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CN111491736A - 惯性细胞聚焦和分选 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及颗粒的微流体分选、分离和/或处理，所述颗粒优选循环肿瘤细胞(CTCs)。在本发明的一个方面，提供了一种用于分选、分离或处理流体悬浮液中颗粒的装置，该装置包括：(a)至少一个入口以引入流体悬浮液；(b)至少一个出口以排出含有所需尺寸颗粒的悬浮液；(c)与所述至少一个入口和所述至少一个出口流体连通并位于所述至少一个入口和所述至少一个出口之间的通道，该主通道的一部分弯曲形成至少一个弯曲单元，该弯曲单元被塑造成具有一个波峰、一条在波谷上方弯曲形成的波缘和一个波面的波浪轮廓，其中，所述弯曲单元的波峰、波缘、波面和波谷分别形成一个半圆弧段，流体悬浮液从波峰的半圆弧段穿过弯曲单元到达波谷的半圆弧段。

Description

惯性细胞聚焦和分选
本发明涉及微流体领域。具体地，本发明涉及微粒的微流体分选、分离和/或处理。更具体地，本发明涉及惯性微流体，其利用被动流体动力，用于无鞘惯性颗粒聚焦和细胞分选。
微观生物颗粒(例如细胞和病原体)的分类在生物学分析和医学诊断中起着重要作用。例如，从人血细胞中分离循环肿瘤细胞(CTCs)并分选出不同的干细胞类型，例如间充质干细胞(MSCs)和造血干细胞(HSCs)，对于临床分析和生物学研究非常重要。高通量是当前细胞分选技术适用于实际生物医学应用的主要限制之一。
实际的生物医学分析通常需要处理来自患者的1-10mL原始生物样品。通常在进行实际上生物医学分析之前需要对样品进行纯化，以提高灵敏度和选择性。因此，非常需要以很高的通量方法(～mL/min)纯化样品，以最大程度地减少总周转时间。当前的细胞分选技术要么需要密集型劳动(离心)，要么需要昂贵的仪器(荧光激活的细胞分选)。
在微尺度上对细胞进行精确的处理和分离是生物学研究的必备技能，并且在生物工程和制药工业中也展示出巨大的商业潜力。在过去的20年中，已经开发了各种微流体细胞分选技术，并且可以将其分为主动式和被动式。常规的主动式通常应用外部的声场1,2,3,4,5、电场6,7,8,9,10和磁场11,12,13，它们具有高精度分离细胞的卓越能力。但是，由于复杂的装置制造和集成，相对较低的通量，特别是当需要处理大量样品体积(几毫升左右)以分离极低丰度的生物颗粒时，主动式细胞分选方法在实际应用中的广泛使用受到了阻碍。被动细胞分选技术主要包括基于尺寸的微滤14,15、确定性侧向位移(DLD)16,17,18和惯性聚焦。早在1961年，Segré和Silberberg19就首次观察到颗粒会在层流状态下沿圆柱管自发地形成环形图案(管状收缩效应)，这是由两个相反的惯性升力之间的平衡引起的。这种向确定性平衡位置的横向迁移称为惯性聚焦现象。这种被动颗粒聚焦现象是当流体在中间雷诺数范围(～1<Re<～100)中时惯性升力的结果。近年来，已经发现，当微流体装置以非常高的流速(～mL/min)运行时，微米级颗粒(通常大于1微米)的惯性聚焦也可以实现。有效惯性聚焦需要的高流速还可以实现实际生物医学应用中需要的高通量样品处理。自2007年20以来，惯性聚焦已成为微流体中最有力的精确细胞处理技术之一，并因其高通量、低能耗、简单的装置结构和友好的制造工艺，以及与现有微流控芯片相结合的功能组件的易用性21,22,23而逐渐在微流体研究领域得到了广泛关注。
惯性聚焦是一种被动微流体处理技术，其中尺寸选择处理很大程度上取决于通道的几何形状。已应用多种通道几何设计实现惯性聚焦，包括直线24,25,26,27、弯曲/蛇形28,29,30,31、不对称曲线32,29,33、螺旋34,35,27,36和收缩/膨胀37,38,39,40，其中每个通道设计表现出不同的惯性聚焦特性21。具有曲线或膨胀收缩特征的微流体通道可产生垂直于主流方向的迪恩(Dean)二次流。迪恩流的产生是由于中心和近壁区域中连续流动的惯性不匹配导致的，惯性不匹配通常是沿通道横截面反向旋转迪恩涡流。因此，迪恩二次流产生的迪恩阻力可用于平衡惯性升力，从而提供了控制颗粒平衡位置的灵活性41。具体来说，迪恩阻力和惯性升力的标度与颗粒尺寸非常不同，这样就可以在连续流中对不同尺寸的颗粒在不同的平衡位置进行分选42。迪恩二次流还有助于减少平衡位置的数量，而这是方便样品收集的。
作为一种多能微流体处理方法，惯性聚焦已应用于多种场景，例如流式细胞术中的无鞘对准43,30、尺寸依赖性细胞分离36,44,45、变形性依赖性细胞分离46、稀有细胞分离34,32,40,47、细菌分离26、血小板分离29、血浆提取48和溶液交换40,49，仅举几例。值得注意的是，循环肿瘤细胞(CTCs)是从原发性肿瘤(或转移后的肿瘤)脱落的恶性肿瘤细胞，经历上皮-间质转化(EMT)，然后侵入循环系统。CTCs被认为是肿瘤转移的先决条件，并且捕获和分析CTCs的能力使癌症的早期诊断和对癌症转移的系统研究成为可能。但是，CTCs在血液中极为罕见(即1毫升全血样品中仅有数十个CTCs50)，因此CTC分选技术需要满足实际研究和临床对高通量、高纯度和高捕获率的需求。由于惯性聚焦具有以高通量方式处理样品的能力，因此开发高通量惯性分选或富集技术的兴趣日益增长。例如，螺旋通道是一项经过广泛研究并应用于惯性细胞聚焦和分选的设计，例如在稀有细胞分离51,52,35(例如CTC)、特定细胞类型分离36,44,27和单个细胞的封装53。Majid Ebrahimi Warkiani等人通过使用螺旋惯性装置结合鞘流，在掺入癌细胞的裂解的血液样品中达到了至少85％的回收率54，并且通过带有鞘流的倾斜螺旋通道在掺入癌细胞的全血中的回收率超过了80％51。Jiashu Sun等人应用双螺旋微通道技术在掺入癌细胞的全血中得到了88.5％的回收率35。
由于迪恩二次流较弱，这种螺旋惯性装置不能有效地聚焦较小的细菌。因此，它们可以用于血细胞富集，而不能用于从血样中分离去除细菌。我们设计了添加生物相容性聚合物的黏弹性流体，可以实现弹性惯性聚焦和对临床样品中的亚微米颗粒进行分选。
在本发明中，设计了一种新颖的通道，其具有用于无鞘惯性颗粒聚焦和细胞分选的一系列反向波浪通道结构。所述的“反向”是指根据本发明一个实施例的弯曲单元中的迪恩二次流的反向。在多个实施例中，单个波浪通道单元由四个半圆形段组成，其沿着通道的横截面产生周期性反向的迪恩二次流。惯性提升力和迪恩阻力之间的平衡导致确定性的平衡聚焦位置，这也取决于流通的颗粒和细胞的大小。六个荧光微球(15μm、10μm、7μm、5μm、3μm和1μm)用于研究尺寸相关的惯性聚焦行为。我们具有急弯亚单元的新颖设计可以有效地聚焦粒径小至3μm(血小板平均尺寸)的颗粒，从而无需使用鞘流就可以从全血中分选癌细胞。通过优化的通道设计，展示了在不使用鞘流的情况下对掺入稀释的全血样品中基于大小的MCF-7乳腺癌细胞分选。一次分选过程能够从原始混合物中回收89.72％的MCF-7细胞，并以优异的细胞活力将MCF-7细胞从原始纯度5.3％富集至68.9％。
此外，使用四个不同大小的荧光亚微米球(1μm、500nm、300nm和100nm)来研究黏弹性流体在各种条件下的聚焦行为。实现了亚微米外泌体纯度高于88％、回收率高于76％的简单、高通量和无标签分选。
在本说明书中对显然是先前出版的文件的列出或讨论不应被认为是该文件是现有技术的一部分或是公知常识。
此处引用的任何文件均通过引用全文并入本文。
本发明提出了一系列新的惯性微流控装置，用于以～mL/min量级的流速进行高通量的细胞分选。具体地，本发明利用了惯性升力和来自迪恩二次流的阻力之间的平衡。流通的细胞的不同平衡位置高度依赖于其大小，因此可以实现基于大小的高通量细胞分选。迪恩二次流由周期性的转向通道结构产生。对于亚微米颗粒聚焦，与传统的直线通道相比，通过引入添加了生物相容性聚合物的黏弹性流体，波浪形通道可以产生更大的弹力，从而促进颗粒在垂直和水平方向上更好地聚焦于通道中心线区域。这些转向结构的不同几何设计导致平衡位置的变化，这意味着应用于特定的细胞分选需要这些周期性转向通道结构的独特设计。该系列新型惯性微流控装置具有巨大的潜力，应用于高通量和高保真度分选体积为1～10mL的复杂生物样品中的稀有细胞群，例如全血样品中的循环肿瘤细胞、外泌体和病原体。
在本发明的一个方面，提供了一种用于分选、分离或处理流体悬浮液中颗粒的装置，该装置包括：(a)至少一个入口以引入流体悬浮液；(b)至少一个出口以排出含有所需尺寸颗粒的流体悬浮液；(c)与至少一个入口和至少一个出口流体连通并位于所述至少一个入口和所述至少一个出口之间的通道，所述主通道的一部分弯曲以形成至少一个弯曲单元，所述弯曲单元被塑造成具有一个波峰、一条在波谷上方弯曲形成的波缘和一个波面的波浪轮廓。其中弯曲单元的波峰、波缘、波面和波谷分别形成一个半圆弧段，流体悬浮液从波峰的半圆弧段穿过弯曲单元到达波谷的半圆弧段。
有利地，具有至少一个具有急弯的弯曲单元的本发明的装置可以有效地聚焦小至3μm的颗粒，并通过改变半径参数容易地实现可调谐的颗粒分离。另外，通过引入黏弹性力，可以实现亚微米颗粒聚焦。所述的“弯曲”是指包括主通道的任何弯曲。例如，通道可被弯曲以形成锯齿形、半圆形、O形、弹簧/螺旋形等。
在多个实施例中，本发明的弯曲单元类似于不间断的波，使得弯曲单元的曲率可以被设计为与现有技术的螺旋形通道相比，具有小得多的曲率半径。这种螺旋形通道具有逐渐增加的曲率半径。因此，由弯曲单元创建的这些周期性转向通道结构可产生比螺旋通道强得多的迪恩二次流，从而实现～1μm颗粒的聚焦(1μm颗粒的聚焦对于螺旋通道而言具有挑战性)。有效处理～1μm颗粒的能力对于细菌分选至关重要，因为它们中的大多数小于4μm。直线通道无法实现具有如此小粒径的细菌的纯惯性力(即不引入迪恩阻力)的聚焦。根据本发明的教导，通过改变半径参数，本弯曲单元可以有效地聚焦小至3μm的颗粒，并容易地实现可调谐的颗粒分离。
在多个实施例中，波谷的半圆弧段的直径等于或大于波峰的半圆弧段的直径。
在多个实施例中，主通道包括多个弯曲单元。
在多个实施例中，多个弯曲单元沿线性方向布置。尽管单个通道可以以0.1-1ml/min的速率处理样品，但是在实际应用中，对于高通量细胞分选仍需要通道并行化。通道并行化，即具有多个并行运行的通道，很难在螺旋微流体装置中实现。在本发明中，这样的多个弯曲单元可以在线性方向上排列或布置，与螺旋通道相比，这更易于实现通道平行化。
在多个实施例中，多个弯曲单元包括10至40个弯曲单元。
在多个实施例中，该装置包括一个以上的出口。例如，该装置可包括三个出口，即第一出口、第二出口和第三出口，其中每个出口排出流体悬浮液样品中不同尺寸或类型的颗粒。
在多个实施例中，第一出口、第二出口和第三出口的宽度是不同的。第一出口、第二出口和第三出口的宽度可以分别为30-80μm、40-55μm和30-80μm。可以根据被处理的目标/颗粒来调节宽度。
在多个实施例中，主通道具有矩形的横截面轮廓。在一个示例中，主通道的宽度为20-125μm，高度为5-40μm。
在多个实施例中，每个入口和至少一个出口进一步组成分别用于流体悬浮液和悬浮液中的分选颗粒的储存器。在一个示例中，储存器的直径是1.5mm。
在多个实施例中，波峰的半圆弧段的直径在600至800μm之间，波面的半圆弧段的直径在200至350μm之间，波缘的半圆弧段的直径在200至350μm之间，波谷的半圆弧段的直径在600μm至1200μm之间。
应当指出，惯性分选是一种被动技术，聚焦、分选或处理效率在很大程度上取决于通道的几何形状、特定尺寸和工作流条件。对于不同的细胞分选应用，通道的几何形状和尺寸需要非常仔细的设计，这绝对是具有可专利性的。因此，如将在下文详细描述的，本发明的弯曲单元的几何形状和设计构造的选择不是任意的。
在本发明的另一方面，提供了一种用于分选、分离或处理流体悬浮液中的颗粒的方法，该方法包括：(a)提供至少一个入口以引入流体悬浮液的；(b)提供至少一个出口以排出含有所需尺寸的颗粒的流体悬浮液；(c)与至少一个入口和至少一个出口流体连通并位于所述至少一个入口和所述至少一个出口之间的主通道，该主通道的一部分弯曲以形成至少一个弯曲单元，弯曲单元被塑造成具有一个波峰、一条在波谷上方弯曲形成的波缘和一个波面的波浪轮廓。其中弯曲单元的波峰、波缘、波面和波谷分别形成一个半圆弧段，流体悬浮液从波峰的半圆弧段穿过弯曲单元到达波谷的半圆弧段，和(d)通过弯曲单元将流体悬浮液从波峰的半圆弧段泵送至波谷的半圆弧段。
在多个实施例中，该方法还包括通过弯曲单元泵送流体悬浮液，其中，波谷的半圆弧段的直径等于或大于波峰的半圆弧段的直径。
在多个实施例中，该方法还包括通过沿线性方向布置的多个弯曲单元泵送流体悬浮液，所述多个弯曲单元包括10至40个弯曲单元。
在多个实施方式中，该方法还包括以40μl/min至200μl/min的流速泵送流体悬浮液。
在多个实施例中，该方法包括通过波形弯曲单元泵送流体悬浮液，其中，波峰的半圆弧段的直径在600至800μm之间，波面的半圆弧段的直径在200至350μm之间，波缘的半圆弧段的直径在200至350μm之间，波谷的半圆弧段的直径在600μm至1200μm之间。
在多个实施例中，该方法还包括在第一出口、第二出口和第三出口的三个出口中排出流体悬浮液。
在多个实施例中，该方法还包括在第一出口处排出包含尺寸为约3μm至10μm的颗粒的流体悬浮液，在第二出口处排出包含尺寸为约15μm的颗粒的流体悬浮液，并且在第三出口处含有粒径约为3μm的颗粒的流体悬浮液。
在多个实施例中，流体悬浮液是全血样品，并且该方法从样品中分离癌细胞，从流体悬浮液样品中分离不同类型的血细胞或分离亚微米囊泡和外泌体。
在多个实施例中，该方法将具有约300nm的大小(大于或等于)的颗粒与具有约100nm的大小的颗粒分离。
有利地，本发明具有很高的潜力，可用于生物学研究和临床诊断中稀有细胞群体的高通量和高保真度分选。
为了可以完全理解本发明并容易地将其付诸实践，现在将参照附图，对本发明的优选实施方案通过非限制性实施例的方式描述。
附图说明
图1.惯性聚焦的三种不同通道设计，带有一系列反向波形通道单元。(a)代表性的惯性分选微流体装置的照片。将蓝色染料注入微通道有助于可视化通道设计。比例尺为1cm。(b)在单次混合输入中，三种不同尺寸的微粒(3μm：蓝色，10μm：红色和15μm：绿色)的惯性聚焦行为示意图。(c)每个样式的详细几何参数。样式1-3具有相同的上半圆(上外半圆和上内半圆)和下内半圆的几何参数，下外半圆的增量为200μm。所有通道设计的宽度为125μm，高度为40μm。
图2.三个通道设计中不同横截面的迪恩二次流的数值模拟。(a)选择四个横截面A-D以可视化沿着单个波形通道单元的迪恩流。R1、R2、R3和R4分别是上外半圆、下内半圆、上内半圆和下外半圆的曲率半径。(b)沿通道横截面的典型迪恩二次流(两个对称的反向旋转涡流)。(c)在三个通道设计中沿四个横截面A-D的模拟速度轮廓。所有左侧均指通道的外壁。色阶表示迪恩流速的大小。(d)在三个通道模式中横截面D处的速度轮廓放大比例。
图3.在三种通道设计中惯性聚焦的六个不同尺寸的颗粒(15μm、10μm、7μm、5μm、3μm和1μm)的荧光显微图像(a：样式1；b：样式2；c：样式3)。第一列和第二列分别显示了上游和中游的颗粒轨迹。第三至第六列显示了Rec＝10(流速：49.41μl/min)、20(流速：98.83μl/min)、30(流速：148.25μl/min)和40(流速：197.60μl/min)时的下游颗粒轨迹。(d)比较三个通道设计中下游六个颗粒的聚焦位置。横坐标和纵坐标分别表示通道雷诺数Rec和通道宽度。
图4.使用样式3分选装置分离三种不同尺寸的颗粒。(a)在单次混合输入中分离三种不同尺寸的微粒(3μm，10μm和15μm)的示意性实验装置。(b)在三岔出口处的三个颗粒的荧光条纹。在输出1和2中分别收集了10μm(红色荧光)和15μm颗粒(绿色荧光)。在输出1和3中收集了3μm颗粒(蓝色荧光)。流速为197.60μl/min(Rec＝40)。比例尺为125μm。
图5.在样式3分选装置中从全血中分离癌细胞。(a)混合物中单个细胞的显微图像。两个黄色箭头表示两个单独的MCF-7细胞，与周围的血细胞相比要大得多。比例尺为100μm。(b)示意图显示从稀释的(100×)全血中分离癌细胞，其中显示了癌细胞、白细胞和红细胞的预期聚焦位置。(c)在三岔出口处聚焦的癌细胞的荧光图像。癌细胞沿绿线聚焦(从输出2引出)，红细胞沿暗红线聚焦(从输出1引出)。比例尺为125μm。(d)在明场模式下，高速照相机捕获的从其他血细胞中分离单个MCF-7细胞的过程(视场为c中的虚线框)。箭头指示MCF-7在相应时刻的位置。比例尺为125μm。
图6.预混合和分选样品的显微图像和流式细胞术结果。(a-d)通过惯性分选装置(样式3)从输入到输出的混合有癌细胞的稀释全血的荧光图像。MCF-7由绿色荧光指示。比例尺为100μm。(e)培养从输出2收集的MCF-7细胞并其能够增殖。(f)通过惯性分选装置获得的三个输出处的MCF-7细胞的回收率，该值通过流式细胞仪分析获得。(g)通过惯性分选装置的三个输出和入口获得的MCF-7细胞的纯度。
图7.异质细胞样品中单个靶细胞具有波形微通道结构的惯性分选技术示意图：(I)分离微米级循环肿瘤细胞(CTCs)；(II)亚微米外泌体的分离。
图8.荧光显微图像显示了黏弹性流体中沿着具有多个PEO浓度的波形通道的四个不同尺寸的亚微米球体(1μm、500nm、300nm和100nm)的弹性惯性聚焦。图像显示了微通道下游三岔输出部分附近的一个单元。所有实验均在相同条件下以雷诺数Rec＝30(流速：44.90μl/min)进行。列(I)至(V)代表0.08wt％至0.16wt％的相对PEO浓度。
图9.使用黏弹性流体的波形通道对两个不同尺寸的100nm(蓝色)和300nm(粉红色)颗粒进行分离的NTA结果。(a)分选之前100nm和300nm颗粒的混合物样品的归一化分布。(b)从旁路输出收集的样品的归一化分布。(c)从中路输出收集的样品的归一化分布。(d)从NTA结果计算出的从中路和旁路输出中收集的样品的回收率。
图10.使用含黏弹性流体的波形通道在MCF-7培养基中分离外泌体和较大EV的NTA结果。(a)分选之前外泌体和较大EV的混合物的归一化分布。(b)从旁路输出收集的样品的归一化分布。(c)从中路输出收集的样本的归一化分布。(a)-(c)的浓度为5×108颗粒/ml。(d)从中路和旁路输出中收集的样品，根据NTA结果计算的外泌体和较大EV的回收率。
在本发明中，设计了用于无鞘惯性颗粒聚焦和细胞分选的新颖的几何通道，即不对称的反向波形微通道。尽管已经研究了多种横截面形状，例如梯形44、圆形、半圆形和三角形55，但由于其简单的制造工艺，所以选择了经典的矩形横截面设计。在三个通道模式设计中，已经对六个荧光微米级颗粒(15μm、10μm、7μm、5μm、3μm和1μm)的惯性聚焦行为进行了实验检查。已经发现，有效惯性聚焦的最小粒径在1-3μm之间。在这些实验研究的基础上，确定了满足全血样分离癌细胞要求的优化通道设计。为了证明这种新颖装置设计的应用潜力，使用模仿临床CTC样品的掺入乳腺癌细胞的稀释全血样品来测试我们的惯性微流体装置的分选性能。一个单一的分选过程能够回收≥89％的癌细胞并将癌细胞的纯度提高13倍。与先前的惯性分选装置相比，具有急转弯子单元的本新颖设计可以有效地聚焦小至3μm的细胞，从而可以有效地从癌细胞中分离出三种主要的血细胞类型(即红细胞、白细胞和血小板)，而无需使用鞘流。此外，重复的波形单元在线性方向上排列，这使得处理大量样品多个通道的水平(2D)和垂直(3D)并行化更加容易。此外，使用四个不同大小的荧光亚微米球(1μm、500nm、300nm和100nm)来研究在各种条件下在黏弹性流体中的聚焦行为。对外泌体的简单、高通量和无标记的分选纯度高于88％，回收率高于76％。这种改进的弹性惯性外泌体分选技术可能为各种与外泌体相关的生物学研究、临床和制药应用提供潜在的平台。
图1示出了惯性装置5的实施例，该惯性装置5用于分选、分离或处理流体悬浮液中的颗粒。参照图1，装置5包括用于接收或引入流体悬浮液的入口10、通道15和出口20。这样，流体悬浮液从入口10经过通道15行进并通过出口20流出装置5。
所述的“流体悬浮液”是指包含需要分选、分离或处理的颗粒悬浮液的任何流体。颗粒可以是生物物质或其他。在多个实施例中，如将在下面详细描述的，流体悬浮液可以是包括血液成分的血液样本。
该图示出了入口10和出口20设置于相对的端部，通道15与入口10和出口20连通并设置于入口10和出口20之间。出口20用于排出已分选/分离/处理的颗粒。在多个实施例中，出口20可包括一个以上。例如，图5b示出了三个出口20a、b和c。每个出口用于分选特定尺寸的颗粒。装置5实现分选的方式是使通道15的一部分弯曲以形成至少一个弯曲单元25。图1b示出了根据本发明实施例的弯曲单元25的分解图。
弯曲单元25被塑造成具有一个波峰30、一条在波谷40上方弯曲形成的波缘35和一个波面面45的波浪轮廓，其中弯曲单元25的波峰30、波缘40、波面35和波谷45分别形成一个半圆弧段。图1b和2a中的箭头示出了流体悬浮液通过弯曲单元25的行进方向，即从波峰30的半圆弧段到波谷40的半圆弧段。
所述的“半圆弧段”是指包括任何曲线的半圆弧段。在多个实施例中，还意味着包括可以形成圆的一部分的任何曲线。这样的片段包括通过圆的割线或弦线从圆的其余部分“切除”的任何区域。在本发明内容中，设置在入口10和(多个)出口20之间的任何曲线表示弯曲通道15。在本发明的非限制性具体实施例中，半圆弧段可以是通过沿径线切割整个圆而形成的半圆。
可以更详细地描述弯曲单元25。从图中可以看出，弯曲单元25的波形可以具有分别由波峰30(上外半圆)和波面45(上内半圆)表示的上半圆，以及由波缘35(下内半圆)和波谷40(下外半圆)表示的下半圆。上下半圆围绕假设的水平轴彼此相对。
概念与工作原理
当固体颗粒以中间雷诺数范围内(～100>Re>～1)沿有界直线通道流动时，除了沿主流方向施加在颗粒上的粘性阻力外，还有四种垂直于主流方向作用在颗粒上的惯性升力22：i)由于颗粒滑转引起的马格努斯力；ii)由于颗粒滑切而产生的萨夫曼力；iii)由于流体速度曲线的曲率(从颗粒指向壁)的剪切梯度引起的升力，以及iv)由于颗粒与壁之间的相互作用(将颗粒推离壁)由壁引起的升力。在这些力中，马格努斯力和萨夫曼力通常比其他两个升力小得多，在微流体分选应用中通常可以忽略不计。后两个惯性升力的平衡导致Segré和Silberberg19观察到沿圆柱管的管状挤压效应。根据Asmolov模型56,42，由两个主要升力组成的净惯性升力可以表示如下，
近中心：
Figure BDA0002539758980000111
近壁：
Figure BDA0002539758980000112
上式中，FL表示升力系数，当雷诺数Re＜100，ρf、U和a分别表示流体密度、流体速度和粒径时，升力系数通常取0.520。H在此定义为液压直径，在矩形通道中计算为2wh/(w+h)，其中w表示通道宽度，h表示横截面的通道高度。
稳态不可压缩的Navier-Stokes方程(等式3)和连续性方程(等式4)用于描述微通道内部的流体流动。等式3左手侧的项是在急弯时产生迪恩二次流的流体的惯性。
Figure BDA0002539758980000113
Figure BDA0002539758980000114
为了量化作用在流体上的惯性力和粘性力之间的关系，通道雷诺数Rec定义如下：
Figure BDA0002539758980000115
其中Um是最大流速，μ是流动粘度。
Figure BDA0002539758980000116
是流体速度矢量，p是流体压力。
二次侧向流动的引入，例如在中间雷诺数范围中的曲率引起的迪恩流，使得颗粒的平衡位置具有更大的可控性。由于横向离心力在中心和近壁区域中的连续流动以及质量守恒上的不匹配，沿弯曲通道的横截面会产生两个反向旋转的迪恩涡旋。无因次迪恩数De用于表征迪恩流强度41,57，
Figure BDA0002539758980000117
其中R是曲率半径。迪恩流量的大小在
Figure BDA0002539758980000118
为
Figure BDA0002539758980000119
迪恩流阻碍垂直于主流方向的颗粒，迪恩阻力可定义为
Figure BDA00025397589800001110
迪恩阻力具有线性尺寸比例，这与净惯性升力的尺寸比例不同。因此，迪恩阻力和净惯性提升力的共同作用导致不同尺寸颗粒的平衡位置不同，从而可以在连续流中进行基于尺寸的惯性分选。
在先前对某些通道几何形状的研究中发现了两个经验参数，以指导惯性分选装置的设计。首先，通常建议，a/H＞0.07，以成功实现惯性聚焦20。另一个经验参数Rf是惯性升力与迪恩阻力的比值，定义如下：
Figure BDA0002539758980000121
当Rf>～0.08时，表明惯性升力超过迪恩阻力。相反，当Rf<～0.08时，颗粒运动由迪恩流而不是惯性升力控制。Rf值过小会产生混乱的颗粒运动，而不是确定性的颗粒聚焦。
对于非牛顿力黏弹性流体，在颗粒上产生的附加弹力也会影响颗粒的平衡聚焦位置。Weissenberg数Wi被用来测量流体的黏弹性效应58,59,60
Figure BDA0002539758980000122
这里的λ是指流体的弛豫时间，
Figure BDA0002539758980000123
表示通道横截面上的流体剪切速率。在黏弹性流体中流动的颗粒受到第一和第二法向应力61,62，N1＝τ11-τ22表示沿主流方向施加张力63，N2＝τ22-τ33沿通道的横截面施加二次流动64，其中τ11、τ22和τ33分别代表流动、速度梯度和旋转方向。因为在大多数黏弹性溶液中N1的量值远大于N2 65,66，N2可以忽略不计，施加在指向较小剪切速率区域的颗粒上的弹力可以表示为67,68,69，
Figure BDA0002539758980000124
其中CE是无因次的弹性升力系数。
图1显示了三种不同的通道样式，以理解下外半圆的半径如何影响这些通道几何形状中的惯性颗粒聚焦。样式1-3具有相同的上半圆设计和不同的下外半圆设置，其中样式1相对于单元样式的中心是几何对称的，而样式2和3则表现出一定程度的几何不对称性。这三个通道的所有设计均使用一个进样口设计，主通道的宽度为125μm，高度为40μm，采用低纵横比设计(AR＝h/w＝0.32)。三个出口分支的宽度分别为80μm、45μm和80μm。入口和出口储存器的直径为1.5mm。图1a显示了具有代表性的反向波状通道结构的微通道，其中，当根据颗粒大小离开通道时，入口处随机分布的颗粒可以确定性地聚焦成不同的紧密条纹上(图1b)。这些样式设计的详细几何参数如图1c所示。
材料和方法
装置制造
使用标准的聚二甲基硅氧烷(PDMS)软光刻工艺制造三个不同的微通道，其中用于PDMS浇铸的母模是使用SU-8(SU-8 2025，MicroChem，Newton，MA，USA)在硅片上制造的。用空气等离子体(Harrick Plasma PDC-32G，Ithaca，NY，USA)处理PDMS微通道层和超声清洗的载玻片，以在表面上产生羟基官能团。然后联结处理过的表面以形成封闭的微通道。
数字建模
在稳态研究中，使用COMSOL Multiphysics 5.0层流模块进行了基于有限元方法(FEM)的数值模拟(www.comsol.com)。该模型由三个反向波浪通道单元组成，其几何尺寸和入口流速与实验相同。不可压缩的Navier-Stokes方程(等式3)和连续性方程(等式4)是模拟微通道内部流体运动的控制方程式，可以帮助理解迪恩二次流如何影响惯性颗粒聚焦。除入口和出口以外的边界都设置防滑条件。计算得到入口的流速为197.60μl/min(对应于通道雷诺数Rec＝40)，并得到最大迪恩流速。
细胞培养
MCF-7乳腺癌细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，产品目录号HB-72)，并在Dulbecco's Eagle of Medium培养基(DMEM)(Thermo Fisher Scientific，美国)中培养，补充10％胎牛血清(FBS，Thermo Fisher Scientific，美国)以提供生长因子，补充抗生素，包括青霉素和链霉素(Thermo Fisher Scientific，美国)，以防止细菌生长。每2至3天当单层细胞达到80-90％的融合度后，在保持37℃，5％(v/v)CO2的湿度培养箱中传代培养细胞。然后用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Thermo Fisher Scientific，美国)对细胞进行胰蛋白酶处理。
样品制备
购买未经任何进一步修饰的荧光聚苯乙烯微球(15μm、10μm、7μm、5μm、3μm和1μm)，(Magsphere，美国)。将所有这些荧光聚苯乙烯颗粒用含有0.6％Pluronic F127(Sigma-Aldrich，美国)的去离子(DI)水稀释，以避免颗粒聚团并粘附在通道壁上。以下实验中使用的典型颗粒浓度约为6×106颗粒/ml。悬浮在去离子水(含0.6％F127)中的15μm、10μm和3μm颗粒的混合物用于显示连续流中基于尺寸的颗粒分选。癌细胞(MCF-7)用SYTO 9荧光染料(Thermo Fisher Scientific，美国)染色，并与稀释的全血混合(终浓度约为5×107细胞/ml)。使用这种细胞混合物来展示利用波浪惯性聚焦装置从血细胞中基于大小分选MCF-7癌细胞。
购买未经任何进一步修饰的荧光聚苯乙烯微球(1μm、500nm、300nm和100nm)(Magsphere，美国)。为了避免颗粒聚团并粘附在微通道壁上，将所有这些荧光聚苯乙烯颗粒用含有0.6％Pluronic F127(Sigma-Aldrich，美国)的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS，Thermo Fisher Scientific，美国)稀释。实验中使用的典型颗粒浓度约为6×107颗粒/ml。通过将PEO(Mw＝600KDa，Sigma-Aldrich，USA)粉末溶解到DPBS(Thermo FisherScientific，USA)中制备浓度为0.08wt％、0.10wt％、0.12wt％、0.14wt％和0.14wt％的PEO(聚环氧乙烷)溶液。将PEO粉加入DPBS后，需要将溶液轻轻搅拌过夜，以保持溶液均质。在水溶液中添加PEO会使流体成为非牛顿流体。通过这样做，可以使用附加力来处理流体中的亚微米颗粒。
在细胞生长约48h-72h后(细胞融合度达到约85％)，从MCF-7细胞培养基中收集细胞外囊泡。然后，将含有细胞外囊泡的细胞培养上清液进行差速离心。首先，以500×g的速度离心5分钟，以去除庞大的凋亡细胞和死细胞碎片。随后，通过在2000×g和12000×g离心10分钟，去除剩余的完整细胞和部分较大的EV。所有离心步骤需注意均在4℃进行，以防止蛋白质内容物变性。最后，通过膜过滤(孔径：0.8μm，Millipore，美国)对培养基进行处理，以除去不需要的碎片。实验中使用的典型囊泡浓度约为5×108颗粒/ml。
实验装置
每个实验均使用新的微通道装置进行，以避免交叉污染以及所用装置中残留的颗粒或气泡可能造成的堵塞。对于每个实验，使用注射泵以49.41μl/min至197.60μl/min的流速(对应的Rec为10至40)将制备的水性样品连续注入微通道。使用CCD照相机在倒置显微镜(Olympus，CKX53，日本)上记录这些荧光微粒的轨迹，以捕获惯性聚焦行为。使用高速照相机(FASTCAM Mini UX100，PHOTRON，日本)捕获三岔出口中单个细胞的运动，以可视化细胞分离过程。通过市售流式细胞仪(Accuri C6，Becton Dickinson，CA，美国)分析惯性分选前后样品中的细胞含量，以评估分选性能。对于外泌体分离实验，分选前后样品中的培养液所含之物通过商业NTA纳米颗粒跟踪分析系统(ZetaView，Particle Metrix，德国)进行分析，以得到粒度分布，然后评估分选性能。所有样品均用DPBS稀释，浓度约为5×106，用于NTA测量，以获得准确的结果，所有测量均在22℃下进行。所有数据均通过ZetaView(www.particle-metrix.de)收集的，然后使用ZetaView Analyze进行分析。
结果与讨论
在三种通道设计中模拟流体流动
首先模拟了三种不同通道设计中的流体流动，因为特别有趣的是研究沿两个横截面A-D的速度分布，如图2a所示。所有模拟均以197.60μl/min(Rec＝40)的流速进行。图2b示出了沿通道横截面之一的代表性流动轮廓，其中，左侧和右侧分别是通道的外壁(曲率半径较大)和内壁(曲率半径较小)。当流体流过转向通道时，流体的惯性在中间通道雷诺数范围(～100>Rec>～1)下变得不寻常。在通道的中间区域，沿着主流方向移动更快的流体倾向于沿着横截面方向朝着外壁移动。为了节省封闭通道中的流体质量，靠近顶壁和底壁的移动较慢的流体趋于向内壁移动，从而产生两个垂直于主流方向的对称的反向旋转涡流，称为迪恩二次流。
表1样式1、2和3中A-D截面处的迪恩流最大速度
Figure BDA0002539758980000151
图2c中的第一列显示了沿通道样式1中四个横截面的迪恩二次流，该样式设计为相对于单个波浪通道单元的中心几何对称。当流体流过横截面A时，它开始沿横截面产生相对较弱的迪恩二次流。图2c中的外壁始终位于通道横截面的左侧。流体从横截面A到B从上外半圆流到下内半圆，在此期间曲率半径逐渐减小。由于迪恩流的大小与R成反比，与横截面A相比，迪恩二次流在横截面B上变得更加明显。值得一提的是，从横截面A到B，外壁沿通道的同一侧延伸。从横截面B到C，流体从下内半圆流到上内半圆，并经历了最陡的流动转向。尽管两个横截面具有相同的曲率半径，但与横截面B相比，迪恩二次流在横截面C处变得更强。可以直观地理解，考虑到从A到B和从B到C的曲率半径不同，导致B和C处的流动发展有很大差异。表1中列出了四个横截面的最大迪恩流速，以进行定量比较，表中显示B和C的迪恩流强度的相对差异约为27％。尤其是由于采用这种反向波形通道设计，从A到B的外壁沿通道同侧反向于从B到C的内壁。这意味着沿横截面的迪恩二次流的方向从横截面B反向到C。从横截面C到D，曲率半径逐渐增大，并且内壁保持在沿同一通道侧。结果，当从上内半圆流到下外半圆时，迪恩二次流变弱。总之，沿着单个波形通道单元，迪恩二次流的强度从弱变到强，其中内半圆中的迪恩涡流最强，然后在离开单个波形通道单元时又变弱。另外，迪恩二次流的方向通过一个单一的波形通道单元反转一次。尽管通道样式1相对于单元中心几何对称，但是周期性反转的迪恩二次流的强度显示出一定程度的不对称性，尤其是沿着两个内半圆时。
与通道样式1不同，样式2和3通过将下外半圆的曲率半径分别增加100μm和200μm引入了一定程度的几何不对称性。通常，在四个横截面A、B、C和D上的迪恩流显示出相似的速度轮廓。表1定量比较了三种通道样式设计中不同横截面的最大迪恩流速。三种设计在截面A、B和C处的最大速度的相对差异小于～5％。如前所述，在样式1中，横截面B和C之间的最大迪恩流速的相对差异为～27％。已经发现，在样式2和3中，该相对差异均保持为～27％，表明从B到C一致的流动不对称性。由于引入的几何不对称主要改变了下外半圆的曲率半径，因此发现，样式1和2、样式1和样式3在横截面D处的最大速度的相对差异分别为～23％和～38％。为了清楚地显示出横截面D处的迪恩流的差，在如图2d所示的黑色虚线框中放大流速的比例。显然，截面D的迪恩涡流的强度从样式1减小到样式3。由于截面D的迪恩涡流的强度比截面C的弱约七到十倍，因此下外半圆的曲率半径的变化可以看作是单个波形通道单元中迪恩二次流的微调。
三种通道设计中尺寸依赖的惯性聚焦
研究了三种不同通道设计中不同尺寸的微球(15μm、10μm、7μm、5μm、3μm和1μm)的惯性聚焦行为。这些微球是荧光的，即使在非常高的流速下也可以清晰地观察颗粒轨迹。图3a-3c显示了在三个通道设计中，不同尺寸的颗粒在不同流速下的荧光条纹图像。选择四种不同的流速49.41μl/min、98.83μl/min、148.25μl/min和197.60μl/min来研究惯性聚焦行为，其对应的通道雷诺数分别为Rec＝10、20、30和40。
仔细观察通道样式1(图3a)中的惯性聚焦行为，在通道的上游(如图3a的第一列所示的第一个波形通道单元)中，六个不同尺寸的荧光颗粒表现出非常相似的行为，完全占据了整个的通道横截面，而没有明显的惯性聚焦效应。在惯性聚焦尚未达到稳态的中游(图3a的第二列)(Rec＝40)中，15μm和10μm的颗粒表现出沿通道中心线聚焦的趋势。7μm、5μm和3μm的颗粒倾向于在通道的两个侧壁附近形成两个条纹。最小的1μm没有惯性聚焦的趋势。在下游(最后一个波形通道单元，如图3a的第三至第六列所示)，也是用于收集不同尺寸颗粒的三岔出口，这些颗粒在不同的Rec处达到了稳态惯性聚焦。甚至在Rec＝10时，也将15μm的微球聚焦成沿通道的中心线区域形成单个条纹。由于中心区域附近的惯性升力与U2和a4成比例，因此15μm微球比其他粒径更容易实现惯性聚焦(a/H＝0.354>0.07)。评估惯性升力和迪恩阻力的另一个重要参数是Rf＝0.354。在下文中，使用沿着内半圆的外壁的曲率半径(R＝175μm)计算出不同颗粒的所有Rf值。Rf＝0.354>0.08意味着惯性升力超过迪恩阻力，因此，15μm颗粒的平衡聚焦位置几乎保持在中心线，类似于在AR＝h/w＝0.32的情况下沿直线通道的惯性聚焦。在Rec＝10和20时，15μm的微球最终按预期流入中间出口。但是，在Rec＝30和40时，聚焦的15μm微球流入上部出口，表明其平衡聚焦位置略微移向上部出口。据推测，随着流速的增加，对于15μm的微球，迪恩阻力的增加速度快于惯性力。尽管与惯性升力相比，迪恩阻力要弱一些，但它将使平衡聚焦位置稍微偏离中心线。
10μm微球(a/H＝0.165>0.07，Rf＝0.157>0.08)也聚焦为单个条纹，其中惯性升力主导聚焦行为。此外，相对较弱的迪恩阻力也使其平衡聚焦位置向上移动，因此10μm微球流入上部出口。然而，7μm微球的惯性聚焦行为随流速而变化。a/H＝0.115>0.07意味着它可以有效地聚焦。Rf＝0.077非常接近经验值0.08，表明惯性升力变得与7μm微球的迪恩阻力相当。在Rec＝10和20时，将7μm的微球聚焦到侧壁附近的两个条纹中，其中迪恩阻力略高于惯性升力。由于迪恩二次流沿着重复的波形通道单元周期性地反转，因此迪恩阻力倾向于将颗粒拖向两个侧壁。迪恩阻力和惯性升力之间的平衡，特别是壁引起的升力，在侧壁附近产生了平衡位置。然而，在Rec＝30和40的情况下，将7μm微球聚焦成偏离中心线的单个条纹，这表明惯性升力略高于迪恩阻力。根据推测，7μm为或非常接近惯性升力和迪恩阻力变得同等重要的阈值大小。由于这两个力随流速的变化而略有不同，因此7μm微球的聚焦行为可以很容易地在单个条纹聚焦(偏离中心线)和两个条纹聚焦(靠近侧壁)之间切换。5μm微球的两个重要参数是a/H＝0.083＞0.07和Rf＝0.039<0.08。因此，5μm的微球受到迪恩阻力的支配，因此在两个侧壁附近形成两个条纹。对于3μm的微球，尽管a/H＝0.049<0.07(Rf＝0.014<0.08)，它们仍然有效地聚焦在侧壁附近的两个条纹中。请注意，有效惯性聚焦的经验参数a/H＝0.07是从不同的通道设计获得的，对于不同的通道设计，此阈值可能会略微偏离0.07。对于1μm的微球，两个重要参数是a/H＝0.016<0.07和Rf＝0.002<0.08，因此它们无法实现明显清晰的惯性聚焦。
图3b和3c分别显示了通道样式2和3中六个大小不同的颗粒的惯性聚焦行为。通常，三种通道设计中的惯性颗粒聚焦遵循非常相似的趋势，但是下外半圆中引入的几何不对称仍然在三种设计之间产生了细微的差异。图3d更清晰地比较了三个通道中不同颗粒的聚焦位置和聚焦条纹宽度。对于15μm的微球，当Rec从10增加到40时，样式1的聚焦条纹从64-80.5μm变为73.37-89.87μm，样式2从63-79.5μm变为69.25-85.75μm，样式3从63-78μm变为64.5-79.5μm。由于样式3在下外半圆处具有最大的曲率半径，因此产生的迪恩二次流略微减弱，也在表1中示出。因此，与其他两个样式相比，优选在样式3的中心线附近聚焦15μm的微球。对于10μm的颗粒，它们在Rec＝10时未完全聚焦。当Rec从10增加到40时，样式1中的聚焦条纹从73.3-99.5μm变为83.5-96.8μm，样式2从63.5-86.5μm变为83.2-96.5μm，样式3从81.5-97.8μm变为87.5-97.5μm。因此，样式3是将15μm颗粒与10μm颗粒分离的最佳设计，两个颗粒的聚焦条纹之间的边到边距离最大(至少8μm)。图3c还表明，样式3是唯一的设计，其中15μm和10μm的颗粒在所有四个Rec值处分别流入中间出口和上部出口。对于7μm的颗粒，如前所述，它们从样式1中的双条纹聚焦(Rec＝10和20)切换到单条纹聚焦(Rec＝30和40)。当样式2和3中的迪恩二次流减弱时，7μm颗粒不能很有效地聚焦在Rec＝10和20处。但是它们在样式2和样式3中Rec＝30和40时聚焦形成了一个单一的条纹。三个样式中Rec＝30和40时7μm颗粒的聚焦条纹几乎相同，沿横截面占据99.8-107.8μm。其余三个颗粒(5μm、3μm和1μm)在三个通道样式中的表现非常相似。当Rec>＝20时，5μm颗粒形成两个聚焦条纹，分别占据横截面的101.8-108.8μm(上部条纹)和21.2-29.3μm(下部条纹)。类似地，当Rec>＝20时，3μm颗粒形成两个聚焦条纹，分别占据横截面的94.8-108.8μm(上部条纹)和22-30.8μm(下部条纹)。1μm颗粒在三个样式中均不能被有效聚焦。
基于尺寸的惯性颗粒分选
已知三种不同样式中尺寸不同的单个颗粒的惯性聚焦行为后，选择通道样式3来演示多种粒径的颗粒混合物的分类。为了实现高通量，以下所有分选实验均选择了197.60μl/min的流速(Rec＝40)。图4a显示了对具有15μm(绿色)、10μm(红色)和3μm(蓝色)荧光微粒的颗粒混合物进行分选的示意性实验设置。将输入的颗粒混合物分选为三个分别由输出1、2和3收集的亚群。图4b显示了在流过一系列波形通道单元之后，三种颗粒在三岔出口处的差分聚焦。这些荧光条纹明确表明，15μm(绿色)的颗粒主要沿主通道的中心线聚焦，并收集在输出2中。10μm(红色)的颗粒聚焦为靠近主通道上边缘的紧密条纹，并因此收集在输出1中。在先前对单个颗粒进行惯性聚焦的研究中，15μm和10μm颗粒的聚焦条纹之间的边到边距离约为8-10μm。在该颗粒分选实验中，15μm和10μm颗粒的聚焦条纹之间的距离扩大至30μm左右，这极大地促进了颗粒的分选。15μm和10μm颗粒之间较大的分离距离可能归因于较高浓度下的颗粒-颗粒间相互作用力。当较大的15μm颗粒迅速占据通道的中间区域时，这些较大的颗粒趋向于排斥较小的颗粒使之远离。最小的3μm(蓝色)颗粒聚焦为靠近主通道上下边缘的两个紧密条纹，并相应地收集在输出1和3中。
基于尺寸的惯性细胞分选
样式3的惯性分选装置用于分离在稀释的全血样本中掺入的乳腺癌细胞，旨在证明其在稀有细胞分选中的潜在临床应用。使用无细胞PBS缓冲液将全血样品稀释100倍，使终浓度为每毫升5,000万个细胞。通过流式细胞分析检测荧光信号，混合细胞样品中含有约5％荧光染色的乳腺癌细胞(MCF-7，直径约19～24μm)。细胞混合物中其余的细胞群主要是红细胞(RBC，直径约6～8μm)、血小板(直径约3μm)和白细胞(WBC，直径约10～15μm)。图5a显示了混合细胞样品的显微图像，其中单个MCF-7细胞比其他血细胞大得多。为了获得高通量，采用197.60μl/min的流速(Rec＝40)。根据对图3中单个颗粒的惯性聚焦的研究，预计MCF-7细胞将收集在输出2中，大部分WBC和RBC将收集在输出1中，血小板将收集在输出1和输出3中，如图5b所示。
通过如图5c和5d所示的分选实验，验证了在三岔出口处不同细胞群的收集预期。图5c示出了在三岔出口处的两个主要聚焦条纹。由于在高速流动的活的癌细胞中荧光相对较弱，因此只能看到表示其聚焦位置的暗绿色条纹。高密度的红细胞(也包括相对较少的白细胞和血小板)甚至形成一条没有荧光标记的聚焦的暗红色线(由于小尺寸和低密度，无法观察到通道下边缘附近的血小板聚焦条纹)。显然，在流过一系列波形通道单元进行完全惯性聚焦后，乳腺癌细胞沿主通道的中心线聚集，并与RBC、WBC和血小板有较大的分离距离。图5d甚至显示了由高速相机捕获的单个MCF-7细胞与其他血细胞的分离过程，其中大多数血细胞流入输出1，较大的MCF-7细胞(以白色箭头表示)流入输出2。
使用流式细胞术计数至少10,000个细胞来分析从三个输出收集的原始细胞混合物和分选的样品。图6a-6d显示了原始细胞混合物和从输出中收集的三个样品的显微图像。输入的样品包含相对于全血细胞预设比例为5.3％的荧光染色的MCF-7细胞。惯性分选后，几乎所有的MCF-7细胞都收集在输出2中，如图6c中的绿色荧光斑所示。输出1收集了大部分未标记的血细胞(图6b)，而输出3仅收集了一小部分血细胞(图6d)。为了定量评价分选性能，定义了每个输出中MCF-7细胞的回收率(等式12)和MCF-7细胞的纯度(等式13)。
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经过一个单次分选过程后，能够从原始输入样品中回收89.72％的MCF-7细胞，如图6f所示。由于在高细胞浓度下不可避免的细胞间相互作用，因此还从输出1和输出3收集了一小部分MCF-7细胞，如输出1和输出3中分别为3.56％和2.18％的回收率所示。图6g显示了在单次分选过程之后，从三个输出收集的样品中MCF-7细胞的纯度。输出2(分离的MCF-7细胞)的平均纯度为68.9％，比原始纯度5.3％富集了13倍。研究了从输出2收集的MCF-7细胞的细胞活性。图6e显示了分选的MCF-7细胞能够增殖，表明其在惯性分选过程之后具有优异的细胞活力。
除上述内容外，还应注意的是，由于液体活检具有可替代手术活检的简单且非侵入性的特性，因此液体活检已成为临床诊断和预后检测中一种有前途的常规检查，其中循环肿瘤细胞(CTC)外泌体对研究人员很有吸引力。外泌体成为后起之秀的原因是：(I)转移的癌细胞中包含综合信息：外泌体、几乎所有细胞会分泌的小膜囊泡(30-200nm)都包含重要信息，例如蛋白质、microRNA和DNA，与实践中液体活检的疾病诊断和预后检测密切相关；(II)数量丰富：与患者外周血中CTC的稀少数量(每毫升10-100 CTCs)相比，外泌体不仅在外周血，而且也在唾液、尿液和滑液等中具有高浓度的优势，展示了更方便的临床样品获取平台。然而，由于外泌体的尺寸非常小，传统的外泌体分离方法通常难以实现高纯度、高通量、低成本，省工省时的结果。
本发明已经展示利用本发明的惯性装置实现了对来自微米级粒径(颗粒＞2μm的颗粒)的异质细胞样品(图7(I)所示)中分类/分离/处理稀有的CTC集合。
此外，本发明实现了从具有亚微米直径(或＜2μm的颗粒)的大囊泡(图7(II)所示)中收集外泌体。为了获得外泌体，提出了一系列结合黏弹性流体的反向波形通道结构，用于惯性亚微米/纳米级颗粒的聚焦和分选。与直线通道相比，波形通道产生的微流体周期性反向迪恩二次流可以促进颗粒聚焦。较大的细胞外囊泡受弹性升力的支配，并沿通道的中心线区域集中；而较小的外泌体仍将保留在两侧通道壁附近的区域，因此成功实现了外泌体分离。
PEO浓度对各种亚微米颗粒的影响
研究了在具有单个入口的波形通道中，在变化的PEO浓度下，四种亚微米颗粒(1μm、500nm、300nm和100nm)的弹性惯性聚焦行为。图8显示了PEO浓度从0.08wt％增加到0.16wt％时在三岔出口处的颗粒聚焦行为。1μm的颗粒可在PEO浓度低至0.08wt％时实现有效聚焦，并在PEO浓度增加至0.16wt％时保持类似的聚焦行为。当PEO浓度为0.08wt％时，500nm的颗粒开始显示出聚焦趋势，并且随着PEO浓度增加而表现出更好的聚焦。如等式11所示，弹性升力与d3成比例，这意味着在相同的PEO浓度下，作用于1μm颗粒的弹性升力约为作用于500nm颗粒的力的8倍。如前所述，根据Oldroyd-B模型(其中
Figure BDA0002539758980000211
)，其中PEO溶液的弛豫时间λ随c0.65增大(c表示PEO浓度)，ηp随c和
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增大，可看作在低浓度的PEO溶液时的常数70，因此增加c可以增强弹性升力，并且还导致颗粒进一步向中心线区域迁移71。在PEO浓度为0.08wt％和0.10wt％时，300nm颗粒没有显示清晰的聚焦行为，并且直到PEO浓度增加到高于0.14wt％时，才逐渐实现有效聚焦。即使当PEO浓度从0.08wt％增加到0.16wt％时，100nm颗粒也没有显示任何明显的聚焦。
基于尺寸的亚微米颗粒惯性分选
已知在各种条件下的黏弹性流体中亚微米颗粒在波形通道中的弹性惯性聚焦行为，选择0.16wt％的PEO浓度对300nm和100nm的颗粒混合物进行了基于尺寸的分选。一般地，100nm和300nm颗粒分别用来模拟外泌体和较大的EV。图7(II)中显示了基于尺寸的颗粒混合物分选的示意性实验设置，其中颗粒样品的流速和鞘流为25μl/min(相当于1500μl/h)和150μl/min(相当于9000μl/h)。借助于鞘流，当进入主通道时，颗粒混合物被限制在侧壁附近，并且300nm颗粒在流过一系列反向波形通道单元后逐渐流向中心区域，并沿通道的中心线形成一条紧密的条纹。如前所述，横向迁移，即弹性惯性聚焦，主要由弹性升力控制，并由迪恩流加速。如图8所示，100nm颗粒没有任何聚焦行为，这意味着它们只是跟随主流体流动并且被鞘流限制在通道壁附近。结果，从旁路出口收集了100nm的颗粒，并从中路出口收集了300nm的颗粒，以实现从300nm的颗粒中分离出100nm的颗粒。收集的两个样品通过NTA测量进行了分析，根据图9所示，在单次分选处理后，收集的100nm颗粒可以获得高于95％的纯度和高于87.9％的回收率。分选实验在相同条件下分别重复三遍。
基于尺寸的外泌体惯性分选
为了显示这种新颖的弹性惯性分选技术在与外泌体相关的生物学研究和临床应用中的潜力，探索了使用该技术在MCF-7培养基中分离外泌体和较大的EV。分选条件与上一节中100nm和300nm颗粒的分选条件完全相同。与300nm颗粒的行为类似，较大的EV在流过这些重复的反向波形通道单元后逐渐迁移到中心区域并沿通道的中心线保持聚焦，并最终由中路出口收集。尺寸在30至200nm之间的较小外泌体停留在侧壁附近，并由两个旁路出口收集。通过NTA分析评价收集的两个样品。图10a显示了归一化后来自MCF-7培养基的外泌体(30-200nm)和较大EV(300-800nm)的混合物分布，其中外泌体浓度几乎是较大EV的3.5倍。图10b和10c分别表示分选程序后外泌体和较大EV的分布，与先前的颗粒分离结果高度吻合。如图10d所示，外泌体的初始浓度为5×108颗粒/ml，成功实现了一次高通量的基于尺寸的外泌体分选过程，该分选达到高于88％的纯度和高于76％的回收率。分选实验在相同条件下分别重复三次。
结论
综上，提出了一种新的惯性聚焦和分选装置，其具有一系列反向波形通道结构，并产生垂直于主流方向的周期性反向迪恩二次流。惯性升力和迪恩二次流这两个惯性效应之间的平衡会在通道上产生尺寸相关的颗粒聚焦。研究了六种粒径(15μm、10μm、7μm、5μm、3μm和1μm)在具有不同几何不对称度的三个通道设计中的惯性聚焦行为。已经发现，当惯性升力在15μm和10μm颗粒的惯性力上大于迪恩阻力时，它们形成了单个条纹聚焦。但是，对于15μm和10μm的颗粒，不同程度的控制仍会导致颗粒不同的聚焦位置。随着粒径的缩小，对于7μm的颗粒，这两个力变得相当，它们可以从单个条纹聚焦转换为以不同流速聚焦的两个条纹。对于5μm和3μm颗粒，当迪恩阻力大于惯性升力时，它们聚焦在两个侧壁附近并形成两个紧密条纹。使用通道样式3的装置，展示了从10μm和3μm颗粒中分离出15μm颗粒的过程。由于在通道样式3中有效惯性聚焦的最小粒径介于1μm和3μm之间，还显示了在不使用鞘流的情况下从稀释的全血样品中分离MCF-7癌细胞。发现单一分选过程能够从原始混合物中获得89.72％的MCF-7细胞回收率，并且MCF-7细胞的纯度从5.3％显著提高到68.9％。分选出的MCF-7细胞显示出优异的细胞活性并能够增殖。使用四个不同尺寸的荧光亚微米球(1μm、500nm、300nm和100nm)研究黏弹性流体在各种条件下的聚焦行为。通过优化的参数组合，本发明显示了高通量(数十微升/分钟，数千微升/小时)的基于尺寸且无标记的外泌体分选，分选的纯度高于88％，回收率高于76％。这些重复的波形通道单元的线性排列使多个通道的水平(2D)和垂直(3D)并行变得容易，这为实际生物医学应用中的高通量细胞分选提供了巨大潜力。
本发明相对于现有方法的主要优点/改进在于，惯性微流体装置基于其尺寸为高通量和高保真度的细胞分选提供了非常低成本的平台。该系统中唯一需要动力驱动的组件是用于高流速引入样品的泵。由于惯性微流体装置的成本比具有复杂驱动器的常规微流体装置的成本低得多，因此这些惯性装置可以一次性使用，以避免交叉污染。
尽管在前面的描述中已经描述了本发明的优选实施例，但是本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的情况下，可以对设计或构造的细节进行诸多变化或修改。
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Claims (23)

1.一种用于分选、分离或处理流体悬浮液中的颗粒的装置，该装置包括：
(a)至少一个入口以引入流体悬浮液；
(b)至少一个出口以排出含有所需尺寸颗粒的悬浮液；和
(c)与所述至少一个入口和所述至少一个出口流体连通并位于所述至少一个入口和所述至少一个出口之间的通道，该主通道的一部分弯曲形成至少一个弯曲单元，该弯曲单元被塑造成具有一个波峰、一条在波谷上方弯曲形成的波缘和一个波面的波浪轮廓，
其中，弯曲单元的波峰、波缘、波面和波谷分别形成一个半圆弧段，流体悬浮液从波峰的半圆弧段穿过弯曲单元到达波谷的半圆弧段。
2.如权利要求1所述的装置，其中，所述波谷的半圆弧段的直径等于或大于所述波峰的半圆弧段的直径。
3.如权利要求2所述的装置，其中，所述波谷的半圆弧段的直径在200μm至1200μm之间。
4.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中，所述通道包括多个弯曲单元。
5.如权利要求4所述的装置，其中，所述多个弯曲单元按线性方向布置。
6.如权利要求4或5中任一项所述的装置，其中，所述多个弯曲单元包括10至40个之间的弯曲单元。
7.如前述权利要求中的任一项所述的装置，其中，所述至少一个出口还包括三个出口：第一出口、第二出口和第三出口。
8.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中，所述第一出口、第二出口和第三出口的宽度是不同的。
9.如权利要求8所述的装置，其中，所述第一出口、第二出口和第三出口的宽度分别是30-80μm、40-55μm和30-80μm。
10.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中，所述主通道具有矩形横截面轮郭。
11.如权利要求10所述的装置，其中，所述主通道的宽度为20-125μm，高度为5-40μm。
12.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中，每一个所述入口和所述至少一个出口还包括储存器，所述储存器的直径为1.5mm。
13.如前述权利要求中任一项所述的装置，其中，所述波峰的半圆弧段的直径在600至800μm之间，所述波面的半圆弧段的直径在200至350μm之间，所述波缘的半圆弧段的直径在200至350μm之间，所述波谷的半圆弧段的直径在600μm至1200μm之间。
14.一种用于分选、分离或处理流体悬浮液中的颗粒的方法，该方法包括：
(a)提供至少一个入口以引入流体悬浮液；
(b)提供至少一个出口以排出含有所需尺寸的颗粒的流体悬浮液；
(c)与所述至少一个入口和所述至少一个出口流体连通并位于所述至少一个入口和所述至少一个出口之间的通道，该主通道的一部分弯曲形成至少一个弯曲单元，该弯曲单元被塑造成具有一个波峰、一条在波谷上方弯曲形成的波缘和一个波面的波浪轮廓，其中，弯曲单元的波峰、波缘、波面和波谷分别形成一个半圆弧段；和，
(d)通过弯曲单元将流体悬浮液从波峰的半圆弧段泵送至波谷的半圆弧段。
15.如权利要求14所述的方法，还包括通过所述弯曲单元泵送所述流体悬浮液，其中，所述波谷的半圆弧段的直径等于或大于所述波峰的半圆弧段的直径。
16.如权利要求14或15中任一项所述的方法，还包括通过沿线性方向布置的多个弯曲单元泵送所述流体悬浮液，所述多个弯曲单元包括10至40个之间的弯曲单元。
17.如权利要求14至16中任一项所述的方法，还包括以40μl/min至200μl/min之间的流速泵送所述流体悬浮液。
18.如权利要求14至17中任一项所述的方法，其中，所述波峰的半圆弧段的直径在600至800μm之间，所述面的半圆弧段的直径在200至350μm之间，所述边的半圆弧段的直径在200至350μm之间，所述波谷的半圆弧段的直径在600μm至1200μm之间。
19.如权利要求14至18中任一项所述的方法，还包括在三个出口：第一出口、第二出口和第三出口中排出所述流体悬浮液。
20.如权利要求19所述的方法，还包括：在所述第一出口处排出包含尺寸为约3μm至10μm的颗粒的流体悬浮液，在所述第二出口处排出包含尺寸为约15μm的颗粒的流体悬浮液，在所述第三出口处排出含有粒径约为3μm的颗粒的流体悬浮液。
21.如权利要求14至20中任一项所述的方法，其中所述流体悬浮液是全血样品，并且所述方法从所述样品中分离癌细胞、从所述流体悬浮液样品中分离不同类型的血细胞或分离亚微米囊泡和外泌体。
22.如权利要求14至21中任一项所述的方法，其中，所述方法将具有约300nm的尺寸的颗粒与具有约100nm的尺寸的颗粒分离。
23.一种用于分选、分离或处理流体悬浮液中的颗粒的装置或方法，总体如本文中任一示例或任一附图所述。
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