照されたい］。植 物からの組織外植体はこれらのベクターを用いて形質転換され、統合されたカセ ットの存在について選択に付され、植物に再生され［プラント・セル・リボーツ 、８巻３２５頁を参照されたい］、そしてＰＰＯ発現の変化について分析される 。

本発明のより完全な理解のために、以下の実施例を供する。これらの実施例は本 発明の広い様々な態様を説明するために供されるものであって、これらが本発明 を、本明細書に記載される特定の条件に限定することを意味するものではな（、 またそのように考えるべきでもない。

実施例１（ポリフェノールオキ／ダーゼのクローニング）抗体を用いた選択によ りＰＰＯｃＤＮＡをクローニングするために、精製されたＰＰＯからポリクロー ナル抗体を作製した。ＰＰＯの簡便な供給源は、これらの器官の主たる蛋白構成 成分（約６０％）としてＰＰＯを含有する葉の腺のトリコームを高密度に有する 、ソラヌム・ベルタウルティイ（野生馬鈴薯）またはりコペル／コン・エスキュ レントゥム（トマト）である［ジャーナル・オブ・ヘレディティー、８１巻４７ ５頁を参照されたい］。２００ｍＭのジチオトレイトールに浸した綿棒で小葉（ 約４０００枚）を拭くことにより、ソラヌム・ベルタウルティイの葉の腺のトリ コームからＰＰＯを得た。粗製トリコーム抽出物を注射筒を用いて綿棒から搾り 取り、］、　２０００　ｘ　ｇ、４℃で１０分間遠心した。上清を２％のｐＨ４ −６両性電解質で３０ｍ１容量とし、調製用等電点電気泳動セル（バイオラド・ ロートフォア）で等電点電気泳動を行なった。１）８４．５ないし６からの両分 を、１０％ポリアクリルアミドゲル上の５ＤＳ−ＰＡＧＥ１１気泳動、引続き蛋 白の位置決定のだめのクマノー染色により分析した。精製された５９ｋＤ　ＰＰ Ｏを含有する画分をプールし、１Ｍ　ＮａＣ］　２回に対して透析した（両性電 解質を除去するため）。次いでこの蛋白を８２０　２回に対して透析し、凍結乾 燥した。精製された凍結乾燥ＰＰ○（３００μｇ）を５００μｍのＨ２Ｏ中に再 構成し、同容量の完全フロインドアツユバントで乳化し、２羽のニューシーラン トホワイトウサギの背に複数回皮下注射した。その後１５日および２１日におい て不完全フロインドア／ユバシト中の１００μｇＰＰｏの注射を行なった。最後 のＰＰＯ注射の３０日後に動物を全採血し、抗血清を集めた。抗血清は一８０℃ で保存した。

抗体の特異性を、免疫ブロッティング５ＤＳ−ＰＡＧＥまたは等電点電気泳動ゲ ルにより立証した。ニトロセルロース膜にトランスブロッティングする前に、ゲ ルを、２５ｍＭ）リス、１９２ｍＭグリシン、２０％（Ｖ　／　Ｖ　）メタノー ル、ｐＨ８，３の転移緩衝液中で２０分間平衡化した。１００■、０２５Ａで１ 時間、電気的転移を達成した。常法を用いて膜への非特異結合をブロックし、膜 を洗浄した［カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（１ ９８７）、ＦＭ、アウスベル編、ジョン・ライレイ・アンド・センス、ニューヨ ーク；１０゜８．１−１０．８．６頁を参照されたい］。抗体は１：４０００の 希釈で使用し、プロットは、ヤギ抗ウサギアルカリホスファターゼコンジュゲー トおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート、３６７ｍＮニ トロブルーテトラゾリウム、０．ＬＭ　ＮａＨＣＯ２、ｐＨ９，８で発色させた ［カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（１９８７）、 Ｆ、Ｍアウスベル編、リジン・ライレイ・アンド・センス、ニューヨーク；　１ ０．８．１−１０．８．６頁を参照されたい］。馬鈴薯またはトマトのトリコー ム、葉または池の器官由来のＰＰＯを５ＤＳ−ＰＡＧＥまたは等電点電気泳動ゲ ル上で電気泳動し、ニトロセルロース上に電気ブロッティングし、これらのポリ クローナルウサギ抗ＰＰＯ抗体をもって探索する時、この抗ＰＰＯ血清はトマト および馬鈴薯のＰＰＯを等しく良好に検出した。

ｃＤＮＡ発現ライブラリーの組み立ておよびスクリーニングのためのＰＰ０ｍＲ ＮＡを取得するために、ｍＲＮＡを得、ＰＰＯをコードしていることを立証した 。ピンセントを用いてトマト（リコベルノコン・エスキュレントゥム　ＣＶ。

〜７ＦＮＴチェリー）の小葉および葉柄から４０ｇの表皮および外部組織層を剥 いだ。剥いだ組織は直ちに液体Ｎ２中で凍結した。次にＲＮＡを抽出し［アナリ ティカル・バイオケミストリー、１６２巻１５６頁を参照されたい］、オリゴｄ Ｔセルロースカラムクロマトグラフィーにより精製して［モレキュラー・クロー ニング　ア・ラボラトリ−・ハンドブック第２版（１９８９）、Ｊ　サムプルツ ク、Ｅ、Ｆフリトウツユ、Ｔ、マニアティス、コールド・スプリング・ハーバ− ・ラボラトリ−・プレス、１９７−１９８頁を参照されたい］ポリアデニル化Ｒ ＮＡ３０μｇを得た。３３５−メチオニンの存在下で、網状赤血球溶菌液インビ トロ翻訳系を用いてｍＲＮＡ５μｇをインビトロで翻訳した（製造者の指示に従 う［プロメガ・バイオロジー）。翻訳産物は、１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離 しコダックＸＡＲ−５フィルムを用いて一夜オートラジオグラフィーに付す時、 この組織のｍＲＮＡから翻訳されると予惣される５９ｋＤのＰＰＯの存在を明確 には表わさなかった。故に、翻訳産物を免疫沈降に付した。翻訳反応を９容量の １％ノニデノトＰ−４０，１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、 ０．１５ＭＮａＣ］、１％メチオニン、０．０１Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ７，２ で希釈した。

熱で死滅させた１０％スタフィロコッカス・アウレウス細胞２０μｍをこの翻訳 混合物に加え、４℃で１時間振盪した。次にこの試料を１３０００ｘｇで５分間 遠心した。次いで上清を抗ＰＰＯ抗血清１μｌと共に４℃で一夜インキユベート した。次いで熱で死滅させた１０％スタフィロコッカス・アウレウス細胞１０μ ｍを加え、間欠的に振盪しながら４℃で１時間インキュベートした。１３０００ ｘｇで５分間遠心した後、ペレットを０．５ｍｌの１％ノニデッドＰ−４０，１ ％タデオキコール酸ナトリウム、０１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ　ＮａＣ］、１％メ チオニン、０．ＯＩＭｍ酸ナトリウム、ｐＨ７，２に再懸濁し、１０％シュクロ ースの層０．５ｍ１（０，５ｍｌの１％ノニデソトＰ−４０，１％デオキシコー ル酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１％メチオニン、０ ．０１Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ７，２中）を介して１３０００ｘｇで５分間３回 遠心した。

次いでペレットをＱ、５ｍｌの１％ノニデソトＰ−４０，１％デデカノコール酸 ナトＩ功ム、領１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ　ＮａＣ＋、１％メチオニン、０．０１ Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ７，２で３回洗浄した。次にこの免疫沈澱（ペレ・ノド ）を１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、電気泳動し、−夜オートラジオグラフ イーに付した。この実験は、抗ＰＰＯによって６７ｋＤの生成物が沈澱すること を示した。腺のトリコーム中のＰＰＯのＭ、から予想されるような５９ｋＤの蛋 白の証拠はなかった。

免疫沈降した６７ｋＤ蛋白が５９ｋＤのＰＰＯの前駆体であるかどうかを決定す るために、一連のペプチドマツピング実験をＮ−クロロスクシンイミドおよび蟻 酸滴化を用いて実施した［アナリテイカル・）〈イオケミストリー、１２２巻２ ９８頁、およびアナリテイカル・バイオケミストリー、１２７巻４５３頁を参照 されたいコ。Ｎ−クロロスクシンイミドおよび蟻酸の両者を用いて、腺のトリコ ーム由来の成熟５９ｋＤ　ＰＰＯおよびインビトロ翻訳由来の３５Ｓ−標識され た免疫沈降した６７ｋＤバンドを部分消化した。消化産物を電気泳動する時、成 熟５９ｋＤ　ＰＰＯおよび６７ｋＤ翻訳産物の両者が共通のフラグメントのポリ ペプチドを持っていることが判明した。この結果は、５９ｋＤ　ＰＰＯがまず６ ７ｋＤ前駆体ポリペプチドとして翻訳され、次に蛋白分解的にその５９０００の 成熟Ｍ、への処理を受けることを強く示唆した。

次に、ｃＤＮＡライブラリーをポリアデニル化トマトＲＮＡ２μｇを用いてλＺ ＡＰ中に組み立て（製造者の指示に従う［ストラタジーン］）、常套的技術に従 いポリクローナル抗Ｓ、ベルタウルテイイＰＰＯの１　：　４０００希釈を用い てスクリーニングした［モレキュラー・クローニング・ア・ラボラトリ−・７％ ンドブ・ツク、１２．１６−１２．２０頁；メソツズ・オブ・エンザイモロジー 、１５２巻を参照されたい］。ＰＰ○抗体を有するプラーク３ｘｌＯ５をスクリ ーニングした後に、１２の候補体が４次スクリーニング後に陽性のままであった 。この候補ＣＤＮＡの制限地図作成により、１２のクローン全てが、二つの異な ったｃＤＮＡクラスのうちの一方に属することが示された。ｃＤＮＡの両方のク ラスが、トマトの葉および表皮ｍＲＮＡのノーサンプロット上の約２．Ｏｋｂノ くノドと／へイブリダイズした［モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ −・ハンドブック、７．４３−７．４５頁を参照されたい］。しかしながら、最 長のｃＤＮＡはわずか１．７ｋｂｐであって、このライブラリーの２回目のスク リーニングは、より長いクローンを生成しなかった。故に、新たなｍＲＮＡ調製 物を用いて第二のλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン）ｃＤＮＡライブラリーを組み 立てた。このライブラリーを、第一のライブラリーから得た０、７ｋｂの先端を 切ったＰＰＯｃＤＮＡを用い、常套的技術に従ってスクリーニングした［モレキ ュラー・クローニングア・ラボラトリ−・ハンドブック、２．１０８−２．１１ ７頁、および製造者の指示を＃照されたい］。４次スクリーニングの後に、大き さが共に２．０ｋｂｐに接近している二つのクラスのＰＰ０（ｐＰＰＯ−Ｔ１お よびｐＰＰｏ−Ｔ２）が残った。いずれのｃＤＮＡも、表皮または葉のｍＲＮＡ から作成されたノーサンプロット上の約２．０ｋｂ　ｍＲＮＡ成分とハイブリダ イズしたが、茎部分の組織プリント（プラント・モレキュラー・バイオロジー、 １２巻５１７−５２４頁を参照されたい）を用いて行なわれたノーザンブロソト は、ｐＰＰｏ−ＴＩはトリコームおよび表皮細胞で発現され、ｐＰＰｏ−Ｔ２は 光合成細胞で発現されることを示した。

本発明に係るトマトＰＰ○のｃＤＮＡｐＰＰｏ−ＴｌのＤＮＡ配列は以下の通り である。

に℃苦πズπゴπゴπゴに丁ＮπＭπＮコロταπコ１３９Ｔ＄　ＡＱ：　ＭＣ ＭＡ　ｎ　ＣｒＣＴＣＴ　ＴＣｒ　ＴＯ：　ｍ　ＡＣＣＡＣＣｊｆｆ：　７ＢＡ ＡＩＩ”！’ｎ　ＴＣＣＴＴＧ　Ｔ７７ｋ　’ｔｃＡ　ＡＭ　Ｃｏ：　ｒ　ＣＡ Ａ　Ｃｒｒ　Ｔ’ｌｌＣＣ”１℃　１１７（Ｘ：　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＣＧＴ　Ａ ＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧｒ　ＴＴＣＭＧ　ＧＩＴ　ＴＣＡ　ＴＧＣＡＡＣ１５６α７ ｋ　ＭＣＭＣＧｒｒ　ＩＸＭＡ　ＭＣα？ｒ　ＧＡＣσ：Ｔ　Ｇｒｌ’　Ｇ！ｋ Ｔ　島１９５αスＭＣＧ′ｒｒｃｒｒ　Ｔｌスα刀ηスα込απロＴＴ７σαπ σス　２３４ＣＣｒＭＴロＴα１σスｈス■Ｍゴαテαスαゴにスαス　２７３ ＣＣｒ　ＣＣＴ　ＧｌｔＴ　Ｃ１℃ＡＡＧ　ＴＣＴ　ＴＧｒ　ＧＧｒ　ＡＣｒ　 Ｇｌｍ　ＣＡＴ　Ｇ！７ｋ　ＡＡＡ　３１２ＧＡＡ　ＧＧｒ　ＧｒＴＧＡＴ　Ｇ １７Ｌ　ＡＴＡ　Ｔｉｃ　ＡＧｒ　ＴＧｒπＣＱ？ｒα：Ｔ印ス３５１αＩ：　 ＧＡＴ　ＣＲＧ　ＡＴＣＧｋＴ　ＡＧｒ　ＧｒＴα刀ＴｈＣ１ＴｈＣＭＧ　ＴＴ Ｃα丁　３ηＴＣｒ　ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＭＡ口℃ＣＧ：　ＡｒＣα℃α℃αｒ　 ＧＣｒ　ＣＡＴα刀４２９α℃いＴ　ＧＩＣＧＡＧχωスα刀Ｎ６）σ０端７刀 α＝゛Ｎ刀　４６日本発明に係るトマトＰＰＯｃＤＮＡ　ｐＰＰＯ−Ｔ２のＤＮ Ａ配列は以下の通りである。

へπαス訂印ス印℃π℃蔀ＴＡＩり１にπでＡＧｒ　ＮズＮπ　３９ＡＣｒ　Ａ ＣＡに刀ロ℃ＭＡＮゴαゴーτＮゴπテηスαππ℃７８ＡＣｒ　ＣＣＴ　ＭＧ α）：　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＣｒＴ　ＴＴＣＣＴｒ　ＣＡＴ　ＧＩＩＲＭＡ　ＣＧ ｒ　１１７ＭＣＭＡ　ＡＣＡ　ＴＴＣＭＡ　ＧＩＴπスＴｍＭＧω丁にに蔀ＴＮ σ　１５６ＡＡＣｃＧｒ　ＭＣＣＭ　ｃｗ　ＧＭ　ＡＣＧ　ＭＴπ：Ｔ　ＧＩＴ 　ＧＡＴαＲＡＧＧ　１９５ＡＡＴ　Ｇｒｒｅｒｒ　ｅｒｒ　ｃＧｒ’ｍ　ａＡ ＣＴ　Ｃｒｒ　’＋７４Ｔ　ＧＧｒ　ＧＴＴαコ２３４Ｎσまコにλαス賞λα ℃まＡ窃ぼＴにコαズにＴαス　２７３π℃αズσｆｆ　ＣｒＣＡＭにππαπ 島α℃Ｍ℃にスπ℃３１２ＧＡＴ　ＧＧｒ　ＣＣＡ　ＣＴＴ　ｍα：ＣＴＡＴ　 ＴＣｒ　Ｔｆｆ　ＴＧＴ　Ｃｏ：　ＣＣＴ　ＣＣｒ　３５１ＡＴＧ　ＣＣＧ　Ａ ＣＴ　ＡＡＣＴｒＴ　ＧＡＣＡＣＣＡＴｒ　ＣＣＡ　ＩＡＴ　ＴＸ：　ＭＧ　Ｔ ＴＣ３９０Ｑ？ｒ　ＴＣＩ’　ＡＴＧ　ＡＣｒ　ＡＭ　ＣＫ：απに℃α１ＴＡ ＣＣα：Ｔ　ｔＩＴ　ＣＡＴ　４２９Ｇ：Ｔ：Ｃｍ　ＧＥＴ　％　％　’ｒ　Ａ ＴＣＧＣＧ　ＭＧ　ＴｈＴ　ＡＡＴ　’１７０　ＧＯ：４６ＢにスｙπαスＡπ ｙ刀ダσロ丁χＡＡＧ　ＡＣＡ　Ｇ＋仏α方コ　５０７ＭＣｃＣｒ　Ｃｌ７１α Ｄ　ＴＴＴ　ＭＧ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＭＴ　ＡＴｈ　ＱＣＴＧＴ　５４ ６ＧＣｒ　ｒＭＴＧｒ　ＡＡＣ（ｍα？ｒ　１１７ＬＴ　ＡＴ７ｋ　ＡＴＴαπ αＣＭＡ　ＧＡＧ　５８５ηスａ通印τａ四ＭＣ窩π追ロＴ月℃−℃α刀−℃０ σ　６２４ＣＧＡ　’ｒＧＧ　’ｌ７１ｉＣＴＴＣＴＸ：　ＴＴＴ　Ｔ７ＣＧ” ＩＡ　ＡＧＡ　ＡＴＡ　ＴＴＧ　Ｇｍ　ＡＭ　６６３ａｒｃ　ＡＴＴＧＡＴ　Ｇ ＡＹαｍＡ　ＡＣＴ　ＴＴＣα？ｒ　ＴＴＡ　Ｃｎ　Ｔ７ＣＴＧＧ　Ｍｆｆ’　 ７０２ＴＧＧ　ＧＡＴ　ＯσαスＮ６ぼ℃扇απη）αテαΣにＳ１π　７４１ ＧσαπＧ端σππテＴＱ：口℃χＧσＧ込Ｎ石απＮσ　７８０ＣＡＡ　ＣＡ Ａ　ＧｒＣＣＧｒ　ＡＡＴα込Ｊ’ＣＧ　ＧｒＴ　ＴＴＧ　ＧｋＴ　ＣＴｒ　Ｇ ７　’ｌＴｈ　８１９ＴＴＴ　ＧＧＧ　Ｇｆｆ　ＡＭ　Ｇｒｒ　ＧＭ　ＡＣＡ　 ＡＣＴ　ＯＶＩ　！　ＣＡＧ　ＴｒＧ　ＭＧ　８５Ｂ上記のリーディングフレー ムに加えて、ＡＴＧ開始叶ンの直前に以下の配列を有する上流部分を伴うｃＤＮ Ａ　ｐＰＰｏ−Ｔ２が配列決定された：ＴＡＡＴＴＣＧＧＣＡ　ＣＧＡＧＡＧＣ Ａ　１８この上流部分に加えて、下流部分もまた以下のように配列決定された： このｃＤＮＡ配列は、ｐＰＰｏ−７２ペプチドに対する以下のような推定アミノ 酸配列を提供する。

次に、ｐＰＰｏ−ＴＩおよびｐＰＰｏ−Ｔ２　ｃＤＮＡをインビトロの転写およ び翻訳に付し、これらがＰＰＯをコードしているｃＤＮＡに対して予想される６ ７ｋＤポリペプチドをコードすることができるかどうかを決定した。切除された ｐブルースクリプト含有ｃＤＮＡをＸｈｏｌで線状化した後、Ｔ３ＲＮＡポリメ ラーゼを用いてＲＮＡを転写し、キャッピングした（Ｖ造者の指示に従う［スト ラタシーン］）。得られたｐＰＰｏ−ＴｌおよびｐＰＰｏ−Ｔ２　ｍＲＮＡ（０ ゜５μｇ）を、網状赤血球溶菌液インビトロ翻訳系（上記参照）を用いで５Ｓ− メチオニンの存在下にインビトロで別個に翻訳した。翻訳の生成物を１０％アク リルアミドゲル上の５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。電気泳動の後、ゲルを 乾燥し、オートラジオグラフィーのために一夜露光した。ｐＰＰｏ−７２の一次 翻訳産物は、トマトの葉の外部組織由来のｍＲＮＡの免疫沈降において見られた ５９ｋＤ成熟ＰＰＯに対する前駆体であるとして先に示された６７ｋＤポリペプ チドであった。

ｐＰＰｏ−Ｔｌ　ｃＤＮＡからのインビトロ転写／翻訳結果は、これが幾つ力１ の生成物を翻訳したため、より不明確てあった。このｃｐＮＡは、後にそのゲノ ム対応物の配列決定により、全長より僅かに短いことがわかった。先を切られた ｃＤＮＡにおける開始メチオニンコドンの不在が、恐ら（は下流Ｍｅｔコドンで の翻訳の開始を導いたものであり、これが複数のＰＰＯ生成物の原因であろう。

ポリフェノールオキシダーゼのｃＤＮＡ候補物質の同定を、これらから導かれた アミノ酸配列と種々の供給源からのＰＰＯ蛋白の配列決定から得られたアミノ酸 配列とを比較することにより、さらに確認した。リコペルシコン・エスキュレン トゥム　ｃｖ、ｓ　ＶＦＮＴ、フリーダム、リコベルノコン・チースマニイ、Ｌ 、クミエレフスキイ、およびソラヌム・ベルタウルテイイの葉から、２００ｍＭ ノチオトレイトールに浸した綿棒で葉を拭くことにより、腺のトリコームを収穫 した（上記参照）。このトリコーム抽出物を注射筒を用いて綿棒から搾り取り、 １／１０容量の水冷トリクロロ酢酸を加えて蛋白を沈澱させた。沈澱物を２５ｍ Ｍトリス、ｐＨ７，５に入れた０、５％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、１．２５％β−メル カプトエタノール２００μｍに懸濁し、１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル系で電気泳 動した。電気泳動の後、ゲルを１０ｍＭＣＡＰＳ、ｐＨ１１，１０％ＭｅＯＨ中 でＰＶＤＦ膜（イモピロン−Ｐ）上にトランスプロットした。転移の後、膜をク マンーブルーＲ−２５０で染色し、脱染した。分子量により位置を確認したＰＰ Ｏ含有バンドを切り取り、微量配列決定（ガイド・トウー・プロティン・ピュア リフイケー／ジン、Ｍ、Ｐ、トイチャー編、アカデミツク・プレス、サンディエ ゴ：６０２−６１３頁を参照されたい）によりＮ末端アミノ酸配夕１［を得た。

Ｎ末女高配Ｔｌ１ｌ　ｌま以下の通りである り、ニス＊ユレントウム　ｃｖ、ＶＦＮＴ：Ａ１ａＰｒｏｌｌｅＰｒｏＰｒｏＰ ｒｏＡｓｐＬｅｕＬｙｓＳｅｒＧ１ｙＧ１ｙＴｈｒ＾１ａＬ、ニスキュレントウ ム　ＣＶ、フリーダム。

Ａ１ａＰｒｏ１１ｅＰｒｏＰｒｏＰｒｏ＾５ｐＬｅｕＬｙｓＳｅｒＡｓｐＸａａ ＴｈｒＡ１ａ（Ｘａａ＝指定できなかった残基） Ｌチースマニイ へ１ａＰｒｏ１１ｅＰｒｏＰｒｏＰｒｏＡｓｐＬｅｕＬｙｓＳｅｒＧ１ｎＧ１ｙ Ｔｈｒ＾１ａＨｉｓＡ１ａＰｒｏＩ　１ｅＰｒｏＰ　ｒｏＰｒｏＡｓｐＬｅｕＬ ｙｓＳｅｒＧｌｎＧｌｙＴｈｒＡ　１ａＨｉ　ｓＳベルタウルテイイ： ５ｅｒＰｒｏ１１ｅＰｒｏＰｒｏＰｒｏ＾５ｐＬｅｕＬｙｓＳｅｒＸａａＧ１ｙ Ｖａｌ＾１ａＨｉｓＴｙｒＬｙｓＧ１ｕＰｒ。

（Ｘａａ＝指定できなかった残基） 腺のトリコーム由来の成熟トマト（Ｌ、エスキュレントウム　Ｃｖ、ＶＦＮＴ） ５９ｋＤ　ＰＰＯのＮ末端アミノ酸配列もまた、ｐＰＰｏ−Ｔｌ　ｃＤＮＡから 導き出されたアミノ酸配列内に存在している。類似の推定アミノ酸配Ｊｌｌｉ、 トマトｃＤＮＡ　ｐＰＰｏ−Ｔ２ならびに馬鈴薯ｃＤＮＡ　ｐＰＰｏ−ＰＩおよ びｐｐＰＯ−Ｐ２１：存在する（下記参照）。クローンの中のこの配夕１１の位 置１ま、前駆体蛋白および成熟ＰＰ○ポリペプチドについてそれぞれ約６７およ び５９ｋＤとし）う推定質屋を導き出す。ｐＰＰｏ−ＴＩおよびｐＰＰｏ−Ｔ２ １ま７８％の核酸配夕１ｊの一致を示し、６７ｋＤ前駆体ポリペプチドの全長１ ：わすこり比較する時、８４％の予想アミノ酸類似性および７６％の予想アミノ 酸一致を有する。これらのｃＤＮＡを表わすゲノムクローンをトマト（リコペル シコン・エスキュレントゥムｃｖ、ＶＦＮＴチェリー）から組み立てたλＣｈ３ ５ライブラリーから回収し、常法を用いてトマトＰＰＯｃＤＮＡによりスクリー ニングした（モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・ハンドブック、 ２．１０８−２．１１３頁を参照されたい）。

さらに、０．７ｋｂ先端切除トマトＰＰＯｃＤＮＡを用いて、やはりλＺＡＰＴ Ｉにおいて組み立てられた馬鈴薯の葉ｃＤＮＡライブラリーをブロービングした ｅ　２ｘ　１０’のプラークをスクリーニングして三つのＰＰＯｃＤＮＡ候補物 質の精製に至り、うち二つは約２．０Ｋｂｐの長さであり、三つ目は約１．２Ｋ ｂｐて先端切除されていた。葉、根、花、塊茎および葉柄を含む幾つかの馬鈴薯 組織外植体のノーザン分析は、２．Ｏｋｂの単−ＰＰＯクラスの存在を示した。

二つの最長馬鈴薯ＰＰＯｃＤＮＡ（ｐＰＰｏ−ＰＬおよびｐＰＰｏ−Ｐ２）のＤ ＮＡ配列決定および比較は、９６％の核酸および推定アミノ酸の一致、ならびに 核酸および推定アミノ酸レベルの両者においてトマトＰＰＯＣＤ？’ｌ！Ａとの 高度の配列類似性を示した。

本発明に係る馬鈴薯ＰＰＯｃＤＮＡ　ｐＰＰｏ−ＰＩのＤＮＡ配列は以下の通り である ＴＣｒ　ｉ、ｉ’　”ＫＣｒ　ＡＧｒ　ＸＩＴ　ＡＣｒ　ＡＣｒ　ＡＴＴ　ＣＣ Ａ　ＴＴＡ　ＴＧ：　ＡＱ：　ＡＡＣ３９ＭＡ　ＴＣＣＣＴＣＴＣｒ　ＴＣｒ　 Ｔｏ：　Ｔ１℃ＡＯ：ＡＣＣＭＣＡＡＣＴＣＡＴＣｒ　７８ＴＴＣＴＴＡ　’ｆ ｌ　ＡＡＡ　ＣＣＣＴＣＴ　（Ｍ　ＣＩＴ　Ｔｉ℃Ｃ”ＩｕσＣ（ｎ　ＡＧＩ； 　１１７ＣＧｒ　ＭＴ　ＯＶＡ　ＡＧｒ　’Ｉｎ：　ＭＧ　Ｇｒｒ　ＴＣＡ　Ｔ ＧＩ：　ＭＣＧＣＣＭＣＡＡＴ　１５６ＭＴＧＩＴα℃ＧＡＧσσχＭＡＭＣロ 了σＣＸズｑ丁０σ　１９５Ｎ刀αがＡＡＴ　Ｇｒｒ　ｅｒｒ−スα運コα過α π０ズフσαπ　２３４αコＧＣｒ　ＡＡＴ　Ｃ］丁αスαスηスα℃πゴαズ 式ズσゴにス　２７３αスαズαズＧＡＴＣＩλＮ唐ππππαπ印Ｔσ℃σσ −３１２ＭスＣ占απＧＩＴ　ＧｋＴ印ＤＸスフσにππππ℃σスαズ　３５ １印スα℃ａ四ズＮ℃０σＡＧＣＧＩ丁α℃フＣχＮ６η℃　」つαズαπにｌ にズＡＡＡ　Ｑ’Ｃｃｃ；ｃ　ＡＴＣＣＧＣｃｏ：　ｃｃズαゴ０σ　４２９α ℃ぽ刀θＴυ６０惑ｂσａスαＩ：　ＡＡＧ　Ｔ７１Ｔ　Ｃ）込η℃俣ゴ　４θ Ｎ刀Ｎπα込ＡＴＧに刀り店ａτりσＭＡ　ＧＡＣＫゴＴＴＴＧＡＣ５０７ｃａ ｒ　ｅｒｒ　ａｘ；　ｍ　ＭＡ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ｃａｒ　ＡＡＴ　Ａ［Ｔ　ｏ ｓ　ｗαテ　５４６ＴＡＴＴＣＴＭＣＧＧｒ　ＣＯ’ｍ　ＡＡＡ　＝　Ｇ１１ｉ Ｔ　Ｇ１７　ＭＡ　％　Ｔｉ　５８５ＣＭ　ＧｒＴ　Ｏ！ＬＴ　Ｔｒｃ’ＩＣＧ 　ＴＧＩＩ；　ａτＴＴＣＴＴｒ　ＣＣＧ　ＴＴＴ　ＣＡＴ　ＡＧｌｌｔ　６２ ４面χη℃フσ−℃フσ０端ＮスＡス−℃αスコＣＴＴ　６６３ＡｒｒＭＴ　Ｇ ＥＴ　ＣＤ＋　ＡＣＴ　下ＣＣｒ　ＴＴＡ　ＣＣＡ　ＴｋＴ　ＴＣＧ　ＡＡＴ　 ＴＣＸ３７０２ＧＡＴ　ＣＡＴ　ＣＣＡ　ＡＡＡ　ＣＧｒＡＴＧαＴＡＴ７Ｌα テα℃に℃−丁ＧＡＴ　’７４１ＣＧｒ　ＧＡＧ　ＧＧＧ’ｎ　ＴＣｒ　Ｃｒｒ 　？７１０　ＧＡＴ　（ＡＴ　ＡＡＣ；Ｔ　ＭＣＣＡＡ　７８０ＭＣＣＡＴ　Ｃ ＧＣＡＡＴ　ｔＴｈ　ＡＣｒ　ＡＴｒ　ＡＴｒ　ＧＡＴ　ＣＩＴα：Ｔ　ＣＡＴ 　ＴＴＴ　８１９ＧＧｒ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＧＩＴ　ＧＡＣＡＣＡ　ＧＴｒ　Ｃ ＡＧ　ＣＩＴ　ＣＡＧ　ＡＴＡ　ＡＴＧ　ＡＣｒ　８５８ＡＡＴ　ＭＴ　ＴＩＩ Ａ　ＡＣ７ｋ　Ｃｒ７にに［Ｇ　ＴｈＣα７　ＣＡＡ　ＡＴＧ　ＧＩＩＩＣＡＣ Ｔ　ＡＡＴ　８９’７ＧＣｒ　ＣＣＴ　Ｔｌ　ＣＣＧ　ＴＯ：ＣＡＡ　ＴＴＣＴ ＴＣＧＧｒ　ｒ　ＧＣｒ　ＴＸ：　Ｃ１℃　９３６πおα込ｃ’ｉｓ、ｔ＞店ω ℃ＣＸ；Ｇ晩π刀印Ｌ０１７毛崩　９７５ＡＣＡ　ＴＣＣＣｍ：　ＡＴＡ　Ｑ） ：　ＣＧｒ　ＧＭ　ＡＴｈ　ＴＣＴ　（Ｔｈ　ＣＩＧ　ＧＫ；　Ａ’［７４１０ １４Ｇ１’ＣＣＩＡ　Ｇ１℃ＡＭＡＭＡＣＧ　ＧｒＧＡＭ　ＡＣＡπＤＧＩスＡ ＴｒＫ丁１０５３ＡＴｒ　ＣＡＧ　ＣＸ：　ＧＧｒ　’］Ｔｈ　ＧＡＣα刀ＡＴ ｒ　ＴＩＴ　ＴＡＣＴＧｒ　ＣＡＣＣＡＣ１０１０９２ＧＣＡ印℃ＯＣσ石Ａ冗 π刀ＧＡＴυ端π刀黒−スＡπ１１３１ＧＧＣＧＧＧ　ＭＡ　ＡＧＡ　ＡＧＧ　 ＧＡＴ　ＣＴｈ　ＴＣＡ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＴＧＧ　ＴＴＧ　１１’７ ０ＭＣＴＣＡ　ＧＡＡ　ＴＩ’ＣＴＴＴ　Ｔａ℃Ｔ７’Ｃ：　ＧＡＴ　ＧＡＡ　 ＭＴ　ＣＣＣＡＡＣα７１２０９ＴＸ：　ＣＧｒ　ＧＴ′ＧＭＡ　部ＣＧｒ　Ｇ ”Ｉｃ　ＴＧｒ　ＴｒＧ　ＧＡＣＡＧｒ　ＭＡ　ＭＡ　１２４８に田α込−：Ｃ ＡＧｒ　′ＩＸ：αゴαスＡ冗αスＮズαスπ追απ１２８７ＡＡＴ　ｒｒｒ　 ＡＡＣｍＡ　ｇ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＡＣｒ　ＡＣＡ　ＧｕαＲＭＡ　ＧＴＧ　１ ３２６ＭＴＡＣＡα刀πスにＴσλαスωｒＡ工ＭＧ口℃−℃αス１３６５０ス ま：Ｇ　ＡＪＩＩＧ　Ｃ］あσＣαπαスＡ貰π刀ｎ℃ππに℃ＡＣＣ１４０４ ＡＧＡ　ＣＣＡ　Ｇ：、Ｔ　ＴＯｌｌ；πｍＡ　ＡＧＥ　ＡＣＴ　ＡＣＡ　ＣＡ Ｇ　Ｇ’、Ｇ　ＡＭ　ＭＴ　ＧＡＧ　１４４３ＣＡＡ　ＧＡＧ　ＣＮ３に訊ＣＫ ；　ＡＣＡ　ｒｒｃ　ＡＡＣＭＡ　ａｒｙ＋　ｃａ：　ｗ　ＧＡＴ　１４Ｂ２Ｇ ＡＴ　ＡＣｒ　ＡＡＧ　Ｍ　ＣＴＡ　ＡＧＥ　Ｔ１’ＣＧＡＴ　ＧＩ’Ｇ　ＴＴ ＣＣ１℃ＡＡＣＧｒｒ　１５２１ＧＡＣｊＶ惑にコωｌＮロα石ａ四り惑ＣｒＩ ’Ｇｌ■づＭＧま：Ｇ　ＧＩ’ｉＧ　１５印ＴＴｒＧＣＧαＥＡＧｒスＴＡＣｒ ＡＧＣＴＴＧα刀ＣＡＴ　Ｇ１丁Ｃ７ＬＴαＰ　１５９９ＭＴＭＴＸゴＮσいＴ ωＴ活Ａα工にコ月℃Ｎ惑ロ石〕６３８ＧＣＧ　ＡＴＡ　ＡＣＡ　ＧＭ　ＣＩＩ ＩＧ　酊ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＭＴ　ＧＥＡ　Ｔ１℃Ｇｌ’Ｑ　（ＡＴ　１６７’７ ＧＡＡＧＡＴてにＴ讃ωスて７コＧＩＴσスＭＡωＴ苅１７１６απ０錆απω １πＤＡ貫Ｇ込Ｎπａ℃弘ＧＡτＭＧロ丁１７５５Ｇ６Ｇ四π汀１７６４ これに加えて、下流部分もまた以下のように配列決定された。

ｍすＶＷＸ詰斌軌Ｍ２２２ このｃＤＮＡ配列は、ｐＰＰｏ−ＰＩペプチドに対して以下のような推定アミノ 酸配列を提供する 本発明に係る馬鈴薯ＰＰＯｃＤＮＡ　ｐＰＰｏ−Ｐ２のＤＮＡ配列は以下の通り である。

ＡＣＩ’　ＡＣｒ　ＣｒＴα７１ＴＴＡπｒ　ＭＣＡＡＣＭＡπＩＩ’　ＣｒＣ ｒπｒ　３９ＴＯ：　ＴＴＣｐｃｃ　ＡＯ：　ＭＣｐｊｃ　ＴＣＡ　ｍ　ｒｒｃ 　ＴＴＡ　ｍ　ＭＡ　Ｃｏ：　７ＢＴＣｒ　ＣＡＡ　ｅｒｒ　ｒｒｃ　Ｃｒｃ　 ｃへｃｃｒ；ｇへＧＧＣＧｒ　ＭＴ　ＣＡＡ　ＡＧｒ　ＴＩ’Ｃ１１７ＡＡＧ　 ＧＩＴ　ＴＣＡ　ＴＧｃＡＡＣαＤ　ＭＣＭＴ　ＭＴ　ＧｒＴαＣＧＡＧ　ＣＡ Ｔ　１５６ＧＡＣＡＡＡ　ＭＣＣＴｒ　Ｇ１ＩＣαｒ　ＧＩＴ　ＧＡＴ　ＡＧＧ αａ　ＡＡＴ　Ｇ１τａＴ１９５コλα刀ＴＴＡσλαπロズスＴαπαテαゴ ＭＴＣＩＴαス　２３４α２　ＴＴＡ　ＣｃｃＴＣｒαππＴαコＡスαスαテ α：Ｔ　ＧｋＴ　ＣＴＡ　２７３ＭＡ　ＴＯ”　ＴＧＴαｉｍα）：：　ＣＡＴ 　ＧＩｌｉｌｌ　ＡＡＡ　ＧＡＡαＴｒ　ＧｒＴ　ＧＡＴ　３１２ＧＴＧ　ＴＣ Ａ　Ｔ７ＬＣＡＧｒ　ＴＧｒ　’ＩＩＺα？ｒ　ＣＣｒ　ＧｒＡ　工ＣＧＡＴ　 ＧＡＴ　ＡＴＣ３５１ＧＡＴ　ＡＧＣＧＩＴα）ＩＥ　’ＩＩＸ：　ＴＸＩ：　 ＭＧ　ＴＴＣαテπ？ｒ　ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＡＡＡ　３９０（ＴＣＣＧ：　ＡＴ ＣＣＧ：：　Ｏ）ＣＣＣｒ　Ｇｒ　ＣＡＴ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＡＴ　（Ｘ；　 ＧＡＧ　４２９ｗ　＝　ＧＣＣＡＡＧ　ｍｒ　ＣＡＡ　ｒｒａ　ｃｃｒ　ＡＣＧ 　ｍ　ＣＧＡ　ＡＴＧ　ｈｔ：ｘ；　４６ＢＧＭ　ＣＩＴ　Ｇ”ｆｆ　ＭＡ　Ｇ ＡＣＴＣｒ　ＴＩＴ　ＧＡＣＣＣｒ　ＣＩＴ　ＧＧＩＩ；　ＴＩＴ　ＡＭ　５０ ７０’ｌＡ　ＣＡＡ　ＧＣｒ　ＭＴに：Ｔ　ＣＡＴ　’ｒ　Ｇ（ゴＩＡＴ　ＴＧ Ｔ　ＭＣαπαス５４６ＴＭ　ＭＡ　ＧＴＴＧＧｒ　（Ｅｒ　ＡＡＡ　％　ＴＴ Ｇ　ＣＭ　ＧｒＴ　ＣＡＴ　ＴＴＣＴＯＩ；　５８５ｗ　ｃｒｒ　ＴｒｃＴＴＴ 　ＣＣＧ　ＴＴ　ＣＡＴ　ｙ　ＴＧＧ　ｎｃ　ＴＴＧ　ｐｃ　ＴＴＣ６２４］ｃ 　ＧＡＡ　Ａ［ス屓ＴＩ’Ｇ　Ｇ（スπス０ズＡ貫す’ＡＴＧ＋びαスＮπ　６ ６３ＴＴＴ　ＧＣｒ　ＴＩＡα２　’１７１ｔＴ　ＴＧＩＩ；　ＭＴπＤ　ＧＡ Ｔ　Ｃ７ｋＴα）島απ７０２ＡＴＧαπに１αテα：ｔ　ＡＴＧ　Ｔ１ズσσ απａ６σ刀πスπゴ　７４１Ｃｒｒ　’＆　ＣＭＧＡＴ　ＭＡ　ＣＧｒ　ＭＣ ＣＭ　ＭＣＣＡＴ　ＣＧ：　ＡＡＴαス　７叩ＡＣｒ　ＡＴｒ　ＡＴｒ　ＣＡｒ 口Ｔ　ＧＧｒ　ＣＡＴ　ＴｒＴ　ＧＧｒ　ＭＧ　ＧＡＡ　ＧＴｒ　（Ｍ　８１９ Ｎスαズ０ＩＩＧ　ｃ’ｒｃ　ａｘに鴎に℃χπ蔀Ｔ詰Ｔ７１ＮスＣ１７ｋ　８ ５Ｂに石）にα７０店に℃工にＮＣまテαπ■πα石π℃８９７σ込７℃−℃α παπαテχ０℃π運αスｃ’１ＭＣａ店　９３６ＧｒＣＣＧＧ　ＣＮ−Ｎ刀印 １０λ月ＤＮスＮスπ℃０℃に１口℃　９７５α℃月℃７１ＣＡＴＣｒαａ　ｃ ｗ　ＧｒＧＡＣＡ　ＡＡＣＣ］℃ＧＡＣＭＡ　ＭＡ　１０１４ＡＣＧω石ＭＡＸ スπ刀凧にテππにＴユＧＣＡＣαπ封λ１０５３ＧＡＣＣＣＧ　ＣｒＴ　Ｔｒ Ｔ　ＴＸ：　ＴＧｒ　ＣＸ：　ＣＡＴ　ＧＣＡ　ＡＡＴ　ＧｒＧ　ＧＩＣαＤ　 １０９２扇π℃弘Ｔ・り込πＤＭＡｍＡ貰σ汀α追ＭＡ　ＡＧＡ　Ａ田１１３１ ＧＡＴ　ｎ　ＴＣＡ　ＡＡＴ　ＡＡＡ　（ＡＴ　ＴＧＧ　ＴＴＧ　ＭＣＴＣＡ　 ＧＡＡ　ＴＴＣＴＩＴ　１１７０ＴｒＣ’ＩＩＸ：　Ｇ１ｆｆ　ＧＭ　ＭＴαＥ 　ＭＣＧＴｒ　ＩＡＣα７　ＧＴＧ　ＭＡ　ＧＩ’Ｃ１２０９απＧＡＣにπη 石スＣＡ（πＮ店ＭＡＡπα込７℃Ｎπ〕Ｃ１２４Ｂ（０αスに石αスＡＣＴα ２ＴＧＧαＴ　ＭＴ　ＴＴＴ　ＭＡ　ＣＣＡ　ＡＴＣ１２８７ＮスＮ端ＮπＮス グスαスにスσ市ＭＴ　ＡＣＡ　讃ＴＣＡ　ＡＴＴ　１３２６（ｎα：Ａ　ｃ’ ｒｃ　Ａａ：　ＭＧ　ｃ’′ｒＧＴＴＣαスロ刀α℃ＮＣ口ｕ　ＧＡＣ１３６５ ＣＧｒ　ＧＣＧ　ＡＴＴ　ＴＣＡ　ＴＴＣＴｃｒＡ１’Ｃ八Ｏ：　Ａ（Ａ　ＣＣ Ａ　ＧＣｒ　ＴｃＧＴｃ八　１４０４ＡＧＧＡＣｒ　ＡＣＧ　Ｏ’ｌＧ　％　ｊ Ｖ！ｔＡ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＣＭ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　Ａ？７ｋ　ＣｒＧ　１４４ ３Ｎス冗島Ｎ６にスα℃スＴ蒲ＧＡＴ心（支）籍Ｔ彌１４８２ＡＩＩｎ　’Ｉｍ ：　Ｇ’ｌＴ　ＧＴＧ　Ｔｒｉ：　ＣＩＧ　ＭＣＧｒｒ　ＧＡＣＭＧにｒ　ＧＩ Ｇ　ＡＡＴ　１５２１ＧＣＧ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＣｍτＧｋＴ　ＪＶＩＧ　Ｇｕ 　Ｇ１１ｉＧ　ＴＴＴ　（ＤＧ　ＧＧＳ　ＡＧｒ　’ＥＡＴ　１５６０ＡＣｒ　 ＡＧＣＴＴＧα刀ＣＡＴ　Ｇｒｒ　ＣＡＴ　ＧＧｉ　ＭＴ　ＭＴ　ＡＣｒ　ＭＴ σｆｆ　１５９９ＧＣｒ　ＡＣＧ　ＡＧｒ　ＧｌτＡＣｒ　ＴＴＣＡＣＡαπα ＣＡＴｈ　ＡＣ７ｋ　ＧＩＡ　ＣＴＧ　１６３ＢＴＴＧ　ＧＡＧ　（ＡＴ　ＡＩ Ｔ　ＧＩＡ　ＴＩＧ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＧＭ　（ＡＴ　ＡＣｒ　ＡＴｒ　讃１６ Ｖ７ωλΔ口頂工工Ａ　ＭＡ　Ｇひαπαπ囁απ范π：Ｃ１７１６ＡＴｒＧＭ にπ印ぢり６ＡτＮ６０Ｔ弘ＧＧσππ１７４９これに加えて、下流部分もまた 以下のように配列決定された。

このｃＤＮＡ配列は、ｐＰＰｏ−Ｐ２ペプチドに対して以下のような推定アミノ 酸配列を提供する。

Ｌｅｕ　Ａｓｐ　ＬｙＳ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ｔｙｒ　’Ｉｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　）ｈｓＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　 Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　 Ｃｙｓ上に示されたｐｐｐｏ−”ｒｌについての配列は、そのゲノムクローンの 配列決定から決定された幾つかのｂｐを含んでいる。トマトおよび馬鈴薯の両者 において全てのＰＰＯｃＤＮＡは染色体８にマツピングされる。ＰＰＯはＭ、約 ６７０００の前駆体蛋白の合成を典型的に特定する一群の遺伝子によりコードさ れており、この蛋白は次いて約５９０００の成熟Ｍ、へと処理される。キノンを 介する架橋、グリコリル化、および蛋白分解のような幾つかの翻訳後修飾現象（ フィトケミストリー、１８巻１９３−２１５頁、およびフィトケミストリー、２ ６巻１１−２０頁を参照されたい）により、成熟ＰＰＯに対して観察される複数 のＭ。

およびｐ＋成分が生ずる。

実施例Ｉ＋（変更されたＰＰＯの発現を達成するための馬鈴薯の形質転換）馬鈴 薯ＰＰＯｃＤＮＡ（１）ＰＰＯ−ＰＩ）をＳｍａ　ＩおよびＸｈｏｌを用いてｐ ブルースクリプトから切り取った。Ｘｈｏｌ制限消化から得られた５゛突出をＤ ＮＡ　Ｐｏ１ｌのフレノウフラグメントを用いて埋めた。形質転換組み立て物ｐ Ｂ１１２１をＳｍａＩおよび５ｓｔｌで制限消化しこ。得られた３′突出部をＴ ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作成しこ。この操作は内因性ＧＵＳ 遺伝子を除去し、ｐＰＰｏ−Ｐ１統合のためのベクターを調製した。上記のよう に調製されたｐＢ１１２１およびＰＰＯ挿入物を、ベクターに対する挿入物の比 が２１の反応で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用して一夜うイゲーリジンした。

得られた組み替えｐＢｌ　１２１／ＰＰＯプラスミドを大腸菌株ＤＨδα中に電 気穿孔で導入した。プラスミドをｋａｎ’コロニーから分離し、ＢａｍＨＩ／Ｋ ｐｎｌおよびＢａｍＨ１ｚ’Ｐｓｔｌで制限重化し、それぞれセンスおよびアン チセンス組み立て物の正の同定をした。両方の組み立て物に対し、Ｈｉｎｄｌｌ ｌ／Ｘｂａｌ制限消化を実施して、ベクターのＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターの 完全性を確認した。

センスおよびアンチセンスＰＰＯ含有プラスミドをアグロバクテリウム・トウメ ファ／エンス（Ｐ　Ｃ２７６０）中に電気穿孔で導入した（ヌクレイツク・アン ズ・リサーチ、１６巻６１２７−６１４５頁：モレキュラー・アンド・ジェネラ ル・ノエ不ティクス、２１６巻１７５−１７７頁；ヌクレイツク・アシズ・リサ ーチ、１７巻６７４７頁）。馬鈴薯（ソラヌム・トゥベロスム　Ｌ、ｃｖ、アト ランティック）の微細塊茎の円板を１５分間接種し、次いでｐＰＰｏ−ＰＬセン スまたはアンチセンス組み立て物のいずれかが組み入れられたアグロバクテリウ ム培養と２日間共培養し、次にカナマイシンを含有する培地に移した。塊茎の円 板から再生しつつある小植物を取り、より大きな容器に移して生育させた（プラ ント・セル・リホーツ、８巻３２・５−３２８頁を参照されたい）。

内因性ＰＰ○レベルを決定するため、非形質転換馬鈴薯植物の葉の試料を１゜２ ５％β−メルカプトエタノールおよび０．５％ＳＤＳを含有する緩衝液中でホモ ジナイズし、５分間煮沸し、そして１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥにロードした。電気 泳動の後、ゲルをニトロセルロース上に電気ブロッティングし、ポリクローナル ウサギ抗ＰＰ○抗体をもって探索しく上記参照）、次いでヤギ抗つサギアルカリ ホスファターゼ−ノンュゲートで発色させた。センスおよびアンチセンスＰＰ０ 組み立て物で形質転換させた再生植物から同様の葉の抽出物を作成した。非形質 転換植物、ＰＰＯ形質転換植物および対照植物（ｐＢｌ１２１のみで形質転換） 由来の蛋白の等量を１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルの各ウェルにロードした。電気 的転移およびポリクローナルウサギ抗ＰＰＯ抗体による上記のような免疫プロッ ティングの後、センスまたはアンチセンスいずれの向きにＰＰＯを含む組み立て 物により形質転換された植物も、非形質転換植物またはｐＢ＋１２１ベクター単 独で形質転換された対照と比べて成る範囲の変更されたＰＰＯの発現を有してい るという結果が示された。形質転換された植物中に存在するこの発現範囲は、数 倍の過剰発現から殆ど検出できないレベルのＰＰＯまでであった。

本発明に係るトマトおよび馬鈴薯のＰＰ０ｃＤＮＡのクローニングは、ＰＰＯに 関してかつて最も解決し難かった問題を研究する特異な機会を提供する。本発明 の結果、ＰＰＯを過剰および過小発更する形質転換植物を使用することにより、 ＰＰＯの機能および発現に取り組むことが今や可能である。変更されたＰＰ○発 現を行なう形質転換植物は、食用植物の収穫後生理学上のＰＰＯの経済的影響力 を変えるために使用することができ、同様に、作物の病害虫耐性を増すためのＰ ＰＯ活用のための努力において重要である。

商業的に重要な植物においでＰＰ○レベルを変える能力は、植物の病害虫耐性の 増加および収穫量に及ぼすＰＰＯの不都合な効果の低減の両者に用途を有するに 相違ない。即ち、作物の葉（またはその他の非食用部分）のＰＰＯレベルを増大 させると、病害虫の耐性が増すに違いない。このような試みは、作物の保護のた めの一般的方法としての用途を有するかも知れない。別法として、様々な植物器 官におけるＰＰＯ発現の選択的ダウン１／ギユレーンヨンは、一連のＰＰＯの触 媒する褐色化更象の経済的影響力を減じ、これらの物を保存しそして／または加 工するための抗酸化添加物に対する必要性を排除または低下させ得るであろう。

本明細書中に記載されるアミノ酸および核酸配列に対する配列表は以下の通りで ある 配列表 （１）一般的情報 （ｉ）出願人　ジョン・Ｃステファンス（１１、発明の名称　ポリフェノールオ キシダーゼ（ｉｉｉ）配列の数・１９ （２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　１７６１塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数　一本鎮 （Ｄ）トポコノ−。直鎖状 （Ｊｌ）分子の型　ｃＤＮＡ （λ］）配列の記載　配列番号１・ ＡＴＧ　Ｔｌｌ　ＴＣＴＴＣＴｒ　ＴＣＴ　ＡＴＴ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　 ＣＴｒ　ＣＣＴ　Ｔ］７１　３９Ｔｆｆ　ＡＣＣＭＣ７ＡＭπ℃ロ℃πテＴＣ］ ”ＴＣＣＴｒＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣ’７８ＭＣＴＣＡ　ＴＯ：ＴＴＧ　ＴＴＡ　 ＴＣＡ　ＡＡＡ　Ｃｏ：　ｒ　Ｃ７Ｖ　ＣＩＴ　ｆｆ　Ｃ１℃　１１７ＣＡＣα 込に石α７　ＭＴ　ＣＭ　７１ｆｆ　ＴＴＣＡＡＧ　ＧＩＴ　ＴＣＡπＣＭＣ１ ５６Ｇ＞、ＡＡＣＭＣ工ＧＬＣＡＡＡ　ＡＡＣＣＣｒ　ＧＡＣｒ　工ＧＩｔＴ　 ＡＧＩｌｔ　１９５Ｇ込ＭＣ印ｒｃｒｒ−スα石コα込απロ丁フ四〇刀′αス 　２３４αコＡＡＴ　ＣＩＴゲスαスコα刀Ａ口αＴま込α丁にスαス　２７３ ＣＣｒ　ＣＣＴ　Ｇ！ｋＴ　ＣｒＣＡＡＧ　ｒ　ＴＧＴα７　ＡＣＴ　ＧＩＩ： 　ＣＡＴ　ＧｒＡ　７１ＡＡ　３１２ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＧＩＴ　ＧＡＴ　Ｇｌ八 へへＡ　ＴへＣＡＧ丁ＴＧｒ　ＴＧＣＣＣｒ　ＣＯ”　ＧＩＩＡ　３５１ＣＣＣ ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＡＴＣＣＡＴ　ＡＧｒ　ＧＩＴα）ｌ；　Ｔ７４ＣＴＡＣＭＧ 　ＴｒＣαズ　３ηＴＣｒＡＴＧ　ＡＣＴ　ＭＡ　Ｃ１℃α：ｔ　ＡＴＣＣＧ： 　ＣＣＣＣＣＴα：Ｔ　ＣＡＴ　ＧＯＥ　４２９α刀ＧＡＴ　ＧＡＧυ６χ印Ａ ま：ＣＭＧ　ＴＡＴ　Ｃ）偽封店αＴＡ印　４６８ＡＧｒ　ＣＧＡ　ＡＴＧ　Ａ ＧＩＩ；　ＣＭロアｒ　ＧＡＴ　ＡＭ　ＧＡＣαｒ　７弘ｃαＴ５０７ＣＩＴ　 ＧＧＣＴＴＴ　ＡＭ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ｒ　ＡＡＴ八ＴへＣ八ＴへＧ丁Ｇ？ｒＷ 　５４６Ｔｇ：　ＭＣＣ７ＧＣ’ｒ　ＴｈＣＡＡＡ　ＧＴＴ　（Ｉ　ＧＧｒ　Ｍ Ａ　ＧＡＡ　ｍ　ＣＭ　５Ｅ１５ＧＩＴ　ＣＡＴ　ＴＴＣＴＣＧπ４　ＣＩＴ　 Ｔ１’ＣＴｒＣｃｃｃ　釘τＣＡＴ　ＡＧＡ　ＴＧＧ　６２４ＴｉＩＣｍ　’Ｉ Ｘ：　ＴＴｒ　ＴＡＣＧＡＡ　ＡＧＡ　ＡＴｒ　ＴｒＧ　ＣＴｈ　Ｔｎ　（？ｒ Ｔ　ＡＴｒ　６６３ＡＡＴ　ＧＡＴα）Ｎテ奮０コ゛コαゴスＣπるＮσ■刀α σ　１０２ＣＡＴ　ＣＣＡ　ＡＭ　ＧＧ：に℃α汀にスαゴ鄭ＣＡｆｆＧ奮賭Ｔ απ　７４１ＧＡＧ　ＧＧＡ　ＴＣＡ　ＴＣｒロアｒ　ＴＸ：　ＣＡＴ　ＧＡＧ 　ＭＡα７ＭＣＣＭＭＴ　７８０ａσαＣＭＴαスにＴＡ訂にτ０σ口了απａ ＣηＴαπ　８１９ＭＧＧＭ印ＴχにスαＴＧＧロスひＧにスＡπＮテＮυ゛８ ５８ＭＴ月スＮ℃ロス烏フＣαπσ端Ａπ印７ｒＮテＡＡＴα丁８９７αコ″ｒ ＧｃσコπＥ　店’ｎｃ　’ｎｃ　Ｇ（汀αコゝまＴ）ＣσＴ口℃　９３６ＧＧ ｒ　ｒ　Ｇｌ晩αスにπα刀σπＣＡＧαπにゴＡＴｒ　Ｇ端ＡＩ’Ｃ９７５Ａ ＴＣＣＣｒαＴ訂α刀印ＴユＣに℃π℃℃苅０℃Ｎψ、１０１４αコαπσｌ＋ Ａ　ＭＡ　ＡＡＣＧＧｒ　ＣＭ　ＧＡＣＡＴＤσ汀ＡＡＴ　ｆｆ　Ｔ７’Ｃ１０ ５３πスα℃α７　ＴＴＡ　ＧＡＴα’Ｉ；　ＡｒＴ　ＴＩＴ　ＴＡＣＴＧＣＣ ＡＣ（７ｔＴαＩ：　１０９２ＭＴ　印−ＧＡＣＡＧＩ；　ＡｆｆＧ　Ｔｍ　Ｍ Ｔ　ＧＡＡ　Ｔｌ＄　ＡＡＡ　ｍにｒα：Ｃ１１３１α刀ＭＡ　ＡＧＡ　Ａ■ス Ｔ月１心Ｇσ黒スＴＫ逼封ぢＡＡＣ１１７０ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＴｒＣＴＩＴ　Ｔ ＴＣＴＸ：　（？Ｔ　ＧＡＡ　ＭＴ　０７　ＡＡＣα：Ｔ　Ｔ７Ｃ１２０９απ 印：ＣＡＡＧ式）Ｚ　ｎ　ＣＡＣ面−３弘ＣでＮ晩ＭＡＡ冗１２４８αス−℃ス Ｔフにα刀αλに石α℃Ａロ゛αスπ石α汀Ｍ７１２８７ＴＴＴ　ＡＭ　ＣＣＡ 　ＡＴＣＡＧＡ　ＭＧ　ＴＣＡ　ＴＣＡ　ＴＣＡ　ＧＩＡ　ＡＭ　ＧＩ’Ｇ　Ａ ＡＴ　１３２６Ｎスα刀ＴＣＡ　ＡＵ丁αスαス渭Ａ困ＡＡＧω毛７℃σＡ月Ｄ 　１３６５α℃助Ｇロη０Ｃα汀まあに７ｒＴＹ刀゛ロ℃πＴＡにＮ刀α石１４ ０４α２　ＧＣＣＴｌ＄　Ｔｎ　ＡＧＧ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＣＭ　ＧＡＧ　ＭＡ 　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　１４４３り１６ＧＡＧにスロ：Ｇ　ＡＣＡ　Ｔ１℃ Ｍｒ　ＡＪ店Ａ−πｌπσいＴ（ＡＴ　１４Ｂ２Ｎ方ＭＣスＴωスＮ刀ＴＴＣＧ ＡＴＡＴＴ口１０ｎ　ＡＡＣＧＴｕχ１５２１ＭＧ　ＡＣＴ　ＧＩＧＡＡＴα： Ａ　ＧＡＴ　ＧＡＧロアｒ　ＧＡＴ　ＭＧ　ＧＯＧ　ＧＡＧ　ＴＩＴ　１．５６ ０αスα石Ｍπ）σＮゴＡ■コ刀α刀αＴωＴ０■゛αスＡ量１５９９ＮσＡ（ ？ｒ　ＭＴ　Ｏ’ｔｌＴ　ＧＥＴ　ＡＴＮ道′印：ＴＡＣＴ封℃ＭＧ　Ｃ１毛α 刀１６３ＢＡＴＡＡＣｒ　ＧＩＡ　ＣＴＧ　ＴＩ’Ｇ　ＧＡＧ　（ＡＴ　ＡＴＴ 　ＧＳＡ　ＴＴＧ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　（ＥＭ　１６１１ＧＡＴ　ＡＣｒ　ＡＴＴ 　ＧＣＧ　口ＬＡＣＴ　ｍ　ＧＩＴ　ＣＣＡ　ＭＡ　ＧＣＴ　（ｆ　Ｃ７１’７ １６ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＴＧ　ＴＣＣＡＴＴ　ＧＡＡ　ＡＧｒ　ＧｒＧ　ＧＡＧ 　ＡＴＣＡＡＧ　ＣＩＴ　％　１７５５Ｇｆｆ　ＴＧｒ　１７６１ （２）配列番号２についての情報 （１）配列の特徴 （＾）長さ　３０塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）　ｈポロン−１直鎖状 （１１）分子の型　ｃ　ＤＮＡ （Ｘｌ）配列の記載　配列番号２ ＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＣＧＡＧＣＴＣＣＡ　ＴＣＡＣ＾＾ＣＡＣＡ　３０（２ ）配列番号３についての情報 （１）配列の特徴・ （八）長さ　１４１塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１］）分子の型　ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載、配列番号３゜ 工■菖℃駆口Ｇ■ぼフ１π可万１賦π℃スπコｆｆ　Ｇ　１．４１（２）配列番 号４についての情報 （１）配列の特徴。

（＾）長さ　５８７アミノ酸 （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （」１）分子の型　ペプチド （Ｘｌ）配列の記載、配列番号４ （２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１７８８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロンー二直鎖状 （ｉｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載：配列番号５： のＡＴＧαスＡＣｒαスπηαπＮ■′η℃Ａ！端αスＮ〃コ１３２６ＡＡＧ　 ＧＣＧ　ＴＣＣＧＩ７４αＤ　ＭＡ　ＧｒＧ　ＭＴ　ＡＣＡ　ＡＧｒ　ＡＣＡ口 ℃Ｃｏ：　１３６５αスＧＣＡ　ＭＣＧＡＧ印λη℃αスロ℃α刀ＭＧＡπいＴ 　ＭＧ　１４０４ＡＣＴ　ＡＴｒ　ＴＣＡ　ＴＴＴ　（ＩＴ　ＡＴＣＭＣＡＧ３ 　ＣＣＡ　ＣＣＴ　ＴＣＡ　’ｎ　ＣＧＳ　１４４３ＡＣｒ　ＣＡＡ　ＣＭ　Ｇ ＡＧ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　Ｇ１℃ＡＴＧ　ＴＴＡＡＣＧ 　１４８２ＴＩＣＡＡＴ　ＭＣＡＴ７１ｔ　ＮスフσいＴＭＣＡααおπＣにλ Ａ印１５２１ＴｒＣＧＡＴ　ＧＩ’Ｇ　ＴＴＣＣ１’Ｇ　ＭＣＧｒＧ　ＧＣＭＣ ＭＴ　Ｃ１’Ｇ　ＭＣα：Ｇ　１５６０ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＣＩＴ　ＧＡｆｆ’　 ＭＧ　ＧＣＡ　ＧＬＧ　ＴＴＣＧＣＧ　（ｍ　ＡＧｒ　ＴＡＴ　ＡＣｒ　１５９ ９ＡＧｒ　ＴＴＧ　ＣＣＡ　ＯσＧｒＴ　ＣＡＣＡＧＡα：Ｔ　ＧＧＣＧＡＧ　 ＪｌｔＡＴ　ＧＡＴ　ＣＡＴ　１６３８ＡＴＣＧＣＧ　ＭＧ　ＧＩＴ　ＭＴ　Ｔ ＴＣＣＡＧ　ＣＩ’Ｇ　圓Ｇ　ＡＩＡ　ＡＣＡ　ＧＩＡ　Ｃ１’Ｇ　１６７７Ｔ ＴＧ　ＧＡＧ弘ＣＡ貫απ月℃σ店ωσり通いＴＸゴに℃α刀１７１６ＧＴＧ　 ＡＣＴ　ＣＴＧ　ＧｒＡαｍＡＭＧ　ＭＡαＣＧＧｒ　（ＡＡαπにＣＴＱ：　 １７５５ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＭＴ　ＧｒＧ　ＧｌｔＧ　ＡＴＣＭＧ　Ｃ１丁ＧｒＧ ＧｔσＴＧｒ　ｌ’７８Ｂ（２）配列番号６についての情報： （１）配列の特ｍ： （Ａ）長さ７１８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー、［鎖状 （ｉｉ）分子の型　ｃ　ＤＮＡ （ｘｌ）配列の記載、配列番号６゜ ＴＡＡＴＴＣＧＧＣＡ　ＣＧＡＧＡＧＣ＾１８（２）配列番号７についての情報 ・ （ｉ）配列の特徴： （＾）長さ：１８９塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖の数・−末娘 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （］ｉｉ分子の型：ｃＤＮ、Ａ （ｘｌ）配列の記載　配列番号７ （２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：５９６アミノ酸 （Ｂ）型、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・−末鎖 （Ｄ）トポロノー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型、ペプチド （ｘｉ）配列の記載二配列番号８： （２）配列番号９についての情報。

（ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ、１４アミノ酸 （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｃ）鎮の数　−重鎖 （Ｄ）トポロン−。直鎖状 （ｉｉ）分子の型°ペプチド （ｘｉ）配列の記載　配列番号９゜ ＾１ａＰｒｏＩ　１ｅＰｒｏＰｒｏＰｒｏＡｓｐＬｅｕＬｙｓＳｅｒＧ１ｙＧｌ ｙＴｈｒ＾１ａ（２）配列番号１０についての情報 （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ　１４アミノ酸 （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎮 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （１１）分子の型、ペプチド （２）配列番号１５についての情報： （１）配列の特徴； （Ａ）長さ・２２２塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）娘の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （１１）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｌ）配列の記載・配列番号１５： （２）配列番号１６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ・５８８アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・−末鎖 （Ｄ）トポロン−１直鎮状 （１１）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：配列番号１６： （２）配列番号１７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （＾）長さ＋１７４９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー−直鎖状 （］ｉ）分子の型：ｃＤＮＡ （ｘｌ）配列の記載、配列番号１７： （２）配列番号１８についての情報・ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１７３塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロノー　直鎮状 （１］）分子の型　ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列の記載　配列番号１８ （２）配列番号１９についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ　６３３アミノ酸 （Ｂ）型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｄ）トポロノー、＠鎖状 （ｉ＋）分子の型　ペプチド （ｘｉ）配列の記載・配列番号１９゜ このように本発明者は本発明の好ましい態様を例示し説明してきたが、本発明が 変化および修飾可能であることは理解されるべきであり、故に、本発明者は、開 示される正確な用語に限定されることを望まず、本発明を様々な用途および条件 に適合させるためになされ得る変化および変更を利用することを望むものである 。本発明に対するこのような変化および変更は、係る変更が、上に与えられたｃ ＤＮＡ配列の性質から変更された配列の性質に有意な影響を及ぼさない限り、− 塩基置換、および本明細書中に示されるＤＮＡ配列の除去、挿入または翻訳を、 無制限に包含する。したがって、このような変化および変更は、当然、等飾物の 全範囲内にあることが意図され、故に以下の請求項の範囲内にある。

このように、本発明ならびにこれを製造し使用する方法および工程を、これが関 係しまたはこれが最も密接に結びついている分野に・ついて通常の知識を有する 者なら誰でもこれを製造し使用することができるよう、完全な、明瞭な、簡潔な そして正確な用語で説明してきたが、請求項は以下の通りである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．ＰＰＯ−Ｔ１、ＰＰＯ−Ｔ２、ＰＰＯ−Ｐ１、およびＰＰＯ−Ｐ２蛋白の発 現のためのＤＮＡの群から分離されたｃＤＮＡ。
2. ２．該植物によるＰＰＯ産生の増大をもたらすゲノムを有する形質転換された植 物であって、該植物のゲノムが、ＰＰＯを発現可能なＤＮＡ配列をセンス方向に 挿入させている植物。
3. ３．通常の非形質転換条件下で該植物によるＰＰＯ産生の低下をもたらすゲノム を有する形質転換された植物であって、該植物のゲノムが、ＰＰＯを発現可能な ＤＮＡ配列をアンチセンス方向に挿入させている植物。