JP6057251B2 - 粒子分別装置および粒子分別方法 - Google Patents

Description

本発明は、粒子分別装置および粒子分別方法に関する。より詳細には、本発明は、細胞や化学合成された粒子等の、粒子毎に異なる密度を有する粒子群を密度差に従って分別することができる、マイクロメートルオーダーの流路を有する粒子分別装置および粒子分別方法に関する。

従来、細胞や化学合成された粒子等の、粒子毎に異なる性質の粒子群を分別する方法として、質量差により分別する方法、大きさにより分別する方法、密度差により分別する方法等、さまざまな方法が知られている。

例えば、異なる密度を有する粒子群を密度差により分別する方法としては、密度を調節した分離液を用いる沈殿平衡法や沈殿速度法、遠心分離法等の方法が挙げられる（特許文献１〜６を参照）。

また、粒子として細胞を分別する場合には、細胞等の生体試料が有する固有の免疫学的な特性である特異的な抗原抗体反応を活用し、磁気粒子や蛍光分子を結合させ、磁気細胞分別または蛍光活性化細胞分別のような細胞分別機により分別する方法が知られている。

また、マイクロ流路を用い、電気泳動や凝集剤等を用いた方法も検討されている（特許文献７を参照）。また、マイクロ流路で超音波やピンチド流路を用いて密度に従って粒子群を分別する装置（非特許文献１，２を参照）および微粒子群を分級する方法（特許文献８，９を参照）が開発されている。

特表平１０−５０８１９０号公報（１９９８年８月１８日公開） 特表２００２−５０５８６６号公報（２００２年２月２６日公開） 特開２００７−２８２５５２号公報（２００７年１１月１日公開） 特開２００８−１０５０１０号公報（２００８年５月８日公開） 特開２００５−９８７０４号公報（２００５年４月１４日公開） 特開２００４−３１４０６８号公報（２００４年１１月１１日公開） 特開２００５−２９２０９２号公報（２００５年１０月２０日公開） 特許第４４６２０５８号公報（２０１０年２月２６日登録） 特開２０１０−７５８２０号公報（２０１０年４月８日公開）

Anal Chem,2007 July 15;79(14) p5117-5123 Microfluid Nanofluid,2011 March 8;11 p105-110

しかしながら、上述したような沈殿平衡法や沈殿速度法、遠心分離法等の方法を用いた場合では、分別した粒子の回収時に、ピペッティング等により目的の粒子を採取する操作を行うが、粒子のコンタミネーションを避けるため、分別する粒子群同士の距離を離す必要がある。そのため、粒子の移動距離を長くする必要があり、例えば遠心分離法では、より強い遠心力で、長時間の遠心分離を行うことが必要である。

そのため、例えば、粒子として体細胞を用いた場合には、体細胞に大きなストレスがかかるので、体細胞を用いた研究において、体細胞の細胞機能の低下が観測される場合や、十分な細胞応答を観察することができない場合が多いという問題がある。また、分別した粒子の回収時に、操作が煩雑で、多くの手間と時間がかかるという問題もある。

また、細胞分別機を用いた方法でも、高度な技術が要求され、操作が煩雑で、多くの手間と時間がかかるという問題がある。

また、マイクロ流路を用い、電気泳動や凝集剤等を用いた方法や、マイクロ流路で超音波やピンチド流路を用いた方法では、以下の問題がある。すなわち、特許文献７に記載の方法は、粘度差により細胞を分離する手法であり、それゆえ、密度が互いに近い細胞の分別には向いていない。また、非特許文献１に記載の方法は、粒子のサイズと密度とを超音波により分別する手法であるが、体細胞を用いた場合は大きなストレスがかかる。非特許文献２に記載の方法は、粒子のサイズと密度とを分別するものであるが、分別の精度が十分でない。また、特許文献８，９に記載の方法は、例えば細胞のように、サイズが同じで密度等の性質が異なる粒子を対象としておらず、従って当該粒子を分別することはできない。

このようなことから、粒子径（サイズ）が同じであっても、密度等の性質の異なる粒子群を低刺激で短時間に分別および回収する容易な方法が望まれている。

本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その主たる目的は、粒子に重力負荷等の大きなストレスをかけずに、短時間で粒子群を分別することができ、分別した粒子群を容易に回収することができる粒子分別装置および粒子分別方法を提供することにある。

上記課題を解決するために鋭意検討した結果、本発明者は、液体中において、体細胞や化学合成された粒子は、ストークスの式に従って、粒子径や密度が互いに異なる粒子群同士の挙動が異なることに着目し、これら粒子群を分別液が流れる流路において分別することができると考え、本発明に係る粒子分別装置および粒子分別方法を発明するに至った。

すなわち、本発明に係る粒子分別装置は、上記課題を解決するために、分別液および少なくとも二種類の密度を有する粒子群が供給され、一定方向に分別液が流れる分別流路と、上記分別流路の上記分別液が流れる方向の少なくとも末端に接続された分岐部と、上記分岐部から上方向に向かって形成された第１流路と、上記分岐部から下方向に向かって形成された第２流路と、を少なくとも備えることを特徴としている。なお、ここにおける「下方向」とは「重力方向」であり、「上方向」とは「重力に逆らう方向」である。

上記の構成によれば、ストークスの式に従い、一定方向に流れる分別液中を、より高い密度を有する粒子群は、分別流路中の比較的下方向の領域を流れ、また、より低い密度を有する粒子群は、分別流路中の比較的上方向の領域を流れる。そのため、それぞれの粒子群が、上記分岐部から上方向または下方向に向かって形成された第１流路または第２流路に供給され、結果として、粒子径（サイズ）が同じであっても、密度の差に従って粒子群を分別することができる。

これにより、粒子に大きなストレスをかけずに、短時間で粒子群を分別することができ、分別した粒子群を容易に回収することができる粒子分別装置を提供することができるという効果を奏する。

本発明に係る粒子分別装置は、上記分別流路が水平方向に形成されていることがより好ましい。上記の構成によれば、分別流路の流れに従って、粒子群を効率的に分別することができる。

本発明に係る粒子分別装置は、上記分別液の密度が、上記第１流路に供給される低い密度を有する粒子群における粒子の最大密度より低く、且つ、上記第２流路に供給される高い密度を有する粒子群における粒子の最小密度より高いことがより好ましい。上記の構成によれば、第１流路に供給される低い密度を有する粒子群は、ストークスの式に従って全て浮上し、逆に、第２流路に供給される高い密度を有する粒子群は、全て沈降するため、より効率的に、より精確に粒子群を分別することができる粒子分別装置を提供することができる。

本発明に係る粒子分別装置は、上記分別流路、分岐部、第１流路および第２流路を構成する溝が形成された第一部材、および、上記分別流路、分岐部、第１流路および第２流路を構成する溝が形成された第二部材を、上記溝で分別流路、分岐部、第１流路および第２流路が構成されるように重ね合わせてなることがより好ましい。上記の構成によれば、粒子分別装置をより簡単に形成することができる。また、分別流路、分岐部、第１流路および第２流路をより簡単に清掃することができる。

本発明に係る粒子分別装置は、上記分別流路、分岐部および第１流路を構成する溝が形成された第一部材、および、上記分別流路、分岐部および第２流路を構成する溝が形成された第二部材を、上記溝で分別流路、分岐部、第１流路および第２流路が構成されるように重ね合わせてなることがより好ましい。上記の構成によれば、粒子分別装置をより簡単に形成することができる。また、分別流路、分岐部、第１流路および第２流路をより簡単に清掃することができる。さらに、上記の構成によれば、第１流路および第２流路を分別流路から見て段違いに（二層構造に）形成することができるので、粒子分別装置の上下方向の幅（高さ）をより狭くすることができる。

本発明に係る粒子分別装置は、上記分別流路、分岐部、第１流路および第２流路を構成する溝が形成された第一部材、および、溝が形成されていない平滑な第二部材を、上記溝で分別流路、分岐部、第１流路および第２流路が構成されるように重ね合わせてなることがより好ましい。上記の構成によれば、粒子分別装置をさらに簡単に形成することができる。また、分別流路、分岐部、第１流路および第２流路をさらに簡単に清掃することができる。

本発明に係る粒子分別装置は、上記第１流路および上記第２流路のそれぞれに分別された粒子群の最小密度差が、０．００２ｇ／ｍＬ以上であることがより好ましい。上記の構成によれば、分別した粒子同士のコンタミネーションを防ぐことができ、より精度の高い分別が可能な粒子分別装置を提供することができる。

本発明に係る粒子分別装置は、上記分別流路、第１流路および第２流路の最小径が、上記粒子群の粒子径の３倍以上、１，０００倍以下の範囲であることがより好ましい。上記の構成によれば、分別流路、第１流路および第２流路において粒子が詰まるおそれを、より低減することができる。

本発明に係る粒子分別装置は、上記粒子群の粒子径が、１〜１，０００μｍの範囲内であることがより好ましい。上記の構成によれば、粒子がより精確にストークスの式を満たすため、粒子群をより効率的に分別することができる。また、浮上または沈降速度が極端に速すぎない、または遅すぎないため、適度な長さの分別流路を備えるより実用的な粒子分別装置を提供することができる。

本発明に係る粒子分別装置は、上記粒子群が体細胞であることがより好ましい。上記の構成によれば、粒子（体細胞）を分別するときに、体細胞の細胞機能が低下する、または十分な細胞応答性が得られない等という不都合を防止することができる。

本発明に係る粒子分別装置は、上記粒子群が低品質の細胞と中品質ないし高品質の細胞との混合物であることがより好ましい。中品質ないし高品質の細胞は、低品質の細胞よりも物質の取り込み速度が速いため、密度がより高くなり、分別液中において先に沈降する。そのため、上記の構成によれば、低刺激で迅速かつ簡便に、低品質の細胞と中品質ないし高品質の細胞とを容易に分別することができる。

また、本発明に係る粒子分別方法は、上記課題を解決するために、上記粒子分別装置を用いた粒子分別方法であって、粒子群を、密度が高い粒子群と、密度の低い粒子群に分別することを特徴としている。

上記の構成によれば、従来行われてきた粒子群の分別方法に比べて、粒子群を短時間で容易に分別する粒子分別方法を提供することができる。

本発明に係る粒子分別装置および粒子分別方法によれば、ストークスの式に従い、一定方向に流れる分別液中を、より高い密度を有する粒子群は、分別流路中の比較的下方向の領域を流れ、また、より低い密度を有する粒子群は、分別流路中の比較的上方向の領域を流れる。つまり、密度の差に従って粒子群が重力方向に異なる挙動を示すため、粒子径（サイズ）が同じであっても、異なる密度を有する粒子群を分別し回収することができる。従って、粒子に重力負荷等の大きなストレスをかけずに、短時間で粒子群を容易に分別することができ、分別した粒子群を容易に回収することができるという効果を奏する。

一実施形態に係る実施例１における粒子分別装置の概略の構成を示す（ａ）は側面図であり、（ｂ）は（ａ）のＸ−Ｘ’線矢視断面図である。 （ａ），（ｂ）共に、実施例１における分別評価試験での粒子分別装置の分岐部近傍を、水平方向から観察した側面図である。 一実施形態に係る実施例２における粒子分別装置の概略の構成を示す（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＹ−Ｙ’線矢視断面図であり、（ｃ）は（ａ）のＹ”−Ｙ'''線矢視断面図である。 （ａ）は、実施例２における分別評価試験での粒子分別装置の分岐部近傍を、垂直方向から観察した平面図であり、（ｂ）は（ａ）に対応する水平方向から見た概略の断面図である。 （ａ）は、実施例２における分別評価試験での粒子分別装置の分岐部近傍を、垂直方向から観察した平面図であり、（ｂ）は（ａ）に対応する水平方向から見た概略の断面図である。 一実施形態に係る実施例３における粒子分別装置の概略の構成を示す（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＺ−Ｚ’線矢視断面図であり、（ｃ）は（ａ）のＺ”−Ｚ'''線矢視断面図である。 （ａ）は、実施例３における分別評価試験での粒子分別装置の分岐部近傍を、垂直方向から観察した平面図であり、（ｂ）は（ａ）に対応する水平方向から見た概略の断面図である。 分別流路内における、ストークスの式に従った粒子の挙動を説明する説明図である。 （ａ）〜（ｃ）はそれぞれ、他の実施形態における粒子分別装置の変形例を示すものであり、概略の構成を説明する説明図である。 一実施形態に係る実施例６における粒子分別装置の概略の構成を示す（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＷ_１−Ｗ_２線矢視断面図であり、（ｃ）は（ａ）のＷ_３−Ｗ_４線矢視断面図であり、（ｄ）は（ａ）のＷ_５−Ｗ_６線矢視断面図であり、（ｅ）は（ａ）のＷ_７−Ｗ_８線矢視断面図である。 実施例６における粒子分別装置としての細胞分別装置の合流部近傍、分別流路および分岐部近傍を水平方向から見た概略の断面図である。 実施例６における低品質の卵子Ａと中品質ないし高品質の卵子Ｂとで沈降の速度が異なることを説明する説明図である。 （ａ）は、実施例６における低品質の卵子Ａと中品質ないし高品質の卵子Ｂとを垂直方向から観察した平面図であり、（ｂ）は実施例６における分別評価試験での粒子分別装置の分岐部近傍を、垂直方向から観察した平面図である。

以下の説明において、「密度」とは「２５℃における密度」を示すものとする。また、図面において「ｇ」は重力方向を示すものとする。

〔実施の形態１〕
本発明に係る実施の一形態を、図面を参照しながら以下に説明する。図１は、後述する実施例１における粒子分別装置の概略の構成を示す（ａ）は側面図であり、（ｂ）は（ａ）のＸ−Ｘ’線矢視断面図である。本実施の形態に係る粒子分別装置は、図１（ａ）に示すように、粒子分別装置の要部であるチップ１を備え、チップ１はその内部に、導入口２、分別流路３、分岐部４、第１流路５、第１排水口６、第２流路７および第２排水口８を少なくとも備えている。

チップ１は、例えば、金属や樹脂にて形成することができる。用いることができる金属や樹脂としては、分別すべき粒子が吸着したり、分別液により溶解や変質したりしない限り、特に限定されない。樹脂は透明であってもよく、不透明であってもよい。樹脂の具体例としては、例えば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等を挙げることができる。チップ１の形状としては、図１（ａ）に示すように直方体形状である以外に、円板形状、三角柱形状、平行四辺形を底面とする四角柱形状、不定形状等、どのような形状であってもよい。

導入口２は、分別流路３内に粒子群を含む分別液を導入する導入口である。導入口２の大きさや形状は、分別流路３の大きさや形状に従って定めればよい。例えば、導入口２の形状は、外部から粒子群を含む分別液を導入するための送液管等を固定することができる形状であってもよい。また、粒子群を一点から分別流路３内に放出することができるように、導入口２を分別流路３の大きさに比べて細い構造としてもよく、または絞りを設けてもよい。

分別流路３は、分別液に含まれる粒子群を、下記式（１）（ストークスの式）に従って、粒子径および分別液との密度の差に基づいて分別する流路である。分別液中の粒子群は、分別流路３を一定方向に流れながらストークスの式である下記式（１）に従い、一定の速度で、重力方向に沈降、または、重力に逆らう方向に浮上する。また、理論上、粒子の密度と分別液の密度とが等しいとき、粒子は浮上も沈降もしない。

（但し、式（１）において、ｖ_ｓは粒子の分岐部４における理論上の浮上速度または沈降速度、Ｄｐは粒子の粒子径、ρ_ｐは粒子の密度、ρ_ｆは分別液の密度、ｇは重力加速度、ηは分別液の粘度を表す。）
図８に従って、式（１）について理論的に説明する。図８に示された粒子ａ、粒子ｂ、粒子ｃおよび粒子ｄの各密度は、粒子ｄが一番高く、粒子ｃ、粒子ｂ、粒子ａの順に低いと仮定する。さらに、粒子ｃの密度は分別液と等しいと仮定する。この場合、密度が一番低い（最小密度の）粒子ａの浮上速度が一番大きいので浮上する。また、密度が二番目に低い粒子ｂは、粒子ａに比べて浮上速度が小さいものの浮上する。また、分別液と密度が等しい粒子ｃは、浮上も沈降もしない。さらに、密度が一番高い（最大密度の）粒子ｄは、沈降する。

結果として、図８に示すように、分別流路３内では流れに従って、粒子ａ〜ｄは沈降または浮上する。つまり、粒子ａ〜ｄは、理論上、直線の流形を描きながら浮上または沈降する。そして、粒子ａが重力に逆らう方向に浮上した距離ａ’は、粒子ｂが浮上した距離ｂ’に比べ大きくなる。また、粒子ｄは、重力方向に距離ｄ’だけ沈降する。

すなわち、チップ１においては、上記式（１）に従って、分別する粒子群の粒子径や密度に応じて、分別流路３の長さや流路径、分別液の密度や粘度、流速等を最適な値に設定すればよい。

例えば、分別流路３が重力に対して水平であり、分別液との密度差がそれぞれ０．００２ｇ／ｍＬである密度が低い粒子と密度が高い粒子とからなる粒子群がある場合には、分別流路３内の分別液の線速を７ｃｍ／分、分別液の流速を２０μＬ／分、分別液の粘度を０．００１８ｋｇ／（ｍ・ｓ）、粒子の粒子径を１５０μｍ、滞留時間を３０秒とすると、粒子群は重力方向（または重力に逆らう方向）に４５０μｍ浮上または沈降する。これに従えば、粒子群が分別流路３内に無秩序に導入された場合、分別流路３の重力方向の流路径を４５０μｍ以下にすれば、全ての粒子が浮上または沈降し得る。また、粒子群が分別流路３内の一点に導入された場合、その一点から重力方向（または重力に逆らう方向）に向かって４５０μｍ付近に粒子群が浮上または沈降することがわかる。

また、分別流路３は、ある程度の傾斜を有していても構わない。傾斜角は、分別液の流速や分別流路３の流路径等に従えばよい。分別流路３の傾斜角としては、具体的には、水平方向を０ｄｅｇとすると、−３０〜３０ｄｅｇの範囲内であることが好ましく、−１５〜１５ｄｅｇの範囲内であることがより好ましく、−５〜５ｄｅｇの範囲内であることがさらに好ましい。

分別流路３の断面形状としては、図１（ｂ）に示されるような長方形状に限定されずに、正方形状や円形状、楕円形状であってもよい。分別流路３の流路径（最小径）は、分別される粒子群の粒子径の３倍以上であることが好ましく、５倍以上であることがより好ましく、１０倍以上であることがさらに好ましい。流路径は粒子径に対して大きいほどよく、粒子群が分別流路３内で詰まるおそれを、より低減することができる。但し、チップ１が過度に大きくならないように、分別流路３の流路径（最小径）は、分別される粒子群の粒子径の１，０００倍以下であることが好ましい。同様に、分岐部４、第１流路５および第２流路７の流路径（最小径）は、分別される粒子群の粒子径の３倍以上であることが好ましく、５倍以上であることがより好ましく、１０倍以上であることがさらに好ましい。

また、分別流路３の流路径（最大径）は、具体的には、１００，０００μｍ以下であることが好ましく、１０，０００μｍ以下であることがより好ましく、１，０００μｍ以下であることがさらに好ましい。流路径が大きすぎると、分別が困難になり、分別効率が低下するおそれがある。また、分別流路３の流路径（最小径）は、具体的には、１μｍ以上であることが好ましく、１０μｍ以上であることがより好ましく、１００μｍ以上であることがさらに好ましい。流路径が小さすぎると、粒子群が分別流路３内で詰まるおそれがある。

また、分別流路３の長さは、分別すべき粒子群に従って設定すればよいものの、具体的には、０．１〜１００ｃｍであることが好ましく、1〜１０ｃｍであることがより好ましい。分別流路３が短すぎる場合には、分別の精度が低下し、コンタミネーションの原因となるおそれがある。また、分別流路３が長すぎる場合には、分別の効率が低下する。

分岐部４は、分別流路３に接続され、分別流路３の少なくとも末端で式（１）に従って重力方向に分布した粒子群を含む分別液を、上方向（重力に逆らう方向）に向かって延びる第１流路５および下方向（重力方向）に向かって延びる第２流路７に分別する分岐点を備えている。分岐部４の構造は、例えば垂直Ｙ字構造（図１の構造）であるが、この構成に限定されない。分岐部４の他の構造としては、例えば、垂直Ｔ字構造、二層構造、平面二層Ｙ字構造（図３の構造）等が挙げられる。垂直Ｙ字構造は、分別流路３から垂直方向にＹ字状に枝分かれしている構造であり、分別する粒子群が沈降する粒子および浮上する粒子の混合物である場合に、効率的に分別することができる構造である。本実施の形態に係る粒子分別装置を使用する場合には、チップ１の最大面を重力方向に対して凡そ垂直にして当該チップ１を固定すればよい。凡そ垂直とは、垂直を含むと共に、ある程度の傾斜角を有していてもよいという意味であり、チップ１の最大面を垂直にしたときを９０ｄｅｇとした場合、当該傾斜角は６０〜１２０ｄｅｇの範囲内であればよく、７０〜１１０ｄｅｇの範囲内であることがより好ましい。当該傾斜角が小さすぎる場合、または大きすぎる場合には、分別の精度が低下するおそれがある。

また、垂直Ｔ字構造は、分別流路３から垂直方向にＴ字状に枝分かれしている点以外は、垂直Ｙ字構造と同様の構造である。二層構造はチップ１の最大面と並行に二層に分かれている構造であり、チップ１の最大面を重力に対して水平にしてチップ１を固定して使用することができる。平面二層Ｙ字構造は、二層に分かれている第１流路５および第２流路７がチップ１の最大面と並行にＹ字状に分かれていく構造である以外は二層構造と同様の構造である。

第１流路５は、分岐部４の上方向（重力に逆らう方向）に向かって延びる流路である。分別流路３において、分別流路３から分岐部４の方向（一定方向）に流れる分別液中を密度が低い粒子（分別液の密度より密度が低い粒子）群が浮上して上方向に分布しているため、分岐部４にて、密度が低い粒子群を含む分別液は、上方向に向かって形成された第１流路５に供給される。すなわち、第１流路５には、分別液に含まれる密度が低い粒子群が供給される。

第１流路５の流路の形状は、長方形状であってもよく、正方形状や円形状、楕円形状、不定形状であってもよい。また、第１流路５の流路径（最大径）は、具体的には、１００，０００μｍ以下であることが好ましく、１０，０００μｍ以下であることがより好ましく、１，０００μｍ以下であることがさらに好ましい。また、第１流路５の流路径（最小径）は、具体的には、１μｍ以上であることが好ましく、１０μｍ以上であることがより好ましく、１００μｍ以上であることがさらに好ましい。流路径が小さすぎると、粒子群が第１流路５内で詰まるおそれがある。また、第１流路５の長さは特に限定されない。

第１流路５の断面積は、特に限定されないが、分別液の滞留や逆流等を防ぐ目的から、後述する第２流路７の断面積との合計が、分別流路３の断面積の値以下であることが好ましい。

第１排水口６は、チップ１で分別された密度の低い粒子群を含む分別液を排出する排水口である。第１排水口６の大きさや形状は、第１流路５の大きさや形状に従って定めればよい。例えば、第１排水口６の形状は、チップ１で分別された粒子群を含む分別液を回収するための送液管等を固定するための形状であってもよい。或いは、第１排水口６の形状は、チップ１で分別された粒子群を含む分別液を回収するための液溜りを構成する形状であってもよい。

第２流路７は、分岐部４の下方向（重力方向）に向かって延びる流路である。分別流路３において、分別流路３から分岐部４の方向（一定方向）に流れる分別液中を密度が高い粒子（分別液の密度より密度が高い粒子）群が沈降して下方向に分布しているため、分岐部４にて、密度が高い粒子群を含む分別液は、下方向に向かって形成された第２流路７に供給される。すなわち、第２流路７には、分別液に含まれる密度が高い粒子群が供給される。

第２流路７の流路の形状や流路径（最小径）については、第１流路５の流路の形状や流路径（最小径）と同様にすればよい。但し、第１流路５および第２流路７は互いに異なった構成であってもよく、例えば粒子径に応じて、第１流路５の流路径（最小径）を小さく、第２流路７の流路径（最小径）を大きくした構造であってもよい。

第２排水口８は、チップ１で分別された密度の高い粒子群を含む分別液を排出する排水口である。第２排水口８の大きさや形状は、第２流路７の大きさや形状に従って定めればよい。例えば、第２排水口８の形状は、チップ１で分別された粒子群を含む分別液を回収するための送液管等を固定するための形状であってもよい。或いは、第２排水口８の形状は、チップ１で分別された粒子群を含む分別液を回収するための液溜りを構成する形状であってもよい。

本発明に係る粒子分別装置の要部であるチップ１は、例えば、マイクロ流路（マイクロメートルオーダーの流路）である上記分別流路３、分岐部４、第１流路５および第２流路７を構成する溝が形成された第一部材、および、上記分別流路３、分岐部４、第１流路５および第２流路７を構成する溝が形成された第二部材を、上記溝で分別流路３、分岐部４、第１流路５および第２流路７が構成されるように重ね合わせることにより、より簡単に形成することができる。また、このようにチップ１を形成することにより、分別流路３、分岐部４、第１流路５および第２流路７をより簡単に清掃することができる。

また、本発明に係る粒子分別装置の要部であるチップ１は、例えば、マイクロ流路である上記分別流路３、分岐部４および第１流路５を構成する溝が形成された第一部材、および、上記分別流路３、分岐部４および第２流路７を構成する溝が形成された第二部材を、上記溝で分別流路３、分岐部４、第１流路５および第２流路７が構成されるように重ね合わせることにより、より簡単に形成することができる。また、このようにチップ１を形成することにより、分別流路３、分岐部４、第１流路５および第２流路７をより簡単に清掃することができる。さらに、上記の構成によれば、第１流路５および第２流路７を分別流路３から見て段違いに（二層構造に）形成することができる（図３の構造）ので、粒子分別装置のチップ１の上下方向における幅（高さ）をより狭くすることができる。

さらには、本発明に係る粒子分別装置の要部であるチップ１は、例えば、マイクロ流路である上記分別流路３、分岐部４、第１流路５および第２流路７を構成する溝が形成された第一部材、および、溝が形成されていない平滑な第二部材を、上記溝で分別流路３、分岐部４、第１流路５および第２流路７が構成されるように重ね合わせることにより、さらに簡単に形成することができる。また、このようにチップ１を形成することにより、分別流路３、分岐部４、第１流路５および第２流路７をさらに簡単に清掃することができる。

粒子分別装置の分別流路３に供給する分別液は、粒子群を分散または懸濁させることができる液であればよい。分別液は、具体的には、例えば、水や有機溶媒であればよく、分別すべき粒子が溶解や変質したり、分別流路３、分岐部４、第１流路５および第２流路７が形成されているチップ１を溶解や変質したりしない性質の液体である限り、特に限定されない。また、分別液は、上記式（１）に基づき、分散させる粒子群の密度や粒子径、分別流路３等の流路径や流路の長さ等に従って、適宜、密度や粘度を変化させればよい。分別液の密度や粘度を変化させる方法としては、粒子を変質させない例えば塩や糖類等の有機化合物を予め溶解させておく方法が挙げられる。

分別液は、分別流路３内、分岐部４内、第１流路５内および第２流路７内を層流で流れる。すなわち、分別液は、チップ１内を層流で流れる。これにより、粒子群は、上記式（１）に従った挙動を行うことになる。

本発明において分別対象となる粒子群は、分別液中において安定に存在することができる粒子群であればよく、例えば、生体粒子、樹脂粒子、金属粒子等の粒子群が挙げられる。生体粒子としては、例えば、卵子を含む体細胞、赤血球、血小板、細菌類、酵母細菌、細胞フラクション、脂質小球、たんぱく質ミセル、プランクトン、藻類等であって、殆ど生体運動を伴わない粒子が挙げられる。例えば、本発明によれば、密度が互いに異なる受精卵と未受精卵との分別を行うことができる。また、樹脂粒子としては、有機高分子や無機高分子からなる粒子群が挙げられる。金属粒子としては、粒子状の合金、砂鉄、砂金等が挙げられる。粒子の形状は、球形であることが好ましいものの、概略球形や楕円球形、不定形破砕形であってもよい。

粒子の粒子径は、０．１μｍ以上であればよく、１μｍ以上であることがより好ましく、１０μｍ以上であることがさらに好ましい。粒子の粒子径が小さすぎる場合には、上記式（１）を満たさなくなる上、粒子の浮上または沈降の速度が極めて遅くなるため、分別流路３を極端に長くする必要があり、粒子分別装置が大型化する。また、第１排水口６または第２排水口８から回収される粒子のロスが大きくなる場合がある。

また、粒子の粒子径は、５，０００μｍ以下であればよく、１，０００μｍ以下であることがより好ましく、１００μｍ以下であることがさらに好ましい。粒子の粒子径が大きすぎる場合には、上記式（１）を満たさなくなる上、粒子の浮上または沈降の速度が極めて速くなるため、分別液の流速が遅い場合には、粒子群が分別流路３内で詰まるおそれがある。また、精度の高い分別を容易に行うことが難しくなる場合がある。

また、第１流路５および第２流路７のそれぞれに分別される粒子同士の最小密度差は、特に限定されないものの、０．００１ｇ／ｍＬ以上であればよく、０．００２ｇ／ｍＬ以上であることがより好ましく、０．００５ｇ／ｍＬ以上であることがさらに好ましく、０．０１ｇ／ｍＬ以上であることが特に好ましい。これにより、分別した粒子同士のコンタミネーションを防ぐことができ、より精度の高い分別が可能となる。

すなわち、本実施の形態に係る粒子分別装置は、上記構成により、分別した粒子同士のコンタミネーションを防ぐことができ、より精度の高い分別が可能となる。

粒子分別装置は、要部であるチップ１の他に、必要に応じて、分別液を供給するシリンジポンプ等の送液装置や、粒子群を含む分別液を攪拌するスターラーやボルテックスミクサ等の攪拌装置、シリコーン等からなる送液管、水槽、吸引装置等を備えていてもよい。つまり、粒子分別装置は、攪拌装置で粒子群を含む分別液を攪拌して懸濁させ、当該分別液を送液装置で送液管を介して導入口２からチップ１内の分別流路３に供給してもよい。或いは、重力差を用いて高い位置から、粒子群を含む分別液を、懸濁させながら送液管等を介して導入口２からチップ１内の分別流路３に供給してもよい。或いは、第１排水口６および第２排水口８から吸引装置で分別液を吸引することで、粒子群を含む分別液を分別流路３に供給してもよい。そして、第１排水口６または第２排水口８から排出される粒子群を含む分別液は、送液管等を介して水槽に回収してもよい。また、第１排水口６および第２排水口８から送液管を介して吸引装置で分別液を吸引して水槽に回収してもよい。

また、第１排水口６または第２排水口８から排出される粒子群を含む分別液から当該粒子群を取り出す方法としては、例えば、濾過する方法、沈殿させる方法等が挙げられる。

従って、本発明は、上記粒子分別装置を用いた、粒子群を、密度が高い粒子群と、密度の低い粒子群に分別する粒子分別方法も提供する。

〔実施の形態２〕
本発明に係る実施の他の形態を、図面を参照しながら以下に説明する。図３は、後述する実施例２における粒子分別装置の概略の構成を示す（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＹ−Ｙ’線矢視断面図であり、（ｃ）は（ａ）のＹ”−Ｙ'''線矢視断面図である。本実施の形態に係る粒子分別装置は、図３（ａ）に示すように、粒子分別装置の要部であるチップ１１を備え、チップ１１はその内部に、第１導入口１２、第１導入流路２１、第２導入口１９、第２導入流路２０、合流部２２、分別流路１３、分岐部１４、第１流路１５、第１排水口１６、第２流路１７および第２排水口１８を少なくとも備えている。

なお、チップ１１は実施の形態１におけるチップ１に、第１導入口１２および第２導入口１９は導入口２に、分別流路１３は分別流路３に、第１流路１５は第１流路５に、第１排水口１６は第１排水口６に、第２流路１７は第２流路７に、第２排水口１８は第２流路８に対応する。従って、以下の説明において特に記載していない構成または形態は、上記実施の形態１の構成または形態と同様である。

第１導入口１２および第２導入口１９は、第１導入流路２１内または第２導入流路２０内に粒子群を含む分別液を導入する導入口である。第１導入口１２および第２導入口１９の大きさや形状は、第１導入流路２１および第２導入流路２０の大きさや形状に従って定めればよい。例えば、第１導入流路２１および第２導入流路２０の形状は、実施の形態１の導入口２と同様に、外部から粒子群を含む分別液を導入するための送液管等を固定することができる形状であってもよい。また、粒子群を一点から分別流路１３内に放出することができるように、第１導入口１２および第２導入口１９を分別流路１３の大きさに比べて細い構造としてもよく、または絞りを設けてもよい。

第１導入口１２および第２導入口１９からは、それぞれ異なった粒子群を含む分別液を供給してもよい。また、一方から粒子群を含む分別液を供給し、他方から緩衝液や異なる密度の別の分別液を供給してもよい。緩衝液は、粒子群を含む分別液の密度を一定に保つため、或いは、粒子を安定に保つために導入される。また、異なる密度の別の分別液を供給することにより、分別流路１３内において粒子群を含む分別液の密度とは異なる特定の密度の分別液（混合液）を形成することができる。つまり、上記式（１）に従って粒子を分別するのに好適な密度の分別液に調節することができる。

第１導入流路２１および第２導入流路２０は、それぞれ、第１導入口１２および第２導入口１９から合流部２２へ粒子群を含む分別液を送液するための管である。第１導入流路２１および第２導入流路２０の流路径（最大径）は、分別流路１３の流路径（最大径）と同一にすればよく、具体的には、５０，０００μｍ以下であることが好ましく、５，０００μｍ以下であることがより好ましく、５００μｍ以下であることがさらに好ましい。また、第１導入口１２および第２導入口１９の流路径（最小径）は、具体的には、１μｍ以上であることが好ましく、１０μｍ以上であることがより好ましく、１００μｍ以上であることがさらに好ましい。

流路径（最小径）が小さすぎると、粒子群が第１導入流路２１内および第２導入流路２０内で詰まるおそれがある。第１導入流路２１および第２導入流路２０のそれぞれの流路径は、互いに異なっていてもよい。また、特に限定されないが、分別液の滞留や逆流等を防ぐ目的から、第１導入流路２１と第２導入流路２０との断面積との合計は、分別流路１３の断面積の値以下であることが好ましい。

合流部２２は、第１導入流路２１と第２導入流路２０とが合流する合流点を備えている。合流部２２の構造は、実施の形態１の分岐部４と同様な構造であればよく、例えば平面Ｙ字構造（図１の分岐部４の構造）、平面Ｔ字構造、二層構造、平面二層Ｙ字構造（図３の構造）等が挙げられる。合流部２２では、第１導入流路２１および第２導入流路２０の両方から流れてきた分別液や緩衝液を効率的に混合するために、その一部を徐々に細くした後、徐々に太くした構造としてもよい。または絞り構造を設けてもよい。

分別流路１３は、実施の形態１の分別流路３と同様に、分別液に含まれる粒子群が上記式（１）に従って、粒子径および分別液との密度の差に基づき分別される流路である。したがって、チップ１１は、上記式（１）に従って、分別する粒子群の粒子径や密度に応じて、分別流路１３の長さや流路径、分別液の密度や粘度、流速等を最適な値に設定すればよい。

分岐部１４は、図３において、平面二層Ｙ字構造として形成されているが、実施の形態１の分岐部４と同様、これに限定されるものではない。

本実施の形態に係る粒子分別装置は、上記構成により、分別した粒子同士のコンタミネーションを防ぐことができ、より精度の高い分別が可能となる。

〔実施の形態３〕
本発明に係る実施の他の形態を、図面を参照しながら以下に説明する。図６は、後述する実施例３における粒子分別装置の概略の構成を示す（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＺ−Ｚ’線矢視断面図であり、（ｃ）は（ａ）のＺ”−Ｚ'''線矢視断面図である。本実施の形態に係る粒子分別装置は、図６（ａ）に示すように、粒子分別装置の要部であるチップ３１を備え、チップ３１はその内部に、第１導入口３２、第１導入流路４１、第２導入口３９、第２導入流路４０、粒子挿入部４３、合流部４２、分別流路３３、分岐部３４、第１流路３５、第１排水口３６、第２流路３７および第２排水口３８を少なくとも備えている。

なお、チップ３１は実施の形態２におけるチップ１１に、第１導入口３２は第１導入口１２に、第２導入口３９は第２導入口１９に、合流部４２は合流部２２に、分別流路３３は分別流路１３に、分岐部３４は分岐部１４に、第１流路３５は第１流路１５に、第１排水口３６は第１排水口１６に、第２流路３７は第２流路１７に、第２排水口３８は第２排水口１８に対応する。従って、以下の説明において特に記載していない構成または形態は、上記実施の形態２の構成または形態と同様である。

第１導入流路４１および第２導入流路４０は、合流部４２を介して分別流路３３に向かって滑らかな曲線を描くようにして（ある曲率を有する曲線状に）接続されている。これにより、分別液または粒子群を含む分別液が円滑に流れるため、粒子群が詰まるおそれを、より低減することができる。また、粒子群を分別液中に効率的に分散することができるため、粒子分別装置の分別精度がより向上する。

粒子挿入部４３は、粒子群を懸濁液として、または、粒子群のみを挿入して合流部２２にて分別液と混合、分散して、分別流路３３に供給するための挿入口である。粒子群の挿入方法としては、当該粒子群を挿入することができる限り、特に限定されないが、例えば、シリンジポンプ等の送液装置を使用し、送液装置から管を介して粒子群を懸濁液として挿入する方法、分別液が粒子挿入部４３から逆流しないように、重力差を用いて高い位置から粒子群を直接挿入する方法等が挙げられる。粒子挿入部４３から直接挿入可能な粒子群としては、ゲル状の粒子群や弾力を有する粒子群が挙げられる。粒子挿入部４３を介して粒子群を挿入することにより、粒子群を分別液中に効率的に分散させることができ、粒子群をより効率的に分別することができる。

第１流路３５および第２流路３７は、第１導入流路４１および第２導入流路４０と同様に、分岐部３４を介して分別流路３３に向かって滑らかな曲線を描くようにして（ある曲率を有する曲線状に）接続されている。これにより、分別液または粒子群を含む分別液が円滑に流れるため、粒子群が詰まるおそれを、より低減することができる。

〔実施の形態４〕
上記実施の形態１〜３で示される粒子分別装置の構成は、図９に示す構成であってもよい。図９は、粒子分別装置の分別流路および分岐部の変形例を示すものであり、概略の構成を説明する説明図である。具体的には、図９（ａ）は、分別液の密度よりも低い密度の粒子群同士を分別する構成を示した説明図であり、図９（ｂ）は、分別液の密度に比べて極めて低い密度の粒子群だけを先に分別する構成を示した説明図であり、図９（ｃ）は、分別液の密度よりも低い密度の粒子群、高い密度の粒子群に加え、分別液の密度に近い密度の粒子群を分別する構成を示した説明図である。以下、より具体的に説明する。

図９（ａ）に示される構造においては、導入口（または分岐部）の流路径が分別流路の流路径に比べて狭い構造となっており、密度が互いに異なる二種類の粒子群が、下方向（重力方向）の一領域から第１流路２０１および第２流路２０２に供給される。分別液の密度よりも低い密度であって、密度が互いに異なる二種類の粒子群は、上記式（１）に従って、それぞれの浮上速度で浮上する。一定の条件において、式（１）に従えば、密度が互いに異なる二種類の粒子群は、分別流路の末端である分岐部において、それぞれ異なった高さ（重力方向に対する高さ）に位置する。すなわち、分岐部において上方向（重力に逆らう方向）に集まる粒子群と、分岐部において下方向（重力方向）に集まる粒子群とに別れることになり、それぞれ、第１流路２０１および第２流路２０２によって分別が可能となる。

図９（ｂ）に示される構造においては、導入口（または分岐部）の流路径が分別流路の流路径に比べて狭い構造となっており、密度が互いに異なる少なくとも二種類の粒子群が、中央の一領域から第２流路２０２に供給される。密度が互いに異なる少なくとも二種類の粒子群のうち、分別液の密度に比べて極めて低い密度の粒子群は、上方向（重力に逆らう方向）に比較的速い浮上速度で浮上する。従って、導入口（または分岐部）から一定の距離における位置を分岐点として、上方向（重力に逆らう方向）に第１流路２０１を設けることにより、一定の条件において、極めて低い密度の粒子群のみが第１流路２０１に供給されることによって分別が可能となる。また、残りの粒子群は、第２流路２０２に供給されることによって分別が可能となり、必要に応じて第２流路２０２に分岐部を設けることにより、さらに分別が可能となる。

図９（ｃ）に示される構造においては、導入口（または分岐部）の流路径が分別流路の流路径に比べて狭い構造となっており、分別液の密度よりも低い密度の粒子群、高い密度の粒子群、および、分別液の密度に近い密度の粒子群の混合物からなる粒子群が、中央の一領域から第１流路３０１、第２流路３０２および第３流路３０３に供給される。混合物からなる上記粒子群のうち、分別液の密度よりも低い密度の粒子群は、上方向（重力に逆らう方向）に浮上する。また、分別液の密度よりも高い密度の粒子群は、下方向（重力方向）に沈降する。そして、分別液の密度に近い密度の粒子群は、上記式（１）に従えば、浮上も沈降もしないで、流路内を一定の高さを維持しながら流れる。従って、分別液の密度よりも低い密度の粒子群は上方向（重力に逆らう方向）に設けられた第１流路３０１に供給され、分別液の密度よりも高い密度の粒子群は下方向（重力方向）に設けられた第２流路３０２に供給され、分別液の密度に近い密度の粒子群は第１流路３０１と第２流路３０２との間（中央付近）に設けられた第３流路３０３に供給される。これにより、それぞれの粒子群は、第１流路３０１、第２流路３０２および第３流路３０３によって分別が可能となる。

〔実施の形態５〕
本発明に係る実施のさらに他の形態を、図面を参照しながら以下に説明する。図１０は、後述する実施例６における粒子分別装置の概略の構成を示す（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＷ_１−Ｗ_２線矢視断面図であり、（ｃ）は（ａ）のＷ_３−Ｗ_４線矢視断面図であり、（ｄ）は（ａ）のＷ_５−Ｗ_６線矢視断面図である。本実施の形態に係る粒子分別装置は、図１０（ａ）に示すように、粒子分別装置の要部であるチップ５１を備え、チップ５１はその内部に、第１導入口５２、第１導入流路６１、第２導入口５９、第２導入流路６０、粒子挿入部６３、合流部６２、分別流路５３、分岐部５４、第１流路５５、第１液溜り５６、第２流路５７および第２液溜り５８を少なくとも備えている。

なお、チップ５１は実施の形態３におけるチップ３１に、第１導入口５２は第１導入口３２に、第２導入口５９は第２導入口３９に、第１導入流路６１は第１導入流路４１に、第２導入流路６０は第２導入流路４０に、合流部６２は合流部４２に、分別流路５３は分別流路３３に、分岐部５４は分岐部３４に、第１流路５５は第１流路３５に、第１液溜り５６は第１排水口３６に、第２流路５７は第２流路３７に、第２液溜り５８は第２排水口３８に対応する。従って、以下の説明において特に記載していない構成または形態は、上記実施の形態３の構成または形態と同様である。

第１液溜り５６は、チップ５１で分別された密度の低い粒子群を含む分別液を排出する排水口の代わりに設けられ、チップ５１で分別された粒子群を含む分別液を回収するための液溜りを構成する形状となっている。第２液溜り５８は、チップ５１で分別された密度の高い粒子群を含む分別液を排出する排水口の代わりに設けられ、チップ５１で分別された粒子群を含む分別液を回収するための液溜りを構成する形状となっている。

本実施の形態に係る粒子分別装置は、上記構成により、実施の形態３で示される粒子分別装置と同様に、分別した粒子同士のコンタミネーションを防ぐことができ、より精度の高い分別が可能となる。

以下、本発明を、実施例を用いてさらに説明する。

〔実施例１〕
図１は、粒子分別装置の概略の構成を示す（ａ）は側面図であり、（ｂ）は（ａ）のＸ−Ｘ’線矢視断面図である。本実施例に係る粒子分別装置は、実施の形態１に係る粒子分別装置の一具体例である。チップ１は、従来公知の製造方法で製造した。すなわち、精密機械を用いてポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）樹脂を加工して、マイクロ流路となる矩形状の凸部を有する型を形成し、この型を鋳型として、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）樹脂を用いて、チップ１となる溝が形成された第一部材を製造すると共に、溝が形成されていない平滑な第二部材（ガラス基板）を製造し、両部材を重ね合わせてチップ１を製造した。

分別流路３の断面は、垂直方向に６００μｍ、水平方向に２００μｍの長方形となるように加工した。また、分別流路３の長さは、４ｃｍとした。第１流路５および第２流路７の断面は、垂直方向に３００μｍ、水平方向に２００μｍの長方形となるように加工した。また、分岐部４は、垂直Ｙ字構造を形成するように加工した。さらに、ポリジメチルシロキサン樹脂からなるチップ１の強度を高めるために、当該チップ１の表面（最大面）に、補強のためのガラス基板を、従来公知の酸素プラズマ処理を用いることによって接合した。

このようにして製造したチップ１を含む粒子分別装置の分別評価試験を行った。分別評価試験の方法を以下に具体的に説明する。チップ１は分別評価試験時に、その最大面が重力方向と垂直になるようにして固定した。すなわち、チップ１は垂直に固定して用いた。

分別評価試験に用いる分別液として、濃度１．２ｇ／ｍＬに調製したショ糖水溶液を用いた。分別評価試験に用いる粒子群として、一般的にゲル濾過に用いられるポリアクリルアミドゲルを用いた。当該ポリアクリルアミドゲルとして、低い密度を有するポリアクリルアミドゲルＡ、および、高い密度を有するポリアクリルアミドゲルＢの二種類を用いた。ポリアクリルアミドゲルＡは、ショ糖水溶液（濃度１．２ｇ／ｍＬ）による膨潤時において、密度１．０ｇ／ｍＬ以下、且つ、粒子径４５〜９０μｍである。また、ポリアクリルアミドゲルＢは、ショ糖水溶液（濃度１．２ｇ／ｍＬ）による膨潤時において、密度１．３ｇ／ｍＬ以上、且つ、粒子径４５〜９０μｍである。

粒子群を含む分別液は、シリンジポンプを使用して、送液管を介して導入口２から分別流路３に送液した。粒子を含む分別液の流速は４．０μＬ／分とし、マイクロ流路内の流速は３．３ｃｍ／分とした。そして、第１流路５および第２流路７から排出される粒子群を含む分別液は、第１排水口６および第２排水口８から送液管を介して回収した。その後、分別液から粒子群を取り出した。

分別評価試験の結果、ポリアクリルアミドゲルＡは、分別流路３内を流れながら浮上し、分岐部４にて上方向に接続している第１流路５に供給された。ポリアクリルアミドゲルＡにポリアクリルアミドゲルＢは混入しておらず、第１排水口６からはポリアクリルアミドゲルＡのみが回収された。一方、ポリアクリルアミドゲルＢは、分別流路３内を流れながら沈降し、分岐部４にて下方向に接続している第２流路７に供給された。ポリアクリルアミドゲルＢにポリアクリルアミドゲルＡは混入しておらず、第２排水口８からはポリアクリルアミドゲルＢのみが回収された。

図２は、（ａ），（ｂ）共に、分別評価試験での粒子分別装置の分岐部４近傍を、水平方向から観察した側面図である。図２（ａ）では、ポリアクリルアミドゲルＡが分別流路３内を流れながら浮上し、分岐部４にて上方向に接続している第１流路５に供給される様子が示されている。また、図２（ｂ）では、ポリアクリルアミドゲルＢが分別流路３内を流れながら沈降し、分岐部４にて下方向に接続している第２流路７に供給される様子が示されている。

〔実施例２〕
図３は、粒子分別装置の概略の構成を示す（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＹ−Ｙ’線矢視断面図であり、（ｃ）は（ａ）のＹ”−Ｙ'''線矢視断面図である。本実施例に係る粒子分別装置は、実施の形態２に係る粒子分別装置の一具体例である。チップ１１は、実施例１のチップ１と同様にして、鋳型を用いて第一部材および第二部材を製造し、両部材を重ね合わせて製造した。

分別流路１３の断面は、垂直方向に４００μｍ、水平方向に４００μｍの正方形となるように加工した。また、分別流路１３の長さは、４ｃｍとした。第１流路１５および第２流路１７の断面は、垂直方向に２００μｍ、水平方向に４００μｍの長方形となるように加工した。また、合流部２２および分岐部１４は、平面二層Ｙ字構造を形成するように加工した。すなわち、合流部２２および分岐部１４は垂直方向から見た形状がＹ字状であり、立体的には二つの流路が重なって「く」の字状となるように形成した。

チップ１１は分別評価試験時に、その最大面が水平方向と垂直になるようにして固定した。すなわち、チップ１１は水平に固定して用いた。また、粒子を含む分別液の流速は４．０μＬ／分とし、マイクロ流路内の流速は２．５ｃｍ／分とした。さらに、第１導入口１２および第２導入口１９の両方から同一の速度で粒子群を含む分別液を導入した。それ以外の条件は、実施例１の条件と同じにした。

分別評価試験の結果、ポリアクリルアミドゲルＡは、分別流路１３内を流れながら浮上し、分岐部１４にて上方向に接続している第１流路１５に供給された。ポリアクリルアミドゲルＡにポリアクリルアミドゲルＢは混入しておらず、第１排水口１６からはポリアクリルアミドゲルＡのみが回収された。一方、ポリアクリルアミドゲルＢは、分別流路１３内を流れながら沈降し、分岐部１４にて下方向に接続している第２流路１７に供給された。ポリアクリルアミドゲルＢにポリアクリルアミドゲルＡは混入しておらず、第２排水口１８からはポリアクリルアミドゲルＢのみが回収された。

図４（ａ）および図５（ａ）は、分別評価試験での粒子分別装置の分岐部１４近傍を、垂直方向から観察した平面図であり、図４（ｂ）および図５（ｂ）はそれぞれ（ａ）に対応する水平方向から見た概略の断面図である。図４（ａ），（ｂ）では、ポリアクリルアミドゲルＡが分別流路１３内を流れながら浮上し、分岐部１４にて上方向に接続している第１流路１５に供給される様子が示されている。また、図５（ａ），（ｂ）では、ポリアクリルアミドゲルＢが分別流路１３内を流れながら沈降し、分岐部１４にて下方向に接続している第２流路１７に供給される様子が示されている。

〔実施例３〕
図６は、粒子分別装置の概略の構成を示す（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＺ−Ｚ’線矢視断面図であり、（ｃ）は（ａ）のＺ”−Ｚ'''線矢視断面図である。本実施例に係る粒子分別装置は、実施の形態３に係る粒子分別装置の一具体例である。チップ３１は、実施例２のチップ１１と同様にして製造した。

分別流路３３の断面は、垂直方向に４００μｍ、水平方向に７００μｍの長方形となるように加工した。また、分別流路３３の長さは、４ｃｍとした。第１導入流路４１、第２導入流路４０、第１流路３５および第２流路３７の断面は、垂直方向に２００μｍ、水平方向に４００μｍの長方形となるように加工した。さらに、粒子挿入部４３の断面は、垂直方向に２００μｍまたは３００μｍ、水平方向に２００μｍまたは３００μｍの正方形となるように加工した。また、合流部４２および分岐部３４は、平面二層Ｙ字構造を形成するように加工した。すなわち、合流部４２および分岐部３４は垂直方向から見た形状がＹ字状であり、立体的には二つの流路が重なって「く」の字状となるように形成した。第１導入流路４１および第２導入流路４０は、合流部４２を介して分別流路３３に向かって滑らかな曲線を描くようにして（ある曲率を有する曲線状に）形成した。第１流路３５および第２流路３７は、分岐部３４を介して分別流路３３に向かって滑らかな曲線を描くようにして（ある曲率を有する曲線状に）形成した。

このようにして製造したチップ３１を含む粒子分別装置の分別評価試験（二回）を行った。チップ３１は分別評価試験時に、その最大面が水平方向と垂直になるようにして固定した。すなわち、チップ３１は水平に固定して用いた。

分別評価試験に用いる分別液として、濃度１．０５ｇ／ｍＬに調製したショ糖水溶液を用いた。分別評価試験に用いる粒子群として、粒子径の標準として用いられるポリスチレン粒子を用いた。当該ポリスチレン粒子として、低い密度を有するポリスチレン粒子Ａ、および、高い密度を有するポリスチレン粒子Ｂの二種類を用いた。ポリスチレン粒子Ａは、ショ糖水溶液（濃度１．０５ｇ／ｍＬ）による膨潤時において、密度１．０４〜１．０５ｇ／ｍＬ以下、且つ、粒子径１５０μｍである。また、ポリスチレン粒子Ｂは、ショ糖水溶液（濃度１．０５ｇ／ｍＬ）による膨潤時において、密度１．０５〜１．０６ｇ／ｍＬ以上、且つ、粒子径１４０μｍである。

分別液は、シリンジポンプを使用して、送液管を介して第１導入口３２および第２導入口３９から同一の流速で分別流路３３に送液した。粒子群は、粒子挿入部４３から挿入した。粒子を含む分別液の流速は２０μＬ／分とし、マイクロ流路である分液流路３３内の流速は７．１ｃｍ／分とした。そして、第１流路３５および第２流路３７から排出される粒子群を含む分別液は、第１排水口３６および第２排水口３８から送液管を介して回収した。その後、分別液から粒子群を取り出した。それ以外の条件は、実施例２の条件と同じにした。

分別評価試験の結果、二回とも、ポリスチレン粒子Ａは、分別流路３３内を流れながら浮上し、分岐部３４にて上方向に接続している第１流路３５に供給された。ポリスチレン粒子Ａにポリスチレン粒子Ｂは混入しておらず、第１排水口３６からはポリスチレン粒子Ａのみが回収された。一方、ポリスチレン粒子Ｂは、分別流路３３内を流れながら沈降し、分岐部３４にて下方向に接続している第２流路３７に供給された。ポリスチレン粒子Ｂにポリスチレン粒子Ａは混入しておらず、第２排水口３８からはポリスチレン粒子Ｂのみが回収された。

図７（ａ）は、分別評価試験での粒子分別装置の分岐部３４近傍を、垂直方向から観察した平面図であり、（ｂ）は（ａ）に対応する水平方向から見た概略の断面図である。図７（ａ）では、ポリスチレン粒子Ａが分別流路３３内を流れながら浮上し、分岐部３４にて上方向に接続している第１流路３５に供給される様子が示されている。また、図７（ｂ）では、ポリスチレン粒子Ｂが分別流路３３内を流れながら沈降し、分岐部３４にて下方向に接続している第２流路３７に供給される様子が示されている。

〔実施例４〕
粒子挿入部４３の断面を、垂直方向に３００μｍ、水平方向に３００μｍの正方形となるように加工した以外は、実施例３と同様にしてチップ３１を製造した。そして、実施例３と同様にして、チップ３１を含む粒子分別装置の分別評価試験を行った。

分別評価試験の結果、ポリスチレン粒子Ａは、分別流路３３内を流れながら浮上し、分岐部３４にて上方向に接続している第１流路３５に供給された。ポリスチレン粒子Ａにポリスチレン粒子Ｂは混入しておらず、第１排水口３６からはポリスチレン粒子Ａのみが回収された。一方、ポリスチレン粒子Ｂは、分別流路３３内を流れながら沈降し、分岐部３４にて下方向に接続している第２流路３７に供給された。ポリスチレン粒子Ｂにポリスチレン粒子Ａは混入しておらず、第２排水口３８からはポリスチレン粒子Ｂのみが回収された。

〔実施例５〕
粒子挿入部４３の断面を、垂直方向に２００μｍ、水平方向に２００μｍの正方形となるように加工した以外は、実施例３と同様にしてチップ３１を製造した。そして、実施例３と同様にして、チップ３１を含む粒子分別装置の分別評価試験を行った。

分別評価試験の結果、ポリスチレン粒子Ａは、分別流路３３内を流れながら浮上し、分岐部３４にて上方向に接続している第１流路３５に供給された。ポリスチレン粒子Ａにポリスチレン粒子Ｂは混入しておらず、第１排水口３６からはポリスチレン粒子Ａのみが回収された。一方、ポリスチレン粒子Ｂは、分別流路３３内を流れながら沈降し、分岐部３４にて下方向に接続している第２流路３７に供給された。ポリスチレン粒子Ｂにポリスチレン粒子Ａは混入しておらず、第２排水口３８からはポリスチレン粒子Ｂのみが回収された。

〔実施例６〕
図１０は、粒子分別装置の概略の構成を示す（ａ）は平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＷ_１−Ｗ_２線矢視断面図であり、（ｃ）は（ａ）のＷ_３−Ｗ_４線矢視断面図であり、（ｄ）は（ａ）のＷ_５−Ｗ_６線矢視断面図である。本実施例に係る粒子分別装置は、実施の形態５に係る粒子分別装置の一具体例であり、細胞分別装置である。チップ５１は、実施例３のチップ３１と同様にして製造した。但し、粒子挿入部６３を構成する溝は、第一部材にのみ形成した。

分別流路５３の断面は、垂直方向に１，０００μｍ、水平方向に７００μｍの長方形となるように加工した。また、分別流路５３の長さは、１ｃｍとした。第１導入流路６１、第２導入流路６０、第１流路５５および第２流路５７の断面は、垂直方向に５００μｍ、水平方向に７００μｍの長方形となるように加工した。さらに、粒子挿入部６３の断面は、垂直方向に４００μｍ、水平方向に４００μｍの正方形となるように加工した。また、合流部６２および分岐部５４は、平面二層Ｙ字構造を形成するように加工した。すなわち、合流部６２および分岐部５４は垂直方向から見た形状がＹ字状であり、立体的には二つの流路が重なって「く」の字状となるように形成した。第１導入流路６１および第２導入流路６０は、合流部６２を介して分別流路５３に向かって滑らかな曲線を描くようにして（ある曲率を有する曲線状に）形成した。第１流路５５および第２流路５７は、分岐部５４を介して分別流路５３に向かって滑らかな曲線を描くようにして（ある曲率を有する曲線状に）形成した。

第１液溜り５６および第２液溜り５８は、分別された粒子群を含む分別液をそれぞれ回収するのに十分な大きさに形成した。

このようにして製造したチップ５１を含む細胞分別装置の分別評価試験を行った。チップ５１は分別評価試験時に、その最大面が水平方向と垂直になるようにして固定した。すなわち、チップ５１は水平に固定して用いた。

分別評価試験に用いる分別液として、濃度（流体密度）１．０５ｇ／ｍＬに調製したショ糖水溶液（ポリビニルアルコールを０．０５重量％含有）を用いた。分別評価試験に用いる粒子群として、直径が約１５０μｍであるウシの卵子（粒子群）を用いた。当該ウシの卵子は、密度が比較的低い低品質の卵子Ａ（細胞）と、密度が比較的高い中品質ないし高品質の卵子Ｂ（細胞）との混合物であった。なお、低品質の卵子Ａは主に未成熟卵子であり、中品質ないし高品質の卵子Ｂは主に成熟卵子である。

分別液は、シリンジポンプを使用して、送液管を介して第１導入口５２および第２導入口５９から同一の流速で分別流路５３に送液した。卵子（粒子群）は、粒子挿入部６３から挿入した。卵子を含む分別液の流速は１５μＬ／分とし、マイクロ流路である分液流路５３内の流速は４．３ｃｍ／分とした。そして、第１流路５５および第２流路５７から排出される卵子を含む分別液は、第１液溜り５６および第２液溜り５８にそれぞれ溜めて回収した。その後、分別液から卵子を取り出した。それ以外の条件は、実施例３の条件と同じにした。

分別評価試験の結果、低品質の卵子Ａは、分別流路５３内を流れながら浮上ないし僅かに（ゆっくりと）沈降し、分岐部５４にて上方向に接続している第１流路５５に供給された。低品質の卵子Ａに中品質ないし高品質の卵子Ｂは混入しておらず、第１液溜り５６からは低品質の卵子Ａのみが回収された。一方、中品質ないし高品質の卵子Ｂは、分別流路５３内を流れながら大きく（速く）沈降し、分岐部５４にて下方向に接続している第２流路５７に供給された。中品質ないし高品質の卵子Ｂに低品質の卵子Ａは混入しておらず、第２液溜り５８からは中品質ないし高品質の卵子Ｂのみが回収された。従って、図１２に示すように、低品質の卵子Ａと中品質ないし高品質の卵子Ｂとで沈降の速度が異なること（時間差）を利用して、両者を分別し回収することができた。

図１１は、分別評価試験での細胞分別装置の合流部６２近傍（図１０（ｃ）に記載の部位に相当、図１１では「ａ」と記載した箇所）、分別流路５３（図１０（ｂ）に記載の部位に相当、図１１では「ｂ」と記載した箇所）および分岐部５４近傍（図１０（ｅ）に記載の部位に相当、図１１では「ｃ」と記載した箇所）を、水平方向から見た概略の断面図である。倒立顕微鏡で観察した結果、図１１から明らかなように、低品質の卵子Ａは、分別流路５３内を流れながら浮上ないし僅かに沈降し、分岐部５４にて上方向に接続している第１流路５５に供給される様子を確認することができた。また、中品質ないし高品質の卵子Ｂは、分別流路５３内を流れながら大きく沈降し、分岐部５４にて下方向に接続している第２流路５７に供給される様子を確認することができた。

また、分別液の流速等を変更して、さらに分別評価試験を行った。図１３における（ａ）は、低品質の卵子Ａと中品質ないし高品質の卵子Ｂとを垂直方向から観察した平面図であり、（ｂ）は細胞分別装置の分岐部５４近傍を、垂直方向から観察した平面図である。

当該分別評価試験の条件として、第１導入口５２および第２導入口５９から各流速４０μＬ／分で分別液を送液するとともに、粒子挿入部６３から流速１０μＬ／分で卵子Ａ・Ｂを含む分別液を送液した。そして、粒子挿入部６３から第１流路５５または第２流路５７までの距離（卵子Ａ・Ｂの移動距離）を１１４μｍとし、卵子Ａ・Ｂの滞留時間（１１４μｍを移動する時間）を８秒とした。また、粒子挿入部６３から供給する卵子の個数を５０個とした。

その結果、第１液溜り５６には２３個の卵子が回収され、第２液溜り５８には２７個の卵子が回収された。図１３（ｂ）では、卵子が分別流路５３内を流れながら僅かにまたは大きく沈降し、分岐部５４にて上下方向に接続している第１流路５５または第２流路５７に供給される様子が示されている。

回収された卵子を体外受精させて発生を確認したところ、第１液溜り５６に回収された卵子は低品質の卵子Ａであり、第２液溜り５８に回収された卵子は中品質ないし高品質の卵子Ｂであることを確認することができた。

一方、第１導入口５２および第２導入口５９から各流速２０μＬ／分で分別液を送液するとともに、粒子挿入部６３から流速１０μＬ／分で卵子Ａ・Ｂを含む分別液を送液し、かつ、移動距離を１９１μｍとし、滞留時間を１４秒とし、供給する卵子の個数を２３個として分別評価試験を行った。その結果、全ての卵子が沈降して第２液溜り５８に回収された。

従って、細胞分別装置を用い、滞留時間を好適に制御することで、低品質の卵子Ａと中品質ないし高品質の卵子Ｂとを分別し回収することができることがわかった。

本発明に係る粒子分別装置および粒子分別方法によれば、密度の差に従って粒子群が重力方向に異なる挙動を示すため、粒子径（サイズ）が同じであっても、異なる密度を有する粒子群を分別し回収することができる。従って、粒子に重力負荷等の大きなストレスをかけずに、短時間で粒子群を容易に分別することができ、分別した粒子群を容易に回収することができる。本発明に係る粒子分別装置および粒子分別方法は、特に、体細胞、赤血球、血小板、細菌類、酵母細菌、細胞フラクション、脂質小球、たんぱく質ミセル、プランクトン、藻類等の生体粒子、樹脂粒子、金属粒子等の粒子群の分別に好適である。

３ 分別流路
４ 分岐部
５ 第１流路
７ 第２流路
１３ 分別流路
１４ 分岐部
１５ 第１流路
１７ 第２流路
３３ 分別流路
３４ 分岐部
３５ 第１流路
３７ 第２流路
５６ 第１液溜り
５８ 第２液溜り

Claims (12)

1. 分別液および少なくとも二種類の密度を有する粒子群が供給され、一定方向に分別液が流れる分別流路と、
   上記分別流路の上記分別液が流れる方向の少なくとも末端に接続された分岐部と、
   上記分岐部から上方向に向かって形成された第１流路と、
   上記分岐部から下方向に向かって形成された第２流路と、
   を少なくとも備え、
   上記分岐部は、
   鉛直方向から見た形状がＹ字状であり、
   上記分岐部から分かれる上記第１流路および上記第２流路が、粒子分別装置を構成するチップの最大面と並行にＹ字状に分かれていき、かつ、上記第１流路および上記第２流路が「く」の字状となるように分かれていく構造である平面二層Ｙ字構造を有しており、
   上記分別液が、上記粒子群を分散または懸濁させることができ、かつ、上記チップ内を層流で流れる分別液であることを特徴とする粒子分別装置。
2. 上記分別流路が水平方向に形成されていることを特徴とする請求項１に記載の粒子分別装置。
3. 上記分別液の密度が、上記第１流路に供給される低い密度を有する粒子群における粒子の最大密度より低く、且つ、上記第２流路に供給される高い密度を有する粒子群における粒子の最小密度より高いことを特徴とする請求項１または２に記載の粒子分別装置。
4. 上記分別流路、分岐部、第１流路および第２流路を構成する溝が形成された第一部材、および、上記分別流路、分岐部、第１流路および第２流路を構成する溝が形成された第二部材が、上記溝で分別流路、分岐部、第１流路および第２流路を構成するように重ね合わされていることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の粒子分別装置。
5. 上記分別流路、分岐部および第１流路を構成する溝が形成された第一部材、および、上記分別流路、分岐部および第２流路を構成する溝が形成された第二部材が、上記溝で分別流路、分岐部、第１流路および第２流路を構成するように重ね合わされていることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の粒子分別装置。
6. 上記分別流路、分岐部、第１流路および第２流路を構成する溝が形成された第一部材、および、溝が形成されていない平滑な第二部材が、上記溝で分別流路、分岐部、第１流路および第２流路を構成するように重ね合わされていることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の粒子分別装置。
7. 上記第１流路および上記第２流路のそれぞれに分別された粒子群の最小密度差が、０．００２ｇ／ｍＬ以上であることを特徴とする請求項１から６の何れか１項に記載の粒子分別装置。
8. 上記分別流路、第１流路および第２流路の最小径が、上記粒子群の粒子径の３倍以上、１，０００倍以下の範囲であることを特徴とする請求項１から７の何れか１項に記載の粒子分別装置。
9. 上記粒子群の粒子径が、１〜１，０００μｍの範囲内であることを特徴とする請求項１から８の何れか１項に記載の粒子分別装置。
10. 上記粒子群が体細胞であることを特徴とする請求項１から９の何れか１項に記載の粒子分別装置。
11. 上記粒子群が、密度がより低い低品質の細胞と密度がより高い中品質ないし高品質の細胞との混合物であることを特徴とする請求項１０に記載の粒子分別装置。
12. 請求項１から１１の何れか１項に記載の粒子分別装置を用いた粒子分別方法であって、
    粒子群を、密度が高い粒子群と、密度の低い粒子群に分別することを特徴とする粒子分別方法。

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