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JP2012501162A - 癌の治療および診断のための標的遺伝子としてのｏｉｐ５ - Google Patents

癌の治療および診断のための標的遺伝子としてのｏｉｐ５ Download PDF

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JP2012501162A
JP2012501162A JP2011509327A JP2011509327A JP2012501162A JP 2012501162 A JP2012501162 A JP 2012501162A JP 2011509327 A JP2011509327 A JP 2011509327A JP 2011509327 A JP2011509327 A JP 2011509327A JP 2012501162 A JP2012501162 A JP 2012501162A
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cancer
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polypeptide
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祐輔 中村
弥太郎 醍醐
亮 富樫
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Oncotherapy Science Inc
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Abstract

本発明は、肺癌および／または食道癌の発癌においてＯＩＰ５遺伝子が担う役割に関し、ＯＩＰ５遺伝子に対する二本鎖分子または、そのような二本鎖分子および抗体を含む組成物、ベクター、もしくは細胞を投与することによって、肺癌および／または食道癌を治療および／または予防するための方法を特徴とする。本発明はまた、ＯＩＰ５の検出によって、肺癌および／または食道癌を検出および／または診断するための方法、あるいは、肺癌および／または食道癌を有する患者の予後を評価／判定し、かつ／またはそのような患者における癌治療の有効性をモニターするための方法も特徴とする。さらに、ＯＩＰ５に関連する癌を治療および予防するための化合物を同定する方法も開示する。

Description

優先権
本出願は２００８年８月２８日に出願した米国仮特許出願第６１／１９０，５３０号の恩典を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
技術分野
本発明は、生物科学の分野、より具体的には癌研究、癌診断、および癌治療の分野に関する。さらに本発明は、肺癌を治療および／または予防するための剤をスクリーニングする方法に関する。
肺癌は世界中の癌による死因の第１位であり、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）はそれらの症例の８０％近くを占めている（Greenlee RT, et al., CA Cancer J Clin 2001; 51: 15-36（非特許文献１））。食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）は消化管の最も致死的な悪性腫瘍の１つであり、診断時にはほとんどの患者が進行期にある（Shimada H, et al., Surgery 2003; 133: 486-94（非特許文献２））。放射線療法および化学療法などの様々な治療様式と組み合わせて、最新の手術技法を用いているにもかかわらず、ＥＳＣＣの全５年生存率はいまだ４０％〜６０％に留まっており（Tamoto E, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 3629-38（非特許文献３））、肺癌の全５年生存率はわずか１５％である（Greenlee RT, et al., CA Cancer J Clin 2001; 51: 15-36（非特許文献１））。
肺癌および食道癌の診断、治療、および／または予防のための潜在的分子標的を単離するため、２７，６４８個の遺伝子からなるｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、肺癌患者１０１名およびＥＳＣＣ患者１９名由来の癌細胞の遺伝子発現プロファイルのゲノム全域にわたる解析を行った（WO2004/031413（特許文献１）, WO2007/013665（特許文献２）, WO2007/013671（特許文献３）, Daigo Y and Nakamura Y, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53（非特許文献４）, Kikuchi T, et al., Oncogene 2003;22:2192-205（非特許文献５）, Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 2003;1:485-99（非特許文献６）, Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43（非特許文献７）, Kikuchi T, et al., Int J Oncol 2006; 28:799-805（非特許文献８）, Taniwaki M, et al., Int J Oncol 2006;29:567-75（非特許文献９）, およびYamabuki T, et al., Int J Oncol 2006;28:1375-84（非特許文献１０））。各遺伝子産物の生物学的および臨床病理学的な意義を検証するため、ＲＮＡｉ技術により、かつ臨床肺癌材料の腫瘍組織マイクロアレイ解析を用いて、機能喪失効果のハイスループットスクリーニングを行った（Suzuki C, et al., Cancer Res 2003;63:7038-41（非特許文献１１）, Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 2004;10:8363-70（非特許文献１２）, Kato T, et al., Cancer Res 2005;65:5638-46（非特許文献１３）, Furukawa C, et al., Cancer Res 2005;65:7102-10（非特許文献１）, Ishikawa N, et al., Cancer Res 2005; 65:9176-84（非特許文献１５）, Suzuki C, et al., Cancer Res 2005;65:11314-25（非特許文献１６）, Ishikawa N, et al., Cancer Sci 2006;97:737-45（非特許文献１７）, Takahashi K, et al. Cancer Res 2006;66:9408-19（非特許文献１８）, Hayama S, et al., Cancer Res 2006;66:10339-48（非特許文献１９）, Kato T, et al., Clin Cancer Res 2007;13:434-42（非特許文献２０）, Suzuki C, et al., Mol Cancer Ther 2007;6:542-51（非特許文献２１）, Yamabuki T, et al., Cancer Res 2007;67:2517-25（非特許文献２２）, Hayama S, et al., Cancer Res 2007;67:4113-22（非特許文献２３）, Kato T, et al., Cancer Res 2007;67:8544-53（非特許文献２４）, Taniwaki M, et al., Clin Cancer Res 2007;13:6624-31（非特許文献２５）, Ishikawa N, et al., Cancer Res 2007;67:11601-11（非特許文献２６）, Mano Y, et al., Cancer Sci 2007;98:1902-13（非特許文献２７）, Suda T, et al., Cancer Sci 2007;98:1803-8（非特許文献２８）, Kato T, et al., Clin Cancer Res 2008;14:2363-70（非特許文献２９） およびMizukami Y, et al., Cancer Sci 2008;99:1448-54（非特許文献３０））。
ＯＩＰ５（ｏｐａ相互作用タンパク質５）は、酵母ツーハイブリッド解析によって、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）混濁関連（ｏｐａｃｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ；Ｏｐａ）タンパク質と相互作用することが判明した（Williams, J. M., et al., Mol Microbiol 1998; 27(1): 171-86（非特許文献３１））。ＯＩＰ５は、ヒト上皮細胞への淋菌の接着および浸潤に関与している。以前の研究によりヒト胃癌におけるＯＩＰ５ ｍＲＮＡの発現上昇が実証され（Nakamura Y, et al., Ann Surg Oncol 2007;14:885-92.（非特許文献３３））、かつ、Ｒａｆ１などの一部のタンパク質はＯＩＰ５と相互作用することが以前に報告されたが（Yuryev, A. and L. P. Wennogle, Genomics 2003; 81(2): 112-25（非特許文献３２））、発癌の際のＯＩＰ５の生物学的役割は明らかになっていない。
WO2004/031413 WO2007/013665 WO2007/013671
Greenlee RT, et al., CA Cancer J Clin 2001; 51: 15-36 Shimada H, et al., Surgery 2003; 133: 486-94 Tamoto E, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 3629-38 Daigo Y and Nakamura Y, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53 Kikuchi T, et al., Oncogene 2003;22:2192-205 Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 2003;1:485-99 Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43 Kikuchi T, et al., Int J Oncol 2006; 28:799-805 Taniwaki M, et al., Int J Oncol 2006;29:567-75 Yamabuki T, et al., Int J Oncol 2006;28:1375-84 Suzuki C, et al., Cancer Res 2003;63:7038-41 Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 2004;10:8363-70 Kato T, et al., Cancer Res 2005;65:5638-46 Furukawa C, et al., Cancer Res 2005;65:7102-10 Ishikawa N, et al., Cancer Res 2005; 65:9176-84 Suzuki C, et al., Cancer Res 2005;65:11314-25 Ishikawa N, et al., Cancer Sci 2006;97:737-45 Takahashi K, et al. Cancer Res 2006;66:9408-19 Hayama S, et al., Cancer Res 2006;66:10339-48 Kato T, et al., Clin Cancer Res 2007;13:434-42 Suzuki C, et al., Mol Cancer Ther 2007;6:542-51 Yamabuki T, et al., Cancer Res 2007;67:2517-25 Hayama S, et al., Cancer Res 2007;67:4113-22 Kato T, et al., Cancer Res 2007;67:8544-53 Taniwaki M, et al., Clin Cancer Res 2007;13:6624-31 Ishikawa N, et al., Cancer Res 2007;67:11601-11 Mano Y, et al., Cancer Sci 2007;98:1902-13 Suda T, et al., Cancer Sci 2007;98:1803-8 Kato T, et al., Clin Cancer Res 2008;14:2363-70 Mizukami Y, et al., Cancer Sci 2008;99:1448-54 Williams, J. M., et al., Mol Microbiol 1998; 27(1): 171-86 Yuryev, A. and L. P. Wennogle, Genomics 2003; 81(2): 112-25 Nakamura Y, et al., Ann Surg Oncol 2007;14:885-92
本発明において、ＯＩＰ５の過剰発現は肺癌細胞および食道癌細胞の悪性の性質に寄与し得ることが開示される。したがって、ＯＩＰ５分子を標的とすることは、肺癌および食道癌の臨床管理における新規の診断上および治療上の戦略の開発に有望である。
特に本発明は、特定配列（詳細には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２）からなる二本鎖分子が、肺癌細胞および／または食道癌細胞の細胞増殖を阻害するのに有効であるという発見に起因する。具体的には、本発明により、ＯＩＰ５遺伝子を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が提供される。これらの二本鎖分子は単離状態で用いることができ、またはベクターにコードさせて、該ベクターから発現させることもできる。したがって、そのような二本鎖分子を、ならびに、それらを発現するベクターおよび宿主細胞を提供することは、本発明の目的である。
１つの局面において、本発明は、本発明の二本鎖分子またはベクターをそれを必要とする対象に投与することにより、細胞増殖を阻害するためならびに肺癌および／または食道癌を治療するための方法を提供する。そのような方法は、本発明の二本鎖分子またはベクターの１つまたは複数からなる組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を包含する。
別の局面において、本発明は、本発明の二本鎖分子またはベクターの少なくとも１つを含む、癌を治療するための組成物を提供する。
さらに別の局面において、本発明は、患者由来の生物学的試料中のＯＩＰ５の発現レベルを測定することにより、対象における肺癌および／または食道癌に対する素因を診断または決定する方法を提供する。ＯＩＰ５遺伝子の正常対照レベルと比較して該遺伝子の発現レベルが上昇していることにより、対象が肺癌および／または食道癌に罹患しているか、あるいは肺癌および／または食道癌の発症リスクを有することが示される。
さらに本発明は、ＯＩＰ５の高発現レベルが、生存率不良と相関するという発見に関する。したがって本発明は、肺癌および／または食道癌を有する患者の予後を評価または判定するための方法、例えば、ＯＩＰ５の発現レベルを検出する工程、それを所定の参照発現レベルと比較する工程、およびそれらの違いから患者の予後を判定する工程を含む方法を提供する。
さらなる局面において、本発明は、肺癌および／または食道癌を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。そのような化合物は、ＯＩＰ５ポリペプチドと結合するか、ＯＩＰ５ポリペプチドの生物活性を低下させるか、ＯＩＰ５遺伝子またはＯＩＰ５遺伝子の代替となるレポーター遺伝子の発現を低下させるか、ＯＩＰ５ポリペプチドとＲａｆ１ポリペプチドの間の結合を阻害するか、または、ＯＩＰ５ポリペプチドのリン酸化を阻害すると考えられている。
本発明の１つまたは複数の局面が特定の目的を満たし得る一方、１つまたは複数の他の局面が特定の他の目的を満たし得ることが、当業者によって理解されよう。各目的は、すべての点において本発明のすべての局面に等しく当てはまらない場合がある。したがって、前述の目的は、本発明の任意の１つの局面に関して択一的に考慮され得る。本発明のこれらおよびその他の目的物および特徴は、実施例および添付の図面と併せて以下の詳細な説明を読んだ場合に、より完全に明らかになるであろう。しかしながら、本発明の前述の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様のものであり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明ならびに発明の詳細な説明およびその好ましい態様を考慮して、当業者に明らかになるであろう。
図１は、肺癌および食道癌ならびに正常組織におけるＯＩＰ５発現を示す。Ａ部において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により検出した、正常肺組織および１５例の臨床肺癌試料［肺腺癌（ＡＤＣ）、肺ＳＣＣ、およびＳＣＬＣ；上パネル］、ならびに１５例の肺癌細胞株（下パネル）におけるＯＩＰ５の発現を示す。Ｂ部において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により検出した、正常食道および１０例の臨床ＥＳＣＣ組織試料（上パネル）、ならびに１０例のＥＳＣＣ細胞株（下パネル）におけるＯＩＰ５の発現を示す。Ｃ部において、ＳＢＣ−５細胞における内因性ＯＩＰ５タンパク質の細胞内局在性を示す。ＯＩＰ５は、核および細胞質において染色された。ＤＡＰＩは、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを示す。Ｄ部において、正常ヒト組織１６例におけるＯＩＰ５転写産物のノーザンブロット解析の結果を示す。精巣において強力なシグナルが観察された。 図２は、ＮＳＣＬＣ患者のＯＩＰ５タンパク質発現および臨床転帰不良とのその関連性を示す。Ａ部において、肺癌（扁平上皮癌、×１００）および正常肺（×１００）におけるＯＩＰ５の発現の代表例、ならびに拡大図（×２００）を示す。Ｂ部において、ＯＩＰ５発現レベルによる、ＮＳＣＬＣ患者の腫瘍特異的生存率のカプラン・マイヤー解析の結果（Ｐ＜０．００９９；ログランク検定）を示す。 図３は、細胞の増殖に対するＯＩＰ５の効果を示す。Ａ部において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって解析した、ＬＣ３１９細胞（左）およびＳＢＣ５細胞（右）における、ｓｉ−ＯＩＰ５（ｓｉ−１およびｓｉ−２）または対照ｓｉＲＮＡ（ＬＵＣおよびＯｎ−Ｔａｒｇｅｔ ｐｌｕｓ／ＣＮＴ）に応答したＯＩＰ５の発現（上パネル）を示す。詳細には、ｓｉ−１、ｓｉ−２、ｓｉ−ＬＵＣ、またはｓｉ−ＣＮＴに応答した、ＭＴＴアッセイによって評価したＬＣ３１９細胞またはＳＢＣ−５細胞の生存度（中央パネル）。特異的ｓｉＲＮＡまたは対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＬＣ３１９細胞およびＳＢＣ−５細胞のコロニー形成アッセイ（下パネル）。実験はすべて、３回のアッセイで行った。Ｂ部において、ＣＯＳ−７細胞の増殖に対するＯＩＰ５の効果を示す。詳細には、ウエスタンブロット解析によって調べた、ＣＯＳ−７細胞におけるＯＩＰ５の発現（左上パネル）。ｐＣＡＧＧＳｎ３Ｆｃ−ＯＩＰ５またはモックベクターをトランスフェクトした細胞をそれぞれ３回培養し、細胞生存度をＭＴＴアッセイによって評価した（右パネル）。ＯＩＰ５発現プラスミドをトランスフェクトした細胞に由来するコロニーのサイズおよび数は、モックベクターをトランスフェクトした細胞のものよりも大きかった（左下パネル）。 図４は、内因性および外因性ＯＩＰ５のリン酸化を示す。詳細には、λＰＰａｓｅによる処理によって、内因性または外因性のＯＩＰ５の上方（リン酸化された）バンドは減少した。 図５は、肺癌および食道癌ならびに正常組織におけるＯＩＰ５発現を示す。Ａ部において、ウエスタンブロット解析により、肺癌細胞株におけるＯＩＰ５の発現を調べた。ＡＣＴＢの発現を量的対照とした。Ｂ部において、ＳＢＣ−５細胞における内因性ＯＩＰ５タンパク質の細胞内局在性を示す。ＯＩＰ５は、核および細胞質において染色された。ＤＡＰＩは、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを示す。 図６は、正常組織ならびに肺癌および食道癌におけるＯＩＰ５タンパク質発現を示す。Ａ部において、正常ヒト組織２３例におけるＯＩＰ５転写産物のノーザンブロット解析を示す。精巣において強力なシグナルが観察された。Ｂ部において、免疫組織化学染色により、正常ヒト組織６例、ならびに様々な組織型の肺癌およびＥＳＣＣにおけるＯＩＰ５の発現を検出した（倍率×１００）。陽性染色は、主に精巣細胞および肺癌細胞の核および細胞質に見られた。 図７は、ＮＳＣＬＣ患者およびＥＳＣＣ患者についてのＯＩＰ５発現と臨床転帰不良との関連性を示す。Ａ部において、肺癌（扁平上皮癌）および正常肺におけるＯＩＰ５発現の代表例（上は×１００；下は×２００）を示す。Ｂ部において、ＯＩＰ５発現レベルによる、ＮＳＣＬＣ患者における腫瘍特異的生存率のカプラン・マイヤー解析（Ｐ＝０．００５３；ログランク検定）を示す。Ｃ部において、ＥＳＣＣおよび正常食道におけるＯＩＰ５発現の代表例（上は×１００；下は×２００）を示す。Ｄ部において、ＯＩＰ５発現レベルによる、ＥＳＣＣ患者における腫瘍特異的生存率のカプラン・マイヤー解析（Ｐ＝０．０１２９；ログランク検定）を示す。 図８は、Ｒａｆ１タンパク質とのその相互作用を介した、ＯＩＰ５タンパク質の安定化を示す。Ａ部において、肺癌細胞における外因性ＯＩＰ５タンパク質と内因性Ｒａｆ１タンパク質との相互作用を示す。Ｍ２−Ｆｌａｇアガロース、ならびに、ｐＣＡＧＧＳｎ３ＦＣ−ＯＩＰ５−Ｆｌａｇをトランスフェクトされかつ内因性Ｒａｆ１を発現したＣＯＳ−７細胞からの抽出物を用いて、免疫沈降を行った。免疫沈降物を、抗Ｒａｆ１ポリクローナル抗体を用いるウエスタンブロット解析に供して、内因性Ｒａｆ１を検出した。ＩＢは免疫ブロッティングを示す；ＩＰは免疫沈降を示す。Ｂ部において、肺癌細胞株におけるＯＩＰ５タンパク質およびＲａｆ１タンパク質の発現を示す。ＯＩＰ５の発現パターンは、Ｒａｆ１タンパク質の発現パターンとの十分な一致を示した。Ｃ部において、Ｒａｆ１発現がＯＩＰ５タンパク質のレベルに与える効果を示す。左パネル、Ｒａｆ１ノックダウンがＯＩＰ５タンパク質のレベルに与える効果を示す。ｓｉ−Ｒａｆ１をトランスフェクトしたＳＢＣ−５細胞において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析およびウエスタンブロット解析により、内因性Ｒａｆ１およびＯＩＰ５の転写産物ならびにそれらのコードタンパク質の発現を検出した。右パネル、Ｒａｆ１過剰発現がＯＩＰ５タンパク質のレベルに与える効果を示す。Ｒａｆ１発現ベクターをトランスフェクトしたＳＢＣ−５細胞において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析およびウエスタンブロット解析により、Ｒａｆ１およびＯＩＰ５の転写産物およびタンパク質の発現レベルを検出した。 図９は、補足図を示す。Ａ部において、ＯＩＰ５に対する抗体特異性を調べるための抗原ブロッキングアッセイを示す。免疫組織化学染色の前に、抗ＯＩＰ５抗体を組換えＯＩＰ５タンパク質と共にインキュベーションした（抗ＯＩＰ５＋ｒｈＯＩＰ５）。肺癌組織において得られた抗ＯＩＰ５抗体による陽性シグナル（抗ＯＩＰ５）は、ｒｈＯＩＰ５とのプレインキュベーションにより減少した。Ｂ部において、ＯＩＰ５によるＣＯＳ−７の細胞浸潤性の増大を示す。ＣＯＳ−７細胞におけるＯＩＰ５の発現を、ウエスタンブロット解析によって調べた（左上パネル）。マトリゲル基質中でのアッセイにより、ｐＣＡＧＧＳｎ３Ｆｃ−ＯＩＰ５−Ｆｌａｇのトランスフェクション後のＣＯＳ−７細胞の浸潤特性が実証される。ギムザ染色（下パネル；倍率×１００）、およびマトリゲル被覆フィルターを通して遊走する細胞の相対数（右上パネル）を示した。Ｃ部において、ＯＩＰ５タンパク質とＲａｆ１タンパク質との直接的な相互作用を示す。抗Ｈｉｓ抗体および、Ｈｉｓタグ付ＯＩＰ５タンパク質とＧＳＴ融合組換えＲａｆ１タンパク質との混合物を用いて、ＯＩＰ５タンパク質のプルダウンを行った。Ｒａｆ１に対するポリクローナル抗体（ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたその後のウエスタンブロッティングにより、ＯＩＰ５と結合しているＲａｆ１タンパク質が検出された。Ｄ部において、半定量的ＲＴ―ＰＣＲにより検出した、肺癌細胞株におけるＲａｆ１の発現を示した。
［態様の説明］
本発明の態様の実施または試験において、本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を用いることができるが、以下で好ましい方法、装置、および材料を記載する。しかしながら、本発明の材料および方法を記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣行的な実験および最適化に従って変更可能であるため、本発明はこれらに限定されないことを理解されたい。説明において使用する専門用語は特定の型または態様の説明のみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも、また理解されたい。
本明細書において言及した各出版物、特許、または特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明確に組み入れられる。しかしながら、本明細書中の全ては、本発明が先行発明のためにそのような開示に先行する権利がないと解釈されるべきではない。
矛盾する場合には、定義を含め、本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。
定義
本明細書で用いる「１つの（a）」、「１つの(an)」、および「その（the）」という語は、特記しない限り「少なくとも１つの」を意味する。
本明細書で用いる「生物学的試料」という用語は、生物全体、またはその組織、細胞、もしくは構成部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液、および精液を含むがこれらに限定されない体液）のサブセットを指す。「生物学的試料」はさらに、生物全体またはその細胞、組織、もしくは構成部分のサブセットから調製されたホモジネート、溶解物、抽出物、細胞培養物、もしくは組織培養物、またはその画分もしくは一部を指す。最後に、「生物学的試料」は、タンパク質またはポリヌクレオチドなどの細胞成分を含む、その中で生物が増殖したニュートリエントブロスまたはゲルなどの培地を指す。
「遺伝子」「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、核酸残基のポリマーを指すよう本明細書において互換的に用いられ、かつ特記しない限り、その一般に認められている１文字コードで呼ばれる。本用語は、１つまたは複数の核酸がエステル結合によって結合している核酸（ヌクレオチド）ポリマーに適用される。核酸ポリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせからなってよく、天然および非天然の核酸ポリマーの両方を包含する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すよう本明細書において互換的に用いられる。本用語は、天然および合成のアミノ酸、ならびに、アミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体、あるいは、１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾残基である、対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基アミノ酸ポリマーを指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに、細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合した、α炭素）を有するが、修飾Ｒ基または修飾骨格を有する、化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的アミノ酸と異なる構造および類似の機能を有する化学物質を指す。本明細書においてアミノ酸は、その一般的に知られている３文字表記で表されてもよく、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ推奨の１文字表記で表されてもよい。
特記されない限り、「癌」という用語は、ＯＩＰ５遺伝子を過剰発現している癌を指す。ＯＩＰ５を過剰発現している癌の例としては肺癌および食道癌が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
遺伝子またはタンパク質
本発明の関心対象の遺伝子の核酸配列およびポリペプチド配列は以下の番号で示されるが、これらに限定されるわけではない：
ＯＩＰ５：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３および１４；
Ｒａｆ１：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７および１８。
さらに、配列データは以下のアクセッション番号によって入手可能である：
ＯＩＰ５：ＮＭ＿００７２８０；
Ｒａｆ１：ＮＭ＿００２８８０。
本発明の一局面によれば、機能的同等物もまた上記の「ポリペプチド」であるとみなされる。本明細書において、タンパク質の「機能的同等物」とは、該タンパク質と同等の生物活性を有するポリペプチドである。すなわち、元の参照ペプチドの生物活性を保持する任意のポリペプチドを、本発明においてそのような機能的同等物として用いることができる。そのような機能的同等物には、タンパク質の天然アミノ酸配列に対して１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されたものが含まれる。あるいは、該ポリペプチドは、各タンパク質の配列に対して少なくとも約８０％の相同性（配列同一性とも称する）を有する、より好ましくは、少なくとも約９０％〜９５％の相同性、さらにより好ましくは９６％〜９９％の相同性を有する、アミノ酸配列から構成されてもよい。他の態様において、該ポリペプチドは、遺伝子の天然ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ得る。
本発明のポリペプチドは、これを産生させるために用いた細胞もしくは宿主または使用した精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に差異を有しうる。しかしながらこれは、本発明のヒトタンパク質の機能と同等の機能を有する限り、本発明の範囲内に含まれる。
「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、典型的には核酸の複雑な混合物中で、核酸分子がその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とは検出可能な程度にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況下では変動する。配列が長いほど、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度 ｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとで）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である（Ｔｍにおいて標的配列が過剰に存在する場合、プローブの５０％が平衡状態で占められる）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、以下のものが含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、または、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーション、ならびに０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、５０℃での洗浄。
本発明の文脈において、上記のヒトタンパク質と機能的に同等のポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって規定通り選択され得る。例えば、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液」（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ）を用いて６８℃で３０分間またはそれ以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、６８℃で１時間またはそれ以上加温することにより、ハイブリダイゼーションを行うことができる。それに続く洗浄工程は、例えば低ストリンジェント条件下で行い得る。例示的な低ストリンジェント条件には、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが含まれ得る。高ストリンジェント条件の使用が好ましいことが多い。例示的な高ストリンジェント条件には、２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳにおける室温で２０分間の洗浄を３回行った後に、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける３７℃で２０分間の洗浄を３回行い、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける５０℃で２０分間の洗浄を２回行うことが含まれ得る。しかしながら、温度および塩濃度などのいくつかの要素がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与え得るため、当業者は必要なストリンジェンシーを達成するためにこれらの要素を適切に選択することができる。
一般的に、タンパク質中の１つ、２つ、またはそれ以上のアミノ酸の改変は、該タンパク質の機能に影響しないと考えられる。実際、変異タンパク質または改変タンパク質（すなわち、１つ、２つ、またはいくつかのアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、および／または付加によって改変されているアミノ酸配列からなる、ペプチド）は、元の生物活性を保持することが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984)；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982)；Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。したがって当業者は、単一のアミノ酸もしくはわずかな割合のアミノ酸を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、もしくは置換、またはタンパク質の変化により類似の機能を有するタンパク質がもたらされる「保存的改変」であるとみなされるものが、本発明の文脈において許容されることを認識するであろう。したがって１つの態様において、本発明のペプチドは、参照配列において１つ、２つ、またはさらにそれより多いアミノ酸残基が付加、挿入、欠失、および／または置換されたアミノ酸配列を有しうる。
タンパク質の活性が維持されている限り、アミノ酸変異の数は特に限定されない。しかしながら、アミノ酸配列の５％またはそれ未満を変更することが一般的に好ましい。したがって、好ましい態様において、このような変異体において変異させるアミノ酸の数は一般的に、３０アミノ酸またはそれ未満、好ましくは２０アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは１０アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは５もしくは６アミノ酸またはそれ未満、およびさらにより好ましくは３もしくは４アミノ酸またはそれ未満である。
突然変異されるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の特性が保存された別のアミノ酸に突然変異されることが好ましい（保存的アミノ酸置換として知られるプロセス）。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および共通して以下の官能基または特徴を有する側鎖である：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基を含有する側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子を含有する側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミドを含有する側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基を含有する側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；および芳香族を含有する側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。機能的に類似したアミノ酸を規定する保存的置換表は当技術分野で周知である。例えば、以下の８つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい）。
このように保存的に修飾されたポリペプチドが本発明のタンパク質に含まれる。しかしながら、本発明はこれらに限定されず、該タンパク質の少なくとも１種類の生物活性が保持されている限り、非保存的改変を含む。さらに、修飾タンパク質は、多型変異体、種間ホモログ、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子によりコードされるものも含む。
さらに、本発明の遺伝子は、タンパク質のそのような機能的同等物をコードするポリヌクレオチドを包含する。上記の配列情報に基づき合成されたプライマーを用いて、タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するために、ハイブリダイゼーションに加え、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用することができる。ヒトの遺伝子およびタンパク質とそれぞれ機能的に同等なポリヌクレオチドおよびポリペプチドは通常、元のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して高い相同性を有する。「高い相同性」とは典型的に、４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％から９５％またはそれ以上、さらにより好ましくは９６％から９９％またはそれ以上の相同性を指す。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、「Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)」のアルゴリズムに従って決定することができる。
二本鎖分子
本明細書で使用される「単離された二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指し、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、例えば二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ、例えばＤＮＡとＲＮＡとの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡとＲＮＡとの低分子ヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む。
本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡが転写される鋳型をＤＮＡとした技術を含む、ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的な技術を用いる。ｓｉＲＮＡとしては、ＯＩＰ５センス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＯＩＰ５アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方が挙げられる。単一転写産物が、標的遺伝子のセンス核酸配列と相補的なアンチセンス核酸配列との両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＲＮＡを構築してもよい。ｓｉＲＮＡはｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれかであり得る。
本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに対する相補配列からなり、且つ二本鎖ＲＮＡ分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つのＲＮＡ分子の構築物を指す。２本の鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含み得る。
本明細書で使用される「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに対して相補的である第１の領域および第２の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステム−ループ構造を有するｓｉＲＮＡを指す。領域の相補性および配向性の程度は、塩基対形成が領域間で起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結され、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によって生じる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
本明細書で使用される「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡとＤＮＡの両方からなる二本鎖ポリヌクレオチド分子を指し、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する。本明細書中で、ハイブリッドとは、ＤＮＡからなるポリヌクレオチドとＲＮＡからなるポリヌクレオチドとが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示し、一方キメラとは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含有し得るものを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡとしては、ＯＩＰ５センス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、ＯＩＰ５アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）またはその両方が挙げられる。単一転写産物が、標的遺伝子由来のセンス核酸配列および相補的アンチセンス核酸配列の両方、例えばヘアピンを有するように、ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを構築してもよい。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれかであり得る。
本明細書で使用される「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに対する相補配列からなり、且つ二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成するように相補配列を介して共にアニーリングしている、２つの分子の構築物を指す。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」のポリヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含み得る。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成される（キメラ分子）か、あるいは代替的に、一方の分子がＲＮＡから構成され、もう一方がＤＮＡから構成される（ハイブリッド二本鎖）。
本明細書で使用される「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに対して相補的である第１の領域および第２の領域、即ちセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる、ステム−ループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを指す。領域の相補性および配向性の程度は、領域間で塩基対形成が起こるのに十分であり、第１の領域および第２の領域がループ領域によって連結し、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠失によって生じる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センス鎖とアンチセンス鎖との間に介在する一本鎖領域であり、「介在一本鎖」とも称され得る。
本明細書で用いられる「単離された核酸」とは、その元の環境（例えば、天然由来である場合には天然の環境）から取り出され、かつしたがってその天然状態から合成によって改変された、核酸である。本発明の文脈において、単離された核酸の例には、ＤＮＡ、RＮＡ、およびこれらの誘導体が含まれる。
標的ｍＲＮＡとハイブリダイズする、ＯＩＰ５に対する二本鎖分子は、該遺伝子の通常は一本鎖のｍＲＮＡ転写産物に結合し、それにより翻訳に干渉し、かつしたがってタンパク質の発現を阻害することによって、ＯＩＰ５遺伝子でコードされるＯＩＰ５タンパク質の生成を低減または阻害する。本明細書において実証されるように、肺癌細胞株および／または食道癌細胞株におけるＯＩＰ５の発現は、ｄｓＲＮＡによって阻害された（図３Ａ）。したがって本発明は、ＯＩＰ５遺伝子を発現している細胞に導入されるとＯＩＰ５遺伝子の発現を阻害することができる、単離された二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、後述のものなどのｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムによって設計され得る。
ＯＩＰ５標的配列の例には、例えば以下のヌクレオチドが含まれる。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の７９〜９７ｎｔの位置）
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の５５７〜５７５ｎｔの位置）
以下に示す二本鎖分子［１］〜［１８］が、本発明において特に関心対象となる：
［１］ 細胞に導入されるとＯＩＰ５のインビボ発現および細胞増殖を阻害する、単離された二本鎖分子であって、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖からなり、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成する、二本鎖分子；
［２］ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の７９〜９７ｎｔの位置）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の５５７〜５７５ｎｔの位置）の中より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡに作用する、［１］記載の二本鎖分子；
［３］ 前記センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［２］記載の二本鎖分子；
［４］約１００ヌクレオチド未満の長さを有する、［３］に記載の二本鎖分子；
［５］約７５ヌクレオチド未満の長さを有する、［４］に記載の二本鎖分子；
［６］約５０ヌクレオチド未満の長さを有する、［５］に記載の二本鎖分子；
［７］約２５ヌクレオチド未満の長さを有する、［６］に記載の二本鎖分子；
［８］約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［７］に記載の二本鎖分子；
［９］介在一本鎖によって連結されたセンス鎖とアンチセンス鎖との両方を有する単一ポリヌクレオチドからなる、［１］に記載の二本鎖分子；
［１０］一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、センス鎖であり、［Ｂ］は３個〜２３個のヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、［Ａ’］は、［Ａ］と相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［９］に記載の二本鎖分子；
［１１］ＲＮＡからなる、［１］に記載の二本鎖分子；
［１２］ＤＮＡおよびＲＮＡの両方からなる、［１］に記載の二本鎖分子；
［１３］ＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドとのハイブリッドである、［１２］に記載の二本鎖分子；
［１４］センス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡからなる、［１３］に記載の二本鎖分子；
［１５］ＤＮＡとＲＮＡとのキメラである、［１２］に記載の二本鎖分子；
［１６］アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、または、センス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡである、［１５］に記載の二本鎖分子；
［１７］隣接領域が９個〜１３個のヌクレオチドからなる、［１６］に記載の二本鎖分子；ならびに
［１８］３’オーバーハングを含有する、［１］に記載の二本鎖分子。
本発明の二本鎖分子は以下でより詳細に説明される。
細胞内の標的遺伝子発現を阻害する能力をもつ二本鎖分子を設計する方法が知られている（例えば、その全体が本明細書中で参照により組み入れられる米国特許第６，５０６，５５９号を参照されたい）。例えば、ｓｉＲＮＡを設計するためのコンピュータプログラムは、Ambionのウェブサイトから入手可能である（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）。
コンピュータプログラムは、以下のプロトコルに基づき、二本鎖分子に対する標的ヌクレオチド配列を選択する。
標的部位の選択：
１． 転写産物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として、個々のＡＡの出現とその３’側に隣接する１９ヌクレオチドを記録する。Tuschl et al.は、５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲｓ）および開始コドン近傍（７５塩基以内）の領域に対してｓｉＲＮＡを設計することを推奨していない。これらの領域は調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体が、ｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
２． 潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）とを比較し、他のコード配列に対して有意な相同性を有する任意の標的配列を考慮から外す。基本的には、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/におけるＮＣＢＩサーバー上のＢＬＡＳＴを用いる（Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997 Sep 1, 25(17): 3389-402）。
３． 合成用の的確な標的配列を選択する。遺伝子の長さに従って標的配列をいくつか選択して評価するのが一般的である。
上記プロトコルを用い、本発明の単離された二本鎖分子の標的配列を、ＯＩＰ５遺伝子についてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２として設計した。
上述の標的配列を標的とする二本鎖分子をそれぞれ、該標的遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力に関して調べた。したがって、本発明は以下の群から選択される配列のいずれかを標的とする二本鎖分子を提供する：
ＯＩＰ５遺伝子についてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の７９〜９７ｎｔの位置）および１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の５５７〜５７５ｎｔの位置）。
本発明の二本鎖分子は単一の標的ＯＩＰ５遺伝子配列を対象としてもよく、または複数の標的ＯＩＰ５遺伝子配列を対象としてもよい。
ＯＩＰ５遺伝子の上述の標的配列を標的とする本発明の二本鎖分子としては、標的配列の核酸配列および／または標的配列に相補的な配列のいずれかを含む単離されたポリヌクレオチドが挙げられる。ＯＩＰ５遺伝子を標的とするポリヌクレオチドの例として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１もしくは１２の配列を含むものおよび／またはこれらのヌクレオチドに相補的な配列が挙げられる。しかしながら本発明はこれらの例に限定されず、改変分子がＯＩＰ５遺伝子の発現を抑制する能力を保持している限り、上述の核酸配列における軽微な改変が許容可能である。本明細書において核酸配列に関連して用いられる「軽微な改変」という語句は、該配列に対する１つ、２つまたはいくつかの核酸の置換、欠失、付加または挿入を示す。
本発明の文脈において、核酸の置換、欠失、付加および／または挿入に適用される「いくつかの」という用語は、３〜７個の、好ましくは３〜５個の、より好ましくは３〜４個の、さらにより好ましくは３個の核酸残基を意味しうる。
本発明によれば、本発明の二本鎖分子は、実施例で利用される方法を用いて、その能力に関して試験することができる。本明細書で後述する実施例では、ＯＩＰ５遺伝子のｍＲＮＡの様々な部分のセンス鎖またはそれに相補的なアンチセンス鎖からなる二本鎖分子を、標準的な方法に従い、肺癌細胞株および／または食道癌細胞株におけるＯＩＰ５遺伝子産物の産出を低減させる能力に関してインビトロで試験した。さらに例えば、候補分子の非存在下で培養した細胞に比べて、候補二本鎖分子と接触させた細胞におけるＯＩＰ５遺伝子産物の低減は、例えば、実施例１「半定量的ＲＴ−ＰＣＲ」の項で言及されたＯＩＰ５ ｍＲＮＡに対するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより検出することができる。インビトロ細胞ベースのアッセイにおいてＯＩＰ５遺伝子産物の産生を低減する配列を、次に、細胞増殖に対するこれらの阻害効果に関して試験することができる。その後、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列を、癌を有する動物、例えばヌードマウス異種移植片モデルを用いてこれらのインビボでの能力に関して試験し、ＯＩＰ５遺伝子産物の産生の低減および癌細胞増殖の低減を確認することができる。
単離されたポリヌクレオチドがＲＮＡまたはその誘導体である場合、ヌクレオチド配列において塩基「ｔ」は「ｕ」に置き換えるものとする。本明細書で使用される「相補性」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド単位間のワトソンクリック型またはフーグスティーン型の塩基対形成を指し、「結合」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的なまたは化学的な相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが修飾ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドもまた同じように互いに結合し得る。一般的に、相補的なポリヌクレオチド配列は、適当な条件下でハイブリダイズして、ほとんどまたは全くミスマッチを含まない安定な二重鎖を形成する。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。１つの好ましい態様において、このような二重鎖は１０個のマッチあたりわずか１個のミスマッチしか含有しない。特に好ましい態様では、二重鎖の鎖が完全に相補的である場合、このような二重鎖はミスマッチを含有しない。
ＯＩＰ５については、ポリヌクレオチドが１２４９ヌクレオチド長未満であることが好ましい。例えば、ポリヌクレオチドは、全ての遺伝子については５００ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、または２５ヌクレオチド長未満である。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＯＩＰ５遺伝子に対する二本鎖分子を形成するのに、または二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡを調製するのに有用である。ポリヌクレオチドが二本鎖分子を形成するのに使用される場合、ポリヌクレオチドは１９ヌクレオチドより長くてよく、好ましくは２１ヌクレオチドより長く、より好ましくは約１９〜２５ヌクレオチド長である。
したがって本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子を提供し、該センス鎖は、標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、センス鎖は標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズして、１９〜２５ヌクレオチド対の長さを有する二本鎖分子を形成する。
本発明の二本鎖分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含有し得る。当技術分野において周知である化学修飾は、二本鎖分子の安定性、利用可能性および／または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に組み込まれ得る他の種類の化学修飾も認識するであろう（国際公開公報第０３／０７０７４４号、国際公開公報第２００５／０４５０３７号）。一態様では、分解耐性の向上または取り込みの改善を与えるために、修飾を用いることができる。このような修飾の例としては、ホスホロチオエート結合、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上で）、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「普遍的塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂａｓｅ）」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆デオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙｂａｓｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅ）の組み込み（ＵＳ２００６０１２２１３７）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
別の態様では、二本鎖分子の安定性を向上させるために、または標的化効率を増大させるために修飾を用いることができる。そのような修飾の例としては、二本鎖分子の相補鎖２つの間の化学架橋結合、二本鎖分子の鎖の３’末端または５’末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチドおよび２’−デオキシリボヌクレオチドが挙げられる（国際公開公報第２００４／０２９２１２号）が、これらに限定されるわけではない。別の態様において、標的ｍＲＮＡにおけるおよび／または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性を増減するために修飾を用いることができる（国際公開公報第２００５／０４４９７６号）。例えば、非修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、または５−プロピニルピリミジンに置換することができる。さらに、非修飾プリンを７−デアザプリン、７−アルキルプリン、または７−アルケニルプリンに置換することができる。別の態様では、二本鎖分子が３’オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３’末端のヌクレオチドが突出したヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドで置換してもよい（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15（2）: 188-200）。さらに詳細には、ＵＳ２００６０２３４９７０などの公開文献が利用可能である。本発明は、これらの例には限定されず、得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、任意の既知の化学修飾を本発明の二本鎖分子に対して利用することができる。
さらに、本発明の二本鎖分子はＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含み得る（例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、安定性の増大を示す。ＤＮＡとＲＮＡとの混合、即ちＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とからなるハイブリッド型二本鎖分子、一本鎖（ポリヌクレオチド）の一方または両方にＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むキメラ型二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を向上させるために形成してもよい。
ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖とのハイブリッドは、標的遺伝子を発現している細胞に導入した場合に該遺伝子の発現を阻害できる限り、センス鎖がＤＮＡでありアンチセンス鎖がＲＮＡであっても、またはその反対であってもよい。好ましくは、センス鎖のポリヌクレオチドはＤＮＡであり、アンチセンス鎖のポリヌクレオチドはＲＮＡである。また、キメラ型二本鎖分子は、遺伝子を発現する細胞に導入した場合に標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖とアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡからなってもよく、またはセンス鎖とアンチセンス鎖のいずれか一方がＤＮＡおよびＲＮＡからなってもよい。二本鎖分子の安定性を向上させるために、該分子は可能な限り多くのＤＮＡを含有する方が好ましいが、標的遺伝子発現の阻害を誘導するためには、発現の十分な阻害を誘導する範囲内で分子がＲＮＡであることが必要である。
キメラ型二本鎖分子の好ましい例としては、二本鎖分子の上流部分領域（即ちセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列に隣接する領域）がＲＮＡである。好ましくは、上流部分領域とは、センス鎖の５’側（５’末端）およびアンチセンス鎖の３’側（３’末端）を示す。あるいは、センス鎖の５’末端に隣接する領域および／またはアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域を、上流部分領域と称する。即ち、好ましい態様では、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、または、センス鎖の５’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域との両方がＲＮＡからなる。例えば、本発明のキメラまたはハイブリッド型二本鎖分子は以下の組み合わせを含む。
センス鎖：５’−［−−−ＤＮＡ−−−］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’：アンチセンス鎖、
センス鎖：５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’：アンチセンス鎖、および
センス鎖：５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（−−−ＲＮＡ−−−）−５’：アンチセンス鎖。
好ましくは上流部分領域は、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内で、標的配列またはこれに対する相補配列の末端から数えて９〜１３ヌクレオチドからなるドメインである。さらに、そのようなキメラ型二本鎖分子の好ましい例としては、少なくともポリヌクレオチドの上流半分の領域（センス鎖では５’側領域およびアンチセンス鎖では３’側領域）がＲＮＡでありかつもう半分がＤＮＡである、１９〜２１ヌクレオチド鎖長を有するものが挙げられる。そのようなキメラ型二本鎖分子では、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合、標的遺伝子の発現を阻害する効果がかなり高くなる（ＵＳ２００５０００４０６４）。
本発明の文脈において、二本鎖分子は、ヘアピン、例えばショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および、ＤＮＡとＲＮＡからなるショートヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成してもよい。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするのに使用することができる緊密なヘアピンターンを作製する、ＲＮＡの配列またはＲＮＡとＤＮＡの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列とアンチセンス標的配列とを含み、これらの配列はループ配列によって分かれている。一般的に、ヘアピン構造は細胞機構によって切断されてｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡとなり、続いてＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に一致するｍＲＮＡと結合し、これを切断する。
ヘアピンループ構造を形成するために、任意のヌクレオチド配列からなるループ配列を、センス配列とアンチセンス配列との間に配置することができる。したがって、本発明は、一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］は標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在一本鎖であり、［Ａ’］は［Ａ］に対する相補配列を含むアンチセンス鎖である、二本鎖分子も提供する。標的配列は、例えば、ＯＩＰ５についてのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２のヌクレオチドの中から選択され得る。
本発明はこれらの例には限定されず、［Ａ］における標的配列は、標的となるＯＩＰ５遺伝子の発現を抑制する能力を該二本鎖分子が保持する限り、これらの例に由来する改変配列であってもよい。領域［Ａ］は領域［Ａ’］とハイブリダイズし、領域［Ｂ］からなるループを形成する。介在一本鎖部分［Ｂ］、即ちループ配列は、好ましくは３〜２３ヌクレオチド長であり得る。例えばループ配列は以下の配列の中から選択することができる（http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html）。さらに、２３個のヌクレオチドからなるループ配列は活性ｓｉＲＮＡも提供する（Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435-8, Epub 2002 Jun 26）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418（6896）: 435- 8, Epub 2002 Jun 26；
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100（4）: 1639-44, Epub 2003 Feb 10；および
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4（6）: 457-67。
ヘアピンループ構造を有する本発明の二本鎖分子の好ましい例を以下に示す。以下の構造では、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡの中から選択することができるが、本発明はこれらに限定されない：
ＣＧＧＣＡＵＣＧＣＵＣＡＣＧＵＵＧＵＧ−［Ｂ］−ＣＡＣＡＡＣＧＵＧＡＧＣＧＡＵＧＣＣＧ（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）；
ＧＵＧＡＣＡＡＡＡＵＧＧＵＧＵＧＣＵＡ−［Ｂ］−ＵＡＧＣＡＣＡＣＣＡＵＵＵＵＧＵＣＡＣ（標的配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。
さらに、二本鎖分子の阻害活性を高めるために、いくつかのヌクレオチドを３’オーバーハングとして標的配列のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端に付加することができる。付加されるヌクレオチドの数は少なくとも２個、一般に２〜１０個、好ましくは２〜５個である。付加されるヌクレオチドは二本鎖分子のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端で一本鎖を形成する。付加されるヌクレオチドの好ましい例としては「ｔ」および「ｕ」が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。二本鎖分子が単一ポリヌクレオチドからなってヘアピンループ構造を形成する場合、該単一ポリヌクレオチドの３’末端に３’オーバーハング配列を付加してもよい。
二本鎖分子を調製するための方法は特に限定されないが、当技術分野で既知の任意の化学合成法を使用することが好ましい。化学合成法に従って、一本鎖のセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドを別々に合成した後、それらを適当な方法により共にアニーリングして二本鎖分子を得る。アニーリングに関する特定の例には、合成した一本鎖ポリヌクレオチドを好ましくは少なくとも約３：７のモル比で、より好ましくは約４：６のモル比で、最も好ましくは実質的に等モル量（即ち約５：５のモル比）で混合することが含まれる。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度まで加熱した後、徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野で既知の通常利用される方法によって精製することができる。精製法の例としては、アガロースゲル電気泳動を利用する方法、または、残存する一本鎖ポリヌクレオチドが任意で、例えば適当な酵素を用いる分解によって取り除かれる方法が挙げられる。
その発現を独立して、あるいは時間的または空間的な様式で調整することができるように、ＯＩＰ５配列に隣接する調節配列は同一であってもまたは異なっていてもよい。ＯＩＰ５遺伝子鋳型を、例えば低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来のＲＮＡポリＩＩＩ転写ユニットまたはヒトＨ１ ＲＮＡプロモーターを含有するベクターにクローニングすることによって、二本鎖分子を細胞内で転写することができる。
本発明の二本鎖分子を含有するベクター：
本明細書に記載の二本鎖分子を１つまたは複数含有するベクター、およびそのようなベクターを含有する細胞も、本発明に包含される。
以下に示す［１］〜［１０］のベクターが、本発明において特に関心対象となる：
［１］ 細胞に導入されるとＯＩＰ５のインビボ発現および細胞増殖を阻害する二本鎖分子をコードするベクターであって、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖からなり、該鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成する、ベクター。
［２］ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の７９〜９７ｎｔの位置）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の５５７〜５７５ｎｔの位置）の中より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡに作用する前記二本鎖分子をコードする、［１］記載のベクター；
［３］ 前記センス鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［１］記載のベクター；
［４］ 約１００ヌクレオチド長未満の前記二本鎖分子をコードする［３］記載のベクター；
［５］ 約７５ヌクレオチド長未満の前記二本鎖分子をコードする［４］記載のベクター；
［６］ 約５０ヌクレオチド長未満の前記二本鎖分子をコードする［５］記載のベクター；
［７］ 約２５ヌクレオチド長未満の前記二本鎖分子をコードする［６］記載のベクター；
［８］ 約１９〜約２５ヌクレオチド長の前記二本鎖分子をコードする［７］記載のベクター；
［９］ 前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結された前記センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドからなる、［１］記載のベクター；
［１０］ 一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有する二本鎖分子をコードし、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［９］記載のベクター。
本発明のベクターは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードすることが好ましい。本明細書において、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入されると、ベクターが該分子を発現することを示す。好ましい態様において、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節エレメントを含む。本発明のそのようなベクターは、本発明の二本鎖分子を産生させるために用いることができ、または癌を治療するための有効成分として直接用いることができる。
本発明のベクターは、例えば、調節配列が（ＤＮＡ分子の転写によって）両方の鎖の発現を可能にする様式で機能的にＯＩＰ５配列に連結されるように、ＯＩＰ５配列を発現ベクターにクローニングすることによって作製することができる（Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20（5）: 500-5）。例えば、ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子が第１のプロモーター（例えばクローニングされるＤＮＡの３’末端に隣接するプロモーター配列）によって転写され、該ｍＲＮＡに対するセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（例えば該クローニングされるＤＮＡの５’末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センス鎖とアンチセンス鎖とがインビボでハイブリダイズして、遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生成する。代替的に、二本鎖分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれコードする２つのベクター構築物を利用してセンス鎖とアンチセンス鎖とをそれぞれ発現させた後、二本鎖分子構築物を形成させる。さらに、クローニングした配列は、二次構造（例えばヘアピン）を有する構築物、即ち標的遺伝子のセンス配列および相補的アンチセンス配列の両方を含有するベクターの単一転写産物をコードすることができる。
本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせの各々または両方を含むベクターに関し、該アンチセンス鎖は該センス鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写産物は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ該ベクターは、ＯＩＰ５遺伝子を発現している細胞に導入されると、該遺伝子の発現を阻害する。
本発明のベクターはまた、標的細胞のゲノムへの安定した挿入を達成するためのものを包含してもよい（例えば相同的組換えカセットベクターの説明に関しては、Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-12を参照されたい）。例えば、Wolff et al., Science 1990, 247: 1465-8、米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号、同第５，８０４，５６６号、同第５，７３９，１１８号、同第５，７３６，５２４号、同第５，６７９，６４７号、および国際公開公報第９８／０４７２０号を参照されたい。ＤＮＡベースの送達技術の例としては、「ネイキッドＤＮＡ」、促進性（ブピバカイン、ポリマー、ペプチドに媒介される）送達、カチオン性脂質複合体、および、粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性の送達が挙げられる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）。
本発明のベクターは、例えばウイルス性または細菌性のベクターを含む。発現ベクターの例としては、牛痘ウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が挙げられる（例えば米国特許第４，７２２，８４８号を参照されたい）。このアプローチは、例えば二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしての、牛痘ウイルスの使用を伴う。標的遺伝子を発現する細胞に導入されると、組換え牛痘ウイルスが分子を発現し、それにより該細胞の増殖を抑制する。使用することのできるベクターの別の例としてはカルメット・ゲラン桿菌（Bacille Calmette Guerin；ＢＣＧ）が挙げられる。ＢＣＧベクターはStover et al., Nature 1991, 351: 456-60に記載される。広範な他のベクターが、二本鎖分子の治療的投与および生成に有用である。例としては、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、無毒化炭疽菌毒素ベクター等が挙げられる。例えば、Shata et al., Mol Med Today 2000, 6: 66-71、Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806、およびHipp et al., In Vivo 2000, 14: 571-85を参照されたい。
本発明の二本鎖分子を用いて癌細胞の増殖を阻害または低減する方法および癌を治療する方法：
特定のｓｉＲＮＡがＮＳＣＬＣを阻害する能力は、参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第２００５／８９７３５号で既に記載されている。本発明においては、ＯＩＰ５に対する２種類の異なるｄｓＲＮＡを、細胞増殖を阻害する能力に関して試験した。ＯＩＰ５に対する２種類のｄｓＲＮＡ（図３Ａ）は肺癌細胞株および食道癌細胞株における該遺伝子の発現を効果的にノックダウンし、これは細胞増殖の抑制と一致した。
したがって本発明は、ＯＩＰ５の発現阻害を介してＯＩＰ５遺伝子の機能不全を誘発することによって細胞増殖、すなわち肺癌細胞および／または食道癌細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。ＯＩＰ５遺伝子の発現は、ＯＩＰ５遺伝子を特異的に標的とする上述の本発明の二本鎖分子、または該二本鎖分子のいずれかを発現できる本発明のベクターのいずれによっても、阻害することができる。
本発明の二本鎖分子およびベクターが癌性細胞の細胞増殖をそのように阻害できることにより、これらが、癌を治療するための方法に使用可能であることが示される。ＯＩＰ５遺伝子は正常器官においてほとんど検出されなかったので（図１Ａ、Ｂ、およびＤ、図６）、したがって本発明は、有害作用を伴わずに、ＯＩＰ５遺伝子に対する二本鎖分子または該分子を発現するベクターを投与することによって癌を有する患者を治療するための方法を提供し、ここで癌は肺癌および／または食道癌である。
以下に示す［１］〜［３６］の方法が、本発明において特に関心対象となる：
［１］ 癌細胞の増殖を阻害するためおよび癌を治療するための方法であって、該癌細胞または該癌がＯＩＰ５遺伝子を発現し、該方法が、該遺伝子を過剰発現している細胞においてＯＩＰ５の発現および細胞増殖を阻害する少なくとも１つの単離された二本鎖分子を投与する工程を含み、該二本鎖分子が、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖からなり、互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、該センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３からの連続配列に相当するヌクレオチド配列を含む、方法。
［２］ 前記二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の７９〜９７ｎｔの位置）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の５５７〜５７５ｎｔの位置）の中より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［１］記載の方法。
［３］ 前記センス鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［２］記載の方法。
［４］ 治療される前記癌が肺癌および／または食道癌である、［１］記載の方法；
［５］ 前記肺癌がＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣであり、前記食道癌がＥＳＣＣである、［４］記載の方法；
［６］ 複数種類の二本鎖分子を投与する、［１］記載の方法；
［７］ 前記二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［３］記載の方法；
［８］ 前記二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［７］記載の方法；
［９］ 前記二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［８］記載の方法；
［１０］ 前記二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［９］記載の方法；
［１１］ 前記二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［１０］記載の方法；
［１２］ 前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結された前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、［１］記載の方法；
［１３］ 前記二本鎖分子が一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［１２］記載の方法；
［１４］ 前記二本鎖分子がＲＮＡである、［１］記載の方法；
［１５］ 前記二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む、［１］記載の方法；
［１６］ 前記二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１５］記載の方法；
［１７］ 前記センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドがそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡからなる、［１６］記載の方法；
［１８］ 前記二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１５］記載の方法；
［１９］ 前記アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡからなる、［１８］記載の方法；
［２０］ 前記隣接領域が９〜１３個のヌクレオチドからなる、［１９］記載の方法；
［２１］ 前記二本鎖分子が３’オーバーハングを含む、［１］記載の方法；
［２２］ 前記二本鎖分子が、該分子に加えてトランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む組成物中に含まれる、［１］記載の方法。
［２３］ 前記二本鎖分子がベクターによってコードされる、［１］記載の方法；
［２４］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の７９〜９７ｎｔの位置）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の５５７〜５７５ｎｔの位置）の中より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［２３］記載の方法。
［２５］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子の前記センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［２４］記載の方法。
［２６］ 治療される前記癌が肺癌および／または食道癌である、［２３］記載の方法；
［２７］ 前記肺癌がＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣであり、前記食道癌がＥＣＳＳである［２６］記載の方法；
［２８］ 複数種類の前記二本鎖分子を投与する、［２３］記載の方法；
［２９］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［２５］記載の方法；
［３０］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［２９］記載の方法；
［３１］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［３０］記載の方法；
［３２］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［３１］記載の方法；
［３３］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［３２］記載の方法；
［３４］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結された前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、［２３］記載の方法；
［３５］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が、一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［３４］記載の方法；ならびに
［３６］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が、該分子に加えてトランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む組成物中に含まれる、［２３］記載の方法。
本発明の方法を、以下でより詳細に説明する。
ＯＩＰ５遺伝子を発現している細胞の増殖は、ＯＩＰ５遺伝子に対する二本鎖分子、該分子を発現するベクター、またはこれを含む組成物に該細胞を接触させることによって阻害され得る。さらに該細胞を、トランスフェクション剤に接触させてもよい。好適なトランスフェクション剤は当技術分野で既知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、分子に曝露されていない細胞に比べて、細胞の増殖速度がより遅くなるか、または生存率が低減することを示す。細胞増殖は、当技術分野で既知の方法、例えばＭＴＴ細胞増殖アッセイの使用によって、測定されうる。
細胞が本発明の二本鎖分子の標的遺伝子を発現または過剰発現している限り、いずれの種類の細胞の増殖も本発明に従って抑制され得る。例示的な細胞としては肺癌細胞および／または食道癌細胞、特にＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、およびＥＳＣＣが挙げられる。
したがって、ＯＩＰ５に関連する疾患を患うまたはその発症リスクを有する患者は、少なくとも１つの本発明の二本鎖分子、少なくとも１つの該分子を発現する少なくとも１つのベクター、または少なくとも１つの該分子を含む少なくとも１つの組成物を投与することによって、治療され得る。例えば、肺癌および／または食道癌を患う患者は本方法に従って治療され得る。癌の種類は、診断されるべき特定の種類の腫瘍に従って、標準的な方法によって同定され得る。肺癌および／または食道癌は、例えば肺癌および／または食道癌のマーカーとしての癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＹＦＲＡ、ｐｒｏ−ＧＲＰなどを用いて、あるいは胸部Ｘ腺撮影および／または喀痰細胞診を用いて診断され得る。より好ましくは、本発明の方法によって治療される患者は、ＲＴ−ＰＣＲまたはイムノアッセイによって該患者由来の生検材料におけるＯＩＰ５の発現を検出することによって、選択される。好ましくは、本発明の治療の前に、当技術分野で既知の方法、例えば免疫組織化学解析またはＲＴ−ＰＣＲによって、対象由来の生検標本をＯＩＰ５遺伝子過剰発現に関して確認する。
本方法によれば、複数種類の二本鎖分子（またはこれを発現するベクターまたはこれを含有する組成物）の投与によって細胞増殖を阻害してそれにより癌を治療するために、該分子それぞれは異なる構造を有しうるが、ＯＩＰ５の同一の標的配列に一致するｍＲＮＡに作用する。代替的に、複数種類の二本鎖分子が、同一遺伝子の異なる標的配列に一致するｍＲＮＡに作用してもよい。例えば本方法は、ＯＩＰ５に指向性を有する二本鎖分子を利用してもよい。
細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子を、該分子に対応するｍＲＮＡ転写産物との結合を達成するための形態で細胞内に直接導入してもよい。代替的に、上記のように、二本鎖分子をコードするＤＮＡを、ベクターとして細胞に導入してもよい。二本鎖分子およびベクターを細胞内に導入するために、ＦｕＧＥＮＥ（Roche diagnostics）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Invitrogen）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Invitrogen）およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光純薬工業株式会社）などのトランスフェクション増強剤を利用してもよい。
ＯＩＰ５遺伝子発現の低減または対象における癌のサイズ、有病率もしくは転移能の低下などの臨床的利点がもたらされる場合、治療は「有効」であると見なされる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、癌の形成を遅らせる若しく妨害すること、または癌の臨床症状を予防もしくは緩和することを意味する。有効性（Efficaciousness）は、特定の腫瘍型を診断または治療するための任意の既知の方法に関連して決定される。
本発明の方法および組成物が「予防」および「予防法（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」の文脈において有用である限り、このような用語は本明細書において互換的に用いられ、疾患による死亡率または罹患率の負荷を軽減する任意の働きを指す。予防および予防法は、「一次、二次、および三次の予防レベル」で行われ得る。一次の予防および予防法が疾患の発生を防止するのに対して、二次および三次レベルの予防および予防法には、疾患の進行および症状の出現の予防および予防法を目的とした、ならびに機能を回復させることおよび疾患関連合併症を軽減することによって、既に確立された疾患の悪影響を軽減することを目的とした働きが包含される。あるいは、予防および予防法は、特定の障害の重症度を軽減すること、例えば腫瘍の増殖および転移を減少させることを目的とする、広範な予防的治療を含み得る。
癌の治療および／もしくは予防法、ならびに／またはその術後再発の予防には、癌細胞の外科的切除、癌性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、寛解の誘導および癌発生の抑制、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかが含まれる。癌の効果的な治療および／または予防法によって、死亡率が低下し、癌を有する個人の予後が改善され、血中の腫瘍マーカーのレベルが低下し、かつ癌に伴う検出可能な症状が緩和される。例えば、症状の軽減または改善は効果的な治療および／または予防法を構成し、これは、１０％、２０％、３０％、もしくはそれ以上の軽減もしくは安定した疾患を含む。
本発明の二本鎖分子は、準化学量論的な量でＯＩＰ５ ｍＲＮＡを分解することが理解される。いずれかの理論に束縛されるわけではないが、本発明の二本鎖分子は、触媒的な様式で標的ｍＲＮＡの分解を引き起こすと考えられる。したがって、治療効果を発揮するために本発明が必要とする、癌部位またはその近くにおける二本鎖分子の送達は、標準的な癌治療に比べて有意に少ない。
当業者は、対象の体重、年齢、性別、疾患の種類、症状および他の状態；投与経路；ならびに投与が局所的であるのか全身的であるのかなどの要素を考慮することにより、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の有効量を、容易に決定することができる。概して、本発明の二本鎖分子の有効量は、癌部位またはその近傍での細胞内濃度約１ナノモル（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、より好ましくは約２．５ｎＭ〜約１０ｎＭである。より多いまたはより少ない量の二本鎖分子も投与可能であることが意図される。特定の状況に関して必要とされる正確な投与量は、当業者によって容易かつ規定通りに決定され得る。
本発明の方法を用いて、少なくともＯＩＰ５を発現している癌；例えば肺癌および／または食道癌、特にＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、またはＥＳＣＣの増殖または転移を阻害することができる。具体的には、ＯＩＰ５の標的配列（すなわちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１または１２）を含む二本鎖分子が、肺癌および／または食道癌の治療のために特に好ましい。
癌を治療するために、本発明の二本鎖分子を該二本鎖分子とは別の薬剤と組み合わせて対象に投与することもできる。代替的に、本発明の二本鎖分子を、癌を治療するために設計された別の治療法と組み合わせて対象に投与することができる。例えば、本発明の二本鎖分子は、癌の治療または癌転移の予防に現在利用されている治療法（例えば放射線療法、外科的手術、および、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシンまたはタモキシフェンなどの化学療法剤を用いた治療）と組み合わせて投与することができる。
本発明の方法において、二本鎖分子を、送達試薬と組み合わせたネイキッド二本鎖分子として、または該二本鎖分子を発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、対象に投与することができる。
本発明の二本鎖分子と組み合わせて投与するのに適した送達試薬としては、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）またはリポソームが挙げられる。好ましい送達試薬はリポソームである。
リポソームは、肺および／または食道の腫瘍組織などの特定の組織への二本鎖分子の送達を支援でき、かつまた該二本鎖分子の血中半減期も増大させ得る。本発明の文脈における使用に適したリポソームは標準的な小胞形成脂質から形成され得、これは一般に、中性のまたは負に帯電したリン脂質および、コレステロールなどのステロールを含む。一般に脂質の選択は、所望のリポソームのサイズおよび血流中におけるリポソームの半減期などの要素を考慮して導かれる。リポソームの調製に関しては、例えばSzoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9: 467、および米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号（その開示全体が参照により本明細書に引用される）に記載されたような様々な方法が知られている。
好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、該リポソームを癌部位に送達することができるリガンド分子を含む。腫瘍または小胞内皮細胞に広まった受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原と結合するモノクローナル抗体が、好ましい。
特に好ましくは、本発明の二本鎖分子を封入するリポソームは、例えばその構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内系によるクリアランスを回避するように修飾される。一態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
本発明のリポソームを調製するのに用いるオプソニン化阻害部分は典型的に、リポソーム膜と結合する巨大な親水性ポリマーである。本明細書で使用されるように、オプソニン化阻害部分は、化学的にまたは物理的にリポソーム膜に付着すると、例えば脂質可溶性アンカーの膜自体へのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接結合によって、リポソーム膜と「結合」する。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，９２０，０１６号に記載されるように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および網内系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取り込みを有意に低減する保護表面層を形成する。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは非修飾リポソームよりもずっと長く循環中に残存する。このため、そのようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることもある。
ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性（leaky）」の微小血管系が流れ込む組織内に蓄積することが知られている。したがって、そのような微小血管系欠損を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍では効率的にこれらのリポソームが蓄積する。Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの低減は、肝臓および脾臓への有意な蓄積を妨害することによってステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分で修飾された本発明のリポソームは、本発明の二本鎖分子を腫瘍細胞に送達することができる。
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、好ましくは分子量が約５００ダルトン〜約４００００ダルトン、より好ましくは約２０００ダルトン〜約２００００ダルトンの水溶性ポリマーである。そのようなポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＰＧ；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンなどの、合成ポリマー；直鎖、分岐鎖またはデンドリマーのポリアミドアミン；ポリアクリル酸；多価アルコール、例えば、カルボン酸基またはアミノ基が化学結合したポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドが挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧもしくはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはそれらの誘導体も好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーはまた、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖、例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン；アミノ化多糖またはオリゴ糖（直鎖または分岐鎖）；あるいは、たとえばカルボン酸基の連結が得られたカルボン酸の誘導体と反応させた、カルボキシル化多糖またはカルボキシル化オリゴ糖でもあり得る。
好ましくは、オプソニン化阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることもある。
オプソニン化阻害部分は、多くの既知の技術のいずれか１つによってリポソーム膜と結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーと結合し、続いて膜と結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば比率３０：１２のテトラヒドロフランと水を用いる６０℃での還元アミノ化によって、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
本発明の二本鎖分子を発現するベクターが上記で述べられた。本発明の二本鎖分子を少なくとも１つ発現するそのようなベクターもまた、直接、または、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＬＴ１脂溶性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、またはポリカチオン（例えばポリリシン）またはリポソームを含む好適な送達試薬と組み合わせて、投与することができる。本発明の二本鎖分子を発現する組換えウイルスベクターを患者の癌領域に送達する方法は当技術分野内である。
本発明の二本鎖分子は、該二本鎖分子を癌部位に送達するのに適した任意の手段によって、対象に投与することができる。例えば二本鎖分子は、遺伝子銃、電気穿孔法、または他の好適な非経口投与経路もしくは腸内投与経路によって投与することができる。
好適な腸内投与経路としては、経口送達、直腸送達、または鼻腔内送達が挙げられる。
好適な非経口投与経路としては、膀胱内投与または静脈内投与（例えば静脈ボーラス注射、静脈注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系へのカテーテル点滴注入）；組織周囲および組織内注射（例えば腫瘍組織周囲注射および腫瘍内注射）；皮下注入を含む皮下注射または皮下沈着（例えば浸透圧ポンプによる）；例えばカテーテルもしくは他の留置装置（placement device）（例えば、多孔性、非孔性またはゼラチン様の材料を含む、坐剤またはインプラント）による癌部位の領域またはその近傍への直接適用；ならびに吸入が挙げられる。二本鎖分子またはベクターの注射または注入は、癌部位またはその近傍で行われることが好ましい。
本発明の二本鎖分子は、単回投与量または複数回投与量で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が注入による場合、該注入は、単回の持続投与量であってもよく、または複数回の注入によって送達することもできる。組織内への剤の直接注射とは、好ましい癌部位またはその近傍である。癌部位またはその近傍の組織への剤の複数回注射が特に好ましい。
当業者はまた、本発明の二本鎖分子を所定の対象に投与するための適当な投与レジメンを容易に決定することもできる。例えば二本鎖分子を、例えば癌部位またはその近傍での単回注射または沈着として、対象に一回で投与することができる。代替的に、二本鎖分子を、約３日〜約２８日、より好ましくは約７日〜約１０日の期間にわたり、１日１回または２回、対象に投与することができる。好ましい投与レジメンでは、二本鎖分子を７日間、１日１回、癌部位またはその近傍に注射する。投与レジメンに複数回投与が含まれる場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与レジメン全体を通して投与される二本鎖分子の総量を含むことができることが理解される。
本発明の二本鎖分子を含む組成物：
上記に加えて、本発明は、本発明の二本鎖分子または該分子をコードするベクターの少なくとも１つを含む薬学的組成物も提供する。以下の［１］〜［３６］の組成物が、本発明において特に関心対象となる：
［１］ ＯＩＰ５の発現および癌細胞増殖を阻害する少なくとも１つの単離された二本鎖分子を含む、癌細胞の増殖を阻害するためおよび癌を治療するための組成物であって、該癌および該癌細胞が少なくとも１つのＯＩＰ５遺伝子を発現し、さらに該分子が、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖からなる、組成物。
［２］ 前記二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の７９〜９７ｎｔの位置）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の５５７〜５７５ｎｔの位置）の中より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［１］記載の組成物。
［３］ 前記二本鎖分子、前記センス鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［２］記載の組成物。
［４］ 治療される前記癌が肺癌および／または食道癌である、［１］記載の組成物；
［５］ 前記肺癌がＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣであり、前記食道癌がＥＳＣＣである、［４］記載の組成物；
［６］ 複数種類の二本鎖分子を含む、［１］記載の組成物；
［７］ 前記二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［３］記載の組成物；
［８］ 前記二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［７］記載の組成物；
［９］ 前記二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［８］記載の組成物；
［１０］ 前記二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［９］記載の組成物；
［１１］ 前記二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［１０］記載の組成物；
［１２］ 前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結された前記センス鎖および前記アンチセンス鎖を含む単一ポリヌクレオチドからなる、［１］記載の組成物；
［１３］ 前記二本鎖分子が一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖配列であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［１２］記載の組成物；
［１４］ 前記二本鎖分子がＲＮＡである、［１］記載の組成物；
［１５］ 前記二本鎖分子がＤＮＡおよび／またはＲＮＡである、［１］記載の組成物；
［１６］ 前記二本鎖分子がＤＮＡポリヌクレオチドとＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［１５］記載の組成物；
［１７］ 前記センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドがそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡからなる、［１６］記載の組成物；
［１８］ 前記二本鎖分子がＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［１５］記載の組成物；
［１９］ 前記アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡからなる、［１８］記載の組成物；
［２０］ 前記隣接領域が９〜１３個のヌクレオチドからなる、［１９］記載の組成物；
［２１］ 前記二本鎖分子が３’オーバーハングを含む、［１］記載の組成物；
［２２］ トランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む、［１］記載の組成物。
［２３］ 前記二本鎖分子がベクターによってコードされ、かつ前記組成物中に含まれる、［１］記載の組成物；
［２４］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の７９〜９７ｎｔの位置）およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の５５７〜５７５ｎｔの位置）の中より選択される標的配列と一致するｍＲＮＡにおいて作用する、［２３］記載の組成物。
［２５］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子の前記センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中より選択される標的配列に相当する配列を含む、［２４］記載の組成物。
［２６］ 治療される前記癌が肺癌および／または食道癌である、［２３］記載の組成物；
［２７］ 前記肺癌がＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣであり、前記食道癌がＥＳＣＣである、［２６］記載の組成物；
［２８］ 複数種類の前記二本鎖分子を投与する、［２３］記載の組成物；
［２９］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が約１００ヌクレオチド長未満である、［２５］記載の組成物；
［３０］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が約７５ヌクレオチド長未満である、［２９］記載の組成物；
［３１］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が約５０ヌクレオチド長未満である、［３０］記載の組成物；
［３２］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が約２５ヌクレオチド長未満である、［３１］記載の組成物；
［３３］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、［３２］記載の組成物；
［３４］ 前記ベクターによってコードされる前記二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結された前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、［２３］記載の組成物；
［３５］ 前記二本鎖分子が、一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、［２３］記載の組成物；ならびに
［３６］ トランスフェクション増強剤および薬学的に許容される担体を含む、［２３］記載の組成物。
本発明の適切な組成物を、以下でさらに詳細に説明する。
本発明の二本鎖分子は、当技術分野で既知の技術に従って、対象に投与する前に薬学的組成物として製剤化することが好ましい。本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌であり且つパイロジェンフリーであることを特徴とする。本明細書で使用される「薬学的製剤」とは、ヒトおよび獣医学的用途のための製剤を含む。本発明の薬学的組成物を調製する方法は、例えばその開示全体が参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)に記載のように、当技術分野の技術の範囲内である。
本発明の薬学的製剤は、生理学的に許容可能な担体媒体と混合した、本発明の二本鎖分子またはこれをコードするベクターの少なくとも１つ（例えば０．１重量％〜９０重量％）、または該分子の生理学的に許容可能な塩を含む。好ましい生理学的に許容可能な担体媒体は例えば、水、緩衝水、生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
本発明によれば、本組成物は複数種類の二本鎖分子を含有してもよく、該分子のそれぞれが、ＯＩＰ５の同一標的配列または異なる標的配列に指向性を有し得る。例えば本組成物は、ＯＩＰ５に指向性を有する二本鎖分子を含有してもよい。代替的に、例えば本組成物は、１つ、２つまたはそれ以上の標的配列ＯＩＰ５に指向性を有する、二本鎖分子を含有してもよい。
さらに本発明の組成物は、１つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクターを含有してもよい。例えば該ベクターは、１種類、２種類または複数種類の二本鎖分子をコードしてもよい。代替的に本発明の組成物は、複数種類のベクターを含有してもよく、該ベクターのそれぞれが別々の二本鎖分子をコードする。
その上、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物中にリポソームとして含有され得る。リポソームの詳細に関しては、「二本鎖分子を用いて癌を治療する方法」の項を参照されたい。
本発明の薬学的組成物はまた、従来の薬学的賦形剤および／または添加剤も含み得る。好適な薬学的賦形剤としては、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝液およびｐＨ調整剤が挙げられる。好適な添加剤としては、生理学的に生体適合性がある緩衝液（例えば塩酸トロメタミン）、（例えばＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミドなどの）キレート剤（chelant）の添加またはカルシウムキレート錯体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、あるいは任意でカルシウム塩またはナトリウム塩の添加（例えば塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）が挙げられる。本発明の薬学的組成物は、液体形態での使用のために包装されていても、または凍結乾燥されていてもよい。
固体組成物については、従来の非毒性固体担体、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を使用することができる。
例えば、経口投与用の固体薬学的組成物は、上記で列挙された任意の担体および賦形剤と、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子とを含むことができる。エアロゾル（吸入）投与のための薬学的組成物は、上記のようにリポソーム内に封入された、０．０１重量％〜２０重量％、好ましくは１重量％〜１０重量％の１つまたは複数の本発明の二本鎖分子と、噴霧剤とを含むことができる。所望に応じて、担体、例えば鼻内送達用のレシチンを含むことができる。
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のインビボ機能を阻害しない限り、他の薬学的に活性な成分を含有してもよい。例えば本組成物は、癌を治療するのに従来使用される化学療法剤を含有してもよい。
別の態様において、本発明は、ＯＩＰ５の発現に特徴づけられる肺癌および／または食道癌を治療する際に使用するための薬学的組成物の製造における、本発明の二本鎖核酸分子の使用を提供する。例えば本発明は、ＯＩＰ５を発現する肺癌および／または食道癌を治療する際に使用するための薬学的組成物を製造するための、細胞内のＯＩＰ５遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子の使用に関し、ここで該分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中から選択される配列を標的とする。
本発明は、ＯＩＰ５の発現に特徴づけられる肺癌および／または食道癌の治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスをさらに提供し、ここで該方法またはプロセスは、有効成分としての、ＯＩＰ５を過剰発現する細胞内で該遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子と共に薬学的または生理学的に許容可能な担体を製剤化する工程を含み、該分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中から選択される配列を標的とする。
別の態様において、本発明は、ＯＩＰ５の発現に特徴づけられる肺癌および／または食道癌の治療用の薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、ここで該方法またはプロセスは、有効成分と薬学的または生理学的に許容可能な担体とを混和させる工程を含み、該有効成分は、ＯＩＰ５を過剰発現する細胞内で該遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、該分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２の中から選択される配列を標的とする。
肺癌および／または食道癌を検出または診断する方法：
ＯＩＰ５の発現は、肺癌および／または食道癌の細胞内で特異的に上昇することが見出された（図１ＡおよびＢ）。したがって、本明細書で同定された遺伝子、ならびにその転写産物および翻訳産物は肺癌および／または食道癌に対するマーカーとして診断上の有用性を有し、細胞試料におけるＯＩＰ５の発現を測定することによって、肺癌および／または食道癌を診断することができる。特に本発明は、対象におけるＯＩＰ５の発現レベルを測定することによって、肺癌および／または食道癌の存在またはその発症素因を検出、診断、および／または判定するための方法を提供する。本発明の方法によって診断することができる肺癌および／または食道癌にはＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、およびＥＳＣＣが含まれる。さらに、肺および／または食道の腺癌ならびに肺および／または食道の扁平上皮癌（ＳＣＣ）を含むＮＳＣＬＣも、本発明によって診断または検出可能である。
本発明に従って、対象の状態を試験するための中間的な結果が与えられ得る。そのような中間的な結果をさらなる情報と組み合わせて、対象が疾患を患っていると、医師、看護師、または他の実施者が判定するのを補助してもよい。すなわち本発明は、癌を調べるための診断マーカーであるＯＩＰ５を提供する。
あるいは本発明は、対象由来の肺または食道の組織試料中の癌細胞を検出または同定するための方法を提供し、該方法は、対象由来の生物学的試料中のＯＩＰ５遺伝子の発現レベルを測定する工程を含み、該遺伝子の正常対照レベルと比較して該発現レベルが上昇していることにより、該組織中に癌細胞が存在することまたはその疑いがあることが示される。
このような結果を付加的な情報と組み合わせて、対象が疾患に罹患していると診断する際の医師、看護師、または他の医療従事者を支援することができる。換言すれば、本発明は、対象が疾患に罹患していると診断するのに有用な情報を医師に提供し得る。例えば本発明によると、対象から得られた組織中に癌細胞の存在が疑われる場合には、ＯＩＰ５遺伝子の発現レベルに加えて、組織病理学、公知の血中腫瘍マーカーのレベル、および対象の臨床経過等を含む疾患の様々な局面を考慮することによって、医療従事者は臨床判断を下すことができる。例えば、ＩＡＰ、ＡＣＴ、ＢＦＰ、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４、ＣＡ１３０、ＣＥＡ、ＫＭＯ−１、ＮＳＥ、ＳＣＣ、ＳＰ１、Ｓｐａｎ−１、ＴＰＡ、ＣＳＬＥＸ、ＳＬＸ、ＳＴＮ、およびＣＹＦＲＡは、血中の周知の肺腫瘍診断マーカーである。代替的に、血中の食道腫瘍診断マーカーCEA、DUPAN-2、IAP、NSE、SCC、SLX、およびSpan-1も、周知である。すなわち、本発明のこの特定の態様において、遺伝子発現解析の結果は、対象の疾患状態をさらに診断するための中間的な結果として役立つ。
別の態様において、本発明は、癌の診断マーカーを検出するための方法を提供し、該方法は、肺癌の診断マーカーとして、対象由来の生物学的試料中のＯＩＰ５遺伝子の発現を検出する工程を含む。以下の方法［１］〜［１０］が、本発明において特に関心対象となる：
［１］肺癌および／または食道癌を診断する方法であって、
（ａ）生物学的試料において、ＯＩＰ５のアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現レベルを検出する工程と、
（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比べて、検出された発現レベルが増大したことを、疾患の存在と関連付ける工程と
を含む、方法。
［２］前記発現レベルが前記正常対照レベルよりも少なくとも１０％大きい、［１］に記載の方法。
［３］前記発現レベルが、
（ａ）ＯＩＰ５の配列を含むｍＲＮＡの検出、
（ｂ）ＯＩＰ５のアミノ酸配列を含むタンパク質の検出、および
（ｃ）ＯＩＰ５のアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性の検出
の中から選択される方法によって検出される、［１］に記載の方法。
［４］前記肺癌がＮＳＣＬＣまたはＳＣＬＣであり、前記食道癌がＥＳＣＣである、［１］に記載の方法。
［５］前記発現レベルが、前記遺伝子の遺伝子転写産物に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出することによって決定される、［３］に記載の方法。
［６］前記発現レベルが、遺伝子にコードされる前記タンパク質に対する抗体の結合を検出することによって、該遺伝子の該発現レベルとして決定される、［３］に記載の方法。
［７］前記生物学的試料が生検材料、痰または血液を含む、［１］に記載の方法。
［８］対象由来の生物学的試料が上皮細胞を含む、［１］に記載の方法。
［９］対象由来の生物学的試料が癌細胞を含む、［１］に記載の方法。
［１０］対象由来の生物学的試料が癌性上皮細胞を含む、［１］に記載の方法。
肺癌および／または食道癌を診断する方法が以下でより詳細に説明される。
本方法によって診断される対象は好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物としては例えば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが挙げられるが、これらに限定されない。
生物学的試料を診断するべき対象から採取して、診断を実施することが好ましい。目的となるＯＩＰ５転写産物またはＯＩＰ５翻訳産物を含んでいる限り、任意の生物学的材料を、判定のための生物学的試料として使用することができる。生物学的試料としては、これらに限定されるわけではないが、診断が望まれるかまたは癌への罹患が疑われる身体組織、ならびに体液、例えば生検材料、血液、痰、胸水、および尿が挙げられる。好ましくは、生物学的試料は、上皮細胞、より好ましくは癌性上皮細胞、または、癌性であると疑われる組織に由来する上皮細胞を含む、細胞群を含有する。さらに、必要に応じて、入手した身体組織および体液から細胞を精製し、生物学的試料として使用してもよい。
本発明に従って、対象由来の生物学的試料におけるＯＩＰ５の発現レベルが測定される。発現レベルは、当技術分野で既知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルとして測定することができる。例えば、ＯＩＰ５のｍＲＮＡを、プローブを用いて、ハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション）によって定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で実施してもよい。ＯＩＰ５を含む複数の遺伝子（例えば様々な癌特異的遺伝子）の発現レベルを検出に関しては、アレイの使用が好ましい。当業者は、ＯＩＰ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７２８０）の配列情報を利用して、そのようなプローブを調製することができる。例えば、ＯＩＰ５のｃＤＮＡをプローブとして使用してもよい。必要に応じて、色素、蛍光、および同位元素などの適切な標識でプローブを標識してもよく、該遺伝子の発現レベルを、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
さらに、ＯＩＰ５の転写産物を、プライマーを用いて増幅ベースの検出法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって定量してもよい。そのようなプライマーは、入手可能な該遺伝子の配列情報に基づいて調製することもできる。例えば、実施例で使用されるプライマー対（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２、または５および６）は、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット解析による検出に用いられ得るが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
具体的には、本発明の方法に用いられるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中程度にストリンジェントな条件下、または低ストリンジェントな条件下で、ＯＩＰ５のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で用いる「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、より短い配列よりも高温で観察される。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとで）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で該標的配列とハイブリダイズする温度である。Ｔｍにおいて標的配列は一般に過剰に存在するため、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的には、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ ７．０〜８．３において塩濃度がナトリウムイオン約１．０ Ｍ未満、典型的にはナトリウムイオン（または他の塩）約０．０１〜１．０ Ｍであり、かつ温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関しては少なくとも約３０℃、およびより長いプローブまたはプライマーに関しては少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成してもよい。
代替的に、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、ＯＩＰ５タンパク質の量を測定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を測定するための方法としては、該タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が挙げられる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、断片がＯＩＰ５タンパク質との結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または修飾（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を検出に使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために本発明において任意の方法を利用することができる。
ＯＩＰ５遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、ＯＩＰ５タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析によって、染色強度を観察してもよい。即ち、強い染色が観察されることは、タンパク質の存在量が多いことを示すと同時に、ＯＩＰ５遺伝子の発現レベルが高いことを示す。
さらに、診断の正確性を向上させるために、ＯＩＰ５遺伝子の発現レベルに加えて他の癌関連遺伝子、例えば肺癌および／または食道癌において差次的に発現することが公知である遺伝子の発現レベルを測定してもよい。
生物学的試料におけるＯＩＰ５遺伝子を含む癌マーカー遺伝子の発現レベルは、対応する癌マーカー遺伝子の対照レベルよりも、例えば１０％、２５％、もしくは５０％増大していれば、または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、もしくはそれ以上増大していれば、増大したとみなすことができる。
疾患状態（癌性または非癌性）が既知である対象（複数可）から以前に採取して保存していた試料（複数可）を使用することによって、試験される生物学的試料と同時に対照レベルを決定してもよい。代替的に、疾患状態が既知である対象の試料において以前に測定されたＯＩＰ５遺伝子の発現レベル（複数可）を解析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに対照レベルは、以前に試験された細胞由来の発現パターンのデータベースであることもできる。さらに、本発明の一局面によれば、生物学的試料におけるＯＩＰ５遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較することができる。患者由来の生物学的試料の組織型と類似した組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを用いることが好ましい。さらに、疾患状態が既知である群におけるＯＩＰ５遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．または平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用することができる。
本発明の文脈において、非癌性であることが既知である生物学的試料から決定した対照レベルは「正常対照レベル」と称する。他方で、癌性生物学的試料から決定した場合、対照レベルは「癌性対照レベル」と称する。
ＯＩＰ５遺伝子の発現レベルが正常対照レベルに比べて増大しているか、または癌性対照レベルと同程度である場合、対象は、癌を患っているかまたはその発症リスクを有すると診断され得る。さらに、複数の癌関連遺伝子の発現レベルを比較する場合、試料と癌性である参照との間の遺伝子発現パターンが類似していることは、対象が、癌を患っているかまたはその発症リスクを有することを示す。
試験される生物学的試料の発現レベルと対照レベルとの間の相違を、細胞の癌性状態または非癌性状態に応じて発現レベルが変わらない対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して、正規化することができる。例示的な対照遺伝子としては、βアクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼおよびリボソームタンパク質Ｐ１が挙げられるが、これらに限定されない。
癌の予後を評価するための方法：
本発明は、ＯＩＰ５発現が、患者の予後不良（ｐｏｏｒｅｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）に有意に関連しているという新規発見に関連する。したがって本発明は、患者の生物学的試料におけるＯＩＰ５の発現レベルを検出し；検出した発現レベルを対照レベルと比較し；かつ対照レベルに対して増大した発現レベルを予後不良（低い生存率）を示すと判定することによって、癌、特に肺癌および／または食道癌を有する患者の予後を判定するまたは評価するための方法を提供する。
加えて、治療前および治療後のＯＩＰ５遺伝子の発現レベルを本発明の方法に従って比較して、治療の有効性を評価することもできる。具体的には、治療後の対象由来の生物学的試料において検出された発現レベル（すなわち、治療後レベル）を、同じ対象から治療開始前に得た生物学的試料において検出された発現レベル（すなわち、治療前レベル）と比較する。治療前レベルと比較して治療後レベルが低下しているならば、関心対象の治療が有効であると示されるのに対し、治療前レベルと比較して治療後レベルが上昇しているかまたは同様である場合には、臨床転帰または予後があまり好ましくないと示される。
本明細書において用いる「有効」という用語は、治療が、病理学的に上方制御された遺伝子の発現の低下、病理学的に下方制御された遺伝子の発現の上昇、または対象における癌腫のサイズ、有病率、もしくは転移能の低減をもたらすことを示す。関心対象の治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、該治療が、腫瘍の形成を遅らせるもしくは妨げられるか、または疾患の少なくとも１つの臨床症状が遅延される、妨げる、もしくは緩和することを意味する。対象における腫瘍の状態の評価は、標準的な臨床プロトコールを用いて行うことができる。
加えて、治療の有効性は、癌を診断するための任意の公知の方法に関連して判定することもできる。癌は、例えば、症候性の異常、例えば体重減少、腹痛、背部痛、食欲不振、悪心、嘔吐、ならびに全身倦怠感、衰弱、および黄疸を同定することによって診断することができる。
本明細書中で、「予後」という用語は、疾患の推定転帰、ならびに症例の性質および症状によって示されるような疾患からの回復の予想に関する予測を指す。したがって、好ましくない、陰性の、不良である予後は、治療後生存期間または生存率が低いことによって定義される。反対に、陽性、良好な、または好ましい予後は、治療後生存期間または生存率が高いことによって定義される。
「予後を評価する」という用語は、患者の癌の今後の転帰（例えば悪性度、癌の治癒見込み、生存見込み等）を予測するまたは、所定の検出または測定と関連付ける能力を指す。例えば、ＯＩＰ５の発現レベルの経時的な測定により、患者に対する転帰（例えば悪性度の増減、癌の進行度（grade）の増減、癌の治癒見込み、生存率等）の予測が可能となる。
本発明の文脈において、「予後を評価する（または判定する）」という語句は、癌の進行、特に癌の再発、転移拡散、および疾患再発の予測および見込み解析を包含することが意図される。本発明の予後評価法は、治療的介入、病期分類などの診断基準、ならびに腫瘍性疾患の転移または再発に関する疾患モニタリングおよび監視を含む治療様式について結論を出す際に、臨床的に使用されることが意図される。
本方法に使用する、患者由来の生物学的試料は、試料中でＯＩＰ５遺伝子を検出することができる限り、評価するべき対象由来の任意の試料でありうる。好ましくは、生物学的試料は、肺および／または食道の細胞（肺および／または食道から得られる細胞）である。さらに、生物学的試料には、痰、血液、血清、または血漿などの体液が含まれ得る。さらに、試料は組織から精製された細胞であってもよい。生物学的試料は、治療前、治療中および／または治療後を含む様々な時点で、患者から得ることができる。
本発明によると、患者由来の生物学的試料において測定されるＯＩＰ５遺伝子の発現レベルが高ければ高いほど、治療後の寛解、回復および／または生存に関する予後が不良になり且つ不良な臨床転帰の見込みが高くなる。したがって、本方法によれば、比較に使用される「対照レベル」とは例えば、治療後に癌の良好なまたは陽性の予後を示した個体または個体群において何らかの種類の治療の前に検出されたＯＩＰ５遺伝子の発現レベルであり得、これは本明細書で「予後良好対照レベル」とも称される。代替的に、「対照レベル」とは、治療後に癌の不良なまたは陰性の予後を示した個体または個体群において何らかの種類の治療の前に検出されたＯＩＰ５遺伝子の発現レベルであり得、これは本明細書で「予後不良対照レベル」と称する。「対照レベル」とは、単一の参照群に由来するまたは複数の発現パターンに由来する、単一の発現パターンである。したがって対照レベルは、癌患者において、または疾患状態（予後良好または予後不良）が既知である患者群において何らかの種類の治療の前に検出されたＯＩＰ５遺伝子の発現レベルに基づいて決定することができる。好ましくは、癌は肺癌および／または食道癌である。疾患状態が既知である患者群におけるＯＩＰ５遺伝子の発現レベルの標準値を用いることが好ましい。標準値は、当技術分野で既知の任意の方法によって得ることができる。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．または平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用することができる。
何らかの種類の治療を行う前の、疾患状態（良好な予後または不良な予後）が既知である癌患者（複数可）（対照または対照群）から以前に採取および保存されていた試料（複数可）を使用することによって、試験される生物学的試料と同時に対照レベルを決定することができる。
代替的に、対照レベルは、対照群から以前に採取および保存された試料におけるＯＩＰ５遺伝子の発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計学的方法によって決定してもよい。さらに対照レベルは、以前に試験された細胞由来の発現パターンのデータベースであり得る。
さらに、本発明の一局面によれば、生物学的試料におけるＯＩＰ５遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較してもよい。患者由来の生物学的試料と類似した組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを用いることが好ましい。
本発明によれば、予後良好対照レベルに対してＯＩＰ５遺伝子の発現レベルが類似していることは患者のより良好な予後を示し、予後良好対照レベルに対して発現レベルが増大していることは、治療後の寛解、回復、生存および／または臨床転帰に関するあまり好ましくない不良な予後を示す。他方で、予後不良対照レベルに対してＯＩＰ５の発現レベルが低減していることは、患者のより好ましい予後を示し、予後不良対照レベルに対して発現レベルが類似していることは治療後の寛解、回復、生存および／または臨床転帰に関するあまり好ましくない予後不良を示す。
生物学的試料におけるＯＩＰ５遺伝子の発現レベルは、対照レベルと比べて１．０倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、またはそれ以上異なる場合に、変化したとみなされ得る。
試験される生物学的試料と対照レベルとの間の発現レベルの相違は、対照、例えばハウスキーピング遺伝子に対して正規化することができる。例えば、癌性細胞と非癌性細胞との間で発現レベルが異ならないことが知られるポリヌクレオチド、例えばβアクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質Ｐ１をコードするポリヌクレオチドを用いて、ＯＩＰ５遺伝子の発現レベルを正規化してもよい。
発現レベルは、当技術分野で周知の技術を用いて患者由来の生物学的試料における遺伝子転写産物を検出することによって、決定してもよい。本発明の方法によって検出される遺伝子転写産物には、転写産物および翻訳産物の両方、例えばｍＲＮＡおよびタンパク質が含まれる。
例えば、ＯＩＰ５遺伝子の転写産物は、遺伝子転写産物に対するＯＩＰ５遺伝子プローブを使用するハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション解析によって検出することができる。検出はチップまたはアレイ上で行ってもよい。ＯＩＰ５遺伝子を含む複数の遺伝子の発現レベルの検出に関しては、アレイの使用が好ましい。別の例として、検出のために、増幅ベースの検出法、例えばＯＩＰ５遺伝子特異的なプライマーを使用する逆転写ベースのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用してもよい（実施例を参照されたい）。ＯＩＰ５遺伝子特異的なプローブまたはプライマーは、ＯＩＰ５遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）の配列全体を参照することにより、従来の技術を用いて設計および調製されうる。例えば、実施例で使用するプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２）は、ＲＴ−ＰＣＲによる検出に利用され得るが、本発明はそれらに限定されない。
詳細には、本発明の方法で使用されるプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低ストリンジェントな条件下でＯＩＰ５遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズする。本明細書で使用される「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列とはハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、様々な状況下で異なる。長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高い温度で観察される。一般的に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列に関する熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度で）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度である。一般的にＴｍでは標的配列が過剰に存在するので、プローブの５０％が平衡状態で占められる。典型的に、ストリンジェントな条件とは、ｐＨ７．０〜８．３で塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１Ｍ〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）である条件であり、該温度は、短いプローブまたはプライマー（例えば１０個〜５０個のヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、より長いプローブまたはプライマーについては少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの脱安定化剤の添加によっても達成され得る。
代替的に、本発明の評価のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、ＯＩＰ５タンパク質の量を測定することができる。翻訳産物としての該タンパク質の量を測定する方法としては、ＯＩＰ５タンパク質を特異的に認識する抗体を使用するイムノアッセイ法が挙げられる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。さらに、抗体の任意の断片または修飾（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を、該断片がＯＩＰ５タンパク質との結合能を保持している限り、検出に使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製するための方法が当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために任意の方法を本発明で利用することができる。
その翻訳産物に基づきＯＩＰ５遺伝子の発現レベルを検出するための別の方法として、ＯＩＰ５タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析によって、染色の強度を観察することができる。即ち、強い染色が確認されることは、ＯＩＰ５タンパク質の存在量が多いことおよび同時に、ＯＩＰ５遺伝子の発現レベルが高いことを示す。
さらに、ＯＩＰ５タンパク質は細胞増殖活性を有することが知られている。したがって、ＯＩＰ５遺伝子の発現レベルを、指標としてそのような細胞増殖活性を用いて測定することができる。例えば、ＯＩＰ５を発現する細胞を、生物学的試料の存在下で調製および培養し、次に増殖速度を検出することまたは細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することによって、該生物学的試料の細胞増殖活性を決定することができる。
その上、評価の正確性を向上させるために、ＯＩＰ５遺伝子の発現レベルに加えて、肺癌および／または食道癌に関連する他の遺伝子、例えば肺癌および／または食道癌において差次的に発現することが知られている遺伝子の発現レベルも測定してもよい。そのような他の肺および／または食道の細胞関連遺伝子の例としては、国際公開公報第２００４／０３１４１３号および国際公開公報第２００５／０９０６０３号に記載されるものが挙げられ、その全文が参照により本明細書に組み入れられる。
代替的に、本発明に従って、対象の予後を評価するための他の試験結果に加えて、中間的な結果も与えられ得る。そのような中間的な結果は、医師、看護師、または他の実施者が対象の予後を評価、判断または推測する助けとなりうる。予後を評価するために本発明によって得られる中間的な結果と組み合わせて考慮することができる付加的情報としては、対象の臨床症状および身体状態が挙げられる。
本方法に従って癌の予後を評価される患者は哺乳動物であることが好ましく、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが含まれる。
癌を診断するため、癌の予後を評価するため、および／または癌治療の効果をモニタリングするためのキット：
本発明は、癌を診断するため、癌の予後を評価するため、および／または癌治療の効果をモニタリングするためのキットを提供する。好ましくは、癌は肺癌および／または食道癌である。詳細には、本キットは、患者由来の生物学的試料においてＯＩＰ５遺伝子の発現を検出するための試薬を少なくとも１種類含み、該試薬は、
（ａ）ＯＩＰ５遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬、
（ｂ）ＯＩＰ５タンパク質を検出するための試薬、および
（ｃ）ＯＩＰ５タンパク質の生物活性を検出するための試薬
からなる群より選択され得る。
ＯＩＰ５遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬としては、ＯＩＰ５ ｍＲＮＡの一部に対する相補配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、ＯＩＰ５ ｍＲＮＡと特異的に結合するまたはこれを同定する核酸が挙げられる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、ＯＩＰ５ ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で既知の方法に基づき調製することができる。必要に応じて、ＯＩＰ５ ｍＲＮＡを検出するための試薬を、固体マトリクスに固定化させてもよい。さらに、ＯＩＰ５ ｍＲＮＡを検出するための試薬を２種類以上、本キットに包含させることができる。
一方、ＯＩＰ５タンパク質を検出するのに適した試薬として、ＯＩＰ５タンパク質に対する抗体が挙げられる。抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、抗体の任意の断片または修飾（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等）を、該断片がＯＩＰ５タンパク質に対する結合能を保持している限り、試薬として使用することができる。タンパク質の検出のためにこれらの種類の抗体を調製する方法が当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために任意の方法を本発明において利用することができる。さらに抗体を、直接連結または間接的な標識法によってシグナル生成分子で標識してもよい。抗体を標識するためおよびその標的に対する抗体の結合を検出するための標識および方法が当技術分野で周知であり、任意の標識および方法を本発明に利用することができる。さらに、ＯＩＰ５タンパク質を検出するための試薬を２種類以上、本キットに包含させることができる。
さらに生物活性は、例えば生物学的試料内で発現したＯＩＰ５タンパク質によって細胞増殖活性を測定することによって決定することができる。例えば、細胞を患者由来の生物学的試料の存在下で培養し、次に、増殖速度を検出することによってまたは細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することによって、該生物学的試料の細胞増殖活性を決定することができる。必要に応じて、ＯＩＰ５ ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体マトリクス上に固定化することができる。さらに、ＯＩＰ５タンパク質の生物活性を検出するための試薬を２種類以上、本キットに包含させることができる。
本キットは、上述の試薬を２種類以上含み得る。さらに本キットは、固体マトリクスと、ＯＩＰ５遺伝子に対するプローブを結合させるための試薬またはＯＩＰ５タンパク質に対する抗体と、細胞を培養するための培地および容器と、陽性および陰性の対照試薬と、ＯＩＰ５タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体とを含み得る。例えば、予後良好または予後不良の患者から得られた組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットはさらに、（緩衝液、希釈剤、フィルタ、ニードル、シリンジ、および取扱説明書を含む添付文書（例えば、書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業的観点およびユーザーの観点から望ましい他の材料を含み得る。これらの試薬等は、ラベルを付けた容器内で保持され得る。好適な容器としては、ボトル、バイアルおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料で形成され得る。
本発明の一態様として、試薬がＯＩＰ５ ｍＲＮＡに対するプローブである場合、該試薬を、多孔性ストリップなどの固体マトリクス上に固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成してもよい。多孔性ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれが核酸（プローブ）を含有する複数の部位を含み得る。試験ストリップはまた、陰性対照および／または陽性対照用の部位も含有し得る。代替的に、対照部位を、試験ストリップと分離したストリップ上に位置させてもよい。任意で、異なる検出部位は、異なる量の、即ち第１の検出部位ではより多い量の、および後続の部位ではより少ない量の、固定化核酸を含有することができる。試験試料の添加の際、検出可能なシグナルを提示する部位の数が、該試料中に存在するＯＩＰ５ ｍＲＮＡの量の定量的指標を与える。検出部位は、任意の好適に検出可能な形状で構成されていてもよく、かつこれは典型的に試験ストリップ幅に広がったバーまたはドットの形状である。
本発明のキットはさらに、陽性対照試料またはＯＩＰ５標準試料を含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＯＩＰ５陽性の血液試料を採取することによって調製することができ、次にそのＯＩＰ５レベルを分析する。代替的に、精製されたＯＩＰ５タンパク質またはポリヌクレオチドを、ＯＩＰ５を含まない血清に添加して、陽性試料またはＯＩＰ５標準を形成することができる。
抗癌化合物のスクリーニング：
本発明の文脈において、本スクリーニング法により同定される剤は、任意の化合物、または複数の化合物を含む組成物を含む。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞またはタンパク質に曝露される試験剤は、単一の化合物であってもよく、化合物の組み合わせであってもよい。本方法において化合物の組み合わせを使用する場合、該化合物を連続的にまたは同時に接触させることができる。
本発明のスクリーニング法においては、任意の試験剤、例えば細胞抽出物、細胞培養物上清、発酵微生物の生成物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（核酸構築物、例えばアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマー等を含む）、および天然化合物を使用することができる。本発明の試験剤はまた、（１）生物学的ライブラリ法、（２）空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリ法または溶液相ライブラリ法、（３）逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法、（４）「一ビーズ一化合物」ライブラリ法、および（５）アフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリ法を含む、当技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリ法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることもできる。アフィニティクロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ、または低分子ライブラリにも適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1997, 12: 145-67）。分子ライブラリを合成する方法の例は、当技術分野において見つけることができる（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13、Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6、Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994、Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059、Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061、Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51）。化合物のライブラリは、溶液中（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照されたい）、または、ビーズ（Lam, Nature 1991, 354: 82-4）、チップ（Fodor, Nature 1993, 364: 555-6）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9）、もしくはファージ（Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90、Devlin, Science 1990, 249: 404-6、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10、米国特許出願第２００２１０３３６０号）の表面に提供され得る。
本スクリーニング法のいずれかによってスクリーニングされ、構造の一部が付加、欠失、および／または置換により変換された化合物は、本発明のスクリーニング法により得られる剤に含まれる。
さらに、スクリーニングした試験剤がタンパク質である場合、該タンパク質をコードするＤＮＡを得るために、該タンパク質の全アミノ酸配列を決定して該タンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、または得られた該タンパク質の部分アミノ酸配列を分析し、該配列に基づいてオリゴＤＮＡをプローブとして調製し、該プローブを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。得られたＤＮＡは、癌を治療または予防するための候補である試験剤の調製における有用性を確認される。
本明細書中に記載されるスクリーニングにおいて有用な試験剤とは、ＯＩＰ５タンパク質または元のタンパク質の生物活性が欠如したその部分ペプチドにインビボで特異的に結合する、抗体でもあり得る。
試験剤ライブラリの構築は当技術分野で周知であるが、以下本明細書において、本発明のスクリーニング法に関する試験剤の同定およびそのような剤のライブラリの構築についてのさらなる案内を提供する。
（ｉ）分子モデリング：
試験剤ライブラリの構築は、求められる特性を有することが既知である化合物の分子構造、および／または、ＯＩＰ５の分子構造を知ることでより容易になる。さらなる評価に適した試験剤を予備スクリーニングするための1つのアプローチは、試験剤とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングを利用する。
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の三次元原子構造の可視化、および該分子と相互作用すると考えられる新たな化合物の合理的設計が可能になる。三次元の構築は典型的に、選択した分子のＸ線結晶解析またはＮＭＲイメージングのデータに依存する。分子ダイナミクスは力場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムによって、新たな化合物が標的分子にどのように結合するかを予測することが可能になり、該化合物および該標的分子の構造の実験的操作が結合特異度を改善できるようになる。軽微な変化を一方または両方に加えた場合に、分子−化合物間の相互作用がどうなるのかを予測するには、通常は分子設計プログラムと使用者との間にユーザーフレンドリーなメニュー形式のインターフェースを備えた、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型（computationally intensive）コンピュータが必要である。
上記に概説される分子モデリングシステムの例には、ＣＨＡＲＭｍプログラムおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Polygen Corporation，Waltham，Mass）が含まれる。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子ダイナミクスの機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング、および分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡにより、互いに対する分子のインタラクティブな構築、修飾、可視化、および挙動分析が可能になる。
特異的タンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングに関して多数の論文が公開されており、その例としてはRotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97: 159-66、Ripka, New Scientist 1988, 54-8、McKinlay & Rossmann, Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989, 29: 111-22、Perry & Davies, Prog Clin Biol Res 1989, 291: 189-93、Lewis & Dean, Proc R Soc Lond 1989, 236: 125-40, 141-62、および核酸成分のモデル受容体に関するAskew et al., J Am Chem Soc 1989, 111: 1082-90が挙げられる。
化学物質をスクリーニングおよび図式化する他のコンピュータプログラムは、BioDesign, Inc.（Pasadena，Calif.）、Allelix, Inc（Mississauga，Ontario，Canada）、およびHypercube, Inc.（Cambridge，Ontario）等の企業から市販されている。例えば、DesJarlais et al., J Med Chem 1988, 31: 722-9、Meng et al., J Computer Chem 1992, 13: 505-24、Meng et al., Proteins 1993, 17: 266-78、Shoichet et al., Science 1993, 259: 1445-50を参照されたい。
後述のように、推定インヒビターが同定されたら、コンビナトリアル化学技術を用いて、同定された推定インヒビターの化学的構造に基づいて任意の数の変異体を構築することができる。得られた推定インヒビターまたは「試験剤」のライブラリを、本方法を用いてスクリーニングし、癌の治療および／もしくは予防に、ならびに／または癌の術後再発の防止に適した試験剤を同定してもよく、特に該癌は肺癌および／または食道癌である。
（ｉｉ）コンビナトリアル化学合成：
試験剤のコンビナトリアルライブラリは、既知のインヒビター中に存在するコア構造の知識を必要とする合理的薬物設計プログラムの一部として作製してもよい。このアプローチにより、適当なサイズにライブラリを維持することが可能になり、これによってハイスループットスクリーニングが容易になる。代替的に、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより、単純な、特に短い重合体分子ライブラリを構築してもよい。この後者のアプローチの一例は、全ペプチドが６アミノ酸長のライブラリである。そのようなペプチドライブラリは６アミノ酸ごとの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
コンビナトリアル化学ライブラリの調製は当業者に周知であり、化学合成または生物学的合成のいずれによって作成してもよい。コンビナトリアル化学ライブラリとしては、ペプチドライブラリ（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、Furka, Int J Pept Prot Res 1991, 37: 487-93、Houghten et al., Nature 1991, 354: 84-6を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。化学的多様性ライブラリを作成するための他の化学を使用することもできる。そのような化学としては、ペプチド（例えば国際公開公報第９１／１９７３５号）、コード化ペプチド（例えば国際公開公報第９３／２０２４２号）、ランダムバイオオリゴマー（random bio-oligomer）（例えば国際公開公報第９２／０００９１号）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド等のダイバーソマー（diversomer）（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13）、ビニローグ（ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド（Hagihara et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 6568）、グルコース骨格を有する非ペプチド性（nonpeptidal）ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J Amer Chem Soc 1992, 114: 9217-8）、低分子化合物ライブラリの類似有機合成（Chen et al., J. Amer Chem Soc 1994, 116: 2661）、オリゴカルバメート（oligocarbamate）（Cho et al., Science 1993, 261: 1303）、および／またはペプチジルホスホネート（peptidylphosphonate）（Campbell et al., J Org Chem 1994, 59: 658）、核酸ライブラリ（Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USAを参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14(3): 309-14、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７号を参照されたい）、糖質ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 1996, 274: 1520-22、米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、ならびに有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン（Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31.）、イソプレノイド（米国特許第５，５６９，５８８号）、チアゾリジノンおよびメタチアゾノン（metathiazanone）（米国特許第５，５４９，９７４号）、ピロリジン（米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号）、モルホリノ化合物（米国特許第５，５０６，３３７号）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）等を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
コンビナトリアルライブラリを調製するための装置は市販されている（例えば、３５７ ＭＰＳ、３９０ ＭＰＳ（Advanced Chem Tech，Louisville KY）、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ（Rainin，Woburn，MA）、４３３Ａ（Applied Biosystems，Foster City，CA）、９０５０ Ｐｌｕｓ（Millipore，Bedford，MA）を参照されたい）。また、多数のコンビナトリアルライブラリ自体も市販されている（例えば、ComGenex（Princeton，N.J.）、Tripos, Inc.（St. Louis，MO）、3D Pharmaceuticals（Exton，PA）、Martek Biosciences（Columbia，MD）等を参照されたい）。
（ｉｉｉ）その他の候補物質：
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」（Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6）を用いて、非常に大きなライブラリを構築することができる（例えば１０６個〜１０８個の化学物質）。第２のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法（Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74）、およびFodor et al.の方法（Science 1991, 251: 767-73）がその例である。Furka et al.（14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93）、Houghten（米国特許第４，６３１，２１１号）、およびRutter et al.（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験可能なペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
アプタマーとは、特定の分子標的に対して緊密に結合する核酸からなる巨大分子である。ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（Science. 249:505-510 (1990)）は、アプタマーの選択に関するＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法を開示している。ＳＥＬＥＸ法では、核酸分子の大きなライブラリ（例えば１０１５個の異なる分子）をスクリーニングに使用することができる。
ＯＩＰ５結合化合物のスクリーニング：
本発明の文脈において、正常器官では発現が認められなかったのに対し、肺癌および／または食道癌ではＯＩＰ５の過剰発現が検出された（図１Ａ、Ｂ、Ｄ、および２Ａ）。したがって本発明は、ＯＩＰ５遺伝子、該遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて、ＯＩＰ５に結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。肺癌および／または食道癌におけるＯＩＰ５の発現により、ＯＩＰ５に結合する化合物は癌細胞の増殖を抑制し、かつしたがって癌を治療または予防するために有用であると予測され、ここで該癌は肺癌および／または食道癌である。したがって本発明はまた、ＯＩＰ５ポリペプチドを用いて、癌細胞の増殖および／または細胞浸潤を抑制する化合物をスクリーニングする方法、ならびに癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法も提供し、ここで特に、該癌は肺癌および／または食道癌である。このスクリーニング法の１つの態様は以下の工程を含む：
（ａ）試験化合物を、ＯＩＰ５のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験化合物との間の結合活性を検出する工程；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する試験化合物を選択する工程。
本発明の文脈において、治療効果は、試験剤または化合物とＯＩＰ５ポリペプチドとの結合に関連付けられ得る。例えば、試験剤または化合物がＯＩＰ５タンパク質に結合する場合には、該試験剤または化合物を、必要な治療効果を有する剤または化合物の候補として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または化合物がＯＩＰ５タンパク質に結合しない場合には、該試験剤または化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
本発明の方法を以下でより詳細に説明する。
スクリーニングに使用されるＯＩＰ５ポリペプチドは、天然ポリペプチドまたはその部分ペプチドに由来する組換えポリペプチドまたはタンパク質であり得る。試験化合物と接触させるポリペプチドは例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体と結合した形態、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であり得る。
例えば、ＯＩＰ５ポリペプチドを用いてＯＩＰ５ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。そのようなスクリーニングは例えば、特に以下の様式の、免疫沈降法によって実施することができる。ＯＩＰ５ポリペプチドをコードする遺伝子を外来遺伝子に対する発現ベクター、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳおよびｐＣＤ８に挿入することによって、該遺伝子を宿主（例えば、動物）細胞等において発現させる。
発現に使用するプロモーターは、一般的に使用可能な任意のプロモーターであってよく、例えばＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson（ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141（1982））、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 91: 217-23（1990））、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 108: 193(1991)）、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704(1987)）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 8: 466(1988)）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9(1987)）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1: 385-94(1982)）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 9: 946(1989)）、ＨＳＶ ＴＫプロモーター等が挙げられる。
外来遺伝子を発現させるために、任意の方法、例えば電気穿孔法（Chu et al., Nucleic Acids Res 15: 1311-26(1987)）、リン酸カルシウム法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52(1987)）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 12: 5707-17(1984)、Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1641-3(1984)）、リポフェクチン法（Derijard B., Cell 76: 1025-37(1994)、Lamb et al., Nature Genetics 5: 22-30(1993)、Rabindran et al., Science 259: 230-4(1993)）等に従って、宿主細胞への遺伝子の導入を実施することができる。
ＯＩＰ５遺伝子によってコードされるポリペプチドを、特異性が明らかになっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を該ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に導入することによって、モノクローナル抗体のエピトープを含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを用いることができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。その複数のクローニング部位を使用することによって、例えばβ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現することができるベクターが、市販されている。また、融合によってＯＩＰ５ポリペプチドの特性が変わらないように、数アミノ酸〜１２アミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することによって調製された、融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶタグ）、Ｅタグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）等のエピトープ、およびこれらを認識するモノクローナル抗体は、ＯＩＰ５ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる（Experimental Medicine 13: 85-90（1995））。
免疫沈降において、適当な界面活性剤を使用して調製された細胞溶解物にこれらの抗体を加えることによって、免疫複合体が形成される。免疫複合体は、ＯＩＰ５ポリペプチドと、該ポリペプチドとの結合能を含むポリペプチドと、抗体とからなる。上記エピトープに対する、上記のように調製可能な抗体の使用に加えて、ＯＩＰ５ポリペプチドに対する抗体を使用して免疫沈降を実施することもできる。抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、例えばプロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースによって免疫複合体を沈降させることができる。ＯＩＰ５遺伝子によってコードされるポリペプチドを、ＧＳＴなどのエピトープとの融合タンパク質として調製する場合、免疫複合体は、ＯＩＰ５ポリペプチドに対する抗体の使用と同じように、これらのエピトープと特異的に結合する物質、例えばグルタチオン−セファロース４Ｂを用いて形成することができる。
免疫沈降は、例えば文献（Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York（1988））の方法に従ってまたは準じて実施することができる。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは免疫沈降タンパク質の解析に一般的に使用され、結合したタンパク質を、適当な濃度のゲルを用いて該タンパク質の分子量によって解析することができる。ＯＩＰ５ポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色または銀染色などの一般的な染色法では検出が困難であるため、放射性同位体、３５Ｓ−メチオニンまたは３５Ｓ−システインを含有する培養培地中で細胞を培養する工程、細胞中のタンパク質を標識する工程、該タンパク質を検出する工程により、該タンパク質に対する検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が明らかである場合、標的タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製することができ、その配列を決定することができる。
ＯＩＰ５ポリペプチドを用いて該ポリペプチドと結合するタンパク質をスクリーニングする方法として、ウエスト−ウエスタンブロット解析（Skolnik et al., Cell 65: 83-90（1991））を使用することができる。具体的には、ファージベクター（例えばＺＡＰ）を用いて、ＯＩＰ５ポリペプチドと結合するタンパク質を発現していると予想される培養細胞からｃＤＮＡライブラリを調製する工程、ＬＢ−アガロース上で該タンパク質を発現させる工程、発現した該タンパク質をフィルター上に固定する工程、精製および標識したＯＩＰ５ポリペプチドを上記のフィルターと反応させる工程、ならびに、標識に従って、ＯＩＰ５ポリペプチドと結合するタンパク質を発現したプラークを検出することによって、ＯＩＰ５ポリペプチドと結合するタンパク質を得ることができる。本発明のポリペプチドは、ビオチンとアビジンとの結合を利用することによって、またはＯＩＰ５と特異的に結合する抗体、またはＯＩＰ５ポリペプチドと融合したペプチドもしくはポリペプチド（例えばＧＳＴ）を利用することによって、標識してもよい。放射性同位体または蛍光色素等を使用する方法を使用してもよい。
代替的に、本発明のスクリーニング方法の別の態様において、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用してもよい（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ」（Clontech）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（Stratagene）、「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612（1992）」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92（1994）」を参照されたい）。
ツーハイブリッドシステムにおいて、本発明のポリペプチドを、ＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合させ、酵母細胞内で発現させる。本発明のポリペプチドと結合するタンパク質を発現することが予想される細胞から発現したらＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域と融合するように、ｃＤＮＡライブラリを調製する。次に、該ｃＤＮＡライブラリを上記の酵母細胞に導入し、検出された陽性クローン（本発明のポリペプチドと結合するタンパク質が酵母細胞で発現すると、両者の結合がレポーター遺伝子を活性化し、これにより陽性クローンが検出可能となる）から、該ライブラリに由来するｃＤＮＡを単離する。上記で単離されたｃＤＮＡを大腸菌に導入する工程および該タンパク質を発現させる工程によって、該ｃＤＮＡによってコードされたタンパク質を調製することができる。ＨＩＳ３遺伝子に加えて、レポーター遺伝子として、例えばＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
ＯＩＰ５遺伝子によってコードされるポリペプチドと結合する化合物を、アフィニティクロマトグラフィを用いてスクリーニングすることもできる。例えば、本発明のポリペプチドをアフィニティカラムの担体上に固定化してもよく、本発明のポリペプチドと結合可能なタンパク質を含有する試験化合物を該カラムに適用する。本明細書における試験化合物は例えば、細胞抽出物、細胞溶解物等であり得る。試験化合物をロードした後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドと結合した化合物を調製することができる。試験化合物がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、該配列に基づきオリゴＤＮＡを合成し、プローブとして該オリゴＤＮＡを用いてｃＤＮＡライブラリをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを得る。
表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサが、本発明における結合化合物を検出または定量するための手段として使用され得る。そのようなバイオセンサを使用する場合、本発明のポリペプチドと試験化合物との相互作用は、標識を用いることなく微量のポリペプチドだけを用いて、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Pharmacia）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサを用いて、本発明のポリペプチドと試験化合物との結合を評価することが可能である。
ＯＩＰ５タンパク質と結合するタンパク質だけでなく化学物質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）も単離するための、固定化ＯＩＰ５ポリペプチドを合成化学物質、または天然物質バンクまたはランダムファージペプチド提示ライブラリに曝露した場合に結合する分子をスクリーニングする方法、および、コンビナトリアル化学技術に基づきハイスループットを用いてスクリーニングする方法（Wrighton et al., Science 273: 458-64（1996）、Verdine, Nature 384: 11-13（1996）、Hogan, Nature 384: 17-9(1996)）は、当業者に既知である。
ＯＩＰ５の生物活性を抑制する化合物のスクリーニング：
本発明の文脈において、ＯＩＰ５タンパク質は、肺癌細胞および／または食道癌細胞の細胞増殖（図３Ｂ）および細胞浸潤活性（図９Ｂ）を促進する活性を有することを特徴とする。本発明は、この生物活性を指標として用いて、癌細胞の増殖および／または細胞浸潤を抑制する化合物をスクリーニングする方法、ならびに癌を治療または予防する化合物をスクリーニングする方法を提供し、ここで特に該癌は肺癌および／または食道癌である。したがって、本発明は、以下の工程を含む、ＯＩＰ５遺伝子に関連する癌を治療または予防する化合物をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験化合物を、ＯＩＰ５のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）のポリペプチドの生物活性を検出する工程；および
（ｃ）試験化合物の非存在下で検出されるＯＩＰ５のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの生物活性と比較して、該ポリペプチドの生物活性を抑制している試験化合物を選択する工程。
本発明に従って、細胞増殖促進活性の抑制に対する試験化合物の治療効果、またはＯＩＰ５に関連する癌（例えば肺癌および／または食道癌）を治療もしくは予防するための候補化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、以下の工程を含む、ＯＩＰ５ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を抑制するための候補化合物、またはＯＩＰ５に関連する癌を治療もしくは予防するための候補化合物をスクリーニングする方法も提供する：
ａ）試験化合物を、ＯＩＰ５ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる工程；および
ｂ）工程（ａ）の該ポリペプチドまたは断片の生物活性を検出する工程；および
ｃ）ｂ）の生物活性を試験剤または化合物の治療効果と関連付ける工程。
本発明の文脈において、治療効果はＯＩＰ５ポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性と相関し得る。例えば、試験剤または化合物が、該試験剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＯＩＰ５ポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性を抑制または阻害する場合には、該試験剤または化合物を、治療効果を有する候補剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または化合物が、該試験剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＯＩＰ５ポリペプチドまたはその機能的断片の生物活性を抑制も阻害もしない場合には、該試験剤または化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
本発明の方法を以下でより詳細に記載する。
ＯＩＰ５タンパク質の生物活性を抑制する限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに用いることができる。このような生物活性には、ＯＩＰ５タンパク質の細胞増殖活性が含まれる。例えば、ＯＩＰ５タンパク質を用いることができ、これらのタンパク質と機能的に同等のポリペプチドもまた用いることができる。このようなポリペプチドは、細胞によって内因的または外因的に発現され得る。
このスクリーニングにより単離された化合物は、ＯＩＰ５遺伝子によってコードされるポリペプチドのアンタゴニストの候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を阻害する分子を指す。この用語はまた、ＯＩＰ５をコードする遺伝子の発現を低下させるまたは阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングによって単離された化合物は、ＯＩＰ５ポリペプチドと分子（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）とのインビボ相互作用を阻害する化合物の候補である。
本発明の方法において検出されるべき生物活性が細胞増殖である場合には、例えば、ＯＩＰ５ポリペプチドを発現する細胞を調製し、該細胞を試験化合物の存在下で培養し、かつ、細胞増殖速度を決定すること、細胞周期等を測定することによって、および例えば図３に示す生存細胞またはコロニー形成活性を測定することによって、それを検出することができる。ＯＩＰ５を発現した細胞の増殖速度を低下させる化合物を、肺癌および／または食道癌を治療または予防するための候補化合物として選択する。
より具体的には、本方法は以下の工程を含む：
（ａ）試験化合物を、ＯＩＰ５を発現している細胞と接触させる工程；
（ｂ）細胞増殖活性を測定する工程；および
（ｃ）試験化合物の非存在下における細胞増殖活性と比較して、細胞増殖活性を低下させる試験化合物を選択する工程。
好ましい態様において、本発明の方法は以下の工程をさらに含み得る：
（ｄ）ＯＩＰ５をほとんどまたは全く発現しない細胞に対して全く影響を与えない試験化合物を選択する工程。
本明細書において定義される「生物活性を抑制する」という語句は、化合物の非存在下と比較した、ＯＩＰ５の生物活性の好ましくは少なくとも１０％の抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の抑制、および最も好ましくは９０％の抑制を指す。
ＯＩＰ５の発現を変化させる化合物のスクリーニング：
本発明において、ｓｉＲＮＡによるＯＩＰ５の発現の低下は癌細胞増殖の阻害をもたらし（図３Ａ）、ＯＩＰ５の過剰発現の増大は細胞浸潤の促進をもたらす。したがって本発明は、ＯＩＰ５の発現を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。ＯＩＰ５の発現を阻害する化合物は、癌細胞の増殖および／または細胞浸潤を抑制すると予測され、よってＯＩＰ５に関連する癌の治療または予防に有用であり、ここで特に該癌は肺癌および／または食道癌である。したがって本発明はまた、癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングするための方法、およびＯＩＰ５に関連する癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法も提供し、ここで特に該癌は肺癌および／または食道癌である。本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば以下の工程を含み得る：
（ａ）ＯＩＰ５を発現している細胞と候補化合物を接触させる工程；および
（ｂ）対照と比較して、ＯＩＰ５の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する工程。
本発明の方法を以下でより詳細に記載する。
ＯＩＰ５を発現する細胞には、例えば肺癌および／もしくは食道癌から樹立された細胞株、またはＯＩＰ５発現ベクターをトランスフェクトした細胞株が含まれ；任意のそのような細胞株を、本発明の上記スクリーニングに用いることができる。発現レベルは、当業者に周知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫染色、およびフローサイトメトリー解析によって推定することができる。本明細書において定義される「発現レベルを低下させる」とは、化合物の非存在下における発現レベルと比較した、ＯＩＰ５の発現レベルの好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％のレベル低下、および最も好ましくは９５％のレベル低下である。本明細書記載の化合物には、化学物質、二本鎖ヌクレオチド等が含まれる。二本鎖ヌクレオチドの調製は、上記で記載されている。スクリーニング法においては、ＯＩＰ５の発現レベルを低下させる化合物を、肺癌および／または食道癌の治療または予防に用いられる候補化合物として選択することができる。
あるいは、本発明のスクリーニング法は以下の工程を含み得る：
（ａ）候補化合物を、ＯＩＰ５の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とを含むベクターを導入した細胞と接触させる工程；
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する工程；および
（ｃ）該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる候補化合物を選択する工程。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは化合物の治療効果、またはＯＩＰ５関連疾患を治療もしくは予防するための候補剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、癌細胞の増殖を抑制する候補剤または化合物をスクリーニングする方法、およびＯＩＰ５関連疾患を治療または予防するための候補剤または化合物をスクリーニングする方法も提供する。
本発明の文脈において、そのようなスクリーニング法は、例えば以下の工程を含み得る：
ａ）試験剤または化合物を、ＯＩＰ５遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とからなるベクターが導入された細胞と接触させる工程；
ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を検出する工程；ならびに
ｃ）ｂ）の発現レベルを該試験剤または化合物の治療効果と関連付ける工程。
本発明の文脈において、治療効果はレポーター遺伝子の発現または活性と相関し得る。例えば、試験剤または化合物が、該試験剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる場合には、該試験剤または化合物を、治療効果を有する候補剤または化合物として同定または選択することができる。あるいは、試験剤または化合物が、該試験剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させない場合には、該試験剤または化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野で周知である。例示的なレポーター遺伝子にはルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺ、およびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が非限定的に含まれ、宿主細胞はＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をＯＩＰ５の転写調節領域に連結することにより調製することができる。本明細書におけるＯＩＰ５の転写調節領域には、転写開始部位から少なくとも５００ ｂｐ上流まで、好ましくは１０００ ｂｐまで、より好ましくは５０００または１００００ ｂｐ上流までの領域が含まれる。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリーから単離することができ、またはＰＣＲによって増幅することができる。スクリーニングに必要なレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をこれらの遺伝子のいずれか１つの転写調節領域に連結することにより調製することができる。転写調節領域を同定する方法と、同じくアッセイプロトコールも、周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17, 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
前記レポーター構築物を含むベクターを宿主細胞に感染させ、該レポーター遺伝子の発現または活性を、当技術分野で周知の方法により（例えば、ルミノメーター、吸光分光計、フローサイトメーター等を用いて）検出する。本明細書において定義される「発現または活性を低下させる」とは、化合物非存在下と比較した、レポーター遺伝子の発現または活性の好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の低下、および最も好ましくは９５％の低下を指す。
ＯＩＰ５とＲａｆ１の結合を指標として用いるスクリーニング：
本発明において、プルダウンアッセイにより、ＯＩＰ５タンパク質とＲａｆ１タンパク質との直接的な相互作用が示された（図９Ｃ）。抗Ｈｉｓ抗体、およびＨｉｓタグ付ＯＩＰ５タンパク質とＧＳＴ融合組換えＲａｆａタンパク質をインキュベーションした混合物を用いて、ＯＩＰ５タンパク質のプルダウンを行った。Ｒａｆ１に対するポリクローナル抗体を用いたその後のウエスタンブロッティングにより、ＯＩＰ５と結合しているＲａｆ１タンパク質が検出された（図９Ｃ）。したがって本発明は、ＯＩＰ５とＲａｆ１との間の結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。
ＯＩＰ５タンパク質とＲａｆ１タンパク質との間の結合レベルを指標として検出することにより、ＯＩＰ５タンパク質とＲａｆ１タンパク質との間の結合を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。したがって本発明は、ＯＩＰ５タンパク質とＲａｆ１タンパク質との間の結合レベルを指標として用いて、ＯＩＰ５タンパク質とＲａｆ１タンパク質との間の結合を阻害するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。ＯＩＰ５タンパク質とＲａｆ１タンパク質との間の結合を阻害する化合物は、ＯＩＰ５タンパク質の不安定化を介して、癌細胞増殖および／または細胞浸潤を抑制すると予測される。したがって本発明はまた、ＯＩＰ５遺伝子を発現している癌細胞、例えば肺癌細胞および／または食道癌細胞の増殖を阻害するまたは低下させるための候補化合物、ならびにしたがって癌、例えば、肺癌および／または食道癌を治療または予防するための候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。さらに、本発明のスクリーニング法によって得られた化合物は、細胞浸潤を阻害するのにも有用であると考えられる。
本発明にとって特に関心対象となるのは、以下の［１］〜［５］の方法である：
［１］ＯＩＰ５ポリペプチドとＲａｆ１ポリペプチドとの間の結合を妨げる化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、ＯＩＰ５ポリペプチドまたはその機能的同等物をＲａｆ１ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる工程；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合レベルを検出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合レベルを、該試験化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する工程；および
（ｄ）結合レベルを低下させる試験化合物を選択する工程
を含む、方法。
［２］癌の治療もしくは予防、または癌細胞増殖および／もしくは細胞浸潤の阻害に有用な剤または化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験化合物の存在下で、ＯＩＰ５ポリペプチドまたはその機能的同等物をＲａｆ１ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる工程；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合レベルを検出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合レベルを、該試験化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する工程；および
（ｄ）結合レベルを低下させる試験化合物を選択する工程
を含む、方法。
［３］ＯＩＰ５の前記機能的同等物がＲａｆ１結合ドメインを含む、［１］または［２］記載の方法。
［４］Ｒａｆ１の前記機能的同等物がＯＩＰ５結合ドメインを含む、［１］または［２］記載の方法。
［５］前記癌が肺癌および食道癌からなる群より選択される、［１］記載の方法。
本発明の文脈において、ＯＩＰ５ポリペプチドおよびＲａｆ１ポリペプチドの機能的同等物とは、それぞれＯＩＰ５ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、Ｒａｆ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）ポリペプチドと同程度の生物活性を有するポリペプチドである。詳細には、ＯＩＰ５の機能的同等物とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のアミノ酸配列のような、Ｒａｆ１に対する結合ドメインを含むポリペプチド断片である。同様に、Ｒａｆ１の機能的同等物とは、ＯＩＰ５結合ドメインを含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のポリペプチド断片である。
ＯＩＰ５のＲａｆ１への結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。
スクリーニングに用いるポリペプチドは組換えポリペプチドもしくは天然源由来のタンパク質であってよく、またはそれらの部分ペプチドであってもよい。前述の任意の試験化合物をスクリーニングに用いることができる。
ＯＩＰ５タンパク質とＲａｆ１タンパク質との間の結合を検出する方法として、当業者に周知の任意の方法を用いることができる。そのような検出は、例えば、免疫沈降、ウエスト−ウエスタンブロッティング解析（Skolnik et al., Cell 65:83-90 (1991)）、細胞を利用するツーハイブリッドシステム（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲツーハイブリッドシステム」、「哺乳動物ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲツーハイブリッドアッセイキット」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲワンハイブリッドシステム」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰツーハイブリッドベクターシステム」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献「Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)」、「Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)」）、アフィニティークロマトグラフィー、および表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーを用いて行うことができる。
いくつかの態様では、ＯＩＰ５タンパク質およびＲａｆ１タンパク質の両方を発現する細胞を用いる細胞ベースのアッセイにおいて、本発明のスクリーニング法を行ってもよい。ＯＩＰ５タンパク質およびＲａｆ１タンパク質を発現する細胞としては、例えば、癌、例えば肺癌および／または食道癌から樹立された細胞株が挙げられる。あるいは該細胞を、ＯＩＰ５タンパク質およびＲａｆ１タンパク質をコードするヌクレオチドで細胞を形質転換することによって調製してもよい。そのような形質転換は、ＯＩＰ５およびＲａｆ１の両方をコードする発現ベクター、またはＯＩＰ５もしくはＲａｆ１のいずれか一方をコードする発現ベクターを用いて行うことができる。試験化合物の存在下でそのような細胞をインキュベーションすることによって、本発明のスクリーニングを行うことができる。ＯＩＰ５タンパク質のＲａｆ１タンパク質への結合は、抗ＯＩＰ５抗体または抗Ｒａｆ１抗体を用いる免疫沈降アッセイによって検出することができる。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する候補剤もしくは化合物の治療効果、またはＯＩＰ５に関連する癌（例えば、肺癌および食道癌）の治療もしくは予防に関する候補剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、以下の工程を含む、ＯＩＰ５ポリペプチドまたはその機能的同等物を用いて、細胞増殖を抑制するための候補剤もしくは化合物、または癌（例えば、肺癌および食道癌）を治療もしくは予防するための候補剤もしくは化合物をスクリーニングする方法を提供する：
（ａ）試験剤または化合物の存在下で、ＯＩＰ５ポリペプチドまたはその機能的同等物をＲａｆ１ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる工程；
（ｂ）該ポリペプチド間の結合レベルを検出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で検出された結合レベルを、該試験剤または化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）の結合レベルを該試験剤または化合物の治療効果と関連付ける工程。
本発明において、治療効果は、ＯＩＰ５ポリペプチドとＲａｆ１ポリペプチドとの間の結合レベルと相関し得る。例えば、試験剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該試験剤または化合物が該ポリペプチド間の結合レベルを抑制する場合には、該試験剤または化合物を、治療効果を有する候補剤または化合物として同定または選択することができる。代替的に、試験剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該試験剤または化合物が該ポリペプチド間の結合レベルを抑制も阻害もない場合には、該試験剤または化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
ＯＩＰ５のリン酸化を抑制する化合物のスクリーニング：
本発明において、Ｒａｆ１タンパク質によるＯＩＰ５タンパク質のリン酸化がＯＩＰ５ポリペプチドの安定化に寄与することが実証され（図８Ｃ）、よってこれは、癌細胞増殖において重要な役割を有し得る。したがって、Ｒａｆ１タンパク質によるＯＩＰ５タンパク質のリン酸化を阻害する化合物は、癌細胞増殖および／または細胞浸潤を阻害するのに有用であると予測され、よって、ＯＩＰ５過剰発現に関連する癌（例えば、肺癌または食道癌）を治療または予防するための候補化合物となり得る。
したがって本発明はまた、ＯＩＰ５のリン酸化レベルを指標として用いて、細胞増殖および／もしくは細胞浸潤を抑制するための候補化合物、またはＯＩＰ５過剰発現に関連する癌を治療もしくは予防するための候補化合物をスクリーニングする方法も提供する。本発明の文脈において、そのようなスクリーニングは、例えば以下の工程を含み得る：
（ａ）ＯＩＰ５ポリペプチドのリン酸化に適した条件下で、試験化合物の存在下において、ＯＩＰ５ポリペプチドまたはその機能的同等物をＲａｆ１ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる工程；
（ｂ）ＯＩＰ５ポリペプチドのリン酸化レベルを検出する工程；
（ｃ）工程（ｂ）におけるリン酸化レベルを、該試験化合物の非存在下で検出されたリン酸化レベルと比較する工程；および
（ｄ）ＯＩＰ５ポリペプチドのリン酸化レベルを低下させる試験化合物を選択する工程。
本発明に従って、細胞増殖の阻害に対する試験剤もしくは化合物の治療効果、またはＯＩＰ５関連疾患、例えば肺癌および食道癌を治療もしくは予防するための候補剤もしくは化合物の治療効果を評価することができる。したがって本発明はまた、乳癌細胞の増殖を抑制する候補剤または化合物をスクリーニングする方法、および乳癌を治療または予防するための候補剤または化合物をスクリーニングする方法を提供する。
より具体的には、本方法は以下の工程を含む：
（ａ）試験剤または化合物の存在下で、ＯＩＰ５タンパク質をＲａｆ１タンパク質と接触させる工程；
（ｂ）ＯＩＰ５タンパク質のリン酸化レベルを検出する工程；
（ｃ）ＯＩＰ５タンパク質の該リン酸化レベルを、該試験剤または化合物の非存在下で検出されたリン酸化レベルと比較する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）のリン酸化レベルを該試験剤または化合物の治療効果と関連付ける工程。
本発明において、治療効果は、ＯＩＰ５タンパク質のリン酸化レベルと相関し得る。例えば、試験剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、該試験剤または化合物がＯＩＰ５タンパク質のリン酸化レベルを低下させる場合には、該試験剤または化合物を、治療効果を有する候補剤または化合物として同定または選択することができる。代替的に、試験剤または化合物が、試験剤または化合物の非存在下で検出されたレベルと比較して、ＯＩＰ５タンパク質のリン酸化レベルを低下させない場合には、該試験剤または化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。
本発明の文脈において、ＯＩＰ５ポリペプチドまたはＲａｆ１ポリペプチドの機能的同等物とは、それぞれＯＩＰ５ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）またはＲａｆ１ポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）と同等の生物活性を有するポリペプチドである。本明細書で用いる「機能的同等物」という語句は、「遺伝子またはタンパク質」の項に記載したのと同じ意味である。
Ｒａｆ１ポリペプチドによるＯＩＰ５ポリペプチドのリン酸化を阻害する化合物をスクリーニングする方法として、当技術分野で公知の任意の方法を用いることができる。本発明の文脈において、ＯＩＰ５ポリペプチドのリン酸化に適した条件は、例えばＡＴＰといったリン酸供与体の存在下における、単離されたＯＩＰ５ポリペプチドおよび単離されたＲａｆ１ポリペプチドのインキュベーションによって提供され得る。Ｒａｆ１によるＯＩＰ５リン酸化に適した条件はまた、ＯＩＰ５ポリペプチドおよびＲａｆ１ポリペプチド両方を発現する細胞の培養を含む。例えば、そのような細胞は、癌細胞（例えば、肺癌細胞、食道癌細胞）のようにＯＩＰ５およびＲａｆ１を内因的に発現する細胞であってもよく、またはＯＩＰ５ポリペプチドおよび／もしくはＲａｆ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを包含する形質転換細胞であってもよい。
試験化合物の存在下において、前記の単離されたポリペプチドまたは該ポリペプチドを発現している細胞をインキュベーションした後、リン酸化ＯＩＰ５を認識する抗体などの試薬を用いて、ＯＩＰ５ポリペプチドのリン酸化レベルを検出することができる。例えば、ＯＩＰ５ポリペプチドのリン酸化状態を検出するために、イムノアッセイまたはウエスタンブロッティングアッセイを適用することができる。
リン酸化ＯＩＰ５を検出する前に、ＯＩＰ５ポリペプチドを他の成分から分離してもよい。例えば、ＯＩＰ５ポリペプチドを残りの構成要素から分離するために、ゲル電気泳動を用いることができる。あるいは、抗ＬＧＮ／ＧＰＳＭ２抗体を有する担体によって、ＯＩＰ５ポリペプチドを捕捉してもよい。
あるいは、単離されたＯＩＰ５ポリペプチドおよびＲａｆ１ポリペプチド、またはこれらのポリペプチドを発現している細胞を標識リン酸供与体と共にインキュベーションし、その後該標識を追跡することにより、ＯＩＰ５ポリペプチドのリン酸化レベルを検出することもできる。例えば、放射標識ＡＴＰ（例えば、３２Ｐ−ＡＴＰ）をリン酸供与体として用いる場合、分離されたＯＩＰ５ポリペプチドの放射活性はＯＩＰ５ポリペプチドのリン酸化レベルと相関する。
本発明の文脈において、癌を治療または予防する可能性を有する候補化合物を同定することができる。これらの候補化合物の治療可能性は、癌の治療剤を同定するための二次スクリーニングおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価することができる。例えば、ＯＩＰ５タンパク質に結合する化合物が癌の上記活性を阻害する場合には、そのような化合物がＯＩＰ５特異的治療効果を有すると結論づけることができる。
本発明の局面を以下の実施例において記載するが、該実施例は添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定することを意図していない。
特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本発明を実施または試験するにあたって、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を用いることができるが、適切な方法および材料について後述する。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらは、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
材料および方法
細胞株および組織試料
本研究で用いた１５種のヒト肺癌細胞株には、５種の腺癌（ＡＤＣ）（Ａ５４９、ＬＣ３１９、ＰＣ−１４、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、およびＮＣＩ−Ｈ１７８１）、５種の扁平上皮癌（ＳＣＣ）（ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＬＵ６１、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、およびＮＣＩ−Ｈ２１７０）、１種の大細胞癌（ＬＣＣ）（ＬＸ１）、および４種の小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）（ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＳＢＣ−３、およびＳＢＣ−５）が含まれた。本研究で用いたヒト食道癌細胞株は以下の通りであった；９種のＳＣＣ細胞株（ＴＥ１、ＴＥ２、ＴＥ３、ＴＥ４、ＴＥ５、ＴＥ６、ＴＥ８、ＴＥ９、およびＴＥ１０）、および１種のＡＤＣ細胞株（ＴＥ７）（Nishihira T, et al., J Cancer Res Clin Oncol 1993;119:441-9）。細胞はすべて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充した適切な培地中で単層培養し、５％ＣＯ２を含む加湿大気中で３７℃で維持した。正常対照として使用したヒト小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）は、Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ製の最適化培地（ＳＡＧＭ）中で増殖させた。原発性肺癌およびＥＳＣＣの試料は先に入手していた。本研究および言及したすべての臨床材料の使用は、個々の施設内倫理委員会によって承認された。臨床病期は、ＵＩＣＣ ＴＮＭ分類に従って判断した（Sobin L and Wittekind Ch. 6th ed. New York: Wiley-Liss; 2002）。組織マイクロアレイでの免疫染色のために使用したホルマリン固定した原発性肺腫瘍および隣接する正常肺組織試料は、北海道大学（札幌、日本）で根治的手術を受けた２７９名の患者（ＡＤＣ １６１例、ＳＣＣ ９６例、ＬＣＣ １８例、ＡＳＣ ４例；女性患者９６名および男性患者１８３名；２６〜８４歳の範囲で年齢中央値は６３．３歳）から入手していた。計２８０例のホルマリン固定した原発性ＥＳＣＣ（女性患者２７名および男性患者２５３名；３８〜８２歳の範囲で年齢中央値は６１．５歳）および隣接する正常食道組織試料もまた、恵佑会札幌病院（札幌、日本）で根治的手術を受けた患者から入手していた。さらに、組織マイクロアレイでの免疫染色のための計３３６例のＮＳＣＬＣ（病期Ｉ〜ＩＩＩＡ；ＡＤＣ ２０１例、ＳＣＣ １０１例、ＬＣＣ ２３例、ＡＳＣ １１例；女性患者１０３名および男性患者２３３名；２９〜８５歳の範囲で年齢中央値は６６．０歳）および正常肺組織試料もまた、埼玉県立がんセンター（埼玉、日本）から入手した。これらの患者は原発性癌の切除を受けており、そのうちリンパ節転移が陽性であった患者のみが、術後に、白金に基づく補助化学療法による治療を受けた。２２１例のホルマリン固定した原発性ＥＳＣＣ（病期Ｉ〜ＩＶＡ；女性患者２１名および男性患者２００名；４４〜７９歳の範囲で年齢中央値は６２歳）および隣接する正常食道組織試料は、恵佑会札幌病院（札幌、日本）で根治的手術を受けた患者から入手していた。７６例のＥＳＣＣ（病期Ｉ〜ＩＶＢ；女性患者１３名および男性患者６３名；３８〜８４歳の範囲で年齢中央値は６３歳）および隣接する正常食道組織試料もまた、北海道大学およびその提携病院（札幌、日本）で根治的手術を受けた患者から入手していた。本研究およびすべての臨床材料の使用は、個々の施設内倫理委員会によって承認された。
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ
製造業者のプロトコールに従ってＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を用いて、培養細胞および臨床組織から全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡおよび正常ヒト組織ポリ（Ａ）ＲＮＡをＤＮａｓｅ Ｉ（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ、東京、日本）で処理し、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いて逆転写した。以下のＯＩＰ５特異的プライマーまたは内部対照としてのＡＣＴＢ特異的プライマーを用いて、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った：
ＯＩＰ５：５’−ＣＴＴＣＡＡＧＡＡＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、および
５’−ＧＴＡＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＣＴＧＣＴＣＣＡＴＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；
ＡＣＴＢ：５’−ＧＡＧＧＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）および
５’−ＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＡＣＡＧＧＴＡＡＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）。
産物強度が増幅の対数期の範囲内に入るように、サイクル数に関してＰＣＲ反応を最適化した。
ノーザンブロット解析
ヒト多組織ブロット（ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｂｌｏｔ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を、ＯＩＰ５の３２Ｐ標識ＰＣＲ産物とハイブリダイズさせた。ＯＩＰ５のｃＤＮＡプローブは、以下のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによって調製した：
５’−ＣＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＴＧＴＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、および
５’−ＧＴＡＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＣＴＧＣＴＣＣＡＴＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）。
製造業者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄を行った。増感スクリーンを用いて、−８０℃で１週間、ブロットのオートラジオグラフィーを行った。
ウエスタンブロッティング
腫瘍組織または細胞を、溶解緩衝液（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、およびプロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））中で溶解させた。高感度化学発光ウエスタンブロッティング解析システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、以前に記載された通りに使用した（Kato T, et al., Cancer Res 2005;65:5638-46）。肺癌細胞株および食道癌細胞株、ならびに正常気道上皮細胞の溶解物を用いるウエスタンブロット解析により、ヒトＯＩＰ５に対する市販のウサギポリクローナル抗体（カタログ番号１２１４１−１−ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ ｇｒｏｕｐ． Ｉｎｃ．）が内因性ＯＩＰ５タンパク質に特異的であることが確認された。
免疫細胞化学
培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて室温で３分間の透過処理を行った。非特異的結合をブロッキングするため、細胞をＣＡＳＢＬＯＣＫ（ＺＹＭＥＤ）により室温で１０分間覆った。次いで、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した一次抗体と共に、細胞を室温で６０分間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、免疫複合体をＡｌｅｘａ４８８結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。各標本を、４’，６’−ジアミジン−２’−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）でマウントし、スペクトル共焦点スキャンシステム（ＴＳＣ ＳＰ２ ＡＯＢＳ：Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｔｚｌａｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で可視化した。
免疫組織化学および組織マイクロアレイ解析
ホルマリン固定したＮＳＣＬＣを用いて、以前に公表された通りに腫瘍組織マイクロアレイを構築した（Chin SF, et al., Mol Pathol 2003;56:275-9、Callagy G, et al., Diagn Mol Pathol 2003;12:27-34、Callagy G, et al. J Pathol 2005;205:388-96）。スライド上の対応するＨ＆Ｅ染色切片による視覚的配置に基づいて、試料採取用の組織領域を選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取された３つ、４つ、または５つの組織コア（直径０．６ ｍｍ；高さ３〜４ ｍｍ）を、組織マイクロアレイヤー（Ｂｅｅｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｕｎ Ｐｒａｉｒｉｅ， ＷＩ）を用いて、レシピエントパラフィンブロック中に配置した。正常組織のコアを各症例から打ち抜いた。得られたマイクロアレイブロックの５μｍ切片を、免疫組織化学的解析に使用した。３名の独立した研究者が、臨床病理学的データの事前知識を持たずに、ＯＩＰ５の陽性度を半定量的に評価し、各自が染色を陽性または陰性と記録した。評価者全員が陽性と規定した場合にのみ、肺癌を陽性と決定した。
臨床ＮＳＣＬＣにおけるＯＩＰ５過剰発現の意義を調べるため、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて組織切片を染色した。内因性ペルオキシダーゼおよびタンパク質をブロッキングした後、ＯＩＰ５抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ ｇｒｏｕｐ． Ｉｎｃ．）を添加し、各切片を二次抗体としてのＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧと共にインキュベーションした。基質−色素原を添加し、ヘマトキシリンで標本を対比染色した。
統計学的解析
分割表を用いて、ＮＳＣＬＣ患者におけるＯＩＰ５発現と臨床病理学的変数との関係を解析した。手術日からＮＳＣＬＣ関連の死亡時点までの、または最終経過観察時点までの、腫瘍特異的生存曲線を算出した。各関連変数に関して、およびＯＩＰ５発現に関して、カプラン・マイヤー曲線を算出した；ログランク検定を用いて、患者サブグループ間の生存期間の違いを解析した。Ｃｏｘ比例ハザード回帰モデルを用いて単変量解析および多変量解析を行い、臨床病理学的変数と癌関連死亡率との関連性を判定した。最初に、年齢、性別、組織型、ｐＴ分類、およびｐＮ分類を含む考えられる予後因子と死亡との関連性を、一度に１因子を考慮して解析した。次に、多変量Ｃｏｘ解析を、Ｐ値０．０５未満の開始レベルを満たした任意の全ての変数と共に、常にＯＩＰ５発現を強制的にモデルに当てはめる逆方向の（段階的な）方法に適用した。モデルが因子を付加し続ける限り、独立因子はＰ＜０．０５の終了レベルを超えなかった。
ＲＮＡ干渉アッセイ
製造業者のプロトコールに従って３０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）を用いて、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ， Ｉｎｃ．、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ， ＣＯ）（１００ ｎＭ）をＮＳＣＬＣ細胞株Ａ５４９にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を７日間培養し、コロニー数をギムザ染色によって計数し；細胞の生存度を臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイ（細胞計数キット−８溶液；Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、熊本、日本）によって評価した。ＯＩＰ５ ｍＲＮＡ発現の抑制を確認するために、上記のＯＩＰ５に特異的な合成プライマーを用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。ＲＮＡ干渉のための合成オリゴヌクレオチドの標的配列は、以下の通りであった：
対照１（ルシフェラーゼ／ＬＵＣ：フォチナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子）：５’−ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）；
対照２（Ｏｎ−Ｔａｒｇｅｔ ｐｌｕｓ／ＣＮＴ；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｉｎｃ．）：５’−ＵＧＧＵＵＵＡＣＡＵＧＵＣＧＡＣＵＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）；
ｓｉＲＮＡ−ＯＩＰ５−１：５’−ＣＧＧＣＡＵＣＧＣＵＣＡＣＧＵＵＧＵＧＵＵ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）；ｓｉＲＮＡ−ＯＩＰ５−２：５’−ＧＵＧＡＣＡＡＡＡＵＧＧＵＧＵＧＣＵＡＵＵ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）；ｓｉＲＮＡ−Ｒａｆ１−１：５’−ＧＣＡＡＡＧＡＡＣＡＵＣＡＵＣＣＡＵＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）；およびｓｉＲＮＡ−Ｒａｆ１−２：５’−ＧＡＣＡＵＧＡＡＡＵＣＣＡＡＣＡＡＵＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）。
細胞増殖アッセイ
ＯＩＰ５を発現するように設計したプラスミド（ｐｃＡＧＧＳｎ３ＦＣ−ＯＩＰ５−Ｆｌａｇ）またはモックプラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、細胞１×１０６個／１００ ｍｍディッシュの密度でプレーティングした。０．４ ｍｇ／ｍＬジェネテシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培地中で細胞を７日間選択し、ＭＴＴアッセイ（細胞計数キット−８溶液；Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により細胞数を評価した。
マトリゲル浸潤アッセイ
ＯＩＰ５を発現するｐ３ＸＦＬＡＧタグ付プラスミド（ｐｃＡＧＧＳｎ３ＦＣ−ＯＩＰ５−Ｆｌａｇ）またはモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中でコンフルエント近くまで増殖させた。細胞をトリプシン処理によって回収し、血清もプロテイナーゼインヒビターも添加していないＤＭＥＭ中で洗浄し、細胞１×１０５個／ｍｌの濃度でＤＭＥＭに懸濁した。細胞懸濁液を調製する前に、マトリゲル基質（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）の乾燥層を室温で２時間ＤＭＥＭを用いて再水和させた。１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（０．７５ ｍｌ）を２４ウェルマトリゲル浸潤チャンバーの各下部チャンバーに添加し、０．５ ｍｌ（細胞５×１０４個）の細胞懸濁液を上部チャンバーの各インサートに添加した。インサートのプレートを３７℃で２４時間インキュベーションした。インキュベーション後、チャンバーを処理した；供給業者（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ）の指示通りに、マトリゲルを通して浸潤する細胞を固定し、ギムザで染色した。
結果
肺癌および食道癌ならびに正常組織におけるＯＩＰ５発現
肺癌および食道癌に対する新規治療剤および／またはバイオマーカーを開発するための標的分子を同定するため、ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、肺癌およびＥＳＣＣのゲノム全域にわたる発現プロファイル解析を行った（Daigo Y and Nakamura Y, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53、Kikuchi T, et al., Oncogene 2003;22:2192-205、Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 2003;1:485-99、Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43、Kikuchi T, et al., Int J Oncol 2006; 28:799-805、Taniwaki M, et al., Int J Oncol 2006;29:567-75,およびYamabuki T, et al., Int J Oncol 2006;28:1375-84）。スクリーニングした２７，６４８個の遺伝子のうち、調べた肺癌試料および食道癌試料の大多数で、ＯＩＰ５転写産物の発現上昇（３倍またはそれ以上）が同定された。その過剰発現は、肺癌組織１５例のうち９例において、肺癌細胞株１５例のうち１５例において、ＥＳＣＣ組織１０例のうち６例において、およびＥＳＣＣ細胞株１０例のうち９例において、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験により確認された（図１Ａおよび１Ｂ）。
肺癌細胞株および食道癌細胞株における高レベルのＯＩＰ５発現を、抗ＯＩＰ５抗体を用いるウエスタンブロット解析によりさらに確認した（図５Ａ）。ＯＩＰ５タンパク質がウエスタンブロッティングにより２本のバンドとして検出され、ＯＩＰ５タンパク質の修飾の可能性が示された。そのため、内因性ＯＩＰ５を過剰発現するＳＢＣ−５細胞、およびＯＩＰ５発現プラスミド（ｐｃＡＧＧＳｎ３ＦＣ−ＯＩＰ５−Ｆｌａｇ）をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞からの抽出物を、プロテインホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下または非存在下においてインキュベーションし、ウエスタンブロット解析によりＯＩＰ５タンパク質の分子サイズを解析した。ホスファターゼ処理した抽出物中の内因性および外因性のＯＩＰ５タンパク質両方の大多数の測定重量は、未処理細胞内のものよりも小さかった。このデータから、ＯＩＰ５が細胞内でリン酸化される可能性が示された（図４）。免疫蛍光解析を行って、肺癌細胞株ＳＢＣ−５における内因性ＯＩＰ５の細胞内局在性を調べ、ＯＩＰ５が核内および細胞質内に位置することを見出した（図１Ｃ、図５Ｂ）。プローブとしてＯＩＰ５ ｃＤＮＡを用いるノーザンブロット解析により、調べた１６例の組織（図１Ｄ）または２３例の組織（図６Ａ）の中で精巣のみにおいて、１．５ｋｂの転写産物に相当する強力なシグナルが同定された。さらに、６例の正常組織（肝臓、心臓、腎臓、肺、食道、および精巣）におけるＯＩＰ５タンパク質発現を、免疫組織化学により抗ＯＩＰ５ポリクローナル抗体を用いて、肺癌および食道癌における発現と比較した。ＯＩＰ５は、精巣細胞ならびに肺癌細胞および食道癌細胞の核内および細胞質内で大量に検出されたが；その発現は残りの５例の正常組織ではほとんど検出不可能であった（図６Ｂ）。抗ＯＩＰ５抗体と組換えヒトＯＩＰ５とのプレインキュベーションにより、肺癌組織で得られた該抗体による陽性シグナルは減少し、このことは、ＯＩＰ５タンパク質に対するその高い特異性を示すものである（図９Ａ）。
ＮＳＣＬＣ患者およびＥＳＣＣに関するＯＩＰ５発現と予後不良との関連性
次に、外科切除したＮＳＣＬＣにおけるＯＩＰ５発現と様々な臨床病理学的変数との相関関係を調べた。ＯＩＰ５の臨床病理学的意義を検証するため、根治的外科的切除を受けた患者４１９名由来の肺癌組織を含む組織マイクロアレイにより、ＯＩＰ５タンパク質の発現をさらに調べた。ＡＤＣ腫瘍２６２例中１６３例（６２．２％）および非ＡＤＣ腫瘍１５７例中１３９例（８８．５％）において、陽性染色が観察された（図２Ａ）。次いで、ＯＩＰ５発現（陽性 対 陰性）と様々な臨床病理学的パラメータとの相関関係を調べ、組織像（非腺癌においてより高い；カイ二乗検定によりＰ＜０．０００１；表１）とのその有意な相関関係を見出した。カプラン・マイヤー法により、ＮＳＣＬＣにおけるＯＩＰ５状態（陽性 対 陰性）と腫瘍特異的生存率との間の有意な関連性が示された（ＯＩＰ５陽性症例において生存期間がより短い；ログランク検定によりＰ＝０．００９９；図２Ｂ）。単変量解析により、組織像（腺癌 対 非腺癌）、腫瘍サイズ（ｐＴ１ 対 ｐＴ２〜４）、リンパ節転移（ｐＮ０ 対 ｐＮ１〜３）、年齢（＜６５歳 対 ｚ６５歳）、性別（女性 対 男性）、およびＯＩＰ５陽性度（陰性 対 陽性）は全て、ＮＳＣＬＣ患者の腫瘍特異的生存の不良と有意に関連していた（表２）。さらに、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いた多変量解析により、ｐＴ病期、ｐＮ病期、年齢、および陽性ＯＩＰ５染色が、ＮＳＣＬＣに関する独立した予後因子であることが示された（表２）。
（表１）ＮＳＣＬＣ組織におけるＯＩＰ５陽性度と患者の特徴との関連性（ｎ＝４１９）
Figure 2012501162
ＡＤＣ、腺癌
非ＡＤＣ、扁平上皮癌＋大細胞癌および腺扁平上皮癌
Ｐ＜０．０５（χ２検定）
（表２）ＮＳＣＬＣ患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル解析
Figure 2012501162
ＡＤＣ、腺癌
非ＡＤＣ、扁平上皮癌＋大細胞癌および腺扁平上皮癌
Ｐ＜０．０５
ＯＩＰ５の臨床病理学的意義をさらに検証するため、外科的切除を受けたＮＳＣＬＣ患者３３６名およびＥＳＣＣ患者２９７名からの肺癌組織を含む組織マイクロアレイにより、ＯＩＰ５タンパク質の発現をさらに調べた。ＡＤＣ腫瘍２０１例中１３１例（６５．２％）、非ＡＤＣ腫瘍１３５例中１１８例（８７．４％）において、陽性染色が観察された（図７Ａ）。次いで、ＯＩＰ５発現（陽性 対 陰性）と様々な臨床病理学的パラメータとの相関関係を調べ、組織像（非ＡＤＣにおいてより高い；フィッシャーの直接確率検定によりＰ＜０．０００１）との、腫瘍サイズ（ｐＴ２〜Ｔ３においてより高い；フィッシャーの直接確率検定によりＰ＝０．０３１８）との、および喫煙（喫煙者においてより高い；フィッシャーの直接確率検定によりＰ＝０．０１８７）との有意な相関関係を見出した（表３Ａ）。カプラン・マイヤー法により、ＯＩＰ５陽性度とＮＳＣＬＣ患者のより短い腫瘍特異的生存期間との間の有意な関連性が示された（ログランク検定によりＰ＝０．００５３；図７Ｂ）。単変量解析により、非腺癌の組織像、より大きな腫瘍サイズ（ｐＴ２〜３）、リンパ節転移の存在（ｐＮ１〜２）、高齢であること（＞６５歳）、男性であること（女性 対 男性）、およびＯＩＰ５陽性度が、ＮＳＣＬＣ患者の腫瘍特異的生存の不良と有意に関連していた（表３Ｂ）。さらに、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いた多変量解析により、ｐＴ病期、ｐＮ病期、年齢、および陽性ＯＩＰ５染色が、ＮＳＣＬＣ患者に関する独立した予後因子であることが示された（表３Ｂ）。
（表３Ａ）ＮＳＣＬＣ組織におけるＯＩＰ５陽性度と患者の特徴との関連性（ｎ＝３３６）
Figure 2012501162
ＡＤＣ、腺癌
非ＡＤＣ、扁平上皮癌＋大細胞癌および腺扁平上皮癌
＊Ｐ＜０．０５（フィッシャーの直接確率検定）
（表３Ｂ）ＮＳＣＬＣ患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル解析
Figure 2012501162
ＡＤＣ、腺癌
非ＡＤＣ、扁平上皮癌＋大細胞癌および腺扁平上皮癌
＊Ｐ＜０．０５
一方、外科切除した食道癌２９７例のうち１７２例（５７．９％）においてＯＩＰ５の陽性染色が観察されたのに対し、隣接する正常食道組織のいずれにおいても染色は観察されなかった（図７Ｃ）。ＯＩＰ５発現（陽性 対 陰性）と様々な臨床病理学的パラメータとの相関関係を調べ、腫瘍サイズ（ｐＴ２〜Ｔ３においてより高い；フィッシャーの直接確率検定によりＰ＝０．００４）およびリンパ節転移（ｐＮ１〜Ｎ２においてより高い；フィッシャーの直接確率検定によりＰ＝０．００５２）とのその有意な相関関係を見出した（表４Ａ）。カプラン・マイヤー解析により、ＯＩＰ５陽性度とＥＳＣＣ患者のより短い腫瘍特異的生存期間との間の有意な関連性が示された（ログランク検定によりＰ＝０．０１２９；図７Ｄ）。単変量解析により、より大きな腫瘍サイズ（ｐＴ２〜３）、リンパ節転移陽性（ｐＮ１〜２）、男性であること、およびＯＩＰ５陽性度は、ＥＳＣＣ患者の腫瘍特異的生存の不良と有意に関連していた（表４Ｂ）。多変量解析において、ＯＩＰ５状態は、本研究に参加した外科治療を受けたＥＳＣＣ患者に関する独立した予後因子として統計学的に有意なレベルには到達しなかったが（Ｐ＝０．１０１５）、ｐＴ病期およびｐＮ病期ならびに年齢は到達しており、これにより、食道癌におけるＯＩＰ５発現とこれらの臨床病理学的因子との関連性が示唆された（表４Ｂ）。
（表４Ａ）食道癌組織におけるＯＩＰ５陽性度と患者の特徴との関連性（ｎ＝２９７）
Figure 2012501162
＊Ｐ＜０．０５（フィッシャーの直接確率検定）
（表４Ｂ）食道癌患者における予後因子のＣｏｘ比例ハザードモデル解析
Figure 2012501162
＊Ｐ＜０．０５
細胞の増殖および浸潤に対するＯＩＰ５の効果
ＯＩＰ５の上方制御が肺癌細胞の増殖または生存において役割を果たすかどうかを評価するため、２つの異なる対照（ＬＵＣおよびＣＮＴに対するｓｉＲＮＡ）と共に、ＯＩＰ５に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉ−１およびｓｉ−２）をＬＣ３１９細胞およびＳＢＣ−５細胞にトランスフェクトして、内因性ＯＩＰ５の発現を抑制した（図３Ａ）。ｓｉ−１、ｓｉ−２をトランスフェクトした細胞におけるＯＩＰ５発現のレベルは、２つの対照ｓｉＲＮＡと比較して有意に低下した（図３Ａ、上パネル）。ＭＴＴアッセイおよびコロニー形成アッセイによって測定された細胞生存度およびコロニー数は、対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞と比較して、ｓｉ−１またはｓｉ−２をトランスフェクトした細胞において有意に減少した（図３Ａ、中段パネル）。
腫瘍形成におけるＯＩＰ５の潜在的役割をさらに調べるため、ＯＩＰ５を発現するように設計したプラスミド（ｐｃＡＧＧＳｎ３ＦＣ−ＯＩＰ５−Ｆｌａｇ）を調製し、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。ウエスタンブロット解析によりＯＩＰ５発現を確認した後（図３Ｂ、左上パネル）、ＭＴＴアッセイおよびコロニー形成アッセイを行い、ＯＩＰ５−ＣＯＳ−７細胞の増殖が、モックベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞と比較して有意な程度に促進されたことを見出した（図３Ｂ、左下パネルおよび右パネル）。ＣＯＳ−７−ＯＩＰ５細胞には、対照細胞よりも大きなコロニーを形成する顕著な傾向も有し（図３Ｂ、左下パネル）、これにより、ＯＩＰ５が哺乳動物細胞において発癌活性を有することが示唆された。
ＯＩＰ５が細胞浸潤能において一定の役割を果たし得るかどうかを判定するため、マトリゲル浸潤アッセイを行った。マトリゲルを通したＣＯＳ−７−ＯＩＰ５細胞の浸潤は、モックプラスミドをトランスフェクトした対照細胞と比較して有意に増強された（図９Ｂ）。これらの結果から、ＯＩＰ５が癌細胞の悪性度の高い表現型に寄与し得ることが独立して示唆される。
Ｒａｆ１とのその相互作用を介したＯＩＰ５タンパク質の安定化
発癌におけるＯＩＰ５活性化の生物学的重要性を明らかにするため、癌細胞においてＯＩＰ５と相互作用するタンパク質を同定することを試みた。ヒトＲａｆ１のＮ末端調節ドメインを「ベイト」として用いる網羅的な酵母ツーハイブリッドスクリーニングに関する以前の報告から、ＯＩＰ５がＲａｆ１の相互作用パートナー候補２０個のうちの１つであることが示されたが（Yuryev A and Wennogle LP. Genomics 2003;81:112-25.）、哺乳動物細胞におけるそれらの生理的相互作用および機能はいまだ明らかにされていない。Ｒａｆ１は広範な腫瘍型において活性化されることが周知であり、細胞の成長および増殖から生存および運動性までの反応カスケードを引き起こす（Yuryev A and Wennogle LP. Genomics 2003;81:112-25.）。したがってまず、ＯＩＰ５がＲａｆ１と生理的に結合し得るかどうかを調べた。Ｆｌａｇタグ付ＯＩＰ５発現プラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞において、抗Ｆｌａｇ抗体を用いてＯＩＰ５を免疫沈降させた後、抗Ｒａｆ１抗体を用いて免疫ブロッティングを行ったところ、外因性ＯＩＰ５と内因性Ｒａｆ１との相互作用が示された（図８Ａ）。次に、プルダウンアッセイにより、ＯＩＰ５タンパク質とＲａｆ１タンパク質との直接的な相互作用を確認した。抗Ｈｉｓ抗体、および、Ｈｉｓタグ付ＯＩＰ５タンパク質とＧＳＴ融合組換えＲａｆ１タンパク質とをインキュベーションした混合物を用いて、ＯＩＰ５タンパク質のプルダウンを行った。Ｒａｆ１に対するポリクローナル抗体を用いたその後のウエスタンブロッティングにより、ＯＩＰ５と結合しているＲａｆ１タンパク質が検出された（図９Ｃ）。次に、ヒト肺癌細胞株におけるＯＩＰ５発現を半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験（図９Ｄ）およびウエスタンブロッティング（図８Ｂ）によって調べたところ、調べた肺癌細胞の大多数においてＯＩＰ５とＲａｆ１の共発現が見出され、肺癌細胞におけるこれら２つのタンパク質の複合体形成の可能性が示唆された。
Ｒａｆ１の発現が癌細胞におけるＯＩＰ５機能の調節において役割を果たすかどうかをさらに評価するため、Ｒａｆ１に対するｓｉＲＮＡを用いてＲａｆ１の生物学的意義を調べた。癌細胞におけるＯＩＰ５タンパク質機能に対するＲａｆ１の効果をさらに評価するため、Ｒａｆ１に対するｓｉＲＮＡをＳＢＣ−５細胞にトランスフェクトした後、内因性ＯＩＰ５タンパク質のレベルを測定した。興味深いことに、ｓｉ−Ｒａｆ１で処理した細胞においてＯＩＰ５タンパク質のレベルは低下したが、ＯＩＰ５ ｍＲＮＡの発現レベルは変化しなかった（図８Ｃ、左パネル）。一方、Ｒａｆ１の過剰発現により、ＯＩＰ５タンパク質の発現レベルの上昇がもたらされたのに対し、ＯＩＰ５の発現レベルは変化せず（図８Ｃ、右パネル）、これにより、ＯＩＰ５タンパク質の安定性がＲａｆ１によって調節を受けている可能性が示された。
考察
最新の手術技法および補助化学療法の改善にもかかわらず、肺癌およびＥＳＣＣの予後は悪性腫瘍の中でも悪いことが知られている。複数の分子標的薬が開発され、癌治療におけるそれらの有効性が判明しているが；良好な反応を示す患者の割合は依然として限定的である（Ranson M, et al., J Clin Oncol 2002;20: 2240-50）。したがって、有害反応が最小であるかまたは全く無く、悪性細胞に対して高い特異性を有する新規抗癌剤を開発することが急務である。レーザーマイクロダイセクションにより癌細胞の濃縮を行った後に、２７，６４８個の遺伝子を含むｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、肺癌１０１例およびＥＳＣＣ細胞１９例のゲノム全域にわたる発現プロファイル解析を行った（Daigo Y and Nakamura Y, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53, Kikuchi T, et al., Oncogene 2003;22:2192-205, Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 2003;1:485-99, Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 2004;13:3029-43, Kikuchi T, et al., Int J Oncol 2006; 28:799-805, Taniwaki M, et al., Int J Oncol 2006;29:567-75, およびYamabuki T, et al., Int J Oncol 2006;28:1375-84）。本発明者らは、ゲノム全域にわたる発現解析による候補分子のスクリーニングと、ＲＮＡｉ技術を用いた機能喪失効果のハイスループットスクリーニングとを併用する戦略に取り組み、組織マイクロアレイ上の数百もの臨床試料におけるタンパク質発現の系統的解析を行った（Suzuki C, et al., Cancer Res 2003;63:7038-41, Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 2004;10:8363-70, Kato T, et al., Cancer Res 2005;65:5638-46, Furukawa C, et al., Cancer Res 2005;65:7102-10, Ishikawa N, et al., Cancer Res 2005; 65:9176-84, Suzuki C, et al., Cancer Res 2005;65:11314-25, Ishikawa N, et al., Cancer Sci 2006;97:737-45, Takahashi K, et al. Cancer Res 2006;66:9408-19, Hayama S, et al., Cancer Res 2006;66:10339-48, Kato T, et al., Clin Cancer Res 2007;13:434-42, Suzuki C, et al., Mol Cancer Ther 2007;6:542-51, Yamabuki T, et al., Cancer Res 2007;67:2517-25, Hayama S, et al., Cancer Res 2007;67:4113-22, Kato T, et al., Cancer Res 2007;67:8544-53, Taniwaki M, et al., Clin Cancer Res 2007;13:6624-31, Ishikawa N, et al., Cancer Res 2007;67:11601-11, Mano Y, et al., Cancer Sci 2007;98:1902-13, Suda T, et al., Cancer Sci 2007;98:1803-8, Kato T, et al., Clin Cancer Res 2008;14:2363-70, およびMizukami Y, et al., Cancer Sci 2008;99:1448-54）。その結果、ＯＩＰ５が臨床上の肺癌と食道癌の試料および細胞株において頻繁に過剰発現すること、ならびにその遺伝子産物が癌細胞の生存／増殖および悪性度の促進に不可欠であることが示された。
ＯＩＰ５タンパク質は、コイルドコイルドメインを有する２２９アミノ酸タンパク質をコードする。ＯＩＰ５は、酵母ツーハイブリッド解析によって、淋菌混濁関連（Ｏｐａ）タンパク質と相互作用することが見出され（Williams, J. M., et al., Mol Microbiol 1998; 27(1): 171-86）、これにより、ヒト上皮細胞への淋菌の接着および浸潤におけるその関与が示唆された。ＯＩＰ５はまた、網羅的な酵母ツーハイブリッド解析により、Ｒａｆ１と相互作用することも見出された（Yuryev, A. and L. P. Wennogle, Genomics 2003; 81(2): 112-25）。ＯＩＰ５は、ラミナ結合ポリペプチド（ＬＡＰ２ａ）への結合を介して、核タンパク質として細胞周期離脱に関与することが示唆されている（Naetar, N., et al., J Cell Sci 2007; 120(Pt 5): 737-47）。
本研究において、ＯＩＰ５遺伝子は肺癌および食道癌において頻繁に過剰発現し、かつそれらの癌の発生において重要な役割を果たし得ることが実証された。
肺癌細胞におけるｓｉＲＮＡによるＯＩＰ５発現のノックダウンは、細胞増殖の抑制をもたらした。さらに、本発明者らの組織マイクロアレイ実験によって得られた臨床病理学的な証拠から、ＯＩＰ５陽性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者は、ＯＩＰ５陰性腫瘍を有するＮＳＣＬＣ患者よりも癌特異的生存期間が短いことが示された。重要なことに、癌細胞においてＲａｆ１はＯＴＰ５と相互作用して、これを安定化し得る。インビトロおよびインビボでのアッセイによって得られた結果から、ＯＩＰ５が重要な増殖因子でありかつ、肺癌細胞のより悪性度の高い表現型と関連する可能性が高いことが、強く示唆された。ＯＩＰ５経路のさらなる調査により、発癌における癌遺伝子活性化の機序の理解をさらに深めることができる。加えて、これらの結果から、ＯＩＰ５がＲａｆ１経路の構成要素の１つとして癌細胞の増殖／生存において重要な役割を果たすことが示されるため、Ｒａｆ１とＯＩＰ５の間の機能的相互作用を選択的に標的化することは有望な治療戦略となり得るが、ＯＩＰ５癌遺伝子活性化の機序のより良い理解をもたらし得るＯＩＰ５経路のさらなる調査が必要である。
ＯＩＰ５は典型的な癌精巣抗原の１つとして分類されるため、分子標的剤によるＯＩＰ５活性の選択的阻害は、有害事象のリスクが最小でありかつ癌に対して強力な生物活性を有すると予測される、有望な治療戦略となり得る。
要約すると、ＯＩＰ５は、Ｒａｆ１と相互作用することにより、肺癌および食道癌の増殖において重要な役割を果たし得る。切除標本におけるＯＩＰ５過剰発現は、予後不良である可能性の高い患者に補助療法を適用するための有用な指標となり得る。加えて、データから、ヒト癌治療のために、ＯＩＰ５を特異的に標的化するように新規抗癌薬および癌ワクチンを設計することの実現性が強く示唆される。
［産業上の利用可能性］
レーザーキャプチャーダイセクションとゲノム全域にわたるｃＤＮＡマイクロアレイの組み合わせを用いた本明細書記載の癌の遺伝子発現解析により、癌の予防および治療のための標的として、特定の遺伝子が同定された。差次的発現遺伝子、すなわちＯＩＰ５の発現に基づいて、本発明は癌、特に肺癌および／または食道癌を同定および検出するための分子診断マーカーを提供する。
本明細書において提供したデータは、癌の包括的な理解の一助となり、新規診断戦略の開発を促進し、かつ治療薬および予防剤の分子標的を同定するための手がかりを提供する。このような情報は、腫瘍形成をより深く理解するのに寄与し、かつ、癌の診断、治療、および最終的には予防のための新規な戦略を開発するための指標を提供するものである。
本明細書で引用した特許、特許出願、および出版物はすべて、その全体が参照により組み入れられる。
さらに、本発明をその特定の態様に関して詳細に説明してきたが、上記の説明は事実上、例示的かつ説明的なものであって、本発明およびその好ましい態様を説明することを意図していることが理解されるべきである。当業者は、規定の実験を通して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正がその中でなされ得ることを容易に理解するであろう。したがって、本発明は上記の説明によって規定されるのではなく、添付の特許請求の範囲およびその同等物によって規定されることが意図される。

Claims (31)

  1. 肺癌および／または食道癌を診断するための方法であって、
    （ａ）（ｉ）ＯＩＰ５遺伝子のｍＲＮＡの検出、
    （ｉｉ）ＯＩＰ５遺伝子によってコードされるタンパク質の検出、および
    （ｉｉｉ）ＯＩＰ５遺伝子によってコードされるタンパク質の生物活性の検出
    からなる群より選択される方法のいずれか１つにより、対象由来の生物学的試料中のＯＩＰ５遺伝子の発現レベルを測定する工程；ならびに
    （ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較した、工程（ａ）で測定した発現レベルの上昇を、肺癌および／または食道癌の存在と関連付ける工程
    を含む、方法。
  2. 工程（ａ）で測定した発現レベルが正常対照レベルよりも少なくとも１０％高い、請求項１記載の方法。
  3. 工程（ａ）で測定した発現レベルが、ＯＩＰ５タンパク質に対する抗体の結合を検出することによって測定される、請求項１記載の方法。
  4. 前記対象由来の生物学的試料が生検材料を含む、請求項１記載の方法。
  5. 肺癌および／または食道癌を有する患者の予後を評価または判定する方法であって、
    （ａ）患者由来の生物学的試料中のＯＩＰ５遺伝子の発現レベルを検出する工程；
    （ｂ）検出された発現レベルを対照レベルと比較する工程；および
    （ｃ）（ｂ）の比較に基づいて該患者の予後を判定する工程
    を含む、方法。
  6. 前記対照レベルが予後良好な対照レベルであり、該対照レベルと比較した発現レベルの上昇が予後不良と判定される、請求項５記載の方法。
  7. 前記上昇が対照レベルよりも少なくとも１０％高い、請求項６記載の方法。
  8. （ａ）ＯＩＰ５遺伝子のｍＲＮＡの検出；
    （ｂ）ＯＩＰ５遺伝子によってコードされるタンパク質の検出；および
    （ｃ）ＯＩＰ５遺伝子によってコードされるタンパク質の生物活性の検出
    からなる群より選択されるいずれか１つの方法によって発現レベルを測定する、請求項５記載の方法。
  9. 前記患者由来の生物学的試料が生検材料を含む、請求項５記載の方法。
  10. 肺癌および／もしくは食道癌を診断するため、または肺癌および／もしくは食道癌に罹患している患者の予後を評価もしくは判定するためのキットであって、
    （ａ）ＯＩＰ５遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
    （ｂ）ＯＩＰ５遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；および
    （ｃ）ＯＩＰ５遺伝子によってコードされるタンパク質の生物活性を検出するための試薬
    からなる群より選択される試薬を含む、キット。
  11. 前記試薬が前記遺伝子の遺伝子転写産物に対するプローブである、請求項１０記載のキット。
  12. 前記試薬が前記遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体である、請求項１０記載のキット。
  13. 細胞に導入されるとＯＩＰ５遺伝子のインビボ発現および細胞増殖を阻害する単離された二本鎖分子であって、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：１３由来の連続した配列に相当するヌクレオチド配列を含む、単離された二本鎖分子。
  14. 前記センス鎖が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２からなる群より選択される標的配列に相当する配列を含む、請求項１３記載の二本鎖分子。
  15. 約１９〜約２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項１４記載の二本鎖分子。
  16. 介在一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドからなる、請求項１３記載の二本鎖分子。
  17. 一般式
    ５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
    を有し、式中、［Ａ］はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１および１２からなる群より選択される標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、請求項１６記載の二本鎖分子。
  18. 請求項１３〜１７のいずれか一項記載の二本鎖分子をコードする、ベクター。
  19. ＯＩＰ５遺伝子を発現する癌を治療または予防するための方法であって、請求項１３〜１７のいずれか一項記載の単離された二本鎖分子の少なくとも１つ、または請求項１８記載のベクターを投与する工程を含む、方法。
  20. 前記治療される癌が肺癌および／または食道癌である、請求項１９記載の方法。
  21. ＯＩＰ５遺伝子を発現する癌を治療または予防するための組成物であって、請求項１３〜１７のいずれか一項記載の単離された二本鎖分子の少なくとも１つ、または請求項１８記載のベクターを含む、組成物。
  22. 前記治療される癌が肺癌および／または食道癌である、請求項２１記載の組成物。
  23. ＯＩＰ５遺伝子の過剰発現と関連した癌を治療もしくは予防するため、または該癌の細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験化合物を、ＯＩＰ５遺伝子のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる工程；
    （ｂ）該ポリペプチドと該試験化合物との間の結合活性を検出する工程；および
    （ｃ）該ポリペプチドに結合する試験化合物を選択する工程
    を含む、方法。
  24. ＯＩＰ５遺伝子の過剰発現と関連した癌を治療もしくは予防するため、または該癌の細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験化合物を、ＯＩＰ５遺伝子のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる工程；
    （ｂ）工程（ａ）の該ポリペプチドの生物活性を検出する工程；および
    （ｃ）試験化合物の非存在下で検出された、ＯＩＰ５遺伝子のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物活性と比較して、該ポリペプチドの生物活性を抑制する該試験化合物を選択する工程
    を含む、方法。
  25. 前記生物活性が前記細胞増殖の促進である、請求項２４記載の方法。
  26. ＯＩＰ５遺伝子の過剰発現と関連した癌を治療もしくは予防するため、または該癌の細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験化合物を、ＯＩＰ５遺伝子を発現している細胞と接触させる工程；および
    （ｂ）試験化合物の非存在下で検出されたＯＩＰ５遺伝子の発現レベルと比較して、該発現レベルを低下させる該試験化合物を選択する工程
    を含む、方法。
  27. ＯＩＰ５遺伝子の過剰発現と関連した癌を治療もしくは予防するため、または該癌の細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験化合物を、ＯＩＰ５遺伝子の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる工程；
    （ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する工程；ならびに
    （ｃ）対照と比較して、該レポーター遺伝子の発現または活性のレベルを低下させる試験化合物を選択する工程
    を含む、方法。
  28. ＯＩＰ５遺伝子の過剰発現と関連した癌を治療もしくは予防するため、または該癌の細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）試験化合物の存在下で、ＯＩＰ５ポリペプチドまたはその機能的同等物をＲａｆ１ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる工程；
    （ｂ）該ポリペプチド間の結合レベルを検出する工程；
    （ｃ）工程（ｂ）で検出された結合レベルを、該試験化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較する工程；および
    （ｄ）工程（ｃ）において、試験化合物の非存在下で検出された結合レベルと比較して、結合レベルを低下させる該試験化合物を選択する工程
    を含む、方法。
  29. ＯＩＰ５の前記機能的同等物がＲａｆ１結合ドメインを含む、請求項２８記載の方法。
  30. ＯＩＰ遺伝子の過剰発現と関連した癌を治療もしくは予防するため、または該癌の細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）リン酸化に適した条件下で、試験化合物の存在下において、ＯＩＰ５ポリペプチドまたはその機能的同等物をＲａｆ１ポリペプチドまたはその機能的同等物と接触させる工程；
    （ｂ）ＯＩＰ５ポリペプチドのリン酸化レベルを検出する工程；および
    （ｃ）試験化合物の非存在下で検出されたＯＩＰ５ポリペプチドのリン酸化レベルと比較して、該リン酸化レベルを低下させる該試験化合物を選択する工程
    を含む、方法。
  31. 前記癌が肺癌および食道癌より選択される、請求項２３、２４、２６、２７、２８、または２９のいずれか一項記載の方法。
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