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JP2013542192A - マクロオートファジーの異常を伴う疾患の診断、予防、治療及びフォローアップのための、ｍｉＲＮＡの使用 - Google Patents

マクロオートファジーの異常を伴う疾患の診断、予防、治療及びフォローアップのための、ｍｉＲＮＡの使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、オートファジーの異常を伴う少なくとも１つの疾患の診断、予防、治療、並びに治療中及び治療後のフォローアップをオートファジー関連遺伝子及びタンパク質への作用を通じて行うための、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ファミリーに属する少なくとも１種のｍｉＲＮＡ（マイクロリボ核酸）又は該ｍｉＲＮＡの少なくとも１種の阻害剤の使用、並びにその方法である。
【選択図】図６

Description

本発明は、オートファジーを減弱、阻害又は刺激するための、特定のｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）ファミリーであるｈｓａ−ｍｉＲ−３７６、又はそれを阻害するために製造されたｍｉＲＮＡ阻害剤の使用に関する。
本発明は特に、オートファジーの異常を伴う少なくとも１つの疾患の診断、予防、治療、並びに治療中及び治療後のフォローアップを、オートファジー関連遺伝子の発現を制御することによって行うための、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｂ又は関連配列、及び該ｍｉＲＮＡの阻害剤の使用、並びにその方法に関する。
関連技術
オートファジーは、二重膜小胞又は多重膜小胞におけるバルクな細胞質、タンパク質及びオルガネラの隔離、並びに細胞自身のリソソーム／液胞系へのそれらの送達及び該リソソーム／液胞系によるその後の分解により特徴づけられる（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２００２）。この生物学的現象は、非欠乏条件下でのすべての細胞型（酵母から哺乳動物まで）において低い基礎レベルで生じ、恒常性維持機能（例えば、タンパク質の分解、オルガネラの代謝回転）を果たす。オートファジーは、細胞ストレス（例えば、栄養素又は成長因子の欠乏）に至る条件下で急速にアップレギュレートされ、細胞内の構成ブロック及びエネルギー生成基質の代替源を提供する（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２００２）。
初期の形態学に基づく研究は哺乳動物の細胞及び組織で行われたが、オートファジーを調節する遺伝子は酵母において発見された。少なくとも３０個のＡＴＧ（オートファジー）遺伝子（以前はＡＰＧ遺伝子、ＡＵＴ遺伝子及び／又はＣＶＴ遺伝子と呼ばれていた。）が酵母からクローニングされ、ＡＴＧ遺伝子のタンパク質生成物はオートファジープロセスの様々な段階（例えば、小胞の核形成、拡大、オートファジー小胞の後期エンドソーム／リソソームへの融合、及びカーゴの分解）に関与していることが示された（Ｇｏｚｕａｃｉｋ， Ｋｉｍｃｈｉ ２００４； Ｏｈｓｕｍｉ ２００１）。ＡＴＧ遺伝子の一部の哺乳動物オルソログはクローニングされ、その機能は哺乳動物系で実際に保存されていた（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．２００２）。
酵母モデルと同様に、哺乳動物のオートファジー経路は様々なタンパク質複合体の作用を経る。例えば、Ａｔｇ１／Ｕｌｋ１−２タンパク質複合体は、成長因子シグナル及び栄養状態センサーのＴｏｒｃ１複合体からオートファジー経路へシグナルを中継する（Ｖｅｌｌａｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．２００９）。複合体ｍＴｏｒの主要タンパク質の不活性化はオートファジーの刺激をもたらす。オートファジー小胞の形成における他の重要な事象は、隔離膜と呼ばれるオートファジー小胞核形成中心におけるＶｐｓ３４ホスホイノシトール３−キナーゼ複合体による、ホスファチジルイノシトール３−リン酸の生成及び蓄積である（Ｆｕｒｕｙａ Ｎ ｅｔ ａｌ．２００５）。Ｖｐｓ３４複合体の活性は、Ｂｅｃｌｉｎ１を含む幾つかのタンパク質により開始される。オートファジー経路の主要タンパク質の１つであることから、Ｂｅｃｌｉｎ１のｍＲＮＡ及びタンパク質量はオートファジーの活性化中に一般にアップレギュレートされ（Ｒａｍｉ ｅｔ ａｌ．２００８）、このタンパク質のノックアウト又はノックダウンは様々な系においてオートファジーを阻害する。
２つのユビキチン様コンジュゲーション系がオートファジー小胞の生合成に関与する。１つはＡｔｇ１２系からなり、Ａｔｇ１２は、ユビキチン化と同様にＡｔｇ５にコンジュゲートする（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．１９９８）。コンジュゲーション反応は、Ｅ１様酵素（Ａｔｇ７と呼ばれる。）によるＡｔｇ１２の活性化により開始する。その後、Ａｔｇ７によるＡｔｇ１２のＥ２様酵素（Ａｔｇ１０と呼ばれる。）への転移が続く（Ｓｈｉｎｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｔａｎｉｄａ ｅｔ ａｌ．１９９９）。最終的に、Ａｔｇ１２は、Ａｔｇ１２のカルボキシ末端グリシンがＡｔｇ５タンパク質の中心部のリジン残基に共有結合することによってＡｔｇ５にコンジュゲートする。Ａｔｇ１２／Ａｔｇ５コンジュゲーションは、Ａｔｇ１２／Ａｔｇ５及びＡｔｇ１６を含有するより大きいタンパク質複合体の形成及び安定化に関与する（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．１９９９； Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．２００３ａ）。Ａｔｇ１６（哺乳動物におけるＡｔｇ１６Ｌ）は、そのコイルドコイルドメインを介してホモオリゴマー化する能力を有する。Ａｔｇ１２／Ａｔｇ５／Ａｔｇ１６複合体は、第２のユビキチン化様反応においてＥ３様酵素として働く。
第２の反応において、Ａｔｇ８（又は哺乳動物ＬＣ３）は、脂質分子のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）にコンジュゲートする（ｌｃｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２０００）。このコンジュゲーション反応を起こすために、Ａｔｇ８／ＬＣ３タンパク質は、翻訳時にカルボキシ末端の一部の切断による加工を受けなければならない。この加工に関与するプロテアーゼはＡｔｇ４タンパク質（Ａｔｇ４ａ−ｃ）である（Ｋｉｒｉｓａｋｏ ｅｔ ａｌ．２０００）。Ａｔｇ４によるＡｔｇ８／ＬＣ３の切断によりカルボキシ末端グリシンが露出される。Ｅ１様タンパク質Ａｔｇ７及びＥ２様タンパク質Ａｔｇ３の作用に続いて、Ａｔｇ８／ＬＣ３タンパク質のカルボキシ末端グリシンはＰＥのアミノ基にコンジュゲートする。このコンジュゲーションにより、本来は細胞質型／膜表面結合型であるＡｔｇ８／ＬＣ３が膜と密に結合する（Ｋｉｒｉｓａｋｏ ｅｔ ａｌ．１９９９）。脂質化反応は可逆的であり、Ａｔｇ４プロテアーゼ（ユビキチン脱コンジュゲーション酵素のようにも作用する。）はＡｔｇ８／ＬＣ３とＰＥとの間のアミド結合を切断でき、Ａｔｇ８／ＬＣ３の再生利用を可能とする。
Ａｔｇ９タンパク質の再生利用、及びＡｔｇ１８、Ａｔｇ２等のタンパク質との相互作用もまた、脂質分子の輸送において果たしている可能性がある役割を通じて、オートファジー小胞の核形成及び伸張での重要な事象と考えられている（Ｒｅｇｇｉｏｒｉ Ｆ ｅｔ ａｌ．２００４）。
上記タンパク質複合体の協調的な作用を介して、オートファジー小胞の核形成、膜の伸張、カーゴの補充、二重膜オートファゴソームの形成がなされる。オートファゴソームは後期エンドソーム又はリソソームと融合し、オートリソソームを形成する。特定の因子がこのステップに関与している。Ｖｐｓ複合体及びＲａｂ ＧＴＰａｓｅタンパク質が融合部位の組織化に関与している。そして、ＳＮＡＲＥタンパク質（ＳＮＡＰ（可溶性ＮＳＦ接着タンパク質）受容体）（Ｄａｒｓｏｗ Ｔ １９９７）が、２つのオルガネラ間の架橋として働く複合体を形成する。膜は融合してオートリソソームを形成し、カーゴはリソソームに送達される。
リソソーム／液胞の内腔において、Ａｔｇ１５等のリパーゼは残りのオートファジー膜をまず分解し、次いでカーゴがリソソーム溶解酵素で分解される（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．２００７）。小胞の分解に続いて、構成ブロックがさらなる使用のためにサイトゾルに輸送される。特殊なリソソーム膜タンパク質（例えば、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２）はこのプロセスに関与している。
オートファジーは、肝障害、筋障害、神経変性疾患、心疾患、老化、ミオパチー、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患、虚血性疾患、免疫不全症、糖尿病、軸索損傷、リソソーム蓄積症、神経系疾患、腎疾患、癌等の疾患においても重要な役割を果たしている（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．２００８； Ｃｕｅｒｖｏ ＡＭ ２００４）。神経変性疾患に関しては、オートファジーが、蓄積された異常タンパク質を除去して恒常性を回復するのに関与している可能性があること、及び／又はオートファジーが神経細胞死に寄与している可能性があることが指摘されている（Ｇｏｚｕａｃｉｋ， Ｋｉｍｃｈｉ ２００４； Ｓｈｉｎｔａｎｉ， Ｋｌｉｏｎｓｋｙ ２００４）。癌において、オートファジー及びおそらくオートファジー細胞死は、腫瘍形成中は不活性である重要な腫瘍抑制機構である（Ｇｏｚｕａｃｉｋ， Ｋｉｍｃｈｉ ２００４； Ｏｈｓｕｍｉ ２００１）。逆説的に、腫瘍型に応じて、オートファジーは、急速な増殖及び不完全な血管新生により課せられた虚血状態下での腫瘍細胞の生存にも関与している可能性がある。さらに、オートファジーは、バクテリア、ウイルス等の細胞内寄生生物に対する重要な細胞防御システムを構成する（Ｓｈｉｎｔａｎｉ， Ｋｌｉｏｎｓｋｙ ２００４）。したがって、オートファジーのメカニズム及びその病的状態との関係に対する研究は極めて重要である。
最近の研究では、幾つかのオートファジー関連タンパク質が癌、クローン病等の疾患に直接関係づけられている。例えば、Ｂｅｃｌｉｎ１は癌関連オートファジー遺伝子の周知の例である。マウスにおけるＢｅｃｌｉｎ１のヘテロ接合性欠失は、自発性及び誘発性の腫瘍形成率の増加をもたらした。単一対立遺伝子Ｂｅｃｌｉｎ１の欠失は乳癌及び卵巣癌の４０〜７５％で観察された（Ａｉｔａ ｅｔ ａｌ．１９９９）。ヒト上皮性乳癌細胞において、内因性Ｂｅｃｌｉｎ１タンパク質の発現が低レベルであることが見出された。すなわち、内因性Ｂｅｃｌｉｎ１タンパク質の発現低下は乳房悪性腫瘍の発現／進行に寄与しているものと思われた（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９９）。Ｂｅｃｌｉｎ１の発現低下は子宮頸部扁平上皮癌細胞及び上皮性卵巣癌細胞においても観察された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００６； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００７）。ヒト脳腫瘍におけるＢｅｃｌｉｎ１タンパク質及びｍＲＮＡの発現量に関する研究では、Ｂｅｃｌｉｎ１が脳腫瘍においてダウンレギュレートすることが示された（Ｍｉｒａｃｃｏ ｅｔ ａｌ．２００７）。他の研究では、Ｂｅｃｌｉｎ１遺伝子は、大腸癌細胞株においてｍＲＮＡ及びタンパク質の発現量に応じて腫瘍の増殖を阻害することが示された（Ｋｏｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．２００７）。オートファジータンパク質Ａｔｇ１６Ｌ及びＩＲＧＭ遺伝子の異常はクローン病（炎症性腸疾患）と関連していることが見出された（Ｐａｌｏｍｉｎｏ−Ｍｏｒａｌｅｓ ＲＪ ｅｔ ａｌ．２００９）。さらなる研究では、Ａｔｇ１６Ｌ又はＡｔｇ５欠損腸は、クローン病患者で観察された粘膜防御異常に寄与する異常なＰａｎｅｔｈ細胞を宿すことが示唆された（Ｃａｄｗｅｌｌ Ｋ ｅｔ ａｌ．２００８）。
ｍｉＲＮＡは、細胞増殖、幹細胞分裂、アポトーシス等の様々な基本的生物学的プロセスを制御する遺伝子発現の負の調節因子の１つである（Ａｍｂｒｏｓ Ｖ ２００４）。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ転写物の安定性を変化させることによって、及び／又はリボソームによるタンパク質翻訳を阻害することによって作用する（Ｌｅｗｉｓ ＢＰ ｅｔ ａｌ．２００５）。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ遺伝子クラスターからｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして合成される。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのサイズは、数百ヌクレオチドから数千ヌクレオチドと様々である。核では、Ｄｒｏｓｈａ及びＰａｓｈａ／ＤＧＣＲ８によるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの処理によって、フランキング配列を有するステムループ構造からなる約６０〜７０塩基長のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが生成される。Ｅｘｐｏｒｔｉｎ５及びＲａｎ−ＧＴＰによる細胞質への輸送後、Ｄｉｃｅｒタンパク質によるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの処理によって、約２２ヌクレオチドの小さいＲＮＡ二本鎖が生成される。次いで、ｍｉＲＮＡ二本鎖（ｄｓ−ｍｉＲＮＡ）の誘導鎖はＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードされる。次いで、成熟ｍｉＲＮＡにより誘導されたＲＩＳＣは、その３’ＵＴＲ領域にしばしば見出されるｍｉＲＮＡ結合部位を介してｍＲＮＡを標的とし、その翻訳抑制又は分解をもたらす。このようにして、ｍｉＲＮＡは、その標的遺伝子及びタンパク質の転写及び／又は翻訳を調節し、生理学的及び病理学的イベントを組織化する。
これまで、哺乳動物系におけるｍｉＲＮＡとオートファジーとの関係についての研究で公表されているものは１つしかない。この研究において、Ｚｈｕ等は、Ｂｅｃｌｉｎ１遺伝子とｍｉＲ−３０ａとの直接的相互作用を示した（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．２００９）。
ｍｉＲＮＡとオートファジーとの関係のさらなる理解は、オートファジーの異常を伴う疾患の制御に寄与するであろう。ｍｉＲＮＡが治療標的となる可能性がある理由は、例えば下記の通りである。
・ｍｉＲＮＡは、有機分子及び天然のアンチセンス相互作用物質である。
・ｍｉＲＮＡ発現プロファイルが病状を診断するのに使用可能であり、ダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡが疾患の開始及び発現に寄与する。
・ｍｉＲＮＡは、幾つかの遺伝子の発現を直ちに組織化することによって生物学的及び病理学的プロセスを制御・調節する能力を有する。
・ヒト疾患を模倣するマウスモデルにより、ｍｉＲＮＡが様々な疾患で重要な役割を果たし、治療用分子として使用可能であることが示されている（Ｍｅｌｎｉｋｏｖａ Ｉ ２００７）。
・ｍｉＲＮＡの小さいサイズ（２２〜２４ヌクレオチド長）及びその有機性により、ｍｉＲＮＡは医薬品開発にとって非常に魅力的である。
関連技術を特許文献に求めると、ｍｉＲＮＡ及び疾患に関する幾つかの出願が見出される。例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１１３５７７号には、ｍｉＲ１４５核酸が内因性ＩＲＳ−１の３’ＵＴＲに特異的に結合し、結腸細胞の増殖を抑制又は阻害することが開示されている。すなわち、ｍｉＲ１４５核酸は結腸癌を治療するために使用できる。さらに、米国特許出願公開第２０１０／００１００７３号には、心疾患の診断、予防及び／又は治療のためのｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の使用について記載されている。さらに、米国特許出願公開第２０１０／０４８６７４号には、ｍｉＲ−１８１ａは、Ｎｏｔｃｈ経路及びｐｒｅ−ＴＣＲ経路の負の調節因子を協調的に減少させることによってＮｏｔｃｈ経路とｐｒｅ−ＴＣＲ経路との間の活性シグナル伝達を支持することができることから、Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病の治療標的として使用可能であることが記載されている。しかし、これらの出願はいずれも、ｍｉＲＮＡとオートファジーとの疾患治療関係については開示していない。
本出願は、特定のｍｉＲＮＡファミリー又はその阻害剤を介した複数のレベルでのオートファジー経路の調節を示した最初の知見を提示する。
明らかにされる特定のｍｉＲＮＡファミリーはｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ファミリーである。ｍｉＲ−３７６ファミリーは、Ｄｌｋｌ／Ｇｔｌ２領域と呼ばれるヒト染色体１４ｑ３２のｍｉＲＮＡクラスター領域によりコードされる。ｍｉＲ−３７６ホモログはマウスにも存在し、マウス第１２染色体の遠位端に位置する（Ｋｉｒｃｈｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．２００８； Ｓｅｉｔｚ Ｈ ｅｔ ａｌ．２００４）。ｍｉＲ−３７６ ＲＮＡは様々な胎児及び成体組織において発現する（Ｓｅｉｔｚ Ｈ ｅｔ ａｌ．２００４； Ｐｏｙ ＭＮ ｅｔ ａｌ．２００４）。
本発明の主な目的は、細胞のオートファジーを阻害することである。すなわち、過剰なオートファジーにより生じる疾患の診断、予防又は治療が可能となる。他方、本発明の他の態様は、本発明のｍｉＲＮＡの阻害剤で該ｍｉＲＮＡを抑制することによりオートファジーを開始して、細胞のオートファジーの欠損により生じる疾患を制御することである。
本発明は特に、オートファジーの異常を伴う少なくとも１つの疾患の診断、予防、治療、並びに治療中及び治療後のフォローアップを、オートファジー関連遺伝子の発現を制御することによって行うための、ｍｉＲＮＡ及び該ｍｉＲＮＡの阻害剤の使用、並びにその方法に関する。
ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｂの過剰発現はオートファジーを阻害できる。 ｍｉＲＮＡスクリーニング装置。上部パネル：９６ウェルプレートシステム中、ＭＣＦ−７細胞をｍｉＲＮＡで一時的にトランスフェクトした。各ｍｉＲＮＡを２つ組で試験した。完全培地をＥＢＳＳと交換することによって飢餓を誘発した。下部パネル：２時間の飢餓後のＧＦＰ−ＬＣ３ドット形成のパーセンテージを観測した。各条件について１５０〜２００個の細胞を測定した。ＧＦＰ−ＬＣ３ドット陽性細胞のパーセンテージのグラフにより、飢餓（ＳＴＶ）後、対照レベルからの２倍の増加が示されたが、この増加はｍｉＲＮＡ過剰発現により阻害された（ｎ＝４）。 ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｂの過剰発現はオートファジーを阻害できる。 オートファジー関連ＬＣ３−ＩＩ形成をｍｉＲ−３７６ｂにより減弱させた。遊離ＬＣ−Ｉ型の減少及びＬＣ３−ＩＩ型の蓄積は、対照ｍｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞（ＣＮＴ）における飢餓（ＳＴＶ）後のオートファジーの活性化を示していた。対照的に、ｍｉＲ−３７６ｂの過剰発現により、プロセスが逆転し、オートファジーが阻害されたが、これは、より高いレベルのＬＣ３−Ｉ及び比較的低いレベルのＬＣ−ＩＩが非飢餓状態及び（より顕著には）飢餓（ＳＴＶ）状態のいずれでも存在したことを反映していた。 ｍｉＲ−３７６ｂは、ＭＣＦ−７乳癌細胞においてＡｔｇ４ｃ及びＢｅｃｌｉｎ１を標的とする。 Ａ． Ａｔｇ４ｃ及びＢｅｌｉｎ１の３’ＵＴＲにおける推定ｍｉＲ−３７６ｂ結合配列（ｍｉＲ応答エレメント，ＭＲＥ）（ＳＡＮＧＥＲアルゴリズムにより特定）を示す図。 Ｂ． 対照でトランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞（ＣＮＴ）又はｍｉＲ−３７６ｂでトランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞（ｍｉＲ−３７６ｂ）における、Ａｔｇ４ｃ及びＢｅｃｌｉｎ１のｍＲＮＡ量の定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析。Ａｔｇ４ｃ（左）及びＢｅｃｌｉｎ１（右）のｍＲＮＡ量は、非飢餓状態及び飢餓状態のいずれにおいてもｍｉＲ−３７６ｂの発現後有意に減少した（ｎ＝３）。ｑＰＣＲデータは、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量を用いて標準化されている。 Ｃ及びＤ． Ａｔｇ４ｃ及びＢｅｃｌｉｎ１のタンパク質量はｍｉＲ−３７６発現後に減少した。 Ｃ． 非飢餓状態又は飢餓（ＳＴＶ）状態の対照トランスフェクション細胞（ＣＮＴ）又はｍｉＲ−３７６ｂトランスフェクション細胞（ｍｉＲ−３７６ｂ）の免疫ブロット。βアクチンをローディングコントロールとして使用した。 Ｄ． ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いたＣの免疫ブロットの濃度分析（Ｂｅｃｌｉｎ１ではｎ＝５；Ａｔｇ４Ｃではｎ＝３）。 ｍｉＲ−３７６ｂは、Ｈｕｈ−７肝細胞癌細胞においてＡｔｇ４ｃ及びＢｅｃｌｉｎ１を標的とする。 Ａ． 対照でトランスフェクトしたＨｕｈ−７細胞（ＣＮＴ）又はｍｉＲ−３７６ｂでトランスフェクトしたＨｕｈ−７細胞（ｍｉＲ−３７６ｂ）における、Ａｔｇ４ｃ及びＢｅｃｌｉｎ１のｍＲＮＡ量の定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析。Ａｔｇ４ｃ（左）及びＢｅｃｌｉｎ１（右）のｍＲＮＡ量は、非飢餓状態及び飢餓状態のいずれにおいてもｍｉＲ−３７６ｂの発現後有意に減少した（ｎ＝３）。ｑＰＣＲデータは、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量を用いて標準化されている。 Ｂ及びＣ． Ａｔｇ４ｃ及びＢｅｃｌｉｎ１のタンパク質量はｍｉＲ−３７６ｂの発現後に減少した。 Ｂ． 非飢餓状態又は飢餓（ＳＴＶ）状態の対照トランスフェクション細胞（ＣＮＴ）又はｍｉＲ−３７６トランスフェクション細胞（ｍｉＲ−３７６）の免疫ブロット。βアクチンをローディングコントロールとして使用した。 Ｃ． ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いたＣでの免疫ブロットの濃度分析（Ｂｅｃｌｉｎ１及びＡｔｇ４Ｃのいずれにおいてもｎ＝３）。 推定ｍｉＲ−３７６結合部位は、Ａｔｇ４Ｃ及びＢｅｃｌｉｎ１に対する観察されたｍｉＲＮＡの作用に関わる。 Ａ． ｐＧＬ３ベクター中のレポーターホタルルシフェラーゼの３’ＵＴＲにおいてクローニングされたＡｔｇ４ｃ ＭＲＥ（上部配列）又はその変異型（下部配列）の配列を示す図。 Ｂ． ｐＧＬ３ベクター中のレポーターホタルルシフェラーゼの３’ＵＴＲにおいてクローニングされたＢｅｃｌｉｎ１ ＭＲＥ（上部配列）又はその変異型（下部配列）の配列を示す図。 Ｃ． 野生型又は変異型のＡｔｇ４ｃルシフェラーゼコンストラクトと、対照（ＣＮＴ）又はｍｉＲ−３７６（ｍｉＲ−３７６）のプラスミドと、でコトランスフェクトした細胞からの抽出物における、標準化されたルシフェラーゼ活性。 Ｄ． 野生型又は変異型のＢｅｃｌｉｎ１ルシフェラーゼコンストラクトと、対照（ＣＮＴ）又はｍｉＲ−３７６（ｍｉＲ−３７６）のプラスミドと、でコトランスフェクトした細胞からの抽出物における、標準化されたルシフェラーゼ活性。ルシフェラーゼ活性は、コトランスフェクトされたウミシイタケルシフェラーゼ活性に標準化されている。 内因性ｍｉＲ−３７６ｂに対するアンチｍｉＲＮＡ（アンタゴマー）はＡｔｇ４ｃ及びＢｅｃｌｉｎ１のｍＲＮＡ量の増加をもたらした。対照アンタゴマー（ＣＮＴ）で又はｍｉＲ−３７６ｂに対するアンタゴマー（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）でトランスフェクトした非飢餓（Ｎｏ−ＳＴＶ）細胞における、Ａｔｇ４ｃ（左）及びＢｅｃｌｉｎ１（右）のｍＲＮＡ量を示すグラフ。結果は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対する倍率変化で示されている。 オートファジーにおけるｍｉＲ−３７６ｂの作用を示す概略図である。
発明の詳細な説明
本発明は、オートファジーの異常を伴う少なくとも１つの疾患の診断、予防、治療、並びに治療中及び治療後のフォローアップを単独で又は疾患の他の従来の治療法と組み合わせて行うための、ｍｉＲ−３７６ファミリーに属する少なくとも１種のｍｉＲＮＡ（マイクロリボ核酸）又は該ｍｉＲＮＡの少なくとも１種の阻害剤の使用に関する。
本発明は、オートファジーの異常を伴う少なくとも１つの疾患の診断、予防、治療、並びに治療中及び治療後のフォローアップを行うためのオートファジー制御方法にも関する。下記は該方法のステップである。
・ｍｉＲ−３７６ファミリーに属する少なくとも１種のｍｉＲＮＡ又は前記ファミリーに属するｍｉＲＮＡの少なくとも１種の阻害剤を、前記オートファジーが生じている細胞に供給するステップ
・前記ｍｉＲＮＡ又はその阻害剤を用いてオートファジーを阻害又は開始するステップ
疾患が過剰なオートファジーに由来する場合、上記方法は、
ｍｉＲ−３７６ファミリーに属する少なくとも１種のｍｉＲＮＡの過剰量を、前記過剰なオートファジーが生じている細胞又は生体に供給するステップと、
少なくとも１つのオートファジー関連遺伝子を抑制するステップと、
前記遺伝子を制御下に置くことにより過剰なオートファジーを阻害するステップと、
を含む。
疾患がオートファジーの欠如又は欠損に由来する場合、上記方法は、
ｍｉＲ−３７６ファミリーに属するｍｉＲＮＡの少なくとも１種の阻害剤の過剰量を、オートファジーの欠損を有する細胞に供給するステップと、
前記ｍｉＲＮＡを抑制するステップと、
オートファジー関連遺伝子が抑制されないようにするステップと、
前記オートファジー関連遺伝子を用いてオートファジーを開始するステップと、
を含む。
上記方法において、ｍｉＲＮＡは１２〜１７０ヌクレオチド長である。上記ｍｉＲＮＡは、裸の合成ＲＮＡ又は化学的に修飾された合成ＲＮＡである。化学的に修飾された合成ＲＮＡの場合、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）及び２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＰＥＧ、末端逆位ｄＴ塩基、フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ又は４’−Ｓ−ＦＡＮＡ）又はアラビノ核酸（ＡＮＡ）、ラウリン酸、リトコール酸及びコレステロール誘導体、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される化学的部分で修飾されている。
ｍｉＲ−３７６ファミリーの上記ｍｉＲＮＡは、配列番号１及び配列番号２に記載のヌクレオチド配列のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、ｄｓｍｉＲＮＡ及びそれらのフラグメント若しくは変異体を含む。上記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７６ｂであるか、あるいは該ｍｉＲＮＡ（例えば配列番号２）の２１連続ヌクレオチドと少なくとも約７０％同一の配列を有するＲＮＡ中に存在する配列のいずれかに相補的なＲＮＡであることが好ましい。
他方、上記ｍｉＲＮＡ阻害剤は、ｍｉＲ−３７６ファミリーのｍｉＲＮＡを標的とする少なくとも１種の核酸分子（例えばアンタゴマー）である。ｍｉＲＮＡ阻害剤分子は１２〜３０ヌクレオチド長であり、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、ｄｓｍｉＲＮＡ及びフラグメント若しくは変異体の連続５’→３’配列に少なくとも７０％相補的である５’→３’配列を含む。
上記ｍｉＲＮＡ阻害剤は、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）及び２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＰＥＧ、末端逆位ｄＴ塩基、フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ又は４’−Ｓ−ＦＡＮＡ）又はアラビノ核酸（ＡＮＡ）、ラウリン酸、リトコール酸及びコレステロール誘導体、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される修飾部分を含む。
ｍｉＲＮＡ及びその阻害剤はいずれも、好ましくは、単離された核酸によりコードされたものである。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ前駆体分子又はアンチｍｉＲＮＡをコードするＤＮＡ分子も本発明の範囲内である。核酸は、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子又は核酸アナログ分子（例えば、糖又は骨格修飾リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド）から選択できる。しかし、他の核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ））も適している。単離された核酸はベクターに結合されてもよく、ここで、ベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルス及び人工染色体からなる群から選択される。
ｍｉＲＮＡにより抑制されるオートファジー関連遺伝子は、Ｂｅｃｌｉｎ１（Ａｔｇ６）及びＡｔｇ４Ｃの少なくとも１つである。診断、予防又は治療が所望される疾患は、神経変性疾患、癌、心疾患、肝疾患、老化、ミオパチー、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患、虚血性疾患、免疫不全、糖尿病、軸索損傷、リソソーム蓄積症及び神経系疾患からなる群から選択される。以下に説明される実験及び得られた結果は、特に癌細胞（中でも乳癌細胞、肝癌細胞）に対する効果を証明するものである。
ｍｉＲＮＡが罹患組織に対して用いられる場合、ｍｉＲＮＡは、リポソーム、ポリマーナノ粒子、コレステロールコンジュゲート、シクロデキストラン複合体、ポリエチレンイミンポリマー若しくはタンパク質複合体に含まれた状態で、又はウイルス若しくはウイルス様粒子に組み込まれた状態で投与されてもよく、あるいは静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、腹腔内、経膣、経肛門、経口、眼内若しくは髄腔内投与されてもよい。
実験操作：
オートファジーを調節するｍｉＲＮＡを見つけ出すために、ＭＣＦ−７乳癌細胞の無作為スクリーニングを、ＧＦＰ融合Ａｔｇ８／ＬＣ３（ＧＦＰ−ＬＣ３）をオートファジーマーカーとして用いて行った。ＭＣＦ−７乳癌細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン）が添加されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｉｅｓ）中、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。
次いで、細胞を、４４３ヒトｍｉＲＮＡの１つ又は対照ｈＴＲ（ヒトテロメラーゼｍＲＮＡ）を担持するプラスミドと共にＧＦＰ−ＬＣ３マーカープラスミドでコトランスフェクトした。完全培地で増殖した細胞において、ＧＦＰ融合ＬＣ３は拡散性の細胞質／核染色を示した。オートファジー刺激（例えば、血清、アミノ酸及びグルコース飢餓）を、添加剤なしの平衡緩衝液（ＥＢＳＳ）を用いて得た後、ＧＦＰ−ＬＣ３ドットが細胞質に出現したが、これはＬＣ３タンパク質がオートファジー小胞に補充されたことを反映している。ヒトｍｉＲＮＡを二つ組で細胞にトランスフェクトし、飢餓誘導性ＧＦＰ−ＬＣ３ドット形成（図１Ａ）、ひいてはオートファジーを一貫して阻害するｍｉＲＮＡを選択した。
飢餓によるオートファジーの誘導を強力に阻害することから、ｍｉＲＮＡの１つが特に選択された。このｍｉＲＮＡはｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｂ（又は簡単にｍｉＲ−３７６ｂ）と呼ばれ、ｍｉＲ−３７６ｍｉＲＮＡファミリーに属するものである。ＭＣＦ−７乳癌細胞におけるその後の試験により、このｍｉＲＮＡのオートファジー阻害作用を示す最初のスクリーニング結果が確認された（図１Ａ及びＢ）。
オートファジーの調節に関連する潜在的ｍｉＲ−３７６標的を見つけ出すために、一般に入手可能なバイオインフォマティクスツールの組み合わせを用いてｍｉＲＮＡ結合部位を予測した。
各々異なるパターンを有するアルゴリズムＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．２００５）（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ／）、ｍｉｃｒｏＴ（Ｍａｒａｇｋａｋｉｓ Ｍ ｅｔ ａｌ．２００９）、ＭｉｒＧａｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｅｗｈａ．ａｃ．ｋｒ／ｍｉＲＧａｔｏｒ／ｍｉＲＧａｔｏｒ．ｈｔｍｌ）、ｍｉＲＧｅｎ（Ｍｅｇｒａｗ Ｍ ｅｔ ａｌ．２００６）、ＰＩＴＡ（標的接近可能性による相互作用の確率）（Ｋｅｒｔｅｓｚ ｅｔ ａｌ．２００７）及びｍｉＲａｎｄａ（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉｏ．ｍｓｋｃｃ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｉｒｎａｖｉｅｗｅｒ／ｍｉｒｎａｖｉｅｗｅｒ．ｐｌ）を用いてｍｉＲＮＡと標的との相互作用（例えば、進化的保存性、エネルギー、接近可能性）を調べることによって、予測ｍｉＲＮＡ標的の分析を行った。
バイオインフォマティクス解析により、Ｂｅｃｌｉｎ１及びＡｔｇ４Ｃの遺伝子が潜在的ｍｉＲ−３７６ｂ標的として明らかになった。Ｂｅｃｌｉｎ１及びＡｔｇ４Ｃがいずれも実際にｍｉＲ−３７６ｂ標的であることを確認するために、それらの発現についてｑＰＣＲ試験及び免疫ブロッティングを行った。ＭＣＦ７乳癌細胞を、ｍｉＲ−３７６ｂ又は対照ｈＴＲをコードするプラスミドでトランスフェクトし、完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）又は飢餓培地（アール平衡塩類溶液，ＥＢＳＳ）で増殖させた。Ｂｅｃｌｉｎ１及びＡｔｇ４ＣのｍＲＮＡ量をｑＰＣＲ試験により分析した。図２Ｂ（Ｂｅｃｌｉｎ１、Ａｔｇ４Ｃ）に示されるように、ｍｉＲ−３７６ｂでの過剰発現により、完全培地又は飢餓培地で増殖したＭＣＦ−７細胞の両オートファジータンパク質のｍＲＮＡ量はダウンレギュレートされた（対照ｍｉＲＮＡではそうならなかった）。タンパク質量がｍｉＲＮＡの発現により影響を受けたかどうかを確認するために、Ｂｅｃｌｉｎ１又はＡｔｇ４Ｃに対する特異的抗体を用いて免疫ブロッティングを行った（図２Ｃ及びＤ）。これらの免疫ブロッティングにより、いずれのオートファジータンパク質に関しても、タンパク質量はｍｉＲ−３７６ｂの過剰発現の影響を受けることが示された。
ｍｉＲＮＡの作用が細胞型特異的でないことを証明するために、Ｈｕｈ−７肝細胞癌細胞株において同様のｑＰＣＲ及び免疫ブロッティングを行った。ＭＣＦ−７細胞の場合と同様に、Ｂｅｃｌｉｎ１及びＡｔｇ４ｃのｍＲＮＡ量（図３Ａ）は、ｍｉＲ−３７６ｂでトランスフェクトしたＨｕｈ−７細胞において有意に低下した。Ｂｅｃｌｉｎ１及びＡｔｇ４ｃ（図３Ｂ及びＣ）のタンパク質量は、ｍｉＲ−３７６ｂでトランスフェクトした細胞において減少した（対照プラスミドでトランスフェクトした細胞ではそうならなかった）。
これらの結果はすべて、ｍｉＲ−３７６ｂが、オートファジー経路の２つの主要タンパク質であるＢｅｃｌｉｎ１及びＡｔｇ４Ｃの発現を調節することによってオートファジーを阻害することを示している。ｍｉＲ−３７６ｂは、両タンパク質のｍＲＮＡ量に影響を与えることによりオートファジーを阻害した。Ｂｅｃｌｉｎ１及びＡｔｇ４Ｃタンパク質量の減少はｍＲＮＡ量に対する作用の結果であり得るが、タンパク質翻訳に対する該ｍｉＲＮＡのさらなる作用が存在した可能性は排除できない。
ｍｉＲＮＡシード領域と、３’ＵＴＲ領域におけるその対応配列（シードマッチ配列）と、の間の部分的な塩基対形成による安定な相互作用はｍｉＲＮＡの作用にとって極めて重要である。幾つかの不安定化変異を、ＢＥＣＬＩＮ１又はＡＴＧ４Ｃの３’ＵＴＲの推定ｍｉＲＮＡ結合部位においてシードマッチ配列に挿入し、これらの変異型ｍｉＲ−３７６結合部位又は野生型配列をｐＧＬ３哺乳動物発現ベクター中のルシフェラーゼｃＤＮＡの３’ＵＴＲ領域にクローニングした（それぞれ図４Ａ及びＢ）。
細胞にトランスフェクトすると、ルシフェラーゼ活性はバックグラウンドレベルより数ログ分増加した。野生型ＢＥＣＬＩＮ１（図４Ｃ）又はＡＴＧ４Ｃ（図４Ｄ）の３’−ＵＴＲを含有するルシフェラーゼコンストラクトと共発現させると、ｍｉＲ−３７６ｂはルシフェラーゼ発現を劇的に減弱できた（標準化ルシフェラーゼ活性により測定）。
対照的に、ＢＥＣＬＩＮ１又はＡＴＧ４Ｃの変異型３’−ＵＴＲに融合したルシフェラーゼコンストラクトはｍｉＲ−３７６ｂの作用に不応性であった。これらの結果は、オートファジータンパク質の発現に対するｍｉＲ−３７６ｂの作用は直接的であり、ＢＥＣＬＩＮ１及びＡＴＧ４Ｃの３’−ＵＴＲ領域に見出されたｍｉＲＮＡ結合配列を必要とすることを示している。
サイレンシング内因性ｍｉＲＮＡがＢｅｃｌｉｎ１及びＡｔｇ４Ｃの量に影響を及ぼすかどうかを調べるために、ｍｉＲ−３７６ｂに対するアンタゴマーを設計した。細胞をアンタゴマーでトランスフェクトした。
ｍｉＲ−３７６ｂアンタゴマー又は対照アンタゴマーでトランスフェクトされた細胞を完全培地又は飢餓培地でインキュベートし、ｑＰＣＲを用いてＢｅｃｌｉｎ１又はＡｔｇ４ｃ（図５）のｍＲＮＡ量を調べた。アンタゴマー３７６ｂのトランスフェクションにより両オートファジータンパク質のｍＲＮＡが増加し、その作用は飢餓後により顕著であった。これらの結果は、内因性ｍｉＲ−３７６ｂが細胞のＢｅｃｌｉｎ１及びＡｔｇ４ｃの量を制御することを示している。
実際、Ｂｅｃｌｉｎ１は主要なオートファジータンパク質であり、幾つかの独立したグループによる報告は、Ｂｅｃｌｉｎ１のノックアウト又はノックダウンが、様々な刺激により活性化されるオートファジーを強力に阻害することを示している。上述のように、普遍的に発現するタンパク質Ｂｅｃｌｉｎ１は、哺乳動物細胞においてｈＶｐｓ３４／クラスＩＩＩ ＰＩ３Ｋに結合し、オートファジーを調節する（Ｌｉａｎｇ ＸＨ ｅｔ ａｌ．１９９９； Ｆｕｒｕｙａ Ｎ ｅｔ ａｌ．２００５）。さらに、Ｂｅｃｌｉｎ１はＢｃｌ−２ファミリーのメンバー（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ）を結合することが示され、Ｂｃｌ−２タンパク質量とＢｅｃｌｉｎ量とのバランスはオートファジーの活性化に影響を与えることが示された（Ｐａｔｔｉｎｇｒｅ Ｓ ｅｔ ａｌ．２００５）。このタンパク質のダウンレギュレーション又はＢｃｌ−２非含有Ｂｅｃｌｉｎの割合の変更は初期段階のオートファゴソーム形成を阻害する（Ｈａｍａｓａｋｉ Ｍ，Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ Ｔ ２０１０）。
他方、Ａｔｇ４Ｃ／ａｕｔｏｐｈａｇｉｎ３は、Ａｔｇ８／ＬＣ３及び他のＡｔｇ８様タンパク質（すなわち、ＧＡＴＥ−１６、ＧＡＢＡＲＡＰ）のプロセシング及び脂質化に関与するシステインプロテアーゼ（Ａｔｇ４ａ、ｂ、ｃ）のファミリーに属する。Ａｔｇ４タンパク質はヒト組織において普遍的に発現する（Ｍａｒｉｎｏ Ｇ ｅｔ ａｌ．２００３）。Ａｔｇ４タンパク質は、オートファジー及びオートファジー小胞の流れの重要な調節因子でもある（Ｓｈｏｕｖａｌ Ｒ ｅｔ ａｌ．２００７）。実際、Ａｔｇ４Ｃのノックアウトはオートファジーの阻害をもたらした（Ｍａｒｉｎｏ Ｇ ｅｔ ａｌ．２００７）。
上述の知見は、ｍｉＲ−３７６ｂがオートファジーの活性を制限できることを示している。ｍｉＲ−３７６ｂは、Ｂｅｃｌｉｎ１及びＡｔｇ４ｃのｍＲＮＡ量及びタンパク質量を減少させることによりオートファジーの活性を制限する。実際、ｍｉＲ３７６ｂは、Ｂｅｃｌｉｎ１及びＡｔｇ４ｃのｍＲＮＡに対する直接的作用を通じてＢｅｃｌｉｎ１及びＡｔｇ４ｃの量に影響を与えた。これは、これらの遺伝子の３’ＵＴＲが機能的及び特異的ｍｉＲ−３７６ｂ結合部位を有し、それらの変異体がｍｉＲＮＡの作用の大きさを減少させたことによる。さらに、上記ｍｉＲＮＡの阻害剤（アンタゴマー）は関連ｍｉＲＮＡの作用を抑制でき、標的の量を増加させた。ｍｉＲ−３７６ｂ（又はその誘導体）又はアンチｍｉＲＮＡ（例えばアンタゴマー）の使用は、医療目的でオートファジーを調節・操作することを可能とし、ひいては、新規の診断、治療及びフォローアップの方法を提供するか、及び／又はオートファジーの異常を伴う前述の疾患に対して用いられている現在のプロトコルを改善する可能性を有する。
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４７． Ｃａｄｗｅｌｌ Ｋ， Ｌｉｕ ＪＹ， Ｂｒｏｗｎ ＳＬ， Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｈ， Ｌｏｈ Ｊ， Ｌｅｎｎｅｒｚ ＪＫ， Ｋｉｓｈｉ Ｃ， Ｋｃ Ｗ， Ｃａｒｒｅｒｏ ＪＡ， Ｈｕｎｔ Ｓ， Ｓｔｏｎｅ ＣＤ， Ｂｒｕｎｔ ＥＭ， Ｘａｖｉｅｒ ＲＪ， Ｓｌｅｃｋｍａｎ ＢＰ， Ｌｉ Ｅ， Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ Ｎ， Ｓｔａｐｐｅｎｂｅｃｋ ＴＳ， Ｖｉｒｇｉｎ ＨＷ ４ｔｈ． Ｎａｔｕｒｅ ２００８；４５６（７２１９）：２５９−６３
４８． Ｐｏｙ ＭＮ， Ｅｌｉａｓｓｏｎ Ｌ， Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ Ｊ， Ｋｕｗａｊｉｍａ Ｓ， Ｍａ Ｘ， Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ＰＥ， Ｐｆｅｆｆｅｒ Ｓ， Ｔｕｓｃｈｌ Ｔ， Ｒａｊｅｗｓｋｙ Ｎ， Ｒｏｒｓｍａｎ Ｐ， Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｍ． Ｎａｔｕｒｅ ２００４；４３２（７０１４）：２２６−３０
配列：
Figure 2013542192
Figure 2013542192

Claims (23)

  1. オートファジーの異常を伴う少なくとも１つの疾患の診断、予防、治療、並びに治療中及び治療後のフォローアップを単独で又は疾患の他の従来の治療法と組み合わせて行うための、ｍｉＲ−３７６ファミリーに属する少なくとも１種のｍｉＲＮＡ（マイクロリボ核酸）又は前記ｍｉＲＮＡの少なくとも１種の阻害剤の使用。
  2. 前記疾患が過剰なオートファジーにより生じる場合に、前記ｍｉＲＮＡはオートファジーを阻害するために用いられることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
  3. 前記ｍｉＲＮＡは、少なくとも１つのオートファジー関連遺伝子を抑制してオートファジーを阻害するために用いられることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
  4. 前記疾患がオートファジーの欠如又は欠損から生じる場合に、前記ｍｉＲＮＡ阻害剤はオートファジーを活性化するために用いられることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
  5. 前記ｍｉＲＮＡ阻害剤は、ｍｉＲＮＡ−３７６ファミリーの少なくとも１種のｍｉＲＮＡを抑制してオートファジーを開始するために用いられることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
  6. オートファジーの異常を伴う少なくとも１つの疾患の診断、予防、治療、並びに治療中及び治療後のフォローアップを行うためのオートファジー制御方法であって、
    ｍｉＲ−３７６ファミリーに属する少なくとも１種のｍｉＲＮＡ又は前記ファミリーに属するｍｉＲＮＡの少なくとも１種の阻害剤を、前記オートファジーが生じている細胞に供給するステップと、
    前記ｍｉＲＮＡ又はその阻害剤を用いてオートファジーを阻害又は開始するステップと、
    を含むことを特徴とする方法。
  7. 前記疾患が過剰なオートファジーに由来する場合に、該方法は、
    ｍｉＲ−３７６ファミリーに属する少なくとも１種のｍｉＲＮＡの過剰量を、前記過剰なオートファジーが生じている細胞又は生体に供給するステップと、
    少なくとも１つのオートファジー関連遺伝子を抑制するステップと、
    前記遺伝子を制御下に置くことにより過剰なオートファジーを阻害するステップと、
    を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
  8. 前記疾患がオートファジーの欠如又は欠損に由来する場合に、該方法は、
    ｍｉＲ−３７６ファミリーに属するｍｉＲＮＡの少なくとも１種の阻害剤の過剰量を、オートファジーの欠如又は欠損を有する細胞に供給するステップと、
    前記ｍｉＲＮＡを抑制するステップと、
    オートファジー関連遺伝子が抑制されないようにするステップと、
    前記オートファジー関連遺伝子を用いてオートファジーを開始するステップと、
    を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
  9. Ｂｅｃｌｉｎ１及びＡｔｇ４ｃの少なくとも１つである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のオートファジー関連遺伝子。
  10. １２〜１７０ヌクレオチド長である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ。
  11. 配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含むか、あるいは配列番号１のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、ｄｓｍｉＲＮＡ及びフラグメント若しくは変異体からの２１連続ヌクレオチドと少なくとも約７０％同一の配列を有するＲＮＡ中に存在する配列のいずれかに相補的なＲＮＡを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ。
  12. 裸の合成ＲＮＡである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ。
  13. 化学的に修飾された合成ＲＮＡである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ。
  14. 前記合成ＲＮＡは、ホスホロチオエート、ボラノホスフェート、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）及び２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＰＥＧ、末端逆位ｄＴ塩基、フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ又は４’−Ｓ−ＦＡＮＡ）又はアラビノ核酸（ＡＮＡ）、ラウリン酸、リトコール酸及びコレステロール誘導体、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される化学的部分で修飾されている、請求項１３に記載のｍｉＲＮＡ。
  15. ｍｉＲ−３７６ｂである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ。
  16. リポソーム、ポリマーナノ粒子、コレステロールコンジュゲート、シクロデキストラン複合体、ポリエチレンイミンポリマー又はタンパク質複合体に含まれた状態で投与される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ。
  17. 生体の罹患組織に直接投与されるか、又は静脈内、皮下、筋肉内、経鼻、腹腔内、経膣、経肛門、経口、眼内若しくは髄腔内投与される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ。
  18. 少なくとも１種の核酸分子である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
  19. １２〜３０ヌクレオチ長である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
  20. ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、ｄｓｍｉＲＮＡ及びフラグメント若しくは変異体の連続５’→３’配列に少なくとも７０％相補的である配列を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
  21. ２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）及び２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、ＰＥＧ、末端逆位ｄＴ塩基、フルオロ−β−ｄ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡ又は４’−Ｓ−ＦＡＮＡ）又はアラビノ核酸（ＡＮＡ）、ラウリン酸、リトコール酸及びコレステロール誘導体、並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される修飾部分を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ阻害剤。
  22. 神経変性疾患、癌、心疾患、肝疾患、老化、ミオパチー、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患、虚血性疾患、免疫不全、糖尿病、軸索損傷、リソソーム蓄積症及び神経系疾患からなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の疾患。
  23. 乳癌又は肝癌である、請求項２２に記載の疾患。
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