JP5624470B2 - ヒト末梢血微小胞におけるｍｉＲＮＡの発現およびその使用 - Google Patents

Description

ヒト末梢血微小胞におけるｍｉＲＮＡの発現およびその使用に関する。
優先権の主張、および連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載
本出願は、２００７年９月１４日に提出された米国仮特許出願６０／９９３，８０９号、および２００８年５月２２日に提出された６１／０５５，１７８号に対する優先権を主張し、これら文献を本明細書において参照としてすべて援用する。本発明は政府のいかなる援助も受けておらず、したがって政府は本発明における権利を有するものではない。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）は、動物および植物において発現される低分子ノンコーディングＲＮＡである。これらは、細胞の機能、細胞の生存、細胞の活性化、および発生時の細胞の分化を制御する^７；８。

マイクロＲＮＡは、１９−２５ヌクレオチドのＲＮＡの低分子ノンコーディングファミリーであり、配列特異的な様式でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的とし、ｍｉＲＮＡおよびそれらの標的との間の相補性の程度に依存して、翻訳の抑制またはｍＲＮＡの分解の誘発することにより、遺伝子の発現を制御する (Bartel, D.P. (2004) Cell 116, 281- 297; Ambros, V. (2004) Nature 431, 350-355)。多くのｍｉＲは、遠位の関連する器官の間で配列中に保存されており、これらの分子が本質的な過程にかかわっていることを示唆する。事実ｍｉＲは、発生時の遺伝子発現の制御(Xu, P., et al. (2003) Curr. Biol. 13, 790-795)、細胞の増殖 (Xu, P., et al. (2003) Curr. Biol. 13, 790-795)、アポトーシス (Cheng, A.M., et al. (2005) Nucl. Acids Res. 33, 1290-1297)、グルコース代謝 (Poy, M.N., et al. (2004) Nature 432, 226-230)、ストレス抵抗性 (Dresios, J., et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1865-1870) 、および癌(Calin, G.A, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 1554-15529; Calin, G.A., et al. (2004) Proc. Natl Acad. ScL USA 101, 11755-11760; He, L., et al (2005) Nature 435, 828-833; およびLu, J., et al (2005) Nature 435:834-838)に関与している。

ｍｉＲが、哺乳類の血球新生に一役を担っているという強力なエビデンスもある。マウスにおいてｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１４２は、血球新生組織中で差次的に発現され、それらの発現は血球新生および分化系列決定の間に制御を受ける (Chen, C.Z., et al. (2004) Science 303, 83-86)。マウスの血球新生前駆細胞におけるｍｉＲ−１８１の異所的発現は、Ｂ細胞内コンパートメントにおける増殖をもたらした(Chen, C.Z., et al. (2004) Science 303, 83-86)。マウス血球新生系細胞における系統的なｍｉＲ遺伝子のプロファイリングは、神経組織と比較して血球新生系における異なるｍｉＲ発現パターンを明らかにし、細胞分化の間に起こる個々のｍｉＲの発現の変化を同定した(Monticelli, S., et al. (2005) Genome Biology 6, R71)。近年の研究は、ＣＤ３４^＋臍帯血前駆体細胞のヒト赤血球新生培養において、ｍｉＲ−２２１およびｍｉＲ−２２２が低レベルに調節されることを同定した(Felli, N., et al. (2005) Proc. Natl. Acad. ScL USA. 102, 18081-18086)。これらのｍｉＲは、腫瘍遺伝子ｃ−Ｋｉｔを標的とすることが発見された。さらなる機能の研究は、赤血球新生培養におけるこれら２つのｍｉＲの低下が、Ｋｉｔタンパク質の産生を翻訳レベルで遮断できなくなり、早期赤血球細胞のexpansion（成熟血球の増幅）を導くことを示した (Felli, N., et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 102, 18081-18086)。ｍｉＲ群が細胞分化を制御するという仮定と一致して、ｍｉＲ−２２３は、Ｃ/ＥＢＰａおよびＮＦＩ−Ａの関与する制御回路の鍵となるメンバーであり、オールトランスレチノイン酸処理した急性前骨髄球性白血病細胞株において、顆粒球の分化をコントロールすることが発見された(Fazi, F., et al. (2005) Cell 123, 819-831)。

Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病における、２つのｍｉＲの高頻度の欠失および低発現が同定された^９。この発見が、頭頚部癌、小細胞肺癌、神経膠芽腫、乳癌、慢性リンパ性白血病、およびバーキットリンパ腫における、ｍｉＲの異常な発現を実証する多数の論文を刺激することとなった^９−１２。より最近には、炎症とｍｉＲ間の関連性がマクロファージにおいて報告されている^１３。

Bartel, D.P. (2004) Cell 116, 281-297 Ambros, V. (2004) Nature 431, 350-355 Xu, P., et al. (2003) Curr. Biol. 13, 790-795 Cheng, A.M., et al. (2005) Nucl. Acids Res. 33, 1290-1297 Poy, M.N., et al. (2004) Nature 432, 226-230 Dresios, J., et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 1865-1870 Calin, G.A, et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 1554-15529 Calin, G.A., et al. (2004) Proc. Natl Acad. Sci USA 101, 11755-11760 He, L., et al (2005) Nature 435, 828-833 Lu, J., et al (2005) Nature 435:834-838 Chen, C.Z., et al. (2004) Science 303, 83-86 Monticelli, S., et al. (2005) Genome Biology 6, R71 Felli, N., et al. (2005) Proc. Natl. Acad. ScL USA. 102, 18081-18086 Fazi, F., et al. (2005) Cell 123, 819-831

そのような障害に関する検査を目的として、そのようなマクロファージの存在を確認するための組織サンプルが獲得されている。加えて現在までのところ、血中を循環する微小胞がｍｉＲを含有することを示す報告はなされていない。

本発明のさらなる利点、目的、および特色は、以下の記述で部分的に説明することとし、そして当業者には以下の実験で部分的に明らかになり、または本発明を実施することで学ばれることと思う。本発明の目的および利点は、付記した請求項で特に指摘したように理解され、達成されることと思う。

発明の概要
１つの側面において、微小胞内に存在し、そして/または組織、体液、および/もしくは細胞において具体的なｍｉＲの発現レベルが変化している、具体的なｍｉＲを同定するための方法を提供する。

微小胞は細胞間の情報交換を促進する。マクロファージ、血小板、Ｔ細胞、および腫瘍を含む多くの細胞は、核酸および/またはタンパク質を含有する小さな微小胞を放出する^１−５。微小胞内に含有される因子は、血管新生、細胞の成長、および細胞の分化を制御する^１−３。

もう１つの側面において、特定の障害に罹っている患者の末梢血のような体液中のｍｉＲの存在を決定する。
もう１つの側面において、肺線維症に罹っている患者の肺組織中のｍｉＲの存在を決定する。

なおもう１つの側面において、被験者（例えばヒト）の特定の障害を診断または予後診断する方法を本明細書にて提供する。１つの特定の方法に従って、被験者由来検査サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物のレベルを、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産生物のレベルと比較する。コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産生物のレベルと比較しての、検査サンプル中のｍｉＲ遺伝子産生物のレベルの変化（例えば増加、減少）が、被験者が急性炎症性障害を有する、または発症するリスクがあるかのいずれかであることを示す。

１つの態様において被験者由来検査サンプル中のｍｉＲ遺伝子産生物のレベルは、コントロールのレベルより高い。もう１つの態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物は、本明細書に示したようなｍｉＲＮＡから成る群より選択される。

特定の態様において診断または予後診断される障害は、単核食細胞および/またはＴＨＰ−１細胞による微小胞放出を引き起こすものである。
特定の態様において診断または予後診断される障害は、炎症反応を引き起こすものである。

もう１つの態様において本発明は、被験者（例えばヒト）の癌および/または炎症性障害を治療する方法である。
１つの特定の方法において、表Ｉ−ＶＩに見出せる群の１つまたはそれより多くより選択される、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物の発現を阻害するための化合物の有効量を、被験者に投与する。

１つの態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物の発現を阻害するための化合物は、表Ｉ−ＶＩに見出せる群の１つまたはそれより多くより選択されるｍｉＲ遺伝子産生物の発現を阻害する。

本発明はさらに、癌および/または炎症性障害を治療するための医薬組成物を提供する。１つの態様において本発明の医薬組成物は、少なくとも１つのｍｉＲ発現阻害化合物、および医薬的に受容可能な担体を包含する。特定の態様において、少なくとも１つのｍｉＲ発現阻害化合物は、その発現が正常と比較して疾患患者由来血液中でより高いｍｉＲ遺伝子産生物に対して特異的である。

なおもう１つの態様において、医薬組成物はさらに少なくとも１つの抗炎症薬を包含する。
１つの態様において本発明は、ｍｉＲ遺伝子産生物の過剰発現と関連する癌、および/またはｍｉＲ遺伝子産生物の過剰発現と関連する肺の障害を治療するための、医薬組成物である。そのような医薬組成物は、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物の有効量、および医薬的に受容可能な担体を包含し、その場合少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物が結合して、そのｍｉＲ遺伝子産生物の発現を低減させる。もう１つの態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物は、そのｍｉＲ遺伝子産生物の核酸配列と相補的である核酸配列を包含する。まだもう１つの態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物は、ｍｉＲ、またはそのバリアントもしくは生物学的に活性なそのフラグメントである。なおもう１つの態様において、医薬組成物はさらに少なくとも１つの抗癌薬を包含する。

本発明の様々な目的および利点は、添付の図を照らし合わせて読むことで、好ましい態様の以下の詳細な記載から当業者には明らかになろう。

図１は、分化がマクロファージからの微小胞の放出を誘導したことを示す。末梢血単球（ＰＢＭ）は、未処理のまま（淡黒点）とするか、または２４時間ＧＭ−ＣＳＦで処理（黒点）した。細胞を含まない上清を集め、超遠心した。小胞をＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメトリーでサイズについて解析した。解析の前に、２μｍ標準ビーズを使用してＦＳＳおよびＳＳＣのパラメータを調整した（示していない）。３名の別個のドナーからの代表的なデータを示す。 図２Ａ−２Ｃは、微小胞がマクロファージの分化を仲介することを示す。微小胞を、ＰＭＡ処理したＴＨＰ１細胞より集めた後、未分化のＴＨＰ１細胞（図２Ｂ）または単球（図２Ｃ）に加えた。コントロールとして、ＴＨＰ１細胞を未処理のまま残した（図２Ａ）。細胞は毎日写真撮影した。第３日の細胞を示す。 図３Ａ−３Ｃは、末梢血微小胞の単離を示す。インフォームドコンセント後、正常なボランティアドナーからの２０ｃｃ血液から血漿を得た。０．５ｃｃ血漿由来の微小胞を、ＣＤ２０６−ＦＩＴＣまたはＭＨＣＩＩ−ＦＩＴＣ抗体と共にインキュベートし、前方散乱 対 側方散乱を使用してのサイズ（図３Ａ）、および表面抗原発現（図３Ｂ）について、ＢＤ ＦＡＣＳ Caliburで解析した。同位体のコントロールと比較してのＣＤ２０６またはＭＨＣ ＩＩのいずれかの発現のパーセントを、図３Ａに示したゲート領域に関して決定した（図３Ｃ）。２人のドナーの平均±ＳＥＭを示す。 末梢血微小胞の由来の解析。図４は、健常なドナー（ｎ＝１０）由来の末梢血微小胞をフローサイトメトリーにより解析した。細胞の由来を決定するため、微小胞を、ＣＤ３、ＣＤ２０２ｂ（Ｔｉｅ−２）、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ７９ａ、またはＣＤ４１ａについて染色し、Ｔ細胞、内皮細胞、好中球、Ｂ細胞、または血小板に由来するものを決定した。単核食細胞由来の微小胞は、ＣＤ１４、ＣＤ２０６、ＣＣＲ３、ＣＣＲ２、またはＣＣＲ５に対してポジティブとした。ゲートされた全イベントの最大値の％の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。 末梢血微小胞およびＰＢＭＣからのｍｉＲＮＡの発現。（図５Ａ）微小胞およびＰＢＭＣに関する階層的クラスター解析を、フィルタリング基準に基づいて示す。 末梢血微小胞およびＰＢＭＣからのｍｉＲＮＡの発現。微小胞（図５Ｂ）に関する発現プロファイルを示すヒートマップを作製した。 末梢血微小胞およびＰＢＭＣからのｍｉＲＮＡの発現。ＰＢＭＣ（図５Ｃ）に関する発現プロファイルを示すヒートマップを作製した。 末梢血微小胞およびＰＢＭＣからのｍｉＲＮＡの発現。（図５Ｄ）各サンプル群で共有する数、および各サンプル群に特異的な数を示す。 図６：表１は、様々な疾患、ならびにそれらに関連してアップレギュレートおよびダウンレギュレートされたｍｉＲを示す。癌および癌以外の適用を含む、ヒトの疾患の組織内において重要であるマイクロＲＮＡを列記する。我々のデータセット（図７、表ＩＩ）からは血漿中に検出されないｍｉＲＮＡを、特定の疾患の組織内で増加することが知られているｍｉＲＮＡと比較して、発見者らは、数種のｍｉＲＮＡが血漿中のバイオマーカーとして役立ててよいことを予測することを今回確信する（図６、表１の増加した発現の列の太字のｍｉＲを参照のこと）。 図７−１：表ＩＩは、血漿中で発現されたｍｉＲ、および検出されなかったｍｉＲを示す。 図７−２：表ＩＩ（続き）は、血漿中で発現されたｍｉＲ、および検出されなかったｍｉＲを示す。 図７−３：表ＩＩ（続き）は、血漿中で発現されたｍｉＲ、および検出されなかったｍｉＲを示す。 図８：表ＩＩＩはｍｉＲを列記し、すべての個体からの血漿微小胞およびＰＢＭＣにおける最も高発現の１０のｍｉＲＮＡを示す。 図９：表ＩＶは、Sanger miRBase単独（上）、またはSanger miRBaseおよびTargetScanからの共通の標的（下）を使用すると、獲得免疫系の代謝および制御に関与する基準経路が、これらのｍｉＲＮＡの発現により大きく制御されることを示す。 図１０−１：表Ｖは、ＰＢＭＣ分画中では２０のｍｉＲＮＡが、微小胞血漿サンプルと比較して３倍の発現増加を有したこと、同様にＰＢＭＣと比較しての血漿小胞における倍数変化（最後の列）を示す。 図１０−２：表Ｖ（続き）は、ＰＢＭＣ分画中では２０のｍｉＲＮＡが、微小胞血漿サンプルと比較して３倍の発現増加を有したこと、同様にＰＢＭＣと比較しての血漿小胞における倍数変化（最後の列）を示す。 図１１−１：表ＶＩは、検出されたすべてのｍｉＲに関する正規化した発現データ：ディテクターの名称、平均−ＭＮＣ、標準偏差−ＭＮＣ、ディテクターの名称、平均−血清、標準偏差−血清を示す。 図１１−２（続き）：表ＶＩは、検出されたすべてのｍｉＲに関する正規化した発現データ：ディテクターの名称、平均−ＭＮＣ、標準偏差−ＭＮＣ、ディテクターの名称、平均−血清、標準偏差−血清を示す。

本発明は部分的には、炎症反応に関与し、そして/または血中で発現レベルが変化している具体的なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の同定に基づく。本発明はさらに部分的には、特定の診断、予後診断、および治療の特徴と、これらのｍｉＲＮＡとの関連性に基づく。

本明細書において説明して実例を挙げたように、特定のｍｉＲＮＡは、組織の障害時および/または炎症時にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる。
本明細書において互換的に使用される場合、“ｍｉＲ遺伝子産生物”、“マイクロＲＮＡ”、“ｍｉＲ”、“ｍｉＲ（斜体）”、または“ｍｉＲＮＡ”は、プロセシングされていないまたはプロセシングされたｍｉＲ遺伝子からのＲＮＡ転写物をいう。ｍｉＲ遺伝子産生物はタンパク質に翻訳されないため、“ｍｉＲ遺伝子産生物”という用語はタンパク質を含まない。プロセシングされていないｍｉＲ遺伝子転写物はまた、“ｍｉＲ前駆体”とも呼ばれ、典型的には約７０−１００ヌクレオチド長のＲＮＡ転写物を包含する。ｍｉＲ前駆体は、リボヌクレアーゼ（例えばダイサー、アルゴノート、ＲＮＡｓｅＩＩＩ（例えば大腸菌ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ））により活性な１９−２５ヌクレオチドＲＮＡ分子に消化されることにより、プロセシングされ得る。この活性な１９−２５ヌクレオチドＲＮＡ分子はまた、“プロセシングされた”ｍｉＲ遺伝子転写物、または“成熟”ｍｉＲＮＡとも呼ばれる。

活性な１９−２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、天然のプロセシング経路（例えばインタクトな細胞もしくは細胞可溶化液を使用して）を通して、または合成のプロセシング経路（例えば単離されたプロセシング酵素、例えば単離されたダイサー、アルゴノート、ＲＮＡｓｅＩＩＩを使用して）により、ｍｉＲ前駆体から得ることができる。活性な１９−２５ヌクレオチドＲＮＡ分子はまた、ｍｉＲ前駆体からプロセシングするのではなく、生物学的または化学的合成により直接合成することもできる。マイクロＲＮＡを本明細書においてこの名称でいう場合、別に指摘していない限り、その名称は前駆体および成熟型の双方に対応する。

本発明は、被験者が、微小胞が放出される障害を有するか、または発症するリスクがあるかどうかを診断または予後診断する方法を包括的に含む。
当該方法は、被験者由来サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物のレベルを決定し、そしてサンプル中のｍｉＲ遺伝子産生物のレベルをコントロールと比較することを包含する。本明細書において使用する場合、“被験者”は、そのような障害を有する、または有すると疑われるあらゆる哺乳類であることができる。好ましい態様において、被験者は、そのような障害を有する、または有すると疑われるヒトである。

少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物のレベルは、被験者から得た生体サンプルの細胞において測定することができる。
もう１つの態様において、サンプルは被験者から採取することができ、そしてＤＮＡは標準的な技術により抽出および単離することができる。例えばある種の態様において、サンプルは、放射線療法、化学療法、またはその他の治療処置の開始前に、被験者から入手することができる。対応するコントロールサンプル、またはコントロールリファレンスサンプル（例えばコントロールサンプルの母集団から得たもの）は、被験者の障害を受けていないサンプルから、正常なヒト個体もしくは正常な個体集団から、または被験者のサンプル中の大半の細胞に対応する培養細胞から得ることができる。その後、コントロールサンプルは被験者由来サンプルと共に処理することができ、その結果被験者のサンプル由来細胞中の所定のｍｉＲ遺伝子から産生されるｍｉＲ遺伝子産生物のレベルを、コントロールサンプルの細胞由来の対応するｍｉＲ遺伝子産生物のレベルと比較することができる。あるいはリファレンスサンプルを、検査サンプルとは別に（例えば別の時に）入手して処理することもでき、検査サンプル由来細胞中の所定のｍｉＲ遺伝子から産生されるｍｉＲ遺伝子産生物のレベルを、リファレンスサンプル由来の対応するｍｉＲ遺伝子産生物のレベルと比較することができる。

１つの態様において、検査サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産生物のレベルより高い（すなわちｍｉＲ遺伝子産生物の発現は“アップレギュレート”されている）。本明細書において使用する場合、被験者由来サンプル中のｍｉＲ遺伝子産生物の量が、コントロール（例えばリファレンススタンダード、コントロール細胞サンプル、コントロール組織サンプル）中の前記遺伝子産生物の量より多い場合、ｍｉＲ遺伝子産生物の発現は“アップレギュレート”されている。

もう１つの態様において、検査サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産生物のレベルより低い（すなわちｍｉＲ遺伝子産生物の発現は“ダウンレギュレート”されている）。本明細書において使用する場合、被験者由来サンプル中のその遺伝子から産生されるｍｉＲ遺伝子産生物の量が、コントロールサンプル中の前記遺伝子から産生される量より少ない場合、ｍｉＲ遺伝子産生物の発現は“ダウンレギュレート”されている。コントロールおよび正常なサンプル中の相対的なｍｉＲ遺伝子の発現は、１つまたはそれより多くのＲＮＡ発現スタンダードに関して決定することができる。スタンダードは、例えばｍｉＲ遺伝子のゼロレベルの発現、スタンダードの細胞株におけるｍｉＲ遺伝子の発現レベル、被験者の障害を受けていないサンプル中のｍｉＲ遺伝子発現レベル、または正常なヒトコントロールの集団に関する先に得たｍｉＲ遺伝子発現の平均レベル（例えばコントロールリファレンススタンダード）を包含することができる。

少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物のレベルは、当業者に周知されている多様な技術（定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット解析、液相ハイブリダイゼーション法）を使用して測定することができる。特定の態様において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物のレベルは、被験者から得た検査サンプル由来のＲＮＡを逆転写して、ひと組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供し、その標的オリゴデオキシヌクレオチドを１つまたはそれより多くのｍｉＲＮＡ特異的なプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて（例えばｍｉＲＮＡ特異的なプローブオリゴヌクレオチドを包含するマイクロアレイ）、検査サンプルに関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、そして検査サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルを、コントロールサンプルから作成したハイブリダイゼーションプロファイルと比較することにより測定する。コントロールサンプルと比較しての検査サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルの変化が、被験者が特定の障害を有する、またはそのリスクがあることを示す。

またマイクロアレイは、公知のｍｉＲＮＡ配列から作成された遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから調製することができる。アレイは、各ｍｉＲＮＡに対して２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブを含有してよく、一方は活性な成熟した配列を含有し、そして他方はｍｉＲＮＡの前駆体に対して特異的なものとする。このアレイはまた、ハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件のためのコントロールとして役立てることができるコントロール、例えばわずか数塩基しかヒトのオルソログと異ならない１つまたはそれより多くのマウスの配列を含有してよい。双方の種由来のｔＲＮＡおよびその他のＲＮＡ（例えばｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）もまた、マイクロチップ上にプリントし、特異的なハイブリダイゼーションのための内部基準の、比較的安定なポジティブコントロールを提供してよい。非特異的なハイブリダイゼーションに関する１つまたはそれより多くの適当なコントロールもまた、マイクロチップ上に含めてよい。この目的に関しては配列は、いかなる公知のｍｉＲＮＡといかなる相同性もないことに基づいて選択する。

マイクロアレイは、当該技術分野に公知の技術を使用して製作してよい。例えば適当な長さ、例えば４０ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドは、Ｃ６位で修飾された５’−アミンとし、市販の利用可能なマイクロアレイシステム、例えばthe GeneMachine OmniGrid（登録商標）100 Microarrayer およびAmersham CodeLink（登録商標）活性化スライドを使用してプリントする。標的ＲＮＡに対応する標識ｃＤＮＡオリゴマーは、標識プライマーによる標的ＲＮＡの逆転写により調製する。最初の二本鎖の合成に続いて、ＲＮＡ/ＤＮＡハイブリッドを変性させ、ＲＮＡの鋳型を分解する。その後このように調製した標識した標的ｃＤＮＡを、ハイブリダイゼーションの条件下でマイクロアレイチップにハイブリダイズさせる、例えば６Ｘ ＳＳＰＥ/３０％ホルムアミド、２５℃、１８時間、続いて０．７５Ｘ ＴＮＴ中、３７℃で４０分間洗浄する。固定化したプローブＤＮＡがサンプル中の相補的な標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置で、ハイブリダイゼーションが起こる。標識した標的ｃＤＮＡは、結合が起こるアレイ上の正確な位置を指し示し、自動的な検出および定量を可能にする。結果はハイブリダイゼーションのイベントのリストから成り、特異的なｃＤＮＡ配列が比較的多量にあること、そしてそれ故患者サンプル中に対応する相補的ｍｉＲが比較的多量にあることを示す。１つの態様に従って標識ｃＤＮＡオリゴマーは、ビオチン標識プライマーより調製されたビオチン標識ｃＤＮＡである。次に、例えばStreptavidin-Alexa64複合体を使用してのビオチン含有転写物の直接的な検出によりマイクロアレイを処理し、従来のスキャン法を利用してスキャンする。アレイ上の各スポットの画像強度は、患者サンプル中の対応するｍｉＲの量と比例する。

アレイの使用は、ｍｉＲＮＡの発現検出に関していくつかの利点を有する。第一に、数百の遺伝子の網羅的な発現を同一サンプル中で一度に同定することができる。第二に、オリゴヌクレオチドプローブの注意深いデザインを通して、成熟した分子と前駆体分子の双方の発現を同定することができる。第三に、ノーザンブロット解析と比較して、チップは少量のＲＮＡを必要するため、２．５μｇの総ＲＮＡを使用して再現性ある結果を提供する。比較的限定された数のｍｉＲＮＡ（一種あたり数百）であることが、各種に関する個別のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、いくつかの種に関する共通のマイクロアレイの作成を可能にする。そのようなツールは、様々な条件下での公知の各ｍｉＲに関する種横断的な発現の解析を可能にする。

具体的なｍｉＲの定量的発現レベルのアッセイのための使用に加えて、ｍｉＲＮｏｍｅの実質的な部分、好ましくはｍｉＲＮｏｍｅ全体に対応する、ｍｉＲＮＡ特異的なプローブオリゴヌクレオチドを含有するマイクロチップを利用して、ｍｉＲ発現パターンの解析のためのｍｉＲ遺伝子発現プロファイリングを実行してもよい。個別のｍｉＲシグネチャは、確立された疾患のマーカーに、または直接疾患の状態に関連させることができる。

本明細書に記載した発現プロファイリング法に従って、特定の障害を有すると疑われる被験者由来サンプルからの総ＲＮＡを、定量的に逆転写して、サンプル中のＲＮＡに相補的なひと組の標識した標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供する。次に標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを包含するマイクロアレイにハイブリダイズさせて、サンプルに関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供する。この結果は、サンプル中のｍｉＲＮＡの発現パターンを表す、サンプルに関するハイブリダイゼーションプロファイルである。このハイブリダイゼーションプロファイルは、マイクロアレイ中のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドへの、サンプル由来標的オリゴデオキシヌクレオチドの結合からのシグナルを包含する。プロファイルは、結合の有無（シグナル 対 ゼロシグナル）として記録してよい。より好ましくは記録されるプロファイルは、各ハイブリダイゼーションからのシグナルの強度を含む。このプロファイルを、正常なコントロールサンプルまたはリファレンスサンプルから作成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較する。シグナルの変化が、被験者における特定の障害の存在、または発症する傾向を示す。

ｍｉＲ遺伝子の発現を測定する他の技術もまた、当該分野の技術の範囲内であり、ＲＮＡの転写および分解の速度を測定するための様々な技術を含む。
本発明はまた、被験者が有害な予後を伴う特定の障害を有するか、または発症するリスクがあるかどうかを診断する方法を提供する。本方法において、特定の障害の有害な予後と関連する少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物のレベルは、被験者から得た検査サンプル由来のＲＮＡを逆転写して、ひと組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供することにより測定する。次にこの標的オリゴデオキシヌクレオチドを、１つまたはそれより多くのｍｉＲＮＡ−特異的プローブオリゴヌクレオチド（例えばｍｉＲＮＡ−特異的プローブオリゴヌクレオチドを包含するマイクロアレイ）とハイブリダイズさせて、検査サンプルに関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、そして検査サンプルハイブリダイゼーションプロファイルを、コントロールサンプルから作成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較する。コントロールサンプルと相対しての検査サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルの変化が、被験者が有害な予後を伴う特定の障害を有する、または発症するリスクがあることを示す。

症例によっては、サンプル中の複数の異なるｍｉＲ遺伝子産生物の発現レベルを同時に決定することが望ましいこともある。他の症例では、特定の障害に相関するすべての公知のｍｉＲ遺伝子の転写物の発現レベルを決定することが望ましいこともある。数百ものｍｉＲ遺伝子または遺伝子産生物に関する具体的な発現レベルを評価することは、時間もかかり、多量の総ＲＮＡ（各ノーザンブロットに関しては少なくとも２０μｇ）を必要とし、自動放射線撮影技術は放射性同位体を必要とする。

これらの制限を克服するため、ひと組のｍｉＲ遺伝子に対して特異的であるひと組のオリゴヌクレオチド（例えばオリゴデオキシヌクレオチド）プローブを含有する、マイクロチップフォーマット（すなわちマイクロアレイ）上のオリゴライブラリーを構成してよい。そのようなマイクロアレイを使用して、生体サンプル中の多数のマイクロＲＮＡの発現レベルを、ＲＮＡを逆転写してひと組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを作成し、そしてそれらをマイクロアレイ上のプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション、または発現プロファイルを作成することにより、決定することができる。次に検査サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルを、コントロールサンプルのそれと比較して、どのマイクロＲＮＡが変化した発現レベルを有するかを決定することができる。本明細書において使用する場合、“プローブオリゴヌクレオチド”または“プローブオリゴデオキシヌクレオチド”は、標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする能力のあるオリゴヌクレオチドをいう。“標的オリゴヌクレオチド”または“標的オリゴデオキシヌクレオチド”は、検出される分子（例えばハイブリダイゼーションを介して）をいう。“ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチド”または“ｍｉＲに対して特異的なプローブオリゴヌクレオチド”により、特異的なｍｉＲ遺伝子産生物と、または特異的なｍｉＲ遺伝子産生物の逆転写物とハイブリダイズするように選択された配列を有する、プローブオリゴヌクレオチドを意味する。

特定のサンプルの“発現プロファイル”または“ハイブリダイゼーションプロファイル”は、本質的にサンプルの状態のフィンガープリントである；２つの状態で、どれか特定の遺伝子の発現が類似していてもよく、いくつかの遺伝子を同時に評価することで、その細胞の状態に独特である遺伝子発現プロファイルの作成が可能になる。すなわち、正常なサンプルは、対応する障害提示サンプルとは識別されてよい。そのような障害提示サンプルの内で、異なる診断の状態（例えば良好なまたは悪い長期生存の見通し）が決定されてもよい。異なる状態にある障害提示サンプルの発現プロファイルを比較することにより、これら状態の各々においてどの遺伝子が重要であるか（遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーション双方を含む）に関する情報が得られる。

障害提示サンプル内で異なって発現された配列の同定、ならびに異なる予後の結果に至る異なる発現は、いくつかのやり方でのこの情報の使用することが可能になる。例えば特定の治療計画を（例えば特定の被験者における長期的予後を改善するように化学療法薬が作用するかどうかを決定するために）評価してよい。同様に、被験者由来サンプルを公知の発現プロファイルと比較することにより、診断を行う、または確立してよい。さらにこれらの遺伝子発現プロファイル（または個々の遺伝子）は、特定の障害の発現プロファイルを抑制する、または悪い予後のプロファイルをより良好なプロファイルに変換する薬剤候補物質のスクリーニングを可能にする。

細胞内の１つまたはそれより多くのｍｉＲ遺伝子産生物のレベルの変化は、結果的にこれらｍｉＲに関する１つまたはそれより多くの意図された標的の制御を解除してしまう可能性があり、そのことが特定の障害を導き得る。それ故、ｍｉＲ遺伝子産生物のレベルを（例えば障害提示細胞内でアップレギュレートされているｍｉＲのレベルを減少させることにより、障害提示細胞内でダウンレギュレートされているｍｉＲのレベルを増加させることにより）変化させることで、障害を治療することができるものと思われる。

したがって本発明は、被験者の障害を治療する方法を包括的に含み、その場合被験者の細胞において少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物は制御が解除されている（例えばダウンレギュレート、アップレギュレートされている）。１つの態様において、検査サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物のレベルが、コントロールサンプルまたはリファレンスサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産生物のレベルより高い。もう１つの態様において、検査サンプル中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物のレベルが、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産生物のレベルより低い。少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産生物が検査サンプル中でダウンレギュレートされている場合、当該方法は、少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産生物、または単離されたそのバリアントもしくは生物学的に活性なそのフラグメントの有効量を投与し、そうして被験者体内の障害提示細胞の増殖を阻害することを包含する。

例えば、あるｍｉＲ遺伝子産生物が被験者の癌細胞内でダウンレギュレートされている場合、有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産生物を被験者に投与することで、癌細胞の増殖を阻害することができる。被験者に投与する単離されたｍｉＲ遺伝子産生物は、癌細胞内でダウンレギュレートされている内在する野生型ｍｉＲ遺伝子産生物と同一であることができ、またはそのバリアントもしくは生物学的に活性なそのフラグメントであることもできる。

本明細書において定義する場合、ｍｉＲ遺伝子産生物の“バリアント”は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産生物と１００％より少ない同一性を有するが、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産生物の１つまたはそれより多くの生物的活性を保有するｍｉＲＮＡをいう。そのような生物的活性の例として、標的ＲＮＡ分子の発現の阻害（例えば標的ＲＮＡ分子の翻訳を阻害する、標的ＲＮＡ分子の安定性を調節する、標的ＲＮＡ分子のプロセシングを阻害する）、ならびに癌および/または骨髄増殖性障害と関連する細胞の過程（例えば細胞の分化、細胞の成長、細胞死）の阻害を含むが、これに限定されない。これらのバリアントには、ｍｉＲ遺伝子における種のバリアント、および１つまたはそれより多くの変異（例えば置換、欠失、挿入）の結果であるバリアントを含む。ある種の態様においてバリアントは、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産生物と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。

本明細書において定義する場合、ｍｉＲ遺伝子産生物の“生物学的に活性なフラグメント”は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産生物の１つまたはそれより多くの生物学的活性を保有する、ｍｉＲ遺伝子産生物のＲＮＡフラグメントをいう。上に記載したように、そのような生物学的活性の例として、標的ＲＮＡ分子の発現の阻害、ならびに癌および/または骨髄増殖性障害と関連する細胞の過程の阻害を含むが、これに限定されない。ある種の態様において生物学的に活性なフラグメントは、少なくとも約５、７、１０、１２、１５または１７ヌクレオチド長である。特定の態様において、単離されたｍｉＲ遺伝子産生物は、１つまたはそれより多くの付加的な抗癌治療と組み合わせて被験者に投与することができる。適切な抗癌治療には、化学療法、放射線療法、およびそれらの組み合せ（例えば放射線化学療法）を含むが、これに限定されない。

癌細胞内で少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産生物がアップレギュレートされている場合、当該方法は、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物の発現を阻害し、そうして障害提示細胞の増殖を阻害する化合物の有効量を、被験者に投与することを包含する。そのような化合物は、本明細書においてｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物という。適切なｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物の例として、本明細書に記載したもの（例えば二本鎖ＲＮＡ、アンチセンス核酸、および酵素としてのＲＮＡ分子）を含むが、これに限定されない。

特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、１つまたはそれより多くの抗癌治療と併用して被験者に投与することができる。適切な抗癌治療には、化学療法、放射線療法、およびそれらの組み合せ（例えば放射線化学療法）を含むが、これに限定されない。

本明細書に記載したように、少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産生物が癌細胞内でアップレギュレートされている場合、当該方法は、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物の発現を阻害する少なくとも１つの化合物の有効量を被験者に投与し、そうして癌細胞の増殖を阻害することを包含する。

“治療する”、“治療すること”、“治療”という用語は、本明細書において使用する場合、疾患の症状の開始を妨げるもしくは遅らせる、および/または疾患、障害もしくは状態の症状の重症度もしくは頻度を軽減することを含む、疾患または状態、例えば癌および/またはその他の状態または障害に関連する症状を寛解させることをいう。“被験者”、“患者”および“個体”という用語は、本明細書において、動物、例えば哺乳類（霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、またはその他のウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類、もしくはネズミの種を含むがこれに限定されない）を含むものと定義する。好ましい態様において動物はヒトである。

本明細書において使用する場合、“単離された”ｍｉＲ遺伝子産生物は、合成されたもの、またはヒトの介入により天然の状態から変化させたもしくは取り出されたものである。例えば、合成ｍｉＲ遺伝子産生物、またはその天然の状態の共存する材料から部分的にもしくは完全に分離されたｍｉＲ遺伝子産生物は、“単離された”とみなされる。単離されたｍｉＲ遺伝子産生物は、実質的に精製された形で存在することができ、またはｍｉＲ遺伝子産生物が送達された細胞内に存在することができる。したがって送達可能なように送達された、または細胞内で発現されたｍｉＲ遺伝子産生物は、“単離された”ｍｉＲ遺伝子産生物とみなされる。ｍｉＲ前駆体分子から細胞内部で産生されるｍｉＲ遺伝子産生物もまた、“単離された”分子であるとみなされる。本発明に従って、本明細書に記載した単離されたｍｉＲ遺伝子産生物を、被験者（例えばヒト）を治療するための医薬剤の製造のために使用することができる。

単離されたｍｉＲ遺伝子産生物は、いくつかの標準的な技術を使用して得ることができる。例えばｍｉＲ遺伝子産生物は、当該技術分野で公知の方法を使用して化学的に合成する、またはリコンビナントにより産生させることができる。１つの態様においてｍｉＲ遺伝子産生物は、適当に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト、および従来のＤＮＡ/ＲＮＡシンセサイザーを使用して化学的に合成する。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の市販供給元として、例えばProligo (Hamburg, Germany), Dharmacon Research (Lafayette, CO, U.S.A.), Pierce Chemical (Perbio Scienceの一部, Rockford, IL, U.S.A.), Glen Research (Sterling, VA, U.S.A.), ChemGenes (Ashland, MA, U.S.A.) およびCruachem (Glasgow, UK)を含む。

あるいはｍｉＲ遺伝子産生物は、いずれかの適切なプロモーターを使用して、リコンビナントの環状または直鎖ＤＮＡプラスミドから発現させることができる。プラスミドからＲＮＡを発現するための適切なプロモーターとして、例えばＵ６もしくはＨｌ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターを含む。その他の適切なプロモーターの選択も当該分野の技術の範囲内である。本発明のリコンビナントプラスミドはまた、細胞（例えば癌細胞、骨髄増殖性障害を提示する細胞）におけるｍｉＲ遺伝子産生物の発現のための、誘導性プロモーターまたは制御可能なプロモーターを包含することができる。

リコンビナントプラスミドから発現させたｍｉＲ遺伝子産生物は、標準的な技術により培養細胞発現系から単離することができる。リコンビナントプラスミドから発現させたｍｉＲ遺伝子産生物はまた、細胞内に送達し、細胞内で直接発現させることができる。

ｍｉＲ遺伝子産生物は、別々のリコンビナントプラスミドから発現させることができ、または同一のリコンビナントプラスミドから発現させることもできる。１つの態様においてｍｉＲ遺伝子産生物は、ただ１つのプラスミドからＲＮＡ前駆体分子として発現させ、そして癌細胞内に現存するプロセシングシステムを含むがこれに限定されない適切なプロセシングシステムにより、前駆体分子を機能的なｍｉＲ遺伝子産生物にプロセシングする。

ｍｉＲ遺伝子産生物を発現するための適切なプラスミドの選択、核酸配列をプラスミド内に挿入して遺伝子産生物を発現させる方法、およびリコンビナントプラスミドを対象の細胞に送達する方法は、当該分野の技術の範囲内である。例えばZeng et al. (2002), Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol, 20:446-448; Brummelkamp et al. (2002), Science 296:550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:497-500; Paddison et al (2002), Genes Dev. 16:948-958; Lee et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:500-505;および Paul et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:505-508を参照のこと。これら文献の全開示内容を本明細書において参照として援用する。例えばある種の態様において、ｍｉＲ遺伝子産生物を発現するプラスミドは、ＣＭＶ即時−早期プロモーターのコントロール下でｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする配列を包含することができる。本明細書において使用する場合、プロモーターの“コントロール下”は、ｍｉＲ遺伝子産生物をコードする核酸配列がプロモーターの３’に位置し、その結果プロモーターがｍｉＲ遺伝子産生物をコードする配列の転写を開始することができることを意味する。

ｍｉＲ遺伝子産生物はまた、リコンビナントウイルスベクターから発現させることができる。ｍｉＲ遺伝子産生物は、２つの別々のリコンビナントウイルスベクターから、または同一のウイルスベクターから産生させることができると考えられる。リコンビナントウイルスベクターから発現させたＲＮＡは、標準的な技術により培養細胞発現系から単離するか、または細胞（例えば癌細胞、骨髄増殖性障害を提示する細胞）内で直接発現させるかのいずれかとすることができる。

本発明の治療法のその他の態様において、ｍｉＲの発現を阻害する少なくとも１つの化合物の有効量を、被験者に投与することができる。本明細書において使用する場合、“ｍｉＲの発現を阻害すること”は、治療後にｍｉＲ遺伝子産生物の前駆体および/または活性な成熟した形の産生が、治療前に産生された量より少ないことを意味する。当業者は、例えば本明細書で考察したｍｉＲ転写物のレベルを決定するための技術を使用して、ｍｉＲの発現が細胞内で阻害されているかどうかを容易に決定することができる。阻害は、遺伝子の発現レベルで（すなわちｍｉＲ遺伝子産生物をコードするｍｉＲ遺伝子の転写を阻害することにより）、またはプロセシングのレベルで（例えば成熟した活性なｍｉＲへのｍｉＲ前駆体のプロセシングを阻害することにより）起こることができる。

本明細書において使用する場合、ｍｉＲの発現を阻害する化合物の“有効量”は、癌および/または骨髄増殖性障害に罹っている被験者における細胞の増殖を阻害するための十分量である。当業者は、所定の被験者に投与するｍｉＲ発現阻害化合物の有効量を、因子、例えば被験者のサイズおよび体重；疾患の浸透の程度；被験者の年齢、健康状態および性別；投与経路；ならびに投与が局所的または全身性であるかどうかを考慮することにより、容易に決定することができる。

当業者はまた、ｍｉＲの発現を阻害する化合物を所定の被験者に投与するための適当な投与計画を、本明細書に記載したように容易に決定することができる。ｍｉＲ遺伝子の発現を阻害するための適切な化合物として、二本鎖ＲＮＡ（例えば低分子干渉ＲＮＡまたは“ｓｉＲＮＡ”）、アンチセンス核酸、および酵素としてのＲＮＡ分子、例えばリボザイムを含む。これらの化合物は各々、所定のｍｉＲ遺伝子産生物を標的とし、標的ｍｉＲ遺伝子産生物の発現を（例えば翻訳を阻害することにより、開裂および/または分解を誘導することにより）妨害することができる。

例えば所定のｍｉＲ遺伝子の発現は、ｍｉＲ遺伝子産生物の少なくとも一部分との、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列相同性を有する、単離された二本鎖ＲＮＡ（“ｄｓＲＮＡ”）を用いて、ｍｉＲ遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導することにより阻害することができる。特定の態様において、ｄｓＲＮＡ分子は“低分子干渉ＲＮＡ”または“ｓｉＲＮＡ”である。

少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物の投与、またはｍｉＲ発現を阻害するための少なくとも１つの化合物の投与は、癌および/または骨髄増殖性障害を有する被験者における、細胞（例えば癌細胞、骨髄増殖性障害を提示する細胞）の増殖を阻害することになる。本明細書において使用する場合、“癌細胞、または骨髄増殖性障害を提示する細胞の増殖を阻害する”ことは、細胞を死滅させる、または細胞の成長を永久にもしくは一時的に抑止もしくは遅延させることを意味する。被験者の体内のそのような細胞の数が、ｍｉＲ遺伝子産生物もしくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物の投与後に一定であるか、または減少している場合、細胞増殖の阻害を推測することができる。癌細胞または骨髄増殖性障害を提示する細胞の増殖の阻害はまた、そのような細胞の絶対数は増加していても、腫瘍の成長速度が減少している場合にも、推測することができる。

ｍｉＲ遺伝子産生物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物はまた、あらゆる適切な経腸的または非経口の投与経路により被験者に投与することができる。本方法のための適切な経腸投与経路には、例えば経口、経直腸、または経鼻による送達を含む。適切な非経口経路には、例えば血管内投与（例えば静脈内ボーラス注射、静脈内点滴、動脈内ボーラス注射、動脈内点滴、および血管内へのカテーテル滴下注入）；組織周囲および組織内への注射（例えば腫瘍周囲および腫瘍内への注射、網膜内注射、または網膜下注射）；皮下注入（例えば浸透圧ポンプによる）を含む皮下注射または皮下設置(deposition)；例えばカテーテルまたはその他の設置デバイス（例えば網膜ペレット、または座剤、または多孔質、非多孔質、もしくはゼラチンの材料を包含するインプラント）による対象組織への直接投与、；および吸入、を含む。特に適切な投与経路は、注射、注入、および腫瘍内への直接注射である。

ｍｉＲ遺伝子産生物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、それらを被験者に投与する前に、当該分野の公知の技術に従って、時には“医薬剤”と呼ばれる医薬組成物として製剤化することができる。したがって本発明は、癌および/または骨髄増殖性障害を治療するための医薬組成物を包括的に含む。

本医薬組成物は、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（またはｍｉＲ遺伝子産生物もしくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を包含する少なくとも１つの核酸）（例えば０．１から９０重量％）、または生理学的に受容可能なその塩を、医薬的に受容可能な担体と混合して包含する。ある種の態様において本発明の医薬組成物は、付加的に１つまたはそれより多くの抗癌薬（例えば化学療法薬）を包含する。本発明の医薬製剤はまた、リポソームおよび医薬的に受容可能な担体によりカプセル化された、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（またはｍｉＲ遺伝子産生物もしくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を包含する少なくとも１つの核酸）を包含することができる。

本発明の医薬組成物はまた、従来の医薬用賦形剤および/または添加剤を包含することができる。適切な医薬用賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、バッファー、およびｐＨ調整剤を含む。適切な添加剤として、例えば生理学的に生物学的適合性のあるバッファー（例えばトロメタミン塩酸塩）、キレート剤（例えばＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ビスアミド）もしくはキレートカルシウム複合体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）の添加、または所望により、カルシウム塩もしくはナトリウム塩（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、もしくは乳酸カルシウム）の添加を含む。本発明の医薬組成物は、液体の形での使用のために梱包することができるし、または凍結乾燥することもできる。

本発明の固体医薬組成物用には、従来の非毒性の固体の医薬的に受容可能な担体；例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム、等を含むことができる。

例えば経口投与用の固体医薬組成物は、上に列記した担体および賦形剤のいずれか、および１０−９５％、好ましくは２５％−７５％の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（またはそれらをコードする配列を包含する少なくとも１つの核酸）を包含することができる。エアゾール（吸入）投与用の医薬組成物は、０．０１−２０重量％、好ましくは１重量％−１０重量％の、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（またはｍｉＲ遺伝子産生物もしくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を包含する少なくとも１つの核酸）を、上に記載したようなリポソーム内、および噴霧剤内に封入して包含することができる。担体はまた所望の場合には、例えば鼻腔内送達用のレシチンを含めることができる。

本発明の医薬組成物はさらに、１つまたはそれより多くの抗癌薬を包含することができる。特定の態様において当該組成物は、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（またはｍｉＲ遺伝子産生物もしくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を包含する少なくとも１つの核酸）、および少なくとも１つの化学療法薬を包含する。本発明の方法に適する化学療法薬として、ＤＮＡ−アルキル化薬、抗腫瘍性抗生物質、抗代謝薬、チューブリンの安定化剤、ホルモンのアンタゴニスト剤、トポイソメラーゼ阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬、ＮＭＧ−ＣｏＡ阻害薬、ＣＤＫ阻害薬、サイクリン阻害薬、カスパーゼ阻害薬、メタロプロテイナーゼ阻害薬、アンチセンス核酸、三重鎖ＤＮＡ、核酸アプタマー、ならびに分子的に修飾されたウイルス、細菌および外毒素の薬剤を含むが、これに限定されない。本発明の組成物に適する薬剤の例として、シチジンアラビノシド、メトトレキセート、ビンクリスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、デキサメタゾン、アルグラビン、シクロホスファミド、サルコリシン、メチルニトロソウレア、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ビンブラスチン、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、ミトマイシンＣ、過酸化水素、オキサリプラチン、イリノテカン、トポテカン、ロイコボリン、カルムスチン、ストレプトゾシン、ＣＰＴ−１１、タキソール、タモキシフェン、ダカルバジン、リツキシマブ、ダウノルビシン、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、イマチニブ、フルダラビン、ドセタキセル、およびＦＯＬＦＯＸ４を含むが、これに限定されない。

１つの態様において本方法は、検査薬を細胞に提供し、そして癌細胞内の減少した発現ルベルに関連する少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物のレベルを測定することを包含する。適切なコントロール（例えばコントロール細胞内のｍｉＲ遺伝子産生物のレベル）と比較して、細胞内でのｍｉＲ遺伝子産生物のレベルが増加することが、検査薬が抗癌薬であることを示す。

適切な薬剤には、薬剤（例えば低分子物、ペプチド）、および生体高分子（例えばタンパク質、核酸）を含むが、これに限定されない。薬剤は、リコンビナントにより、合成により製造することができるが、あるいは天然の原料から単離（例えば精製）してもよい。そのような薬剤を細胞に提供するための様々な方法（例えば形質導入）は、当該分野において周知されており、そのような方法のいくつかは本明細書でも上述している。少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産生物の発現を検出するための方法（例えばノーザンブロット法、in situハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、発現プロファイリング）もまた、当該技術分野において周知されている。これらの方法のいくつかもまた本明細書に記載する。

以下の非限定的な実施例を参照することにより本発明はより理解されることと思うが、これら実施例は本発明を説明するためであって、限定するために提示する訳ではない。
本明細書のデータは、活性化された単核食細胞およびＴＨＰ−１細胞が、新たに単離された単球の生存および分化を誘導する微小胞を放出することを示す。理論に拘束されることは望まないが、発見者らは本明細書において、特定の炎症性疾患のもとでは微小胞の含有量が変化して急速に反応を誘導するのではないかと考えている。データはまた、微小胞がヒト末梢血内を循環することを示す。循環血液中の微小胞は、正常な細胞の恒常性を制御し、組織の傷害および炎症の間には遠位の細胞への指示を循環する。

微小胞は、疾患の病因、および自然免疫反応の全身へのメディエーターに関するバイオマーカーとして、役立つものと思われる。したがって侵襲的方法により組織を得る代わりに、末梢血中の微小胞の単離を通して同様の情報を入手できることは、有益である。また末梢血中の微小胞の正常なシグネチャを理解することは、急性炎症イベント時のイベントを理解するための基盤を提供することにもなる。

また本明細書に示したように異常なマクロファージの分化は、免疫の恒常性の破壊をきたす。単球の成熟はＧＭ−ＣＳＦまたはＭ−ＣＳＦにより誘導されるため、発見者らは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦを介した分化の機序および相違点を理解する研究に着手した。Ｍ−ＣＳＦとは異なり、ＧＭ−ＣＳＦに対する応答における分化への傾倒は、急速で非可逆的であった（データは示していない）。わずか４時間の処置でマクロファージの分化が誘導されるため、持続的なＧＭ−ＣＳＦの刺激はこの効果に関しては必要ではなかった。同様の観察結果は、マクロファージの分化のモデルとして使用されるＰＭＡ処理したＴＨＰ１細胞においても得られた。

したがって発明者らは、分化を誘導する際に、シグナルを維持するか、または他の細胞を活性化して分化させるかのいずれかである少なくとも１つの因子が分泌されると特定した。それ故、単球またはＴＨＰ１細胞を、各々ＧＭ−ＣＳＦに４時間またはＰＭＡに１時間暴露させ、その後細胞を洗浄し、刺激物質を含まない最小培地に入れた。２４時間後、培養液の上清を集め、未分化の単球またはＴＨＰ１細胞に加えた。特に、ＰＭＡ処理したＴＨＰ１細胞の上清、またはＧＭ−ＣＳＦ処理した単球の上清は、単球およびＴＨＰ１細胞を分化させた（データは示していない）。

培養液上清中の２７種類までの異なるサイトカインを検出するためBioplex懸濁アレイシステムを使用したが、発見者らは原因となるサイトカインを検出することはできなかった。発見者らは、増殖因子非依存性のＴＨＰ１細胞株をＧＭ−ＣＳＦ刺激した単球の上清を用いて分化させたことから、サイトカイン/増殖因子がこの効果の原因ではないと結論した。発明者らは次に、微小胞が培養液上清中に分泌されて骨髄の成熟を仲介する可能性について調べた。

図１に示したように、ＧＭ−ＣＳＦで２４時間処理した単球は、未処理の単球（淡黒点）と比較して、培養液上清中に有意数の微小胞（黒点）を放出していた。
同様にＰＭＡ処理したＴＨＰ１細胞もまた、分化の間に微小胞を分泌した（データは示していない）。特に図１は、分化がマクロファージからの微小胞の放出を誘導したことを示す。末梢血単球（ＰＢＭ）は未処理のまま（淡黒点）、またはＧＭ−ＣＳＦで２４時間処理（黒点）した。細胞を含まない上清を集め、超遠心した。小胞をＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメトリーでサイズについて解析した。解析の前に、ＦＳＳおよびＳＳＣのパラメータを、２μｍスタンダードビーズを使用して調整した（示していない）。３名の異なるドナーからの代表的なデータを示す。

ＰＭＡ処理したＴＨＰ１細胞由来の微小胞を精製し、新たに単離した単球、または未分化のＴＨＰ１細胞のいずれかに加えた。形態的に示した（図２Ａ−２Ｃを参照のこと）ように、微小胞単独で、双方の細胞タイプにおいてマクロファージの分化、および表面抗原の発現を誘導した（データは示していない）。

これらの微小胞の含有物を解析した。発見者らは、ＰＭＡ処理したＴＨＰ１細胞由来微小胞内に、ｍｉＲＮＡの存在を検出した（データは示していない）。
発見者らはまた、正常なボランティアの末梢血中の循環する微小胞およびｍｉＲＮＡについても評価した。サイズに基づいて、発見者らは循環血液中の微小胞の３つの亜集団を発見した（図３Ａ）。マクロファージ由来微小胞は、マンノース受容体（ＣＤ２０６）およびＭＨＣ ＩＩを検出する抗体を使用して検出した（図３Ｂ）。血漿中の全微小胞のおよそ４０％（ゲート領域）が、ＣＤ２０６またはＭＨＣＩＩのいずれかの発現に基づき、マクロファージに由来する（図３Ｃ）。

発明者らはさらに、ｍｉＲＮＡが末梢血微小胞内に含有されているかどうかを決定した。我々は多数のｍｉＲＮＡの発現を検出した。最も高く検出されたｍｉＲＮＡを、表ＩＩＩを示す図８に示す（ｎ＝５１）。

特に、ｍｉＲ−１４６は末梢血中では検出されず、一方ｍｉＲ−１５５の発現は最も高発現のｍｉＲＮＡの８０分の１であった。ｍｉＲ−１４６およびｍｉＲ−１５５の双方とも我々のＩＰＦ患者サンプル中では上昇していたが、正常なドナー由来末梢血中では低くて検出されなかったことから、循環血液中のｍｉＲＮＡを検討することは、疾患のバイオマーカーとして役立つと思われる。

今回本明細書において、循環血液中の微小胞はｍｉＲＮＡを含有し、そして循環血液中微小胞が、ｍｉＲＮＡが細胞−対−細胞の情報交換を行うための手段を提供することができることを示す。ｍｉＲＮＡを収容する微小胞はまた、疾患の遺伝的基盤への洞察を提供することができ、予測バイオマーカーとして役立てることができる。

またマクロファージの分化の間に放出される微小胞は、未成熟細胞の成熟を仲介することができる。マクロファージの成熟時に集められた微小胞は、ヒト単球の分化および生存を仲介し、ＲＮＡを含有する。ｍｉＲＮＡおよびプロセシングされたｍＲＮＡの双方とも、未成熟細胞に成熟のシグナルを与える原因となる。

実施例−血漿
微小胞は、正常な健康な固体の血漿から単離する。微小胞およびマッチする単核細胞の双方からＲＮＡを単離し、リアルタイムＰＣＲにより４２０の公知の成熟ｍｉＲＮＡについてプロファイリングする。データセットの階層的クラスター解析は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および血漿微小胞間のｍｉＲＮＡ発現における有意差を示した。

我々は、微小胞およびＰＢＭＣで有意に発現された各々１０４および７５のｍｉＲＮＡについて観察した。特に３３のｍｉＲＮＡは、ＰＢＭＣと比較して微小胞において特異的に発現された。ｍｉＲＮＡのコンピュータによるモデリングを行い、検出されたｍｉＲＮＡにより制御される生物学的経路を決定した。血液由来微小胞で発現されたマイクロＲＮＡの大半は、血液細胞の細胞分化および代謝経路を制御すると予測された。興味深いことに選択された数種のマイクロＲＮＡは、免疫機能の重要なモジュレータであると予測される。

本実施例は、正常な被験者の循環血血漿の微小胞におけるｍｉＲＮＡの発現を同定し定義する初めての例である。
近年のエビデンスは、細胞間のｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの遺伝子交換が、エキソームを介しての伝達を通して達成される可能性があることを明らかにしている（PMID:17486113）。微小胞は、正常な健常な細胞タイプ、または損傷された細胞タイプにより放出されるエンドサイトーシス由来の小さなエキソソーム/小胞である（PMID: 17337785, PMID: 17409393, PMID: 16791265）。微小胞は細胞膜から細胞外環境に排出されて、細胞間の情報交換を促進する。これらの小さなサイズ（５０ｎｍから１μｍ）にもかかわらず、微小胞は生理活性分子内に濃縮され、核酸および/またはタンパク質を含有すると予想されている：これらの細胞粒子は、成長、分化、および癌の進行に一役を担う（PMID: 16453000）。末梢血において、２/３の微小胞は血小板に由来する。血小板由来微小胞は、血管新生および癌、例えば肺癌の転移拡大に一役を担う（PMID: 15499615）。血小板由来微小胞は、造血細胞、内皮細胞、および単核球細胞における遺伝子発現を制御することで免疫反応を誘導する（PMID: 17378242, PMID: 17127485）。

興味深いことに、微小胞とｍｉＲＮＡとの関係が近年構築されてきた。近年、Valadiおよび共同研究者らは、ヒトおよびマウスのマスト細胞株から放出される小胞が、１２００を越えるｍＲＮＡおよびおよそ１２１のｍｉＲＮＡ分子を含有することを報告した（PMID: 17486113）。反対に本発明は、自然の状態で生成されるヒト血漿および血液の微小胞が、ex vivoで生物学的効果を導くマイクロＲＮＡを含有していることに関する。

図８−表１は、マイクロＲＮＡが、癌および癌以外の適用を含むヒトの疾患において重要であることを示す。ヒト血漿微小胞において、疾患組織では発現が増加するが、正常には本来の低発現または検出できない発現を伴うマイクロＲＮＡ分子（表１、図６に示す）は、健康および疾患の変化を定義する機会を提供し、そして有効なバイオマーカーであってよい（太字、増加した発現の列）。同様に正常には豊富なマイクロＲＮＡが、組織内で観察される減少を反映して、ヒト血漿微小胞内で減少していてもよい（太字、減少した発現の列）。

かなりのエビデンスが、ヒト遺伝子系の不可避な礎石としてのｍｉＲＮＡの重要性を示している。遺伝子材料を伝達するために微小胞の使用を採り入れることは、ヒト体内での有効な伝達方法となるだろう。微小胞によるｍｉＲＮＡの伝達は、遠距離での情報交換を可能にすることだろう。

方法
血液の採集および微小胞の単離。末梢血（４０ｃｃ）は、インフォームドコンセント後２４名女性および２７名男性の健康な非喫煙白人ドナーから、ＥＤＴＡ試験管に採集した。血液の採集は、午前中および午後の早い時間のいずれかに行った。女性ドナー、ならびに男性ドナーの年齢の中央値は２９歳であった。末梢血は無菌低エンドトキシンＰＢＳで１：１希釈し、以前に記載されている（PMID: 16931806）ようにficoll-hypaque (d=1.077)上で層化し、遠心した。単核細胞画分はＰＢＳ中で１回洗浄した。微小胞は血漿から精製した。手短には小胞を１６０，０００×ｇ、１時間、４℃の遠心により濃縮した（PMID: 10648405）。

ＲＮＡ抽出。トリゾール(Invitrogen, Carlsbad, CA)抽出法により、総ＲＮＡを単離した。低分子ＲＮＡの収率を上げるため、ＲＮＡを一晩沈殿させた。ＲＮＡの濃度を決定し、Agilent 2100 バイオアナライザー(Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA)でのキャピラリー電気泳動によりＲＮＡの完全性(integrity)を決定した。単核細胞から単離したＲＮＡに関しては、９以上のＲＮＡ integrity number（ＲＩＮ）のみを使用した。微小胞においてはインタクトの１８ｓおよび２８ｓ ｒＲＮＡが可変的であったため、これらのサンプルに関してはＲＩＮで制限することはできなかった。

定量的ＰＣＲによるｍｉＲＮＡのプロファイリング。４２０の成熟ヒトｍｉＲＮＡの発現を、リアルタイムＰＣＲによりプロファイリングした。以前にに公開された逆転写条件（PMID: 18158130）を使用して、４２０の公知のヒト成熟ｍｉＲＮＡに対するループプライマーの混合物（Mega Plex kit, Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて刺激することにより、ＲＮＡ（５０ｎｇ）をｃＤＮＡに変換した。微小胞中の公知のコントロールｍｉＲＮＡがないため、いくつかの内部コントロールについて検討した。内部コントロール、すなわち低分子核小体（ｓｎｏ）ＲＮＡ Ｕ３８Ｂ、ｓｎｏＲＮＡ Ｕ６、低分子核（ｓｎ）ＲＮＡ Ｕ６、ならびに１８Ｓおよび５Ｓ ｒＲＮＡに対するプライマーを、プライマーの混合物中に含めた。

発現は、３８４ウェル反応プレートを装備したApplied Biosystems 7900HT リアルタイムＰＣＲ装置を使用してプロファイリングした。液体ハンドリングロボットおよびZymak Twisterロボットを使用して、スループットを増加し、エラーを低減した。リアルタイムＰＣＲは標準的な条件を使用して行った。

フローサイトメトリー。末梢血微小胞は、遠心により濃縮せずに直接血漿から免疫染色した。由来する細胞を決定するため、０．５ｃｃの血漿を抗体のパネルごとに免疫染色した。パネルＩは、ＣＤ６６ｂ−ＦＩＴＣ（好中球）、ＣＤ２０２ｂ（Ｔｉｅ２）−ＰＥ（内皮細胞）、ＣＤ２０６ ＰＥ−Ｃｙ５（マクロファージ/樹状細胞）、ＣＤ７９ａ−ＡＰＣ（Ｂ細細胞）およびＣＤ１４ Ｐｅ−Ｃｙ７（単球）を認識する抗体を含有した。パネルＩＩは、ＣＤ４１ａ−ＰＥ−Ｃｙ５（血小板）、ＣＣＲ２−ＡＰＣ（単球）、ＣＣＲ３−ＰＥ（樹状細胞）、ＣＣＲ５−ＰＥ−Ｃｙ７（マクロファージ）、およびＣＤ３−Ａｌｅｘａ６１０（Ｔ細胞）に対する抗体を含有した。パネルＩＩＩはアイソタイプのコントロール抗体を含有した。サンプルはBD Aria フローサイトメーター(BD Biosciences San Jose, CA)で解析した。データはゲートされた細胞のパーセントとして表した。

統計解析。バックグラウンドのノイズを低減するため、個々の観察結果の８０％が３５より高いＣＴ生スコアを有したｍｉＲＮＡは、データ解析時に除外した。内部コントロール（１８Ｓ、５Ｓ、ｓｎｏＲＮＡ Ｕ３８Ｂ、ｓｎｏＲＮＡ Ｕ４３、およびｓｎＲＮＡ Ｕ６）は血漿微小胞においては非常に可変的であり、同様に血漿微小胞 対 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における発現レベルも有意に異なった。

したがって、あるｍｉＲＮＡを正規化補正因子として使用することに起因するバイアスを低減し、そしてＲＴ−ＰＣＲアレイ間のサンプルの変動を低減するため、median normalization（中央値による正規化）解析を使用して、各アレイ上のｍｉＲＮＡ全体の発現に対する相対的発現に基づいて、血漿微小胞およびＰＢＭＣ間でｍｉＲＮＡを比較した（PMID: 16854228）。ドナーの性別および年齢をコントロールし、線形混合モデルを使用して、血漿微小胞およびＰＢＭＣ間での特異的なｍｉＲＮＡの差を見積もった。倍数変化は、見積もられた平均の差に基づいて算出した。

各組織に関するフィルタリング基準を満たしたｍｉＲＮＡを使用してヒートマップを作成し、ｍｉＲＮＡの相対的発現の平均に基づいて、ｍｉＲＮＡの階層的クラスタリングを行った。ｍｉＲＮＡの発現はまた、血漿微小胞およびＰＢＭＣに関するそれらのＣ生スコアに基づいてランクづけした。さらなる統計解析、例えばＡＮＯＶＡを行って、２つの処理群間で有意に発現されているｍｉＲＮＡを決定した。

経路の解析および予測。予測されるｍｉＲＮＡの標的は、miRanda (microrna.sanger.ac.uk/targets/v5/)を使用して決定した。miRandaアルゴリズムに基づき、各標的についてスコアを作成し、１７より大きいスコアのみをIngenuity Pathway Analysis ソフトウェア(Ingenuity Systems, Redwood City,CA)を使用してさらに解析した。このソフトウェアを使用して、基準の経路をｍｉＲＮＡの標的に基づいて決定した。データセットを検討して、ｍｉＲＮＡの標的の遺伝子オントロジーに基づいて関連する経路を決定した。

結果
末梢血微小胞の亜集団
最初に、正常な健康な被験者の末梢血中の微小胞の由来細胞を検討した。フローサイトメトリーを使用して、以前に報告された（PMID: 10648405）ように末梢血微小胞の大半が血小板由来であることを発見した（図４）。

我々はまた、単核細胞食細胞系列に由来する微小胞の第二の大きな集団についても観察した。単核食細胞上の表面抗原を検出する抗体を用いて、この集団を免疫染色した。特にわずかなパーセントの末梢血微小胞だけしか、Ｔ細胞および好中球に由来していなかった。Ｂ細胞に由来する小胞は検出できなかった（データは示していない）。興味深いことに、内皮細胞由来の表面抗原を発現する微小胞の小さな亜集団を検出した。

血漿微小胞およびＰＢＭＣにおけるｍｉＲＮＡの発現
ｍｉＲＮＡが、末梢血中の微小胞内コンパートメントに含有されていて、体内の異なる組織間の情報伝達を可能にし、遺伝子の変化に影響を及ぼすかどうかを検査するため、精製した血漿由来微小胞に関するｍｉＲＮＡプロファイリングを行った。２７名男性および２４名女性を包含する５１名の非喫煙の健康な個体に由来する微小胞のすべての亜集団について解析した。微小胞およびＰＢＭＣ間でｍｉＲＮＡの発現に違いがあるかどうかを決定するため、各ドナー由来ＰＢＭＣもまた精製した。リアルタイムＰＣＲ解析を行って、４２０のｍｉＲＮＡの発現について検討した。フィルタリングしたデータに、ＰＢＭＣおよび血漿サンプル間のｍｉＲＮＡ発現プロファイルを比較する階層的クラスター解析を行った（図５Ａ）。

３つを除くすべてのＰＢＭＣサンプルを、微小胞サンプルとは別にクラスター化したところ、２群間のｍｉＲＮＡ発現プロファイルが有意に異なることを示した。バックグラウンドのノイズを低減するフィルタリング基準に基づくと、微小胞およびＰＢＭＣサンプルにおいて各々１０４および７５のｍｉＲＮＡが発現されていることを発見した（図５Ｂおよび５Ｃ）。

これらのｍｉＲＮＡのうち、７１は各サンプル群で共有していた（図５Ｄ）。特に、２つのｍｉＲＮＡ、すなわちｍｉＲ−０３１および２９ｃのみがＰＢＭＣサンプル中だけで発現され、一方４つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２７、−１３４、−４８５−５Ｐ、および−４３２）は血漿画分において独自に発現されていた。血漿中で正常に発現された１０４ｍｉＲＮＡすべてを示す（表ＩＩ、図７に示す）。

年齢および性別の効果
いずれかのサンプル群からのｍｉＲＮＡ発現において、年齢および/または性別の効果は観察できなかった。特に、女性および男性双方のドナーの年齢の中央値は２９歳であった。最も高年齢の個体は５８歳であり、最も若年齢は２１歳であった。したがって差異を検討するためさらにデータを層別化した。年齢のマッチしたサンプル間の検討でも、ＰＢＭＣおよび微小胞サンプル間でｍｉＲＮＡ発現にいかなる有意な効果も明らかにされなかった。性別をコントロールして、我々はまた年齢の上位四分位点を年齢の下位四分位点と比較した。すなわち各群の平均年齢は各々４８．９±６．２歳および２１．９±１．２歳であった。しかし年齢に基づいてのサンプルセット間で、ｍｉＲＮＡ発現に有意差を検出することはできなかった（データは示していない）。

ＰＢＭＣおよび微小胞におけるｍｉＲＮＡ発現の比較
表ＩＩＩ、図８に、すべての個体に由来する血漿微小胞およびＰＢＭＣにおいて、最も高発現の１０のｍｉＲＮＡを示す。血漿に関する最も高発現の１０のｍｉＲＮＡは、高い方から順にｍｉＲ−２２３、−４８４、−１９１、−１４６ａ、−０１６、−０２６ａ、−２２２、−０２４、−１２６、および−３２である。一方ＰＢＭＣにおいては、ｍｉＲ−２２３、−１５０、−１４６ｂ、−０１６、−４８４、−１４６ａ、−１９１、−０２６ａ、−０１９ｂ、および−０２０ａが高く発現されていた。微小胞における最も高発現の１０のｍｉＲＮＡは、１００％の個体で検出された。しかしＰＢＭＣサンプルでは、ｍｉＲ−１５０（９８％のドナー）およびｍｉＲ−４８４（８９％のドナー）を除くすべてが１００％の個体で観察された。

我々はまた、これらｍｉＲの６つ（ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−２６ａ、およびｍｉＲ−１６）が、ＰＢＭＣおよび微小胞の双方において最も高発現の１０で共有されていることを発見した。特にｍｉＲ−２２３は、双方のコンパートメント内で最も顕著に発現されたｍｉＲである。各個体のドナーのランキング解析に基づいて、具体的なｍｉＲＮＡが最も高発現の１０のｍｉＲＮＡに挙げられる頻度を決定したところ、ｍｉＲ−２２３はＰＢＭＣおよび微小胞の双方において１００％の頻度であった。ｍｉＲ−４８６の発現は、血漿微小胞で最も高い１０のｍｉＲＮＡに挙げられているにもかかわらず、このｍｉＲＮＡは、プロファイリングした個体の２０％のみでしか最も高い１０に挙げられていないことを発見した。興味深いことに血漿微小胞において最も高発現のｍｉＲＮＡ群は、組織特異的なｍｉＲ群として同定できなかった。

我々はさらに、各々＞６６％および＞８８％という任意の値（データセットからのnatural cut-off）より大きなランキングスコアを持つ、微小胞およびＰＢＭＣのｍｉＲの集合的機能について検討した。この基準に基づいて、微小胞およびＰＢＭＣのサンプルから最も高い９にランクされたｍｉＲについて、さらに検討した。したがって、血漿で見出されたｍｉＲ−２２３、−４８４、−１９１、−１４６ａ、−０１６、−０２６ａ、−２２２、−０２４、および−１２６の組み合わせた機能を解析した。ＰＢＭＣに関しては、以下のｍｉＲＮＡ、すなわちｍｉＲ−２２３、−１５０、−１４６ｂ、−０１６、−４８４、−１４６ａ、−１９１、−０２６ａ、および−０１９ｂの組み合わせた機能を検討した。Sanger miRBase Target version 5を使用して、血漿微小胞に関する組み合わせたｍｉＲの、１５７８の予測される標的を見出した（データは示していない）。これらの組み合わせの標的についてコンピュータ解析を行って、それらが集合的に制御する経路を決定した。Ingenuity Pathway Analysis (IPA)ソフトウェアを使用し、獲得免疫系の代謝および制御に関与する基準の経路が、ｍｉＲＮＡで示されたこれらの発現により大きく制御されることを発見した（表ＩＶ、図９の上に示す）。

ＰＢＭＣ画分から検討した９のｍｉＲＮＡについて、１８５７の予測されるｍＲＮＡの標的を見出した（データは示していない）。最終的にこれらのｍｉＲＮＡにより制御される最も高い５の基準の経路は、とりわけ様々なアミノ酸および脂質の代謝経路である（表ＩＶ、図９の上に示す）。我々はまたSanger miRBase およびTargetScanから共通して予測される標的を見出し、それらの機能を決定した（表ＩＶ、図９の下に示す）。

次に、微小胞およびＰＢＭＣ間でどのｍｉＲＮＡが異なって発現されたかについて検討した。２０のｍｉＲＮＡが、微小胞サンプルと比較してＰＢＭＣ画分において３倍より高く発現された（表Ｖ、図１０に示す）。反対に、１５のｍｉＲＮＡは、ＰＢＭＣと比較して血漿微小胞において有意に発現されていた。

図１１：表ＶＩは、ＰＢＭＣおよび血漿において発現されたすべてのｍｉＲＮＡ（ディテクターの名称）に関する、正規化したデータの平均を各々の標準偏差と共に示す。
考察
これらの実施例において、発見者らは今回、末梢血中の正常な恒常的状態下でｍｉＲが微小胞内にて循環することを示す。本明細書において、１０４のｍｉＲが血漿微小胞内で発現され、そしてｍｉＲの発現はＰＢＭＣとは有意に異なっていたことを示す。今日までに多数の研究が、多くの細胞の機能を制御するｍｉＲの能力を示している。しかしながらこれらの研究はほとんど、ｍｉＲがそのホスト細胞内にとどまって効果を及ぼすことを意味している（PMID: 17923084）。我々のデータは、微小胞内に含有されたｍｉＲＮＡが、細胞の恒常性を制御するための遠位の細胞への情報伝達シグナルであると思われることを示すものである。

微小胞内のこれらのｍｉＲＮＡは、異なる組織の標的へと循環すると思われる。血漿微小胞内で最も高発現されたｍｉＲＮＡのさらなる検討は、これらの機能の多くが血球新生および細胞分化プログラムを制御することを示す（表ＩＩＩ、図８に示す）。例えばｍｉＲ−２２３の発現は、骨髄、顆粒球、および破骨細胞の分化を制御する（PMID: 18278031, PMID: 17471500, PMID: 16325577）。ｍｉＲ−２２３はまた造血幹細胞の増殖に一役を担っているようである（PMID: 18278031）。興味深いことにｍｉＲ−２２３は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）では喪失される（PMID: 18056805）。反対にｍｉＲ−１２６のダウンレギュレーションは巨核球の分化時に起こる（PMID: 16549775）。特にｍｉＲ−２４の発現は、血球新生の強力なポジティブおよびネガティブ制御因子であるＴＧＦ−βにより制御される（PMID: 16123808, PMID: 18353861）。微小胞内で発現されるｍｉＲ−２４およびｍｉＲ−１６は双方とも赤血球の産生を制御する（PMID: 17906079, PMID: 17976518）が、一方ｍｉＲ−１６はリンパ系の発生もまた調節する（PMID: 16616063）。ｍｉＲ−１６の発現の喪失は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）において広範に検討されている（PMID: 17327404, PMID: 17351108）。

血漿微小胞内で発現される多くのｍｉＲはまた、細胞周期の進行にかかわるタンパク質を制御する（PMID: 18365017 PMID: 17914108）。ｍｉＲ−２２２はｐ２７Ｋｉｐｌを標的とし（PMID: 17914108）、一方ｍｉＲ−２４はｐｌ６（ＩＮＫ４ａ）を抑制する（PMID: 18365017）。ｍｉＲ−１６の増加された発現は、結果的に細胞周期Ｇ０/Ｇ１期に細胞を蓄積することになる（PMID: 16123808）。反対に乳癌細胞におけるｍｉＲ−１２６の発現は細胞の増殖および腫瘍の成長を増大するが、転移を阻害する（PMID: 18185580）。このことは血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ１）を通して起こる（PMID: 18227515）。

他のｍｉＲが血漿微小胞内で高発現されるのとは異なり、ｍｉＲ−１４６ａは異なるレベルで機能するようである。ｍｉＲ−１４６ａは腫瘍抑制因子として作用し、このｍｉＲの喪失は前立腺癌の発症と関連することが示唆された（PMID: 18174313）が、ｍｉＲ−１４６ａは免疫機能もまた調節する（PMID: 16885212, PMID: 18057241）。血漿微小胞におけるこのｍｉＲの発現が、免疫制御機能を定義する可能性がある（表ＩＶ、図９に示す）。

標的の遺伝子オントロジーを検討するＩＰＡ解析に基づくと、ｍｉＲ−１４６ａの発現により影響を受けると予測される最大の関連ネットワークは、細胞の増殖、免疫系およびリンパ系の発生および機能である。加えてこのｍｉＲは、自然免疫反応を制御すると予測されている。この解析から我々は、ＬＰＳ/ＩＬ−１およびトール様受容体のシグナリングが、このｍｉＲ−１４６ａにより制御されると予測される最も高い５の基準経路の中にあることを発見した。

今日までｍｉＲ−４８４またはｍｉＲ−４８６の機能はわかっていない。ｍｉＲ−１４６ａと同様に、ｍｉＲ−４８４およびｍｉＲ−４８６も免疫反応のモジュレータとして機能するようである。特にｍｉＲ−４８４は、相対的発現に基づくと微小胞画分において２番目に高く発現されたｍｉＲである。予測モデリングは、このｍｉＲが複数の機能を有することを示している。微小胞内で発現された多くの他のｍｉＲの様に、ｍｉＲ−４８４は血球新生を制御すると予測される。特に、ＮＫ細胞シグナリング経路およびＩＬ−４シグナリング経路が、ｍｉＲ−４８４の標的であると予測されるが、一方ｍｉＲ−４８４は抗原提示を制御すると提唱されている。加えてｍｉＲ−４８６は、細胞の分化、増殖および成長も制御するようである。

我々は血漿微小胞内に１０４のｍｉＲを検出したが、プロファイリングした全ｍｉＲから検出できなかったものも多い。血漿微小胞内の検出できなかったｍｉＲもまた、疾患のバイオマーカーとして役立つかもしれない。近年Lawrieらは、Ｂ細胞リンパ腫の患者の血漿中にｍｉＲが検出されたことを報告した（PMID: 18318758）。この研究は、これらの患者由来血漿中でｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１０およびｍｉＲ−２１が上昇し、そしてｍｉＲ−２１が再発に相関することを示した。この研究に基づき、我々は正常な個体においてｍｉＲ−１５５およびｍｉＲ−２１を検出したが、ｍｉＲ−２１０は発見できなかった。興味深いことに我々は、血漿において７５％の個体がｍｉＲ−１５５を発現し、６０％がｍｉＲ−２１を発現することを発見した（データは示していない）。

したがって、疾患の予測マーカーとしてこれらのｍｉＲを使用するためには、各個体は疾患の検出の前にベースラインを必要とすることになる。したがってｍｉＲ−２１０の発現は、Ｂ細胞リンパ腫のより良いマーカーとして役立つものと思われる。さらなる関連性も存在すると思われる。例えばｍｉＲ−２０３は血漿微小胞には検出できない。このｍｉＲの上昇した発現は膀胱癌および結腸腺癌と関連しており、したがってバイオマーカーとして使用できると思われる（PMID: 18230780, PMID: 17826655）。

正常には発現されるがその後疾患にともなって喪失されるという逆の関係も、血漿ｍｉＲに関して存在すると思われる。例えば急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）において、ｍｉＲ−２２３はダウンレギュレートされる（PMID: 18056805）。ｍｉＲ−２２３は血漿微小胞内で発現される最も顕著なｍｉＲであるため、その減少した発現はＡＬＬの診断マーカーとして有用であると思われる。加えてｍｉＲ−１５ａ/１６は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）では喪失またはダウンレギュレートされる（PMID: 18362358）。我々は、ｍｉＲ−１６は検討したすべての健常な個体で発現されていたことを発見したが、ｍｉＲ−１５ａはプロファイリングした個体の４４％にしか発現されていなかった（データは示していない）。

我々が正常な個体の血液中に組織特異的なｍｉＲＮＡを検出しなかったことは興味深い（PMID: 18025253）。正常な個体からの微小胞の大半は、血液細胞に由来する。我々は、わずかなパーセントの内皮細胞由来の微小胞を実に検出した。この内皮細胞由来微小胞は、内皮細胞の損傷時に増加すると思われる。同様に、末梢血中の組織特異的ｍｉＲおよび微小胞の検出は、組織損傷時にしばしば起こるイベントであると思われる。腫瘍は微小胞を産生する（PMID: 16283305）ため、これらが末梢血中に検出されてもよい。

ｍｉＲが血漿中で検出されることが報告された（PMID:18318758）が、本発明は公知の血漿由来ｍｉＲすべての特徴づけを行った最初の研究である。本研究において我々は、人種を因子としてコントロールした。

末梢の体液および/または血液中のｍｉＲの存在、不在、またはレベルの変化を検査することは、様々な疾患について検討し、独特のｍｉＲＮＡプロファイルを同定し、そして疾患の予測因子であるバイオマーカーとして、有用となり得る。微小胞内に含有される循環血液中のｍｉＲは、血液細胞の恒常性の産生ならびに代謝機能を制御する上での、生命維持機能を有する。

明確に参照として援用しなかった本明細書に引用したすべての公開文献の関連技術を、それらの全内容において本明細書にて参照として援用する。本発明は、その好ましい態様に関して特に示し記載してきたが、当業者には、付記した請求項に包括的に含まれる本発明の範囲から離れることなく、形および詳細における様々な変更を行ってよいことは、理解されるものとする。

本発明を様々なそして好ましい態様に関して記載してきたが、当業者には、本発明の本質的な範囲から離れることなく、その要素について様々な変更を行ってよく、そして均等物を置き換えてよいことは、理解されなければならない。加えて、特定の状況または材料を本発明の技術に適応するために、本発明の本質的な範囲から離れることなく、多くの修飾を行ってよい。それ故本発明は、本発明を実行するために考慮された本明細書に開示された特定の態様に限定されないが、本発明は請求項の範囲内に収まるすべての態様を含むものとすることを意図する。

対象のｍｉＲは公開データベースに列記されている。ある種の好ましい態様において、公開データベースは、ｍｉＲ配列に命名の割り付けが行われ、同様に世界中のウェブサイトを介して到達でき、オンライン検索できるデータベース内の配列の保管場所でもあるSanger研究所www.http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/により提供される中心的レポジトリであることができる。一般にSanger研究所によりｍｉＲの配列について集められたデータは、種、原料、対応するゲノム配列およびゲノムの位置（染色体の座標）、ならびに完全長の転写産生物、および成熟した完全にプロセシングされたｍｉＲＮＡ（５’末端リン酸基を有するｍｉＲＮＡ）の配列を含む。もう１つのデータベースとして、アメリカのthe National Institutes of Health（国立衛生研究所）およびthe National Library of Medicine（国立医学図書館）により維持管理されている、National Center for Biotechnology Information （ＮＣＢＩ：国立生物工学情報センター）のウェブサイトを通してアクセスするGenBankデータベースが可能である。これらのデータベースをすべて本明細書において参照として援用する。

「参考文献」
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3. Jungi TW, Spycher MO, Nydegger UE, Barandun S. Platelet-leukocyte interaction: selective binding of thrombin-stimulated platelets to human monocytes,
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Claims (7)

1. 被験者における前立腺癌の診断または予後診断を補助するために、被験者に由来するサンプルを分析する方法であって、以下：
   ｉ）被験者の末梢血から単離した微小胞内の、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを決定する；そして
   ｉｉ）当該少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルをコントロールと比較する、ここで、コントロールのレベルと比較しての、当該少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルの増加が前立腺癌の診断または予後診断を補助するための指標である、
   を含み、
   ここで、ｍｉＲ−２１ならびに以下のｍｉＲ：ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５の少なくとも１つのレベルを決定する、前記方法。
2. 前立腺癌のためのバイオマーカーとしての単離微小胞の使用であって、当該バイオマーカーは、前立腺癌を有する被験者の末梢血中の微小胞から単離され、
   少なくとも以下のｍｉＲ：ｍｉＲ−２１が、単離微小胞内で、コントロール被験者と比較してアップレギュレートされ、そして少なくとも以下のｍｉＲ：ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５が、単離微小胞内で、コントロール被験者と比較してダウンレギュレートされる、前記使用。
3. コントロールが以下から成る群：
   ｉ）リファレンススタンダード；
   ｉｉ）前立腺癌を有していない被験者由来の単離微小胞内の当該少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベル；および
   ｉｉｉ）前立腺癌を提示していない被験者サンプル由来の単離微小胞内の当該少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベル
   より選択される、請求項１に記載の方法。
4. 被験者に由来するサンプルが、血漿を含む、請求項１に記載の方法。
5. 当該少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット解析、液相ハイブリダイゼーション法、および／またはマイクロアレイ解析によって測定される、請求項１または４に記載の方法。
6. 微小胞が、遠心により単離したものである、請求項１、４または５に記載の方法。
7. ｍｉＲ−２１が、単離微小胞内で、コントロール被験者と比較してアップレギュレートされ；そして以下のｍｉＲ：ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１４５の少なくとも１つが、単離微小胞内で、コントロール被験者と比較してダウンレギュレートされる、請求項１、４、５または６に記載の方法。