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WO1999041391A1 - Promoteur inductible dans les plantes, sequence incorporant ce promoteur et produit obtenu - Google Patents

Promoteur inductible dans les plantes, sequence incorporant ce promoteur et produit obtenu Download PDF

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Publication number
WO1999041391A1
WO1999041391A1 PCT/FR1999/000315 FR9900315W WO9941391A1 WO 1999041391 A1 WO1999041391 A1 WO 1999041391A1 FR 9900315 W FR9900315 W FR 9900315W WO 9941391 A1 WO9941391 A1 WO 9941391A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
promoter
sequence
plants
plant
Prior art date
Application number
PCT/FR1999/000315
Other languages
English (en)
Inventor
Robert Esnault
Dominique Buffard
Colette Breda
Pierre Coutos-Thevenot
Michel Boulay
Original Assignee
Champagne Moet & Chandon
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Champagne Moet & Chandon filed Critical Champagne Moet & Chandon
Priority to JP2000531572A priority Critical patent/JP2002508938A/ja
Priority to EP99903741A priority patent/EP1053336A1/fr
Priority to CA002320420A priority patent/CA2320420A1/fr
Priority to BR9907853-8A priority patent/BR9907853A/pt
Priority to AU24291/99A priority patent/AU2429199A/en
Priority to US09/622,260 priority patent/US6677505B1/en
Publication of WO1999041391A1 publication Critical patent/WO1999041391A1/fr

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
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    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
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    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8239—Externally regulated expression systems pathogen inducible

Definitions

  • the present invention relates to a set of plant promoters inducible by biotic or abiotic stresses, in particular by pathogens, their use, expression vectors comprising said promoters and a gene of interest, cells and / or plants transformed by said said vectors.
  • the invention also relates to methods for obtaining said cells or plants, said transformed plants having improved resistance to said pathogens.
  • Botryti ⁇ cinera gray rot agent that attacks berries at harvest and leads to bad tastes in wines
  • reduced production for example leaf diseases such as Downy mildew and Oidium, attacks of Botrytis on flowers or Knotwort disease linked to the presence of the virus GFLV, Grape Fan Leaf Virus
  • wood diseases such as eutypiosis or esca syndrome
  • the present invention relates to a nucleic acid sequence chosen from the group comprising: a) the IND SI sequence, b) any sequence corresponding to a fragment of the IND SI sequence and having promoter sequence effect in plants.
  • the invention also relates to the promoters in plants, chosen from the group comprising: a) the PMs PR10-1 promoter corresponding to the IND SI sequence, b) a PMs PR10-1 type promoter corresponding to a sequence according to the invention .
  • said promoters of the PMs PR10-1 type which have at least 80% homology with the IND SI sequence. Particularly preferred are those which have at least 90% or 95% homology with said sequence.
  • the promoter sequences in plants characterized in that they comprise at least one sequence identical to those of the promoters mentioned above, are also included in the present invention.
  • the object of the invention relates very particularly to the use of promoters according to the invention, for the expression, specific or not tissues, of a gene in an inducible manner in plants, by biotic or abiotic stress.
  • biotic stresses caused by the attack of a parasite such as a virus, bacteria, yeast or fungus are particularly preferred.
  • abiotic stresses caused by a mechanical injury, such as that caused in particular by an insect or by a physical phenomenon such as wind or frost.
  • the promoters or promoter sequences according to the invention can be used for the production of expression systems in plants, systems which may be inducible and / or constitutive depending on the transformed tissues or organs of the plant (cf. Examples 2, 3 and 4).
  • promoters were obtained from the regulatory sequences of PR protein genes in alfalfa.
  • the incompatible response obtained in the host-parasite relationship between alfalfa (Medicago sa tiva) and Pseudomonas syringae pv pî ⁇ i was used to study the promoter responsible for this reaction.
  • the plant material was therefore removed after the bacterial attack in order to constitute a bank of cDNA from the messenger RNAs produced in the infected areas and in the vicinity of the necrosis.
  • Amplification by polymerase chain reaction (PCR) using synthetic polynucleotides corresponding to conserved motifs of PR genes from legume proteins, made it possible to obtain a radioactive probe which was then used to select transcripts from the library.
  • cDNA was chosen because, after sequencing, it presented a good homology with equivalent genes coding for PR proteins known for other plants (cf. Figures 1 and Ibis representing the diagram general of the promoter's isolation method).
  • Ms PR10-1 Medicago sa tiva PR protein class
  • the present invention also relates to systems for expression of a gene in plants and characterized in that they comprise at least the sequence of said gene under the control of a promoter or of a sequence according to the invention.
  • the expression vectors and in particular the expression vectors of plasmid type are preferred.
  • said expression vectors are characterized in that they can be transferred into strains of Agrobacterium.
  • the subject of the invention is also a system or vector for expression of a gene in plants according to the invention, characterized in that it is inducible in plants by biotic or abiotic stress, preferably biotic stress or abiotics such as those described above.
  • the invention further relates to the systems or vectors according to the invention, characterized in that said gene is a gene of interest.
  • a gene is considered a gene of interest if its modulation can be desired or used in any kind of industry, including agriculture. In addition to the agriculture already mentioned, we will think of industries such as for example the food industry, the cosmetic industry, the pharmaceutical industry, the chemical industry, etc. This list of examples is of course not limiting.
  • the gene could therefore be for example a gene of agronomic interest or a gene allowing the plant to produce substances of interest for nutrition or human or animal health.
  • genes of agronomic interest one understands, for example, any gene whose expression makes it possible to modulate the physiology of the plant, such as in particular the inhibition, the slowing down, the acceleration or the triggering of stages or phenomena occurring at a given period in the life of the plant, or any gene whose expression makes it possible to improve or decrease the resistance of the plant to physical, chemical or biological aggressions.
  • genes of interest allowing the plant to produce substances of interest for nutrition or human or animal health, we mean for example the genes coding for pharmaceutical, enzymatic compounds (which can be used for biosynthesis or biodegradation of organic compounds) or with nutritional value, or genes making it possible to modulate or inhibit the expression of pharmaceutical, nutritive, toxic or flavoring compounds.
  • the invention comprises in particular the systems or vectors according to the invention, characterized in that said gene of interest is a gene involved in the response to biotic or abiotic stress, preferably in the response to inducing biotic or abiotic stress.
  • the invention relates to the systems or vectors according to the invention, characterized in that the biotic stress is the attack on a parasite and the gene of interest a gene for resistance to said parasite.
  • the invention comprises the systems or vectors according to the invention, characterized in that the parasite is a virus, a bacteria, a yeast or a fungus, and the gene of interest is a gene involved in the synthesis of anti-pathogenic molecule, preferably a gene involved in the synthesis of phytoalexins or PR.
  • constructs allowing the expression of these genes may of course comprise, in addition to the gene of interest, sequences in particular of polyadenylation at the 3 ′ end of the coding strand, as well as “enhancer” sequences of said gene or of a gene. different.
  • genes of interest which can be expressed by the constructs according to the present invention, mention should be made of the genes which can be placed under the control of the promoter PMs PR10-1 in order to trigger mechanisms of resistance to plant pathogens such as viroids , viruses, phytoplasmas, bacteria, fungi, or even resistance to insects or pests (the promoter is also inducible, in tobacco in particular, by injury).
  • VAN LOON et al., 1994 such as osmotine (LIU et al., 1994; ZHU et al., 1995), "thau atines like PR-proteins” (VIGERS et al., 1992) , PR proteins of class 1 (CUTT et al., 1989; HAHN K. and STRITTMATTER G., 1994),
  • the present invention also relates to plant cells transformed by a system or a vector according to the present invention.
  • said plant cells are vine cells and the gene of interest is a gene conferring resistance to a parasite.
  • the present invention also relates to processes for obtaining cells, characterized in that plant cells are transformed using a microbiological process including a system or an expression vector according to the invention.
  • Agrobacterium mention should be made in particular of the methods using Agrobacterium, whether they are Agro acterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes.
  • the strain is used to transfer the recombinant plasmids into strains of agrobacteria which will then be used to transform the cells vegetable.
  • the present invention also relates to the transformed plant cells obtained by this process.
  • the invention further comprises a process for obtaining a plant expressing a gene of interest, characterized in that plant cells of said plant are transformed using a system or a vector according to the invention , the cells expressing the gene of interest are selected and a plant is regenerated from said selected cells.
  • the invention also includes plants comprising a system or a vector according to the invention, and / or cells according to the invention, preferably plants obtained by the implementation of a method according to the invention.
  • Figures 1 and Ibis general diagram representing the different stages of the method of isolation of the inducible promoter PMs PR10-1 corresponding to the sequence IND SI.
  • Figure 2 presentation of the various clones isolated and corresponding to a Southern blot, hybridized with the 5 'and 3' parts of DNA-PR7, delimited by a Bam site
  • Figure 3 DNA sequence corresponding to the IND SI sequence, genomic sequence isolated from the inducible alfalfa promoter PMs PR10-1.
  • the PR proteins are known to have conserved motifs, this has allowed the synthesis of oligonucleotides corresponding to these motifs, defined from the sequencing already carried out on PR pea and soy proteins. PCR amplification made it possible to obtain a radioactive probe, which was then used to select transcripts from the cDNA library.
  • ADNC-PR7 was selected because after sequencing it presented 87% homology with the genes coding for the PR proteins of peas and soybeans. Analysis has shown that it actually corresponds to a gene coding for a PR protein class 10 according to the classification of Van LOON et al. (1994). It was named Ms PR10-1 (Medicago sativa PR protein class 10, clone 1).
  • This fragment is characterized by the existence of an internal Bam-BI site (denoted B in FIG. 1) which delimits two parts: - one called 5 ′, of about 340 bases, includes the upstream region of the ATG (transcribed but not translated) and a downstream sequence corresponding to 306 bases, the other called 3 ′, corresponds to the end of the coding part, ie 165 bases, and to the 3 ′ region, not translated, ie 186 nucleotides from the stop codon to at the beginning of poly A.
  • B internal Bam-BI site
  • the first sequencing work revealed the presence of an intron of around 315 nucleotides in the open reading frame of the gene coding for the protein PR.
  • the clone studied was then analyzed after digestion with Bam HI (see Figure Ibis).
  • promoter regions used for these control transformations two promoters were chosen: a control promoter and the PR promoter isolated from the alfalfa genome, derived from C15 (corresponding to the PMs promoter PR10-1).
  • Ca MV-35S promoter This promoter, said to be constitutive, is conventionally used. It corresponds to the regulatory sequence for the transcription of the gene for the 35S RNA subunit of the cauliflower mosaic virus (CaMV).
  • PMs PR 10-1 The promoter region of the genomic clone C15 was studied. This promoter was subsequently called PMs PR10-1. PMs PR 10-1:
  • This fragment therefore includes, with reference to the cDNA which served to clone it and in addition to the upstream promoter region: 39 terminal nucleotides of the 5'UTR (UnTranslated Region) of the Ms PR10-1 gene, located 10 bp from the ATG codon initiator, the ATG of the Ms PR10-1 gene and a short fragment of its coding region (10 bp), just upstream from the integrated Bam HI site.
  • 5'UTR UnTranslated Region
  • the promoter thus constructed presents a potential ATG which could lead to the presence of two ATG codons, at a short distance from each other, during the construction of chimeric genes.
  • a risk of modification of the coding phase of the gene used could then exist.
  • PMs PR10-1 (PRI) was used as it is after cloning into the plasmid pSK +/- Bluescript of STRATAGENE. It could be isolated again in the form of an Eco RI / Bam HI fragment of approximately 1.5 kb.
  • this gene coding for a ⁇ glucuronidase makes it possible, using a particular substrate
  • This plasmid was constructed by one of the laboratories participating in the project to test the effectiveness of promoters (P. RATET, ISV, cited in SZABADOS et al., 1995). It has the particular advantage of having a multiple cloning site, allowing a transcriptional fusion with the coding phase of the gus gene (E. coli uid A) containing the LSI intron. It also has some of the characteristics of the previous plasmid p35S - gus intron
  • the promoter activity can be revealed and measured by histochemical and enzymatic tests of the GUS type.
  • the 35S promoter cloned in the plasmid pDH51 (cf. paragraph below concerning the agrobacterial strains), was extracted and inserted into the multiple cloning site of pPR97, upstream of the reporter gene, in the form 18
  • the different plasmids were used to transform competent bacteria E. coli strain DH5 ⁇ by thermal shock in calcium chloride medium. After selection of the bacteria transformed on antibiotic medium (Kanamycin) and control by miniprep of their recombinant nature, they were used to transfer the recombinant plasmids into strains of agrobacteria by triparental conjugation, using the strain of JE .. coli
  • control plasmids p35S-gus intron and pPR97-35S gave a positive GUS staining although weak with the second plasmid.
  • the construction pPR97 - PMs PR10-1 showed an activity of the gus gene similar to that of the positive control 35S gus intron. This promoter, which was expected to be inducible, therefore presented an effect comparable to a constitutive promoter in this case.
  • the experimental protocol was modified to reduce the stress caused to the explants (elevation of the osmolarity of the coculture medium using sucrose concentrations of 10 to 30 gl "1 , realization of a range more or less high vacuum: from 10 to 80 mm of relative vacuum mercury and creation of more or less strong lesions on the leaves with significant or medium crushing of the epidermis).
  • the results showed that the more the pressure was important, the higher the number of cells transformed.
  • a compromise must be found in order to obtain stable transformations since the numerous transient transformations obtained in this case often prove to be often lethal for the cells. calluses and therefore regenerate buds and then plants.
  • the inducible nature of the promoter is partly confirmed because if the coloration due to the 35S gus intron construct is detectable up to 5 days after coculture, that obtained with pPR97 - PMs PR10-1- gus intron appears more rapidly at 48 hours but then decreases very quickly.
  • Accl. acclimatized seedlings. Number of buds per explants: the number in brackets corresponds to the number of buds obtained at one month, for the first series. For this one
  • the calluses were left longer on the culture medium in order to obtain a maximum of buds and therefore of plants to be acclimated.
  • the second series after one month, a sufficient number of buds were obtained and the experiment was then stopped.
  • the promoter is induced and the histochemical test is positive after 2 hours of incubation (against 5 hours with the 35S promoter).
  • the activity of the gus gene is not 23
  • a constitutive inducing activity of the isolated promoter PMs PR10-1 is therefore possible in the trichomes of tobacco leaves (3 plants out of 7) but it seems to be under the influence of the development stages.
  • the activity of the promoter in tobacco is therefore limited to the root, to the floral parts (anthers and pollen) and to some cells of the aerial part (mainly trichomes).
  • Young sprouts were used. After development of the main root, the hypocotyls, excised, were soaked in a suspension of Agrobacterium tumefaciens EHA 105 having either the plasmid p35S-gus intron or the plasmid pPR97-PMs PR10-1- gus intron, so as to obtain by following the newly formed transformed roots. After a week, roots were obtained and a GUS histochemical test was performed. For this experiment, the control was constituted by young germinations treated in an identical manner to the preceding batches (hypocotyls excised, but not soaked in the suspension of agrobacteria).
  • PMs PR10-1 is just as functional in this plant as in the original plant (Medicago sa tiva).
  • Lotus corniculatus The purpose of the experiment was again to study the induction of the promoter during nodulation by the symbiont bacteria Rhizobium meliloti NZP 2037 (PETIT et al., 1987).
  • Composite plants were therefore produced by transforming hypocotyl cells from young Lotier germinations with Agrobacterium rhizogene ⁇ strain A4TC24, to obtain the phenomenon of root scalp (hairy root phenotype). Once this developed, the main roots were excised and the seedlings were placed in a liquid medium to increase the development of the phenomenon.
  • the study of the induction of the promoter (s) has been carried out by placing the seedlings in nodulation condition (BLONDON, 1964).
  • the two study promoters selected were the same as those used during the experiment conducted with M. trunculata: 35S and PMs
  • the hypersensitivity reaction developed in the interaction N. benthamiana - Pseudomonas syringae pv. pisi, was used in this study.
  • Transformed tobacco plants having incorporated into their genome the various inserts of the plasmids p35S-gus intron and pPR97 -
  • PMs PR10-1-gus intron were acclimated and then infiltrated with a suspension of P. syringae (ES ⁇ AULT et al., 1993) at a concentration of 10 9 bacteria per ml.
  • the solution was injected into the limbus using a hypodermic syringe.
  • the HR type reaction is considered to be well developed.
  • the leaves, infiltrated with the suspensions of bacteria, were removed 24, 48 and 96 hours after inoculation to evaluate, by GUS histochemical test, the induction of the various promoters studied. Analysis of a possible systemic response was also evaluated, using the same histochemical test, on leaves located below the infiltrated leaf.
  • this promoter is very inducible by attack by a pathogen.
  • the HR type reaction is not yet fully developed (48 hours for full exposure), however, the GUS test is already positive. With the young transformed tobacco plants obtained, the coloration is weak and is localized mainly in the limb of the infiltrated leaf.
  • the coloration obtained during the test is more intense, especially in the veins and trichomes of the infected leaf and only in these tissues for the systemic response.
  • the induction is also not limited to the HR type reaction obtained during the interaction 28
  • Quantitative expression of the raw intron gene under the control of the various promoters is based on an enzymatic test.
  • a crude extract of the enzyme encoded by the gus gene obtained from transformed tobacco plants and b) a substrate, p nitro-phenyl-glucuronide.
  • the rate of hydrolysis of the substrate is followed by a spectrophotometer and is related to the total amount of protein in the extract.
  • the method requires the presence of a strong promoter, upstream of the gus gene, because it is not very sensitive. 29
  • the promoter 35S placed in the plasmid pG3-3, gave a rate of hydrolysis of the substrate (expressed in arbitrary unit) 5 times higher than the promoter PMs PR10-1, meanwhile placed in the plasmid pPR97.
  • the PMs PR10-1 promoter gave a stronger expression of the gus gene than the 35S promoter, if the latter is placed in the plasmid p35S-gus intron. Indeed, in the latter case no detection of hydrolysis of the substrate was obtained.
  • the other constructions did not make it possible to give detectable values to the spectrophotometer.
  • alfalfa responds well to the characteristics required to use it as a regulatory sequence for a gene of agronomic interest that can act in the defense of plants against an attack by a pathogen. It is inducible by a pathogen (bacteria and fungus), including in a heterologous system, tobacco. It also has a weak constitutive activity, mainly in the roots, including in other heterologous systems ( ⁇ f. Truncatula and L. Corniculata). Another constitutive activity, not yet explained, has also been observed in embryogenic alfalfa calluses. 30
  • Plant defensins Novel Antimicrobial-peptides as components of the host defense System. Plant Physiol. 108, 1353-1358.
  • Pathogen defense gene prpl-1 from potato encodes an auxin - responsive glutathione S Transferase. Eur J. Biochem. 226, 619-626.
  • HAIN R. REIF HJ, KRAUSE E., LANGEBARTELS R., KINDL H., WORNAM B., WIESE W., SCHMELZER E., SCHREER PH, STOECKER 32
  • the gene for stinging nettle lectin (Urtica dioica agglutinin) encodes both a lectin and a chitinase. J. Biol. Chem. 267, 11085-11091.
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Abstract

La présente invention concerne un ensemble de promoteurs végétaux inductibles par des stress biotiques ou abiotiques, notamment par des pathogènes, leur utilisation, des vecteurs d'expression comportant lesdits promoteurs et un gène d'intérêt, des cellules et/ou des plantes transformées par lesdits vecteurs. L'invention est aussi relative à des procédés d'obtention desdites cellules ou plantes, lesdites plantes transformées présentant des résistances améliorées auxdits pathogènes.

Description

PROMOTEUR INDUCTIBLE DANS LES PLANTES, SEQUENCE INCORPORANT CE PROMOTEUR ET PRODUIT OBTENU.
La présente invention concerne un ensemble de promoteurs végétaux inductibles par des stress biotiques ou abiotiques, notamment par des pathogènes, leur utilisation, des vecteurs d'expression comportant lesdits promoteurs et un gène d'intérêt, des cellules et/ou des plantes transformées par lesdits vecteurs. L'invention est aussi relative à des procédés d'obtention desdites cellules ou plantes, lesdites plantes transformées présentant des résistances améliorées auxdits pathogènes .
Les maladies, qu'elles soient d'origine fongique, bactérienne ou virale, sont le problème majeur en viticulture, tant au plan de la qualité des moûts et des vins produits (par exemple Botrytiβ cinera, agent de la pourriture grise qui attaque les baies à la vendange et entraîne des mauvais goûts dans les vins) , des baisses de production (par exemple les maladies foliaires telles que Mildiou et Oidium, les attaques de Botrytis sur fleurs ou la maladie de Court noué liée à la présence du virus G.F.L.V., Grape Fan Leaf Virus), voire à celui de la survie du vignoble (par exemple les maladies du bois comme 1 ' eutypiose ou le syndrome de l'esca). L'arsenal classique de la lutte va de la simple prophylaxie aux traitements phytosanitaires, la lutte biologique étant jusqu'à présent d'application très limitée.
La lutte chimique est bien sûr la méthode la plus utilisée, même si l'on tempère de plus en plus les traitements (modèles de prévision des risques de maladies pour le Mildiou par exemple) . En ce qui concerne les fongicides par exemple, le vignoble français, qui représente environ 10 % des terres cultivées en France, utilise chaque année près de 40 % des fongicides consommés dans ce pays. Au plan européen, sur près de 4 millions d'hectares du vignoble, les 9 à 10 traitements effectués chaque année pour lutter contre ces maladies entraînent l'application de 120 000 tonnes de produits fongicides. Pour ne citer que le seul problème de la pourriture grise, on estime que sur les années 1992-1993, il a concerné 25 à 30 % des 3,7 millions d'hectares du vignoble européen, pour un coût de produits phytosanitaires de respectivement 97 et 69 millions de Marks allemands (DM) .
L'application de ces produits n'est pas sans conséquence pour l'environnement (c'est le cas par exemple pour les fumigants des sols utilisés pour détruire les nématodes, vecteurs du virus du Court noué) . Elle pose aussi quelquefois des problèmes technologiques avec les difficultés qui peuvent survenir au cours des fermentations
(l'utilisation d'inhibiteurs de la biosynthèse des stérols peut bloquer la croissance des levures en fin de fermentation) et commerciaux (procymidone, produit anti- Botrytis, retrouvé parfois dans les vins, d'où le contentieux américain des années 1990-1991) .
Par ailleurs, l'utilisation de ces produits a déjà entraîné l'apparition de souches résistantes. Ce phénomène a été particulièrement marqué en Champagne et certaines années il a été recommandé par le Comité Interprofessionnel des Vins de Champagne (CIVC) de ne pas traiter contre le Botrytis .
Pour pallier ces inconvénients, il est impératif d'équilibrer l'utilisation de produits phytosanitaires en mettant au point de nouvelles méthodes de lutte afin de diminuer de manière importante les quantités de produits épandues au vignoble.
Deux approches sont actuellement envisagées :
* Renforcer la prophylaxie et diminuer la quantité de produits appliqués (méthodes culturales et lutte préventive, modèles de prévision des risques de maladies, nouveaux matériels d'épandage, nouvelles molécules plus dégradables, etc.).
* Améliorer la résistance des cépages à la maladie .
Pour cette seconde approche, l'amélioration génétique classique par voie sexuée (hybridation avec des variétés tolérantes) est impossible de par la législation française sur les Appellations d'Origine Contrôlée (A.O.C.) qui impose les cépages à utiliser pour une appellation donnée. En outre, techniquement, la vigne, végétal ligneux, nécessiterait plusieurs dizaines d'années pour intégrer un ou des nouveaux caractères de résistance tout en conservant les caractéristiques biochimiques et aromatiques des cépages, facteurs de la qualité organoleptique des vins produits . La maîtrise de la régénération et de la transformation génétique de la vigne, réalisée par l'équipe de recherche des laboratoires de la société Demanderesse depuis 1989-1990, a permis d'envisager d'utiliser les techniques modernes de la biologie cellulaire et moléculaire pour accroître la tolérance des cépages aux maladies fongiques.
Il est désormais possible d'une part d'intégrer dans le génome de la vigne un ou plusieurs gènes homologues ou hétérologues permettant la surexpression ou l'expression d'une molécule d'intérêt de nature protéique ou autre, et/ou l'ouverture d'une nouvelle voie de biosynthèse, et d'autre part de régénérer une plante plus tolérante à une ou des maladies, c'est-à-dire ayant des mécanismes de défense renforcés vis-à-vis du ou des pathogènes en cause. Chez les végétaux, ces mécanismes sont de plusieurs ordres. Les uns peuvent être considérés comme passifs et sont liés aux caractéristiques physico-chimiques des cellules, des tissus épidermiques et/ou des organes de la plante (par exemple la cuticule ou les caractéristiques morphologiques de la grappe) . Les autres appartiennent à la dynamique des interactions gène à gène (gènes de résistance du végétal et d'avirulence du pathogène, mécanismes des interactions hôte-parasite) . Ces interactions peuvent conduire au développement de la réaction d'hypersensibilité (mort rapide des cellules du végétal autour du point d'infection pour bloquer la colonisation de la plante par le champignon, la bactérie ou le virus) , mais aussi à la synthèse et à l'accumulation de toute une série de composés. Parmi ceux-ci, certains peuvent être des constituants pariétaux, impliqués dans la formation d'une barrière "physique" autour du point d'infection (callose, lignine, protéine riche en hydroxyproline, etc.), d'autres des molécules aux fonctions antimicrobiennes plus ou moins bien définies (phytoalexines, protéines associées aux pathogènes : PR protéines (Pathogenesis Related protein) , etc. ) . La surexpression de ces molécules aux fonctions antimicrobiennes ou impliquées dans la formation d'une barrière physique autour du point d'infection peut permettre d'obtenir une résistance "naturelle" des plantes en réponse à des stress, notamment des stress de type microbien.
Toutefois, une surexpression constitutive de ce type de protéines ne peut être envisagée sans inconvénient pour la plante (coût énergétique, ralentissement de la croissance, etc.), c'est pourquoi il est nécessaire de prévoir l'utilisation de promoteurs inductibles et en particulier de promoteurs qui soient inductibles par le stress lui-même. C'est précisément l'objet de la présente invention.
La présente invention concerne une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe comprenant : a) la séquence IND SI, b) toute séquence correspondant à un fragment de la séquence IND SI et ayant effet de séquence promotrice chez les plantes. L'invention concerne également les promoteurs chez les plantes, choisis dans le groupe comprenant : a) le promoteur PMs PR10-1 correspondant à la séquence IND SI, b) un promoteur de type PMs PR10-1 correspondant à une séquence selon l'invention.
Sont préférés lesdits promoteurs de type PMs PR10-1, qui présentent au moins 80 % d'homologie avec la séquence IND SI. Particulièrement préférés sont ceux qui présentent au moins 90 % ou 95 % d'homologie avec ladite séquence. Les séquences promotrices chez les plantes caractérisées en ce qu'elles comportent au moins une séquence identique à celles des promoteurs mentionnés précédemment, sont également comprises dans la présente invention.
L'objet de l'invention concerne tout particulièrement l'utilisation des promoteurs selon l'invention, pour l'expression, tissus spécifiques ou non, d'un gène de manière inductible dans les plantes, par un stress biotique ou abiotique.
Parmi lesdits stress biotiques selon l'invention, on préfère en particulier les stress biotiques engendrés par l'attaque d'un parasite tel qu'un virus, une bactérie, une levure, un champignon.
Parmi lesdits stress abiotiques selon l'invention, on préfère en particulier les stress abiotiques engendrés par une blessure mécanique, telle que celle causée notamment par un insecte ou par un phénomène physique tel que le vent ou le gel.
Les promoteurs ou les séquences promotrices selon l'invention peuvent être utilisés pour la réalisation de systèmes d'expression dans les plantes, systèmes pouvant être inductibles et/ou constitutifs suivant les tissus ou organes de la plante transformés (cf. Exemples 2, 3 et 4) .
Ces promoteurs ont été obtenus à partir des séquences régulatrices de gènes PR protéines chez la luzerne. On a mis à profit la réponse incompatible (réaction d'hypersensibilité HR) obtenue dans la relation hôte-parasite entre la luzerne (Medicago sa tiva) et Pseudomonas syringae pv pîβi pour étudier le promoteur responsable de cette réaction.
Lors de l'attaque par Pseudomonas de la luzerne, l'apparition d'une réaction de la plante est observée dans la zone d'infection.
Le matériel végétal a donc été prélevé après l'attaque bactérienne afin de constituer une banque d'ADNc à partir des ARNs messagers produits dans les zones infectées et voisines de la nécrose. Une amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) , utilisant des polynucléotides de synthèse correspondant à des motifs conservés de gènes de PR protéines de légumineuses, a permis d'obtenir une sonde radioactive qui a été ensuite utilisée pour sélectionner des transcrits dans la banque d'ADNc. Parmi ceux-ci, l'un d'entre eux a été retenu car, après séquençage, il présentait une bonne homologie avec des gènes équivalents codant pour des PR protéines connus pour d'autres plantes (cf. Figures 1 et Ibis représentant le schéma général de la méthode d'isolement du promoteur).
L'analyse a montré qu'il correspondait à un gène codant pour une PR protéine de classe 10 selon la classification de van Loon (1994). C'est pourquoi ce gène a été dénommé Ms PR10-1 (Medicago sa tiva PR protéine classe
10, clone 1) .
La présente invention a également pour objet des systèmes d'expression d'un gène chez les plantes et caractérisés en ce qu'ils comportent au moins la séquence dudit gène sous contrôle d'un promoteur ou d'une séquence selon l'invention. Parmi les systèmes d'expression selon l'invention, on préfère les vecteurs d'expression et notamment les vecteurs d'expression de type plasmidique. Avantageusement, lesdits vecteurs d'expression sont caractérisés en ce qu'ils peuvent être transférés dans des souches d'Agrobacterium.
L'invention a également pour objet un système ou vecteur d'expression d'un gène chez les plantes selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est inductible dans les plantes par un stress biotique ou abiotique, de préférence un stress biotique ou abiotique tel que ceux décrits précédemment . L'invention concerne en outre les systèmes ou vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce que ledit gène est un gène d'intérêt. Un gène est considéré comme un gène d'intérêt si sa modulation peut être souhaitée ou utilisée dans tout genre d'industrie, y compris l'agriculture. Outre l'agriculture déjà citée, on pensera aux industries telles que par exemple l'industrie agro-alimentaire, l'industrie cosmétique, l'industrie pharmaceutique, l'industrie chimique, etc.. Cette liste d'exemples n'est bien sûr pas limitative .
Le gène pourra donc être par exemple un gène d'intérêt agronomique ou un gène permettant à la plante de produire des substances présentant un intérêt pour la nutrition ou la santé humaine ou animale. Parmi les gènes d'intérêt agronomique, on entend, par exemple, tout gène dont 1 ' expression permet de moduler la physiologie de la plante, telle que notamment l'inhibition, le ralentissement, l'accélération ou le déclenchement d'étapes ou de phénomènes intervenant à une période donnée de la vie de la plante, ou tout gène dont l'expression permet d'améliorer ou de diminuer la résistance de la plante à des agressions physiques, chimiques ou biologiques. Parmi les gènes d'intérêt permettant à la plante de produire des substances présentant un intérêt pour la nutrition ou la santé humaine ou animale, on entend par exemple les gènes codant pour des composés pharmaceutiques, enzymatiques (pouvant être utilisés pour la biosynthèse ou la biodégradation de composés organiques) ou à valeur nutritive, ou des gènes permettant de moduler ou d'inhiber l'expression de composés pharmaceutiques, nutritifs, toxiques ou d'arômes.
L'invention comprend en particulier les systèmes ou vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce que ledit gène d'intérêt est un gène impliqué dans la réponse a un stress biotique ou abiotique, de préférence dans la réponse au stress biotique ou abiotique inducteur.
De manière préférée, l'invention concerne les systèmes ou vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce que le stress biotique est l'attaque d'un parasite et le gène d'intérêt un gène de résistance audit parasite. O 99/41391
De manière encore plus préférée, l'invention comprend les systèmes ou vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce que le parasite est un virus, une bactérie, une levure ou un champignon, et le gène d'intérêt est un gène intervenant dans la synthèse de molécule à action anti-pathogène, de préférence un gène intervenant dans la synthèse des phytoalexines ou des PR.
Les constructions permettant l'expression de ces gènes pourront bien entendu comporter, outre le gène d'intérêt, des séquences notamment de polyadénylation à l'extrémité 3' du brin codant, ainsi que des séquences "enhancer" dudit gène ou d'un gène différent.
Bien entendu, les constructions devront être adaptées afin d'assurer que le gène sera lu en phase de lecture correcte avec le promoteur et il sera évidemment possible de prévoir d'utiliser, si cela est nécessaire, plusieurs promoteurs du même type ainsi que plusieurs séquences "enhancer" .
Il est également possible d'exprimer à l'aide des promoteurs selon la présente invention plusieurs gènes, soit placés en cascade, soit portés par des systèmes d'expression différents.
Parmi les gènes d'intérêt pouvant être exprimés par les constructions selon la présente invention, il faut citer les gènes qui peuvent être placés sous le contrôle du promoteur PMs PR10-1 afin de déclencher des mécanismes de résistance aux pathogènes des plantes que sont les viroïdes, les virus, les phytoplasmes, les bactéries, les champignons, voire aussi la résistance à des insectes ou à des ravageurs (le promoteur étant aussi inductible, chez le tabac notamment, par des blessures) .
Parmi les stratégies possibles, on peut se référer aux revues de LAMB et al., 1992 ; VAN LOON et al., 1994 ; BROOGLIE et BROOGLIE, 1993 ; CHET, 1993 et à celle de PAPPINEN et al., 1994. A titre d'exemple, on peut citer qu'ils soient homologues ou hétérologues, des gènes codant pour :
- des enzymes hydrolytiques tels que les chitinases
(BROOGLE et al., 1991), les β 1-3 glucanases (KAUFFMAN et al., 1987) ou des combinaisons de gènes codant pour ces deux enzymes,
- des PR protéines (VAN LOON et al., 1994) comme l'osmotine (LIU et al., 1994 ; ZHU et al., 1995), les "thau atines like PR-proteines" (VIGERS et al., 1992), les PR protéines de classe 1 (CUTT et al., 1989 ; HAHN K. et STRITTMATTER G. , 1994) ,
- des protéines RIP (Ribosome Inactivating Protein) de plantes (LOGEMANN J. et al., 1992) ou d'autres organismes ou micro-organismes, - des protéines ayant un rôle inhibiteur d'enzymes d'attaque des champignons : inhibiteur de protéases
(MASOUD et al., 1993), des protéines inhibitrices de polygalacturonase (TOUBART et al., 1992), ou d'autres protéines inhibitrices, - des lectines ou des protéines se liant à la chitine (chitin binding proteins) (BROEKAERT et al., 1989 LERNER et RAIKHEL, 1992) ,
- des protéines de type lysozyme de phage (T4) ou de mammifères (DURING et al., 1992), - des protéines impliquées dans la voie de biosynthèse de phytoalexines (HAIN et al., 1993),
- des peptides antimicrobiens de type défensine (BROEKAERT et al., 1995 ; VIGERS et al., 1991 ; TERRAS et al., 1995) , - des protéines de résistance à des pathogènes (DE WIT, 1992) impliquées dans ou déclenchant des réactions d'hypersensibilité (STRITTMATTER et al., 1995) ou des enzymes conduisant à la production d'eau oxygénée ( U et al., 1995), - des protéines amenant à la production de toxines antifongiques, antibactériennes ou anti-insectes (KINAL et al. , 1995) , 10
- des protéines à fonction péroxydase pouvant intervenir dans la polymérisation des lignines (LAGRIMINI et al., 1987) ou dans d'autres réactions oxydatives (BRADLEY et al., 1992), - des protéines d'origine virale telles que des protéines de la coque des virus en position sens ou antisens (voir BEJARANO and LICHTENSTEIN, 1992),
- des protéines impliquées dans la synthèse de molécules déclenchant la chaîne de transduction des signaux des mécanismes de stress (acide jasmonique, acide salicylique, etc.) ou des protéines impliquées elles- mêmes comme signal de stress ou intermédiaires dans la chaîne de transduction (systémine, "GTP binding protéines") voir pour cela SCHEEL et al., 1991 ; VERMA et al., 1994 ; VERA-ESTRELLA et al., 1994),
- des protéines toxiques pour les insectes (VAECK et al . , 1987) .
Cette liste n'est pas limitative.
La présente invention a également pour objet des cellules végétales transformées par un système ou un vecteur selon la présente invention. Avantageusement, lesdites cellules végétales sont des cellules de vigne et le gène d'intérêt est un gène conférant la résistance à un parasite. La présente invention concerne également des procédés d'obtention de cellules, caractérisés en ce qu'on transforme des cellules végétales à l'aide d'un procédé microbiologique incluant un système ou un vecteur d'expression selon l'invention. Parmi les méthodes de transformation les plus utilisées, il faut citer notamment les méthodes mettant en oeuvre Agrobacterium, qu'il s'agisse d'Agro acterium tumefaciens ou d'Agrobacterium rhizogenes .
Ces méthodes sont connues et elles ne seront pas décrites de nouveau en détail .
Cette technologie, partant de systèmes plasmidiques, permet d'effectuer une première trans- 11
formation d'une souche de bactéries compétentes, en général E. col i , ce qui permet de contrôler la structure des plasmides, puis la souche est utilisée pour transférer les plasmides recombinants dans des souches d' agrobactéries qui seront ensuite utilisées pour transformer les cellules végétales .
La présente invention concerne également les cellules végétales transformées obtenues par ce procédé.
L'invention comprend en outre un procédé d'obtention de plante exprimant un gène d'intérêt, caractérisé en ce qu'on transforme des cellules végétales de ladite plante à l'aide d'un système ou d'un vecteur selon l'invention, on sélectionne les cellules exprimant le gène d'intérêt et l'on régénère une plante à partir desdites cellules sélectionnées.
L'invention comprend également les plantes comportant un système ou un vecteur selon l'invention, et/ou des cellules selon l'invention, de préférence les plantes obtenues par la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention.
Il faut en particulier remarquer que les constructions selon la présente invention et utilisant les promoteurs inductibles ont permis de transformer des plantes diverses, notamment le tabac (Nicotiana bentha iana) , la luzerne (Lotus cornicula tus) et également la vigne (Vitis sp . ) .
Lors de la régénération de plantes à partir de cellules, on a d'ailleurs pu mettre en évidence l'intérêt du promoteur selon la présente invention. En effet, les promoteurs des constructions équivalentes mettant en oeuvre des promoteurs constitutifs forts n'ont jamais permis d'obtenir des plantes régénérées, et il se pourrait que la production de protéines de défense conduise très rapidement à la nécrose des cellules, empêchant ainsi la régénération. II s'agit là d'un avantage annexe des constructions selon 12
la présente invention dans certains systèmes de transformation et de régénération de plantes.
D'autres caractéristiques et avantages des constructions et des procédés selon la présente invention pourront être mis en évidence dans les exemples qui vont suivre .
Légendes des Figures
Figures 1 et Ibis : schéma général représentant les différentes étapes de la méthode d'isolement du promoteur inductible PMs PR10-1 correspondant à la séquence IND SI.
Figure 2 : présentation des divers clones isolés et correspondant à un Southern blot, hybride avec les parties 5' et 3' de l'ADN-PR7, délimitées par un site Bam
HI (B) interne, détecté dans cet ADNc.
Sites de restriction : E = Eco RI, B = Bam HI .
Les valeurs indiquées sur la Figure sont exprimées en kb (kilo bases) . Figure 3 : séquence d'ADN correspondant à la séquence IND SI, séquence génomique isolée du promoteur inductible de luzerne PMs PR10-1.
Exemple 1 Obtention de clones génomigues comprenant des séquences régulatrices de gênes PR protéine de luzerne
Obtention d'une sonde pour la recherche des promoteurs (cf. Figures 1 et Ibis) La réponse incompatible (réaction d'hypersensibilité : HR) , obtenue dans la relation hôte-parasite luzerne (Medicago sativa) et Pseudomonas syringae pv pisi a permis de constituer une banque d'ADNc. Elle a été réalisée à partir d'ARNs messagers extraits et purifiés de la zone voisine de la nécrose provoquée par l'infection bactérienne. Les prélèvements de matériel végétal ont été effectués 13
6 heures après l'infiltration par la suspension bactérienne .
Chez les légumineuses, les PR protéines sont connues pour avoir des motifs conservés, ceci a permis la synthèse d' oligonucléotides correspondant à ces motifs, définis à partir des séquençages déjà réalisés sur PR protéines de pois et de soja. Une amplification par PCR a permis d'obtenir une sonde radioactive, utilisée ensuite pour sélectionner dans la banque d'ADNc des transcrits. Parmi ceux-ci, un des clones : ADNC-PR7 a été retenu car après séquençage il a présenté 87 % d'homologie avec les gènes codant pour les PR protéines de pois et de soja. L'analyse a montré qu'il correspondait en fait à un gène codant pour une PR protéine de classe 10 selon la classification de VAN LOON et al. (1994) . Il a été nommé Ms PR10-1 (Medicago sativa PR protéine classe 10, clone 1) .
Un contrôle, effectué chez la luzerne par
Northern blot, a montré que le transcrit correspondant s'accumulait dès 3 heures après l'infection dans le cas de la réponse incompatible, passait par un maximum entre 24 et
48 heures et diminuait lentement à partir de 72 heures.
Ce fragment est caractérisé par l'existence d'un site Bam-BI interne (noté B sur la figure 1) qui délimite deux parties : - l'une dite 5', d'environ 340 bases, inclut la région amont de l'ATG (transcrite mais non traduite) et une séquence aval correspondant à 306 bases, l'autre dite 3', correspond à la fin de la partie codante soit 165 bases et à la région 3 ' non traduite soit 186 nucléotides du codon stop jusqu'au début du poly A.
Isolement de clones génomiσues comprenant des promoteurs de PR protéines
* Isolement de clones génomiques Une banque génomique de luzerne, préparée dans
EMBL4 (titre : 7.108 p.f.u. (plates forming unit) .ml"1) , a 14
été utilisée à cette occasion et 6.105 p.f.u. étalées. Pour cribler cette banque, le fragment 5' de Ms PR10-1 (ADNc- PR7) a servi de sonde et 45 clones ont donné un signal intense sur 13 d'entre eux. Les cartes de restriction et les hybridations, réalisées avec les fragments 5' et 3' de Ms PR10-1, ont permis de conclure à l'existence de 7 clones distincts (cf. Figure 2) . La comparaison des tailles des 7 clones (9,3 ; 6,5 ; 6,1 ; 5,8 ; 4,8 ; 4,2 ; 2,2 kb) obtenus à partir du criblage de la banque, à celle des bandes détectées sur Southern blot d'ADN génomique de luzerne a montré une bonne concordance entre ces deux types de données expérimentales (cf. Figure 2) . Il a donc été possible d'en déduire que les gènes codant pour la protéine PR7 correspondaient à une petite famille multigénique . Les fragments (sites Eco-RI/Eco-RI) de ces clones
(hormis le clone C12) ont ensuite été sous-clonés en totalité ou en partie et les séquençages entrepris. * Séquençages réalisés
Un clone a été choisi pour être séquence en premier, le clone C15 (cf. Figure Ibis).
Les premiers travaux de séquençage ont mis en évidence la présence d'un intron d'environ 315 nucléotides dans le cadre ouvert de lecture du gène codant pour la PR protéine. Le clone étudié a été analysé ensuite après digestion par Bam HI (cf. Figure Ibis) .
Clone C15 : 6 , 1 kb
L'analyse du clone par Eco RI et Bam HI a permis d'obtenir deux fragments E-B (environ 2,4 kb) et B-E (environ 3,7 kb) . Après séquençage et comparaison de la séquence codante (interrompue par un intron de 600 nucléotides) avec celle du Ms PR10-1 (ADNc-PR7) , il est apparu que ce clone génomique était absolument identique à cet ADNc de référence.
* Analyse de 1 ' expression des clones isolés dans le système luzerne- Pseudomonas 15
Les expériences ont porté sur le clone C15, en utilisant la technique d'extension en 5', pour déterminer les messagers effectivement transcrits lors de l'induction des réactions de défense. Cette technique a en outre l'avantage de permettre de localiser le site d'initiation de la transcription. Les résultats ont montré que le clone C15 était effectivement exprimé lors de l'induction des réactions de défense dans les feuilles, lors de l'interaction luzerne - Pseudomonas .
Exemple 2
Transformations généti ues réalisées pour vérifier l'activité promotrice du clone isolé
Régions promotrices utilisées Pour ces transformations de contrôle, deux promoteurs ont été retenus : un promoteur témoin et le promoteur PR isolé du génome de la luzerne, issu de C15 (correspondant au promoteur PMs PR10-1) .
* Promoteur Ca MV-35S Ce promoteur, dit constitutif, est classiquement utilisé. Il correspond à la séquence de régulation de la transcription du gène de la sous-unité ARN 35S du virus de la mosaïque du chou- fleur (CaMV) . La région promotrice qui a été utilisée pour réaliser la construction avec le gène rapporteur gus , correspond en fait à une fraction de ce promoteur, isolée de nouveau sous forme d'un fragment Eco RI/Bam HI à partir du plasmide pDH51 (PIETRZAK et al.,
1986) .
* Promoteur PR La région promotrice du clone génomique C15 a été étudiée. Ce promoteur a été appelé par la suite PMs PR10-1. PMs PR 10-1 :
Il provient du fragment Eco RI/Bam HI (E/B) de
2,4 kb du clone C15 Figure Ibis) . L'intégration de ce fragment dans le plasmide binaire, en amont du gène 16
rapporteur (voir ci-après) , a été rendue délicate car aucun site de restriction n'existait sur le clone C15 entre la boîte TATA (initiation de la transcription) et l'ATG (initiation de la traduction) . Des expériences de délétion ont donc été réalisées jusqu'à obtenir un fragment de 1,5 kb environ (séquence IND SI) . Puis, par ligation en bout franc, un autre site Bam HI a été ajouté au fragment ainsi obtenu pour permettre son insertion en amont des différentes séquences codantes utilisées par la suite. Ce fragment comprend donc en se référant à l'ADNc qui a servi à le cloner et outre la région promotrice amont : 39 nucléotides terminaux de la 5'UTR (UnTranslated Région) du gène Ms PR10-1, située à 10 bp du codon ATG initiateur, l'ATG du gène Ms PR10-1 et un court fragment de sa région codante (10 bp) , juste en amont du site Bam HI intégré.
Tenant compte des sites de clonage, le promoteur ainsi construit présente un ATG potentiel ce qui pourrait conduire à la présence de deux codons ATG, à faible distance l'un de l'autre, lors des constructions de gènes chimériques. Un risque de modification de la phase codante du gène utilisé (gène rapporteur ou gène d'intérêt agronomique) pourrait alors exister.
Pour les expériences de transformation avec le gène rapporteur, PMs PR10-1 (PRI) a été utilisé tel quel après clonage dans le plasmide pSK+/- Bluescript de STRATAGENE. Il a pu être de nouveau isolé sous la forme d'un fragment Eco RI/Bam HI de 1,5 kb environ.
* Plasmides utilisés a) p35S - gus intron (VANCANNEYT et al., 1990) Ce plasmide est un dérivé de pBinl9 (BEVAN, 1984) et possède comme tel les bordures droite et gauche des plasmides binaires permettant l'insertion de la partie comprise entre ces bordures dans les plantes via des agrobactéries . Le développement du gène rapporteur gus intron
(intron dérivé du gène LSI de la pomme de terre) a permis 17
d'éliminer les faux positifs (notamment en expression transitoire) dus aux agrobactéries contaminantes. Elles sont incapables d'épisser les introns.
Classiquement, ce gène codant pour une β glucuronidase permet, en utilisant un substrat particulier
(le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β glucuronide) , d'obtenir une coloration bleue. Celle-ci indique alors la nature transformée de la plante analysée et, par voie de conséquence, la transcription de la séquence codante du gène correspondant à l'enzyme, donc l'induction du promoteur qui la commande. b) pPR97
Ce plasmide a été construit par l'un des laboratoires participant au projet pour tester l'efficacité de promoteurs (P. RATET, ISV, cité dans SZABADOS et al., 1995). Il a notamment l'avantage de posséder un site de clonage multiple, permettant une fusion transcriptionnelle avec la phase codante du gène gus (uid A d'E. coli ) contenant 1 ' intron LSI . Il possède en outre certaines des caractéristiques du plasmide précédent p35S - gus intron
(bordures d'intégration dans le génome des plantes, gène de sélection permettant la résistance aux antibiotiques de type néo ycine : npt II gène) .
L'activité du promoteur peut être révélée et mesurée par des tests histochimique et enzymatique de type GUS.
* Dérivés de pPR97
Deux constructions principales ont été faites et utilisées par la suite pour la transformation de plantes modèles . a) pPR97 - 35S
Le promoteur 35S, clone dans le plasmide pDH51 (cf. paragraphe ci-dessous concernant les souches d' agrobactéries) , a été extrait et inséré dans le site de clonage multiple de pPR97, en amont du gène rapporteur, sous forme 18
d'un fragment Eco RI/Bam HI . Ce plasmide est à la fois un contrôle positif, pour démontrer que la construction est fonctionnelle et, une référence car le promoteur 35S a été placé dans le même environnement que le promoteur isolé des clones de PR protéine. b) pPR97 - PMs PR10-1
Les 1,5 kb ont été insérés dans le même site de clonage que celui défini ci-dessus, sous la forme là aussi d'un fragment Eco RI/Bam HI . c) pG3-3
Il a permis de réaliser un contrôle positif fort par un test histochimique et un test enzymatique en clonant deux promoteurs 35S en tandem inversé. Les séquences activatrices des promoteurs agissent alors en synergie. La phase codante du gène gus intron a été alors placée sous le contrôle de l'un des deux promoteurs 35S.
* Les souches d' agrobactéries réalisées
Les différents plasmides ont été utilisés pour transformer des bactéries compétentes E. coli souche DH5α par choc thermique en milieu chlorure de calcium. Après sélection des bactéries transformées sur milieu antibiotique (Kanamycine) et contrôle par miniprep de leur nature recombinante, elles ont servi à transférer les plasmides recombinants dans des souches d' agrobactéries par conjugaison triparentale, en utilisant la souche d'JE.. coli
HB101 contenant le plasmide pRK2013 autotransférable (DITITA et al. , 1985) .
Deux souches d' agrobactéries ont été retenues : EHA 105, AgroJbacteriuin tumefaciens désarmée, permettant la régénération de plantes transformées (transformations stables) et, A4TC24 Agrobacterium rhizogèneβ utilisée pour obtenir la réaction de type chevelu racinaire (Hairy root) et des plantes composites, possédant des racines transformées mais dont le reste de la plante est de phénotype identique à celui d'origine. 19
* Transformations génétiques sur plantes modèles
Deux types de transformations (transitoires et stables) ont été réalisés en utilisant trois plantes modèles Nicotiana benthamiana , Medicago trunca tula et Lotus cornicula tuβ .
On exposera principalement les résultats obtenus avec N. benthamiana .
* Transformations transitoires
Cette première série d'expériences a été effectuée afin de permettre une vérification rapide de la fonctionnalité des constructions réalisées avec le gène gus dans les cellules d' eucaryotes .
Des feuilles de N. benthamiana ont donc été excisées et mises en coculture sur milieu gélose avec les différents dérivés de la souche EHA 105. Des tests histochimiques ont été ensuite pratiqués 48 h après la transformation puis examinés après une nuit d'incubation
(12 h) .
Les plasmides de contrôle p35S-gus intron et pPR97-35S ont donné une coloration GUS positive bien que faible avec le second plasmide.
Cette faible réactivité vient sans doute d'un problème de construction car, à proximité du site d'initiation de la transcription et de l'ATG du gène gus, une partie du polylinker a dû être gardée. Celle-ci comportant une séquence répétée peut gêner la transcription du gène .
La construction pPR97 - PMs PR10-1 a montré une activité du gène gus semblable à celle du contrôle positif 35S gus intron. Ce promoteur que l'on attendait inductible, a donc présenté un effet comparable à un promoteur constitutif dans ce cas.
Ce résultat peut être expliqué comme la conséquence soit de 1 ' infection bactérienne soit des blessures effectuées sur les feuilles lors du prélèvement 20
ou de la mise en culture. La première hypothèse ne pouvant être vérifiée, le protocole expérimental a été modifié pour diminuer le stress causé aux explants (élévation de l'osmolarité du milieu de coculture en utilisant des concentrations de saccharose de 10 à 30 g.l"1, réalisation d'une gamme de vide plus ou moins poussée : de 10 à 80 mm de mercure de vide relatif et création de lésions plus ou moins fortes sur les feuilles avec écrasement important ou moyen de l'épiderme) . Les résultats ont montré que plus la pression était importante, plus le nombre de cellules transformées était élevé. Cependant, un compromis doit être trouvé pour obtenir des transformations stables car les nombreuses transformations transitoires, obtenues dans ce cas, se révèlent par la suite souvent létales pour les cellules. Elles sont alors incapables de donner des cals et donc de régénérer des bourgeons puis des plantes .
Par ailleurs, la nature inductible du promoteur est en partie confirmée car si la coloration due à la construction 35S gus intron est détectable jusqu'à 5 jours après la coculture, celle obtenue avec pPR97 - PMs PR10-1- gus intron apparaît plus rapidement à 48 heures mais décroît ensuite très vite.
* Transformations stables a) Tabac : N. benthamiana
Une série de transformations a été réalisée avec pPR97-35S, pPR97-PMs PR10-1 et pG3-3. Un nombre important de plantules a été obtenu avec cette série de transformations. Pour chacun des plasmides utilisés, on a cherché à obtenir au moins 7 plantes acclimatées. Cependant, cela n'a pas été possible pour p35S - gus intron où seulement 5 plantes ont été régénérées et acclimatées. Les résultats obtenus sont rassemblés au Tableau 1. 21
Tableau 1 :
Transformations stables obtenues sur N. ben thamiana par transformation avec la souche EHA 105 d ' Agrobacter um tumefaciens et ses dérivés.
Cals/explants Plantules constructions mis en Bourgeons culture obtenus In vivo Accl
p35S-gus intron 10 (45) 6(1) 5 5
pPr97-35S 115/122 23 13 12 gus intron
pPR97-PMs PR10-1 135/139 27 20 7 gus intron
pG3-3-35S en tandem inversé non évalué 37 28 20 (promot . fort)
Figure imgf000023_0001
Légende Tableau 1 :
Les résultats sont exprimés en quantité obtenue.
Accl. : plantules acclimatées. Nombre de bourgeons par explants : le chiffre entre parenthèses correspond au nombre de bourgeons obtenus à un mois, pour la première série. Pour celle-ci
(comportant les constructions 35S gus intron) , les cals ont été laissés plus longtemps sur le milieu de culture afin d'obtenir un maximum de bourgeons et donc de plantes à acclimater. Pour la seconde série, après un mois, un nombre suffisant de bourgeons a été obtenu et l'expérience a alors été arrêtée .
Les transformations génétiques : elles sont faites classiquement sur des morceaux de limbe de feuilles 22
de 1 cm , immergés 30 secondes dans la suspension d ' Agrobacteri um puis, cocultivés 48 heures avant repiquage sur milieu gélose de division cellulaire et de caulo- génèse : M. S. (MURASHIGE et SKOOG, 1992), ANA (acide naphtalène acétique) 0,1 mg.l"1, BAP (benzyl amino purine)
1 mg.l"1, cefotaxime 400 mg.l"1 (élimination des agrobactéries) et kanamycine 70 mg.l"1 (agent de sélection des cellules transformées) . Dès l'apparition des premiers bourgeons (environ un mois après coculture) , ils sont placés sur milieu d'enracinement identique au premier mais ne comprenant pas d'hormones végétales.
L'analyse des résultats, en fonction de l'expression du gène gus intron, selon la nature du promoteur situé en amont de la phase codante du gène, montre que le promoteur PMs PR10-1 donne les meilleurs résultats de l'ensemble des promoteurs testés. Une analyse plus détaillée est présentée ci-après.
* Caractéristiques du promoteur PMs PR10-1 Plasmide pPR97 - PMs PR10-1 - gus intron Ce promoteur a donné les meilleurs résultats avec des différences d'expression constitutive du gène gus selon les organes testés . a) Activité dans les cals
Une expression constitutive forte a été trouvée. Quelques minutes d'incubation ont suffi pour obtenir un test histochimique positif. Le promoteur est donc fortement induit dans ce type de matériel, ce qui est en accord avec les résultats obtenus par VAN LOON (1985) . Les cals en culture in vitro sont en état de stress et dans ces conditions les PR protéines sont exprimées. b) Activité sur plantes entières acclimatées Racines
Le promoteur est induit et le test histochimique est positif après 2 heures d'incubation (contre 5 heures avec le promoteur 35S) . L'activité du gène gus n'est pas 23
uniforme dans les racines de tabac, seul l 'épidémie des parties âgées et le meristème apical ont donné la coloration bleue caractéristique du test. Selon la littérature, une activité des gènes de défense dans les racines est aussi classiquement observée. Fleurs
Chez tous les tabacs transformés par cette construction, une forte activité constitutive a été trouvée dans les fleurs et plus particulièrement dans les anthères et le pollen. Une activité du gène gus a aussi été décelée dans les trichomes des sépales et plus faiblement dans les pétales. Ces résultats sont aussi en accord avec ceux de VAN LOON (1985) qui indiquent une expression des gènes de défense dans les pièces florales. Feuilles
Une faible activité constitutive gus a été observée dans les trichomes de jeunes feuilles de plantes adultes. Chez le tabac, le stade rosette à larges feuilles correspond au stade juvénile et le stade vieillissant à celui de la formation des graines. Cette faible activité a été constatée majoritairement dans les trichomes pluri- cellulaires. L'expression d'une protéine PR dans de telles structures n'a jamais été décrite à notre connaissance.
Une activité inductrice constitutive du promoteur isolé PMs PR10-1 est donc possible dans les trichomes des feuilles de tabac (3 plantes sur 7) mais elle semble sous l'influence des stades de développement.
En l'absence d'induction par un pathogène, l'activité du promoteur chez le tabac est donc limitée à la racine, aux pièces florales (anthères et pollen) et à quelques cellules de la partie aérienne (trichomes essentiellement) .
Exemple 3 Autres espèces végétales transformées 24
* Medicago trunca tula
Pour cette espèce, on a cherché à réaliser des plantes composites, c'est-à-dire possédant à la fois une partie aérienne de type sauvage (non transformée généti- quement) et des racines transformées.
De jeunes germinations ont été utilisées. Après développement de la racine principale, les hypocotyles, excisés, ont été trempés dans une suspension d ' Agrobacterium tumefaciens EHA 105 possédant soit le plasmide p35S-gus intron soit le plasmide pPR97-PMs PR10-1- gus intron, de façon à obtenir par la suite des racines néoformées transformées. Après une semaine, des racines ont été obtenues et un test histochimique GUS a été réalisé. Pour cette expérimentation, le témoin a été constitué par de jeunes germinations traitées de manière identique aux lots précédents (hypocotyles excisés, mais non trempées dans la suspension d' agrobactéries) .
Tous les explants du lot témoin ont néoformé des racines en une semaine ; par contre, 50 % seulement ont réagi pour les lots traités par les agrobactéries. Quel que soit le traitement, aucune racine n'a donné de réponse positive au test GUS. En revanche, la base des hypocotyles des lots traités, bien que nécrosée, a souvent réagi pour donner une coloration bleue (présence de cellules transformées) . La partie nécrosée des explants a alors été excisée et ils ont été remis en enracinement. 50 % ont alors développé des racines néoformées dont certaines se sont révélées, dans quelques zones, positives au test.
Ce sont donc des racines chimériques (cellules transformées et non transformées) qui ont été obtenues, les parties transformées correspondant à des lignées cellulaires ayant intégré la construction dans une cellule souche de base .
Les deux constructions testées, p35S-gus intron et pPR97-PMs PR10-l-gus intron, ont donné ces lignées cellulaires racinaires transformées dans respectivement 3 25
et 2 explants sur les 6 mis en expérimentation pour chaque lot.
Bien que le modèle expérimental ne soit pas adapté à l'étude poursuivie (étude de l'expression des protéines PR lors du phénomène de nodulation par
Rhizobium) , il n'en a pas moins démontré que le promoteur
PMs PR10-1 est tout aussi fonctionnel dans cette plante que dans la plante d'origine (Medicago sa tiva) .
Lotus corniculatus L'expérimentation avait, là aussi, pour but d'étudier l'induction du promoteur lors de la nodulation par la bactérie symbiote Rhizobium meliloti NZP 2037 (PETIT et al., 1987). Des plantes composites ont donc été réalisées en transformant des cellules de l'hypocotyle de jeunes germinations de Lotier par Agrobacterium rhizogeneβ souche A4TC24 , pour obtenir le phénomène de chevelu racinaire (phénotype hairy root) . Une fois celui-ci développé, les racines principales ont été excisées et les plantules ont été placées en milieu liquide pour accroître le développement du phénomène. Une fois les plantes acclimatées, l'étude de l'induction du ou des promoteur (s) a été réalisée en plaçant les plantules en condition de nodulation (BLONDON, 1964). Les deux promoteurs d'étude retenus ont été les mêmes que ceux utilisés lors de l'expérimentation menée avec M. trunculata : 35S et PMs
PR10-1. Pour ces deux constructions, moins de 10 % des racines à phénotype hairy root ont montré des racines positives au test GUS. D'une manière générale, les racines ayant ce phénotype ont donné moins de nodules que les racines témoins.
Pour celles obtenues avec la construction comportant le promoteur 35S, seuls les nodules ont présenté une réponse positive au test GUS, alors que pour l'autre
(promoteur PMs PR10-1) , la coloration s'est développée sur toute la racine, exceptée au point d'initiation des racines secondaires. Par ailleurs, cette dernière construction n'a 26
pas permis d'obtenir des nodules sur les racines issues de chevelu racinaire en interaction avec Rhi zobium meliloti .
Exemple 4 Etude de la réaction d'hypersensibilité du tabac transformé avec les constructions utilisant le promoteur du gène PR de luzerne et le gène crue intron
Réaction d'hypersensibilité sur N. benthamiana transformé avec les constructions associant le promoteur du gène PR de luzerne et le gène gus intron.
* Test de réaction d'hypersensibilité (HR)
La réaction d'hypersensibilité (HR) , développée dans l'interaction N. benthamiana - Pseudomonas syringae pv. pisi , a été utilisée dans cette étude. Des plants de tabac transformés, ayant incorporé dans leur génome les différents inserts des plasmides p35S-gus intron et pPR97 -
PMs PR10-l-gus intron, ont été acclimatés puis infiltrés par une suspension de P. syringae (ESΝAULT et al., 1993) à une concentration de 109 bactéries par ml. La solution a été injectée dans le limbe à l'aide d'une seringue hypodermique. Avec un tel modèle, en 48 heures, la réaction de type HR est considérée comme bien développée. Les feuilles, infiltrées par les suspensions de bactéries, ont été prélevées 24, 48 et 96 heures après inoculation pour évaluer, par test histochimique GUS, l'induction des différents promoteurs étudiés. L'analyse d'une éventuelle réponse systémique a été aussi évaluée, en utilisant le même test histochimique, sur des feuilles situées en dessous de la feuille infiltrée.
* Etude de 1 ' induction des promoteurs en conditions de réaction de type HR a) Promoteur constitutif 35S
Dans le cas du promoteur constitutif 35S 27
(plasmide pG3-3 par exemple), l'inoculation par P . syringae n'a pas modifié la réponse au test et cela en quelques minutes d'incubation. L'infiltration par les bactéries n'altère donc pas l'activité glucuronidase de type constitutive obtenue avec le promoteur 35S. b) Promoteur du gène de protéines PR : Promoteur PMs PR10-1
Comme le montre le tableau 2, ce promoteur est bien inductible par l'attaque par un pathogène. A 24 heures, la réaction de type HR n'est pas encore entièrement développée (48 heures pour l'exposition complète), cependant, le test GUS est déjà positif. Avec les jeunes plants de tabac transformés obtenus, la coloration est faible et est localisée majoritairement dans le limbe de la feuille infiltrée.
En réponse systémique, réponse au niveau de la feuille inférieure à la feuille infectée, la coloration est uniquement dans le limbe. Les plants de tabac adultes
(tiges développées mais n'ayant pas encore fleuri) et juvéniles (en rosette) ont le même type de réponse avec une activité faible du gène gus, déterminée par le test histochimique .
Pour les tabacs plus âgés, en fleur ou portant des graines, la coloration obtenue lors du test est plus intense, surtout dans les nervures et les trichomes de la feuille infectée et uniquement dans ces tissus pour la réponse systémique .
Des différences d'expression du gène rapporteur sont donc mis en évidence selon l'âge de la plante. Cette réponse, dépendante du stade de développement, a été trouvée dans la plupart des études menées sur les protéines PR des végétaux. L'induction du promoteur PMs PR10-1 est un phénomène transitoire puisque l'expression du gène rapporteur n'est plus visible 96 heures après l'inoculation par les bactéries .
L'induction n'est pas non plus limitée à la réaction de type HR obtenue lors de l'interaction 28
plante/bactérie. Le même type de réponse a été obtenu avec la construction PMs PR10-l-gus intron lors d'une infection de l'un des explants par un champignon. Une expression homogène du gène gus a alors été visible sur l'ensemble de la feuille infectée, hormis la zone de contamination qui, elle, s'est nécrosée.
Tableau 2
Induction des différents promoteurs étudiés lors de la réaction de type HR entre N. benthamiana et P. syringae .
24h après inoculation 96h après inoculation
Construction Feuille Feuille Feuille infiltrée infiltrée inférieure réaction type HR
PMs PR10-1 6/7 6/7 0/3
pG3-3 (35S) 3/3 3/3 0/3
Figure imgf000030_0001
Légende Tableau 2 :
Les résultats sont présentés en nombre de plantes répondant positivement au test histochimique GUS par rapport au nombre de plantes analysées .
Expression quantitative du gène crus intron sous contrôle des différents promoteurs . La méthode est basée sur un test enzymatique.
Elle utilise : a) un extrait brut de l'enzyme codée par le gène gus obtenu à partir des plants de tabac transformés, et b) un substrat, le p nitro-phenyl-glucuronide . La vitesse d'hydrolyse du substrat est suivie au spectro- photomètre et est rapportée à la quantité totale de protéines de l'extrait. La méthode nécessite par contre la présence d'un promoteur fort, en amont du gène gus, car elle est peu sensible. 29
En conséquence, elle n'a pas été appliquée aux essais pour lesquels 12 heures ou plus d'incubation avec le substrat utilisé pour le test histochimique (X gluc :
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β glucuronide) ont été néces- saires.
Dans ces conditions expérimentales, le promoteur 35S, placé dans le plasmide pG3-3, a donné une vitesse d'hydrolyse du substrat (exprimée en unité arbitraire) 5 fois plus élevée que le promoteur PMs PR10-1, placé quant à lui dans le plasmide pPR97. Par contre, le promoteur PMs PR10-1 a donné une plus forte expression du gène gus que le promoteur 35S, si celui-ci est placé dans le plasmide p35S- gus intron. En effet, dans ce dernier cas aucune détection d'hydrolyse du substrat n'a été obtenue. De même, les autres constructions n'ont pas permis de donner de valeurs détectables au spectro- photomètre .
Conclusions Le promoteur PMs PR10-1, isolé de M. sa tiva
(luzerne) , répond bien aux caractéristiques requises pour l'utiliser comme séquence de régulation d'un gène d'intérêt agronomique pouvant agir dans la défense des plantes contre une attaque d'un pathogène. Il est inductible par un pathogène (bactérie et champignon) et cela y compris dans un système hétérologue, le tabac. Il a en outre une activité constitutive faible, principalement dans les racines, y compris dans d'autres sytèmes hétérologues (Λf. truncatula et L . corniculata) . Une autre activité constitutive, non encore expliquée, a aussi été constatée dans les cals embryogènes de luzerne . 30
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Claims

36
REVENDICATIONS
1) Séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe comprenant : a) la séquence IND SI, b) toute séquence correspondant à un fragment de la séquence IND SI et ayant effet de séquence promotrice chez les plantes.
2) Promoteur chez les plantes, choisi dans le groupe comprenant : a) le promoteur PMs PR10-1 correspondant à la séquence IND SI, b) un promoteur de type PMs PR10-1 correspondant à une séquence selon la revendication lb) .
3) Promoteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que le promoteur de type PMs PR10-1 présente au moins 80 % d'homologie avec la séquence IND SI.
4) Promoteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que le promoteur de type PMs PR10-1 présente au moins 90 % d'homologie avec la séquence IND SI.
5) Promoteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que le promoteur de type PMs PR10-1 présente au moins 95 % d'homologie avec la séquence IND SI.
6) Séquence promotrice chez les plantes, caractérisée en ce qu'elle comporte une séquence identique à celles des promoteurs selon l'une des revendications 2 à 5.
7) Utilisation d'un promoteur selon l'une des revendications 2 à 5, pour l'expression, tissu spécifique ou non, d'un gène de manière inductible dans les plantes par un stress biotique ou abiotique. 37
8) Utilisation d'un promoteur selon la revendication
7, caractérisée en ce que le stress biotique est l'attaque d'un parasite.
9) Utilisation d'un promoteur selon la revendication
8, caractérisée en ce que le parasite est un virus, une bactérie, une levure ou un champignon.
10) Utilisation d'un promoteur selon la revendication 7, caractérisée en ce que le stress abiotique est une blessure mécanique.
11) Utilisation d'un promoteur selon la revendication 10, caractérisée en ce que la blessure mécanique est causée par un insecte .
12) Utilisation d'un promoteur selon la revendication 10, caractérisée en ce que la blessure mécanique est causée par un phénomène physique tel que le vent ou le gel .
13) Système d'expression d'un gène chez les plantes, caractérisé en ce qu'il comporte au moins la séquence dudit gène sous le contrôle d'un promoteur ou d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 6.
14) Vecteur d'expression d'un gène, caractérisé en ce qu'il comporte au moins la séquence dudit gène sous le contrôle d'un promoteur ou d'une séquence selon l'une des revendications 1 à 6.
15) Vecteur d'expression selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide.
16) Vecteur d'expression selon l'une des revendica- tions 14 et 15, caractérisé en ce qu'il peut être transféré dans des souches d ' Agrobacterium. 38
17) Système ou vecteur selon l'une des revendications 13 à 16, caractérisé en ce qu'il est inductible dans les plantes par un stress biotique ou abiotique.
18) Système ou vecteur selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit gène est un gène d'intérêt.
19) Système ou vecteur selon la revendication 18, caractérisé en ce que ledit gène d'intérêt est un gène impliqué dans la réponse a un stress biotique ou abiotique.
20) Système ou vecteur selon la revendication 19, caractérisé en ce que ledit gène d'intérêt est un gène impliqué dans la réponse au stress biotique ou abiotique inducteur.
21) Système ou vecteur selon la revendication 20, caractérisé en ce que le stress biotique est l'attaque d'un parasite et le gène d'intérêt un gène de résistance audit parasite.
22) Système ou vecteur selon la revendication 21, caractérisé en ce que le parasite est un virus une bactérie, une levure ou un champignon, et le gène d'intérêt est un gène intervenant dans la synthèse de molécule à action anti-pathogène.
23) Système ou vecteur selon la revendication 22, caractérisé en ce que la molécule à action anti-pathogène est choisie parmi les phytoalexines ou les PR protéines .
24) Cellule végétale transformée par un système ou un vecteur selon l'une des revendications 13 à 23.
25) Cellule selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'il s'agit de cellule de vigne. 39
26) Cellule selon l'une des revendications 24 et 25, caractérisée en ce que le gène d'intérêt est un gène de résistance à un parasite.
27) Procédé d'obtention de cellule végétale, caractérisé en ce qu'on transforme une cellule végétale à l'aide d'un procédé microbiologique incluant un système ou vecteur selon l'une des revendications 13 à 23.
28) Procédé d'obtention de plante exprimant un gène d'intérêt, caractérisé en ce qu'on transforme des cellules végétales desdites plantes à l'aide d'un système ou d'un vecteur selon l'une des revendications 13 à 23, on sélectionne les cellules exprimant le gène d'intérêt et l'on régénère une plante à partir desdites cellules sélectionnées .
29) Plante comportant un système ou un vecteur selon l'une des revendications 13 à 23.
30) Plante comportant des cellules selon l'une des revendications 24 à 26.
31) Plante obtenue par la mise en oeuvre d'un procédé selon la revendication 28.
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