JPH0564739B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は、免疫化学的測定法の一つである酵素
免疫測定法（以下「EIA」と言う。）に用いられ
る担体とそれを用いた酵素免疫測定法に関するも
のである。 ［従来の技術］ 生体に作用する種々の蛋白、ホルモン等を高感
度で測定するための免疫化学的測定法は近年、臨
床検査の分野等で重要性を増し、その一つとし
て、EIAが広く繁用されている。この測定法は、
抗原又は抗体をβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペル
オキシダーゼのような酵素で標識し、これを基質
とを反応させ、酵素によつて合成された化合物の
量で目的とする蛋白、又はホルモン等を定量する
方法である。 EIAは測定手法の相異により、サンドイツチ
法、二抗体法、競合法等に分けられる。基本原理
である抗原又は抗体等を適当な担体に不溶化し、
これに抗原又は抗体等の被測定物を作用させる
点、また、その量の測定のために抗体又は抗原に
酵素を標識し、それを次に反応させ、その後、固
相と液相とを分離し、固相側又は液相側の酵素反
応による生成物を測定することにより、その目的
物質の量を知る点については共通である。 EIAに用いられる不溶化担体は、普通ポリスチ
レンボール、プラスチツク試験管、ガラスビーズ
等が用いられ、前二者は抗原又は抗体を物理的に
固着させ、後者は化学的結合で固着させている。 ［発明が解決しようとする問題点］ しかし、これらの抗原又は抗体を担持した担体
は、不安定で極めて保存性が悪く、通常、測定す
る直前に担体に抗原又は抗体を担持させていた。
そのため、測定準備に時間を要し、その結果、判
定が遅くなるとともに、複数回の測定に誤差を生
ずる恐れもあつた。又、測定毎に担体を調整する
ため、担体自体の品質も一定のものが得にくいと
いう問題もあつた。 しかも、上記した測定法の内、前二者は、抗体
または抗原を物理的固着でポリスチレンボールや
ポリスチレンチユーブ等の担体に結合させるた
め、抗体または抗原の性状に因つては十分な固着
ができず、測定結果が一定しないといつた不合理
な結果を見ることもあつた。 ［問題点を解決するための手段］ 本発明は安定な、保存性の高い担体を提供する
とともに、それを用いた測定法も提供することを
目的とするものであり、その解決手段として、次
のような構成を採用するものである。 即ち、第１発明は、 式 R₁−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−R₂−R₃ （式中のR₁は一価の炭化水素基、R₂は二価の
炭化水素基、R₃はR₂と結合することにより第三
アミンを形成するアミノ基を表わす。）で表わさ
れる化合物群の内から選ばれた１種又は２種以上
の化合物を用いて、抗原又は抗体を担持させたポ
リアクリルアミドからなる担体を処理し、次いで
該担体をグアニジン塩又は尿素にて処理してなる
ことを特徴とする酵素免疫測定用担体を要旨とす
る。 第２発明は、 式 R₁−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−R₂−R₃ （式中のR₁は一価の炭化水素基、R₂は二価の
炭化水素基、R₃はR₂と結合することにより第三
アミンを形成するアミノ基を表わす。）で表わさ
れる化合物群の内から選ばれた１種又は２種以上
の化合物を用いて、第１の抗原又は第１の抗体を
担持させたポリアクリルアミドからなる担体を処
理し、次いで該担体をグアニジン塩又は尿素にて
処理してなる酵素免疫測定用担体に、 測定対象の抗体又は抗原を上記第１の抗原又は
第１の抗体との抗原抗体反応にて結合させ、 次いで上記測定対象の抗体又は抗原と結合した
担体に、酵素が標識された所定量の第２の抗原又
は第２の抗体を上記測定対象の抗体又は抗原との
抗原抗体反応にて結合させた後、 上記担体に結合した又は結合しなかつた第２の
抗原又は第２の抗体の酵素活性を測定することに
より上記測定対象の抗体又は抗原の量を測定する
ことを特徴とする酵素免疫測定法を要旨とする。 第１発明及び第２発明において、 R₁−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−R₂−R₃ は、カルボジイミドの誘導体を表わしている。こ
こで、R₁は一価の炭化水素基であり、例えばメ
チル基、エチル基、プロピル基、シクロヘキシル
基等が該当する。R₂は二価の炭化水素基であり、
例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン
基、ブチレン基、シクロヘキシレン基等が該当す
る。R₃は上記R₂と結合することにより、第三ア
ミンを形成するアミノ基であり、メチル基、エチ
ル基、プロピル基等の一価の炭化水素基から選ば
れた２つの炭化水素基を有するアミノ基や、ピペ
リジノ基あるいは炭素以外の原子を環内に有する
モルホリノ基等が該当する。これらカルボジイミ
ドの誘導体の内でも、１−エチル−３−（３−ジ
エチルアミノプロピル）−カルボジイミド、１−
シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）−
カルボジイミド及び１−シクロヘキシル−３−
（４−ジエチルアミノシクロヘキシル）−カルボジ
イミドの使用が、担体上への抗原または抗体の固
定上、効果的である。 ここで用いられる担体はポリアクリルアミドか
らなるものであり、その形状は粒状、片状、繊維
状等、重量の割に表面積の大きい形態のものが主
に用いられる。表面積が大きければ、抗原又は抗
体を多量に担持させることが可能だからである。
その点、特にゲルカラムクロマトグラフイーに用
いられるゲル状のポリアクリルアミドが好まし
い。 ２番目に担体はグアニジン塩又は尿素にて処理
されるが、グアニジン塩としては無機酸の塩、有
機酸の塩が用いられ、特に塩酸グアニジンが、尿
素と同様に、担体の安定剤として高い効果を示
す。 上記カルボジイミドの誘導体や、グアニジン塩
又は尿素による処理は、通常水溶液又は分散液の
状態のものに、ポリアクリルアミドからなる担体
を浸漬することによりなされる。 第２発明における酵素活性の測定は基質の化学
変化後に生じた生成物の量によつてなされる。 ［作用］ 第１発明の酵素免疫測定用担体におけるカルボ
ジイミドの誘導体の作用は明らかではないが、お
そらくポリアクリルアミドと抗原又は抗体との架
橋剤的働きをしていると考えられる。 グアニジン塩又は尿素の作用も明らかではない
が、おそらく上記架橋状態と、抗原又は抗体自身
を安定化する作用があるものと解される。 これら両作用から、担体上の抗原又は抗体が失
活することなく長期間安定に保持されるものと考
えられる。 第２発明の酵素免疫測定法においては、上記担
体を用い、該担体上に安定して担持されている第
１の抗原又は第１の抗体に、測定しようとする抗
体又は抗原を作用させることにより、担体上の第
１の抗原又は第１の抗体の一部に抗体又は抗原を
結合させる。結合の量は測定しようとする抗原又
は抗体の濃度に比例する。 次にこの状態の担体に酵素が標識された第２の
抗原又は第２の抗体を作用させる。第２の抗原又
は第２の抗体は、測定対象の抗体又は抗原の遊離
状態にある他の反応部位に、担体上の測定対象の
抗体又は抗原の量に対応した量だけ結合すること
になる。即ち、標識された酵素は測定対象の抗体
又は抗原と比例した量が担体上に結合残存するこ
とになる。こうして、担体上又は担体外の酵素活
性を測定すれば容易に、測定対象の抗体又は抗原
の量又は濃度が決定できる。 ［発明の効果］ 第１発明の酵素免疫測定用担体は、上述のごと
く構成されていることにより、抗原又は抗体が安
定状態で担体上に担持されている。このため一度
に大量に製造でき、安定した、同一品質の測定用
担体を供給することが可能となり、測定の迅速化
と精度の向上を実現することができる。 又、第２発明の測定法は、上述のごとく構成さ
れていることにより、酵素活性により基質からの
生成物が多量に生成され、その量は酵素の量を増
幅して反映するが、担体の品質が一定で、安定し
ているためその誤差が基質からの生成物の量に反
映されても、大きな誤差は生じず、極めて正確な
測定となる。 ［実施例 １］ 担体の製造 各種原料からの抽出物（抗原）１mgを溶解させ
た0.003Mリン酸緩衝液（PH6.3）によりポリアク
リルアミド粒子（φ3〜10μ）100mgを浸漬させ、
全量を10mlにした。これを４℃で一晩静置したの
ち、さらに４℃でカルボジイミドの誘導体［１−
エチル−３−（３−ジエチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミド］を添加し10〜16時間静置した。そ
の後、0.15Mリン酸緩衝液にて洗浄し、5Mの塩
酸グアニジン水溶液にて２〜３時間静置し、固定
させた。さらにその後、保護剤として牛血清アル
ブミンにてポリアクリルアミド担体粒子を処理す
る。 このようにして製造した担体を密閉状態、５℃
で保存し、経時による安定性を確認した。同時に
従来のスチレンチユーブにカルボジイミドの誘導
体及び、塩酸グアニジンを用いずに抗体又は抗原
を担持させたものを比較例として用いた。 安定性の確認は、後述する実施例−２の方法に
より測定された図に示す吸光度の全体のカーブの
低下の程度が著しいもの、又はその吸光度による
定量測定の結果のバラツキが著しいものを不安定
と判定した。 その結果を第１表に示す。

【表】 第１表の結果より、第１発明にて製造された担
体は極めて長期にわたつて保存可能であることが
わかつた。 ［実施例 ２］ 鼻アレルギー患者の血清中に存在するダニに特
異的イムノグロブリンＧ（IgG）抗体の測定 １ 一次反応：上記担体液30μに患者血清200μ
を加え、37℃、２時間静置した。 ２ 洗浄：0.15Mリン酸緩衝液（PH7.2）（以下こ
れを「PBS」という）にて３回洗浄した。 ３ 二次反応：２の洗浄後の担体にβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ標識抗ヒトIgG5μ加え、37℃、
３時間反応させた。 ４ 洗浄：PBSで３〜４回洗浄した。 ５ 酵素反応：β−Ｄ−ガラクトピラノサイド溶
液200μを加え、37℃、一晩静置させた。 ６ 反応停止：1M炭酸ナトリウム液を500μ加
え、反応を停止させた。 ７：測定：分光光度計にて呈色液の吸光度（O.
D.420）を測定した。その結果を図に示す。図
からわかるように、血清希釈度に応じた吸光度
が示され、抗体濃度が精度よく測定された。 上述した実施例１，２について、カルボジイミ
ドの誘導体［１−エチル−３−（３−ジエチルア
ミノプロピル）−カルボジイミド、１−シクロヘ
キシル−３−（２−モルホリノエチル）−カルボジ
イミド、１−シクロヘキシル−３−（４−ジエチ
ルアミノシクロヘキシル）−カルボジイミド］と
塩酸グアニジン、尿素との他の組み合せも検討し
たところ、同様に良好な結果であつた。

【図面の簡単な説明】

図は実施例−２において抗体濃度を測定した結
果の血清希釈度と吸光度との関係を示すグラフを
表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 R₁−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−R₂−R₃ （式中のR₁は一価の炭化水素基、R₂は二価の
   炭化水素基、R₃はR₂と結合することにより第三
   アミンを形成するアミノ基を表す。）で表される
   化合物群の内から選ばれた１種又は２種以上の化
   合物を用いて、抗原又は抗体を担持させたポリア
   クリルアミドからなる担体を処理し、次いで該担
   体をグアニジン塩又は尿素にて処理してなること
   を特徴とする酵素免疫測定用担体。 ２ 式 R₁−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−R₂−R₃ （式中のR₁は一価の炭化水素基、R₂は二価の
   炭化水素基、R₃はR₂と結合することにより第三
   アミンを形成するアミノ基を表す。）で表される
   化合物群の内から選ばれた１種又は２種以上の化
   合物を用いて、第１の抗原又は第１の抗体を担持
   させたポリアクリルアミドからなる担体を処理
   し、次いで該担体をグアニジン塩又は尿素にて処
   理してなる酵素免疫測定用担体に、 測定対象の抗体又は抗原を上記第１の抗原又は
   第１の抗体との抗原抗体反応にて結合させ、 次いで上記測定対象の抗体又は抗原と結合した
   担体に、酵素が標識された所定量の第２の抗原又
   は第２の抗体を上記測定対象の抗体又は抗原との
   抗原抗体反応にて結合させた後、 上記担体に結合した又は結合しなかつた第２の
   抗原又は第２の抗体の酵素活性を測定することに
   より上記測定対象の抗体又は抗原の量を測定する
   ことを特徴とする酵素免疫測定法。