KR102732170B1 - 구강미생물 정보를 이용한 폐암의 조기진단 및 위험성 예측 방법 또는 이를 위한 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 구강 마이크로바이옴을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 폐암 진단 또는 발병 위험성 예측용 조성물; 이를 포함하는 키트; 및 폐암 진단, 발병 위험성 예측 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로서, 타액 유래의 구강 마이크로바이옴을 분석함으로써, 신속하고 정확한 폐암의 조기 진단, 발병 위험성 또는 예후 예측이 가능하여, 폐암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 구강미생물 정보를 이용한 폐암의 조기 진단, 위험성 또는 예후 예측을 위한 정보 제공과 이를 위한 조성물에 관한 것이다.
폐암은 가장 흔한 암 중 하나로 2020년 전 세계적으로 약 2,207 만 명의 환자가 발생했으며, 암 사망의 가장 흔한 원인으로서, 2020년 전 세계에서 1,796만 명이 폐암으로 사망하였다 (International Agency for Research on Cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. Fact sheets on cancer from IARC).
폐암은 조직학적 유형에 따라 SCLC(small cell lung cancer, 소세포폐암)와 NSCLC(non-small cell lung cancer, 비소세포폐암)로 분류되며, 각각은 전체 폐암의 10-15% 및 80-85%를 차지하고 있다 (American Cancer Society. About Lung Cancer. Accessed Dec 16, 2020). NSCLC은 선암(adenocarcinoma), 편평상피암(squamous cell carcinoma) 및 대세포암(large cell carcinoma)의 세 가지 서브타입으로 세분화된다. 이 중 폐선암(lung adenocarcinoma)은 폐암에서 가장 흔하게 관찰되는 서브타입으로 전체 폐암 중 대략 40%가 이 서브타입이다 (American Cancer Society. About Lung Cancer. Accessed Dec 16, 2020; 및 Nat Commun 2020;11(1):2285).
흡연은 폐암의 주요 위험인자이나 (Transl Lung Cancer Res 2018;7(3):220-33), 남성 폐암 환자의 15~20%가 비흡연자이고, 여성 폐암 환자의 50% 이상이 비흡연자로, 흡연 이외의 위험인자도 폐암 발생에 중요한 역할을 할 것으로 추정할 수 있다 (CA Cancer J Clin 2005;55(2):74-108). 특히, 아시아에서는 여성 폐암 환자 중 비흡연자의 비율이 60~80%로 높게 보고되었다 (Clin Lung Cancer 2012;13(1):75-9). 비흡연자에서 가장 많이 발생하는 폐암의 서브타입은 폐선암이다 (American Cancer Society. About Lung Cancer. Accessed Dec 16, 2020). 비흡연자의 폐암 발생을 높이는 위험 인자들로는 라돈, 대기 오염, 직업적 위험, 간접흡연, 감염 또는 염증에 대한 노출 등이 제시되었다 (Transl Lung Cancer Res, 7 (2018) 220-233). 그러나, 이러한 위험 인자들은 비흡연자의 폐암 발병을 완전히 설명할 수 없다.
최근, 마이크로바이옴의 변화가 폐암의 위험 인자 중 하나로 인식되고 있다 (Nat Med 2019;25(3):377-88). 선행 연구들은 구강 마이크로바이옴의 변화가 폐암과 관련 있음을 보여준다. Yan et al. 은 폐암 환자의 타액에서 나이세리아속(Neisseria) 풍부도가 감소되고, 카프노이시트파가속(Capnocytophaga), 셀레노모나스속(Selenomonas,) 및 베일로넬라속(Veillonella) 풍부도가 증가되었다고 보고하였다 (Am J Cancer Res, 5 (2015) 3111-3122). 또 다른 연구에서는 여성 비흡연 폐암 환자의 타액에 스핀고모나스속(Sphingomonas) 및 블라스토모나스속(Blastomonas) 미생물이 현저히 풍부해지고, 아시네토박터속(Acinetobacter) 및 스트렙토코쿠스속(Streptococcus) 미생물이 덜 풍부해진 것으로 보고하였다 (Front Oncol, 8 (2018) 520). 또한, 구강 마이크로바이옴 다양성 감소와 구강 마이크로바이옴의 Lactobacillales 풍부도 증가가 폐암 위험도 증가와 관련있는 것으로 보고되었다 (Thorax 2021;76(3):256-63).
지금까지 보고된 연구들에 따르면 폐암 관련 미생물 종류가 연구마다 일치하지는 않는다. 이러한 차이는 제한된 샘플 수와 환자의 특성 차이로 기인된 것으로 보인다. 이런 한계에도 불구하고, 상기 연구들은 폐암 환자의 마이크로바이옴이 건강한 사람의 것과 현저하게 상이함을 보여주었다.
최근에는 미생물 자체 혹은 미생물을 조절할 수 있는 물질이 새로운 항암 치료제로 활용될 수 있다는 가능성이 제시되고 있다 (Science, 359 (2018) 1366-1370). 또한 점막염, 설사 및 변비와 같은 항암 화학요법 부작용이 인체 마이크로바이옴의 변화와 관련 있을 것으로 여겨지며, 마이크로바이옴 조절을 통해 항암 치료의 부작용을 완화하는 방법도 활발히 탐색되고 있다. 특히, 구강 마이크로바이옴의 변화는 악성 종양 환자에서 화학요법에 의해 유도된 구강 점막염과 관련되어 있음이 보고되었으며 (Clin Microbiol Infect, 19 (2013) E559-567), 폐암에 대한 항함 화학요법의 효과가 특정 장내 마이크로바이옴 종(species)의 증가 혹은 감소와 관련되어 있음이 보고되었다 (Thorac Cancer, 12 (2021) 66-78).
상기 연구들은 인체 마이크로바이옴이 암의 진행 상태 모니터링, 항암 치료제 개발, 혹은 항암 요법 부작용 최소화 등의 다양한 응용가능성이 있음을 보여준다. 이에 본 발명자들은 대규모 병렬 시퀀싱 (massive parallel sequencing)을 통해 비흡연 환자의 구강 마이크로바이옴을 건강한 개체와 비교하여 폐선암과 관련된 미생물을 조사하였고, 마이크로바이옴 정보에 기반하여 폐암 환자와 건강한 개체를 구분할 수 있는지 여부를 확인하였다. 또한, 치료 환자와 비치료 환자 사이에 구강 마이크로바이옴의 차이를 조사하였고, 마이크로바이옴 데이터를 이용하여 폐암 환자의 생존율을 예측할 수 있는지 확인하였다.
본 발명의 목적은 구강 마이크로바이옴을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 폐암 진단 또는 발병 위험성 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단 또는 발병 위험성 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 타액에서 추출된 DNA에 대하여 16S rRNA 유전자의 서열분석(sequencing)을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 서열분석을 통해 구강 마이크로바이옴의 풍부도를 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 폐암의 진단, 발병 위험성 예측 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 구강 마이크로바이옴을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 폐암 진단 또는 발병 위험성 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단 또는 발병 위험성 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 타액에서 추출된 DNA에 대하여 16S rRNA 유전자의 서열분석(sequencing)을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 서열분석을 통해 구강 마이크로바이옴의 풍부도를 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 폐암의 진단, 발병 위험성 예측 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물 또는 방법은 타액으로부터 분리된 샘플로부터 구강 마이크로바이옴의 풍부도를 확인함으로써, 신속하고 정확한 폐암의 조기 진단, 발병 위험성 또는 예후 예측이 가능하여, 폐암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 건강한 개체(대조군)와 폐암 환자 사이의 구강 마이크로바이옴 다양성을 나타낸 결과로서, 각 왼쪽 패널은 샤논 다양성 결과이고, 각 오른쪽 패널은 PCoA (principal coordinate analysis) plot 결과이며, a는 대조군과 폐암 환자 사이의 비교 결과이고, b는 대조군, 비치료 그룹 (Treatment -) 및 치료 그룹 (Treatment +) 사이의 비교 결과이다 (*p < 0.05, **p < 0.01).
도 2는 건강한 개체(대조군)와 폐암 환자 사이의 구강 마이크로바이옴의 차등적인 풍부한 속(genus)을 확인한 결과로서, 각 왼쪽 패널은 Log10으로 변환된 상대적 풍부도 결과이고, 각 오른쪽 패널은 차등적인 풍부한 속의 일반화된 배수 변화 결과이며, a는 모든 폐암 환자와 대조군 사이의 결과이고, b는 비치료 그룹과 대조군 사이의 결과이며, c는 치료 그룹과 대조군 사이의 결과이다 (q < 0.1).
도 3은 구강 마이크로바이옴에 의한 폐암 예측 결과로서, a는 폐암 환자, 치료 그룹, 비치료 그룹 및 대조군 사이를 구별하는 예측 모델의 ROC(Receiver operating characteristic) 곡선이고, b는 예측 모델(Bayesian Ridge)의 정규화된 계수를 나타낸 결과이다 (계수가 상위 5% 및 하위 5%인 속을 표시함).
도 4는 폐암 환자에서 구강 마이크로바이옴 프로파일의 예후적 영향을 확인한 결과로서, a는 구강 마이크로바이옴의 PCoA plot를 나타낸 결과이고 (폐암 환자는 Bray-Curtis distances를 근거로 두 그룹으로 분류됨), b는 유사성이 가장 높은 대조군까지의 거리를 근거로 한 구강 미이크로바이옴 군집의 밀도 플롯을 나타낸 결과이며, c는 구강 마이크로바이옴 프로파일의 두 군집에 대한 생존 곡선을 나타낸 결과이고, d는 Cluster 1과 Cluster 2를 구별하는 예측 모델의 ROC (receiver operating characteristic) 곡선을 나타낸 결과이며, e는 예측 모델 (Bayesian Ridge)의 정규화된 계수를 나타낸 결과이다.
도 2는 건강한 개체(대조군)와 폐암 환자 사이의 구강 마이크로바이옴의 차등적인 풍부한 속(genus)을 확인한 결과로서, 각 왼쪽 패널은 Log10으로 변환된 상대적 풍부도 결과이고, 각 오른쪽 패널은 차등적인 풍부한 속의 일반화된 배수 변화 결과이며, a는 모든 폐암 환자와 대조군 사이의 결과이고, b는 비치료 그룹과 대조군 사이의 결과이며, c는 치료 그룹과 대조군 사이의 결과이다 (q < 0.1).
도 3은 구강 마이크로바이옴에 의한 폐암 예측 결과로서, a는 폐암 환자, 치료 그룹, 비치료 그룹 및 대조군 사이를 구별하는 예측 모델의 ROC(Receiver operating characteristic) 곡선이고, b는 예측 모델(Bayesian Ridge)의 정규화된 계수를 나타낸 결과이다 (계수가 상위 5% 및 하위 5%인 속을 표시함).
도 4는 폐암 환자에서 구강 마이크로바이옴 프로파일의 예후적 영향을 확인한 결과로서, a는 구강 마이크로바이옴의 PCoA plot를 나타낸 결과이고 (폐암 환자는 Bray-Curtis distances를 근거로 두 그룹으로 분류됨), b는 유사성이 가장 높은 대조군까지의 거리를 근거로 한 구강 미이크로바이옴 군집의 밀도 플롯을 나타낸 결과이며, c는 구강 마이크로바이옴 프로파일의 두 군집에 대한 생존 곡선을 나타낸 결과이고, d는 Cluster 1과 Cluster 2를 구별하는 예측 모델의 ROC (receiver operating characteristic) 곡선을 나타낸 결과이며, e는 예측 모델 (Bayesian Ridge)의 정규화된 계수를 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 구강 마이크로바이옴을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 폐암 진단 또는 발병 위험성 예측용 조성물을 제공한다.
상기 용어, "구강 마이크로바이옴"은 구강에서 서식하거나 공존하는 미생물과 그 유전정보 전체를 포함하는 미생물군집을 의미한다.
상기 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 폐암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 폐암의 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.
발명의 일 실시예에 있어서, 상기 검출할 수 있는 제제는 구강 마이크로바이옴에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레이티드, 압타머 또는 항체인 것일 수 있고, 바람직하게는 구강 마이크로바이옴의 16S rRNA에 특이적인 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레이티드인 것일 수 있다.
상기 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 염기서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 본 발명이 속하는 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
상기 용어, "프로브"는 유전자에 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지되어 있어 특정 유전자의 존재 유무 및 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 본 발명이 속하는 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다.
상기 용어, "압타머"는 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다. 압타머 생산은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.
상기 용어, "항체"는 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합을 모두 포함한다. 또한, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv를 모두 포함한다. 항체 생산은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.
발명의 일 실시예에 있어서, 상기 폐암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 소세포폐암(small cell lung cancer), 선암(adenocarcinoma), 편평상피암(squamous cell carcinoma) 및 대세포암 (large cell carcinoma)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
발명의 일 실시예에 있어서, 상기 구강 마이크로바이옴은 모기박테리움속(Mogibacterium), 배리오보랙스속(Variovorax), 랄스토니아속(Ralstonia), 불레이디아속(Bulleidia), 베일로넬라속(Veillonella), 액티노마이세스속(Actinomyces), 슬래키아속(Slackia) 및 슈바르치아속(Schwartzia)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 폐암 진단 또는 발병 위험성 예측용 키트를 제공한다.
상기 키트는 구강 마이크로바이옴을 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 또는 항체 등의 검출 제제를 포함할 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트 또는 래피드(rapid) 키트인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 프라이머, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 또는 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
상기 ELISA 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한, ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
상기 래피드(rapid) 키트는 5분 이내 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트로서, 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한, 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 타액에서 추출된 DNA에 대하여 16S rRNA 유전자의 서열분석(sequencing)을 수행하는 단계; 및 (b) 상기 서열분석을 통해 구강 마이크로바이옴의 풍부도를 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 폐암의 진단, 발병 위험성 예측 또는 예후 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 용어, "예후(prognosis)"는 질병을 진단하여 판단된 장래의 증세 또는 경과에 대한 전망하는 것을 의미한다. 암 환자에 있어서 예후는 통상적으로 암 발병 또는 외과적 시술 후 일정기간 내의 전이 여부 또는 생존기간을 뜻한다. 예후 예측은 암의 화학치료 여부를 비롯하여 향후 암 치료 방향에 대한 단서를 제시하므로 매우 중요한 임상적 과제이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 타액은 비흡연자로부터 채취된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 구강 마이크로바이옴은 모기박테리움속(Mogibacterium), 배리오보랙스속(Variovorax), 랄스토니아속(Ralstonia), 불레이디아속(Bulleidia), 베일로넬라속(Veillonella), 액티노마이세스속(Actinomyces), 슬래키아속(Slackia) 및 슈바르치아속(Schwartzia)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 상기 구강 마이크로바이옴에서 모기박테리움속(Mogibacterium), 배리오보랙스속(Variovorax), 랄스토니아속(Ralstonia) 및 불레이디아속(Bulleidia)으로 이루어진 군에서 선택되는 구강 마이크로바이옴의 풍부도가 증가하면 폐암이 아니거나 폐암의 발병 위험성이 낮은 것으로 판단하는 것일 수 있고, 상기 구강 마이크로바이옴에서 베일로넬라속(Veillonella), 액티노마이세스속(Actinomyces), 슬래키아속(Slackia) 및 슈바르치아속(Schwartzia)으로 이루어진 군에서 선택되는 구강 마이크로바이옴의 풍부도가 증가하면 폐암이거나 폐암의 발병 위험성이 높은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 구강 마이크로바이옴은 스트렙토코쿠스속(Streptococcus) 및 메가스페에라속(Megasphaera)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있고, 여기에서, 상기 스트렙토코쿠스속(Streptococcus) 및 메가스페에라속(Megasphaera)으로 이루어진 군에서 선택되는 구강 마이크로바이옴의 풍부도가 증가하면 폐암에 대한 예후가 나쁜 것으로 판단하는 것일 수 있고, 상기 헤모필루스속(Haemophilus)의 풍부도가 증가하면 폐암에 대한 예후가 좋은 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 구강 마이크로바이옴의 풍부도가 기준치와 비교하여 유사성이 높은 경우 폐암에 대한 예후가 좋은 것으로 판단하는 것일 수 있고, 반대로, 상기 구강 마이크로바이옴의 풍부도가 기준치와 비교하여 유사성이 높지 않은 경우 폐암에 대한 예후가 나쁜 것으로 판단하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 폐암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 소세포폐암(small cell lung cancer), 선암(adenocarcinoma), 편평상피암(squamous cell carcinoma) 및 대세포암 (large cell carcinoma)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험방법
1.1. 실험 설계 및 샘플 수집
본 발명에서는 2018년 4월에서 2019년 8월 사이에 국립암센터 (한국, 고양시)에서 흡연 이력이 없고, 폐선암 (lung adenocarcinoma)으로 진단된 총 100명의 환자를 모집하였다. 암의 조직학적 유형은 폐종양에 대한 2004 WHO (World Health Organization) 분류에 따라 결정되었다. TNM (tumor-node-metastasis) 단계는 폐암 병기 결정 시스템의 제8판에 근거하였다 (Chest 2017;151(1):193-203). 본 발명은 국립암센터 기관감사위원회의 승인 하에 수행되었다 (승인번호: NCC2016-0208). 모든 참가자는 서면 동의서를 제출하였다.
타액 샘플은 샘플 수집 전의 1 시간 동안 음식, 음료 섭취 및 양치를 하지 않도록 요청한 후 수집하였다. 환자의 타액은 물로 입을 헹군 후, 50 ml 튜브에 2~5 ml의 타액을 뱉어 수집하였다. 타액 샘플은 사용 전까지 - 80℃에서 보관하였다.
대조군은 비흡연자(never-smoking)로 선택하고, 연령 및 성별을 환자와 일치시켜, 기존 한국 마이크로바이옴 연구로부터 선별하였다. 다양한 만성 질환, 임상적으로 중요한 질환, 주요 위장 질환 또는 암의 병력이 있는 피험자; 및 샘플 채취 전 3개월 이내에 항생제를 투여받은 피험자는 한국 마이크로바이옴 연구에 포함되지 않았다. 대조군의 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 위한 타액 샘플링의 전 과정은 환자의 샘플에 사용된 동일한 과정으로 수행되었다.
예측 모델 검증을 위해, 41명의 한국 NSCLC(non-small cell lung cancer) 환자와 612명의 건강한 한국인의 구강 마이크로바이옴 데이터를 사용하여 독립적인 데이터세트를 구성하였고, 연습에 사용된 대조군은 제외하였다.
1.2. DNA 추출, 16S rRNA 유전자 시퀀싱 및 시퀀싱 데이터 분석
타액 샘플의 전체 DNA는 제조사의 지시에 따라 QIAamp DNA Microbiome Kit (Qiagen)를 사용하여 추출하였다. 타액 샘플로부터 추출된 전체 DNA는 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Illumina protocol (Part # 15044223 Rev. B, Illumina, San Diego, CA, USA)에 따라 16S rRNA V3-V4 library preparation을 수행하였다. 시퀀싱은 Illumina MiSeq instrument (Illumina)를 사용하여 수행하였다. 16S rRNA 유전자 시퀀싱 데이터의 초기 데이터는 QIIME2 (2019.10 version)를 사용하여 처리되었다 (Nat Biotechnol, 37 (2019) 852-857). 서열 품질 관리 및 표의 구성은 q2-dada2 plugin으로 수행되었다 (Nat Methods, 13 (2016) 581-583). 알파 및 베타 다양성 메트릭스는 샘플당 10,000 서열의 균일한 샘플링 깊이에서 q2-diversity plugin을 사용하여 계산되었다. 분류는 q2-feature-classifier plugin와 함께 Greengenes 13_8 99% OTUs 에 대한 pre-trained naive Bayes classifier을 사용하여 ASV(amplicon sequence variants)에 할당되었다 (Appl Environ Microbiol, 72 (2006) 5069-5072; 및 Microbiome, 6 (2018) 90).
1.3. 통계적 분석
폐선암 (lung adenocarcinoma) 환자와 건강한 대조군 사이의 유의적인 차이는 Student's t-test 또는 Fisher's exact test로 평가하였다. 그룹 사이의 마이크로바이옴의 샤논 다양성(Shannon diversity)은 Wilcoxon rank-sum test 또는 Kruskal-Wallis test를 사용하여 비교하였다. 베타 다양성과 폐암의 관련성은 Bray-Curtis distance에 대한 vegan R package에서 Adonis function을 사용하여 PERMANOVA(permutational multivariate analysis of variance)에 의해 평가되었다. 피험자 그룹 사이의 차등적인 속(genus)의 풍부도는 Wilcoxon rank-sum test을 사용하여 확인되었고, 실험은 최대 풍부도가 0.001 보다 높은 속에서 수행되었다. P 값은 Benjamini-Hochberg FDR method를 사용하여 조정되었고, q<0.1를 가진 미생물 특징이 보고되었다.
1.4. 암 상태(cancer status)에 대한 예측 모델
암 상태는 개인이 비-질병 집단에 속하는 경우를 1로 하고, 암 환자에 속하는 경우를 0으로 기록하였다. 미생물의 상대적 풍부도는 0.00005를 더한 후, 밑이 10인 로그 함수를 사용하여 변환하였다. Scikit-learn package (Version 0.22.1)에 있는 Bayesian Ridge method가 변환된 미생물 풍부도를 사용하여 암 상태를 예측하는데 이용되었다 (J Mach Learn Res, 12 (2011) 2825-2830).
5중 교차 검증법은 예측력을 평가하는데 이용되었다. 교차 검증법 자체는 데이터 세트를 학습 및 테스트 세트로 분할함으로써 나타나는 편차를 줄이기 위해 5번 반복되었다. 각 테스트 세트의 위양성 비율과 양성 비율은 ROC (receiver operating characteristic) 곡선 및 AUC (average area under curve)을 측정하기 위해 사용되었다. 각 예측 모델에 대한 각 미생물의 기여도를 평가하기 위해, Bayesian Ridge model의 계수가 추출되고, 모델의 최대 절대 계수로 나누어 정규화하였다.
독립 데이터 세트에서 예측력의 측정을 위해, Bayesian Ridge model을 파일로 저장하였다. 모델은 독립 데이터 세트의 암 상태를 예측하는데 사용되었고, ROC AUC는 모델의 성능을 측정하기 위해 각 예측 모델에 대해 측정되었다. 독립 데이터 세트의 상대적 풍부도 데이터는 미생물을 모델의 학습에 사용된 것과 일치시킨 후 모델의 입력으로 사용되었다.
1.5. 예후 분석
폐암 환자는 PyClustering software package (v. 0.10.1)의 PAM (partition around medoids) 알고리즘을 사용하여 Bray-Curtis distances를 근거로 두 그룹으로 나누었다 (Journal of Open Source Software 2019;4(36):1230). Kaplan-Meier 곡선으로 나타내었고, 로그-순위 테스트 (log-rank test)는 survminer R packages를 이용하여 생존률을 분석하였다. 예측 모델은 두 가지의 폐암 환자 그룹에 대한 데이터세트로 수행되었다.
실시예 2. 대상 환자의 특성
본 발명에는 총 100명이 등록되었고, 총 91명의 환자가 포함되었다 (1명은 중단; 8명은 품질관리 실패). 대부분의 환자는 여성 (n = 84, 92.3%)이었고, 4기 폐암 (n = 81, 89.0%)이었다. 마이크로바이옴 샘플링 시점에, 39명의 환자는 폐암 치료를 받지 않았고, 52명의 환자는 처음 폐암 진단을 받은 이후 폐암에 대한 화학치료요법이나 표적화 약물 치료를 1회 이상 받았다. 91명의 대조군은 환자와 연령 및 성별과 일치된 건강한 비흡연의 한국인이 선택되었다. 대상 환자의 특성은 하기 표 1에 나타내었다.
실시예 3. 폐암 환자에서 구강 마이크로바이옴 다양성의 감소
본 발명자들은 폐암 환자와 건강한 개체(대조군)에서 구강 마이크로바이옴의 다양성을 조사하였다. 그 결과, 환자 그룹의 샤논 다양성은 대조군보다 현저히 낮음을 확인하였다 (p = 0.015) (도 1a). 또한, 암 환자의 전체 구강 마이크로바이옴의 구조는 대조군과 통계적으로 유의한 차이가 있었다 (Adonis, R2 = 0.014, P < 0.001) (도 1a).
또한, 본 발명자들은 암 치료가 구강 마이크로바이옴의 변화와 관련이 있는지 여부를 확인하였다. 환자는 화학치료요법 또는 표적화 약물의 치료 그룹(Treatment +, n = 52)과 비치료 그룹(Treatment -, n = 39)으로 나누었다. 그 결과, 치료 그룹(Treatment +)의 샤논 다양성은 대조군에 비해 현저히 낮았음을 확인하였다 (도 1b). 또한, 비치료 그룹(Treatment -)의 마이크로바이옴은 대조군보다 덜 다양했으나, 통계적으로 유의하지는 않았다. 치료 그룹(Treatment +)과 비치료 그룹(Treatment -)의 medoid는 PCoA (principal coordinate analysis) 플롯에서 서로 가깝게 위치하였다 (도 1b).
상기 결과로부터, 폐암 환자에서는 건강한 개체에 비해 구강 마이크로바이옴의 다양성이 감소하였음을 확인하였다. 또한, 화학치료요법 또는 표적화 약물 치료와 같은 폐암 치료를 받은 폐암 환자(Treatment +)에서는 건강한 개체나 치료를 받지 않은 폐암 환자(Treatment -)에 비해 다양성이 감소되는 경향을 보였다.
실시예 4. 폐암과 구강 미생물의 관련성
본 발명자들은 폐암 환자에서 풍부도가 변화된 구강 미생물을 확인하였다. 모든 폐암 환자와 대조군의 구강 미생물의 상대적 풍부도가 속(genus) 수준에서 비교되었다. 그 결과, 폐암 환자에서는 대조군에 비해 베일로넬라속(Veillonella)의 상대적 풍부도가 높은 반면, 모기박테리움속(Mogibacterium), 부티리비브리오속(Butyrivibrio), 배리오보랙스속(Variovorax), 랄스토니아속(Ralstonia), 카토넬라속(Catonella), 불레이디아속(Bulleidia) 및 오리박테리움(Oribacterium)을 포함한 15개 속(genus)의 상대적 풍부도가 현저하게 낮았다 (Wilcoxon rank-sum test, FDR < 0.1) (도 2a).
또한, 치료 그룹(Treatment +) 및 비치료 그룹(Treatment -)을 대조군과 각각 비교하였을 때, 두 그룹 모두에서는 대조군에 비해 앞서 언급한 7개 속의 미생물이 현저히 덜 풍부하게 나타났다 (도 2b 및 2c). 일부 분류군에서는 치료 조건과 더욱 특이적으로 관련되었다. 치료 그룹(Treatment +)에서는 올스넬라속(Olsenella)이 더욱 풍부한 반면, 비치료 그룹(Treatment -)에서는 베일로넬라속(Veillonella)이 더욱 풍부한 것으로 확인되었다 (도 2b 및 2c). 또한, 치료 그룹(Treatment +)에서는 캄필로박터속(Campylobacter)이 덜 풍부한 반면, 비치료 그룹(Treatment -)에서는 팔루디박터속(Paludibacter), 트레포네마속(Treponema), 타네넬라속(Tannerella) 및 SHD-231 속의 미생물가 덜 풍부한 것으로 확인되었다 (도 2b 및 2c). 비치료 그룹과 대조군의 비교에서 차등적으로 나타난 속 미생물은 전체 암환자와 대조군을 비교에서 차등적으로 풍부하게 나타난 속 미생물에 모두 포함되었다 (도 2a 및 2b).
실시예 5. 구강 마이크로바이옴 프로파일을 이용한 폐암 예측
이후, 본 발명자들은 구강 마이크로바이옴의 조성으로부터 암 상태를 예측할 수 있는지 여부를 조사하였다. 본 발명자들은 대조군과 모든 폐암 환자의 구강 마이크로바이옴의 구성을 사용하여 암 상태를 예측하기 위하여, 기계 학습 접근법(machine learning approaches)을 사용하였다. 그 결과, ROC AUC가 0.95로서, 예측 모델이 대조군으로부터 폐암 환자를 구별할 수 있음을 확인하였다 (도 3a).
또한, 본 발명자들은 41명의 진행성 NSCLC 환자와 612명의 건강한 한국인이 포함된 독립 데이터 세트를 사용하여 예측 모델의 성능을 평가하였다. 그 결과, 독립 데이터 세트에서의 예측력은 ROC AUC가 0.88로서 매우 높았음을 확인하였다. 이로써, 예측 모델은 건강한 개체로부터 폐암 환자를 구별할 수 있음을 확인하였다.
예측 모델에 따르면, 모기박테리움속(Mogibacterium), 배리오보랙스속(Variovorax), 랄스토니아속(Ralstonia) 및 불레이디아속(Bulleidia)의 풍부도가 예측에 중요한 것으로 나타났고, 이러한 속(genus)의 높은 풍부도를 가진 샘플은 건강한 개체로 예측되었다 (도 3b). 반면, 베일로넬라속(Veillonella), 액티노마이세스속(Actinomyces), 슬래키아속(Slackia) 및 슈바르치아속(Schwartzia)의 높은 풍부도는 폐암 환자로 예측될 확률이 높은 것을 확인하였다 (도 3b).
대조군과 치료 그룹 (Treatment +)의 구강 마이크로바이옴 프로파일로 연습된 예측 모델은 ROC AUC가 0.96으로서, 대조군과 비치료 그룹 (Treatment -)의 구강 마이크로바이옴 프로파일로 연습된 예측 모델(ROC AUC=0.88)보다 암 상태를 더욱 잘 구별할 수 있었다 (도 3a). 두 예측 모델(Control vs Treatment -; 및 Control vs Treatment +) 사이에서 예측력에 차이가 있더라도, 유사한 미생물 세트가 두 모델에 사용되었고, 모델에서의 계수가 서로 유사한 것으로 나타났다 (도 3b).
실시예 6. 마이크로바이옴 프로파일에 의한 폐암의 예후 예측
본 발명자들은 폐암 환자의 생존 결과를 분석하여 마이크로바이옴 프로파일의 예후 영향력을 평가하였다. 환자는 구강 마이크로바이옴의 유사성에 따라 두 그룹으로 나누었다 (도 4a). 첫 번째 그룹(이하, "Cluster 1")은 두 번째 그룹(이하, "Cluster 2")에 비해 대조군과 더 유사하지 않은 마이크로바이옴 프로파일을 가지고 있었다 (도 4b). 또한, 비치료 그룹(Treatment -)에서, Cluster 2 환자는 Cluster 1에 비해 더 길게 생존하는 경향을 보였다 (p = 0.14) (도 4c). 다만, 치료 그룹(Treatment +)에서는 Cluster 1 및 Cluster 2 사이의 생존율에 유의한 차이가 없었다 (도 4c).
추가로, 본 발명자들은 Cluster 1 및 Cluster 2를 분리할 수 있는 구강 미생물 분류를 확인하였다. 그 결과, 더 나쁜 생존 결과를 보인 그룹인 Cluster 1에서는 Cluster 2에 비해 스트렙토코쿠스속(Streptococcus) 및 메가스페에라속(Megasphaera)의 미생물이 더욱 풍부한 반면, 헤모필루스속(Haemophilus) 미생물은 덜 풍부한 것으로 나타났다 (도 4d 및 4e).
상기 결과로부터, 폐암 치료를 받지 않은 환자 중에서 구강 마이크로바이옴의 프로파일이 대조군(건강한 개체)과 유사성이 높은 경우, 폐암에 대한 예후가 좋은 것으로 예측할 수 있고, 유사성이 낮은 경우, 폐암에 대한 예후가 나쁜 것으로 예측할 수 있음을 확인하였다.
또한, 스트렙토코쿠스속(Streptococcus) 및 메가스페에라속(Megasphaera)의 미생물이 더욱 풍부하고, 헤모필루스속(Haemophilus) 미생물은 덜 풍부한 폐암 환자는 폐암에 대한 예후가 나쁜 것으로 예측할 수 있음을 확인하였다.
Claims (13)
- 구강 마이크로바이옴으로서, 모기박테리움속(Mogibacterium)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 폐암 진단 또는 발병 위험성 예측용 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 제제는 구강 마이크로바이옴에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레이티드, 압타머 또는 항체인 것인, 조성물. - 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 폐암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 소세포폐암(small cell lung cancer), 선암(adenocarcinoma), 편평상피암(squamous cell carcinoma) 및 대세포암 (large cell carcinoma)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물. - 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 폐암 진단 또는 발병 위험성 예측용 키트.
- 제 5 항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트 및 래피드(rapid) 키트로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인, 키트. - (a) 타액에서 추출된 DNA에 대하여 16S rRNA 유전자의 서열분석(sequencing)을 수행하는 단계; 및
(b) 상기 서열분석을 통해 구강 마이크로바이옴의 풍부도를 건강 대조군의 구강 마이크로바이옴 풍부도와 비교하는 단계를 포함하고,
상기 마이크로바이옴은 모기박테리움속(Mogibacterium)인, 폐암의 진단, 발병 위험성 예측을 위한 정보 제공 방법. - 제 7 항에 있어서,
상기 타액은 비흡연자로부터 채취된 것인, 정보 제공 방법. - 제 7 항에 있어서,
상기 구강 마이크로바이옴에서 모기박테리움속(Mogibacterium)의 풍부도가 건강 대조군의 수준 대비 더 높은 경우, 폐암이 아니거나 폐암의 발병 위험성이 없는 것으로 판단하는 것인, 정보 제공 방법. - 삭제
- 삭제
- 제 7 항에 있어서,
상기 구강 마이크로바이옴의 풍부도가 건강 대조군의 구강 마이크로바이옴 풍부도와 비교하여 오차범위 내인 경우 폐암의 발병 위험성이 낮은 것으로 판단하는 것인, 정보 제공 방법. - 제 7 항에 있어서,
상기 폐암은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 소세포폐암(small cell lung cancer), 선암(adenocarcinoma), 편평상피암(squamous cell carcinoma) 및 대세포암 (large cell carcinoma)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 정보 제공 방법.
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