DE19734218A1

DE19734218A1 - Verfahren zur Ertragssteigerung in Pflanzen

Info

Publication number: DE19734218A1
Application number: DE19734218A
Authority: DE
Inventors: Marion Kwart; Lothar Willmitzer; Joerg Riesmeier
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1997-08-07
Filing date: 1997-08-07
Publication date: 1999-02-11
Also published as: BR9811853A; CN1265704A; WO1999007863A1; AU9257298A; PL338561A1; EP1002118A1; KR20010021566A; HUP0004258A2; HUP0004258A3; JP2001512685A; AU734951B2; CA2299388A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Ertrags-Stei gerung in Pflanzen, rekombinante Nucleinsäuremoleküle, die bei diesen Verfahren eingesetzt werden, deren Verwen dung, sowie die Pflanzen, die eine Ertragssteigerung aufwei sen.

Auf dem Gebiet der Agrar- und Forstwirtschaft ist man stetig darum bemüht, Pflanzen mit erhöhtem Ertrag zur Verfügung zu stellen insbesondere um die Ernährung der fortwährend an wachsenden Weltbevölkerung sicherzustellen und die Versor gung mit nachwachsenden Rohstoffen zu gewährleisten. Tradi tionell wird versucht, ertragreiche Pflanzen durch Züchtung zu erhalten. Dieses ist jedoch zeit- und arbeitsintensiv. Ferner müssen entsprechende Züchtungsprogramme für jede interessierende Pflanzenart durchgeführt werden.

Fortschritte wurden zum Teil bereits durch die genetische Manipulation von Pflanzen erzielt, d. h. durch die gezielte Einführung und Expression von rekombinanten Nucleinsäuremo lekülen in Pflanzen. Derartige Ansätze haben den Vorteil, daß sie in der Regel nicht auf eine Pflanzenart beschränkt sind, sondern sich auch auf andere Pflanzenarten übertragen lassen.

So wurde beispielsweise in EP-A 0 511 979 beschrieben, daß die Expression einer prokaryontischen Asparagin-Synthetase in Pflanzenzellen unter anderem zu einer erhöhten Biomasse produktion führt.

Die WO 96/21737 beschreibt z. B. die Ertragssteigerung in Pflanzen durch Expression von de- oder unregulierter Fruc tose-1,6-bisphosphatase, aufgrund der Erhöhung der Photosyn thaserate.

Trotzdem besteht nach wie vor bedarf an generell anwendbaren Verfahren zur Verbesserung des Ertrages bei land- oder forstwirtschaftlich interessanten Pflanzen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, weitere Verfahren zur Ertragssteigerung in Pflanzen zur Ver fügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungs formen gelöst.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Steigerung des Ertrages bei Pflanzen, das dadurch gekenn zeichnet ist, daß in Pflanzen stabil im Genom integrierte rekombinante DNA-Moleküle exprimiert werden, enthaltend

(a) eine Region, die die Transkription spezifisch in den Ge leitzellen von Pflanzen erlaubt; und in operativer Ver knüpfung damit
(b) eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, aus gewählt aus der Gruppe bestehend aus:
- (i) Proteinen mit Saccharose-spaltender enzymatischer Aktivität;
- (ii) Saccharose-Transportern;
- (iii) Proteinen, deren Aktivität zur Stimulation des Protonengradienten an der Plasmamembran pflanzli cher Zellen führt; und
- (iv) Citratsynthasen (E.C. 4.1.3.7).

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Expression der obengenannten Proteine spezifisch im Phloem von Pflanzen zu einer drastischen Steigerung des Ertrages führt.

Der Begriff "Ertragsteigerung" bedeutet dabei vorzugsweise eine Erhöhung der Biomasseproduktion, insbesondere, wenn diese am Frischgewicht pro Pflanze gemessen wird.

Eine derartige Ertragssteigerung bezieht sich vorzugsweise auf die sogenannten "sink"-Organe der Pflanze, d. h. diejeni gen Organe, die die während der Photosynthese gebildeten Photoassimilate aufnehmen. Besonders bevorzugt sind dies erntebare Pflanzenteile wie Samen, Früchte, Speicherwurzeln, Wurzeln Knollen, Blüten, Knospen, Sprosse, Stämme oder Holz. Die Ertragssteigerung beträgt erfindungsgemäß mindestens 3%, bezogen auf die Biomasse, im Vergleich zu entsprechen den nicht-transformierten Pflanzen desselben Genotyps, wenn diese unter denselben Bedingungen kultiviert werden, bevor zugt mindestens 10% und besonders bevorzugt mindestens 20%.

Den oben genannten Proteinen ist gemeinsam, daß ihre biolo gische Aktivität bei Expression im Phloem zu einer Erhöhung der Beladung des Phloems mit Photoassimilaten führt. Unter Photoassimilaten werden im Rahmen der vorliegenden Er findung Zucker und/oder Aminosäuren verstanden.

Generell kann die unter (b) genannte Nucleotidsequenz erfin dungsgemäß sowohl ein pflanzliches als auch ein bakterielles Protein oder ein Protein aus Pilzen oder tierischen Organis men codieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform codiert die Nucleotid sequenz eine Saccharose-Synthase (E.C. 2.4.1.13), vorzugs weise eine aus Pflanzen, insbesondere aus Solanum tuberosum, und besonders bevorzugt die in Knollen von S. tuberosum ex primierte Form. Derartige Sequenzen sind beispielsweise be schrieben in Salanoubat und Belliard (Gene 60 (1987), 47-56) und verfügbar in der EMBL-Datenbank unter der Zugriffsnummer X67125.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform codiert die Nucleotidsequenz eine Saccharose-Phosphorylase (E.C. 2.4.1.7).

Sequenzen, die Saccharose-Phosphorylase codieren, sind bei spielsweise bekannt aus der WO 96/24679.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform codiert die Nucleotidsequenz eine Invertase (E.C. 3.2.1.26), vorzugs weise eine Invertase aus einem Mikroorganismus, insbesondere einem Pilz der Gattung Saccharomyces, bevorzugt aus S. cerevisiae. Besonders bevorzugt sind dabei Sequenzen, die eine cytosolische Invertase codieren (Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95-106)
Unter einem Saccharose-Transporter wird erfindungsgemäß ein Transporter verstanden, der Saccharose in pflanzlichen Systemen über eine Membran transportiert. Dieser ist vor zugsweise pflanzlich (z. B. EMBL-Genbank Zugriffsnummer G21319). Besondere bevorzugt codiert die unter (b) genannte Sequenz einen Saccharosetransporter aus Spinat (Spinacia oleracea), insbesondere mit der Sequenz des Clons SoSUT1 wie beispielsweise beschrieben in Riesmeier et al. (EMBO J. 11 (1992), 4705-4713)
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Pro tein, das den Protonengradienten an der Plasmamembran stimu liert, eine Protonen-ATPase.

In diesem Fall codiert die unter (b) genannte Sequenz vor zugsweise ein Protein aus einem Mikroorganismus, insbeson dere einem Pilz der Gattung Saccharomyces, bevorzugt aus S. cerevisiae.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform codiert die Sequenz die Protonen ATPase PMA1 aus S. cerevisiae (Serrano et al., Nature 319 (1986), 689-693; EMBL-Genbank) oder eine am 3'-Ende verkürzte Form dieser Protonen-ATPase aus S. cerevisiae, insbesondere die Form APMA1 wie beschrieben in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung.

Alternativ kann die Nucleotidsequenz auch eine Proto nen-ATPase aus Pflanzen codieren, vorzugsweise eine Proto nen-ATPase aus Solanum tuberosum.

Besonders bevorzugt sind dabei Sequenzen die die Proto nen-ATPase PHA2 aus Kartoffel codieren (Harms et al, Plant Mol. Biol. 26 (1994), 979-988; EMBL-Genbank X76535) oder eine am 3'-Ende verkürzte Form dieser Protonen-ATPase aus Kartoffel, insbesondere die Form ΔPHA2 wie beschrieben in Beispiel 4 der vorliegenden Erfindung.

Bei der Citratsynthase kann es sich erfindungsgemäß um jede beliebige Citratsynthase handeln, beispielsweise um solche aus Bakterien, Pilzen, Tieren oder Pflanzen. DNA-Sequenzen, die Citratsynthase codieren sind z. B. von den folgenden Or ganismen bekannt: Bacillus subtilus (U05256 und U05257), E. coli (V01501), R. prowazekii (M17149), P. aeruginosa (M29728), A. anitratum (M33037) (siehe Schendel et al., Appl. Environ. Microbiol. 58 (1992), 335-345 und Referenzen darin), Haloferax volcanii (James et al. Biochem. Soc. Trans. 20 (1992), 12), Arabidopsis thaliana (Z17455) (Unger et al., (1989) Plant Mol. Biol. 13 (1989), 411-418), B. coagulans M74818), c. burnetii (M36338) (Heinzen et al., Gene 109 (1990), 63-69), M. smegmatis (X60513), T. acidophilum (X55282), T. thermophila (D90117), Schwein (M21197) (Bloxham et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78 (1981), 5381-5385), N. crassa (M84187) (Ferea et al., Mol. Gen. Genet. 242 (1994), 105-110), S. cerevisiae (Z11113, Z23259, M14686, M54982, X00782) (Suissa et al., EMBO J. 3 (1984), 1773-1781) und Kartoffel (EP 95 91 3066.7).

Bei den in Klammern angegebenen Nummern handelt es sich je weils um die Zugriffsnummern in der GenEMBL-Datenbank.

Die erfindungsgemäß verwendeten Nucleotidsequenzen können generell entsprechende Proteine aus jedem beliebigen Orga nismus codieren, insbesondere aus Pflanzen, Pilzen, Bakte rien oder Tieren. Vorzugsweise codieren die Sequenzen Pro teine aus Pflanzen oder Pilzen. Als Pflanzen bevorzugt sind dabei höhere Pflanzen, insbesondere stärke- oder ölspei chernde Nutzpflanzen, beispielsweise Kartoffel, oder Getrei dearten, wie z. B. Reis, Mais, Weizen, Gerste, Roggen, Triticale, Hafer, Hirse etc., sowie Spinat, Tabak, Zucker rübe, Soja, Baumwolle usw.

Bei den Pilzen handelt es sich vorzugsweise um solche der Gattung Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Aspergillus oder Neurospora, insbesondere um Saccharomyces cerevisiae, Schizosacharomyces pombe, Aspergillus flavus, Aspergillus niger oder Neurospora crassa.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die unter (a) genannte Region, die eine Ge leitzellen-spezifische Transkription gewährleistet, der Pro motor des rolC-Gens aus Agrobacterium rhizogenes.

Dieser Promotor ist beispielsweise beschrieben in Schmülling et al. (Plant Celle (1989), 665-671) und Kühn (Charakterisie rung und Lokalisation des Saccharosetransporters SUT1 in Solanaceen, Dissertation (1991), Freie Universität Berlin, Fachbereich Biologie). Vorzugsweise wird der Bereich des Promotors verwendet, der die unter Seq ID Nr. 1 angegebene Nucleotidsequenz aufweist.

Neben dem genannten rolC-Promotor ist es jedoch für den Fachmann ohne weiteres möglich, andere Promotoren für eine geleitzellspezifische Expression zu verwenden. So sind in der Literatur weitere geleitzellspezifische Promotoren be schrieben wie z. B. der Promotor des Saccharosetransporters aus Arabidopsis thaliana (Truernit und Sauer, Planta 196 (1995), 564-570.

Des weiteren sind in der Literatur für verschiedene RNAs als auch Proteine spezifische Vorkommen in den Geleitzellen be schrieben (siehe z. B. Foley et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 687-695; DeWitt, Plant J. 1 (1991), 121-128; Stadler et al., Plant Cell 7 (1995), 1545-1554). Ausgehend von einem bekannten Protein ist es für einen Fachmann ohne Probleme möglich, mittels Antikörper oder unter Verwendung von aus der Aminosäuresequenz abgeleiteten Oligonucleotiden die cDNA zu isolieren (vgl. z. B. Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Cold Spring Harbor, NY.). Ausgehend von den so er haltenen cDNAs ist es weiterhin möglich, aus dem jeweiligen Organismus angelegte genomische Banken zu durchmustern und genomische Fragmente zu identifizieren. Durch Vergleich der Nucleotidsequenz der cDNA und des genomischen Clones kann ein erster Einblick in die Lage des Promotors erhalten wer den. Die Spezifität des Promotors kann sodann in einer transgenen Situation unter Verwendung von chimären Genen be stehend aus dem Promotor und Indikatorgenen, wie z. B. der β-Glu curonidase verifiziert werden (vgl. z. B. Kertbundit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 5212-5216).

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich prinzipiell auf alle beliebigen Pflanzen anwenden. In Betracht kommen daher insbesondere monokotyle als auch dikotyle Pflanzenarten. Be vorzugt wird das Verfahren bei Pflanzen mit landwirtschaft lichem, gartenwirtschaftlichem und/oder forstwirtschaftli chem Interesse angewendet.

Beispiele hierfür sind Gemüsepflanzen, wie z. B. Gurke, Me lone, Kürbis, Aubergine, Zucchini, Tomate, Spinat, Kohlar ten, Erbsen, Bohnen, etc., sowie Obstarten, wie z. B. Birnen, Äpfel, usw.

In Betracht kommen ferner ölspeichernde Pflanzen, wie z. B. Raps, Sonnenblume, Soja, sowie in einer besonders bevorzug ten Ausführungsform stärkespeichernde Pflanzen, wie insbe sondere Getreidearten (Reis, Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Hirse, Gerste), Kartoffel, Maniok, Süßkartoffel etc.

Das Verfahren kann ebenfalls angewendet werden bei Saccha rose-speichernden Pflanzen, wie z. B. Zuckerrübe und Zucker rohr, aber auch bei anderen Nutzpflanzen, wie beispielsweise Baumwolle, Tabak, Holzarten, Wein, Hopfen usw.

Weiterhin betrifft die Erfindung rekombinante Nucleinsäure moleküle, enthaltend

(a) eine Region, die die Transkription spezifisch in den Ge leitzellen von Pflanzen erlaubt; und in operativer Ver knüpfung damit
(b) eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, aus gewählt aus der Gruppe bestehend aus
- (i) Saccharose-Synthasen;
- (ii) Saccharose-Phosphorylasen;
- (iii) Saccharose-Transportern;
- (iv) Proteine, deren Aktivität zur Stimulierung des Protonengradienten an der Plasmamembran pflanzli cher Zellen führt, und
- (v) Citratsynthasen.

Hinsichtlich der bevorzugten Ausführungsformen derartiger Moleküle trifft für die unter (a) genannte Region und die unter (b) genannte Nucleotidsequenz dasselbe zu, was bereits oben im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ge sagt wurde.

Die Erfindung betrifft auch Vektoren, die erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle enthalten, insbesondere solche, die zur Transformation pflanzlicher Zellen geeignet sind sowie zur Integration von Fremd-DNA in das pflanzliche Genom.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Pflanzenzellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül trans formiert sind und dieses stabil im Genom integriert enthal ten. Diese Zellen unterscheiden sich von natürlicherweise auftretenden Pflanzenzellen beispielsweise dadurch, daß ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül an einer Stelle in dem Genom der Zelle integriert ist, in der es natürlicherweise nicht vorkommt.

Die Erfindung betrifft auch transgene Pflanzen, die erfin dungsgemäße Pflanzenzellen enthalten und die aufgrund der Expression des in dem Genom integrierten rekombinanten Nucleinsäuremoleküls in den Geleitzellen der Pflanzen eine Steigerung des Ertrages aufweisen im Vergleich zu entspre chenden nicht-transformierten Pflanzen, die unter gleichen Bedingungen kultiviert wurden.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Vermehrungsmate rial von erfindungsgemäßen Pflanzen enthaltend die oben be schriebenen erfindungsgemäßen Pflanzenzellen. Der Begriff "Vermehrungsmaterial" umfaßt dabei insbesondere Samen, Früchte, Knollen, Rhizome, Stecklinge, Calli, Zellkulturen etc.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwen dung von rekombinanten Nucleinsäuremolekülen enthaltend eine Region, die die Transkription spezifisch in den Geleitzellen von Pflanzen erlaubt und, in operativer Verknüpfung damit, eine Nucleotidsequenz codierend ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(i) Proteinen mit Saccharose-spaltender enzymatischer Ak tivität;
(ii) Saccharose-Transportern;
(iii) Proteinen, deren Aktivität zur Stimulation des Proto nengradienten an der Plasmamembran führt; und
(iv) Citratsynthasen

zur Expression in transgenen Pflanzen zur Steigerung des Er trages.

Bei den codierten Proteinen handelt es sich vorzugsweise um die im vorangehenden näher beschriebenen Proteine.

Verfahren zur Transformation monokotyler und dikotyler Pflanzen sind dem Fachmann bekannt.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzen zellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden.

Die Verwendung von Agrobakterien für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in der EP-A 120 516, in Hoekema (In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Chapter V) Fraley et al. (Crit. Rev. Plant. Sci. 4, 1-46) und An et al. (EMBO J. 4 (1985), 277-287) beschrieben wor den.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflan zen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert wer den. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Sus pensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Se lektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen kön nen dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA un ter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Pro toplastentransformation sind bekannt (vgl. z. B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Vo lume Comprehensive Treatise (H. J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).

Die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid-Vek torsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens ist wohl etabliert. Neuere Arbeiten weisen darauf hin, daß auch mono kotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium ba sierender Vektoren zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282; Deng et al., Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11 (1992), 76-80; May et al., Bio/Technology 13 (1995), 486-492; Conner und Domisse; Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al., Transgenic Res. 2 (1993), 252-265).
Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24 (1994), 317-325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631), die Protoplasten transformation, die Elektroporation von partiell permeabili sierten Zellen, sowie die Einbringung von DNA mittels Glas fasern.

Insbesondere die Transformation von Mais wird in der Litera tur verschiedentlich beschrieben (vgl. z. B. WO 95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875; Fromm et al., Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200) In EP 292 435 und in Shillito et al. (Bio/Technology 7 (1989), 581) wird ein Verfahren beschrieben, mit Hilfe des sen, ausgehend von einem schleimlosen, weichen (friable) granulösen Mais-Kallus, fertile Pflanzen erhalten werden können.

Prioli und Söndahl (Bio/Technology 7 (1989), 589) beschrei ben die Regeneration und die Gewinnung fertiler Pflanzen aus Mais-Protoplasten der Cateto Mais-Inzuchtlinie Cat 100-1.

Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben, z. B. für Gerste (Wan und Lemaux, s.o.; Ritala et al., s. o.) und für Weizen (Nehra et al., Plant J. 5 (1994), 285-297)
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektions marker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz ge genüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. ver mittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen. Von den Pflanzen können Samen gewonnen werden.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Fig. 1 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pBinRolC-SS.

Fig. 2a zeigt die Analyse der Saccharose-Synthase (55)-Ak tivität in Blättern transgener Kartoffelpflanzen, die mit dem RolC-SS-Konstrukt transformiert worden waren. Die Enzymaktivität wurde nach Zrenner et al., Plant J. 7 (1995), 97-107) bestimmt. Die Aktivität ist angegeben in µmol Hexose-Äquivalen te/(min × g Frischgewicht) Die Säulen stellen Durchschnittswerte von 3 Proben pro Genotyp dar. Die Standardabweichung ist eben falls angegeben.

Fig. 2b zeigt die Analyse des Knollenertrages von trans genen Kartoffelpflanzen, die mit dem RolC-SS-Kon strukt transformiert worden waren. Die Säulen stellen Durchschnittswerte von 10-15 Pflanzen pro Genotyp dar. Die Standardabweichung ist ebenfalls angegeben. Der Knollenertrag ist angegeben in g Frischgewicht

Fig. 2c zeigt die Analyse der Knollenstärke von transgenen Kartoffelpflanzen, die mit dem RolC-SS-Konstrukt transformiert worden waren. Dazu wurde die Knol lenernte von 10-15 Pflanzen pro Genotyp zusammen gefaßt und der Stärkegehalt der Knollen nach Von Schéele et al. (Landw. Vers. Sta. 127 (1937), 67- 96) bestimmt.

Fig. 3 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pBinRolC-Suc2.

Fig. 4 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pBinRolC-ΔPMA1.

Fig. 5 zeigt schematisch die Clonierungsstrategie von ΔPMA1.

Schritt von A nach B

Über PCR mit der cDNA-PMAI als Matritze und kom plementären internen Primern wurde die am 3'-Ende verkürzte H⁺-ATPase ΔPMA1 amplifiziert (A). Die flankierenden Restriktionsschnittstellen des PCR-Pro dukts (B) wurden durch die entsprechend synthe tisierten Primer eingeführt.

Schritt von B nach C

PstI/NotI Verdau und Clonierung des PCR-Fragments in den E. coli Vektor SK- über PstI/NotI Schnitt stellen (C)

Schritt von C nach D

BclI/SpeI Verdau des Plasmids SK-ΔPMA1 und Clonie rung des Fragments in die kompatiblen BamHI/XbaI Schnittstellen des pBinRolC (D)

Fig. 6 stellt die Ergebnisse der Polymerase-Ketten-Reak tion mit spezifischen Oligonucleotiden als Nach weis der stabilen Integration von ΔPMA1 im Genom von transgenen Pflanzen dar, die durch Transforma tion mit dem rolC-ΔPMA1-Konstrukt gewonnen worden waren. PCR-Produktgröße = 730 bp; WT = Wildtyp; M = Marker.

Fig. 7 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pBinRolC-ΔPHA2.

Fig. 8 zeigt schematisch die Clonierungsstrategie von ΔPHA2.

Schritt von A nach B

Über PCR mit der cDNA-PHA2 als Matrize und komple mentären internen Primern wurde die am 3'-Ende verkürzte H⁺-ATPase ΔPHA2 amplifiziert (A). Die flankierenden Restriktionsschnittstellen des PCR-Pro dukts (B) wurden durch die entsprechend synthe tisierten Primer eingeführt.

Schritt von B nach C

PstI/EcoRI Verdau und Clonierung des PCR-Fragments in den E. coli Vektor SK- über PstI/EcoRI Schnitt stellen (C)

Schritt von C nach D

BglII/SpeI Verdau des Plasmids SK-ΔPHA2 und Clo nierung des Fragments in die kompatiblen BamHI/XbaI Schnittstellen des pBinRolC (D)

Fig. 9 zeigt die Ergebnisse der Polymerase-Ketten-Reak tion mit spezifischen Oligonucleotiden als Nach weis der stabilen Integration von ΔPHA2 im Genom von transgenen Pflanzen, die durch Transformation mit dem rolC-ΔPHA2-Konstrukt gewonnen worden wa ren. PCR-Produktgröße = 758 bp; WT = Wildtyp; M = Marker.

Fig. 10 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pBinRolC-SoSUT1.

Fig. 11 zeigt schematisch die Konstruktion des Plasmids pBinRolC-CiSy.

Fig. 12 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung des Saccharo segehaltes in parenchymatischen und mit vasculärem Gewebe angereicherten Proben von Knollen gepfropf ter Kartoffelpflanzen. Zur Pfropfung verwendete Genotypen sind die Linien RolC-Suc2-#25 (cytosoli sche Invertase) und Wildtyp Solanum tuberosum var. Desiree. Der Saccharosegehalt wurde nach Stitt et al. (Methods Enzymol. 174 (1989), 518-522) be stimmt. Die Säulen stellen Durchschnittswerte von 12 Proben pro Pfropfungstyp dar. Die Standardab weichung ist angegeben. Der Saccharosegehalt ist angegeben als µmol Hexose-Äquivalente/g Frisch gewicht.

Fig. 13 zeigt die Analyse von Phloem-Exudaten von ΔPMA1-Blät tern, die im Licht für 6 Stunden in einer 14CO₂-Atmosphäre gehalten wurden. Der Saccharose gehalt wurde nach Stitt et al. (a.a.O.) bestimmt. Die Säulen stellen Durchschnittswerte von vier bis fünf Proben pro Genotyp dar. Die Standardabwei chung ist angegeben.

Fig. 14 zeigt den Knollenertrag (in Gramm Frischgewicht) von ΔPMA1-Pflanzen. Die Säulen stellen Durch schnittswerte von sechs Pflanzen pro Genotyp dar. Die Standardabweichung ist angegeben. Der Knollen ertrag ist angegeben in g Frischgewicht.

Fig. 15 zeigt den Knollenertrag (in Gramm Frischgewicht) von ΔPHA2-Pflanzen. Die Säulen stellen Durch schnittswerte von vier bis fünf Pflanzen pro Geno typ dar. Die Standardabweichung ist angegeben. Der Knollenertrag ist angegeben in g Frischgewicht.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung des Plasmids pBinRolc-SS und Herstellung trans gener Kartoffelpflanzen

Das Plasmid pBinRolC-SS enthält die drei Fragmente A, B und C im binären Vektor pBin19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711) (vgl. Fig. 1)
Das Fragment A umfaßt den rolC-Promotor aus Agrobacterium rhizogenes. Der rolC-Promotor enthält als EcoRI/Asp718 DNA-Frag ment von 1138 bp (Lerchl et al., Plant Cell 7 (1995), 259-270) die DNA-Region (Position: 11306 bis Position 12432) der TL-DNA des Ri-Agropin-Typ-Plasmids von A. rhizogenes (Slightom et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 108-121). Das Fragment A ist in die Schnittstellen EcoRI und Asp718 des Polylinkers von pBin19 insertiert.

Das Fragment B enthält die codierende Region (Position: 76 bis Position 2493) der cDNA der Saccharose-Synthase (SS) aus Solanum tuberosum (Salanoubat und Belliard, Gene 60 (1987), 47-56). Das Fragment B wurde als BamHI-Fragment von 2427 bp aus dem Vektor pBluescript SK erhalten, in welchem es in der BamHI-Schnittstelle des Polylinkers insertiert ist. Das Fragment B wurde in den Vektor pBin19 in die BamHI-Schnitt stelle in Sinnorientierung insertiert, d. h. stromabwärts des rolC-Promotors in einer Orientierung, die die Transkription einer translatierbaren RNA ermöglicht.

Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTi ACH 5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846), insbesondere die Nucleotide 11749- 11939, welches als PvuII/HindIII-Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera-Estrella et al., Nature 303 (1983), 209- 213) isoliert worden ist und nach Addition von SphI-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SphI- und die HindIII-Schnittstelle des Polylinkers von pBin19 cloniert worden ist.

Das resultierende Plasmid pBinRolC-SS wurde über den Agro bacterium tumefaciens vermittelten Gentransfer in Kartoffel pflanzenzellen eingeführt. Dazu wurden zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffelsterilkultur (Solanum tuberosum L. cv.) Desiree) in 10 ml MS-Medium (Murashige und Skoog, Physiol. Plant. 15 (1962), 473 mit 2% Saccharose gelegt, welches 50 µl einer unter Selektion ge wachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5-minütigem, leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für zwei Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallus-Induktion auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Ben zylaminopurin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8 % Bacto-Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Me dium mit 1,6% Glucose, 1,4 mg/l Zeatinribose, 20 µg/l Naphthylessigsäure, 20 µg/l Giberellinsäure, 250 mg/l Clafo ran, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar gelegt.

Die Analyse der Blätter einer Reihe von mit diesem Vektor system transformierten Pflanzen, zeigte eindeutig das Vor kommen einer erhöhten Saccharose-Synthase-Aktivität. Dies ist auf die Expression des in pBinRolC-SS enthaltenen Saccharose-Synthasegens aus Kartoffel zurückzuführen (vgl. Fig. 2a).

Die Analyse des Knollenertrages (Knollen-Frischgewicht in Gramm) von mit diesem Vektorsystem transformierten Pflanzen, die eine erhöhte Saccharose-Synthase-Aktivität aufweisen, ergab eindeutig eine Erhöhung des Knollenertrages. Dies ist ebenfalls auf die Expression des in pBinRolC-SS enthaltenen Saccharose-Synthasegens aus Kartoffel zurückzuführen (vgl. Fig. 2b).

Der Stärkegehalt von Kartoffelknollen ist linear von der Dichte der Knollen abhängig (von Scheele et al., Landw. Vers. Sta. 127 (1937), 67-96). Überraschenderweise zeigte die Analyse der Dichte von transgenen Knollen, der mit dem Vektorsystem pBinRolC-SS transformierten Pflanzen, welche eine erhöhte Saccharose-Synthase-Aktivität aufweisen, eine Erhöhung des Stärkegehaltes. Dieses ist auf die Expression des in pBinRolC-SS enthaltenen Saccharose-Synthasegens aus Kartoffel zurückzuführen (vgl. Fig. 2c).

Beispiel 2 Herstellung des Plasmids pBinRolC-Suc2 und Herstellung transgener Kartoffelpflanzen

Das Plasmid pBinRolC-Suc2 enthält die drei Fragmente A, B und C im binären Vektor pBin19 (Bevan, loc cit.) und ist in Fig. 3 dargestellt.

Die Fragmente A und C entsprechen den Fragmenten A und C, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Das Fragment B enthält die codierende Region (Position: 845 bis Position: 2384) des Gens der cytosolischen Invertase aus Hefe (Saccharomyces cerevisiae). Das Fragment B wurde als BamHI-Fragment mit einer Länge von 1548 bp aus dem Vektor pBluescript SK erhalten, in dem es in die Schnittstelle BamHI des Polylinkers insertiert ist. Das Fragment B ist im pBin19 in die BamHI-Schnittstelle in Sinnorientierung inser tiert.

Das Plasmid pBinRolC-Suc2 wurde über den Agrobacterium ver mittelten Gentransfer in Kartoffelpflanzenzellen eingeführt. Aus transformierten Zellen wurden intakte Pflanzen regene riert.

Derartige Pflanzen zeigen im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen einen erhöhten Ertrag (Steigerung der Biomasse)

Beispiel 3 Herstellung des Plasmids pBinRolC-ΔPMA1 und Herstellung transgener Kartoffepflanzen

Das Plasmid pBinRolC-ΔPMA1 enthält die drei Fragmente A, B und C im binären Vektor pBin19 (Bevan, loc cit.) und ist in Fig. 4 schematisch dargestellt.

Die Fragmente A und C entsprechen den Fragmenten A und C wie in Beispiel 1 beschrieben.

Das Fragment B enthält die codierende Region (Position: 937 bis Position: 3666) des Gens der Protonen-ATPase PMA1 aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae (Serrano et al., Nature 319 (1986), 689-693). Das Fragment B wurde mittels Polyme rase-Ketten-Reaktion (PCR) erhalten. Dabei wurde absichtlich das 3'-Ende der codierenden Region des Gens PMA1 um 27 bp verkürzt und gleichzeitig ein notwendiges neues Stopcodon eingeführt. Dieses so modifizierte DNA-Fragment wurde ΔPMA1 genannt. Das Fragment B wurde als BclI/Spel-Fragment mit einer Länge von 2739 bp in die Schnittstellen BamHI (kompa tible Insertionsstelle für BclI-Schnittenden) und XbaI (kom patible Insertionsstelle für SpeI-Schnittenden) des Vektors pBin19 in Sinnorientierung insertiert.

Das Fragment B als BcII/SpeI-Fragment wurde aus dem Vektor pBluescript SK erhalten, in dem es über die Schnittstellen NotI und PstI des Polylinkers insertiert ist (vgl. Fig. 5) Das Plasmid pBinRolC-ΔPMA1 wurde über den Agrobacterium ver mittelten Gentransfer in Kartoffelpflanzenzellen eingeführt. Aus transformierten Zellen wurden intakte Pflanzen regene riert.

Die stabile Integration von ΔPMA1 im Genom transgener Pflan zen, die unter Einsatz des Vektorsystems pBinRolC-ΔPMA1 ge wonnen worden waren, wurde mittels Polymerase-Ketten-Reak tion (PCR) nachgewiesen (vgl. Fig. 6).

Die transformierten Pflanzen zeigen im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen einen erhöhten Ertrag (Steigerung der Biomasse) (siehe Fig. 13 und 14).

Beispiel 4 Herstellung des Plasmids pBinRolC- ΔPHA2 und Herstellung transgener Kartoffelpflanzen

Das Plasmid pBinRolC-ΔPHA2 enthält die drei Fragmente A, B und C im binären Vektor pBin19 (Bevan, Ioc cit.) und ist in Fig. 7 schematisch dargestellt.

Das Fragment B enthält die codierende Region (Position: 64 bis Position: 2672) der cDNA der Protonen-ATPase PHA2 (Harms et al., Plant Mol. Biol. 26 (1994), 979-988). Das Fragment B wurde mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) erhalten. Da bei wurde absichtlich das 3'-Ende der codierenden Region des Gens PHA2 um 249 bp verkürzt und gleichzeitig zwei neue Stopcodons eingeführt. Dieses so modifizierte DNA-Fragment wurde ΔPHA2 genannt. Das Fragment B wurde als BglII/SpeI- Fragment mit einer Länge von 2631 bp in die Schnittstellen BamHI (kompatible Insertionsstelle für BgIII-Schnittenden) und XbaI (kompatible Insertionsstelle für SpeI-Schnittenden) des Vektors pBin19 in Sinnorientierung insertiert.

Das Fragment B wurde als BgIII/SpeI. Fragment aus dem Vektor pBluescript SKI erhalten, in dem es in die EcoRI- und PstI-Schnitt stellen der Polylinker Sequenz insertiert ist (vgl. Fig. 8: Clonierungsstrategie-ΔPHA2).

Das Plasmid pBinRolC-ΔPHA2 wurde über den Agrobacterium ver mittelten Gentransfer in Kartoffelpflanzenzellen eingeführt. Aus transformierten Zellen wurden intakte Pflanzen regene riert.

Die stabile Integration von ΔPHA2 im Genom transgener Pflan zen, die unter Einsatz des Vektorsystems pBinRolC- ΔPHA2 ge wonnen wurden, wurde mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) nachgewiesen (vgl. Fig. 9).

Die transformierten Pflanzen zeigen im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen einen erhöhten Ertrag (Steigerung der Biomasse) (siehe Fig. 15).

Beispiel 5 Herstellung des Plasmids pBinRolC-SoSUT1 und Herstellung transgener Kartoffelpflanzen

Das Plasmid pBinRolC-SoSUT1 enthält die drei Fragmente A, B und C im binären Vektor pBin19 (Bevan, loc cit.) und ist schematisch in Fig. 10 dargestellt.

Das Fragment B enthält die cDNA (Position: 1 bis Position: 1969), die einen Saccharosetransporter aus Spinat (Spinacia oleracea) codiert (Riesmeier et al., EMBO J. 11 (1992), 4705-4713; Zugriffsnummern X67125 and 551273). Das Fragment B wurde als NotI-Fragment aus dem Vektor pBluescript SKI er halten, in dem es über eine NotI-Linker-Sequenz insertiert ist. Zur Clonierung in die SmaI-Schnittstelle des Vektors pBin19 wurden die NotI-Schnittenden des Fragments in glatte Enden überführt und in Sinnorientierung in den pBin19 inser tiert. Das resultierende Plasmid wurde pBinRolC-SoSUT1 ge nannt.

Es wurde über den Agrobacterium vermittelten Gentransfer in Kartoffelpflanzenzellen eingeführt. Aus transformierten Zel len wurden intakte Pflanzen regeneriert.

Derartige transformierte Pflanzen zeigen im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen einen erhöhten Ertrag (Stei gerung der Biomasse)

Beispiel 6 Herstellung des Plasmids pBinRolc-CiSy und Herstellung transgener Kartoffelpflanzen

Das Plasmid pBinRolC-CiSy enthält die drei Fragmente A, B und C im binären Vektor pBin19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711) modifiziert nach Becker, Nucl. Acids Res. 18 (1990) 203 (vgl. Fig. 11).

Das Fragment A umfaßt den rolC-Promotor aus Agrobacterium rhizogenes. Der rolC-Promotor enthält als EcoRI/Asp718 DNA-Frag ment von 1143 bp (Lerchl et al., The Plant Cell 7 (1995), 259-270) die DNA-Region (Position: 11306 bis Posi tion 12432) der TL-DNA des Ri-Agropin-Typ-Plasmids von A. rhizogenes (Slightom et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 108- 121). Das Fragment A ist in die Schnittstellen EcoRI und Asp718 des Polylinkers von pBin19 insertiert.

Das Fragment B enthält die codierende Region der cDNA der Citrat-Synthase (CiSy) aus der Sproßhefe Saccharomyces cerevisiae. Das Fragment B wurde als BamHI-Fragment von 1400 bp aus dem Vektor pBluescript SK- erhalten, in welchem es in der BamHI-Schnittstelle des Polylinkers insertiert ist (Landschütze, Untersuchungen zur Beeinflussung der Acetyl- CoA-Synthese und Verwendung in transgenen Pflanzen, Disser tation, Freie Universität Berlin, (1985) D83/FB15 Nr. 028). Das Fragment C enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH 5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846), Nucleotide 11749-11939, welches als PvuII/HindIII-Fragment aus dem Plasmid pAGV 40 (Herrera- Estrella et al., Nature 303 (1983), 209-213) isoliert worden ist und nach Addition von SphI-Linkern an die PvuII-Schnitt stelle zwischen die SphI- und die HindIII-Schnittstelle des Polylinkers von pBin19 cloniert worden ist.

Das Plasmid pBinRolC-CiSy hat eine Größe von ca. 13 kb. Das Plasmid pBinRolC-CiSy wurde über den Agrobacterium tumefaciens vermittelten Gentransfer in Kartoffelpflanzen eingeführt. Aus transformierten Zellen wurden intakte Pflan zen regeneriert.

Die Analyse einer Reihe von mit diesem Vektorsystem trans formierten Pflanzen, zeigte eindeutig eine Erhöhung der Bio masse, was auf die Expression der in pBinRolC-CiSy enthalte nen CiSy-cDNA aus Hefe zurückzuführen ist.

Beispiel 7 Pfropfungsexperiment

Beim Pfropfen ("Grafting") wird der Sproß einer Empfänger pflanze durch den einer Donorpflanze ersetzt.

In dem hier beschriebenen Experiment wird der Sproß einer transgenen Pflanze (RolC-Suc2 #25) auf die Basis einer Wild typ-Pflanze (Solanum tuberosum, var. Desiree) gepfropft. Als Kontrolle um experimentell bedingte Kultivierungsunter schiede auszuschließen, wird ein Wildtypsproß auf eine Wild typbasis gepfropft (Autopfropfung). Ziel des Versuchs ist, den alleinigen Einfluß der Photosyntheseleistung und Pho toassimilatverteilung eines transgenen Sprosses auf Organe (in diesem Fall Knollen) einer Wildtyppflanzenbasis zu un tersuchen.

Kartoffelpflanzen werden aus Gewebekultur in Erde gepflanzt und ins Gewächshaus überführt. Nach ca. 5 Wochen (Pflanzen haben in diesem Stadium noch keine Knollenbildung induziert) werden die Pflanzen gepfropft. Dazu wird der nicht ge brauchte Sproß der Empfängerpflanze abgeschnitten und der Stamm der Empfängerpflanze keilförmig eingeschnitten. Der auf zupfropfende Donorsproß wird am Stammende dementsprechend zurechtgeschnitten und in den Keil der Empfängerpflanze ein gesetzt. Die Pfropfungsstelle wird mit Klebeband fixiert. Anschließend werden die gepfropften Kartoffelpflanzen für ca. eine Woche unter erhöhter Luftfeuchtigkeit und schatti gen Bedingungen gehalten. Danach werden sie, innerhalb von 7-10 Tagen, schrittweise an normale Gewächshausbedingungen adaptiert. Die Pflanzen sind dann ca. 7 Wochen alt.

Alle Blätter der Basispflanze werden nun entfernt und der Stamm derselben mit Alufolie abgedunkelt, um zu gewährlei sten, daß im weiteren nur die Photosyntheseleistung und Pho toassimilatverteilung des Donorsprosses die Basis der gepfropften Pflanze versorgt.

Bis zur Ernte der Kartoffelknollen, ca. 2 Monate nach der Pfropfung bzw. ca. 3 Monate nach der Pflanzung in Erde, ver bleiben die Pflanzen im Gewächshaus. Die Ergebnisse eines solchen Pfropfungsexperiments sind in Fig. 12 dargestellt.

Sequenzprotokoll

Claims

1. Verfahren zur Steigerung des Ertrages bei Pflanzen, da durch gekennzeichnet, daß in Pflanzen stabil im Genom integrierte rekombinante DNA-Moleküle exprimiert werden, enthaltend

(a) eine Region, die die Transkription spezifisch in den Geleitzellen von Pflanzen erlaubt; und in operativer Verknüpfung damit
(b) eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
- (i) Protonen mit Saccharose-spaltender enzymati scher Aktivität;
- (ii) Saccharose-Transportern;
- (iii) Proteinen, deren Aktivität zur Stimulation des Protonengradienten an der Plasmamembran pflanzlicher Zellen führt; und
- (iv) Citratsynthasen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz ein pflanzliches Protein codiert.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz ein Protein aus einem Bakterium oder einem Pilz codiert.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz ein Protein mit Saccharose-spaltender enzymatischer Ak tivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Saccharose-Synthasen, Saccharose-Phosphorylasen und In vertasen.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz einen Saccharosetransporter aus Spinacia oleracea co diert.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz eine Protonen-ATPase codiert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Nucleotidsequenz eine Protonen-ATPase aus Solanum tuberosum oder aus Saccharomyces cerevisia codiert.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die unter (a) genannte Region der rolC-Promotor aus Agrobac terium rhizogenes ist.

9. Rekombinantes Nucleinsäuremolekül enthaltend

(a) eine Region, die die Transkription spezifisch in den Geleitzellen von Pflanzen erlaubt; und in operativer Verknüpfung damit
(b) eine Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
- (i) Sacharose-Synthasen;
- (ii) Saccharose-Phosphorylasen;
- (iii) Saccharose-Transportern;
- (iv) Proteinen, deren Aktivität zur Stimulation des Protonengradienten an der Plasmamembran pflanzlicher Zellen führt; und
- (v) Citratsynthasen.

10. Vektor, enthaltend ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül nach Anspruche 9.

11. Vektor nach Anspruch 10, der zur Transformation pflanz licher Zellen geeignet ist und zur Integration von Fremd-DNA in das pflanzliche Genom.

12. Pflanzenzelle transformiert mit und enthaltend ein re kombinantes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 9.

13. Pflanze, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 12, wo bei die Pflanze aufgrund der Expression des rekombinan ten Nucleinsäuremoleküls in den Geleitzellen der Pflan zen eine Steigerung des Ertrages im Vergleich zu einer entsprechenden nicht-transformierten Pflanze aufweist.

14. Vermehrungsmaterial einer Pflanze nach Anspruch 13, ent haltend Pflanzenzellen nach Anspruch 12.

15. Verwendung eines rekombinanten Nucleinsäuremoleküls ent haltend eine Region, die die Transkription spezifisch in den Geleitzellen von Pflanzen erlaubt und, in operativer Verknüpfung damit, eine Nucleotidsequenz, die ein Poly peptid codiert ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(i) Proteinen mit Saccharose-spaltender enzymatischer Aktivität;
(ii) Saccharose-Transportern;
(iii) Proteinen, deren Aktivität zur Stimulation des Protonengradienten an der Plasmamembran führt; und
(iv) Citratsynthasen, zur Expression in transgenen Pflanzen zur Steigerung des Ertrages.