JP2005529623A - 非生物ストレスに対する単子葉植物類の耐性増加の方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、非生物ストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加させるための方法であって、融合遺伝子（ＴＰＳＰ）を発現させるため、トレハロース６リン酸塩合成酵素（ＴＰＳ）遺伝子及びトレハロース６リン酸塩ホスファターゼ（ＴＰＰ）遺伝子を融合させたＴＰＳＰ遺伝子を含む組換えプラスミドにより単子葉植物を形質転換するステップを含んで成り、その上通常の成長及び発育特性を維持する。本発明はさまざまなストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加させることができるため、価値ある農作物の生産及び品質の改善に大きく貢献することができる。
Description
本発明は、非生物ストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加する方法に関する。より明確には、本発明は単子葉植物類中のトレハロース６リン酸塩合成酵素（ＴＰＳ）及びトレハロース６リン酸塩ホスファターゼ（ＴＰＰ）の発現により非生物ストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加させ、その上通常の成長及び発育特性を驚くほどに持続させるための方法に関する。
２０００年１１月２３日に公開された国際公開WO00/70067では、米のアクチン２プロモーター及びアクチン２イントロン、並びにそれらの使用方法について示唆する。干ばつに対する環境もしくはストレス耐性に関しては、（対応する米国特許No.6,429,357 cols.19及び20を参照）トレハロース６リン酸塩合成酵素をコード化した遺伝子の導入、及び細胞中における先天性ホスファターゼの続けて起こる作用を通じて説明されており、もしくはストレスの効果を緩和することができる保護的化合物であるトレハロースをもたらす特定のホスファターゼの導入及び共発現によって説明されている。
米国特許No.5,925,804は、大腸菌のトレハロースリン酸合成酵素遺伝子を用いて植物類中でトレハロースの製造を増加させることを記載する（cols７及び８を参照）。
Seo HS等による、Appl.Environ. Microbiol.,66:2484-2490,(2000)は、大腸菌のトレハロース６リン酸塩合成酵素及びトレハロース６リン酸ホスファターゼの二機能融合酵素（ＴＰＳＰ）の特徴に関する。
トレハロース（α−Ｄ−グルコピラノシル−〔１，１〕−α−Ｄ−グルコピラノース）は、非還元性２配糖体であり、それゆえメイラード褐色化（Maillard browning）の一部としてアミノ酸もしくは蛋白質と反応しない。トレハロースは、バクテリア、藻類、真菌、酵母、昆虫及び一部の植物類を含む様々な有機体中で見出され、炭水化物の貯蔵体（reservoir）としてだけでなく、物理的及び化学的ストレスの変化に対する保護剤としても働く（Elbein A,Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.,30:227-256,1974;Eleutherio ECA等., Cryobiology,30:591-596,1993;Strom AR and KaasenI,Mol.Microbiol.,8:205-210,1993; van Laere A,FEMS Microbiol.Rev.,63:201-210,1989;及びWiemken A,J.Gen.Microbiol., 58:209-217,1990を参照）。更にトレハロースは細胞膜の流動性を維持するために乾燥条件下における高い水保持活性を示し、並びに脱水及び再水和のサイクルの間に自然に起こるストレスに対して耐性を植物にもたせる（Leslie SB等.,Appl. Environ.Microbiol., 61:3592-3597,1995;Drennan PM等.,J.Plant Physiol., 142:493-496,1993;及びMuller J等.,Plant Sci.,112:1-9,1995参照）。ストレス耐性におけるそのようなトレハロースの効果は、脱水に対する耐性を持つS.レイドフィラ（S.Leidophylla）のような隠れた植物種で証明された。これに関して、そのような植物種の脱水の間、植物の乾燥重量の１２％のレベルのトレハロースが蓄積されるが、一方、トレハロースの蓄積は再水和の間、減少することが報告された（Goddijn OJM及びvan Dun K, Trends Plant Sci.,4:315-319,1999参照）。
トレハロースのそのような活性特長により、植物類のストレス耐性の増加が試みられている。現在まで、双子葉植物中での大腸菌もしくは酵母からのトレハロース６リン酸塩合成酵素（ＰＴＳ）遺伝子、及び／もしくはトレハロース６リン酸塩ホスファターゼ（ＴＰＰ）遺伝子を発現するトランスジェニック植物類が見出された。これらのトランスジェニック植物類は、一般的に非常に低いレベルでトレハロースを発現する。しかしながらこれらのトランスジェニック植物類においてストレス耐性がやや増加したにもかかわらず、重篤な成長阻害及び根のゆがみといった副作用が発現した。これらの副作用は、トレハロースの蓄積の欠乏でさえも提示する（Holmstrom K-O等., Nature,379:683-684,1996; Goddijn OJM等., Plant Physiol.,113:181-1990,1997;Muller等.,Plant Sci.,147:37-47,1999;Pilon-Smits EAH等.,J.Plant Physiol.,152:525-532,1998;及びRomeo C等.,Planta,201:293-297,1997を参照）。
ヒトの繁栄及び生存のための食物の生産において、米、大麦、小麦、トウモロコシ等を含む単子葉植物類は、生存に関する商業的に価値のある植物類である。それゆえそのような作物の生産性及び品質を高めるため多大な努力がなされた。特に干ばつ、塩濃度上昇、低温等といった非生命の自然条件に対する耐性を持つ作物を作るための継続的な努力がなされている。
このように、本発明は非生命のストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加させるための方法を開発するために熱心に研究がされた。結果として、発明者等は、トレハロース６リン酸塩合成酵素（ＴＰＳ）遺伝子及びトレハロース６リン酸塩ホスファターゼ（ＴＰＰ）遺伝子の融合遺伝子が単子葉中に導入され発現された時、脱水、高い塩濃度レベル及び低温に対する植物ストレス耐性を、成長レベルを阻害せずに増強させることができることを確認し、このようにして本発明が完成した。
その結果、本発明の目的は、ＴＰＳ遺伝子及びＴＰＰ遺伝子の融合した表現型の常態が持続している間中発現することによって、非生物ストレスに対する単子葉植物類の耐性が増加するための方法を提供する。
本発明の他の目的は、ＴＰＳ遺伝子及びＴＰＰ遺伝子の融合した表現型による非生物ストレスに対する耐性を増加させる単子葉植物類の製造方法を提供することである。
本発明の他の目的は、ＴＰＳ遺伝子及びＴＰＰ遺伝子の融合遺伝子を発現させることによって、成長及び発育阻害、並びに根のゆがみといった形態学的な成長欠陥がなく、そして非生物ストレスに対する耐性を増加させた単子葉植物類の製造方法を提供することである。
本発明の他の目的は、ＴＰＳ遺伝子及びＴＰＰ遺伝子の融合遺伝子（ＴＰＳＰ）を発現させることによって、非生物ストレスに対する耐性を増加させ、且つ正常な成長及び発育の特徴を示す単子葉植物類を製造するための方法を提供することである。
本発明は、脱水ストレス、塩ストレス、もしくは冷ストレスといった非生物ストレスにより持ちこたえるための単子葉植物類の耐性を増加させる方法に関し、トレハロース６リン酸塩合成酵素（ＴＰＳ）遺伝子及びトレハロース６リン酸塩ホスファターゼ（ＴＰＰ）遺伝子の二機能融合酵素遺伝子（ＴＰＳＰ）を含む組換えプラスミドにより単子葉植物を形質転換することを含み、それによって形質転換された単子葉植物類中でのトレハロース６リン酸塩の蓄積を制限し、且つトレハロースの蓄積を増強させる一方、通常の成長の特徴を維持する方法に関する。
好適には、ＴＰＳ遺伝子及びＴＰＰ遺伝子は大腸菌もしくは酵母から由来する。本発明による方法は、単子葉植物類（特に商業的に重要な植物である米、小麦、大麦及びトウモロコシといった単子葉植物類）の耐性を増加させるために用いることができる。
発現し得る二機能融合遺伝子の受容植物細胞への導入、即ち形質転換は、アグロバクテリウム仲介法によって実行される。
発明の実施形態
本発明による、非生物ストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加させる方法は、ＴＰＳＰ遺伝子を発現させるためトレハロース６リン酸塩合成酵素（ＴＰＳ）遺伝子及びトレハロース６リン酸塩ホスファターゼ（ＴＰＰ）遺伝子の融合遺伝子（ＴＰＳＰ）を含む組換えプラスミドによる単子葉植物類の形質転換のステップを含んで成る。本方法では、ＴＰＳ遺伝子及びＴＰＰ遺伝子は大腸菌もしくは酵母から由来するものであり、アグロバクテリウム仲介法によって米、大麦、小麦、もしくはトウモロコシといった単子葉植物類へ導入される。本方法における非生物ストレスは、特に制限はないが、脱水ストレス、塩ストレスもしくは冷ストレスを含む。
本発明による、非生物ストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加させる方法は、ＴＰＳＰ遺伝子を発現させるためトレハロース６リン酸塩合成酵素（ＴＰＳ）遺伝子及びトレハロース６リン酸塩ホスファターゼ（ＴＰＰ）遺伝子の融合遺伝子（ＴＰＳＰ）を含む組換えプラスミドによる単子葉植物類の形質転換のステップを含んで成る。本方法では、ＴＰＳ遺伝子及びＴＰＰ遺伝子は大腸菌もしくは酵母から由来するものであり、アグロバクテリウム仲介法によって米、大麦、小麦、もしくはトウモロコシといった単子葉植物類へ導入される。本方法における非生物ストレスは、特に制限はないが、脱水ストレス、塩ストレスもしくは冷ストレスを含む。
本発明による非生物ストレスに対する耐性が増加した単子葉植物類の製造方法は、前記非生物ストレスに対する単子葉植物類のストレスを増加するための方法と同一のステップを通じて実施されるが、但しＴＰＳＰ遺伝子を含む組換えプラスミドを単子葉植物類もしくはそれらの原型種細胞（それらの細胞が植物へと再生できる限り）の中に導入するものとする。
本明細書において後に、本発明はより明確に説明される。
現在に至るまでのトレハロースを用いた植物中でのストレス耐性の増加への試みは、単子葉植物類のための適したベクターがないこと、及び研究文献の不足という難しさから、双子葉植物類でのみ実施されてきた。しかしながら、トレハロースの発現が双子葉植物類においてストレス耐性を増加させるにもかかわらず、植物成長の重篤な阻害という副作用のため、いかなる注目すべき効果も得ることができなかった。従って、そのような試みは、単子葉植物類にまで行われることはなかった。
貴重な食物資源としての単子葉植物類においてストレス耐性を増加させるために、本発明者等は、トレハロース６リン酸塩合成酵素（ＴＰＳ）及びトレハロース６リン酸塩ホスファターゼ（ＴＰＰ）（両方ともトレハロース合成に必要とされる酵素）をコードする遺伝子の融合遺伝子を、組換えプラスミドを構築するために単子葉植物中で比較的高い活性を示すＵｂｉ１プロモーターを含むベクターに組み入れ、その後アグロバクテリウムトゥメファシエンスにより仲介される形質転換によって、米植物類中へ導入した。
その後、形質転換した米遺伝子型を、導入された遺伝子が米染色体中で安定して融合されたかを確認するためサザンブロッドにより分析した。更に、導入された遺伝子が通常に発現したか確認するため、前記米の葉から抽出した米ＲＮＡをノーザンブロットにより分析した。更に、従来技術においてＴＰＳもしくはＴＰＰにより形質転換させたタバコから発現する公知レベルの２００倍という高いレベルで発現したトレハロースを炭水化物定量的分析を通して確認した。培養レベルでの観察では、双子葉植物類とは反対で、米植物類におけるトレハロースの過剰発現は単子葉植物類としての米の成長に大きく影響せず、更にトレハロースは、脱水、塩、及び低温といった非生物ストレスに対する耐性の増加をもたらすことも確認した。
従って、本発明の方法では、様々なストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加させることができることから、貴重な農作物の生産及び品質改善に大きく貢献できることが期待される。本明細書に後述する実施例により本発明はより詳細に説明される。本発明を明確に説明するためだけに用いられるそれらの実施例は、当業界において通常の知識を有する者に理解され、また本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
プラスミドの構築及び米植物類の形質転換
大腸菌ＴＰＳ遺伝子の終止コドンは、ＰＣＲを通して除去し、その後ＴＰＳ及びＴＰＰの融合組換え遺伝子としてＴＰＳＰを構築するためにＴＰＰ遺伝子を結紮した。（図１、及び本明細書において十分に述べられたように参考文献によって組入れられたSeo HS等.,Appl.Environ.Microbiol.,66:2484-2490,(2000)参照。）得られたＴＰＳＰを、Ｕｂｉ１：：ＴＰＳＰを構築するためにトウモロコシユビキチンプロモーターと結合させ、ｐＳＢ−ＵＴＰＳＰ組換えプラスミド（図２参照）を構築するために３５Ｓプロモーター及びバーコーディング領域（ホスフィノスリシン（phosphinothricin）アセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を含む発現ベクター中に挿入した。図２は右側境界（right border）配列を表すＢＲ；左側境界（left border）配列を表すＢＬ；ポテトプロテアーゼ阻害剤II遺伝子の３’領域を表す３’ｐｉｎII；３５Ｓプロモーターを表す３５Ｓ；及びノパリン合成酵素遺伝子の３’領域を表す３’ｎｏｓが存在するｐＳＢ−ＵＴＰＳＰ組換えプラスミドの遺伝子マップを示すダイヤグラムである。バー遺伝子の中にコードされているホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼは、ホスフィノスリシン由来の除草剤の毒性を解毒するために機能することから、選択マーカーとして機能し得る。ｐＳＢ−ＵＴＰＳＰを三親交配によりアグロバクテリウムトゥメファシエンスＬＢＡ４４０４の中に導入した。
大腸菌ＴＰＳ遺伝子の終止コドンは、ＰＣＲを通して除去し、その後ＴＰＳ及びＴＰＰの融合組換え遺伝子としてＴＰＳＰを構築するためにＴＰＰ遺伝子を結紮した。（図１、及び本明細書において十分に述べられたように参考文献によって組入れられたSeo HS等.,Appl.Environ.Microbiol.,66:2484-2490,(2000)参照。）得られたＴＰＳＰを、Ｕｂｉ１：：ＴＰＳＰを構築するためにトウモロコシユビキチンプロモーターと結合させ、ｐＳＢ−ＵＴＰＳＰ組換えプラスミド（図２参照）を構築するために３５Ｓプロモーター及びバーコーディング領域（ホスフィノスリシン（phosphinothricin）アセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を含む発現ベクター中に挿入した。図２は右側境界（right border）配列を表すＢＲ；左側境界（left border）配列を表すＢＬ；ポテトプロテアーゼ阻害剤II遺伝子の３’領域を表す３’ｐｉｎII；３５Ｓプロモーターを表す３５Ｓ；及びノパリン合成酵素遺伝子の３’領域を表す３’ｎｏｓが存在するｐＳＢ−ＵＴＰＳＰ組換えプラスミドの遺伝子マップを示すダイヤグラムである。バー遺伝子の中にコードされているホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼは、ホスフィノスリシン由来の除草剤の毒性を解毒するために機能することから、選択マーカーとして機能し得る。ｐＳＢ−ＵＴＰＳＰを三親交配によりアグロバクテリウムトゥメファシエンスＬＢＡ４４０４の中に導入した。
前記アグロバクテリウムトゥメファシエンスＬＢＡ４４０４による米植物類の形質転換のため、７０％（ｖ／ｖ）エタノールを約２００の殻をむいていない種（Oryza sativa L.cv Nakdong）に付加し、当該種を殺菌するため１分間穏やかに互いを混合した。その後エタノールを捨て、当該種を1時間２０％（ｖ／ｖ）Ｃｌｏｒａｘ１００ｍＬと共に更に穏やかに混合することにより殺菌し、その後何度か殺菌した水で洗浄した。種からのカルスの誘導、上記記載のように構築されたプラスミドを含む、アグロバクテリウムとのカルスの共培養、及び形質転換したカルスの選定は以前に記載されている通りに実施した（Jang,I-C.等.,Mol.Breeding,5:453-461,1999参照）。アグロバクテリウム仲介法で形質転換した米植物類を、除草剤Ｂａｓｔａに対して耐性を持つ植物類のみを選定するために温室中で栽培した。上述通りに形質転換及び選定されたトランスジェニック米植物類のサザンブロット分析によれば、導入遺伝子が米染色体中に組み込まれ、並びに１から３のコピーを持つことを確認できた。更なる試験では、ＴＰＳＰ遺伝子の１つのコピーを含む当該植物類を選定し、選定された植物類の葉由来の全ＲＮＡサンプルを用いたノーザンブロット分析では、およそ２．４ｋｂのｍＲＮＡを観察することができ、それによってＴＰＳＰの通常の発現を確認した。
トランスジェニック植物類中のトレハロースの蓄積レベルの研究
トランスジェニック植物類中のトレハロースの蓄積レベル、及びトレハロースが植物類中の内容物である炭水化物へ及ぼす影響の研究のため、実施例１で製造されたトランスジェニック米植物類としてのＵｂｉ１：：ＴＰＳＰの葉及び種を液体窒素で消化し（digested）、その後１００℃の水１０ｍＬ／ｇにより１０分間かけて抽出した。当該抽出物を遠心分離し、得られた上清液を０．４５Ｎｍフィルターでろ過した。その後、４ｘ２５０ｎｍＣａｒｂｏ−Ｐａｋ ＰＡ１カラムを備えたＤＸ５００ＨＰＩＣ（high performanceイオンクロマトグラフィー、Ｄｉｏｎｅｘ５００、Ｄｉｏｎｅｘ、ＵＳＡ）を用いて定量的な分析を実施した。ＨＰＩＣは、０ｍＭから２５０ｍＭの酢酸ナトリウム塩を含む１５０ｍＭのＮａＯＨ溶液を用いて、３０分間線形勾配条件下において実施した。当該ＨＰＩＣの結果は、標準品として商業的に入手し得るトレハロース（Sigma Chemicals Co.,USA）を用いてＥＤ４０電気化学検出器（Dionex DC Amperometry,Dionex,USA）によりモニターされた（図３ａ参照）。
トランスジェニック植物類中のトレハロースの蓄積レベル、及びトレハロースが植物類中の内容物である炭水化物へ及ぼす影響の研究のため、実施例１で製造されたトランスジェニック米植物類としてのＵｂｉ１：：ＴＰＳＰの葉及び種を液体窒素で消化し（digested）、その後１００℃の水１０ｍＬ／ｇにより１０分間かけて抽出した。当該抽出物を遠心分離し、得られた上清液を０．４５Ｎｍフィルターでろ過した。その後、４ｘ２５０ｎｍＣａｒｂｏ−Ｐａｋ ＰＡ１カラムを備えたＤＸ５００ＨＰＩＣ（high performanceイオンクロマトグラフィー、Ｄｉｏｎｅｘ５００、Ｄｉｏｎｅｘ、ＵＳＡ）を用いて定量的な分析を実施した。ＨＰＩＣは、０ｍＭから２５０ｍＭの酢酸ナトリウム塩を含む１５０ｍＭのＮａＯＨ溶液を用いて、３０分間線形勾配条件下において実施した。当該ＨＰＩＣの結果は、標準品として商業的に入手し得るトレハロース（Sigma Chemicals Co.,USA）を用いてＥＤ４０電気化学検出器（Dionex DC Amperometry,Dionex,USA）によりモニターされた（図３ａ参照）。
それぞれの炭水化物の構造及び分布におけるトレハロースの影響は、図３ｂ及び３ｃに示されている。図３ｂ及び３ｃは、ＨＰＩＣクロマトグラムが示すＵｂｉ１：：ＴＰＳＰ植物の葉及び種からの抽出物の炭水化物プロファイルであり、ここでそれぞれにＮＴは形質転換されていない米植物を表し、Ｕｂｉ１：：ＴＰＳＰ−１及びＵｂｉ１：：ＴＰＳＰ−２は、実施例１で選定されたＴＰＳＰ遺伝子の１つのコピーを含む２つの植物を表す。図３ｂ及び３ｃに見ることができるように、ＴＰＳもしくはＴＰＰ遺伝子により形質転換されたトランスジェニックタバコ植物類の公知レベルよりも２００倍高い１．０７６ｍｇ／ｇのレベルでのトレハロースは、Ｕｂｉ１：：ＴＰＳＰ米植物類の葉及び種抽出物中に存在した。更に、内容物である炭水化物は、Ｕｂｉ１：：ＴＰＳＰ米植物類の葉抽出物中で実質的に変化せず、種抽出物中で大きく変化した。
その上、Ｕｂｉ１：：ＴＰＳＰ米植物類の培養レベルでの観察結果として、Ｕｂｉ１：：ＴＰＳＰ米植物類は、形質転換されていない米植物類と同等のレベルまで成長したことを確認できた。現在までは、大腸菌もしくは酵母のＴＰＳ及び／もしくはＴＰＰにより形質転換されたトランスジェニック植物類が双子葉植物用として公知であり、これらのトランスジェニック植物類ではトレハロースが非常に低いレベルで発現するにもかかわらず、成長及び発育の重篤な障害並びに根のゆがみといった現象を引き起こすことが報告された。しかしながら、Ｕｂｉ１：：ＴＰＳＰ米植物類は、たとえ植物の質量の０．１％レベルまでトレハロースを過度に生産しても根の発現及びそれらの成長の中でいかなる変化も見せなかった。従って双子葉植物類とは反対に、米植物類中でのトレハロースの過剰発現は植物類の通常の成長を妨げないことを見出した。
トレハロースよるストレス耐性の増加
エタノール及びCloraxと共に殺菌し、実施例１で説明したように洗浄した種は、明所で１６時間／暗所で８時間のサイクルで成長空間の温度を２８℃にして土の上で発芽させ、その後、若い苗木を作成するために１４日間成長させた。脱水ストレスのための処理は、植物全体を１５０Ｎｍ／ｍ２／ｓの光条件下において２８℃で１時間空気乾燥させた。塩ストレスのための処理は、前記若い苗木を２日間０．１％（ｖ／ｖ）Ｈｙｐｏｎｅｘ（Ｈｙｐｏｎｅｘ、Ｊａｐａｎ）の栄養溶液中で成長させ、９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含む新鮮な栄養溶液へ移動させ、その後２時間、２８℃で１５０Ｎｍ／ｍ２／ｓの光条件下において成長させた。冷ストレスのための処理は、前記若い苗木を６時間、４℃で１５０Ｎｍ／ｍ２／ｓの光条件下において成長させた。その後、形質転換されていないコントロール群、及びトランスジェニックテスト群を、様々な条件下におけるストレス処理により２時間暗条件下において保ち、それらの蛍光クロロフィルレベルをパルスモジュレーション（ＰＡＭ）フルオロメーターを用いて測定した。当該蛍光クロロフィルレベルは、測定された最小の蛍光（Ｆｖ）対最大の蛍光（Ｆｍ）の比率（Ｆｖ／Ｆｍ）で表され、ここで当該Ｆｖ／Ｆｍ比率は、光化学系２の活性を意味し、それゆえに植物類の機能障害を評価するための尺度として用いることができる（図４ａ、４ｂ及び４ｃ参照）。
エタノール及びCloraxと共に殺菌し、実施例１で説明したように洗浄した種は、明所で１６時間／暗所で８時間のサイクルで成長空間の温度を２８℃にして土の上で発芽させ、その後、若い苗木を作成するために１４日間成長させた。脱水ストレスのための処理は、植物全体を１５０Ｎｍ／ｍ２／ｓの光条件下において２８℃で１時間空気乾燥させた。塩ストレスのための処理は、前記若い苗木を２日間０．１％（ｖ／ｖ）Ｈｙｐｏｎｅｘ（Ｈｙｐｏｎｅｘ、Ｊａｐａｎ）の栄養溶液中で成長させ、９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含む新鮮な栄養溶液へ移動させ、その後２時間、２８℃で１５０Ｎｍ／ｍ２／ｓの光条件下において成長させた。冷ストレスのための処理は、前記若い苗木を６時間、４℃で１５０Ｎｍ／ｍ２／ｓの光条件下において成長させた。その後、形質転換されていないコントロール群、及びトランスジェニックテスト群を、様々な条件下におけるストレス処理により２時間暗条件下において保ち、それらの蛍光クロロフィルレベルをパルスモジュレーション（ＰＡＭ）フルオロメーターを用いて測定した。当該蛍光クロロフィルレベルは、測定された最小の蛍光（Ｆｖ）対最大の蛍光（Ｆｍ）の比率（Ｆｖ／Ｆｍ）で表され、ここで当該Ｆｖ／Ｆｍ比率は、光化学系２の活性を意味し、それゆえに植物類の機能障害を評価するための尺度として用いることができる（図４ａ、４ｂ及び４ｃ参照）。
図４ａ、４ｂ及び４ｃは、脱水ストレス、塩ストレス、及び冷ストレス処理したＵｂｉ１：：ＴＰＳＰ米植物類における蛍光クロロフィルを示すグラフである。図４ａ、４ｂ及び４ｃから見ることができるように脱水ストレス、塩ストレス、及び冷却ストレスで処理した全ての米植物類はコントロール群よりも１５から１９％高いレベルでＦｖ／Ｆｍ比率を示した。それゆえに、トレハロースは非生物ストレスに対する米植物類の耐性を増加させる役割を果たすことが確認できた。
発明の効果
上記において説明及び論証されたように、本発明は非生物ストレスに対する単子葉植物類の耐性の増加方法に関し、ＴＰＳＰ遺伝子を発現するためのトレハロース６リン酸塩合成酵素（ＴＰＳ）遺伝子及びトレハロース６リン酸塩ホスファターゼ（ＴＰＰ）遺伝子の融合遺伝子（ＴＰＳＰ）を含む組換えプラスミドによる単子葉植物類の形質転換のステップを含んで成る。本発明はさまざまなストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加させるため、価値ある農作物の生産及び品質の改善に大きく貢献することができる。
上記において説明及び論証されたように、本発明は非生物ストレスに対する単子葉植物類の耐性の増加方法に関し、ＴＰＳＰ遺伝子を発現するためのトレハロース６リン酸塩合成酵素（ＴＰＳ）遺伝子及びトレハロース６リン酸塩ホスファターゼ（ＴＰＰ）遺伝子の融合遺伝子（ＴＰＳＰ）を含む組換えプラスミドによる単子葉植物類の形質転換のステップを含んで成る。本発明はさまざまなストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加させるため、価値ある農作物の生産及び品質の改善に大きく貢献することができる。
Claims (9)
- 非生物ストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加させるための方法であって、二機能融合酵素（ＴＰＳＰ）遺伝子を発現させるため、トレハロース６リン酸塩合成酵素（ＴＰＳ）遺伝子及びトレハロース６リン酸塩ホスファターゼ（ＴＰＰ）遺伝子のＴＰＳＰ遺伝子を含む組換えプラスミドにより単子葉植物を形質転換するステップを含んで成り、それによって当該形質転換された単子葉植物類中でのトレハロース６リン酸塩の蓄積を制限し、且つトレハロースの蓄積を増強させ、その上通常の植物成長及び発育の特徴を維持する方法。
- 前記ＴＰＳ遺伝子及びＴＰＰ遺伝子が大腸菌又は酵母から由来する請求項１に記載の非生物ストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加させるための方法。
- 前記単子葉植物が米、小麦、大麦、もしくはトウモロコシである請求項１に記載の非生物ストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加させるための方法。
- 前記形質転換がアグロバクテリウム仲介方法により実施される請求項１に記載の非生物ストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加させるための方法。
- 前記非生物ストレスが脱水ストレス、塩ストレスもしくは冷ストレスである請求項１に記載の非生物ストレスに対する単子葉植物類の耐性を増加させるための方法。
- 非生物ストレスに対する耐性が増加した単子葉植物類の製造方法であって、ＴＰＳＰ遺伝子を発現させるためトレハロース６リン酸塩合成酵素（ＴＰＳ）遺伝子及びトレハロース６リン酸塩ホスファターゼ（ＴＰＰ）遺伝子の二機能融合酵素遺伝子（ＴＰＳＰ）を含む組換えプラスミドにより、単子葉植物類もしくはそれらの原型種を形質転換するステップを含んで成り、それによって表現型に成長の変化がない成長を可能とするために当該形質転換された単子葉植物類中でのトレハロース６リン酸塩の蓄積を制限し、且つトレハロースの蓄積を増強させる方法。
- トランスジェニック単子葉植物の製造方法であって、以下のステップ；
（ａ）融合されたトレハロース６リン酸塩合成酵素（ＴＰＳ）遺伝子及びトレハロース６リン酸塩ホスファターゼ（ＴＰＰ）遺伝子から成る（ＴＰＳＰ）融合遺伝子配列を構築し；
（ｂ）受容植物細胞の中へ前記ＴＰＳＰ融合遺伝子配列を形質転換し；そして
（ｃ）成熟植物中で前記植物を再生し、前記成熟植物は前記（ＴＰＳＰ）融合遺伝子配列を含むトランスジェニック単子葉植物である、
を含んで成る方法。 - 前記トランスジェニック単子葉植物が、米、小麦、大麦、もしくはトウモロコシから成る単子葉植物類の群から選定される請求項７に記載の方法。
- 請求項７に記載の方法により製造されるトランスジェニック単子葉植物。
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