JPS6343711B2 - - Google Patents
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- JPS6343711B2 JPS6343711B2 JP54170179A JP17017979A JPS6343711B2 JP S6343711 B2 JPS6343711 B2 JP S6343711B2 JP 54170179 A JP54170179 A JP 54170179A JP 17017979 A JP17017979 A JP 17017979A JP S6343711 B2 JPS6343711 B2 JP S6343711B2
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Description
本発明と同時に出願された、本発明者の“単離
された形のレクチン−免疫学的接合体製品及びそ
の製法”という名称の特許出願明細書を本明細書
における参考文献とする。 本発明は、ラベル付き接合体を固体表面に可逆
的に付着させて反応混合物の残余分から分別した
後に固体表面から該ラベル付接合体を取出して分
析することから成る免疫学的接合体（conjugate）
の１成分、例えば抗原又は抗体の免疫化学的ラベ
ル分析技術に関する。 通常の免疫学的分析技術はいわゆるサンドイツ
チ法又は競争的結合法である。サンドイツチ法で
は既知濃度の抗原を含む血清のような試料を抗体
と免疫学的に反応させ、反応混合物の残余分から
分別する。次にこの結合抗原をラベル付き抗体と
共にインキユベーシヨンし、免疫学的に結合した
ラベル付き抗体の量を測定する。競争的結合法に
おいては測定すべき濃度の抗原と既知量のラベル
付き抗原とを競争的に抗体と免疫学的に反応させ
て反応混合物の残余分から分別する。かように分
別され、抗体に結合しているラベル付き抗原を次
に定量して元の試料中の抗原の全量を間接的に測
定する。 上記２方法の共通の問題は、結合したラベル付
き免疫学的接合体生成物を未結合のラベル付き物
質を含む反応混合物から正確に分別することであ
る。この分別のための１つの方法は、ラベル付き
反応生成物を固体表面に結合させて液状反応混合
物から除去する方法である。この方法の１つの問
題は、酵素におけるような或種のラベルでは基質
の酵素への拡散速度が遅く且つ固体表面上での酵
素の移動性が限定されるために酵素と基質との衝
突頻度が少くなるのでラベルの測定が困難だとい
うことである。液相中での酵素活性の測定は遥か
にずつと迅速で且つ正確である。この固相法のも
う１つの欠点は固相が一般に再生能力を欠くこと
である。 固体表面の再使用並びに液状基質中のラベル付
きの抗原又は抗体の測定のための１つの方法はジ
ヨンソン（Johnson）の米国特許第3896217号明
細書中に記載されている。この方法では抗体を共
有結合などによつて固体表面に不可逆的に結合さ
せた後に試料抗原と免疫学的に反応させ且つラベ
ル付けを行う。固体表面を反応混合物から分別し
た後にエチルアルコールのような開裂試薬を加え
て抗体−抗原結合を破壊する。次に、かように遊
離されたラベル付き抗原を液相中で測定し、固体
表面を再生させる。もう１つの方法はギエバ
（Giaever）の米国特許第4041146号明細書中に記
載されており、この方法では固体表面上の抗体−
抗原結合間の開裂試薬として酸を用いる。これら
の方法には多くの欠点がある。例えば該開裂はラ
ベル付き化合物の完全解放には有効でない。その
上この開裂試薬は酵素の変性並びに抗体又は抗原
の沈殿を起す可能性である。 本発明は流体試料中の免疫学的接合体の１成分
又はそれ以上の成分の測定のための固相分別方法
を提供する。説明を簡単にするため特に断らない
限り抗限とは試料化合物を意味し、抗体とは接合
体の反応する免疫学的化合物を意味する。ラベル
付き接合体を固体表面に可逆的に付着させ、次に
免疫化学的結合を開裂することなく固体表面から
解放する。１つの実施態様においては不溶化糖が
固体表面に不可逆的に結合しており且つ抗体によ
つてレクチンに結合させたラベル付き免疫学的反
応生成物がこの不溶化糖と選択的に且つ可逆的に
反応性である。このラベル付きレクチン結合生成
物をこの特殊な糖と接触させ、且つこれを固体表
面上に保持して、可溶性ラベル生成物を含む残り
の反応混合物から分別する。その後に不溶化糖結
合レクチン生成物中のラベル付き化合物の量を、
測定すべき試料成分の量の目安として測定する。
１つの好ましい測定方法では、分別されたラベル
付き生成物をこのラベル付き生成物と同じ型の糖
の溶液を用いてカラムから洗つてラベル付きレク
チン生成物をカラムから溶液中に放出させた後に
溶液中のラベル付き生成物を測定する。 上記の方法はそれを通して反応混合物を通過さ
せる多孔性粒子床または固体濾過材に不溶化糖を
共有結合させる急速貫流系に適用可能である。ま
た多数の抗原又は抗体を、異なるラベル（例えば
酵素）を有する異なる特異的な抗体又は抗原を用
いることによつて分析することも可能である。こ
の場合には反応混合物を単一のカラム中へ通過さ
せ、且つカラムから放出させた後に溶液中の異な
る酵素を分析する。所望ならばレクチンと糖との
役割を逆にし、レクチンを不溶化し、糖を免疫学
的複合体の１構成員に結合させることができる。 本発明の目的は先行技術の上記欠点をなくした
免疫学的接合体の１成分の定量分析法を提供する
ことである。 本発明の特別な目的はラベル付き免疫学的反応
生成物を固体表面に可逆的に結合させることによ
つて反応混合物の残余分から分別した後に測定の
ため容易に溶液中に放出させることから成る上記
の型の分析法を提供することである。 本発明の特別な目的は可逆的な基質結合のため
に特異なレクチン−糖対を用いる特異な固体表面
免疫化学系を提供することである。 本発明のそれ以上の目的は上記の型の貫流系を
提供することである。 本発明のさらにもう１つの目的は均一溶液のイ
ンキユベーシヨン法とその後の上記分別法とを提
供することである。 本発明のさらにもう１つの目的は多成分定量の
可能な系を提供することである。 上記以外の本発明の目的並びに特徴は好ましい
実施態様を示す以下の詳細な説明から明らかにな
るであろう。 本発明の免疫学的方法では免疫学的反応混合物
からのラベル付き免疫学的反応生成物の分別方式
として、レクチン−糖対の１員が固体表面上で不
溶化形にされた該対の１員との高度に特異的な可
逆的反応生成物を使用する。その後にカラム上に
存在するものと同じ型の可溶性の糖又はレクチン
を通過させて反応生成物を固体表面からストリツ
ピングし、分析すべき物質の目安としてこの混合
物中のラベル付き化合物の量を測定する。 本発明の系は免疫学的接合体の１成分の測定に
適用可能である。広義にはかような接合体は互い
に免疫学的に結合する物質の対を含む。特に接合
体は抗原とその抗体、生物学的機能性ハプテンと
その抗体、酵素とその基質、ホルモンとその受容
体並びにビタミンとその受容体を含む。かくして
接合体は第１抗体と第１抗体に対抗する第２抗体
とを含むことができる。説明を簡単にするため特
に断らない限り以下、測定すべき流体試料特に血
清の成分として抗原を有する抗原−抗体対を免疫
学的接合体と称する。他の別法は試料中の抗体の
分析法を含む。 レクチン類は、特別な糖に対して受容体部位特
異性を有するが他の糖に対しては受容体部位特異
性を有しない蛋白質又は糖蛋白質である。例えば
コンカナバリンＡ（Concanavalin）（ConA）はα
−Ｄ−グルコース及びα−Ｄ−マンノースに対し
て特異性を有する。グルコースのような配位子が
固体マトリツクスに共有結合しているとき、グル
コース配位子がConAの受容体部位と結合性をも
つのでConAは表面上に保持される。かようにし
てグルコース溶液はConAを表面から放出させ
る。 本発明の系でレクチンは好ましくは共有結合に
よつて抗体又は抗原に不可逆的に結合する。該結
合はレクチンと抗原又は抗体とを二官能性架橋剤
によつて架橋することによつて行われることが適
当である。適当な二官能性化合物はK.ピーター
ズ（Peters）及びF.M.リチヤーズ（Richards）
による報文（Ann.Rev.Biochem）46（1977）523〕
中に記載されている。アルキルイミデートは蛋白
質によつてそれらに示される官能基の中で高度の
特異性を示す。反応は第一級アミノ基に対して特
異的である。 血清のような流体試料中の抗原の測定のために
は、抗体に免疫学的に結合した抗原を含む反応生
成物を生成させ次にこの生成物をレクチンに結合
させる。この反応生成物中には免疫学的対の中で
同じ型の抗原又は同じ型の抗体のいずれかに結合
したラベル化合物が含まれる。次に反応生成物
を、結合レクチンと選択的に且つ可逆的に反応性
の不溶化糖と接触させて反応生成物をレクチンに
よつて不溶化糖に可逆的に結合させる。次に不溶
化糖結合レクチン反応生成物を反応混合物の残余
分から分別し、反応生成物又は残余分のいずれか
の中にあるラベル付き化合物の量を試料中の抗原
量の目安として測定する。好ましくは反応生成物
中のラベル化合物を測定するが、測定前に不溶化
糖を糖溶液と接触させてレクチン生成物を洗浄除
去し、可溶形のラベル化合物の測定を可能にす
る。 特殊な様式で表現すると前節の免疫学的接合体
反応生成物は次のようにして生成される。まず抗
原を含む流体試料と、レクチンに結合したその特
異的な抗体とを接触させ、及び同じ抗原又はその
特異的な抗体のいずれかのラベル付きの形のもの
と接触させ、かようにして免疫学的反応生成物を
生成させる。残りの工程は上記のようにして行わ
れる。 主題分別系に使用するための２つの好ましい免
疫学的反応方式は競争型とサンドイツチ型とであ
る。しかしながら分別が固体表面上の可逆的レク
チン−糖結合を用いて行われる限り、他の方式も
使用できることは言うまでもない。まる競争的方
法について以下に説明する。 競争的均一免疫学的系 本発明の１つの形において、均一免疫学的反応
を最初にすべて溶液中で逐次に又は同時に行う。
血清のような流体試料中の抗原を測定すると仮定
し、抗原を含む試料と“酵素のようなラベル化合
物に好適には二官能状架橋剤によつて、共有的に
結合させた既知量の抗原”とを混合する。さらに
レクチンに結合させた上記抗原の特異的抗体を加
えて流体反応混合物をつくり、インキユベーシヨ
ンする。インキユベーシヨン中に未知抗原とラベ
ル付き抗原とは既知の方法でレクチン結合抗体と
競争的に反応して免疫反応生成物を生成する。こ
の生成物を“固体表面に結合されていて結合レク
チンと選択的且つ可逆的に反応性の型の不溶化
糖”と接触させる。固体表面への糖の結合も通常
の二官能性架橋剤による共有型結合であることが
適当である。反応生成物はレクチンによつて不溶
化糖に可逆的に結合される。 次の工程で、不溶化糖結合レクチン反応生成物
を反応混合物の残余分から分別する。基質が粒子
の充填カラムから成ると仮定すると、この工程は
反応混合物の非レクチン部分の除去のために反応
混合物をカラムを通して流すことによつて行われ
ることが適当である。 その後に不溶化糖結合レクチン生成物又は反応
混合物の残余分のいずれかの中のラベル付き化合
物の量を試料中の抗原の量の目安として測定す
る。この工程は、不溶化糖結合レクチン生成物と
“不溶化糖と同じ型のラベル付き糖”とを接触さ
せ、結合レクチン生成物と可溶性糖とを反応させ
て可溶化形に変えることによつて行われることが
好ましい。次に可溶性成分と不溶性成分と異なる
画分に分ける。その後に好ましくは可溶性画分中
のラベル付き化合物の量を試料中の抗原の量の目
安として測定する。 上記の酵素ラベル系では、通常の競争系と同様
に、可溶性糖画分中の酵素濃度は抗体部位に対し
て被測定抗原と競争した抗原酵素接合体濃度に由
来するものであるので、酵素濃度は被測定抗原濃
度に対して逆比例の関係を有する。抗原の種々の
標準濃度において酵素濃度対インキユベーシヨン
時間〔床中の次の流れ（Subsequent flow）を含
む〕の曲線をプロツトすることができる。これか
ら一定のインキユベーシヨン時間における標準抗
原濃度対酵素率（enzyme rate）の第２標準曲線
をプロツトすることができる。未知抗原の酵素率
を同じインキユベーシヨン時間を用いて測定す
る。次に上記酵素率対抗原のプロツトの結果から
未知抗原の量を測定することができる。 或種の血清試料は抗体結合レクチンと反応性の
糖蛋白質を含む。この糖蛋白質はラベル付き免疫
学的接合体に結合したレクチンの反応性部位に対
して不溶化糖と競争することができ、レクチン生
成物の一部分を不溶化糖に結合させずにカラムを
通過させる可能性がある。この潜在的な誤差源を
避けるため、抗体結合レクチンと同じ型で抗体に
結合していない遊離のレクチンを、レクチンと反
応性の試料糖蛋白よりも過剰に試料へ添加するこ
とができる。この方法により未結合レクチンは糖
蛋白質のレクチン反応性部位を閉塞し、この妨害
源を除去する。 該異質の蛋白質の妨害を除去する他の方法で
は、不溶化糖との接触前に、反応前又は反応後の
試料を、ラベル付き免疫学的反応生成物に結合し
ているレクチンと同じ型であつて抗体に結合して
いない不溶化レクチンの床中を通過させることが
できる。不溶化レクチンは床粒子に共有結合して
いることが適当である。試料をこの床中を通過さ
せることによつて糖蛋白質はカラム上に保持さ
れ、試料から除去される。 競争的貫流免疫学的系 この系の実施態様においては不溶化糖との接触
前にインキユベーシヨンの必要はない。抗原を測
定すると仮定し、その抗原に対して特異的なレク
チン結合抗体を“結合レクチンと選択的に反応性
の不溶化糖”の多孔性床のような包含容積（ａ
contained volume）中を通過させてレクチンを
不溶化糖に可逆的に結合させる。抗原を含む試料
及びラベル付き可溶形の既知量の抗原をこの包含
容積中を通過させ、カラム上の抗体反応性部位に
対して２つの形の抗原間の競争的免疫学的反応を
起させる。試料抗原及びラベル付き抗原は、同時
に或は順次には無関係に次から次へとカラム中を
通過することが可能であることがわかつた。床中
の滞留時間を調節して免疫学的反応を完了させる
ことができる。 この反応計画の残りは均一反応に関して述べた
ものと同じである。要するにレクチンによつて不
溶化糖に結合されない反応混合物の部分は床から
除去される。所望ならばこの未結合部分の酵素活
性を測定することができる。しかし好ましくは不
溶化糖に結合したラベル付き化合物の量を試料中
の未結合成分の量の目安として測定する。上記し
たように、このことは可溶性糖の溶液を用いてレ
クチン生成物をカラムからストリツピングするこ
とによつて行われることが好ましい。標準抗原及
び未知抗原に対して床中で一定インキユベーシヨ
ン時間を用い、同じ酵素測定計画を用いることが
できる。上記したように試料がレクチンと反応性
の糖蛋白質を含む場合には糖蛋白質反応性部位を
閉塞することができ、或は上記方法に従つて糖蛋
白質を試料から除去することができる。 貫流競争法は溶液中の特に酵素の迅速、正確な
分析に特に適している。本発明の１つの具体形に
おいては可溶化レクチンの床を不溶化糖の床から
上流に置く。貫流中に試料糖蛋白質は第１床で除
去されるが、レクチン−免疫学的反応生成物は第
２床中に保持される。その後に糖溶液を第２床中
を通過させてカラムからラベル付き免疫学的反応
生成物を取出す。 サンドイツチ均一免疫学的系 抗原測定のための典型的なサンドイツチ法にお
いては抗原を、分離のための手段を与える能力の
ある特異的抗体及びラベル化合物に結合させた他
の抗体と共にインキユベーシヨンして固体表面−
抗体−抗原−抗体−ラベル化合物のサンドイツチ
を生成させる。本発明の広義の用語において抗原
は流体試料中の免疫学的接合体の１成分から成
り、結合用固体表面に付着した抗体は免疫学的接
合体の対応する成分から成るが、抗（１成分）は
ラベル化合物に結合した抗体から成る。説明を簡
単にするためここでは固体表面−抗体−抗原−抗
体−ラベル化合物の特異的反応系について説明す
る。しかし抗原と抗体との役割を逆にすることに
よつて試料中の抗体を検出することから成る他の
類似の免疫学的系をも使用することができること
は言うまでもない。 レクチンに結合させた抗体と共に試料中の抗原
をインキユベーシヨンして免疫学的な反応を起さ
せる。またこの免疫学的に結合した抗原をラベル
付き抗体と共にインキユベーシヨンして第２の免
疫学的反応を起させる。これら２つのインキユベ
ーシヨン工程は同時に起つてもよく、或は生成し
た反応生成物がレクチン−抗体−抗原−抗体−ラ
ベル化合物（ここではサンドイツチレクチン反応
生成物）である限り、いずれかの順序で逐次起つ
てもよい。 次にサンドイツチレクチン反応生成物を、生成
物の結合レクチンと選択的且つ可逆的に反応性の
不溶化糖と接触させ、競争的均一免疫学的系に関
して上記操作と同様にしてレクチンを不溶化糖に
可逆的に結合させる。詳しくは、不溶化糖結合レ
クチン反応生成物を反応混合物の残余分から分別
し、この不溶化糖結合レクチン反応生成物中のラ
ベル化合物の量を試料中の抗原の量の目安として
測定する。可溶性糖の溶液によるレクチン生成物
のカラムからの上記のストリツピング法をも使用
することができる。また試料がレクチンと反応性
の糖蛋白質を含む場合にはこの誤差源を上記方法
に従つて系から除去することができる。 サンドイツチ系に類似する他の系も使用するこ
とができる。例えばレクチン−第１抗体対を(a)そ
れと免疫学的に反応する、血清中におけるような
被測定抗原と共に、及び(b)第１抗体が第２抗体に
対抗する第２抗体−ラベルと共に、インキユベー
シヨンすることができる。第１抗体と反応する抗
原は第２抗体との反応のために有効な第１抗体の
反応性部位を閉塞する。かようにして第１抗体レ
クチンに結合する第２抗体−ラベルは抗原の量と
逆比例の関係にあり、かくして抗原量の目安とな
る。この型の類似の無レクチン系はビチオン−ア
ビジン系である。 サンドイツチ貫流免疫学的系 競争的貫流免疫学的系の場合と同様にこの方法
では下溶化糖との接触前にインキユベーシヨンの
必要はない。この場合にレクチンに結合させた抗
体を“それと選択的且つ可逆的に反応し得る不溶
化糖の包含容積”と接触させて抗体−レクチンを
不溶化糖に可逆的に結合させる。次に抗原を含む
試料を、カラム上の抗体と免疫学的反応を起させ
る条件下で包含容積中を通過させる。その後にラ
ベル化合物に結合させた抗体を同じカラム中へ通
過させてカラム上の抗原と該ラベル付き抗体との
間に免疫学的反応を起させる。 残りの工程はサンドイツチ均一免疫学的系に関
し上文に説明した工程と同じである。即ち不溶化
糖結合レクチン生成物を残りの反応混合物から分
別し、ラベル化合物の量を試料成分の量の目安と
して測定する。 多種の抗原又は抗体の検出 均一又は貫流、競争的又はサンドイツチ系のい
ずれの系も血清のような流体中における２種以上
の抗原又は抗体の検出に容易に適用されることが
できる。 競争的均一系では、２種又はそれ以上の抗原或
いは抗体を分析することができる。第１抗原及び
第２抗原を含む試料と“それぞれ可溶形の、異な
る第１ラベル化合物及び第２ラベル化合物に結合
させた同じ第１抗原及び第２抗原の既知量”とを
混合し、また“おのおのをレクチンに結合させて
ある、試料の第１抗原及び第２抗原に対してそれ
ぞれ特異的な第１抗体及び第２抗体”とも混合
し、且つインキユベーシヨンさせる。次に、イン
キユベーシヨンした競争的免疫学的反応生成物と
“その生成物のレクチンと選択的且つ可逆的に反
応性の不溶化糖”とを接触させてレクチンを不溶
化糖に可逆的に結合させる。 その後に不溶化糖−レクチン生成物を残りの反
応混合物から分別し、不溶化糖−レクチン生成物
中の第１ラベル化合物及び第２ラベル化合物の量
を第１抗原及び第２抗原の量の目安として測定す
る。この測定を行うに当り不溶化糖と同じ型の可
溶性糖を用いて不溶化糖−結合レクチン生成物を
放出させ、溶液を分別し且つ可溶性画分中の第１
ラベル化合物及び第２ラベル化合物の量を測定す
ることが好ましい。酵素ラベルに特に適用可能な
１つの実施態様においては可溶性生成物を異なる
画分に分け第１及び第２の異なる酵素の量を独立
に測定する。 サンドイツチ均一系では、流体試料中の２種又
はそれ以上の抗原又は抗体を分析することができ
る。簡単化のため、以下に第１抗原と第２抗原と
を含む試料について説明する。この試料をそれぞ
れ可溶形の、異なる第１ラベル化合物及び第２ラ
ベル化合物に結合させた既知量の第１抗原及び第
２抗原と混合し且つインキユベーシヨンさせる。
このラベル付き抗原は試料の第１抗原及び第２抗
原と同じ型である。またこの反応混合物に、おの
おのがレクチンに結合している。試料の第１抗原
及び第２抗原に対してそれぞれ特異的な第１抗体
と第２抗体をも添加する。インキユベーシヨン中
にそれぞれの抗原−抗体対が生成する。この反応
混合物を次に上記したように“レクチンと選択的
且つ可逆的に反応性の不溶化糖”と接触させてレ
クチン反応生成物を不溶化糖に可逆的に結合させ
る。残りの工程はサンドイツチ均一系の場合と同
じである。 競争的貫流系も試料中の多種の抗原及び抗体の
測定に適用可能である。１つの特殊な実施態様に
おいては“第１抗原及び第２抗原と特異的に反応
性の、レクチンに結合させてある第１抗体及び第
２抗体”を“結合レクチンと選択的且つ可逆的に
反応性の不溶化糖の包含容積”へ通過させる。か
ようにしてレクチン−抗体を不溶化糖に特異的に
結合させる。次に第１抗原及び第２抗原を含む試
料と可溶形のラベル付きの第１抗原及び第２抗原
の既知量とを包含容積中へ通過させてラベル付き
抗原とラベル無し抗原との間に糖−結合抗体に対
する競争的免疫学的反応を起させる。 多種抗原の競争的貫流分析法の残りの工程は上
記と同様である。要するに不溶化糖基質に結合し
ない反応混合物を不溶化糖の包含容積から除去す
るのである。次に不溶化糖−結合レクチン生成物
固体表面上の第１ラベル付き化合物及び第２ラベ
ル付き化合物の量を試料中の第１抗原及び第２抗
原の目安として測定する。好ましくは糖溶液を通
過させることによつて不溶化糖基質からレクチン
生成物をストリツピングし可溶性画分を分別して
ラベル付き化合物の分析を行う。 サンドイツチ貫流系を多種の抗原又は抗体の分
析に用いることができる。以下に試料中の第１抗
原及び第２抗原の分析について説明する。試料の
第１抗原及び第２抗原に対してそれぞれ特異的で
あつてレクチンに結合している第１抗体及び第２
抗体を不溶化糖の包含容積中へ通過させ、レクチ
ン−抗体を不溶化糖に可逆的に結合させる。次に
第１抗原および第２抗原を含む試料をこの包含容
積中へ通過させて該試料と糖結合抗体との免疫学
的反応を起させる。この後にそれぞれ第１ラベル
付き化合物及び第２ラベル付き化合物に結合させ
た試料抗原（複数）に対する第３抗体および第４
抗体を糖の包含容積中へ通過させて第１試料抗原
及び第２試料抗原と該抗体（複数）との免疫学的
反応を起させる。その後にレクチンによつて不溶
化糖に結合されない反応混合物を分別し、不溶化
糖結合レクチン生成物上の第１ラベル付き化合物
及び第２ラベル付き化合物の量を試料中の第１抗
原及び第２抗原の量の目安として測定する。 好ましい系では、糖を固体表面上に不溶化し、
これを分離のために用い、レクチン免疫学的反応
生成物中に集められるが、特別な方法に対して所
望ならばレクチンと糖との各役割を逆にしてもよ
いことは言うまでもない。その場合にはレクチン
の不溶化は、結合された官能性カツプリング剤に
よる共有結合のような慣用方法で行われることが
好ましい。糖を抗原又は抗体に結合させるために
も同じカツプリング方法を用いることができる。 レクチン−糖対 上述したように可逆的な糖−レクチン結合は、
すべての上記方法において、免疫学的反応生成物
の分別方式を提供する。レクチン−糖結合の高度
に特異的な性格によつてこの方式が特に有用とな
る。レクチン及び特異的な糖の試料リストを第１
表に示す。
された形のレクチン−免疫学的接合体製品及びそ
の製法”という名称の特許出願明細書を本明細書
における参考文献とする。 本発明は、ラベル付き接合体を固体表面に可逆
的に付着させて反応混合物の残余分から分別した
後に固体表面から該ラベル付接合体を取出して分
析することから成る免疫学的接合体（conjugate）
の１成分、例えば抗原又は抗体の免疫化学的ラベ
ル分析技術に関する。 通常の免疫学的分析技術はいわゆるサンドイツ
チ法又は競争的結合法である。サンドイツチ法で
は既知濃度の抗原を含む血清のような試料を抗体
と免疫学的に反応させ、反応混合物の残余分から
分別する。次にこの結合抗原をラベル付き抗体と
共にインキユベーシヨンし、免疫学的に結合した
ラベル付き抗体の量を測定する。競争的結合法に
おいては測定すべき濃度の抗原と既知量のラベル
付き抗原とを競争的に抗体と免疫学的に反応させ
て反応混合物の残余分から分別する。かように分
別され、抗体に結合しているラベル付き抗原を次
に定量して元の試料中の抗原の全量を間接的に測
定する。 上記２方法の共通の問題は、結合したラベル付
き免疫学的接合体生成物を未結合のラベル付き物
質を含む反応混合物から正確に分別することであ
る。この分別のための１つの方法は、ラベル付き
反応生成物を固体表面に結合させて液状反応混合
物から除去する方法である。この方法の１つの問
題は、酵素におけるような或種のラベルでは基質
の酵素への拡散速度が遅く且つ固体表面上での酵
素の移動性が限定されるために酵素と基質との衝
突頻度が少くなるのでラベルの測定が困難だとい
うことである。液相中での酵素活性の測定は遥か
にずつと迅速で且つ正確である。この固相法のも
う１つの欠点は固相が一般に再生能力を欠くこと
である。 固体表面の再使用並びに液状基質中のラベル付
きの抗原又は抗体の測定のための１つの方法はジ
ヨンソン（Johnson）の米国特許第3896217号明
細書中に記載されている。この方法では抗体を共
有結合などによつて固体表面に不可逆的に結合さ
せた後に試料抗原と免疫学的に反応させ且つラベ
ル付けを行う。固体表面を反応混合物から分別し
た後にエチルアルコールのような開裂試薬を加え
て抗体−抗原結合を破壊する。次に、かように遊
離されたラベル付き抗原を液相中で測定し、固体
表面を再生させる。もう１つの方法はギエバ
（Giaever）の米国特許第4041146号明細書中に記
載されており、この方法では固体表面上の抗体−
抗原結合間の開裂試薬として酸を用いる。これら
の方法には多くの欠点がある。例えば該開裂はラ
ベル付き化合物の完全解放には有効でない。その
上この開裂試薬は酵素の変性並びに抗体又は抗原
の沈殿を起す可能性である。 本発明は流体試料中の免疫学的接合体の１成分
又はそれ以上の成分の測定のための固相分別方法
を提供する。説明を簡単にするため特に断らない
限り抗限とは試料化合物を意味し、抗体とは接合
体の反応する免疫学的化合物を意味する。ラベル
付き接合体を固体表面に可逆的に付着させ、次に
免疫化学的結合を開裂することなく固体表面から
解放する。１つの実施態様においては不溶化糖が
固体表面に不可逆的に結合しており且つ抗体によ
つてレクチンに結合させたラベル付き免疫学的反
応生成物がこの不溶化糖と選択的に且つ可逆的に
反応性である。このラベル付きレクチン結合生成
物をこの特殊な糖と接触させ、且つこれを固体表
面上に保持して、可溶性ラベル生成物を含む残り
の反応混合物から分別する。その後に不溶化糖結
合レクチン生成物中のラベル付き化合物の量を、
測定すべき試料成分の量の目安として測定する。
１つの好ましい測定方法では、分別されたラベル
付き生成物をこのラベル付き生成物と同じ型の糖
の溶液を用いてカラムから洗つてラベル付きレク
チン生成物をカラムから溶液中に放出させた後に
溶液中のラベル付き生成物を測定する。 上記の方法はそれを通して反応混合物を通過さ
せる多孔性粒子床または固体濾過材に不溶化糖を
共有結合させる急速貫流系に適用可能である。ま
た多数の抗原又は抗体を、異なるラベル（例えば
酵素）を有する異なる特異的な抗体又は抗原を用
いることによつて分析することも可能である。こ
の場合には反応混合物を単一のカラム中へ通過さ
せ、且つカラムから放出させた後に溶液中の異な
る酵素を分析する。所望ならばレクチンと糖との
役割を逆にし、レクチンを不溶化し、糖を免疫学
的複合体の１構成員に結合させることができる。 本発明の目的は先行技術の上記欠点をなくした
免疫学的接合体の１成分の定量分析法を提供する
ことである。 本発明の特別な目的はラベル付き免疫学的反応
生成物を固体表面に可逆的に結合させることによ
つて反応混合物の残余分から分別した後に測定の
ため容易に溶液中に放出させることから成る上記
の型の分析法を提供することである。 本発明の特別な目的は可逆的な基質結合のため
に特異なレクチン−糖対を用いる特異な固体表面
免疫化学系を提供することである。 本発明のそれ以上の目的は上記の型の貫流系を
提供することである。 本発明のさらにもう１つの目的は均一溶液のイ
ンキユベーシヨン法とその後の上記分別法とを提
供することである。 本発明のさらにもう１つの目的は多成分定量の
可能な系を提供することである。 上記以外の本発明の目的並びに特徴は好ましい
実施態様を示す以下の詳細な説明から明らかにな
るであろう。 本発明の免疫学的方法では免疫学的反応混合物
からのラベル付き免疫学的反応生成物の分別方式
として、レクチン−糖対の１員が固体表面上で不
溶化形にされた該対の１員との高度に特異的な可
逆的反応生成物を使用する。その後にカラム上に
存在するものと同じ型の可溶性の糖又はレクチン
を通過させて反応生成物を固体表面からストリツ
ピングし、分析すべき物質の目安としてこの混合
物中のラベル付き化合物の量を測定する。 本発明の系は免疫学的接合体の１成分の測定に
適用可能である。広義にはかような接合体は互い
に免疫学的に結合する物質の対を含む。特に接合
体は抗原とその抗体、生物学的機能性ハプテンと
その抗体、酵素とその基質、ホルモンとその受容
体並びにビタミンとその受容体を含む。かくして
接合体は第１抗体と第１抗体に対抗する第２抗体
とを含むことができる。説明を簡単にするため特
に断らない限り以下、測定すべき流体試料特に血
清の成分として抗原を有する抗原−抗体対を免疫
学的接合体と称する。他の別法は試料中の抗体の
分析法を含む。 レクチン類は、特別な糖に対して受容体部位特
異性を有するが他の糖に対しては受容体部位特異
性を有しない蛋白質又は糖蛋白質である。例えば
コンカナバリンＡ（Concanavalin）（ConA）はα
−Ｄ−グルコース及びα−Ｄ−マンノースに対し
て特異性を有する。グルコースのような配位子が
固体マトリツクスに共有結合しているとき、グル
コース配位子がConAの受容体部位と結合性をも
つのでConAは表面上に保持される。かようにし
てグルコース溶液はConAを表面から放出させ
る。 本発明の系でレクチンは好ましくは共有結合に
よつて抗体又は抗原に不可逆的に結合する。該結
合はレクチンと抗原又は抗体とを二官能性架橋剤
によつて架橋することによつて行われることが適
当である。適当な二官能性化合物はK.ピーター
ズ（Peters）及びF.M.リチヤーズ（Richards）
による報文（Ann.Rev.Biochem）46（1977）523〕
中に記載されている。アルキルイミデートは蛋白
質によつてそれらに示される官能基の中で高度の
特異性を示す。反応は第一級アミノ基に対して特
異的である。 血清のような流体試料中の抗原の測定のために
は、抗体に免疫学的に結合した抗原を含む反応生
成物を生成させ次にこの生成物をレクチンに結合
させる。この反応生成物中には免疫学的対の中で
同じ型の抗原又は同じ型の抗体のいずれかに結合
したラベル化合物が含まれる。次に反応生成物
を、結合レクチンと選択的に且つ可逆的に反応性
の不溶化糖と接触させて反応生成物をレクチンに
よつて不溶化糖に可逆的に結合させる。次に不溶
化糖結合レクチン反応生成物を反応混合物の残余
分から分別し、反応生成物又は残余分のいずれか
の中にあるラベル付き化合物の量を試料中の抗原
量の目安として測定する。好ましくは反応生成物
中のラベル化合物を測定するが、測定前に不溶化
糖を糖溶液と接触させてレクチン生成物を洗浄除
去し、可溶形のラベル化合物の測定を可能にす
る。 特殊な様式で表現すると前節の免疫学的接合体
反応生成物は次のようにして生成される。まず抗
原を含む流体試料と、レクチンに結合したその特
異的な抗体とを接触させ、及び同じ抗原又はその
特異的な抗体のいずれかのラベル付きの形のもの
と接触させ、かようにして免疫学的反応生成物を
生成させる。残りの工程は上記のようにして行わ
れる。 主題分別系に使用するための２つの好ましい免
疫学的反応方式は競争型とサンドイツチ型とであ
る。しかしながら分別が固体表面上の可逆的レク
チン−糖結合を用いて行われる限り、他の方式も
使用できることは言うまでもない。まる競争的方
法について以下に説明する。 競争的均一免疫学的系 本発明の１つの形において、均一免疫学的反応
を最初にすべて溶液中で逐次に又は同時に行う。
血清のような流体試料中の抗原を測定すると仮定
し、抗原を含む試料と“酵素のようなラベル化合
物に好適には二官能状架橋剤によつて、共有的に
結合させた既知量の抗原”とを混合する。さらに
レクチンに結合させた上記抗原の特異的抗体を加
えて流体反応混合物をつくり、インキユベーシヨ
ンする。インキユベーシヨン中に未知抗原とラベ
ル付き抗原とは既知の方法でレクチン結合抗体と
競争的に反応して免疫反応生成物を生成する。こ
の生成物を“固体表面に結合されていて結合レク
チンと選択的且つ可逆的に反応性の型の不溶化
糖”と接触させる。固体表面への糖の結合も通常
の二官能性架橋剤による共有型結合であることが
適当である。反応生成物はレクチンによつて不溶
化糖に可逆的に結合される。 次の工程で、不溶化糖結合レクチン反応生成物
を反応混合物の残余分から分別する。基質が粒子
の充填カラムから成ると仮定すると、この工程は
反応混合物の非レクチン部分の除去のために反応
混合物をカラムを通して流すことによつて行われ
ることが適当である。 その後に不溶化糖結合レクチン生成物又は反応
混合物の残余分のいずれかの中のラベル付き化合
物の量を試料中の抗原の量の目安として測定す
る。この工程は、不溶化糖結合レクチン生成物と
“不溶化糖と同じ型のラベル付き糖”とを接触さ
せ、結合レクチン生成物と可溶性糖とを反応させ
て可溶化形に変えることによつて行われることが
好ましい。次に可溶性成分と不溶性成分と異なる
画分に分ける。その後に好ましくは可溶性画分中
のラベル付き化合物の量を試料中の抗原の量の目
安として測定する。 上記の酵素ラベル系では、通常の競争系と同様
に、可溶性糖画分中の酵素濃度は抗体部位に対し
て被測定抗原と競争した抗原酵素接合体濃度に由
来するものであるので、酵素濃度は被測定抗原濃
度に対して逆比例の関係を有する。抗原の種々の
標準濃度において酵素濃度対インキユベーシヨン
時間〔床中の次の流れ（Subsequent flow）を含
む〕の曲線をプロツトすることができる。これか
ら一定のインキユベーシヨン時間における標準抗
原濃度対酵素率（enzyme rate）の第２標準曲線
をプロツトすることができる。未知抗原の酵素率
を同じインキユベーシヨン時間を用いて測定す
る。次に上記酵素率対抗原のプロツトの結果から
未知抗原の量を測定することができる。 或種の血清試料は抗体結合レクチンと反応性の
糖蛋白質を含む。この糖蛋白質はラベル付き免疫
学的接合体に結合したレクチンの反応性部位に対
して不溶化糖と競争することができ、レクチン生
成物の一部分を不溶化糖に結合させずにカラムを
通過させる可能性がある。この潜在的な誤差源を
避けるため、抗体結合レクチンと同じ型で抗体に
結合していない遊離のレクチンを、レクチンと反
応性の試料糖蛋白よりも過剰に試料へ添加するこ
とができる。この方法により未結合レクチンは糖
蛋白質のレクチン反応性部位を閉塞し、この妨害
源を除去する。 該異質の蛋白質の妨害を除去する他の方法で
は、不溶化糖との接触前に、反応前又は反応後の
試料を、ラベル付き免疫学的反応生成物に結合し
ているレクチンと同じ型であつて抗体に結合して
いない不溶化レクチンの床中を通過させることが
できる。不溶化レクチンは床粒子に共有結合して
いることが適当である。試料をこの床中を通過さ
せることによつて糖蛋白質はカラム上に保持さ
れ、試料から除去される。 競争的貫流免疫学的系 この系の実施態様においては不溶化糖との接触
前にインキユベーシヨンの必要はない。抗原を測
定すると仮定し、その抗原に対して特異的なレク
チン結合抗体を“結合レクチンと選択的に反応性
の不溶化糖”の多孔性床のような包含容積（ａ
contained volume）中を通過させてレクチンを
不溶化糖に可逆的に結合させる。抗原を含む試料
及びラベル付き可溶形の既知量の抗原をこの包含
容積中を通過させ、カラム上の抗体反応性部位に
対して２つの形の抗原間の競争的免疫学的反応を
起させる。試料抗原及びラベル付き抗原は、同時
に或は順次には無関係に次から次へとカラム中を
通過することが可能であることがわかつた。床中
の滞留時間を調節して免疫学的反応を完了させる
ことができる。 この反応計画の残りは均一反応に関して述べた
ものと同じである。要するにレクチンによつて不
溶化糖に結合されない反応混合物の部分は床から
除去される。所望ならばこの未結合部分の酵素活
性を測定することができる。しかし好ましくは不
溶化糖に結合したラベル付き化合物の量を試料中
の未結合成分の量の目安として測定する。上記し
たように、このことは可溶性糖の溶液を用いてレ
クチン生成物をカラムからストリツピングするこ
とによつて行われることが好ましい。標準抗原及
び未知抗原に対して床中で一定インキユベーシヨ
ン時間を用い、同じ酵素測定計画を用いることが
できる。上記したように試料がレクチンと反応性
の糖蛋白質を含む場合には糖蛋白質反応性部位を
閉塞することができ、或は上記方法に従つて糖蛋
白質を試料から除去することができる。 貫流競争法は溶液中の特に酵素の迅速、正確な
分析に特に適している。本発明の１つの具体形に
おいては可溶化レクチンの床を不溶化糖の床から
上流に置く。貫流中に試料糖蛋白質は第１床で除
去されるが、レクチン−免疫学的反応生成物は第
２床中に保持される。その後に糖溶液を第２床中
を通過させてカラムからラベル付き免疫学的反応
生成物を取出す。 サンドイツチ均一免疫学的系 抗原測定のための典型的なサンドイツチ法にお
いては抗原を、分離のための手段を与える能力の
ある特異的抗体及びラベル化合物に結合させた他
の抗体と共にインキユベーシヨンして固体表面−
抗体−抗原−抗体−ラベル化合物のサンドイツチ
を生成させる。本発明の広義の用語において抗原
は流体試料中の免疫学的接合体の１成分から成
り、結合用固体表面に付着した抗体は免疫学的接
合体の対応する成分から成るが、抗（１成分）は
ラベル化合物に結合した抗体から成る。説明を簡
単にするためここでは固体表面−抗体−抗原−抗
体−ラベル化合物の特異的反応系について説明す
る。しかし抗原と抗体との役割を逆にすることに
よつて試料中の抗体を検出することから成る他の
類似の免疫学的系をも使用することができること
は言うまでもない。 レクチンに結合させた抗体と共に試料中の抗原
をインキユベーシヨンして免疫学的な反応を起さ
せる。またこの免疫学的に結合した抗原をラベル
付き抗体と共にインキユベーシヨンして第２の免
疫学的反応を起させる。これら２つのインキユベ
ーシヨン工程は同時に起つてもよく、或は生成し
た反応生成物がレクチン−抗体−抗原−抗体−ラ
ベル化合物（ここではサンドイツチレクチン反応
生成物）である限り、いずれかの順序で逐次起つ
てもよい。 次にサンドイツチレクチン反応生成物を、生成
物の結合レクチンと選択的且つ可逆的に反応性の
不溶化糖と接触させ、競争的均一免疫学的系に関
して上記操作と同様にしてレクチンを不溶化糖に
可逆的に結合させる。詳しくは、不溶化糖結合レ
クチン反応生成物を反応混合物の残余分から分別
し、この不溶化糖結合レクチン反応生成物中のラ
ベル化合物の量を試料中の抗原の量の目安として
測定する。可溶性糖の溶液によるレクチン生成物
のカラムからの上記のストリツピング法をも使用
することができる。また試料がレクチンと反応性
の糖蛋白質を含む場合にはこの誤差源を上記方法
に従つて系から除去することができる。 サンドイツチ系に類似する他の系も使用するこ
とができる。例えばレクチン−第１抗体対を(a)そ
れと免疫学的に反応する、血清中におけるような
被測定抗原と共に、及び(b)第１抗体が第２抗体に
対抗する第２抗体−ラベルと共に、インキユベー
シヨンすることができる。第１抗体と反応する抗
原は第２抗体との反応のために有効な第１抗体の
反応性部位を閉塞する。かようにして第１抗体レ
クチンに結合する第２抗体−ラベルは抗原の量と
逆比例の関係にあり、かくして抗原量の目安とな
る。この型の類似の無レクチン系はビチオン−ア
ビジン系である。 サンドイツチ貫流免疫学的系 競争的貫流免疫学的系の場合と同様にこの方法
では下溶化糖との接触前にインキユベーシヨンの
必要はない。この場合にレクチンに結合させた抗
体を“それと選択的且つ可逆的に反応し得る不溶
化糖の包含容積”と接触させて抗体−レクチンを
不溶化糖に可逆的に結合させる。次に抗原を含む
試料を、カラム上の抗体と免疫学的反応を起させ
る条件下で包含容積中を通過させる。その後にラ
ベル化合物に結合させた抗体を同じカラム中へ通
過させてカラム上の抗原と該ラベル付き抗体との
間に免疫学的反応を起させる。 残りの工程はサンドイツチ均一免疫学的系に関
し上文に説明した工程と同じである。即ち不溶化
糖結合レクチン生成物を残りの反応混合物から分
別し、ラベル化合物の量を試料成分の量の目安と
して測定する。 多種の抗原又は抗体の検出 均一又は貫流、競争的又はサンドイツチ系のい
ずれの系も血清のような流体中における２種以上
の抗原又は抗体の検出に容易に適用されることが
できる。 競争的均一系では、２種又はそれ以上の抗原或
いは抗体を分析することができる。第１抗原及び
第２抗原を含む試料と“それぞれ可溶形の、異な
る第１ラベル化合物及び第２ラベル化合物に結合
させた同じ第１抗原及び第２抗原の既知量”とを
混合し、また“おのおのをレクチンに結合させて
ある、試料の第１抗原及び第２抗原に対してそれ
ぞれ特異的な第１抗体及び第２抗体”とも混合
し、且つインキユベーシヨンさせる。次に、イン
キユベーシヨンした競争的免疫学的反応生成物と
“その生成物のレクチンと選択的且つ可逆的に反
応性の不溶化糖”とを接触させてレクチンを不溶
化糖に可逆的に結合させる。 その後に不溶化糖−レクチン生成物を残りの反
応混合物から分別し、不溶化糖−レクチン生成物
中の第１ラベル化合物及び第２ラベル化合物の量
を第１抗原及び第２抗原の量の目安として測定す
る。この測定を行うに当り不溶化糖と同じ型の可
溶性糖を用いて不溶化糖−結合レクチン生成物を
放出させ、溶液を分別し且つ可溶性画分中の第１
ラベル化合物及び第２ラベル化合物の量を測定す
ることが好ましい。酵素ラベルに特に適用可能な
１つの実施態様においては可溶性生成物を異なる
画分に分け第１及び第２の異なる酵素の量を独立
に測定する。 サンドイツチ均一系では、流体試料中の２種又
はそれ以上の抗原又は抗体を分析することができ
る。簡単化のため、以下に第１抗原と第２抗原と
を含む試料について説明する。この試料をそれぞ
れ可溶形の、異なる第１ラベル化合物及び第２ラ
ベル化合物に結合させた既知量の第１抗原及び第
２抗原と混合し且つインキユベーシヨンさせる。
このラベル付き抗原は試料の第１抗原及び第２抗
原と同じ型である。またこの反応混合物に、おの
おのがレクチンに結合している。試料の第１抗原
及び第２抗原に対してそれぞれ特異的な第１抗体
と第２抗体をも添加する。インキユベーシヨン中
にそれぞれの抗原−抗体対が生成する。この反応
混合物を次に上記したように“レクチンと選択的
且つ可逆的に反応性の不溶化糖”と接触させてレ
クチン反応生成物を不溶化糖に可逆的に結合させ
る。残りの工程はサンドイツチ均一系の場合と同
じである。 競争的貫流系も試料中の多種の抗原及び抗体の
測定に適用可能である。１つの特殊な実施態様に
おいては“第１抗原及び第２抗原と特異的に反応
性の、レクチンに結合させてある第１抗体及び第
２抗体”を“結合レクチンと選択的且つ可逆的に
反応性の不溶化糖の包含容積”へ通過させる。か
ようにしてレクチン−抗体を不溶化糖に特異的に
結合させる。次に第１抗原及び第２抗原を含む試
料と可溶形のラベル付きの第１抗原及び第２抗原
の既知量とを包含容積中へ通過させてラベル付き
抗原とラベル無し抗原との間に糖−結合抗体に対
する競争的免疫学的反応を起させる。 多種抗原の競争的貫流分析法の残りの工程は上
記と同様である。要するに不溶化糖基質に結合し
ない反応混合物を不溶化糖の包含容積から除去す
るのである。次に不溶化糖−結合レクチン生成物
固体表面上の第１ラベル付き化合物及び第２ラベ
ル付き化合物の量を試料中の第１抗原及び第２抗
原の目安として測定する。好ましくは糖溶液を通
過させることによつて不溶化糖基質からレクチン
生成物をストリツピングし可溶性画分を分別して
ラベル付き化合物の分析を行う。 サンドイツチ貫流系を多種の抗原又は抗体の分
析に用いることができる。以下に試料中の第１抗
原及び第２抗原の分析について説明する。試料の
第１抗原及び第２抗原に対してそれぞれ特異的で
あつてレクチンに結合している第１抗体及び第２
抗体を不溶化糖の包含容積中へ通過させ、レクチ
ン−抗体を不溶化糖に可逆的に結合させる。次に
第１抗原および第２抗原を含む試料をこの包含容
積中へ通過させて該試料と糖結合抗体との免疫学
的反応を起させる。この後にそれぞれ第１ラベル
付き化合物及び第２ラベル付き化合物に結合させ
た試料抗原（複数）に対する第３抗体および第４
抗体を糖の包含容積中へ通過させて第１試料抗原
及び第２試料抗原と該抗体（複数）との免疫学的
反応を起させる。その後にレクチンによつて不溶
化糖に結合されない反応混合物を分別し、不溶化
糖結合レクチン生成物上の第１ラベル付き化合物
及び第２ラベル付き化合物の量を試料中の第１抗
原及び第２抗原の量の目安として測定する。 好ましい系では、糖を固体表面上に不溶化し、
これを分離のために用い、レクチン免疫学的反応
生成物中に集められるが、特別な方法に対して所
望ならばレクチンと糖との各役割を逆にしてもよ
いことは言うまでもない。その場合にはレクチン
の不溶化は、結合された官能性カツプリング剤に
よる共有結合のような慣用方法で行われることが
好ましい。糖を抗原又は抗体に結合させるために
も同じカツプリング方法を用いることができる。 レクチン−糖対 上述したように可逆的な糖−レクチン結合は、
すべての上記方法において、免疫学的反応生成物
の分別方式を提供する。レクチン−糖結合の高度
に特異的な性格によつてこの方式が特に有用とな
る。レクチン及び特異的な糖の試料リストを第１
表に示す。
【表】
【表】
上記レクチンの異性体をも本発明の範囲に従つ
て使用することができる。 上記レクチンは二官能性試薬によつて適当な免
疫学的物質（例えば抗体、抗原又はハプテン）に
強固に結合される。本発明では免疫学的接合体を
生成するこれらの物質のいずれをも使用すること
ができる。代表的な抗原は第２表の通りである。 第 ２ 表 アルブミン 2H−グロブリン カンシノエンブリオニツク
（Cancinoembryonic）抗原 絨毛性性腺刺激ホルモン ヘプトグロブリン ヘパチチスＢ表面抗原 lgE lgG lgM インシユリン プラセンタルラクトゲン 妊娠関連マクログロブリン ビブリオコレレ−エキソトキシンリポ多糖類 代表的なハプテンは第３表の通りである。 第 ３ 表 コルチソル 卵胞ホルモン ２，４−ジニトロフエノール プロゲステロン 甲状線刺激ホルモン モルフイン及びその他の阿片剤 アンフエタミン バルビツル酸塩 メサドン ベンゾイルエコゴニン（コカイン代謝物） ジフエニルヒダントイン フエノバルビタール プリミドン ジゴキシン モルフイン又はコデイン チロキシン 例として抗原に対する第４表中の抗体を使用す
ることができる。 第 ４ 表 アメーバ、HK−ｇ株 血清アルブミン 種々のアレルゲン カンシノエムブリオニツク抗原 絨毛性性腺刺激モルモン DNA ヒト lgG、lgM、lgA デキストラン ２，４−ジニトロフエノール エキノコクス・グラニユロウス（Echinococcus
granulous） 大腸菌エンテロトキシンＯ及びKl抗原 α−フエトプロテイン γ−グロブリン lgG骨髄腫蛋白質 免疫グロブリン 軽鎖 豚コレラウイルス 第 ４ 表（続） 回旋糸状虫（Onchocera volualus） プロスモジウム（Plosmodium）種 風疹ウイルス サルモネラ種Ｏ抗原 マンソン住血吸虫 ストレプトリジンＯ トキソプラズマゴンジウ（Toxoplasma
Gondiu） トリキネラ属旋毛虫 クルーズトリパノソーマ ローデシアトリパノソーマ及びブルーストリパノ
ソーマ コレラ菌、外毒素及びリポサツカライド 本発明の系においては次の対及び物質の間に強
力な結合が必要である。即ち(a)レクチンと免疫学
的接合体の１成分（例えば抗原、抗体又はハプテ
ン）との間、(b)ラベル化合物と該１成分との間並
びに(c)糖と不溶化用基質との間に強力な結合が必
要である。これらの化合物をカツプリングさせる
ために、ピーターズ及びリチヤーズが前掲報文中
に記載しているものと同様な二官能性試薬を使用
することができる。該カツプリング剤にはジメチ
ルマロンイミデートのようなアミドエステル、免
疫基と容易に反応してアミド結合を生成するタル
トリル（tartryl）ジアジドのアクリルアジドの
ようなアジドが含まれる。ジハロゲン化アリール
（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロ
ベンゼン）、或いは４、4′−ジフルオロ−３，
3′−ジニトロフエニルスルホン、グルタルアルデ
ヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩、ジマレイミド、
混合無水物、ｍ−マレアミドベンジルボイルＮ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル及び他の公知
の架橋剤が含まれる。 上記結合はすべて本質的に不可逆的結合であ
る。そのほかにジスルフイド及びグリコールのよ
うな官能基を有する二官能性試薬を用いることが
できる。該結合を架橋反応後に破壊することがで
きる。該試薬にはジメチル３，3′−ジチオビスプ
ロピオンイミデート、スクシンイミジルプロピオ
ンイミデート、Ｎ−（３−フルオロ−４，６−ジ
ニトロフエニル）シスタミン、タルトリルジアジ
ド、タルトリルジ（グリシルアジド）及びタルト
リルジ（ε−アミノカプロイルアジド）が含まれ
る。 或場合には試薬自体の間で直線結合を形成させ
ることができる。例えば抗体と酵素とをそれぞれ
の物質の官能基によつて結合させることができ
る。１つの特別な例として、ワサビ大根過酸化酵
素含有炭水化物を過ヨウ素酸で処理し且つ抗体と
反応させて該抗体の酵素活性を抑制せず且つ抗体
の免疫学的活性を妨害することなくシツフ塩基を
生成させることができる。 通常の酵素免疫分析に二官能性架橋剤を用いる
公知の方法には(a)１工程グルタルアルデヒド結合
法〔S.アブラメアス（S.Avrameas）、イミユノ
ケミストリー（Immunochemistry）６（1969）
43〕、(b)２工程グルタルアルデヒド結合法〔S.ア
ブラメアス、イミユノケミストリー８（1971）
1175〕、(c)糖残基の酸化お及びシツフ塩基生成法
〔P.K.ナカネ（P.K.Nakane）、J.Hisothem.
Cytochemh.22（1974）1084〕並びにジマレイミ
ド結合法〔K.カトー他、Euro.J.Biochem.62、
（1966）285〕がある。 本発明の糖又はレクチンの不溶化のための固相
表面は溶液がその中を通過できるように多孔性で
あることが好ましい。かようにして例えばセルロ
ース濾紙床の固体を用いることができる。流れに
対する抵抗がより少ない粒子床の方がさらに好ま
しい。その粒子はガラス、ポリスチレン、シート
ポリアクリルアミドゲル、ナイロン６、アガロー
ス或は本発明の分別工程で使用する糖又はレクチ
ンと共有結合を形成する能力のある他の物質であ
り得る。 免疫学的物質（例えば抗原、抗体又はハプテ
ン）に強固に結合することが通常のどんなラベル
も本発明に使用することができる。該ラベルには
燐光体及び螢光体のような発光物質、生物発光物
質、放射性物質、酵素、スピンラベル又は含金属
物質が含まれる。既述の通り好ましいラベルは酵
素である。 適当な蛍光性ラベルにはリサニム（lissanime）
ローダミンＢ、D.A.N.S.（１−ジメチルアミノナ
フタリン−５−スルホン酸）、オルトフタルデヒ
ド、フルオレスセインイソチオシアナート及び螢
光顕微鏡にしばしば用いられるフルオレスサミン
が含まれる。 数多くの公知の酵素ラベル系のいずれをも使用
することができる。１つの系はペツス（Pesce）
らの“全身的紅斑性狼瘡における血清抗DNA抗
体を測定するための酵素結合体の使用（Use of
Enzyme−Linked Antibodied to Measure
Serum Anti−DNA Antibody in Systemic
Lupus Erthyematosus）”〔Clin.Chem.20／３、
353−359（1974）〕と題する輪文中に記載してい
る。もう１つの系はG.B.ウイズダム（G.B.
Wisdom）がClin、Chem.22、（1976）1243中に
記載している。適当な酵素の表はハウク
（Hawk）らが「実際的な生理学的化学
（Practical Physiological Chemistry）」〔マクグ
ロウ．ヒルブツク社、ニユーヨーク（1954）、306
〜397頁〕中に記載している。次の第５表に適当
な酵素の種類と特別な酵素の例を示す。
て使用することができる。 上記レクチンは二官能性試薬によつて適当な免
疫学的物質（例えば抗体、抗原又はハプテン）に
強固に結合される。本発明では免疫学的接合体を
生成するこれらの物質のいずれをも使用すること
ができる。代表的な抗原は第２表の通りである。 第 ２ 表 アルブミン 2H−グロブリン カンシノエンブリオニツク
（Cancinoembryonic）抗原 絨毛性性腺刺激ホルモン ヘプトグロブリン ヘパチチスＢ表面抗原 lgE lgG lgM インシユリン プラセンタルラクトゲン 妊娠関連マクログロブリン ビブリオコレレ−エキソトキシンリポ多糖類 代表的なハプテンは第３表の通りである。 第 ３ 表 コルチソル 卵胞ホルモン ２，４−ジニトロフエノール プロゲステロン 甲状線刺激ホルモン モルフイン及びその他の阿片剤 アンフエタミン バルビツル酸塩 メサドン ベンゾイルエコゴニン（コカイン代謝物） ジフエニルヒダントイン フエノバルビタール プリミドン ジゴキシン モルフイン又はコデイン チロキシン 例として抗原に対する第４表中の抗体を使用す
ることができる。 第 ４ 表 アメーバ、HK−ｇ株 血清アルブミン 種々のアレルゲン カンシノエムブリオニツク抗原 絨毛性性腺刺激モルモン DNA ヒト lgG、lgM、lgA デキストラン ２，４−ジニトロフエノール エキノコクス・グラニユロウス（Echinococcus
granulous） 大腸菌エンテロトキシンＯ及びKl抗原 α−フエトプロテイン γ−グロブリン lgG骨髄腫蛋白質 免疫グロブリン 軽鎖 豚コレラウイルス 第 ４ 表（続） 回旋糸状虫（Onchocera volualus） プロスモジウム（Plosmodium）種 風疹ウイルス サルモネラ種Ｏ抗原 マンソン住血吸虫 ストレプトリジンＯ トキソプラズマゴンジウ（Toxoplasma
Gondiu） トリキネラ属旋毛虫 クルーズトリパノソーマ ローデシアトリパノソーマ及びブルーストリパノ
ソーマ コレラ菌、外毒素及びリポサツカライド 本発明の系においては次の対及び物質の間に強
力な結合が必要である。即ち(a)レクチンと免疫学
的接合体の１成分（例えば抗原、抗体又はハプテ
ン）との間、(b)ラベル化合物と該１成分との間並
びに(c)糖と不溶化用基質との間に強力な結合が必
要である。これらの化合物をカツプリングさせる
ために、ピーターズ及びリチヤーズが前掲報文中
に記載しているものと同様な二官能性試薬を使用
することができる。該カツプリング剤にはジメチ
ルマロンイミデートのようなアミドエステル、免
疫基と容易に反応してアミド結合を生成するタル
トリル（tartryl）ジアジドのアクリルアジドの
ようなアジドが含まれる。ジハロゲン化アリール
（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロ
ベンゼン）、或いは４、4′−ジフルオロ−３，
3′−ジニトロフエニルスルホン、グルタルアルデ
ヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド塩酸塩、ジマレイミド、
混合無水物、ｍ−マレアミドベンジルボイルＮ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル及び他の公知
の架橋剤が含まれる。 上記結合はすべて本質的に不可逆的結合であ
る。そのほかにジスルフイド及びグリコールのよ
うな官能基を有する二官能性試薬を用いることが
できる。該結合を架橋反応後に破壊することがで
きる。該試薬にはジメチル３，3′−ジチオビスプ
ロピオンイミデート、スクシンイミジルプロピオ
ンイミデート、Ｎ−（３−フルオロ−４，６−ジ
ニトロフエニル）シスタミン、タルトリルジアジ
ド、タルトリルジ（グリシルアジド）及びタルト
リルジ（ε−アミノカプロイルアジド）が含まれ
る。 或場合には試薬自体の間で直線結合を形成させ
ることができる。例えば抗体と酵素とをそれぞれ
の物質の官能基によつて結合させることができ
る。１つの特別な例として、ワサビ大根過酸化酵
素含有炭水化物を過ヨウ素酸で処理し且つ抗体と
反応させて該抗体の酵素活性を抑制せず且つ抗体
の免疫学的活性を妨害することなくシツフ塩基を
生成させることができる。 通常の酵素免疫分析に二官能性架橋剤を用いる
公知の方法には(a)１工程グルタルアルデヒド結合
法〔S.アブラメアス（S.Avrameas）、イミユノ
ケミストリー（Immunochemistry）６（1969）
43〕、(b)２工程グルタルアルデヒド結合法〔S.ア
ブラメアス、イミユノケミストリー８（1971）
1175〕、(c)糖残基の酸化お及びシツフ塩基生成法
〔P.K.ナカネ（P.K.Nakane）、J.Hisothem.
Cytochemh.22（1974）1084〕並びにジマレイミ
ド結合法〔K.カトー他、Euro.J.Biochem.62、
（1966）285〕がある。 本発明の糖又はレクチンの不溶化のための固相
表面は溶液がその中を通過できるように多孔性で
あることが好ましい。かようにして例えばセルロ
ース濾紙床の固体を用いることができる。流れに
対する抵抗がより少ない粒子床の方がさらに好ま
しい。その粒子はガラス、ポリスチレン、シート
ポリアクリルアミドゲル、ナイロン６、アガロー
ス或は本発明の分別工程で使用する糖又はレクチ
ンと共有結合を形成する能力のある他の物質であ
り得る。 免疫学的物質（例えば抗原、抗体又はハプテ
ン）に強固に結合することが通常のどんなラベル
も本発明に使用することができる。該ラベルには
燐光体及び螢光体のような発光物質、生物発光物
質、放射性物質、酵素、スピンラベル又は含金属
物質が含まれる。既述の通り好ましいラベルは酵
素である。 適当な蛍光性ラベルにはリサニム（lissanime）
ローダミンＢ、D.A.N.S.（１−ジメチルアミノナ
フタリン−５−スルホン酸）、オルトフタルデヒ
ド、フルオレスセインイソチオシアナート及び螢
光顕微鏡にしばしば用いられるフルオレスサミン
が含まれる。 数多くの公知の酵素ラベル系のいずれをも使用
することができる。１つの系はペツス（Pesce）
らの“全身的紅斑性狼瘡における血清抗DNA抗
体を測定するための酵素結合体の使用（Use of
Enzyme−Linked Antibodied to Measure
Serum Anti−DNA Antibody in Systemic
Lupus Erthyematosus）”〔Clin.Chem.20／３、
353−359（1974）〕と題する輪文中に記載してい
る。もう１つの系はG.B.ウイズダム（G.B.
Wisdom）がClin、Chem.22、（1976）1243中に
記載している。適当な酵素の表はハウク
（Hawk）らが「実際的な生理学的化学
（Practical Physiological Chemistry）」〔マクグ
ロウ．ヒルブツク社、ニユーヨーク（1954）、306
〜397頁〕中に記載している。次の第５表に適当
な酵素の種類と特別な酵素の例を示す。
【表】
キナーゼ
酵素の濃度は螢光性ラベル及び放射性ラベルの
ような他のラベルと全く同様に、標準曲線との比
較によつて測定される。 上文によつて明かな通り本発明の特質は免疫学
的物分析に使用するための分析試薬としての免疫
学的反応生成物製品及びその製造方法並びに該製
品を使用する免疫学的測定法を指向する点にあ
る。 本発明の特質をさらに説明するために以下に本
発明の特別な実施例を示す。実施例中に示すデー
タは単なる例であつて本発明の範囲を限定するた
めのものでないことは言うまでもない。 例 １ レクチン−抗体対の製造（１工程） 乳糖（0.1M）、0.1M燐酸塩バツフア（PH7.2）、
及び0.15M塩化ナトリウムを含む緩衝液１ml中に
５mgの精製PNA（レクチン）を溶解し、これに対
し５mgの山羊抗ヒトlgG抗体と10〜20μのカツ
プリング剤（ラムダ再蒸留グルタルアルデヒド）
とを加える。この混合物を室温で１時間インキユ
ベーシヨンする。0.1M燐酸塩緩衝食塩水に対し
て透析する。次にこれを“カラムマトリツクス上
にPNA及びPNA−抗体を保持するための特異性
を有するガラクトース（１−３）ガラクトミン結
合アガロースビーズカラム”の中へ通過させる。
カラムをOD280の測定値が0.050になるまで洗浄す
る。次に0.5M乳糖溶液のような特異的糖を用い
てPNA複合体をカラムから溶出させ、次にヒト
lgG結合アガロースビーズを含む第２カラム中へ
通過させる。0.1M酢酸（又は3Mイソチオシアン
酸ナトリウム或いはその他の試薬）を用いて
PNA−抗体をマトリツクスから解離させる。複
合体を燐酸塩緩衝食塩水に対して十分に透析す
る。溶出液を濃縮し、ゲル濾過カラム中へ通して
成分を分子量にもとづいて分離する。１：１の複
合比のレクチン−抗体対の分子量に相当する画分
を集める。 例 ２ （レクチン−抗体対の２工程製造法） PNA（１mg）を含む、PH7.2の燐酸塩緩衝食塩
水１mlとPNA結合に対して特異的なガラクトー
ス（１−３）ガラクトサミン結合アガロースビー
ズマトリツクス２mlとを混合し、これにグルタル
アルデヒドを加え、混合物を１〜６時間インキユ
ベーシヨンする。このゲルを焼結ガラスフイルタ
ー漏斗上でPBSで洗浄し、このゲルを１mgの山
羊抗ヒトlgG抗体の溶液中に１晩中懸濁させる。
ビーズをPBSで洗い、次いで0.1Mの特異的糖溶
液で洗つてレクチン−抗体複合体をマトリツクス
から溶出させる。溶出液を集めヒトlgG結合アガ
ロースビーズを含むカラム中へ通す。その後の操
作は例１と同じである。 例 ３ 糖蛋白質又は多糖類又は糖脂質の測定のための
酵素レクチンの直接適用 ヒト血清アルブミン含有0.1M燐酸塩緩衝食塩
水（PH7.2）１ml中0.001nｇから1μｇまでのヒト
lgGの一連の既知濃度の液を抗体被覆ポリスチレ
ン管に加える。この混合物を40℃で１時間インキ
ユベーシヨンし、デカンテーシヨンし、且つ燐酸
緩衝食塩水で洗浄する。WGA−ワサビ大根ペル
オキシダーゼ又はCon Ａ−ミクロペルオキシダ
ーゼ又はその他のレクチン−酵素複合体のような
レクチン−酵素（10μｇ／ml）１mlを各管に加え
る。これを２時間インキユベーシヨンし、デカン
テーシヨンした後に0.01％トウイーン（Tween）
20を含む燐酸塩緩衝食塩水で洗浄する。空の管に
0.01％過酸化水素及びＯ−ジアニシジンを加え、
インキユベーシヨンを15分間行う。465ｍμにお
けるO.D.を記録する。未知試料に対して同じ操
作を用いる。 例 ４ 多重試験 一連の100nｇから20μｇまでの既知濃度のヒト
IgG及びIgMを調製する。この既知濃度を含む各
管に30μｇのPNA−抗IgG及びPNA−抗IgMに加
え、10nｇのヒトIgG−アルカリ性ホスフアーゼ
及び10nｇのヒトIgG−ワサビ大根ペルオキシダ
ーゼを加える。 インキユベーシヨンを１時間行いこの混合物を
“PNAに対して特異的な糖で被覆したフイルター
デイスク又はマトリツクス”が入つているカラム
に移す。次に0.01％トウイーン20を含む燐酸塩緩
衝食塩水４mlずつで２回カラムを洗い溶出液を集
める。液出液１mlを試薬して0.01％過酸化水素及
びＯ−ジアニシジンとのインキユベーシヨン後の
ワサビ大根ペルオキシダーゼ活性を測定する。更
に１mlを用いて、0.1M炭酸ナトリウム緩衝液PH
10.0中の0.001M燐酸Ｐ−ニトロフエニルと共に
インキユベーシヨンしてアルカリホスフアターゼ
活性を測定する。かくして濃度対光学密度の標準
曲線が得られる。しかしヒト血清中のIgGまたは
IgM濃度を測定しようとするときにヒト血清中の
同じ酵素が妨害をひき起こす。そこで別法を用い
る。PNA−抗体−IgG−酵素複合体（complex）
を0.1M特異的糖溶液でカラムデイスクから溶出
する。酵素の活性を測定して標準曲線を作る。未
知試料について同じ操作を行い、IgGおよびIgM
の曲線からその濃度を得ることができる。 例 ５ Ａ 同時多種酵素免疫試験によるチロキシン及び
甲状腺刺激ホルモン（TSH）の試験 チロキシン−ワサビ大根ペルオキシダーゼ接
合体を二重ラベル法で製造する。エタノール
0.1M重炭酸塩緩衝液（PH8.0）中の１mgのチロ
キシド塩酸塩と放射性同位体I125ラベル付きチ
ロキシン（２×10-6cpm）とを１mgのワサビ大
根ペルオキシダーゼ（HRP）と共にナカネの
方法〔P.Q.ナカネ（P.Q.Nakane）及びA.J、
カワビ（A.J.Kawavi）、Histochem.
Cytochem.22、1084（1974）〕で混合する。１晩
４℃でインキユベーシヨンした後に接合体を得
る。次にこの混合物を0.1M燐酸塩緩衝食塩水
に対して３回透析する。この接合体をセフアデ
クスカラムＧ−200（２cm×75cm）及びDEAEセ
フアロースカラムを通してさらに精製する。
HRPの濃度を測定し、全透析物のcpmを測定
する。かくしてHRP1分子についてのチロキシ
ド分子数を推定することができる。過酸化水素
及びＯ−ジアニシジンを用いるとき種々の酵素
濃度における単位時間当りの吸収部位465ｍμ
における光学密度増加又は螢光シグナルに基づ
いてHRPの濃度対ペルオキシダーゼの反応率
をプロツトする。 甲状腺刺激ホルモン（TSH）又はチロトロ
ピン−アルカリホスフアターゼ接合体を調製す
る。 PH8.0の1.0M重炭酸塩緩衝液中で、500μｇの
TSHを２mgのアルカリホスフアターゼおよび
20μのグルタルアルデヒドと混合する。この
混合物を４℃で１晩インキユベーシヨンした後
に0.1M燐酸塩緩衝食塩水に対して充分に透析
する。透析物をセフアデクスＧ−200カラム
（２cm×75cm）又はウルトラゲル34カラム中を
通して接合体を非接合体から分別する。接合体
の濃度をロウリ（Lowry）の方法で測定する。
炭酸塩緩衝液（0.1M、PH10）中0.001M濃度の
燐酸Ｐ−ニトロフエニルを気質として用いると
き種々の酵素濃度における単位時間当りの405
ｍμにおける吸光度増加を測定して複合体濃度
対酵素反応率をプロツトする。 Ｂ ヒト血清中のチロキシンの標準プロツト チロキシン及びTSHを含まないヒト血清
（100μ）に、0.1M燐酸塩緩衝食塩水（PH7.2）
300μ、2nｇ／100μから100nｇ／100μま
での種々の濃度のチロキシン、1nｇのチロキ
シン−HRP複合体、100nｇのPNA−抗T4、
1nｇのTSH−アルカリホスフアターゼ、種々
の既知濃度のTSH及び100nｇのPNA−抗
TSHを加える。 この液の500μlを37℃で30分間インキユベー
シヨンした後にこれを容積１mlのガラクトース
β（１→３）ガラクトサミン複合体アガロース
ビーズ（除外限界1.5M〜15M）床上へ移す。
カラムを４mlのPBSで洗つた後に２mlの0.5M
乳糖PBS溶液で洗い、この溶出液を集める。
乳糖溶出液0.5mlについてのHRPの酵素活性を
検査する。添加したチロキシンの既知濃度に対
してHRPの反応率をプロツトする。次に添加
したTSHの既知濃度に対してアルカリホスフ
アターゼ活性をプロツトする。 Ｃ 同時多種酵素免疫試験によるチロキシンおよ
びTSHの未知濃度の試験 未知試料各100μlに0.1M燐酸塩緩衝食塩水
（PH7.2）300μl、100nｇのPNA−抗T4、100nｇ
のPNA−抗TSH、1nｇのHRP−T4及び1nｇ
のTSH−アルカリホスフアターゼを加える。
混合物をインキユベーシヨンし、Ｂ部の標準と
同様に処理する。 未知試料から検出された酵素活性からチロキ
シンと甲状腺刺激ホルモンとの濃度の標準プロ
ツト上の位置を求める。 例 ６ 交互貫流法 ガラクトースβ（１→３）ガラクトサミン結合
マトリツクスカラム１ml500nｇのPNA結合T4抗
体及びTSH抗体と共にインキユベーシヨンする。 燐酸塩緩衝食塩水（0.1M）で洗浄する。T4−
HRP及びTSH−アルカリホスフアターゼの各1n
ｇ、300μlのPBS、100μlの血清と、及び血清なし
で、室温で５分間混合する。 カラムへ移し、溶出液を集め、0.1M燐酸塩緩
衝食塩水（PH7.2）３mlで洗浄する。 PBS含有0.5M乳糖２mlでカラム洗浄する。溶
出液を集める。 溶出液（0.5ml）を取り、T4−ワサビ大根ペル
オキシダーゼ複合体に対してはＯ−ジアニジンを
用い、アルカリホスフアターゼに対しては４−メ
チルウンベリフエロンを用いて酵素試験を行い、
反応率を記録する。 ブランクを差引いた後に標準曲線から複合体の
濃度を求める。 T4及びTSHの既知濃度から未知のT4及び
TSHの濃度を求める。 例 ７ サンドイツチ均一免疫学的系 試験管に(1)ヒト血清0.5ml、(2)20μｇのPNAを
含むレクチン溶液0.1ml、(3)精製PNA−ウサギ抗
ヒトインシユリン抗体複合体10μｇを含む0.1ml、
(4)アルカリホスフアターゼ山羊抗ヒトインシユリ
ン抗体複合物1μｇを含む0.1ml、(4)アルカリホス
フアターゼ山羊抗ヒトインシユリン抗体複合物
1μｇを含む01ml及び(5)0.1M燐酸塩緩衝食塩水
（PH7.2）0.2mlを混合し、混合物を37℃で30分間
インキユベーシヨンする。 インキユベーシヨンの後に混合物をガラクトー
ス−β（１→３）Ｎ−アセチルガラクトサミン
（本明細書中ではGalβ（１→３）GAl Nac）結合
アガロースビーズ又は固体床を含むカラム中を通
す。次に固体マトリツクスを５mlの燐酸塩緩衝食
塩水で洗浄する。次に0.2M GAlβ（１→３）Gal
Nac燐酸塩緩衝食塩水４mlを加える。溶出液を集
めアルカリホスフアターゼ活性を試験する。酵素
活性に対するインシユリンの種々の既知濃度に基
づいた標準曲線から、測定した酵素活性に基づい
てインシユリンの濃度を求める。ヒト血清の代り
にインシユリンの既知濃度を用いて標準曲線を作
る。
酵素の濃度は螢光性ラベル及び放射性ラベルの
ような他のラベルと全く同様に、標準曲線との比
較によつて測定される。 上文によつて明かな通り本発明の特質は免疫学
的物分析に使用するための分析試薬としての免疫
学的反応生成物製品及びその製造方法並びに該製
品を使用する免疫学的測定法を指向する点にあ
る。 本発明の特質をさらに説明するために以下に本
発明の特別な実施例を示す。実施例中に示すデー
タは単なる例であつて本発明の範囲を限定するた
めのものでないことは言うまでもない。 例 １ レクチン−抗体対の製造（１工程） 乳糖（0.1M）、0.1M燐酸塩バツフア（PH7.2）、
及び0.15M塩化ナトリウムを含む緩衝液１ml中に
５mgの精製PNA（レクチン）を溶解し、これに対
し５mgの山羊抗ヒトlgG抗体と10〜20μのカツ
プリング剤（ラムダ再蒸留グルタルアルデヒド）
とを加える。この混合物を室温で１時間インキユ
ベーシヨンする。0.1M燐酸塩緩衝食塩水に対し
て透析する。次にこれを“カラムマトリツクス上
にPNA及びPNA−抗体を保持するための特異性
を有するガラクトース（１−３）ガラクトミン結
合アガロースビーズカラム”の中へ通過させる。
カラムをOD280の測定値が0.050になるまで洗浄す
る。次に0.5M乳糖溶液のような特異的糖を用い
てPNA複合体をカラムから溶出させ、次にヒト
lgG結合アガロースビーズを含む第２カラム中へ
通過させる。0.1M酢酸（又は3Mイソチオシアン
酸ナトリウム或いはその他の試薬）を用いて
PNA−抗体をマトリツクスから解離させる。複
合体を燐酸塩緩衝食塩水に対して十分に透析す
る。溶出液を濃縮し、ゲル濾過カラム中へ通して
成分を分子量にもとづいて分離する。１：１の複
合比のレクチン−抗体対の分子量に相当する画分
を集める。 例 ２ （レクチン−抗体対の２工程製造法） PNA（１mg）を含む、PH7.2の燐酸塩緩衝食塩
水１mlとPNA結合に対して特異的なガラクトー
ス（１−３）ガラクトサミン結合アガロースビー
ズマトリツクス２mlとを混合し、これにグルタル
アルデヒドを加え、混合物を１〜６時間インキユ
ベーシヨンする。このゲルを焼結ガラスフイルタ
ー漏斗上でPBSで洗浄し、このゲルを１mgの山
羊抗ヒトlgG抗体の溶液中に１晩中懸濁させる。
ビーズをPBSで洗い、次いで0.1Mの特異的糖溶
液で洗つてレクチン−抗体複合体をマトリツクス
から溶出させる。溶出液を集めヒトlgG結合アガ
ロースビーズを含むカラム中へ通す。その後の操
作は例１と同じである。 例 ３ 糖蛋白質又は多糖類又は糖脂質の測定のための
酵素レクチンの直接適用 ヒト血清アルブミン含有0.1M燐酸塩緩衝食塩
水（PH7.2）１ml中0.001nｇから1μｇまでのヒト
lgGの一連の既知濃度の液を抗体被覆ポリスチレ
ン管に加える。この混合物を40℃で１時間インキ
ユベーシヨンし、デカンテーシヨンし、且つ燐酸
緩衝食塩水で洗浄する。WGA−ワサビ大根ペル
オキシダーゼ又はCon Ａ−ミクロペルオキシダ
ーゼ又はその他のレクチン−酵素複合体のような
レクチン−酵素（10μｇ／ml）１mlを各管に加え
る。これを２時間インキユベーシヨンし、デカン
テーシヨンした後に0.01％トウイーン（Tween）
20を含む燐酸塩緩衝食塩水で洗浄する。空の管に
0.01％過酸化水素及びＯ−ジアニシジンを加え、
インキユベーシヨンを15分間行う。465ｍμにお
けるO.D.を記録する。未知試料に対して同じ操
作を用いる。 例 ４ 多重試験 一連の100nｇから20μｇまでの既知濃度のヒト
IgG及びIgMを調製する。この既知濃度を含む各
管に30μｇのPNA−抗IgG及びPNA−抗IgMに加
え、10nｇのヒトIgG−アルカリ性ホスフアーゼ
及び10nｇのヒトIgG−ワサビ大根ペルオキシダ
ーゼを加える。 インキユベーシヨンを１時間行いこの混合物を
“PNAに対して特異的な糖で被覆したフイルター
デイスク又はマトリツクス”が入つているカラム
に移す。次に0.01％トウイーン20を含む燐酸塩緩
衝食塩水４mlずつで２回カラムを洗い溶出液を集
める。液出液１mlを試薬して0.01％過酸化水素及
びＯ−ジアニシジンとのインキユベーシヨン後の
ワサビ大根ペルオキシダーゼ活性を測定する。更
に１mlを用いて、0.1M炭酸ナトリウム緩衝液PH
10.0中の0.001M燐酸Ｐ−ニトロフエニルと共に
インキユベーシヨンしてアルカリホスフアターゼ
活性を測定する。かくして濃度対光学密度の標準
曲線が得られる。しかしヒト血清中のIgGまたは
IgM濃度を測定しようとするときにヒト血清中の
同じ酵素が妨害をひき起こす。そこで別法を用い
る。PNA−抗体−IgG−酵素複合体（complex）
を0.1M特異的糖溶液でカラムデイスクから溶出
する。酵素の活性を測定して標準曲線を作る。未
知試料について同じ操作を行い、IgGおよびIgM
の曲線からその濃度を得ることができる。 例 ５ Ａ 同時多種酵素免疫試験によるチロキシン及び
甲状腺刺激ホルモン（TSH）の試験 チロキシン−ワサビ大根ペルオキシダーゼ接
合体を二重ラベル法で製造する。エタノール
0.1M重炭酸塩緩衝液（PH8.0）中の１mgのチロ
キシド塩酸塩と放射性同位体I125ラベル付きチ
ロキシン（２×10-6cpm）とを１mgのワサビ大
根ペルオキシダーゼ（HRP）と共にナカネの
方法〔P.Q.ナカネ（P.Q.Nakane）及びA.J、
カワビ（A.J.Kawavi）、Histochem.
Cytochem.22、1084（1974）〕で混合する。１晩
４℃でインキユベーシヨンした後に接合体を得
る。次にこの混合物を0.1M燐酸塩緩衝食塩水
に対して３回透析する。この接合体をセフアデ
クスカラムＧ−200（２cm×75cm）及びDEAEセ
フアロースカラムを通してさらに精製する。
HRPの濃度を測定し、全透析物のcpmを測定
する。かくしてHRP1分子についてのチロキシ
ド分子数を推定することができる。過酸化水素
及びＯ−ジアニシジンを用いるとき種々の酵素
濃度における単位時間当りの吸収部位465ｍμ
における光学密度増加又は螢光シグナルに基づ
いてHRPの濃度対ペルオキシダーゼの反応率
をプロツトする。 甲状腺刺激ホルモン（TSH）又はチロトロ
ピン−アルカリホスフアターゼ接合体を調製す
る。 PH8.0の1.0M重炭酸塩緩衝液中で、500μｇの
TSHを２mgのアルカリホスフアターゼおよび
20μのグルタルアルデヒドと混合する。この
混合物を４℃で１晩インキユベーシヨンした後
に0.1M燐酸塩緩衝食塩水に対して充分に透析
する。透析物をセフアデクスＧ−200カラム
（２cm×75cm）又はウルトラゲル34カラム中を
通して接合体を非接合体から分別する。接合体
の濃度をロウリ（Lowry）の方法で測定する。
炭酸塩緩衝液（0.1M、PH10）中0.001M濃度の
燐酸Ｐ−ニトロフエニルを気質として用いると
き種々の酵素濃度における単位時間当りの405
ｍμにおける吸光度増加を測定して複合体濃度
対酵素反応率をプロツトする。 Ｂ ヒト血清中のチロキシンの標準プロツト チロキシン及びTSHを含まないヒト血清
（100μ）に、0.1M燐酸塩緩衝食塩水（PH7.2）
300μ、2nｇ／100μから100nｇ／100μま
での種々の濃度のチロキシン、1nｇのチロキ
シン−HRP複合体、100nｇのPNA−抗T4、
1nｇのTSH−アルカリホスフアターゼ、種々
の既知濃度のTSH及び100nｇのPNA−抗
TSHを加える。 この液の500μlを37℃で30分間インキユベー
シヨンした後にこれを容積１mlのガラクトース
β（１→３）ガラクトサミン複合体アガロース
ビーズ（除外限界1.5M〜15M）床上へ移す。
カラムを４mlのPBSで洗つた後に２mlの0.5M
乳糖PBS溶液で洗い、この溶出液を集める。
乳糖溶出液0.5mlについてのHRPの酵素活性を
検査する。添加したチロキシンの既知濃度に対
してHRPの反応率をプロツトする。次に添加
したTSHの既知濃度に対してアルカリホスフ
アターゼ活性をプロツトする。 Ｃ 同時多種酵素免疫試験によるチロキシンおよ
びTSHの未知濃度の試験 未知試料各100μlに0.1M燐酸塩緩衝食塩水
（PH7.2）300μl、100nｇのPNA−抗T4、100nｇ
のPNA−抗TSH、1nｇのHRP−T4及び1nｇ
のTSH−アルカリホスフアターゼを加える。
混合物をインキユベーシヨンし、Ｂ部の標準と
同様に処理する。 未知試料から検出された酵素活性からチロキ
シンと甲状腺刺激ホルモンとの濃度の標準プロ
ツト上の位置を求める。 例 ６ 交互貫流法 ガラクトースβ（１→３）ガラクトサミン結合
マトリツクスカラム１ml500nｇのPNA結合T4抗
体及びTSH抗体と共にインキユベーシヨンする。 燐酸塩緩衝食塩水（0.1M）で洗浄する。T4−
HRP及びTSH−アルカリホスフアターゼの各1n
ｇ、300μlのPBS、100μlの血清と、及び血清なし
で、室温で５分間混合する。 カラムへ移し、溶出液を集め、0.1M燐酸塩緩
衝食塩水（PH7.2）３mlで洗浄する。 PBS含有0.5M乳糖２mlでカラム洗浄する。溶
出液を集める。 溶出液（0.5ml）を取り、T4−ワサビ大根ペル
オキシダーゼ複合体に対してはＯ−ジアニジンを
用い、アルカリホスフアターゼに対しては４−メ
チルウンベリフエロンを用いて酵素試験を行い、
反応率を記録する。 ブランクを差引いた後に標準曲線から複合体の
濃度を求める。 T4及びTSHの既知濃度から未知のT4及び
TSHの濃度を求める。 例 ７ サンドイツチ均一免疫学的系 試験管に(1)ヒト血清0.5ml、(2)20μｇのPNAを
含むレクチン溶液0.1ml、(3)精製PNA−ウサギ抗
ヒトインシユリン抗体複合体10μｇを含む0.1ml、
(4)アルカリホスフアターゼ山羊抗ヒトインシユリ
ン抗体複合物1μｇを含む0.1ml、(4)アルカリホス
フアターゼ山羊抗ヒトインシユリン抗体複合物
1μｇを含む01ml及び(5)0.1M燐酸塩緩衝食塩水
（PH7.2）0.2mlを混合し、混合物を37℃で30分間
インキユベーシヨンする。 インキユベーシヨンの後に混合物をガラクトー
ス−β（１→３）Ｎ−アセチルガラクトサミン
（本明細書中ではGalβ（１→３）GAl Nac）結合
アガロースビーズ又は固体床を含むカラム中を通
す。次に固体マトリツクスを５mlの燐酸塩緩衝食
塩水で洗浄する。次に0.2M GAlβ（１→３）Gal
Nac燐酸塩緩衝食塩水４mlを加える。溶出液を集
めアルカリホスフアターゼ活性を試験する。酵素
活性に対するインシユリンの種々の既知濃度に基
づいた標準曲線から、測定した酵素活性に基づい
てインシユリンの濃度を求める。ヒト血清の代り
にインシユリンの既知濃度を用いて標準曲線を作
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 免疫学的分析に使用するための反応生成物製
品において、 反応生成物製品の免疫学的に特異的に反応する
１構成員が(a)レクチン及び不溶化糖、又は(b)不溶
化レクチン及び糖に不可逆的に結合し且つ反応生
成物製品のもう１つの免疫学的に特異的に反応す
る１構成員がラベル化合物に不可逆的に結合して
いるラベル付き免疫学的反応生成物から成ること
を特徴とする前記の反応生成物製品。 ２ 免疫学的分析に使用するための反応生成物製
品を製造する方法において、 (a) 第１及び第２抗原又は抗体を含有する流体試
料を、該流体試料の抗原又は抗体に対して特異
的であつて且つレクチンと結合した第１及び第
２の抗体又は抗原と共にインキユベーシヨンし
てそれぞれの抗原−抗体対を反応混合物の形状
で生成させる工程、 (b) 工程(a)の反応生成物を、第１ラベル化合物に
結合した第３の抗体又は抗原及び第２ラベル化
合物に結合した第４の抗体又は抗原と共にイン
キユベーシヨンして、上記の第３及び第４の抗
体又は抗原を、上記の第１及び第２の試料抗原
又は抗体と免疫学的に反応させて反応混合物の
形状となす工程、 (c) 工程(b)の反応混合物を、上記レクチンとそれ
ぞれ選択的に且つ可逆的に反応し得る不溶化糖
と接触させ、レクチンを不溶化糖に可逆的に結
合させて反応混合物の形状で製品を得る工程、
又は該製品を反応混合物の残余分から更に分別
する工程を包含することを特徴とする上記の製
造方法。 ３ 流体試料中の少くとも第１及び第２の抗原又
は抗体を測定する方法において、 (a) 第１及び第２抗原又は抗体を含有する流体試
料を、試料抗原又は抗体に対して特異的であつ
て且つレクチンと結合した第１及び第２抗体又
は抗原と共にインキユベーシヨンしてそれぞれ
の抗原−抗体対を生成させ、 (b) 前項(a)の反応生成物を、第１ラベル化合物に
結合した第３の抗体又は抗原及び第２ラベル化
合物に結合した第４の抗体又は抗原と共にイン
キユベーシヨンして、上記の第３及び第４の抗
体又は抗原を、上記の第１及び第２の試料抗原
又は抗体と免疫学的に反応させ、 (c) 前項(b)の反応混合物を、上記レクチンとそれ
ぞれ選択的に且つ可逆的に反応し得る不溶化糖
と接触させてレクチンを不溶化糖に可逆的に結
合させ、 (d) かようにして得られた不溶化糖−レクチン生
成物、即ち免疫学的分析用の反応生成物製品を
上記反応混合物の残余分から分別し、そして (e) 上記第１及び第２抗原の量の目安として上記
不溶化糖−レクチン生成物即ち免疫学的分析用
の反応生成物製品を使用し、又は上記残余分を
使用し、これらのいずれかの中の第１及び第２
ラベル化合物の量を測定することを特徴とする
前記の測定方法。 ４ 流体試料中の少くとも第１及び第２の抗原又
は抗体を測定する方法において、 (a) 第１及び第２抗原又は抗体を含有する流体試
料を、可溶形の、異る第１及び第２ラベル化合
物にそれぞれ結合した既知量の上記第１及び第
２抗原又は抗体と混合し、及び試料の第１及び
第２抗原又は抗体のそれぞれに対して特異的で
且つレクチンに結合した第１及び第２抗体又は
抗原とも混合し、且つインキユベーシヨンして
それぞれの抗原−抗体対を生成させ、 (b) 上記のインキユベーシヨンされた反応混合物
を、上記レクチンと選択的に且つ可逆的に反応
し得る不溶化糖と接触させてレクチンを不溶化
糖に可逆的に結合させ、 (c) かようにして得られた不溶化糖−レクチン生
成物即ち免疫学的分析用の反応生成物製品を上
記反応混合物から分別し、そして (d) 上記第１及び第２抗原の量の目安として上記
不溶化糖−レクチン生成物即ち免疫学的分析用
の反応生成物製品を使用し、又は上記残余分を
使用し、これらのいずれかの中の第１及び第２
ラベル化合物の量を測定することを特徴とする
前記の測定方法。 ５ 流体試料中の免疫学的接合体の１成分の測定
方法において、 (a) 糖に結合した免疫学的接合体の対応する成分
を、上記結合糖と選択的に且つ可逆的に反応し
得る不溶化レクチンの包含容積の中へ通過させ
て糖を不溶化レクチンに可逆的に結合させ、 (b) 上記１成分と、ラベル化合物に可溶形に結合
した既知量の上記１成分とを含む試料を、上記
包含容積の中へ通過させて上記の免疫学的接合
体の成分間に免疫学的反応を起させ、 (c) かようにして得られた不溶化レクチン結合反
応生成物即ち免疫学的分析用の反応生成物製品
を上記反応混合物の残余分から分別し、そして (d) 上記試料中の上記１成分の量の目安として上
記不溶化レクチン−糖生成物即ち免疫学的分析
用の反応生成物製品を使用し、この中のラベル
化合物の量を測定することを特徴とする前記の
測定方法。
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