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JP4425141B2 - 非小細胞肺癌の診断のための方法 - Google Patents

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Description

本出願は、2002年9月30日に提出された米国特許出願第60／414,673号、2003年2月28日に提出された米国特許出願第60／451,374号、および2003年4月28日に提出された米国特許出願第60／466,100号と関連し、これらは参照として本明細書に組み入れられる。
技術分野
本発明は生物科学の分野に関し、より詳細には癌研究の分野に関する。特に、本発明は、非小細胞肺癌の診断方法、およびこの種の癌細胞において発現が亢進または低下している遺伝子に関する。
背景技術
肺癌は、最も一般的な致命的ヒト腫瘍の一つである。肺癌の発症および進行に付随してみられる多くの遺伝子変化が報告されている。遺伝子変化は、予後の取り組みおよび転移リスクまたは特定の治療に対する応答の予測の一助となりうるが、単一または限られた数の分子マーカーに関する情報では非小細胞肺癌（NSCLC）の臨床的診断を下すのに十分な結果が得られないことが一般的である（Mitsudomiら、Clin Cancer Res 6: 4055-63 (2000)；Niklinskiら、Lung Cancer. 34 Suppl 2: S53-8 (2001)；Watine, Bmj 320: 379-80 (2000)）。非小細胞肺癌（NSCLC）は最も一般的な病型であり、肺腫瘍の80％近くを占める（Society, A. C. Cancer Facts and Figures 2001, 2001）。集学的治療法の最近の進歩にもかかわらず10年全生存率は10％程度と低いが、これはNSCLCの大半が進行した病期になるまで診断されないためである（Fry, W.A., Phillips, J.LおよびMenck, H.R.、Ten-year survey of lung cancer treatment and survival in hospitals in the United States: a national cancer data base report、Cancer. 86: 1867-76., 1999）。プラチナを基盤とする化学療法措置がNSCLCの治療に関して基準となる標準治療法と見なされているが、これらの薬剤は進行したNSCLC患者の生存期間を約6週間しか延長させることができない（Chemotherapy in non-small cell lung cancer: a meta-analysis using updated data on individual patients from 52 randomised clinical trials、Non-small Cell Lung Cancer Collaborative Group、Bmj. 311: 899-909、1995）。チロシンキナーゼ阻害薬を含むさまざまな標的指向性療法がこの疾患に対して研究中であるが、これまでに有望な成績が得られたのはごく限られた数の患者のみであり、幾人かのレシピエントには重篤な有害反応が生じている（Kris M, N.R, Herbst RS、A phase II trial of ZD1839 ('Iressa') in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) patients who had failed platinum- and docetaxel-based regimens (IDEAL 2)、Proc Am Soc Clin Oncol. 21: 292a(A1166)、2002）。
cDNAマイクロアレイ技術により、正常細胞および悪性細胞における遺伝子発現の包括的プロファイルを得ること、ならびに悪性細胞および対応する正常細胞における遺伝子発現を比較することが可能になった（Okabeら、Cancer Res 61: 2129-37 (2001)；Kitaharaら、Cancer Res 61: 3544-9 (2001)；Linら、Oncogene 21: 4120-8 (2002)；Hasegawaら、Cancer Res 62: 7012-7 (2002)）。このアプローチは癌細胞の複雑な性質を明らかにすることを可能にし、発癌の機序を解明する一助となる。腫瘍において脱制御される遺伝子の同定は、個々の癌のより正確で間違いのない診断、および新規な治療標的の開発につながる可能性がある（BienzおよびClevers、Cell 103: 311-20 (2000)）。腫瘍の基礎をなす機序を全ゲノム的な観点から解明するため、ならびに診断および新規治療薬の開発のための標的分子を探索するために、本発明者らは、23040種の遺伝子を含むcDNAマイクロアレイを用いて腫瘍細胞の発現プロファイルを分析してきた（Okabeら、Cancer Res 61: 2129-37 (2001)；Kitaharaら、Cancer Res 61: 3544-9 (2001)；Linら、Oncogene 21: 4120-8 (2002)；Hasegawaら、Cancer Res 62: 7012-7 (2002)）。
発癌の機序を明らかにする目的で計画された研究により、抗腫瘍薬の分子標的を同定することは既に容易である。例えば、Ras（その活性化は翻訳後ファルネシル化に依存する）が関係する増殖シグナル伝達経路を阻害するために当初開発されたファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（FTI）は、動物モデルにおけるRas依存性腫瘍の治療に有効であった（Heら、Cell 99: 335-45 (1999)）。抗癌剤と、原癌遺伝子受容体HER2/neuに拮抗するための抗HER-2モノクローナル抗体トラスツズマブ（trastuzumab）を併用したヒトに対する臨床試験が実施されており、乳癌患者の臨床効果および全般的な生存率の改善が達成されている（Linら、Cancer Res 61: 6345-9 (2001)）。bcr-abl融合タンパク質を選択的に不活性化するチロシンキナーゼ阻害剤STI-571は、bcr-ablチロシンキナーゼの構成的活性化が白血球のトランスフォーメーションに決定的な役割を果たす、慢性骨髄性白血病の治療を目的として開発された。これらの種類の薬剤は、特定の遺伝子産物の発癌活性を抑制する目的で設計されている（Fujitaら、Cancer Res 61: 7722-6 (2001)）。このため、癌細胞で高頻度に上方制御される遺伝子産物は、新規抗癌剤を開発するための標的候補として役立つ可能性がある。
CD8+細胞障害性Tリンパ球（CTL）は、MHCクラスI分子上に提示された腫瘍関連抗原（TAA）に由来するエピトープペプチドを認識して、腫瘍細胞を溶解することが示されている。TAAの最初の例としてMAGEファミリーが発見されて以来、他の多くのTAAが免疫学的アプローチを用いて発見されている（Boon、Int J Cancer 54: 177-80 (1993)；Boonおよびvan der Bruggen、J Exp Med 183: 725-9 (1996)；van der Bruggenら、Science 254: 1643-7 (1991)；Brichardら、J Exp Med 178: 489-95 (1993)；Kawakamiら、J Exp Med 180: 347-52 (1994)）。発見されたTAAのいくつかは現在、免疫療法の標的として臨床開発の段階にある。これまでに発見されたTAAには、MAGE（van der Bruggenら、Science 254: 1643-7 (1991)）、gp100（Kawakamiら、J Exp Med 180: 347-52 (1994)）、SART（Shichijoら、J Exp Med 187: 277-88 (1998)）およびNY-ESO-1（Chenら、Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8 (1997)）が含まれる。一方、腫瘍細胞において特異的に過剰発現されることが示された遺伝子産物は、細胞性免疫応答を誘導する標的として認識されることが示されている。このような遺伝子産物には、p53（Umanoら、Brit J Cancer 84: 1052-7 (2001)）、HER2/neu（Tanakaら、Brit J Cancer 84: 94-9 (2001)）、CEA（Nukayaら、Int J Cancer 80: 92-7 (1999)）などが含まれる。
TAAに関する基礎研究および臨床研究の著しい進歩にもかかわらず（Rosenbegら、Nature Med 4: 321-7 (1998)；Mukherjiら、Proc Natl Acad Sci USA 92: 8078-82 (1995)；Huら、Cancer Res 56: 2479-83 (1996)）、結腸直腸癌を含む腺癌の治療のための候補となるTAAの数は非常に限られている。癌細胞で大量に発現されると同時にその発現が癌細胞に限定されるTAAは、免疫治療の標的として有望な候補になると考えられる。さらに、強力かつ特異的な抗腫瘍免疫応答を誘発する新たなTAAの同定は、様々な種類の癌におけるペプチドワクチン接種の臨床使用を促すと考えられる（Boonおよびcan der Bruggen、J Exp Med 183: 725-9 (1996)；van der Bruggenら、Science 254: 1643-7 (1991)；Brichardら、J Exp Med 178: 489-95 (1993)；Kawakamiら、J Exp Med 180: 347-52 (1994)；Shichijoら、J Exp Med 187: 277-88 (1998)；Chenら、Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8 (1997)；Harris、J Natl Cancer Inst 88: 1442-5 (1996)；Butterfieldら、Cancer Res 59: 3134-42 (1999)；Vissersら、Cancer Res 59: 5554-9 (1999)；van der Burgら、J Immunol 156: 3308-14 (1996)；Tanakaら、Cancer Res 57: 4465-8 (1997)；Fujieら、Int J Cancer 80: 169-72 (1999)；Kikuchiら、Int J Cancer 81: 459-66 (1999)；Oisoら、Int J Cancer 81: 387-94 (1999)）。
ある一定の健常ドナー由来の末梢血単核細胞（PBMC）がペプチド刺激を受けると、ペプチドに反応して著しいレベルのIFN-γを産生するが、51Cr放出アッセイによるとHLA-A24またはHLA-A0201拘束的な様式で腫瘍細胞に対して細胞障害性を及ぼすことはほとんどないと繰り返し報告されている（Kawanoら、Cance Res 60: 3550-8 (2000)；Nishizakaら、Cancer Res 60: 4830-7 (2000)；Tamuraら、Jpn J Cancer Res 92: 762-7 (2001)）。しかし、HLA-A24およびHLA-A0201はどちらも日本人に多いHLAアレルであり、白人でも同様である（Dateら、Tissue Antigens 47: 93-101 (1996)；Kondoら、J Immunol 155: 4307-12 (1995)；Kuboら、J Immunol 152: 3913-24 (1994)；Imanishiら、Proceeding of the eleventh International Hictocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press、Oxford、1065 (1992)；Williamsら、Tissue Antigens 49: 129 (1997)）。このため、これらのHLAによって提示される癌の抗原ペプチドは、日本人および白人の癌の治療に特に有用な可能性がある。さらに、インビトロでの低親和性CTLの誘導は通常、ペプチドを高濃度で用いて、抗原提示細胞（APC）の表面に、これらのCTLを効果的に活性化すると考えられる特異的ペプチド/MHC複合体を高レベルに生じさせることによって起こることが知られている（Alexander-Millerら、Proc Natl Acad Sci USA 93: 4102-7 (1996)）。
発明の概要
本発明は、非小細胞肺癌、例えば、扁平上皮癌、腺癌（すなわち、腺房、乳頭、および気管支肺胞の線癌）、大細胞癌（すなわち、巨細胞および明細胞）、腺扁平上皮癌および未分化癌などと相関する遺伝子発現パターンの発見を基盤とする。
非小細胞肺癌で差次的に発現される遺伝子を、本明細書では「非小細胞肺癌関連遺伝子」「NSC核酸」、または「NSCポリヌクレオチド」と総称し、これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドを「NSCポリペプチド」または「NSCタンパク質」と称する。本明細書において、非小細胞肺癌で差次的に発現されるとは、非小細胞肺癌細胞における遺伝子の発現レベルが正常細胞における発現レベルとは異なることを示す。正常細胞は肺組織から得られた細胞である。
したがって、本発明は、患者由来の生物試料における非小細胞肺癌関連遺伝子の発現レベルを測定することにより、対象における非小細胞肺癌に対する素因を診断または判定する方法を特徴とする。非小細胞肺癌関連遺伝子には、例えば、NSC 1〜1448が含まれる（表1〜3参照）。その遺伝子の正常対照レベルと比較した遺伝子の発現レベルの変化、例えば増加または低下により、対象が非小細胞肺癌に罹患していること、または非小細胞肺癌を発症するリスクを有することが示される。
「正常対照レベル」とは、正常で健康な個体において、または非小細胞肺癌に罹患していないことが判明している個体の集団において検出される遺伝子の発現レベルのことを示す。対照レベルとは、単一の参照集団または複数の発現パターンに由来する、単一の発現パターンのことである。「正常対照レベル」とは対照的に、「対照レベル」とは、罹患状態のバックグラウンド（すなわち、癌であるか癌でないか）が判明している個体または個体の集団において検出される遺伝子の発現レベルである。このため、対照レベルは、正常で健康な個体、非小細胞肺癌に罹患していないことが判明している個体の集団、非小細胞肺癌の患者、または患者の集団のいずれにおける遺伝子の発現レベルに基づいて決定してもよい。非小細胞肺癌の患者または患者の集団における遺伝子の発現レベルに対応する対照レベルは「非小細胞肺癌対照レベル」と呼ばれる。さらに、対照レベルが、以前に検査した細胞の発現パターンのデータベースであってもよい。
被験生物試料で検出されるNSC 807〜1448の遺伝子の任意の1つまたは一群の発現レベルの正常対照レベルと比較した増加により、（試料を採取した）対象が非小細胞肺癌に罹患していること、または非小細胞肺癌を発症するリスクを有することが示される。対照的に、被験生物試料で検出されるNSC 1〜806の遺伝子の任意の1つまたは一群の発現レベルの正常対照レベルと比較した低下により、その対象が非小細胞肺癌に罹患していること、または非小細胞肺癌を発症するリスクを有することが示される。または、生物試料における非小細胞肺癌関連遺伝子の任意の1つまたは一群の発現レベルを、同じ遺伝子または同じ一群の遺伝子の非小細胞肺癌対照レベルと比較してもよい。
遺伝子発現は、対照レベルと比較して10％、25％、50％、またはそれ以上増加または低下する。または、遺伝子発現は対照レベルと比較して1倍、2倍、5倍、またはそれ以上増加または低下する。発現は、非小細胞肺癌関連遺伝子プローブと患者由来の生物試料の遺伝子転写物とのハイブリダイゼーションを、例えばチップ上またはアレイ上で検出することによって測定される。患者由来の生物試料は、例えば非小細胞肺癌を有することが判明しているかその疑いのある患者に由来する、任意の試料であってよい。例えば、生物試料は、痰、血液、血清、血漿、または肺細胞を含む組織でもよい。
本発明はまた、NSC 1〜1448のうち2つまたはそれ以上のものの遺伝子発現レベルのパターンを含む、非小細胞肺癌の参照発現プロファイル（reference expression profile）も提供する。
本発明はさらに、非小細胞肺癌関連遺伝子を発現する被験細胞を被験化合物と接触させること、および非小細胞肺癌関連遺伝子の発現レベルまたは活性を決定することにより、非小細胞肺癌関連遺伝子（例えば、NSC 1〜1448）の発現または活性を阻害または増強する化合物を同定する方法も提供する。被験細胞は肺上皮細胞などの肺細胞であってよい。その遺伝子の対照レベルと比較した発現レベルの低下により、被験化合物が非小細胞肺癌関連遺伝子の発現または機能に対する阻害因子であることが示される。このため、ある化合物がNSC 807〜1448の非小細胞肺癌関連遺伝子の発現レベルを対照レベルと比較して抑制するならば、その化合物は非小細胞肺癌の症状を軽減することが期待される。または、その遺伝子の対照レベルと比較した発現レベルまたは活性の増加により、前記被験化合物が非小細胞肺癌関連遺伝子の発現または機能に対する増強物質であることが示される。NSC 1〜806の非小細胞肺癌関連遺伝子の発現レベルを増加させる化合物は、非小細胞肺癌の症状を軽減することが期待される。
または、本発明は、非小細胞肺癌の治療または予防のための化合物に関するスクリーニングの方法を提供する。本方法は、NSCポリペプチドを被験化合物と接触させること、および、NSCポリペプチドと結合するかまたはその生物学的活性を変化させる被験化合物を選択することを含む。本発明はさらに、非小細胞肺癌の治療または予防のための化合物に関するスクリーニングの方法を提供し、本方法は被験化合物を、NSCタンパク質を発現する細胞もしくはレポーター遺伝子の上流にNSC遺伝子の転写調節領域を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階、および続いてNSCタンパク質またはレポーター遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを変化させる被験化合物を選択する段階を含む。これらのスクリーニング方法によれば、NSC 807〜1448によってコードされるポリペプチド、またはNSC 807〜1448によってコードされるタンパク質を発現する細胞、またはNSC 807〜1448の転写調節領域を用いる場合、その生物学的活性または発現レベルを対照レベルと比較して抑制する被験化合物は非小細胞肺癌の症状を軽減することが期待される。または、NSC 1〜806によってコードされるポリペプチド、またはNSC 1〜806によってコードされるタンパク質を発現する細胞、またはNSC 1〜806の転写調節領域を用いる場合には、その発現レベルを増加させる被験化合物は非小細胞肺癌の症状を軽減することが期待される。
本発明はまた、1つもしくは複数のNSC核酸と結合する、またはNSC核酸の遺伝子産物（例えば、mRNAおよびポリペプチド）と結合する、2つまたはそれ以上の検出用試薬を含むキットも提供する。1つまたは複数のNSC核酸と結合するポリヌクレオチドのアレイもまた提供する。
非小細胞肺癌の治療または予防のための方法、およびこのような方法に用いるための組成物もまた提供する。治療方法には、NSC 807〜1448の遺伝子の発現を低下させるアンチセンス、低分子干渉RNA（siRNA）、もしくはリボザイムの組成物、またはこの遺伝子によってコードされるポリペプチドと結合して機能を抑制する抗体もしくはその断片を含む組成物を対象に投与することにより、対象における非小細胞肺癌を治療または予防する方法が含まれる。
本発明はまた、ワクチンおよびワクチン接種法も含む。例えば、対象における非小細胞肺癌を治療または予防する方法は、NSC 807〜1448のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドまたはこのポリペプチドの免疫活性断片を含むワクチンを対象に投与することによって行われる。免疫活性断片とは、完全長の天然のタンパク質よりも長さが短く、体内に導入されると免疫応答を誘導するポリペプチドのことである。例えば、免疫活性断片には、T細胞またはB細胞などの免疫細胞をインビボで刺激する、少なくとも8残基長のポリペプチドが含まれる。免疫細胞の刺激は、細胞増殖、サイトカイン（例えば、IL-2）の生成、または抗体の産生を検出することによって測定しうる。
他の治療方法には、それらの方法においてNSC 1〜806の遺伝子の発現レベルまたはNSC 1〜806の遺伝子によってコードされるポリペプチドの活性を増加させる化合物が対象に投与されるものが含まれる。または、非小細胞肺癌はNSC 1〜806のポリヌクレオチド（例えば、ベクター中に含まれるもの）またはこのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを投与することにより治療または予防される。さらに、本発明は、本発明のスクリーニング方法によって選択された化合物が投与される、非小細胞肺癌の治療または予防のための方法も提供する。
さらにもう1つの局面において、本発明は、配列番号：2のアミノ酸配列を含む、実質的に純粋なポリペプチドを提供する。アミノ酸配列は、そのアミノ酸配列を有するポリペプチドが配列番号：2のアミノ酸配列からなるタンパク質の1つまたは複数の生物学的活性を保っている限り、少なくとも1、2、3、5、10、25、50、100、または200アミノ酸の置換、除去、挿入、および／または付加によって変異させてもよい。変異したポリペプチドは、配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して少なくとも85％、90％、95％、または99％同一である。配列番号：1の核酸配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドも含まれる。このポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で配列番号：1のヌクレオチド配列とハイブリダイズする。
本明細書で用いる場合、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、その下でプローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドがその標的配列とハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしないと考えられる条件のことを指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、環境が異なれば異なると考えられる。相対的に長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびpHでの特定の配列の融解温度（Tｍ）よりも約5℃低くなるように選択される。Tｍは、標的に対して相補的なプローブの50％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（規定のイオン強度、pH、および核酸濃度の下で）である。標的配列は一般に過剰に存在するため、Tｍでは平衡状態の下でプローブの50％が占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度がナトリウムイオンで約1.0M未満、代表的にはナトリウムイオン（または他の塩）で約0.01〜1.0Mであり、pH 7.0〜8.3であって、温度が、短いプローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチド（例えば、10〜50ヌクレオチド）の場合に少なくとも約30℃であり、より長いプローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチドの場合には少なくとも約60℃である条件と考えられる。また、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によってストリンジェントな条件を得ることもできる。
本発明はさらに、上記の本発明のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドも提供する。本明細書で用いる場合、単離されたポリヌクレオチドとは、その構造がどの天然のポリヌクレオチドの構造とも同一ではないか、または別個の遺伝子3つを上回る範囲にわたる天然のゲノムポリヌクレオチドのどの断片の構造とも同一ではないポリヌクレオチドのことである。このため、この用語には、例えば（a）天然にそれが存在する生物のゲノム中にある天然のゲノムDNA分子の部分的な配列を有するDNA；（b）結果として生じた分子がどの天然のベクターまたはゲノムDNAとも同一でないような様式で、ベクター中または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み入れられたポリヌクレオチド；（c）cDNA、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生じた断片、または制限断片などの分離した分子；および（d）ハイブリッド遺伝子の部分である組換えヌクレオチド配列、すなわち融合ポリペプチドをコードする遺伝子、が含まれる。単離された核酸分子は、配列番号：1に示されたヌクレオチド配列と少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一であることが好ましい。単離されたポリヌクレオチドが、例えば参照配列、配列番号：1よりも長いかそれと長さの等しい場合には、参照配列の完全長との比較が行われる。単離されたポリヌクレオチドが参照配列よりも短い場合、例えば配列番号：1よりも短い場合には、同じ長さ（相同性の算出に必要などのループも除外する）の参照配列のセグメントとの比較が行われる。
本明細書に記載の核酸の1つまたは複数を含むベクター、および本発明のベクターまたは核酸を含む細胞も本発明に含まれる。本発明はまた、上記の任意のポリヌクレオチドを含むベクターによる形質転換を受けた宿主細胞も対象とする。
本発明はまた、配列番号：1の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞を培養することにより、本明細書に記載のポリペプチドを産生するための方法も特徴とする。
さらにもう1つの局面において、本発明は、配列番号：2のポリペプチドと特異的に結合する抗体、またはその断片を提供する。抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でもよい。一部には、本発明のポリヌクレオチドに対して相補的な、またはそのアンチセンスポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスDNA）、リボザイム、およびsiRNA（低分子干渉RNA）も提供される。このようなポリヌクレオチド構築物は、本発明のポリヌクレオチドを検出するため、すなわち、非小細胞肺癌を診断するため、または本疾患の治療もしくは予防のために用いうる。
発明はさらに、配列番号：423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、または531のヌクレオチド配列を有するアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。これらのヌクレオチド配列のうちの任意の配列を有するポリヌクレオチドのすべてが、NSCLC細胞株のフォーカス形成を抑制するのに有効であることが示されている。
さらに、本発明は、配列番号：533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、または552のヌクレオチド配列を有するsiRNAも提供する。これらのヌクレオチド配列のうちの任意の配列を有するsiRNAのすべてが、NSCLC細胞株の細胞生存能力を抑制するのに有効であることが示されている。
本出願はまた、これらのアンチセンスポリヌクレオチドまたはsiRNAの任意のものを用いる、非小細胞肺癌の治療のための薬学的組成物、さらにはこの組成物を用いて非小細胞肺癌を治療または予防するための方法も提供する。
本発明はさらに、配列番号：2のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その機能的同等物、またはそれらのうちの任意のものをコードするポリヌクレオチドを含む、非小細胞肺癌の治療のための薬学的組成物も提供する。この組成物中に含まれるポリヌクレオチドは、インビボで発現させるためのベクターに組み入れられてもよい。
本発明の薬学的組成物の作用経路は、癌細胞の増殖を阻害するものであることが望ましい。薬学的組成物は、ヒトおよび家畜を含む、哺乳動物に対して適用しうる。
さらに、本発明は、上方制御されたNSCポリペプチド（例えば、NSC 807〜1448）もしくはその免疫活性断片、またはそれらをコードするポリヌクレオチドを投与することにより、抗腫瘍免疫を誘導するための方法も提供する。
特に明記しない限り、本明細書で使用するすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される用語と同じ意味をもつ。本明細書に記載された方法および材料と類似または同等の方法および材料を、本発明を実施または検討するにあたって使用することができるが、適切な方法および材料を以下に説明する。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。矛盾が生じる場合は、定義を含め本明細書が優先する。また、材料、方法、および実施例は、単に説明目的であり、制限する意図はない。
本発明の前記の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様のものであって、本発明または本発明のその他の代替的な態様を制限するものではないことが理解される。
発明の詳細な説明
本明細書で用いる「1つの（a）」「1つの（an）」および「その（the）」という用語は、別に特記する場合を除き、「少なくとも1つの」を意味する。
本発明は一部には、肺癌に罹患した患者の原発性肺癌組織由来の肺細胞において、多数の遺伝子の発現パターンが変化しているという発見に基づく。遺伝子の発現レベルの差異は包括的cDNAマイクロアレイシステムによって同定された。
非小細胞肺癌患者において共通して過剰発現される、または抑制される遺伝子を選択するために、23040種の遺伝子に関するcDNAマイクロアレイ分析を行った。本発明によれば1448種の遺伝子が差次的に発現されることが見いだされた。それらのうち、642種の遺伝子は上方制御されており、806種の遺伝子は下方制御されていた。
マイクロアレイ分析によって同定された遺伝子を、治療薬または免疫療法の開発のための標的としての候補遺伝子を同定するために、アンチセンスS-オリゴヌクレオチドおよび／またはsiRNA法によってさらにスクリーニングした。アンチセンスS-オリゴヌクレオチドおよびsiRNAは、標的遺伝子に対応する特異的mRNA鎖とハイブリダイズする、DNA／RNAの短い合成連鎖である（JansenおよびZangemeister-Wittke、Lancet Oncol 3: 672-83 (2002)；Brummenlkampら、Science 296: 550-3 (2002)）。mRNAとの結合により、アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的遺伝子のタンパク質への翻訳を阻害し、その結果遺伝子の働きを阻害する（JansenおよびZangemeister-Wittke、Lancet Oncol 3: 672-83 (2002)）。一方、siRNAは、細胞に導入されて遺伝子機能の非遺伝的で後成的なノックアウト（これは標的遺伝子におけるヌル変異の表現型模写となる）を引き起こす、配列特異的な二本鎖RNAである（Brummenlkampら、Science 296: 550-3 (2002)）。非小細胞肺癌の統合的な遺伝子発現データベースおよび上方制御された遺伝子の後成的ノックダウンを利用するこの複合的アプローチは、個人別の治療法を目的とする標的分子の迅速な同定および評価のための強力な戦略をもたらす。NSCLC細胞の成長、増殖、および／または生存を調節する遺伝子が同定されている。これらの遺伝子は、自己分泌、細胞周期／増殖、およびシグナル伝達に働くタンパク質、または機能が未知である産物をコードしている。
本明細書で同定された差次的に発現される遺伝子は、診断目的に、および、非小細胞肺癌の抑制のための遺伝子標的治療アプローチを開発するために用いることができる。
非小細胞肺癌患者において発現レベルが変化している（すなわち、増加または低下している）遺伝子は表1〜3にまとめられており、これらは本明細書において「非小細胞肺癌関連遺伝子」「NSC遺伝子」「NSC核酸」、または「NSCポリヌクレオチド」と総称され、それらによってコードされるポリペプチドは「NSCポリペプチド」または「NSCタンパク質」と称される。別に指示する場合を除き、「NSC」とは、本明細書中に開示した配列のうち任意の配列を指す（例えば、NSC 1〜1448）。これらの遺伝子は以前に記載されており、ここではデータベースのアクセッション番号とともに提示される。
（表１）下方制御された遺伝子
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（表２）上方制御された遺伝子（≧x5、症例の50％以上）
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（表３）上方制御された遺伝子（≧x5、症例の33％〜50％）
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非小細胞肺癌の診断
種々のNSC遺伝子の発現レベルを測定することにより、対象における非小細胞肺癌の発症または非小細胞肺癌を発症する素因を、対象由来の生物試料を用いて判定することが可能である。
本発明は、生物試料における、表1〜3に列挙されたNSC配列の少なくとも1つ、最大でそのすべての発現レベルを決定すること（例えば、測定すること）を含む。
本発明によれば、非小細胞肺癌関連遺伝子の遺伝子転写物を、その遺伝子の発現レベルを決定するために検出する。既知の配列に関するGenBank（商標）データベースの項目によって得られる配列情報に基づき、当業者に周知の技法を用いて非小細胞肺癌関連遺伝子の検出および測定を行うことができる。本方法によって検出される遺伝子転写物には、mRNAおよびタンパク質といった転写産物および翻訳産物の両方が含まれる。例えば、NSCポリヌクレオチドに対応する配列データベース項目中の配列を、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション分析によってNSC mRNAを検出するためのプローブの構築のために用いることができる。プローブと対象の生物試料中の遺伝子転写物とのハイブリダイゼーションをDNAアレイ上で行うこともできる。複数のNSC遺伝子の発現レベルを検出するにはアレイを用いることが好ましい。もう1つの例として、これらの配列を、例えば、逆転写に基づくポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）などの増幅に基づく検出方法においてNSCポリヌクレオチドを特異的に増幅するためのプライマーの構築のために用いることもできる。さらに、NSC遺伝子の発現レベルを、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性または量に基づいて分析することもできる。タンパク質の量を決定するための方法にはイムノアッセイ法が含まれる。
発現レベルを決定するための生物試料として、試料中のNSC遺伝子を検出しうる限り、任意の生物材料を用いることができ、これには被験細胞集団（すなわち、対象由来の組織試料）が含まれる。生物試料は肺細胞（肺から得られた細胞）を含むことが好ましい。血液、血清、または他の体液（痰など）における遺伝子発現を測定することもできる。さらに、被験試料は、組織から精製された細胞であってもよい。
本方法に従って非小細胞肺癌について診断される対象は好ましくは哺乳動物であり、これにはヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれる。
生物試料における1つまたは複数のNSC遺伝子の発現レベルが、参照試料における同じ遺伝子の発現レベルと比較される。参照試料は、パラメーター、すなわち癌であるか癌でないかが判明している、1つまたは複数の細胞を含む。参照試料は被験試料のものと類似した組織型から得る必要がある。または、対照発現レベルを、アッセイされるパラメーターまたは条件が判明している細胞から得られた分子情報のデータベースに基づいて決定することもできる。
生物試料における遺伝子発現レベルのパターンがNSCLCの存在を示すか否かは、参照細胞集団の組成に依存する。例えば、参照細胞集団が非癌性細胞から構成される場合には、被験生物試料における遺伝子発現レベルが参照試料のものと同程度であることにより、被験生物試料が非癌性であることが示される。これに対して、参照細胞集団が癌細胞から構成される場合には、生物試料における遺伝子発現プロファイルが参照試料のものと同程度であることにより、被験生物試料が癌細胞を含むことが示される。
被験生物試料を多数の参照試料と比較することもできる。多数の参照試料のそれぞれは既知のパラメーターが異なっていてよい。このため、被験試料を、例えば非小細胞肺癌細胞を含むことが判明している参照試料と比較し、これと同時に、例えば非小細胞肺癌細胞ではない細胞（正常細胞）を含むことが判明している第2の参照試料と比較することもできる。
本発明によれば、生物試料における非小細胞肺癌関連遺伝子、例えばNSC 1〜1448のうち1つまたは複数の発現を決定して、同じ遺伝子の正常対照レベルと比較する。「正常対照レベル」という語句は、非小細胞肺癌に罹患していない集団の生物試料で通常認められる非小細胞肺癌関連遺伝子の発現プロファイルのことを指す。対照および被験対象からの生物試料におけるNSC遺伝子の発現レベルを同時に決定してもよく、または正常対照レベルを、対照群から以前に採取した試料における遺伝子の発現レベルを分析することによって得た結果に基づいて統計学的方法によって決定してもよい。患者由来の組織試料から得られた生物試料における非小細胞肺癌関連遺伝子の発現レベルが高いことまたは低いことにより、対象が非小細胞肺癌に罹患していること、または非小細胞肺癌を発症するリスクを有することが示される。例えば、被験生物試料におけるNSC 807〜1448の発現レベルが正常対照レベルと比較して高いことにより、対象が非小細胞肺癌に罹患していること、または非小細胞肺癌を発症するリスクを有することが示される。一方、被験生物試料におけるNSC 1〜806の発現レベルが正常対照レベルと比較して低いことにより、対象が非小細胞肺癌に罹患していること、または非小細胞肺癌を発症するリスクを有することが示される。
被験生物試料におけるNSC遺伝子の発現レベルは、その発現レベルが参照物のものよりも1.0、1.5、2.0、5.0、10.0倍、またはそれ以上異なる場合に変化しているとみなしうる。または、被験生物試料におけるNSC遺伝子の発現レベルは、その発現レベルが参照物のものよりも少なくとも50％、60％、80％、90％、またはそれ以上高いまたは低い場合、変化しているとみなしうる。
被験試料と参照試料との間の遺伝子発現の差異は、対照、例えばハウスキーピング遺伝子に対して標準化することができる。例えば、対照ポリヌクレオチドには、癌細胞と非癌性細胞との間でその発現レベルに差がないことが知られているものが含まれる。被験試料および参照試料における対照ポリヌクレオチドの発現レベルを、NSC遺伝子に関して検出された発現レベルの標準化のために用いることができる。本発明に用いられる対照遺伝子には、β-アクチン、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼおよびリボソームタンパク質P1が含まれる。
本明細書で同定された、差次的に発現されるNSC遺伝子は、非小細胞肺癌の治療の経過のモニタリングも可能にする。この方法では、非小細胞肺癌に対する治療を受けている対象から被験生物試料を得る。必要に応じて、多数の被験生物試料を治療の前、最中、または後のさまざまな時点に対象から採取する。続いて、試料における1つまたは複数のNSC遺伝子の発現を測定し、治療を受けていない非小細胞肺癌に関する状態が判明している参照試料と比較する。
参照試料が非小細胞肺癌細胞を含まない場合には、被験生物試料および参照試料におけるNSC遺伝子の発現レベルが同程度であることは治療の有効性を意味する。しかし、被験試料および参照試料におけるNSC遺伝子の発現レベルに差があることは、臨床的成果または予後があまり好ましくないことを意味する。
「有効な（efficacious）」という用語は、治療が、対象における、病的に上方制御された遺伝子（NSC 807〜1448）の発現低下、病的に下方制御された遺伝子（NSC 1〜806）の発現の増大、または非小細胞肺癌のサイズ、有病率、もしくは転移能の低下をもたらすことを指す。治療が予防的に適用される場合には、「有効な」とは、治療が非小細胞肺癌の発症を遅延もしくは防止すること、または非小細胞肺癌の臨床症状を軽減することを示す。非小細胞肺癌の評価は標準的な臨床的プロトコールを用いて行うことができる。さらに、治療の有効性は、非小細胞肺癌の診断または治療のための任意の既知の方法に付随して判定される。例えば、非小細胞肺癌は病理組織学的に、または慢性的な咳、嗄声、喀血、体重減少、食欲不振、息切れ、喘鳴、気管支炎もしくは肺炎の反復発作、および胸痛などの症候性異常を特定することによって診断される。
さらに、非小細胞肺癌の本診断方法を、患者由来の生物試料におけるNSC遺伝子の発現レベルを比較することによる、この癌を有する患者の予後の評価に適用することもできる。または、患者の予後を評価するために、生物試料における遺伝子の発現レベルを疾患の諸病期の全体にわたって測定することもできる。
正常対照レベルと比較して、NSC 807〜1448の発現レベルが高いこと、またはNSC 1〜806の発現レベルが低いことは、予後があまり好ましくないことを意味する。NSC 807〜1448またはNSC 1〜806の発現レベルが正常対照レベルとの比較で同程度であることは、患者の予後がより好ましいことを意味する。対象の予後を、NSC 807〜1448またはNSC 1〜806の発現プロファイルを比較することによって評価しうることが好ましい。
発現プロファイル
本発明はまた、NSC 1〜1448のうち2つまたはそれ以上の遺伝子発現レベルのパターンを含む、非小細胞肺癌の参照発現プロファイルも提供する。この発現プロファイルは、非小細胞肺癌または本疾患を発症する素因の診断のための対照として、本疾患を有する対象の治療の経過のモニタリング、および予後の評価のために用いることができる。
非小細胞肺癌関連遺伝子の発現を阻害または増強する化合物の同定
非小細胞肺癌関連遺伝子の発現または活性を阻害する化合物は、非小細胞肺癌関連遺伝子を発現する被験細胞を被験化合物と接触させること、および非小細胞肺癌関連遺伝子の発現レベルまたは活性を決定することによって同定される。対照レベルと比較して発現が低いことは、その化合物が非小細胞肺癌関連遺伝子の阻害因子であることを意味する。被験細胞で発現される非小細胞肺癌関連遺伝子が上方制御された遺伝子である場合には、本方法によって同定された化合物は非小細胞肺癌を抑制するために有用である。
または、非小細胞肺癌関連遺伝子の発現または活性を増強する化合物を、非小細胞肺癌関連遺伝子を発現する被験細胞集団を被験化合物と接触させること、および非小細胞肺癌関連遺伝子の発現レベルまたは活性を決定することにより、遺伝子の増強物質として同定することもできる。被験細胞で発現される非小細胞肺癌関連遺伝子が下方制御された遺伝子である場合には、本方法に従って同定された化合物は非小細胞肺癌の抑制に有用であることが示唆される。
被験細胞が細胞の集団であってもよく、これには、その細胞が標的となる非小細胞肺癌関連遺伝子を発現する限り、任意の細胞が含まれる。例えば、被験細胞は、肺組織、血液、血清、または痰に由来する細胞などの上皮細胞を含む。被験細胞は非小細胞肺癌細胞に由来する不死化細胞株であってもよい。または、被験細胞は、NSC遺伝子が導入された細胞、またはレポーター遺伝子と機能的に結合したNSC遺伝子の調節配列（例えば、プロモーター）が導入された細胞であってもよい。
化合物のスクリーニング
NSC遺伝子、この遺伝子によってコードされるタンパク質、またはこの遺伝子の転写調節領域を用いて、遺伝子の発現または遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物学的活性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。このような化合物は非小細胞肺癌の治療または予防のための医薬品として役立つことが期待される。
したがって、本発明は、本発明のポリペプチドを用いる、非小細胞肺癌の治療または予防のための化合物に関するスクリーニングの方法を提供する。このスクリーニング方法の1つの態様は以下の段階を含む：（a）被験化合物を本発明のポリペプチドと接触させる段階；（b）本発明のポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階；および（c）本発明のポリペプチドと結合する化合物を選択する段階。
スクリーニングに用いるポリペプチドは、組換えポリペプチドもしくは天然物に由来するタンパク質でもよく、またはそれらの部分ペプチドでもよい。被験化合物と接触させるポリペプチドは、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質でありうる。
NSCポリペプチドに結合するタンパク質のスクリーニング方法として、当業者に既知の多数の方法を使用することができる。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法、具体的には、以下の方法で実施することができる。NSCポリペプチドのいずれかをコードする遺伝子は、pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3.1、pCAGGS、およびpCD8などの外来遺伝子の発現ベクターに遺伝子を挿入することによって動物細胞等において発現される。発現に使用されるプロモーターは、通常使用することができる任意のプロモーターであってもよく、例えば、SV40初期プロモーター(Riggy、Williamson(編)、Genetic Engineering、3巻、Academic Press、London、83-141(1982))、EF-αプロモーター(Kimら、Gene 91: 217-23(1990))、CAGプロモーター(Niwaら、Gene 108: 193-200(1991))、RSV LTRプロモーター(Cullen、Methods in Enzymology 152: 684-704(1987))、SRαプロモーター(Takebeら、Mol Cell Biol 8: 466(1988))、CMV前初期プロモーター(SeedおよびAruffo、Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9(1987)、SV40後期プロモーター(GheysenおよびFiers、J Mol Appl Genet 1: 385-94(1982))、アデノウイルス後期プロモーター(Kaufmanら、Mol Cell Biol 9: 946(1989))、HSV TKプロモーター等を含む。外来遺伝子を発現させるために動物細胞に遺伝子を導入することは、任意の方法、例えば、電気穿孔法(Chuら、Nucleic Acids Res 15: 1311-26(1987))、リン酸カルシウム法(ChenおよびOkayama、Mol Cell Biol 7: 2745-52(1987))、DEAEデキストラン法(Lopataら、Nucleic Acids Res 12: 5707-17(1984)、SussmanおよびMilman、Mol Cell Biol 4: 1642-3(1985))、リポフェクチン法(Derijard、B Cell 7: 1025-37(1994)、Lambら、Nature Genetics 5: 22-30(1993)、Rabindranら、Science 259: 230-4(1993))等により実施することができる。NSCポリペプチドは、その特異性が明らかにされているモノクローナル抗体のエピトープをポリペプチドのN末端またはC末端に導入することによって、モノクローナル抗体の認識部位(エピトープ)を含む融合タンパク質として発現されてもよい。市販のエピトープ-抗体系を使用することができる(Experimental Medicine 13: 85-90(1995))。マルチクローニングサイトを使用することによって、例えば、β-ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)等との融合タンパク質を発現することができるベクターは市販されている。
融合によってNSCポリペプチドの特性を変化させないように、数個から1ダースのアミノ酸からなる小型エピトープだけを導入することによって調製される融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン(His-tag)、インフルエンザ凝集素HA、ヒトc-myc、FLAG、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-GP)、T7遺伝子10タンパク質(T7-tag)、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(HSV-tag)、E-tag(モノクローナルファージ上のエピトープ)等などのエピトープおよびこれらを認識するモノクローナル抗体を、NSCポリペプチドへのタンパク質結合をスクリーニングするためのエピトープ-抗体系として使用することができる(Experimental Medicine 13: 85-90(1995))。
免疫沈降法では、適当な界面活性剤を使用して調製した細胞溶解物にこれらの抗体を添加することによって免疫複合体が形成される。免疫複合体は、NSCポリペプチド、ポリペプチドとの結合能力を含むポリペプチド、および抗体からなる。免疫沈降法は、上記のように調製することができる抗体を上記エピトープに対して使用する以外に、NSCポリペプチドに対して抗体を使用しても実施することができる。
免疫複合体は例えば、抗体がマウスのIgG抗体の場合は、プロテインAセファロース、またはプロテインGセファロースを用いて沈殿させることができる。NSCポリペプチドを、GSTなどのエピトープとの融合タンパク質として調製するのであれば、これらのエピトープに特異的に結合する物質（グルタチオン-セファロース4Bなど）を用いて、NSCポリペプチドに対する抗体を使用する場合と同じように免疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降は、例えば文献に記載された方法にしたがって、またはその通りに実施することができる（HarlowおよびLane、Antibodies、511-52、Cold Spring Harbor Laboratory publications、New York（1988））。
SDS-PAGEは一般に、免疫沈降されたタンパク質の解析に使用されており、結合状態のタンパク質を、適切な濃度のゲルを用いて、タンパク質の分子量によって解析することができる。NSCポリペプチドに結合した状態のタンパク質は、クーマシー染色または銀染色などの一般的な染色法による検出が困難なので、タンパク質の検出感度は、放射性同位元素の35S-メチオニンまたは35S-システインを含む培地で細胞を培養し、細胞内でタンパク質を標識して、タンパク質を検出することで改善することができる。標的タンパク質は、タンパク質の分子量が明らかになった時点で、SDS-ポリアクリルアミドゲルから直接精製し、その配列を決定することができる。
NSCポリペプチドを用いて、任意のNSCポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングする方法には、例えばウエスト-ウエスタンブロッティング解析（Skolnikら、Cell 65：83-90（1991））を使用することができる。具体的には、NSCポリペプチドに結合するタンパク質は、NSCポリペプチドに結合するタンパク質を発現することが予想される細胞、組織、器官（例えば精巣および前立腺などの組織）、または培養細胞（例えはLNCaP、PC3、DU145）に由来するcDNAライブラリーをファージベクター（例えばZAP）を用いて調製し、タンパク質をLBアガロース上で発現させ、発現されたタンパク質をフィルター上に固定し、精製および標識されたNSCポリペプチドを上記フィルターと反応させ、NSCポリペプチドに結合したタンパク質を発現するプラークを、標識に従って検出することによって得ることができる。NSCポリペプチドは、ビオチンとアビジン間の結合を利用するか、あるいはNSCポリペプチドに特異的に結合する抗体、またはNSCポリペプチドに融合するペプチドもしくはポリペプチド（例えばGST）を利用して標識することができる。放射性同位元素または蛍光などを使用する方法を使用してもよい。
あるいは、本発明のスクリーニング法の別の態様では、細胞を利用するツーハイブリッド系を使用することができる（「MATCHMAKER Two-Hybrid system」、「Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit」、「MATCHMAKER one-Hybrid system」（Clontech）；「HybriZAP Two-Hybrid Vector System」（Stratagene）；「DaltonおよびTreisman、Cell 68：597-612（1992）」、「FieldsおよびSternglanz、Trends Genet 10：286-92（1994）」を参照）。
ツーハイブリッド系では、NSCポリペプチドを、SRF結合領域またはGAL4結合領域に融合させ、酵母細胞で発現させる。NSCポリペプチドに結合するタンパク質を発現することが予想される細胞から、ライブラリーが発現した場合にVP16またはGAL4の転写活性化領域と融合するように、cDNAライブラリーを調製する。次にcDNAライブラリーを上記の酵母細胞に導入し、ライブラリーに由来するcDNAを、検出された陽性クローンから単離する（本発明のポリペプチドに結合するタンパク質を酵母細胞で発現させると、両者の結合がレポーター遺伝子を活性化させ、陽性クローンを検出可能にする）。cDNAにコードされたタンパク質は、上記のように単離されたcDNAを大腸菌（E. coli）に導入し、タンパク質を発現させることで調製できる。
レポーター遺伝子として、HIS3遺伝子に加え、例えばAde2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを使用することができる。
NSCポリペプチドに結合する化合物は、アフィニティクロマトグラフィーでもスクリーニングすることができる。例えば、NSCポリペプチドをアフィニティカラムの担体表面に固定することが可能であり、またNSCポリペプチドに結合可能なタンパク質を含む試験化合物をカラムに添加する。本明細書における試験化合物には例えば、細胞抽出物や細胞溶解物などがある。試験化合物をロードした後にカラムを洗浄し、NSCポリペプチドに結合した化合物を調製することができる。
試験化合物がタンパク質の場合は、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、この配列を元にオリゴDNAを合成し、オリゴDNAをプローブとして用いてcDNAライブラリーをスクリーニングすることで、対象タンパク質をコードするDNAを得る。
表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサーを、本発明の結合化合物を検出または定量する手段として用いることができる。このようなバイオセンサーを使用する場合、NSCポリペプチドと試験化合物間の相互作用を、微量のポリペプチドを用いて、標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えばBIAcore、Pharmacia）。したがって、BIAcoreなどのバイオセンサーを用いることで、NSCポリペプチドと試験化合物間の結合を評価することが可能である。
固定されたNSCポリペプチドを、合成化合物、もしくは天然物質バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーに曝露したときに結合する分子をスクリーニングする方法、およびタンパク質だけでなくNSCタンパク質に結合する化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するコンビナトリアルケミストリー技術をベースとする高処理能を利用したスクリーニング法（Wrightonら、Science 273：458-64（1996）；Verdine、Nature 384：11-13（1996）；Hogan、Nature 384：17-9（1996））は当技術分野で周知である。
あるいは、本発明は、
(a)試験化合物にNSCポリペプチドを接触させる段階；
(b)段階(a)のNSCポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
(c)試験化合物の非存在下で検出される生物学的活性と比較して、NSCポリペプチドの生物学的活性を抑制または増強する化合物を選択する段階
を含む、NSCポリペプチドを使用して非小細胞肺癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。
NSC 1〜1488の遺伝子のいずれかによってコードされるタンパク質は、非小細胞肺癌細胞の細胞増殖を促進する活性を有するので、これらのタンパク質の1つのこの活性を促進または阻害する化合物を、この活性を指標として使用してスクリーニングすることができる。
NSCタンパク質の生物学的活性を含む限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに使用することができる。このような生物学的活性には、NSC 807〜1488の遺伝子によってコードされるタンパク質の細胞増殖活性が含まれる。例えば、NSC 807〜1488によってコードされるヒトタンパク質を使用することができ、これらのタンパク質に機能的に同等のポリペプチドも使用することができる。このようなポリペプチドは細胞によって内因的または外因的に発現されてもよい。
本スクリーニングで単離された化合物は、NSCポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの候補となる。「アゴニスト」という用語は、NSCポリペプチドに結合することで、その機能を活性化する分子を意味する。「アンタゴニスト」という用語は、NSCポリペプチドに結合することで、その機能を阻害する分子を意味する。さらに、このスクリーニングで単離された化合物は、NSCポリペプチドと分子（DNAおよびタンパク質を含む）のインビボでの相互作用を阻害する化合物の候補となる。
本発明の方法において検出対象の生物学的活性が細胞増殖の場合、これは例えば、NSCポリペプチド（例えばNSC 807〜1448）を発現する細胞を調製し、試験化合物の存在下で細胞を培養し、また細胞増殖の速度を決定し、細胞周期などを測定することで検出できるほか、コロニー形成活性を測定することで検出できる。
上記に詳細に考察するように、NSC遺伝子の発現レベルを制御することによって、非小細胞肺癌の発症および進行を制御することができる。したがって、非小細胞肺癌の治療または予防に使用することができる化合物は、NSC遺伝子の1つまたは複数の発現レベルを指標として使用するスクリーニングにより同定することができる。本発明に関連して、このようなスクリーニングは、例えば、以下の段階：
（a)試験化合物を、NSC遺伝子の1つまたは複数を発現する細胞に接触させる段階；および
（b)試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、NSC 807〜1488の1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを低下させる、またはNSC 1〜806の1つまたは複数の遺伝子の発現レベルを増加させる化合物を選択する段階
を含んでもよい。
NSC遺伝子の少なくとも1つを発現する細胞には、例えば、非小細胞肺癌細胞から樹立された細胞系統が含まれ、このような細胞を本発明の上記スクリーニングに使用することができる(例えば、A549、NCI-H226、NCI-H522、LC319)。発現レベルは、当業者に既知の方法によって推定することができる。スクリーニング方法において、NSC遺伝子の少なくとも1つの発現レベルを低下させる化合物を、非小細胞肺癌の治療または予防に使用する候補薬剤として選択することができる。
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、以下の段階：
（a) 1つまたは複数のマーカー遺伝子の転写調節領域および転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入されている細胞に試験化合物を接触させる段階であって、1つまたは複数のマーカー遺伝子がNSC 1〜1448である段階；
（b)上記レポーター遺伝子の活性を測定する段階；および
（c)上記マーカー遺伝子が上方制御遺伝子(例えば、NSC 807-1448)である場合に対照と比較したとき上記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる、または上記マーカー遺伝子が下方制御遺伝子(例えば、NSC 1〜806)である場合に発現レベルを増加させる化合物を選択する段階
を含んでもよい。
好適なレポーター遺伝子および宿主細胞は当技術分野において周知である。スクリーニングに必要なレポーター構築物は、マーカー遺伝子の転写調節領域を使用して調製することができる。マーカー遺伝子の転写調節領域が当業者に公知である場合に、レポーター構築物は以前の配列情報を使用して調製することができる。マーカー遺伝子の転写調節領域が同定されていない場合には、転写調節領域を含有するヌクレオチドセグメントを、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいてゲノムライブラリーから単離することができる。
任意の試験化合物（例えば細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物の産物、海洋生物の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質もしくは未精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物、および天然化合物）を、本発明のスクリーニング法に使用することができる。本発明の試験化合物は、（1）生物学的ライブラリー、（2）空間的に位置指定可能な（spatially addressable）平行固相もしくは液相ライブラリー、（3）逆重畳積分を用いた解析（deconvolution）を必要とする合成ライブラリー法、（4）「1ビーズ-1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法、ならびに（5）アフィニティクロマトグラフィー選択を利用した合成ライブラリー法などの、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法を含む任意の多くの方法でも得られる。アフィニティクロマトグラフィー選択を利用する生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、他の4つの方法は、ペプチド、非ペプチドのオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに応用することができる（Lam（1997）Anticancer Drug Des. 12：145）。分子ライブラリーの合成法の例は当技術分野において見出すことができる（DeWittら（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6909；Erbら（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：11422；Zuckermannら（1994）J. Med. Chem. 37：2678；Choら（1993）Science 261：1303；Carellら（1994）Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33：2059；Carellら（1994）Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33：2061；Gallopら（1994）J. Med. Chem. 37：1233）。化合物のライブラリーは、溶液中（Houghten（1992）Bio/Techniques 13：412を参照）、またはビーズ表面上（Lam（1991）Nature 354：82）、チップ（Fodor （1993）Nature 364：555）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号；第5,403,484号、および第5,223,409号）、プラスミド（Cullら（1992）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：1865）、もしくはファージ（ScottおよびSmith（1990）Science 249：386；Delvin（1990）Science 249：404；Cwirlaら（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：6378；Felici（1991）J. Mol. Biol. 222：301；米国特許出願第2002103360号）に提示することができる。本発明のスクリーニング方法により、細胞またはタンパク質に曝露される試験化合物は単一の化合物または化合物の組み合わせであってもよい。本発明のスクリーニング方法に化合物の組み合わせを使用する場合には、化合物は逐次的または同時に接触されてもよい。
本発明のスクリーニング方法で単離した化合物は、例えば、細胞増殖性疾患によって生じる非小細胞肺癌などの疾患を治療または予防するための、NSCポリペプチドの活性を促進または阻害する薬物の候補である。本発明のスクリーニング方法によって得られる化合物の構造の一部が付加、欠損、および／または置換によって変換された化合物は、本発明のスクリーニング法によって得られる化合物に含まれる。低発現遺伝子(例えば、NSC 1〜806)の刺激または過剰発現遺伝子(例えば、NSC 807〜1448)の発現の抑制に効果的な化合物は、臨床的有用性を有すると思われ、動物モデルまたは被験者において癌細胞増殖を防止する能力についてさらに試験することができる。
特定の個体に適した非小細胞肺癌の治療薬剤の選択
個体の遺伝子構成には差があるので、さまざまな薬剤を代謝する相対的能力には差があることになる。被験者内で代謝されて抗非小細胞肺癌薬剤として作用する化合物は、被験者の細胞における、癌性の状態に特徴的であった遺伝子発現パターンから、非癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンに至る変化を誘導することで顕在化する場合がある。したがって、本明細書に開示された、発現差のあるNSC遺伝子は、選択された被験者に由来する試験細胞（または試験細胞集団）中で候補化合物を試験することによって、被験者に特に適すると推定される治療用または予防用の非小細胞肺癌阻害剤の選択を可能とする。
特定の個体に適切な抗非小細胞肺癌薬剤を同定するために、被験者に由来する試験細胞または試験細胞集団を治療薬に曝露し、1つもしくは複数のNSC 1〜1448遺伝子の発現を決定する。
試験細胞は、非小細胞肺癌関連遺伝子を発現する非小細胞肺癌細胞であるか、または試験細胞集団は、非小細胞肺癌関連遺伝子を発現する非小細胞肺癌細胞を含む。好ましくは、試験細胞は上皮細胞であるか、または試験細胞集団は上皮細胞を含む。例えば、試験細胞または試験細胞集団を、候補薬剤の存在下でインキュベートし、試験細胞または細胞集団の遺伝子発現パターンを測定し、1つまたは複数の標準プロファイル、例えは非小細胞肺癌標準発現プロファイル、もしくは非非小細胞肺癌標準発現プロファイルと比較する。
非小細胞肺癌を含む標準細胞集団に対して、試験細胞または試験細胞集団における、NSC 807〜1448のうち1つもしくは複数の発現が減少するか、またはOEX 1〜806のうち1つもしくは複数の発現が増加すれば、対象薬剤が治療効果を持つこと意味する。
試験薬剤は、任意の化合物または組成物の場合がある。例えば試験薬剤は免疫調節剤である。
キット
本発明は、NSC検出試薬（例えば、1つもしくは複数のNSCポリヌクレオチドに特異的に結合するか、またはこれを同定する核酸）を含むキットも提供する。1つもしくは複数のNSCポリヌクレオチドに特異的に結合するか、またはこれを同定する、こうした核酸の例には、NSCポリヌクレオチドの一部に相補的なオリゴヌクレオチド配列、またはNSCポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドに結合する抗体がある。試薬は、キットの形態で同梱されている。核酸もしくは抗体などの試薬（固体マトリックスに結合されているか、または個別に包装され、これらをマトリックスに結合させる試薬が付属している）、対照試薬（陽性および/もしくは陰性）、ならびに/または核酸もしくは抗体を検出する手段は、好ましくは個別の容器に包装されている。アッセイ法を行うための指示書（例えば、書面、テープ、VCR、CD-ROMなど）がキットに含まれてもよい。キットのアッセイ形式は、当技術分野で周知のノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAの場合がある。
例えばNSC検出試薬を、多孔性ストリップなどの固体マトリックス上に固定し、少なくとも1つのNSC検出部位を形成する。多孔性ストリップの測定領域または検出領域は、各検出部位がNSC検出試薬を含む複数の検出部位を含みうる。試験ストリップは、陰性対照部位および/または陽性対照部位を含む場合もある。あるいは、対照部位は、試験ストリップとは別のストリップ上に位置する。任意選択で、異なる検出部位は、異なる量（すなわち第1検出部位は最も多量で、後続の部位ではより少なくなる）の固定化された試薬を含む場合がある。試験生物学的試料を加えると、検出可能なシグナルを示す部位の数が、試料中に存在するNSCの量の量的指標となる。検出部位は、任意の適切に検出可能な形状に構成することが可能であり、典型的には試験ストリップの幅全体に広がるバーまたはドットの形状である。
あるいはキットは、1つもしくは複数のNSCポリヌクレオチド配列を含む核酸基質アレイを含む。アレイ上の核酸は、NSC 1〜1448で表される1つもしくは複数のポリペプチド配列を特異的に識別する。NSC 1〜1448で表される配列のうち2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、もしくは50個、またはこれ以上の遺伝子の発現レベルを、アレイの試験ストリップまたはチップへの結合レベルによって同定する。基質アレイは、米国特許第5,744,305号に記載された例えば固体基質（例えば「チップ」）の場合がある。
アレイおよび複数性
本発明は、1つもしくは複数のNSCポリヌクレオチドを含む核酸基質アレイも含む。アレイ上の核酸は、NSC 1〜1448で表される1つもしくは複数のポリヌクレオチド配列に特異的に対応する。NSC 1〜1448で表される2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、もしくは50個、またはこれ以上の遺伝子の発現レベルを、核酸のアレイへの結合を検出することで同定する。
本発明は、単離された複数の核酸（すなわち、2つまたはそれ以上の核酸の混合物）も含む。核酸は液相または固相中に存在し、例えばニトロセルロース膜などの固相支持体上に固定されている。複数のポリヌクレオチドは、NSC 1〜1448で表される1つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む。本発明の別の態様によれば、複数の核酸は、NSC 1〜1448で表される2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、もしくは50個、またはこれ以上のポリヌクレオチドを含む。
チップ
DNAチップは、数多くの遺伝子の発現レベルを同時に比較するのに便利な装置である。DNAチップに基づいた発現プロファイリングは、例えば、「Microarray Biochip Technology」(Mark Schena、Eaton Publishing、2000年)等に開示されている方法によって実施することができる。
DNAチップは、数多くの遺伝子を検出するための固定化された高密度プローブを含む。したがって、多数の遺伝子の発現レベルを1回の分析で同時に推定することができる。すなわち、試料の発現プロファイルを1つのDNAチップを用いて測定することができる。本発明のDNAチップに基づいた方法は、以下の段階：
(1)マーカー遺伝子に対応するaRNAまたはcDNAを合成する段階；
(2) aRNAまたはcDNAにマーカー遺伝子のプローブをハイブリダイズさせる段階；および
(3)プローブをハイブリダイズさせたaRNAまたはcDNAを検出し、mRNAの量を定量する段階
を含む。
aRNAは、RNAポリメラーゼを用いて鋳型cDNAから転写されるRNAをいう。DNAチップに基づいた発現プロファイリングのaRNA転写キットは市販されている。このようなキットを用いて、T7 RNAポリメラーゼを使用して、鋳型としてT7プロモーターが結合したcDNAからaRNAを合成することができる。一方、ランダムプライマーを使用するPCRによって、mRNAから合成したcDNAを鋳型として使用してcDNAを増幅することができる。
あるいは、DNAチップは、本発明のマーカー遺伝子を検出するために、その上にスポット化されているプローブを含む。DNAチップにスポット化されるマーカー遺伝子の数に制限はない。例えば、本発明のマーカー遺伝子の5%以上、好ましくは20%以上、より好ましくは50%以上、さらにより好ましくは70%以上を選択することができる。任意の他の遺伝子およびマーカー遺伝子をDNAチップ上にスポット化することができる。例えば、発現レベルがほどんど変化しない遺伝子のプローブをDNAチップにスポット化することができる。アッセイ結果を複数のチップ間または異なるアッセイ間で比較することが目的である場合には、このような遺伝子はアッセイ結果を正規化するために使用することができる。
プローブは、選択され、DNAチップにスポット化される各マーカー遺伝子に対して設計される。このようなプローブは、例えば、5〜50のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。DNAチップ上にこのようなオリゴヌクレオチドを合成する方法は当業者に既知である。さらに長いDNAをPCRによってまたは化学的に合成することができる。PCR等によって合成された長いDNAをガラススライド上にスポット化する方法も当業者に公知である。上記の方法によって得られるDNAチップは、本発明により非小細胞肺癌を診断するために使用することができる。
調製したDNAチップにaRNAを接触させ、次にプローブとaRNAと間のハイブリダイゼーションを検出する。aRNAは、従来のように、蛍光色素で標識することができる。aRNAを標識するためにCy3(赤)およびCy5(緑)などの蛍光色素を使用することができる。対象および対照に由来するaRNAを、それぞれ異なる蛍光色素で標識する。両者の発現レベルの差は、シグナル強度の差に基づいて推定することができる。DNAチップ上の蛍光色素のシグナルはスキャナーで検出され、特殊なプログラムを使用して解析することができる。例えば、Affymetrix社製のSuiteは、DNAチップ解析のためのソフトウェアパッケージである。
非小細胞肺癌を治療または予防する方法
本発明は、被験者の非小細胞肺癌を治療、軽減、または予防する方法を提供する。治療用化合物を、非小細胞肺癌の被験者、または非小細胞肺癌を発症する危険性のある（すなわち発症しやすい）被験者に、予防的または治療的に投与する。このような被験者は、標準的な臨床的方法を用いて、またはNSC 1〜1448の異常な発現レベルもしくは活性を検出することで同定される。予防的投与は、疾患または障害の出現が妨げられるか、またはその進行が遅れるように、疾患の明瞭な臨床症状が現れる前に行う。
治療法は、非小細胞肺癌細胞が由来するものと同じ組織の正常細胞と比較して、非小細胞肺癌細胞で発現が減少している遺伝子（発現低下遺伝子）の1つもしくは複数の遺伝子産物の発現もしくは機能、またはこの両方を増加させる段階を含む。このような方法では、被験者において1つもしくは複数の発現低下遺伝子（NSC 1〜806）の量を増加させる、有効量の化合物で被験者を治療する。投与は全身投与または局所投与とすることができる。治療用化合物は、発現低下遺伝子のポリペプチド産物、または生物学的に活性なこの断片、非小細胞肺癌細胞における遺伝子発現を可能とする、発現制御エレメントの下流の発現低下遺伝子をコードする核酸、非小細胞肺癌細胞に内因的に存在するこのような遺伝子の発現レベルを増加させる化合物（すなわち、発現低下遺伝子の発現を上方制御する化合物）を含む。このような治療用化合物の投与は、被験者の肺細胞の異常発現低下遺伝子の作用に対抗し、被験者の臨床状態を改善する。このような化合物は、上述した本発明のスクリーニング法で得ることができる。
本方法はまた、非小細胞肺癌細胞が由来する同じ種類の組織の正常な細胞と比較して、非小細胞肺癌細胞において発現が異常に増加されている(「過剰発現遺伝子」)遺伝子の1つまたは複数の遺伝子産物の発現もしくは機能、またはその両方を低下させる段階を含む。発現は、当技術分野において公知の任意の方法によって阻害してもよい。例えば、対象における過剰発現遺伝子(NSC 807-1448)の1つまたは複数の量を低下させる有効な量の化合物で対象を治療してもよい。化合物の投与は全身的であっても、局所的であってもよい。このような治療作用のある化合物には、非小細胞肺癌細胞に内因的に存在するこのような遺伝子の発現レベルを低下させる化合物(すなわち、過剰発現遺伝子の発現を下方制御する化合物)が含まれる。このような治療作用のある化合物の投与は、対象の非小細胞肺癌細胞において異常に過剰発現された遺伝子の影響を相殺し、対象の臨床状態を改善することが期待される。このような化合物は、上記の本発明のスクリーニング方法によって得ることができる。
タンパク質(NSC 1〜1448)の活性を調節し、本発明の非小細胞肺癌を治療または予防するために使用することができる化合物には、タンパク質以外に、これらのタンパク質の天然の同族のリガンド、ペプチド、ペプチド模倣物、および他の小分子が含まれる。
あるいは、過剰に発現した遺伝子（NSC 807〜1448）の発現は、過剰発現遺伝子の発現を阻害するかまたはそれに拮抗する核酸を被験者に投与することにより阻害することができる。過剰発現遺伝子の発現を乱すアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、またはリボザイムを、過剰発現遺伝子の発現を阻害するために使用することができる。
上述したように、NSC 807〜1448の任意のヌクレオチド配列に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドを、NSC 807〜1448の発現レベルを減少させるために使用できる。非小細胞肺癌で上方制御される、NSC 807〜1448に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非小細胞肺癌の治療または予防に有用である。具体的には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、NSC 807〜1448にコードされた任意のポリペプチド、またはこれに対応するmRNAに結合することで、遺伝子の転写または翻訳を阻害するか、mRNAの分解を促進するか、および/またはNSCヌクレオチドにコードされたタンパク質の発現を阻害し、最終的にタンパク質の機能を阻害することによって作用しうる。本明細書で用いる、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」という表現は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的配列と特異的にハイブリダイズ可能な限りにおいて、標的配列の全体に相補的なヌクレオチドと、1つもしくは複数のヌクレオチドのミスマッチを有するヌクレオチドの両方を含む。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのすべてにおいてNSCLC細胞株のフォーカス形成の抑制に効果を有することが明らかとなっている、配列番号：423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、469、471、473、475、477、479、481、483、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、505、507、509、511、513、515、517、519、521、523、525、527、529、および531のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。加えて、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、NSC 807〜1448の任意のヌクレオチド配列に対して、少なくとも15残基の連続ヌクレオチドの範囲にわたって少なくとも70%またはこれ以上、好ましくは80%またはこれ以上、より好ましくは90%またはこれ以上、さらにより好ましくは95%またはこれ以上の相同性を有するポリヌクレオチドを含む。当技術分野で周知のアルゴリズムを、相同性の決定に使用することができる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体または修飾産物を、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして本発明で使用することもできる。このような修飾産物の例には、メチルホスホネート型またはエチルホスホネート型などの低級アルキルホスホネート修飾、ホスホロチオエート修飾、およびホスホロアミデート修飾がある。
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびこの誘導体は、NSC 807〜1448にコードされたタンパク質を産生する細胞に対し、タンパク質をコードするDNAまたはmRNAと結合し、転写もしくは翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、かつタンパク質の発現を阻害することによって作用し、その結果タンパク質機能を阻害する。
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびこの誘導体は、誘導体に対して不活性な適切な基剤と混合することにより、塗布剤またはパップ剤などの外用剤になりうる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、NSC 807〜1448の任意の1つにコードされた少なくとも1つのNSCタンパク質の発現を阻害するので、タンパク質の生物学的活性を抑制するのに有用である。
過剰発現遺伝子の1つもしくは複数の遺伝子産物を阻害するポリヌクレオチドには、NSC 807〜1448の過剰発現されるNSCタンパク質をコードするヌクレオチド配列のセンス鎖の核酸と、アンチセンス鎖の核酸の組み合わせを含む低分子干渉RNA（siRNA）も含まれる。「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨げる2本鎖RNA分子を意味する。siRNAを細胞に導入する標準的な手法は、DNAがRNAを転写するテンプレートである手法を含め、本発明の治療または予防に使用可能である。このようなsiRNAは、1つの転写物が、標的遺伝子に由来するセンス配列と相補的なアンチセンス配列の両方を有するように構築される（例えばヘアピン型）。
この方法を用いて、NSC遺伝子の発現が上方制御された細胞の遺伝子発現を抑制する。標的細胞でsiRNAとNSC遺伝子転写物が結合すると、細胞によるNSCタンパク質の産生が減少する。オリゴヌクレオチドの長さは少なくとも10ヌクレオチドであり、天然の転写物と同じ長さでもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドの長さは19〜25ヌクレオチドである。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドの長さは75ヌクレオチド、50ヌクレオチド、または25ヌクレオチド未満である。本発明の好ましいsiRNAは、そのすべてにおいてNSCLC細胞株の生存性を低下させるために有効であることが明らかとなっている、配列番号：533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、および552のヌクレオチド配列を有するポリペプチドを標的配列として含む。
さらに、siRNAのヌクレオチド配列は、Ambion社のウェブサイト（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）から利用可能なsiRNA設計コンピュータプログラムを用いて設計することができる。siRNAのヌクレオチド配列は、以下のプロトコルを元にコンピュータプログラムによって選択される：
siRNA標的部位の選択：
1．転写物のAUG開始コドンを出発点として、AAジヌクレオチド配列を求めて下流をスキャンする。潜在的なsiRNA標的部位として、個々のAAおよび3'側に隣接する19ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschlらは、5'および3'側の非翻訳領域（UTR）、および開始コドンに近い領域（75塩基以内）に対するsiRNAを設計しないように推奨している。というのは、これらの領域は、調節タンパク質結合部位に富む可能性があり、そのために、これらの領域に対して設計されたsiRNAとエンドヌクレアーゼの複合体が、UTR結合タンパク質、および/または翻訳開始複合体の結合に干渉する恐れがあるからである。
2．潜在的な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較し、他のコード配列に対して有意な相同性をもついかなる標的配列も検討対象から除く。相同性検索は、NCBIのサーバー上（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）にあるBLASTを用いて実施することができる。
3．合成に適した標的配列を選択する。Ambion社のウェブサイト上で、複数の好ましい標的配列を、評価対象遺伝子の全体に沿って選択することができる。
このようなsiRNAは、過剰発現されるNSCタンパク質の発現を阻害するので、タンパク質の生物学的活性の抑制に有用である。したがって、siRNAを含む組成物は、非小細胞肺癌の治療または予防に有用である。
過剰発現遺伝子の1つもしくは複数の遺伝子産物を阻害する核酸には、過剰発現遺伝子（NSC 807〜1448）に対するリボザイムも含まれる。
本リボザイムは過剰発現したNSCタンパク質の発現を阻害し、これによりタンパク質の生物学的活性の抑制に有効である。したがって、本リボザイムを含む組成物は非小細胞肺癌の治療または予防に有用である。
一般にリボザイムは、大型リボザイムと小型リボザイムに分けられる。大型リボザイムは、核酸のリン酸エステル結合を切断する酵素として知られる。大型リボザイムとの反応後、反応部位は5'-リン酸基および3'-ヒドロキシル基からなる。大型リボザイムはさらに、（1）グアノシンによる5'-スプライス部位におけるエステル転移反応を触媒するグループIイントロンRNA；（2）投げ縄構造を介した2段階反応による自己スプライシングを触媒するグループIIイントロンRNA；ならびに（3）tRNA前駆体を5'部位で加水分解によって切断するリボヌクレアーゼPのRNA成分に分類される。一方、小型リボザイムは、大型リボザイムと比べて大きさが小さく（約40 bp）、RNAを切断して、5'-ヒドロキシル基および2'-3'環状リン酸を生じる。ハンマーヘッド型リボザイム（Koizumiら（1988）FEBS Lett. 228：225）、およびヘアピン型リボザイム（Buzayan（1986）Nature 323：349；KikuchiおよびSasaki（1992）Nucleic Acids Res. 19：6751）は小型リボザイムに含まれる。リボザイムの設計および構築の方法は当技術分野で周知であり（Koizumiら（1988）FEBS Lett. 228：225；Koizumiら（1989）Nucleic Acids Res. 17：7059；KikuchiおよびSasaki（1992）Nucleic Acids Res. 19：6751を参照）、過剰発現されるNSCタンパク質の発現を阻害するリボザイムは、NSCタンパク質をコードするヌクレオチド配列の配列情報を元に、リボザイムを作製する従来の方法に従い構築することができる。
リボザイムは、過剰発現されるNSCタンパク質の発現を阻害するので、タンパク質の生物学的活性を抑制するのに有用である。したがって、リボザイムを含む組成物は、非小細胞肺癌の治療または予防に有用である。
あるいは、過剰発現遺伝子の1つもしくは複数の遺伝子産物の機能を、遺伝子産物に結合するか、さもなくば遺伝子産物の機能を阻害する化合物を投与することで阻害する。例えば、このような化合物は、過剰発現された遺伝子産物または複数の遺伝子産物に結合する抗体である。
本発明は、抗体の使用、特に、発現が促進される遺伝子にコードされたタンパク質に対する抗体、または抗体断片の使用に関する。本明細書で用いる「抗体」という用語は、抗体合成に使用される抗原を含む分子（すなわち、上方制御される遺伝子産物）、またはこれにごく近縁の抗原と特異的に相互作用する（結合する）、特異的な構造をとる免疫グロブリン分子を意味する。過剰発現されるNSCヌクレオチドに結合する抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形状をとる場合があり、これにはウサギなどの動物をポリペプチドで免疫処置することで得られる抗血清、全クラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝的組換えによって作製されたヒト化抗体が含まれる。
さらに、本発明の非小細胞肺癌を治療または予防する方法で使用される抗体は、マーカー遺伝子にコードされた1つもしくは複数のタンパク質と結合する限りにおいて、抗体または修飾抗体の断片の場合がある。例えば抗体断片は、Fab、F(ab')2、Fv、または、H鎖およびL鎖に由来するFv断片が適切なリンカーで連結された1本鎖Fv（scFv）の場合がある（Hustonら（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-83）。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインやペプシンなどの酵素で処理することで得られる場合がある。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Coら（1994）J. Immunol. 152：2968-76；Better M.およびHorwitz（1989）Methods Enzymol. 178：476-96；PluckthunおよびSkerra（1989）Methods Enzymol. 178：497-515；Lamoyi（1986）Methods Enzymol. 121：652-63；Rousseauxら（1986）Methods Enzymol. 121：663-9；BirdおよびWalker（1991）Trends Biotechnol. 9：132-7を参照）。
抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）などのさまざまな分子との結合によって修飾することができる。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することで得られる。このような修飾法は当技術分野で常套的なものである。
あるいは抗体は、非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とのキメラ抗体として、または、非ヒト抗体由来の相補性決定領域（CDR）、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR）、および定常領域を含むヒト化抗体として得ることができる。このような抗体は、既知の手法で調製することができる。
本発明は、過剰発現されるNSCポリペプチドに対する抗体を用いて非小細胞肺癌を治療または予防する方法を提供する。この方法によると、NSCポリペプチドに対する、薬学的有効量の抗体を投与する。過剰発現されるNSCポリペプチドに対する抗体を、NSCタンパク質の活性を減少させるのに十分な用量で投与する。あるいは、腫瘍細胞に特異的な細胞表面マーカーと結合する抗体を、薬物送達のツールとして用いることができる。したがって例えば、細胞傷害性薬剤を結合させた過剰発現されるNSCポリペプチドに対する抗体を、腫瘍細胞を損傷するのに十分な用量で投与することができる。
本発明は、NSC 807〜1448からなる群より選択される核酸にコードされたポリペプチド、もしくは同ポリペプチドの免疫学的に活性な断片、または同ポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを被験者に投与する段階を含む、被験者の非小細胞肺癌を治療または予防する方法にも関する。このようなポリペプチドの投与は、抗腫瘍免疫を被験者に誘導する。したがって、本発明は抗腫瘍免疫を誘導する方法をさらに提供する。このようなポリペプチド、またはその免疫学的に活性なこの断片は、非小細胞肺癌に対するワクチンとして有用である。場合によっては、タンパク質またはこの断片を、T細胞受容体（TCR）に結合した状態で、またはマクロファージ、樹状細胞（DC）、もしくはB細胞などの抗原提示細胞（APC）上に提示された状態で投与することができる。DCの抗原提示能力は強いため、APCの中でもDCの使用が最も好ましい。
本発明では、「非小細胞肺癌に対するワクチン」という表現は、動物への接種時に、抗腫瘍免疫、または非小細胞肺癌を抑制する免疫を誘導する機能をもつ物質を意味する。一般に抗腫瘍免疫は、以下のような免疫応答を含む：
- 腫瘍に対する細胞傷害性リンパ球の誘導、
- 腫瘍を認識する抗体の誘導、および
- 抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
したがって、あるタンパク質が、動物への接種時に上記免疫応答の任意の1つを誘導する場合、そのタンパク質は抗腫瘍免疫誘導作用をもつと判断される。タンパク質による抗腫瘍免疫の誘導は、そのタンパク質に対する宿主における免疫系の応答を、インビボまたはインビトロで観察することで検出できる。
例えば、細胞傷害性Tリンパ球の誘導を検出する方法は周知である。生体に侵入する外来物質は、抗原提示細胞（APC）の作用によってT細胞およびB細胞に提示される。APCによって提示された抗原に抗原特異的に応答するT細胞は、抗原による刺激のために細胞傷害性T細胞（または細胞傷害性Tリンパ球；CTL）に分化し、後に増殖する（これはT細胞の活性化と呼ばれる）。したがって、あるペプチドによるCTLの誘導は、ペプチドをAPCによってT細胞に提示させ、CTLの誘導を検出することで評価できる。またAPCは、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、マクロファージ、好酸球、およびNK細胞を活性化する効果をもつ。CD4+ T細胞は抗腫瘍免疫にも重要なので、ペプチドの抗腫瘍免疫誘導作用を、これらの細胞の活性化効果を指標として用いることで評価できる。
樹状細胞（DC）をAPCとして用いてCTLの誘導作用を評価する方法は当技術分野で周知である。DCは、APCの中で極めて強力なCTL誘導作用を有する代表的なAPCである。この方法では、最初に試験ポリペプチドをDCに接触させ、次にDCをT細胞に接触させる。DCとの接触後に対象細胞に対して細胞傷害作用を有するT細胞が検出されることは、試験ポリペプチドが、細胞傷害性T細胞を誘導する活性を有することを示す。腫瘍に対するCTLの活性は例えば、51Cr-標識腫瘍細胞の溶解を指標として用いて検出できる。あるいは3H-チミジンの取り込み活性、またはLDH（ラクトースデヒドロゲナーゼ）の放出を指標として用いることで、腫瘍細胞の損傷度を評価する方法も周知である。
DCのほかに、末梢血単核球（PBMC）をAPCとして使用することもできる。CTLの誘導は、PBMCをGM-CSFおよびIL-4の存在下で培養することで増強されることが報告されている。同様にCTLは、PBMCをキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）およびIL-7の存在下で培養することで誘導されることが示されている。
これらの方法でCTL誘導活性をもつことが確認された試験ポリペプチドは、DC活性化効果と、これに続くCTL誘導活性を有するポリペプチドである。したがって、腫瘍細胞に対するCTLを誘導するポリペプチドは、非小細胞肺癌に対するワクチンとして有用である。またポリペプチドに接触させることによって、非小細胞肺癌に対するCTLを誘導する能力を獲得したAPCは、非小細胞肺癌に対するワクチンとして有用である。またAPCによるポリペプチド抗原の提示によって細胞傷害性を獲得したCTLを、非小細胞肺癌に対するワクチンとして使用することもできる。APCおよびCTLによる抗腫瘍免疫を利用する、非小細胞肺癌のこうした治療法は細胞免疫療法と呼ばれる。
一般に、細胞免疫療法にポリペプチドを用いる場合、さまざまな構造をとる複数のポリペプチドを組み合わせて、これをDCに接触させることにより、CTL誘導の効率が高くなること知られている。したがって、DCをタンパク質断片で刺激する際は、複数の種類の断片の混合物を用いることが有利である。
あるいは、ポリペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することで確認できる。例えば、ポリペプチドに対する抗体を、そのポリペプチドを接種した実験動物で誘導し、そして腫瘍細胞の成長、増殖、もしくは転移が、その抗体で抑制された場合、そのポリペプチドが抗腫瘍免疫を誘導する能力をもつと判断してよい。
抗腫瘍免疫を本発明のワクチンを投与することで誘導すると、抗腫瘍免疫の誘導によって非小細胞肺癌の治療および予防が可能となる。非小細胞肺癌に対する治療または発症予防は、NSCLC細胞の成長阻害、NSCLC細胞の退縮、およびNSCLC細胞の出現抑制などの任意の段階を含む。非小細胞肺癌に罹患している個体の死亡率の減少、血中のNSCマーカーの減少、非小細胞肺癌に伴う検出可能な症状の緩和なども、非小細胞肺癌の治療または予防に含まれる。このような治療および予防効果は、好ましくは統計的に有意である。例えば、非小細胞肺癌に対するワクチンの治療効果または予防効果を、ワクチンを投与していない対照と比較する観察において、5%以下は有意水準である。例えばスチューデントのt検定、Mann-WhitneyのU検定、またはANOVAを統計解析に用いることができる。
免疫学的活性を有する上述のタンパク質、または同タンパク質をコードするポリヌクレオチドもしくはベクターをアジュバントと組み合わせることができる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と同時に（または連続的に）投与したときに、タンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を意味する。アジュバントの例には、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ミョウバンなどがあるが、これらに限定されない。また本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体を適切に組み合わせることができる。このような担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液などがある。また、ワクチンは必要に応じて安定剤、懸濁剤、保存剤、界面活性剤などを含む場合がある。ワクチンは全身投与または局所投与する。ワクチンの投与は、1回の投与で実施してもよく、または複数回投与によって追加免疫してもよい。
APCまたはCTLを本発明のワクチンとして使用すると、非小細胞肺癌を、例えばエクスビボの方法で治療または予防することができる。具体的には、治療または予防を受けた被験者のPBMCを回収し、この細胞にポリペプチドをエクスビボで接触させ、APCもしくはCTLを誘導後に、細胞を被験者に投与することができる。APCは、ポリペプチドをコードするベクターをPBMCにエクスビボで導入することで誘導することもできる。インビトロで誘導されたAPCまたはCTLをクローン化してから投与することができる。標的細胞を破壊する高い活性を有する細胞をクローン化して増やすことで、細胞免疫療法を、より効果的に実施することができる。また、このように単離されたAPCおよびCTLを、細胞が由来する個体に対してだけでなく、他の個体の類似のタイプの疾患に対する細胞免疫療法にも用いることができる。
非小細胞肺癌の治療または予防のための薬学的組成物
本発明は、非小細胞肺癌関連遺伝子の発現または活性を変化させる化合物に関する本スクリーニング方法によって選択された化合物を含む、非小細胞肺癌の治療または予防のための組成物を提供する。
本発明のスクリーニング方法によって単離された化合物を、細胞増殖性疾患（例えば、非小細胞肺癌）を治療するために、ヒトおよび他の哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、チンパンジーに対して医薬品として投与する場合には、単離された化合物を直接投与することもでき、または従来の薬剤調製法を用いて剤形として製剤化することもできる。本組成物のこのような医薬製剤には、経口的、直腸内、鼻内、局所外用（口腔内および舌下を含む）、腟内もしくは非経口的（筋肉内、皮下、および静脈内を含む）投与のため、または吸入もしくは吹送による投与のために適した製剤が含まれる。製剤は任意で個別の投薬単位としてパッケージ化される。
経口投与に適した薬学的製剤には、それぞれ所定量の活性成分を含むカプセル、カシェ剤、または錠剤などがある。製剤には、散剤、顆粒、溶液、懸濁液、または乳濁液も含まれる。活性成分は、任意でボーラス、舐剤、またはペーストとして投与される。経口投与用の錠剤およびカプセルは、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、または湿潤剤などの従来の賦形剤を含む場合がある。錠剤は、任意で1つもしくは複数の製剤成分を用いて、圧縮または成形により作製することができる。圧縮錠剤は、粉末または顆粒などの流動状の活性成分を、任意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑剤、表面活性剤、または分散剤と混合して適切な装置で圧縮することで調製することができる。成形錠剤（compressed tablet）は、適切な装置内で、不活性希釈液で湿らせた粉末状化合物の混合物を成形することで作製できる。錠剤は、当技術分野で周知の方法にしたがって被覆することができる。経口流体調製物は例えば、水性もしくは油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、またはエリキシルの状態であってよく、または使用前に水もしくは他の適切な溶媒で再構成するための乾燥製品としてもよい。このような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性溶媒（食用油を含む場合がある）、または保存剤などの従来の添加剤を含む場合がある。錠剤は任意選択で、インビボにおける活性成分の緩やかな放出、すなわち徐放性を提供するように製剤化することができる。錠剤の包装は、月に1回服用される1個の錠剤を含む場合がある。これらの調整物の薬剤の剤型または用量は、適切な用量を服用可能な指示された範囲内とする。
非経口投与する製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を対象レシピエントの血液と等張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌性注射溶液；ならびに懸濁剤および濃化剤を含みうる水性および非水性の滅菌済み懸濁液などがある。製剤は、単位用量または複数回投与用の容器中、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中に入れることが可能であり、また使用直前に滅菌液体担体（例えば生理食塩水や注射用水）を添加するだけの凍結乾燥条件で貯蔵することができる。あるいは製剤を、持続注入用とすることができる。即時調合注射溶液および懸濁液は、既に説明した種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
経腸投与用の製剤には、カカオバターやポリエチレングリコールなどの標準的な担体を含む坐剤などがある。口腔への局所投与、例えば頬または舌下に投与する製剤には、ショ糖およびアカシアなどの香味基剤またはトラガカントなどに活性成分を含むトローチ剤、ならびにゼラチン、グリセリン、ショ糖、またはアカシアなどの基剤中に活性成分を含む香錠が含まれる。活性成分を鼻内投与する場合、液体スプレー、または分散性粉末、または液滴状態を用いることができる。液滴は、1種類もしくは複数の分散剤、可溶化剤、または懸濁剤も含む、水性もしくは非水性の基剤で製剤化することができる。
吸入投与では、組成物は、インサフレーター、ネブライザー、加圧容器、または他の便宜なエアロゾルスプレー送達手段から都合よく投与される。加圧容器は、適切な噴霧剤（ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、炭酸ガス、または他の適切なガス）を含む場合がある。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、一定量を送達するバルブを提供することで決定することができる。
あるいは、吸入もしくは吹送による投与では、組成物は、乾燥粉末組成物、例えば活性成分と、乳糖やデンプンなどの適切な粉末基剤からなる粉末混合体の形状をとる場合がある。粉末組成物は、吸入器またはインサフレーターを利用して粉末を投与可能な、例えばカプセル、カートリッジ、ゼラチン、またはブリスター包装中の単位投与剤形とすることができる。
他の製剤には、治療薬を放出する、移植可能な装置および粘着性パッチなどがある。
望ましい場合、活性成分が徐放性となるように適合した上記の製剤を使用することができる。薬学的組成物は、抗菌剤、免疫抑制剤、または保存剤などの他の活性成分を含む場合もある。
上記で特に言及した成分に加えて、本発明の製剤は、当該製剤の種類に関して当技術分野で周知の他の薬剤を含みうることが理解されるべきであり、例えば経口投与に適した製剤は、香味剤を含みうる。
好ましい単位投与剤型は、後述するような、活性成分の有効用量、またはこの適切な画分を含む剤型である。
上述の各条件に関しては、組成物（例えばポリペプチドや有機化合物）を、約0.1〜約250 mg/kg/日の用量で経口投与または注射する。成人の用量範囲は一般に、約5 mg〜約17.5 g/日であり、好ましくは約5 mg〜約10 g/日であり、最も好ましくは約100 mg〜約3 g/日である。個別の単位で提供される錠剤または他の単位投与剤型は、便宜上、同一単位量を複数回投与した量で有効性を示すような単位量、例えば約5 mg〜約500 mg、通常は約100 mg〜約500 mgを含む量を含む。
使用される用量は、被験者の年齢および性別、治療する正確な疾患、およびその重症度を含む、いくつかの因子に依存する。投与経路も、条件および重症度によって変動する場合がある。
本発明はさらに、NSC 807〜1448の群より選択される任意の1つの遺伝子の発現を阻害する活性成分を含む、非小細胞肺癌を治療または予防するための組成物を提供する。このような活性成分は、対象遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、もしくはリボザイム、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、もしくはリボザイムの発現ベクターなどの誘導体の場合がある。活性成分は、誘導体に対して不活性な適切な基剤と混合することにより、塗布剤またはパップ剤などの外用剤に使用することができる。
また必要に応じて、このような活性成分を、賦形剤、等張剤、可溶化剤、保存剤、鎮痛剤などを添加することにより、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、溶液、点鼻薬、および凍結乾燥剤に製剤化することができる。これらは、医薬を含む核酸を調製する従来の方法で調製することができる。
好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体、siRNA誘導体、またはリボザイム誘導体を、患部に直接塗布することで、または患部に到達するように血管内に注入することで患者に投与する。封入剤を組成物中に使用することで、持続性および膜透過性を高めることもできる。封入剤の例には、リポソーム、ポリ-L-リシン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、およびこれらの誘導体などがある。
このような組成物の用量は、患者の条件にあわせて適切に調整し、かつ所望の量を用いることができる。例えば0.1〜100 mg/kg、好ましくは0.1〜50 mg/kgの用量範囲で投与することができる。
本発明の別の態様は、NSC 807〜1448の群より選択される遺伝子の任意の1つにコードされたポリペプチドに対する抗体、または同ポリペプチドに結合する抗体の断片を含む、非小細胞肺癌を治療または予防するための組成物である。
症状によってある程度の差があるものの、非小細胞肺癌を治療または予防するための抗体またはこの断片の用量は、正常な成人（体重60 kg）に経口投与する場合、約0.1 mg〜約100 mg/日、好ましくは約1.0 mg〜約50 mg/日、より好ましくは約1.0 mg〜約20 mg/日である。
注射液の状態で正常な成人（体重60 kg）に非経口的に投与する場合は、患者の状態、疾患の症状、および投与方法によってある程度の差はあるものの、約0.01 mg〜約30 mg/日、好ましくは約0.1〜約20 mg/日、より好ましくは約0.1〜約10 mg/日の用量を静脈内注射することが好都合である。また他の動物の例でも、体重60 kgに換算した量を投与することが可能である。
ポリペプチド
本発明によれば、対応する非癌性組織と比較して非小細胞肺癌でその発現が顕著に亢進している新規ヒト遺伝子URLC 1（NSC 905）が提供される。
URLC 1（NSC 905）はTUDORドメインをコードする。TUDORドメインはRNA結合および核酸結合の機能を有することが示唆されている。この遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号：1に示されており、この遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は配列番号：2に示されている。
これらの遺伝子は癌細胞に対して発癌活性を付与することが示唆されており、これらのタンパク質の活性の阻害は、癌、特に非小細胞肺癌の治療のための有望な戦略であると考えられる。
本発明は、配列番号：1から選択されるヌクレオチド配列を含む新規ヒト遺伝子のほか、それらの縮重物および変異体も、それらが配列番号：2に示されたアミノ酸配列を含むNSCタンパク質またはその機能的同等物をコードする範囲で含む。本明細書では以後、これらの遺伝子によってコードされるポリペプチドをNSCタンパク質と総称する。NSCタンパク質と機能的に等価なポリペプチドの例には、例えば、ヒトNSCタンパク質に対応する他の生物の相同タンパク質のほか、ヒトNSCタンパク質の変異体が含まれる。
本発明において、「機能的に等価な」という用語は、対象ポリペプチドが、任意のNSCタンパク質のように細胞増殖を促進するとともに、癌細胞に発癌活性を付与する活性を有することを意味する。対象ポリペプチドが細胞増殖活性を有するか否かは、対象ポリペプチドをコードするDNAをそれぞれのポリペプチドを発現する細胞に導入し、細胞増殖の促進またはコロニー形成活性の増加を検出することによって判定しうる。
所定のタンパク質と機能的に等価なポリペプチドを調製するための方法は当業者に周知であり、これにはタンパク質に変異を導入する既知の方法が含まれる。例えば、当業者は、ヒトNSCタンパク質と機能的に等価なポリペプチドを、これらのタンパク質のいずれかのアミノ酸配列に部位特異的変異誘発法によって適切な変異を導入することによって調製することができる（Hashimoto-Gotohら、Gene 152: 271-5 (1995)；ZollerおよびSmith、Methods Enzymol 100: 468-500 (1983)；Kramerら、Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)；KramerおよびFritz、Methods Enzymol 154: 350-67 (1987)；Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-92 (1985)；Kunkel, Methods Enzymol 85: 2763-6 (1988)）。アミノ酸変異は自然下でも起こりうる。本発明のポリペプチドには、1つまたは複数のアミノ酸が変異したヒトNSCタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質が、その結果生じた変異ポリペプチドがヒトNSCタンパク質と機能的に等価であるという前提で含まれる。このような変異体において変異させるアミノ酸の数は一般に10アミノ酸またはそれ未満であり、好ましくは6アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは3アミノ酸またはそれ未満である。
特定のアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、除去、挿入、および／または付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質である変異タンパク質または改変タンパク質は、元の生物学的活性を保つことが知られている（Markら、Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984)；ZollerおよびSmith、Nucleic Acids Res 10: 6487-500 (1982)；Dalbadie-McFarlandら、Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。
変異させるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の特性が保存されている異なるアミノ酸に変異させることが好ましい（保存的アミノ酸置換として知られる工程）。アミノ酸側鎖の特性の例には、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、および、以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖がある：脂肪族側鎖（G、A、V、L、I、P）；水酸基含有側鎖（S、T、Y）；硫黄原子含有側鎖（C、M）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（D、N、E、Q）；塩基含有側鎖（R、K、H）；および芳香族含有側鎖（H、F、Y、W）。括弧内の文字はアミノ酸の一文字略号を示すことに注意されたい。
ヒトNSCタンパク質のアミノ酸配列に1つまたは複数のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドの一例は、ヒトNSCタンパク質を含む融合タンパク質である。融合タンパク質とは、ヒトNSCタンパク質と他のペプチドまたはタンパク質との融合物のことであり、これは本発明に含まれる。融合タンパク質は、本発明のヒトNSCタンパク質をコードするDNAを他のペプチドまたはタンパク質をコードするDNAとフレームが合致するように連結し、この融合DNAを発現ベクターに挿入して、それを宿主において発現させることといった当業者に周知の技法によって作製しうる。本発明のタンパク質と融合させるペプチドまたはタンパク質には制限はない。
本発明のNSCタンパク質と融合させるペプチドとして用いうる既知のペプチドには、例えば、FLAG（Hoppら、Biotechnology 6: 1204-10 (1988)）、6個のHis（ヒスチジン）残基を含む6xHis、10xHis、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-myc断片、VSP-GP断片、p18HIV断片、T7タグ、HSVタグ、Eタグ、SV40T抗原断片、lckタグ、α-チューブリン断片、Bタグ、プロテインC断片などが含まれる。本発明のタンパク質と融合させうるタンパク質の例には、GST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）、インフルエンザ凝集素（HA）、免疫グロブリン定常領域、β-ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）などが含まれる。
融合タンパク質は、上に考察した融合ペプチドまたはタンパク質をコードする市販のDNAを本発明のNSCポリペプチドをコードするDNAと融合させ、調製された融合DNAを発現させることによって調製しうる。
機能的に等価なポリペプチドを単離するための当技術分野で知られた代替的な方法には、例えば、ハイブリダイゼーション法を用いる方法がある（Sambrookら、「Molecular Cloning」第2版、9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)）。当業者は、NSCタンパク質をコードするDNA配列（すなわち、配列番号：1）に対して高い相同性を有するDNAを容易に単離して、単離されたDNAからヒトNSCタンパク質と機能的に等価なポリペプチドを単離することができる。本発明のNSCタンパク質には、ヒトNSCタンパク質をコードするDNA配列の全体または一部とハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつヒトNSCタンパク質と機能的に等価なものが含まれる。これらのポリペプチドには、ヒト由来のタンパク質に対応する哺乳動物の相同体（例えば、サル、ラット、ウサギ、およびウシの遺伝子によってコードされるポリペプチド）が含まれる。ヒトNSCタンパク質をコードするDNAに対して高度に相同なcDNAを動物から単離する際には、肺癌組織を用いることが特に好ましい。
ヒトNSCタンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって日常的に選択されうる。例えば、30分間またはそれ以上にわたる68℃でのプレハイブリダイゼーションを「Rapid-hyb buffer」（Amersham LIFE SCIENCE）を用いて行い、標識したプローブを添加した上で、1時間またはそれ以上にわたって68℃で加温することによって、ハイブリダイゼーションを行ってもよい。それに続く洗浄段階は、例えば、低ストリンジェント条件下で行いうる。低ストリンジェント条件とは、例えば、42℃、2X SSC、0.1％SDS、または好ましくは50℃、2X SSC、0.1％SDSのことである。高ストリンジェント条件を用いることがより好ましい。高ストリンジェント条件とは、例えば、室温の2X SSC、0.01％SDS中での20分間の洗浄を3回行った後に、37℃の1x SSC、0.1％SDS中での20分間の洗浄を3回行い、50℃の1x SSC、0.1％SDS中での20分間の洗浄を2回行うことである。しかし、温度および塩濃度などのいくつかの要因はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼすと考えられ、当業者は必要なストリンジェンシーを得るためにこれらの要因を適切に選択することができる。
ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）方法を、ヒトNSCタンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするDNAを、タンパク質をコードするDNAの配列情報（配列番号：1）に基づいて合成したプライマーを用いて単離するために用いることもできる。
上記のハイブリダイゼーション法または遺伝子増幅法によって単離されたDNAによってコードされる、ヒトNSCタンパク質と機能的に等価なポリペプチドは、通常、ヒトNSCタンパク質のアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。「高い相同性」とは一般に、40％またはそれ以上、好ましくは60％またはそれ以上、より好ましくは80％またはそれ以上、さらにより好ましくは95％またはそれ以上の相同性を意味する。ポリペプチドの相同性は、「WilburおよびLipman、Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」中のアルゴリズムに従って決定することができる。
本発明のポリペプチドは、その産生のために用いる細胞もしくは宿主または用いる精製方法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に関して変化を有していてもよい。しかし、それが本発明のヒトNSCタンパク質のポリペプチドと等価な機能を有する限り、本発明のポリペプチドは本発明の範囲に含まれる。
本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法により、組換えタンパク質として調製することもでき、または天然タンパク質として調製することもできる。組換えタンパク質は、本発明のポリペプチドをコードするDNA（例えば、配列番号：1のヌクレオチド配列を含むDNA）を適切な発現ベクターに挿入し、そのベクターを適切な宿主細胞に導入して抽出物を入手した上で、抽出物をクロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、もしくは本発明のタンパク質に対する抗体を固定したカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーに供することによって、または上述のカラムの複数を組み合わせることによってポリペプチドを精製することにより、調製することができる。
同じく、本発明のポリペプチドを宿主細胞（例えば、動物細胞および大腸菌）内でグルタチオン-S-トランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、または多数のヒスチジンを追加した組換えタンパク質として発現させる場合には、発現された組換えタンパク質をグルタチオンカラムまたはニッケルカラムを用いて精製することができる。または、本発明のポリペプチドをc-myc、多数のヒスチジン、またはFLAGで標識したタンパク質として発現させる場合には、それぞれc-myc、His、またはFLAGに対する抗体を用いて本発明のポリペプチドを検出して精製することができる。
融合タンパク質を精製した後に、必要に応じてトロンビンまたは第Xa因子で切断することにより、目的のポリペプチド以外の領域を除外することも可能である。
天然のタンパク質は、当業者に知られた方法によって、例えば、下記のNSCタンパク質と結合する抗体を結合させたアフィニティーカラムを、本発明のポリペプチドを発現する組織または細胞の抽出物と接触させることによって単離することができる。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でもよい。
本発明はまた、本発明のNSCタンパク質の部分ペプチドも含む。部分ペプチドは、本発明のポリペプチドに対して特異的なアミノ酸配列を有し、少なくとも7アミノ酸、好ましくは8アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは9アミノ酸またはそれ以上からなる。部分ペプチドは、例えば、本発明のNSCタンパク質に対する抗体を調製するために、本発明のNSCタンパク質と結合する化合物に関してスクリーニングするために、および、本発明のNSCタンパク質の促進物質または阻害因子に関するスクリーニングのために、用いることができる。
本発明の部分ペプチドは、遺伝子操作により、既知のペプチド合成方法により、または本発明のポリペプチドを適切なペプチダーゼで消化することにより、作製可能である。ペプチド合成のためには、例えば、固相合成または液相合成を用いうる。
さらに、本発明は、本発明のNSCタンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のNSCタンパク質は、上記のように本発明のNSCタンパク質のインビボもしくはインビトロでの産生のために用いることができ、または本発明のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝的異常に起因する疾患に対する遺伝子治療のために用いることもできる。mRNA、RNA、cDNA、ゲノムDNA、化学合成されたポリヌクレオチドを含む、本発明のポリヌクレオチドの任意の形態を、それが本発明のNSCタンパク質またはその同等物をコードする限りは用いることができる。本発明のポリヌクレオチドには、所定ヌクレオチド配列を含むDNAのほかに、その縮重配列も、結果として生じるDNAが本発明のNSCタンパク質またはその同等物をコードする限りは含まれる。
本発明のポリヌクレオチドは、当業者に知られた方法によって調製することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは以下によって調製しうる：本発明のNSCタンパク質を発現する細胞からcDNAライブラリーを調製すること、および本発明のDNA（例えば、配列番号：1）の部分配列をプローブとして用いるハイブリダイゼーションを行うこと。cDNAライブラリーは、例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning」、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載された方法によって作製しうるか、または市販のcDNAライブラリーを用いてもよい。cDNAライブラリーを以下によって作製することもできる：本発明のNSCタンパク質を発現する細胞からRNAを抽出すること、本発明のDNA（例えば、配列番号：1）の配列に基づいてオリゴDNAを合成すること、オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行うこと、および、本発明のNSCタンパク質をコードするcDNAを増幅すること。
さらに、得られたcDNAのヌクレオチドのシークエンシングを行うことにより、cDNAによりコードされる翻訳領域を日常的に決定することができ、本発明のNSCタンパク質のアミノ酸配列を容易に得ることができる。その上、得られたcDNAまたはその部分を用いてゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムDNAを単離することができる。
より詳細には、mRNAをまず、本発明の対象NSCタンパク質が発現される細胞、組織、または臓器から調製する。mRNAの単離には既知の方法を用いうる；例えば、全RNAはグアニジン超遠心（Chirgwinら、Biochemistry 18: 5294-9 (1979)）またはAGPC法（ChomczynskiおよびSacchi、Anal Biochem 162: 156-9 (1987)）によって調製しうる。さらに、mRNAをmRNA精製キット（Pharmacia）などを用いて全RNAから精製すること、または、mRNAをQuickPrep mRNA精製キット（Pharmacia）によって直接精製することもできる。
得られたmRNAは、逆転写酵素を用いてcDNAを合成するために用いられる。cDNAは、AMV逆転写酵素第一鎖cDNA合成キット（Seikagaku Kogyo）などの市販のキットを用いて合成しうる。または、本明細書に記載のプライマーなど、5'-Ampli FINDER RACE Kit（Clontech）およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いる5'-RACE法（Frohmanら、Proc Natl Acad Sci USA 85: 8998-9002 (1988)；Belyavskyら、Nucleic Acids Res 17: 2919-32 (1989)）に従って、cDNAの合成および増幅を行うこともできる。
所望のDNA断片をPCR産物から調製し、ベクターDNAと連結する。この組換えベクターを大腸菌などの形質転換に用い、選択したコロニーから所望の組換えベクターを調製する。所望のDNAのヌクレオチド配列を、ジデオキシヌクレオチド鎖伸長反応停止法などの従来の方法によって検証する。
本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、発現のために用いる宿主におけるコドン使用頻度を考慮に入れることにより、より効率的に発現されるように設計することもできる（Granthamら、Nucleic Acids Res 9: 43-74 (1981)）。本発明のポリヌクレオチドの配列を、市販のキットまたは従来の方法によって改変することもできる。例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドもしくは適切なポリヌクレオチド断片の挿入、リンカーの付加、または開始コドン（ATG）および／もしくは終止コドン（TAA、TGA、またはTAG）の挿入によって配列を改変することができる。
詳細には、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：1のヌクレオチド配列を含むDNAを含む。
さらに、本発明は、配列番号：1のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも上記の本発明のNSCタンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを提供する。当業者はストリンジェントな条件を適切に選択してよい。例えば、低ストリンジェント条件を用いることができる。高ストリンジェント条件を用いることがより好ましい。これらの条件は上記のものと同じである。上記のハイブリダイズさせるDNAはcDNAまたは染色体DNAであることが好ましい。
ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明の上記のポリヌクレオチドが内部に挿入されたベクターも提供する。本発明のベクターは、宿主細胞において本発明のポリヌクレオチド、特にDNAを保持して本発明のNSCタンパク質を発現させるため、または本発明のポリヌクレオチドを遺伝子治療の目的で投与するために有用である。
大腸菌が宿主細胞であって、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、DH5α、HB101、またはXL1Blue）の内部で大量に増幅および産生させる場合には、ベクターは、大腸菌内で増幅させるための「ori」、および、形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤によって選択される薬剤抵抗性遺伝子）を有する必要がある。例えば、M13シリーズのベクター、pUCシリーズのベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどを用いることができる。さらに、pGEM-T、pDIRECT、およびpT7を、cDNAのサブクローニングおよび抽出のために、ならびに上記のベクターの目的で用いることもできる。本発明のNSCタンパク質の産生のためにベクターを用いる場合には、発現ベクターが特に有用である。例えば、大腸菌内で発現させようとする発現ベクターは、大腸菌内で増幅されるための上記の特徴を有する必要がある。JM109、DH5α、HB101、またはXL1 Blueなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合には、ベクターは、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現しうるプロモーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら、Nature 341: 544-6 (1989)；FASEB J 6: 2422-7 (1992)）、araBプロモーター（Betterら、Science 240: 1041-3 (1988)）またはT7プロモーターなどを有する必要がある。その点に関して、例えば、pGEX-5X-1（Pharmacia）、「QIAexpress system」（Qiagen）、pEGFPおよびpET（この場合、宿主はT7RNAポリメラーゼを発現するBL21であることが好ましい）を上記のベクターの代わりに用いることもできる。さらに、ベクターが、タンパク質分泌のためのシグナル配列をも含んでもよい。大腸菌の周辺質へのNSCタンパク質の分泌を導くシグナル配列の一例は、pelBシグナル配列（Leiら、J Bacteriol 169: 4379 (1987)）である。ベクターを標的宿主細胞に導入するための手段には、例えば、塩化カルシウム法および電気穿孔法が含まれる。
大腸菌のほかに、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（Invitrogen)およびpEGF-BOS（Nucleic Acids Res 18(17): 5322 (1990)）、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば,「Bac-to-BACバキュロウイルス発現系」（GIBCO BRL）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えば、pMH1、pMH2）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、pZIpneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen）、pNV11、SP-Q01）および枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）を、本発明のポリペプチドの産生のために用いることもできる。
ベクターをCHO細胞、COS細胞、またはNIH3T3細胞などの動物細胞内で発現させるためには、ベクターは、この種の細胞における発現のために必要なプロモーター、例えば、SV40プロモーター（Mulliganら、Nature 277: 108 (1979)）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら、Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)）、CMVプロモーターなどを有する必要があるほか、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬剤（例えば、ネオマイシン、G418）によって選択される薬剤抵抗性遺伝子）を有することが好ましい。これらの特徴を備えた既知のベクターの例には、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSVおよびpOP13が含まれる。
NSCタンパク質の産生
さらに、本発明は、本発明のNSCタンパク質を産生するための方法も提供する。NSCタンパク質は、NSCタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを保有する宿主細胞を培養することによって調製しうる。必要に応じて、本方法を、遺伝子を安定的に発現させるため、およびそれと同時に、細胞内の遺伝子のコピー数を増幅するために用いることもできる。例えば、相補的DHFR遺伝子を含むベクター（例えば、pCHO I）を、核酸合成経路が欠失したCHO細胞に導入した後に、メトトレキサート（MTX）によって増幅することができる。さらに、遺伝子の一時的発現の場合には、SV40の複製起点を含むベクター（pcDなど）を、SV40T抗原を発現する遺伝子を染色体上に含むCOS細胞に形質転換導入する方法を用いることができる。
上記のようにして得られた本発明のNSCタンパク質を、宿主細胞の内部または外部（培地など）から単離して、実質的に純粋な均一なポリペプチドとして精製することができる。所定のポリペプチドに言及して本明細書で用いられる「実質的に純粋な」という用語は、そのポリペプチドが他の生体高分子から実質的に遊離していることを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、乾燥重量にして純度が少なくとも75％（例えば、少なくとも80、85、95、または99％）である。純度は任意の適切な標準的方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定しうる。ポリペプチドの単離および精製のための方法は何らかの特定の方法には限定されない；実際には任意の標準的な方法を用いうる。
例えば、カラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析沈殿、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析、および再結晶化を適切に選択し、組み合わせて、NSCタンパク質の単離および精製を行うことができる。
クロマトグラフィーの例には、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが含まれる（「Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual」、Daniel R. Marshakら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。これらのクロマトグラフィーを、HPLCおよびFPLCなどの液体クロマトグラフィーによって行ってもよい。したがって、本発明は、上記の方法によって調製された高純度のポリペプチドを提供する。
本発明のNSCタンパク質を、精製の前または後に適切なタンパク質修飾酵素で処理することにより、任意で改変すること、または部分的に除去することも可能である。有用なタンパク質修飾酵素には、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、タンパク質キナーゼ、グルコシダーゼなどが非制限的に含まれる。
抗体
本発明は、本発明のNSCタンパク質と結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で用いることができ、これにはウサギなどの動物に対する本発明のNSCタンパク質を用いた免疫処置によって得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに遺伝子組換えによって作製されたヒト化抗体を含む。
抗体を得るための抗原として用いられる本発明のNSCタンパク質は、任意の動物種に由来するものでよいが、好ましくはヒト、マウス、またはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のNSCタンパク質は、本明細書に開示されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列から入手しうる。本発明によれば、免疫化抗原として用いるポリペプチドは、完全タンパク質でもよく、またはNSCタンパク質の部分ペプチドでもよい。部分ペプチドは、例えば、本発明のNSCタンパク質のアミノ（N）末端またはカルボキシ（C）末端断片を含みうる。
本明細書において、抗体は、本発明のNSCタンパク質の完全長または断片のいずれかと反応するタンパク質として定義される。
本発明のNSCタンパク質またはその断片をコードする遺伝子を既知の発現ベクターに挿入し、その後に本明細書に記載したような宿主細胞の形質転換に用いてもよい。所望のタンパク質またはその断片を、任意の標準的な方法によって宿主細胞の外部または内部から回収し、後に抗原として用いることができる。または、NSCタンパク質を発現する細胞全体もしくはその溶解産物、または化学合成したポリペプチドを抗原として用いてもよい。
任意の哺乳動物に対して抗原による免疫処置を行いうるが、細胞融合のために用いる親細胞との適合性を考慮に入れることが好ましい。一般に、齧歯類（Rodentia）、ウサギ目（Lagomorpha）、または霊長類（Primate）の動物が用いられる。齧歯類の動物には、例えば、マウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長類の動物には、例えば、狭鼻類（旧世界サル）のサル、カニクイザル（Macaca fascicularis）、アカゲザル、マントヒヒ、およびチンパンジーが含まれる。
動物に対して抗原による免疫処置を行うための方法は当技術分野で周知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射は、哺乳動物の免疫処置のための標準的な方法である。より詳細には、抗原を適切な量のリン酸緩衝食塩水（PBS）、生理食塩水などの中に希釈および懸濁する。必要に応じて、抗原懸濁液を、フロイント完全アジュバントなどの適切な量の標準的アジュバントと混合して乳濁液とした上で哺乳動物に対して投与してもよい。その後に、適切な量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原の投与を4〜21日毎に数回行うことが好ましい。適切な担体を免疫処置のために用いてもよい。上記のような免疫処置の後に、血清を、所望の抗体の量の増加に関して標準的方法によって検討した。
本発明のNSCタンパク質に対するポリクローナル抗体を、血清中の所望の抗体の増加に関して試験した免疫処置後の哺乳動物から血液を採取し、従来の任意の方法によって血液から血清を分離することによって調製することもできる。ポリクローナル抗体にはポリクローナル抗体を含む血清が含まれ、ポリクローナル抗体を含む画分を血清から単離することもできる。免疫グロブリンGまたはMは、本発明のNSCタンパク質のみを認識する画分から、例えば、本発明のNSCタンパク質を結合させたアフィニティーカラムを用い、さらにこの画分をプロテインAカラムまたはプロテインGカラムを用いて精製することにより、調製することができる。
モノクローナル抗体を調製するためには、抗原による免疫処置を行った哺乳動物から免疫細胞を収集し、上記の通りに血清中の所望の抗体のレベル増加について確かめた上で、細胞融合に供する。細胞融合のために用いる免疫細胞は脾臓から採取することが好ましい。上記の免疫細胞と融合させるためのその他の好ましい親細胞には、例えば、哺乳動物の骨髄腫細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞の選択のための獲得特性を有する骨髄腫細胞が含まれる。
上記の免疫細胞および骨髄腫細胞は、既知の方法、例えば、Milsteinら（GalfreおよびMilstein、Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)）の方法に従って融合させることができる。
細胞融合によって結果として得られたハイブリドーマは、それらをHAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地中で培養することによって選択しうる。細胞培養は通常、HAT培地中で、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な期間である、数日間から数週間にわたって続けられる。その後に、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングおよびクローニングのために標準的な限界希釈を行う。
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物に抗原による免疫処置を行う上記の方法に加えて、EBウイルスに感染したヒトリンパ球などのヒトリンパ球に対して、NSCタンパク質、NSCタンパク質発現細胞、またはそれらの溶解産物によるインビトロでの免疫処置を行うこともできる。続いて、免疫処置したリンパ球を、無限に分裂しうるU266などのヒト由来の骨髄腫細胞と融合させ、NSCタンパク質と結合しうる所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる（未審査の公開された日本特許出願 特開昭 63-17688号）。
得られたハイブリドーマを続いてマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出する。得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインAもしくはプロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、または本発明のNSCタンパク質を結合させたアフィニティーカラムによって精製しうる。本発明の抗体は、本発明のNSCタンパク質の精製および検出のためだけでなく、本発明のNSCタンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても用いることができる。さらに、この抗体を、本発明のNSCタンパク質と関連があり、非小細胞肺癌を含む疾患に対する抗体療法に適用することもできる。得られた抗体を人体に対して投与する場合には（抗体療法）、免疫原性を抑えるためにヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に対して、NSCタンパク質、NSCタンパク質発現細胞、またはそれらの溶解産物などの抗原による免疫処置を行う。続いて、抗体産生細胞を動物から採取し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを入手し、それからポリペプチドに対するヒト抗体を調製することができる（国際公開公報第92-03918号、国際公開公報第93-2227号、国際公開公報第94-02602号、国際公開公報第94-25585号、国際公開公報第96-33735号、および国際公開公報第96-34096号を参照のこと）。
または、抗体を産生する免疫処置したリンパ球などの免疫細胞を癌遺伝子によって不死化させ、モノクローナル抗体の調製に用いることもできる。
このようにして得られるモノクローナル抗体を、遺伝子操作技術を用いて組換え的に調製することもできる（例えば、BorrebaeckおよびLarrick、「Therapeutic Monoclonal Antibodies」、英国でMacMillan Publishers LTD (1990)により刊行、を参照）。例えば、抗体をコードするDNAを、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫処置したリンパ球などの免疫細胞からクローニングして適切なベクターに挿入した上で、組換え抗体を調製するために宿主細胞に導入することができる。本発明はまた、上記のようにして調製した組換え抗体も提供する。
さらに、本発明の抗体は、本発明のNSCタンパク質の1つまたは複数と結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Fab、F(ab')2、Fv、またはH鎖およびL鎖由来のFv断片を適切なリンカーによって連結した一本鎖Fv（scFv）であってよい（Hustonら、Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988)）。より詳細には、パパインまたはペプシンなどの酵素で抗体を処理することによって抗体断片を作製することもできる。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築して発現ベクターに挿入した上で、適切な宿主細胞において発現させてもよい（例えば、Coら、J Immunol 152: 2968-76 (1994)；BetterおよびHorwitz、Methods Enzymol 178: 476-96 (1989)；PluckthunおよびSkerra、Methods Enzymol 178: 497-515 (1989)；Lamoyi、Methods Enzymol 121: 652-63 (1986)；Rousseauxら、Methods Enzymol 121: 663-9 (1986)；BirdおよびWalker、Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)を参照されたい）。
抗体を、ポリエチレングリコール（PEG）などの種々の分子との結合によって修飾することもできる。本発明は、このような修飾抗体を提供する。修飾抗体は抗体を化学的に修飾することによって入手しうる。これらの修飾方法は当技術分野で慣例的である。
または、本発明の抗体を、非ヒト抗体由来の可変領域およびヒト抗体の定常領域間のキメラ抗体として、または、非ヒト抗体由来の相補性決定領域（CDR）、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR）、および定常領域を含むヒト化抗体として入手することもできる。このような抗体は、既知の技術を用いて調製可能である。
上記のようにして得られた抗体を均一になるまで精製してもよい。例えば、抗体の分離および精製を、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って行うことができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動など（しかし、これらには限定されない）を適切に選択して組み合わせることにより、抗体の分離および単離を行うことができる（「抗体：A Laboratory Manual. HarlowおよびDavid Lane編、Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）。プロテインAカラムおよびプロテインGカラムはアフィニティーカラムとして用いうる。用いられるプロテインAカラムの例には、例えば、Hyper D、POROS、およびSepharose F.F.（Pharmacia）が含まれる。
クロマトグラフィーの例には、アフィニティークロマトグラフィーを除いて、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどが含まれる（「Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual」、Daniel R. Marshakら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィー手順を、HPLCおよびFPLCなどの液体クロマトグラフィーによって行うこともできる。
本発明の抗体の抗原結合活性を測定するには、例えば、吸光度、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、酵素免疫アッセイ（EIA）、放射免疫アッセイ（RIA）、および／または免疫蛍光検査法を用いうる。ELISAの場合には、本発明の抗体をプレート上に固定化し、本発明のNSCタンパク質をプレートに対して適用した後に、抗体産生細胞の培養上清または精製抗体といった所望の抗体を含む試料を適用する。続いて、一次抗体を認識し、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識された二次抗体を適用し、プレートをインキュベートする。次に、洗浄の後に、p-ニトロフェニルリン酸などの酵素基質をプレートに添加して、試料の抗原結合活性を評価するために吸光度を測定する。C末端断片またはN末端断片といったNSCタンパク質の断片を、抗体の結合活性を評価するための抗原として用いてもよい。BIAcore（Pharmacia）を、本発明による抗体の活性の評価に用いてもよい。
上記の方法は、本発明の抗体を本発明のNSCタンパク質を含むと想定される試料に対して曝露させ、抗体および本タンパク質によって形成された免疫複合体を検出または測定することにより、本発明のNSCタンパク質の検出または測定を可能にする。
本発明によるNSCタンパク質の検出または測定の方法は本タンパク質を特異的に検出または測定することが可能であるため、本方法は本タンパク質が用いられる種々の実験に有用と思われる。
以下の実施例は、本発明を説明し、当業者が本発明を作製および使用することを支援するために提示する。これらの例は、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。
特に明記しない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される用語と同じ意味をもつ。本発明を実施または検討するにあたって、本明細書に記載されたものと類似または等価の方法および材料が使用される場合があるが、適切な方法および材料を以下に説明する。本明細書で引用された任意の特許、特許出願、および刊行物は、参照として本明細書に組み入れられる。
発明を実施するための最良の形態
本発明を、以下の実施例で詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されない。
疾病状態、例えば非小細胞肺癌において差次的に発現される遺伝子を同定するために、罹患組織（例えば、非小細胞肺癌由来の上皮細胞）および正常組織から採取した組織を評価した。アッセイ法は以下の通りに行った。
［実施例1］一般的な方法
（1）患者および組織試料
肺葉切除術を受けた37人の患者（女性15人、男性22人、年齢46〜79歳；年齢の中央値66.0歳）から、インフォームドコンセントを得た上で原発性肺癌組織を採取した。臨床情報を診療録から入手し、それぞれの腫瘍を病理学者が病理組織学的なサブタイプおよびグレードによって診断した；37例の腫瘍のうち22例は腺癌、14例はSCC、1例は腺扁平上皮癌と分類された。各腫瘍の臨床病期はUICC TNM分類に従って判定した。試料はすべて直ちに凍結し、TissueTek OCT媒体（Sakura、Tokyo、Japan）中に包埋して-80℃で保存した。
（2）レーザービームを用いた顕微鏡下微小切除、RNAの抽出およびT7を用いるRNA増幅
保存した試料から、レーザービームを用いた顕微鏡下微小切除を用いて癌細胞を選択的に収集した（Kitaharaら、Cancer Res 61: 3544-9 (2001)）。全RNAの抽出およびT7 RNAポリメラーゼを用いる増幅は以前の記載の通りに行った（Okabeら、Cancer Res 61: 2129-37 (2001)）。対照として、正常ヒト肺ポリ(A)RNA（CLONTECH）を同様の方法で増幅した。各癌組織および対照から増幅したRNA（aRNA）の2.5μgのアリコートを、それぞれCy5-dCTPおよびCy3-dCTPの存在下で逆転写させた。
（3）cDNAマイクロアレイの作製
スライドガラス上にスポット化するためのcDNAを入手するために、各遺伝子に関して以前の記載の通りにRT-PCRを行った（Kitaharaら、Cancer Res 61: 3544-9 (2001)）。Microarray Spotter Generation III（Amersham Biosciences）を用いて、PCR産物をVII型スライドガラス（Amersham Biosciences）上にスポット化した。単一のスライド上に4,608種の遺伝子を2箇所ずつスポット化した。それぞれ同じ52種類のハウスキーピング遺伝子および2種類の陰性対照遺伝子がスポット化された、5種類の異なるスライドのセットを用意した（計23,040遺伝子）。
（4）ハイブリダイゼーションおよびデータ収集
ハイブリダイゼーション、洗浄、およびシグナルの検出は以前の記載の通りに行った（Yanagawaら、Neoplasia 3: 395-401 (2001)）。各標的スポットに関するCy5（腫瘍）およびCy3（対照）の蛍光強度を調整し、52種のハウスキーピング遺伝子の平均Cy3／Cy5比が1に等しくなるようにした。シグナル強度の低いものから得られたデータの信頼性は低い。このため、各スライド上のシグナル強度に対してカットオフ値を決定した。Cy3色素およびCy5色素の両方でカットオフ値よりも低いシグナル強度が得られた場合には、その遺伝子を以降の分析から除外した。
（5）遺伝子発現プロファイルによる37例のNSCLCのクラスター分析
遺伝子および腫瘍の両方に対して階層的クラスター化法を適用した。37件の試料の分類に関して再現性のあるクラスターを得るために、実験の95％で有効なデータが得られ、その発現比の変動が標準偏差1.0を上回っていた899種の遺伝子を選択した。分析は、M. Eisenが作成した、ウェブで入手可能なソフトウエア（「Cluster」および「TreeView」）（http://genome-www5.stanford.edu/MicroArray/SMD/restech.html）を用いて行った。クラスター化アルゴリズムを適用する前に、各スポットに関する蛍光比を対数変換し、続いて実験的偏りを除くために各試料に関してデータの中央値センタリングを行った。
［実施例2］非小細胞肺癌細胞における臨床的に関連のある発現パターンを有する遺伝子の同定
37個すべてのNSCLC試料の発現プロファイルから得たデータを用いて試料と遺伝子との間の類似性を分析するために、二次元階層的クラスター化アルゴリズムを適用した。以前の記載の通り（Yanagawaら、Neoplasia 3: 395-401 (2001)）、Cy3蛍光強度またはCy5蛍光強度がカットオフ値を下回った場合はその遺伝子を以降の分析から除外し、調べた症例の95％超で有効な値が得られたものを選択した。標準偏差の観測値が1.0未満であった遺伝子も同じく除外した。この選択基準を満たした899種の遺伝子をさらに分析した。
試料軸（水平軸）において、症例37例から得た39件の試料（症例2例に関しては実験手順の再現性および信頼性を実証するために2件ずつ調べた）は、発現プロファイルに基づいて2つの大きな群にクラスター化された。樹状図には個々の症例間の発現パターンの類似性が示されている。枝が短いほど類似性が高い。独立した実験で標識およびハイブリダイゼーションを行って2件ずつ調べた症例2例（6番および12番）は、同一群内に最も近接してクラスター化された。この分析によれば、これらの遺伝子はスライドガラス上の異なる位置にスポット化された同一の遺伝子の隣接した列としてクラスター化された（非提示データ）。37例のうち、22例の腺癌は1つの大きな群にクラスター化され、14例のSCCは別の群にクラスター化された。1例のみであった腺扁平上皮癌（25番）はSCCのクラスターに分類された。明らかに、腺癌およびSCCは特異的かつ異なる遺伝子発現プロファイルを有するように思われ、これによって病因の違いに関する分子的性質が明らかになる可能性がある。
NSCLCにおいて下方制御される遺伝子を探索するために、その発現が70％を上回るNSCLCで0.2倍未満に低下している遺伝子をスクリーニングした。NSCLCで下方制御される遺伝子が806種同定されたが、これらは腫瘍抑制機能を有する可能性があり、そのため将来の遺伝子治療に用いうる可能性がある（表1参照）。50％を上回るNSCLCでCy5／Cy3比が5.0を上回った、上方制御される遺伝子は合計582種同定された（表2）。これらの表において、70％を上回るNSCLCで5倍の発現が認められた遺伝子が診断マーカーとなる可能性があり、50％を上回る症例で5倍の過剰発現が認められたものは薬剤の標的となる可能性がある。薬剤の標的として、症例の33％〜50％でデータが存在していた遺伝子も選択し、それらの90％を上回るNSCLCで5倍を上回る発現が認められた60種の遺伝子をさらに決定した（表3）。さらなる選択のための基準は以下の通りとした：（1）血清で検出可能な腫瘍マーカー：ヒトの精巣、卵巣、および4例の胎児組織のみで発現が認められた遺伝子；（2）痰で検出可能な腫瘍マーカー：気道の組織（すなわち、肺、気管、および唾液腺）で発現が認められなかった遺伝子；ならびに（3）治療標的：肝臓および腎臓のようなヒトの重要臓器で発現が認められなかった遺伝子。これらの遺伝子の正常組織での分布に関するデータは、23,040種のヒト遺伝子を含むcDNAマイクロアレイを用いて、25種類の成人組織および4種類の胎児組織における発現プロファイルから入手した。
［実施例3］非小細胞肺癌細胞の増殖を抑制するための分子標的の同定および特徴決定
癌細胞の成長、増殖、および生存を調節する新たな分子標的の同定および特徴決定を行うために、標的遺伝子を選択するためのアンチセンスS-オリゴヌクレオチド法を以下の通りに適用した。
（1）完全長配列の同定
マイクロアレイ上で高いCy5／Cy3シグナル強度比を示した遺伝子の完全長配列を、データベースのスクリーニング、および、Marathon cDNA増幅キット（BD Biosciences Clontech、Palo Alto、CA、USA）を供給元の推奨に従って用いたcDNA末端5'迅速増幅法によって決定した。cDNAテンプレートは遺伝子特異的な逆方向プライマーおよびキットに付属のAP1プライマーを用いてヒト精巣mRNA（BD Biosciences Clontech）から合成した。ヌクレオチド配列は、ABI PRISM 3700 DNAシークエンサー（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を製造元の指示に従って用いて決定した。
（2）ノーザンブロット分析
マイクロアレイでの検討のために選択した遺伝子のそれぞれに対応する32P標識PCR産物を、ヒト多組織ブロット（BD Biosciences Clontech）とハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は供給元の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーは増感スクリーンを用いて-80℃で24〜168時間行った。
各遺伝子の組織分布およびサイズを決定するために、ヒトcDNAをプローブとして用いてヒト多組織ノーザンブロット分析を行ったところ（図4）、それぞれの遺伝子に関して以下の結果が得られた：
NSC 807：単一の4.4kb mRNAが胎盤および精巣に認められた；
NSC 810：単一の3.1kb mRNAが精巣に認められた；
NSC 811：2.4および2.7kb mRNAが胎盤および舌に認められ、弱い発現が腎臓、肝臓、副腎、膀胱、脳（全体）、リンパ節、前立腺、胃、甲状腺、および気管で検出された；
NSC 822：単一の1.3kb mRNAが心臓、肝臓、および精巣に認められた；
NSC 825：単一の4.3kb mRNAが精巣および脊髄に認められた；
NSC 841：2.8kbの転写物の弱い発現が心臓、副腎、脳（全体）、リンパ節、脊髄、胃、甲状腺、舌、および気管に認められた；
NSC 849：単一の1.4kb mRNAが胎盤、前立腺、および気管に認められた；
NSC 855：3.6kb mRNAが胎盤、前立腺、および気管に認められた；
NSC 859：2.1kbの転写物の弱い発現が骨格筋およびリンパ節に認められた；
NSC 885：単一の5.0kb mRNAが精巣に認められた；
NSC 895：単一の1.5kb mRNAが胎盤、胃、および気管に認められた；
NSC 903：単一の2.7kb mRNAが精巣に認められ、弱い発現が胸腺、小腸、結腸、および骨髄で検出された；
NSC 904：単一の4.4kb mRNAが精巣および骨格筋に認められた；
NSC 905：単一の2.5kb mRNAが心臓、骨格筋、肝臓、胃、および舌に認められ、弱い発現が胎盤および甲状腺で検出された；
NSC 915：単一の1.5kb mRNAが精巣に認められた；
NSC 948：単一の3.8kb mRNAが腎臓、肝臓、胎盤、胃、甲状腺、舌、および気管に認められた；
NSC 956：単一の2.1kb mRNAが心臓、骨格筋、精巣、胃、甲状腺、および副腎に認められ、弱い発現が肝臓、膵臓、胸腺、前立腺、および脊髄で検出された；
NSC 994：単一の3.3kb mRNAが骨格筋および精巣に認められ、弱い発現が心臓、肝臓、および膵臓で検出された；
NSC 1000：単一の3.5kb mRNAが脳、膵臓、前立腺、および精巣に認められ、弱い発現が胃、脊髄、および副腎で検出された；
NSC 1066：単一の3.6kb mRNAが骨格筋および精巣に認められた；
NSC 1075：単一の1.9kb mRNAが精巣に認められた；
NSC 1107：単一の2.2kb mRNAが精巣に認められた；
NSC 1131：1.6kbおよび1.4kbの転写物が精巣に認められた；
NSC 1141：単一の2.9kb mRNAが胎盤に認められ、この転写物の弱い発現が骨格筋および精巣で検出された；
NSC 1164：単一の5.2kb mRNAが脳および副腎に認められた；
NSC 1183：単一の2.0kb mRNAが骨格筋および心臓に認められた；
NSC 1201：7.8kbの転写物の弱い発現が心臓、骨格筋、脊髄、前立腺、精巣、甲状腺、脾臓、リンパ節、気管、および副腎に認められた；
NSC 1240：5.7kbの弱い転写物が胃、脊髄、およびリンパ節に認められた；
NSC 1246：単一の1.4kb mRNAが精巣に認められた；
NSC 1254：単一の3.0kb mRNAが精巣に認められた；
NSC 1265：3.0kbの転写物の弱い発現が胃に認められた；
NSC 1277：単一の1.8kb mRNAが精巣に認められた；
NSC 1295：単一の3.5kb mRNAが白血球、リンパ節、および骨髄に認められた；
NSC 1306：単一の7.4kb mRNAが心臓および骨格筋に認められた；
NSC 1343：単一の4.7kb mRNAが胎盤および骨格筋に認められた；
NSC 1362：単一の3.6kb mRNAが脳および脳全体に認められた；
NSC 1389：単一の0.9kb mRNAが舌に認められた；
NSC 1399：単一の0.9kb mRNAが胎盤に認められた；
NSC 1406：単一の2.4kb mRNAが心臓、骨格筋、および前立腺に認められた；
NSC 1413：単一の4.0kb mRNAが肝臓および前立腺に認められた；
NSC 1420：単一の2.8kb mRNAが精巣に認められた。
（2）半定量的RT-PCR分析
50％を上回るNSCLCでのmRNAの発現レベルの5倍またはそれ以上の増加を、以前の記載の通りに半定量的RT-PCRによって確認した（Akashiら、Int J Cancer 88: 873-80 (2000)）。Trizol試薬（Life Technologies, Inc.、Gaithersburg、MD、USA）を製造元のプロトコールに従って用いて、全RNAを培養細胞および臨床組織から抽出した。抽出したRNAをDNアーゼI（Roche Diagnotics, Basel, Switzerland）で処理し、オリゴ（dT）12-18プライマーとともにSuperscript II逆転写酵素（Life Technologies, Inc.）を用いて逆転写して一本鎖cDNAとした。β-アクチン（ACTB）またはβ-2-ミクログロブリン遺伝子（B2M）を定量対照としてモニタリングすることにより、その後のPCR増幅のための各一本鎖cDNAの適切な希釈物を調製した。反応はすべて、GeneAmp PCRシステム9700（Applied Biosystems）により、94℃ 2分間の初期変性の後に、94℃ 30秒間、58〜62℃ 30秒間および72℃ 45秒間を18サイクル（ACTBまたはB2Mの場合）または25〜30サイクル（本発明の各遺伝子の場合）用いて行った。プライマー配列は表4に列挙した。
（表４）半定量的RT-PCR実験のためのプライマー配列
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肺癌患者から得た癌組織における各遺伝子の発現（図1）を半定量的RT-PCRによって確認した。結果は以下の通りであった：
NSC 807：NSC 807の発現はNSCLC症例9例中6例で上方制御されていた；
NSC 810：NSC 810の発現はNSCLC症例10例中6例で上方制御されていた；
NSC 811：NSC 811の発現はNSCLC症例9例の全例で上方制御されていた；
NSC 812：NSC 812の発現はNSCLC症例15例の全例で上方制御されていた；
NSC 816：NSC 816の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 820：NSC 820の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 822：NSC 822の発現はNSCLC症例10例中3例で上方制御されていた；
NSC 824：NSC 824の発現はNSCLC症例9例の全例で上方制御されていた；
NSC 825：NSC 825の発現はNSCLC症例12例の全例で上方制御されていた；
NSC 830：NSC 830の発現はNSCLC症例10例中7例で上方制御されていた；
NSC 837：NSC 837の発現はNSCLC症例9例中7例で上方制御されていた；
NSC 840：NSC 840の発現はNSCLC症例10例中9例で上方制御されていた；
NSC 841：NSC 841の発現はNSCLC症例11例中9例で上方制御されていた；
NSC 842：NSC 842の発現はNSCLC症例8例中7例で上方制御されていた；
NSC 846：NSC 846の発現はNSCLC症例10例中9例で上方制御されていた；
NSC 849：NSC 849の発現はNSCLC症例10例中7例で上方制御されていた；
NSC 850：NSC 850の発現はNSCLC症例7例の全例で上方制御されていた；
NSC 853：NSC 853の発現はNSCLC症例10例中8例で上方制御されていた；
NSC 854：NSC 854の発現はNSCLC症例7例の全例で上方制御されていた；
NSC 855：NSC 855の発現はNSCLC症例11例中10例で上方制御されていた；
NSC 857：NSC 857の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 859：NSC 859の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 861：NSC 861の発現はNSCLC症例7例中5例で上方制御されていた；
NSC 864：NSC 864の上方制御はNSCLC症例10例の全例で半定量的RT-PCRによって確かめれられた；
NSC 870：NSC 870の発現はNSCLC症例11例の全例で上方制御されていた；
NSC 871：NSC 871の発現はNSCLC症例13例中12例で上方制御されていた；
NSC 872：NSC 872の発現はNSCLC症例12例中9例で上方制御されていた；
NSC 881：NSC 881の発現はNSCLC症例10例の全例で上方制御されていた；
NSC 882：NSC 882の発現はNSCLC症例10例中7例で上方制御されていた；
NSC 884：NSC 884の発現はNSCLC症例9例の全例で上方制御されていた；
NSC 885：NSC 885の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 889：NSC 889の発現はNSCLC症例8例中7例で上方制御されていた；
NSC 893：NSC 893の発現はNSCLC症例9例中7例で上方制御されていた；
NSC 895：NSC 895の発現はNSCLC症例6例中5例で上方制御されていた；
NSC 898：NSC 898の発現はNSCLC症例6例中5例で上方制御されていた；
NSC 901：NSC 901の発現はNSCLC症例14例の全例で上方制御されていた；
NSC 902：NSC 902の発現はNSCLC症例8例中7例で上方制御されていた；
NSC 903：NSC 903の発現はNSCLC症例10例中9例で上方制御されていた；
NSC 904：NSC 904の発現はNSCLC症例10例中7例で上方制御されていた；
NSC 905：NSC 905の発現はNSCLC症例13例の全例で上方制御されていた；
NSC 909：NSC 909の発現はNSCLC症例13例中9例で上方制御されていた；
NSC 912：NSC 912の発現はNSCLC症例7例の全例で上方制御されていた；
NSC 915：NSC 915の発現はNSCLC症例9例の全例で上方制御されていた；
NSC 917：NSC 917の発現はNSCLC症例9例の全例で上方制御されていた；
NSC 920：NSC 920の発現はNSCLC症例10例中8例で上方制御されていた；
NSC 921：NSC 921の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 924：NSC 924の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 929：NSC 929の発現はNSCLC症例12例中10例で上方制御されていた；
NSC 930：NSC 930の発現はNSCLC症例10例中9例で上方制御されていた；
NSC 933：NSC 933の発現はNSCLC症例10例中9例で上方制御されていた；
NSC 934：CIT。NSC 934の発現はNSCLC症例8例中7例で上方制御されていた；
NSC 936：NSC 936の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 938：NSC 938の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 940：NSC 940の発現はNSCLC症例10例中2例で上方制御されていた；
NSC 944：NSC 944の発現はNSCLC症例10例の全例で上方制御されていた；
NSC 947：NSC 947の発現はNSCLC症例10例中9例で上方制御されていた；
NSC 948：NSC 948の発現はNSCLC症例10例中8例で上方制御されていた；
NSC 956：NSC 956の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 957：NSC 957の発現はNSCLC症例8例中7例で上方制御されていた；
NSC 958：NSC 958の発現はNSCLC症例10例の全例で上方制御されていた；
NSC 963：NSC 963の発現はNSCLC症例10例の全例で上方制御されていた；
NSC 964：NSC 964の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 965：NSC 965の発現はNSCLC症例11例中10例で上方制御されていた；
NSC 966：NSC 966の発現はNSCLC症例8例中3例で上方制御されていた；
NSC 970：NSC 970の発現はNSCLC症例12例中7例で上方制御されていた；
NSC 972：NSC 972の発現はNSCLC症例10例中9例で上方制御されていた；
NSC 973：NSC 973の発現はNSCLC症例9例中3例で上方制御されていた；
NSC 974：NSC 974の発現はNSCLC症例10例中9例で上方制御されていた；
NSC 975：NSC 975の発現はNSCLC症例12例で上方制御されていた；
NSC 980：NSC 980の発現はNSCLC症例8例中7例で上方制御されていた；
NSC 984：NSC 984の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 989：NSC 989の発現はNSCLC症例9例の全例で上方制御されていた；
NSC 990：NSC 990の発現はNSCLC症例8例中4例で上方制御されていた；
NSC 991：NSC 991の発現はNSCLC症例10例中3例で上方制御されていた；
NSC 994：NSC 994の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 1000：NSC 1000の発現はNSCLC症例13例中12例で上方制御されていた；
NSC 1002：NSC 1002の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 1003：NSC 1003の発現はNSCLC症例10例の全例で上方制御されていた；
NSC 1012：NSC 1012の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 1015：NSC 1015の発現はNSCLC症例10例で上方制御されていた；
NSC 1016：NSC 1016の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 1018：NSC 1018の発現はNSCLC症例6例中3例で上方制御されていた；
NSC 1023：NSC 1023の発現はNSCLC症例12例中7例で上方制御されていた；
NSC 1026：NSC 1026の発現はNSCLC症例9例中7例で上方制御されていた；
NSC 1027：NSC 1027の発現はNSCLC症例8例中5例で上方制御されていた；
NSC 1030：NSC 1030の発現はNSCLC症例6例中5例で上方制御されていた；
NSC 1034：NSC 1034の発現はNSCLC症例8例中5例で上方制御されていた；
NSC 1037：NSC 1037の発現はNSCLC症例9例の全例で上方制御されていた；
NSC 1038：NSC 1038の発現はNSCLC症例7例中6例で上方制御されていた；
NSC 1047：NSC 1047の発現はNSCLC症例6例中4例で上方制御されていた；
NSC 1049：NSC 1049の上方制御はNSCLC症例6例の全例で検出された；
NSC 1052：NSC 1052の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 1057：NSC 1057の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 1058：NSC 1058の発現はNSCLC症例10例中8例で上方制御されていた；
NSC 1059：NSC 1059の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 1064：NSC 1064の発現はNSCLC症例13例の全例で上方制御されていた；
NSC 1066：NSC 1066の発現はNSCLC症例10例中8例で上方制御されていた；
NSC 1067：NSC 1067の発現はNSCLC症例10例の全例で上方制御されていた；
NSC 1071：NSC 1071の発現はNSCLC症例10例の全例で上方制御されていた；
NSC 1072：NSC 1072の発現はNSCLC症例10例中7例で上方制御されていた；
NSC 1075：NSC 1075の発現はNSCLC症例9例中4例で上方制御されていた；
NSC 1077：NSC 1077の発現はNSCLC症例11例中8例で上方制御されていた；
NSC 1078：NSC 1078の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 1086：NSC 1086の発現はNSCLC症例11例中10例で上方制御されていた；
NSC 1089：NSC 1089の発現はNSCLC症例9例中6例で上方制御されていた；
NSC 1090：NSC 1090の発現はNSCLC症例7例中3例で上方制御されていた；
NSC 1103：NSC 1103の発現はNSCLC症例8例中7例で上方制御されていた；
NSC 1107：NSC 1107の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 1109：NSC 1109の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 1113：NSC 1113の発現はNSCLC症例11例中10例で上方制御されていた；
NSC 1116：NSC 1116の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 1125：NSC 1125の発現はNSCLC症例10例で上方制御されていた；
NSC 1131：NSC 1131の上方制御はNSCLC症例6例中2例で検出された；
NSC 1133：NSC 1133の発現はNSCLC症例10例の全例で上方制御されていた；
NSC 1136：NSC 1136の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 1141：NSC 1141の発現はNSCLC症例10例中6例で上方制御されていた；
NSC 1142：NSC 1142の上方制御はNSCLC症例11例中9例で検出された；
NSC 1157：NSC 1157の発現はNSCLC症例11例中1例で上方制御されていた；
NSC 1162：NSC 1162の発現はNSCLC症例10例中9例で上方制御されていた；
NSC 1164：NSC 1164の発現はNSCLC症例7例の全例で上方制御されていた；
NSC 1167：NSC 1167の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 1169：NSC 1169の発現はNSCLC症例7例中3例で上方制御されていた；
NSC 1173：NSC 1173の発現はNSCLC症例7例中5例で上方制御されていた；
NSC 1176：NSC 1176の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 1183：NSC 1183の上方制御はNSCLC症例10例の全例で検出された；
NSC 1184：NSC 1184の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 1185：NSC 1185の上方制御はNSCLC症例6例中5例で検出された；
NSC 1191：NSC 1191の発現はNSCLC症例8例中7例で上方制御されていた；
NSC 1195：NSC 1195の発現はNSCLC症例9例中5例で上方制御されていた；
NSC 1196：NSC 1196の発現はNSCLC症例6例の全例で上方制御されていた；
NSC 1201：NSC 1201の発現はNSCLC症例9例の全例で上方制御されていた；
NSC 1205：NSC 1205の発現はNSCLC症例9例中7例で上方制御されていた；
NSC 1207：NSC 1207の発現はNSCLC症例10例中8例で上方制御されていた；
NSC 1210：NSC 1210の発現はNSCLC症例10例中9例で上方制御されていた；
NSC 1214：NSC 1214の発現はNSCLC症例9例中7例で上方制御されていた；
NSC 1234：NSC 1234の発現はNSCLC症例10例中9例で上方制御されていた；
NSC 1236：NSC 1236の発現はNSCLC症例8例中6例で上方制御されていた；
NSC 1237：NSC 1237の発現はNSCLC症例6例中5例で上方制御されていた；
NSC 1238：NSC 1238の発現はNSCLC症例7例中6例で上方制御されていた；
NSC 1240：NSC 1240の発現はNSCLC症例7例の全例で上方制御されていた；
NSC 1242：NSC 1242の発現はNSCLC症例7例中4例で上方制御されていた；
NSC 1246：NSC 1246の発現はNSCLC症例10例中6例で上方制御されていた；
NSC 1247：NSC 1247の発現はNSCLC症例8例中5例で上方制御されていた；
NSC 1250：NSC 1250の発現はNSCLC症例8例で上方制御されていた；
NSC 1254：NSC 1254の発現はNSCLC症例10例で上方制御されていた；
NSC 1265：NSC 1265の上方制御はNSCLC症例5例中4例で検出された；

NSC 1273：NSC 1273の上方制御はNSCLC症例6例中5例で検出された；
NSC 1277：NSC 1277の発現はNSCLC症例10例の全例で上方制御されていた；
NSC 1279：NSC 1279の発現はNSCLC症例7例の全例で上方制御されていた；
NSC 1288：NSC 1288の発現はNSCLC症例9例中6例で上方制御されていた；
NSC 1289：NSC 1289の発現はNSCLC症例9例中6例で上方制御されていた；
NSC 1290：NSC 1290の発現はNSCLC症例10例の全例で上方制御されていた；
NSC 1292：NSC 1292の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 1293：NSC 1293の上方制御はNSCLC症例6例中4例で検出された；
NSC 1294：NSC 1294の発現はNSCLC症例8例中7例で上方制御されていた；
NSC 1295：NSC 1295の発現はNSCLC症例7例中5例で上方制御されていた；
NSC 1299：NSC 1299の上方制御はNSCLC症例6例中5例で検出された；
NSC 1302：NSC 1302の発現はNSCLC症例7例の全例で上方制御されていた；
NSC 1306：NSC 1306の上方制御はNSCLC症例6例の全例で検出された；
NSC 1309：NSC 1309の発現はNSCLC症例8例中7例で上方制御されていた；
NSC 1310：NSC 1310の発現はNSCLC症例10例中9例で上方制御されていた；
NSC 1315：NSC 1315の発現はNSCLC症例9例中6例で上方制御されていた；
NSC 1320：NSC 1320の発現はNSCLC症例9例中5例で上方制御されていた；
NSC 1323：NSC 1323の発現はNSCLC症例10例の全例で上方制御されていた；
NSC 1325：NSC 1325の発現はNSCLC症例9例中2例で上方制御されていた；
NSC 1328：NSC 1328の発現はNSCLC症例9例の全例で上方制御されていた；
NSC 1337：NSC 1337の発現はNSCLC症例9例の全例で上方制御されていた；

NSC 1345：NSC 1345の発現はNSCLC症例8例中3例で上方制御されていた；
NSC 1350：NSC 1350の発現はNSCLC症例8例中6例で上方制御されていた；
NSC 1353：NSC 1353の発現はNSCLC症例10例中3例で上方制御されていた；
NSC 1362：NSC 1362の発現はNSCLC症例7例中6例で上方制御されていた；
NSC 1371：NSC 1371の発現はNSCLC症例10例の全例で上方制御されていた；
NSC 1375：NSC 1375の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 1377：NSC 1377の発現はNSCLC症例8例中5例で上方制御されていた；
NSC 1378：NSC 1378の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 1384：NSC 1384の発現はNSCLC症例11例中8例で上方制御されていた；
NSC 1389：NSC 1389の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 1390：NSC 1390の発現はNSCLC症例10例中8例で上方制御されていた；
NSC 1391：NSC 1391の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 1394：NSC 1394の発現はNSCLC症例10例中6例で上方制御されていた；
NSC 1395：NSC 1395の発現はNSCLC症例7例中4例で上方制御されていた；
NSC 1398：NSC 1398の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 1399：NSC 1399の発現はNSCLC症例10例中4例で上方制御されていた；
NSC 1403：NSC 1403の発現はNSCLC症例8例中6例で上方制御されていた；
NSC 1406：NSC 1406の発現はNSCLC症例10例の全例で上方制御されていた；
NSC 1407：NSC 1407の発現はNSCLC症例10例の全例で上方制御されていた；
NSC 1410：NSC 1410の発現はNSCLC症例10例中5例で上方制御されていた；
NSC 1412：NSC 1412の発現はNSCLC症例9例中6例で上方制御されていた；
NSC 1417：NSC 1417の発現はNSCLC症例7例中3例で上方制御されていた；
NSC 1420：NSC 1420の上方制御はNSCLC症例7例の全例で検出された；
NSC 1422：NSC 1422の発現はNSCLC症例10例中4例で上方制御されていた；
NSC 1424：NSC 1424の発現はNSCLC症例6例中5例で上方制御されていた；
NSC 1435：NSC 1435の発現はNSCLC症例8例中4例で上方制御されていた；
NSC 1436：NSC 1436の発現はNSCLC症例7例の全例で上方制御されていた；
NSC 1439：NSC 1439の発現はNSCLC症例8例の全例で上方制御されていた；
NSC 1440：NSC 1440の発現はNSCLC症例9例中8例で上方制御されていた；
NSC 1441：NSC 1441の発現はNSCLC症例11例中9例で上方制御されていた；
NSC 1444：NSC 1444の発現はNSCLC症例6例中4例で上方制御されていた；
NSC 1445：NSC 1445の発現はNSCLC症例7例中6例で上方制御されていた；
NSC 1447：NSC 1447の発現はNSCLC症例7例の全例で上方制御されていた。
（3）アンチセンスS-オリゴヌクレオチドアッセイ
各遺伝子に対応する3〜5対の逆配列型（reverse）（対照）S-オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを調製した。6ウェル培養皿または10cm培養皿に配置した4種のNSCLC細胞株A549、NCI-H226、NCI-H522、および／またはLC319に対して、各遺伝子に対応する合成S-オリゴヌクレオチドをLipofectin試薬（Life Technologies, Inc.）を用いて導入し、10％胎児ウシ血清を含む培地中に2日間保った。続いて細胞を100％メタノールで固定し、ギムザ溶液で染色した。26種の遺伝子に対するアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較してフォーカス形成を抑制した。このことから、これらの遺伝子の抑制は遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示された。有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチドおよび逆配列型の対照オリゴヌクレオチドの配列は表5に示されている。当技術分野で知られた方法により、MTTアッセイを3回ずつ行った（Akashiら(2000) Int. J. Cancer 88: 873-80）。各遺伝子に関する方法および結果は以下の通りであった。
NSC 810：TTK；TTKに対応する有効アンチセンスS-オリゴヌクレオチド（配列番号：423）および逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）（配列番号：424）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、TTKに関して最も高い発現レベルが認められたNSCLC細胞株A549およびLC319に導入した。トランスフェクションから2日後に、このアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を抑制することがMTTアッセイによって明らかに示された（図2）。これにより、TTKの抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
NSC 811：SDC1；SDC1に対応する3種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド（AS1（配列番号：425）、AS2（配列番号：427）、およびAS4（配列番号：429））ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）（R1（配列番号：426）、R2（配列番号：428）、およびR4（配列番号：430））を合成し、SDC1に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549にそれぞれを導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を抑制することがMTTアッセイによって明らかに示された（図2）。これにより、SDC1の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
NSC 812：NMB；NMBに対応する2種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド（AS1（配列番号：431）およびAS2（配列番号：433））ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）（R1（配列番号：432）およびR2（配列番号：434））を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、NMBに関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示された（図2）。これにより、NMBの抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。これらの結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
NSC 816：PIR51；PIR51に対応する有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチドAS1（配列番号：435）および逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）R1（配列番号：436）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、NMBに関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、このアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがフォーカス形成によって示された（ギムザによる染色）（非提示データ）。これにより、PIR51の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。
NSC 825：ANLN；ANLNに対応する3種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド（AS1（配列番号：437）、AS3（配列番号：439）、およびAS5（配列番号：441））ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）（R1（配列番号：438）、R3（配列番号：440）、およびR5（配列番号：442））を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、ANLNに関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示された（図2）。これにより、ANLNの抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。
NSC 841：URLC2；URLC2に対応する2種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド、AS4（配列番号：443）およびAS5（配列番号：445）ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）R4（配列番号：444）およびR5（配列番号：446）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、URLC2に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示された（図2）。これにより、URLC2の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
NSC 857：TIGD5；TIGD5に対応する2種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド、AS3（配列番号：447）およびAS4（配列番号：449）ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）、R3（配列番号：448）、およびR4（配列番号：450）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、TIGD5に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示された（図2）。これにより、TIGD5の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
NSC 859：URLC3；URLC3に対応する3対の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド、AS2（配列番号：451）、AS3（配列番号：453）、およびAS5（配列番号：455）ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）、R2（配列番号：452）、R3（配列番号：454）、およびR5（配列番号：456）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、URLC3に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示された（図2）。これにより、URLC3の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
NSC 885：BAG5；BAG5に対応する2種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド、AS1（配列番号：457）およびAS2（配列番号：459）ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）、R1（配列番号：458）、およびR2（配列番号：460）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、BAG5に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがフォーカス形成によって示された（ギムザによる染色）（非提示データ）。これにより、BAG5の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。
NSC 893：MPHOSPH1；MPHOSPH1に対応する2種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド、AS1（配列番号：461）およびAS2（配列番号：463）ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）R1（配列番号：462）およびR2（配列番号：464）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、MPHOSPH1に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示された（図2）。これにより、MPHOSPH1の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
NSC 905：URLC1；URLC1に対応する3種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド、AS2（配列番号：465）、AS3（配列番号：467）、およびAS5（配列番号：469）ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）、R2（配列番号：466）、R3（配列番号：468）、およびR5（配列番号：470）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、URLC1に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示された（図2）。これにより、URLC1の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
NSC 909：FLJ10468；FLJ10468に対応する有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチドAS1（配列番号：471）および逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）R1（配列番号：472）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、FLJ10468に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、このアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがフォーカス形成によって示された（ギムザによる染色）（非提示データ）。これにより、FLJ10468の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。
NSC 920：CHAF1A；CHAF1Aに対応する2種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド、AS1（配列番号：473）およびAS4（配列番号：475）、ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）、R1（配列番号：474）およびR4（配列番号：476）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、CHAF1Aに関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがフォーカス形成によって示された（ギムザによる染色）（非提示データ）。これにより、CHAF1Aの抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。
NSC 947：PKP3；PKP3に対応する4種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド（AS1（配列番号：477）、AS2（配列番号：479）、AS3（配列番号：481）、およびAS4（配列番号：483））ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）（R1（配列番号：478）、R2（配列番号：480）、R3（配列番号：482）、およびR4（配列番号：484）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、PKP3に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549およびLC319に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示された（図2）。これにより、PKP3の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
NSC 956：SIAHBP1；SIAHBP1に対応する2種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド、AS1（配列番号：485）およびAS2（配列番号：487）、ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）、R1（配列番号：486）およびR2（配列番号：488）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、SIAHBP1に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示され（図2）、このことから、SIAHBP1の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
NSC 994：DKFZP434E2318；DKFZP434E2318に対応する4種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド（AS1（配列番号：489）、AS3（配列番号：491）、AS4（配列番号：493）、およびAS5（配列番号：495））ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）（R1（配列番号：490）、R3（配列番号：492）、R4（配列番号：494）、およびR5（配列番号：496））を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、DKFZP434E2318に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示された（図2）。これにより、DKFZP434E2318の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
NSC 1075：URLC4；URLC4に対応する有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチドAS5（配列番号：497）、および逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）R5（配列番号：498）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、URLC4に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、アンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示された（図2）。これにより、URLC4の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。これらの結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
NSC 1107：URLC8；URLC8に対応する2種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド、AS1（配列番号：499）およびAS4（配列番号：501）、ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）、R1（配列番号：500）およびR4（配列番号：502）を合成し、URLC8に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549にそれぞれを導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示された（図2）。これにより、URLC8の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
NSC 1113：URLC5；URLC5に対応する2種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド、AS1（配列番号：503）およびAS2（配列番号：505）、ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）、R1（配列番号：504）およびR2（配列番号：506）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、URLC5に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがフォーカス形成によって示され（ギムザによる染色）（非提示データ）、これにより、URLC5の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。
NSC 1131：SYNJ2BP；SYNJ2BPに対応する有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチドAS1（配列番号：507）および逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）R1（配列番号：508）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、SYNJ2BPに関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549およびNCI-H226に導入した。トランスフェクションから2日後に、このアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがフォーカス形成によって示され（ギムザによる染色）（非提示データ）、このことからSYNJ2BPの抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。
NSC 1142：NAPG；NAPGに対応する有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチドAS1（配列番号：509）および逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）R1（配列番号：510）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、NAPGに関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、このアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがフォーカス形成によって示され（ギムザによる染色）（非提示データ）、このことからNAPGの抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。
NSC 1183：BYSL；BYSLに対応する3種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド、AS1（配列番号：511）、AS2（配列番号：513）、およびAS3（配列番号：515）、ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）、R1（配列番号：512）、R2（配列番号：514）、およびR3（配列番号：516）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、BYSLに関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがフォーカス形成によって示され（ギムザによる染色）（非提示データ）、このことからBYSLの抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。
NSC 1185：URLC6；URLC6に対応する2種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド、AS4（配列番号：517）およびAS6（配列番号：519）ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）、R4（配列番号：518）、およびR6（配列番号：520）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、URLC6に関して最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549およびNCI-H226に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがフォーカス形成によって示され（ギムザによる染色）（非提示データ）、このことからURLC6の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。
NSC 1191：COX17；COX17に対応する3種類の有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチド、AS2（配列番号：521）、AS4（配列番号：523）、およびAS5（配列番号：525）ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）、R2（配列番号：522）、R4（配列番号：524）およびR5（配列番号：526）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、COX17の最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示され（図2）、このことからCOX17の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
NSC 1273：FLJ32549；FLJ32549に対応する2種類の有効アンチセンゴ-オリゴヌクレオチド、AS1（配列番号：527）およびAS2（配列番号：529）、ならびに逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）、R1（配列番号：528）およびR2（配列番号：530）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、FLJ32549の最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549、NCI-H226、およびNCI-H522に導入した。トランスフェクションから2日後に、これらのアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがフォーカス形成によって示され（ギムザによる染色）（非提示データ）、このことからFLJ32549の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。
NSC 1389：NMU；NMUに対応する有効なアンチセンスS-オリゴヌクレオチドAS（配列番号：531）および逆配列型S-オリゴヌクレオチド（対照）R（配列番号：532）を合成した。S-オリゴヌクレオチドのそれぞれを、NMUの最も高い発現が認められたNSCLC細胞株A549およびLC319に導入した。トランスフェクションから2日後に、このアンチセンスS-オリゴヌクレオチドは対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示された（図2）、このことからNMUの抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成によっても裏づけられた（ギムザによる染色）（非提示データ）。
（表５）S-オリゴヌクレオチドの有効な対の配列
Figure 0004425141
Figure 0004425141
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（4）RNA干渉アッセイ
NSCLC細胞における内因性遺伝子のそれぞれの発現を抑制するために、哺乳動物細胞における低分子干渉RNA（siRNA）の合成を導くベクターベースのRNAiシステムであるpsiH1BX3.0を用いた。各遺伝子の標的配列に対して5種類の19塩基対二本鎖ヌクレオチドの合成を導くために5種類のベクターを設計した。これらのベクターを、Lipofectamin 2000試薬（Invitrogene, Carlsbad, CA, USA）を用いて4種類のNSCLC細胞株に導入したところ、60〜90％を上回るトランスフェクション効率でトランスフェクションが生じた。これらの細胞を適切な濃度のジェネティシン（G418）の存在下で5〜9日間培養した。細胞数または細胞生存能力はギムザ染色および／またはMTTアッセイによって3回ずつ評価した。
（5）フローサイトメトリー
細胞を5×105個／100mm培養皿の密度で配置し、上記のようにsiRNA-発現ベクターを用いて導入した。感染から24〜48時間後に細胞をトリプシン処理し、PBS中に収集した上で、70％冷エタノール中で30分間固定した。100μg／mlのRNアーゼ（Sigma Chemical Co.-Aldrich, St. Louis, MO）で処理した後に、細胞を50μg／mlヨウ化プロピジウム（Sigma-Aldrich）によりPBS中で染色した。フローサイトメトリーをBecton Dickinson FACScanで行い、ModFitソフトウエア（Verity Software House, Inc., Topsham, ME）により解析した。細胞周期のG0／G1期、S期、およびG2／M期にある核ならびにサブG1期集団の比率を、同期化していない（ungated）少なくとも20,000個の細胞から決定した。アポトーシスに関しても、アネキシンVとの結合に基づくフローサイトメトリーによって検出した。
（6）RNAi
癌細胞の成長、増殖、および生存を調節する新たな分子標的の同定および特徴決定を行うために、以上の手順によって選択された各候補遺伝子の内因性発現を抑制する目的でpsiH1BX3.0ベクターを用いるRNA干渉法を行った。各候補遺伝子に関する詳細な方法および結果は以下の通りであった。
NSC 807：KOC1：この遺伝子を標的とする19塩基対の二本鎖配列の合成を導く3種類の有効なベクターを設計し、NSCLC細胞株A549およびLC319に導入した。トランスフェクションから5日後に、この遺伝子に対するRNAiベクター（No.1）の導入は対照と比較してコロニー数を明らかに抑制し（図3Aおよび3B）、このことからKOC1の抑制が細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成アッセイによっても裏づけられた（ギムザ染色）（非提示データ）。
NSC 810：TTK：この遺伝子を標的とする19塩基対の二本鎖配列の合成を導く3種類の有効なベクターを設計し、NSCLC細胞株A549およびLC319に導入した。トランスフェクションから5日後に、この遺伝子に対するRNAiベクター（TTK-1）の導入は対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示され（図3Aおよび3B）、このことからTTKの抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成アッセイによっても裏づけられた（ギムザ染色）（非提示データ）。有効なTTK RNAiが導入されたLC319細胞を顕微鏡でさらに検査し、画像を24日毎または48日毎に取り込んだ。TTK RNAiが導入されたLC319細胞は多核細胞表現型を呈し、完全な細胞死を来したが、EGFP RNAiが導入された細胞は単核細胞表現型を呈した（図3C）。抗TTKモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析により、LC319細胞における天然TTKタンパク質の発現およびTTK RNAiによるその抑制が検出された（図3E）。
NSC 825：ANLN：この遺伝子を標的とする19塩基対の二本鎖配列の合成を導く2種類の有効なベクターを設計し、NSCLC細胞株A549およびLC319に導入した。トランスフェクションから5日後に、この遺伝子に対するこれらのRNAiベクターの導入は対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示され（図3Aおよび3B）、このことからANLNの抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成アッセイによっても裏づけられた（ギムザ染色）（非提示データ）。2種類の有効なANLN RNAiのいずれかが導入されたLC319細胞は多核細胞表現型を有し、完全な細胞死を来したが、EGFP RNAiが導入された細胞は単核細胞表現型を呈した（図3C）。フローサイトメトリーによって評価したANLN RNAi遺伝子導入細胞の細胞周期プロファイルでは異常な細胞周期および倍数性（DNA含有量が4Nを上回る）が認められた（図3D）。
NSC 841：URLC2：この遺伝子を標的とする19塩基対の二本鎖配列の合成を導く2種類の有効なベクターを設計し、NSCLC細胞株A549およびLC319に導入した。トランスフェクションから5日後に、この遺伝子に対するこれらのRNAiベクターの導入は対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示され（図3Aおよび3B）、このことからURLC2の抑制が細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成アッセイによっても裏づけられた（ギムザ染色）（非提示データ）。siRNAのトランスフェクションから24時間後にフローサイトメトリーを行った。その結果、LC319細胞のサブG1期集団が28％増加していることが検出された。URLC2-siRNAはアポトーシスを顕著に誘導し、これはアネキシンV結合のフローサイトメトリー分析による評価でも認められた（図3D）。
NSC 903：URLC9：この遺伝子を標的とする19塩基対の二本鎖配列の合成を導く2種類の有効なベクターを設計し、NSCLC細胞株A549およびLC319に導入した。トランスフェクションから5日後に、この遺伝子に対するこれらのRNAiベクターの導入は対照と比較してコロニー数を明らかに抑制し（図3Aおよび3B）、このことからURLC9の抑制が細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成アッセイによっても裏づけられた（ギムザ染色）（非提示データ）。
NSC 956：SIAHBP1：この遺伝子を標的とする19塩基対の二本鎖配列の合成を導く2種類の有効なベクターを設計し、NSCLC細胞株A549およびLC319に導入した。トランスフェクションから5日後に、この遺伝子に対するこれらのRNAiベクターの導入は対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示され（図3Aおよび3B）、このことからSIAHBP1の抑制が細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成アッセイによっても裏づけられた（ギムザ染色）（非提示データ）。
NSC 994：DKFZP434E2318：この遺伝子を標的とする19塩基対の二本鎖配列の合成を導く2種類の有効なベクターを設計し、NSCLC細胞株A549およびLC319に導入した。トランスフェクションから5日後に、この遺伝子に対するRNAiベクター（No.1）の導入は対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示され（図3Aおよび3B）、このことからDKFZP434E2318の抑制が細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成アッセイによっても裏づけられた（ギムザ染色）（非提示データ）。
NSC 1107：URLC8：この遺伝子を標的とする19塩基対の二本鎖配列の合成を導く5種類の有効なベクターを設計し、NSCLC細胞株A549およびLC319に導入した。トランスフェクションから5日後に、この遺伝子に対するこれらのRNAiベクターの導入は対照と比較してコロニー数を明らかに抑制し（図3Aおよび3B）、このことからURLC8の抑制が細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成アッセイによっても裏づけられた（ギムザ染色）（非提示データ）。
NSC 1191：COX17：この遺伝子を標的とする19塩基対の二本鎖配列の合成を導く2種類の有効なベクターを設計し、NSCLC細胞株A549およびLC319に導入した。トランスフェクションから5日後に、この遺伝子に対するRNAiベクター（No.2）の導入は対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示され（図3Aおよび3B）、このことからCOX17の抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成アッセイによっても裏づけられた（ギムザ染色）（非提示データ）。
NSC 1246：SUPT3H：この遺伝子を標的とする19塩基対の二本鎖配列の合成を導く3種類の有効なベクターを設計し、NSCLC細胞株A549に導入した。トランスフェクションから5日後に、この遺伝子に対するRNAiベクター（No.2）の導入は対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示され（図3A）、このことからSUPT3Hの抑制が細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成アッセイによっても裏づけられた（ギムザ染色）（非提示データ）。
NSC 1389：NMU：この遺伝子を標的とする19塩基対の二本鎖配列の合成を導く2種類の有効なベクターを設計し、NSCLC細胞株A549およびLC319に導入した。トランスフェクションから5日後に、この遺伝子に対するRNAiベクター（No.2）の導入は対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがMTTアッセイによって示され（図3Aおよび3B）、このことからNMUの抑制は細胞の成長、増殖、および／または生存性を低下させることが示唆された。この結果はフォーカス形成アッセイによっても裏づけられた（ギムザ染色）（非提示データ）。続いて、siRNAのトランスフェクションから24時間後にフローサイトメトリーを行った。その結果、LC319細胞のサブG1期集団が34.5％増加していることが検出された（図3D）。
NSC 1395：FBN2：この遺伝子を標的とする19塩基対の二本鎖配列の合成を導く1種類の有効なベクターを設計し、NSCLC細胞株A549およびLC319に導入した。トランスフェクションから5日後に、この遺伝子に対するRNAiベクター（No.2）の導入は対照と比較して細胞増殖を明らかに抑制することがフォーカス形成アッセイによって示された（ギムザ染色）（非提示データ）。
（7）シトクロムcオキシダーゼ活性
A549細胞におけるシトクロムcオキシダーゼ（CCO）活性およびCOX17 RNAiによるその阻害に関して試験した。CCO活性の測定方法を説明した概略図は図3Fに示されている。詳細には、ジギトニン（Wako、Osaka、Japan）用いて細胞をミトコンドリアとその他の画分に分けた。緩衝液（10mM Tris、0.2mM EDTA、0.05％n-ドデシル-b-D-マルトシド、pH7.6）中にあるシトクロムc（63mM）を12.5mM L(+)-アスコルビン酸とともに室温（18℃）で30分間インキュベートし、第二鉄性シトクロムcを第一鉄性シトクロムcに変換させた。続いて、37℃のこの混合液2mlに1mg／mlミトコンドリアタンパク質溶液20μlを添加した。反応物をCCO活性に関して550nmで測定した。
天然のCOX17タンパク質がヒトNSCLC細胞においてシトクロムcオキシダーゼ（CCO）活性を有するか否かを明らかにするために、CCO活性の検出を目的として有効なCOX17 RNAiベクターをA549細胞株に導入した。トランスフェクションから2日後または5日後に、COX活性は内因性COX17遺伝子の抑制のために低下していた。この結果により、COX17により生じるCCO活性がヒトNSCLCにおいて重要であることが裏づけられた（図3F、G、およびH）。
RNAiとして有効な合成オリゴヌクレオチドの配列を表6に示している。アンチセンスS-オリゴヌクレオチドおよび／またはRNAiのトランスフェクションによるその阻害が癌細胞の成長、増殖、および生存性の抑制を引き起こした、30種の遺伝子が同定された。
（表６）RNAiに関して有効な合成オリゴヌクレオチドの配列
Figure 0004425141
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（8）免疫細胞化学分析
c-myc-Hisで標識したタンパク質を調製するために、各タンパク質のC末端にc-myc-Hisエピトープ配列（LDEESILKQE-HHHHHH）をコードする遺伝子を含むベクターを構築し、COS-7細胞に導入した。チャンバースライドに蒔きなおした、一時的に導入されたCOS-7細胞を4％パラホルムアルデヒドを含むPBSで固定し、続いて0.1％Triton X-100を含むPBS中に4℃で3分間おいて透過化した。非特異的な抗体結合部位をブロックするために、この細胞をブロッキング溶液（2％BSAを含むPBS）で覆い、室温で30分間おいた。続いて細胞をマウス抗c-myc抗体（ブロッキング溶液で1：800に希釈）とともにインキュベートした。この抗体を、FITCを結合させたヤギ抗マウス二次抗体で染色した上でECLIPSE E800顕微鏡（Nikon）により観察した。遺伝子導入細胞におけるc-myc標識タンパク質の発現を確かめるために、ウエスタンブロット法を以前の記載の通りに行った（Shiratsuchiら、Biochem Biophys Res Commun 247: 597-604 (1998)）。
（9）標的遺伝子の可能性がある産物の哺乳動物細胞における局在
これらの候補遺伝子によってコードされるタンパク質の哺乳動物細胞における細胞性局在を調べるために、COS-7細胞に対して、各タンパク質のC末端にc-myc-His-エピトープ配列（LDEESILKQE-HHHHHH）をコードする遺伝子を含むプラスミドpcDNA3.1(+)／c-myc-Hisを導入した。これらの抗c-myc抗体を用いたところ、24種のタンパク質が個別の細胞内位置で検出された。遺伝子導入細胞におけるタンパク質のいくつかの発現がイムノブロット法によって確認された（図5A）。
（10）抗癌療法および診断のための標識としての膜貫通性／分泌性タンパク質の選択
腫瘍細胞の表面で過剰発現されている可能性のある14種の膜貫通性／分泌性タンパク質がスクリーニングされた。これらのタンパク質は、受容体を標的とする／抗体を基盤とする、癌に対する治療薬および診断薬の優れた標的であると期待される。遺伝子導入されたCOS-7細胞におけるこれらのタンパク質のいくつかの発現および細胞局在が免疫細胞化学分析によって確認された。
各遺伝子によってコードされるタンパク質の細胞内局在を明らかにするために、COS-7細胞に対して、c-myc-HisまたはFlagが標識されたタンパク質を発現するプラスミドを導入した。各遺伝子に関する免疫細胞化学分析の結果を以下に示す。
NSC 807：KOC1：KOC1／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞質中で検出された（非提示データ）。
NSC 810：TTK：TTK／c-myc-Hisタンパク質は主として核内で検出された（非提示データ）。
NSC 825：ANLN：ANLN／c-myc-Hisタンパク質は主として核内および細胞質中で検出された（非提示データ）。
NSC 841：URLC2：URLC2／c-myc-Hisタンパク質は主として核内および細胞質中で検出された（非提示データ）。
NSC 849：GJB5：GJB5／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞膜内で検出された（図5A）。
NSC 855：LNIR：LNIR／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞膜内で検出された（図5A）。
NSC 895：FAM3D：FAM3D／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞質顆粒、ゴルジ、および細胞膜内で検出された（図5A）。培地中へのFAM3Dの分泌がウエスタンブロット法によって検出された（図5B）。このため、FAM3Dは分泌タンパク質であると考えられる。
NSC 903：URLC9：URLC9／c-myc-Hisタンパク質は主として核内で検出された（非提示データ）。
NSC 915：URLC10：URLC10／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞質顆粒およびゴルジで検出され、細胞膜表面の点（dot）としても検出された（図5A）。
NSC 948：TASK-2：TASK-2／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞膜内で検出された（図5A）。
NSC 956：SIAHBP1：SIAHBP1／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞質中で検出された（非提示データ）。
NSC 994：DKFZp434E2318：DKFZp434E2318／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞質中で検出された（非提示データ）。
NSC 1000：PSK-1：PSK-1／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞膜内で検出された（図5A）。
NSC 1103：KCNK1：KCNK1／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞膜内で検出された（図5A）。
NSC 1107：URLC8：URLC8／c-myc-Hisタンパク質は主として核内で検出された（非提示データ）。
NSC 1164：NPTX1：NPTX1／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞質顆粒内で検出された（図5A）。培地中へのNPTX1の分泌がウエスタンブロット法によって検出された（図5B）。このため、NPTX1は分泌タンパク質であると考えられる。
NSC 1191：COX17：COX17／c-myc-Hisタンパク質は主としてミトコンドリア内で検出された（非提示データ）。
NSC 1201：SLC7A1：SLC7A1／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞膜内およびゴルジ内で検出された（図5A）。
NSC 1246：SUPT3H：SUPT3H／c-myc-Hisタンパク質は主として核内および細胞質中で検出された（非提示データ）。
NSC 1288：PTGFRN：PTGFRN／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞膜内およびゴルジ内で検出された（図5A）。
NSC 1295：ADAM8：ADAM8／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞膜内で検出された（図5A）。ADAM8の3種類の切断型の培地中への分泌がウエスタンブロット法によって検出された（図5B）。このため、ADAM8は分泌タンパク質であると考えられた。
NSC 1389：NMU：NMU／c-myc-Hisタンパク質は主としてゴルジ体内で検出され、分泌タンパク質として検出された（図5A）。
NSC 1420：CHDOL：CHDOL／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞膜内およびゴルジ内で検出された（図5A）。
NSC 1441：HSCOV：HSNOV／c-myc-Hisタンパク質は主として細胞膜内およびゴルジ内で検出された（図5A）。
（12）細胞増殖アッセイおよびコロニー形成アッセイ
安定的な遺伝子導入体を標準的なプロトコールに従って樹立した。詳細には、標的遺伝子を発現するプラスミド（pcDNA3.1／myc-His）または遺伝子の相補鎖を発現するプラスミド（pcDNA3.1-アンチセンス）または擬似（mock）プラスミド（pcDNA3.1）をCOS-7細胞に導入した後に、細胞をジェネティシン（G418）とともに14日間培養した。続いてコロニーを選択し、遺伝子の発現をウエスタンブロット法によって検出した。樹立した安定的な遺伝子導入体がモノクローナル性であることは、抗c-myc抗体による免疫染色によって確認した（非提示データ）。COS-7細胞の安定的な遺伝子導入体を6ウェルのマイクロタイタープレートに播き（5×104個／ウェル）、10％FBSとともに抗生物質を含む培地中に24、48、72、96、120、および144時間保った。各々の時点で、セルカウンティングキット（WAKO）またはMTTアッセイによって細胞増殖活性を評価した。
（13）安定的な遺伝子導入体の細胞増殖アッセイおよび自己分泌アッセイ
NSC 810：TTK；哺乳動物細胞の増殖に対するTTKの影響を明らかにするために、外因性TTKを発現するCOS-7細胞（COS-7-TTK1および2）を樹立し、それらの増殖を、擬似ベクターを導入した対照細胞（TTK-mock）のものと比較した。図6に示されているように、COS-7-TTK細胞の増殖は、pcDNA3.1-TTK-c-myc-Hisタンパク質の発現レベルに一致して、対照細胞よりも顕著に亢進していた。この結果は3回の独立した実験によって裏づけられた。COS-7-TTK細胞も、対照細胞よりも大きなコロニーを形成する明らかな傾向を示した（非提示データ）。
NSC 841：URLC2；哺乳動物細胞の増殖に対するURLC2の影響を明らかにするために、外因性URLC2を発現するNIH3T3細胞（NIH3T3-URLC2-3および5）を樹立し、それらの増殖を擬似ベクターを導入した対照細胞（NIH3T3-mock）のものと比較した。図6に示されているように、NIH3T3-URLC2細胞の増殖は、pcDNA3.1-URLC2-myc-Hisタンパク質の発現レベルに一致して、対照細胞よりも顕著に亢進していた。この結果は3回の独立した実験によって裏づけられた。NIH3T3-URLC2細胞も、対照細胞よりも大きなコロニーを形成する明らかな傾向を示した（非提示データ）。
NSC 1389：NMU；哺乳動物細胞の増殖に対するNMUの影響を明らかにするために、外因性NMUを発現するCOS-7細胞（COS-7-NMU-2、3、および5）を樹立し、それらの増殖を、アンチセンス鎖または擬似ベクターを導入した対照細胞（COS-7-AS-1および2；COS-7-mock）のものと比較した。図6に示されているように、COS-7-NMU細胞の増殖は、pcDNA3.1-NMU-c-myc／Hisタンパク質の発現レベルに一致して、対照細胞よりも顕著に亢進していた。この結果は4回の独立した実験によって裏づけられた。COS-7-NMU細胞も、対照細胞よりも大きなコロニーを形成する明らかな傾向を示した。この結果は、過剰発現されたNMUが哺乳動物細胞に対して形質転換作用を及ぼすことを示唆する。
（14）自己分泌アッセイ
細胞増殖におけるNMUの自己分泌機能を確かめるために、NMUの活性型25アミノ酸ポリペプチド（NMU-25）（Alpha diagnostic international：ADI）を最終濃度1μg〜50μg（3μM〜15μM／ml）で含む培地中で、COS-7細胞を培養した。同じ濃度のウシ血清アルブミン（BSA）を含む培地を対照として用いた。これらのポリペプチドまたはBSAを48時間毎に7日間にわたって添加した。24、48、72、96、120、および144時間の時点で、細胞生存能力をMTTアッセイにより測定した。COS-7細胞に対するNMUタンパク質の増殖促進作用を確かめるために、3μM／mlのNMU-25を含む培地中に抗NMU抗体を最終濃度0.5μM〜7.5μM／mlとして添加した。
その結果、NMU-25とともにインキュベートしたCOS-7細胞は、用量依存的な様式で、BSAとともにインキュベートしたものよりもより大きくかつ迅速な細胞増殖を示した（図7A）。
次に、3μM／mlのNMU-25を含むCOS-7の培地中に、抗NMU抗体を最終濃度0.5μM〜7.5μM／mlとして添加した。MTTアッセイによれば、NMU-25および抗NMU抗体とともにインキュベートしたCOS-7細胞は、用量依存的な様式で、対照よりも緩徐な細胞増殖を示した（図7B）。
さらに、抗NMU抗体を、内因性NMUを過剰発現するLC319細胞の培地にも同じ濃度で添加した。MTTアッセイにより、抗NMU抗体とともにインキュベートしたLC319細胞は、用量依存的な様式で、対照よりも緩徐な細胞増殖を示した（図7C）。
（15）免疫組織化学分析
正常肺およびNSCLCを含む臨床組織試料におけるタンパク質の発現を試験するために、ENVISION+Kit／HRP（DAKO）を用いて切片を染色した。詳細には、内因性ペルオキシダーゼ反応およびタンパク質ブロッキング反応の後に、抗ヒト抗体を一次抗体として添加し、続いて組織試料を二次抗体としてのHRP標識抗ウサギIgG抗体で処理した。続いて、組織標本をヘマトキシリンで対比染色するための基質として色素原を添加した。
NSCLCにおけるTTKタンパク質の過剰発現を確かめるために、NSCLC細胞株A549、LC319、およびNCI-H522におけるタンパク質をウエスタンブロット分析によってまず同定した（図8）。続いて、各遺伝子に対する免疫組織化学染色を以下の通りに行った。
NSC 947：PKP3；外科的に入手し、凍結した上でOCT媒体中に包埋したNSCLC（扁平上皮癌）試料に対して、抗PKP3抗体による免疫組織化学染色を行った。すべての腫瘍組織試料の細胞質は抗PKP3抗体で主として染色されたが、正常肺組織は染色されなかった（図9）。
NSC 1164：NPTX1；外科的に入手し、凍結した上でOCT媒体中に包埋したNSCLC試料に対して、抗NPTX1抗体による免疫組織化学染色を行った。すべての腫瘍組織試料の細胞質は抗NPTX1抗体で主として染色されたが、正常肺組織は染色されなかった（図9）。
NSC 1295：ADAM8；外科的に入手し、凍結した上でOCT媒体中に包埋したNSCLC試料に対して、抗ADAM8抗体による免疫組織化学染色を行った。すべての腫瘍組織試料は抗ADAM8抗体で強く染色されたが、正常肺組織の染色は弱かった（図9）。
NSC 1389：NMU；外科的に入手し、凍結した上でOCT媒体中に包埋したNSCLC試料に対して、抗NMU抗体による免疫組織化学染色を行った。すべての腫瘍組織試料の細胞質はいずれも抗NMU抗体で主として染色されたが、正常肺組織は染色されなかった。腺癌試料の場合にはNMUは導管細胞で検出され、扁平上皮癌では核の周囲、特に細胞質顆粒で検出された（図9）。
（16）標的遺伝子の完全長配列の決定、ノーザンブロット法、および半定量的RT-PCR分析
34種類の正常組織と比較して、50％を上回るNSCLCで発現が5倍の高さであることが認められた過剰発現性遺伝子のリストを集約することにより、NSCLCでは特異的に発現されるが正常組織（生存にとって不可欠でないか代替可能である生殖組織または胎児臓器を除く）ではそうでない642種の候補遺伝子を腫瘍マーカーまたは治療標的として選択した。これらの標的遺伝子の完全長配列をESTスクリーニングによって決定し、腫瘍および正常組織におけるそれらの遺伝子発現パターンを半定量的RT-PCRを用いて確認した。
新規遺伝子URLC1が見いだされた。そのヌクレオチド配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列は配列表に以下の配列番号で示されている：
Figure 0004425141
以上のようにして得た結果を、本発明の遺伝子のそれぞれに関して以下にまとめた。
NSC 807：KOC1；この遺伝子は1つのhnRNA K-相同性（KH）ドメインおよび1つのRNA認識モチーフ（RRM）ドメインをコードする。IGF-II（IGF2）リーダー3'mRNAの5'UTRと結合するというKHドメインの機能は、発生後期におけるIGF-IIの翻訳を抑制している可能性がある。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的としてのこの遺伝子の有用性を示唆している。
NSC 810：TTK；この遺伝子はS TKcドメインをコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質はタンパク質をセリン、トレオニン、およびチロシンの位置でリン酸化するが、このリン酸化は細胞増殖と関係すると考えられる。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。本発明によれば、安定的な遺伝子導入体で発現されたTTKタンパク質はCOS-7細胞の増殖を用量依存的な様式で促進した。この結果から、TTKの過剰発現は哺乳動物細胞に対して形質転換作用を及ぼすことが示唆された。これらのデータは、TTKがNSCLCに関する新規癌遺伝子である可能性を示すとともに、TTKを標的とすることによって肺癌の治療のための有望な治療法を確立しうることを示唆する。
NSC 811：SDC1；この遺伝子は、推定的バンド4.1相同体結合モチーフ（4.1m）ドメインをコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質は細胞表面プロテオグリカンであるシンデカンであり、これは細胞外マトリックスに対する受容体として作用する内在性膜タンパク質である。これは膜貫通性ヘパラン硫酸プロテオグリカンの群に属する。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 812：NMB；この遺伝子は1つのシグナルペプチドおよび1つの膜貫通ドメインをコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、ボンベシンファミリーのメンバーであるニューロメジンB（これは肺癌に関係する自己分泌増殖因子である）として機能する。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 816：PIR51；この遺伝子によってコードされるタンパク質は核内に局在し、このタンパク質内にドメインは認められない。このタンパク質はDNA結合タンパク質およびRNA結合タンパク質として機能し、DNAの組換えおよび修復にかかわるRAD51リコンビナーゼタンパク質と相互作用する。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 825：ANLN；この遺伝子はPHドメインをコードし、この遺伝子のいくつか推定的な機能が示唆されている：（1）ヘテロ三量体Gタンパク質のβ／γサブユニットとの結合；（2）脂質、例えばホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸との結合；（3）リン酸化されたSer／Thr残基との結合；および（4）未知の機序による膜との接着。この遺伝子は、セプチンなどの分裂溝タンパク質と相互作用するアクチン結合タンパク質をコードし、細胞質分裂にも役割を果たしている可能性がある。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 841：URLC2；この遺伝子はJmjcドメイン（クピン（cupin）型メタロ酵素の一部であるドメインファミリー）をコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、クロマチン再構築過程を調節する機能不明の酵素であると考えられる。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。本研究によれば、URLC2の抑制はLC319細胞のアポトーシスを誘導した。さらに、安定的な遺伝子導入体で発現されたURLC2タンパク質はNIH3T3細胞の増殖を用量依存的な様式で促進した。この結果は、過剰発現されたURLC2が哺乳動物細胞に対して形質転換作用を及ぼすことを示唆する。これらのデータは、URLC2がNSCLCに関する新規癌遺伝子である可能性を示すとともに、URLC2に焦点を当てることによって肺癌の治療のための有望な治療法を確立しうることを示唆している。
NSC 849：GJB5；この遺伝子はギャップ結合タンパク質β5（コネキシン31.1）をコードする。GJB5はコネキシンファミリー（β型（i群）サブファミリー）のメンバーである。1つのギャップ結合は膜貫通性チャンネルであるコネクソンの稠密な対のクラスターからなり、その中を通って低分子量物質が一方の細胞から隣接する細胞へと拡散することが報告されている。コネクソンはコネキシンの六量体から構成される。免疫細胞化学分析によれば、この遺伝子によってコードされるタンパク質は主として細胞膜内で検出されていた。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さおよびNSCLCにおける高い発現は、この遺伝子がNSCLCに関する診断マーカー（すなわち、血清または痰を用いる診断）および治療標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 855：LNIR；この遺伝子は1つのシグナルペプチド、免疫グロブリン、免疫グロブリンC2ドメイン、および1つの膜貫通ドメインをコードする。この遺伝子によってコードされる膜貫通タンパク質、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、この遺伝子は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 857：TIGD5；この遺伝子は動原体タンパク質B（CENP-B）をコードする。CENP-Bは動原体に局在するDNA結合タンパク質である。このタンパク質のN末端125残基にはDNA結合ドメインが1つあり、これは対応する17bp のCENP-Bボックス配列と結合する。CENP-BのC末端59残基には二量体化ドメインがある。CENP-B二量体は、2つの別個のDNA分子のいずれか、またはループ構造を形成する介在DNA鎖を有する1つのDNA分子上の2つのCENP-Bボックスと結合する。この遺伝子は、ヒトにおけるDNA媒介性トランスポゾンのポゴ（pogo）スーパーファミリーのティガー（tigger）サブファミリーに属する。このサブファミリーに属するタンパク質は真菌および線虫に認められるDNAトランスポゾンと類縁性があり、Tc1およびマリナー（mariner）トランスポザーゼとはさらに隔たりがある。この遺伝子によってコードされるタンパク質は主な哺乳動物動原体タンパク質Bとも極めて類似している。この遺伝子の正確な機能は不明である。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 859：URLC3；この遺伝子はどの既知のドメインもコードせず、この遺伝子によってコードされるタンパク質は真核生物の翻訳開始因子3サブユニット（ヒト）に対して56アミノ酸にわたり70％の類似性を有する。このサブユニットは40sリボソームと結合し、メチオニル-tRNAiとmRNAとの結合を促進する（類似性による）。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 885：BAG5；この遺伝子はBAGドメインをコードする。すなわち、この遺伝子によってコードされるタンパク質はBAG1関連タンパク質ファミリーのメンバーである。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 893：MPHOSP1；この遺伝子は、KIScドメイン、および、オルガネラの細胞内輸送および細胞分裂において重要な役割を果たす微小管依存性分子モーターをコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質はキネシン様タンパク質ファミリーに属し、グアノシン三リン酸（gtp）結合型のrab6aおよびrab6bと相互作用する。このタンパク質は、ゴルジ膜および随伴小胞の微小管に沿ったrab6調節性逆行輸送に必要なモーターとして作用すると思われる。このタンパク質は微小管のプラス端向きの運動性を有し、細胞周期のM期にはリン酸化されている。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 895：FAM3D；この遺伝子はN末端にシグナルペプチドドメインを有する分泌タンパク質と推定されるタンパク質をコードするが、その機能はまだ解明されていない。このタンパク質は免疫細胞化学分析で主として細胞質顆粒内およびゴルジ内で検出され、このことからこのタンパク質が分泌性であることが示唆された。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、およびNSCLCにおける高い発現は、この遺伝子がNSCLCに関する診断マーカーとして（すなわち、血清または痰を用いた診断に）有用である可能性を示唆している。
NSC 898：URLC7；この遺伝子によってコードされるタンパク質は核内に局在し、このタンパク質内に既知のドメインは存在しない。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 903：URLC9；この遺伝子によってコードされるタンパク質は核内に局在し、このタンパク質内に既知のドメインは存在しない。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 905：URLC1；この遺伝子はTUDORドメインをコードし、これに関してはいくつか推定的な機能が示唆されている：（1）RNAの結合；および（2）核酸の結合。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 909：FLJ10468；この遺伝子によってコードされるタンパク質は核内に局在し、このタンパク質内に既知のドメインは存在しない。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 915：URLC10；この遺伝子は2つの膜貫通ドメインをコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、GMLと弱い類似性のある領域を有する。免疫細胞化学分析によれば、このタンパク質は主として細胞質顆粒内およびゴルジ内で検出されるとともに、細胞膜の表面に点として検出されている。この膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 920：CHAF1A；この遺伝子によってコードされる既知のドメインは検出されていない。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、複製中のDNAへのヒストンH3アセチル化H4の付着を補助するクロマチン集合因子1の150kDaサブユニットを有する。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 947：PKP3；この遺伝子はアルマジロ／β-カテニン様反復配列ドメイン（ARM）をコードする。アルマジロ反復配列は約40アミノ酸長の縦列反復配列モチーフであり、ショウジョウバエのセグメント極性遺伝子であるアルマジロにおいて最初に同定された。類似した反復配列はその後、哺乳動物のアルマジロ相同体であるβ-カテニン、接着斑タンパク質であるプラコグロビン、大腸腺腫様ポリポーシス（APC）腫瘍抑制タンパク質、および多数の他のタンパク質でも見いだされた。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、タンパク質-タンパク質相互作用を媒介するプラコフィリン3として機能し、アルマジロタンパク質ファミリーのメンバーである。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。免疫組織化学染色により、PKP3は扁平上皮癌細胞の細胞質で濃染されることが示されている。これらのデータはPKP3が肺癌の治療のための有望な治療標的および診断標的であることを示唆する。
NSC 948：TASK-2；この遺伝子はイオン輸送体ドメインであるシグナルペプチドをコードする（SOSUI）。この遺伝子は、孔形成性Pドメインを2つ含むカリウムチャンネルタンパク質のスーパーファミリーに属するタンパク質をコードする。この遺伝子のmRNAは主として腎臓の皮質部遠位尿細管および集合管で発現される。この遺伝子によってコードされるタンパク質は外部pHに対する感受性が高く、これをその発現パターンと併せて考えると、これが腎臓のカリウム輸送に重要な役割を果たしている可能性が示唆される。この膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 956：SIAHBP1；この遺伝子は、核酸結合ドメインとして知られているRNA認識モチーフ（RRM）ドメインをコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質はRo RNP結合タンパク質である。これはRo RNPと相互作用して、Ro RNPの機能を活性化する。このタンパク質は遠上流エレメント（far upstream element）（FUSE）およびFUSE結合タンパク質と三元複合体を形成する。これはFUSEとの結合を介してc-mycレポーターを抑制しうる。転写因子IIHがこのタンパク質の標的であることも知られており、このタンパク質は活性化された転写を抑制する。この遺伝子は色素性乾皮症と関連づけられている。この遺伝子には、異なるアイソフォームをコードする、選択的スプライシングを受けた2種類の転写変異型が存在する。この遺伝子にはポリアデニル化部位が多数存在するように思われる。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 991：DOLPP1；この遺伝子は1つの膜貫通ドメインおよび1つの酸性ホスファターゼ相同体ドメインをコードする。この遺伝子によってコードされる膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 994：DKFZP434E2318；この遺伝子は1つのBTB／POZドメインおよび1つのKelchドメインをコードする。BTB／POZドメインはタンパク質-タンパク質相互作用モチーフであることが知られている。BTB／POZドメインはホモ二量体化を媒介し、場合によってはヘテロ二量体化も媒介する。いくつかのジンクフィンガータンパク質のPOZドメインは、転写抑制を媒介すること、ならびにN-CoRおよびSMARTを含むヒストンジアセチラーゼコリプレッサー複合体の構成要素と相互作用することが示されている。Kelchドメインはタンパク質-タンパク質相互作用に関与するβプロペラドメインであり、グリコール酸オキシダーゼの様ないくつかの酵素活性を有する。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 1000：PSK-1；この遺伝子は1つのシグナルペプチド、1つのCUBドメイン、1つのSushiドメイン（SCR反復配列）、および1つの膜貫通ドメインをコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、5つのsushi（SCR）ドメインおよび1つの細胞外CUBドメインを含む接着タンパク質であるマウスSez6と高い類似性がある。この膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 1066：MCM8；この遺伝子は、種々の細胞活性と関連のある1つのATPアーゼ（AAA）ドメインおよび1つのミニ染色体維持タンパク質（MCM）ドメインをコードする。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、およびNSCLCにおける高い発現は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 1075：URLC4；この遺伝子によってコードされる既知のドメインは検出されていない。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 1103：KCNK1；この遺伝子は、孔形成性Pドメインを2つ含むカリウムチャンネルタンパク質のスーパーファミリーに属するタンパク質をコードする。この遺伝子の産物が機能性チャンネルであることは示されていない。機能性チャンネルとしての活性には他の孔非形成性タンパク質が必要と考えられる。この膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 1107：URLC8；この遺伝子は二本鎖RNA結合モチーフ（DSRM）ドメインをコードする。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 1113：URLC5；この遺伝子によってコードされる既知のドメインは検出されていない。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 1131：SYNJ2BP；この遺伝子はPDZ膜貫通ドメインをコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、PDZドメインを含む膜標的性シグナル伝達タンパク質である可能性がある。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 1141：URLC11；この遺伝子は9つの膜貫通ドメインをコードする。この遺伝子によってコードされる膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 1142：NAPG；この遺伝子によってコードされる既知のドメインは検出されていない。NAPGによってコードされる推定312アミノ酸のヒトタンパク質配列はウシγ-SNAPと95％同一である。NAPGタンパク質は血小板のエキソサイトーシスを媒介し、この過程の膜融合事象を制御する。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 1164：NPTX1；この遺伝子はペンタキシン（Pentaxin）／C反応性タンパク質をコードする。NPTX1は神経性ペントラキシン遺伝子ファミリーのメンバーである。神経性ペントラキシン1は、ヘビ毒素タイポキシン（taipoxin）の結合タンパク質をコードするラットNP1遺伝子と類似性がある。免疫細胞化学分析によれば、この遺伝子によってコードされるタンパク質は主として細胞質顆粒内で検出された。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、およびNSCLCにおける高い発現は、この遺伝子がNSCLCに関する診断マーカー（すなわち、血清または痰を用いる診断のため）および治療標的として有用である可能性を示唆している。免疫組織化学染色により、NPTX1は腺癌細胞の細胞質で濃染されることが示されている。これらのデータから、NPTX1が肺癌の治療のための有望な治療標的および診断標的である可能性が示唆された。
NSC 1183：BYSL；この遺伝子によってコードされる既知のドメインは検出されていない。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、トロフィニン（trophinin）（TRO）およびTASTINと細胞接着分子複合体を形成し、胚移植のために重要と思われるビスチン（bystin）の機能を有する。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 1185：URLC6；この遺伝子はジンクフィンガーRNA認識モチーフドメインをコードする。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 1191：COX17；この遺伝子によってコードされるタンパク質はミトコンドリア内膜腔に局在し（類似性による）、ミトコンドリアへの銅の輸送に機能すると考えられる。さらに、このタンパク質はシトクロムオキシダーゼの発現に必要と考えられる。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 1201：SLC7A1；この遺伝子は14の膜貫通ドメインをコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、原形質膜を介してアルギニン、リジン、およびオルニチンを輸送する陽イオン性アミノ酸輸送体（同種指向性レトロウイルス受容体）として機能するマウスRec-1（Atrc 1）と強い類似性がある。免疫細胞化学分析によれば、このタンパク質は主として細胞膜内およびゴルジ内で検出された。この膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 1240：FLJ00159；この遺伝子は4つの膜貫通ドメインをコードする。この遺伝子によってコードされる膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 1246：SUPT3H；この遺伝子は転写開始因子αD、18kDサブユニットをコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質を含むファミリーには、Spt3酵母転写因子およびヒト転写開始因子αDの18kDサブユニット（TFαD-18）が含まれる。結晶構造の決定により、非定型的なヒストンの折り畳み構造が示された。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、およびNSCLCにおける高い発現は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 1254：FLJ10815；この遺伝子は膜貫通性のアミノ酸輸送体タンパク質をコードする。この膜貫通領域は、UNC-47およびMTRを含む多くのアミノ酸輸送体に認められる。UNC-47は小胞アミノ酪酸（GABA）輸送体（VGAT）をコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、アミノ酸／オーキシン透過酵素（AAAP）ファミリーの膜輸送体とやや類似した機能を有する。この膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 1265：SLC28A2；この遺伝子はNa+依存性ヌクレオシド輸送体をコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、プリンヌクレオシドおよびウリジンを輸送するナトリウム共役型ヌクレオシド輸送体2として機能する。この膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 1273：FLJ32549；この遺伝子によってコードされる既知のドメインは検出されていない。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 1288：PTGFRN；この遺伝子は、1つのシグナルペプチド、6つの免疫グロブリンドメイン、および1つの膜貫通ドメインをコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、親和定数ではなく受容体数を減少させることにより、プロスタグランジンf2-α（pgf2-α）とその特異的fp受容体との結合を阻害する。このタンパク質はプロスタグランジンf2-α受容体と機能的に共役するように思われる。免疫細胞化学分析によれば、このタンパク質は主として細胞膜内およびゴルジ内で検出された。この膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 1292：C17orf26；この遺伝子は3つの膜貫通ドメイン、1つの亜鉛輸送体ドメイン、および1つのシグナルペプチドをコードする（SOSUI）。この遺伝子によってコードされる膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 1295：ADAM8；この遺伝子は、ヘビディスインテグリン、レプロリシン（Reprolysin）ファミリープロペプチド、およびレプロリシン（M12B）ファミリージンクメタロプロテアーゼと相同なタンパク質をコードする。ADAMファミリーのメンバーは、接着ドメインおよびプロテアーゼドメインと考えられるものをいずれも有する固有の構造を備えた細胞表面タンパク質である。ADAM8の細胞外領域は出血性ヘビ毒タンパク質と有意なアミノ酸配列相同性を示し、メタロプロテアーゼドメインおよびディスインテグリンドメインを含む。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、およびNSCLCにおける高い発現は、この遺伝子がNSCLCに関する診断マーカー（すなわち、血清または痰を用いる診断のため）および治療標的として有用である可能性を示唆している。免疫組織化学染色により、ADAM8は腺癌細胞で濃染されることが示された。これらのデータから、ADAM8は肺癌の治療のための有望な治療標的および診断標的である可能性が示唆された。
NSC 1306：ABCA4；この遺伝子は1つのシグナルペプチドおよび1つのAAAドメインをコードする。この遺伝子によってコードされる膜結合タンパク質は、ATP結合カセット（ABC）輸送体のスーパーファミリーのメンバーである。ABCタンパク質は細胞外膜および細胞内膜を介して種々の分子を輸送する。ABC遺伝子は7つの異なるサブファミリーに分類されている（ABC1、MDR／TAP、MRP、ALD、OABP、GCN20、およびWhite）。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、ABC1サブファミリーのメンバーである。ABC1サブファミリーのメンバーは、多細胞真核生物のみに認められる唯一の主要なABCサブファミリーを含む。このタンパク質はN-レチニリデン（retinylidene）-PEを基質として用いる網膜特異的なABC輸送体である。このタンパク質はもっぱら網膜光受容細胞で発現され、これはこの遺伝子産物が光受容細胞の膜を介した必須分子の輸送を媒介することを示している。この遺伝子の変異はシュタルガルト病と診断された患者で認められており、網膜色素変性症-19および黄斑変性症関連2との関連がみられる。この膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 1343：GPR49；この遺伝子は1つのシグナルペプチド、1つのロイシンリッチ反復N末端ドメインおよび7つの膜貫通受容体（ロドプシンファミリー）をコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質はGタンパク質共役型受容体ファミリーに属し、そのメンバーはロイシンリッチ受容体を含む大きな細胞外領域を有する。この膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 1362：SCAMP5；この遺伝子は4つの膜貫通ドメインをコードする。この遺伝子によってコードされる膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 1389：NMU；この遺伝子は1つのNMUドメインをコードする。大半の活性ペプチドと同じように、この遺伝子によってコードされるタンパク質は、より大きな前駆体タンパク質からのタンパク質分解性プロセシングを受けている。このタンパク質の成熟ペプチドは8〜25残基長であり、そのC末端はアミド化されている。このタンパク質は筋収縮、特に消化管における筋収縮を賦活し、摂食を抑制する。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。本研究によれば、安定的な遺伝子導入体によって培地に分泌されたNMUタンパク質、または培地中に添加された活性型のNMUペプチドはCOS-7細胞の増殖を用量依存的な様式で促進した。免疫組織化学染色によれば、NMUタンパク質は腺癌および扁平上皮癌細胞の両方の細胞質で濃染された。これらのデータから、NMUがNSCLCに関する重要な自己分泌増殖因子であることが示され、NMUリガンド-受容体系に焦点を当てることによって肺癌の治療のための有望な治療法および診断法を開発しうることが示唆された。さらに、NMUの抑制はLC319細胞におけるアポトーシスを誘導した。さらに、LC319細胞において、抗NMU抗体によるNMUタンパク質の抑制は対照と比較して増殖抑制を誘導した。これらの結果は、NMUを標的とする抗体またはsiRNAによって肺癌を治療しうる可能性があることを示唆している。
NSC 1395：FBN2；この遺伝子は1つのカルシウム結合性EGF様（EGF CA）ドメインおよび1つのEGF様（未分類のサブファミリー）ドメインをコードする。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞外ミクロフィブリルの形成および維持を調節すると思われる細胞外マトリックスタンパク質であるフィブリリン2として機能する。FBN2の変異は先天性拘縮性クモ指症の原因となることがある。正常組織におけるこの遺伝子の発現の相対的な低さ、NSCLCにおける高い発現、ならびにこの遺伝子の抑制による遺伝子導入細胞の成長、増殖、および／または生存性の低下は、この遺伝子が新薬および免疫療法のための新規な診断マーカーおよび標的として有用である可能性を示唆している。
NSC 1420：CHDOL；この遺伝子は、C型レクチンの細胞外部分での特徴である糖質認識ドメインを備えたI型膜タンパク質をコードする。他のタンパク質では、このドメインは糖タンパク質および外因性糖保有性病原体のエンドサイトーシスに関与する。この遺伝子によってコードされるタンパク質はほとんど核周辺領域に局在する。免疫細胞化学分析によれば、このタンパク質は主として細胞膜内およびゴルジ内に存在する。この膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
NSC 1441：HSNOV1；この遺伝子は内在性膜タンパク質DFU6ドメインをコードする。免疫細胞化学分析によれば、この遺伝子によってコードされるタンパク質は主として細胞膜内およびゴルジ内で検出された。この膜貫通タンパク質は、腫瘍細胞の表面では過剰発現されるが正常細胞の表面では過剰発現されないと考えられる。このため、このタンパク質は受容体を標的とする治療法または診断のための優れた標的であると考えられる。
産業上の利用可能性
レーザービームを用いた顕微鏡下切除およびゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイとの組み合わせによって行われた、本明細書に記載した非小細胞肺癌の遺伝子発現解析により、非小細胞肺癌の予防および治療のための標的としての特異的な遺伝子が同定された。これらの差次的に発現される遺伝子のサブセットの発現に基づき、本発明は、非小細胞肺癌の同定または検出のための分子診断マーカーを提供する。
本明細書に記載した方法は、非小細胞肺癌の予防、診断、および治療のためのさらなる分子標的の同定にも有用である。本明細書で報告したデータは、非小細胞肺癌の包括的理解を深め、新たな診断法の開発を促すとともに、治療薬および予防薬の分子標的の同定のための手がかりを与えるものである。このような情報は、発癌に関する理解をさらに深めるのに役立つとともに、非小細胞肺癌の診断、治療、さらに最終的にはその予防のための新たな戦略を開発するための指標を提供する。
本発明を、その特定の態様に言及しながら詳細に説明してきたが、これらに、発明の精神および範囲から逸脱することなくさまざまな変更および修正を加えうることは当業者には明らかであると考えられる。
半定量的RT-PCRにより確認した、肺癌細胞で過剰発現された200種の遺伝子を示したブロットの写真を示している。肺癌細胞はLCM法により肺癌患者から採取した。 肺癌細胞株におけるNSC 810、NSC 811、NSC 812、NSC 825、NSC 841、NSC 857、NSC 859、NSC 893、NSC 905、NSC 947、NSC 956、NSC 994、NSC 1075、NSC 1107、NSC 1191、およびNSC 1389を抑制するように指定されたアンチセンスS-オリゴヌクレオチドの増殖抑制作用を示している。NSC 810-AS、NSC 811-AS1、NSC 811-AS2、NSC 811-AS4、NSC 812-AS1、NSC 812-AS2、NSC 825-AS1、NSC 825-AS3、NSC 825-AS5、NSC 841-AS4、NSC 841-AS5、NSC 857-AS3、NSC 857-AS4、NSC 859-AS2、NSC 859-AS3、NSC 859-AS5、NSC 893-AS1、NSC 893-AS2、NSC 905-AS2、NSC 905-AS3、NSC 905-AS5、NSC 947-AS1、NSC 947-AS2、NSC 947-AS3、NSC 947-AS4、NSC 956-AS1、NSC 956-AS2、NSC 994-AS1、NSC 994-AS3、NSC 994-AS4、NSC 994-AS5、NSC 1075-AS5、NSC 1107-AS1、NSC 1107-AS4、NSC 1191-AS2、NSC 1191-AS4、NSC 1191-AS5、およびNSC 1389-ASによる細胞増殖の阻害を示したMTTアッセイの結果を示している。 肺癌細胞株に対するsiRNA（NSC 807-si1、NSC 810-si1、NSC 825-si1、NSC 825-si2、NSC 841-si1、NSC 841-si2、NSC 903-si1、NSC 903-si2、NSC 956-si1、NSC 956-si2、NSC 994-si1、NSC 1107-si1、NSC 1107-si2、NSC 1107-si3、NSC 1107-si4、NSC 1107-si5、NSC 1191-si2、NSC 1246-si2、およびNSC 1389-si2）の増殖抑制作用を示している。図3Aは、対照-siRNAまたは標的-siRNAを発現するベクターを導入したA549細胞に対するMTTアッセイの結果を示している。図3Bは、対照-siRNAまたは標的-siRNAを発現するベクターを導入したLC319細胞に対するMTTアッセイの結果を示している。図3Cは、siRNAを導入したLC319細胞の時間差画像の顕微鏡写真を示している。図3Dは、siRNAを導入した細胞の細胞周期プロファイルを示したフローサイトメトリー分析の結果を示している。図3Eは、2種類のモノクローナル抗体によって検出した、LC319細胞における天然タンパク質の発現およびsiRNAによる阻害を示すウエスタンブロット法の結果を示した写真である。図3F、G、およびHは、A549細胞におけるシトクロムcオキシダーゼ（CCO）活性およびCOX17 RNAiによるその阻害を示している。図3Fは、CCO活性測定の概略図を示している。図3Gは、COX17 RNAiを導入したA549細胞、細胞の細胞質画分およびミトコンドリア画分の、ヒトミトコンドリアに対するマウスモノクローナル抗体（MAB1273；CHEMICON, Temecula, CA）を用いた分別を確認したウエスタンブロット法の結果を示している。図3Hは、トランスフェクションの2日後または5日後の、内因性COX17遺伝子の抑制に起因するCCO活性の低下を示している。 多組織ノーザンブロット分析により分析した、さまざまなヒト組織におけるNSC 807、NSC 810、NSC 811、NSC 822、NSC 825、NSC 841、NSC 849、NSC 855、NSC 859、NSC 885、NSC 895、NSC 903、NSC 904、NSC 905、NSC 915、NSC 948、NSC 956、NSC 994、NSC 1000、NSC 1066、NSC 1075、NSC 1107、NSC 1113、NSC 1131、NSC 1141、NSC 1164、NSC 1183、NSC 1201, NSC 1240、NSC 1246、NSC 1254、NSC 1265、NSC 1277、NSC 1295、NSC 1306、NSC 1343、NSC 1362、NSC 1389、NSC 1399、NSC 1406、NSC 1413、およびNSC 1420の発現を示した写真を示している。 図5Aは、c-myc-His標識性NSC遺伝子発現ベクターを導入したCOS-7細胞に対する、抗mycモノクローナル抗体および可視化のためのローダミン結合二次抗マウスIgG抗体を用いる免疫細胞化学法によって観察した、NSC 849、NSC 855、NSC 895、NSC 915、NSC 948、NSC 1000、NSC 1103、NSC 1164、NSC 1201, NSC 1288、NSC 1295、NSC 1389、NSC 1420、およびNSC 1441の細胞内局在を示した写真を示している。核はDAPIで対比染色した。図5Bは、培地中に分泌されたc-myc標識性NSC 895、NSC 1164、およびNSC 1295のウエスタンブロット分析の結果を示した写真を示している。 c-myc-His標識性発現ベクターを安定的に導入したCOS-7細胞における細胞増殖に対するNSC遺伝子の影響を示している。図6aは、ウエスタンブロット法により検出した、安定的に導入されたCOS-7細胞におけるNSC 810、NSC 841、およびNSC 1389の発現を示している。図6bは、COS-7細胞の増殖に対するNSC 810、NSC 841、およびNSC 1389の影響を示している。NSC 810（COS7-TTK-1および2）、NSC 841（NIH3T3-URLC2-3および5）およびNSC 1389（COS-7-NMU-2、3および5）および対照（擬似）を高レベルに発現する2つまたは3つの独立した遺伝子導入体を3セットずつ培養した。細胞生存能力はMTTアッセイによって測定した。 自己分泌系によって試験した細胞増殖に対するNMUの影響を示している。図7AはNMUの自己分泌アッセイの結果を示している。NMUの活性型25アミノ酸ポリペプチド（NMU-25）およびBSA（対照）タンパク質を個々のCOS-7細胞に対して48時間毎に添加した。添加して7日後に、細胞数をMTTアッセイによって算定した。図7Bは、NMU-25で処理したCOS-7細胞に対する抗NMU抗体の増殖抑制作用を示している。図7Cは、NMUを内因性に過剰発現するLC319細胞に対する抗NMU抗体の増殖抑制作用を示している。 NSCLC細胞株、A549、LC319、およびNCI-H522におけるTTKタンパク質の過剰発現を裏づけるウエスタンブロット分析の結果を示している。 抗NSC 947抗体、抗NSC 1164抗体、抗NSC 1295抗体、および抗NSC 1389抗体を用いた、腺癌、扁平上皮癌、および正常肺を含む臨床試料におけるNSC 947、NSC 1164、NSC 1295、およびNSC 1389の免疫組織化学染色の結果を示している。

Claims (8)

  1. 以下の段階を含む、非小細胞肺癌の治療または予防のための化合物に関するスクリーニングの方法：
    （a）被験化合物を、TTKプロテインキナーゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドと接触させる段階；
    （b）段階（a）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
    （c）TTKプロテインキナーゼ遺伝子によってコードされるポリペプチドの生物学的活性を被験化合物の非存在下で検出される生物学的活性と比較して抑制する化合物を選択する段階。
  2. 生物学的活性が細胞増殖活性である、請求項１記載の方法。
  3. 以下の段階を含む、非小細胞肺癌の治療または予防のための化合物に関するスクリーニングの方法：
    （1）被験化合物をTTKプロテインキナーゼ遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；および
    （2）TTKプロテインキナーゼ遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する段階。
  4. 細胞が非小細胞性肺癌細胞である、請求項３記載の方法。
  5. 以下の段階を含む、非小細胞肺癌の治療または予防のための化合物に関するスクリーニングの方法：
    （1）被験化合物を、TTKプロテインキナーゼ遺伝子の転写調節領域およびその転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階；
    （2）該レポーター遺伝子の活性を測定する段階；および
    （3）対照と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する段階。
  6. TTKプロテインキナーゼ遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチドまたはsiRNAの薬学的有効量を含む、非小細胞肺癌の治療または予防のための組成物。
  7. 配列番号：423を含むアンチセンスポリヌクレオチドの薬学的有効量を含む、非小細胞肺癌の治療または予防のための組成物。
  8. 配列番号： 534のヌクレオチド配列を標的配列として含むsiRNAの薬学的有効量を含む、非小細胞肺癌の治療または予防のための組成物。
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